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特表2018-515086前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）二重特異性結合剤及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2018-515086(P2018-515086A)
(43)【公表日】2018年6月14日
(54)【発明の名称】前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）二重特異性結合剤及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20180518BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20180518BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20180518BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20180518BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20180518BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20180518BHJP
A61P 13/08 20060101ALI20180518BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20180518BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20180518BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20180518BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20180518BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20180518BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20180518BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20180518BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20180518BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20180518BHJP
【ＦＩ】
C12N15/00 A
C07K16/28ZNA
C07K16/30
C07K16/46
C07K19/00
A61P35/00
A61P13/08
A61P13/10
A61P11/00
A61K45/00
A61P43/00 121
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K47/68
A61K47/65
A61P1/04
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】113
(21)【出願番号】特願2017-557335(P2017-557335)
(86)(22)【出願日】2016年5月6日
(85)【翻訳文提出日】2017年12月25日
(86)【国際出願番号】US2016031260
(87)【国際公開番号】WO2016179518
(87)【国際公開日】20161110
(31)【優先権主張番号】62/157,789
(32)【優先日】2015年5月6日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100104282
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 康仁
(72)【発明者】
【氏名】アンダーソン，グレン
(72)【発明者】
【氏名】カードソ，ローサ
(72)【発明者】
【氏名】ディエム，マイケル
(72)【発明者】
【氏名】ゴーデット，フランソワ
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドバーグ，シャロム
(72)【発明者】
【氏名】ハーマン，ベンジャミン シー．
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン，リニュス
(72)【発明者】
【氏名】ジェイコブス，スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】クレイン，ドナ
(72)【発明者】
【氏名】リ，インジェ
(72)【発明者】
【氏名】ルオ，ジンチャン
(72)【発明者】
【氏名】マクデイド，ロナン
(72)【発明者】
【氏名】ネメス−スィー，ジェニファー
(72)【発明者】
【氏名】オニール，カリン
(72)【発明者】
【氏名】ポメランツ，スティーブン シー．
(72)【発明者】
【氏名】チャンドラ ラオ，ガラ
(72)【発明者】
【氏名】スピンカ−ドムス，トレイシー
(72)【発明者】
【氏名】テプライアコブ，アレクシー
(72)【発明者】
【氏名】ウ，シェン−ジウン
(72)【発明者】
【氏名】ムーニー，ジル
(72)【発明者】
【氏名】ルイストロ，レオポルド
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4C076CC41
4C076EE52
4C084AA19
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA66
4C084ZA811
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085CC31
4C085DD62
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明では、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを提供する。ＦＮ３ドメインは、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合し、第２の抗原結合部位は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する。更に、融合タンパク質、提供された融合タンパク質をコードすることができる関連ポリヌクレオチド、及び提供された融合タンパク質を発現する細胞についても記載する。加えて、提供された単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの使用方法について記載する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．ＦＮ３ドメインと、
ｂ．軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ．重鎖（ＨＣ）と、を含む、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子であって、
前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記ＨＣと前記ＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ｂ．軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ．重鎖（ＨＣ）と、を含む、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子であって、
前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、前記ＨＣと前記ＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項3】
前記ＰＳＭＡは、配列番号：１４４である、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項4】
前記ＦＮ３ドメインは、カニクイザルＰＳＭＡ又はチンパンジーＰＳＭＡと交差反応する、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項5】
カニクイザルＰＳＭＡは、配列番号：３２を含む、請求項４に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記チンパンジーＰＳＭＡは、配列番号：３３を含む、請求項４に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項7】
ａ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号：４のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、前記配列番号：１又は配列番号：４は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３及び／又は８６において置換を任意選択的に有する、又は、
ｂ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブラリから単離されている、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ｂ）前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブラリから単離されている、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６２に対応する少なくとも１つの残基位置において、又はＣ末端において、システイン残基を有する、請求項１〜７に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項9】
前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項10】
前記ＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４アイソタイプを含む、請求項９に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項11】
前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡ酵素活性を阻害する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項12】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項13】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項14】
前記ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡのエピトープＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に結合する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項15】
前記ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と少なくとも８９％同一であるか、又は前記配列番号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１カ所の置換を有する、アミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項16】
前記ＦＮ３ドメインのＮ末端においてメチオニンを更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項17】
前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：４０のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：３５のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：３６のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：３７のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：３８のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：３９のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：４６のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：４５のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：４１のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：４４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：４２のアミノ酸配列、又は、
ｌ．配列番号：４３のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ａ．配列番号：４０のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：３５のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：３６のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：３７のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：３８のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：３９のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：４６のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：４５のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：４１のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：４４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：４２のアミノ酸配列、又は、
ｌ．配列番号：４３のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項18】
前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：４７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：５１のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：５０のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：４９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ａ．配列番号：４７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：５１のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：５０のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：４９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項19】
前記ＦＮ３ドメインは、
ａ．配列番号：７５のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：７６のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：７７のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：７８のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：７９のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：８０のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：８１のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：８２のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：８３のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：８４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：８５のアミノ酸配列、
ｌ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｍ．配列番号：８７のアミノ酸配列、
ｎ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｏ．配列番号：８９のアミノ酸配列、
ｐ．配列番号：９０のアミノ酸配列、
ｑ．配列番号：９１のアミノ酸配列、
ｒ．配列番号：９２のアミノ酸配列、
ｓ．配列番号：９３のアミノ酸配列、
ｔ．配列番号：９４のアミノ酸配列、
ｕ．配列番号：９５のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号：９６のアミノ酸配列、
ｗ．配列番号：９７のアミノ酸配列、
ｘ．配列番号：９８のアミノ酸配列、
ｙ．配列番号：９９のアミノ酸配列、
ｚ．配列番号：１００のアミノ酸配列、
ａａ．配列番号：１０１のアミノ酸配列、
ｂｂ．配列番号：１０２のアミノ酸配列、
ｃｃ．配列番号：１０３のアミノ酸配列、
ｄｄ．配列番号：１０４のアミノ酸配列、
ｅｅ．配列番号：１０５のアミノ酸配列、
ｆｆ．配列番号：１０６のアミノ酸配列、
ｇｇ．配列番号：１０７のアミノ酸配列、
ｈｈ．配列番号：１０８のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：１０９のアミノ酸配列、
ｊｊ．配列番号：１１０のアミノ酸配列、
ｋｋ．配列番号：１１１のアミノ酸配列、
ｌｌ．配列番号：１１２のアミノ酸配列、
ｍｍ．配列番号：１１３のアミノ酸配列、
ｎｎ．配列番号：１１４のアミノ酸配列、
ｏｏ．配列番号：１１５のアミノ酸配列、
ｐｐ．配列番号：１１６のアミノ酸配列、
ｑｑ．配列番号：１１７のアミノ酸配列、
ｒｒ．配列番号：１１８のアミノ酸配列、
ｓｓ．配列番号：１１９のアミノ酸配列、
ｔｔ．配列番号：１２０のアミノ酸配列、
ｕｕ．配列番号：１２１のアミノ酸配列、
ｖｖ．配列番号：１２２のアミノ酸配列、
ｗｗ．配列番号：１２３のアミノ酸配列、
ｘｘ．配列番号：１２４のアミノ酸配列、
ｙｙ．配列番号：１２５のアミノ酸配列、
ｚｚ．配列番号：１２６のアミノ酸配列、
ａａａ．配列番号：１２７のアミノ酸配列、
ｂｂｂ．配列番号：１２８のアミノ酸配列、
ｃｃｃ．配列番号：１２９のアミノ酸配列、
ｄｄｄ．配列番号：１３０のアミノ酸配列、
ｅｅｅ．配列番号：１３１のアミノ酸配列、
ｆｆｆ．配列番号：１３２のアミノ酸配列、
ｇｇｇ．配列番号：１３３のアミノ酸配列、
ｈｈｈ．配列番号：１３４のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号：１３５のアミノ酸配列、
ｊｊｊ．配列番号：１３６のアミノ酸配列、
ｋｋｋ．配列番号：１３７のアミノ酸配列、
ｌｌｌ．配列番号：１３８のアミノ酸配列、
ｍｍｍ．配列番号：１３９のアミノ酸配列、又は、
ｎｎｎ．配列番号：１４０のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ａ．配列番号：７５のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：７６のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：７７のアミノ酸配列、
ｄ．配列番号：７８のアミノ酸配列、
ｅ．配列番号：７９のアミノ酸配列、
ｆ．配列番号：８０のアミノ酸配列、
ｇ．配列番号：８１のアミノ酸配列、
ｈ．配列番号：８２のアミノ酸配列、
ｉ．配列番号：８３のアミノ酸配列、
ｊ．配列番号：８４のアミノ酸配列、
ｋ．配列番号：８５のアミノ酸配列、
ｌ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｍ．配列番号：８７のアミノ酸配列、
ｎ．配列番号：８８のアミノ酸配列、
ｏ．配列番号：８９のアミノ酸配列、
ｐ．配列番号：９０のアミノ酸配列、
ｑ．配列番号：９１のアミノ酸配列、
ｒ．配列番号：９２のアミノ酸配列、
ｓ．配列番号：９３のアミノ酸配列、
ｔ．配列番号：９４のアミノ酸配列、
ｕ．配列番号：９５のアミノ酸配列、
ｖ．配列番号：９６のアミノ酸配列、
ｗ．配列番号：９７のアミノ酸配列、
ｘ．配列番号：９８のアミノ酸配列、
ｙ．配列番号：９９のアミノ酸配列、
ｚ．配列番号：１００のアミノ酸配列、
ａａ．配列番号：１０１のアミノ酸配列、
ｂｂ．配列番号：１０２のアミノ酸配列、
ｃｃ．配列番号：１０３のアミノ酸配列、
ｄｄ．配列番号：１０４のアミノ酸配列、
ｅｅ．配列番号：１０５のアミノ酸配列、
ｆｆ．配列番号：１０６のアミノ酸配列、
ｇｇ．配列番号：１０７のアミノ酸配列、
ｈｈ．配列番号：１０８のアミノ酸配列、
ｉｉ．配列番号：１０９のアミノ酸配列、
ｊｊ．配列番号：１１０のアミノ酸配列、
ｋｋ．配列番号：１１１のアミノ酸配列、
ｌｌ．配列番号：１１２のアミノ酸配列、
ｍｍ．配列番号：１１３のアミノ酸配列、
ｎｎ．配列番号：１１４のアミノ酸配列、
ｏｏ．配列番号：１１５のアミノ酸配列、
ｐｐ．配列番号：１１６のアミノ酸配列、
ｑｑ．配列番号：１１７のアミノ酸配列、
ｒｒ．配列番号：１１８のアミノ酸配列、
ｓｓ．配列番号：１１９のアミノ酸配列、
ｔｔ．配列番号：１２０のアミノ酸配列、
ｕｕ．配列番号：１２１のアミノ酸配列、
ｖｖ．配列番号：１２２のアミノ酸配列、
ｗｗ．配列番号：１２３のアミノ酸配列、
ｘｘ．配列番号：１２４のアミノ酸配列、
ｙｙ．配列番号：１２５のアミノ酸配列、
ｚｚ．配列番号：１２６のアミノ酸配列、
ａａａ．配列番号：１２７のアミノ酸配列、
ｂｂｂ．配列番号：１２８のアミノ酸配列、
ｃｃｃ．配列番号：１２９のアミノ酸配列、
ｄｄｄ．配列番号：１３０のアミノ酸配列、
ｅｅｅ．配列番号：１３１のアミノ酸配列、
ｆｆｆ．配列番号：１３２のアミノ酸配列、
ｇｇｇ．配列番号：１３３のアミノ酸配列、
ｈｈｈ．配列番号：１３４のアミノ酸配列、
ｉｉｉ．配列番号：１３５のアミノ酸配列、
ｊｊｊ．配列番号：１３６のアミノ酸配列、
ｋｋｋ．配列番号：１３７のアミノ酸配列、
ｌｌｌ．配列番号：１３８のアミノ酸配列、
ｍｍｍ．配列番号：１３９のアミノ酸配列、又は、
ｎｎｎ．配列番号：１４０のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項20】
前記ＬＣは、
ａ．配列番号：１６７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６８のアミノ酸配列、又は、
ｃ．配列番号：１６９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ａ．配列番号：１６７のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６８のアミノ酸配列、又は、
ｃ．配列番号：１６９のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項21】
前記ＨＣは、
ａ．配列番号：１６３のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６４のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：１６５のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：１６６のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ａ．配列番号：１６３のアミノ酸配列、
ｂ．配列番号：１６４のアミノ酸配列、
ｃ．配列番号：１６５のアミノ酸配列、又は、
ｄ．配列番号：１６６のアミノ酸配列、を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項22】
ａ．前記ＨＣは、配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｂ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｃ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｄ．ＨＣは、配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｅ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｇ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｈ．ＨＣは、配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｉ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｊ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｋ．ＨＣは、配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｌ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｆ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、又は、
ｇ．ＨＣは、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
ｂ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｃ．ＨＣは、前記配列番号：１６３のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｄ．ＨＣは、配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｅ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｇ．ＨＣは、前記配列番号：１６４のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｈ．ＨＣは、配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｉ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｊ．ＨＣは、前記配列番号：１６５のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、
ｋ．ＨＣは、配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６７のアミノ酸配列を含む、
ｌ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６８のアミノ酸配列を含む、
ｆ．ＨＣは、前記配列番号：１６６のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、前記配列番号：１６９のアミノ酸配列を含む、又は、
ｇ．ＨＣは、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣは、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項23】
ＰＳＭＡ過剰発現がんを有する対象を治療するための方法であって、
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に、前記がんを治療するのに十分な時間投与することを含む、方法。
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に、前記がんを治療するのに十分な時間投与することを含む、方法。
【請求項24】
それを必要とする対象においてＰＳＭＡ過剰発現がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法であって、
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投与することを含む、方法。
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項25】
それを必要とする対象においてＴ細胞をＰＳＭＡ過剰発現がん細胞へと再指向させる方法であって、
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投与することを含む、方法。
治療的に有効な量の、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項26】
前記がんは、固体腫瘍である、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記がんは、血管新生疾患である、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
【請求項28】
前記がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、肺がん、扁平上皮がん、神経膠腫、乳がん又は腎がんである、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
【請求項29】
前記がんは、前立腺がんである、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
第２の治療剤を投与することを更に含む、請求項２３、２４又は２５に記載の方法。
【請求項31】
前記第２の治療剤は、化学療法剤又は標的化抗がん治療である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記化学療法剤又は標的化抗がん治療は、アビラテロンアセテート（ザイティガ）、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリクス、ドセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリンアセテート、ジェブタナ（カバジタキセル）、ロイプロリドアセテート、リュープロン（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−３ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−４ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−ペッド（ロイプロリドアセテート）、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ（シプリューセル−Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプリューセル−Ｔ、タキソテール（ドセタキセル）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）又はゾラデックス（ゴセレリンアセテート）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記第２の治療剤は、前記単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと同時に、連続的に又は別々に、前記対象に投与される、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項35】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、同分子又はフラグメントのための包装と、を含む、キット。
【請求項36】
ａ．重鎖と、
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
【請求項37】
前記重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡである、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項38】
ａ．Ｆｃ領域と、
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
ｂ．ＦＮ３ドメインと、
ｃ．リンカーと、を含む、融合タンパク質。
【請求項40】
前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のアミノ末端に連結されている、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項41】
前記リンカー及びＦＮ３ドメインは、前記Ｆｃ領域のカルボキシル末端に連結されている、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項42】
前記リンカーは、配列番号：１７５のアミノ酸配列を含む、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項43】
前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項44】
前記重鎖は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項45】
前記重鎖は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント。
【請求項46】
請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の単離されたＣＤ３ｘＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項47】
請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離された合成ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(配列表)本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、当該配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１６年５月３日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０６６ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１９５，４３６バイトである。
【0002】
本明細書に提供される本開示は、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合しクラスター決定基３（ＣＤ３）に免疫特異的に結合する多重特異性薬剤、並びに当該記載した薬剤の製造方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【0003】
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ又はＮ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼＩとしても周知である前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、二量体のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡは、葉酸塩及びＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸を含むいくつかの基質を開裂させ、また、前立腺内の多数の組織において最も高発現し、小腸、中枢及び末梢神経系、腎臓、並びに肺内において多少発現する。ＰＳＭＡは、クラスリン被覆ピットを介して恒常的に内部移行される。
【0004】
ＰＳＭＡは、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）内においてしばしば過剰発現する前立腺がん関連細胞膜抗原であり、一部の前立腺細胞が異常に見え始めたり異常にふるまい始めたりする状態であり、原発性及び転移性の前立腺がんであり、また、その他固体腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、膀胱がん、腎がん）の新生血管系である。ＰＳＭＡの発現は、疾患進行及びグリーソンスコアと関連している。ＰＳＭＡの発現は、転移性疾患、ホルモン不応性患者、及びより悪性度の高い病変において増加し、アンドロゲン不応性腫瘍内において更に上方制御される。
【0005】
前立腺がんは、男性におけるがん発病の主原因であり、また死につながるがんの２番目の主原因である。世界的に、毎年約１，１００，０００件の新たな症例及び３００，０００件の死亡数が存在し、換算すると、がんによる全死者数の約４％となる。男性の６人に１人が当該疾患と診断されると推定されている。アメリカ合衆国内では、前立腺がんの９０％超が局所又は領域ステージで発見されている。これら初期ステージにおける５年生存率は、ほぼ１００％である。しかしながら、がんが転移した場合、５年生存率は約２８％にまで低下する。
【0006】
前立腺がんにおける現行の治療法としては、外科手術、放射線治療、並びにホルモン及び抗体薬物複合体（ＡＤＣ）療法が挙げられる。しかしながら、腫瘍細胞は多くの場合アンドロゲン不応性となってしまい、これが起こると、残された治療の選択肢が限られることになる。一般的に、がんワクチンのシプリューセル−Ｔ、放射性医薬品（塩化ラジウム−２２３など）、二次ホルモン療法（アビラテロン又はエンザルタミドなど）、及び／又は化学療法（ドセタキセル及びカバジタキセル）が、ホルモン療法に続き順に追加される。
【0007】
これら治療剤のそれぞれは、がんの成長を数ヵ月間遅らせ、当該疾患により生じた症状を緩和させることができるが、当該疾患は最終的にこれら治療剤に耐性を持つようになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、前立腺がん、及びＰＳＭＡを過剰発現するその他のがんを治療するための、更なる向上した医薬品に対する要望は依然として存在している。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本明細書において、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する、単離された多重特異性抗原結合分子（「ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性分子」）、又はその多重特異性抗原結合フラグメントが記載されている。一実施形態では、ＰＳＭＡに対して特異的に結合する、単離された多重特異性分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、結合するＰＳＭＡは、配列番号：１４４のアミノ酸配列を含む。
【0010】
ＦＮ３ドメイン一部の実施形態では、多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントのＰＳＭＡ特異的ドメインは、ヒトＰＳＭＡに結合する。一部の実施形態では、多重特異性又はその多重特異性抗原結合フラグメントのＰＳＭＡ特異的ドメインは、カニクイザルＰＳＭＡ又はチンパンジーＰＳＭＡと交差反応する。好ましい実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、単離された抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、ａ）ＦＮ３ドメインと、ｂ）軽鎖（ＬＣ）と、ｃ）重鎖（ＨＣ）と、を含み、ＦＮ３ドメインは、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＨＣとＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成し、又は、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン×そのＣＤ３二重特異性抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを発現する、単離された細胞を提供する。一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＦＮ３ドメイン（又は「ＰＳＭＡ特異性アーム」）は、配列番号：１のＴｅｎｃｏｎ配列又は配列番号：４のＴｅｎｃｏｎ２７に由来し、配列番号：１又は配列番号：４は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３及び／又は８６において置換を任意選択的に有しており、あるいは、ＦＮ３ドメインは、本明細書に記載する配列番号：２、３、５、６、７又は８の配列を含むライブラリから単離されている。これら配列を有するＦＮ３ドメインの例を、表１に列挙する。
【0011】
【表1】
【0012】
別の実施形態では、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＦＮ３ドメインは、表２に列挙する配列から選択してもよい。
【0013】
【表2-1】
【0014】
【表2-2】
【0015】
【表2-3】
【0016】
【表2-4】
【0017】
別の実施形態では、配列番号：１４４のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの単離ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と８９％同一であるか、又は配列番号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１カ所の置換を有する、アミノ酸配列を含む。
【0018】
別の実施形態では、配列番号：１４４のヒトＰＳＭＡに特異的に結合する、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＦＮ３ドメインは、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９又は１４０のアミノ酸配列を含む。
【0019】
融合タンパク質本発明の別の実施形態は、重鎖と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タンパク質である。重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡであってもよい。本発明の別の実施形態は、Ｆｃ領域と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タンパク質である。リンカー及びＦＮ３ドメインを、Ｆｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結させてもよい。リンカーは、配列番号：１７５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。本発明の別の実施形態は、重鎖と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ ＰＡＡであってもよい。本発明の別の実施形態は、Ｆｃ領域と、ＦＮ３ドメインと、リンカーと、を含む、融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドである。リンカー及びＦＮ３ドメインを、Ｆｃ領域のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結させてもよい。リンカーは、配列番号：１７５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。本本発明の別の実施形態は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
【0020】
ＣＤ３結合アーム一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＣＤ３結合アーム（又は「ＣＤ３特異性アーム」）は、マウスモノクローナル抗体ＳＰ３４、マウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプから得られる（Ｋ．Ｒ．Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，２００８．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５，３８３２〜３８３９）。一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのＣＤ３結合アームは、表３から選択される１つのＶＨドメイン及び１つのＶＬドメインを含む。表３は、ＣＤ３特異性抗体及び抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖の一部の例の概要を提供する。
【0021】
【表3-1】
【0022】
【表3-2】
【0023】
一部の実施形態では、ＣＤ３特異性抗体及び抗原結合フラグメントは、表４の重鎖と、表４の軽鎖と、を含む。表４は、ＣＤ３特異性抗体及び抗原結合フラグメントの重鎖及び軽鎖のマトリクスの概要を提供する。
【0024】
【表4】
【0025】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において、９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において、主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（ＦｃｇＲ）に結合する。同免疫エフェクター細胞は、標的細胞の貪食又は溶解をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。
【0026】
治療抗体の多くの用途について、Ｆｃ媒介性エフェクター機能は、作用のメカニズムの一部ではない。これらのＦｃ媒介性エフェクター機能は、オフメカニズムの毒性を引き起こすことにより、有害であるおそれがあり、安全性リスクを引き起こすおそれがある。エフェクター機能を改変することは、Ｆｃ領域を遺伝子操作して、ＦｃｇＲ又は補体因子への結合性を低下させることにより達成され得る。活性化（ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩＩａ、及びＦｃｇＲＩＩＩｂ）及び阻害性（ＦｃｇＲＩＩｂ）ＦｃｇＲ又は補体の第１のコンポーネント（Ｃ１ｑ）へのＩｇＧの結合性は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメイン中に位置する残基により決まる。場合によっては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４に変異が導入されて、Ｆｃ機能を低下又はサイレンシングさせる。
【0027】
一実施形態において、抗体は、下記特性：（ａ）親Ｆｃと比較した場合、低下したエフェクター機能、（ｂ）ＦｃｇＲＩ、ＦｃｇＲＩＩａ、ＦｃｇＲＩＩｂ、ＦｃｇＲＩＩＩｂ、及び／又はＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性、（ｃ）ＦｃｇＲＩに対する低下した親和性、（ｄ）ＦｃｇＲＩＩａに対する低下した親和性、（ｅ）ＦｃｇＲＩＩｂに対する低下した親和性、（ｆ）ＦｃｇＲＩＩＩｂに対する低下した親和性、又は（ｇ）ＦｃｇＲＩＩＩａに対する低下した親和性のうち１つ又は２つ以上を有するＦｃ領域を含む。
【0028】
一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体である。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ４又はその誘導体である。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ、及びＲ４０９Ｋ置換を含む。一部の実施形態では、例えば、ＣＤ３結合アームが得られるＣＤ３特異性ＩｇＧ４抗体のＦｃ領域は、そのＦｃ領域中に、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ−ＡＡ Ｆｃである。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ−ＡＡ Ｆｃ−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ（ここで、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌは変異である）である。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＴ細胞及び／又は初代カニクイザルＴ細胞上のＣＤ３εに結合する。一部の実施形態では、多重特異性抗体のＣＤ３特異性アームが得られるＣＤ３特異性抗体又は抗原結合フラグメントは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又は初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する。
【0029】
本明細書において、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体と、を含む医薬組成物が更に提供される。
【0030】
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７２のアミノ酸配列を含む。
【0031】
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７１のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む。
【0032】
一部の実施形態では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含み、軽鎖は、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインは、配列番号：１７３のアミノ酸配列を含む。
【0033】
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの使用方法記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの使用方法もまた開示する。例えば、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、それを必要とする対象における、ＰＳＭＡ過剰発現疾患の治療に有用であり得る。一部の実施形態では、疾患は、がん、好ましくは、ＰＳＭＡ過剰発現がんである。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ過剰発現疾患は、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）であり、また、一部の前立腺細胞が異常に見え始めたり異常にふるまい始めたりする状態である。一部の実施形態では、がんは、原発性及び転移性の前立腺がん、並びに、その他固体腫瘍（例えば、乳がん、肺がん、膀胱がん、腎がん）である。一部の実施形態では、がんは、前立腺がん、結腸直腸がん、胃がん、腎明細胞がん、膀胱がん、肺がん、子宮内膜がん、又は腎がんである。一部の実施形態では、ＰＳＭＡ過剰発現がんは、がん、例えば、口腔扁平上皮がん、神経膠腫、及び乳がんの血管新生又は脈管系に関係している。
【0034】
一部の実施形態では、がんは、血管新生疾患、例えば、固体腫瘍の増殖を特徴とするがんである。ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とし、本発明による治療の対象となる、腫瘍の血管新生を伴う例示的ながんとしては、例えば、腎明細胞がん（ＣＣＲＣＣ）、結腸直腸がん、乳がん、膀胱がん、肺がん、及び膵がんが挙げられる（例えば、Ｂａｃｃａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｕｒｏｌｏｇｙ ７０：３８５．３９０，２００７（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＳＭＡ ｉｎ ＣＣＲＣＣ）、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３６２９〜３６３４，１９９７（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＳＭＡ ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ ｎｏｎ−ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｒｅｎａｌ，ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ，ｌｕｎｇ，ｃｏｌｏｎ，ｂｒｅａｓｔ，ａｎｄ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎａｏｍａ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ）、及びＭｉｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：５４０〜５４７，２００７を参照のこと）。
【0035】
それを必要とする対象においてＰＳＭＡ過剰発現疾患を治療する記載する方法は、治療的に有効な量の、記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、当該対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態では、治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、それを必要とする患者に、がんを治療するのに十分な時間投与することにより、ＰＳＭＡ過剰発現がんを有する対象を治療するための方法を提供する。
【0036】
本明細書では、治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを投与し、がん細胞の成長又は増殖を阻害することにより、がん細胞の成長又は増殖を阻害するための方法を更に提供する。
【0037】
また本明細書では、治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを投与し、Ｔ細胞をがんへと再指向させることにより、Ｔ細胞をＰＳＭＡ発現がん細胞へと再指向させる方法を提供する。
【0038】
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのキット本明細書では、開示するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント又はその二重特異性抗原結合フラグメントを含むキットについて記載する。記載するキットを使用して、本明細書で提供するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に周知のその他方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載するキットは、本明細書に記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント、及びＰＳＭＡ発現がんの治療に用いる試薬を含んでいてもよい。そのため、記載するキットは、本明細書に記載するＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント、使用しない際にＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを収容するための容器、及び／又は、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの取扱説明書のうち１つ又は２つ以上を含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】静注後の雄ＮＳＧマウスにおける、非標的８９Ｚｒ標識ＦＮ３ドメインの体内分布を示す図である。
【図2A】カニクイザルＰＳＭＡ二量体と複合体を形成し、ＰＳＭＡ活性部位に近い領域に結合するＨ１０を示す、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０ ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメイン（Ｈ１０）の全体的な結晶構造を示す図である。亜鉛原子（Ｚｎ）は、ＰＳＭＡ活性部位の位置を示している。ＰＳＭＡ分子及びＨ１０分子のＮ末端及びＣ末端は、複合体の１つを示している。細胞膜に近い位置を示している。
【図2B】カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成するＨ１０ ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す図である。Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン内のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧβストランドを示す。正に荷電したＰＳＭＡ活性部位の入口へと挿入された、Ｈ１０のＣＤループ内の負に荷電した残基（残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３）を示す。Ｈ１０残基の番号付けは、配列番号：４１に従う。
【図2C】カニクイザルＰＳＭＡと複合体を形成するＨ１０ ＦＮ３ドメインの結晶構造を示す図である。Ｈ１０接触残基Ｗ３８、Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３を図内に示す。Ｈ１０（Ｒ５１１、Ｋ５１４及びＫ５４５）と接触するか、亜鉛原子（Ｈ３７７、Ｄ３８７、Ｅ４２４、Ｅ４２５、Ｄ４５３及びＨ５５３）と配位結合するか、あるいは、活性部位のくぼみ（Ｒ５３６及びＲ５３４）を構成する、ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ（カニクイザルＰＳＭＡ）残基の一部を示す。Ｈ１０ βストランドＣ、Ｄ、Ｆ及びＧを図内に表示する。Ｈ１０残基及びカニクイザルＰＳＭＡ残基の番号付けはそれぞれ、配列番号：４１及び１４１に従う。
【図3A】Ｈ１０ ＦＮ３ドメインとカニクイザルＰＳＭＡとの間の結合部位を示す結晶構造の拡大図である。Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン接触残基Ａ３２、Ｗ３６、Ｗ３８−Ｄ４１、Ｅ４３、Ａ４４、Ｖ４６、Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０、Ａ７２、Ｗ７９、Ｆ８１、Ｐ８２、Ａ８５、及びＩ８６を示す。ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ接触残基Ｙ４６０、Ｋ４９９−Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０、Ｗ５４１、Ｋ５４５、Ｆ５４６、Ｆ４８８、Ｋ６１０、Ｎ６１３及びＩ６１４を示す。Ｈ１０残基及びカニクイザルＰＳＭＡ残基の番号付けはそれぞれ、配列番号：４１及び１４１に従う。
【図3B】Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン接触残基とカニクイザルＰＳＭＡ接触残基との間の相互作用マップを示す図である。４Åのカットオフ距離を用いて、接触残基を定義した。ＦＮ３ドメイン残基及びｃｙｎｏ ＰＳＭＡ残基をそれぞれ、グレーのボックス及び白色のボックスで示し、ファンデルワールス相互作用は破線で示し、水素結合は実線であり、矢印は骨格水素結合を示し、かつ骨格原子を指している。残基の番号付けは、配列番号：４１（Ｈ１０）及び配列番号：１４１（ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ）に従う。
【図4A】ヒト（ｈ）ＰＳＭＡ細胞外ドメインとカニクイザル（ｃ）ＰＳＭＡ細胞外ドメインとの間のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。Ｈ１０接触残基には、下線及び太字を施してある。ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとの間で異なる残基には、陰を付けてある。Ｈ１０と相互作用する全てのｃｙｎｏ ＰＳＭＡ残基（Ｎ６１３を除く）は、ヒトＰＳＭＡに保存されている。ヒトＰＳＭＡ ＥＣＤ：配列番号：１４３。ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ ＥＣＤ：配列番号：３２。
【図4B】カニクイザルＰＳＭＡと接触するＨ１０ ＦＮ３ドメイン残基を示す図である。接触残基には、下線及び太字を施してある。Ｈ１０アミノ酸配列を、配列番号：４１に示す。
【図5】Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン残基Ｎ６、Ｒ１１、Ｔ２２、Ｄ２５、Ａ２６、Ｓ５２、Ｅ５３及びＫ６２、並びにＮ末端及びＣ末端の位置を示す図である。これらは、カニクイザルＰＳＭＡに結合したＨ１０の結晶構造中における、化学的コンジュゲートが生じ得る部位である。ＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ接触領域を、黒で示す。Ｈ１０ βストランドＣ、Ｄ、Ｆ及びＧを図内に表示する。残基の番号付けは、配列番号：４１（Ｈ１０）に従う。
【図6】抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメイン（黒）及び抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥ（白）で染色した異なる腫瘍細胞株における、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比較を示す図である。
【図7A】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン−ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン−ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＬＮＣａＰ細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。
【図7B】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン−ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン−ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。２２Ｒｖ１細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。
【図7C】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン−ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン−ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＰＣ３細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。
【図7D】ＤＡＰＩ、抗サイトケラチン−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４５−ＡＰＣ及び抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン−ＰＥで染色した異なる腫瘍細胞における、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩによる一連のブラウザ画像を示す図である。サムネイル画像は、右から左に、ＰＳＭＡ−ＰＥ染色、ＣＤ４５−ＡＰＣシグナル、ＤＡＰＩ染色核、サイトケラチン−ＦＩＴＣ反応性、及び最後に、サイトケラチン−ＦＩＴＣとＤＡＰＩ染色との重ね合わせを示す。細胞は核を有し、サイトケラチンを発現し、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）とみなされるＣＤ４５に対して陰性でなければならない。ＣＴＣは、ＰＳＭＡに対する陽性シグナルを有し、ＰＳＭＡ陽性ＣＴＣとなるようにカウントされなければならない。ＳＫＢＲ３細胞におけるＰＳＭＡの発現を示す図である。
【図8】連番を振ってあるＳＰ３４のアミノ酸配列を示す図である。ＡｂＭ定義におけるＣＤＲには下線を引いている。Ｓｅｒ２３０は、パパイン開裂Ｆａｂに存在する最後のＨＣ残基である。残基２３１〜４５５は、ＩＧＨＧ３＿マウス（マウスＩｇＧ３、アイソフォーム２）からのものである。
【図9】図示したＶＬ／ＶＨ界面における重要な残基を有するＳＰ３４の可変ドメインを示す図である。（標識された）ＶＬ中の残基３８、４８、及び５１は、ＣＤＲ−Ｈ３と接触している。
【図10】ＶＨ（配列番号：２３３及び１８４〜１８７、それぞれ表示順）及びＶＬ（配列番号：２３４及び１８８〜１９０、それぞれ表示順）についての、ヒトフレームワーク適合（「ＨＦＡ」）変異体を示す図である。ナンバリングは、連番であり、ＡｂＭ定義におけるＣＤＲに下線を引いていて、ＳＰ３４とは異なる残基は太字で強調され、ＨＦＡ変異体における逆突然変異は、太字にし、下線を引いている。
【図11】ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体の初代ヒトＴ細胞への結合性を示す図である。
【図12】ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体の初代カニクイザルＴ細胞への結合性を示す図である。
【図13】ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体がインビトロにおいて初代ヒトＴ細胞を活性化することを示す図である。ネガティブコントロールを、白色で示し、ポジティブコントロールを、黒色で示す。
【図14】ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体がインビトロにおいて初代カニクイザルＴ細胞を活性化することを示す図である。ネガティブコントロールを、白色で示し、ポジティブコントロールを、黒色で示す。
【図15】ＳＰ３４ ＨＦＡ変異体による結合性と活性化との相関を示す図である。ヒト（図１５Ａ）及びカニクイザル（図１５Ｂ）についての、平均結合性の値及びＣＤ６９の平均蛍光強度（「ＭＦＩ」）の値を互いに対してプロットした。
【図16】ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子構築物の設計を示す図である。
【図17】ＰＳＭＡ＋ＬＮＣＡＰ細胞の、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子における、Ｔ細胞媒介性細胞傷害アッセイの結果を示す図である。
【図18】ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスのＢ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎを用いて治療した、ＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ異種移植片の腫瘍化抑制を示す図である。ＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ細胞を有するＰＢＭＣヒト化マウスに対して、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇでＢ２１９×ＣＷ６の静脈投与を行った（投与を矢印で示す）。週に２度皮下腫瘍を測定し、それぞれの群における平均腫瘍容積として提示された結果を、ｍｍ３±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【図19】Ｂ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎを用いて治療した、ＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ異種移植片を有するＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスの体重を示す図である。ＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ細胞を有するＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスに対して、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇでＢ２１９×ＣＷ６の静脈投与を行った（投与を矢印で示す）。群の平均として提示された体重を、ｇ±標準誤差（ＳＥＭ）で表した。
【発明を実施するための形態】
【0040】
定義本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【0041】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどを含む。
【0042】
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わす全ての数字は、「約」という用語により、全ての事例において修飾されていると理解されたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得られるのが求められる所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【0043】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例中で説明された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差を必然的に生じる、一定の誤差を本質的に含有する。
【0044】
「単離された」は、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」されている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用されるとき、「単離された」ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントとは、異なる抗原特異性を有する、その他のＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを実質的に含まない、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントについて言及することを意味している。
【0045】
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含む。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【0046】
「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。天然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存在するために、幾らかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるであろう。ただし、固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）にはほとんど影響しないか、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４，１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４〜４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【0047】
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味する。
【0048】
「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメントを操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド又はウイルスのことである。
【0049】
「クローン」は、有糸分裂により、単一の細胞又は共通する祖先から得られる細胞集団である。「細胞株」は、多くの世代の間、インビトロにおいて安定して増殖させることができる初代細胞のクローンである。本明細書で提供された一部の例では、細胞は、細胞をＤＮＡでトランスフェクションすることにより、形質転換される。
【0050】
「発現する」及び「生成する」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全ての天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよい。
【0051】
「治療すること」又は「治療」という用語は、損傷、病態、又は病状の減弱又は改善における、何らかの成功又は成功の兆候を指し、これには、症状の寛解、緩解、減少、病状を患者にとってより許容できるものにすること、変性又は減退速度を遅くすること、変性による最終的な衰弱を和らげること、患者の肉体的又は精神的健康を改善すること、あるいは生存期間の長さを延ばすことなどの、何らかの客観的又は主観的パラメータを含む。治療は、客観的又は主観的なパラメータにより評価されてもよい。同パラメータには、身体的検査、神経学的検査、又は精神医学評価の結果が挙げられる。
【0052】
「有効量」又は「治療的に有効な量」は、必要とされる用量及び期間において、所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。治療的に有効な量のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、個々の病態、年齢、性別及び体重などの因子、及び個々における望む応答を引き出す抗体の能力に従って種々であってよい。治療的に有効な量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害作用より、治療的に有益な作用が上回る量でもある。
【0053】
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を意味し、種々の単量体、多量体、及びキメラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される。
【0054】
抗原結合フラグメントは、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る、任意のタンパク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペプチド合成、及び組換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはＣＤＲと他のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しくは二量体、軽鎖単量体若しくは二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になりドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３ Ｎｏｖ．；２１（１１）：４８４〜９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４〜５４６（１９８９））、ラクダ若しくはナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５ Ｊａｎ．；５（１）：１１１〜２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非抗体タンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、所与の抗原結合フラグメントがこの表現において言及された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメントを組み込むことを示すのに使用されてもよい。２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において本明細書で使用される場合、「〜と競合する」又は「〜と交差競合する」という用語は、２つ以上の抗体又は抗原結合フラグメントが結合において競合することを示す。抗体又は抗原結合フラグメントのいくつかのペアについて、一方の抗体がプレート上にコートされ、他方が競合させるために使用される場合、また、その逆の場合、実施例のアッセイにおいて競合又はブロックのみが観察される。文脈において別段に定義されるか、又は否定されない限り、本明細書で使用されるとき、「〜と競合する」又は「〜と交差競合する」という用語は、抗体又は抗原結合フラグメントのこのようなペアに及ぶことも意図している。
【0055】
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能なタンパク質決定因子を意味する。エピトープは、通常、分子の表面グルーピング、例えば、アミノ酸又は糖側鎖からなり、通常、特定の三次元構造特性並びに特定の荷電特性を有する。構造的及び非構造的エピトープは、後者ではなく前者に対する結合が、変性溶媒の存在下で損失するという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的にブロックされるか、又は覆われるアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基が、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内にある）とを含んでもよい。
【0056】
抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「免疫特異的な結合」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子に優先的に結合することなく、対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約１×１０−８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する。「［抗原］特異性」抗体（例えば、ＣＤ３特異性抗体）等の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
【0057】
本明細書で使用される用語「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び原核細胞酵素を含むタンパク質においてしばしば存在するドメインを意味する（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）。例示的なＦＮ３ドメインは、ヒトテネイシンＣに存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）に存在する異なる１５個のＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許第８，２７８，４１９号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインである。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質の名称で呼ばれ、例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）と呼ばれる。
【0058】
本明細書で使用されるとき、「センチリン（Centyrin）」は、ヒトテネイシンＣに存在する異なる１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づくＦＮ３ドメインを意味する。
【0059】
本明細書で使用される用語「置換する」、又は「置換した」、又は「変異する」、又は「変異した」は、その配列の変異体を生成するために、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列に１つ又は２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変化させること、欠失させること、又は挿入することを指す。
【0060】
本明細書で使用される用語「無作為化する」、又は「無作為化した」、又は「多様化した」、又は「多様化する」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を作製することを指す。
【0061】
本明細書で使用する場合、「変種」は、１つ又は２つ以上の修飾、例えば、置換、挿入、又は欠失によって、基準ポリペプチド又は基準ポリヌクレオチドとは異なる、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
【0062】
本明細書で使用される用語「特異的に結合する」又は「特異的結合」は、約１×１０−６Ｍ若しくはそれより低い、例えば約１×１０−７Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０−８Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０−９Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０−１０Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０−１１Ｍ若しくはそれより低い、約１×１０−１２Ｍ若しくはそれより低い、又は約１×１０−１３Ｍ若しくはそれより低い解離定数（ＫＤ）で、本発明のＦＮ３ドメインが既定の抗原に結合する能力を指す。典型的に、本発明のＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いる表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ又はカゼイン）に対するそのＫＤより少なくとも１０倍低いＫＤで既定の抗原（すなわち、ヒトＰＳＭＡ）に結合する。しかしながら、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合する本発明の単離されたＦＮ３ドメインは、他の関連抗原、例えば、他の種由来の同じ既定の抗原（ホモログ）、例えば、Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）又はＰａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）に対して交差反応性を有し得る。
【0063】
用語「ライブラリ」は、変種のコレクションを指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌクレオチド変種で構成され得る。
【0064】
本明細書で使用される用語「安定性」は、例えばヒトＰＳＭＡなどの既定の抗原に対する結合などの、その正常な機能活性のうちの少なくとも１つを保持するように、生理学的条件下で分子が折り畳み状態を維持できること指す。
【0065】
本明細書で使用されるとき、ヒトＰＳＭＡは、短い細胞内ドメイン（１〜１８残基）、膜貫通ドメイン（１９〜４３残基）、及び細胞外ドメイン（４４〜７５０残基）を有する約１００ｋＤの周知のＩＩ型糖タンパク質を指す。成熟ヒトＰＳＭＡのアミノ酸配列は、配列番号：１４４に示される。
【0066】
本明細書で互換的に使用される「過剰発現する」、「過剰発現された」、及び「過剰発現している」は、同じ組織タイプの正常細胞と比較して表面上に測定可能な高レベルのＰＳＭＡを有するがん細胞又は悪性細胞を指す。そのような過剰発現は、遺伝子増幅、又は転写若しくは翻訳の増加によって、引き起こされ得る。ＰＳＭＡ過剰発現は、周知のアッセイを用いて、例えば生存細胞又は溶解細胞におけるＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー、又はラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。あるいは又は加えて、ＰＳＭＡ核酸分子のレベルは、例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、又はＰＣＲ技術を用いて細胞中で測定され得る。ＰＳＭＡは、正常細胞と比較して、細胞表面上のＰＳＭＡのレベルが少なくとも１．５倍高いとき、過剰発現されている。
【0067】
本明細書で使用される「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号：１に示され、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記述される配列を有する合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。
【0068】
本明細書で使用される「がん細胞」又は「腫瘍細胞」は、インビボ、エクスビボ、及び組織培養のいずれかにおいて、新しい遺伝材料の取り込みを必ずしも伴わない自発的又は人為的な表現型の変化を有するがん様、前がん様、又は形質転換細胞を指す。形質転換は、形質転換ウイルスの感染及び新たなゲノム核酸の取り込み、又は外因性の核酸の取り込みにより発生し得るが、自然に又は発がん物質に対する暴露後にも発生して、それによって内因性の遺伝子を変異させ得る。形質転換／がんは、例えば、インビトロ、インビボ、及びエクスビボにおける、形態学的変化、細胞の不死化、異常な増殖制御、病巣の形成、増殖、悪性度、腫瘍特異的マーカーレベル、浸潤性、ヌードマウスなどの適した動物宿主における腫瘍の増殖又は抑制等によって例示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（３ｒｄ ｅｄ．１９９４））。
【0069】
「増殖を阻害する」（例えば、腫瘍細胞などの細胞に言及する場合）は、当業者に周知の適切な対照条件で増殖された同一の細胞の増殖と比較して、治療薬又は治療薬若しくは薬剤の組み合わせと接触されるときのインビトロ又はインビボでの細胞増殖における測定可能な減少を指す。インビトロ又はインビボでの細胞の増殖の阻害は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、又は１００％であり得る。細胞増殖の阻害は、種々の機構、例えば、アポトーシス、壊死、細胞増殖の阻害、又は細胞溶解により生じ得る。
【0070】
用語「ベクター」は、生物系の内部で複製され得る、又はこうした系の間を移動することができるポリヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。そのような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターの複製を可能にする生物学的要素を利用して再構成された生物系が挙げられる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であってもよい。
【0071】
用語「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指示するために、生物系又は再構成生物系において利用することができるベクターを意味する。
【0072】
用語「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されてポリペプチドを生成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を意味する。約５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。
【0073】
本明細書で使用される「価数」は、分子中の抗原に対して特異的な結合部位が明記された数存在することを指す。そのため、用語「１価」、「２価」、「４価」、及び「６価」はそれぞれ、抗原に対して特異的な結合部位が分子中に１個、２個、４個、及び６個存在することを指す。
【0074】
本明細書で使用する場合、「〜と組み合わせて」という用語は、２つ又は３つ以上の治療薬が、対象に混合物の状態で一緒に、それぞれ単独の薬剤として同時に、又はそれぞれ単独の薬剤として任意の順番で順次に投与できることを意味する。
【0075】
「相乗」、「相乗作用」又は「相乗的な」は、組み合わせることで得られると予想される相加効果を超えることを意味する。
【0076】
本明細書で使用されるとき、「ｋｄ」（秒−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味する。値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
【0077】
本明細書で使用されるとき、「ｋａ」（Ｍ−１秒−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を意味する。
【0078】
本明細書で使用されるとき、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。
【0079】
本明細書で使用されるとき、「ＫＡ」（Ｍ−１）という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合平衡定数を意味し、ｋａをｋｄで割ることにより得られる。
【0080】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態において、対象はヒトである。
【0081】
本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から単離された、類似する流体、細胞、又は組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）の収集物、並びに対象内に存在する流体、細胞、又は組織を意味する。一部の実施形態では、サンプルは、体液である。体液は、典型的には、生理学的温度において液体であり、対象又は生物学的ソース中に存在し、これらから採取され、これらから外に出され、又は他の方法で抽出された自然発生する流体を含んでもよい。特定の組織、臓器、又は局所的な領域から得られた特定の体液及び特定の他の体液は、対象又は生物学的ソースにおいて、より全体的に又は全身的に適していてもよい。体液の例には、血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ、尿、唾液、嚢胞液、涙、糞、痰、分泌組織及び臓器の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水液、例えば、非固体腫瘍に関連するもの、肋膜、心膜、腹膜、腹部及び他の体腔の流体、気管支洗浄により収集された流体等が挙げられる。体液はまた、対象又は生物学的ソースと接触した溶液、例えば、細胞又は臓器順化培地を含む細胞及び臓器培養培地、洗浄液等を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「サンプル」という用語は、対象から取り出された材料又は対象中に存在する材料を包含する。
【0082】
「ＣＤ３」という用語は、ヒトＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体を意味する。ＣＤ３タンパク質マルチサブユニット複合体は、６つの区別できるポリペプチド鎖から構成される。これらは、ＣＤ３γ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０９６９３）、ＣＤ３δ鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０４２３４）、２つのＣＤ３ε鎖（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ０７７６６）、及び１つのＣＤ３ζ鎖ホモ二量体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ２０９６３）を含み、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖と会合する。「ＣＤ３」という用語は、特に断らない限り、細胞（Ｔ細胞を含む）により本来発現されているか、又はそれらのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞上に発現され得る任意のＣＤ３変異体、アイソフォーム、及び種間ホモログを含む。
【0083】
「ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメント」は、多重特異性分子であり、任意選択的に、ＦＮ３ドメインと、軽鎖（ＬＣ）と、重鎖（ＨＣ）と、を含む、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原であって、ＦＮ３ドメインは、ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する第１の抗原結合部位を形成し、ＨＣとＬＣとの対は、ＣＤ３に免疫特異的に結合する第２の抗原結合部位を形成する、ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。
【0084】
ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、２つの異なる抗原結合領域を含み、一方の抗原結合領域は、抗原ＰＭＳＡに特異的に結合し、もう一方の抗原結合領域は、ＣＤ３に特異的に結合する。多重特異性抗体は、二重特異性抗体、ディアボディ、又は類似する分子であり得る（ディアボディの説明については、例えば、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０（１４），６４４４〜８（１９９３）を参照のこと）。
【0085】
「参照サンプル」は、別のサンプル、例えば、試験サンプルに対して比較され、比較されたサンプルの特徴を決定することができるサンプルである。参照サンプルは、試験サンプルとの比較の基礎として機能する、いくつかの特徴付けられた特性を有するであろう。例えば、参照サンプルは、がんを有する対象を示すＰＳＭＡレベルについてのベンチマークとして使用することができる。参照サンプルは、試験サンプルと平行して解析されることを必ずしも必要としない。このため、一部の例では、参照サンプルは、所与の条件を特徴付けるために予め決定された数値又は範囲、例えば、対象中のがんを示すＰＳＭＡレベルでもよい。この用語はまた、生理学的状態又は病態、例えば、ＰＳＭＡ発現がんに関連することが周知であるが、未知量のＰＳＭＡを有する、比較目的で使用されるサンプルを含む。
【0086】
ＰＳＭＡ発現がんの進行の文脈において使用されるとき、「進行」という用語は、より重篤でない状態からより重篤な状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の増大を含むことができる。例えば、「結腸がんの進行」には、このようながんの、より重篤でない状態からより重篤な状態への進行、例えば、ステージＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩＩＩへ等の進行が挙げられる。
【0087】
ＰＳＭＡ発現がんの退行の文脈において使用されるとき、「退行」という用語は、より重篤な状態からより重篤でない状態へのがんの変化を含む。これは、腫瘍の数又は重症度、転移の程度、がんが成長又は増殖する速度等の低下を含むことができると考えられる。例えば、「結腸がんの退行」には、このようながんの、より重篤な状態からより重篤でない状態への退行、例えば、ステージＩＩＩからステージＩＩへ、ステージＩＩからステージＩへ等の進行が挙げられる。
【0088】
安定したＰＳＭＡ発現がんの文脈において使用されるとき、「安定した」という用語は、進行性がん又は退行性がんであるとみなすのに臨床的意義のある期間にわたり有意に十分に変化しない、又は変化していなかった病態を説明することを意図している。
【0089】
本明細書に記載された実施形態は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、又は生物系に限定されるものではなく、当然、変動し得る。
【0090】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ又はその誘導体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のアイソタイプである。抗体がＩｇＧ１アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＫ４０９Ｒ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。抗体がＩｇＧ４アイソタイプを有する一部の実施形態では、抗体は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ置換を、そのＦｃ領域中に含有する。
【0091】
組換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0092】
ＰＳＭＡ結合分子本発明のＦＮ３ドメインは、当業者によって実践される表面プラズモン共鳴又はＫｉｎｅｘａ法によって決定する場合、約１×１０−７Ｍより低い、例えば約１×１０−８Ｍより低い、約１×１０−９Ｍより低い、約１×１０−１０Ｍより低い、約１×１０−１１Ｍより低い、約１×１０−１２Ｍより低い、又は約１×１０−１３Ｍより低い解離定数（ＫＤ）で、ヒトＰＳＭＡ、カニクイザルＰＳＭＡ、及び／又はチンパンジーＰＳＭＡに結合可能である。特定のＦＮ３ドメイン−抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる条件（例えば、モル浸透圧濃度、ｐＨ）下で測定すれば、異なり得る。したがって、親和性及び他の抗原結合パラメータ（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、標準化されたタンパク質スキャフォールド及び抗原溶液、並びに本明細書に記載する緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。
【0093】
本発明の別の実施形態では、ＦＮ３ドメインはヒトＰＳＭＡに特異的に結合し、当該ＦＮ３ドメインはヒトＰＳＭＡの酵素活性を阻害する。ＰＳＭＡの酵素活性は、標準的な方法を用いて測定することができる。例えば、ＰＳＭＡの検出可能な又は標識されたＰＳＭＡ基質を加水分解することを利用してもよい。使用可能な例示的なＰＳＭＡ基質は、Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）、葉酸ポリグルタミン酸、メトトレキサートトリ−γグルタミン酸、メトトレキサートジ−γグルタミン酸、プテロイルペンタグルタミン酸及びこれらの誘導体である。
【0094】
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と少なくとも８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0095】
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のアミノ酸配列と比較すると、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１カ所の置換を有するアミノ酸配列を含む。
【0096】
本明細書に記載する本発明の一部の実施形態では、ヒトＰＳＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、配列番号：１の残基位置６、１１、２２、２５、２６、５２、５３、６１に対応する少なくとも１つの残基位置において、又はＣ末端において、システイン残基を含む。
【0097】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号：４１のＦＮ３ドメインを有するヒトＰＳＭＡへの結合に特異的に競合する。
【0098】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメインは、ヒトＰＳＭＡの領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に特異的に結合する。
【0099】
本発明のＦＮ３ドメインが結合したヒトＰＳＭＡエピトープは、配列番号：１５９又は配列番号：１６０に示すアミノ配列中の残基の一部又は全てを含む。本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインが結合したエピトープは、ヒトＰＳＭＡ（配列番号：１４４）の領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）及びＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に少なくとも１つのアミノ酸を含む。本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインが結合したエピトープは、ヒトＰＳＭＡ（配列番号：１４４）の領域ＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ（配列番号：１５９）に少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つのアミノ酸を含み、またヒトＰＳＭＡ（配列番号：１４４）の領域ＮＷＥＴＮＫＦ（配列番号：１６０）に少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのアミノ酸を含む。
【0100】
本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、残基Ｋ４９９、Ｋ５００、Ｓ５０１、Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０、Ｗ５４１、Ｅ５４２、Ｎ５４４、Ｋ５４５及びＦ５４６（残基の番号付けは、配列番号：１４４に従う）においてヒトＰＳＭＡと結合する。
【0101】
本明細書で開示する一部の実施形態において、本発明のＦＮ３ドメインは、残基Ｒ１８１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ６１０及び／又はＩ６１４においてヒトＰＳＭＡと更に結合する。
【0102】
ｃｙｎｏ ＰＳＭＡと複合体を形成するＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０の結晶構造を解析した。ヒトＰＳＭＡとｃｙｎｏ ＰＳＭＡとの間の接触残基が１つの残基を除いて同一であるため、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０がｃｙｎｏ ＰＳＭＡと結合する同一エピトープ残基において、Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０がヒトＰＳＭＡと結合することが予想される。
【0103】
治療方法本明細書に記載の、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを投与する対象としては、ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする特定の疾患を発症するリスクの高い患者に加え、このような疾患を既に発症している患者が挙げられる。一般的に、対象は、治療が求められる疾患を有すると診断されている。更に、対象に対し、治療期間中、疾患のあらゆる変化（例えば、疾患の臨床症状における上昇及び低下）をモニターすることができる。
【0104】
特定の疾患を発症しやすい、あるいは発症するリスクの高い患者に、予防薬用途として、医薬組成物又は薬物を、当該疾患の発症リスクを排除又は抑制するのに、あるいは当該疾患の発症を遅らせるのに十分な量で投与する。治療用途において、かかる疾患が疑われるか又は既に罹患している患者に、組成物又は薬物を、疾患の症状及びその合併症を治療、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与する。これを達成する適切な量は、治療有効投与量又は治療有効量と呼ばれている。予防薬と治療の両方式において、薬剤は通常、十分な応答（例えば、不適切な血管新生活性の阻害）が達成されるまで数回の用量で投与される。一般的に、応答はモニターされ、所望の応答が減退し始めた場合に反復投与が行われる。
【0105】
本発明の方法による治療を行う対象患者を同定するために、一般に認められているスクリーニング法を用いて、特定の疾患と関連するリスク因子を明らかにしてもよく、あるいは対象において同定済みの既に発症している疾患の状態を測定してもよい。このような方法としては、例えば、個人に、特定の疾患と診断された親類がいるかどうかを確認することを挙げることができる。スクリーニング法としてはまた、例えば、遺伝要素を有することが周知な特定の疾患について家族構成を確認するための、通常の精密検査を挙げることができる。例えば、種々のがんはまた、特定の遺伝要素を有していると知られている。がんの遺伝要素としては、例えば、変化する複数の遺伝子（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ及びその他）における変異、特定のＨＬＡ及びキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲ）分子の有無、あるいは、がん細胞が、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの細胞の免疫抑制を直接的又は間接的のいずれかで調節可能な機構が挙げられる（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３２９〜３３９，２００７；Ｂｏｙｔｏｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１〜８，２００７を参照のこと）。この目的のため、慣例的にヌクレオチドプローブを用い、目的とする特定の疾患に関連する遺伝マーカーを有する個人を特定することができる。更に、特定の疾患におけるマーカーを同定するのに有用な、多種多様な免疫学的方法が、当技術分野において周知である。例えば、モノクローナル抗体プローブを用いて特定の腫瘍に関連する抗原を検出する種々のＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が利用可能であり、かつ当該技術分野において周知である。既知の患者の総合的症状、年齢因子、関連リスク因子などを指定することにより、スクリーニングを行うことができる。これらの方法により、医師は慣例的に、治療のための本明細書記載の方法を必要とする患者を選別することができる。これら方法に従い、独立した治療プログラム、経過観察、補助治療、又はその他治療と協調した治療レジメンとして、標的病理学的なＰＳＭＡ発現細胞を構築することができる。
【0106】
本明細書に記載する一部の方法では、第２の治療法と組み合わせて、本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを用い、前立腺がんを有する対象を治療することができる。
【0107】
本明細書に記載する一部の方法では、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを用い、第２の治療法を用いた治療に対して耐性を有する又は耐性を獲得した対象を治療することができる。
【0108】
第２の治療法は、前立腺がんの治療に用いる承認薬であってもよく、それは例えば、アビラテロンアセテート（ザイティガ）、ビカルタミド、カバジタキセル、カソデックス（ビカルタミド）、デガレリクス、ドセタキセル、エンザルタミド、ゴセレリンアセテート、ジェブタナ（カバジタキセル）、ロイプロリドアセテート、リュープロン（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−３ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−４ヵ月（ロイプロリドアセテート）、リュープロンデポ−ペッド（ロイプロリドアセテート）、ミトキサントロン塩酸塩、プレドニゾン、プロベンジ（シプリューセル−Ｔ）、二塩化ラジウム２２３、シプリューセル−Ｔ、タキソテール（ドセタキセル）、Ｖｉａｄｕｒ（ロイプロリドアセテート）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、又はゾラデックス（ゴセレリンアセテート）である（出典：国立がん研究所）。
【0109】
種々の質的及び／又は量的な方法を用いて、対象が、治療に対して耐性を有しているか、耐性を発症しているか、又は耐性を発症しやすいかを判定することができる。耐性に関連し得る症状としては、例えば、患者の健康状態の低下若しくはプラトー状態、腫瘍サイズの増加、腫瘍の増殖低減の停止若しくは増殖低減の緩徐化、及び／又は、１つの部位から他の臓器、組織若しくは細胞への体内のがん性細胞の拡がりが挙げられる。がんに関連する種々の症状の回復又は悪化はまた、対象が、食欲不振、認知機能不全、うつ病、呼吸困難、疲労、ホルモン障害、好中球減少症、痛み、末梢神経障害、及び性的機能不全などの治療に対して耐性を発症しているか又は耐性を発症しやすいか、が指標となり得る。がんに関連する症状は、がんの種類に応じて様々であり得る。例えば、前立腺がんに関連する症状としては、排尿障害又は頻繁な切迫尿意、痛みを伴う排尿、血尿又は血精液、並びに、骨盤、背中及び／又は臀部の苦しい痛み、を挙げてもよい。肺がんに関連する症状としては、持続性のせき、喀血、息切れ、喘鳴胸痛、食欲不振、意図しない体重低下、及び疲労を挙げてもよい。腫瘍学に精通する当業者は、特定のがんのタイプに関連する症状を容易に識別することができる。
【0110】
投与／医薬組成物本発明は、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントの医薬組成物、及び医薬的に許容される担体を提供する。治療的使用として、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、医薬的に許容される担体内の活性成分として、有効量のドメイン又は分子を含有する医薬組成物として調製することができる。用語「担体」は、活性化合物と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのようなビヒクルは、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む、水及び油などの液体であってよい。例えば、０．４％生理食塩水及び０．３％グリシンを用いることができる。これらの溶液は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる製薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調整剤及び緩衝剤、安定化剤、増粘剤、滑剤及び着色剤等を含むことができる。そのような医薬製剤中の本発明の分子濃度は幅広く変化してよく、すなわち約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％から最大で１５又は２０重量％まで変化してもよく、また、選択される特定の投与様式に従って、主として必要とされる用量、液体の体積、粘度等に基づいて選択される。好適なビヒクル及び製剤（他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔｒｏｙ，Ｄ．Ｂ．ｅｄ．，Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ ２００６，Ｐａｒｔ ５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｐ ６９１〜１０９２に記載され、特にｐｐ．９５８〜９８９を参照されたい。
【0111】
したがって、本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントの治療的使用における投与方法は、非経口投与、例えば、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内若しくは皮下、肺、又は経粘膜（口内、鼻腔内、膣内、直腸）で、錠剤、カプセル剤、水剤、散剤、ゲル剤、粒剤状の製剤を用いて、また注射器、移植したデバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプ内に収容させて、又は当該技術分野において周知の、当業者が理解する他の手段など、薬剤を宿主に送達する任意の好適な経路であってよい。部位特異的投与は、例えば、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、膣内、直腸、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。
【0112】
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、及び約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、又はより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの、ＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを含むように調製することができる。
【0113】
本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントは、任意の好適な経路、例えば、非経口的に静脈内（ＩＶ）注射又はボーラス注射で、筋肉内で、皮下内で、又は腹腔で、患者に投与されてもよい。ＩＶ注射は、わずか１５分間にわたり行うことができるが、多くの場合、３０分間、６０分間、９０分間、あるいは更に２時間又は３時間にわたり行われ得る。本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントはまた、疾患部位に直接注射することができる。がんを有する患者に与えられる用量は、治療する疾患を緩和又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量であり（「治療的に有効な量」）、時に、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８，９、又は１０ｍｇ／ｋｇであってもよいが、更に高くてもよく、例えば、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、５０、１００、２００、５００、又は１０００ｍｇの固定単位用量でもまた与えられてもよく、あるいは用量は、例えば、４００、３００、２５０、２００、又は１００ｍｇ／ｍ２の患者の体表面積に基づいていてもよい。がんを治療するのに通常、１回〜８回の用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）で投与されるが、１０、１２、２０又はそれ以上の用量で投与してもよい。本発明のＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントの投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヵ月、５週間、６週間、７週間、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、又はそれよりも長い期間の後に繰り返すことができる。治療過程を繰り返すことも可能であり、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であるか、又は異なる用量であってよい。
【0114】
例えば、静脈内注射用の、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントの医薬組成物は、８０ｋｇの患者に投与するために、約２００ｍＬの減菌リンガー液、及び約８ｍｇ〜約２４００ｍｇ、約４００ｍｇ〜約１６００ｍｇ、又は約４００ｍｇ〜約８００ｍｇのＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインを含むように調製され得る。非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」（１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に、より詳細に記載されている。
【0115】
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、保管用に凍結乾燥されていてもよく、また使用に先立ち適切な容器内で戻してもよい。この技術は、通常のタンパク調製物に関して有効であることが示されており、当該技術分野で公知の凍結乾燥法及び溶解技術を用いることができる。
【0116】
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、対象に１回投与してもよく、又は投与を、例えば１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、１ヵ月後、５週間後、６週間後、７週間後、２ヵ月後、又は３ヵ月後に繰り返してもよい。反復投与は、同じ用量又は異なる用量で行うことができる。投与は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれより多く繰り返してもよい。
【0117】
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを、上記で説明したように第２の治療剤と組み合わせて、同時に、連続的に又は別々に投与してもよい。
【0118】
本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、任意選択的に第２の治療剤と組み合わせて、任意の形態の放射線療法、及び任意の形態の放射線手術、及び／又は外科手術と共に投与され得るが、そのような放射線療法には、体外照射療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）が挙げられ、放射線手術には、ガンマナイフ、サイバーナイフ、Ｌｉｎａｃ、及び組織内放射線照射（例えば、放射性シードの埋め込み、ＧｌｉａＳｉｔｅバルーン）が挙げられる。
【0119】
とりわけ固体腫瘍の治療に関して、終点及び抗腫瘍活性を評価するためのプロトコルは、当該技術分野において周知である。それぞれのプロトコルは異なる腫瘍反応評価を定義し得るが、ＲＥＣＩＳＴ（固体腫瘍の効果判定基準）基準は現在、国立がん研究所が推奨する、腫瘍反応を評価するためのガイドラインであるとみなされている（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９２：２０５〜２１６，２０００を参照のこと）。ＲＥＣＩＳＴ基準によると、腫瘍反応とは、あらゆる測定可能な病巣又は転移部の縮小又は除去を意味する。疾患が、通常の手法を用いて≧２０ｍｍの、あるいは医療用撮影又はＸ線により明確に画定されたマージンを有するスパイラルＣＴスキャン、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、又は診察（病巣が表在性である場合）を用いて≧１０ｍｍの、少なくとも１つの寸法を正確に測定可能な病巣を含む場合、疾患は通常、測定可能であるとみなされている。測定不能な疾患とは、通常の手法を用いて＜２０ｍｍの、あるいはスパイラルＣＴスキャンを用いて＜１０ｍｍの病巣、及び実際に測定不能な病巣（正確に測定するには小さすぎる）を含む疾患のことを意味する。測定不能な疾患としては、胸水、腹水、及び間接証拠により文書化された疾患が挙げられる。
【0120】
客観的な状態の基準は、固体腫瘍の反応を評価するプロトコルに必要とされる。代表的な基準としては、以下の基準が挙げられる。（１）完全寛解（ＣＲ）：あらゆる測定可能な疾患部が完全に消失すること、新規病巣がないこと、疾患関連症状がないこと、及び測定不能な疾患の証拠がないことと定義される。（２）部分寛解（ＰＲ）：標的病巣の最大直径の合計が３０％減少することと定義される。（３）進行性疾患（ＰＤ）：標的病巣の最大直径の合計が２０％増加すること、又は任意の新規病巣が出現することと定義される。（４）安定又は反応なし：ＣＲ、ＰＲ又は進行性疾患にはあてはまらないことと定義される。（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと。）
【0121】
腫瘍学分野において一般に認められている別の終点としては、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）、無増悪期間（ＴＴＰ）、及び無増悪生存期間（ＰＦＳ）が挙げられる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｐｐｒｏｖａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ａｐｒｉｌ ２００５，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＦＤＡ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．を参照のこと）。
【0122】
医薬組成物は、本明細書に記載の医薬組成物を含む容器を含むキットとして提供することができる。医薬組成物は、例えば、単回又は複数回分の用量の注射用液剤形態、又は注射前に戻される滅菌粉末として提供することができる。あるいは、このようなキットは、医薬組成物を投与するための、乾燥粉末分散装置、リキッドエアロゾル発生器、又は噴霧器を含むことができる。このようなキットは、医薬組成物に関する表示及び用法を記載した文書を更に含むことができる。
【0123】
一部の実施形態では、融合タンパク質の発現は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンなどのためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【0124】
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。同部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネントは、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【0125】
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ ｅｔ ａｌ．，７ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７３８〜１７４３（２０００））が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【0126】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、融合タンパク質生成細胞を作製することができる。したがって、別の態様は、融合タンパク質、例えば、本明細書で記載及び例示する融合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞を特徴とする。
【0127】
外来性遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であり、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目的で組換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝子配列を宿主細胞に適切に形質転換されるべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組換えＤＮＡウイルス、組換えＲＮＡウイルス）等が挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９ Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９〜９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
【0128】
本明細書に記載された融合タンパク質の発現に使用するのに適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞である。これらの細胞には、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において十分確立されている。
【0129】
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントの組換え発現について選択され、又はスクリーニングされてもよい。組換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより得られる。
【0130】
多重特異性の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメント好ましい、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを表２１に提示する。
【0131】
種々のフォーマットの二重特異性抗体が記載されてきており、Ｃｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｂａｔｙ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｄｅｖ １２：２７６に近年レビューされた。
【0132】
一部の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、本発明において記載されたもの等の制御されたＦａｂアーム交換により得られたディアボディ、クロスボディ、又は二重特異性抗体である。
【0133】
一部の実施形態では、二重特異性抗体には、ヘテロ二量体化する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子（この分子の２つの側面はそれぞれ少なくとも２種類の抗体のＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部を含有する）、ＩｇＧ融合分子（全長ＩｇＧ抗体がエクストラＦａｂフラグメント又はＦａｂフラグメントの一部に融合されている）、Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化ディアボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域又はその一部に融合されている）、Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂフラグメントが互いに融合されている）、ＳｃＦｖ−及びディアボディ−ベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるディアボディ若しくは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。
【0134】
一部の実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子には、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的マッチされた抗体（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ−Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランド交換操作ドメインボディ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
【0135】
一部の実施形態では、組換えＩｇＧ様デュアル標的化分子には、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）−Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ−Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ−ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
【0136】
一部の実施形態では、ＩｇＧ融合分子には、Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）−Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ−ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｎｎＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【0137】
一部の実施形態では、Ｆｃ融合分子には、ＳｃＦｖ／Ｆｃ Ｆｕｓｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ−ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）．ｓｕｂ．２−Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ−−Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。
【0138】
一部の実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体には、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ−Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ−Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ−ａｎｄ−Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ−Ｆｖ（ＵＣＢ−Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ−、ディアボディ−ベース及びドメイン抗体には、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢＩＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ−ｌｉｋｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＳｃＦｖ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、デュアル標的化ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、デュアル標的化重鎖単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0139】
本発明の全長二重特異性抗体は、例えば、２つの単特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して、インビトロでのセルフリー環境において又は共発現を使用するかのいずれか一方において、異なる特異性を有する２つの抗体半分子の好ましいヘテロ二量体形成のために、各半分子における重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することにより生成されてもよい。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離−会合の結果である。親単特異性抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は減少する。親単特異性抗体のうち１つの得られた遊離システインは、第２の親単特異性抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離−会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体化より好ましいヘテロ二量体化に操作されてもよい。得られた産物は、それぞれが異なるエピトープ、すなわち、ＰＳＭＡ上のエピトープ及びＣＤ３上のエピトープに結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。
【0140】
本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体化」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0141】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体化」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用されるとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。
【0142】
「ノブ−ｉｎ−ホール」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）が、全長二重特異性抗体を生成するのに使用されてもよい。簡潔に、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するために、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原に特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換ペアは、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。
【0143】
他の戦略、例えば、あるＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体化の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されたように使用されてもよい。他の戦略では、ヘテロ二量体化は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されたように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ Ｋ４０９Ｆ Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）により促進されてもよい。
【0144】
上記された方法に加えて、本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載された方法に従って、セルフリー環境でのインビトロにおいて、２つの単特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域中に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合を異性化させる還元条件下において、２つの親単特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することにより生成されてもよい。この方法において、第１の単特異性ＦＮ３ドメイン及び単特異性二価抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体）は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおける特定の置換を有するように操作され、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合異性化を受けるのに十分な還元条件下において共にインキュベートされ、これにより、Ｆａｂアーム交換による二重特異性抗体が生成される。インキュベーション条件は、最適には、非還元条件に戻されてもよい。使用されてもよい例示的な還元剤は、２−メルカプトエチルアミン（２−ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、Ｌ−システイン、及びベータ−メルカプトエタノール、好ましくは、２−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度において、少なくとも２５ｍＭ ２−ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５〜８、例えば、ｐＨ７．０又はｐＨ７．４において、少なくとも９０分のインキュベーションが使用されてもよい。
【0145】
また、本明細書において、当該ＰＭＳＡに結合し、Ｔ細胞を補充して、当該ＰＭＳＡ発現細胞を殺傷すること（すなわち、Ｔ細胞の再指向）が可能な多重特異性抗体を、それを必要とする患者に投与することにより、ＰＭＳＡ発現細胞を殺傷するための方法が提供される。本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントのいずれかを、治療的に使用してもよい。
【0146】
好ましい実施形態では、本発明の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。より好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は抗体フラグメントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち１つは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。一実施形態において、この障害は、がんである。
【0147】
同様に、本明細書において、選択した細胞集団の成長を阻害する方法が更に提供される。当該方法は、その他の細胞傷害剤又は治療剤を単独で又は組み合わせるかのいずれかにおいて、ＰＭＳＡ発現標的細胞又はこのような標的細胞を含有する組織を、本発明の有効量の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントと接触させることを含む。好ましい実施形態では、多重特異性抗原結合分子は、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。選択された細胞集団の成長を阻害するための方法は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて実施され得る。
【0148】
キットまた、本明細書において、例えば、記載された多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、特定の細胞タイプを殺傷するための単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントを使用するための取扱説明書を含むキットも提供される。好ましい実施形態では、本明細書に記載する多重特異性の単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントであり、より好ましくは、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子又はその二重特異性抗原結合フラグメントである。取扱説明書は、多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにおいて使用するための指示を含んでもよい。
【0149】
一般的に、キットは、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ多重特異性抗原結合分子又はその多重特異性抗原結合フラグメントを収容する区画を有するであろう。多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントは、凍結乾燥状態、液状、又はキットに含ませるのに修正可能な他の形態でもよい。キットはまた、キットの取扱説明書に記載された方法を実施するのに必要とされる、更なる要素を含有してもよい。同要素は、例えば、凍結乾燥粉末を再構成するための滅菌溶液、患者への投与の前に多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせるための更なる薬剤、及び多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントを患者に投与するのを支援するツールである。
【実施例】
【0150】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的とするものであり、それらを考慮して種々の改変又は変更が、当業者に明らかであろう。また、本明細書に記載された実施例及び実施形態は、本発明の真の範囲内に含まれ、本発明の真の範囲を逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【0151】
試薬及び構築物カニクイザルＰＳＭＡ（カニクイザルタンパク質データベース参照番号：ＥＨＨ５６６４６．１、配列番号：３２）及びチンパンジーＰＳＭＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照番号：Ｈ２Ｑ３Ｋ５、配列番号：３３）の細胞外ドメインを、６Ｈｉｓタグ及びＡｖｉタグと共にｐＵｎｄｅｒ発現ベクターにクローニングした。タンパク質を、２９３ＨＥＫ−ｅｘｐｉ細胞内で一時的に発現させた。上清を回収し、遠心分離により透明にした。タンパク質を、１）ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを用いたＩＭＡＣ精製、及び２）サイズ排除精製（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００）の二段階の精製プロセスを用いて精製した。ここでの溶出緩衝液は、ＰＳＭＡの二量化を安定させるための、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、及び０．５ｍＭのＺｎＣｌ２を含有するＤＰＢＳである。目的のタンパク質を含有する画分をプールし、タンパク質濃度をＡ２８０で測定した。
【0152】
黄色ブドウ球菌のソルターゼＡをコードする遺伝子をＤＮＡ２．０で作製し、Ｔ５プロモータ下で発現するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にサブクローニングした。可溶性発現用のソルターゼ構築物は、２５個のアミノ酸からなる天然タンパク質のＮ末端ドメインを欠いている。なぜなら、このドメインが膜に会合しているからである（Ｔｏｎ−Ｔｈａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９６：１２４２４〜１２４２９，１９９９）。ソルターゼを、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号：３４）に続くタグ除去用のＴＥＶプロテアーゼ部位（ＥＮＬＹＦＱＳ、配列番号：５４）で発現させ、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するソルターゼを得た。用いたソルターゼタンパク質はまた、野生型タンパク質（配列番号：５３）と比較すると酵素の触媒効率を向上させると報告されている５つの変異を有する配列を含む（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８：１１３９９〜１１４０４，２０１１）。プラスミドを、発現用の大腸菌ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。単一コロニーを選択して、カナマイシンを補足したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）内で培養し、３７℃、２５０ＲＰＭで１８時間インキュベートした。カナマイシンを補足した２５０ｍＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を、これら継代培養から播種し、３７℃で振とうしながら約４時間培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。タンパク質を３０℃で１８時間発現させた。６０００ｇの遠心分離で細胞を回収し、精製するまで−２０℃で保存した。凍結細胞ペレットを室温で３０分間解凍し、３０ｍＬあたり１μＬの組換えリゾチーム（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、細胞ペースト１ｇあたり５ｍＬで補足したタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に懸濁させ、振とう器を用いて室温で３０分間インキュベートした。７４，６００ｇの遠心分離を３０分間行い、溶解液を透明にした。
【0153】
上清を、３ｍＬのＱｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｎｉ−ＮＴＡレジンを充填した自然落下式カラムに添加した。当該レジンは、緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含む）を用いて予め平衡化した。添加後、カラムを１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾールを補足した緩衝液Ａを用いてタンパク質を溶出し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて平衡化した分取用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ ２１．５×６００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）に添加した。ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを用いて、ＰＢＳ中、流速１０ｍＬ／分、室温でゲル濾過クロマトグラフィーを行った。それから、ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたソルターゼを消化し、Ｈｉｓ６タグを除去した。２８ｍｇのソルターゼを、１ｍＭのＤＴＴを補足した添付緩衝液中の、３０００ユニットを含む１０ｍＬのＡｃＴＥＶプロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３０℃で２時間インキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡレジンを用いて、タグを含まないソルターゼを精製した。ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、反応液をＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に交換し、緩衝液Ａを用いて予め平衡化した、０．５ｍＬのＱｉａｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｎｉ−ＮＴＡレジンを充填した自然落下式カラムに添加した。フロースルーを回収し、フロースルーに加えた３ｍＬの緩衝液Ａを用いて、レジンを洗浄した。このフロースルーを、Ａｍｉｃｏｎ １５濃縮器（カットオフ１０ｋＤａ）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、約０．５ｍＬに濃縮した。追加のＴＢＳ緩衝液を加え、サンプルを再度濃縮し（２度繰り返した）、緩衝液をＴＢＳに交換した。４０％グリセロールの１／３容量を加え（終濃度１０％グリセロール）、短期使用向けに−２０℃で、長期使用向けに−８０℃でソルターゼを保存した。
【0154】
実施例１．無作為化したループを有するＴｅｎｃｏｎライブラリの構築Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号：１）は、ヒトテネイシンＣ由来の１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、免疫グロブリン様スキャフォールドのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２、米国特許第８，２７８，４１９号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示す。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を無作為化して、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて特異的標的に結合する新規分子を選択することができる。
【0155】
Ｔｅｎｃｏｎ：Ｌｐａｐｋｎｌｖｖｓｅｖｔｅｄｓｌｒｌｓｗｔａｐｄａａｆｄｓｆｌｉｑｙｑｅｓｅｋｖｇｅａｉｎｌｔｖｐｇｓｅｒｓｙｄｌｔｇｌｋｐｇｔｅｙｔｖｓｉｙｇｖｋｇｇｈｒｓｎｐｌｓａｅｆｔｔ（配列番号：１）
Ｔｅｎｃｏｎスキャフォールド及び種々の設計戦略を用いて、種々のライブラリを作製した。通常、ライブラリＴＣＬ１及びＴＣＬ２は、良好なバインダーを生成する。ＴＣＬ１及びＴＣＬ２ライブラリの作製については、国際公開第２０１４０８１９４４（Ａ２）号に詳細が記載されている。
【0156】
ＴＣＬ１ライブラリの構築Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号：１）のＦＧループのみを無作為化するように設計されたライブラリＴＣＬ１を、ｃｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２）。このシステムにおいて、Ｔａｃプロモータ、Ｔｅｎｃｏｎライブラリコード配列、ＲｅｐＡコード配列、ｃｉｓエレメント、及びｏｒｉエレメントの配列を組み入れる一本鎖ＤＮＡを作製する。インビトロ転写／翻訳系で発現させると、それがコードされるＤＮＡに対してｃｉｓで結合したＴｅｎｃｏｎ−ＲｅｐＡ融合タンパク質の複合体が産生される。次に、標的分子に結合する複合体を単離して、以下に記述されるようにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。
【0157】
ｃｉｓディスプレイで用いるためのＴＣＬ１ライブラリの構築は、ＰＣＲの連続ラウンドによって得られ、最終的に直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子が二等分して産生された；２ｍ（５’）フラグメントは、プロモータとＴｅｎｃｏｎ配列とを含むが、１ｍ（３’）フラグメントはｒｅｐＡ遺伝子とｃｉｓ及びｏｒｉエレメントとを含む。これらの二等分分子を制限酵素消化によって結合させて、完全な構築物を産生する。ＴＣＬ１ライブラリは、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ、ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号：５５）のみにランダムアミノ酸を組み込むように設計された。このライブラリの構築にＮＮＳコドンを用い、それによって２０個全てのアミノ酸及び１つの終止コドンが、ＦＧループに組み入れられ得る。ＴＣＬ１ライブラリは、多様性を更に増加させるために、それぞれが異なる長さの、７〜１２残基の無作為化ＦＧループを有する、６個の個別のサブライブラリを含む。
【0158】
ＴＣＬ１ライブラリ（配列番号：２）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ７〜１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【0159】
ＴＣＬ２ライブラリの構築ＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループの両方が無作為化されて、それぞれの位置でのアミノ酸の分布が厳密に制御されているＴＣＬ２ライブラリを構築した。表６は、ＴＣＬ２ライブラリにおける所望のループ位置でのアミノ酸分布を示す。設計されたアミノ酸分布は２つの目的を有した。第一に、ライブラリを、Ｔｅｎｃｏｎ結晶構造の解析及び／又はホモロジーモデリングに基づいて、Ｔｅｎｃｏｎのフォールディング及び安定性にとって構造的に重要となると予測される残基に向けて偏らせた。例えば、２９番目の位置は、Ｔｅｎｃｏｎが折り畳まれた際に疎水性コアの中に埋もれることから、疎水性アミノ酸のサブセットのみとなるように固定した。第２の設計は、高親和性バインダーを効率よく生成するために、抗体の重鎖ＨＣＤＲ３に優先的に認められる残基の分布となるようにアミノ酸分布を偏らせることを含んだ（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８〜２８，２００８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １６：４７６〜８４，２００７）。この目標に向かって、表５の「設計された分布」は、以下の分布を指す：６％アラニン、６％アルギニン、３．９％アスパラギン、７．５％アスパラギン酸、２．５％グルタミン酸、１．５％グルタミン、１５％グリシン、２．３％ヒスチジン、２．５％イソロイシン、５％ロイシン、１．５％リジン、２．５％フェニルアラニン、４％プロリン、１０％セリン、４．５％トレオニン、４％トリプトファン、１７．３％チロシン、及び４％バリン。この分布には、メチオニン、システイン、及び終止コドンが含まれない。
【0160】
ＴＣＬ２ライブラリ（配列番号：３）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒであり、Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌである。
【0161】
【表5】
【0162】
その後、これらのライブラリを種々の方法を用いて改良した。改良方法としては、野生型Ｔｅｎｃｏｎと比較して安定化させた、置換Ｅ１１Ｒ／Ｌ１７Ａ／Ｎ４６Ｖ／Ｅ８６Ｉ（Ｔｅｎｃｏｎ２７、配列番号：４）を組み込んだＴｅｎｃｏｎフレームワーク（米国特許第８，５６９，２２７号）上にライブラリを構築することと、ＢＣ及びＦＧループにおいて無作為化した位置を変えることと、が挙げられる。Ｔｅｎｃｏｎ２７は、国際公開第２０１３０４９２７５号に記載されている。これにより、ＴｅｎｃｏｎのＦＧループ（ライブラリＴＣＬ９）のみの、あるいは、ＢＣ及びＦＧループの組み合わせ（ライブラリＴＣＬ７）の無作為化を目的とした新規ライブラリを作製した。これらのライブラリを、ｃｉｓディスプレイシステムで用いるために構築した（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１：２８０６〜２８１０，２００４）。この設計の詳細を以下に示す。
【0163】
安定化させたＴｅｎｃｏｎ（Ｔｅｎｃｏｎ２７）（配列番号：４）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0164】
ＴＣＬ７（無作為化したＦＧ及びＢＣループ）（配列番号：５）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損である。
【0165】
ＴＣＬ９（無作為化したＦＧループ）（配列番号：６）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損である。
【0166】
ライブラリ構築では、ライブラリのアミノ酸分布を制御するために、かつ終止コドンを除去するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｓｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＧｍｂＨ）を用いて、無作為化したＢＣループ（長さ６〜９の位置）又はＦＧループ（長さ７〜１２の位置）をコードするＤＮＡフラグメントを合成した。ＢＣループ又はＦＧループのいずれかを無作為化する２つの異なるＤＮＡ分子のセットを別々に合成し、その後ＰＣＲを用いて結合し、完全なライブラリ産物を作製した。
【0167】
ＦＧループライブラリ（ＴＣＬ９）の構築２ｍ（５’）Ｔａｃプロモータに続く、ＦＧループにおいて無作為化したコドンを除くＴｅｎｃｏｎの完全な遺伝子配列からなる合成ＤＮＡ分子のセットを作製した（配列番号：２６〜３１）。ＦＧループの無作為化において、システイン及びメチオニン以外の全てのアミノ酸は、同一の割合でコードされた。多様化した部位の長さは、ＦＧループにおける７個、８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸をコードするようになっている。それぞれに長さを変化させたサブライブラリを２μｇのスケールで別々に合成してから、Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲ（配列番号：９）及びＳｌｏｎｉｎｇ−Ｒｅｖ（配列番号：１０）のオリゴを用いたＰＣＲで増幅した。
【0168】
ライブラリの１ｍ（３’）フラグメントは、ＰｓｐＯＭＩ制限部位、ｒｅｐＡ遺伝子のコード領域、並びにｃｉｓ及びｏｒｉエレメントを含む、ディスプレイのためのエレメントを含む一定のＤＮＡ配列である。ＰＣＲ反応を行い、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーを有するプラスミド（ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として用いて、このフラグメントを増幅させた。得られたＰＣＲ産物を、ＰｓｐＯＭＩで終夜消化して、ゲル精製した。ライブラリＤＮＡの２ｍ（５’）部分を、ｒｅｐＡ遺伝子を含む１ｍ（３’）ＤＮＡにライゲートするために、２ｐｍｏｌ（約５４０ｎｇ〜５６０ｎｇ）の２ｍ（５’）ＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＰｓｐＯＭＩ酵素並びにＴ４リガーゼの存在下で、等モル（約１．２５μｇ）の１ｍ（３’）ｒｅｐＡ ＤＮＡに、３７℃で一晩ライゲートした。オリゴＰＯＰ２２５０（配列番号：１１）及びＤｉｇＬｉｇＲｅｖ（配列番号：１２）を用いた１２サイクルのＰＣＲを使用することにより、ライゲートしたライブラリ産物を増幅した。それぞれのサブライブラリにおいて、１２サイクルのＰＣＲ反応により得られたＤＮＡを混合し、Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを用いて精製した。ＴＣＬ９のそれぞれのサブライブラリの収量は、３２〜３４μｇの範囲であった。
【0169】
ＦＧ／ＢＣループライブラリ（ＴＣＬ７）の構築ＴＣＬ７ライブラリは、無作為化したＴｅｎｃｏｎのＢＣ及びＦＧループを含むライブラリを提供する。このライブラリでは、６〜９アミノ酸長のＢＣループを、無作為化した７〜１２アミノ酸長のＦＧループと組み合わせて混合した。タンパク質のＮ末端部分を上流にコードし、かつＢＣループが６個、７個、８個又は９個の無作為化したアミノ酸のいずれかで置換されるような残基ＶＸを含む、Ｔｅｎｃｏｎ遺伝子を導入するために、合成ＴｅｎｃｏｎフラグメントＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８及びＢＣ９（配列番号：１３〜１６）を作製した。Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８３Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）の発見に先立ってこれらのフラグメントを合成したが、これらの変異を、以下に記載する分子生物学の工程を用いて導入した。このフラグメントを、無作為化したＦＧループをコードするフラグメントと結合させるために、以下の工程を行った。
【0170】
最初に、アミノ酸Ａ１７（１３０ｍｅｒ−Ｌ１７Ａ、配列番号：１７）をコードするヌクレオチド上流の、ＴｅｎｃｏｎのＴａｃプロモータ及び２ｍ（５’）配列をコードするＤＮＡフラグメントを、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ（配列番号：１８）及びＬＳ１１１４（配列番号：１９）を用いたＰＣＲにより作製した。これを行うことにより、ライブラリ内にＬ１７Ａ変異（ＣＥＮ５２４３）を導入した。次に、無作為化したＢＣループを含む、Ｔｅｎｃｏｎ残基Ｒ１８−Ｖ７５をコードするＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのＢＣ６、ＢＣ７、ＢＣ８又はＢＣ９、並びにオリゴＬＳ１１１５（配列番号：２０）及びＬＳ１１１７（配列番号：２１）を用いたＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ工程により、１ｍ（３’）末端にＢｓａＩ部位を導入した。続いて、オリゴＰＯＰ２２２２ｅｘｔ及びＬＳ１１１７をプライマーとして用いたオーバーラッピングＰＣＲ法により、これらのＤＮＡフラグメントを連結させた。２４０ｂｐの得られたＰＣＲ産物をプールし、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。精製したＤＮＡをＢｓａＩ−ＨＦで消化し、ゲル精製した。
【0171】
オリゴヌクレオチドＳＤＧ１０（配列番号：２２）及びＳＤＧ２４（配列番号：２３）を含むＦＧ７、ＦＧ８、ＦＧ９、ＦＧ１０、ＦＧ１１及びＦＧ１２（配列番号：２６〜３１）を鋳型として用いたＰＣＲにより、ＦＧループをコードするフラグメントを増幅し、ＢｓａＩ制限部位、並びにＮ４６Ｖ及びＥ８６Ｉ変異（ＣＥＮ５２４３）を組み込んだ。
【0172】
３ウェイライゲーションを用いた単一工程で、消化したＢＣフラグメント及びＦＧフラグメントを共にライゲートした。１６組の可能な組み合わせに対して４回のライゲーション反応（それぞれのライゲーション反応では、２つのＢＣループ長を２つのＦＧループ長と連結させる）を準備した。それぞれのライゲーションは、約３００ｎｇの総ＢＣフラグメント及び３００ｎｇのＦＧフラグメントを含有していた。それから、オリゴＰＯＰ２２２２（配列番号：２４）及びＳＤＧ２８（配列番号：２５）を用いたＰＣＲにより、これら４つのライゲーションプールを増幅した。その後、７．５μｇのそれぞれの反応産物をＮｏｔＩを用いて消化し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製カラムを用いて洗浄した。５．２μｇのこのＤＮＡを、ＰｓｐＯＭＩを用いて消化した等モル量のＲｅｐＡ ＤＮＡフラグメント（約１４μｇ）とライゲートし、その産物を、オリゴＰＯＰ２２２２を用いたＰＣＲにより増殖させた。
【0173】
実施例２：別の結合表面を有するＴｅｎｃｏｎライブラリの作製特定のライブラリ設計において無作為化させる残基を選択することにより、作製した相互作用表面の全体的な形状が決まる。ＢＣ、ＤＥ及びＦＧループが無作為化されたライブラリからマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と結合させるために選択したスキャフォールドタンパク質を収容するＦＮ３ドメインのＸ線結晶構造解析を行うことにより、ＭＢＰの活性部位に適合する大きく湾曲した界面を有することが示された（Ｋｏｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４：６６３２〜６６３７，２００７）。対照的に、ＭＢＰと結合させるために選択したアンキリン反復スキャフォールドタンパク質は、遥かに平坦な相互作用表面を有し、ＭＢＰの外側表面（活性部位から離れた）に結合することを見出した（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２：５７５〜５８２，２００４）。これらの結果は、スキャフォールド分子の結合表面の形状（湾曲対平坦）が、標的タンパク質上のどの標的タンパク質又は特定エピトープがスキャフォールドに効果的に結合可能かについて決定し得ることを示唆している。タンパク質結合において、ＦＮ３ドメインを収容するタンパク質スキャフォールドの改変に関して公開された試みは、標的結合のための隣接したループを改変することに基づいており、そのため湾曲した結合表面を作製していた。このアプローチでは、このようなスキャフォールドが接触可能な標的及びエピトープの数が制限される場合がある。
【0174】
Ｔｅｎｃｏｎ及びその他のＦＮ３ドメインは、分子の向かい合う面上に位置する２セットのＣＤＲ様ループを有しており、第１のセットはＢＣ、ＤＥ及びＦＧループで形成されており、第２のセットはＡＢ、ＣＤ及びＥＦループで形成されている。２セットのループは、ＦＮ３構造の中心を形成するβストランドにより分離されている。Ｔｅｎｃｏｎの画像を９０度回転させると、別の表面を見ることができる。このわずかに凹状の表面は、ＣＤ及びＦＧループ並びに２本の逆平行βストランド（Ｃ及びＦβストランド）により形成され、本明細書では、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面と呼んでいる。Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を鋳型として用い、表面を形成する残基のサブセットを無作為化することにより、タンパク質スキャフォールド相互作用表面のライブラリを設計することができる。βストランドは、その他全ての残基がタンパク質表面に露出した側鎖を有する反復構造を有している。それゆえ、βストランド内で表面に露出した残基の一部又は全てを無作為化することにより、ライブラリを作製することができる。βストランド内の適切な残基を選択することによって、Ｔｅｎｃｏｎスキャフォールドに固有の安定性が損なわれることを最小限に留める必要があるが、一方で、その他タンパク質と相互作用する独特なスキャフォールド表面が提供される。
【0175】
ライブラリＴＣＬ１４（配列番号：７）を、Ｔｅｎｃｏｎ２７スキャフォールド（配列番号：４）の設計に組み込んだ。
【0176】
このライブラリを構築するために用いた方法の詳細な記述は、米国特許公開第２０１３／０２２６８３４号に記述されている。
【0177】
ＴＣＬ１４ライブラリ（配列番号：７）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２及びＸ１３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｃ又はＭである。
【0178】
Ｔｅｎｃｏｎ２７内でＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面を形成する２本のβストランドは、無作為化させることが可能なトータルで９つの表面に露出した残基、Ｃストランド（Ｓ３０、Ｌ３２、Ｑ３４、Ｑ３６）、及びＦストランド（Ｅ６６、Ｔ６８、Ｓ７０、Ｙ７２及びＶ７４）を有しており、一方で、ＣＤループは、潜在的な６つ残基（Ｓ３８、Ｅ３９、Ｋ４０、Ｖ４１、Ｇ４２及びＥ４３）を有しており、ＦＧループは、潜在的な７つの残基（Ｋ７５、Ｇ７６、Ｇ７７、Ｈ７８、Ｒ７９、Ｓ８０及びＮ８１）を有している。全２２残基が無作為化された場合の、ライブラリのより大きな理論的サイズによって、ＴＣＬ１４設計中に含有させるための選択残基を選択した。
【0179】
無作為化のため、Ｔｅｎｃｏｎ内の１３ヵ所を選択した：Ｃストランド内のＬ３２、Ｑ３４及びＱ３６、ＣＤループ内のＳ３８、Ｅ３９、Ｋ４０及びＶ４１、Ｆストランド内のＴ６８、Ｓ７０及びＹ７２、並びにＦＧループ内のＨ７８、Ｒ７９及びＮ８１。Ｃ及びＦストランド内のＳ３０及びＥ６６は、ＣＤ及びＦＧループを越えた位置に存在し、明らかにＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の一部であるようには見えないため、無作為化させなかった。ＣＤループ内のＧ４２及びＥ４３は、グリシンがループ領域において有用であり（可撓性を提供する）、Ｅ４３が表面の連結部に存在するため、無作為化させなかった。ＦＧループ内のＫ７５、Ｇ７６、Ｇ７７及びＳ８０についても除外した。上記理由によりグリシンを除外したが、結晶構造を慎重に検査することによって、Ｓ８０が、安定したＦＧループの形成を補助するためにコアと重要な接触を行っていることが判明した。Ｋ７５は、Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面の表面から離れて面しており、無作為化の候補としては魅力に欠けていた。オリジナルのＴＣＬ１４設計では上述した残基を無作為化させなかったが、それらを続くライブラリ設計に組み込み、新しい選択の、又は例えば、選択ＴＣＬ１４標的特異性ヒットにおける親和性成熟ライブラリの、更なる多様性を提供することが可能である。
【0180】
ＴＣＬ１４を作製した後に、類似した設計の、３つの別のＴｅｎｃｏｎライブラリを作製した。これら２つのライブラリを用いて、ＴＣＬ１４と同一位置（上記を参照のこと）において、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３を無作為化させるが、これらの位置で生じるアミノ酸の分布は異なる（表６）。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１を設計し、１８個の天然アミノ酸を全ての位置において等しい分布（それぞれ５．５５％）で導入した（システイン及びメチオニンだけは除外）。無作為化したそれぞれの位置が、表６に記載の機能性抗体のＨＣＤＲ３ループ（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７７：１５１８〜１５２８，２００８）において見られるアミノ酸分布に近似するように、ＴＣＬ２３を設計した。ＴＣＬ２１ライブラリと同様に、システイン及びメチオニンは除外した。
【0181】
その他のライブラリにおける潜在的な標的結合表面を拡大するために、３番目の別のライブラリを構築した。このライブラリ、ＴＣＬ２４では、ＴＣＬ１４、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１及びＴＣＬ２３ライブラリと比較して、４ヵ所の別のＴｅｎｃｏｎ位置を無作為化させた。これらの位置には、Ｄストランド由来のＮ４６及びＴ４８、並びにＧストランド由来のＳ８４及びＩ８６が含まれている。これらの残基の側鎖がβストランドＤ及びＧから露出した表面であり、かつＣ及びＦストランドの無作為化した位置と構造的に隣接した位置に存在することから、位置４６、４８、８４及び８６がとりわけ選択された。それゆえ、標的タンパク質に結合するための接触可能な表面積が増加する。ＴＣＬ２４のそれぞれの位置で用いたアミノ酸分布は、表６のＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１について記載した分布と同一である。
【0182】
ＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号：８）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ Ｙ又はＷである。
【0183】
表６．ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４のそれぞれの無作為化した位置におけるアミノ酸頻度（％）
【0184】
【表6】
【0185】
ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４ライブラリの作製アミノ酸分布を制御するために、Ｃｏｌｉｂｒａライブラリ技術（Ｉｓｏｇｅｎｉｃａ）を用いてＴＣＬ２１ライブラリを作製した。アミノ酸分布を制御するために、Ｓｌｏｎｏｍｉｃｓ技術（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を用いて、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２３及びＴＣＬ２４の遺伝子フラグメントを作製した。冒頭の合成に続いてＰＣＲを用いてそれぞれのライブラリを増幅し、その後、ループライブラリについて上記したとおり、ＣＩＳディスプレイシステム（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１：２８０６〜２８１０，２００４）を用いた選択に使用するために、ＲｅｐＡ遺伝子にライゲートした。
【0186】
実施例３：ＰＳＭＡと結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択プレートベース選択
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ７、ＴＣＬ９、ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１ライブラリからＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインを選択した。インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）のために、完全アミノ酸（０．１ｍＭ）、１Ｘ Ｓ３０プレミックス成分、及びＳ３０抽出液（１５μＬ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）（総容積５０μＬ）を用いて、ライブラリＤＮＡ（３μｇ）を３０℃でインキュベートした。１時間後、ブロッキング溶液（３７５μＬ）（１Ｘ ＴＢＳ、ｐＨ７．４、０．０１％ Ｉ−ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，＃Ｔ２０１５）、１００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ）を添加し、反応液を氷上で１５分間インキュベートした。抗ヒトＰＳＭＡ抗体（Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｃａｔａｌｏｇ＃ＬＣ−Ｃ１５０５２７）をコートした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｂプレート上に固定化した、組換えタンパク質、チンパンジーＰＳＭＡ（ｐａｎ ２２９）若しくはカニクイザルＰＳＭＡ（ｐａｎ ２３０）、又はカニクイザルＰＳＭＡ−Ｆｃ融合（ｐａｎ ２３１）を用いて、ＩＴＴ反応液をインキュベートした。非結合ライブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質からＤＮＡを溶出させ、更なるパニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた。それぞれのラウンドにおいて、標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを高めることによって、高親和性バインダーを単離した。
【0187】
パニング後、選択したＦＮ３ドメインをＰＣＲを用いて増殖し、リガーゼ非依存的クローニング部位を含めるように改変されたｐＥＴベクターにサブクローニングして、標準的な分子生物学的手法を用いて大腸菌において可溶性で発現させるために、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞に形質転換した。精製及び検出を可能にするために、Ｃ−末端ポリヒスチジンタグをコードする遺伝子配列を、各ＦＮ３ドメインに付加した。１ｍＬの９６ウェルブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを補足したＴＢ培地中で、培養物を３７℃で吸光度が０．６〜０．８となるまで増殖させた後、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加し、その時点で温度を３０℃に低下させた。およそ１６時間後に細胞を遠心分離させて回収し、−２０℃で凍結した。それぞれのペレットをＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）ＨＴ溶解緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．６ｍＬ中で、室温で４５分間振とうさせながらインキュベートすることによって細胞溶解物を得た。
【0188】
ビーズベース選択ＦＮ３ドメインはまた、ビーズベースの捕捉配列を用いて選択した。ＩＴＴ反応液を上述のように調製した後、ビオチン化組換えタンパク質（チンパンジーＰＳＭＡ又はカニクイザルＰＳＭＡ）を用いてインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕捉した。非結合ライブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質からＤＮＡを溶出させ、更なるパニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた。それぞれのラウンドにおいて、標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを高めることによって、高親和性バインダーを単離した。
【0189】
オフレート選択ビーズベース選択の５回目のラウンドにおける産物を、４ラウンドのオフレート選択に供した。ＩＴＴ後、ビオチン化組換えチンパンジー又はカニクイザルタンパク質を用いて反応液をインキュベートした。タンパク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴで広範囲にわたって洗浄した。結合複合体を、冷却した５μＭの組換えＰＳＭＡタンパク質で１時間洗浄した。それから、ビーズに結合したＩＴＴをＴＢＳＴ及びＴＢＳで広範囲にわたって洗浄し、その後溶出した。ビオチン化標的抗原の濃度を、２５ｎＭ（ラウンド６及び７）から２．５ｎＭ（ラウンド８及び９）へと低下させた。ラウンド７及び９の選択産物を、発現及びスクリーニング用の改変ｐＥＴ１５ベクターにサブクローニングした。
【0190】
親和性成熟ライブラリ選択ＢＣループ由来の２３〜３０位及びＦＧループ由来の７８〜８３位を無作為化させた、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ（Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術を用いて、クローン配列Ｐ２２９ＣＲ９Ｐ８１９−Ｈ１１（配列番号：４０）に基づいた親和性成熟ライブラリ（ＴＣＬ２５）を作製した。親アミノ酸（Ｐ２２９ＣＲ９Ｐ８１９−Ｈ１１由来）をコードするヌクレオチドを、６５％の標的頻度でそれぞれの無作為化した位置にドープすることにより、ライブラリにおける標的結合の維持を達成した。含有しないシステイン及びメチオニンを除外して、その他２０個の天然アミノ酸全てを等しい確率でコードするコドンの組み合わせを含有するように、残り３５％のヌクレオチドを設計した。表７にＴＣＬ２５成熟ライブラリの設計を示す。表において、括弧内の数字は、それぞれの位置に対応するアミノ酸を含有するように設計されたライブラリ中の分子の割合を表す。このドーピングスキーム（１４ヵ所の位置に、６５％の親）により、親分子と比較してほとんどの場合３、４、５、６又は７つの変更を含む、理論上の分子分布が生じる。
【0191】
【表7】
【0192】
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ２５ライブラリからＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインを選択した。ビオチン化組換えタンパク質（チンパンジーＰＳＭＡ又はカニクイザルＰＳＭＡ）を用いて、ＩＴＴ反応液をインキュベートした。ビオチン化組換えタンパク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕捉した。非結合ライブラリメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで連続的に洗浄することによって除去した。洗浄後、８５℃に１０分間加熱することにより標的タンパク質からＤＮＡを溶出させ、更なるパニングラウンドのためにＰＣＲを用いて増幅させた。それぞれのラウンドにおいて、標的ＰＳＭＡの濃度を４００ｎＭから１００ｎＭへと連続的に低下させて、洗浄のストリンジェンシーを高めることによって、ＦＮ３ドメインバインダーを単離した。
【0193】
２回目のラウンドの選択における産物を、４ラウンドのオフレート選択に供した。ＩＴＴ後、ビオチン化組換えＰＳＭＡタンパク質を用いて反応液をインキュベートした。タンパク質及び結合ライブラリメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコートした磁性ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴで広範囲にわたって洗浄した。結合複合体を、冷却した５μＭの組換えＰＳＭＡタンパク質で１時間洗浄した。それから、ビーズに結合したＩＴＴをＴＢＳＴ及びＴＢＳで広範囲にわたって洗浄し、その後溶出した。ビオチン化標的抗原の濃度を、２５ｎＭ（ラウンド３及び４）から２．５ｎＭ（ラウンド５及び６）へと低下させた。ラウンド７及び９の選択産物を、発現及びスクリーニング用の改変ｐＥＴ１５ベクターにサブクローニングした。
【0194】
ＰＳＭＡと結合するＦＮ３ドメインの生化学的スクリーニングニュートラアビジンでコートしたプレートをＳｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１時間ブロッキングし、その後、ビオチン化ＰＳＭＡ（パニングの際と同一の抗原を用いて）又は陰性コントロールで１時間コートした。プレートをＴＢＳＴでリンスし、希釈した溶解物をプレートに１時間添加した。更にリンスを行った後、ＨＲＰコンジュゲート抗ＦＮ３ドメイン抗体（ＰＡＢ２５）でウェルを１時間処理し、それからＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてアッセイした。少なくとも１０倍超のバックグラウンドでシグナルを有するＦＮ３ドメインを、更なる解析用に選択した。
【0195】
サイズ排除クロマトグラフィー分析サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＳＭＡ結合ＦＮ３ドメインの凝集状態を決定した。各精製ＦＮ３ドメインのアリコート（１０μＬ）をＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流速０．３ｍＬ／分でｐＨ７．４のＰＢＳを移動相として注入した。カラムからの溶出を、２８０ｎｍの吸光度によってモニターした。野生型Ｔｅｎｃｏｎを、それぞれのランにおいてコントロールとして含めた。Ａｇｉｌｅｎｔ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０２）を用いて溶出特性を解析した。同一のランにおいて野生型タンパク質の溶出特性と類似した溶出特性を有するタンパク質のみを、更なるキャラクタリゼーション用として検討した。
【0196】
ＦＮ３ドメインのハイスループット発現、コンジュゲート及び精製生化学的結合ＥＬＩＳＡで同定した、ユニークヒット由来の単離クローンを、９６ウェルブロックプレート中の増殖用単一ヒットプレートと混合させ、クローンを１ｍＬの培養液中（選択用にカナマイシンを補足したＬＢ培地）、３７℃で一晩振とうさせながら増殖させた。９６ブロックプレート中でのタンパク質発現用として、カナマイシンを補足したＴＢ培地（１ｍＬ）に、一晩培養した培養物（５０μＬ）を播種し、ＯＤ６００＝０．６−１となるまで３００ｒｐｍで連続振とうを行いつつ３７℃で増殖させた。目的のＯＤに到達次第、ＩＰＴＧを１ｍＭとなるように添加してタンパク質発現を誘導させ、プレートを終夜増殖用に、３０℃（３００ｒｐｍ）に移した。一晩培養した培養物を遠心分離にかけて細胞を回収し、細菌ペレットを、使用できる状態になるまで−８０℃で保存した。陽性コントロール及び陰性コントロールの両方を、複製用の全てのプレートに含ませた。
【0197】
ソルターゼタグへのコンジュゲート用として、細菌ペレットを解凍し、組換えヒトリゾチーム（ＥＭＤ，Ｃａｔａｌｏｇ＃７１１１０）を補足したＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ Ｃａｔａｌｏｇ＃７０９２２）内で再懸濁及び溶解させた。穏やかに攪拌しながら室温で溶解を進めた後、プレートを４２℃に移し、宿主タンパク質を沈殿させた。デブリを遠心分離で沈殿させ、上清を、ソルターゼ触媒標識用の新しいブロックプレートに移した。Ｇｌｙ３−ｖｃ−ＭＭＡＦ（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓ）、タグを含まないソルターゼＡ、及びソルターゼ緩衝液（トリス、塩化ナトリウム及び塩化カルシウム）を含有するマスターミックスを２倍濃縮で調製し、等容積で溶解上清液に添加した。室温で２時間標識化反応を進めた後、Ｎｉ−ＮＴＡマルチトラップＨＰプレート（ＧＥ Ｃａｔａｌｏｇ＃２８−４００９−８９）を用いてタンパク質を精製した。イミダゾール含有溶出緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）を用いた段階的溶出により、タンパク質コンジュゲートを回収し、フィルターを滅菌して細胞ベースの細胞傷害性アッセイに直接用いた。
【0198】
ＦＮ３ドメイン−薬物コンジュゲートのハイスループット細胞傷害性アッセイ培養組織でコートした９６ウェル黒色プレート（ＢＤ／Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔａｌｏｇ＃３５３２１９）に、ＬＮＣａＰ ＦＧＣ細胞（ＡＴＣＣ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＣＲＬ−１７４０）を、アッセイ培地（５％ウシ胎児血清を補足したフェノールレッドフリーＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ＃１１８３５−０３０））内において細胞１０，０００個／ウェルの密度で蒔いた。細胞吸着用とするため、蒔いたプレートを、５％ ＣＯ２、３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、ＣＤＣをアッセイ培地中で希釈（１：１００、１：３００、１：１０００又は１：３０００）し、ＬＮＣａＰ細胞へと直接添加した。それからＬＮＣａＰ細胞を、５％ ＣＯ２、３７℃で６６〜７２時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｇ７５７１）を用いて、細胞毒性を評価した。１００μＬの調製試薬を、処理したウェルに直接添加し、穏やかに攪拌しながら１０分間インキュベートし、光から保護した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダーを用いて、蛍光を測定した。数値を未処理コントロールに正規化し、５０％超の毒性が達成された場合、更なる解析用に選択した。
【0199】
実施例４：抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインのキャラクタリゼーション大規模発現及び精製
ＦＮ３ドメイン変異をコードする遺伝子配列をパニングにより発見し、Ｔ７プロモータ下で発現するか、あるいはＤＮＡ２．０により作製されるｐＥＴ１５ｂベクターにクローニングし、それから、Ｔ５プロモータ下で発現するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１ベクター（ＤＮＡ２．０）にサブクローニングした。得られたプラスミドを、発現用の大腸菌ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）又はＢＬ２１ＤＥ３ Ｇｏｌｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に形質転換した。単一コロニーを選択して、カナマイシンを補足したＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）内で培養し、３７℃、２５０ＲＰＭで１８時間インキュベートした。カナマイシンを補足した１リットルのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（Ｔｅｋｎｏｖａ）を、これら継代培養から播種し、３７℃で振とうしながら４時間培養した。６００ｎｍの吸収での吸光度が１．０に到達次第、１ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。３７℃、４時間で又は３０℃、１８時間でタンパク質を発現させた。６０００ｇの遠心分離により細胞を回収し、精製するまで−２０℃で保存した。凍結細胞ペレット（約１５ｇ〜２５ｇ）を室温で３０分間解凍し、０．２ｍｇ／ｍＬの組換えリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）を、細胞ペースト１ｇあたり５ｍＬで補足したタンパク質抽出試薬ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＨＴ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に懸濁させ、振とう器を用いて室温で１時間インキュベートした。７４６００ｇ、２５分間の遠心分離により、溶解液を透明にした。ＡＫＴＡ ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを用いて、上清を流速４ｍＬ／分で氷に挿したＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡカートリッジ（５ｍＬ）に添加した。その他全てのＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー工程を、流速５ｍＬ／分で行った。２５．０ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び１０ｍＭイミダゾールを含む）（緩衝液Ａ）を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを平衡化した。添加後、カラムを１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄し、続いて、１００ｍＬの５０ｍＭトリス−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．０、１０ｍＭイミダゾール、１％ＣＨＡＰＳ及び１％ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド界面活性剤、を含む）及び１００ｍＬの緩衝液Ａで洗浄した。２５０ｍＭのイミダゾールを補足した緩衝液Ａを用いてタンパク質を溶出し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて平衡化した分取用ゲル濾過カラム、ＴＳＫ Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ ２１．５×６００ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ）に添加した。ＡＫＴＡ−ＡＶＡＮＴクロマトグラフィーシステムを用いて、ＰＢＳ中、流速１０ｍＬ／分、室温でゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
【0200】
熱安定性測定キャピラリＤＳＣを用いて熱安定性を測定した。それぞれのサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈した。オートサンプラー（ＭｉｃｒｏＣａｌ，ＬＬＣ）を備えたＶＰ−ＤＳＣ装置を使用して、これらサンプルの融解温度を測定した。サンプルを、１０℃から９５℃又は１００℃まで毎分１℃の速度で加熱した。統合に用いるベースラインを算出するために、各サンプルスキャン間の緩衝液のみのスキャンを完了させた。データを、２つの状態のアンフォールディングモデルにフィッティングさせ、続いて緩衝液のみのシグナルを差し引いた。セルから取り出さずに各サンプルのスキャンを繰り返すことにより、熱変性の可逆性を測定した。
【0201】
ＰＳＭＡ＋細胞における、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン−薬物コンジュゲートの選択的細胞傷害性システイン−マレイミド間の化学反応（Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３：２〜１３，１９９２）を介して、あるいは上記のソルターゼ反応を用いて、ＦＮ３ドメインをｖｃ−ＭＭＡＦにコンジュゲートした。ＬＮＣａＰ、ＶＣＡＰ、ＭＤＡ−ＰＣ−２Ｂ及びＰＣ３細胞における、ＦＮ３ドメイン−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの細胞傷害性をインビトロで評価した。９６ウェル黒色プレートで細胞を２４時間培養し、その後、異なる量のＦＮ３ドメイン−ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートで処理した。ＦＮ３ドメイン−薬物コンジュゲート（ＦＤＤＣ）で、細胞を６６〜７２時間インキュベートした。上述したように、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏを用いて毒性を評価した。蛍光値をエクセルにインポートし、そこから蛍光値を、グラフ解析用のＰｒｉｓｍへとコピー及びペーストした。Ｘ＝Ｌｏｇ（ｘ）を用いてデータを変換してから、非線形回帰を用いて解析し、ＩＣ５０を測定するために３パラメータモデルを適用した。
【0202】
表８は、多数の配列ファミリーに対してパニング及びスパニングを行うことにより同定したユニークヒットについてまとめている。ＦＮ３ドメインは、５５℃〜８５℃において熱安定性を示し、２２．６〜０．３８ｎＭのＩＣ５０値でｖｃＭＭＡＦにコンジュゲートした際、ＬＮＣａＰ細胞に対して細胞傷害性を示した。表９、表１０及び表１１は、選択クローンのＢＣ、Ｃ、ＣＤ、Ｆ及びＦＧループのアミノ酸配列を示す。表１２は、クラインのアミノ酸配列を示す。
【0203】
【表8】
【0204】
【表9】
【0205】
【表10】
【0206】
【表11】
【0207】
【表12】
【0208】
細胞株パネルに対して、選択薬物コンジュゲートを試験した。表１３は、ｖｃＭＭＡＦにコンジュゲートしたＦＮ３ドメインのいくつかにおけるＩＣ５０値を示す。データは、１〜９つのカーブフィッティングの平均値を表す。データは、平均値±ＳＥＭで提示されている。ＣＤＣは、高濃度のＰＳＭＡを発現することが周知な株であるＬＮＣａＰ細胞において最も強力であった。ＣＤＣはまた、低濃度のＰＳＭＡの前立腺がん株であるＭＤＡ−ＰＣＡ−２Ｂ細胞及びＶＣＡＰ細胞において活性であった。ＰＳＭＡ陰性細胞株であるＰＣ３細胞において活性は観察されず、選択性を示していた。
【0209】
【表13】
【0210】
実施例５：抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの改変システインスキャニング
タンパク質中の種々の位置に導入されたシステイン残基を有する、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン（Ｐ２３３ＦＲ９＿１０）をコードする遺伝子をＤＮＡ２．０から入手し、上記で説明したように、タンパク質を発現及び精製するのに用いた。上記のとおり、熱安定性（ｖｃＭＭＡＦコンジュゲートの有無両方の場合）及びＬＮＣａＰ細胞傷害性について、得られたＦＮ３ドメインを評価した。結果は、表１４にまとめられている。
【0211】
【表14】
【0212】
実施例６：非標的ＦＮ３ドメインの体内分布イメージング６２位にシステインを含むように遺伝子操作した、標的抗原に特異的結合を示さないＦＮ３ドメインを、ＤＯＴＡにコンジュゲートし、その後、ＩｓｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ，ＬＬＣ（Ａｎｇｌｅｔｏｎ，ＴＸ）にてジルコニウム−８９放射性同位体を結合させた。去勢雄ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に１．５％イソフルラン麻酔を行い、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｉｎｖｅｏｎ ｍｉｃｒｏＰＥＴ／ＣＴでイメージングを行った。マウスに、約０．２ｍＣｉの［８９Ｚｒ］ＦＮ３ドメイン（配列番号：５１）を尾静脈から静注することにより投与し（冷却したＦＮ３ドメインを最大１ｍｇ／ｋｇの投与量で）、最初の６０分間にわたり連続的にイメージングを行い、その後、ＦＮ３ドメインの注入から３、６及び２４時間後にイメージングを行った。
【0213】
２Ｄサブセット化による期待値最大化アルゴリズム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）を用いて、３次元ＰＥＴ画像を、０．１０７ｍｍ×０．１０７ｍｍ×０．１０７ｍｍのボクセルサイズで７６８×７６８×５１２の断層撮影容積に再構成した。ＰＭＯＤ ｖ３．０ソフトウェア（ＰＭＯＤ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、画像を処理及び解析した。周知の活性のシリンダをＰＥＴスキャナにスキャンし、ドーズキャリブレータで測定した注入ドーズとＰＥＴ画像内のボクセルあたりのカウントとの間のクロスキャリブレーションを行った。それぞれのＰＥＴ画像をＣＴ画像へと共に登録し、ＰＭＯＤ画像融合ソフトウェアを用いて解剖学的基準化を行った。解析するそれぞれの組織の４番目のセクション毎に、関心領域（ＲＯＩ）を囲んだ。ボクセルあたりの平均カウントを抽出し、周知の活性のキャリブレーションシリンダから導いた補正係数を用いて、体重１ｇあたりの注入ドーズの割合へと変換した。周知のＺｒ−８９半減期（７８．４１時間）を用いて、放射活性の全測定値に対して減衰補正を行った。
【0214】
図１に、経時的な、放射能標識ＦＮ３ドメインの組織分布を示す。腎臓及び膀胱への急速な集積が観察され、肝臓への集積はわずかに限られている。このことは、ＦＮ３ドメインが腎臓通過時に取り除かれることを示唆している。
【0215】
実施例７：ｃｙｎｏ ＰＳＭＡと複合体を形成した抗ＰＳＭＡ Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０の結晶構造Ｈｉｓタグを付加したＰ２３３ＦＲ９−Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン（本明細書ではＨ１０ ＦＮ３ドメインと呼ぶ）を大腸菌内で発現させ、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ｄＰＢＳ（ｐＨ７．２）中にＦＮ３ドメインを加えた。
【0216】
ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃ領域にＣ末端融合するカニクイザルＰＳＭＡ細胞外ドメインを、ＧｎＴＩ−細胞内で発現させ、親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。ｄＰＢＳ（０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２）中に融合タンパク質を加えた。その後、Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ処理によりＦｃ領域を除去し、続いて親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを行った。単離されたカニクイザルＰＳＭＡ（ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ）細胞外ドメインを、ｄＰＢＳ（０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２）中で保存した。
【0217】
ｃｙｎｏ ＰＳＭＡとＨ１０ ＦＮ３ドメインをモル比１：３（ＦＮ３ドメインが過剰）で混合し、同時に２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．０、０．５ｍＭ ＺｎＣｌ２）を用いて４℃で４８時間透析を行うことにより、Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン／ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ複合体を調製した。その後、グラジエント（４８〜６８ｍＭ ＮａＣｌ）、Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）及びグリセロール（１０％）で、複合体をモノＳカラムから溶出させてから、３．４ｍｇ／ｍＬに濃縮した。シッティングドロップ蒸気拡散法を２０℃で用いて、Ｘ線回折に適した結晶を、２５％ ＰＥＧ（３ｋＤａ）、ＮＨ４Ｃｌ（０．２Ｍ）及び酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、ｐＨ４．５）から得た。
【0218】
Ｘ線データ収集のために、結晶を、２０％グリセロールを補足した母液を含む抗凍結溶液中に数秒間浸してから、液体窒素中で凍結させた。アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）ビームライン１７−ＩＤにおいて、Ｄｅｃｔｒｉｓ Ｐｉｌａｔｕｓ ６Ｍ画素配列検出装置を用いて、Ｘ線回折データを収集した。ＨＫＬ２０００プログラム（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ ＆ Ｍｉｎｏｒ，１９９７）を用いて、回折データを処理した。Ｘ線データの統計値を表１５に示す。
【0219】
Ｐｈａｓｅｒ（Ｒｅａｄ，２００１）を用いた分子置換（ＭＲ）で構造を解析した。ＭＲ用のサーチモデルは、ヒトＰＳＭＡ（ＰＤＢコード２Ｃ６Ｇ）の結晶構造及びＰ１１４ＡＲ７Ｐ９４−Ａ３ Ｗ３３Ａ ＦＮ３ドメインの構造であった。ＰＨＥＮＩＸ（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，２００４）を用いて構造を精密化し、ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ ＆ Ｃｏｗｔａｎ，２００４）を用いてモデルの調整を行った。ＣＣＰ４プログラムスーツ（ＣＣＰ４，１９９４）を用いて、その他全ての結晶学的計算を行った。ＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ，２００２）を用いて、全ての分子グラフィックスを生成した。構造精密化の統計値を表１５に示す。
【0220】
【表15】
【0221】
ホモ二量体のｃｙｎｏ ＰＳＭＡの構造は、二量体サブユニット毎に、プロテアーゼドメイン（残基５７〜１１６及び３５２〜５９０）、アピカルドメイン（残基１１７〜３５１）及びヘリカルドメイン（残基５９１〜７５０）、並びに、１１個の生じ得るＮ−結合型グリカンのうちの８個（Ａｓｎ−７６、−１２１、−１４０、−１９５、−４５９、−４７６、−６１３及び−６３８）に対応する残基５７〜７５０を含む。ｃｙｎｏＰＳＭＡ活性部位は、３ドメイン間の界面に位置しており、当該活性部位は、ヒスチジン残基（Ｈ３７７及びＨ５５３）及びグルタミン酸／アスパラギン酸残基（Ｄ３８７、触媒性のＥ４２４、Ｅ４２５及びＤ４５３）、並びに水分子に配位する２個の亜鉛原子を含んでいる。Ｈ１０ ＦＮ３ドメイン（配列番号：４１）の構造は、残基２〜９２を含む。Ｈ１０残基の番号付けは、配列番号：４１に従い連番で付けられる。ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基の番号付けは、配列番号：１４１のｃｙｎｏ ＰＳＭＡ配列の完全長に従い付けられる。成熟ｃｙｎｏＰＳＭＡ（シグナルペプチドを有さない）は、配列番号：１４１の残基４４から始まる。
【0222】
それぞれのＰＳＭＡサブユニットに結合した１つのＨ１０ ＦＮ３ドメインを有する非対称ユニットには、１つのｃｙｎｏＰＳＭＡホモ二量体が存在する（図２Ａ）。ＰＳＭＡサブユニット内の全同価原子の重ね合わせにおける０．７２Åの根平均二乗偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）によって示されるように、２組のＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ複合体は、構造的に非常に類似している。また、ヒトＰＳＭＡとカニクイザルＰＳＭＡとの間には高度な構造類似性がある。ＦＮ３ドメイン複合体内のｃｙｎｏＰＳＭＡ分子と非結合ヒトＰＳＭＡ（ＰＤＢコード２ＯＯＴ、１．６Åの解像度における構造）との間の、Ｃα原子の重ね合わせにおける０．５Åのｒ．ｍ．ｓ．ｄ．によって示されるように、ＦＮ３ドメイン結合により生じる大きなコンフォメーション変化はない。興味深い特性は、ＦＮ３ドメインとの相互作用を介したループコンフォメーションの安定化のために、ループ領域５４１〜５４７がカニクイザルタンパク質内でのみ可視であることである。
【0223】
ＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ結合部位は、２Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃ電子密度マップによりはっきりと規定され、結合残基の確実な位置決めが可能となる。Ｂ鎖とＣ鎖（それぞれＰＳＭＡドメイン鎖、ＦＮ３ドメイン鎖）との間の相互作用についてのみ、次のセクションで説明する。
【0224】
Ｈ１０ ＦＮ３ドメインは、ＰＳＭＡ活性部位に近い領域に結合し（図２Ａ）、約１，１７０Å２のｃｙｎｏＰＳＭＡ領域を覆う。とりわけ、ＦＮ３ドメインは、図３及び図４に示すとおり、プロテアーゼドメイン（Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｋ４９９−Ｐ５０２、Ｐ５０４、Ｒ５１１、Ｋ５１４、Ｎ５４０−Ｅ５４２及びＮ５４４−Ｆ５４６）、アピカルドメイン（残基Ｒ１８１）及びヘリカルドメイン（残基Ｋ６１０、Ｎ６１３及びＩ６１４）において、ｃｙｎｏＰＳＭＡ残基を認識する。
【0225】
ＦＮ３ドメイン４本鎖βシートの表面は、ＣＤループを活性部位の入口へと深く挿入させた状態で、ＰＳＭＡ表面上を包み込む（図２Ｂ及び図２Ｃ）。具体的には、ＰＳＭＡ結合に関わるＨ１０ ＦＮ３ドメイン残基は、Ｃ（Ａ３２及びＧ３４）、Ｄ（Ｖ４６）、Ｆ（Ｇ６４、Ｐ６８、Ｙ７０及びＡ７２）及びＧ（Ｓ８４−Ｉ８６）βストランド、並びにＣＤループ（Ｗ３６、Ｗ３８−Ｄ４１、Ｅ４３及びＡ４４）及びＦＧループ（Ｗ７９、Ｆ８１及びＰ８２）に位置する。残基Ｄ３９、Ｄ４０、Ｄ４１及びＥ４３は、ＦＮ３ドメインのＣＤループに負電荷を付与し、これら残基は、基質がファネルに入ること及びＰＳＭＡの酵素活性を妨げるように、活性部位内の亜鉛イオンとなる正に荷電したファネルへと約２０Åの深さで挿入される（図２Ｂ及び図２Ｃ）。しかしながら、ＦＮ３ドメインは、亜鉛イオン又はその配位残基と直接相互作用することはない。
【0226】
保存ＰＳＭＡ残基Ｗ５４１、Ｙ４６０、Ｆ４８８、Ｐ５０２及びＰ５０４は、結合部位間において、ＦＮ３ドメイン残基Ｗ３６、Ｐ６８、Ｙ７０、Ｗ７９、Ｆ８１及びＰ８２と芳香族クラスターを形成する（図３Ａ）。保存残基Ｒ５１１は結合部位と水素結合Ｙ７０との中心位置に存在し、ＦＮ３ドメイン４本鎖βシートの中心残基である。図３Ｂは、パラトープ及びエピトープ残基の略画を示す。
【0227】
ヒトＰＳＭＡ及びカニクイザルＰＳＭＡは９７％同一であり、Ｈ１０と相互作用する全ての残基（Ｓ６１３Ｎ変異を除く）は、２種間において保存されている（図４）。Ｓ６１３Ｎ変異はｃｙｎｏＰＳＭＡ内でのＮ６１３のグリコシル化をもたらし、ヒト酵素中には存在しない、炭水化物とＦＮ３ドメイン残基（Ｅ６６、Ｉ８６、Ｔ８８）（Ｆ及びＧβストランド）との間のファンデルワールス接触が得られる。
【0228】
コンジュゲート用のＦＮ３ドメイン残基ＰＳＭＡの結合又はＦＮ３ドメインのフォールディングを阻害させずに小分子（毒性搭載物）をコンジュゲートさせるため、結合部位の外側にある種々のＨ１０ ＦＮ３ドメイン残基を改変することができる。Ｃ末端（Ｈｉｓタグの後ろ）及び位置Ｒ１１、Ｅ５３及びＫ６２に、システインを既に配置し搭載物にコンジュゲートした。これら変異の全ては、同様に強力な細胞傷害性を示した。加えて、ＢＣループ内の残基Ｔ２２、Ｄ２５及びＡ２６、末端残基Ｎ６、並びにＤＥループ内のＳ５２は、変異誘発に続く化学的コンジュゲートのための潜在的に良好な部位である（図５）。溶媒に曝されたこれらの残基は、ＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ界面から離れて構造的に柔軟な領域に配置される。
【0229】
更に、Ｎ末端領域及びＣ末端領域の両方は、その他タンパク質ドメインと融合しない。Ｎ末端はＰＳＭＡプロテアーゼドメインの方向に向けられ、融合リンカーと接触させることができる。一方で、接触可能なＣ末端もまた、ＰＳＭＡヘリカルドメインの方向に向いている。ＦＮ３ドメイン融合パートナーとの最適リンカー長は、標的分子上の融合パートナーの構造及び結合部位の位置によって決まる。
【0230】
作用機序Ｈ１０ ＦＮ３ドメインは、搭載物（毒性小分子、核酸など）をＦＮ３ドメイン／ＰＳＭＡ複合体の内部移行により前立腺がん細胞へと送達する際の標的候補である。更に、Ｈ１０ ＦＮ３ドメインは、多重特異性フォーマットの場合、免疫細胞を前立腺がん細胞へと再指向させる際の候補である。
【0231】
Ｈ１０ ＦＮ３ドメインはまた、ＰＳＭＡの酵素活性を阻害するものと考えられ、それにより細胞適応度及び細胞生存率の低下がもたらされ得る。ＦＮ３ドメイン／ｃｙｎｏＰＳＭＡ構造は、活性部位の入口に結合したＦＮ３ドメインを示し、それにより、結合部位における立体遮断及び直接競合による基質のＰＳＭＡとの相互作用が阻害され得る。
【0232】
実施例８：別の抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン変異体の作製選択抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを更に改変し、親ＦＮ３ドメインの特性を向上させた。それから、上記のライブラリを用いてＰＳＭＡに結合するＦＮ３ドメインを作製し、ＰＳＭＡへの結合性を試験した。
【0233】
表１６は、作製した分子のアミノ酸配列を示す。
【0234】
【表16-1】
【0235】
【表16-2】
【0236】
【表16-3】
【0237】
【表16-4】
【0238】
実施例９：蛍光染料にコンジュゲートした抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いた、腫瘍細胞におけるＰＳＭＡ発現の検出本実施例は、蛍光染料にコンジュゲートした抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いた、細胞上に存在するＰＳＭＡの検出について示す。アミノ酸５３に遊離システインを有する、Ｃ末端にＨｉｓタグを付加した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（配列番号：４９）を、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｐｒｏｚｙｍｅ ｃａｔａｌｏｇ＃ＰＢ３１）にコンジュゲートした。スルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ ｃａｔａｌｏｇ＃２２１２２）を用いてＰＥを６０分間活性化させ、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５及びＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、活性化させたＰＥを遊離スルホ−ＳＭＣＣから分離した。ＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．＃６４６５４７）を用いて、ＦＮ３ドメインを３０分間還元した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５及びＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより、還元したＦＮ３ドメインを遊離ＴＣＥＰから分離した。活性化させたＰＥを還元したＦＮ３ドメインに９０分間共有結合させ、続いて、Ｎ−エチルマレイミド（Ｓｉｇｍａ ｃａｔａｌｏｇ＃０４２６０）を用いて２０分間反応を停止させた。ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）に取り付けたＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ硫酸ナトリウム、０．０５％アジ化ナトリウム、ｐＨ６．５）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、「ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメイン」を精製した。
【0239】
フローサイトメトリー及びＣｅｌｌＳｅａｒｃｈの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）アッセイにおいて、ＰＳＭＡに対して陽性及び陰性を示す細胞株を用い、ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインの感度及び特異性を試験した。次の前立腺細胞株：ＬＮＣａＰ（ＰＳＭＡ高発現）、２２Ｒｖ１（ＰＳＭＡ低発現）及びＰＣ３（ＰＳＭＡ発現なし）をＡＴＣＣから購入し、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの特異性を確認するために使用した。
【0240】
フローサイトメトリーを用いた、細胞株におけるＰＳＭＡの検出標準的な細胞培養法を用いて、前立腺細胞株を回収した。ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインを含む０．１ｍＬのＰＢＳ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有）中で、細胞（約３０，０００）を２０分間染色した。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（クローンＬＮＩ−１７ ｃａｔａｌｏｇ ＃ ３４２５０４）の抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥコンジュゲートを、陽性コントロールとして用いた。インキュベート後、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液（３ｍＬ）を加え、非結合ＰＥコンジュゲートを遠心分離（８００ｇ、５分間）により除去した。上清を吸引し、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．３ｍＬ）中に細胞を再懸濁させた。サンプルをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。それぞれの細胞株におけるＰＳＭＡ染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、抗ＰＳＭＡ抗体のＭＦＩと比較した。ＭＦＩは、ＰＳＭＡ高発現細胞株由来の高いＭＦＩを有するＰＳＭＡの発現レベルと直接関連している。図６は、抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥのＭＦＩ値と比較した、抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインで検出された異なる細胞株におけるＭＦＩ値を示す。
【0241】
結果は、抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインが、ＰＳＭＡ陽性細胞株に結合し、ＰＳＭＡ陰性細胞には非特異的に結合しないことを示している。ＭＦＩは、予想どおり、ＰＳＭＡ低発現細胞株（２２Ｒｖ１）の低いＭＦＩと比較して、ＰＳＭＡ高発現細胞株（ＬＮＣａＰ）で高い。ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３）のＭＦＩは、バックグラウンドシグナルに近い。更に、ＦＮ３ドメイン−ＰＥの異なる細胞株への結合特性は、抗ＰＳＭＡ抗体−ＰＥと類似しており、ＦＮ３ドメインコンジュゲート及び抗体コンジュゲートの両方において同様のＭＦＩ値が得られた。本実施例は、抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインが、腫瘍細胞上のＰＳＭＡ検出において感度及び特異性を有していることを示す。
【0242】
循環腫瘍細胞アッセイを用いた、ＰＳＭＡの検出ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイで抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインを試験し、７．５ｍＬの血液中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を検出し数えることにより、上記の結果について更に確認した。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨシステム（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いた循環腫瘍細胞の計数は、製造業者のプロトコル及びトレーニングに従い行った。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈアッセイでは、捕捉用に、磁性粒子（強磁性流体）にコンジュゲートした抗ＥｐＣＡＭを用い、またＣＴＣの可視化用に、フルオレセインにコンジュゲートしたサイトケラチン（８、１８及び１９）に特異的な抗サイトケラチンを用いる。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイでは、サンプル調製用にＡｕｔｏＰｒｅｐを用い、解析用にＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ（登録商標）（ＣＴＡ ＩＩ）を用いる。ＣＴＡ ＩＩは４色の半自動蛍光顕微鏡であり、ＣＴＣを同定して数えるために３色を用いる。ＣＴＡ ＩＩの４番目の色は、別の目的マーカーを有するＣＴＣの表現型に用いることができる。本実施例では、組織培養した腫瘍細胞を正常血液にスパイクし、血液中のＣＴＣをミミックした。約５００個の腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ、２２Ｒｖ１、ＰＣ３又はＳＫＢＲ３細胞）を、ＣｅｌｌＳａｖｅチューブ（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に採取した正常ドナーの血液（７．５ｍＬ）にスパイクした。ＰＳＭＡ陰性細胞株として、乳がん細胞株（ＳＫＢＲ３）もまた用いた。ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ ＣＸＣキット、及びマーカーとしての抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインを用いたＡｕｔｏＰｒｅｐでサンプルを処理した。ＡｕｔｏＰｒｅｐサンプル調製システムでは、抗ＥｐＣＡＭ強磁性流体を用いて腫瘍細胞を捕捉することにより、腫瘍細胞を濃縮する。有核細胞を同定するために、ＣＴＣを濃縮したサンプルを核酸染料（ＤＡＰＩ）で染色し、腫瘍細胞を同定するために、抗サイトケラチン抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートし、また白血球を同定するために、抗白血球抗体をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）にコンジュゲートした。サンプルを最終容量０．３２ｍＬに処理してから、サンプルチャンバ、更にはＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）細胞提示デバイスの内部へと移した。ＭａｇＮｅｓｔ（登録商標）デバイスは、ＣＥＬＬＴＲＡＣＫＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩ（登録商標）で解析するための磁気的に標識した細胞を提供する。ＣＴＡ ＩＩを用いてサンプルを解析しＣＴＣを計数して、ＣＴＣ上のＰＳＭＡを検出した。解析装置は自動的にサンプルを解析し、確認用のサムネイル画像で、ＤＡＰＩ及びサイトケラチンに対して陽性を示す候補腫瘍細胞を提示する。抗ＰＳＭＡ ＰＥコンジュゲートＦＮ３ドメインで染色した腫瘍細胞のＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨアッセイでの結果を、図７に示す。
【0243】
図７ＡはＬＮＣａＰ腫瘍細胞におけるＰＳＭＡの発現を示し、これら細胞の１００％はＰＳＭＡに対して陽性である。ＰＳＭＡ低発現細胞株（２２Ｒｖ１）は、ＰＳＭＡに対して２６％陽性である（図７Ｂ）。また一方で、ＰＳＭＡ陰性細胞株（ＰＣ３−９及びＳＫＢＲ３）はＰＳＭＡに対して陰性である（図７Ｃ及び図７Ｄ）。これらの結果は、フローサイトメトリーの結果と一致する。本実施例は、抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインを用いてＣＴＣにおけるＰＳＭＡの発現を検出可能であること、更に抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインの感度及び特異性を確認可能であることを示す。
【0244】
実施例１０：抗ＣＤ３ Ｆａｂの結晶構造ＳＰ３４ Ｆａｂの結晶構造を、２．１Å解像度で決定した。完全なアミノ酸配列が明らかにされ、ＳＰ３４ ｍＡｂが得られる可能性のあるマウス生殖細胞系が特定された。構造を用いてヒトフレームワーク適合を誘導した。
【0245】
材料ＳＰ３４ ｍＡｂであるマウスＩｇＧ３／ラムダアイソタイプを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．５５６６１１）から購入した。技術データシートに従って、同アイソタイプを、親和性クロマトグラフィーにより組織培養上清から精製し、４℃で保存した。Ｆａｂフラグメントを、ｍＡｂ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ ＃ ４４９８５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）のパパイン消化により生成し、Ｎａｂ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｐｌｕｓ Ｓｐｉｎカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃４４９８５，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用し、製造業者のプロトコルに従って、Ｆｃから分離した。Ｆａｂを、２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．５（緩衝液Ａ）で平衡化したＭｏｎｏＳカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で更に精製した。緩衝液Ａで、５０カラム体積において、１Ｍ ＮａＣｌの１３〜２８％グラジエントで溶出を行った。主なピークに対応する画分をプールし、９．２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、結晶化に使用した。
【0246】
結晶化Ｏｒｙｘ４ロボット（Ｄｏｕｇｌａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）及びＭｏｓｑｕｉｔｏロボット（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いた蒸気拡散法により、２０℃で結晶化を行った。実験は、９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ ３５５０プレートにおいて、シッティングドロップ形式で、等しい体積のタンパク質及びリザーバ溶液で構成された。初期スクリーニングは、ＰＥＧキット（Ｑｉａｇｅｎ）、並びに自社製スクリーンＩＨ１及びＩＨ２を用いて行った。ＩＨ２スクリーンでの初期スクリーニング後に得られたＦａｂシードを用いたＭＭＳ最適化により、種々の条件下における多数の結晶を作製した。Ｘ線解析に用いるＦａｂ結晶を、１２％ ＰＥＧ ３３５０、０．２Ｍ Ｋ／Ｎａ酒石酸（ｐＨ７．４）、３％イソプロパノール、及び３％ジオキサン（緩衝液なし）から得た。結晶データを表１７に示す。
【0247】
【表17】
【0248】
Ｘ線データ収集及び構造決定Ｘ線データ収集のために、１つの結晶を、２０％グリセロールを補足した母液中に数秒間浸し、液体窒素中で瞬間冷凍した。回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）ＩＭＣＡビームラインで、Ｐｉｌａｔｕｓ ＣＣＤ検出器を使用して収集した。０．５°の像毎に０．５秒露光で１８０°の結晶回転にわたり回折強度を検出し、ＸＤＳプログラムを用いて処理した［Ｋａｂｓｃｈ Ｗ．２０１０．ＸＤＳ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６６：１２５〜１３２．］。Ｘ線データの統計値を表１７に示す。
【0249】
マウス抗Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原抗体Ｊａａ−Ｆ１１（ＰＤＢ ３ｇｎｍ）から構築されたＦａｂモデルを使用する分子置換により構造を解いた。Ｊａａ−Ｆ１１は、ＩｇＧ３／カッパアイソタイプである。全ての結晶学的計算を、ＣＣＰ４プログラムスーツ［１９９４，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：７６０〜７６３．］により行った。プログラムＣＯＯＴ［Ｅｍｓｌｅｙ Ｐ，ａｎｄ Ｃｏｗｔａｎ Ｋ．２００４．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ６０：２１２６〜２１３２．］を使用して、モデル調節を行った。精密化統計値を表１７に示す。
【0250】
生殖細胞系の情報を用いて、ＳＰ３４の配列決定を行った。Ｘ線データにより、いくつかの体細胞変異の同定に加え、ＣＤＲ−Ｈ３の全配列（生殖細胞系の一部ではない）の同定が可能となった。水素結合ネットワーク及び原子のＢ因子（場合により、原子Ｃ、Ｎ及びＯ間で異なり得る）を基準にして、割り当てＤ／Ｎ、Ｅ／Ｑ、Ｔ／Ｖのアンビギュイティについて可能なものは全て解析した。
【0251】
ＶＬの４０、９７及び９８位、並びにＶＨの３５、５５、５６、５７及び８０位における体細胞変異を同定した。
【0252】
予想どおり、Ｆａｂ構造内に５ヵ所のジスルフィドが観察された（軽鎖内の２２〜９０及び１３７〜１９６、重鎖内の２２〜９８及び１５２〜２０７、並びに鎖間ジスルフィドの２１４（Ｌ）−１４０（Ｈ））。
【0253】
結晶内Ｆａｂ間の相互作用結晶内において、Ｆａｂ分子は、一方のＦａｂのＣＤＲがもう一方の重鎖のＣ末端部分と結合するように頭尾結合で束ねられている。Ｃ末端は、ＶＬとＶＨとの間にある深い凹部にデッドエンド方式で収まる。Ｓ２３０の末端カルボキシル基は、ＶＨのＮ３５及びＲ５０並びにＶＬのＷ９８と水素結合を形成する。これにより、余分な残基のための空間が残らず、ｍＡｂのパパイン開裂がヒンジ領域のＳ２３０とＴ２３１との間で生じたことを示す。
【0254】
推定上のパラトープ本発明の構造中のＣＤＲコンフォメーション、及び上記のＣ末端認識様式により、抗原結合に最も関与しやすい残基の選択が可能となる。それら残基としては、以下のものが挙げられる。
ＣＤＲ−Ｌ１：Ｙ３４、ＣＤＲ−Ｌ２：なし、ＣＤＲ−Ｌ３：Ｗ９３、
ＣＤＲ−Ｈ１：Ｔ３１、Ｙ３２及びＡ３３、ＣＤＲ−Ｈ２：Ｒ５０、Ｒ５２、Ｙ５５及びＮ５６、並びに、ＣＤＲ−Ｈ３：Ｎ１０３、Ｇ１０５、Ｓ１０７、Ｙ１０８及びＳ１１０。
【0255】
相互作用の大部分は、主にＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３が寄与するＶＨにおいて生じやすい。
【0256】
ＩＧＨＧ３＿マウス（マウスＩｇＧ３、アイソフォーム２）由来の残基２３１〜４５５を有する、ＳＰ３４の配列（配列番号：１６０及び１６１）を図８に示す。
【0257】
実施例１１：抗ＣＤ３抗体ＳＰ３４のヒトフレームワーク適合抗ＣＤ３マウス抗体ＳＰ３４を、ヒトフレームワーク適合法（Ｆｒａｎｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ，ＪＭＢ，２０１０）によりヒト化した。４種類の重鎖を、３種類の異なる軽鎖と組み合わせて、１２個のヒト化変異体を生成した。
【0258】
ＳＰ３４のヒト化及び親和性成熟ヒト生殖細胞系の選択
ヒトフレームワーク適合（ＨＦＡ）法［１６］を用いてＳＰ３４をヒト化した。４つのヒト重ｖ領域及び３つの軽ｖ領域配列のマトリクスを、試験のために選択した。ヒト生殖細胞系の選択は、フレームワーク領域（ＦＲ）における、ＳＰ３４に対する全体的な配列類似性のみに基づいた。ＣＤＲ配列も、その長さ又は標準構造も、この選択には考慮しなかった。
【0259】
重鎖について最も近いマッチは、ヒトＧＬ ＩＧＨＶ３−７２及びＩＧＨＶ３−７３である。ヒトＢ細胞レパートリーにおけるその高い発生頻度のために、別のＧＬであるＩＧＨＶ３−２３を選択した。
【0260】
軽鎖について最も近いマッチは、ヒトラムダＧＬ ＩＧＬＶ７−４３（ａｋａ ７ａ）、ＩＧＬＶ７−４６（ａｋａ ７ｂ）、及びＩＧＬＶ１−５１（ａｋａ １ｂ）である。ＩＧＬＶ７−４６は、仮想的にＩＧＬＶ７−４３と同一であるが、２位におけるＡｌａの利点を有する、すなわち、ＳＰ３４におけるのと同様である。
【0261】
選択されたＪ領域は、下記：重鎖に対してＩＧＨＪ１、ラムダ軽鎖に対してＩＧＬＪ３である。
【0262】
逆突然変異ＳＰ３４の結晶構造を基準として、ＨＦＡ変異体モデルを構築した。モデルにより、ＶＬ内の、電位が一致しないいくつかのＦＲ位置が明らかとなり、最も顕著な位置は、Ｖａｌ３８、Ｇｌｙ４８及びＧｌｙ５１である（図９）。ＣＤＲ−Ｈ３のコンフォメーションを維持させるために、マウス残基は、３つの位置（ａｋａ「逆突然変異」）全てにおいて保持される必要がある。これら突然変異を、成熟計画に加えた。
【0263】
重鎖の５７位におけるＡｓｎは、この構造における良好な側鎖密度を有さない。同Ａｓｎはまた、ＣＤＲ−Ｈ２の中間に位置し、典型的な結合部位から離れて位置している。この分析に基づいて、同Ａｓｎは、結合に有意に影響し得ない。加えて、骨格の幾何形状は、ＲａｍａｃｈａｄｒａｎプロットにおけるＧｌｙ残基に最も好ましい領域にある。このため、同Ａｓｎを、必須のフレキシビリティを実現し、（非グリシン関連位置構造歪みを減少させることにより）安定性を潜在的に改善する一方で、結合性に影響を及ぼさないために、成熟計画において、Ｇｌｙにトランケートした。
【0264】
親和性成熟設計に関して検討された、いくつかの他の考察が存在した。まず、ヒトＧＬ ＩＧＬＶ７−４６及びＩＧＬＶ７−４３は、望ましくない酸化電位を有する５９位にＴｒｐを導入する。２つの他のＧＬは、この位置にＧｌｙを有する。このＧｌｙは、マウス配列に対応する。したがって、Ｇｌｙ５９を、ＩＧＬＶ７−４６及びＩＧＬＶ７−４３の両方の変異体において保持した。最後に、ＶＨの４９位におけるＡｌａは必須である。また、９９位における残基（ＳＰ３４ではＶａｌ）は、抗原結合性に影響を及ぼし得る。これらの位置を試験するために、逆突然変異を、一部の変異体に導入した（図１０）。
【0265】
ＨＦＡマトリクスＨＦＡマトリクスは、４つのＶＨ変異体及び３つのＶＬ変異体から構成される（図１０）。ＨＦＡの目的のために、ＡｂＭ ＣＤＲ定義を用いる（短いＣＤＲ−Ｈ２、長いＣＤＲ−Ｌ１）。
【0266】
ＶＨについての変異体：ＣＤ３Ｈ１４１（配列番号：１６３）：マウスＣＤＲ＋Ｇｌｙ４９Ａｌａを有するＩＧＨＶ３−７２＊０１
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0267】
ＣＤ３Ｈ１４２（配列番号：１６４）：マウスＣＤＲ＋Ｓｅｒ４９Ａｌａを有するＩＧＨＶ３−２３＊０１ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0268】
ＣＤ３Ｈ１４３（配列番号：１６５）：マウスＣＤＲ＋Ｓｅｒ４９Ａｌａ、Ａｌａ９９Ｖａｌを有するＩＧＨＶ３−２３＊０１ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0269】
ＣＤ３Ｈ１４４（配列番号：１６６）：マウスＣＤＲ＋Ａｓｎ５７Ｇｌｙを有するＩＧＨＶ３−７３＊０１ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＧＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0270】
ＶＬについての変異体：ＣＤ３Ｌ６３（配列番号：１６７）：マウスＣＤＲ＋Ｆ３８Ｖ、Ａ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇ、Ｗ５９Ｇを有するＩＧＬＶ７−４６＊０１
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0271】
ＣＤ３Ｌ６４（配列番号：１６８）：マウスＣＤＲ＋Ｙ３８Ｖ、Ｌ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇを有するＩＧＬＶ１−５１＊０１ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＬＰＧＴＡＰＫＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0272】
ＣＤ３Ｌ６６（配列番号：１６９）：マウスＣＤＲ＋Ｆ３８Ｖ、Ａ４８Ｇ、Ｙ５１Ｇ、Ｗ５９Ｇを有するＩＧＬＶ７−４３＊０１ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0273】
表１８ ＣＤ３の重鎖及び軽鎖のマトリクス（全て、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌを含有するＩｇＧ１−ＡＡ Ｆｃにより調製）
【0274】
【表18】
【0275】
アミノ酸配列を、ＤＮＡに逆翻訳させ、遺伝子合成手法（米国特許第６，６７０，１２７号、米国特許第６，５２１，４２７号）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、重鎖（ＨＣ）ｖ領域を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ変異を含有するヒトＩｇＧ１−ＡＡ Ｆｃ上にサブクローニングした。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、軽鎖（ＬＣ）可変領域を、ヒトラムダ（λ）定常領域上にサブクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にトランスフェクションし、ｍＡｂを発現させた。プロテインＡカラム（ｈｉＴｒａｐ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法により精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２内へ透析した。
【0276】
【表19-1】
【0277】
【表19-2】
【0278】
配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４３を作製した。配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４４を作製した。配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４６を作製した。配列番号：１６４のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４７を作製した。配列番号：１６４のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１４８を作製した。配列番号：１６４のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５０を作製した。配列番号：１６５のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５１を作製した。配列番号：１６５のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５２を作製した。配列番号：１６５のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５４を作製した。配列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１６７のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５５を作製した。配列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１６８のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５６を作製した。配列番号：１６６のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＦ４０５Ｌ置換を有するＩｇＧ１定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体ＣＤＢ１５８を作製した。
【0279】
実施例１２：初代Ｔ細胞に対するヒト化抗ＣＤ３ヒットの内因性細胞結合抗ＣＤ３抗体の得られたパネルを、初代ヒトＴ細胞上の細胞表面ＣＤ３εに対する結合性について試験した。この試験を行うために、ポリクローナル抗ヒト二次抗体を使用して、発現上清からの抗体の結合を可視化し、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔に、細胞表面ＣＤ３εに対する抗ＣＤ３抗体の結合性を、陰性選択により精製された初代ヒトＴリンパ球（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ，Ｃｏｌｍａｒ，ＵＳＡ）を使用するフローサイトメトリーにより評価した。発現上清又は精製抗体をそれぞれ培地又はＦＡＣＳ緩衝液（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）中において１０μｇ／ｍＬに正規化した。２×１０５個の細胞を、９６ウェル丸底プレート（ＣｏＳｔａｒ）のウェルに、標識化のためにアリコートした。発現上清中の抗体を、細胞に加え、４℃で４５分間インキュベートした。１３００ｒｐｍで３分間の遠心分離及び上清の除去後、５０μＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７二次抗体（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を、終濃度１０μｇ／ｍＬで、４℃において、直接光を避けて、細胞と共に３０分間インキュベートした。続けて、洗浄し、３０μＬのＦＡＣｓ緩衝液（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁させた。サンプル収集を、ＦｏｒｅＣｙｔソフトウェアを使用するＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨＴＦＣシステムにおいて行った。結合分析の前に、緑色又は赤色のｆｉｘａｂｌｅ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）と、前方／側方散乱面積及び高さパラメータをそれぞれ使用して、生きた単一の細胞をゲーティングした。平均蛍光強度値を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ５においてグラフ化した。
【0280】
滴定系列をランしたが、中間濃度を、明確性のために、図１３に表わす。治療抗体として、同一のＦｃ領域を有する２つの自社製ファージ由来抗体；Ｇ１１（ＨＣ配列番号：１７６、ＬＣ配列番号：１７７）（非ｃｙｎｏ交差反応性、アゴニスト抗体を、陽性コントロールとして使用した）、及びＣＤ３Ｂ９４（ＨＣ配列番号：１７８、ＬＣ配列番号：１７９）（非バインダー／非アゴニスト抗体を、非特異的結合を評価するのに使用した）を、コントロールとして使用した。市販のＳＰ３４抗体を、このアッセイでは比較対象として使用しなかった。ＳＰ３４抗体は、マウス抗体であり、異なる二次検出試薬の使用は、試験された変異体との直接的な比較を妨げるであろうためである。
【0281】
データから、ヒト化抗ＣＤ３ヒットのパネル内での結合可能性のアレイが証明される。ここで、２つの抗体（ＣＤ３Ｂ１４４、ＣＤ３Ｂ１５２）は、ヒトＴ細胞に対する結合性の完全な損失を示す。残りの抗体は、任意の閾値としてＧ１１結合を使用して強いバインダーと弱いバインダーとに広く分割され得る結合可能性の範囲を示した。これらのパラメータを使用して、７つの強いバインダーと、７つの弱いバインダーとを、変異体のパネルから特定した（図１３）。
【0282】
それから、初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗ＣＤ３ヒットの結合性解析を、交差反応性の保持を評価するために試験した。カニクイザルの末梢血から精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｚｅｎ Ｂｉｏ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を使用した。アッセイプロトコルは、上記されたものと同様とした。Ｇ１１は、カニクイザルＣＤ３ε（ＣＤ３Ｂ１２４）と交差反応しないため、マウスフレームワーク及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃを有するＳＰ３４のＶＨ及びＶＬを有する自社製キメラＳＰ３４由来抗体を、このアッセイにおける陽性コントロールとして使用した（図１４）。興味深いことに、複数の変異体が、ヒト細胞について見られた結合可能性と比較して、低下した結合可能性を示した。これには、強いバインダーであるＣＤ３Ｂ１５０、ＣＤ３Ｂ１５１、及びＣＤ３Ｂ１５４が含まれ、結合性が低下した。複数の弱いバインダーは、もはや、バックグラウンドを上回って結合を検出することができなかった。結合性のこの損失は、特定の免疫グロブリン鎖に関係しなかった。このことは、重鎖と軽鎖との組み合わせが、交差反応性の損失において役割を果たすことを示唆している。まとめると、これらのアッセイにより、ヒトＣＤ３εとカニクイザルのＣＤ３εとの間での種間交差反応性を保持した変異体の特定が可能となった。
【0283】
実施例１３：初代Ｔ細胞におけるヒト化抗ＣＤ３ヒットの機能性解析結合性分析により、ヒト化抗ＣＤ３ヒットのパネルが、ヒト及びカニクイザルＴ細胞に対する結合可能性の範囲を示したことが証明された。ＣＤ３ε架橋を介して活性化を誘引する各変異体の能力を調査するために、初代Ｔ細胞を、ビーズコンジュゲート抗体の存在下において、一晩培養した。翌日、細胞を回収し、抗ＣＤ６９抗体で標識し、活性化を測定した（図１３）。ヒト化抗ＣＤ３抗体を、プロテインＡコート磁性ビーズ（ＳｐｈｅｒｏＴｅｃｈ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ，ＵＳＡ）に、１０μｇ／ｍＬでの抗体と一晩インキュベートすることにより結合させた。翌日、２×１０５個の初代ヒトＴ細胞を、丸底細胞培養プレートに３連で播種し、２×１０５個のコートビーズを加えた。３７℃で一晩培養した後、細胞を回収し、抗ＣＤ６９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（クローンＦＮ５０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識して、この活性化マーカーの上方制御を評価した。サンプルの収集及び分析を、結合性について上記されたように行った。複数の陰性コントロールをランした。同コントロールには、Ｔ細胞単独、Ｔ細胞と非コートビーズ、及びＴ細胞とアイソタイプコントロール（ＣＤ３Ｂ９４）コートビーズが挙げられる。これらは全て、非染色Ｔ細胞と比較して、同様の平均蛍光強度値を示した。このことは、バックグラウンドがこのアッセイにおいて低かったことを示している。複数の陽性コントロールを、比較のためにランした。同コントロールには、ＯＫＴ３（米国特許第５９２９２１２号）及び市販のＳＰ３４−２抗体が挙げられる。
【0284】
それから、ヒト化抗ＣＤ３ヒットを、同一のアッセイにおいて、初代カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｚｅｎ Ｂｉｏ，Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，ＵＳＡ）を活性化するその能力について試験した（図１４）。ＦＮ５０抗ＣＤ６９抗体は、非ヒトタンパク質と交差反応性であると説明されてきたため、これらの細胞の活性化を試験するために使用することができた。
【0285】
ヒト及びカニクイザルでの活性化データは、ヒットのパネルが活性化の可能性の範囲を示した結合データと関連した。数多くの強いバインダーが、市販のＳＰ３４−２と比較して同等又は上回る程度に、ヒトＴ細胞を活性化する能力を示した。複数の変異体は、ＳＰ３４−２と比較して低い活性化可能性を示した。一方、一部のバインダーは、ＣＤ６９刺激の証拠を示さなかった。活性化能がないのは、結合性がないか又は弱い結合性を示した変異体においてのみ見られ、強いバインダーは全て、あるレベルの活性化を示した。このことは、ヒト（図１５Ａ）及びカニクイザル（図１５Ｂ）の両方についての、結合性と活性化との間の相関性を示唆している。
【0286】
実施例１５．ＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａにおける二重特異性フォーマットでの多重特異性抗原結合分子の調製ＣＤ３ ｍＡｂアーム（ＦＮ３ドメイン融合があるもの及びないもの）と、インビトロＦａｂアーム交換（国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載）での単特異性ＰＳＭＡ Ｆｎ３ドメインＦＣ融合とを組み合わせることにより、二重特異性のＰＳＭＡ×ＣＤ３多重特異性抗原結合分子を作製した。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する二重特異性の単離された多重特異性抗原結合分子を作製するために、抗ＣＤ３ ｍＡｂを複数の方向に有する融合タンパク質としての抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン（Ｐ２３３ＦＲ９−Ｈ１０、配列番号：４１）を作製し、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させてＰＳＭＡ発現細胞株へと向けさせるこれらの分子の能力に関して、かかる方向の効果を評価した。
【0287】
ＣＤ３ ｍＡｂ Ｂ２１９の発現単特異性ＣＤ３抗体の１つであるＣＤＢ１４６を、Ｆｃ領域内にＦｃ置換Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ（番号付けは、ＥＵインデックスに従う）を有するＩｇＧ４として発現させた。ＨＥＫ２９３細胞に対して一過性トランスフェクションを行うことにより、単特異性抗体を作製した。
【0288】
配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びに、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＲ４０９Ｋ置換を有するＩｇＧ４定常領域を含む単特異性抗ＣＤ３抗体Ｂ２１９を作製した。単特異性抗ＣＤ３抗体Ｂ２１９は、配列番号：１７０の軽鎖アミノ酸配列、及び配列番号：１７１の重鎖アミノ酸配列を含んでいる。
【0289】
ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合の設計一価のＣＤ３相互作用又は二価のＣＤ３相互作用のいずれか一方を生じさせる構築物を設計した。一価のＣＤ３相互作用としては、Ｂ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ５（配列番号：１７２）、Ｂ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ６（配列番号：１７３）及びＢ２２１（配列番号：１７０及び１７４）×ＣＷ５（配列番号：１７２）があり、二価のＣＤ３相互作用としては、Ｂ２２１（配列番号：１７０及び１７４）がある。同様に、一価のＰＳＭＡ相互作用を生じさせることが可能な分子：Ｂ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ６（配列番号：１７３）及びＢ２１９（配列番号：１７０及び１７１）×ＣＷ５（配列番号：１７２）、又は二価のＰＳＭＡ相互作用を生じさせることが可能な分子：Ｂ２２１（配列番号：１７０及び１７４）及びＢ２２１（配列番号：１７０及び１７５）×ＣＷ５（配列番号：１７２）を設計した。最後のバリエーションは重鎖に関連するＦＮ３ドメインの位置であり、Ｎ末端及びＣ末端の両方を有する融合を作製した。全ての分子において、Ａ（ＧＧＧＧＳ）２リンカー（配列番号：１７５）を、Ｐ２３３ＦＲ９−Ｈ１０と重鎖定常領域との間に導入した。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する設計した単離された多重特異性抗原結合分子の略図を図１６に示す。
【0290】
【表20】
【0291】
アミノ酸配列を、ＤＮＡに逆翻訳させ、遺伝子合成手法（米国特許第６，６７０，１２７号、米国特許第６，５２１，４２７号）を使用して、ｃＤＮＡを調製した。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、タンパク質を発現させた。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、重鎖（ＨＣ）ｖ領域を、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＦ４０５Ｌ変異を含有するヒトＩｇＧ４−ＡＡ Ｆｃ上にサブクローニングした。ＣＭＶプロモータを含む自社製発現ベクターを使用し、標準的な分子生物学的手法を使用して、軽鎖（ＬＣ）可変領域を、ヒトラムダ（λ）定常領域上にサブクローニングした。得られたプラスミドを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にトランスフェクションし、ｍＡｂを発現させた。プロテインＡカラム（ｈｉＴｒａｐ ＭＡｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム）を使用する標準的な方法により精製した。溶出後、プールを、Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．２内へ透析した。
【0292】
抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ５を作製した。当該抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ５は、リンカー（配列番号：１７５）でＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域のＣ末端と連結した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９−Ｈ１０（配列番号：４１）、及び配列番号：１７２を含む融合のアミノ酸配列を含む。抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ６を作製した。当該抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合ＣＷ６は、リンカー（配列番号：１７５）でＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換を有するＩｇＧ４定常領域のＮ末端と連結した抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメインＰ２３３ＦＲ９−Ｈ１０（配列番号：４１）、及び配列番号：１７３を含む融合のアミノ酸配列を含む。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する単離された二重特異性の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３抗原結合分子であるＢ２２１を作製した。当該Ｂ２２１は、重鎖のＣ末端において、リンカー（配列番号：１７５）でＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｐ２３３ＦＲ９−Ｈ１０（配列番号：４１）に結合する抗ＰＳＭＡ単離多重特異性抗原結合分子と融合した、配列番号：１６３のＶＨ及び配列番号：１６９のＶＬを有するＶＨ及びＶＬ領域、並びにＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｆ４０５Ｌ及びＫ４０９Ｒ置換を有するＩｇＧ４定常領域を含む、抗ＣＤ３ ｍＡｂ Ｂ２１９と、配列番号：１７４を含む重鎖及び配列番号：１７０を含む軽鎖によりＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する、抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子のアミノ酸配列と、を含む。
【0293】
表１７に記載の親分子の組み合わせを用いた部分的な還元及び制御されたＦａｂアーム交換により、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原タンパク質（Ｂ２１９×ＣＷ５、Ｂ２１９×ＣＷ６及びＢ２２１×ＣＷ５）に結合する、単離された多重特異性抗原結合分子を調製した。簡潔に、親分子を約１〜２０ｍｇ／ｍＬでモル比１．０８：１（Ｂ２１９／Ｂ２２１：Ｗ５／Ｗ６）で混合し、２−ＭＥＡ（ＰＢＳ中７５０ｍＭの原液）を７５ｍＭの終濃度となるように添加した。反応液を３１℃で５時間インキュベートし、続いてＰＢＳで透析した。それからタンパク質を回収して滅菌濾過し、２８０ｎｍの吸光度で純度及び濃度を測定してから、陽イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【0294】
ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｂ２１９×ＣＷ５に結合する、二重特異性の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子を作製した。当該分子は、配列番号：１６３及び１６９のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を含むＢ２１９抗ＣＤ３重鎖及び軽鎖と対になった配列番号：１７２のアミノ酸配列を含むＣＷ５抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含む。ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原Ｂ２１９×ＣＷ６に結合する、二重特異性の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子を作製した。当該分子は、配列番号：１７１及び１７０のアミノ酸配列を含むＢ２１９抗ＣＤ３重鎖及び軽鎖と対になった配列番号：１７３のアミノ酸配列を含むＣＷ６抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含む。二重特異性の抗ＰＳＭＡ×ＣＤ３単離多重特異性抗原結合分子であるＢ２２１×ＣＷ５を作製した。当該分子は、配列番号：１７４のアミノ酸配列を含むＢ２２１抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン重鎖融合と対になった配列番号：１７２のアミノ酸配列と、配列番号：１７０のアミノ酸配列を含む軽鎖と、を含む、ＣＷ５抗ＰＳＭＡ ＦＮ３ドメイン融合アームを含む。
【0295】
【表21-1】
【0296】
【表21-2】
【0297】
実施例１６：機能性細胞殺傷アッセイを用いた、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する二重特異性の単離された多重特異性抗原結合分子の評価２４時間の標準的なクロム放出アッセイを用いて、ＰＳＭＡ陽性ＬＮＣＡＰ腫瘍標的（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７４０）を殺傷する機能を有するＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する、単離された多重特異性抗原結合分子を決定した。１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３（米国特許第５９２９２１２号）及び２０Ｕ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ Ｃａｔ＃２００−０２）を用いて、正常ドナーの凍結汎Ｔ細胞（Ａｌｌ Ｃｅｌｌｓ Ｃａｔ＃ＰＢ９００−１Ｆ）を１２〜２４時間で予め活性化させた。その後Ｔ細胞を洗浄してから、クロムで標識したＲＰＭＩ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｔ＃ＮＥＺ０３０Ｓ００１ＭＣ）中、エフェクター：標的比率５：１でＬＮＣＡＰ腫瘍標的細胞と共培養した。投与量最大時のウェル内終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように、ＣＤ３抗原及びＰＳＭＡ抗原に結合する単離された多重特異性抗原結合分子を添加した。その後、１：２０希釈溶液を用いた７点の滴定曲線を作製し、１８〜２４時間インキュベートした。培養液の上清を回収し、ガンマカウンターの測定値を読んだ。標的細胞からのクロムの自然放出を制御するために、標的を培地だけで培養してから、上清を回収した。Ｔｒｉｔｉｏｎ−Ｘ−１００を添加して全標的を溶解させ、最大放出を測定した。ガンマカウンターを用いて１分あたりのカウントを収集し、次式を用いて％細胞傷害性を測定した。全てのサンプルに対して３回行った。
【0298】
％細胞傷害性の算出＝（実験カウント−自然放出）（最大放出−自然放出）×１００％。
【0299】
％細胞傷害性をそれぞれに対し３回算出し、３回の％細胞傷害性の平均＋ＳＥＭをプロットする。
【0300】
図１７は、２回の独立した実験における代表的なグラフを示す。データは、Ｂ２１９×ＣＷ６による腫瘍細胞殺傷をもたらすＣＤ３Ｂ２１９×ＰＳＭＡ単離ＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子の全ての構造が最も強力であり、Ｂ２２１及びＢ２１９×ＣＷ５がそれに続くことを示している。以下の表２２は、単離されたＣＤ３×ＰＳＭＡ二重特異性抗原結合分子のそれぞれに対するＥＣ５０、これらＥＣ５０の９５％信頼区間、及びＲ二乗値を示している。
【0301】
【表22】
【0302】
実施例１７：ＰＢＭＣヒト化ＮＳＧマウスを用いたＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ異種移植片の腫瘍化抑制における、Ｍａｂｔｙｒｉｎ Ｂ２１９×ＣＷ６の抗腫瘍効果雄ＮＳＧマウスに播種したヒトドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡヒト異種移植片の腫瘍化抑制（予防モデル）により、Ｂ２１９×ＣＷ６の効果を評価した（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。腫瘍細胞移植の７日前（−７日目）に、外側尾静脈から、１×１０７個のヒトＰＢＭＣをマウスに静注（ｉｖ）した。０日目に、１×１０７個のＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ細胞をマウスの右後脇腹に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍移植の初日に、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ（２５ｇマウスあたり、それぞれ０．１μｇ、１μｇ及び１０μｇに相当）でＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）コントロール及びＢ２１９×ＣＷ６を静注投与し、１日おきから２日おきに、０日目、３日目、５日目、７日目及び１０日目にトータルで５回の投与を行った。
【0303】
腫瘍容積を、次式：腫瘍容積（ｍｍ３）＝（ａ×ｂ２／２）（式中、「ａ」はノギス測定により求められた腫瘍の長さを表し、「ｂ」はノギス測定により求められた腫瘍の幅を表す）を用いて算出し、試験中、週２回モニターした。腫瘍増殖抑制率（ＴＧＩ）を、治療群の平均腫瘍容積とコントロール群（ＰＢＳ）の平均腫瘍容積との間の差と定義し、ＴＧＩ＝［（（ＴＶｃ−ＴＶｔ）／ＴＶｃ）＊１００］（式中、ＴＶｃは、任意のコントロール群における平均腫瘍容積であり、ＴＶｔは、治療群における平均腫瘍容積である）を用いて算出した。ＮＣＩ基準で定義されるように、≧６０％ ＴＧＩは生物学的に有意と考えられている（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＪＩ，ｅｔ ａｌ（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４（１０）：１４２４〜３１）。最大腫瘍容積が１５００ｍｍ３に達したとき、動物を試験から除外した。
【0304】
ヒトＰＢＭＣの移植は最終的に、マウスの移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらす。この場合、移植されたドナーＴ細胞は活性化され、宿主組織に浸潤し、体重減少及び臓器不全をもたらし、必然的に死亡する。ＧＶＨＤの発症及び重症度をモニターするために、体重を１週間に２回記録し、グラム（ｇ）単位で表した。体重変化率を、次式：体重変化＝［（（Ｂｔ Ｂ０）／Ｂ０）＊１００］（式中、Ｂｔは、試験の任意の日における体重であり、Ｂ０は、治療開始時の体重である）を用いて算出した。当初の体重に対し２０％超の体重減少を維持した動物は瀕死であるとみなされ、試験から除外した。
【0305】
Ｄｕｎｎｅｔｔ多重比較検定（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６）を使用）を利用した、多重比較１−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて、統計的有意性を評価した。指定した試験用の別の統計解析法は、実験ノートに記載されている。
【0306】
全インビボ試験は、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従って行い、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒ ＆ Ｄ（Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ，ＰＡ）により承認された。
【0307】
Ｂ２１９×ＣＷ６ Ｍａｂｔｙｒｉｎ治療により、腫瘍化が効果的に遅延し、移植したＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ細胞の腫瘍増殖を阻害した（図１８）。小さいが触知可能なＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ腫瘍は、試験１６日目（最後の治療処置から６日後）のＰＢＳ治療群におけるマウスの８匹中７匹で検出可能であった。それに対し、ＣＤ３Ｂ２５０（０．４ｍｇ／ｋｇ）治療群のマウス全８匹において腫瘍は見られなかった。Ｂ２１９×ＣＷ６（０．０４ｍｇ／ｋｇ）治療群のマウスでは、８匹中２匹が触知可能な腫瘍を有し、Ｂ２１９×ＣＷ６（０．００４ｍｇ／ｋｇ）群マウスでは、８匹中１匹が小さな腫瘍を有していた。各群あたり依然として７匹又は８匹いる状態で、治療終了から３２日後（腫瘍移植後４２日目）に腫瘍増殖抑制を評価した。Ｂ２１９×ＣＷ６高投与（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝８）治療群における腫瘍増殖は、ＰＢＳ治療コントロールと比較して８５％阻害された（ｐ＜０．００１）。Ｂ２１９×ＣＷ６中間投与（０．０４ｍｇ／ｋｇ）では、ＰＢＳコントロールと比較して統計的に有意な方法（ＴＧＩ＝６７％、ｎ＝７）で腫瘍増殖を阻害した（ｐ＜０．０００１）。最後に、Ｂ２１９×ＣＷ６最低投与（０．００４ｍｇ／ｋｇ）でもまた、腫瘍に対してＰＢＳ治療を施したコントロールと比較して７８％、ＨＥＫ２９３−ＰＳＭＡ腫瘍の増殖を効果的に阻害した（ｐ＜０．０００１）。
【0308】
本試験においてＰＢＭＣを投与された動物群は結局、進行性ＧＶＨＤで死亡したが、体重減少はわずかであった（図１９）。Ｂ２１９×ＣＷ６（１μｇ）群のうち１匹のマウスだけ著しく体重が増加し、３０日目にＧＶＨＤで死亡した。４２日目までに、ＰＢＳ治療群における腫瘍の大部分が１５００ｍｍ３の腫瘍容積指標を超え、その時点で本試験を終了させた。
【0309】
配列配列番号：１＝オリジナルのＴｅｎｃｏｎ配列
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ
【0310】
配列番号：２＝ＴＣＬ１ライブラリＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ（Ｘ）７−１２ＰＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７は、任意のアミノ酸であり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【0311】
配列番号：３＝ＴＣＬ２ライブラリＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３ＳＸ１４Ｘ１５ＬＳＡＥＦＴＴ；式中、Ｘ１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ６は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ７は、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＴｙｒであり、Ｘ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ又はＴｈｒであり、Ｘ９は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１０は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１１は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１２は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１３は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１４は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌであり、Ｘ１５は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌである。
【0312】
配列番号：４＝安定化させたＴｅｎｃｏｎＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0313】
配列番号：５＝ＴＣＬ７（ＦＧ及びＢＣループ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５及びＸ１６は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１７、Ｘ１８及びＸ１９は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損である。
【0314】
配列番号：６＝ＴＣＬ９（ＦＧループ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹであり、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１及びＸ１２は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙ又は欠損である。
【0315】
配列番号：７＝ＴＣＬ１４ライブラリＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ８ＶＸ９ＩＸ１０ＧＶＫＧＧＸ１１Ｘ１２ＳＸ１３ＰＬＳＡＩＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２及びＸ１３は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹである。
【0316】
配列番号：８＝ＴＣＬ２４ライブラリＴＣＬ２４ライブラリ（配列番号：８）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＸ１ＩＸ２ＹＸ３ＥＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７ＧＥＡＩＸ８ＬＸ９ＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＸ１０ＶＸ１１ＩＸ１２ＧＶＫＧＧＸ１３Ｘ１４ＳＸ１５ＰＬＸ１６ＡＸ１７ＦＴＴ；式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６及びＸ１７は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｙ又はＷである。
【0317】
配列番号：９＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＦＯＲＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣ
【0318】
配列番号：１０＝Ｓｌｏｎｉｎｇ−ＲＥＶＧＣＣＴＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＧ
【0319】
配列番号：１１＝ＰＯＰ２２５０ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣ
【0320】
配列番号：１２＝ＤｉｇＬｉｇＲｅｖＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＡ
【0321】
配列番号：１３＝ＢＣ９ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【0322】
配列番号：１４＝ＢＣ８ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【0323】
配列番号：１５＝ＢＣ７ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【0324】
配列番号：１６＝ＢＣ６ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＴＹＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＧＣ
【0325】
配列番号：１７＝１３０ｍｅｒ−Ｌ１７ＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧ
【0326】
配列番号：１８＝ＰＯＰ２２２ｅｘｔＣＧＧ ＣＧＧ ＴＴＡ ＧＡＡ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＡＴ ＴＡＡ ＴＡＣ
【0327】
配列番号：１９＝ＬＳ１１１４ＣＣＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＡＣＧ ＧＧＣ ＡＧＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＡＡＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＡＣ ＣＡＧ ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＧＧ ＣＧＣ ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＡＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＴＣＣ ＴＧＴ ＴＴＣ
【0328】
配列番号：２０＝ＬＳ１１１５ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＣＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＧＴ ＣＴＴ ＧＧ
【0329】
配列番号：２１＝ＬＳ１１１７ＣＡＧ ＴＧＧ ＴＣＴ ＣＡＣ ＧＧＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ＡＧＡ ＧＴＣ ＧＡＡ
【0330】
配列番号：２２＝ＳＤＧ１０ＣＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＴＴＣＣＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴ
【0331】
配列番号：２３＝ＳＤＧ２４ＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＧＧＧＴＴＡＧ
【0332】
配列番号：２４＝ＰＯＰ２２２２ＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣ
【0333】
配列番号：２５＝ＳＤＧ２８ＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＴＣＧＣＡＧＡＣ
【0334】
配列番号：２６＝ＦＧ１２ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【0335】
配列番号：２７＝ＦＧ１１ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【0336】
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【0337】
配列番号：２９＝ＦＧ９ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【0338】
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【0339】
配列番号：３１＝ＦＧ７ＧＴＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＣＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＡＧＴＣＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＧＧＣ
【0340】
配列番号：３２＝ＰＳＭＷ１（Ｎ’−ＡｖｉＴａｇ−ＨｉｓＴａｇ−ＧＳ−Ｃｙｎｏ ＰＳＭＡ＿ＥＣＤ）ＫＳＳＳＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＨＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＴＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＡＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＴＧＶＩＬＹＳＤＰＤＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＭＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＳＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＭＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＥＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＳＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＶＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＲＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＱＡＷＧＥＶＫＲＱＩＳＩＡＴＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
【0341】
配列番号：３３＝ＰＳＭＷ８（Ｎ’−ＡｖｉＴａｇ−ＨｉｓＴａｇ−ＧＳ−Ｃｈｉｍｐ ＰＳＭＡ＿ＥＣＤ）ＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＬＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＨＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＴＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＤＶＫＲＱＩＳＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
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【0343】
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【0344】
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【0345】
配列番号：３７＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｆ０４ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＶＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0346】
配列番号：３８＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７０＿Ｆ０９ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＩＤＥＱＲＤＷＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0347】
配列番号：３９＝Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＡＩＤＥＱＲＤＷＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶＹＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0348】
配列番号：４０＝Ｐ２２９ＣＲ５Ｐ８１９＿Ｈ１１ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＤＩＤＥＱＲＤＷＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＹＨＶＹＲＳＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0349】
配列番号：４１＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0350】
配列番号：４２＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｂ５−５ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＴＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0351】
配列番号：４３＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３−１ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＨＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0352】
配列番号：４４＝Ｐ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｄ９ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＷＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0353】
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【0354】
配列番号：４６＝Ｐ２３４ＣＲ９＿Ｈ０１ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＥＷＷＶＩＰＧＤＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＶＮＳＧＱＷＮＤＴＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0355】
配列番号：４７＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｃ末端ｃｙｓ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴＣ
【0356】
配列番号：４８＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｋ６２Ｃ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＣＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0357】
配列番号：４９＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｅ５３Ｃ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＣＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0358】
配列番号：５０＝Ｐ２３３ＦＲ９＿Ｈ１０（Ｒ１１Ｃ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＣＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0359】
配列番号：５１＝非標的ＦＮ３ドメイン（Ｋ６２Ｃ）ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＣＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＨＨＨＨＨＨ
【0360】
【0361】
配列番号：５３＝タグを含まないソルターゼＡＳＫＰＨＩＤＮＹＬＨＤＫＤＫＤＥＫＩＥＱＹＤＫＮＶＫＥＱＡＳＫＤＫＫＱＱＡＫＰＱＩＰＫＤＫＳＫＶＡＧＹＩＥＩＰＤＡＤＩＫＥＰＶＹＰＧＰＡＴＲＥＱＬＮＲＧＶＳＦＡＥＥＮＥＳＬＤＤＱＮＩＳＩＡＧＨＴＦＩＤＲＰＮＹＱＦＴＮＬＫＡＡＫＫＧＳＭＶＹＦＫＶＧＮＥＴＲＫＹＫＭＴＳＩＲＮＶＫＰＴＡＶＥＶＬＤＥＱＫＧＫＤＫＱＬＴＬＩＴＣＤＤＹＮＥＥＴＧＶＷＥＴＲＫＩＦＶＡＴＥＶＫ
【0362】
配列番号：５４＝ＴＥＶプロテアーゼ開裂部位ＥＮＬＹＦＱＳ
【0363】
配列番号：５５＝ＴｅｎｃｏｎのＦＧループＫＧＧＨＲＳＮ
【0364】
配列番号：５６＝ＢＣループＤＩＤＥＱＲＤＷ
【0365】
配列番号：５７＝ＢＣループＴＩＤＥＱＲＤＷ
【0366】
配列番号：５８＝ＢＣループＶＩＤＥＱＲＤＷ
【0367】
配列番号：５９＝ＢＣループＡＩＤＥＱＲＤＷ
【0368】
配列番号：６０＝ＢＣループＥＷＷＶＩＰＧＤ
【0369】
配列番号：６１＝ＢＣループＧＥＱＦＴＩ
【0370】
配列番号：６２＝ＢＣループＴＡＰＤＡＡ
【0371】
配列番号：６３＝ＣループＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥ
【0372】
配列番号：６４＝ＣループＦＥＳＦＬＩＱＹＱＥ
【0373】
配列番号：６５＝ＣループＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥ
【0374】
配列番号：６６＝ＣループＦＤＳＦＰＩＧＹＷＥ
【0375】
配列番号：６７＝ＣループＦＤＳＦＴＩＧＹＷＥ
【0376】
配列番号：６８＝ＣＤループＳＥＫＶＧＥ
【0377】
配列番号：６９＝ＣＤループＷＤＤＤＧＥ
【0378】
配列番号：７０＝ＦループＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶ
【0379】
配列番号：７１＝ＦループＴＥＹＴＶＳＩＹＧ
【0380】
配列番号：７２＝ＦループＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶ
【0381】
配列番号：７３＝ＦループＴＥＹＷＶＹＩＡＧＶ
【0382】
配列番号：７４＝ＦループＴＥＹＨＶＹＩＡＧＶ
【0383】
配列番号：７５〜１４０は、上記表内に示す。
【0384】
配列番号：１４１＝完全長ｃｙｎｏＰＳＭＡＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＳＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＨＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＴＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＡＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＴＧＶＩＬＹＳＤＰＤＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＭＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＳＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＳＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＭＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＹＮＬＴＫＥＬＥＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＳＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＶＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＮＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＲＤＦＤＫＳＮＰＩＬＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹ
【0385】
＞１４２リンカーＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ
【0386】
＞１４３ヒトＰＳＭＡ ＥＣＤＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
【0387】
＞１４４シグナル配列を含むヒトＦＬ ＰＳＭＡＭＷＮＬＬＨＥＴＤＳＡＶＡＴＡＲＲＰＲＷＬＣＡＧＡＬＶＬＡＧＧＦＦＬＬＧＦＬＦＧＷＦＩＫＳＳＮＥＡＴＮＩＴＰＫＨＮＭＫＡＦＬＤＥＬＫＡＥＮＩＫＫＦＬＹＮＦＴＱＩＰＨＬＡＧＴＥＱＮＦＱＬＡＫＱＩＱＳＱＷＫＥＦＧＬＤＳＶＥＬＡＨＹＤＶＬＬＳＹＰＮＫＴＨＰＮＹＩＳＩＩＮＥＤＧＮＥＩＦＮＴＳＬＦＥＰＰＰＰＧＹＥＮＶＳＤＩＶＰＰＦＳＡＦＳＰＱＧＭＰＥＧＤＬＶＹＶＮＹＡＲＴＥＤＦＦＫＬＥＲＤＭＫＩＮＣＳＧＫＩＶＩＡＲＹＧＫＶＦＲＧＮＫＶＫＮＡＱＬＡＧＡＫＧＶＩＬＹＳＤＰＡＤＹＦＡＰＧＶＫＳＹＰＤＧＷＮＬＰＧＧＧＶＱＲＧＮＩＬＮＬＮＧＡＧＤＰＬＴＰＧＹＰＡＮＥＹＡＹＲＲＧＩＡＥＡＶＧＬＰＳＩＰＶＨＰＩＧＹＹＤＡＱＫＬＬＥＫＭＧＧＳＡＰＰＤＳＳＷＲＧＳＬＫＶＰＹＮＶＧＰＧＦＴＧＮＦＳＴＱＫＶＫＭＨＩＨＳＴＮＥＶＴＲＩＹＮＶＩＧＴＬＲＧＡＶＥＰＤＲＹＶＩＬＧＧＨＲＤＳＷＶＦＧＧＩＤＰＱＳＧＡＡＶＶＨＥＩＶＲＳＦＧＴＬＫＫＥＧＷＲＰＲＲＴＩＬＦＡＳＷＤＡＥＥＦＧＬＬＧＳＴＥＷＡＥＥＮＳＲＬＬＱＥＲＧＶＡＹＩＮＡＤＳＳＩＥＧＮＹＴＬＲＶＤＣＴＰＬＭＹＳＬＶＨＮＬＴＫＥＬＫＳＰＤＥＧＦＥＧＫＳＬＹＥＳＷＴＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫＬＧＳＧＮＤＦＥＶＦＦＱＲＬＧＩＡＳＧＲＡＲＹＴＫＮＷＥＴＮＫＦＳＧＹＰＬＹＨＳＶＹＥＴＹＥＬＶＥＫＦＹＤＰＭＦＫＹＨＬＴＶＡＱＶＲＧＧＭＶＦＥＬＡＮＳＩＶＬＰＦＤＣＲＤＹＡＶＶＬＲＫＹＡＤＫＩＹＳＩＳＭＫＨＰＱＥＭＫＴＹＳＶＳＦＤＳＬＦＳＡＶＫＮＦＴＥＩＡＳＫＦＳＥＲＬＱＤＦＤＫＳＮＰＩＶＬＲＭＭＮＤＱＬＭＦＬＥＲＡＦＩＤＰＬＧＬＰＤＲＰＦＹＲＨＶＩＹＡＰＳＳＨＮＫＹＡＧＥＳＦＰＧＩＹＤＡＬＦＤＩＥＳＫＶＤＰＳＫＡＷＧＥＶＫＲＱＩＹＶＡＡＦＴＶＱＡＡＡＥＴＬＳＥＶＡ
【0388】
＞１４５テネイシンＣの３番目のＦＮ３ドメインＤＡＰＳＱＩＥＶＫＤＶＴＤＴＴＡＬＩＴＷＦＫＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹＧＩＫＤＶＰＧＤＲＴＴＩＤＬＴＥＤＥＮＱＹＳＩＧＮＬＫＰＤＴＥＹＥＶＳＬＩＳＲＲＧＤＭＳＳＮＰＡＫＥＴＦＴＴ
【0389】
＞１４６フィブコンＬｄａｐｔｄｌｑｖｔｎｖｔｄｔｓｉｔｖｓｗｔｐｐｓａｔｉｔｇｙｒｉｔｙｔｐｓｎｇｐｇｅｐｋｅｌｔｖｐｐｓｓｔｓｖｔｉｔｇｌｔｐｇｖｅｙｖｖｓｌｙａｌｋｄｎｑｅｓｐｐｌｖｇｔｑｔｔ
【0390】
＞１４７フィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメインＶＳＤＶＰＲＤＬＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩＳＷＤＡＰＡＶＴＶＲＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶＰＧＳＫＳＴＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫＰＩＳＩＮＹＲＴ
【0391】
＞１４８ＧＳＧＳ
【0392】
＞１４９ＧＧＧＳＧＧＧＳ
【0393】
＞１５０ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【0394】
＞１５１ＡＰＡＰ
【0395】
＞１５２ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
【0396】
＞１５３ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
【0397】
＞１５４ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
【0398】
＞１５５アルブミン変異体ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＳＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【0399】
＞１５６ ｃＤＮＡ Ｈ１０ＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＴＣＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＴＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＡＡＴＡＴＣＣＧＧＴＧＴＡＴＡＴＴＧＣＧＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＡＣＣ
【0400】
＞１５７ ｃＤＮＡ Ｐ２５８ＡＲ６Ｐ１０７１＿Ｄ０２ＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＡＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＡＴＡＣＧＧＴＧＡＧＣＡＴＴＴＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＡＧＣＡＡＴＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ
【0401】
＞１５８ ｃＤＮＡＰ２３３ＦＲ９Ｐ１００１＿Ｈ３−１
ＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＣＣＣＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＣＧＡＧＣＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＴＡＴＣＡＣＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＧＧＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＣＧＡＣＣ
【0402】
＞１５９ ＰＳＭＡエピトープＫＫＳＰＳＰＥＦＳＧＭＰＲＩＳＫ
【0403】
＞１６０ ＰＳＭＡエピトープＮＷＥＴＮＫＦ
【0404】
＞１６１ ＳＰ３４軽鎖ＱＡＶＶＴＱＥＳＡＬＴＴＳＰＧＥＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥＫＰＤＨＬＦＴＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＶＰＡＲＦＳＧＳＬＩＧＤＫＡＡＬＴＩＴＧＡＱＴＥＤＥＡＩＹＦＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＳＳＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＥＴＮＫＡＴＬＶＣＴＩＴＤＦＹＰＧＶＶＴＶＤＷＫＶＤＧＴＰＶＴＱＧＭＥＴＴＱＰＳＫＱＳＮＮＫＹＭＡＳＳＹＬＴＬＴＡＲＡＷＥＲＨＳＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＨＴＶＥＫＳＬＳＲＡＤＣＳ
【0405】
＞１６２ ＳＰ３４重鎖ＥＶＫＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＫＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＤＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＭＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＴＴＴＡＰＳＶＹＰＬＶＰＧＣＳＤＴＳＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＶＫＷＮＹＧＡＬＳＳＧＶＲＴＶＳＳＶＬＱＳＡＦＹＳＬＳＳＬＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＩＣＮＶＡＨＰＡＳＫＴＥＬＩＫＲＩＥＰＲＩＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＣＰＰＧＮＩＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＡＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＨＶＳＷＦＶＤＮＫＥＶＨＴＡＷＴＱＰＲＥＡＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＡＬＰＩＱＨＱＤＷＭＲＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＡＬＰＡＰＩＥＲＴＩＳＫＰＫＧＲＡＱＴＰＱＶＹＴＩＰＰＰＲＥＱＭＳＫＫＫＶＳＬＴＣＬＶＴＮＦＦＳＥＡＩＳＶＥＷＥＲＮＧＥＬＥＱＤＹＫＮＴＰＰＩＬＤＳＤＧＴＹＦＬＹＳＫＬＴＶＤＴＤＳＷＬＱＧＥＩＦＴＣＳＶＶＨＥＡＬＨＮＨＨＴＱＫＮＬＳＲＳＰＧＫ
【0406】
＞１６３ ＣＤ３Ｈ１４１ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0407】
＞１６４ ＣＤ３Ｈ１４２ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0408】
＞１６５ ＣＤ３Ｈ１４３ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0409】
＞１６６ ＣＤ３Ｈ１４４ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＲＩＲＳＫＹＮＧＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＴＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【0410】
＞１６７ ＣＤ３Ｌ６３ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0411】
＞１６８ ＣＤ３Ｌ６４ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＬＰＧＴＡＰＫＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0412】
＞１６９ ＣＤ３Ｌ６６ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
【0413】
＞１７０．Ｂ２１９軽鎖ＱＴＶＶＴＱＥＰＳＬＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬＴＣＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮＷＶＱＱＫＰＧＱＡＰＲＧＬＩＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧＧＫＡＡＬＴＬＳＧＶＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＴＥＣＳ
【0414】
＞１７１．Ｂ２１９重鎖ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【0415】
＞１７２．ＣＷ５ Ｃ末端ＦＮ３ドメインＦＣ融合ＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0416】
＞１７３．ＣＷ６ Ｎ末端ＦＮ３ドメインＦＣ融合ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【0417】
＞１７４．Ｂ２２１重鎖ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＡＩＧＹＷＥＷＤＤＤＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＰＶＹＩＡＧＶＫＧＧＱＷＳＦＰＬＳＡＩＦＴＴ
【0418】
＞１７５ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
【0419】
＞１７６ Ｇ１１ ｍＡｂ重鎖ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳ ＳＹＧＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧ ＩＮＧＧＧＧＳＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＴＳ ＡＱＲＦＤＹＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ ＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡ ＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦ ＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳ ＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦ ＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳ ＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣ ＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫ ＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣ ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ ＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤ ＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤ ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ ＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ ＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡ ＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ ＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ ＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬ ＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ ＬＳＬＳＰＧＫ
【0420】
＞１７７ Ｇ１１ ｍＡｂ軽鎖ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ ＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＳＹＳＬＰＬＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ ＲＧＥＣ
【0421】
＞１７８ ＣＤ３Ｂ９４ ｍＡｂ重鎖ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳ ＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧ ＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩ ＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＰ ＡＲＬＹＳＹＹＦＤＹ ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣ ＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ ＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧ ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ ＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰ ＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴ ＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤ ＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ ＶＬＤＳＤＧＳＦＬＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲ ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳ ＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹ ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ Ｋ
【0422】
＞１７９ ＣＤ３Ｂ９４ ｍＡｂ軽鎖ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】