特表 2018-507908 分解性チオール−エンポリマー及びそれを製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2018-507908(P2018-507908A)

(43)【公表日】2018年3月22日

(54)【発明の名称】分解性チオール−エンポリマー及びそれを製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/00 20060101AFI20180223BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20180223BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20180223BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20180223BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20180223BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20180223BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20180223BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20180223BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20180223BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20180223BHJP

   C08G 81/00 20060101ALI20180223BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/00ZNA

   A61K38/02

   A61K47/42

   A61K47/62

   A61K47/64

   A61L27/52

   A61L27/38

   A61L27/36 100

   A61L27/54

   A61K35/12

   C08G81/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】112

(21)【出願番号】特願2017-560474(P2017-560474)

(86)(22)【出願日】2016年2月9日

(85)【翻訳文提出日】2017年10月10日

(86)【国際出願番号】US2016017189

(87)【国際公開番号】WO2016130573

(87)【国際公開日】20160818

(31)【優先権主張番号】62/114,034

(32)【優先日】2015年2月9日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】517278543

【氏名又は名称】モザイク バイオサイエンシズ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】アレクセイ ブイ．カザンツェフ

(72)【発明者】

【氏名】ピーター ディー．マリナー

(72)【発明者】

【氏名】マーティン スタントン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C081

4C084

4C087

4H045

4J031

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076AA95

4C076CC29

4C076EE41

4C076EE59

4C081AB00

4C081BA12

4C081CD111

4C081CD34

4C081DA12

4C081DC11

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA03

4C084NA13

4C084NA14

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087MA05

4C087MA28

4C087NA13

4H045AA20

4H045EA34

4H045FA33

4H045FA40

4J031AA04

4J031AA11

4J031AA15

4J031AA25

4J031AA49

4J031AA52

4J031AA53

4J031AA56

4J031AB06

4J031AC11

4J031AD01

4J031AE07

4J031AE11

4J031AF03

(57)【要約】

ラジカル模倣チオール−エン化学を用いて、ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を他の部分に連結する方法が提供される。例えば、ポリペプチドに反応性チオール基を導入して修飾し、次いでラジカルチオール−エン又はチオール−イン反応を支持する条件下で、チオール基をオレフィン含有試薬又はアルキン含有試薬と反応させることが挙げられる。反応性チオール基はシステインチオール基よりもラジカルチオール−エン反応に関し高い活性を有するチオール基であり、例えばペプチド骨格から少なくとも２つの炭素原子により隔てられたチオール基、例えばホモシステイン残基のチオール基である。また、前記連結されたポリペプチドを含む組成物及び生体材料、例えばペプチド及びタンパク質コンジュゲート、並びにチオール−エンに基づく生体適合性ヒドロゲルポリマー、更にはそれらの医療分野における使用が挙げられる。
【選択図】図８Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチドを連結するための方法であって、前記ポリペプチドがペプチド骨格と１又は２以上の反応性チオール基とを含むと共に、前記方法が、ラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で、前記ポリペプチドの反応性チオール基を１又は２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含み、ここで、前記ポリペプチドの反応性チオール基の前記ラジカル媒介性チオール−エン反応に関する反応性が、システインチオール基の反応性の少なくとも２倍である、方法。

【請求項2】

前記方法が、前記ポリペプチドの反応性チオール基を、ラジカル開始剤及び前記エン化合物と反応させることを含む、請求項１に係る方法。

【請求項3】

前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、請求項１又は２に係る方法。

【請求項4】

前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、又は、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール基である、請求項３に係る方法。

【請求項5】

前記ポリペプチドの反応性チオールが、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基である、請求項３に係る方法。

【請求項6】

前記ラジカル開始剤が、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オンからなる群より選択される光開始剤である、請求項２〜５の何れか一項に係る方法。

【請求項7】

チオール−エン反応が、前記光開始剤を、前記光開始剤の励起波長に合致する波長を有する光に暴露することにより開始される、請求項６に係る方法。

【請求項8】

前記方法が更に、前記光開始剤の量、前記光の強度、及び／又は、前記光開始剤が前記光に暴露される時間を制御することを含む、請求項６又は７に係る方法。

【請求項9】

前記チオール−エン反応が、完了率約７０％〜約９５％に達する、請求項８に係る方法。

【請求項10】

前記ポリペプチドが２以上の反応性チオール基を含み、前記反応性チオール基が各々、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、請求項１〜９の何れか一項の方法。

【請求項11】

前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、請求項１０に係る方法。

【請求項12】

前記ポリペプチドが、ｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、ｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である、請求項１１に係る方法。

【請求項13】

前記エン化合物が、エン修飾生体適合性モノマーである、請求項１２に係る方法。

【請求項14】

前記エン化合物が、ノルボルネン修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１３に係る方法。

【請求項15】

前記ポリペプチドが更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む、請求項１３又は１４に係る方法。

【請求項16】

前記チオール−エン反応が、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを提供する、請求項１５に係る方法。

【請求項17】

前記エン化合物が、１個の反応性エン基を含む、請求項１〜９の何れか一項の方法。

【請求項18】

前記エン化合物が、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドを含む、請求項１７に係る方法。

【請求項19】

前記エン化合物が、生物活性成分を含む、請求項１７に係る方法。

【請求項20】

前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含む、請求項１７〜１９の何れか一項に係る方法。

【請求項21】

前記ポリペプチドが、ペプチド又はタンパク質ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択される、請求項１７〜２０の何れか一項に係る方法。

【請求項22】

前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、請求項１〜９の何れか一項に係る方法。

【請求項23】

前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、請求項２２に係る方法。

【請求項24】

前記方法が更に、第二のチオール化合物を、２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含むと共に、前記第二のチオール化合物が、２以上の反応性チオール基を含む、請求項２２に係る方法。

【請求項25】

前記第二のチオール化合物がｊ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物がｋ個の反応性エン基を含み、ここでｊ及びｋは独立に２以上の整数であり、ｊ＋ｋ≧５である、請求項２４に係る方法。

【請求項26】

前記第二のチオール化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、請求項２４又は２５に係る方法。

【請求項27】

前記第二のチオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含む、請求項２４又は２５に係る方法。

【請求項28】

前記第二のチオール化合物が、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列と、前記ペプチド配列の両側に存在する２個のホモシステイン残基とを含む、請求項２７に係る方法。

【請求項29】

前記第二のチオール化合物が、ポリエチレングリコールと、前記ポリエチレングリコールに付着された２つの末端チオール基とを含む、請求項２４又は２５に係る方法。

【請求項30】

前記エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、請求項２２〜２９の何れか一項の方法。

【請求項31】

１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドを製造することを更に含む、請求項１〜３０の何れか一項の方法、

【請求項32】

１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、カルボキシ基に隣接する炭素原子から２以上の炭素原子により隔てられたチオール基を含有する、保護されたチオール含有アミノ酸又はアミノ酸類似体、例えば保護されたホモシステイン又は２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸、を用いたポリペプチド合成を含む、請求項３１の方法。

【請求項33】

１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、チオール化剤を用いてポリペプチドを修飾することを含む、請求項３１の方法。

【請求項34】

１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、ポリペプチド中のメチオニン残基を、化学的又は酵素的に、ホモシステイン残基に転換することを含む、請求項３１の方法。

【請求項35】

請求項１〜３４に係る方法で製造される連結されたポリペプチド。

【請求項36】

生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを製造するための方法であって、反応性チオール化合物をラジカル開始剤及び反応性エン化合物と反応させることを含み、ここで、前記反応性チオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含み、前記反応性エン化合物が、２以上の反応性エン基を含むエン修飾生体適合性モノマーである、方法。

【請求項37】

前記ポリペプチドが、ｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、ｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である、請求項３６に係る方法。

【請求項38】

前記反応混合物に生物活性成分を加えることを更に含むと共に、前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされる、請求項３６に係る方法。

【請求項39】

前記反応性チオール化合物の反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール、及び、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基から独立に選択される、請求項３６又は３８に係る方法。

【請求項40】

前記ラジカル開始剤が、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オンからなる群より選択される光開始剤である、請求項３６〜３９の何れか一項に係る方法。

【請求項41】

前記反応性エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、請求項３６〜４０の何れか一項に係る方法。

【請求項42】

前記生物活性成分が、組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物である、請求項３８〜４１の何れか一項に係る方法。

【請求項43】

前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックス内に封入されている、請求項４２に係る方法。

【請求項44】

前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスに共有結合されている、請求項４２に係る方法。

【請求項45】

前記生物活性成分が、前記生物活性ポリペプチドの反応性チオール基をエン基と反応させることにより形成されるチオエーテル結合によって、前記ポリマーマトリックスに共有結合されている生物活性ポリペプチドであり、ここで、前記チオエーテル結合のチオ基が、前記生物活性ポリペプチドの骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、請求項４４に係る方法。

【請求項46】

請求項３５〜４５に係る方法で製造される、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー。

【請求項47】

前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、請求項４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー。

【請求項48】

式（Ａ）の化合物：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドである）。

【請求項49】

前記化合物が、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、請求項４８の化合物。

【請求項50】

式（Ｂ）の化合物：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、ｙは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【請求項51】

前記化合物が、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、請求項５０の化合物。

【請求項52】

Ｑが、式（Ｑａ）のポリマー部分である：

【化1】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化2】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、前記式（Ｑａ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分）のうち、一方への付着点を表す）、請求項５０の化合物。

【請求項53】

Ｑが、式（Ｑｂ）のポリマー部分である：

【化3】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化4】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｂ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち、一方への付着点を表す）、請求項５０の化合物。

【請求項54】

式（Ｉ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化5】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【請求項55】

前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、請求項５４のポリマー材料。

【請求項56】

式（II）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化6】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化7】

は、式（II）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【請求項57】

式（III）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化8】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化9】

は、式（III）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【請求項58】

式（Ｃ）の化合物：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分（例えば、薬物、毒素、又は殺虫剤）、ポリマー部分（例えばＰＥＧ）、捕捉部分（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団）、糖又は炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない））。

【請求項59】

前記化合物が、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、請求項５８の化合物。

【請求項60】

式（Ｄ）の化合物：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、ｙは１又は１よりも大きい整数（例えば２、３、４又はそれ以上）であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【請求項61】

前記化合物が、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、請求項６０の化合物。

【請求項62】

Ｑが、式（Ｑｃ）のポリマー部分：

【化10】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化11】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｃ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分、のうち一方への付着点を表す）、請求項６０の化合物。

【請求項63】

Ｑが、式（Ｑｄ）のポリマー部分である：

【化12】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化13】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｄ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分、のうち一方への付着点を表す）、請求項６０の化合物。

【請求項64】

式（IV）の繰り返し単位を含むポリマー材料（例えばチオール−エンヒドロゲル）：

【化14】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【請求項65】

前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、請求項６４のポリマー材料。

【請求項66】

式（Ｖ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化15】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化16】

は、式（Ｖ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【請求項67】

式（VI）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化17】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化18】

は、式（VI）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【請求項68】

ある状態又は障害を、それを必要とする対象において治療する方法であって、請求項３５の修飾ポリペプチド；請求項４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；請求項４８の化合物；請求項５０の化合物；請求項５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５８の化合物；請求項６０の化合物；請求項６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は請求項６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分を投与することを含む方法。

【請求項69】

組織を再生する方法であって、請求項４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーに封入された細胞又は組織を、損傷又は欠損を有する組織の部位で放出することを含む方法。

【請求項70】

生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを含む組成物 損傷又は欠損を有する組織の部位で産生することを更に含む、請求項６９に係る方法。

【請求項71】

請求項３５の修飾ポリペプチド；請求項４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；請求項４８の化合物；請求項５０の化合物；請求項５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５８の化合物；請求項６０の化合物；請求項６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は請求項６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分を含むキット。

【請求項72】

請求項３５の修飾ポリペプチド；請求項４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；請求項４８の化合物；請求項５０の化合物；請求項５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項５８の化合物；請求項６０の化合物；請求項６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；請求項６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は請求項６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分を含む製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は米国仮出願第６２／１１４,０３４号（２０１５年２月９日出願）に基づく優先権の利益を主張する。その開示はその全体が援用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、ラジカルチオール−エン及びチオール−イン化学を用いて、ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を別の部分に連結する方法、及び、斯かる連結ポリペプチド（例えばポリペプチドコンジュゲート及びチオール−エン系生体適合性ヒドロゲルポリマー）を含む組成物、並びにそれらの生体材料分野における使用に関する。

【背景技術】

【0003】

生体材料分野は過去数十年の間に劇的な進化を遂げてきた。新規な生体材料の組合せの開発と共に、技術者達は未だ満たされていない臨床上の要請に応えるポリマー材料を創造すべく、大きく歩を進めてきた。これらの生体材料の創成に使用されてきた古典化学には相当な制約があったことから、本分野の関心は生体適合性バイオポリマーを形成する新たな方法の探索に向けられてきた。クリック化学の登場によって、古典化学の制約の一部を克服するための仕組みは提供されたものの、これらの反応が生物医学工学に活用されるまでには、相当な進展が必要となるであろう。

【0004】

ラジカル媒介性チオール−エン及びチオール−イン化学はクリック様特性を有し、広範な生物医学用途に汎用可能なプラットフォームを提供する。分解性ポリマーの形成にラジカル媒介性チオール−エン化学を用いることは、Bowman等による米国特許第７，２８８，６０８号に記載されたのが最初である（本公報は援用により本明細書に組み込まれる）。ラジカル媒介性チオール−イン化学の使用は、Anseth等による米国特許出願第１３／９８１，８８５号に記載されている（本出願は援用により本明細書に組み込まれる）。一般に考えられているところによれば、とりわけ穏やかなこの化学を用いることで、生細胞及び／又は組織の存在下、段階成長ポリマーネットワークを生成することが可能となる。本明細書に記載のラジカル媒介性チオール−エン化学等のような、重合混合物内の生物活性成分（細胞、組織、タンパク質、ペプチド）を変更しない化学は、しばしば「バイオ直交性（bio直交性）」という語を用いて表される。チオール−エン化学に基づく材料は、創傷治癒、軟骨修復、細胞及び薬物送達など、数々の用途で実証されてきた。

【0005】

McＣall及びAnsethは、最近発表された論文において、ＰＥＧ−ノルボルネンをＰＥＧ−ジチオールとラジカル媒介性チオール−エン反応させて形成されたヒドロゲルにリゾチーム及びＴＧＦβを封入し、その活性を評価している。この実験の結果によれば、「チオール−エンクリック反応は、低開始剤濃度にて、原位置（in situ）でのタンパク質の生物活性に対して殆ど、或いは全く影響を与えることなく、迅速に進行することが可能である」。

【0006】

多くの用途では、タンパク質又はペプチドをポリマー骨格内に組み込むことが有用である。例えば、Anderson等の報告では、ノルボルネン官能化四アーム型（４-arm）ＰＥＧマクロマーをシステイン隣接型（cycteine flanked）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドで架橋することにより、細胞分泌性ＭＭＰで分解されるヒドロゲルネットワークが形成された。このヒドロゲルにヒト間葉系幹細胞を封入したところ、該幹細胞は活性を維持し、増殖能を有することが観察された。別の例として、Mariner等によれば、同様のヒドロゲルに組換骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を封入したところ、ＢＭＰ活性の喪失は見られなかった。なお、最後の例では、架橋性ジシステイン担持オリゴペプチドはポリマー骨格に共有結合されていたのに対し、フリーなチオールを有さないＢＭＰはヒドロゲルに共有結合されておらず、ＢＭＰ２の生物活性の喪失は検出されなかった。システイン残基をペプチド又はタンパク質を介して導入又は連結するこれらの方法は広く使用されており、観察の及ぶ限り、ネットワーク内に封入又は導入された生体成分の活性喪失を招くことはないと考えられている。

【0007】

しかし、本発明者等は予想外にも、システイン隣接型（cycteine flanked）ＭＭＰ分解性ペプチドで架橋されたノルボルネン官能化四アーム型（４-arm）ＰＥＧマクロマーから形成されたチオール−エンヒドロゲルにタンパク質を封入したところ、ヒドロゲルを重合させるのに必要な最少量のラジカル開始剤を用い、最少の時間しか暴露していないにもかかわらず、この反応によって実質的に修飾されることを見いだした。即ち、高濃度の有害なフリーラジカルを生成する必要なく、タンパク質又はペプチドをチオール−エン化学によりポリマーに導入又は連結するための方法が、依然として求められている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本明細書に開示されるのは、ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いて、例えば、ポリペプチドに連結された（システインチオール基よりも高い活性を有する）反応性チオール基を、オレフィン又はアルキン化合物と、ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン反応を促進する条件下で反応させることにより、ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を別の部分に連結するための組成物及び方法である。また、これらの方法により製造される生体材料、並びにその医療分野における使用も開示される。

【0009】

一つの側面によれば、本発明は、ペプチド骨格及び１又は２以上の反応性チオール基を含むポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を連結するための方法であって、ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を促進する条件下で、前記１又は２以上の反応性チオール基を、オレフィン又はアルキン化合物と反応させることを含み、ここで前記チオール基は、ラジカルチオール−エン又はチオール−イン反応の進行に関して、同様の条件におけるシステインチオール基の反応性よりも高い反応性を有する、方法を提供する。ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基の反応性は、システインチオール基の反応性の少なくとも２倍、５倍又は１０倍以上である。ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、ペプチド骨格から少なくとも２つの炭素原子により隔てられている。ある態様によれば、前記反応はラジカル開始剤により開始される。ある態様によれば、前記反応は光により開始されてもよい。ある態様によれば、前記反応は低酸素環境中で、或いは酸素の不在下で実施されてもよい。

【0010】

一つの側面によれば、ポリペプチドを連結するための方法であって、前記ポリペプチドがペプチド骨格と１又は２以上の反応性チオール基とを含むと共に、前記方法が、前記ポリペプチドの反応性チオール基を、ラジカル開始剤と、更には１若しくは２以上の反応性エン基を含むエン化合物、又は、１若しくは２以上の反応性イン基を含むイン化合物と反応させることを含み、ここで前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、方法が提供される。

【0011】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオールは、リシン残基の側鎖アミノ基にＰＥＧリンカー等のリンカーを介して連結されたチオール基である。

【0012】

ある態様によれば、前記ラジカル開始剤は、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（例えばIrgacure^{（登録商標）}２９５９）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（例えばIrgacure^{（登録商標）}１８４）及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン（例えばIrgacure^{（登録商標）}６５１）からなる群より選択される光開始剤である。

【0013】

ある態様によれば、前記チオール−エン反応は、前記光開始剤を、前記光開始剤の励起波長に合致する波長を有する光に暴露することにより開始される。

【0014】

ある態様によれば、前記方法は更に、前記光開始剤の量、前記光の強度、及び／又は、前記光開始剤が前記光に暴露される時間を制御することを含む。

【0015】

ある態様によれば、前記方法は更に、前記反応混合物から酸素を部分的又は完全に除去することを含む。

【0016】

ある態様によれば、非限定的な例としてレオロジーや、エルマンアッセイを用いた遊離チオールの消費量等で測定した場合に、前記チオール−エン反応の完了率は、約７０％〜約９５％に達する。他の態様によれば、前記チオール−エン反応は完了率約７０％〜１００％に達する。他の態様によれば、前記チオール−エン反応は完了率約９５％〜１００％に達する。

【0017】

ある態様によれば、前記ポリペプチドは２以上の反応性チオール基を含み、前記反応性チオール基は各々、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられてなる。

【0018】

ある態様によれば、前記エン化合物は、２以上の反応性エン基を含む。

【0019】

ある態様によれば、前記ポリペプチドはｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物はｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である。

【0020】

ある態様によれば、前記エン化合物はエン修飾生体適合性モノマーであり、前記チオール−エン反応により生体適合性の架橋されたポリマーマトリックスが提供される。

【0021】

好ましい態様によれば、前記エン化合物はノルボルネン修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。

【0022】

ある態様によれば、前記エン化合物はエン修飾非生体適合性モノマーであり、前記チオール−エン反応は非生体適合性の架橋されたポリマーマトリックスを提供する。

【0023】

前記態様のある変形例によれば、前記ポリペプチドは更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列、例えばマトリックスメタロプロテアーゼにより分解されるペプチドを含む。別の変形例によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型（active thiol-flanked）プラズミン分解性ペプチドである。更に別の変形例によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。１又は２以上の酵素分解性配列を含む他の変形例は、当業者であれば理解しうるであろう。

【0024】

ある態様によれば、前記チオール−エン反応によって生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーが提供される。

【0025】

ある態様によれば、前記チオール−エン反応によって生体適合性の架橋された非分解性ヒドロゲルポリマーが提供される。

【0026】

ある態様によれば、前記チオール−エン反応によって非生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーが提供される。

【0027】

ある態様によれば、前記チオール−エン反応によって非生体適合性の架橋された非分解性ヒドロゲルポリマーが提供される。

【0028】

別の側面では、前記エン化合物は１個の反応性エン基を含む。

【0029】

ある態様によれば、前記エン化合物は、ポリマー（例えばＰＥＧ）、捕捉部分（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識）、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドを含む。

【0030】

他の態様によれば、前記エン化合物が、生物活性成分（例えば薬物、毒素、又は殺虫剤）を含む。

【0031】

ある態様によれば、前記ポリペプチドは、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含む。

【0032】

ある態様によれば、前記ポリペプチドは、ペプチド又はタンパク質ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択される。

【0033】

更に別の側面では、前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む。

【0034】

ある態様によれば、前記エン化合物は、２以上の反応性エン基を含む。

【0035】

ある態様によれば、前記方法は更に、２以上の反応性チオール基を含む第二のチオール化合物を、２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含む。ある態様によれば、前記エン化合物は非生体適合性エン化合物である。ある態様によれば、前記第二のチオール化合物は非生体適合性チオール化合物である。ある態様によれば、前記エン化合物は非分解性エン化合物である。ある態様によれば、前記第二のチオール化合物は非分解性チオール化合物である。

【0036】

ある態様によれば、前記第二のチオール化合物がｊ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物がｋ個の反応性エン基を含み、ここでｊ及びｋは独立に２以上の整数であり、ｊ＋ｋ≧５である。

【0037】

ある変形例によれば、前記第二のチオール化合物は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。

【0038】

別の変形例によれば、前記第二のチオール化合物は、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含む。更に他の変形例によれば、前記第二のチオール化合物は、ペプチド骨格と、非分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含む。

【0039】

別の変形例によれば、前記第二のチオール化合物は、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列と、前記ペプチド配列の両側に存在する２個のホモシステイン残基とを含む。

【0040】

別の変形例によれば、前記第二のチオール化合物は、ポリエチレングリコールと、前記ポリエチレングリコールに付着された２つの末端チオール基とを含む。

【0041】

ある態様によれば、前記エン化合物は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。

【0042】

前記全ての側面の変形例によれば、前記方法は更に、１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドを製造することを含む。

【0043】

前記変形例のある態様によれば、１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造は、前記カルボキシ基に隣接する炭素原子から２以上の炭素原子により隔てられたチオール基を含有する、保護されたチオール含有アミノ酸、例えば保護されたホモシステイン若しくは２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸、或いは、保護されたチオール含有アミノ酸類似体又は保護されたチオール含有アミノ酸模倣体を用いた、ポリペプチド合成を含む。

【0044】

前記変形例のある態様によれば、１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、（例えば、ペプチド内のアミノ基を、Ｎ−スクシンイミジル−３−（アセチルチオ）プロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、又はＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ等のチオール化剤と反応させることにより）チオール化剤を用いてポリペプチドを修飾することを含む。

【0045】

前記変形例のある態様によれば、１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、ポリペプチド中のメチオニン残基を、化学的又は酵素的に、ホモシステイン残基に転換することを含む。

【0046】

本明細書にて更に開示されるのは、前記の任意の側面、態様、又は変形例に係る方法により製造される連結ポリペプチドである。ある態様によれば、前記連結ポリペプチドは、生体適合性の架橋されたポリマーマトリックスに連結されてなる。ある態様によれば、前記連結ポリペプチドは、非生体適合性の架橋されたポリマーマトリックスに連結されてなる。

【0047】

別の側面では、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを製造するための方法であって、反応性チオール化合物をラジカル開始剤及び反応性エン化合物と反応させることを含み、ここで、前記反応性チオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含み、前記反応性エン化合物が、２以上の反応性エン基を含むエン修飾生体適合性モノマーである、方法が開示される。ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基を含む。エチレン性不飽和基の例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル

【化1】

、及びノルボルン−２−エン−５−イル

【化2】

、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、前記エン化合物は、ノルボルネン（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）部分を誘導体化したものである。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。ある態様によれば、前記エン化合物の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イル、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。当業者であれば理解するように、前記エン化合物の反応性エン基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。ある態様によれば、前記反応性エン基は、ノルボルネン（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）部分を含む。ある態様によれば、前記エン化合物は、例えば各端にノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）を含む直鎖又は分岐のＰＥＧのように、１又は２以上のノルボルネン（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）基を含む化合物である。ある態様によれば、前記エン化合物は、例えばノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）及びビニルエーテル部分の双方を含むＰＥＧポリマーのように、２以上の異なるエン基を含む化合物である。反応性チオール化合物をイン修飾生体適合性モノマーと反応させるチオール−イン反応の場合、前記イン基としてはエチニル、プロパルギル、プロピオレート（propiolate）、環状アルキン等の部分、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。

【0048】

ある態様によれば、前記方法は更に、前記反応混合物から酸素を部分的又は完全に除去することを含む。

【0049】

ある態様によれば、前記ポリペプチドはｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物はｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍは独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である。

【0050】

ある態様によれば、前記方法が更に、前記反応混合物に生物活性成分を加えることを含み、ここで前記生物活性成分は、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わせて（例えば封入されて、或いは共有結合されて（導入又は連結されて））いる。

【0051】

ある態様によれば、前記チオール化合物の反応性チオール基は、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール、及び、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基から独立に選択される。

【0052】

ある態様によれば、前記ラジカル開始剤は、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（例えばIrgacure^{（登録商標）}２９５９）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（例えばIrgacure^{（登録商標）}１８４）及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン（例えばIrgacure^{（登録商標）}６５１）からなる群より選択される光開始剤である。

【0053】

ある態様によれば、前記反応性エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。

【0054】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基を含む。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イル、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、前記エン化合物は、ノルボルネン由来の化合物、例えばノルボルン−２−エン−５−イル基を含むエン化合物である。ある態様によれば、前記エン化合物の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イル、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。ある態様によれば、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。ある態様によれば、前記エン化合物は、例えばノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）を各末端に含む直鎖又は分岐のＰＥＧのように、１又は２以上のノルボルン−２−エン−５−イル基を含む化合物である。チオール−イン反応のために、前記イン化合物は、１又は２以上のアルキン基、例えばエチニル、プロパルギル、プロピオレート（propiolate）、環状アルキン等、又はこれらの任意の組合せのうち１又は２以上を含む。

【0055】

ある態様によれば、前記生物活性成分は、組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物である。

【0056】

前記態様のある変形例によれば、前記生物活性成分は、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックス内に封入されている。

【0057】

前記態様の別の変形例によれば、前記生物活性成分は、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスに共有結合されて（例えば導入又は連結されて）いる。

【0058】

前記態様の別の変形例によれば、前記生物活性成分が、前記生物活性ポリペプチドの反応性チオール基をエン基と反応させることにより形成されるチオエーテル結合によって、前記ポリマーマトリックスに共有結合されている生物活性ポリペプチドであり、ここで、前記チオエーテル結合のチオ基が、前記生物活性ポリペプチドの骨格から２以上の炭素原子により隔てられている。

【0059】

また、前記側面の種々の態様の何れかに係る方法により製造される、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーも開示される。

【0060】

また、前記側面の種々の態様の何れかに係る方法により製造される、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーであって、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされて（例えば封入又は共有結合されて（導入又は連結されて）いる）いる生物活性成分を更に含む、分解性ヒドロゲルポリマーも開示される。

【0061】

当業者であれば理解するように、一部の変形例によれば、前記側面の方法は、その態様及び変形例の何れかにおいて、非生体適合性及び／又は非分解性エン化合物及び／又は非生体適合性及び／又は非分解性チオール化合物に適用することも可能である。従って、前記変形例の方法により製造される非生体適合性及び／又は非分解性の架橋されたヒドロゲルポリマーも提供される。

【0062】

本明細書では、式（Ａ）の化合物：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり［即ち、Ｐは炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して１又は２以上のチオエーテル部分に連結されてなる］、ｘは１又は１よりも大きい整数［例えば２、３、４又はそれ以上］であり、Ｑは、生物活性成分［例えば薬物、毒素、又は殺虫剤］、ポリマー［例えばＰＥＧ］、捕捉部分［例えばビオチン］、標識［例えば蛍光標識］、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドである）が開示される。

【0063】

当業者であれば理解するように、式Ａにおける硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基（Ｐ−［Ｃ_t−ＳＨ］_xのＳＨ部分）と反応性エン基（適切なエチレン性不飽和基を有するＱの−Ｃ＝Ｃ−部分）とのチオール−エン反応によって生じる部分である。ここでエチレン性不飽和基（−Ｃ＝Ｃ−部分）はＱに対して直接結合していてもよく、リンカー部分を介して結合していてもよいと解され、また本明細書ではそのように定義される。リンカー部分の非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。また、反応性エン基は、末端の無置換のエン基（例えば、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑ）であってもよく、１又は２以上のエチレニル炭素が置換されていてもよい。斯かる置換は、二重結合を含有する環構造（例えばノルボルネン誘導体化Ｑ又はＴ−Ｑ）の一部を−Ｃ＝Ｃ−部分が構成する置換であってもよいと解される。更に、式ＡのＣ_t部分は、少なくとも２原子長のリンカーであり、そのような部分は無置換でも置換されていてもよいと解され、またそのように定義される。

【0064】

ある態様によれば、前記式（Ａ）の化合物は、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される。ここで、Ｐ、Ｃ_t、ｘ及びＱは、式（Ａ）において定義されるとおりである。ある態様によれば、前記式（Ａ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で製造される。

【0065】

ある態様によれば、Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される前記式（Ａ）の化合物が提供される。本化合物は、例えば式Ｐ−［Ｃ_t−ＳＨ］_xの化合物及び式Ｔ−Ｑの化合物をラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と反応させることにより製造されてもよい。ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ及びｘは、式（Ａ）において定義されるとおりであり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す。一つの側面によれば、Ｔは環状アルケン部分である。これはモノシクロ又はビシクロ型のシクロアルケンであってもよく、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される最大２つの環ヘテロ原子を有していてもよく、置換されていてもよい。ここで、ビシクロ型のシクロアルケンは縮合、架橋、又はスピロ環型の何れのビシクロ環であってもよい。ある態様によれば、Ｔはノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。

【0066】

更に本明細書で開示されるのは、式（Ｂ）の化合物：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり［即ち、Ｐはチオエーテル部分に対して、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されてなる］、ｙは１又は１よりも大きい整数であり［例えば２、３、４又はそれ以上］、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）である。

【0067】

当業者であれば理解するように、式（Ｂ）における硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基（Ｐ−Ｃ_t−ＳＨのＳＨ部分）と反応性エン基（適切なエチレン性不飽和基を有するＱの−Ｃ＝Ｃ−部分）とのチオール−エン反応によって生じる部分である。ここで、前記エチレン性不飽和基（−Ｃ＝Ｃ−部分）はＱに対して直接結合していてもよく、リンカー部分を介して結合していてもよいと解され、また本明細書ではそのように定義される。リンカー部分の非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。また、反応性エン基は、末端の無置換のエン基（例えば［ＣＨ_２＝ＣＨ］_y−Ｑ）であってもよく、１又は２以上のエチレニル炭素が置換されていてもよい。斯かる置換は、二重結合を含有する環構造（例えばノルボルネン誘導体化Ｑ）の一部を−Ｃ＝Ｃ−部分が構成する置換であってもよいと解される。更に、式（Ｂ）のＣ_t部分は、少なくとも２原子長のリンカーであり、そのような部分は無置換でも置換されていてもよいと解され、またそのように定義される。

【0068】

ある態様によれば、前記式（Ｂ）の化合物は、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される。ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｙ及びＱは、式Ｂにおいて定義されるとおりである。ある態様によれば、前記式（Ｂ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で製造される。

【0069】

ある態様によれば、Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される前記式（Ｂ）の化合物が提供される。本化合物は、例えば式Ｐ−Ｃ_t−ＳＨの化合物及び式［Ｔ］_ｙ−Ｑの化合物をラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と反応させることにより製造されてもよい。ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ及びｘは、式（Ｂ）において定義されるとおりであり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す。一つの側面によれば、Ｔは環状アルケン部分である。これはモノシクロ又はビシクロ型のシクロアルケンであってもよく、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される最大２つの環ヘテロ原子を有していてもよく、置換されていてもよい。ここで、ビシクロ型のシクロアルケンは縮合、架橋、又はスピロ環型の何れのビシクロ環であってもよい。ある態様によれば、Ｔはノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。

【0070】

更に本明細書で開示されるのは、式（Ｉ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化3】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり［即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている］、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）である。

【0071】

ある態様によれば、前記ポリマー材料は更に、前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされて（例えば封入又は共有結合されて（導入又は連結されて））なる生物活性成分を含む。

【0072】

更に本明細書で開示されるのは、ある状態又は障害を、それを必要とする対象（例えばヒト又は動物）で処置する方法であって、前述の側面、態様及び変形例の、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされて（例えば封入又は共有結合されて（導入又は連結されて））なる修飾ポリペプチド；生物活性成分；又は、ポリマー材料と組み合わされて（例えば封入又は共有結合されて（導入又は連結されて））なる化合物；生物活性成分を投与することを含む方法である。

【0073】

更に本明細書で開示されるのは、組織を再生する方法であって、前述の側面の、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーに封入された細胞又は組織を、損傷又は欠損を有する組織の部位で放出することを含む方法である。

【0074】

ある態様によれば、前記方法は更に、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを含む組成物を、損傷又は欠損を有する組織の部位で産生することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0075】

【図1】図１は、アミノ酸としてＡ）システイン、Ｂ）ホモシステイン、Ｃ）２−アミノ−５−スルファニルペンタン酸、チオール化剤としてＤ）ＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、Ｅ）Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｆ）Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、及びＧ）ＮＨＳ−ノルボルネンのそれぞれの構造を示す。

【0076】

【図2】図２は、リシン残基のＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ修飾を介して反応性チオール基を付加するためのスキームを示す。

【0077】

【図3】図３は、生物活性成分をポリマーマトリックスと組み合わせる模式的な側面の例を示す。

【0078】

【図4A-B】図４Ａ〜４Ｅは、生物活性成分をポリマーマトリックスと組み合わせる模式的な側面の例を示す。

【図4C-D】同上。

【図4E】同上。

【0079】

【図5】図５は、低反応速度のジシステイン架橋剤対ＰＥＧ−ジチオール架橋剤を実証する、レオロジー的微少量のヒドロゲル光重合を示す。

【0080】

【図6】図６は、光開始チオール−エン反応の過程における複数のチオール含有化合物の遊離チオール基の消費量を実証する、エルマン（Ellman）アッセイの結果を示す。

【0081】

【図7】図７は、ジシステイン含有ペプチドをチオール−エンポリマーに導入するのに必要な条件下でのタンパク質の損傷を実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を示す。

【0082】

【図8A-B】図８Ａ及びＢは、ホモシステインを含む複数のチオール含有化合物の光開始チオール−エン反応の過程における遊離チオール基の消費量を実証する、エルマン（Ellman）アッセイの結果を示す。

【0083】

【図9】図９は、低反応速度のジシステイン架橋剤対ジホモシステイン架橋剤を実証する、レオロジー的微少量のヒドロゲル光重合を示す。

【0084】

【図10】図１０は、ジシステイン含有ペプチドをチオール−エンポリマーに導入するのに必要な条件下でのタンパク質の損傷と、ジホモシステイン含有ペプチドをチオール−エンポリマーに導入するのに必要な条件下でのタンパク質の損傷の欠落を実証する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験を示す。

【0085】

【図11】図１１は、溶液中の酸素の存在が、エルマン（Ellman）アッセイにより遊離チオール基の消費速度として観察される、光開始チオール−エン反応の速度に与える影響を実証する。

【0086】

【図12A】図１２Ａは、種々の骨格を有するチオール化合物のそれぞれの構造を示す。

【0087】

【図12B】図１２Ｂは、光開始チオール−エン反応の過程において、システイン骨格の修飾が遊離チオール基の消費量に与える影響を実証する、エルマン（Ellman）アッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0088】

本発明は、ラジカル媒介性チオール−エン及びチオール−イン化学を用いてポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を１又は２以上の他の部分に連結するための組成物及び方法を提供する。当該方法のある側面は、前記ポリペプチドに結合させた反応性チオール基を、ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を促進する条件下で、オレフィン又はアルキン化合物と反応させることを含む。当該方法は、ペプチド及びタンパク質を他の部分に対してラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン反応を介して連結する際に、システインチオールを用いる方法と比較して改善された効率を提供する。本方法を用いて製造される連結ポリペプチド、例えばタンパク質及びペプチドのコンジュゲートやチオール−エン系生体適合性ポリマー等は、ヒトや動物の疾患の治療用途や、創傷治癒や組織再建等の医療用途の生体材料として有用である。

【0089】

本明細書で使用する場合、単数不定冠詞（「a”や“an」）は、別途明記しない限り、１又は２以上を指す。

【0090】

本明細書において、値又はパラメーターに付される「約」（「about」）は、その値又はパラメーター自体を対象とする態様も含む（と共に、その態様も記載する）ものとする。例えば、「約Ｘ」という記載は、「Ｘ」に関する記載も含む。

【0091】

方法
本発明の一側面は、ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を用いて、ポリペプチドを連結するための方法を提供する。現在の科学文献及び特許文献、例えば本明細書で参照する文献等では、システインチオール基を用いたチオール−エン反応を、複数のポリペプチドを連結するための「バイオ直交性」（bioorthogonal）の方法であるとみなしてきた。しかし、これらの教示とは反対に、本発明者等は予想外にも、システイン隣接ＭＭＰ分解性ペプチドにより架橋されたノルボルネン官能化四アーム型（４-arm）ＰＥＧマクロマーから形成されたチオール−エンヒドロゲルに封入されたタンパク質が、ヒドロゲルを重合させるのに必要とされる最少量のラジカル開始剤及び暴露時間を用いた場合であっても、この反応により実質的に修飾されることを見いだした。更に、これらの同一のタンパク質が、ＰＥＧ−ジチオールで架橋されたノルボルネン（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）官能化四アーム型（４-arm）ＰＥＧマクロマーによって形成されたチオール−エンヒドロゲルに封入された場合には、修飾されないことを見いだした。これら２つの実験の主な相違点は、第二の事例では、第一の事例において用いられた開始剤の量の僅か１０分の１（１／１０）の量で、ヒドロゲルを十分に重合させることが可能であったという点にある。この結果は、これらのペプチド内に存在するシステインチオールが、ＰＥＧチオールよりも反応性が低いことを示している。

【0092】

驚くべきことに、本発明者等は、システインのチオール基とペプチド骨格との間に１又は２以上の追加の炭素原子を挿入すると、ラジカル媒介性チオール−エン反応に関する反応性チオールの反応性が増強されることを見いだした。例えば、システインと比べてチオールとペプチド骨格との間に追加の炭素原子を有するホモシステインの反応性は、システインと比べて顕著に増強される。チオール基とペプチド骨格との距離を同様に延長した他の化合物も、チオール基の活性が同様に増強されるであろう。例えば、システインの代わりに２−アミノ−５−スルファニルペンタン酸を用いれば、チオールとペプチド骨格との間に更に２つの炭素原子を追加することができる。

【0093】

更に、本発明者等は、遊離システインがチオール−エン反応に関与する能力を評価した。驚くべきことに、遊離システインは、他の小分子チオール、例えばジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、ホモシステイン、システアミン及び３−メルカプトプロピオン酸等と比較して、実質的に低下した活性を示した。

【0094】

本分野における現在の教示と相反するこれらの観察結果を考え合わせると、ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いてペプチドとエン含有部分とを、ペプチド内のシステイン残基を介して反応させるための条件は、前記反応混合物内に含有される生物活性成分を修飾し、或いは他の手法で損傷させることが可能な、高濃度の有害なフリーラジカルの生成に繋がることが示唆される。即ち、しばしば指摘されるラジカル媒介性チオール−エン化学の特性、即ちバイオ直交性（bioorthogonality）は、これらの条件下では維持されない。

【0095】

システインチオールと比較して増強された反応性を有するチオール基を用いる場合、反応に必要なラジカル開始剤の濃度はより低く、前記反応混合物中に存在する有害なフリーラジカルの濃度はより低く、及び／又は、反応の完了に要する時間はより短くなる。斯かる知見から導かれる結論は、これらの増強されたチオールを使用することで、チオール−エン反応のバイオ直交性という所望の特性が実現されるということだ。

【0096】

ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン反応におけるホモシステインの使用は、従来はごく限られた場面でしか論じられてこなかった。Yan等(2013)は、プロプ−２−イン−１−イル−（２−オキソテトラヒドロチオフェン−３−イル）カルバメートを使用することにより、非ペプチドポリマーにホモシステインを導入した。非水性環境において、プロプ−２−イン−１−イル（２−オキソテトラヒドロチオフェン−３−イル）カルバメートをアミノ分解すると、アルキン含有置換ホモシステイン残基が形成される。これを引き続き、同様に形成される化合物の別の分子のアルキン部分、或いは生成されたポリマーのアルケン部分との反応により、遊離ラジカル化学的開始剤の不在下で重合させる。本論文で使用された条件下では、この反応は累積で１５時間の太陽光照射後に完了する。In Espeel等(2011)は、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ホモシステインチオラクトンを使用することにより、非ペプチドポリマーにホモシステインを導入した。非水性環境において、Ｎ−（アリルオキシカルボニル）ホモシステインチオラクトンをアミノ分解すると、アルケン含有置換ホモシステイン残基が形成される。これを引き続き、同様に形成される化合物の別の分子のアルキン部分との反応により、遊離ラジカル化学的開始剤の不在下で重合させる。本論文で使用された条件下では、この反応は３時間のＵＶ光照射後に完了する。Yan等やEspeel等の論文に記載される反応は、比較的ゆっくりと進行すると共に、非水性環境において小モノマーを用いて実施されるものであった。ホモシステインをチオール−エン反応 に用いることで、水性ヒドロゲルに封入された生物活性成分の活性を保存する試みは、従来は議論されていなかった。

【0097】

即ち、一側面によれば、ポリペプチドを連結するための方法であって、前記ポリペプチドがペプチド骨格と１又は２以上の反応性チオール基とを含むと共に、前記方法が、ラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で前記ポリペプチドの反応性チオール基を１又は２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含む方法が提供される。また、ポリペプチドを連結するための方法であって、前記ポリペプチドがペプチド骨格と１又は２以上の反応性チオール基とを含むと共に、前記方法が、ラジカル媒介性チオール−イン反応を促進する条件下で、前記ポリペプチドの反応性チオール基を、１又は２以上の反応性イン基を含むイン化合物と反応させることを含む方法が提供される。本発明の方法に適した反応性チオール基は、ラジカルチオール−エン又はチオール−イン化学の条件下で、システインチオール基よりも高い反応性を有する。ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、ラジカル媒介性チオール−エン反応において、システインチオール基の少なくとも２倍という高い反応性を有する。ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、ラジカル媒介性チオール−エン反応において、システインチオール基の少なくとも３倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍という高い反応性を有する。２つのチオール基の相対反応性とは、（例えばエルマン（Ellman）アッセイを用いて）例えばチオール基の消費速度により測定される、同一の反応条件下でのこれら２つのチオール基の反応の相対速度である。ある態様によれば、相対反応性とは、同一の反応条件下で（例えば光化学的に開始された反応下、同一濃度のチオール、エン、及び開始剤の存在下、同一の波長及び強度の光を用いて）、前記ポリペプチドの反応性チオール基を用いた反応速度が、システインを用いた反応速度を表示の値で乗算したものと一致することを意味する。

【0098】

チオール−エン反応は化学的に又は光化学的に開始することができる。ある態様によれば、前記反応はラジカル開始剤により開始される。ある例によれば、前記反応は開始剤化合物の不在下で、光（例えばＵＶ光又は太陽光）により開始されてもよい。好ましい態様によれば、ラジカル開始剤は光開始剤化合物でもよい。適切な光開始剤、例えばBowman等により使用される光開始剤、例えば米国特許第第７，２８８，６０８号公報及び国際公開第２０１２／１０３４４５号公報に記載の光開始剤を使用できる。ある態様によれば、光開始剤は、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）又はフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）である。ある態様によれば、光開始剤は、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（例えばIrgacure^{（登録商標）}２９５９）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（例えばIrgacure^{（登録商標）}１８４）、又は２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン（例えばIrgacure^{（登録商標）}６５１）である。

【0099】

チオール−エン反応は典型的にはフリーラジカルを生成する光開始剤の光分解により開始される。好ましくは、使用される光の波長は、前記光開始剤の励起波長と合致するように選択される。即ち、ある態様によれば、チオール−エン反応は、前記光開始剤を、前記光開始剤の励起波長に合致する波長を有する光に暴露することにより開始される。ＬＡＰ又はＮＡＰの場合、光の波長は約３７２ｎｍであり、３６０ｎｍから３８０ｎｍまでは許容できる範囲である。２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（例えばIrgacure^{（登録商標）}２９５９）の場合、光の波長は約２７６ｎｍ又は３３１ｎｍである。１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（例えばIrgacure^{（登録商標）}１８４）の場合、光の波長は約２４６ｎｍ、２８０ｎｍ又は３３３ｎｍである。２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン（例えばIrgacure^{（登録商標）}６５１）の場合、光の波長は約２５４ｎｍ又は３３７ｎｍである。

【0100】

最適な結果を得るためには、概して、前記チオール−エン反応が所望の完了状態に到達する（或いはほぼ到達する）のに必要な最少の光開始剤の量及び暴露時間を選択することが推奨される。特定の態様によれば、チオール−エン又はチオール−イン反応が完了率１００％未満、例えば約９８％、約９５％、約９０％、約８０％、又は完了率約７０％に到達するように、暴露時間が選択される。これにより、前記反応混合物の他の成分に対する過度のラジカル損傷を避けることができる。本発明の一態様によれば、ネットワーク形成は、光強度、暴露時間、及び開始剤濃度の関数であるレオロジーによりモニターされる。別の態様によれば、反応はエルマンアッセイを用いた遊離チオールの消費量によりモニターされる。レオロジー及びチオール消費量の他にも、反応をモニターするための更なる方法は、当業者には明確である。

【0101】

即ち ある態様によれば、チオール−エン化学を用いてポリペプチドを連結する方法は、前記光開始剤の量、前記光の強度、及び／又は、前記光開始剤が前記光に暴露される時間を制御することを更に含む。ある例によれば、前記チオール−エン反応が１００％完了していないものの、所定の目標が実質的に達成された時点まで反応を行うことが、前記反応混合物の他の成分に実質的な損傷が及ぶのを避けることができる点で望ましい。例えば、合理的な程度に高速での光重合が達成されるように、光誘導性重合を比較的高濃度の光開始剤を用いて実施することが好ましい。斯かる例では、反応を１００％完了させるための開始剤の全量は必要とされない。斯かる例では、チオール−エン反応を１００％完了させてしまうと、開始剤の光分解により生じるフリーラジカルからの保護作用を有するチオール−エン反応物は完全に消費されてしまうため、生物活性カーゴ（cargo）に損傷が生じてしまう。これらの例では、前記チオール−エン反応の完了目標を１００％未満とすることで、反応の完了度合いとカーゴ（cargo）の完全性との合理的な妥協を容易に図ることが可能となる。とりあえずの例（an ad hoc example）としては、チオール−エン光重合反応を特定の条件下で９０％まで完了させることにより、予測可能な機械弾性特性（mechano-elastic properties）を有するヒドロゲルを形成すると共に、１０％のチオール又はエンを残存させることで、封入された生物活性カーゴ（cargo）を十分に保護することが可能となる。例えば、一態様によれば、光開始剤が０．０１重量％のＬＡＰ又は０．０１重量％のＮＡＰであり、前記反応混合物を１９ｍＷ／ｃｍ^２の３８０ｎｍの光に１０秒暴露する。ある態様によれば、前記チオール−エン反応は（下限）約７０％、８０％、９０％、９５％、又は９８％の完了率に到達する。ある態様によれば、前記チオール−エン反応は（上限）約９９．９９％、９９．９％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％又は８５％の完了率に到達する。即ち、前記チオール−エン反応の所望の完了率は、約７０％〜約９９．９９％の範囲から選択される任意の完了率であり、下限が上限よりも小さければよい。ある態様によれば、前記チオール−エン反応は、完了率約７０％から完了率約９５％の範囲に到達する。

【0102】

チオール−エン又はチオール−イン反応は、任意の適切な媒体又は溶媒の中で実施される。しかし、タンパク質や他の水容性の生体材料を伴う反応では、水性媒体が好ましい。即ち、ある好適な態様では、ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いてポリペプチドを連結するための方法は、水性環境又は水性媒体の中で、反応性チオール基をエン／イン化合物と反応させることを含む。当然ながら、例えば水性溶媒の存在下で反応を実施する場合等には、これらの方法により、ポリマーマトリックスを含むヒドロゲルが形成されることがある。

【0103】

典型的には、大気と平衡状態にある水溶液は、約２００μＭ濃度の溶存酸素を含んでおり、これが多くのラジカル媒介性反応の阻害剤となることが知られている。しかし、ラジカル媒介性チオール−エン重合は、現在のところ、酸素媒介性阻害による影響を受けないと考えられている。ラジカル媒介性チオール−エン反応が酸素阻害に対して感受性ではないとの報告は、多くの文献（例えばMcCall, J. D.及びAnseth, K. S., 2012、更にはHoyle, C. E., Lee, T. Y.及びRoper, T. 2004等を参照）。しかし、予想外にも、バイオポリマーの急速な形成を生じるノルボルネン及びチオールの濃度、例えば反応性チオール基及び反応性エン基の各濃度が１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲では、酸素が阻害作用を有すること、また、反応物溶液から酸素を除去することで、こうした酸素阻害を回避できることが見いだされた。従って、一側面によれば、（例えば反応を低酸素環境下で実施して）溶存酸素への反応の暴露を低減させることにより、ラジカル媒介性チオール−エン反応の反応速度を増加させる方法が提供される。ラジカル媒介性チオール−エン反応を低酸素環境下で実施することで、反応速度を増加させ、惹いては任意のチオール化合物／エン化合物の対、例えばシステイン／ノルボルネンの対やホモシステイン／ノルボルネンの対等について、不所望の副反応を防止することができると考えられる。一つの側面によれば、低酸素環境下で反応を実施することにより（例えばチオール化合物及びエン化合物を、脱気した溶液中、ラジカル媒介性チオール−エン反応に適した条件下で反応させることにより）、ラジカル媒介性チオール−エン反応のラジカル媒介性副生成物を低減する方法が提供される。ある態様によれば、チオール化合物は反応性チオール基を含有し、前記反応性チオール基はシステインのチオール基残基である。ある態様によれば、チオール化合物は反応性チオール基を含有し、前記反応性チオール基はホモシステイン残基のチオール基である。ある態様によれば、前記エン化合物は、１又は２以上のノルボルン−２−エン−５−イル部分を含む。ある特定の側面によれば、前記チオール−エン反応は脱気した溶液中で実施され、ここで反応性チオール基の濃度は１ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、反応性エン基の濃度は反応性チオール基の濃度と同等であるか、或いはこれと合理的な程度に近い濃度である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１ｍＭから５０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１ｍＭから４０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１ｍＭから３０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１ｍＭから２０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１ｍＭから１０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも１０ｍＭから５０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも２０ｍＭから５０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも３０ｍＭから５０ｍＭの範囲である。ある変形例によれば、反応性チオール基及び反応性エン基の濃度は、何れも４０ｍＭから５０ｍＭの範囲である。

【0104】

チオール−エン又はチオール−イン反応は、低酸素環境下で、例えば酸素の不在下で、或いは反応の酸素暴露を低減するための手段を何ら講じない場合のチオール−エン反応と比較して低減された量の酸素の存在下で、実施することができる。例えば、反応の開始前に、本技術分野で一般に使用される方法により、反応溶液を脱気してもよい。ある態様によれば、ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いてポリペプチドを連結するための方法は、反応媒体から酸素を除去することを含む。

【0105】

ある態様によれば、前記エン化合物は、非生体適合性エン化合物である。ある態様によれば、前記チオール化合物は、非生体適合性チオール化合物である。ある態様によれば、前記エン化合物は、非分解性エン化合物である。ある態様によれば、前記チオール化合物は、非分解性チオール化合物である。

【0106】

反応性チオール含有ポリペプチド
本発明の方法に適した前記ポリペプチドの反応性チオール基は、ラジカル媒介性チオール−エン反応について、ペプチド骨格から炭素原子一つにより隔てられているシステインチオール基よりも高い反応性を有する。ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている。ある態様によれば、前記ポリペプチドは、１又は２以上の反応性チオール基を含む。ある態様によれば、ポリペプチドは、本発明の方法に適した１又は２以上の反応性チオール基を導入するように修飾されてなる。ある態様によれば、ポリペプチドのシステイン残基が、稀少アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体で置換されてなる。ポリペプチドに導入可能な反応性チオール基の限定されない例を下記表１に示す。表１の側鎖修飾アミノ酸残基は、ポリペプチドへの導入又はポリペプチド内での存在に適したアミノ酸残基であって、ラジカル媒介性チオール−エン反応において反応性エン基と反応しうるアミノ酸残基である。斯かる側鎖修飾アミノ酸残基は、ポリペプチド骨格とチオール基との間のアルカンジイル部分が、システインに比べて延長されてなる（１又は２以上の追加のリンカー基、例えば非限定的な例としてアミド及び／又はＰＥＧ部分等を含んでいてもよい）という所望の特性を有する。如何なる理論にも縛られるものではないが、延長されたアルカンジイル部分は、システインチオールにより形成されるラジカルと比較してチオールラジカルを不安定化する結果、システインチオールを用いた場合と比較して遊離ラジカル媒介性チオール−エン反応速度を増加させるものと考えられる。こうした反応速度の増加は有益であり、重要な効果をもたらす。斯かる効果としては、例えばラジカル媒介性副反応の量や程度の低減、組織や他の生物学的生成物への損傷の低減、（内因性システインの修飾の発生率の低減による）修飾が所望されるペプチドの選択性の向上、患者臨床時の処置プロトコールの迅速化（例えば、反応完了までの時間を約５〜５０分の１に短縮、例えばシステイン系チオールでは９０秒のところを、側鎖修飾アミノ酸では２〜１０秒に低減）等が挙げられる。表１の骨格修飾アミノ酸残基（例えばβ−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基、アミノ酸類似体、及びアミノ酸模倣体等）とは、ラジカル媒介性チオール−エン反応時に反応性エン基と反応しうるチオール部分を有し、ポリペプチドへの導入に適したアミノ酸残基を指す。斯かる骨格修飾アミノ酸残基は、非修飾ポリペプチド骨格と比べてチオール−エン反応の総反応速度を増加させるのに有用であると考えられ、例えば副反応低減、選択性向上、及び処置プロトコールの迅速化等、側鎖修飾アミノ酸残基と同じ有益な特性を有すると予想される。

【表1】

【0107】

以下の［実施例］欄でも例示するが、ペプチド骨格とチオールとの間に１又は２以上の炭素原子を介在させるようにチオールをペプチドに導入する方法は多数存在する。これらの方法としては、これらに限定されるものではないが、以下が挙げられる。１）（ペプチドの骨格となるべき）２位の炭素原子から、チオールが２以上の炭素原子により隔てられてなる、保護されたアミノ酸を用いたペプチド合成。斯かる保護されたアミノ酸の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｆｍｏｃ−保護構成要素（Ｓ）−２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−４−トリチルスルファニル−酪酸（Bachem）又は（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−（トリチルチオ）−ペンタン酸（ポリペプチド）が挙げられる。２） チオール化剤を用いたペプチドの修飾。斯かるチオール化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、及びＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨが挙げられる。３）メチルトランスフェラーゼ反応によるメチオニンのホモシステインへの転換。

【0108】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、又は、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール基である。ホモシステイン又は２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基を含むポリペプチドは、本分野で公知のペプチド合成法、例えば本明細書に記載の方法を用いて製造できる。図２に、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨをチオール化剤として用いて、リシン残基の側鎖に反応性チオール基を導入する方法を挙げる。

【0109】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、アミノ基の側鎖アミノ基（例えばリシン残基の側鎖アミノ基又はＮ−末端アミノ基）にリンカーを介して連結されたチオール基である。前記ポリペプチドの反応性チオール基は、リシンの側鎖アミノ基に対して、チオール化剤を用いて連結されてなる。斯かるチオール化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、及びＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ等が挙げられる。

【0110】

ポリペプチドを連結するための方法のある態様は、反応性チオール基をラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン反応を促進する条件に供する前に、１又は２以上の反応性チオール基を含むポリペプチドを製造することを更に含む。ある態様によれば、前記方法は、保護されたチオール含有アミノ酸を用いたポリペプチド合成を含み、ここで前記チオール基は、前記カルボキシ基に隣接する炭素原子から２以上の炭素原子により隔てられてなる、例えば限定されるものではないが、保護されたホモシステイン（例えば（Ｓ）−２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−４−トリチルスルファニル−酪酸等）又は２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸（例えば（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−（トリチルチオ）−ペンタン酸等）等である。ある態様によれば、前記方法は、チオール化剤を用いてポリペプチドを修飾すること、例えばペプチド内のアミノ基をチオール化剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（アセチルチオ）プロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、又はＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ等と反応させることを含む。ある態様によれば、前記方法は、ポリペプチド中のメチオニン残基を、化学的又は酵素的に、例えばメチルトランスフェラーゼ反応等により、ホモシステイン残基に転換することを含む。

【0111】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、非天然アミノ酸に連結されたチオール基、例えばチオール置換βアミノ酸、チオール置換γアミノ酸、チオール置換δアミノ酸、又はチオール置換εアミノ酸等のチオール基である。チオール置換βアミノ酸、チオール置換γアミノ酸、チオール置換δアミノ酸又はチオール置換εアミノ酸残基を含むポリペプチドは、本分野で公知のペプチド合成法、例えば本明細書に記載の方法を用いて製造することができる。

【0112】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基は、アミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体残基に連結されたチオール基である。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分又はより長い炭素鎖（任意により酸素、硫黄、及び窒素から選択された１又は２以上のヘテロ原子が介在していてもよい）により置換された、天然アミノ酸、稀少アミノ酸又は非天然アミノ酸から誘導される。ある態様によれば、アミノ酸類似体又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分又はより長い炭素鎖（任意により酸素、硫黄、及び窒素から選択された１又は２以上のヘテロ原子が介在していてもよい）により置換された、天然アミノ酸、稀少アミノ酸又は非天然アミノ酸から誘導される。

【0113】

前記態様のある変形例によれば、前記チオール化合物は、非生体適合性チオール化合物である。前記態様の別の変形例によれば、前記チオール化合物は、非生体適合性チオール化合物である。前記態様のある変形例によれば、前記チオール化合物は、分解性チオール化合物である。前記態様の別の変形例によれば、前記チオール化合物は、非分解性チオール化合物である。

【0114】

本発明のポリペプチドを連結するための方法を用いて、タンパク質又はペプチドを第二の部分に連結してもよい。第二の部分としては、生物活性成分（例えば本明細書に記載の成分）を有する部分や、ポリペプチドに追加の特性を付与する部分、例えばインビボ（in vivo）での循環半減期を延長するポリマー（例えばＰＥＧ）、捕捉機能を提供する親和性タグ、例えばビオチン、抗体、アプタマー（又は他の捕捉部分又はタグ）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団等）、糖又は他の炭水和物、核酸、リボヌクレオタンパク質、別のポリペプチド、脂質又は別の疎水性部分、ナノ粒子、ナノチューブ、又は高次マクロ分子アセンブリ等が挙げられる。

【0115】

本発明の方法を用いて種々のポリペプチドを修飾することができる。特定の態様によれば、ポリペプチドは、ペプチド及びタンパク質ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択される。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体や同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン、及びコラーゲン等が挙げられる。

【0116】

本発明の方法を用いて、分解性ペプチドを、チオール−エン又はチオール−イン系のヒドロゲルポリマーに導入してもよい。ある態様によれば、前記ポリペプチドが更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。別の態様によれば、ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。特定の態様によれば、ポリペプチドは、ホモシステイン隣接型マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinase：ＭＭＰ）分解性ペプチドである。これは、細胞分泌性ＭＭＰにより分解されるヒドロゲルネットワークを形成する。

【0117】

ある態様によれば、前記方法は、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含むポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）を用いる。ある態様によれば、前記ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）は、各々前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、２以上の反応性チオール基を含む。ある態様によれば、前記ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）は、各々前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、２つの反応性チオール基を含む。ある態様によれば、前記ポリペプチド（ペプチド及びタンパク質を含む）は、各々前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、３つ又は４つ又はそれ以上の反応性チオール基をを含む。ある態様によれば、前記反応性チオール基は、ホモシステイン残基のチオール基、２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール基、又は、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカー（例えばＰＥＧリンカー）を介して連結されたチオール基である。

【0118】

エン／イン含有化合物
本発明の方法において有用なエン化合物又はイン化合物は、ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学に適したエン化合物又はイン化合物、例えばラジカルチオール−エン又はチオール−イン条件下で反応性を有するアルケン又はアルキン基（「反応性エン基」又は「反応性イン基」）を含む化合物であれば、その種類は任意である。エン化合物（又はエン含有化合物）は、反応性エン基と、反応性エン基を担持する足場を構成するエン担持部分とを含む。適切なエン化合物のリスト、並びにそれらの相対反応速度の表示は、Hoyle等(2004)、“Thiol-enes: Chemistry of the past with promise for the future”に記載されている。本文献は引用により本明細書に組み込まれる。イン化合物（又はイン含有化合物）は、を含む the 反応性イン基と、反応性イン基を担持する足場を構成するイン担持部分とを含む。

【0119】

前記態様のある変形例によれば、前記エン化合物は、非生体適合性エン化合物である。前記態様の別の変形例によれば、前記エン化合物は、非生体適合性エン化合物である。前記態様のある変形例によれば、前記エン化合物は、分解性エン化合物である。前記態様の別の変形例によれば、前記チオール化合物は、非分解性エン化合物である。

【0120】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基を含む。その例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イル等が挙げられる。好ましい態様によれば、前記エン化合物は、ノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。ある態様によれば、前記エン化合物の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。ある態様によれば、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。ある態様によれば、前記エン化合物は、１又は２以上のノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。前記イン化合物は、１又は２以上のアルキン基、例えばエチニル、プロパルギル、プロピオレート（propiolate）、環状アルキン等を含む。

【0121】

反応性エン基及びそれらの対応するチオール−エン反応生成物の限定されない例を表２に示す。表中、点線は付着点を意味する。

【表2】

【0122】

当業者であれば理解するように、反応性チオール基の硫黄原子を、反応性エン基の炭素−炭素二重結合のいずれかの末端に連結してもよい。これも当業者であれば理解するように、チオール−エン反応は、反応性エン基の炭素−炭素二重結合面の何れの側で生じてもよい。結果として、前記チオール−エン反応の生成物は、（炭素−炭素二重結合の異なる炭素原子に対する反応により）位置異性を生じうると共に、（炭素−炭素二重結合の異なる面での反応により）立体異性も生じうる。可能な生成物の全てが本発明の対象となる。更に当業者には理解されるように、２以上の同一の反応性エン基を含むエン化合物を用いれば、個々の反応性エン基が異なる反応を生じた生成物を得ることができる。非限定的な例としては、ＰＥＧジノルボルネン（２つのノルボルン−２−エン−５−イル反応性基を有するエン化合物）により、一のノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）が５−エキソ硫黄を有するチオエーテル結合を生じ、他のノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）が６−エンド硫黄を有するチオエーテル結合を生じた生成物を得ることができる。当然ながら、斯かる多様な化合物も本発明に含まれる。

【0123】

エン／イン化合物のエン／イン担持部分は、本発明のラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン反応により、反応性チオール含有ポリペプチドに共有結合される。前記エン／イン担持部分は、連結により達成しようとする具体的な機能特性に応じて選択される。限定されない例としては、蛍光団又は発色団の導入、親和性タグの導入、酵素活性の導入、所定の化学的部分又は部分の導入、溶解性、薬物動態、薬動力学、又は生体膜や固体表面との相互作用を改変するための親水性、疎水性又は両親媒性ポリマー端の導入、更なる重合のためのタンパク質含有ポリマー又はテレケリック（telechelic）モノマーの生成等があげられる。前記エン担持部分には、以下の適切な誘導体（限定されない例）を含んでいてもよい。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマー、メロキサポール（meroxapols））、ポロキサミン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースやメチルヒドロキシプロピルセルロース、並びに、天然ポリマー、例えばポリペプチド、核酸、多糖類、又は炭水和物、例えばポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、及びその同様の誘導体、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、又はアルギン酸、並びに、タンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミン、又はオボアルブミン、フィブリノーゲン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質又はその類似体、蛍光及び非蛍光色素、蛍光消光剤、高親和性タグ、例えばポリペプチドタグ（Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ等）、抗体及びその断片、核酸アプタマー、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、高次マクロ分子アセンブリ、例えばリボヌクレオタンパク質、ウイルスカプシド等が挙げられる。エン担持部分は、任意の公知の修飾を有する核酸（「修飾核酸」）を含んでいてもよい。修飾核酸の例としては、修飾塩基（例えば塩基の１又は２以上の位置、例えば２’ 位及び５位に、修飾を有する塩基）を導入した核酸や、ロックド核酸が挙げられる。

【0124】

ある態様によれば、エン／イン化合物は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸、ロックド核酸、多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるエン／イン担持部分を含む。

【0125】

ある態様によれば、エン／イン担持部分は、生物活性成分を含んでいてもよい。ある態様によれば、エン／イン担持部分は、ポリペプチドに連結されることによりポリペプチドに追加の特性を付与する第二の部分を含んでいてもよい。第二の部分の例としては、インビボ（in vivo）での循環半減期を延長するポリマー（例えばＰＥＧ）、捕捉機能を提供する親和性タグ、例えばビオチン、抗体、アプタマー（又は他の捕捉部分又はタグ）、糖又は他の炭水和物、核酸、別のポリペプチド等が挙げられる。ある態様によれば、エン／イン担持部分は、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドを含む。エン／イン官能基は、本明細書に詳細に記載したエン／イン担持部分や、他の適切な化合物に対して、本技術分野で公知の方法により導入することができる。

【0126】

生物活性成分としては、多種多様な物質や化合物が挙げられる。その例としては、これらに制限されるものではないが、組織、細胞、タンパク質、ペプチド、毒素、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物が挙げられる。細胞型としては、上皮又は間葉由来の細胞、例えば幹細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、骨芽細胞、軟骨細胞、及び内皮細胞が挙げられる。タンパク質の非限定的な例としては、接着ペプチド（例えばＲＧＤ接着配列）、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、ホルモン、抗ホルモン、シグナル伝達化合物、酵素、血清タンパク質、アルブミン、マクログロブリン、グロブリン、凝集素、レクチン、細胞外マトリックスタンパク質、抗体、及び抗原等が挙げられる。他のタンパク質としては、ペプチド及びタンパク質ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質が挙げられる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。小分子薬物としては、これらに限定されるものではないが、鎮痛剤、解熱剤、非ステロイド抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗細菌剤、抗貧血剤、細胞毒性剤、抗高血圧剤、皮膚病薬、精神治療剤、ビタミン、ミネラル、食欲抑制剤、栄養剤、抗肥満剤、炭水和物代謝剤、タンパク質代謝剤、甲状腺剤、抗甲状腺剤、及び補酵素が挙げられる。農業用化合物としては、これらに限定されるものではないが、殺菌剤、除草剤、肥料、殺虫剤、炭水和物、核酸、有機分子、及び無機生物活性分子等が挙げられる。

【0127】

当業者であれば理解するように、本明細書に記載のエン／イン担持部分にエン／イン基を追加する方法は数多く存在する。これらの方法により、エン／イン担持部分とエン／イン官能基との間にリンカー基を形成することができる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）をＰＥＧに対してエステル結合を介して連結する。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）をＰＥＧに対してアミド結合を介して連結する。限定されない例を以下に提示し、ノルボルネン修飾ＰＥＧの形成について説明する。

【化4】

【0128】

ある態様によれば、本方法では、１つの反応性エン基を含むエン化合物。ある態様によれば、前記エン化合物は、２以上の反応性エン基を含む。ある態様によれば、前記エン化合物は、２つの反応性エン基を含む。ある態様によれば、前記エン化合物は、３つ又は４つ又はそれ以上の反応性エン基を含む。

【0129】

ポリペプチド 修飾／誘導体化
ある態様によれば、ラジカル媒介性チオール−エン反応により、ポリペプチドに別の部分（第二の部分）を連結して、ポリペプチドを修飾することができる。ある態様によれば、ペプチドは、１又は２以上の反応性チオール基を有する。前記の反応性チオール基は、前記ペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられていてもよい。前記第二の部分は、１又は２以上の反応性エン基を含む。好ましい態様によれば、ペプチドは斯かる反応性チオール基を１つのみ有し、第二の部分は反応性エン基を１つのみ有する（図４Ｄ）。

【0130】

ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いてポリペプチドを連結するための方法のある態様によれば、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の１又は２以上の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、本明細書に記載の１個の反応性エン基を含む。斯かる例では、本明細書に記載の１又は２以上のエン担持部分は、前記ポリペプチドの１又は２以上の反応性チオール基から誘導されるチオエーテルを介して、前記ポリペプチドに連結されてなる。

【0131】

特定の態様によれば、前記ポリペプチドは、以下のペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択することができる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0132】

ある態様によれば、前記エン化合物は、生物活性成分、例えば、薬物、毒素、又は殺虫剤を含む。ある態様によれば、前記エン化合物は、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、捕捉部分又はタグ（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団）、糖又は炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドを含む。

【0133】

本方法のある態様によれば、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の１つの反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、本明細書に記載の１個の反応性エン基を含む。斯かる例では、前記ポリペプチドは、前記エン化合物のエン担持部分に対し、前記チオール−エン反応により形成されるチオエーテル結合を介して、連結（コンジュゲート）されてなる。

【0134】

これらの方法を用いて、タンパク質又はペプチドを第二の部分に連結してもよい。第二の部分としては、生物活性成分（例えば本明細書に記載の成分）を有する部分や、ポリペプチドに追加の特性を付与する部分、例えばインビボ（in vivo）での循環半減期を延長するポリマー（例えばＰＥＧ）、捕捉機能を提供する親和性タグ、例えばビオチン、抗体、アプタマー（又は他の捕捉部分又はタグ）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団等）、糖又は他の炭水和物、核酸、別のポリペプチドが挙げられる。本方法の一態様は、ペプチドにモノマーを連結することにより、ペプチドのＡＤＭＥ特性を変更するのに用いられる。別の態様によれば、官能基が付加される。

【0135】

この方法の重要な利点の一つは、１又は複数のシステイン残基の存在下で、タンパク質を特異的に誘導体化できるという点である。即ち、前記ペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられたチオールの活性が増加していることから、前記チオール−エン反応が、タンパク質内の他のシステインチオール基と比較して、その活性チオール基で優先的に生じる。

【0136】

更に、本明細書に記載の方法により製造される連結ポリペプチド（例えば生物活性成分、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドに連結されたポリペプチド）も提供される。

【0137】

ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を用いてポリペプチドを連結する方法のある態様によれば、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の１つの反応性チオール基を含み、エン／イン化合物は、本明細書に記載の１又は２以上の反応性エン／イン基を含む。斯かる例では、本明細書に記載の１又は２以上のポリペプチドは、本明細書に記載のエン／イン担持部分に対して、前記ポリペプチドの反応性チオール基から誘導されるチオエーテルを介して連結されてなる。

【0138】

これらの態様の一部によれば、前記エン／イン化合物は、本明細書に記載のエン／イン担持部分の何れかを含んでいてもよい。ある態様によれば、前記エン化合物は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含んでいてもよい。

【0139】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基を含む。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。好ましい態様によれば 前記エン化合物が、ノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。ある態様によれば、前記エン化合物の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。ある態様によれば、前記エン化合物は、１又は２以上のノルボルネン（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）基を含む。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。前記イン化合物は、１又は２以上のアルキン基、例えばエチニル、プロパルギル、プロピオレート（propiolate）、環状アルキン等を含む。

【0140】

ある態様によれば、ラジカル媒介性チオール−エン反応により形成されたポリマーマトリックスに、ラジカル媒介性チオール−エン反応によりペプチドを導入することにより、ポリペプチドを修飾する（図４Ｃ）。特定の態様によれば、前記ポリマーマトリックスは、第二のチオール化合物とエン含有化合物との間のポリマー媒介性チオール−エン反応により形成される。ある態様によれば、前記ポリマーマトリックスは生体適合性である。他の態様によれば、前記ポリマーマトリックスは非生体適合性である。ある態様によれば、前記ポリマーマトリックスは分解性である。他の態様によれば、前記ポリマーマトリックスは非分解性である。

【0141】

ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を用いてポリペプチドを連結する方法のある態様によれば、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の１つの反応性チオール基を含み、前記エン／イン化合物は、本明細書に記載の２以上の反応性エン／イン基を含む。即ち、ポリペプチドをチオール−エン系ポリマー（例えば生体適合性架橋分解性ヒドロゲルポリマー）に連結する方法であって、前記ポリペプチドは、ペプチド骨格と、１つの反応性チオール基（例えば前記ペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている反応性チオール基）とを含むと共に、前記方法は、ラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で（例えばラジカル開始剤を用いる条件下及び／又は水性環境中で）、前記ポリペプチドの反応性チオール基及び第二のチオール化合物を、２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含み、ここで前記第二のチオール化合物が、２以上の反応性チオール基を含む、方法が提供される。

【0142】

これらの態様の一部によれば、前記ペプチドは、以下のペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択することができる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0143】

これらの態様の一部によれば、前記第二のチオール化合物がｊ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物がｋ個の反応性エン基を含み、ここでｊ及びｋは独立に２以上の整数であり、ｊ＋ｋ≧５である。

【0144】

特定の態様によれば、前記第二のチオール化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。好ましい態様によれば、前記第二のチオール化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。

【0145】

ある用途では、連結されるポリペプチドを制御下で放出するために、連結されるチオール−エン系ポリマーは分解性ポリマーマトリックスを有することが必要となる。他の用途では、連結されたポリペプチドにおいて構築された異なる機序を通じて、連結されたポリペプチドを保持し、又は連結されたポリペプチドを放出する非分解性ポリマーマトリックスが必要となる。

【0146】

即ち ある態様によれば、前記第二のチオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含む。ある態様によれば、前記第二のチオール化合物が、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。特定の態様によれば、細胞分泌性ＭＭＰにより分解されるヒドロゲルネットワークを形成するために、前記第二のチオール化合物が、２つのホモシステイン残基により挟まれた、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列、例えばジホモシステインで挟まれたメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドを含む。別の態様によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。他の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。

【0147】

他の態様によれば、前記第二のチオール化合物が、ポリエチレングリコールと、前記ポリエチレングリコールに付着された２つの末端チオール基とを含む。ある態様によれば、前記ポリペプチドは、一つの反応性チオール基を含み、前記反応性チオール基は、ペプチド骨格から少なくとも２つの炭素原子を含むリンカー及び分解性部分を以て隔てられてなる。即ち、連結されたポリペプチドは、ポリマーマトリックスを分解しなくとも放出することができる。これらの態様の一部によれば、前記方法は更に、ペプチド骨格から分解性部分を含むリンカーによって隔てられた反応性チオール基を含むポリペプチドを製造することを含む。

【0148】

特定の態様によれば、前記エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。好ましい態様によれば、前記エン化合物は、ポリペプチド、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む。

【0149】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基、例えば、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルを含む。好ましい態様によれば 前記エン化合物が、ノルボルン−２−エン−５−イル基を含む。ある態様によれば、前記エン化合物の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。ある態様によれば、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。

【0150】

更に、本明細書に記載の方法により製造される、１又は２以上の連結されたポリペプチドを含む化合物（例えばエン担持部分に連結された複数のポリペプチド化合物、又はチオール−エン系ポリマー）も提供される。

【0151】

架橋
ラジカル媒介性チオール−エン化学を用いてポリペプチドを連結するための方法のある態様によれば、前記ポリペプチドは、本明細書に記載の２つの反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、本明細書に記載の２つの反応性エン基を含む。斯かる例では、ラジカル媒介性チオール−エン反応により誘導されたチオエーテル結合を介してエン担持部分に連結された前記ポリペプチドを含む繰り返し単位を有する直鎖ポリマーが形成される。

【0152】

ラジカル媒介性チオール−エン又はチオール−イン化学を用いてポリペプチドを連結する方法のある態様によれば、前記ポリペプチドが、本明細書に記載の２以上の反応性チオール基を含み、前記エン／イン化合物は、本明細書に記載の２以上の反応性エン／イン基を含む。斯かる例では、本明細書に記載の１又は２以上のポリペプチドが、前記ポリペプチドの反応性チオール基から誘導されたチオエーテルを介して、本明細書に記載のエン／イン担持部分に連結されてなる。

【0153】

特定の態様によれば、前記方法は、ｎ個の反応性チオール基を含むポリペプチドと、ｍ個の反応性エン基を含むエン化合物とを用い、ここでｎ及びｍは、独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である。前記ポリペプチドは、反応性チオール基を介してエン担持部分に架橋され、チオール−エン系ポリマーマトリックスを形成する。

【0154】

前記エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。好ましい態様によれば、前記のエン基は、ノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。非限定的な置換基の例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。

【0155】

前記イン化合物は、１又は２以上のアルキン基、例えばエチニル、プロパルギル、プロピオレート（propiolate）、環状アルキン等を含んでいてもよい。

【0156】

ある態様によれば、前記エン化合物は、本明細書に記載のエン含有化合物の何れであってもよい。ある態様によれば、前記エン化合物は、エン修飾生体適合性モノマーであり、前記チオール−エン反応により生体適合性の架橋されたポリマーマトリックスが提供される。

【0157】

当業者であれば理解するように、本明細書に記載のエン／イン担持部分にエン／イン基を付加する方法は数々存在する。これらの方法により、エン／イン担持部分とエン／イン官能基との間にリンカー基が形成される。一態様によれば、ＰＥＧが５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾されることにより、１又は２以上の末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）部分がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンがＮＨＳ−ノルボルネンで修飾されることにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（例えばノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してアミド結合を介して結合される。

【0158】

ある態様によれば、前記イン化合物は、本明細書に記載のイン含有化合物の何れであってもよい。ある態様によれば、前記インは、イン修飾生体適合性モノマーであり、前記チオール−イン及びその後のチオール−エン反応により、生体適合性の架橋されたポリマー材料が提供される。

【0159】

ある態様によれば、前記ポリペプチドが更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列、例えばマトリックスメタロプロテアーゼによるペプチド分解性を有することが既知のペプチド配列を含む。ある態様によれば、前記ポリペプチドは、２つのホモシステイン残基で挟まれた、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列、例えばジホモシステインにより挟まれたメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドを含む。斯かるポリペプチドを用いて作製されたヒドロゲルネットワークは、細胞分泌性ＭＭＰによる分解性を有する。斯かるポリペプチドの具体例の一つは「ｈＣ ＭＭＰＡ」である。これはジホモシステイン類似体ＭＭＰＡ（アミノ酸配列ＫＣＧＰＱＧＩＡＧＱＣＫ）であって、ＭＭＰＡと同一の配列を有すると共に、各システイン残基がホモシステインで置換されてなる。別の態様によれば、前記ポリペプチドは活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。

【0160】

ある態様によれば、前記エン化合物は、エン修飾生体適合性モノマーであり、前記ポリペプチドは、２つのホモシステイン残基によって挟まれた、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列（例えば、ジホモシステインによって挟まれたメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチド）を含む。斯かる場合、前記チオール−エン反応によって、生体適合性の架橋された分解性（例えばＭＭＰによる分解性）ヒドロゲルポリマーが提供される。

【0161】

ある態様によれば、架橋反応の際に、エン化合物の代わりに、或いはエン化合物に加えて、アルキン含有化合物（又はイン化合物）が用いられる。一次チオール−イン付加物を更に反応性チオールとのチオール−エン反応に供することにより、更なる架橋が行われる。

【0162】

更に、本明細書に記載の方法により製造される、架橋されたポリペプチド（例えば架橋されたチオール−エン系ポリマー）が提供される。

【0163】

架橋された分解性ヒドロゲルポリマー
一つの側面によれば、ポリペプチド架橋剤を含むチオールを用いてエン化合物を架橋することにより、生体適合性ポリマーが作製される（例えば図３Ａ又は図４Ａ）。前記ポリペプチドは、２又はそれ以上の反応性チオール基を含むように合成され、或いはそのように修飾される。前記の反応性チオール基は、前記ポリペプチド骨格から、２又はそれ以上の炭素原子によって隔てられていてもよい。特定の態様によれば、２又はそれ以上のホモシステイン残基を前記ポリペプチド内に組み込むことにより、２又はそれ以上のチオールが提供される。

【0164】

ある態様によれば、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを製造するための方法であって、反応性チオール化合物をラジカル開始剤及び反応性エン化合物と反応させることを含み、ここで、前記反応性チオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含み、前記反応性エン化合物が、２以上の反応性エン基を含むエン修飾生体適合性モノマーである、方法が提供される。

【0165】

特定の態様によれば、前記ポリペプチドが、ｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、ｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である。

【0166】

ある態様によれば、前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている。ある態様によれば、前記反応性チオール化合物の反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール、及び、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基から独立に選択される。ある態様によれば、前記方法が更に、本明細書に記載の方法／製法によって、反応性チオール基をポリペプチドに組み込むことにより、前記ポリペプチドを製造することを含む。ここで、反応性チオール基のポリペプチドへの組み込みは、例えば、所望のチオール基を有するアミノ酸を用いたペプチド合成により、或いは、リシン残基のアミノ基を介して、反応性チオール基をポリペプチドに連結することにより行われる。前記ポリペプチドの反応性チオール基は、チオール化剤を用いて、リシンの側鎖アミノ基に結合することができる。斯かるチオール化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）、Ｎ−アセチルホモシステインチオラクトン、及びＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨが挙げられる。

【0167】

ある態様によれば、前記ポリペプチドは、各々前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられた、２以上の反応性チオール基を含んでいてもよい。

【0168】

前記チオール−エン反応は、化学的に又は光化学的に開始される。ある態様によれば、前記反応はラジカル開始剤、例えば光開始剤等により開始される。ある態様によれば、前記ラジカル開始剤は、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン（例えばIrgacure^{（登録商標）}２９５９）、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン（例えばIrgacure^{（登録商標）}１８４）及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オン（例えばIrgacure^{（登録商標）}６５１）からなる群より選択される光開始剤である。ある態様によれば、光の波長は、前記光開始剤の励起波長に合致するように選択される。ある態様によれば、前記チオール−エン反応は、例えばレオロジーの測定により、或いはエルマンアッセイを用いた遊離チオールの消費量により、約７０％〜約９５％の完了率に到達するように制御される。ある態様によれば、前記チオール−エン反応は、水性環境又は水性媒体の中で実施される。

【0169】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意の適切なエチレン性不飽和基とすることができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。好ましい態様によれば、前記エン化合物は、ノルボン−２−エン−５−イル基を含む。

【0170】

ある態様によれば、前記エン化合物は、任意のエン修飾生体適合性モノマーから選択することができる。例としては、制限されるものではないが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せが挙げられる。特定の態様によれば、前記エン化合物は、エン修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにエステル結合により連結される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで連結することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合で連結される。

【0171】

ある態様によれば、得られるバイオポリマーは三次元ネットワークを形成する。特定の態様によれば、前記バイオポリマーは、＞９８％、＞９５％、＞９０％、＞８０％、又は＞７０％の水を含むヒドロゲルを形成する。

【0172】

多くの生物医学用途では、生物活性成分をポリマーマトリックスに封入し、又は組み込むことが望ましい。

【0173】

多くの場合、上述の生物活性成分を単にポリマーマトリックス内に含有されることが好ましい。ある例によれば、ポリマーマトリックスを分解することにより、非共有結合的に封入された成分を放出させることができる（図３Ｃ）。他の例では、成分がポリマーマトリックスの孔サイズよりも小さい場合、前記成分が拡散によりポリマーネットワークから放出される（図３Ｂ）。ある態様によれば、前記生物活性成分をまずナノ又はマイクロ粒子内に封入し、これを更にポリマーマトリックスに封入してもよい。生物活性成分を粒子内に封入する方法は当業者に周知である。

【0174】

或いは、前記生物活性成分をポリマーネットワーク内に連結し、又は組み込むことが好ましい場合もある。即ち、前記成分をポリマーマトリックスに対して、１又は２以上の共有結合を介して連結し、又は組み込む。例えば、孔サイズよりも小さな生物活性成分については、共有結合により成分をネットワークに連結し、ネットワークが分解されたときにだけ前記成分が放出されるようにすることが望ましい場合もある（図３Ｄ）。ある態様によれば、ネットワークを架橋するのに使用したのと同じペプチドを介して、前記生物活性成分がポリマーネットワークに連結される。他の態様によれば、前記生物活性成分が、分解性又は非分解性リンカーにより連結される。ある例によれば、前記分解性リンカーは、加水分解又は酵素分解により分解されるリンカーである。特定の態様によれば、酵素分解により分解されるリンカーは、プロテアーゼにより切断されるペプチドである。上述の各々の場合において、前記生物活性成分を前記ネットワークに（介在するリンカーを介して、或いはリンカー無しで）ペプチドのチオールを介して連結し、或いは組み込む場合には、斯かるチオールは前記ペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられていることが好ましい。

【0175】

ある態様によれば、前記方法は更に、前記反応混合物に生物活性成分を加えることを含み、ここで前記生物活性成分は、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされる。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに封入されてなり、前記生物活性成分と前記ポリマーマトリックスとの間には共有結合は存在しない。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに共有結合されてなる。前記生物活性成分の前記ポリマーマトリックスに対する相対的な位置関係に応じて、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに組み込まれ、或いはポリマーマトリックスに連結される。

【0176】

前記生物活性成分としては、適用可能な任意の生体材料、例えば本明細書に記載の生物活性成分のうち任意のものを使用することができる。例としては、本明細書に記載の組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物が挙げられる。

【0177】

前記生物活性成分を、生物活性ポリペプチドに組み込んでもよい。この場合、生物活性ポリペプチドには、本発明のチオール−エン反応での使用に適した反応性チオール基を組み込んでもよい。

【0178】

即ち ある態様によれば、前記方法は、（例えば本明細書に記載のようなＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ試薬を用いてチオール基をリシン側鎖アミンに連結することにより）反応性チオール基を生物活性ポリペプチドに組み込み、前記反応性チオール基にエン化合物のエン基を反応させることを含む。

【0179】

ある態様によれば、前記生物活性成分が、前記生物活性ポリペプチドの反応性チオール基をエン基と反応させることにより形成されるチオエーテル結合を介して、ポリマーマトリックスに共有結合された生物活性ポリペプチドであり、ここで前記チオエーテル結合のチオ基が、前記生物活性ポリペプチドの骨格から２以上の炭素原子により隔てられてなる。

【0180】

更に、本明細書に記載の方法により製造される生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーも提供される。ある態様によれば、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーは、更に前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を含む。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに封入されてなる。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、前記ポリマーマトリックスに共有結合され（例えば、導入又は連結され）てなる。

【0181】

組成物
ラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下（例えばラジカル開始剤の存在下）で、ポリペプチドの反応性チオール基（例えばペプチド骨格から少なくとも２つの炭素原子により隔てられているチオール基）を、オレフィン含有化合物（エン化合物）と反応させる本明細書に記載の方法を用いることにより、反応性チオール基とオレフィン含有化合物のエン基との間のフリーラジカル反応により形成されるチオエーテル結合を介して別の部分に共有結合されているポリペプチド（例えばペプチド又はタンパク質）；反応性チオール基とオレフィン含有化合物のエン基との間のフリーラジカル反応で形成された生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー；及び、反応性チオール基とオレフィン含有化合物のエン基との間のフリーラジカル反応により形成された生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされ［例えば封入又は共有結合されて（導入又は連結され）］た生物活性成分を更に含む生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー等の、数々の化合物や組成物が製造される。前記チオール含有ポリペプチドの各分子が有する反応性チオール基の数と、前記エン化合物が有する反応性エン基の数とに応じて、種々の化合物や組成物を製造することができる。当業者であれば理解するように、生体適合性又は非生体適合性の化合物及び組成物は、前記エン化合物及び１又は２以上のチオール化合物の生体適合性又は非生体適合性に応じて、本明細書に記載の方法を用いて製造することができる。これも当業者であれば理解するように、分解性又は非分解性の化合物及び組成物は、前記エン化合物及び１又は２以上のチオール化合物の分解性又は非分解性に応じて、本明細書に記載の方法を用いて製造することができる。これも当業者であれば理解するように、本明細書に記載の方法を用いて製造される化合物及び組成物を、分解性部分と非分解性部分の双方を含むように改変してもよい。非限定的な例としては、分解性ポリペプチドを非分解性ポリマーマトリックスに連結してもよい。分解性の化合物及び組成物は、酵素的、生物学的、化学的、又は物理的手法の何れにより分解される物であってもよい。

【0182】

１又は２以上の反応性チオール基を含むチオール含有ポリペプチドを、単一の反応性エン基を含むエン化合物と反応させる場合には、各エン含有化合物が単一の反応性チオール基と反応できるように、エン含有化合物に由来する１又は２以上の「末端」部分を有するように前記ポリペプチドを修飾する。

【0183】

即ち、式（Ａ）の化合物が提供される。
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（ｔ≧２であり）、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分（例えば、薬物、毒素、又は殺虫剤）、ポリマー部分（例えばＰＥＧ）、捕捉部分（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団）、糖又は炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドである。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である。）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により得られる部分である。この反応性エン基は、例えば、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される反応性エン基である。ある態様によれば、前記の硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により得られる部分であって、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、前記エチレン性不飽和基は、１又は２以上の適切な置換基により更に置換されていてもよい。置換基の非限定的な例としては、ハロ、アルキル、アルコキシ又はオキソが挙げられる。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。前記エン／イン官能基の非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、前記の硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化5】

からなる群より選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。リンカー部分の非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0184】

斯かる態様において、ポリペプチドＰは、１又は２以上のチオエーテル部分に対して、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されてなる。また、各チオエーテル部分もＱ部分に対し、前記エン基に由来するエチレン単位を介して連結される。

【0185】

式（Ａ）のある態様によれば、Ｐは、ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択することができる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0186】

式（Ａ）のある態様によれば、前記ポリペプチドＰは更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。別の態様によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。特定の態様によれば、前記ポリペプチドは、ホモシステイン隣接型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドであり、細胞分泌性ＭＭＰで分解されるヒドロゲルネットワークを形成する。

【0187】

ある態様によれば、ｘは１であり、ここで単一のＱ部分は、前記ポリペプチドＰに連結されてなる。ある態様によれば、ｘは２、３、４、又はより大きな整数である。

【0188】

式（Ａ）の特定の態様によれば、Ｐ部分は、ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択される。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン、及びコラーゲンが挙げられる。

【0189】

ある態様によれば、前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、修飾により付与するべき目的となる具体的な機能特性に応じて選択される。斯かる機能特性の限定されない例としては、蛍光団又は発色団の導入、親和性タグの導入、酵素活性の導入、所定の化学的部分又は部分の導入、溶解性、薬物動態、薬動力学又は生体膜や固体表面との相互作用を改変するための親水性、疎水性又は両親媒性ポリマー端の導入、更なる重合のためのポリペプチド含有ポリマー又はテレケリック（telechelic）モノマーの生成等が挙げられる。例としては、以下の（限定されない例の）適切な誘導体が挙げられる。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマー、メロキサポール（meroxapols））、ポロキサミン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースやメチルヒドロキシプロピルセルロース、並びに天然ポリマー、例えばポリペプチド、多糖類、又は炭水和物、例えばポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、及びそれらの同様の誘導体、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、又はアルギン酸、及びタンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミン、又はオボアルブミン、フィブリノーゲン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質又はその類似体、蛍光及び非蛍光の色素、蛍光消光剤、高親和性タグ、例えばポリペプチドタグ（Ｈｉｓ−タグやＦＬＡＧ−タグ等）、その抗体及び断片、核酸アプタマー、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、高次マクロ分子アセンブリ、例えばリボヌクレオタンパク質、ウイルスカプシド等が挙げられる。前記第二の部分の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、ポリマー部分を含んでいてもよい。その例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せが挙げられる。ある態様によれば、前記第二の部分は、生物活性成分を含んでいてもよい。

【0190】

式（Ａ）の特定の態様によれば、前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、生物活性成分を含んでいてもよい。例としては、本明細書に記載の任意の生物活性成分が挙げられる。ある態様によれば、前記Ｑ部分は、本明細書に記載のポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドが挙げられる。

【0191】

ある態様によれば、前記式（Ａ）の化合物は、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と、例えば本明細書に記載のラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で反応させることにより製造される（ここでＰ、Ｃｔ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ａ）において定義されるとおり、又はその任意の変形である）。一つの側面によれば、前記ＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＣＨ_２＝ＣＨ−部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、及びＮ−ビニルカルバモイルからなる群より選択される反応性エン基である。

【0192】

ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑは、末端の無置換のアルケン部分を有するエン基を表す。しかし、本明細書に記載の置換アルケンを用いてもよいと解される。即ち、当然ながら、前記Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される式（Ａ）の化合物も提供され、これらは、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物と、式Ｔ−Ｑの化合物と、ラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）とを、フリーラジカル媒介性反応条件下で反応させることにより製造することができる（ここでＰ、Ｃｔ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ａ）において定義されるとおり、又はその任意の変形であり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す）。一つの側面によれば、Ｔ−Ｑは、下記式の環状アルケン部分である。

【化6】

ここで、環Ｇは、モノシクロ又はビシクロシクロアルケンを意味する。ここで当該アルケンは、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１又は２以上の環ヘテロ原子を有していてもよく、オキソ、ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群より選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。また、前記ビシクロシクロアルケンは、縮合、架橋、又はスピロ環型のビシクロ環であってもよい。当然ながら、Ｑは、Ｔに直接連結されていてもよく、リンカー部分を介してＴに連結されていてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。Ｔ−Ｑの例としては、マレイミド基、プロペニルエーテル基、ノルボルン−２−エン−５−イル基又はこれらの任意の組合せにより誘導体化されたＱ部分が挙げられる。これらのうち１又は２以上は、Ｑに直接結合していてもよく、リンカー部分を介してＱに結合していてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0193】

ある態様によれば、Ｔ−ＱのＴ部分は、ノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、ＣＨ_２＝ＣＨ−部分をＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＱ基に付加し、或いはＴ部分をＴ−ＱのＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにエステル結合を介して付加される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、前記ＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＣＨ_２＝ＣＨ−部分は、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｓ（＝Ｏ）_２−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−（Ｃ_０−Ｃ_４）−アルカンジイル−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＨ_２−Ｏ−、及びＣＨ_２＝ＣＨ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−からなる群より選択される部分であり、Ｔ−ＱのＴ部分は、

【化7】

−ＣＨ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−Ｏ−、及び

【化8】

からなる群より選択される。ここで、＊（アスタリスク）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0194】

ある態様によれば、前記式（Ａ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で、例えば脱気溶媒の存在下で製造される。

【0195】

式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑ及びＴ−Ｑの種々の化合物並びに対応する式（Ａ）の化合物（ここでｘは１である）（即ち、（Ａ）は式Ｐ−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑである）の限定されない例を下記表３に示す。式Ｐ−Ｃ_t−ＳＨの種々の化合物並びに対応する式（Ａ）の化合物（ここでｘは１である）（即ち、（Ａ）は式Ｐ−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑである）の限定されない例を下記表４に示す。

【表3】

【表4】

【0196】

また、式（Ｂ）の化合物も提供される。
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｐは、チオエーテル部分に対して、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されてなる）、ｙは１又は１よりも大きい整数（例えば２、３、４又はそれ以上）であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。式（Ａ）について記載したＰ、Ｃ_ｔ、ｔ及びＱの全ての選択肢が、式（Ｂ）に対しても同様に適用可能であり、式（Ｂ）についても同様に、各記載、選択肢、側面又は態様を個別具体的に列挙しているように記載されているものとする。即ち、当然ではあるが、式（Ａ）は、２以上の−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑが所与のＰに付着していてもよい物質を記載し、式（Ｂ）は、２以上のＰ−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−が所与のＱに付着していてもよい物質を記載するが、それらのＰ、Ｃｔ、ｔ及びＱの定義は何れの式でも同様である。

【0197】

ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−からなる群より選択される（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、各硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、前記硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、各硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分が、部分は独立に、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化9】

からなる群より選択される。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0198】

ある態様によれば、前記式（Ｂ）の化合物は、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と、例えば本明細書に記載のラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で反応させることにより製造される（ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ、及びｙは、式（Ｂ）について定義されたもの又はその変形例である。

【0199】

一つの側面によれば、［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの各ＣＨ_２＝ＣＨ−部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、及びＮ−ビニルカルバモイルからなる群より独立に選択される反応性エン基である。

【0200】

［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱは、１又は２以上の末端の無置換のアルケン部分を含むエン基を表すと解される。しかし、本明細書に記載の置換アルケンを用いてもよい。即ち、当然ながら、Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される式（Ｂ）の化合物も提供され、これらは、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物と、式［Ｔ］_ｙ−Ｑの化合物と、ラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）とを、フリーラジカル媒介性反応条件下で反応させることにより製造することができる（ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ｂ）について定義されたもの又はその変形例であり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す）。一つの側面によれば、［Ｔ］_ｙ−Ｑは、１又は２以上の環状アルケン部分を含み、［Ｔ］_ｙ−Ｑは、下記式のものである。

【化10】

ここで、各環Ｇは独立に、モノシクロ又はビシクロシクロアルケンを意味する。ここで当該アルケンは、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１又は２以上の環ヘテロ原子を有していてもよく、オキソ、ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群より選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。また、前記ビシクロシクロアルケンは、縮合、架橋、又はスピロ環型のビシクロ環であってもよい。当然ながら、Ｑは直接、１又は２以上のＴ部分の各々について独立に、Ｔに連結されていてもよく、リンカー部分を介してＴに連結されていてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。［Ｔ］_ｙ−Ｑの例としては、マレイミド基、プロペニルエーテル基、ノルボルン−２−エン−５−イル基、並びにこれらの任意の組合せから独立に選択される１又は２以上の基により誘導体化されたＱ部分が挙げられる。これらのうち１又は２以上は、Ｑに直接結合していてもよく、リンカー部分を介してＱに結合していてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0201】

ある態様によれば、［Ｔ］_ｙ−Ｑの各Ｔ部分は、ノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、１又は２以上のＣＨ_２＝ＣＨ−部分を［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱのＱ基に付加する手法、或いは１又は２以上のＴ部分を［Ｔ］_ｙ−ＱのＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、末端ノルボルネンがＰＥＧにエステル結合を介して付加される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、末端ノルボルネンがＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの各ＣＨ_２＝ＣＨ−部分が、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｓ（＝Ｏ）_２−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−（Ｃ_０−Ｃ_４）−アルカンジイル−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＨ_２−Ｏ−、及びＣＨ_２＝ＣＨ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−からなる群より独立に選択される部分であり、［Ｔ］_ｙ−Ｑ各Ｔ部分は、

【化11】

−ＣＨ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−Ｏ−、及び

【化12】

からなる群より独立に選択される。ここで、＊（アスタリスク）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。ある態様によれば、前記式（Ｂ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で、例えば脱気溶媒の存在下で製造される。

【0202】

ある態様によれば、前記式（Ｂ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で製造される。

【0203】

式（Ｂ）のある態様によれば、Ｐは、から選択することができる ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0204】

式（Ｂ）のある態様によれば、前記ポリペプチドＰは更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。特定の態様によれば、前記ポリペプチドは、ホモシステイン隣接型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドであり、細胞分泌性ＭＭＰで分解されるヒドロゲルネットワークを形成する。別の態様によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。

【0205】

式（Ｂ）のある態様によれば、Ｑは、式（Ｑａ）のポリマー部分である。

【化13】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化14】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、或いは、前記式（Ｑａ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ａ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ａはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーである。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−からなる群より選択される（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＲ^２基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化15】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）はＲ^２基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0206】

Ｒ^１及びＲ^２のサイズは、得られるポリマー材料の所望の特性に応じて種々変更することができる。より具体的には、Ｒ^１及びＲ^２の分子量は、約３０Ｄａ〜約５００００Ｄａの範囲とすることができる。本発明のポリマー材料の形成に先立ち、光開始チオール−エン重合に関与するように、Ｒ^１を２以上の反応性チオール基を含むように誘導体化してもよく、また、Ｒ^２を３以上の反応性エン基を含むように誘導体化してもよい。チオール化マクロマー、例えばポリ（エチレングリコール）ジチオールは、市販品を入手可能である。前記反応性エン基は、炭素−炭素二重結合を有する任意の適切な化合物から選択することができる。例えば、前記反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。その例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。即ち、当然ながら、上に挙げた繰り返し単位において、前記炭素はＣＨ_２でもよく繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。Ｒ^１が２つの反応性チオールにより誘導体化され、Ｒ^２が２つの反応性エン基により誘導体化されている場合、得られるチオール−エンポリマーは、Ｒ^１及びＲ^２セグメントの繰り返しからなる直鎖コポリマーとなるであろう。しかし、前記チオール−エンポリマー材料は、架橋及び分岐を含むように形成されることが好ましい。即ち、誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントは、架橋及び重合に関与しうる反応性チオール基又は反応性エン基を、１分子当たり３つ以上有することが好ましい。分岐及び架橋の程度は、異なるように誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントを用いると共に、出発物質の濃度を制御することにより、制御することが可能である。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ｂ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ｂはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＲ^１ｂの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基である。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。

【0207】

式（Ｂ）のある態様によれば、Ｑは、式（Ｑｂ）のポリマー部分である。

【化16】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。ここで、

【化17】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｂ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ａ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ａはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーである。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＲ^２基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化18】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）はＲ^２基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ｂ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ｂはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含む各残基 Ｒ^１ｂは、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。

【0208】

Ｒ^１及びＲ^２のサイズは、得られるポリマー材料の所望の特性に応じて種々変更することができる。より具体的には、Ｒ^１及びＲ^２の分子量は、約３０Ｄａ〜約５００００Ｄａの範囲とすることができる。本発明のポリマー材料の形成に先立ち、光開始チオール−エン重合に関与するように、Ｒ^１を２以上の反応性チオール基を含むように誘導体化してもよく、Ｒ^２を３以上の反応性エン基を含むように誘導体化してもよい。チオール化マクロマー、例えばポリ（エチレングリコール）ジチオールは、市販品を入手可能である。前記反応性エン基は、炭素−炭素二重結合を有する任意の適切な化合物から選択することができる。例えば、前記反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。その例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。即ち、当然ながら、上に挙げた繰り返し単位において、前記炭素はＣＨ_２でもよく、繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。Ｒ^１が２つの反応性チオールにより誘導体化され、Ｒ^２が２つの反応性エン基により誘導体化されている場合、得られるチオール−エンポリマーは、Ｒ^１及びＲ^２セグメントの繰り返しからなる直鎖コポリマーとなるであろう。しかし、前記チオール−エンポリマー材料は、架橋及び分岐を含むように形成されることが好ましい。即ち、誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントは、架橋及び重合に関与しうる反応性チオール基又は反応性エン基を、１分子当たり３つ以上有することが好ましい。分岐及び架橋の程度は、異なるように誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントを用いると共に、出発物質の濃度を制御することにより、制御することが可能である。

【0209】

また、式（Ｉ）の繰り返し単位を含むポリマー材料（例えばチオール−エンヒドロゲル）も提供される：

【化19】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化20】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0210】

また、式（II）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料も提供される：

【化21】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化22】

は、式(II)のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化23】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0211】

また、式(IIＩ)の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料も提供される：

【化24】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、からなる群より選択される ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化25】

は、式(IIＩ)のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化26】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0212】

ある態様によれば、式（Ｉ）、（II）又は（III）のポリマー材料は更に、前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに封入されてなる。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに共有結合され（例えば導入又は連結され）てなる。この生物活性成分としては、本明細書に記載の任意の適用可能な生物活性成分を用いることができる。その例としては、本明細書に記載の組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物が挙げられる。

【0213】

当然ながら、式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｉ）、（II）、及び（III）に示す繰り返し単位において、炭素原子はＣＨ_２であってもよく、繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。更に、当然ながら、生物活性化合物をエン／インで誘導体化するために、生物活性化合物と炭素との間に１又は２以上の連結基が存在してもよい。

【0214】

１又は２以上の反応性チオール基を含むチオール含有ポリペプチドを、単一の反応性エン基を含むエン化合物と反応させる場合、各エン含有化合物が単一の反応性チオール基と反応できるように、エン含有化合物に由来する１又は２以上の「末端」部分を含むよう前記ポリペプチドを修飾する。

【0215】

即ち、式（Ｃ）の化合物が提供される：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分（例えば、薬物、毒素、又は殺虫剤）、ポリマー部分（例えばＰＥＧ）、捕捉部分（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団）、糖又は炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、前記硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。その例としては、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される反応性エン基である。ある態様によれば、前記硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、前記硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化27】

からなる群より選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0216】

斯かる態様において、ポリペプチドＰは、１又は２以上のチオエーテル部分に対して、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されてなる。各チオエーテル部分も、Ｑ部分に対して、前記エン基に由来するエチレン単位を介して連結される。

【0217】

式（Ｃ）のある態様によれば、Ｐは、ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択することができる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0218】

式（Ｃ）のある態様によれば、前記ポリペプチドＰは更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。別の態様によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。特定の態様によれば、前記ポリペプチドは、ホモシステイン隣接型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドであり、細胞分泌性ＭＭＰで分解されるヒドロゲルネットワークを形成する。

【0219】

ある態様によれば、ｘは１であり、ここで単一のＱ部分は、前記ポリペプチドＰに連結されてなる。ある態様によれば、ｘは２、３、４、又はより大きな整数である。

【0220】

式（Ｃ）の特定の態様によれば、Ｐ部分は、から選択される ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0221】

ある態様によれば、前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、修飾により付与するべき目的となる具体的な機能特性に応じて選択される。斯かる機能特性の限定されない例としては、蛍光団又は発色団の導入、親和性タグの導入、酵素活性の導入、所定の化学的部分又は部分の導入、溶解性、薬物動態、薬動力学又は生体膜や固体表面との相互作用を改変するための親水性、疎水性又は両親媒性ポリマー端の導入、更なる重合のためのポリペプチド含有ポリマー又はテレケリック（telechelic）モノマーの生成等が挙げられる。その例としては、以下の（限定されない例の）適切な誘導体が挙げられる：ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー（ポロキサマー、メロキサポール（meroxapols））、ポロキサミン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリアミノカーボネート、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリウレタン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキル化セルロース、例えばヒドロキシエチルセルロースやメチルヒドロキシプロピルセルロース、並びに天然ポリマー、例えばポリペプチド、多糖類、又は炭水和物、例えばポリスクロース、ヒアルロン酸、デキストラン、及びそれらの同様の誘導体、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、又はアルギン酸、及びタンパク質、例えばゼラチン、コラーゲン、アルブミン、又はオボアルブミン、フィブリノーゲン、フィブリン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質又はその類似体、蛍光及び非蛍光の色素、蛍光消光剤、高親和性タグ、例えばポリペプチドタグ（Ｈｉｓ−タグやＦＬＡＧ−タグ等）、その抗体及び断片、核酸アプタマー、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、高次マクロ分子アセンブリ、例えばリボヌクレオタンパク質、ウイルスカプシド等が挙げられる。前記第二の部分の反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イル等が挙げられる。前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、ポリマー部分を含んでいてもよい。その例としては、これらに限定されるものではないが、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せ等が挙げられる。ある態様によれば、前記第二の部分は、生物活性成分を含んでいてもよい。

【0222】

式（Ｃ）の特定の態様によれば、前記ポリペプチドＰに連結されたＱ部分は、生物活性成分を含んでいてもよい。例としては、本明細書に記載の任意の生物活性成分が挙げられる。ある態様によれば、前記Ｑ部分は、本明細書に記載のポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドが挙げられる。

【0223】

ある態様によれば、式（Ｃ）の化合物は、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と、例えば本明細書に記載のラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で反応させることにより製造される（ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ｃ）について定義されたもの又はその変形例である）。一つの側面によれば、ＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＣＨ_２＝ＣＨ−部分が、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、及びＮ−ビニルカルバモイルからなる群より選択される反応性エン基である。

【0224】

ここで、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑは、末端の無置換のアルケン部分を有するエン基を表すと解される。しかし、本明細書に記載の置換アルケンを用いてもよい。即ち、当然ながら、Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される式（Ｃ）の化合物も提供され、これらは、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物と、式Ｔ−Ｑの化合物と、ラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）とを、フリーラジカル媒介性反応条件下で反応させることにより製造することができる（ここで、Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ｃ）について定義されたもの又はその変形例であり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す）。一つの側面によれば、Ｔ−Ｑは、下記式の環状アルケン部分である。

【化28】

ここで、環Ｇは、モノシクロ又はビシクロシクロアルケンを意味する。ここで当該アルケンは、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１又は２以上の環ヘテロ原子を有していてもよく、オキソ、ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群より選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。また、前記ビシクロシクロアルケンは、縮合、架橋、又はスピロ環型のビシクロ環であってもよい。当然ながら、Ｑは、Ｔに直接連結されていてもよく、リンカー部分を介してＴに連結されていてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。Ｔ−Ｑの例としては、マレイミド基、プロペニルエーテル基、ノルボルン−２−エン−５−イル基又はこれらの任意の組合せにより誘導体化されたＱ部分が挙げられる。これらのうち１又は２以上は、Ｑに直接結合していてもよく、リンカー部分を介してＱに結合していてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0225】

ある態様によれば、Ｔ−ＱのＴ部分は、ノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、ＣＨ_２＝ＣＨ−部分をＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＱ基に付加する手法や、Ｔ部分をＴ−ＱのＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにエステル結合を介して付加される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、前記ＣＨ_２＝ＣＨ−ＱのＣＨ_２＝ＣＨ−部分が、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｓ（＝Ｏ）_２−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−（Ｃ_０−Ｃ_４）−アルカンジイル−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＨ_２−Ｏ−、及びＣＨ_２＝ＣＨ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−からなる群より選択される部分であり、Ｔ−ＱのＴ部分は、

【化29】

−ＣＨ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−Ｏ−、及び

【化30】

からなる群より選択される。ここで、＊（アスタリスク）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0226】

ある態様によれば、式（Ｃ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で、例えば脱気溶媒の存在下で製造される。

【0227】

また、式（Ｄ）の化合物も提供される：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）；ｙは１又は１よりも大きい整数（例えば２、３、４又はそれ以上）であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。式（Ｃ）について記載されたＰ、Ｃ_ｔ、ｔ及びＱの全ての選択肢が、式（Ｄ）に対しても同様に適用可能であり、また、各記載、選択肢、側面又は態様を個別具体的に列挙しているように、式（Ｄ）についても記載されるものとする。即ち、当然ではあるが、式（Ｃ）は、２以上の−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑが所与のＰに付着していてもよい物質を記載し、式（Ｄ）は、２以上のＰ−Ｃｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−が所与のＱに付着していてもよい物質を記載するが、それらのＰ、Ｃｔ、ｔ及びＱの定義は何れの式でも同様である。

【0228】

ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、各硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分が、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、前記硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、各硫黄原子とＱとの間のＣ−Ｃ部分が、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化31】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0229】

ある態様によれば、式（Ｄ）の化合物は、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）と、例えば本明細書に記載のラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で反応させることにより製造される（Ｐ、Ｃ_ｔ、ｔ、Ｑ、及びｙは、式（Ｄ）について定義されたもの又はその変形例である）。

【0230】

一つの側面によれば、［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの各ＣＨ_２＝ＣＨ−部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、及びＮ−ビニルカルバモイルからなる群より独立に選択される反応性エン基である。

【0231】

［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱは、１又は２以上の末端の無置換のアルケン部分を含むエン基を表すと解される。しかし、本明細書に記載の置換アルケンを用いてもよい。即ち、当然ながら、Ｃ−Ｃ部分が末端の無置換のアルケン以外のアルケンから誘導される式（Ｄ）の化合物も提供され、これらは、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物と、式［Ｔ］_ｙ−Ｑの化合物と、ラジカル開始剤（例えば本明細書に記載の光開始剤）とを、フリーラジカル媒介性反応条件下で反応させることにより製造することができる（ここで、Ｐ、ｔ、Ｑ、及びｘは、式（Ｄ）について定義されたもの又はその変形例であり、Ｔは、末端の無置換のアルケン部分以外のアルケン部分を指す）。一つの側面によれば、［Ｔ］_ｙ−Ｑは、１又は２以上の環状アルケン部分を含み、［Ｔ］_ｙ−Ｑは、下記式のものである。

【化32】

ここで、各環Ｇは独立に、モノシクロ又はビシクロシクロアルケンを意味する。ここで当該アルケンは、Ｏ、Ｓ、及びＮから選択される１又は２以上の環ヘテロ原子を有していてもよく、オキソ、ハロ、アルキル、及びアルコキシからなる群より選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。また、前記ビシクロシクロアルケンは、縮合、架橋、又はスピロ環型のビシクロ環であってもよい。当然ながら、Ｑは直接、１又は２以上のＴ部分の各々について独立に、Ｔに連結されていてもよく、リンカー部分を介してＴに連結されていてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。［Ｔ］_y−Ｑの例としては、マレイミド基、プロペニルエーテル基、ノルボルン−２−エン−５−イル基、並びにこれらの任意の組合せから独立に選択される１又は２以上の基により誘導体化されたＱ部分が挙げられる。これらのうち１又は２以上は、Ｑに直接結合していてもよく、リンカー部分を介してＱに結合していてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0232】

ある態様によれば、［Ｔ］_y−Ｑの各Ｔ部分は、ノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、１又は２以上のＣＨ_２＝ＣＨ−部分を［ＣＨ_２＝ＣＨ］_yＱのＱ基に付加する手法や、１又は２以上のＴ部分を［Ｔ］_y−ＱのＱ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。好ましい態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにエステル結合を介して付加される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、末端ノルボルネン（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの各ＣＨ_２＝ＣＨ−部分が、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｓ（＝Ｏ）_２−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−（Ｃ_０−Ｃ_４）−アルカンジイル−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝Ｃ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、ＣＨ_２＝ＣＨ−ＣＨ_２−Ｏ−、及びＣＨ_２＝ＣＨ−ＮＨＣ（＝Ｏ）−からなる群より独立に選択される部分であり、［Ｔ］_ｙ−Ｑの各Ｔ部分は独立に、

【化33】

−ＣＨ（ＣＨ_３）＝ＣＨ−Ｏ−、及び

【化34】

からなる群より選択される。ここで、＊（アスタリスク）は、Ｑ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。ある態様によれば、式（Ｄ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で、例えば脱気溶媒の存在下で製造される。

【0233】

ある態様によれば、式（Ｄ）の化合物は、低酸素環境中又は酸素の不在下で製造される。

【0234】

式（Ｄ）のある態様によれば、Ｐは、ペプチド及びタンパク質：ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択することができる。成長因子としては、ＡＭ、Ａｎｇ、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＧＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＦ、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＫＧＦ、ＭＳＦ、ＮＧＦ、ＴＰＯ、ＦＢＳ、ＥＰＯ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、及びインターロイキン、並びにそれらの誘導体及び同族物質が挙げられる。構造タンパク質としては、フィブリン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ケラチン、アクチン、ラミニン及びコラーゲンが挙げられる。

【0235】

式（Ｄ）のある態様によれば、前記ポリペプチドＰは更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む。特定の態様によれば、前記ポリペプチドは、ホモシステイン隣接型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）分解性ペプチドであり、細胞分泌性ＭＭＰで分解されるヒドロゲルネットワークを形成する。別の態様によれば、前記ポリペプチドは、活性チオール隣接型プラズミン分解性ペプチドである。別の態様によれば、前記ペプチドには２つのプラズミン分解性配列が含まれる。

【0236】

式（Ｄ）のある態様によれば、Ｑは、式（Ｑｃ）のポリマー部分である：

【化35】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。ここで、

【化36】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｃ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ａ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ａはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーである。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＲ^２基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化37】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｒ^２基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ｂ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ｂはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含む各残基Ｒ^１ｂは、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。

【0237】

Ｒ^１及びＲ^２のサイズは、得られるポリマー材料の所望の特性に応じて種々変更することができる。より具体的には、の分子量Ｒ^１及びＲ^２は、約３０Ｄａ〜約５００００Ｄａの範囲とすることができる。本発明のポリマー材料の形成に先立ち、光開始チオール−エン重合に関与するように、Ｒ^１を２以上の反応性チオール基を含むように誘導体化してもよく、Ｒ^２を３以上の反応性エン基を含むように誘導体化してもよい。チオール化マクロマー、例えばポリ（エチレングリコール）ジチオールは、市販品を入手可能である。前記反応性エン基は、炭素−炭素二重結合を有する任意の適切な化合物から選択することができる。例えば、前記反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。その例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。即ち、当然ながら、上に挙げた繰り返し単位において、前記炭素はＣＨ_２でもよく、繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。Ｒ^１が２つの反応性チオールにより誘導体化され、Ｒ^２が２つの反応性エン基により誘導体化される場合、得られるチオール−エンポリマーは、Ｒ^１及びＲ^２セグメントの繰り返しからなる直鎖コポリマーとなるであろう。しかし、前記チオール−エンポリマー材料は、架橋及び分岐を含むように形成されることが好ましい。即ち、誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントは、架橋及び重合に関与しうる反応性チオール基又は反応性エン基を、１分子当たり３つ以上有することが好ましい。分岐及び架橋の程度は、異なるように誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントを用いると共に、出発物質の濃度を制御することにより、制御することが可能である。

【0238】

式（Ｄ）のある態様によれば、Ｑは、式（Ｑｄ）のポリマー部分である：

【化38】

式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。ここで、

【化39】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｄ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ａ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ａはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーである。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＲ^２基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＲ^２との間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化40】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｒ^２基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。ある態様によれば、Ｒ^１は、式−Ｃ_ｔ−Ｒ^１ｂ−Ｃ_ｔ−のポリペプチドである。ここで、Ｒ^１ｂはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含む各残基Ｒ^１ｂは、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基により置換されていてもよい。

【0239】

Ｒ^１及びＲ^２のサイズは、得られるポリマー材料の所望の特性に応じて種々変更することができる。より具体的には、Ｒ^１及びＲ^２の分子量は、約３０Ｄａ〜約５００００Ｄａの範囲とすることができる。本発明のポリマー材料の形成に先立ち、光開始チオール−エン重合に関与するように、Ｒ^１を２以上の反応性チオール基を含むように誘導体化してもよく、Ｒ^２を３以上の反応性エン基を含むように誘導体化してもよい。チオール化マクロマー、例えばポリ（エチレングリコール）ジチオールは、市販品を入手可能である。前記反応性エン基は、炭素−炭素二重結合を有する任意の適切な化合物から選択することができる。例えば、前記反応性エン基は、任意の適切なエチレン性不飽和基から選択することができる。その例としては、これらに限定されるものではないが、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルが挙げられる。即ち、当然ながら、上に挙げた繰り返し単位において、前記炭素はＣＨ_２でもよく、繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。Ｒ^１が２つの反応性チオールにより誘導体化され、Ｒ^２が２つの反応性エン基により誘導体化される場合、得られるチオール−エンポリマーは、Ｒ^１及びＲ^２セグメントの繰り返しからなる直鎖コポリマーとなるであろう。しかし、前記チオール−エンポリマー材料は、架橋及び分岐を含むように形成されることが好ましい。即ち、誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントは、架橋及び重合に関与しうる反応性チオール基又は反応性エン基を、１分子当たり３つ以上有することが好ましい。分岐及び架橋の程度は、異なるように誘導体化されたＲ^１及びＲ^２セグメントを用いると共に、出発物質の濃度を制御することにより、制御することが可能である。

【0240】

また、式（IV）の繰り返し単位を含むポリマー材料（例えばチオール−エンヒドロゲル）も提供される：

【化41】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化42】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0241】

また、式（Ｖ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料も提供される：

【化43】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化44】

は、式（Ｖ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、

【化45】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0242】

また、式（VI）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料も提供される：

【化46】

式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化47】

は、式（VI）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す。ある態様によれば、前記非天然アミノ酸残基は、チオール置換βアミノ酸残基、チオール置換γアミノ酸残基、チオール置換δアミノ酸残基、又はチオール置換εアミノ酸残基。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、カルボニル官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、前記アミノ酸類似体残基又はアミノ酸模倣体残基は、アミノ官能基がメチレン部分により置換されてなる天然アミノ酸残基又は非天然アミノ酸残基から誘導される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは、（Ｃ_２−Ｃ_６）アルカンジイル−、−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−、及び−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ_１−Ｃ_６）−アルカンジイル−（Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚ−（ここでｚは１〜１０，０００の整数である）からなる群より選択される。ある態様によれば、Ｃ_ｔは更に、ハロ、アルキル、及びアルコキシから選択される１又は２以上の置換基で置換されていてもよい。当業者であれば理解するように、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。反応性エン基は独立に、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間のＣ−Ｃ部分は、反応性チオール基と反応性エン基とのチオール−エン反応により形成される部分である。ここで、前記反応性エン基はノルボルン−２−エン−５−イルである。当業者であれば理解するように、Ｃ−Ｃ部分をＹ基に付加する手法は数々存在する。これらの方法により、前記エン／イン担持部分と前記エン／イン官能基との間にリンカー基が形成されてもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。一態様によれば、ＰＥＧを５−ノルボルネン−２−カルボン酸で修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧに対してエステル結合を介して結合される。別の態様によれば、ＰＥＧアミンをＮＨＳ−ノルボルネンで修飾することにより、１又は２以上の末端ノルボルネン部分（ノルボルン−２−エン−５−イル）がＰＥＧにアミド結合を介して付加される。ある態様によれば、硫黄原子とＹとの間の各Ｃ−Ｃ部分は、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−（Ｃ_２−Ｃ_６）−アルカンジイル−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨＣ（＝Ｏ）−，

【化48】

からなる群より独立に選択される部分である。ここで、第一の−（ダッシュ）（−Ｃ−Ｃ）又は波線は、硫黄原子への結合を表し、第二の−（ダッシュ）（Ｃ−Ｃ−）は、Ｙ基への結合を表す。これは直接結合でも、リンカー部分を介した結合でもよい。その非限定的な例としては、アミド官能基、エステル官能基、又はそれらの組合せが挙げられる。当然ながら、斯かるＣ−Ｃ部分は、ビニルアセチル、ビニルエステル、ビニルスルホニル、ビニルエーテル、アリル、アクリレートエステル、メタクリレートエステル、アクリルアミド、マレイミド、プロペニルエーテル、アリルエーテル、アルケニル、不飽和エステル、ジエニル、Ｎ−ビニルカルバモイル及びノルボルン−２−エン−５−イルからなる群より選択される部分を含むエン基に由来する基である。

【0243】

ある態様によれば、式（IV）、（Ｖ）又は(VI)のポリマー材料は更に、前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を含んでいてもよい。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに封入されてなる。これらの態様の一部によれば、前記生物活性成分は、ポリマーマトリックスに共有結合され（例えば導入又は連結され）てなる。この生物活性成分としては、本明細書に記載の任意の適用可能な生物活性成分を用いることができる。その例としては、本明細書に記載の組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物が挙げられる。

【0244】

当然ながら、式（Ｃ）、（Ｄ）、（IV）、（Ｖ）、及び（VI）に示す繰り返し単位において、炭素原子はＣＨ_２であってもよく、繰り返し基内の１又は２以上の炭素が置換されていてもよく、更には二重結合を組み込んだ環構造を形成していてもよい。更に、当然ながら、生物活性化合物をエン／インで誘導体化するために、生物活性化合物と炭素との間に１又は２以上の連結基が存在してもよい。

【0245】

用途
本明細書に記載のペプチド：ポリマー組成物、又は、本明細書に記載の方法により製造されるペプチド：ポリマー組成物は、ヒト及び動物の治療において数々の用途を有する。一態様（薬物送達）によれば、生物活性化合物はヒドロゲルに封入され、連結され、或いは組み込まれ、当該ヒドロゲルが組織と接触されると、生物活性成分が組織内に放出される。組織内への放出の機序は上述の何れの機序であってもよく、例としてはヒドロゲルからの拡散、ヒドロゲルの分解、又は分解性リンカーを介した放出が挙げられる。別の態様（組織再生）によれば、ヒドロゲルが組織再生の足場として機能する。斯かる態様の一つによれば、細胞又は組織が足場内に封入され、当該足場が組織欠損内に配置される。斯かるヒドロゲルは予め製造してもよく、使用時に予め重合してもよく、或いは欠損部位において原位置（in situ）重合してもよい。別の態様によれば、ヒドロゲルが周辺組織から組織内に遊走する際の足場として機能する。

【0246】

ある態様によれば、患者の状態又は障害を治療する方法であって、それを必要とする対象（例えばヒト又は動物）に対して、本明細書に記載の修飾ポリペプチド（例えば第二の部分とコンジュゲートされたポリペプチド）；本明細書に記載の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた［例えば封入又は共有結合された（導入又は連結された）］生物活性成分；本明細書に記載の化合物；又は本明細書に記載のポリマー材料と組み合わされた［例えば封入又は共有結合された（導入又は連結された）］生物活性成分を投与することを含む方法が提供される。

【0247】

ある態様によれば、組織を再生する方法であって、本明細書に記載の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーに封入された細胞、又は組織を、損傷又は欠損を有する組織の部位で放出することを含む方法が提供される。ある態様によれば、前記方法は更に、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを含む組成物を、損傷又は欠損を有する組織の部位で産生することを含む。

【0248】

キット
本発明において提供される化合物又は組成物（例えば、式（Ａ）の化合物−（Ｄ）又は（Ｉ）−（VI）、又は斯かる化合物の一又は二以上の前駆体、及び任意により更なる剤、例えば更なる生物活性成分）を含むキットが提供される。一つの側面によれば、当該キットは更に、創傷等の損傷の処置に使用するための指示書を含む。

【0249】

本明細書の上記記載及び全体において詳細に記載した任意の組成物をキットに使用できる。ここで、上述の全ての化合物及び組成物は各々、キットとの関連でも個別具体的に記載されているものとする。斯かるキットは任意により、創傷等の損傷の治療用途等に関する指示書を含んでいてもよい。斯かるキットは、前記化合物又は組成物を個体の所望の部位（例えば創傷）に送達するために、治療に関連する更なる要素、例えばアプリケーター、例としては針及び／又はシリンジを含んでいてもよい。斯かるキットは更に、重合を開始するように選択された光開始剤を含んでいてもよい。前記キットは更に、重合開始に使用される光開始剤の吸収スペクトルに合致するように選択される波長の光を発する光源を含んでいてもよい。

【0250】

製品
本発明において提供される化合物又は組成物（例えば、式（Ａ）の化合物−（Ｄ）又は（Ｉ）−（VI）、又は斯かる化合物の一又は二以上の前駆体、及び任意により更なる剤、例えば更なる生物活性成分）を含有する容器を含む製品も提供される。斯かる製品は、瓶、バイアル（例えば封止済又は封止可能なチューブ）、アンプル、単回使用の使い捨てアプリケーター、シリンジ等の何れであってもよい。斯かる容器は、種々の材料、例えばガラス又はプラスチック等から形成することができ、一側面によれば、斯かる容器に貼付され、或いは斯かる容器と同封された、所望の適応の治療（例えば創傷治癒）に用いるための指示を更に含んでなる。

【0251】

一つの側面によれば、前記容器は、本発明にて提供される組成物の単位用量形態を含む医療デバイスである。前記デバイスは、当該組成物を個体の損傷部位（例えば創傷）に適用するためのアプリケーターを含んでいてもよい。或いは、容器（例えば瓶、バイアル又はアンプル）と共に、使用に関する指示書や、組成物を容器から所望の部位（例えば創傷）に分注するための針及び／又はシリンジを、同封又は添付してもよい。一つの側面によれば、本発明において提供される化合物又は組成物、又は本発明において提供される化合物又は組成物の一又は二以上の前駆体（例えば式（Ａ）の化合物−（Ｄ）又は（Ｉ）−（VI）、又は斯かる化合物の一又は二以上の前駆体）を含む製品を、任意の更なる剤、例えば更なる生物活性成分を取得又は保存するのに適した第二の容器と共に供してもよい。

【0252】

本明細書に記載の任意の組成物を製品に使用することができる。ここで、上述の全ての組成物は各々、製品との関連でも個別具体的に記載されているものとする。

【0253】

列挙される態様
本発明は更に以下の態様として記載される。各態様の特徴は適切且つ実用可能な限りにおいて、各々他の態様の特徴と組み合わせることも可能である。

【0254】

態様１：ポリペプチドを連結するための方法であって、前記ポリペプチドがペプチド骨格と１又は２以上の反応性チオール基とを含むと共に、前記方法が、ラジカル媒介性チオール−エン反応を促進する条件下で、前記ポリペプチドの反応性チオール基を１又は２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含み、ここで前記ポリペプチドの反応性チオール基の前記ラジカル媒介性チオール−エン反応に関する反応性が、システインチオール基の反応性の少なくとも２倍である方法。

【0255】

態様２：前記方法が、前記ポリペプチドの反応性チオール基を、ラジカル開始剤及び前記エン化合物と反応させることを含む、態様１に記載の方法。

【0256】

態様３：前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、態様１又は２に記載の方法。

【0257】

態様４：前記ポリペプチドの反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、又は、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール基である、態様３に記載の方法。

【0258】

態様５：前記ポリペプチドの反応性チオールが、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基である、態様３に記載の方法。

【0259】

態様６：前記ラジカル開始剤が、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オンからなる群より選択される光開始剤である、態様２〜５の何れか一つに記載の方法。

【0260】

態様７：チオール−エン反応が、前記光開始剤を、前記光開始剤の励起波長に合致する波長を有する光に暴露することにより開始される、態様６に記載の方法。

【0261】

態様８：前記方法が更に、前記光開始剤の量、前記光の強度、及び／又は、前記光開始剤が前記光に暴露される時間を制御することを含む、態様６又は７に記載の方法。

【0262】

態様９：前記チオール−エン反応が約７０％から約９５％の間の完了率に到達する、態様８に記載の方法。

【0263】

態様１０：前記ポリペプチドが２以上の反応性チオール基を含み、前記反応性チオール基が各々、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、態様１〜９の何れか一つに記載の方法。

【0264】

態様１１：前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、態様１０に記載の方法。

【0265】

態様１２：前記ポリペプチドが、ｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、ｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である、態様１１に記載の方法。

【0266】

態様１３：前記エン化合物が、エン修飾生体適合性モノマーである、態様１２に記載の方法。

【0267】

態様１４：前記エン化合物が、ノルボルネン修飾ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、態様１３に記載の方法。

【0268】

態様１５：前記ポリペプチドが更に、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列を含む、態様１３又は１４に記載の方法。

【0269】

態様１６：前記チオール−エン反応が、生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを提供する、態様１５に記載の方法。

【0270】

態様１７：前記エン化合物が、１個の反応性エン基を含む、態様１〜９の何れか一つに記載の方法。

【0271】

態様１８：前記エン化合物が、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドを含む、態様１７に記載の方法。

【0272】

態様１９：前記エン化合物が、生物活性成分を含む、態様１７に記載の方法。

【0273】

態様２０：前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含む、態様１７〜１９の何れか一つに記載の方法。

【0274】

態様２１：前記ポリペプチドが、ペプチド又はタンパク質ホルモン、成長因子、サイトカイン、インターロイキン、受容体、可溶化受容体、治療用タンパク質、酵素、及び構造タンパク質から選択される、態様１７〜２０の何れか一つに記載の方法。

【0275】

態様２２：前記ポリペプチドが、前記ポリペプチドのペプチド骨格から２以上の炭素原子により隔てられている１個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、態様１〜９の何れか一つに記載の方法。

【0276】

態様２３：前記エン化合物が、２以上の反応性エン基を含む、態様２２に記載の方法。

【0277】

態様２４：前記方法が更に、第二のチオール化合物を、２以上の反応性エン基を含むエン化合物と反応させることを含むと共に、前記第二のチオール化合物が、２以上の反応性チオール基を含む、態様２２に記載の方法。

【0278】

態様２５：前記第二のチオール化合物がｊ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物がｋ個の反応性エン基を含み、ここでｊ及びｋは独立に２以上の整数であり、ｊ＋ｋ≧５である、態様２４に記載の方法。

【0279】

態様２６：前記第二のチオール化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、態様２４又は２５に記載の方法。

【0280】

態様２７：前記第二のチオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含む、態様２４又は２５に記載の方法。

【0281】

態様２８：前記第二のチオール化合物が、プロテアーゼに対して感受性であることが既知のペプチド配列と、前記ペプチド配列の両側に存在する２個のホモシステイン残基とを含む、態様２７に記載の方法。

【0282】

態様２９：前記第二のチオール化合物が、ポリエチレングリコールと、前記ポリエチレングリコールに付着された２つの末端チオール基とを含む、態様２４又は２５に記載の方法。

【0283】

態様３０：前記エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、態様２２〜２９の何れか一つに記載の方法。

【0284】

態様３１：態様１〜３０の何れか一つに記載の方法。１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドを製造することを更に含む.

【0285】

態様３２：１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、カルボキシ基に隣接する炭素原子から２以上の炭素原子により隔てられたチオール基を含有する、保護されたチオール含有アミノ酸又はアミノ酸類似体、例えば保護されたホモシステイン又は２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸、を用いたポリペプチド合成を含む、態様３１に記載の方法。

【0286】

態様３３：１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、チオール化剤を用いてポリペプチドを修飾することを含む、態様３１に記載の方法。

【0287】

態様３４：１又は２以上の反応性チオール基を含む前記ポリペプチドの製造が、ポリペプチド中のメチオニン残基を、化学的又は酵素的に、ホモシステイン残基に転換することを含む、態様３１に記載の方法。

【0288】

態様３５：態様１〜３４の何れか一つに記載の方法により製造される連結されたポリペプチド。

【0289】

態様３６：生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを製造するための方法であって、反応性チオール化合物をラジカル開始剤及び反応性エン化合物と反応させることを含み、ここで、前記反応性チオール化合物が、ペプチド骨格と、分解性ペプチドと、前記ペプチド骨格から各々２以上の炭素原子により隔てられている２以上の反応性チオール基とを含み、前記反応性エン化合物が、２以上の反応性エン基を含むエン修飾生体適合性モノマーである、方法。

【0290】

態様３７：前記ポリペプチドが、ｎ個の反応性チオール基を含み、前記エン化合物が、ｍ個の反応性エン基を含み、ここでｎ及びｍが独立に２以上の整数であり、ｎ＋ｍ≧５である、態様３６に記載の方法。

【0291】

態様３８：前記反応混合物に生物活性成分を加えることを更に含むと共に、前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされる、態様３６に記載の方法。

【0292】

態様３９：前記反応性チオール化合物の反応性チオール基が、前記ポリペプチドのホモシステイン残基のチオール基、前記ポリペプチドの２−アミノ−５−メルカプトペンタン酸残基のチオール、及び、リシン残基の側鎖アミノ基にリンカーを介して連結されたチオール基から独立に選択される、態様３６又は３８に記載の方法。

【0293】

態様４０：前記ラジカル開始剤が、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸リチウム（ＬＡＰ）、フェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（ＮＡＰ）、２−ヒドロキシ−１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−メチル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、及び２，２−ジメトキシ−１，２−ジフェニルエタン−１−オンからなる群より選択される光開始剤である、態様３６〜３９の何れか一つに記載の方法。

【0294】

態様４１：前記反応性エン化合物が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択されるポリマー部分を含む、態様３６〜４０の何れか一つに記載の方法。

【0295】

態様４２：前記生物活性成分が、組織、細胞、タンパク質、ペプチド、小分子薬物、核酸、（例えば脂質ナノ粒子に封入された）カプセル化核酸、脂質、炭水和物、又は農業用化合物である、態様３８〜４１の何れか一つに記載の方法。

【0296】

態様４３：前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックス内に封入されている、態様４２に記載の方法。

【0297】

態様４４：前記生物活性成分が、前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスに共有結合されている、態様４２に記載の方法。

【0298】

態様４５：前記生物活性成分が、前記生物活性ポリペプチドの反応性チオール基をエン基と反応させることにより形成されるチオエーテル結合によって、前記ポリマーマトリックスに共有結合されている生物活性ポリペプチドであり、ここで、前記チオエーテル結合のチオ基が、前記生物活性ポリペプチドの骨格から２以上の炭素原子により隔てられている、態様４４に記載の方法。

【0299】

態様４６：態様３５〜４５の何れか一つに記載の方法により製造される生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー。

【0300】

態様４７：前記生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーのポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、態様４６に記載の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマー。

【0301】

態様４８：式（Ａ）の化合物：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分、ポリマー、捕捉部分、標識、炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドである）。

【0302】

態様４９：前記化合物が、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、態様４８に記載の化合物。

【0303】

態様５０：式（Ｂ）の化合物：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、ｙは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；a ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【0304】

態様５１：前記化合物が、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、態様５０に記載の化合物。

【0305】

態様５２：Ｑが、式（Ｑａ）のポリマー部分である：

【化49】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化50】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は前記式（Ｑａ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す、態様５０に記載の化合物。

【0306】

態様５３：Ｑが、式（Ｑｂ）のポリマー部分である：

【化51】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化52】

は、式（Ｂ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｂ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す）態様５０に記載の化合物。

【0307】

態様５４：式（Ｉ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化53】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【0308】

態様５５：前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、態様５４に記載のポリマー材料。

【0309】

態様５６：式（II）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化54】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化55】

は、式（II）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【0310】

態様５７：式（III）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化56】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧２であり、Ｃ_ｔは、少なくとも２つの炭素原子を含むリンカーであり（即ち、Ｘは、少なくとも２つのチオエーテル部分に対し、炭素原子２個又はそれ以上の長さのリンカーを介して連結されている）、Ｙは、からなる群より選択される ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化57】

は、式（III）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【0311】

態様５８：式（Ｃ）の化合物：
Ｐ−［Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ−Ｑ］_ｘ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ｘは１又は１よりも大きい整数であり、Ｑは生物活性成分（例えば、薬物、毒素、又は殺虫剤）、ポリマー部分（例えばＰＥＧ）、捕捉部分（例えばビオチン）、標識（例えば蛍光標識、発色団、又は蛍光団）、糖又は炭水和物、核酸、又は第二のポリペプチドであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）。

【0312】

態様５９：前記化合物が、式Ｐ−［Ｃ_ｔ−ＳＨ］_ｘの化合物を、式ＣＨ_２＝ＣＨ−Ｑの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、態様５８に記載の化合物。

【0313】

態様６０：式（Ｄ）の化合物：
［Ｐ−Ｃ_ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｃ］_ｙ−Ｑ
（式中、Ｐはポリペプチドであり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ｔ≧１であり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＰの残基の各々は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない； ｙは１又は１よりも大きい整数（例えば２、３、４又はそれ以上）であり、Ｑは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【0314】

態様６１：前記化合物が、式Ｐ−Ｃ_ｔ−ＳＨの化合物を、式［ＣＨ_２＝ＣＨ］_ｙＱの化合物及びラジカル開始剤と反応させることにより製造される、態様６０に記載の化合物。

【0315】

態様６２：Ｑが、式（Ｑｃ）のポリマー部分である：

【化58】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化59】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｃ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す）、態様６０に記載の化合物。

【0316】

態様６３：Ｑが、式（Ｑｄ）のポリマー部分である：

【化60】

（式中、Ｒ^１及びＲ^２は独立に、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化61】

は、式（Ｄ）のＰ−Ｃ_ｔ−Ｓ−部分の一つの硫黄原子、又は、式（Ｑｄ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分のうち一方への付着点を表す）、態様６０に記載の化合物。

【0317】

態様６４：式（IV）の繰り返し単位を含むポリマー材料（例えばチオール−エンヒドロゲル）：

【化62】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択される）。

【0318】

態様６５：前記ポリマー材料のポリマーマトリックスと組み合わされた生物活性成分を更に含む、態様６４に記載のポリマー材料。

【0319】

態様６６：式（Ｖ）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化63】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化64】

は、式（Ｖ）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【0320】

態様６７：式（VI）の繰り返し単位を含む［例えばチオール−エンヒドロゲルに対する］ポリマー材料：

【化65】

（式中、Ｘはポリペプチドであり、ｔ≧１であり、Ｃ_ｔは、少なくとも１つの炭素原子を含むリンカーであり、ここでＣ_ｔリンカーを含むＸの各残基は、天然アミノ酸残基、稀少アミノ酸残基、非天然アミノ酸残基、アミノ酸類似体残基、又はアミノ酸模倣体残基からなる群より選択されうる（但し、前記Ｃ_ｔリンカーを含む天然アミノ酸残基は、システイン残基ではない）と共に、Ｙは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）；ポリグリコリド（ＰＧＡ）；ＰＬＡとＰＧＡとのコポリマー（ＰＬＧＡ）；ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）；ポリ（エチレンオキシド）；ポリ（エチレンオキシド）−コ−ポリ（プロピレンオキシド）ブロックコポリマー；ポロキサミン；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリジオキサノン；ポリカーボネート；ポリアミノカーボネート；ポリ（ビニルピロリドン）；ポリ（エチルオキサゾリン）；ポリウレタン；カルボキシメチルセルロース；ヒドロキシアルキル化セルロース；ポリペプチド；核酸；修飾核酸；ロックド核酸；多糖類；炭水和物；ヘパリン硫酸；コンドロイチン硫酸；ヘパリン、アルギン酸；及びそれらの組合せからなる群より選択され、ここで

【化66】

は、式（VI）のポリマー部分の別のサブ単位のチオエーテル部分に対する付着点を表す）。

【0321】

態様６８：ある状態又は障害を、それを必要とする対象において治療する方法であって、態様３５の修飾ポリペプチド；態様４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；態様４８の化合物；態様５０の化合物；態様５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５８の化合物；態様６０の化合物；態様６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は態様６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分、を投与することを含む方法。

【0322】

態様６９：組織を再生する方法であって、態様４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーに封入された細胞又は組織を、損傷又は欠損を有する組織の部位で放出することを含む方法。

【0323】

態様７０：生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーを含む組成物を、損傷又は欠損を有する組織の部位で産生することを更に含む、態様６９に記載の方法。

【0324】

態様７１：態様３５の修飾ポリペプチド；態様４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；態様４８の化合物；態様５０の化合物；態様５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５８の化合物；態様６０の化合物；態様６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は、態様６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分、を含むキット。

【0325】

態様７２：態様３５の修飾ポリペプチド；態様４６の生体適合性の架橋された分解性ヒドロゲルポリマーと組み合わされた生物活性成分；態様４８の化合物；態様５０の化合物；態様５４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様５８の化合物；態様６０の化合物；態様６４のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；態様６６のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分；又は、態様６７のポリマー材料と組み合わされた生物活性成分、を含む製品。

【実施例】

【0326】

以下の実施例は例示のために供されるものであり、本発明を限定するものではない。

【0327】

実施例１：固相合成における合成オリゴペプチドへのホモシステイン及び２−アミノ−５−スルファニルペンタン酸の組み込み
本技術分野において確立された方法に従って、配列ＫＣＧＰＱＧＩＡＧＱＣＫ（「ＭＭＰＡ」）及びＣＡＬＫＶＬＫＧＣ（「Ｃ２ｘＰＣ」）のシステイン含有オリゴペプチドを、Rink-アミド樹脂での固相Ｆｍｏｃ合成手順により合成した（Chan W.C. and White P.D. 2000参照）。

【0328】

これらの配列のシステインの代わりにホモシステイン又は２−アミノ−５−スルファニルペンタン酸残基を部位特異的に組み込むために、システインの一般的な材料（例えばＦｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）に代えて、Ｆｍｏｃ保護成分（Ｓ）−２−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−４−トリチルスルファニル−酪酸（Bachem）又は（Ｓ）−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−（トリチルチオ）−ペンタン酸（ポリペプチド）を用いて合成手順を実施した。合成されたオリゴペプチドは、本分野で周知の標準的な方法によって樹脂から剪断され、脱保護され、精製される。

【0329】

実施例２：非天然チオールの合成オリゴペプチドへの組み込み
手順１：ＮＨＳ−ＰＥＧ−チオールによるペプチドの樹脂選択的チオール化
２つのシステインアミノ酸の組み込みのないジチオールペプチド架橋剤を生成するために、自動固相ペプチドシンセサイザーを用い、標準的なＦｍｏｃ化学に従って、以下のペプチドを０．５ｍｍｏｌのスケールで合成した（Tribute, Protein Technologies）： ＧＰＱ^（trt）ＧＩＷＧＱ^（trt）ＧＫ^（Dde）Ｇ−樹脂。最後に脱保護工程を追加し、Ｎ−末端Ｆｍｏｃをペプチドから除去し、遊離末端アミンを生成した：ＮＨ_２−ＧＰＱ^（trt）ＧＩＷＧＱ^（trt）ＧＫ^（Dde）Ｇ−樹脂。続いて、ペプチド−樹脂を２０ｍｌ ＤＭＦ ＋ ２％ ヒドラジンと共に室温で１０分間インキュベートし（この脱保護工程を３回繰り返し）、Ｋ^{（Ｄｄｅ）}のＤｄｅ保護基を除去することにより、ＮＨ_２−ＧＰＱ^（trt）ＧＩＷＧＱ^（trt）ＧＫ^（NH２）Ｇ−樹脂を生成した。次に、ペプチド−樹脂をＤＭＦで洗浄してヒドラジンを除去してから、秤量した（５．５ｇのペプチド−樹脂が回収された）。

【0330】

続いて、５１．４ｍｇのペプチド−樹脂を別のガラス反応容器に移送し（０．５ｍｍｏｌスケールの合成で５．５ｇのペプチド−樹脂が得られたことから、５１．４ｍｇは約０．００５ｍｍｏｌのペプチドに相当する）。１ｍｌの無水ＤＭＦ（Sigma）、１００ｍｇの３．５ＫＤａ ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ（Nanocs）、及び９μｌのジイソプロピルエチルアミン（Sigma）を反応容器に加え、室温で＞２４時間攪拌した。次いで、遊離アミンの存在をニンヒドリン試験で検証した（２μｌのビーズを反応系から取り出し、４０μｌの５％ニンヒドリンのエタノール溶液、４０μｌのフェノールとエタノールとの混合液（４：１の比）、及び４０μｌのピリジンと共に、１００℃で２分間インキュベートする。この試験では、遊離アミンの存在は紫色の発色により検出される）。この試験では未反応ペプチド−樹脂は顕著な紫色を呈するのに対し、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ反応系から取り出したビーズは比較試験にて紫色を呈しなかったことから、遊離アミンが首尾よくＮＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨと反応したことが分かった。次に、１ｍｌの切断用カクテル（０．５ｍｌ Ｈ_２Ｏ、０．２５ｇ フェノール、０．２５ｇ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１２５ｍｌ トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、５ｍｌ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と反応させることにより、ペプチドを樹脂から切断した。この工程によりＱ^{（ｔｒｔ）}のＴｒｔ保護基も除去された。得られたペプチドをエーテル沈殿により回収した。

【0331】

手順２：メルカプト−酸によるペプチドの樹脂選択的チオール化
２つのシステインアミノ酸の組み込みを含まないジチオールペプチド架橋剤を生成するために、自動固相ペプチドシンセサイザー（Tribute, Protein Technologies）を用い、標準的なＦｍｏｃ化学に従って、以下のペプチドを０．５ｍｍｏｌスケールで合成する：ＧＫ^{（Ｂｏｃ）}Ｋ^{（Ｄｄｅ）}Ｑ^{（ｔｒｔ）}ＧＩＷＧＱ^{（ｔｒｔ）}ＧＫ^{（Ｄｄｅ）}Ｋ^{（Ｂｏｃ）}Ｇ−樹脂。最後に脱保護及びキャッピング工程を加え、Ｎ−末端Ｆｍｏｃをペプチドから除去すると共に、遊離末端アミンにキャップを付す。次に、ペプチド−樹脂を２０ｍｌ ＤＭＦ ＋ ２％ ヒドラジンと共に室温で１０分間インキュベートする（この脱保護工程を３回繰り返す）ことにより、Ｋ^{（Ｄｄｅ）}のＤｄｅ保護基を除去し、ＧＫ^{（Ｂｏｃ）}Ｋ^{（ＮＨ２）}Ｑ^{（ｔｒｔ）}ＧＩＷＧＱ^{（ｔｒｔ）}ＧＫ^{（ＮＨ２）}Ｋ^{（Ｂｏｃ）}Ｇ−樹脂を産生する。このペプチド樹脂をＤＣＭで複数回洗浄して残留ヒドラジンを除去し、１０ｍｌの無水ＤＣＭを含む反応ガラス容器内に移す。

【0332】

第二の反応は、６００ｍｇのＮＨＳ、８００μｌのジイソプロピルカルボジイミド（DIＣ）、及び４４０μｌの３−メルカプト−プロピオン酸を、無水ＤＣＭ中で、少量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と混合することにより実施する。この反応時に、視認可能な沈殿が形成されれば、ＮＨＳが首尾よく活性化されたことが分かる。この反応系を濾過して沈殿を除去し、ＤＣＭ中のペプチド−樹脂に付加する。混合したペプチド−樹脂と活性化したＮＨＳを室温で３０分間混合し、Ｋ^{（ＮＨ２）}をＫ^{（Ｎ−ＣＣＣ−ＳＨ）}に完全に転換する。この転換はニンヒドリン試験によりモニターされる（前記手順にて説明）。

【0333】

その後、切断用カクテル（１．０ｍｌ Ｈ_２Ｏ、０．５ｇ フェノール、０．５ｇ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．２５ｍｌ トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、１０ｍｌ トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））と反応させることにより、ペプチドを樹脂から切断する。この工程によって、Ｋ^{（Ｂｏｃ）}及びＱ^{（ｔｒｔ）}からＢｏｃ及びＴｒｔ保護基も除去される。得られたペプチドをエーテル沈殿により回収する。

【0334】

前述の手順の代わりに、本分野で公知の数々のチオール化剤を用いて、選択的に脱保護されたアミノ基を非システインチオールに転換することができる。例としては、市販のＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）又はＮ−アセチルホモシステインチオラクトンが挙げられる。

【0335】

実施例３：非システインチオール基のコラーゲンへの組み込み
２０ｍＭ 酢酸（Corning）に〜３ｍｇ／ｍＬ濃度で溶解したラット尾部コラーゲンを、ｐＨ８．０のリン酸緩衝剤中６Ｍ 尿素溶液に対して、＋４℃で一晩透析する。その後、透析された変性コラーゲンに対し、ジメチルスルホキシド中Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（ＳＡＴＰ）の５５ｍＭ 溶液を１：１００（体積：体積）で加え、常温で２時間処理する。リン酸緩衝剤（ｐＨ７．４）中６Ｍ 尿素溶液に対して＋４℃で一晩透析することにより、未反応のＳＡＴＰ及びジメチルスルホキシドを除去する。このタンパク質溶液に対し、０．５Ｍ ヒドロキシルアミン及び２５ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝剤（ｐＨ７．４）を、１：１０（体積：体積）の比率で加え、常温で２時間処理することにより、変性コラーゲンに連結されたチオール基を脱アセチル化し、２０ｍＭ 酢酸に対して＋４℃で更に透析することにより、脱アシル化工程の尿素、緩衝剤、及び低分子量生成物を除去する。

【0336】

実施例４：ジシステイン架橋剤及びＰＥＧ−ジチオール架橋剤を用いたチオール−エンヒドロゲルの光重合の反応速度論
６％（ｗｔ／ｖｏｌ）の４アーム型２０ｋＤａ ＰＥＧテトラノルボルネン（Fairbanks）、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（又はＮＡＰ）（Fairbanks 2）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ５．０）、及び、６ｍＭのジチオール架橋剤 （ノルボルネンはチオールに対して化学量論比）を含む１００μｌの試料を調製した。ジチオール架橋剤としては、直鎖ＰＥＧ−ジチオール、３．５ｋＤａ（JenKem USA）、又は、合成ジシステイン含有オリゴペプチドであるペプチド「ＭＭＰＡ」（アミノ酸配列ＫＣＧＰＱＧＩＡＧＱＣＫ）の何れかを含む物を使用した。何れの試料も二連で調製及び分析した。

【0337】

ヒドロゲル光重合のリアルタイム動態は、Discovery HR-3レオメーター（TA Instruments）の平行プレート配置における原位置（in situ）動的レオロジーにより測定した。１９ｍＷ／ｃｍ^２の３８５ｎｍの光を扁平石英プレートを通じて試料に透過させつつ、０．２５０ｍｍのギャップ、１％の歪み、及び１０ｒａｄ／ｓで、常温で動的応力測定を行った。重合後に歪みを解消し、線形応答レジームを検証した。重合は剪断貯蔵弾性率（Ｇ’）プラトー値に到達するまで継続した（図５）。これは光重合反応の完了を示している。

【0338】

データを検証したところ、架橋剤としてＰＥＧジチオールを用いた場合には、僅か１０ｓ未満の照射でＧ’がプラトー値に到達するのに対し、ジシステインペプチドＭＭＰＡを用いた場合には、顕著に長い時間（８０ｓ超）が必要であることが分かる。

【0339】

実施例５：光誘導性チオール−エン反応の過程における複数のチオール含有化合物についての遊離チオール基の消費率
光開始チオール−エン反応における種々のチオール担持化合物の相対反応性を比較するために、６ｍＭ 直鎖ＰＥＧジノルボルネン（ＭＷ３．８ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積）ＮＡＰ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、及びチオール担持化合物をチオール換算で１２ｍＭの濃度（ノルボルネンの濃度は化学量論比）を含む溶液２００μｌを調製し、これを平底９６ウェル組織培養プレートに入れて、３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で照射した。試験したチオール担持化合物は、β−メルカプトエタノール、メトキシＰＥＧチオール（ＭＷ５ｋＤａ、「ＭＭＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＳＨ」）、塩酸システイン、及び合成ジシステイン含有オリゴペプチド「Ｃ２ｘＰＣ」（アミノ酸配列ＣＡＬＫＶＬＫＧＣ）を含む。

【0340】

特定の時点において、１０μｌのアリコートを前記反応混合物から抜き出し、脱イオン水で１２倍に希釈し残存する遊離チオールの濃度をエルマンアッセイにより以下の手順で測定した。透明な平底９６ウェルプレートで、希釈試料２０μｌと２００μｍｏｌの５,５'−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の５０ｍＭ リン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）２００μｌと混合し、常温で１５分間インキュベートした。試料中の遊離チオールから放出された２−ニトロ−５−チオベンゾエート由来の４０５ｎｍでの光学密度をBioTek ELx800プレートリーダーで決定した。新たに調製した塩酸システインの０．０６３ｍＭから１．４６ｍＭまでの希釈系列を同様に製造し、Microsoft Excelの線形回帰によるフィッティングにより、試料中の遊離チオール濃度と４０５ｎｍでの光学密度との一次方程式を作成し、これを用いて照射された試料における遊離チオールの濃度を算出した。

【0341】

試験した４つの化合物全てについての光誘導性チオール−エン反応の程における遊離チオールの消費量の動態を図６に示す。注目すべき点として、動態曲線は２つの異なる群に明確に分かれている。即ち、β−メルカプトエタノール及びＭＭＥ−ＰＥＧ５Ｋ−ＳＨは僅か１０秒の照射で反応が完了まで進んだのに対し、システイン含有化合物（システイン及びＣ２ｘＰＣオリゴペプチド）の反応は何れもより緩やかであり、反応が概ね完了するまでに９０秒の照射が必要であった。

【0342】

他の注目すべき点として、この実験で使用された前記チオール−エン反応条件は、上述の実施例４と実質的に同一であり、唯一の違いは、本実施例では反応生成物が直鎖の水溶性分子であったのに対し、実施例４では共有結合により架橋されたネットワークであった点ある。図５及び図６の動態曲線を直接比較すれば明らかなように、システイン含有架橋剤とチオール担持ＰＥＧとのネットワーク形成速度の違いは、主にこれらの化合物群により提供されるチオール官能基の反応性の違いによるものである。即ち、光誘導性チオール−エン反応においてシステイン系チオールが示す反応性は特に緩やかであることが分かる。

【0343】

実施例６：システイン媒介性チオール−エン反応による鶏卵リゾチームの損傷
１．４ ｍｇ／ｍＬ 鶏卵リゾチーム、６ｍＭ 直鎖ＰＥＧジノルボルネン（ＭＷ３．８ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積） ＮＡＰ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と、及びチオール担持化合物をチオール換算で１２ｍＭの濃度（ノルボルネンの濃度は化学量論比）を含む溶液５０μｌを調製し、開放１．５ ｍＬ エッペンドルフチューブに入れて上方から３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で照射した。チオール担持化合物としては、システイン（遅反応）又はメトキシＰＥＧチオール （速反応）を含むものを用いた。照射時間は、遅反応については９０秒、速反応については１０秒とした。選択された条件下でこれらの照射時間結果を適用した結果、実施例４で使用したのと同様の多アーム型ノルボルネン−及びチオール−担持モノマーを使用した場合、遅反応及び速反応の双方でチオールが完全に消費され（図６；実施例５）、共有結合により架橋されたネットワークの形成が十分に誘導された。

【0344】

照射試料及び非照射対照をＬＤＳゲル装填緩衝剤（Invitrogen）で〜８００倍に希釈し、反応生成物を１２％ Novex NuPageゲル（Invitrogen）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いで銀染色を行った（SilverQuest染色キット、Invitrogen）。

【0345】

結果を図７に示す。ＰＥＧ−チオール架橋ヒドロゲルを完全に光重合させるのに必要な時間に亘ってリゾチームを速反応のチオール−エンプロセスに暴露した結果、未処理対照と比較してタンパク質の移動性に検出可能な変化は現れなかった（「ＰＥＧ−ＳＨ, 未ＵＶ」レーンと「ＰＥＧ−ＳＨ, １０”ＵＶ」レーンとの対比）。これは、カーゴ（cargo）タンパク質（リゾチーム）が無傷であったことを示唆している。一方、チオール−エンプロセスが遅反応の場合、ネットワーク形成が完了するのに必要な時間に亘って目的タンパク質を反応に暴露することにより、移動の遅いタンパク質形態が相当量生じた（「Ｃys, 未ＵＶ」レーンと「Ｃys, ９０”ＵＶ」レーンとの対比）。この結果は、天然状態の鶏卵リゾチームには遊離チオールは利用できないにもかかわらず、カーゴ（cargo）タンパク質が何らかの二次的なプロセスに関与した結果、おそらくは３．８ｋＤａＰＥＧジノルボルネンが付加されたことを示している。

【0346】

この実施例は、チオール−エンの速反応と遅反応との間で、バイオ直交性が大きく異なることを示している。即ち、より反応性の高いチオール部分（例えばメトキシ−ＰＥＧ−チオール）により媒介されるチオール−エンプロセスは真のバイオ直交性（遊離チオールを欠くバイオマクロ分子に対して非反応性）であるのに対し、より緩やかなシステイン系チオールにより媒介されるプロセスは、少なくともある選択されたバイオマクロ分子（リゾチーム）に対してはバイオ直交性を欠く。

【0347】

実施例７：光誘導性チオール−エン反応の過程におけるシステイン及びホモシステイン含有化合物の遊離チオール基の消費率
光開始チオール−エン反応におけるシステイン系チオールとホモシステイン系チオールとの相対反応性を比較するために、６ｍＭ 直鎖ＰＥＧジノルボルネン（ＭＷ３．８ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積） ＮＡＰ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、及びチオール担持化合物をチオール換算で１２ｍＭの濃度（ノルボルネンの濃度は化学量論比）で含む溶液２００μｌを調製し、平底９６ウェル組織培養プレートに入れて３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で照射した。試験されたチオール担持化合物としては、遊離アミノ酸であるシステイン及びホモシステインに加えて、合成ジシステイン含有ペプチド「ＭＭＰＡ」及び「Ｃ２ｘＰＣ」（アミノ酸配列ＫＣＧＰＱＧＩＡＧＱＣＫ及びＣＡＬＫＶＬＫＧＣ）並びにシステインを含むホモシステインを含むそれらの類似体「ｈＣ ＭＭＰＡ」及び「ｈＣ２ｘＰｈＣ」を用いた。特定の時点において、反応系から１０μｌのアリコートを抜き出し、脱イオン水で１２倍に希釈し、上記実施例で説明したように、残存する遊離チオールの濃度をエルマンアッセイにより測定した。

【0348】

遊離チオールの消費量の動態について、システインとホモシステインとを比較した結果を図８のパネルＡに示し、オリゴペプチドを含むジシステインとジホモシステインとを比較した結果を図８のパネルＢに示す。遊離システイン並びにジシステイン含有ペプチドＭＭＰＡ及びＣ２ｘＰＣのチオール消費速度は、実施例５に示した値と実質的に同様であり、約９０秒間の照射でほぼ完全にチオールが消費された。遊離ホモシステインは遙かに速く反応し、僅か２０秒の照射で完全に消費された（図８パネルＡ）。ジホモシステイン含有ペプチドであるｈＣＭＭＰＡ及びｈＣ２ｘＰｈＣの反応は更に速く、僅か１５秒の照射でチオールが完全に消費された。

【0349】

実施例８：ジシステイン架橋剤及びジホモシステイン架橋剤を用いたチオール−エンヒドロゲルの光重合の反応速度論
６％（ｗｔ／ｖｏｌ）の４アーム型２０ｋＤａＰＥＧ テトラノルボルネン（Fairbanks）、０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィン酸ナトリウム（又はＮＡＰ）（Fairbanks 2）、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤 ｐＨ５．０、及び６ｍＭのジチオール架橋剤（ノルボルネンはチオールに対して化学量論比）を含む試料１００μｌを調製した。ジチオール架橋剤としては、合成ジシステイン含有オリゴペプチドであるペプチド「ＭＭＰＡ」（アミノ酸配列ＫＣＧＰＱＧＩＡＧＱＣＫ）、又は、各システイン残基がホモシステインで置換されてなる他は同一の配列を有するジホモシステイン類似体「ｈＣＭＭＰＡ」の何れかを用いた。全ての試料の調製及び分析は二連で行った。

【0350】

ヒドロゲル光重合のリアルタイム動態を、Discovery HR-3レオメーター（TA Instruments）の平行プレート配置における原位置（in situ）での動的レオロジーにより測定した。３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で、扁平石英プレートを通じて試料二等化させつつ、０．２５０ｍｍギャップ、１％の歪み、及び１０ｒａｄ／ｓで、常温で動的応力測定を行った。重合後に歪みの解消を行い、線形応答レジームを検証した。重合は剪断貯蔵弾性率（Ｇ’）がプラトー値に到達するまで継続した（図９）。これは光重合反応の完了を示している。

【0351】

データを検証したところ、架橋剤としてジホモシステインペプチドであるｈＣＭＭＰＡを用いた場合、２０秒以内の照射でＧ’がプラトー値に到達するのに対し、ジシステインペプチドＭＭＰＡを用いた場合は顕著に長い時間（８０秒超）が必要となることが分かる。更に、ＭＭＰＡ架橋ネットワークの場合、Ｇ’のプラトー値は、ｈＣ ＭＭＰＡ架橋ネットワークよりも顕著に低かった。使用したモノマーはほぼ同一の化学組成を有していることを考慮すると、これは予想外の結果である。斯かる相違点は、ジシステイン含有架橋剤の場合、反応があまりに遅いため、光重合の過程でヒドロゲルネットワークが完全に形成される前に全ての開始剤が消費されてしまうのに対し、反応性がより高いジホモシステイン架橋剤の場合には、ヒドロゲルが完全に形成されることを示している。この仮説を県s徴するべく、１０倍濃度の開始剤（０．１％ ＮＡＰ）を用いてＭＭＰＡ架橋剤についての光重合実験を繰り返した。図９が示すように、斯かる高濃度の開始剤を用いた場合、ＭＭＰＡ媒介性光重合の全体の速度は、０．０１％ ＮＡＰを用いたｈＣ ＭＭＰＡ媒介性プロセスの場合に近い値となった上に、結果として得られたネットワークの弾性特性はほぼ同一であった。しかし、この速度の増加は、モノマー溶液及び生物活性カーゴ（cargo）（例えば封入されたタンパク質）を１０倍濃度の開始剤に暴露して得られたものである。惹いては、より高い濃度のフリーラジカルに暴露されることになり、カーゴ（cargo）の安定性に有害作用を及ぼす可能性が高い。

【0352】

実施例９：ホモシステイン媒介性チオール−エン反応に暴露されたリゾチームのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
１．４ｍｇ／ｍＬ 鶏卵リゾチーム、６ｍＭ 直鎖ＰＥＧジノルボルネン（ＭＷ３．８ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積） ＮＡＰ、５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、及びチオール担持化合物をチオール換算で１２ｍＭの濃度（ノルボルネンの濃度は化学量論比）含む溶液５０μｌを調製し、開放１．５ｍＬ エッペンドルフチューブに入れて、上方から３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で照射した。チオール担持化合物としては、システイン（遅反応）又はホモシステイン（速反応）を用いた。照射時間は、システインについては９０秒、ホモシステインについては２０秒とした。選択された反応条件下でこれらの照射時間を適用した結果、実施例８と同様の多アーム型ノルボルネン−及びチオール−担持モノマーを用いた場合、遅反応及び速反応の何れでもチオールが完全に消費され（図８；実施例７）、光重合を完了させるのに十分であった。更に、上述の実施例８で議論したように、システイン媒介性光重合の過程において、ネットワークを完全に形成させる条件への暴露によりカーゴ（cargo）タンパク質の損傷の可能性を調べるべく、１０倍濃度の開始剤（０．１％ ＮＡＰ）を用いて、１０秒の照射でシステイン媒介性反応を繰り返した。

【0353】

照射試料及び非照射対照を、ＬＤＳゲル装填緩衝剤（Invitrogen）により〜８００倍に希釈し、反応生成物を１２％ Novex NuPageゲル（Invitrogen）によりＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いで銀染色を行った（SilverQuest染色キット、Invitrogen）。

【0354】

結果を図１０に示す。完了まで誘導したホモシステイン媒介性反応にリゾチームを暴露した結果、システイン媒介性反応への暴露による障害作用から、完全に保護することが可能であった（図１０、「Ｃys, ９０”ＵＶ」レーンと「ｈＣｙｓ, ２０“ＵＶ」レーンとの対比）。これと同時に、ホモシステイン系架橋剤の場合には完全にネットワークが形成されたと推測されるのに対し（実施例８）、システイン系の場合には当てはまらなかった。後者の場合、ネットワーク形成を完了させるには、開始剤濃度を１０倍にする必要があった（図９、実施例８）。これにより、非常に短い反応時間であったにもかかわらず、カーゴ（cargo）タンパク質の殆どが二次的なプロセスに消費されてしまった（「Ｃys, １０”ＵＶ」レーン）。

【0355】

実施例１０：光誘導性チオール−エン反応の過程における遊離チオール基の消費速度に対する酸素の影響
光開始チオール−エン反応においてチオールの反応性に溶存酸素が与える影響を調べるため、濃度６ｍＭの直鎖ＰＥＧ−ジノルボルネン（ＭＷ３．５ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積）のＮＡＰ、及び濃度６ｍＭのＰＥＧ−ジチオール（ＭＷ３．５ｋＤａ）を含む（即ちチオール基及びノルボルネン基が化学量論比で存在する）溶液４ｍＬを調製した。この溶液を２ｍＬのアリコート２つに分割し、その一方の溶液にアルゴンの低圧流を２０分間バブリングして酸素を除去した（脱気）。第二の２ｍＬのアリコートは脱気せずに用いた。各溶液の４０μＬのアリコートを円錐底９６ウェルポリプロピレンプレートに入れ、３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で表示の時間照射した。その後、照射試料から１０μＬのアリコートを抜き出し、脱イオン水で１１倍に希釈し、残存する遊離チオール基の濃度を、実施例５で説明したようにエルマンアッセイで測定した。全てのデータ点は二連で収集し、標準的な統計技術に従って平均値及び標準偏差を計算した。

【0356】

未処理（「そのまま」、“as is”）系及び脱気反応系の遊離チオールの消費量の動態を図１１で比較した。未処理（「as is」）反応系は、活性化に〜３〜４秒の顕著な知見期間を示したが、その後は僅か４秒で急速に完了した。反応物溶液を脱気した系では、活性化の遅延は全く消失し、反応も遙かに速く進行し、最初の４秒間の照射で反応がほぼ完了した。

【0357】

実施例１１：骨格の修飾の影響
前記の実施例では、側鎖長を延長する（例えば、システインに炭素を付加してホモシステインとする）ことで、ラジカルチオール−エン化学に関するチオール基の活性を増強できることを示した（図８Ａ及び８Ｂ参照）。光開始チオール−エン反応においてシステイン骨格（即ち側鎖よりもα−アミノ酸部分）の修飾がチオールの反応性に与える影響を調べるために、濃度６ｍＭの直鎖ＰＥＧ−ジノルボルネン（ＭＷ３．５ｋＤａ）、０．０１％（重量／体積）のＮＡＰ、及び、４つの異なるチオールの何れかを濃度１２ｍＭで含む（即ち、チオール基及びノルボルネン基は化学量論比で存在する）溶液４ｍＬを調製した。試験対象のチオールとしては、システイン、ホモシステイン、３−メルカプトプロピオン酸、及びシステアミンを用いた（図１２Ａ参照）。各溶液の４０μＬのアリコートを円錐底９６ウェルポリプロピレンプレートに入れ、３８５ｎｍの光を１９ｍＷ／ｃｍ^２で、表示された時間に亘って照射した。その後、照射試料から１０μｌのアリコートを抜き出し、脱イオン水で１１倍に希釈し、上記の実施例５で説明したように、残存する遊離チオールの濃度をエルマンアッセイにより測定した。全てのデータ点は二連で収集し、標準的な統計技術によって平均値及び標準偏差を求めた。

【0358】

各化合物の遊離チオールの消費量の動態を図１２Bで比較する。この結果から明らかなように、骨格修飾（この場合ではカルボキシル基又はアミンの除去）により、ホモシステインで見られるのと同様の速度の増加が見られる。

【0359】

参考文献
Chan W.C. and White P.D. (Eds.) 2000. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. New York, NY: Oxford University Press.
Yan J-J, Sun J-T, You Y-Z, Wu D-C, Hong C-Y. Growing Hyperbranched Polymers Using Natural Sunlight. Scientific Reports 2013;3:2841.
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【0360】

本明細書を通じた引用文献、例えば公報、特許、特許出願、及び公開特許出願等は、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。

【0361】

以上、理解の明確化の目的で、本発明を例示及び実施例を通じて幾分詳細に説明したが、細かな変更や改変を施して実施できることは当業者には明らかであろう。従って、発明の詳細な説明及び実施例が本発明の範囲を限定するものと介してはならない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A-B】

【図4C-D】

【図4E】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A-B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【国際調査報告】