特表 2017-537656 ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、及びその遺伝子工学的細菌及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-537656(P2017-537656A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(54)【発明の名称】ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、及びその遺伝子工学的細菌及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20171124BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20171124BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/00 A

   C12N1/21ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】24

(21)【出願番号】特願2017-549563(P2017-549563)

(86)(22)【出願日】2014年12月12日

(85)【翻訳文提出日】2017年6月30日

(86)【国際出願番号】CN2014093667

(87)【国際公開番号】WO2016090622

(87)【国際公開日】20160616

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517204656

【氏名又は名称】イースト チャイナ ユニバーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】ワン，フェンチン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ，ドンジ

(72)【発明者】

【氏名】シュー，リチン

(72)【発明者】

【氏名】リュー，ハオハオ

(72)【発明者】

【氏名】リュー，シンビン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ネンフイ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA45X

4B065AB10

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、及びその遺伝子工学的細菌及びその応用を提供する。前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ｉ）または、（ｉ）に限定されたアミノ酸配列において、置換、欠失または重複を介して、１つまたは複数個のアミノ酸が欠失または重複されて由来され、（ｉ）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質（ｉｉ）をコードする。本発明は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を欠いているマイコバクテリウムの遺伝子工学的細菌を構築することにより、それを１、４−ＢＮＡ、４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡ等のステロイド化合物の製造に用いて、ステロイド剤の生産効率と製品品質を高め、薬剤前駆体の利用率を向上させ、生産コストを削減し、反応条件が軽く、環境に優しく、高い経済的及び社会的利益を有する。
【選択図】図６

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ステロイド化合物の製造においてのマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌の応用であって、
前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失されたマイコバクテリウムであり、前記ステロイド化合物は、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−１と、４−ジエン−３−オンと、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−エン−３−オン ９αと、２２−ジヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−ジエン−３−オンとを含み、
前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ｉ）または、（ｉ）に限定されたアミノ酸配列において、置換、欠失または重複を介して、一つまたは複数個のアミノ酸が欠失または重複されて由来され、（ｉ）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質（ｉｉ）をコードすることを特徴とする、
ステロイド化合物の製造においてのマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌の応用。

【請求項2】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードしたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有することを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項3】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有する１１４３〜２０５４位に示されるヌクレオチド配列（１）、または
前記配列（１）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列（２）を有することを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項4】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項３に記載の応用。

【請求項5】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、放線菌に由来することを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項6】

前記放線菌は、マイコバクテリウム属微生物と、ロドコッカス属微生物とを含むことを特徴とする請求項５に記載の応用。

【請求項7】

前記マイコバクテリウム属微生物は、高速成長型のマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項６に記載の応用。

【請求項8】

前記高速成長型のマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３６８３、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉから選択されることを特徴とする請求項７に記載の応用。

【請求項9】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、高速成長型のマイコバクテリウムＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来することを特徴とする請求項８に記載の応用。

【請求項10】

前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子がさらに欠失されたマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項11】

前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、３−ケトステロイド − △^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子がさらに欠失されたマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項12】

前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子とが同時に欠失されたマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項１に記載の応用。

【請求項13】

ステロイド化合物の製造においてのマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌の応用であって、
前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が欠失されたマイコバクテリウムであり、前記ステロイド化合物は、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−１と、４−ジエン−３−オンと、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−エン−３−オン ９αと、２２−ジヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−ジエン−３−オンとを含み、
前記アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ｉｉｉ）、または
（ｉｉｉ）に限定されたアミノ酸配列において、置換、欠失または重複を介して、一つまたは複数個のアミノ酸が欠失または重複されて由来され、（ｉｉｉ）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質（ｉｖ）をコードすることを特徴とする、ステロイド化合物の製造においてのマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌の応用。

【請求項14】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子がコードしたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有することを特徴とする請求項１３に記載の応用。

【請求項15】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を有する１０１０〜２１７４位に示されるヌクレオチド配列（３）、または
前記配列（３）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列（４）を有することを特徴とする請求項１３に記載の応用。

【請求項16】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列と少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１５に記載の応用。

【請求項17】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は放線菌に由来することを特徴とする請求項１３に記載の応用。

【請求項18】

前記放線菌は、マイコバクテリウム属微生物とロドコッカス属微生物とを含むことを特徴とする請求項１７に記載の応用。

【請求項19】

前記マイコバクテリウム属微生物は、高速成長型のマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項１８に記載の応用。

【請求項20】

前記高速成長型のマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３６８３、Ｍ ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉから選択されることを特徴とする請求項１９に記載の応用。

【請求項21】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、高速成長型のマイコバクテリウムＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来することを特徴とする請求項２０に記載の応用。

【請求項22】

前記マイコバクテリウム遺伝子工学的細菌は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子とが同時に欠失されたマイコバクテリウムであることを特徴とする請求項１３に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子工学技術分野に関するもので、さらに具体的に、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、及びその遺伝子工学的細菌及びその応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ステロイド化合物はステロイドとも呼ばれており、シクロペンタノペルヒドロフェナントレンを母核とする構造的に類似している化合物である。その基本的な構造は、以下の図面に示すように、３つの６員環と１つの５員環からなり、それぞれＡ環、Ｂ環、Ｃ環、Ｄ環と呼ばれ、母核の１０位、１３位にはメチル基を有し、３位、１１位、１７位にはヒドロキシ基、ケトン基、またはアルキル基を有することができ、Ａ環、Ｂ環、Ｃ環及びＤ環は二重結合を有することができ、１７位には、多くの場合、長さが不同の側鎖が存在する。ステロイド母核においての置換基、二重結合の位置または立体構成などが異なっているため、一連のユニークな生理機能を備えた化合物を形成した。人間と動物の体内において、ステロイドは主要な内因性ホルモンであり、生殖器と副腎皮質から分泌され、生殖、大脳及び骨格の発育、恒常性の維持及び生物効果の調整などと緊密に関連している。同時に外因性ホルモンとして、ステロイドホルモン類薬は、臨床の中で欠かせない薬物であり、体について重要な調節作用があり、非常に重要な薬用価値があることで、例えば、副腎皮質ホルモンは、抗炎症、抗アレルギー、抗変態、抗ショック相などの効果がある。

【0003】

【化1】

【0004】

図１に示すように、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アシル−ＣｏＡチオラーゼは、マイコバクテリウムがステロール側鎖を分解することに関与する２つの重要な酵素である。結核菌のステロイド代謝遺伝子クラスターにおいて、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの機能が、１７位のヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼとして定義されているが、それは哺乳動物細胞の第ＩＶ型１７β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼのＮ段機能ドメインに非常に似ていることから得られた名前である。同時に、その酵素は、３−ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼの機能を備えていることが報告されているが、これまでに確認されてはいない。アシル−ＣｏＡチオラーゼは、ステロール側鎖が分解するチオリシス脱炭反応に関与しており、脂肪酸のβ−酸化過程においてのチオリシス反応に似ている。ステロール側鎖の分解過程は、１つの極めて複雑で総合的な酵素反応であるので、このような分解過程のメカニズムは、さらに多くの研究を必要とする。

【0005】

微生物変換は、ステロイド薬工業生産システムにおける難題として、その立ち遅れた微生物ステロイド薬の製造工程、高効率な菌株の開発、変換生産ラインを新たに建設するための莫大な支出などの問題は、皆ステロイド医薬産業の急速な発展を制限するとともに、ステロイド薬の生産コストが高い１つの重要な原因ともなる。中国は、ステロイド医薬生産企業が多くて、生産額が膨大であり、また目前のいくつかの重要なステロイドの微生物変換反応において、高効率の生産菌株においての改造及び開発を成功的に進めていることで、産業界でも歓迎されることが常に期待され、全体的に、中国におけるステロイド医薬産業の生産レベルを向上させ、その生産においての経済的効果は非常によいことである。

【0006】

ステロイド医薬工業生産システムにおける重要な微生物変換反応において、遺伝子工学の技術革新により、高効率の微生物変換反応を開発させ、またステロイド薬の生産効率と製品品質とを大幅に向上させることができ、ステロイド薬生産過程中のエネルギー消費量の減少、薬物前駆体の利用率の向上、生産段階の簡素化及び生産コストの削減に役に立つことで、ステロイド薬の価格低下に役立つことである。また、微生物変換反応条件が穏やかで環境に優しく、グリーン化学技術に属し、その生産への応用を強力に促進することは、社会が持続的に発展するための必然的要求である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の目的は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子、及びその遺伝子工学的細菌及びその応用を提供することにより、従来技術においてのステロイド薬工業生産工程の複雑さ、低効率、高コストによるステロイド薬の高価という欠点を解決することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、前記技術的課題を解決するために、以下のような技術を採用する。

【0009】

本発明の第１の態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ｉ）または、（ｉ）に限定されたアミノ酸配列において、置換、欠失または重複を介して、１つまたは複数個のアミノ酸が欠失または重複されて由来され、（ｉ）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質（ｉｉ）をコードするヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を提供する。

【0010】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子がコードしたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有することが好ましい。８０％以上の相同性を有することがさらに好ましく、９０％以上の相同性を有することがもっとも好ましい。

【0011】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有する１１４３〜２０５４位に示されるヌクレオチド配列（１）、または前記配列（１）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列（２）を有する。前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有する１１４３〜２０５４位と少なくとも８７％の相同性を有するヌクレオチド配列を有し、または前記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列と６０％以上の相同性を有することも好ましい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列以外のヌクレオチド配列は、その酵素の調整要素と隣接遺伝子断片とを含む。

【0012】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、放線菌に由来し、マイコバクテリウム属微生物とロドコッカス属微生物であることが好ましい。

【0013】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、マイコバクテリウム属微生物に由来することが比較的好ましい。

【0014】

前記マイコバクテリウム属微生物は、高速成長型マイコバクテリウムであることがさらに好ましい。

【0015】

さらに、前記高速成長型のマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３６８３及びＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉである。

【0016】

さらに、前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、高速成長型のマイコバクテリウムＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来する。

【0017】

前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子は、高速成長型のマイコバクテリウムであるマイコバクテリウムネオアウルームＮｗＩＢ−００に由来することが最も好ましい。

【0018】

本発明の第２の態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（ｉｉｉ）、または（ｉｉｉ）に限定されたアミノ酸配列において、置換、欠失または重複を介して、１つまたは複数個のアミノ酸が欠失または重複されて由来され、（ｉｉｉ）のタンパク質と同一の機能を有するタンパク質（ｉｖ）をコードするアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を提供する。

【0019】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子がコードしたタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を有し、８０％以上の相同性を有することが好ましい。

【0020】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を有する１０１０〜２１７４位に示されるヌクレオチド配列（３）、または前記配列（３）に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を有するヌクレオチド配列（４）を有し、８７％以上の相同性を有することが好ましい。

【0021】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列と少なくとも６０％の相同性を有する。

【0022】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は放線菌に由来する。

【0023】

前記放線菌は、マイコバクテリウム属微生物とロドコッカス属微生物とを含むことが比較的好ましい。

【0024】

前記マイコバクテリウム属微生物は、高速成長型のマイコバクテリウムであることがさらに好ましい。

【0025】

さらに、前記高速成長型のマイコバクテリウムは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３６８３、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＮＲＲＬＢ−３８０５、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｉｌｖｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｈｌｅｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖａｎｂａａｌｅｎｉｉから選択される。

【0026】

前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子は、高速成長型のマイコバクテリウムＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００に由来することが最も好ましい。

【0027】

本発明の第３の態様において、マイコバクテリウム遺伝子工学細菌を提供し、前記マイコバクテリウム遺伝子工学細菌は、前記ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子または前記アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が欠損されたマイコバクテリウムである。その特徴として、前記のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を突然変異させ、また相同組換えにより獲得することである。つまり、遺伝子操作を通じて、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の不活性化とアシル−ＣｏＡチオラーゼ機能の不活性化とを実現することにより、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子活性またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性のないマイコバクテリウム遺伝子工学菌株を構築することで、それはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を標的として、無標記の遺伝子工学操作を行うことにより実現される。

【0028】

好ましくは、本発明は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子とヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子とが同時に欠失されたマイコバクテリウムであるマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌も提供する。

【0029】

さらに好ましくは、前記マイコバクテリウム遺伝子工学の細菌は、３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子とヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が同時に欠失されたマイコバクテリウムである。

【0030】

さらに好ましくは、前記マイコバクテリウム遺伝子工学の細菌は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子とが同時に欠失されたマイコバクテリウムであることもできる。

【0031】

さらに好ましくは、前記マイコバクテリウム遺伝子工学の細菌は、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子とアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が同時に欠失されたマイコバクテリウムであることもできる。

【0032】

本発明の第４の態様では、ステロイド化合物の製造において、前記マイコバクテリウム遺伝子工学の細菌の応用を提供する。

【0033】

前記ステロイド化合物は、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−１と、４−ジエン−３−オンと、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−エン−３−オン ９αと、 ２２−ジヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−ジエン−３−オンとを含む。

【発明の効果】

【0034】

前記の内容を総合すると、本発明は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子およびアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子を提供し、様々なベクターを構築し、関連する菌株を形質転換させることを通じ、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性とアシル−ＣｏＡチオラーゼ活性がないマイコバクテリウムを含む、さまざまな工学の菌株を得る。これらの工学の細菌を使用すれば、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−１と、４−ジエン−３−オン（１，４−ＢＮＡ）と、２２−ヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−エン−３−オン（４−ＢＮＡ）と９αと、２２−ジヒドロキシ−２３と、２４−ビスノールコレスト−４−ジエン−３−オン（９−ＯＨ−ＢＮＡ）などのステロイド化合物を選択的に製造することができ、ステロイド剤の生産効率を大幅に向上させ、ステロイド剤の生産過程でのエネルギー消費を減少させることとなり、薬剤前駆体の利用率を向上させ、生産段階を簡素化し、生産コストを削減し、反応条件が軽く、環境に優しく、強力に普及して応用することに適して、比較的高い経済効率と社会の効率を有する。これらの潜在力があり、価値がある新規前駆体化合物を簡単な化学手段を経て改造し、副腎皮質系のステロイド剤を生成することができ、特にプロゲステロンを生成することができる。もし普遍化して普及されると、中国の既存の副腎皮質類似製品の生産工程の遅れた現在の状況を大幅に改善するものである。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】微生物がステロールを分解して製造した４−ＢＮＡ、１，４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡ反応式と肝心な酵素模式図である。

【図2】従来の選別技術を応用して、マイコバクテリウム形質転換体について二段階選別を行って、最終的にヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ｈｓｄ４Ａ）欠失菌株を得て、ここで、ＭはＤＮＡ標準マーカー（Ｍａｒｋｅｒ ）であり、 ＤＣＯは、選別された二重交換増幅の結果であり、 ｗｔはノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）していない菌株で、同じプライマーでＰＣＲを行った増幅結果である。

【図3】従来の選別技術を応用して、マイコバクテリウム形質転換 体について二段階選別を通じて、最終的にアシル−ＣｏＡチオラーゼ（ｆａｄＡ５）欠失菌株を得たものであり、ここで、ＭはＤＮＡ標準マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）であり、 ＤＣＯは、選別されたダブルクロス オーバー体の増幅の結果であり、ｗｔはノックアウトしていない菌株で、同じプライマーでＰＣＲを行った増幅結果である。

【図4】マイコバクテリウムＮｗＢ−００は、植物ステロールを形質転換させた結果の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）のスペクトルである。

【図5】ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ欠失工学の菌株が植物ステロールを形質転換させた結果の薄層クロマトグラフィーのスペクトルである。

【図6】ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ欠失工学の菌株が植物ステロールを形質転換させた結果の高速液体クロマトグラフィーのスペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

本発明をさらに容易に理解するために、次の具体的な実施例に結びつけて、より説明する。次の実施例は、本発明を説明するためのもので、本発明の範囲がこれに限定されるものであると理解してはならない。

【0037】

下記の実施例では、具体的な条件を示していない実験方法は、一般に「分子クローン：実験室ハンドブック」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）で記載した条件と同じ通常の条件に基づいて行う。

【0038】

本発明で使用した遺伝子操作技術は、主に無標識酵素の機能不活性技術である。無標識の機能不活性技術で、主に無抗性標識のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子または、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が同時に欠失される方法がある。

【0039】

本発明の実施例で使用された大腸菌ＤＨ５ａ、ｐＭＤ１９−ＴベクターはすべてＮｏｖａｇｅｎ社から購入し、プライマーはすべて大連宝生物（タカラ（Ｔａｋａｒａ））会社で合成したものである。

【0040】

本発明で言うステロイド化合物の基質は、３−オール−５−エンステロイド化合物であり、３−オール−５−エンステロイド化合物である「ステロール」だけの例として、いわゆるステロールは、一般的に動植物に由来し、例えば、コレステロールとフィトステロールがあり、コレステロールは動物の油脂に由来することができるが、フィトステロールは様々に由来し、例えば、植物油加工の過程での脱臭蒸留物、紙パルプ製造工業でのトール油などがあり、フィトステロールは、一般的には混合物であり、通常シトステロールと、スティグマトステロールと、カンペステロールと、ブラシカステロールなどを含む。一部のステロールは、微生物に由来することもあり、例えば、エルゴステロールなどがある。

【0041】

本発明で言うマイコバクテリウムは、病気を起こさない高速成長型のマイコバクテリウムであり、本発明の内容をより容易に理解するために、ネオマイコバクテリウムの中での１つの標準的な菌株ＮｗＢ−００（受託番号：ＡＴＣＣ ２５７９５ ）を具体的な実施例でさらに説明する。次の実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲がこれに限定されるものと理解してはならない。

【0042】

実施例１．マイコバクテリウムＮｗＢ−００によるヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、アシル−ＣｏＡチオラーゼ欠失工学の菌株の構築

【0043】

本実施例は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトを例にして、マイコバクテリウムで一般に使用される相同組換え二重交換ノックアウトの主要な技術手段と方法を説明するとともに、この方法でアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のノックアウトを完成した。マイコバクテリウムの遺伝子ノックアウトはいろいろあるが、ここでは遺伝子ノックアウトの方法を制限することなく、Ｔａｎｙａ Ｐａｒｉｓｈ教授が開発した遺伝子ノックアウトの方法を例にして、ターゲット遺伝子のノックアウトについて例を挙げる（Ｂｈａｖｎａ Ｇｏｒｄｈａｎ ａｎｄ Ｔａｎｙａ Ｐａｒｉｓｈ。Ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ＤＮＡ。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ。２００１、ｐｐ７７−９２）。

【0044】

マイコバクテリウムヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子のノックアウトプラスミドを構築し、前記プラスミドは、電気的形質転換を経て、マイコバクテリウムに入る。カナマイシン（Ｃａｎａｂｉｃｉｎ）とヒグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）を利用して、２つの抗体で選別を行った後、ショ糖プレートを利用して、再度選別し、遺伝子ノックアウトレコン（ｒｅｃｏｎ）を得る。 ＰＣＲ方法を用いて前記レコンを検証する。本発明は、マイコバクテリウムＮｗＢ−００について、それぞれヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子と、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と、３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子と、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の１つまたは２つの遺伝子の欠失を進め、それぞれ六株の異なるマイコバクテリウム菌株を得て、順にＮｗＩＢ−Ｘ０１、ＮｗＩＢ−Ｘ０２、ＮｗＩＢ−Ｘ０３、ＮｗＩＢ−Ｘ０４、ＮｗＩＢ−Ｘ０５、ＮｗＩＢ−Ｘ０６と命名した。

【0045】

ここで、ＮｗＩＢ−Ｘ０１菌株は、ＮｗＢ−００菌株について３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｋｓｈＡ１）とヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｓｄ４Ａ）欠失を進めて得られたものであることから（欠失は前後の順序がなし）、ステロイド母核を分解することができずに、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａである。

【0046】

ＮｗＩＢ−Ｘ０２菌株は、ＮｗＩＢ−Ｘ０１菌株に対して３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ欠失を進めて得られたものであり、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの遺伝子、１つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｋｓｔｄ１）をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１である。

【0047】

ＮｗＩＢ−Ｘ０３菌株は、ＮｗＩＢ−Ｘ０２の誘導菌株であり、ＮｗＩＢ−Ｘ０２菌株の基礎の上、他の２つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ欠失を進めて得られたものであり、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、３つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｋｓｔｄ１＋ｋｓｔｄ２＋ｋｓｔｄ３）をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｋｓｈＡ１＋ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１＋ｋｓｔｄ２＋ｋｓｔｄ３である。

【0048】

ＮｗＩＢ−Ｘ０４菌株は、ＮｗＢ−００菌株について３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子とヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠失を進めて得られたものであり（欠失は前後順序がない）、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、１つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１である。

【0049】

ＮｗＩＢ−Ｘ０５菌株は、ＮｗＩＢ−Ｘ０４の誘導菌株であり、ＮｗＩＢ−Ｘ０４菌株に対して他の２つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失を進めて得られたものであり、１つのヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子、３つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｈｓｄ４Ａ＋ｋｓｔｄ１＋ｋｓｔｄ２＋ｋｓｔｄ３である。

【0050】

ＮｗＩＢ−Ｘ０６菌株は、ＮｗＢ−００菌株について３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子とアシル−ＣｏＡチオラーゼ欠失を進めて得られたものであり、１つの３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子と１つのアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子をノックアウトさせたことを意味し、すなわち、ｋｓｈＡ１＋ｆａｄＡ５である。

【0051】

ここで、３−ケトステロイド−９α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ｋｓｈＡ１）の配列とノックアウト方法について、具体的なことは、出願番号Ｎｏ：２００９１００５１６１３．７の特許明細書を参照することができ、これに対して、繰り返して記述しない。

【0052】

ここで、ｋｓｔｄ１、ｋｓｔｄ２、ｋｓｔｄ３の３つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼは、イソ酵素であり、配列が似ており、この配列とノックアウト方法について、具体には、出願番号Ｎｏ：２００９１００５１６１５．６の特許明細書をことができ、これに対して、繰り返して記述しない。

【0053】

１．１．ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流下流の配列の取得およびノックアウトプラスミド構築

【0054】

マイコバクテリウムＮｗＩＢ−００に対して、全ゲノム配列決定を行い、その配列情報に基づいて、ゲノム注釈情報で検索を行い、報告された類似菌株遺伝子クラスター情報に合わせて、マイコバクテリウムヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子に対応する完全なリーディングフレーム配列を見つけて、追跡してヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流及び下流に隣接する配列を得た。上流及び下流の配列に基づいて、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子ノックアウトの上流及び下流プライマーを、ソフトウェアＯｌｉｇｏ ６．０及びＰｒｉｍｅｒ ５．０を用いて設計する：

【0055】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｕＦ：ＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＣＧＡ

【0056】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｕＲ：ＴＣＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＣＴＴＴＣＣＧＧＡＣＡＧＧ

【0057】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｄＦ：ＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＧＴＧＴＡＣＧ

【0058】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ｄＲ：ＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＣＧＴＴＧＡＴＧＡＡ

【0059】

Ｍ．ｎｅｏａｕｒｕｍ ＮｗＩＢ−００ゲノムを鋳型としてＰＣＲ増幅して、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流及び下流の断片を獲得し、また標的遺伝子の上流および下流遺伝子をそれぞれｐＭＤ１９−Ｔベクターにクローニングした後、それぞれＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、消化産物を、それぞれ対応する消化されたマイコバクテリウム遺伝子ノックアウトプラスミドｐＮＬに結合させる。前記プラスミドとｐＧＯＡＬ１９プラスミドをそれぞれＰａｃＩで消化した後、非方向性ライゲーションを行って、遺伝子ノックアウトプラスミドＱＣ−ｈｓｄ４Ａを構築した。

【0060】

１．２．アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の上流及び下流配列の獲得及びノックアウトプラスミドの構築

【0061】

実施例１．１の方法によって、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子（ｆａｄＡ５）ノックアウトの上流及び下流プライマーを設計する：

【0062】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ｕＦ：ＧＣＧＣａａｇｃｔｔＧＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧ

【0063】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ｕＲ：ＴＡＴＡｇａａｔｔｃＧＴＡＣＴＧＧＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧ

【0064】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ｄＦ：ＧＣＧＣｇａａｔｔｃＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＧ

【0065】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ｄＲ：ＴＡＴＡｇｃｇｇｃｃｇｃＧＧＴＣＧＣＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＧＧＧＡＴＣＴＴ

【0066】

ＮｗＩＢ−００ゲノムを鋳型としてＰＣＲ増幅して、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の上流及び下流の断片を獲得し、また標的遺伝子の上流および下流遺伝子をそれぞれｐＭＤ１９−Ｔベクターにクローニングした後、それぞれＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩで消化し、消化産物を、それぞれ対応する消化されたマイコバクテリウム遺伝子ノックアウトプラスミドｐ２ＮＩＬに結合させる。ＰａｃＩで前記プラスミドとｐＧＯＡＬ１９プラスミドを消化した後、非方向性ライゲーションを行って、遺伝子ノックアウトプラスミドＱＣ−ｆａｄＡ５を構築した。

【0067】

１．３．マイコバクテリウムコンピテントセルのノックアウトプラスミド形質転換

【0068】

マイコバクテリウムコンピテンスの調製：１次種のＯＤが０．５〜１．５程度まで増殖し、５％〜１０％を２次種に伝達し、１４〜２４時間後、２％のグリシンを添加して、約２４時間培養を続ける。遠心分離で菌体を収集し、４回に分けて１０％のグリセリンで懸濁した細胞をすすぎ、遠心分離し、最後に１ｍｌのグリセリンを入れて菌体を懸濁させ、パッケージして保存する。

【0069】

電気的形質転換：１０μｌのアルカリ溶解処理した前記プラスミドを１００μｌのコンピテンス菌体に入れて、１５分間放置し、感電条件は、２．５ｋｖ／ｃｍ、２５μＦ、２０ｍｓである。

【0070】

１．４．組換えのスクリーニングと検証

【0071】

電気的形質転換産物を培地に入れて、３〜２４時間の培養を回復し、培地（培地成分：５０μｇ／ｍｌのｈｙｇ、２０μｇ／ｍｌのＫｎ、５０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ）に塗布し、３０℃で静かに放置して３〜７日間培養し、青いスポットのコロニーを選んで、ＰＣＲ検証をした。検証された単一交換（ＳＣＯ）菌を２％のショ糖プレートに塗布し、３０℃で静かに放置して３〜７日間培養し、白いコロニーを選んで、ＰＣＲ検証をした。

【0072】

組換えの検証：単一交換および二重交換のＰＣＲ分析を含み、検証原理は、前述した引用文献に記載された通りであり、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子ノックアウト検証プライマーは、以下のように示す：

【0073】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ＹＺ−Ｆ：ＡＣＧＴＡＧＡＡＧＴＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＴＧ

【0074】

Ｑ−ｈｓｄ４Ａ−ＹＺ−Ｒ：ＴＡＧＴＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＧＴＧＡＡＴＡＴＧ

【0075】

検証結果は、図２に示した通りであり、失敗したノックアウトヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子の菌株理論は、約１２００ｂｐの大きさのバンドしか確認されず；ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子二重交換（ＤＣＯ）理論は、約５００ｂｐの大きさのバンドのみ確認された。ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子単一交換（ＳＣＯ）理論は、２つの大きさが、５００ｂｐと１２００ｂｐ程度のバンドで確認され、ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子が既に成功的にノックアウトし、元の酵素の機能を破壊したことを表示する。

【0076】

アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子ノックアウト検証プライマーは、以下のように示す：

【0077】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ＹＺ−Ｆ：ＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＡＧＣＣ

【0078】

Ｑ−ｆａｄＡ５−ＹＺ−Ｒ：ＡＴＣＣＧＧＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＴＧＧＡＡＴ

【0079】

検証結果は、図２に示した通りであり、ノックアウトしなかったアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子の菌株理論は、約１３００ｂｐの大きさのバンドしか確認されず；アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子二重交換（ＤＣＯ）理論は、約５００ｂｐの大きさのバンドしか確認されず、アシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が既に成功的にノックアウトし、元の酵素の機能を破壊したことを表示する。

【0080】

実施例２：マイコバクテリウムＮｗＩＢ−００によるステロイド化合物に対する形質転換及び結果の分析方法

【0081】

１％〜１０％の界面活性剤、ポリマーまたは有機溶媒（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、エタノール、シリコーンオイル、大豆油等）等の物質を用いて、ステロール基質に対して可溶化する。二次または三次培養を利用して、５％〜１０％の種で最終的な形質転換培地に接種し、ステロール基質は、いずれの時間にも添加することができる。ステロール形質転換の条件は、２５〜３７℃の培養温度、溶存酸素値、ｐＨは、５．０〜８．０の間に制御することができ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）またはガスクロマトグラフィー（ＧＣ）で形質転換反応の終了時間を分析し、確定することができる。反応終了後、ステロール形質転換物は、同じ体積の酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒で３回抽出することができ、反応液を合併し、真空乾燥し、次いで分析し及び生成物を調製できる。

【0082】

マイコバクテリウムＮｗＩＢ−００形質転換植物ステロールを、振とうフラスコで培養し、５％〜１０％のＴｗｅｅｎ８０またはシリコーンオイルを用いて、植物ステロールの溶媒とし、３０ｍＬの試料量を持つ２５０ｍＬの振とうフラスコに、二次培養を利用して、５％〜１０％の種量を０．４〜２ｇ／ｌの植物ステロール濃度を含む二次培地に接種し、２６〜３５℃、２００〜３００ｒｐｍ、ｐＨ５．０〜８．０の間の条件で培養し、３〜７日間を経て、酢酸エチルで振とうして、抽出し、有機相は、ＴＬＣ及びＧＣ等の方法でステロール形質転換の様子を検出した。

【0083】

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）の操作条件は、展開溶媒は、石油エーテル：酢酸エチル（６：４ないし７：３）、薄型板は、煙台シリコン工場の製品である５×１０ｃｍのプレハブパネルを使用し、色は、２０％の硫酸溶液を均一に吹き付け、１０５℃のオーブンで５分〜１０分間焼くと、観察後に斑点が見える。

【0084】

マイコバクテリウムＮｗＩＢ−００形質転換植物ステロールの結果は、図４に示した通りである。マイコバクテリウムＮｗＩＢ−００は、植物ステロールを完全に分解し、代謝することができ、１，４−ＢＮＡ、４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡ等の産物を蓄積しない。

【0085】

実施例３：遺伝子工学的細菌ＮｗＩＢ−Ｘ０１、ＮｗＩＢ−Ｘ０２、ＮｗＩＢ−Ｘ０３、ＮｗＩＢ−Ｘ０４、ＮｗＩＢ−Ｘ０５、ＮｗＩＢ−Ｘ０６が、ステロール分解して、１，４−ＢＮＡ、４−ＢＮＡ、９−ＯＨ−ＢＮＡの精製中の応用

【0086】

遺伝子工学的細菌株の培養条件とステロールの形質転換条件は、実施例２を参照することができる。振とうフラスコ（３０ｍｌの液／２５０ｍｌの振とうフラスコ）に植物ステロールを基質として、試料投入量が０．５〜５％である条件の下で、形質転換時間が５〜１０日であり、工程菌株形質転換植物ステロールの結果は、図５と図６に示した通りである。

【0087】

遺伝子工学的細菌ＮｗＩＢ−Ｘ０１がステロール形質転換分解する同時に、１，４−ＢＮＡと４−ＢＮＡを生成し、ここで、１，４−ＢＮＡの産物を主にし、ＮｗＩＢ−Ｘ０２がステロール形質転換分解する同時に、１，４−ＢＮＡと４−ＢＮＡを生成するが、菌株の中の１つが３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失のため、主に４−ＢＮＡ生成し、ＮｗＩＢ−Ｘ０３がステロール形質転換分解する同時に、４−ＢＮＡと９−ＯＨ−ＢＮＡを生成し、菌株中の３つの３−ケトステロイド−△^１−デヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失のため、ＮｗＩＢ−Ｘ０２菌株に比べて、４−ＢＮＡが主な産物である。遺伝子工学的細菌ＮｗＩＢ−Ｘ０６は、ステロール分解形質転換することができ、１，４−ＢＮＡと４−ＢＮＡを精製する他に、部分的にアンドロスト−４−エン−３，１７−ジオン（ＡＤ）と、アンドロスト−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）を生成することができる。

【0088】

遺伝子工学的細菌ＮｗＩＢ−Ｘ０４がステロール形質転換分解して、主に、９−ＯＨ−ＢＮＡを精製することができ、９−ＯＨ−ＢＮＡ以外には、部分的に９α−アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン（９−ＯＨ−ＡＤ）を精製することができ、ＮｗＩＢ−Ｘ０５も同様にステロール分解形質転換して、９−ＯＨ−ＢＮＡを精製することができる。

【0089】

要約すると、本発明のヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子及び／またはアシル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子が構築したマイコバクテリウム遺伝子工学的細菌を利用して、選択的に２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビス−コレステリル−１，４−ジエン−３−オン、２２−ヒドロキシ−２３，２４−ビス−コレスト−４−エン−３−オン ９α，２２−ジヒドロキシ−２３，２４−ビス−コレスト−４−ジエン−３−オンのステロイド化合物を精製することができ、これらの産物は、産業上副腎皮質ステロイド薬物の精製に応用され、部分的に現在のジオスゲニンを原料として、ジエンを経て副腎皮質ホルモンの精製する工程に替わることができ、ステロール薬物の精製効率を大幅に向上し、ステロール薬物の精製工程中のエネルギーと材料の消費の削減に役立ち、精製段階を簡単化し、生産費用を減らす。

【0090】

上述したのは、単なる本発明の好ましい実施例であり、本発明の範囲を限定するためであり、本発明の前記実施例は、また様々な変化をすることができる。即ち、本発明の請求した特許請求の範囲及び本出願の明細書の内容に従って行われる簡単で、均等な変化及び修正は、全て本発明の特許請求の範囲内に含まれる。本発明の詳細に説明されていないのは、全て従来の技術の内容である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【国際調査報告】