特表 2017-537981 リン酸カルシウムナノ粒子封入医薬用半固体ゲル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2017-537981(P2017-537981A)

(43)【公表日】2017年12月21日

(54)【発明の名称】リン酸カルシウムナノ粒子封入医薬用半固体ゲル

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/06 20060101AFI20171124BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20171124BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20171124BHJP

   A61K 47/38 20060101ALI20171124BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20171124BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20171124BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALN20171124BHJP

   A61P 27/06 20060101ALN20171124BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/06

   A61K47/02

   A61K47/36

   A61K47/38

   A61K47/32

   A61K45/00

   A61K31/5377

   A61P27/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】41

(21)【出願番号】特願2017-550082(P2017-550082)

(86)(22)【出願日】2015年12月9日

(85)【翻訳文提出日】2017年8月4日

(86)【国際出願番号】US2015064817

(87)【国際公開番号】WO2016094571

(87)【国際公開日】20160616

(31)【優先権主張番号】62/089,234

(32)【優先日】2014年12月9日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517204483

【氏名又は名称】ベルモント ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】リード，ケネス ダブリュ．

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076BB01

4C076BB24

4C076BB29

4C076BB30

4C076CC10

4C076CC50

4C076DD26M

4C076EE10P

4C076EE32P

4C076EE36P

4C076EE37P

4C076FF31

4C084AA17

4C084MA28

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA58

4C084MA60

4C084NA12

4C086AA02

4C086BC85

4C086GA09

4C086GA10

4C086MA05

4C086MA28

4C086MA58

4C086NA12

4C086ZA33

(57)【要約】

本開示は、概して、改良された薬剤放出性、滞留性、および審美性を示す、リン酸カルシウムナノ粒子封入医薬用半固体ハイドロゲルを与える。ハイドロゲルは、薬剤分子の局所適用に特に有用である。本開示は、１種以上の薬剤を含有する医薬用半固体ハイドロゲルを製造すること、および前記ハイドロゲルを必要とする対象に投与することによって、薬剤を投与する方法にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ハイドロゲル、およびリン酸カルシウムナノ粒子を含んでなる医薬組成物。

【請求項2】

前記ハイドロゲルが、カルボキシレート、カルボニル、アミン、およびそれらの混合からなる群から選択される官能基を有するポリマーを含んでなる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ハイドロゲルが、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カーボポール（架橋ポリアクリレート）、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物を含んでなる、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ハイドロゲルが、カルボキシメチルセルロースまたはカーボポールを含んでなる、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記リン酸カルシウムナノ粒子中のＣ対Ｐの数の比が１：１〜３：１に及ぶ、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記リン酸カルシウムが、リン酸三カルシウムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記リン酸カルシウムが、第二リン酸カルシウム二水和物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記リン酸カルシウムナノ粒子が、約５〜約２００ｎｍに及ぶサイズを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記リン酸カルシウムナノ粒子が、約１０〜約１００ｎｍに及ぶサイズを有する、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記リン酸カルシウムナノ粒子が、約１０〜約８０ｎｍに及ぶサイズを有する、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記リン酸カルシウム粒子が、約１０〜約１００ｍ^２／ｇｍに及ぶ表面積を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記リン酸カルシウム粒子が、約３０〜約６０ｍ^２／ｇｍに及ぶ表面積を有する、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

約０．１重量％〜約５重量％のカルシウムナノ粒子を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物の重量で、約０．５％〜約５％のカルシウムナノ粒子を含んでなる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記組成物の重量で、約０．５%〜約２％のカルシウムナノ粒子を含んでなる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項16】

カルボキシレート、カルボニル、アミン、およびそれらの混合からなる群から選択される官能基を有するポリマーを、前記組成物の重量で約０．２％〜約５％含んでなる、請求
項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記ハイドロゲルが、前記組成物の重量で、約０．５%〜約２％のポリマーを含んでなる、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

薬剤をさらに含んでなる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

薬剤を前記薬剤を必要とする患者に投与する方法であって、
請求項１８に記載の組成物を準備すること、および
前記組成物を前記患者に投与すること、
を含んでなる前記方法。

【請求項20】

前記投与が、局所、眼内、経口、直腸内、または膣内である、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１２月９日に出願された米国仮出願第６２／０８９，２３４号の優先権の利益を主張し、その内容を、その全体で、本明細書の一部を構成するものとして援用する。

【0002】

本開示は、概して、改良された薬剤放出性、滞留性、および審美性を示す、リン酸カルシウムナノ粒子封入医薬用半固体ハイドロゲルに関する。ハイドロゲルは、薬剤分子の局所適用に特に有用である。

【背景技術】

【0003】

眼用ベータ遮断薬は、開放隅角緑内障の初期治療に一般に使用される。粘性が低い眼用マレイン酸チモロール溶液の使用は、前角膜領域からの製剤の急速な除去をもたらす。通常、５％未満のチモロールが、眼内組織に実際に達する。これらの特徴により、一日に二度という頻回投与が推奨される。薬剤吸収は、前角膜領域からのチモロールの排液後、鼻涙管を介して起こり、そして、このことにより、全身に吸収される可能性が増す。結果として生じる全身性ＣＶベータ遮断効果は、徐脈、心ブロック、心不全、および喘息を引き起こし得る。マレイン酸チモロールの使用から最初の７年間に、３２の死亡が報告された。薬剤放出速度が低下した眼用薬剤送達システムは、投与頻度の減少、薬剤有害事象の減少、必要な薬剤濃度の低下、忍容性の向上、およびチモロールなどの眼用製剤の患者の服用順守の改善をもたらし得る。眼用ゲルは、眼内の薬剤の滞留時間を延ばすこと（角膜の接触を増加させること）、および体循環への薬剤吸収量を減少させることにより、眼内薬剤送達の改善を可能にし得る。これらの特性は、溶液と比較して、ゲルの粘性が高いことに起因する。また、ゲルからの薬剤放出は、溶液の剤形と比較して、緩徐であると考えられている。これらの特性は、その他の局所用製剤においても同様に有利であろう。

【0004】

第二リン酸カルシウム二水和物［７７８９−７７−７］は、多年にわたり、錠剤およびカプセル希釈剤として使用されてきた（Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed. 2000 American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. CD-ROM）。リン酸カルシウムは、その良好な結合特性、流動性、低コスト、化学的純度、および薬剤との相溶性のため、医薬用錠剤充填剤および結合剤として有用である。

【0005】

医薬用錠剤化に有用なリン酸カルシウムには、第二リン酸カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ_４・Ｈ２０；ＤＣＰまたはＤＣＰＤ）、第二リン酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ_４；ＤＣＰＡまたはＡＣＰ）、およびヒドロキシアパタイト（Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ＯＨ”；ＨＰまたはＨＡＰまたはＨＡ）が含まれる。（Calcium phosphates in pharmaceutical tableting.（Physico-pharmaceutical Propeties by P.C. Schmidt and R. Herzog. Pharmacy World & Science, 15(3):105-115, 1993.）

【0006】

第二リン酸カルシウム二水和物は、一般に、非毒性で非刺激性の材料とみなされている（ＧＲＡＳのリストに記載されている）。第二リン酸カルシウム二水和物は、ＦＤＡ非活性成分ガイド（Inactive Ingredients Guide）（経口カプセルおよび錠剤）、ならびに欧州、英国、および米国において認可された非経口的でない医薬に含まれている。しかしながら、大量の経口摂取は、腹部不快感を引き起こし得る。

【0007】

リン酸カルシウムは、ＵＳＰにより規定されているように、水に不溶である。（Physical and Chemical Properties of Calcium Phosphates for Solid State Pharmaceutical
Formulations by J.R. Carstensen and C. Ertell. Drug Development and Industrial
Pharmacy, 16(7):1121-1133, (1990).）リン酸二カルシウムは、低いｐＨ値でのみ可溶であるが、生理的ｐＨで不溶である（１００ｇｍの水に０．００２ｇ）。通常、リン酸カルシウムは、ｐＨ環境が６．５未満で下回るにつれて、溶解性が増す。（Calcium Phosphate Nanocomposite Particles for In Vitro Imaging and Encapsulated Chemotherapeutic Drug Delivery to Cancer Cells by Mark Kester et.al., Nano Letters, 8 (12):4116-4121, (2008).）

【0008】

リン酸カルシウムは、骨および歯のエナメル質の主成分でもあり、骨および歯のエナメル質の主要成分である、非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）および結晶性ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）の形態で見られる。また、Ｃａ^２＋およびＰＯ_４^３−の両方は、通常１〜５ｍＭという比較的高い濃度で血流に見られる。Encapsulation of Organic Molecules
in Calcium Phosphate Nanocomposite Particles for Intracellular Imaging and Drug
Delivery by Thomas T. Morgan et.al., Nano Letters, 8 (12):4108-4115, (2008).）生体鉱物として、ＣＰは、腎臓を介して制御される溶解物質と共に、安全に体内分布する。ＣＰは、生理的ｐＨで比較的不溶であるが、体内、例えばリソソーム内で生じ得る酸性環境で溶解性が増す。リン酸カルシウムナノ粒子を運ぶエンドソームがリソソームと融合するときに、リン酸カルシウムナノ粒子は、低いｐＨに晒されて、溶解すると考えられている。

【0009】

ＨＰおよびＤＣＰは、飽和塩水に懸濁された場合に、それぞれ、６．６および６．０のｐＨ値を与えることが分かった。ＨＰに関するゼータ電位は、イオン強度が０．１５４のｐＨ６．６の媒質中で約＋１３ｍＶであることが測定された。ＤＣＰに関するゼータ電位は、イオン強度が０．１５４のｐＨ６．０の媒質中で約＋３ｍＶであることが測定された。^（Effect of Two New Polysaccharides on Growth, Agglomeration and Zeta Potential of Calcium Phosphate Crystals by E.R. Boeve et.al. The Journal of Urology, 155:368-373, 1996.）ゼータ電位は、（ずり面またはすべり面と呼ばれる）強固に結合している層の表面と溶液の電気的中性な領域との間の電位差として定義される。

【0010】

おそらく、正電荷のＨＰおよびＤＣＰ粒子は、ＯＨ⁻基をすべり面に強く引き付けることによって、塩水のｐＨを減少させる。ナノメーターサイズの粒子は、特に高いイオン強度で、分散しにくいことがよくある。おそらく、低いゼータ電位は、これらの凝集体の形成を促進する。

【0011】

ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に関するゼータ電位は、純水中で−２〜−１０ｍＶとして測定された。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）に関するゼータ電位は、ＨＡ粒子にクエン酸ナトリウムが吸着することによって、約−４５〜−５０ｍＶの値に増加した。そして、このことにより、粒子間の引力が減少し、ダイラタント流動性の減少が測定される。^（Ionic modification of calcium phosphate cement viscosity. Part I:hypodermic injection and strength improvement of apatite cement by Uwe Gbureck et.al., Biomaterials, 25:2187-2195 (2004）.ＨＡへのクエン酸塩の吸着は、カルボン酸クエン酸基の存在によるものであると推定し得る。

【0012】

純水中のリン酸二カルシウム無水物（ＤＣＰＡ）に関するゼータ電位は、純水中で−１５〜−１８ｍＶとして測定された。以下から分かるように、ゼータ電位は、リン酸ナトリウムの存在下で、ｐＨが増加するとともに、増加した。抗生物質の添加により、ＤＣＰＡおよびヒドロキシルアパタイト（ＨＡ）の両方でゼータ電位は変化し、これは、表面への結合が起こったことを示す。^（20Surface properties of calcium phosphate particles for self setting bone cements by U. Gbureck et.al., Biomolecular Engineering, 19:51-55 (2002).）

【0013】

前述の研究と一致して、リン酸チタンカルシウム粒子（ＣＴＰ）およびヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡＰ）に関するゼータ電位は、ｐＨの増加とともに増加した。（Calcium phosphate-alginate microspheres as enzyme delivery matrices by CC. Ribeiro et.al., Biomaterials, 25:4363-4373 (2004).）

【0014】

ハイドロゲルは、水溶性ポリマーの３次元架橋ネットワークである。ゲルに空隙があることにより、薬剤はゲルマトリックスに封入され得、続いて、ゲルネットワークにより、小分子または巨大分子の拡散係数に依存した速度で、薬剤放出が起こる。薬剤をゆっくりと溶出し、周辺組織で薬剤の高い局所濃度を長期間維持するデポー製剤が製造される。ハイドロゲルの水含有量が多いことにより、生体適合性が促進される。従って、ハイドロゲルは、特に眼内投与では、有利な剤形であることが分かる。

【0015】

通常、直鎖状ポリマーマトリクスからの薬剤放出速度は、その粘性に反比例する。 （Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges by Todd R. Hoare and Daniel S. Kohane, Polymer 49:11993-2007 (2008).）このことにより、所望の持続放出を与えるために、加工を難しくする非常に大きな粘性が必要であり得るという難点が生じる。架橋していない水溶性ポリマーハイドロゲルは、膨張し、続いて、生体内の環境で水に溶解する。（Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges by Todd R. Hoare and Daniel S. Kohane, Polymer 49:11993-2007 (2008).）従って、ポリマーが架橋され得る場合は、ポリマーは、眼の領域などの生体内の環境で、より長く留まる可能性がある。

【0016】

異なるポリマー間の架橋は、粘弾性を有し、時には純粋な弾性を有するネットワークを与える。ポリマーは、化学的にのみならず、物理的に架橋され得る。例えば、アルギン酸塩は、イオン相互作用により、例えばカルシウムイオンを介して架橋され得る。「金属イオンと架橋されている陰イオンポリマーに加えて、ハイドロゲルは、多価陰イオンと多価陽イオンの複合体形成によっても得られ得る。イオンで架橋されたキトサンハイドロゲルは、キトサンと硫酸デキストランまたはポリリン酸などの多価陰イオンとの間の複合体形成により形成される。」（Novel Crosslinking methods to design hydrogels by W.E. Hennink and C.R. van Nostrum, Advanced Drug Delivery Reviews 64:223-236 (2012）。)

【0017】

水溶性が低い薬剤であるイブプロフェンの放出制御錠剤が、製造され、イブプロフェンの放出について試験された。「ｐＫ_ａが６±０．５より高いｐＨ環境に晒した場合に、カーボポールは非常に膨張する。急速なゲル形成は、カルボキシレート基がイオン化し、それによって負の粒子間の反発が起こり、ポリマーがさらに膨張することが原因であり得る。この膨張は、薬剤の放出の制御に関与すると考えられる。」（Controlled Release Oral Delivery System Containing Water Insoluble Drug by Panna Thapa et.al., Kathmandu University Journal of Science, Engineering and Technology 1(1):1-10 (2005).）放出の研究は、（ＤＣＰ錠剤濃度が同時に減少しながら）カーボポールの濃度が増加するほど、放出速度は、ゆっくりとなり、より比例するようになることを示した。著者は、「このことの原因は、錠剤の周囲に形成されたゲル層が、より強固になり、ミクロゲル間の格子空間が少ないことにあり得る」と述べた。

【0018】

要約すれば、医薬用担体組成物を与えるために、改良された粘性、屈曲性、および薬剤放出性を有し、ならびに改良された美観を有するハイドロゲル製剤を与えることが、有用であり得る。このような組成物は、様々な医薬製剤、特に局所用製剤を与えるために有用であり得る。

【発明の概要】

【0019】

本開示は、ゲルの屈曲性および粘弾性を高めるために、リン酸カルシウムナノ粒子がハイドロゲルに添加されている医薬組成物を与える。このことは、活性薬剤分子のより持続性の制御可能な徐放をもたらすことが、予想される。また、ゲルは、透明であり、そのため局所用剤形として（特に眼用剤形として）より許容可能なものであるべきである。本明細書に記載のゲルは、眼以外の局所に（例えば皮膚に局所的に）適用されるゲル用に見た目にもより好ましいものであるべきである。さらに詳細には、このような組成物は、眼用途用に特に有利であり得る。このような製剤は、その他の形式の投与、例えば、経口投与、皮膚（真皮）への局所的投与、直腸内投与、および膣への適用にも有用であり得る。

【0020】

従って、本開示は、ハイドロゲルおよびリン酸カルシウムナノ粒子を含んでなる医薬組成物を与える。特定の実施形態において、ハイドロゲルは、カルボキシレート、カルボニル、アミン、およびそれらの混合からなる群から選択される官能基を有するポリマーを含んでなる。本開示に有用なハイドロゲルの例として、限定はされないが、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カーボポール（架橋ポリアクリレート）、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物が挙げられる。

【0021】

リン酸カルシウムナノ粒子は、大きさが約５〜約２００ｎｍ、より詳細には、約１０〜約１００ｎｍ、さらにより詳細には、約１０〜約８０ｎｍに及ぶ。

【0022】

いくつかの実施形態において、組成物は、組成物の重量で、約０．１％〜約５％のカルシウムナノ粒子を含んでなる。

【0023】

本開示は、薬剤を、前記薬剤を必要とする患者に投与する方法であって、ハイドロゲル、リン酸カルシウムナノ粒子、および薬剤を含んでなる医薬組成物を準備すること、ならびに前記患者に前記組成物を投与することを含んでなる前記方法を、さらに与える。

【0024】

上記の概要および以下の詳細な説明は、両方とも、本開示の実施形態を与え、本開示の性質および特徴を、クレームされている通りに理解するための概要または骨子を与えることが意図されていることが、理解されるべきである。説明は、クレームされている対象の原理および作用を説明する役割を果たす。本開示のその他の特徴および利点は、当業者には、以下の開示を読んだ上で、容易に明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】様々な濃度での２９５λでのマレイン酸チモロール標準吸光度曲線のグラフである。方程式は、ｙ切片を無理にゼロに合わせてはおらず、ｒ^２値が０．９９９９であった。実験サンプル中のマレイン酸チモロールの濃度を、この標準吸光度曲線を用いて求めた。

【図2】１％カーボポール９８０ゲルからの典型的なチモロール放出性の代表的なサンプルを個々のデータポイント（８５対と共に示す、シグモイドフィットを有するグラフである。

【図3】図２に示した典型的なチモロール放出性のグラフであり、フィットおよびデータは、時間ではなくｌｏｇ（時間）をＸ軸として示されている。

【図4】放出の線形性を調べるための１つのアプローチを示すグラフであり、曲線の直線部分は、放出速度の尺度として調べた。線形回帰を使用して、初期データ対をフィットさせた。

【図5】チモロール放出の線形性を調べるためのチモロール放出の別のアプローチに関して、初期の線形およびシグモイドフィットの比較を示すグラフである。

【図6】代表的なチモロール−ゲル−リン酸カルシウムナノ粒子製剤に関して、シグモイドフィットの線形特性を示すグラフである。

【図7】代表的なチモロール−ゲル−リン酸カルシウムナノ粒子製剤に関して、直線値からの差の一次導関数を時間に対してプロットするグラフである。

【図8】代表的なリン酸カルシウムナノ粒子製剤からのチモロール放出に関して、近似曲線の比較を示すグラフである。

【図9】代表的なリン酸カルシウムナノ粒子製剤からのｌｏｇ時間で示されたチモロール放出に関して、近似曲線の比較を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

詳細な説明
ここで、本開示の実施形態に関して、詳細に言及していくが、これらの実施形態の１つ以上の実施例は、後述する。各実施例は、本開示の組成物の説明として与えられており、限定するものではない。実際、様々な修正および変形が、本開示の範囲または精神から逸脱することなく、本開示の教示に対してなされ得ることが、当業者には明らかであろう。例えば、１つの実施形態の一部として図示または記載されている特徴は、別の実施形態と共に使用されて、さらなる他の実施形態を生じ得る。

【0027】

従って、本開示は、添付の請求項およびそれらの均等物の範囲内に入るこのような修正および変形を包含することが、意図されている。本開示の他の対象、特徴、および態様は、以下の詳細な説明において開示され、以下の詳細な説明から明らかである。本考察は、例示的な実施形態を説明するだけのものであり、本開示のより幅広い態様を限定することを意図されてはいないことが、当業者に理解されるべきである。

【0028】

特定の理論に拘束されることはないが、当該ハイドロゲル中のリン酸カルシウムナノ粒子の添加は、ゲルの屈曲性および粘弾性を高めると考えられている。このことは、活性薬剤分子のより持続性の制御可能な徐放をもたらすことが、予想される。また、ゲルは、透明であり、そのため局所用剤形として（特に眼用剤形として）より許容可能なものであるべきである。本明細書に記載のゲルは、眼以外の局所に（例えば皮膚科学的に）適用されるゲル用に見た目にもより好ましいものであるべきである。この種類のゲルは、経口投与もされ得ることが予想される。

【0029】

本開示は、ハイドロゲルおよびリン酸カルシウムナノ粒子を含んでなる医薬組成物を与える。当該医薬組成物は、薬剤用担体として有用である。
リン酸カルシウムの選択（表面相互作用）：

【0030】

リン酸カルシウム（ＣａＰ）粒子は、カルボキシレート、カルボニル、およびアミン官能基と相互しやすいことが文献で示されていた。この相互作用は、形成結合および配位錯体と見なされるのに十分な強度であった。網羅的なリストではないが、リストされた文献のレビューは、リン酸カルシウム表面相互作用が、抗生物質、コラーゲン、ヘパリン類似体、クエン酸ナトリウム、ウシ血清アルブミン、ゼラチンの両方の種類、タンパク質、ヒアルロン酸、アルギン酸、ＤＮＡ、および炭酸阻害剤で生じることが分かったことを示している。理論に拘束されることはないが、ＣａＰは、適切な官能基が利用可能であるならば、低または高分子量分子との静電型の表面相互作用を受けやすいようである。リン酸カルシウムの広範囲に及ぶ吸着性を考慮すると、ＣａＰ ＮＰ−ポリマー相互作用が起こるようにするために必要とされるのは、リストされた官能基に限らない。むしろ、リストされた官能基は、ＣａＰ ＮＰ−ポリマー相互作用の形成に有利なものとして考えられるべきである。

【0031】

リン酸カルシウムの形態の選択
いくつかの実施形態におけるリン酸カルシウムナノ粒子中のＣ対Ｐの数の比は、１：１〜３：１に及ぶ。一実施形態において、リン酸カルシウムの形態は、第二リン酸カルシウム二水和物（ＣａＨＰＯ_４・Ｈ２０）である。別の実施形態において、リン酸カルシウム
の形態は、リン酸三カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）であり、これはナノメートルサイズで利用しやすいからである。リン酸カルシウムの好ましい形態には、第二リン酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ_４）およびヒドロキシルアパタイト（Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ＯＨ）が含まれ、これは、それらが一般的に医薬用に用いられているためである。ｐＨが６．５〜８．０で不溶である全てのリン酸カルシウム（カルシウム原子とリン原子との間の化学結合，リン原子は酸素原子とさらに結合しており、酸素原子は水素と結合していても結合していなくてもよい）は、本明細書に記載の医薬組成物に適当であると考えられる。

【0032】

リン酸カルシウムナノ粒子の選択（安全性）：
リン酸カルシウムは、医薬品に安全に使用されてきた長い歴史があり、体内に通常存在し、リン酸カルシムナノ粒子（ＣａＰ ＮＰ）は安全であると一般に認めらえている。ＣａＰ ＮＰが細胞に取り込まれる場合、ＣａＰ ＮＰはリソソーム内で可溶であり、体内に内生的に存在する元素であるＣａおよびＰに変換されるはずである。

【0033】

ナノ粒子の選択（物性）：
分離したナノ粒子は、水に分散されているときに、透明であると考えられている。このことにより、眼に投与されたときに、かすみ目になりにくい。また、皮膚科用剤形として用いられる場合に、見た目にもより好ましいはずである。膜形成帯具として皮膚科用剤形を用いる場合、透明性により、保護膜（帯具）を取り外すことなく、創傷および擦傷の視診が可能になる。

【0034】

いくつかの実施形態において、リン酸カルシウムナノ粒子は、約５ｎｍ〜約２００ｎｍに及ぶサイズを有する。他の実施形態において、リン酸カルシウムナノ粒子は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍに及ぶサイズを有し、一方で、さらなる他の実施形態において、リン酸カルシウムナノ粒子は、約１０〜約８０ｎｍに及ぶサイズを有する。

【0035】

当該組成物に有用なリン酸カルシウムナノ粒子は、医薬品産業で使用される標準的なリン酸カルシウムと比較して、表面積が大きい。例えば、いくつかの実施形態において、リン酸カルシウム粒子は、約１０ｍ^２／ｇｍ〜約１００ｍ^２／ｇｍに及ぶ表面積を有し、一方で、他の実施形態において、リン酸カルシウム粒子は、約３０〜６０ｍ^２／ｇｍに及ぶ表面積を有する。

【0036】

実際に、ナノ粒子は、ミクロン範囲またはそれ以上の粒子と比較して、表面積が大幅に増加している（以下参照）。リン酸三カルシウムのナノ粒子（１０〜８０ナノメートル）の表面積は、市販の錠剤化グレードの第二リン酸カルシウム二水和物について示されている０．４４〜０．４６ｍ^２／ｇｍの表面積と比較して、３０〜６０ｍ^２／ｇｍとして供給業者により示されている^１。この表面積の増加は、ＣａＰと好適な親水性ポリマーとの間に想定される表面相互作用を拡大するはずである。

【0037】

親水性ポリマーの選択：
ハイドロゲルを形成するために使用されるポリマーは、水溶性であることが好ましく、いくつかの実施形態において、カルボキシレート、カルボニル、および／またはアミン官能基を有する。カルボキシレート基は、ＣａＰとの最も強い相互作用を与えるように見える。理論に拘束されることはないが、ＣａＰの固体粒子の使用は、高濃度の水溶性Ｃａ^＋２イオンで時々見られるポリマーの沈殿を防ぐと考えられている。この用途に最も好ましい親水性ポリマーは、ヒアルロン酸である。生物分解性であり、眼の白内障手術に広く用いられてきたものは、多数のカルボキシレート基を有する天然高分子量ポリマーである。他の実施形態において、親水性ポリマーは、カーボポール、アルギン酸ナトリウム、およびカルボキシメチルセルロースである。このようなポリマーは、その高い分子量、豊富なカルボキシレート基、および優れた安全性のために、有用である。その他の水溶性（非イ
オン性）ポリマーも、いくつかの実施形態において、有用である。

【0038】

屈曲性（または多孔性）の重要性
屈曲性は、屈曲性の（ねじれている；多くの屈曲を有する）曲線の性質を表すものとして当業で理解されている。この性質を定量化するいくつかの試みがあった。屈曲性は、多孔性媒質中の拡散を説明するために一般に使用される。ハイドロゲルネットワークに溶解したときに、薬剤分子の放出が緩徐になる理由を説明するために、ハイドロゲルで通常引き合いに出される。すなわち、薬剤分子は、システムの外に放出されるために、ポリマーネットワークを通り抜けなければならない。ＣａＰ ＮＰの使用により、薬剤分子の進路をふさぐ多数のＮＰが生じ、それによって薬剤分子の放出がさらに緩徐になる。また、大半の薬剤粒子が、ＣａＰ ＮＰに吸着し、脱着が必要なことにより、ハイドロゲルからの薬剤粒子の放出がさらに緩徐になり得る。

【0039】

ナノ粒子を確実に分散させる親水性ポリマーの重要性：
ＣａＰ ＮＰにクエン酸Ｎａが吸着することにより分散が起こるのとちょうど同じように、親水性ポリマーがＣａＰ ＮＰに吸着するときに、同じ分散イベントが起こることが予想される。ＣａＰ ＮＰの凝集体は、透明性の低下、および固体相と溶媒和ポリマーとの間の相互作用の全体強度の顕著な減少をもたらし得る。

【0040】

得られるハイドロゲルの粘弾性増加の重要性：
ＣａＰ ＮＰの親水性ポリマー鎖への結合は、得られるハイドロゲルの粘性（流れ抵抗）および弾性（変形抵抗）の劇的な増加をもたらし得ることが予想される。ポリマーの物理的架橋によってこのような効果がもらされる例が、文献に示されていた。

【0041】

粘性の増加は、眼内の涙の流れを抑え、眼用ゲルの滞留時間を増加させ得る。弾性の増加は、コンタクトレンズとほとんど同じように、まばたきのエネルギーを吸収することにより、眼の滞留時間を増加させ得る。弾性の増加は、皮膚科用ゲルを、蒸発から膜が形成されるまで留まるように、ゲル化させることに役立ち得る。弾性の増加は、このようなゲルで充填されたカプセルが胃の外に完全なまま出て、その後胃腸管でマイクロハイドロゲルに分解することを確実にするのに役立ち得る。

【0042】

粘性の増加は、ＣａＰ−ポリマーハイドロゲルに懸濁または溶解されている薬剤の放出を緩慢にするはずである。注目すべきは、放出速度が、ＣａＰまたはポリマーの量およびＣａＰとポリマーの比により制御され得ることである。従って、製品放出速度の設計において屈曲性の増加が達成される。

【0043】

上記の医薬組成物は、様々な薬剤用の担体または送達賦形剤として使用され得る。

【0044】

当該医薬組成物で有用な薬剤は限定されず、当該組成物中に使用されるハイドロゲルおよびリン酸カルシウムナノ粒子中で安定であり、相溶性であるのであれば、あらゆる薬剤が使用され得る。例えば、低分子量活性成分（小分子）、例えば、多くの抗ウイルス剤、肝臓療法剤、神経保護剤、免疫療法剤および免疫抑制剤、循環器疾患または癌用低分子量活性成分、鎮痛剤、低分子量抗炎症剤、抗生および抗菌性活性成分、ベータ遮断薬（チモロールなど）、ならびに低分子量ホルモンなど、または高分子活性成分、例えば、核酸断片もしくは核酸（ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）など。低分子量活性成分の例は、ヌクレオシド類似体、ベータ−インターフェロン、アルファリポ酸、ペプチド類似体、酵素または受容体阻害剤、アゴニストおよびアンタゴニスト、プロスタグランジン、ステロイド、細胞増殖抑制剤、およびヘテロ環抗生物質である。特に、活性成分をプロドラッグの形態で用いることも可能である。

【0045】

実施例は、本開示の組成物のいくつかの実施形態を例証するために与えられるが、限定するものとして解釈されるべきではない。本書の特許請求の範囲の範囲内にあるその他の実施形態は、本書で開示されている組成物または方法の明細書または実施例の考察から、当業者には明らかとなるであろう。明細書は、実施例と共に、ただ例示的なものとしてみなされることが意図されており、開示の範囲および精神は、実施例の後に続く特許請求の範囲により示されている。

【実施例】

【0046】

ＵＶ可視分光器を使用して、８つの異なる濃度でのマレイン酸チモロール標準溶液の２９５λでのＵＶ吸光度の量を測定した。次に、マレイン酸チモロールの２９５λでの吸光度と濃度との間に、較正曲線を生成した（図１）。方程式は、ｙ切片を無理にゼロに合わせてはおらず、ｒ２値が０．９９９９であった。実験サンプル中のチモロールの濃度を、標準曲線を用いて求めた。

【0047】

実施例１：リン酸カルシウムナノ粒子を含有するカーボポールハイドロゲル中のチモロール製剤

【0048】

開放隅角緑内障は、視神経乳頭の萎縮をもたらし、視力喪失と関連する視神経症として定義されている眼疾患である。増加した眼内圧（ＩＯＰ）は、緑内障の患者に存在し得る。緑内障を治療するための薬理学的療法は、ＩＯＰを低下させることに焦点を当てている。眼房水と呼ばれる透明な流体は、ＩＯＰを維持する。ヒトの眼の前面は、眼房水で満たされており、眼房水は、毛様体によって絶えず生成されている。ＩＯＰを維持することに加えて、眼房水は、眼のための栄養を保護し、供給する。眼房水は、眼から排出され、鼻涙管を通って患者の体循環へと入る。緑内障は、しばしば、眼房水の排出が阻害され、それによりＩＯＰが増加することに起因する。ＩＯＰの低下は、眼房水の流出が増加すること、または眼房水の生成が減少することによって達成され得る。米国眼科緑内障学会（American Academy of Ophthalmology Glaucoma）のガイドラインによれば、眼用プロスタグランジン類似体および眼用ベータ遮断薬は、両方とも、開放隅角緑内障の初期治療における一次療法と考えられている。^３プロスタグランジン類似体は、眼房水の流出を増加させ、ベータ遮断薬と比較してＩＯＰの減少が優っていることが示されている。プロスタグランジン類似体の使用は、虹彩の褐変ならびに睫毛の伸びおよび暗色化という有害作用により、本来制限されている。これらの有害作用は、１つの眼に緑内障がある患者でとくに問題である。眼用ベータ遮断薬は、眼房水の生成を抑制し、プロスタグランジン類似体が引き起こす美容への有害作用を回避する。眼用ベータ遮断薬の主要な制限事項は、鼻涙管を通ってベータ遮断薬が全身に吸収されることにより生じ得る全身性有害作用の可能性である。これらの有害作用のいくつかとして、徐脈、心ブロック、心不全、および喘息が挙げられる。これらの有害作用は、特に、未知の潜在的な心臓または肺の異常がある患者に関連がある。

【0049】

この研究において、ベータ遮断薬マレイン酸チモロールを、長年にわたり使用されてきたことと、美容への有害作用を回避することとから、開放隅角緑内障の患者の治療のために選択した。眼用マレイン酸チモロールを投与するために使用し得る、様々な薬剤送達システムがある。マレイン酸チモロール溶液は、粘性が低く、そのため、溶液からの薬剤放出速度が速くなるということに起因する多くの欠点を有する。眼用溶液により示される流動のしやすさは、活性なマレイン酸チモロールが、眼内の作用部位を離れ、体循環へと流出することを可能にする。^４眼用マレイン酸チモロールの商業生産から最初の７年間に、製品によって引き起こされた推定死亡者数は３７であった。これらの死亡は、マレイン酸チモロールが全身に吸収されたときに引き起こし得る有害な循環器、肺、ＣＮＳ、および内分泌の作用に起因すると理論づけられた。^５診断未確定の循環器、肺、ＣＮＳ、および内分泌の障害を有する無数の患者がいるため、マレイン酸チモロールの有害作用のリスク
が増加している患者を適切に特定することは、難題である。

【0050】

眼用ゲルは、眼用溶液の使用に伴い経験される問題の一部を解決するために使用されてきた。眼用ゲルは、予め形成されたゲル、または生体内で形成するゲルであり得る。理想的な生体内で形成するゲルは、非生理的条件（ｐＨ４．０かつ２５℃）で自由流動性液体であるが、生理的条件（ｐＨ７．４かつ３７℃）に晒されると、粘性が増して強固なゲルに転移する。この転移は、点眼による薬剤の一貫した、再現性のある投与を可能にする。対照的に、予め形成されたゲルは、一貫した、再現性のある投与量で投与することが難しい。予め形成された眼用ゲルは、従来チューブで供給され、患者は、リボン状のゲルを下眼瞼のポケットに押し入れるように指示されるが、投薬過誤が容易に起こり得る。眼用ゲルは、薬剤の放出速度を低下させ、作用部位での滞留時間を延ばし、鼻涙管を通じた排出を減少させることができる。投与頻度の減少、使用する薬剤濃度の低下、および全身性吸収の減少は、全て、溶液と比較して、ゲルの使用に起因し得る。ゲルの主要な制限事項は、ゲルの高い粘性による不快感およびかすみ目の可能性である。

【0051】

ポリマーを眼用ゲルの製造に使用する。カルボマーは、高分子量非直線状ポリアクリル酸であり、多くの有益な特性を有する架橋ポリマーである。カルボマーは、擬塑性を呈する非ニュートン性ポリマーである。擬塑性は、ずり速度の増加が粘性を減少させるので、眼用ゲルに好ましい。まばたきの間のずり速度は、約１００００ｓ^−１であり、このずり速度での粘性の減少は、抵抗を減らし、まばたきの間の患者の快適性を向上し得る。カルボマーは、ｐＨが４．０より高くなると、溶液からゲルへ転移する。生理的ｐＨは、カルボマーが眼の生理的条件でゲルになることを示す７．４である。投与前ではポリマーが溶液の形態であることは、点眼による一貫した投与を可能にし得る。この研究において、我々は、予め形成されたゲルを製造することとし、従って、生体内のゲル化特性の利点を利用しないこととする。眼用ゲルの一貫した投与における難しさは、本実験に使用する製品の使用に対する障壁となり得る。また、カルボマーは、懸濁能力を高める５，５００ｄｙｎ／ｃｍ^２という高い降伏値を有する。眼用送達システムに特に関係があるカルボマーの透明性は、０．５％未満の濃度で高い。^８カルボマーポリマーは、内在性の緩衝能を促進する、その化学構造に組み込まれたカルボキシル官能基を有する。ヒトの涙は、それ自体で緩衝能を有するが、眼用製品の投与の際の不快感を避けるために、薬剤は、涙のｐＨである７．４にできるだけ近いべきである。カルボマーの緩衝能は、このことに役立ち得る。カルボマーゲルおよび眼用溶液を比較するこれまでの研究において、カルボマーゲルは、全身性吸収の減少、薬剤濃度対時間特性の均一化、薬剤の有効濃度の低下を示した。また、カルボマーは、様々な剤形、例えば、眼用、局所用、経口用、直腸内用、膣用、および口腔用製品で使用されてきたので、カルボマーの使用の良好な安全性は確立されている。

【0052】

カルボマーポリマーは、様々なグレードで手に入る。この研究において、カルボマー９８０を使用することにする。カルボマーの粘性は、ポリマーの濃度に依存する。カルボマー９４０および９８０は、その他のカルボマーのグレードと比較して、より低い濃度で最高の粘性を有する。粘性は眼用薬剤の眼内の滞留を増加させることが示されているので、高い粘性が望ましいであろう。カルボマー９４０は、カルボマー９８０に対して、粘性をわずかに増加させた。カルボマー９４０および９８０は、その他の類似の特性、例えば、高い透明性、低い相対的イオン耐性、および高い相対的せん断応力を有する。これらは、低いイオン耐性を除いて、全て、眼用ゲルの望ましい特性であり、低いイオン耐性は後の考察で扱うこととする。高い透明性は、これらの製品を眼に投与するため、望ましい特性である。高い相対的せん断応力は、ポリマーが処理される間、原形を保つことを可能にし得る。全体として、カルボマー９４０および９８０は、眼用ゲルを製造するときに有益であり得る特性を有する。０．５％のカルボマー９８０を本実験においてゲルに使用することにする。ポリマー濃度が０．２％より低いと、強固なゲルは生理的条件で形成できない
が、濃度が０．５％より高い場合、ゲルは硬くなり、患者に不快感を与えるリスクが高まり、酸性は、ゲルが中和しにくくなるので、このポリマー濃度を選んだ。０．５％より高い濃度では、透明性も減少する。^８

【0053】

また、固体リン酸カルシウムナノ粒子をカルボマーゲルに添加することにする。リン酸カルシウムナノ粒子の目的は、マレイン酸チモロールの放出速度をさらに下げることである。上述したように、ゲルの粘性の増加は、ゲル内および作用部位での薬剤の滞留時間を増加させ、全身性吸収を減少させるが、代償として、かすみ目の悪化、および快適性の低下がある。リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、ゲルの粘性をさらに増加させることなく、薬剤の滞留時間を増加する効果を潜在的に有し得る。リン酸カルシウムナノ粒子は、追加的な障壁として作用するようになり、薬剤は、カルボマーゲルから放出されるために動き回らなければならないので、滞留時間が増加し得る。

【0054】

リン酸カルシウムナノ粒子の取り込みに関して、カルボマーは、カルボキシル官能基の存在および高い降伏値などの望ましい特性も有する。カルボキシル官能基は、分散に役立つリン酸カルシウムナノ粒子との強固な結合を形成でき、高い降伏値は、マレイン酸チモロールおよびリン酸カルシウムナノ粒子の良好な懸濁を可能にし得る。リン酸カルシウムナノ粒子を使用するときのカルボマーの潜在的な不都合として、その低いイオン耐性が挙げられるが、これは、リン酸カルシウムナノ粒子の不溶性に起因する問題であるとは考えられていない。

【0055】

目的
この研究の目的は、ゲルに取り込ませたリン酸カルシウムナノ粒子の濃度を変化させながら、カルボマーゲルからのマレイン酸チモロールの放出速度を測定することである。マレイン酸チモロールの放出速度の低下がリン酸カルシウムナノ粒子により生じた障壁によるものである場合、眼内の滞留時間の増加、およびマレイン酸チモロールの全身性吸収の減少という結果が観察され得る。これらの特性を有する眼用薬剤送達システムの発見は、薬剤有害事象の減少、投与頻度の減少、必要な薬剤濃度の低下、忍容性の向上、および眼用医薬品の患者の服用順守の改善をもたらし得る。

【0056】

方法
本実験の全体設計は、マレイン酸チモロールからなる眼用カルボマーゲルからのマレイン酸チモロールの放出速度を測定すること、およびリン酸カルシウムナノ粒子の濃度を変えることである。これを、溶液、ゲル、およびリン酸カルシウムナノ粒子からなるゲルを含む数種類のマレイン酸チモロール製剤を製造することによって達成した。製剤を透析管に入れ、管をリン酸緩衝食塩水のビーカーに置いた。吸い込み条件の存在により、マレイン酸チモロールは、透析管の内側からビーカーに流れた。サンプルをビーカーから取り出し、マレイン酸チモロールの濃度を吸光度測定値により求めた。製剤の放出速度を比較して、カルボマーゲルへのリン酸カルシウムナノ粒子の添加がマレイン酸チモロールの放出速度を減少させたかどうかについて判定した。リン酸カルシウムナノ粒子の濃度がマレイン酸チモロールの放出速度に与える影響も調べた。

【0057】

この研究の第１ステップは、標準較正曲線を作成して、マレイン酸チモロールの吸光度と濃度の間の関係を求めることであった。ベアーの法則を利用して、キュベットの大きさのより通過する放射の経路の長さが１０ｃｍと等しいことを用い、この関係を求めた。マレイン酸チモロール塩およびリン酸緩衝食塩水を混合して、放出速度研究の間１００ｍＬビーカーのリン酸緩衝食塩水中に存在し得るマレイン酸チモロールの可能総濃度が１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％の濃度であるマレイン酸チモロール溶液を製造した。１ｍＬの０．６８％マレイン酸チモロールを、１００ｍＬビーカーのリン酸緩衝食塩水中に置かれた透析管に入れたことに着目して、マレイン酸チモロールの可
能総濃度を計算した。マレイン酸チモロールが透析管に残り、１００ｍＬのリン酸緩衝食塩水で希釈した。従って、１０１ｍＬの溶液中の１ｍＬの０．６８％マレイン酸チモロールにより、可能な総濃度が０．０６７３３ｍｇ／ｍＬとなった。０．００６７ｇ／１００ｍｌの貯蔵溶液をリン酸緩衝食塩水を用いて製造した。この貯蔵溶液のうち１ｍＬ、２ｍＬ、４ｍＬ、６ｍＬ、８ｍＬ、および１０ｍＬを、リン酸緩衝食塩水と混合して、それぞれ、マレイン酸チモロールの総濃度が１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、および１００％の合計１０ｍＬの溶液を製造した。ＵＶ可視分光器を使用して、各溶液の吸光度を測定した。様々な濃度のマレイン酸チモロールは、様々な量の吸収放射をもたらした。吸光度対濃度のプロットを作り上げ、線形回帰を使用して、直線の方程式を作った。直線の方程式は、ベアーの法則に対応し、溶液またはゲルの吸光度を与えれば、マレイン酸チモロール濃度の特定が可能となった。マレイン酸チモロール溶液またはゲルの吸光度が、吸光度対濃度のプロットの直線領域に留まっている場合、吸光度および濃度は、その直接的関係により互換的に使用し得る。この関係により、マレイン酸チモロールの吸光度対時間をプロットして、様々な製剤からのマレイン酸チモロールの放出速度を明らかにした。

【0058】

次に、透析管、セルロースエステル透析膜を、冷却装置から取り出した。分画分子量（ＭＷＣＯ）が３，５００〜５，０００Ｄの透析管を使用した。透析管を３回蒸留水ですすいで保存剤を除去し、次に、リン酸緩衝食塩水に一夜浸した。この時点で、透析管をマレイン酸チモロール溶液およびゲルで充填する準備ができた。

【0059】

０．０６８ｇのマレイン酸チモロール塩と１０ｍＬのリン酸緩衝食塩水を混合して、０．６８％のマレイン酸チモロールである溶液を製造することによって、マレイン酸チモロール溶液を製造した。均一性を確保するために、溶液を５回反転し、撹拌子を溶液に入れ、マグネチックスターラー上に置いた。リン酸緩衝食塩水は等張性でありｐＨが７であるので、溶液のｐＨおよび張度を調節しなかった。

【0060】

カルボマー９８０ゲルの固体製剤に蒸留水を加えることによって、最初にカルボマー９８０ゲルの濃縮製剤を製造することによって、マレイン酸チモロールゲルを作り上げた。カルボマーゲルは、０．５％カルボマー９８０からなっていたが、２％カルボマー製剤を使用して様々なゲルを製造した。１２５ｍＬの蒸留水および２．５ｇのカルボマー９８０を撹拌子およびマグネチックスターラーにより一夜混合して、２％カルボマー貯蔵ゲルを製造した。ゲルを手でも混合した。最終ゲルのｐＨを７．０〜８．０のｐＨに調整したが、０．０５％のカルボマーゲルを最初に、０．５％カルボマーゲルを適切に調整するために必要となり得る水酸化ナトリウムの量に近づくように製造した。これを達成するために、２．５ｇの２％カルボマーゲルを秤量し、蒸留水で１００ｍＬにした。０．１Ｎおよび１Ｎの水酸化ナトリウムを少量単位で、電極により検出されるｐＨが７．０〜８．０になるまで０．０５％カルボマーゲルに加えた。次に、２５ｍＬの２％カルボマーゲルを２５０ｍＬビーカーに入れることによって、０．５％カルボマーゲルを製造した。約８０ｍＬの水をゲルに加え、次に０．６８ｇのマレイン酸チモロールをゲルに配合した。全ての塊が消えるまで、ゲルを手で混合した。０．６８％のマレイン酸チモロールを含有する０．５％カルボマーゲルのｐＨは、０．０５％カルボマーゲルをｐＨ調整するために必要であった水酸化ナトリウムの量の１０倍弱を加えることにより調節したｐＨであった。電極をゲルから取り出し、蒸留水ですすいで、全成分が確実にゲル中に留まるようにした。ゲルを蒸留水で１００ｇにした。

【0061】

正確なオスモル濃度が０．５％であるカルボマー９８０ゲルは知られていなかったが、０．３％カルボマー９３４のオスモル濃度を使用して計算した。^１９０．６８％マレイン酸チモロールは、３１．４ｍＯｓｍに寄与し、カルボマーは、約４２ｍＯｓｍに寄与する。ゲルを等張にするために、４．１ｇの５％デキストロースを加えて、張度が３００ｍＯｓｍの等張性ゲルを得る必要があり得る。しかしながら、本実験の結果を、カルボキシメ
チルセルロース、ＣＭＣを使用する類似の実験の結果と比較することにする。ＣＭＣは、浸透圧調節が必要なく、従って、ゲル間のより直接的な比較を可能にするために、デキストロースをカルボマーゲルに加えなかった。ゲルを手で完全に混合し、次に、撹拌子およびマグネチックスターラーで混合して、均一性を確保した。

【0062】

マレイン酸チモロールおよびリン酸カルシウムナノ粒子を含有するカルボマー９８０ゲルを、カルボマーゲルに関する前述のステップと同じステップを使用して製造したが、１００ｇの２％カルボマーおよび２．７２ｇのマレイン酸チモロールを使用して、３５０ｇのゲルを製造した。このゲルを、前述の方法を使用してｐＨ調整した。８７．５ｇのこのゲルを秤量し、リン酸カルシウムナノ粒子をゲルに加えた。０．５％、１％、２％、および５％のリン酸カルシウムナノ粒子を含有するゲルを得るために、０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、および５ｇの固体のリン酸カルシウムナノ粒子をそれぞれ加えた。ゲルを１００ｇにし、撹拌子およびマグネチックスターラーで混合した。次に、ゲルを、さらに１５分間、Ｂｒｅｖｉｌｌｅ ｏｖｅｒｈｅａｄという電動ミキサーに入れて、均一性を確保した。５つのゲルを製造した後、０．６８％マレイン酸チモロールを含有する７３．８ｇの０．５％カルボマーゲルが残った。残ったゲルを使用して、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％カルボマーゲルを製造した。０．４２１５ｇのカルボマー９８０を残ったゲルに加えた。ゲルを手で混合し、ｐＨが７．０〜８．０になるまで、ｐＨを水酸化ナトリウムで調整した。ゲルを８４．３ｇにした。ゲルを次にＢｒｅｖｉｌｌｅミキサーに入れた。ゲルの粘性をＨａａｋｅ ５５０ ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒを使用して測定した。カーブフィット分析を、粘性データでＯｓｔｗａｌｄ ｄｅ ＷａｅｌｅおよびＢｉｎｇｈａｍのモデルを用いて実施した。Ｏｓｔｗａｌｄ ｄｅ Ｗａｅｌｅモデルは、流動コンシステンシー指数Ｋおよび流動性指数ｎの計算を可能にした。Ｂｉｎｇｈａｍモデルは、降伏値を計算した。Ｈａａｋｅ ５５０ ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒも使用して、ゲルのチキソトロピーを調べた。

【0063】

次に、溶液およびゲルからのマレイン酸チモロールの放出速度を測定した。リン酸カルシウムナノ粒子を含有するゲルを、２分間ホモジナイザーに入れて、確実に、粒子をゲル中に均一に懸濁させた。透析管を１０ｃｍのセグメントに切り出した。透析管の底部をクリップで留めた。１ｍＬのマレイン酸チモロール溶液または１グラムのマレイン酸チモロールゲルを透析管に入れた。メスピペットを使用して、１ｍＬの溶液を透析管に移した。このように移すためにメスピペットを使用するには、ゲルはどろどろしすぎているので、２４ｍＬシリンジをゲルで満たした。２４ｍＬシリンジを使用して、３ｍＬシリンジをゲルで満たした。プラスチックカテーテル先端を３ｍＬシリンジの上に置き、１ｍＬのゲルを透析管に移すことが可能になった。ゲル中に気泡があり、それにより、１ｇのゲルを正確に移すことが困難になっていたことが明らかであった。ゲルを移す前および後に３ｍＬシリンジを秤量して、透析管に入れられたゲルの正確な重量を計算することによって、この障害を解消した。透析管の上部もクリップで留め、１００ｍＬビーカーのリン酸緩衝食塩水中に入れた。撹拌子をビーカーの底部に置いて、確実に、マレイン酸チモロールの濃度がビーカー中で均一になるようにした。上部クリップをビーカーの縁に置き、パラフィルムでビーカーの上部を覆って、クリップをその場所に保持し、蒸発を制限した。次にビーカーを秤量して、確実に、実験中に蒸発が起こった場合に蒸発が検出されるようにした。ビーカーの吸い込み条件により、マレイン酸チモロールは、透析管から放出され、ビーカーのリン酸緩衝食塩水に流れた。放出されたマレイン酸チモロールの吸光度をＵＶ可視分光器を使用して測定した。ピペットを使用して、ビーカーから溶液を収集し、吸光度分析のためにキュベットに入れた。吸光度の読み取りを実施した後、サンプルをビーカーに戻し入れた。第１の吸光度の読み取りを、５分と１０分との間に溶液およびゲルについて実施して、マレイン酸チモロールが透析管からどれだけ速く放出されているかを最初に評価した。マレイン酸チモロールの吸光度がどれだけ速く変化しているかに応じて、読み取りは、５分、１０分、２０分、または３０分おきに実施した。マレイン酸チモロールの放
出速度を各製剤の６つのサンプルについて測定した。実験が進行するにつれて、０．５％ゲルサンプルのうち１つのマレイン酸チモロールの放出速度が、残りのサンプルとは異なることが明らかになった。このため、１つのサンプルを加えて、０．５％ゲル製剤について、全部で７つのサンプルを得た。

【0064】

次に、ゲルの吸光度を１ｇに正規化して、全てのサンプル間の一様な比較を可能にした。このことは、サンプル中のゲルの重量で１を割ることにより行った。得られた数に、サンプルについての吸光度の読み取りを掛けた。次に、正規化吸光度を、その最大の正規化吸光度のパーセンテージに変換した。正規化吸光度のパーセントを、時間に対してプロットして、マレイン酸チモロールの放出速度を表した。各プロットの直線部分を分離し、線形回帰を使用して、傾きを求めた。傾きは、マレイン酸チモロールが溶液およびゲルからどれだけ速く放出されたかを表す。各製剤の６つのサンプルの平均の傾きを計算して、異なる製剤からのマレイン酸チモロールの放出速度を比較した。

【0065】

データをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈというカーブフィッティングプログラムを使用して分析した。非線形回帰を様々な製剤からのマレイン酸チモロールの放出速度について求めた。シグモイドカーブフィットモデルを用いてデータをフィットさせ、シグモイドパラメーターをｍ値として表した。ｍ３パラメーターは、マレイン酸チモロールの放出速度と最良に相関した。比較する２つ以上の群があったので、分散の分析であるＡＮＯＶＡという統計検定を本実験で利用した。異なるマレイン酸チモロール製剤間に統計的差異があるのかどうかを判定することができた。＜０．０５のｐ値は、統計的有意性を示した。次に、事後のテューキーの検定を用いて、どの製剤に統計的差異があるのかを判定した。ＡＮＯＶＡおよび事後のテューキーの検定を、傾きおよびｍ３値について行った。

【0066】

結果
溶液およびゲルからのマレイン酸チモロールの放出速度をさらに評価するために、正規化した吸光度のパーセント対時間のグラフの傾きを計算し、表１に示す。各製剤のサンプルの平均の傾きは、マレイン酸チモロールが最も緩徐に放出されたのは、１％リン酸カルシウムナノ粒子（ＣａＰ ＮＰ）を含有する１％ゲルであり、そのすぐあとに１％ＣａＰ
ＮＰを含有する０．５％ゲルが続くことを結論付けた。０．５％ゲルおよび０．５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルが次に最も緩徐であり、その次に緩徐なのは溶液である。逆に、マレイン酸チモロールが最も速く放出されたのは、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、その後に２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルが続く。１％ＣａＰ ＮＰを含有する製剤が示したマレイン酸チモロールの放出速度が遅くなることは、予想していたが、２％および５％ＣａＰ ＮＰを含有する製剤からのマレイン酸チモロールの放出速度が速くなることは、予想していなかった。ＣａＰ ＮＰの添加が、マレイン酸チモロールの放出速度の低下をもたらし、特に高濃度のＣａＰ ＮＰで低下し得ることを理論づけたが、これらの結果は、マレイン酸チモロールの放出速度の低下がＣａＰ ＮＰの濃度に依存することを示した。

【0067】

【表1】

【0068】

正規化吸光度パーセント対時間のグラフの傾きのＡＮＯＶＡ統計検定の結果を、表２に示す。この検定は、マレイン酸チモロール製剤の一部の間に統計的有意差があることを示す。Ｆ値は、群内の変動と比較した群間の変動の比である。大きなＦ値は、比が大きく、統計的有意性を示す小さなｐ値があるはずであることを示す。ＡＮＯＶＡ検定は、１３．０８４８３２という大きなＦ値、および＜０．０００１という小さく、統計的有意なｐ値を明らかにした。次に、事後のテューキーの検定を実施して、どの製剤が統計的に有意に異なるのかを判定した。この検定の結果は、表３にある。差異があるいくつかの製剤があった。概して、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルは、その速いマレイン酸チモロールの放出速度により、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ゲル、１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、０．５％ゲル、および０．５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルと有意差があった。２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルは、１％ＣａＰ ＮＰを含有するゲルと有意差があり、これは、溶液と比較して、２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルのマレイン酸チモロールの放出速度が上昇しており、１％ＣａＰ ＮＰを含有するゲルのマレイン酸チモロールの放出速度が低下していることに起因するようであった。また、このマレイン酸チモロールの放出速度の低下に起因して、１％ＣａＰ ＮＰを含有するゲルは、溶液と有意差があった。最後に、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ゲルは、全製剤のうち、放出速度が最も遅く、０．５％ゲルと有意差があった。

【表2】

【表3】

【0069】

溶液およびゲルについてマレイン酸チモロールの放出速度を表す正規化した吸光度のパーセント対時間のグラフを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈプログラムを用いて分析した。カーブフィット分析を実施し、シグモイドモデルがデータを最良にフィットすると判断した。シグモイド曲線は、値ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４により表される。各製剤についてｍ値の平均を計算し、表４に示す。ｍ３値は、マレイン酸チモロールの放出速度と最も密
接に関連する。高いｍ３値は、遅い放出速度を示す。最も高いｍ３値を有したのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ゲルであり、次いで１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであった。最も低いｍ３値であったのは、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、次いで２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであった。平均ｍ値を使用して、異なる製剤間でマレイン酸チモロールの放出速度を比較することを可能にするシグモイド曲線を作成した。

【表4】

ＡＮＯＶＡ統計検定は、ｍ３値の間にいくつかの統計的有意差があることを明らかにし、事後のテューキーの検定は、どの製剤が互いに統計的に異なるのかを明らかにした。ＡＮＯＶＡから、および事後のテューキーの検定からの結果は、それぞれ、表５および表６にある。傾きおよびｍ３値の結果は、両方とも、チモロールの放出速度を反映する。傾きおよびｍ３値の傾向は、近く、厳密ではないが、相関している。直線傾向線は、ｒ^２値が０．８１１９であり、統計的に有意である。放出速度の表現としての傾きおよびｍ３値は、両方とも、有用なデータを生成し、それらの強い相関は、放出速度の結果全体を強化する。

【表5】

【表6】

【0070】

粘性を各ゲルについて測定した。最も高い粘性を有したのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ゲルであり、次いで５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、０．５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、０．５％ゲルであり、最後が１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、最低の粘性を有した。粘性の結果は、マレイン酸チモロールの放出速度と相関しなかった。

【0071】

粘性曲線をＯｓｔｗａｌｄ ｄｅ ＷａｅｌｅおよびＢｉｎｇｈａｍのモデルによってフィットさせた。結果を表７に示す。チキソトロピーも各ゲルについて評価した。結果を表７にある。様々な濃度のＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルは、Ｋおよび降伏値について直線関係を示した。０．５％ゲルと比較して１％ゲルの粘性に有意差があるため、１％ゲルを、レオロジー特性の比較に含めなかった。最小のＫ値が生成されたのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、次いで、０．５％ゲル、０．５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、最後に２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであった。これらのゲル間の直線関係は、ｒ^２値が０．８７２４６であった。これは、統計的に有意なｐ値が＜０．０１であることに対応する。降伏値の結果は同様の傾向を有し、最小の降伏値が生成されたのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、次いで、０．５％ゲル、０．５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲル、次に５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであった。降伏値の関係のｒ^２値は、０．９２５５８であった。これは、統計的に有意なｐ値が＜０．００１であることを示す。これらの値の間の傾向は、２％と５％のＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルの順序に関して、わずかな違いがあるが、Ｋおよび降伏値は、これらのゲルについて非常に類似していた。前述の放出速度の結果は、０．５％ゲルについて同様の傾向を示し、最も遅い放出速度が生成されたのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、最も速い放出速度が生成されたのは、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルであり、そのすぐあとに２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルが続く。従って、放出速度とゲルとそれらの対応するＫ値および降伏値との間に相関があった。ｍ３値は、同様の傾向を生成したが、最小のｍ３値は、Ｋ値および降伏値について最大値と相関した。最小のｍ３値が最速の放出速度を示したので、この関係は、平均の傾きと同じ関係を表す。ｎとチキソトロピーとの間の関係は、０．５％ゲル間に直線関係を生成しなかった。ｎ値は、全て１未満であった。１未満であるｎ値は、ゲルが、擬塑性を呈することを示し、これは予想していた発見であった。チキソトロピーの結果は、負の値を生成した。負のチキソトロピーの結果は、ずり速度が１０００ １／秒から０ １／秒に減少した場合と比較して、ずり速度が０ １／秒から１０００ １／秒に増加した場合に、ゲルがより低い粘性を有したことを示す。５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％ゲルは、他のゲルよりもはるかに負であるチキソトロピーの結果を有した。

【表7】

【0072】

考察
表１の正規化した吸光度のパーセント対時間の傾きにより明らかにされた溶液およびゲルについてのマレイン酸チモロールの放出速度は、予想していなかった結果を表した。リン酸カルシウムナノ粒子のカルボマーへの添加は、マレイン酸チモロールの放出速度を下げ得ることを理論づけたが、この種類のゲルは、研究されていなかった。カルボマーゲルに加えるリン酸カルシウムナノ粒子が多くなるにつれて、マレイン酸チモロールの放出が徐々に遅くなることが予想されていたが、このことは見られなかった。予想していたよう
に、溶液と比較して０．５％カルボマーゲルでは、放出速度が遅かった。１％リン酸カルシウムナノ粒子を０．５％カルボマーゲルに加えた場合にも、放出速度は低下した。しかしながら、５％リン酸カルシウムナノ粒子を０．５％カルボマーゲルに加えた場合に、マレイン酸チモロールの放出速度は上昇したが、これは予想していなかった。０．５％および２％のリン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％ゲルのマレイン酸チモロールの放出速度を測定することによって、この現象をさらに調べた。０．５％リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、０．５％と比較してマレイン酸チモロールの放出速度をわずかに上昇させたが、放出速度は、０．５％ゲルと非常に類似していた。このことは、０．５％リン酸カルシウムナノ粒子は、マレイン酸チモロールの放出速度に有意な差異を生成するのに十分に高い濃度ではないことを示し得る。２％リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、溶液よりも速いマレイン酸チモロールの放出速度をもたらした。従って、２％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％カルボマーゲルは、５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％カルボマーゲルと同様に、マレイン酸チモロールの放出速度を低下させることに有効ではなかった。０．５％カルボマーゲルへの１％リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、マレイン酸チモロールの放出速度を低下させることに最も有効であったので、リン酸カルシウムナノ粒子が放出速度を低下させることになおも有効であるかを判断するために、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％カルボマーゲルを調べた。１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％カルボマーゲルからのマレイン酸チモロールの放出速度は、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％カルボマーゲルと同様の放出速度を有したが、マレイン酸チモロールの放出速度は、わずかに遅かった。ＡＮＯＶＡ統計検定および事後のテューキーの検定からの結果は、マレイン酸チモロール製剤の間にある程度の統計有意差があったことを明らかにしたが、いくつかの製剤は、類似しすぎており、統計的な差異がある傾きは生成できなかった。全体として、特定の濃度のリン酸カルシウムナノ粒子のみ、低下したマレイン酸チモロールの放出速度を生成したことが明らかになった。ポリマーの濃度が増加するにつれて、低下したマレイン酸チモロールの放出速度は、さらに低下するように見えたが、カルボマーゲル中のリン酸カルシウムナノ粒子は、これまで研究されていなかったので、この効果を確かめるために、さらなる研究が必要である。マレイン酸チモロールの放出速度の結果に寄与する、カルボマーゲルとリン酸カルシウムナノ粒子との間の相互作用があり得ると考えられる。

【0073】

マレイン酸チモロールの放出速度のｍ値およびシグモイド曲線は、異なる製剤が、マレイン酸チモロールの放出速度の速さと相関する異なる曲線を生成することも示す。シグモイド方程式のｍ３パラメーターが、マレイン酸チモロールの放出速度を表すという解釈により、ｍ３の客観的計測値は、平均の傾きの値により求められた放出速度を強化することができた。ｍ３値は、平均の傾きと厳密に相関してはいるわけではなかったが、ｍ３値は、１％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルおよび１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ゲルが最も遅い放出速度を有することを明らかにしたデータを支持した。ｍ３値は、５％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルおよび２％ＣａＰ ＮＰを含有する０．５％ゲルが最も速い放出速度を有することも強く支持した。このデータは、ＣａＰ ＮＰの添加は、マレイン酸チモロールの放出速度を低下させることが可能であるが、特定の濃度でのみ可能であることを示唆する。シグモイドカーブフィットモデルのｍ１、ｍ２、およびｍ４パラメーターも調べた。ｍ１パラメーターは、放出速度曲線の高さと関連しており、グラフの後部曲線部分の形状と関連している可能性があると考えられる。ｍ２パラメーターは、遅延時間と関連していると考えられ、ｍ４パラメーターは、曲線の全体形状に関連しているように見える。この実験では、マレイン酸チモロールの放出速度に最も焦点が置かれていたので、ｍ３値を最もよく調べた。

【0074】

粘性の結果は、マレイン酸チモロールの放出速度の順序と相関しなかった。これまでの研究において、ゲルの放出速度は、粘性が増加するにつれて減少する。従って、最速の放出速度を有するゲルは、最低の粘性を有することが想定され、最低の放出速度を有するゲ
ルは、最高の粘性を有することが想定されたが、このことは、この研究では見られなかった。最低の放出速度を有した１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ゲルは、最高の粘性を有したが、このゲルは、０．５％ゲルと比較できない。０．５％ゲルの予想外の粘性の結果は、粘性の上昇に寄与しないが、より遅い放出速度を生成するカルボマーゲルとリン酸カルシウムナノ粒子との間の相互作用があり得るという理論を強化する。粘性の増加が、眼用ゲルを使用する患者の不快感を引き起こすことがよくあり、ゲルの粘性を増加させることなく、薬剤の放出速度を減少させることが望ましいとされ得るので、このことが将来の研究で再現される場合、このことは、有益な発見であり得る。

【0075】

０．５％ゲルに関するＫおよび降伏値の傾向は、概して、放出速度の増加と共にＫおよび降伏値が増加するという傾向に従う。現段階では、これらの結果の有意性は、分からない。全てのゲルに関する１未満のｎ値の結果は、ＣａＰ ＮＰの添加が、カルボマーゲルの擬塑性を妨げないことを示唆する。従来発表されていたように、１未満のｎ値は、ゲルが擬塑性を呈することを示すので、このことは、有望な発見である。擬塑性は、ずり速度が増加するにつれて、ゲルが低粘稠性になることを可能にする。ずり速度がまばたきにより増加するときに患者の快適性が維持され得るので、このことは、眼用製品にとって望ましい性質である。ずり速度が増加するときの粘性値とずり速度が減少するときの粘性との間の差異を明らかにするチキソトロピーの結果は、明瞭な傾向を示さなかった。チキソトロピーの結果は、全て負であり、これは、多くのポリマーで共通ではないが、負のチキソトロピーは、Ｍａｌａｈによる研究において、カルボマーゲルでも見られた。また、チキソトロピー研究は、負の結果を確認するために２回実施した。ゲルのうち有意差があったただ１つのチキソトロピーの値は、５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する０．５％ゲルであった。これは、最高の濃度のリン酸カルシウムを含有し、最速のマレイン酸チモロールの放出速度を有するゲルであったので、チキソトロピー値の増加とリン酸カルシウムナノ粒子の増加との間に潜在的な相関がある。この相関は、１つのデータ点で見られただけであるので、まだ確証されておらず、この結果の存在を確証するために、より多くのデータが必要である。

【0076】

結論
１％リン酸カルシウムナノ粒子のカルボマーゲルへの添加は、マレイン酸チモロールの放出速度を低下することに成功した。マレイン酸チモロールの放出速度の低下は、２％および５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有するカルボマーゲルでは見られなかった。現段階では、特定の濃度のリン酸カルシウムナノ粒子で、マレイン酸チモロールの放出速度の低下に寄与する、カルボマーゲルとリン酸カルシウムナノ粒子との間の相互作用があり得ることが考えられる。ゲルの粘性をさらに増加させることなく、薬剤の放出速度を低下させるために、眼用ゲルは、リン酸カルシウムナノ粒子を利用することが可能であり得る。カルボマーゲルに対するリン酸カルシウムナノ粒子の効果を確証するために、さらなる研究が必要である。

【0077】

実施例２
眼用ゲルは、眼用ゲルを構成するポリマーなどの、眼用ゲルの性質を決める複数の成分を示す。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）は、水溶性であり、粘膜付着性を示す生体接着ポリマーであり、生物分解性である。生体接着性は、薬剤のポリマーへの付着を可能にし、薬剤の眼組織との接触時間を延ばし、眼のバイオアベイラビリティを向上することができる。製造業者によるＣＭＣに関する安全性データは、動物およびヒトの研究から毒性がないことを示す。この毒性がないということは、製造業者が、このポリマーを多くの製品で頻繁に使用および配合することに供することである。Ｎａ ＣＭＣを潤いを与えるための目薬で使用した場合に、ゴロゴロ／ザラザラする眼、かすみ目、ドライアイ、視力の低下、および眼瞼辺縁痂皮形成というよく見られる有害作用がＮａ ＣＭＣで報告されている。ＣＭＣは、ＣＭＣが涙液膜と相互作用するようにする膜形成特性を有し、この
ことにより、ポリマーの安定性が増加する。^５

【0078】

セルロースポリマーおよび低分子量ＣＭＣは、ずり速度とは無関係に粘性を示し、まばたきのときに痛みを引き起こす粘性の増加を示すニュートン性を呈する。しかしながら、この研究で使用するＮａ ＣＭＣは分子量がより大きいので、非ニュートン性擬塑性が見られ、ずり速度の増加に伴い粘性が減少する。これらの特性により、まばたきの時に抵抗がより少なくなり、患者の忍容性の向上が可能となる。アルミニウムなどの三価の金属を添加すると、カルボキシメチル基間のポリマー分子の架橋の機構を介して、ＣＭＣでゲル化が起こる。一塩基性酢酸アルミニウム、可溶性塩、または不溶性塩、例えば、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウムからのアルミニウムの徐放は、ＣＭＣの生体内での形成を引き起こす。^９しかしながら、上記のゲル化の組み込みを必要としない予め形成されたゲルを、この研究で採用することにする。低粘稠性ＣＭＣに関する降伏値は、３６ｄｙｎ／ｃｍ^２であり、これは、応力を受けた初期流れ抵抗を示す値であり、懸濁能力を判定するために使用される。

【0079】

ＣＭＣポリマーを、分子量に基づく粘性の度合い、および温度を変えながら、製造し得る。この研究における因子ではないが、ＣＭＣポリマー粘性は、温度により影響を受けるが、高温（＞４８時間の間８２℃）での長期間の加熱の場合だけであり、６０％粘性を下げ得る。製造される様々な種類は、低粘性、中等度の粘性、および高粘性である。より高い粘性のＣＭＣポリマーは、分子量が９０，０００で重合度が４００である最低の粘性のＣＭＣポリマーと比較して、７００，０００という最高分子量、および３２００という重合度を有する。重合度は、鎖の平均長を表し、鎖が長いほど、ポリマーはより粘稠性となるという概念に一致する。置換度（ＤＳ）は、各ＣＭＣポリマーで異なり、ＣＭＣを様々な種類にさらに分類するものであり、ＤＳ０．７は、最も頻繁に利用され、眼用薬剤送達に十分である。７として書かれるＤＳ０．７は、１２として書かれるＤＳ１．２と比較してポリマーの置換度がより低いことに起因して、高い粘性を可能にする。

【0080】

様々なＣＭＣポリマーの最高の粘性は、Ｈにより示され、この研究において、Ｎａ ＣＭＣでは、７ＨＦ ＰＨを利用することにする。上記のように、ＣＭＣには多くの異なる用途がある。様々な種類は、文字で区別され、例えば食品または化粧品ではＦ、医薬品ではＰ、化粧品または医薬品ではＰＨ、工業目的では無しである。この研究において、Ｆ ＰＨは、食品、化粧品、または医薬品の用途について使用されるグレードである。この研究において使用されるＮａ ＣＭＣの濃度は、高い粘性の種類であり、最も眼の滞留を長くさせる１％および３％であった。ポリマーが潤いを与えるための目薬としてこれまでの臨床試験で研究されている場合に、Ｎａ ＣＭＣ１％は、頻繁に使用される。Ｎａ ＣＭＣ３％は、ゲル形成能力を示すことが臨床的に分かっている、より粘性が高い濃度である。Ｎａ ＣＭＣ１％および３％は、両方とも、ヒトの眼に許容できるものとして確認されており、このポリマーから得ることができる最も高い粘性を可能にする。粘性の増加は、薬剤放出を遅延させることに理想的であるが、高すぎる粘性は、眼の不快感を引き起こし得、透明性を損ない得る。この研究は、２つのポリマー濃度間の変動の大きさを異ならせるのに役立ち得る。Ｎａ ＣＭＣは、必要に応じてｐＨ調整を制御する緩衝能力を有するので、ポリマーとして有利でもある。

【0081】

Ｋｙｙｒｏｎｅｎらは、Ｎａ ＣＭＣを添加したときのマレイン酸チモロール、および全身性吸収に関するその結果を研究した。結果は、マレイン酸チモロールを含有するＮａ
ＣＭＣは、非粘稠性目薬と比較して、３〜９倍眼内濃度を向上させたことを結論づけた。また、この研究は、マレイン酸チモロールの全身性吸収率の３３％の低減があり、ポリマーを含有しない他の研究群で見られるＣＶ副作用を緩和したことを示した。これらの利点は、角膜の接触を長くすること、および溶液の鼻涙腺への拡散を遅くすることを可能にするＮａ ＣＭＣの粘膜付着効果に起因していた。Ｊａｒｖｉｎｅｎらは、ウサギにおけ
る眼用マレイン酸チモロールの全身性吸収について、ＣＭＣをカーボポールと比較した。２つの生体接着ポリマーは、等粘性溶液において、全身性吸収の類似の減少があり、血漿におけるマレイン酸チモロールのＡＵＣに５０％の減少があったことを示した。これらの研究は、全身性ＣＶ合併症の発症を減ずる、ベータ遮断薬の全身性吸収の防止におけるＮａ ＣＭＣの効果を明らかにしている。

【0082】

上述したように、粘性の増加は、眼の不快感およびかすみ目というマイナス要素を有する。不快感を増すことなく粘性の増加の利点を得、全身性吸収を防止するために、リン酸カルシウムナノ粒子の添加をこの研究において採用し、検討することにする。この添加は、薬剤送達の速度をさらに低下させることによって、ポリマーを増強する新しいアプローチである。リン酸カルシウムナノ粒子のナノ粒子は、薬剤送達の経路を阻害するために、ポリマーで表面領域の増加を可能にし得る。眼用薬剤送達にナノ粒子を配合することは、必要となるポリマーの使用量を減らし、同時に、薬剤放出速度を低下させ、眼内に留まっている活性成分をなおも維持することが可能であり得る。

【0083】

方法論
この実験のための研究デザインは、リン酸カルシウムナノ粒子のマレイン酸チモロールおよびＮａ ＣＭＣポリマーへの添加、ならびに薬剤の放出速度へのその効果である。様々な濃度のリン酸カルシウムナノ粒子（ＣａＰ ＮＰ）を使用して、ナノ粒子の量が薬剤送達のさらなる遅延と相関するかどうかを判定した。また、２つの異なる濃度のＮａ ＣＭＣポリマーを研究して、粘性の程度が放出速度に影響を与えるかどうかを評価した。この研究は、眼用溶液、眼用ゲル、および様々な濃度のリン酸カルシウムナノ粒子を含有する眼用ゲルなどの異なるマレイン酸チモロールの製剤を取り入れた。マレイン酸チモロールの標準較正曲線を、研究において後に参照するために、最初に開発して、吸光度値に基づいてマレイン酸チモロールの濃度を求めた。様々な製剤を透析管に入れ、次に、透析管を１００ｍｌビーカーのリン酸緩衝食塩水中に入れた。マレイン酸チモロールは、製剤に応じて様々な濃度で、透析管からビーカーに流れた。これらの値をプロットして、マレイン酸チモロールの放出速度が、リン酸カルシウムナノ粒子およびＮａ ＣＭＣポリマーの添加で遅くなったかどうかを判定した。

【0084】

実施例１で説明したように、標準較正曲線を、マレイン酸チモロール塩とリン酸緩衝食塩水を使用して開発した。

【0085】

この研究のために６つのゲルを製造し、表８に要約した。

【表8】

【0086】

所望の濃度のＮａ ＣＭＣポリマーは１％および３％であり、マレイン酸チモロールは０．６８％であった。これらの目標濃度に達するために、より高濃度のポリマーを使用し
てゲルを製造し、５％および９％のＮａ ＣＭＣポリマーを得た。第１に、１％Ｎａ ＣＭＣを含有するマレイン酸チモロールおよび３％Ｎａ ＣＭＣを含有するマレイン酸チモロールを製造した。５％の濃厚ポリマーを製造するために、貯蔵溶液を製造して、３つの異なるゲルのＮａ ＣＭＣに十分な量を製造した。５ｇのポリマーを蒸留水に浸し、これを一夜置いて、水和および均一化させた。次に、３３．３ｍｌのＮａ ＣＭＣおよび０．６８ｇのマレイン酸チモロール塩を共に加えて、１％Ｎａ ＣＭＣを製造した。次に、このゲルを蒸留水で１００ｍｌにした。

【0087】

また、３つのゲルに十分な量を製造するために濃厚な９％のポリマーを製造するため、９ｇのポリマーを２５０ｍｌビーカーに加えた。ポリマーを蒸留水で水和させて１８０ｍｌにし、１時間かけて、マグネチックスターラーの使用により、および手で撹拌することにより、溶解させた。次に、０．６８ｇのマレイン酸チモロール塩を、６０ｍｌのＮａ ＣＭＣが入ったビーカーに加えた。次に、内容物を最終濃度の１００ｍｌにした。ビーカーをスパチュラで混合して、薬剤とポリマーの均一な分散物を製造した。生成物を確実に３００ｍＯｓｍと等張にし、それにより、眼の刺激を引き起こすことなく緑内障のために臨床で使用することが想定される結果を出すことを可能にすることが重要であった。マレイン酸チモロールは、オスモル濃度が３１ｍＯｓｍであり、Ｎａ ＣＭＣは、理論的オスモル濃度が４７０ｍＯｓｍであり、これは、浸透圧に達するためにデキストロースを加える必要性を緩和した。^１８ｐＨを、電極を使用して測った。ｐＨは７〜８であり、そのため、生理的ｐＨに達するために水酸化ナトリウムを加える必要性が生じないようになった。さらに１０分間、混合物をＢｒｅｖｉｌｌｅ Ｓｃｒａｐｅｒ Ｍｉｘｅｒに入れて、混合物をさらに均一にした。

【0088】

様々な濃度のリン酸カルシウムナノ粒子を添加して形成された残りのゲルについて、同じアプローチを実施した。１％および５％強度のリン酸カルシウムナノ粒子を製造するために、それぞれ、１ｇおよび５ｇのナノ粒子を配合することが必要であった。１％のＮａ
ＣＭＣでは、３３．３ｍｌのポリマーを０．６８ｇのマレイン酸チモロールに加え、３％のＮａ ＣＭＣでは、６０ｍｌのポリマーを０．６８ｇのマレイン酸チモロールに加えた。次に、１ｇまたは５ｇのリン酸カルシウムナノ粒子を加えて、各製剤について、それぞれ、１％および５％に達しさせた。内容物を最終濃度の１００ｍｌにし、スパチュラで混合して、薬剤とポリマーの均一な分散物を製造した。最後に、さらに１５分間、内容物をＢｒｅｖｉｌｌｅ Ｓｃｒａｐｅｒ Ｍｉｘｅｒに入れて、混合物をさらに均一にした。全てのゲル製剤を、放出速度研究を始める前に、２４のスピードで、２分間、ホモジナイザーの使用により、均質かつ均一にした。さらに、ゲルの粘性を、Ｈａａｋｅ ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒ ５５０を使用して測った。様々な粘性の度合いが、再現性があり、正確であることを確証するために、粘性研究を２回行った。カーブフィット分析を、ＢｉｎｇｈａｍおよびＯｓｔｗａｌｄ Dｅ Ｗａｅｌｅのモデルを使用して実施した。Ｂｉｎｇｈａｍモデルは、各ゲル製剤について、降伏値の計算を可能にした。Ｏｓｔｗａｌｄ Dｅ Ｗａｅｌｅモデルは、流動コンシステンシー指数（ｋ）および流動性指数（ｎ）を求めることを可能にした。また、Ｈａａｋｅ ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒ ５５０の使用により、チキソトロピー分析を評価して、各製剤のずれ揺変性を求めた。

【0089】

前述の１０ｃｍに事前に切った透析管を、１ｇのゲル、または１ｍｌの溶液で満たした。ゲルおよび溶液の各製剤は、誤差および再現性を説明するために、６つ以上の透析管を有した。溶液またはゲルを透析管に入れたら、管の上部をクリップで留め、タイマーをスタートさせた。マレイン酸チモロール溶液について、第１の放出速度研究を実施した。１ｍｌメスピペットの使用により、溶液を透析管に入れた。次に、内部に溶液が入った透析管を、１００ｍｌのリン酸緩衝食塩水が入ったビーカーに入れた。撹拌子をビーカーに入れ、ビーカーをマグネチックスターラー上に置いて、製剤を均一に保った。蒸発および溶液の損失を防ぐために、ビーカーをパラフィルムカバーで覆った。蒸発が起こったかどう
かを評価するために、各サンプルについて、ビーカーの重量を記録した。透析管からのサンプル濃縮物をピペットにより得、キュベットに入れて、透析管からビーカーに放出されたマレイン酸チモロールを測った。次に、これらのサンプルを、ＵＶ可視分光器に入れて、吸光度測定値を識別した。放出速度研究の間中、各サンプルを評価したときに、時間を記録した。これらの吸光度測定を使用して、上述したようにマレイン酸チモロールの濃度を求めた。ゲル製剤の放出速度研究では、製剤の粘性が高いため、異なる方法を使用して、ゲルを吸い上げて、透析管に入れた。ゲルの様々な製剤を、２４ｍｌシリンジに入れ、次に、３ｍｌシリンジを使用して、２４ｍｌシリンジから、１ｍｌのゲルを吸い上げた。管にゲルを入れる前に、３ｍｌシリンジを秤量し、１ｍｌを透析管に入れた後に、再度秤量した。２つの重量の差が、管内のゲルの量を決めた。この方法は、透析管内に入れられたゲルの量の正確な記述を可能にし、シリンジ内に存在する気泡を考慮に入れるデータの正規化を可能にした。ゲル放出速度研究に関する残りの手順は、上述した溶液と同じであった。

【0090】

サンプルがチェックされる頻度は、製剤が溶液であるか、またはゲルであるか、およびリン酸カルシウムナノ粒子を加えたかどうかに基づいて導かれる。例えば、眼用溶液をチェックする間隔は、より短く、最初に、５分、１０分、１５分にチェックした。（リン酸カルシウムナノ粒子を含有しない）ゲル製剤は、５分、その後１０分おきにチェックした。吸光度値が下がり始めたら、時間間隔を、２０分おき、その後３０分おきに延ばした。これらの初期の眼用ゲル中の放出されたマレイン酸チモロールの量は、残りの期間をチェックする頻度を決定するのに役立った。例えば、マレイン酸チモロールの放出が１０分で最小であった場合、次の間隔は、１０分ではなく、２５分というより長い期間に延ばした。リン酸カルシウムナノ粒子を含有するゲル製剤では、マレイン酸チモロールの放出の最も長い遅延があり得ることが予想された。しかしながら、第１の初期サンプルを、５分にさらに得、次にレベルに基づいて、その時点で、その後の間隔を決めた。ビーカーを２４時間後に秤量して、製剤の損失がないことを確認した。ビーカーの重量を、放出速度研究の開始時に記録した重量と比較した。重量の差は、蒸発に起因するが、研究の開始時の重量に達するように、蒸留水を加え、最後の吸光度の読み取りを１回行った。

【0091】

上述したように、異なる製剤のそれぞれは、試験される６つの異なるサンプルを準備するために、６つ以上の異なる管を有した。このことにより、データがさらに正確になり、再現性が得られ、偶然による誤差がより少なくなった。１％ＣＭＣゲルおよび１％リン酸カルシウムナノ粒子（ＣａＰ ＮＰ）を含有する１％ＣＭＣのゲルに関して放出速度研究が進んだときに、２つのサンプルは、残りのサンプルとある程度の差異があった。このことにより、製剤当りさらに２つのサンプルを加えることになり、従って、８つのサンプルを試験した。５％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣのゲルには、適切にクリップで止められてリン酸緩衝食塩水に入れられてはいなかった１つのサンプルがあった。このサンプルは、他の５つのサンプルと一致しない吸光度を示し、外れ値とみなした。次に、これらの結果を、吸光度対時間のグラフにプロットした。放出速度の結果の直線部分は、マレイン酸チモロールの濃度対時間のグラフの推定を可能にした。ゲル製剤に関するデータを、透析管に含まれるゲルの量に基づいて正規化した。データを管当りの所期のゲルの量（１ｇ）を実際に存在する量で割ることにより正規化した。これは、そのサンプルについて各吸光度に掛けるために使用する因数であった。これにより、その製剤において、全てのサンプルを、互いに直接比較することが可能になった。また、ゲルの正規化吸光度、および溶液の吸光度を、吸光度のパーセントに基づいて評価した。吸光度のパーセントを得るために、それぞれの正規化吸光度（ゲル）または吸光度（溶液）を、マレイン酸チモロールの最大放出であると求められたそのサンプルの最高の吸光度で割った。サンプルの最高の吸光度を１００で割り、吸光度のパーセントを得た。このことにより、その製剤においてだけでなく、全てのその他の製剤において、各サンプルを互いに評価することが可能になった。

【0092】

統計解析を、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４プログラムを使用して実施し、放出速度データに最良にフィットするカーブフィッティングプログラムを使用して、非線形回帰データを求めた。ＡＮＯＶＡ検定を使用して、製剤群間の差異を分析した。ＡＮＯＶＡは、全ての異なる製剤の分散を求め、異なる分散間の相関がどれだけ強いかを判定した。＜０．０５のｐ値を、統計的に有意とみなした。事後検定であるテューキーの検定を実施して、放出速度研究の多重比較を可能にして、様々な製剤と統計的に差異があるデータはどれかを判定した。

【0093】

結果
各サンプルの吸光度のパーセント対時間をプロットし、異なる製剤が、異なる放出速度をもたらすことが示された。各サンプルの直線部分を取り出して、各直線の傾きを求めて、互いに直接比較することにより、このグラフをさらに調べた。各製剤の平均の傾きは、溶液が予想されていた最高の放出速度を有したことを明らかにした（表９）。１％ＣＭＣゲルは、溶液と比較して、マレイン酸チモロールの放出速度を有意には遅延させなかった。しかしながら、１％リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、１％ＣＭＣゲルと比較して、活性薬剤の放出速度を大幅に遅延させた。５％リン酸カルシウムナノ粒子は、さらに放出を遅延させたであろうと予想されたが、反対のことが見られ、１％リン酸カルシウムナノ粒子よりも高い放出速度が見られた。３％ＣＭＣゲルは、全ての１％ＣＭＣ製剤と比較して粘性が高いことに起因して、放出速度を遅延させることが分かった。１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ＣＭＣゲルと一致して、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％ＣＭＣも、ゲル自体よりも遅かった。しかしながら、５％リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、再度、１％リン酸カルシウムナノ粒子と比較して放出速度を増加させた。このことは、リン酸カルシウムナノ粒子は、薬剤だけを含有するただのポリマーと比較して、マレイン酸チモロールの放出を遅延させるが、使用するべき特定の濃度のナノ粒子があることを示す。リン酸カルシウムナノ粒子の濃度が高いほど、放出速度の遅延がより長くなるという濃度依存性相関はない。また、３％ＣＭＣゲルと比較した１％ＣＭＣゲルは、ずっと速かったが、このことは、ポリマーの粘性が放出速度との相関関係を有したことを示す。１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％のＮａ ＣＭＣの粘稠性ポリマーの添加は、全７研究群の中で最低の放出速度を与えることが分かった。１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％のＮａ ＣＭＣゲルは、特定の濃度のナノ粒子と粘稠性ポリマーが、薬剤放出速度に顕著な障害を引き起こし得ることを示した。平均の傾きは、最高の放出速度溶液を有するのは、溶液であり、次に１％ＣＭＣ製剤であり、最後に３％ＣＭＣ製剤であることを明らかにする。

【表9】

【0094】

ＡＮＯＶＡを、様々な製剤からの各サンプルの傾きについて実施した（表１０）。結果は、ｐ値＜０．００１により示される、異なる研究群間の統計的有意差があったことを示す。また、Ｆ統計比は、群内の変動と比較した異なる治療群間の変動を示す。高いＦ比は、様々な製剤を比較する統計有意差を示す。次に、事後分析を、テューキーの検定を使用して、製剤のサンプルからの全ての傾きを調べることにより実施した（表１１）。０．６８％マレイン酸チモロールの溶液製剤は、＜０．０５のｐ値により示される、より遅い放出速度の製剤、例えば３％ＣＭＣポリマーを含有する製剤、および１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％Ｎａ ＣＭＣを含有する製剤からの統計的有意性があった。さらに、溶液と放出速度が類似していると記録された１％ＣＭＣゲルも、＜０．００１のｐ値により示される、３％ＣＭＣポリマー製剤および１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％Ｎａ ＣＭＣとの統計的な差異があった。溶液および１％ＣＭＣゲルは、２つの最速の放出速度データを有し、１％ＣＭＣ５％ＣａＰ ＮＰ以外の他の製剤とは、非常に差異があるとみなされた。１％ＣＭＣ５％ＣａＰ ＮＰゲルは、三番目に速い製剤であり、全ての３％ＣＭＣゲル製剤と比較して、＜０．０５のｐ値により示される統計的差異があった。

【表10】

【表11】

【0095】

時間および吸光度のパーセントを使用する各製剤に関する放出速度データを使用して、各サンプルについてカーブフィットを行った。シグモイドカーブフィットは、散布グラフを最良にフィットするモデルであった。この曲線の方程式は、４つの変数、ｍ１、ｍ２、ｍ３、およびｍ４を有する。製剤からの各サンプルについて平均をとり、表１２にリストする。

【表12】

【0096】

各製剤の粘性を求めた。最も粘性が高いのは、１％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣゲルであり、次いで３％ＣＭＣゲル、５％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣゲル、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ＣＭＣゲル、１％ＣａＰ ＮＰを含有する１％ＣＭＣゲル、１％ＣＭＣゲルであった。これらの結果は、様々なゲルの粘性として予想したことと相関しなかった。粘性データは、ゲル製剤に関する放出速度研究と一致する。

【0097】

各ゲルについて得られた粘性データを、ＢｉｎｇｈａｍおよびＯｓｔｗａｌｄ Dｅ Ｗａｅｌｅのモデルを使用するカーブフィット分析を開発することに使用した（表１３）。流動コンシステンシー指数（ｋ）および流動性指数（ｎ）を、Ｏｓｔｗａｌｄ Dｅ Ｗａｅｌｅのモデルを使用する様々なグラフについて評価した。全てのゲルのｎ値は、＜１であり、これは、ゲルが擬塑性を示すことを示した。この特性は、予想したように、より高いずり速度では、ゲルがより低い粘性を示すことを明らかにした。上述したように、より大きい分子量を有するＮａ ＣＭＣポリマーは、より小さい分子量のＣＭＣポリマーと比較して、より大きいずれ揺変性を示す。^９このことは、ＣａＰ ＮＰを添加したときでも、１％ＣＭＣゲルと３％ＣＭＣゲルとの間のｎ値で見られたことと相関する。Ｏｓｔｗａｌｄ Dｅ Ｗａｅｌｅのモデルからのｋ値も、放出速度研究と一致した。最も遅いゲル放出速度は、最高のｋ値を有する１％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣであり、次いで３％ＣＭＣゲル、その次に５％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣであった。１％ＣＭＣゲル製剤は、より低いｋ値を示した。

【0098】

さらに、チキソトロピーを求め、特にＣａＰ ＮＰを加えたときに各ゲル製剤で変わる、ヒステリシスループおよびずれ揺変性を示した。流動曲線は、応力に関する２つの値を決め、一方の値は、ずれの速度の増加に関し、もう一方の値は、ずれの速度の低下に関するものであり、これらの２つの値の差を表１３に記載した。１％ＣＭＣの粘稠性がより低いポリマーゲルは、ナノ粒子を全く加えていない１％ＣＭＣゲルでは見られなかった負の値を示した。ナノ粒子が加えられた３％ＣＭＣのより粘稠性のポリマーは、３％ＣＭＣゲル自体と比較して、より小さい値を示した。また、降伏値も、放出速度研究の結果と一致した。全ゲルの中で最も遅い放出速度は、１％ＣａＰ ＮＰを含有する３％ＣＭＣであり、これは、最高の降伏値を示したゲルでもあった。３％ＣＭＣゲル製剤は、１％ＣＭＣゲル製剤と比較して、より高い降伏値を示し、応力下で流動する３％ＣＭＣゲル製剤でより高い抵抗があることを示した。降伏値の他に、評価した異なるレオロジーパラメーターの値間の直線関係はなかった。３％ＣＭＣゲル製剤の降伏値は、直線関係を示し、Ｒ^２値が０．９９６であり、ｐ値が＜０．００１であった。

【表13】

【0099】

考察
各製剤に関するマレイン酸チモロールの放出速度は、ポリマーの粘性に基づいて変わった。１％ＣＭＣゲルを最初に研究し、結果は、溶液と比較した放出速度に最小の差異があることを示した。３％ＣＭＣポリマーゲルは、１％ＣＭＣポリマーゲルよりも長い放出速度を示し、粘性が活性薬剤の放出における大きな成分であることを明らかにした。粘性は、薬剤放出の遅延に相関があることがこれまでに分かっていたが、リン酸カルシウムナノ粒子の配合という新しいアプローチも、マレイン酸チモロールの放出速度を下げる特性を示した。この放出速度の遅延は、ナノ粒子の濃度に依存した。５％リン酸カルシウムナノ粒子は、１％リン酸カルシウムナノ粒子と比較して、さらに放出を遅延させたであろうと予想されたが、５％リン酸カルシウムナノ粒子は、活性薬剤のより速い放出を引き起こした。この現象は、１％および３％のＮａ ＣＭＣポリマーの両方の濃度で見られた。この濃度依存性活性がその他のポリマーまたは製剤で見られるかどうかを評価するために実施されたリン酸カルシウムナノ粒子を用いた研究はこれまでに存在しないが、Ｎａ ＣＭＣポリマーとナノ粒子との相互作用があることは明らかである。この相互作用は、残りの製剤の成分にかかわらず、より高い濃度のリン酸カルシウムナノ粒子で見られる。１％リン酸カルシウムナノ粒子は、最も遅い放出速度をもたらし、ナノ粒子が、粘稠性ポリマー単独と比較して、放出速度を遅延させるのに役立つことも明らかにする。

【0100】

分散の分析を実施し、いくつかの製剤の平均の傾きが統計的に有意であることが示された。事後のテューキーの検定は、製剤が放出速度の変動を有することを示した。結果は、溶液が、全てのゲルと比較して最速の放出を有したことを明らかにする放出速度のデータと一致した。さらに、１％ＣＭＣゲルおよび５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ＣＭＣゲルは、溶液の次に最速であり、その他のゲル製剤と統計的な差異があった。これらの結果は、リン酸カルシウムナノ粒子が、放出速度を遅くする能力に関して濃度依存性であるという傾向を支持する。このことは、より高い濃度のナノ粒子がポリマーと相互作用し得ることに起因し得た。また、３％ＣＭＣポリマーは、ナノ粒子を含有する１％ＣＭＣポリマー製剤と統計的に差異があった。溶液対１％ＣＭＣゲルは、統計的に有意ではなかったが、１％ＣａＰ ＮＰの１％ポリマーへの添加は、放出速度に有意な差異を示した。さらに、３％ＣＭＣポリマー対溶液は、放出速度を低下させ、１％ＣａＰ ＮＰの３％ＣＭＣポリマーへの添加は、放出をさらに遅延させた。このことは、ＣａＰ ＮＰが、ポリマーの粘性にかかわらず、放出速度をさらに遅延させるという見解を明らかにする。

【0101】

シグモイドカーブフィットモデルは、プロットされた様々なｍ値を示した。結果は、時間に対して直接比較した場合の様々な製剤が、各ゲルおよび溶液の全てのサンプルの放出速度との整合性を有することを示した。ｍ３およびｍ４値は、放出速度および曲線の形状を決める。しかしながら、ｍ３値は、この研究で分かったデータと一貫して相関するわけではなく、このことは、曲線の形状におけるｍ４の変化に起因し得る。それでもなお、平均のｍ１〜ｍ４値をグラフ化したとき、結果は、放出速度研究と同じ傾向を示した。

【0102】

粘性データは、予想していたように、３％ＣＭＣゲルが、１％ＣＭＣゲルと比較して最高の粘性を示すことを示した。しかしながら、濃度を変えたときのリン酸カルシウムポリマーは、異なる粘性を示し、Ｎａ ＣＭＣポリマーの濃度も因子であった。例えば、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％ポリマーゲル製剤は、全ての他の３％ＣＭＣゲル製剤と比較して最高の粘性を有したが、逆に、５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ポリマーゲル製剤は、全ての１％ＣＭＣゲル製剤と比較して最高の粘性であった。このことは、ナノ粒子とポリマーとの相互作用が両方の成分に関して濃度依存性であることも示す。ゲル製剤のチキソトロピーは、直接比較をしたときに、変わった。全くナノ粒子を添加していないゲルは、Ｎａ ＣＭＣポリマーのこれまでの研究から予想されていた結果を示した。しかしながら、リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ＣＭＣゲルは、ゲルの粘性がずれ応力と共に増加したことを示す負の値を示し、これは、ＣＭＣポリマー単独では通常見られない。リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％ＣＭＣゲルは、粘性が時間依存性のずれ応力と共に減少したことを示す、より小さい正の値を示したが、ポリマー単独よりも低い値であった。ポリマーおよびナノ粒子に基づくチキソトロピーの有意差があるように見える。より高い濃度のポリマーを使用するとき、より高い濃度のポリマーは、正のチキソトロピーの値が見られることにより明らかであるポリマーの効果を失わせる。しかしながら、より低い濃度のポリマーを使用するとき、ナノ粒子は、通常見られることを圧倒する効果を引き起こし、ゲルの粘性は、時間依存的様式で増加する。

【0103】

Ｏｓｔｗａｌｄ−Ｄｅ Ｗａｅｌｅのモデルは、全てのゲルが、高分子量のＮａ ＣＭＣポリマーの特性に基づいて予想されていた擬塑性を維持したことを示した。リン酸カルシウムナノ粒子は、眼用薬剤送達および患者の快適性にとって有益なゲルの擬塑性を変えなかった。Ｂｉｎｇｈａｍモデルから得られた流動コンシステンシー指数および降伏値は、全体的に同じ一般的な傾向で、互いに相関するように見えた。降伏値は、１％ＣＭＣゲル製剤よりも、より粘稠性の３％ＣＭＣゲル製剤でより高いことが分かった。最高の降伏値を有するのは、１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する３％ＣＭＣであり、次いで３％ＣＭＣゲルである。しかしながら、１％ＣＭＣゲル製剤では、最高の降伏値を有したのは、５％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ＣＭＣであり、次いで１％リン酸カルシウムナノ粒子を含有する１％ＣＭＣであった。このことは、リン酸カルシウムナノ粒子が、流れるゲルの初期抵抗に影響を与えることを示すが、この特性の程度は不明である。この同じ特性は、流動コンシステンシー指数で見られ、ポリマーおよびナノ粒子が、濃度に依存する相互作用を有し、前記相互作用がゲル全体のレオロジー特性を決定することを再び顕著にする。また、ゲルについて示された特性は、どの剤が優位であるかを決定するポリマーとナノ粒子の両方の濃度に依存し、優位な剤がゲルの特性を決定する。

【0104】

結論
この研究は、マレイン酸チモロールの薬剤送達速度と共に、粘性およびリン酸カルシウムナノ粒子の添加の効果を例証した。これまでの研究は、眼用ゲルが、溶液に対して、活性薬剤の放出を遅延させることを示していた。しかしながら、リン酸カルシウムナノ粒子の添加は、これまで研究されていなかったが、薬剤放出速度の濃度依存性遅延を示した。１％リン酸カルシウムナノ粒子は、最も遅い放出速度を示した。このことは、眼の快適性を損なうことのない眼用製剤中のナノ粒子に関するさらなる研究を正当化する。上述したように、眼の不快感は、粘性が増加すると起こり得、より粘性のポリマーが理想的ではあるが、実用的でないということを結論付ける。リン酸カルシウムナノ粒子の使用は、薬剤遅延において、ポリマーと同様の薬剤的特性を示し得る。また、ゲルの擬塑性特性は、ナノ粒子で損なわれず、このことは、ずれ揺変性を可能にし、眼の不快感を防止する。この研究は、リン酸カルシウムナノ粒子をポリマーと共に眼用ゲルに使用する場合に、リン酸カルシウムナノ粒子の濃度を評価する、さらなる研究が示唆されることを結論づける。この研究の結果は、ポリマーとリン酸カルシウムナノ粒子との間には、両方の濃度を変えた
ときに、確かな相関があることを意味する。２つの成分間の適当な比を見つけることは、最適な薬剤送達および患者の不快感の緩和を可能にし得る。

【0105】

実施例１および２ 結果およびデータの要約
セルロースエステル透析膜の１０センチメートルのセグメント（３，５００〜５，０００ＤのＭＷＣＯ）を脱イオン水で洗浄して、保存剤を除去した。次に、透析膜セグメントを、２４時間以上、周囲温度で、ＤＰＢＳで平衡化した。透析管を一端で閉じ、約１ｇの製剤で満たし、次に、上端を留めた。それぞれの充填した透析膜「バッグ」を、１００ｍＬのＤＰＢＳで満たしたビーカーに入れて、吸い込み条件を誘発した。撹拌子をビーカーに入れ、次にビーカーをパラフィルムで覆った。次に、各サンプル「セットアップ」を周囲温度でマルチステーション撹拌プレートに置き、同じ速度で撹拌した。各セットアップについて重量を記録し、必要に応じて、脱イオン水を加えて、水の損失を補った。持効性チモロール／ＤＰＢＳサンプルを、測定後、専用使い捨てＵＶキュベットおよびホールピペットを用いてセットアップに戻した。従って、各セットアップ中のＤＰＢＳ受容流体を、取り出した測定済みのサンプルを補うためにＤＰＢＳを加えることによって希釈することはしなかった。

【0106】

チモロールは、製剤から放出され、透析膜を通ってＤＰＢＳに拡散した。高分子量ポリマーおよびＣａＰ ＮＰは、透析バッグ内に残った。チモロールの吸光度（２９５λ）を定期的間隔で、ＵＶ可視分光器を使用して測定した。放出データを、溶液について７時間以上収集し、ゲルについて１８時間以上収集した。１５以上のサンプリング回数を各実験について実施し、各製剤について６つ以上の実験を実施した。透析バッグに移ったゲル製剤の実際の量を測定し、吸光度の読み取りを、１ｇの被試験ゲルに正規化した。放出されたチモロールの測定量を、理論的に放出され得るチモロールの総量のパーセンテージ（％理論）として表した。すなわち、パーセント理論は、０．０６７ｍｇ／ｍｌ（１０１ｍｌに希釈した１ｇｍの０．６８％マレイン酸チモロール）で割ったチモロールの測定量の１００倍に等しい。

【0107】

％理論として表されるチモロール濃度を、各実験について、サンプルを測定した時間に対してプロットした。データを、シグモイドカーブフィットを使用して、一般形のロジスティック関数（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ）を使用して評価した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈで定義されているデータのシグモイドカーブフィッティングに使用する４つの変数の方程式は、Ｙ＝Ｍ１＋（Ｍ２−Ｍ１）／（１＋（Ｘ／Ｍ３）＾Ｍ４）である。本書において、Ｙは、Ｘ（分で表された時間）での放出されたチモロールの量（％理論）である。ロジスティック関数の１つの変数は、透析実験が始まる前の濃度に対応する（Ｍ２）。この変数を０．０％理論に固定して、カーブフィッティングを実施した。第２の変数（Ｍ１）は、無限時間での濃度に対応する。この変数を、全てのチモロールが無限に全製剤から放出されるものと過程して、カーブフィッティングの間、１００％理論と定めた。また、変数Ｍ１およびＭ２を（１００および０．０）と定めず、変化させて、データをこの方程式にフィットさせた。Ｍ１およびＭ２に関する変数値の平均は、それぞれ、９８．８±５．５および１．０±０．９であった。Ｍ１およびＭ２を値が変わるようにしたときに見られたｒ２値の非常にわずかな改善は、自由度が失われたことを正当化しなかった。

【0108】

Ｍ２およびＭ１を固定して、Ｍ３パラメーターを変化させた。Ｍ３パラメーターは、中点（５０％理論）または変曲点が、チモロール放出の最低量（０．０％）と最高量（１００％）との間に達する時間である。従って、Ｍ３の値は、チモロールが製剤からどれだけ速く放出されて、膜を通って受容流体（ＤＰＢＳ）に拡散するのかを示す有効な尺度である。第４の変数（Ｍ４）を、変化させ、形状パラメーターとみなす。Ｍ３と比較して、どれだけ速くチモロールが放出されているかに関して第４の変数（Ｍ４）が与える情報は少ない。

【0109】

通常のチモロール放出特性の代表的なサンプルを、１％Ｃ９８０実験からの個々のデータポイント（８５ペア）に沿ったシグモイドフィットと共に図２に示す。フィットのシグモイド性は、フィットおよびデータを、Ｘ軸として時間ではなくｌｏｇ（時間）で示した場合（図３）に、より容易に認められる。

【0110】

図２および３を観察；７５％理論の近傍で収集したデータは、（初期直線部分から離れた）Ｓ字曲線の上部屈曲部にあるが、シグモイドモデルにより、まだ接近して記載されている。従って、７５％理論に達する時間（Ｔ７５）を、方程式７５＝Ｍ３×｛（３）｝＾（１／Ｍ４）を用いてそれぞれの個々のフィットについて計算した。ここで、時間０の０％理論および無限での１００％理論の仮定を適用する。

【0111】

曲線の直線部分を、放出速度の尺度として調べた。線形回帰を使用して、初期データ対をフィットさせた。データペアの選択を、ｒ２値の増加または減少に関して調べるとともに、視覚的に実施した。より高い傾きの値は、チモロールの放出速度がより速いことを示すと考えられる（図４）。

【0112】

放出の線形性を調べるための別のアプローチは、２分の遅延時間を割り当てること、およびＭ３値により決まる時間までに現れる近似放出曲線の初期「直線」部分を定めることである。図５は、このアプローチの例を示し、シグモイドフィットは、約５０％理論まで、形状がほぼ直線状である。

【0113】

各時点で計算した「線形」値からフィットさせたシグモイド値を引くことは、シグモイドフィットの「線形性」の指標を与える。すなわち、差がゼロに近くなるほど、シグモイドフィットの部分はより線形となる。以下の図を見ると、１％ＣＭＣプラス１％ＣａＰ ＮＰゲルは、０．５％カーボポール９８０プラス５％ＣａＰゲルよりも長期間、幾分線形（±５％以下の差）であることが明らかである。「線形性の終わり」（ＥＯＬ）を、線形性からの差が０に近くなる最後の時点（分）として定義する。

【0114】

Ｍ３、Ｍ４、およびＴ７５値は、各実験についてシグモイドフィットを使用して求めた。統計解析の前に、様々な製剤のＭ３値について外れ値を、ディクソン型検定を使用して検出した。次に、外れた実験を、さらなる統計解析で切り捨てた。生成したＭ３、Ｍ４、およびＴ７５値を、独立したデータ点とみなし、一元配置ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定（ｐ＜０．０５）を使用して、様々な製剤のＭ３、Ｍ４、およびＴ７５値の統計的有意性を判定した。各製剤に関する個々のＭ３、Ｍ４、およびＴ７５値の平均値を、その製剤の代表値とみなす。

【0115】

ゲルの粘性を、Ｈａａｋｅ ｖｉｓｃｏｔｅｓｔｅｒ ５５０を使用して測った。カーブフィット分析を、Ｏｓｔｗａｌｄ−Ｄｅ ＷａｅｌｅおよびＢｉｎｇｈａｍのモデルを使用して実施した。Ｏｓｔｗａｌｄ−Ｄｅ Ｗａｅｌｅモデルにより、粘性関連定数（ｋ）および流動性指数（ｎ）を、τがずれ応力である方程式τ＝ｋγ^・＾ｎに従って求めることが可能となった。ｋ値が高くなるほど、ゲル製剤の粘性はより粘稠性となる。ｎが１に等しい場合、流体は、ニュートン性とみなされる。ｎが１未満の場合、流体は、擬塑性（ずれ揺変性）とみなされ、ｎの値が減少するほど、よりずれ揺変性であるとみなされる。Ｂｉｎｇｈａｍモデルは、各ゲル製剤について、降伏値の計算を可能にした。

【0116】

非線形カーブフィット（シグモイドモデル−ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ）を使用して、各実験を％理論対サンプリング時間について評価した。全ての個々のカーブフィットについて得られたＲ２値は、０．９６〜０．９９に及び、平均値は０．９９であった。各実験に関するＭ３、Ｍ４、およびＴ７５値を平均化した。表１４および１５にリストする。よ
り大きいＭ３中点値は、チモロール放出速度がより遅いことを示す。Ｍ４変数は、形状パラメーターであるが、通常、この研究で見られる範囲内のＭ４の増加により、９０％理論が達成される速度が速くなる。より大きいＴ７５値は、放出がより遅くなる指標である。

【表14】

【表15】

【0117】

ＡＮＯＶＡの結果は、チモロール放出速度の指標とみなされた全ての製剤の値（Ｍ３、Ｍ４、およびＴ７５）の間に、ｐ値＜０．０００１で統計的有意差があったことを示した。Ｍ３、Ｍ４、およびＴ７５値のテューキーの事後分析を使用して、互いと統計的に有意であるチモロール放出速度を生成した製剤はどれであるかを判定した。全体として、比較されている製剤のペア間で平均Ｍ３値に６６分の差があったこと（１つのペアは、５８分の差で統計的差異があった）は、統計的有意性を示す。製剤間のチモロール放出速度における多くの有意差の中で、最も関連性のある差異を表１６に示す。

【0118】

【表16】

【表17】

【表18】

【0119】

直線の傾き（放出の初期部分）の値が平均Ｍ３値に対して回帰した場合に、良好な相関（ｒ^２＝０．８５２６）が、予想していた順序で達成された。Ｍ３値は、データの初期部分について放出速度を適切に記述すると考えられる。良好な正の相関が、製剤に関するＭ３値とＥＯＬとの間に得られた。従って、５０％理論的放出までの時間が最も遅い製剤は、最長の時間、「線形」性も示した。

【0120】

直線の値からの差の一次導関数対時間をプロットすることにより、シグモイドフィットが線形特性と異なる速度を観察することが可能である。図７を見ると、１００％理論がシグモイドモデルでほぼ達成される時間で、ほぼ一定のレベルの変化が、達成されている。ほぼ一定のレベルの変化は、Ｍ３値と強い（負の）相関関係にあり、直線部分の傾きが、放出の遅延を示す製剤では、より小さくなることを示す。

【0121】

図８および９は、それぞれ、放出時間およびｌｏｇ時間の分に対するいくつかの製剤に関する近似曲線の比較を表す。

【0122】

平均Ｔ７５値は、平均Ｍ３値との強い対応関係を示す。０．９４７の相関係数（ｒ）は、Ｔ７５およびＭ３が互いに対して回帰する場合に達成された。Ｔ７５に関する統計的結果は表１７に要約されており、通常、１８８分の差が、統計的有意性を得るために必要である。Ｔ７５に関する要約された結果は、Ｍ３をチモロール放出速度の指標として使用した場合に見られる結果と基本的に同一である。

【0123】

放出されたチモロールの量を決める代替的なアプローチは、％理論ではなく測定された最後の値のパーセンテージによりデータをフィットすることである。最後の値は、通常、１４時間を超える期間の放出後に得られ、％一夜として表された。％一夜として表されたデータについてのＭ３値のフィットが、％理論を用いて得られたＭ３値に対して回帰した場合（Ｒ^２＝０．９８，１．０２の傾き）に、良好な相関が達成された。Ｍ３値は、フィットパラメーターをどのようにして決めるかに関してかなりロバストである形で、放出速度を示すように見える。

【0124】

Ｍ３（曲線の中点）は放出速度の最良の指標であると考えられるが、Ｍ４変数（形状）パラメーターは、シグモイド曲線の直線部分の傾きに関してある程度の目安を与える。Ｍ４値が大きくなると、９０％理論が達成される時間が、より早くなる。平均のＭ３値およびＭ４値が互いに対して回帰した場合、統計的に有意である０．６の相関係数で、中程度の相関が達成される。回帰分析は、概して、より高いＭ４値がより低いＭ３値（より速い放出）と相関することを示す。０．５％Ｃ９８０ゲルのＭ４値対２％ＣａＰを含有する０．５％Ｃ９８０のＭ４値では、Ｍ３値では見られない統計的有意差がある。しかしながら、これらの製剤のＭ３値は、放出速度に関する順番が、Ｍ４値で見られる順番と同じである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】