特表 2018-503802 内皮機能不全を処置するための物質及び方法ならびに被験者における治療の有効性をモニタリングするための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2018-503802(P2018-503802A)

(43)【公表日】2018年2月8日

(54)【発明の名称】内皮機能不全を処置するための物質及び方法ならびに被験者における治療の有効性をモニタリングするための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20180112BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20180112BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20180112BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20180112BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20180112BHJP

   A61P 9/08 20060101ALI20180112BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20180112BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20180112BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

   A61K35/28

   A61P9/00

   A61P9/10

   A61P9/04

   A61P9/08

   G01N33/48 M

   C12Q1/04

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-526979(P2017-526979)

(86)(22)【出願日】2015年11月13日

(85)【翻訳文提出日】2017年6月23日

(86)【国際出願番号】US2015060624

(87)【国際公開番号】WO2016081309

(87)【国際公開日】20160526

(31)【優先権主張番号】62/080,984

(32)【優先日】2014年11月17日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】510250892

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ マイアミ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＭＩＡＭＩ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100062144

【弁理士】

【氏名又は名称】青山 葆

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(72)【発明者】

【氏名】ジョシュア・エム・ヘア

(72)【発明者】

【氏名】コートニー・プレマー

(72)【発明者】

【氏名】アーノン・ブルム

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C087

【Ｆターム（参考）】

2G045AA13

2G045AA24

2G045AA40

2G045BA13

2G045BB20

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045DA13

2G045DA14

2G045DA36

2G045FA11

2G045GC10

2G045JA01

4B063QA07

4B063QA19

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QS33

4B063QS40

4B063QX10

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BB63

4C087CA04

4C087MA16

4C087MA65

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA36

4C087ZA39

(57)【要約】

本開示は、内皮機能不全の処置を必要とする被験者において、それを処置するための物質及び方法を対象とする。処置の有効性を判定する方法もまた提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

被験者において、内皮機能不全のための治療の有効性をモニタリングする方法であって、
内皮機能不全のための治療の適用前に、前記被験者から得られた第１の試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のレベルを測定することと、
内皮機能不全のための治療の適用後に、前記被験者から得られた第２の試料内のＶＥＧＦ及びＥＰＣのレベルを測定することと、を含み、
前記第１の試料内のＶＥＧＦ及びＥＰＣの前記レベルと比較して、前記試料内のＶＥＧＦのレベルが低く前記第２の試料内のＥＰＣのレベルが高ければ、前記内皮機能不全の有効な処置であることを示す、方法。

【請求項2】

内皮機能不全のための前記治療が、間葉系幹細胞治療を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記間葉系幹細胞治療が、前記被験者に対する同種異系の間葉系幹細胞の適用を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

心血管障害に罹患している被験者において、間葉系幹細胞治療の有効性をモニタリングする方法であって、前記幹細胞治療の適用後に、前記被験者から得られた試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを測定することと、ＶＥＧＦの前記レベルを所定の基準と比較することとを含む、方法。

【請求項5】

内皮機能不全の処置を必要としている被験者において、それを処置する方法であって、被験者に対して、同種異系の間葉系幹細胞を、前記被験者内の血管内皮増殖因子の循環レベルを低下させ、内皮前駆細胞のレベルを増大させるために有効な量で適用し、それによって前記内皮機能不全を治療することを含む、方法。

【請求項6】

前記被験者が、心血管障害に罹患している、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記心血管障害が、心不全、特発性拡張型心筋症、及び虚血性心筋症からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記間葉系幹細胞が、局所的に適用される、請求項５に記載の方法。

【請求項9】

前記間葉系幹細胞が、経心内膜注入によって適用される、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記間葉系幹細胞が、約２０００万個〜約１億個の範囲の細胞量で適用される、請求項５に記載の方法。

【請求項11】

前記間葉系幹細胞の適用が、少なくとも３％の、前記被験者における血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）の増大をもたらす、請求項５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

米国政府の利益に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって与えられた認可番号Ｒ０１ＨＬ１１０７３７−０１の下、米国政府の支持をもってなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。

【0002】

本開示は、人間の被験者において、内皮機能不全を処置し、心血管障害に罹患している被験者において、間葉系幹細胞治療の有効性をモニタリングするための物質及び方法を対象とする。

【背景技術】

【0003】

心不全（ＨＦ）は、依然として米国内における主要な罹患及び死亡原因である^１。循環の不全は、心機能低下のみならず、内皮機能不全も特徴とする^２。内皮機能不全は、全身血管抵抗の増大を生じさせ、これが不全の心臓に対してストレスを増加させ、ＨＦ総体症状の原因となる^３、４。また、内皮機能不全は、多数の心血管（ＣＶ）障害の病態生理学のきわめて重大な要素であり、アテローム硬化症、高血圧症、及び糖尿病等のＣＶ危険因子を有する患者に発症する^５、６。また、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）は、内皮に組み入れ、損傷した内皮細胞を置換して、成熟した内皮細胞を活性化させる血管形成因子を分泌することによって血管系の健康を調整する^７、８。とりわけ、ＨＦ患者は、低下した循環ＥＰＣレベル及び生物活性を有する^７。

【発明の概要】

【0004】

内皮機能不全のための治療の有効性をモニタリングする方法が提供される。１つの態様では、本方法は、内皮機能不全のための治療の適用前に、被験者から得られた第１の試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のレベルを測定することと、内皮機能不全のための治療の適用後に、被験者から得られた第２の試料内のＶＥＧＦ及びＥＰＣのレベルを測定することと、を含み、第１の試料内のＶＥＧＦ及びＥＰＣのレベルと比較して、第２の試料内のＶＥＧＦのレベルが低くＥＰＣのレベルが高ければ、内皮機能不全の治療として有効であることを示す。いくつかの実施形態では、内皮機能不全のための治療は、間葉系幹細胞治療を含む。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞治療は、被験者に対する同種異系の間葉系幹細胞の適用を含む。

【0005】

代替的に、本発明は、内皮機能不全のための治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、内皮機能不全のための治療の適用後に、被験者から得られた試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のレベルを測定することと、ＶＥＧＦ及びＥＰＣのレベルを所定の基準、例えば健康な被験者から得られたＶＥＧＦ及びＥＰＣのレベルと比較することとを含む。所定の基準と比較して、試料内のＶＥＧＦのレベル（例えば、試料内のＶＥＧＦのレベルが健康な被験者におけるＶＥＧＦのレベルに対応している）が低くＥＰＣのレベル（例えば、試料内のＥＰＣのレベルが健康な被験者におけるＥＰＣのレベルに対応している）が高ければ、内皮機能不全の治療として有効であることを示す。内皮細胞不全のための任意の治療が、本明細書において意図され、１つの態様では、治療は、細胞ベースの治療、例えば幹細胞（例えば間葉系幹細胞）の適用である。

【0006】

また、本明細書では、心血管障害に罹患している被験者において、間葉系幹細胞治療の有効性をモニタリングする方法が記載され、幹細胞治療の適用後に、被験者から得られた試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを測定することと、ＶＥＧＦのレベルを所定の基準、例えば健康な被験者から得られたＶＥＧＦのレベルと比較することとを含む。試料内のＶＥＧＦのレベルが健康な被験者におけるＶＥＧＦのレベルに対応しているような、試料内の低下したＶＥＧＦのレベルは、有効な幹細胞治療を示す。

【0007】

試料内のＶＥＧＦ及び／またはＥＰＣのレベルを測定するステップは、任意の手段、例えば当技術分野で既知であり、以下に説明されたものによって行われる。例えば、試料内のＶＥＧＦのレベルの測定は、本発明のいくつかの態様においては、試料内のＶＥＧＦタンパク質量の定量化を要するが、ＶＥＧＦ ＤＮＡまたはｍＲＮＡの量の定量化もまた意図されている。いくつかの実施形態では、本方法は、ＥＰＣを試料から分離し、ＥＰＣを少なくとも２４時間培養し、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数を計数することを含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、試料は、血液試料または血清試料である。

【0009】

本開示は、被験者における内皮機能不全を特定する方法をさらに提供し、被験者から得られた試料内の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のレベルを測定することと、被験者から得られた試料内の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のレベルを測定することとを含み、試料内のＶＥＧＦのレベルが高く試料内のＥＰＣのレベルが低ければ、被験者が内皮機能不全に罹患していることを示す。

【0010】

別の態様では、本明細書では、内皮機能不全の処置を必要としている被験者において、それを処置する方法が記載され、被験者に対して、同種異系の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、被験者内のＶＥＧＦの循環レベルを低下させ、ＥＰＣのレベルを増大させるために有効な量で適用し、それによって内皮機能不全を治療することを含む。いくつかの実施形態では、被験者は、心血管障害、例えば心不全、特発性拡張型心筋症及び虚血性心筋症等に罹患している。種々の実施形態では、本方法は、血管緊張を改善させる。

【0011】

間葉系幹細胞は、当技術分野で既知のものを含む任意の好適な方法に従って適用される。いくつかの実施形態では、細胞は、局所的に適用される。いくつかの実施形態では、細胞は、経心内膜注入によって適用される。

【0012】

任意には、間葉系幹細胞は、約２０００万個〜約１億個の範囲の細胞量で適用される。いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞は、約２０００万個〜約３０００万個の細胞、または約２０００万個〜約４０００万個の細胞、または約２０００万個〜約５０００万個の細胞、または約２０００万個〜約６０００万個の細胞、または約２０００万個〜約７０００万個の細胞、または約２０００万個〜約８０００万個の細胞、または約２０００万個〜約９０００万個の細胞、または約３０００万個〜約５０００万個の細胞、または約３０００万個〜約７０００万個、または約３０００万個〜約９０００万個の細胞、または約５０００万個〜約１億個の細胞の量の範囲で適用される。いくつかの実施形態では、約２０００万個、または約２５００万個、または約３０００万個、または約３５００万個、または約４０００万個、または約４５００万個、または約５０００万個、または約５５００万個、または約５０００万個、または約５５００万個、または約６０００万個、または約６５００万個、または約７０００万個、または約７５００万個、または約８０００万個、または約８５００万個、または約９０００万個、または約９５００万個、または約１億個の間葉系幹細胞が、被験者に適用される。

【0013】

いくつかの実施形態では、間葉系幹細胞の被験者への適用は、少なくとも３％の、被験者における血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）の増大をもたらす。

【0014】

本明細書に記載された方法のいずれかにおいては、被験者は、人間の被験者である。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】拡張型及び虚血性心筋症を含む心不全を有する患者における内皮機能。図１Ａは、対象とする患者（ｎ＝２２）が、健康対照（ｎ＝１０、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１）と比較して、障害のあるＥＰＣ−ＣＦＵを見せたことを示す。図１Ｂは、対象とする患者（ｎ＝２２）が、健康対照（ｎ＝１０、＊＊Ｐ＝０．００１７）と比較して、ＦＭＤ％が低かったことを示す。

【図2】同種異系かあるいは自己由来のいずれかの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）で処置された心不全患者における内皮コロニー形成ユニット。図２Ａは、同種異系のＭＳＣで処置された患者が、ＥＰＣ−ＣＦＵの処置３カ月後における有意な改善を見せたこと（ｎ＝１５、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。図２Ｂは、自己由来ＭＳＣで処置された患者が、ＥＰＣ−ＣＦＵ後処置（ｎ＝７）において変化がなかったことを示す。図２Ｃ及び２Ｅは、ＭＳＣ適用前５日間フィブロネクチン上で平板培養されたＥＰＣ−ＣＦＵをそれぞれ示す（倍率２０ｘ）。図２Ｄ及び２Ｆは、ＭＳＣ適用後５日間フィブロネクチン上で平板培養されたＥＰＣ−ＣＦＹをそれぞれ示す（倍率２０ｘ）。

【図3】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）処置前後の血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）測定値。図３Ａは、同種異系のＭＳＣで処置された患者で、ＦＭＤ％が処理３カ月後に増大を見せたことを示す（ｎ＝１５、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図３Ｂは、自己由来ＭＳＣで処置された患者が、ＦＭＤ％の処理３カ月後における有意差がなかったことを示す（ｎ＝７、Ｐ＝ＮＳ）。図３Ｃは、すべての患者（Ｐ＜０．００１、Ｒ＝０．６８４）における、ベースラインからＭＳＣ注入後３カ月までのＦＭＤ％における絶対変化とＥＰＦ−ＣＦＵにおける絶対変化との間の相関を示す。

【図4】患者及び健康対照における血清ＶＥＧＦ濃度。図４Ａは、患者（ｎ＝１４）が、ベースライン（Ｐ＝０．０００９）における健康対照（ｎ＝９）と比較して高レベルの循環ＶＥＧＦを見せたことを実証する。図４Ｂは、同種異系のＭＳＣ（ｎ＝９）による処置を受けた患者では注入後（Δ−５４７．５±３５０．８ｐｇ／ｍＬ）のＶＥＧＦ血清レベルが低下し、一方で、自己由来ＭＳＣによる処置を受けた患者（ｎ＝５）では注入後（Δ８１４．１±８７５．８）、が血清ＶＥＧＦレベルが上昇し、群間に差（＊＊Ｐ＝０．００１２）があったことを実証する。図４Ｃは、ベースラインと３カ月のＭＳＣ後処置との両方において、患者内でＥＰＣ−ＣＦＵと血清ＶＥＧＦとの間に相関があることを示す（Ｒ＝−０．４２１、Ｐ＝０．０２６）。図４Ｄは、ベースラインから３カ月の後処置までのＥＰＣ−ＣＦＵの変化と、ＶＥＧＦにおける変化に強い相関が見られたことを示す（Ｒ＝−０．８６３、Ｐ＜０．００１）。

【発明を実施するための形態】

【0016】

本開示は、増大した血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の循環レベルが、任意には低下した内皮前駆細胞（ＥＰＣ）のレベルと組み合わせて、被験者における内皮機能不全を示し、低下したＶＥＧＦのレベル及び増大したＥＰＣのレベルが、内皮機能不全、血管緊張、及び心血管疾患のための治療有効性を示すという発見に、少なくとも部分的に基づく。本明細書において提供されたデータは、心不全に罹患している被験者に対する同種異系の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の適用が、ＥＰＣ生物活性を促進させ、血流依存性血管拡張反応を正常値まで回復させたことを実証している。同種異系のＭＳＣの能力は、内皮機能の回復、ＥＰＣ ＣＦＵ形成の強化、及びＶＥＧＦレベルの抑制において、自己由来ＭＳＣのものを大きく上回る。これらの知見はともに、ＭＳＣの生物活性に関する新しい臨床上の見識をもたらし、内皮機能不全を特徴とする障害のための新規な治療方針を提案し、処置の成功を検出して測定するための有用な診断用標識を提供する。

【0017】

ＭＳＣは、骨髄内に原型的に発見され、多数の細胞タイプに分化する能力を有する成体幹細胞である。これらは、内因性前駆細胞の増殖及び分化を促進し、幹細胞ニッチの維持において重要な役割を果たす^２７。加えて、ＭＳＣは、血管新生、心筋発生、心血管新生、他の内因性幹細胞の促進、及び免疫システムの調整に関係する傍分泌因子を分泌する^{２８、２９}。ＭＳＣは、心臓内の心臓前駆細胞及び細胞周期活性を促進することが知られているが、他の内因性前駆体集団を促進することにおけるそれらの役割は、従来知られていなかった。本明細書において提供されたデータは、ＭＳＣが内因性ＥＰＣの活性化を促進して、機能性ＥＰＣの数及び質を高めることを立証している。これらの知見は、ＥＰＣの増加が、それによってＭＳＣが好ましい生物学的効果を及ぼす、新規な作用機序を表し得ることを示唆する。

【0018】

過去１０年間にわたり、ＣＶ障害におけるＭＳＣの使用に新たに関心が集まっている^３０。臨床実験は、ＭＳＣ適用のための主要な安全性プロファイル実証しており、ＨＦ患者における有効性を示唆している^{３０〜３２}、しかしながら、潜在的な作用機序については、精力的に議論され続けている。虚血性及び非虚血性の両方のＨＦを有する患者への同種異系のＭＳＣ注入は、結果として、特にＥＰＣ機能、ＦＭＤの回復、及び低いＶＥＧＦレベルの正常値への回復によって、内皮機能を改善させることがすぐに見いだされれば、ＭＳＣの作用機序に主要な新しい見識をもたらされる。試験対象集団において、増大した血清ＶＥＧＦは、減少したＥＰＣ−ＣＦＵと相関し、ＶＥＧＦが補償の役割を果たすという概念に適合しており、また、脳動脈瘤を有する患者においても知見が報告された^２６。本明細書において提供された知見は、同種異系のＭＳＣを使用して、ＥＰＣ生物活性を促進し、動脈の生理的な血管拡張反応を改善させ、ＣＶ疾患及び内皮機能不全に関連する他の障害を有する患者における望ましくないサイトカイン可動化を減少させることができることを立証している。

【0019】

本明細書において提供されたデータは、同種異系のＭＳＣが、患者における内皮機能を自己由来ＭＳＣのものを大きく上回る度合いまで回復させたことを実証する。以下に記載された調査において、すべての同種異系の幹細胞ドナーは、２０〜３５歳の間の健康で若いドナーであった。自分自身の幹細胞を受けている患者は、基礎疾患として慢性疾患を有しているのみならず、年齢がより高かった（４５〜７５歳の間）。自己由来のＭＳＣの老化は、残存、分化、及びＥＰＣを損傷部位に補充するための能力を損ない、最終的にそれらの治療の有効性を低下させるおそれがある^{３８、３９}。

【実施例】

【0020】

方法
試験集団：ＨＦ患者を、ＰＯＳＥＩＤＯＮ−ＤＣＭ（ＮＣＴ０１３９２６２５）、「Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ，Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｉｌｏｔ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｖｅｒｓｕｓ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｎｏｎｉｓｃｈｅｍｉｃ Ｄｉｌａｔｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ」及びＴＲＩＤＥＮＴ（ＮＣＴ０２０１３６７４）、「Ｔｈｅ ＴＲａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｎｅｏｍｙｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｔｕｄｙ」に登録した。ＰＯＤＥＩＤＯＮ−ＤＣＭにおいて、１億個の自己由来あるいは同種異系のＭＳＣのいずれかの経心内膜送達によって受け取るために患者をランダム化した。心臓カテーテル法の４〜６週間前に、自己由来のＭＳＣを患者の骨髄から吸引した（腸骨稜吸引）。ＴＲＩＤＥＮＴ試験において、２０００万または１億個の同種異系のＭＳＣを経心内膜によって受けるように、ＩＣＭ患者をランダム化した。同種異系のＭＳＣを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍによって製造した。健康で年齢２２〜５８歳の男女被験者（ｎ＝１０）を登録した。すべての被験者から文書による同意を取得し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉａｍｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ倫理委員会から試験の承認を受けた。

【0021】

内皮コロニー形成ユニット（ＥＰＣ−ＣＦＵ）：ＭＳＣ注入前及びその３か月後に、患者から末梢血液試料を得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いてＥＰＣを試料から分離し、５００万個の細胞を、ＣＦＵ−Ｈｉｌｌ ｍｅｄｉｕｍ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５９００）１７の中のフィブロネクチンでコーティングした６ウェル皿（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に播種した。４８時間後に非付着性細胞を収集し、１００万個の細胞を、フィブロネクチンでコーティングした２４ウェル皿上に播種した。５日目に、ＥＰＣ−ＣＦＵを５ウェルにおいてカウントし、平均値を得た。

【0022】

血流依存性血管拡張反応（ＦＭＤ）：一晩絶食後の朝、上腕動脈の直径測定及びＦＭＤ％を行った。被験者の右腕を伸ばした位置で固定し、超音波を介して、上腕動脈を肘前窩上５〜１０ｃｍでスキャンした^{１７、１８}。その後、上腕カフを超収縮期血圧（収縮期血圧を上回る４０〜５０ｍｍＨｇ）まで５分間膨張させた。続いて、カフを収縮させて、上腕動脈の直径を３分間記録した。

【0023】

ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ：ベースライン及び同種異系の（ｎ＝６）または自己由来の（ｎ＝５）ＭＳＣ処置後６カ月で、ＤＣＭ患者における血清血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レベル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃ＫＨＧ０１１１）を測定した。ＩＣＭ患者（ｎ＝４）においては、ベースライン及び同種異系のＭＳＣ処置後３カ月で、ＶＥＧＦを測定した。同種異系のＭＳＣの細胞移植を受けたＤＣＭ及びＩＣＭ患者を併合して、自己由来細胞移植を受けた患者と比較した。最後に、健康対照におけるＶＥＧＦを測定した（ｎ＝９）。

【0024】

Ｃ反応性タンパク質：ＣＲＰモノクローナル抗体でコーティングされたラテックス粒子とともに血漿試料がインキュベートされた、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、比濁法を用いて評価した。分析感度は０．２ｍｇ／Ｌであり、結果をｍｇ／Ｌで報告した。

【0025】

統計分析：自己由来細胞により処置した群と同種異系細胞により処置した群との間の差異を評価するために、対応のない両側Ｔ検定を用いた。各群における処置前後の差異を測定するために、対応のある両側Ｔ検定及び一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）の両方を利用した。ガウス分布を前提として、ピアソン相関を用いて相関を計測した。平均値及び平均値の標準偏差としてデータを提示する。ＨＵＶＥＣ処置群間の差異を判定するために、対応のない両側Ｔ検定を用いた。

【0026】

結果
ベースライン特性：本試験では、計２２人の患者を解析対象とした。その内訳は、同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者１５人、自己由来ＭＳＣによる処置を受けた７人であった。試験被験者のベースライン特性を表１に要約する。年齢及び性別を均等に分散させた。

【表1】

【0027】

心不全患者及び健康な被験者におけるＥＰＣ−ＣＦＵ及びＦＭＤ：虚血性（ｎ＝１５）のみならず非虚血性（ｎ＝６）の心筋症を有する患者は、ベースラインでの内皮機能不全を有しており、ＥＰＣ−ＣＦＵを形成する能力の低下と、損なわれたＦＭＤ反応とを特徴とする（図１）。具体的には、患者では、健常対照（それぞれ４±３対２５±１６、Ｐ＜０．００１）と比較してＥＰＣ−ＣＦＵ数が低下しており、ＦＭＤ％が低下していた（それぞれ５．６±３．２対９．２±４、Ｐ＝０．００１７）。

【0028】

ＭＳＣで処置された心不全患者におけるＥＰＣ−ＣＦＵ：ＭＳＣ処置前及びその３カ月後に、ＥＰＣ−ＣＦＵについて患者を評価した。同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者では、処置後のＥＰＣ−ＣＦＵ数に有意な改善が認められた（Δ１０±５、Ｐ＜０．００１、図２Ａ）。一方、自己由来ＭＳＣによる処置を受けた患者では改善は認められなかった（Δ１±３、Ｐ＝ＮＳ、図２Ｂ）。また、同種異系のＭＳＣ処置と自己由来ＭＳＣ処置とを比較したが、同種異系のＭＳＣ処置は、ＥＰＣコロニー形成の促進において優れていた（Ｐ＝０．０２）。

【0029】

また、ＥＰＣ−ＣＦＵを形態についても調べた。ＨＦ患者からのＥＰＣは、組織化されていない不完全なコロニー形成体を有し（図２Ｃ及びＥ）、結果として、機能的コロニーを形成し損なったクラスタが生じた。同種異系のＭＳＣ処置の３カ月後、患者のコロニーは組織化されて、外見は正常となった（図２Ｄ及びＦ）。これらの知見は、経心内膜ＭＳＣ治療が、虚血性及び非虚血性の両方を病因とするＨＦを有する患者において、ＥＰＣ生物活性を促進することを示唆する。

【0030】

ＭＳＣで処置された心不全患者におけるＦＭＤ：ＭＳＣ注入前及びその３カ月後に、上腕動脈ＦＭＤを用いて、すべての患者を評価した。同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者では、ＦＭＤ％に劇的な改善が認められた（Δ３．７±３％、Ｐ＝０．００１、図３Ａ）。反対に、自己由来ＭＳＣ処置を受けた患者では改善が見られず、大多数の患者が処置後３カ月で悪化した（Δ−０．４６±３％、図３Ｂ）。

【0031】

自己由来のＭＳＣでの処置と、同種異系のＭＳＣでの処置との間の差異を解析した。２つの細胞タイプ間には顕著な差異があり（Ｐ＝０．００５）、この患者集団では自己由来のＭＳＣによる処置によって内皮機能が回復しないことが示唆される。また、すべての患者を対象としてＥＰＣ−ＣＦＵとＦＭＤ％との間の相関を評価したところ、ΔＦＭＤ％とΔＥＰＣ−ＣＦＵとの間にきわめて有意な相関が認められた（Ｐ＜０．００１、Ｒ＝０．６８４、図３Ｃ）。

【0032】

自己由来及び同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者におけるＶＥＧＦの評価：患者及び健康対照を対象としてＶＥＧＦ血清循環濃度を測定した。ベースラインのＶＥＧＦ血清循環濃度は、患者において健康対照と比較して非常に高かった（１１３０．３±８０３．３対２．０±５．９ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＜０．００１、図４Ａ）。同種異系のＭＳＣはＶＥＧＦ濃度を低下させ（−５４７．５±３５０．８ｐｇ／ｍＬ、Ｐ＝０．００２）、一方で自己由来ＭＳＣによる処置を受けた患者ではＶＥＧＦの増加が認められた（８１４．１±８７５．８ｐｇ／ｍＬ、図４Ｂ）。さらに、同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者と自己由来ＭＳＣによる処置を受けた患者との間には有意差が認められた（Ｐ＝０．００１２、図４Ｂ）。

【0033】

ＶＥＧＦ濃度はＥＰＣ−ＣＦＵと相関を示した（Ｐ＝０．０２６、Ｒ＝−０．４２１、図４Ｃ）。より驚くべきことに、ベースラインから処置後３カ月までのＶＥＧＦにおける変化幅とＥＰＣ−ＣＦＵにおける変化幅には有意な相関が認められた（Ｒ＝０．８６３、Ｐ＜０．００１、図４Ｇ）。とりわけ、自己由来ＭＳＣによる処置を受けた患者から成るグループによって示されるように、高レベルのＶＥＧＦと低レベルのＥＰＣは相関を示した。逆に、同種異系のＭＳＣによる処置を受けた患者から成るグループによって示されるように、低レベルのＶＥＧＦは高レベルのＥＰＣ−ＣＦＵと相関を示した。総合的に考えると、これらのデータから、ＭＳＣによってＥＰＣ可動化が促進され、ＶＥＧＦ循環濃度における代償的な上昇が抑制されることが示される。

【0034】

要約
本実施例から、ＨＦ患者において、ＭＳＣを用いた経心内膜治療によって強力かつ臨床的に重大な有効性の転帰がもたらされることが示される。同種異系のＭＳＣは、血流依存性の上腕動脈拡張及びＥＰＣ生物活性を回復させ、ＶＥＧＦ濃度を正常値まで回復させる。ＣＶ疾患を有する患者の血管機能における異常は、好ましくない転帰及び疾患の進行を強く示唆することから、内皮機能を標的とすることは重大な治療戦略と言える。また、データから、ＶＥＧＦは、内皮機能不全の治療の成功、血管緊張の回復、及び心血管疾患の合併症の緩和を示す新規な指標とされる。ＦＭＤが改善された被験者では、ＦＭＤが改善されなかった心不全の被験者と比較して、ＶＥＧＦ循環濃度が低く、ＥＰＣ−ＣＦＵのレベルが高かった。

【0035】

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３４．Ｆｒａｎｚ Ａｌｂｅｒ Ｈ，Ｄｕｌａｋ Ｊ，Ｆｒｉｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２００２；３９：１９５１−５．
３５．Ｙｕ ＫＲ，Ｋａｎｇ ＫＳ．Ａｇｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ： ａ ｍｉｎｉ−ｒｅｖｉｅｗ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０１３；５９：５５７−６３．
３６．Ｂｕｓｔｏｓ ＭＬ，Ｈｕｌｅｉｈｅｌ Ｌ，Ｋａｐｅｔａｎａｋｉ ＭＧ，ｅｔ ａｌ．Ａｇｉｎｇ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｆａｉｌ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｃｔ Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４；１８９：７８７−９８．
３７．Ｅｆｉｍｅｎｋｏ Ａ，Ｄｚｈｏｙａｓｈｖｉｌｉ Ｎ，Ｋａｌｉｎｉｎａ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｉｐｏｓｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ａｇｅｄ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｗｉｔｈ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｋｅｅｐ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｂｕｔ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｈａｖｅ Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３．
３８．Ａｓｕｍｄａ ＦＺ．Ａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｉｃｈｅ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ａｇｉｎｇ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｔｈｅｒａｐｙ ２０１３；４：４７．
３９．Ｃｈａｎｇ ＥＩ，Ｌｏｈ ＳＡ，Ｃｅｒａｄｉｎｉ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ａｇｅ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｄｅｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ １α Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００７；１１６：２８１８−２９．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【国際調査報告】