特表 2019-512006 ＥＧＦＲリガンドを有する治療用ナノ粒子ならびにその作製および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2019-512006(P2019-512006A)

(43)【公表日】2019年5月9日

(54)【発明の名称】ＥＧＦＲリガンドを有する治療用ナノ粒子ならびにその作製および使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/60 20170101AFI20190412BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20190412BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20190412BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190412BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20190412BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20190412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190412BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20190412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20190412BHJP

   B82Y 5/00 20110101ALI20190412BHJP

   B82Y 30/00 20110101ALI20190412BHJP

   B82Y 40/00 20110101ALI20190412BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20190412BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20190412BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20190412BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20190412BHJP

   C07K 14/485 20060101ALN20190412BHJP

   C07K 17/08 20060101ALN20190412BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/60ZNA

   A61K47/59

   A61K47/34

   A61K45/00

   A61K9/16

   A61K45/06

   A61P43/00 121

   A61K38/10

   A61P35/00

   B82Y5/00

   B82Y30/00

   B82Y40/00

   G01N33/68

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   G01N21/41 101

   C07K14/485

   C07K17/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】63

(21)【出願番号】特願2018-541254(P2018-541254)

(86)(22)【出願日】2016年8月19日

(85)【翻訳文提出日】2018年9月28日

(86)【国際出願番号】US2016047807

(87)【国際公開番号】WO2017138983

(87)【国際公開日】20170817

(31)【優先権主張番号】62/369,590

(32)【優先日】2016年8月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/293,609

(32)【優先日】2016年2月10日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KN,KP,KR,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ,UA,UG,US

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン イー． ジャーレ

(72)【発明者】

【氏名】ケヴィン マクドンネル

(72)【発明者】

【氏名】アレン ホーホタ

【テーマコード（参考）】

2G045

2G059

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CB02

2G045DA36

2G045FA14

2G045FB03

2G059AA01

2G059BB12

2G059DD02

2G059DD03

2G059DD04

2G059EE02

4C076AA12

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC27

4C076EE23

4C076EE24

4C076EE49

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA17

4C084AA20

4C084BA01

4C084BA18

4C084DA45

4C084MA02

4C084MA05

4C084MA13

4C084MA28

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA58

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA62

4H045CA40

4H045DA20

4H045EA20

4H045FA33

4H045FA81

(57)【要約】

本明細書では、一つには、生体適合性ポリマーと、ポリマー−ＥＧＦＲリガンドコンジュゲートであって、ＥＧＦＲリガンドは、直接または化学リンカーを介してポリマーに共有結合している、ポリマー−ＥＧＦＲリガンドコンジュゲートと、治療剤とを含む治療用ナノ粒子が提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療剤と、
ジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと、
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドとして表されるポリマーコンジュゲートであって、ＥＧＦＲリガンドは、直接、間接的に、または化学リンカーを介してＰＥＧに結合または会合しており、ＰＬＡは、ポリ（乳）酸であり、ＰＥＧは、ポリ（エチレン）グリコールである、ポリマーコンジュゲートと
を含む治療用ナノ粒子。

【請求項2】

約０．２〜約３５重量パーセントの治療剤と、
約５０〜約９８重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと、
約２％〜約１２％のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンド密度であって、ＥＧＦＲリガンドは、アジド官能化ＰＥＧ−ＰＬＡに結合または会合しており、ＰＬＡは、ポリ（乳）酸であり、ＰＥＧは、ポリ（エチレン）グリコールである、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンド密度と
を含む治療用ナノ粒子。

【請求項3】

前記治療用ナノ粒子の流体力学的直径が約６０〜約１５０ｎｍである、請求項１から２のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。

【請求項4】

前記流体力学的直径が約９０〜約１４０ｎｍである、請求項１から３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。

【請求項5】

約１〜約１０重量パーセントの前記治療剤を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子。

【請求項6】

前記ＥＧＦＲリガンドがペプチドである、請求項１から５に記載の治療用ナノ粒子。

【請求項7】

ペプチドが、クリック化学反応によって、ナノ粒子に共有結合性にコンジュゲートされている、請求項６に記載の治療用ナノ粒子。

【請求項8】

Ａｃ−ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、ＡｃＤＡＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱ、ＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎ ＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎ、ＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、ＡｃＤＰＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、およびＡｃＤＡＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ_２、またはこれらの修飾体からなる群から選択される配列を含むペプチジルリガンドにコンジュゲートさせたＰＬＡ−ＰＥＧを含むナノ粒子。

【請求項9】

ペプチジルリガンド分子にコンジュゲートさせた約２００〜約５００の前記ＰＬＡ−ＰＥＧを含む、請求項８に記載のナノ粒子。

【請求項10】

前記ＰＬＡ−ＰＥＧが、アジド官能化ＰＬＡ−ＰＥＧを反応させ、歪み促進型アルキン−アジド付加環化を使用することにより、前記ペプチジルリガンド分子にコンジュゲートされている、請求項８または９に記載のナノ粒子。

【請求項11】

前記ＰＬＡ−ＰＥＧのＰＬＡが、約１５〜約１７ｋＤａの数平均分子量を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項12】

前記ＰＬＡ−ＰＥＧのＰＥＧが、約４〜約６ｋＤａの数を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。

【請求項13】

請求項１から１２のいずれかに記載の複数の治療用ナノ粒子と、薬学的に許容できる添加剤とを含む、薬学的に許容できる組成物。

【請求項14】

それを必要とする患者において固形腫瘍がんを処置する方法であって、請求項１から１３のいずれか一項に記載の治療用ナノ粒子を含む治療有効量の組成物を患者に投与することを含む方法。

【請求項15】

標的化リガンド−ナノ粒子コンジュゲートを特定する方法であって、
１）アジド官能化ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子を用意するステップと、
２）潜在的なＥＧＦＲリガンドを前記アジドＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子と接触させて、標的化されたナノ粒子を形成するステップと、
３）リガンド親和性および／またはナノ粒子結合について、前記標的化されたナノ粒子をスクリーニングするステップと、
４）前記潜在的なＥＧＦＲリガンドをモジュレートするステップと、
５）ステップ２〜４を繰り返して、所望のリガンド親和性および／または結合を有する標的化されたナノ粒子を得るステップと
を含む方法。

【請求項16】

前記スクリーニングが表面プラズモン共鳴を使用することを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

モジュレートすることが、リガンドの１つまたは複数のアミノ酸を置き換えすること、挿入すること、または修飾することを含む、請求項１４または１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連技術への相互参照
本出願は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１６年２月１０日出願の米国仮出願第６２／２９３，６０９号、および２０１６年８月１日出願の米国仮出願第６２／３６９，５９０号の優先権および利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

患者へのある種の薬物を送達する（例えば、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする）か、または薬物の放出を制御する系は、有益であると長い間認識されてきた。

【0003】

例えば、活性薬物を含み、かつ、特定の組織もしくは細胞型を標的とするか、または正常組織ではなく特定の患部組織を標的とする治療法は、標的とされていない体の組織における薬物の量を低減し得る。周囲の非がん組織を死滅させることなしに細胞毒性用量の薬物ががん細胞に送達されることが望ましい状態、例えば、がんを処置するときに、これは特に重要である。有効な薬物標的化は、抗がん療法においては一般的である、望ましくなく、時には生命を危うくする副作用を低減し得る。さらに、このような治療法は、薬物がその他の治療法では到達することができないある種の組織に到達することを可能にし得る。制御放出および／または標的療法を実現する治療法はまた、有効量の薬物を送達できなければならないが、これは他のナノ粒子送達系において公知の制限である。

【0004】

例えば、伝統的ながん処置の主要な制約は、健康な細胞に優先した、がん細胞に対する選択性が不十分であることである。最近では、ナノ医療を使用して腫瘍に抗がん剤を効率よく送達することに向けて相当な量の研究がなされている。固形腫瘍がかなりの栄養素および酸素に依存する結果、血管新生が激しくなり、これがひいては、内皮細胞間の大きな間隙の形成につながる。結果として生じる漏れやすい血管系は、腫瘍において、巨大分子およびナノ粒子の、サイズ依存的な、例えば２００〜８００ｎｍの蓄積をもたらす。この形の受動的な標的化は、ナノ医療にとって遊離薬物に優る利点とはなるが、腫瘍細胞に対するまたは腫瘍細胞中への直接の積荷の送達を確実にするものではない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、種々のがんにおいて上方調節され、腫瘍増殖と関連付けられており、ナノ治療標的化のための有望な受容体であると一般にみなされている、十分に理解されている標的である。したがって、ＥＧＦＲを標的とし得るナノ粒子などの標的化ナノ粒子治療法が求められている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本明細書では、治療剤と上皮成長因子受容体を標的とするリガンドとを含むポリマーナノ粒子、ならびにそのような治療用ナノ粒子を作製および使用する方法を記載する。一部の実施形態では、企図されるナノ粒子は、がんの処置に使用することができる。

【0007】

例えば、本明細書では、治療剤と、ジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはジブロックポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーと、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドとして表されるポリマーコンジュゲートであって、ＥＧＦＲリガンドは、直接、間接的に、または化学リンカーを介してＰＥＧに結合または会合しており、ＰＬＡは、ポリ（乳）酸であり、ＰＥＧは、ポリ（エチレン）グリコールである、ポリマーコンジュゲートとを含む治療用ナノ粒子が提供される。

【0008】

さらに、本明細書では、複数の企図される治療用ナノ粒子を含む薬学的に許容できる組成物、およびそれを必要とする患者において固形腫瘍がんを処置する方法であって、企図される治療用ナノ粒子を含む組成物の治療有効量を患者に投与することを含む方法が提供される。

【0009】

さらに別の態様では、標的化リガンド−ナノ粒子コンジュゲートを特定する方法であって、１）アジド官能化ＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子を用意するステップと、２）潜在的なＥＧＦＲリガンドをアジドＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子と接触させて、標的化されたナノ粒子を形成するステップと、３）リガンド親和性および／またはナノ粒子結合性について、標的化されたナノ粒子をスクリーニングするステップと、４）潜在的なＥＧＦＲリガンドをモジュレートするステップと、５）ステップ２〜４を繰り返して、所望のリガンド親和性および／または結合性を有する標的化されたナノ粒子を得るステップとを含む方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】開示されるナノ粒子を形成するためのエマルジョンプロセスについてのフローチャートである。

【図2A】開示されるエマルジョンプロセスについての流れ図である。

【図2B】開示されるエマルジョンプロセスについての流れ図である。

【図3A】ポリマー成分ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドの、市販品として入手可能なＨＯ−ＰＥＧ−アジドからの合成を示す図である。

【図3B】ポリマーＰＬＡ−Ｃｙ５蛍光ペイロードの合成を示す図である。

【図4A】ＤＢＣＯ−アミンのＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドへのコンジュゲーションを示す図である。

【図4B】ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドと反応したときのＤＢＣＯアミンの９９％の消費を実証する、クリック反応の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）による分析を示すグラフである。

【図4C】アジドナノ粒子に適用したときのＤＢＣＯアミンの９８％の消費を実証する、クリック反応のＬＣＭＳ分析を示すグラフである。

【図5】ＤＢＣＯアルデヒドリンカー（上）、ＥＧＦのＮ末端に対する還元的アミノ化のためのＤＢＣＯ−アルデヒドの調製、および後続のアジド官能化ナノ粒子へのコンジュゲーション（下）を示す図である。

【図6】ＥＧＦ−ＤＢＣＯの、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎによる精製後（上）、ＥＧＦ−ＤＢＣＯがアジド官能化ナノ粒子にクリックされた後（中）、およびＺｅｂａ Ｓｐｉｎによるナノ粒子の精製後（下）のＬＣＭＳ分析を示すグラフである。

【図7A】ＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡによる、ＥＧＦナノ粒子およびＤＢＣＯリガンドのＥＧＦＲへの結合を示すグラフである（ＥＧＦ ＩＣ_５０＝１．２ｎＭ、ＥＧＦ−ＤＢＣＯ ＩＣ_５０＝２．３ｎＭ、２．５％ＥＧＦ ＩＣ_５０＝９ｎＭ）。

【図7B】ＥＧＦＲ−Ｆｃ表面に結合している、ＥＧＦ、ＥＧＦ−ＤＢＣＯ、ＥＧＦナノ粒子、および基盤アジドナノ粒子のＳＰＲ分析を示すグラフである。挿入グラフは、非修飾ＥＧＦからのより低いシグナルおよび基盤アジドナノ粒子の最小限の非特異的結合を拡大したものである。ＰＴＮＰは、非官能化ナノ粒子を示す。

【図8A】報告されたＥＧＦＲ結合性ペプチドについてのＳＰＲ結合データのプロットを示すグラフである。

【図8B】５％および１０％でナノ粒子にコンジュゲートさせた選択された文献ペプチド（１ｍｇ／ｍＬ）のＳＰＲ分析を示すグラフである。２．５％ＥＧＦナノ粒子は比較のために示す。

【図9A】ＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡによる、遊離リガンドおよびナノ粒子コンジュゲート結合についての相対的なＩＣ_５０を示すグラフである。Ｐ_１における各アミノ酸をアラニンにより置き換え、結合への影響を、親ペプチドまたはペプチド−ＮＰと比較した。

【図9B】ＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡによるＰ_１アラニンスキャンナノ粒子結合を示すグラフである（Ｐ_１−３ ＩＣ_５０＝１０．３μｇ／ｍＬ、Ｐ_１ ＩＣ_５０＝２１１μｇ／ｍＬ）。

【図9C】１ｍｇ／ｍＬでのＳＰＲによるＰ_１およびＰ_１−３ Ｎｐ結合を示すグラフである。

【図10】ＥＧＦの存在下または非存在下での、５％および１０％リガンド密度のＰ_２−ＮＰコンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬ）の親和性のＳＰＲ分析を示すグラフである。

【図11】ＥＧＦの存在下または非存在下での、（０．２５ｍｇ／ｍｌでの）Ｐ_２−ＮＰコンジュゲート結合のＳＰＲ分析を示すグラフである。

【図12】ＥＧＦ／Ｐ_２二重標的化ＮＰの相乗的な影響を示すグラフである。ＰＴＮＰは、非官能化ナノ粒子を示す。

【図13】ＥＧＦＲの結合に肝要な残基を示す、Ｐ_２ペプチドのアラニンスキャニングの結果を示すグラフである。親ペプチドＰ_２のＫ_Ｄに対して、ＳＰＲによって測定される相対的な結合親和性が各ペプチドについて示される。^＊の値は、グラフに出ているより高い。

【図14】ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）とアスパラギン酸残基との間の内部アミド結合形成の一例を示す図である。

【図15】ペニシラミン（ｐｅｎ）およびホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓ）の構造を示す図である。

【図16】Ｐ_２の代替ジスルフィド変形形態を示すグラフである。Ｃｙｓ置き換えは、２つの位置（Ｃｙｓ３またはＣｙｓ１２）それぞれについて示しており、ＳＰＲによって測定される相対的な親和性は、親ペプチド（Ｐ_２）のＫ_Ｄと比較したものである。^＊の値は、グラフに出ているより高い。

【図17】Ｐ２−ビオチン二量体を示す図（上）、およびビオチン化Ｐ_２誘導体結合のＥＧＦ濃度への依存を示すグラフ（下）である。

【図18】遊離Ｐ_２を、１％および５％Ｐ_２にコンジュゲートさせたナノ粒子と比較する、Ｐ_２競合アッセイ結果を示すグラフである。

【図19】別個の動態プロファイルを有するリガンドによる相乗的なＮＰ結合を示すグラフである。

【図20】ＳＰＲによる、最適化されたＰ_２類似体の３．２μＭでの結合を示すグラフである。

【図21A】多様な濃度での５％Ｐ_２−２ナノ粒子のＳＰＲセンソグラムを示すグラフである。注入終了時点で、センサー表面上のタンパク質密度に対して正規化した、各用量での結合応答をとり、用量に対してプロットしている。

【図21B】多様な濃度での５％Ｐ_２−２ナノ粒子のＳＰＲセンソグラムを示すグラフである。センサー表面上のタンパク質密度に対して正規化した、各用量での結合応答を、注入終了時点で測定し、用量に対してプロットしている。

【図21C】ＳＰＲによって測定される、単一アミノ酸置換を有するＰ_２類似体を５％のリガンド密度で擁するナノ粒子の、ＥＧＦの存在下および非存在下での相対的結合を示すグラフである。

【図22】ＳＰＲによって測定される、２つまたは３つのアミノ酸置換を有するＰ_２類似体を５％のリガンド密度で擁するナノ粒子にコンジュゲートさせたナノ粒子の、ＥＧＦの存在下および非存在下での相対的結合を示すグラフである。

【図23A】ＥＧＦなしで、Ａ_４３１細胞を結合するＥＧＦＲ標的化ナノ粒子を示すグラフである。

【図23B】５０ｎＭのＥＧＦ存在下で、Ａ_４３１細胞を結合するＥＧＦＲ標的化ナノ粒子を示すグラフである。

【図23C】ＥＧＦ、Ｐ_１−３、およびＰ_{２／５５／１０２}ナノ粒子結合の比較を示すグラフである。

【図24】表示されたナノ粒子の、フローサイトメトリーによってアッセイされる相対的な結合を示すグラフである。

【図25A】３７℃でのＥＧＦ、Ｐ_１−３、およびＰ_{２／５５／１０２}ナノ粒子のＡ_４３１細胞への全結合および内部移行を示すグラフである。

【図25B】標的化ナノ粒子の内部移行の速度を示すグラフである。

【図26】ＨＰＬＣおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ放出によって測定された、３７℃での経時的なナノ粒子からのＣｙ５ ＰＬＡの放出を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本明細書では、治療剤を含むポリマーナノ粒子、ならびに血液脳関門を超えて効率よく往来するかかる治療用ＥＧＦＲリガンドと治療剤を作製および使用する方法を記載する。

【0012】

本明細書では、生体適合性ポリマーと、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドとして表されるポリマーコンジュゲートであって、ＥＧＦＲリガンドは、直接または化学リンカーを介してＰＥＧに共有結合しており、ＰＬＡは、ポリ（乳）酸であり、ＰＥＧは、ポリ（エチレン）グリコールである、ポリマーコンジュゲートと、治療剤とを含む治療用ナノ粒子が提供される。例えば、開示するナノ粒子は、約０．２〜約１０重量パーセントのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドを含む場合がある。

【0013】

本明細書ではまた、治療剤と、約５０〜約７００個のＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンド分子と、生体適合性ポリマーとを含む治療用ナノ粒子の流体力学的直径を有する治療用ナノ粒子が提供される。

【0014】

適切な生体適合性ポリマーは、本明細書に記載しており、一部の実施形態では、ジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、ポリ（乳）酸、ジブロックポリ（乳−ｃｏ−グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、ポリ（乳−ｃｏ−グリコール）酸、およびこれらの混合物からなる群から選択することができる。例えば、企図されるナノ粒子は、数平均分子量が約１５〜約２０ｋＤａであるポリ（乳酸）と、数平均分子量が約４〜約６ｋＤａであるポリ（エチレン）グリコールとを含むジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含む場合がある。開示される治療用ナノ粒子は、約１０〜約９７重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、または、ある特定の実施形態では、約４０〜約９０重量パーセントのジブロックポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含み得る。

【0015】

一部の実施形態では、開示されるＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドは、数平均分子量が約１５〜約２０ｋＤａであるポリ（乳酸）（ＰＬＡ）と、数平均分子量が約４〜約６ｋＤａであるポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）とを含む。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンドコンジュゲートが、ＰＥＧとＥＧＦＲリガンドそれ自体との間に、許容される化学および／または高分子リンカーを含んでもよいことは理解される。例えば、本明細書では、アジド官能基を使用して（例えばクリック化学反応によって）ＰＥＧにコンジュゲートさせたビオチンと、標的化構築物（ＥＧＦＲ抗体に結合された抗ビオチン抗体を含むＥＧＦＲリガンド）とを有するナノ粒子が提供される。

【0016】

例えば、開示されるナノ粒子は、トランスフェリン受容体（Ｔｅｒｉ）を標的とするまたはそれに結合するのに有効な、本明細書で記載するものなどのペプチドまたは抗体リガンドを含む。ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、特定の比のリガンドがコンジュゲートしたポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンド）と非官能化ポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧ）とを含む。有効量のリガンドが、疾患または障害、例えば、がんの処置のためのナノ粒子と会合するように、ナノ粒子は、最適化された比のこれらの２種のポリマーを有することができる。例えば、リガンド密度の増加は、標的結合（細胞結合／標的取込み）を増加させ、ナノ粒子を「標的特異的」とし得る。代わりに、ナノ粒子における非官能化ポリマー（例えば、非官能化ＰＬＧＡ−ＰＥＧコポリマー）のある特定の濃度は、炎症および／または免疫原性（例えば、免疫応答を誘発する能力）を制御し、かつナノ粒子が、疾患または障害の処置のために適した循環半減期を有することを可能とする。さらに、非官能化ポリマーは、一部の実施形態では、細網内皮系（ＲＥＳ）を介した循環器系からのクリアランスの速度を低下し得る。このように、非官能化ポリマーは、投与によって粒子が体内を移動することを可能とし得る特徴を有するナノ粒子を提供し得る。一部の実施形態では、非官能化ポリマーは、それ以外の場合では高濃度になってしまうリガンドを相殺することができる。リガンドが高濃度であったなら、対象によるクリアランスが加速され、標的細胞への送達が低下してしまっていた可能性がある。

【0017】

一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子は、ナノ粒子の全ポリマー組成物（例えば、官能化＋非官能化ポリマー）の概ね０．１〜５０モルパーセント、例えば、０．１〜３０モルパーセント、例えば、０．１〜２０モルパーセント、例えば、０．１〜１０モルパーセント、例えば、０．１〜２．５モルパーセントを構成する、ＥＧＦＲリガンドにコンジュゲートした官能化ポリマーを含み得る。

【0018】

例えば、本明細書では、ポリマー（例えばＰＬＡ−ＰＥＧ）分子と関連した（例えば、直接、またはリンカーもしくは抗体／抗抗体会合を介して間接的に結合した）概ね５０〜約１０００個のリガンド、例えば、ポリマー分子と関連した約５０〜約８００、約１００〜約１０００、約２００〜約９００、約５００〜約９００、約６００〜約９００個のリガンドを含むナノ粒子が提供される。例えば、本明細書では、約５０〜約８００個のＰＬＡ−ＰＥＧ−リンカー−ＥＧＦＲリガンド分子が企図される。

【0019】

一般に、「ナノ粒子」とは、直径（例えば流体力学的直径）が、１０００ｎｍ未満、例えば約１０ｎｍ〜約２００ｎｍである、任意の粒子を指す。開示されている治療用ナノ粒子は、約６０〜約１２０ｎｍ、または約７０〜約１２０ｎｍ、または約８０〜約１２０ｎｍ、または約９０〜約１２０ｎｍ、または約１００〜約１２０ｎｍ、または約６０〜約１３０ｎｍ、または約７０〜約１３０ｎｍ、または約８０〜約１３０ｎｍ、または約９０〜約１３０ｎｍ、または約１００〜約１３０ｎｍ、または約１１０〜約１３０ｎｍ、または約６０〜約１４０ｎｍ、または約７０〜約１４０ｎｍ、または約８０〜約１４０ｎｍ、または約９０〜約１４０ｎｍ、または約１００〜約１４０ｎｍ、または約１１０〜約１４０ｎｍ、または約６０〜約１５０ｎｍ、または約７０〜約１５０ｎｍ、または約８０〜約１５０ｎｍ、または約９０〜約１５０ｎｍ、または約１００〜約１５０ｎｍ、または約１１０〜約１５０ｎｍ、または約１２０〜約１５０ｎｍの直径を有するナノ粒子を含み得る。例えば、開示されるナノ粒子は、約５０〜約１４０ｎｍ、約６０〜１３０ｎｍ、約７０〜約１４０ｎｍの流体力学的直径を有する場合がある。

【0020】

ポリマー
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ポリマーのマトリックスと、治療剤とを、含んでいてもよい。一部の実施形態では、治療剤および／または標的化部分（例えば、ＥＧＦＲ抗体またはペプチド）は、ポリマーマトリックスの少なくとも一部と会合させることができる。例えば、一部の実施形態では、標的化部分（例えば、ＥＧＦＲリガンド）は、ポリマーマトリックスの表面と共有結合的に会合させることができる。一部の実施形態では、共有結合的会合は、リンカーによって媒介される。治療剤は、ポリマーマトリックスの表面と会合するか、ポリマーマトリックス内にカプセル化されるか、ポリマーマトリックスによって囲まれるか、かつ／またはポリマーマトリックスにわたって分散し得る。

【0021】

多種多様のポリマーおよびそこから粒子を形成する方法は、薬物送達の当技術分野において公知である。一部の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの巨大分子を有するナノ粒子を対象とし、第１の巨大分子は、低分子量リガンド（例えば、標的化部分）に結合した第１のポリマーを含み、第２の巨大分子は、標的化部分に結合していない第２のポリマーを含む。ナノ粒子は、１種または複数のさらなる非官能化ポリマーを場合により含むことができる。

【0022】

任意の適切なポリマーを、開示されているナノ粒子において使用することができる。ポリマーは、天然または非天然（合成）のポリマーでよい。ポリマーは、２種またはそれ超のモノマーを含むホモポリマーまたはコポリマーでよい。配列に関して、コポリマーは、ランダム、ブロックでよいか、またはランダムおよびブロック配列の組合せを含むことができる。典型的には、ポリマーは、有機ポリマーである。

【0023】

用語「ポリマー」は、本明細書において使用する場合、当技術分野で使用されるようなその通常の意味を与えられ、すなわち、分子構造は、共有結合によって連結した１つまたは複数の繰り返し単位（モノマー）を含む。繰り返し単位は、全て同一であり得るか、または場合によって、ポリマー内に存在する２種以上のタイプの繰り返し単位があり得る。場合によって、ポリマーは、生物学的に由来するもの、例えば、生体ポリマーでよい。場合によって、さらなる部分、例えば、生物学的部分、例えば、下記に記載したものがまた、ポリマー中に存在し得る。２種以上のタイプの繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、ポリマーは、「コポリマー」と言われる。ポリマーを用いる任意の実施形態では、用いられるポリマーは、場合によって、コポリマーであり得ることを理解すべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の様式で配置し得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、またはブロックコポリマーとして配置してもよく、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば、第１のブロック）を含む１つまたは複数の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば、第２のブロック）を含む１つまたは複数の領域などを含む。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ超の数の別個のブロックを有し得る。

【0024】

開示されている粒子は、コポリマーを含むことができ、これは一部の実施形態では、通常、２種またはそれ超のポリマーが一緒の共有結合によって互いに会合している、２種またはそれ超のポリマー（例えば、本明細書に記載されているもの）を説明する。このように、コポリマーは、第１のポリマーおよび第２のポリマーを含んでいてもよく、これらは一緒にコンジュゲートされて、ブロックコポリマーを形成し、第１のポリマーは、ブロックコポリマーの第１のブロックでよく、第２のポリマーは、ブロックコポリマーの第２のブロックでよい。当然ながら、ブロックコポリマーは、場合によって、ポリマーの複数のブロックを含有してもよく、「ブロックコポリマー」は、本明細書において使用する場合、単一の第１のブロックおよび単一の第２のブロックのみを有するブロックコポリマーのみに限定されないことを当業者は理解する。例えば、ブロックコポリマーは、第１のポリマーを含む第１のブロック、第２のポリマーを含む第２のブロック、および第３のポリマーまたは第１のポリマーなどを含む第３のブロックを含み得る。場合によって、ブロックコポリマーは、任意の数の第１のポリマーの第１のブロック、および第２のポリマーの第２のブロック（およびある特定の場合では、第３のブロック、第４のブロックなど）を含有することができる。さらに、ブロックコポリマーはまた、場合によって、他のブロックコポリマーから形成することができることに留意すべきである。例えば、第１のブロックコポリマーは、別のポリマー（ホモポリマー、生体ポリマー、別のブロックコポリマーなどでよい）にコンジュゲートして複数のタイプのブロックを含有する新規なブロックコポリマーを形成し、かつ／または他の部分（例えば、非ポリマー部分）にコンジュゲートし得る。

【0025】

一組の実施形態では、本明細書において企図されるポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）は、生体適合性ポリマー、すなわち、典型的には、生きている対象中に挿入または注射されたとき、例えば、Ｔ細胞応答によるかなりの炎症および／または免疫系によるポリマーの急性拒絶を伴わずに有害な応答を惹起しないポリマーを含む。したがって、本明細書において企図される治療用粒子は、非免疫原性であり得る。非免疫原性という用語は、本明細書において使用する場合、循環抗体、Ｔ細胞、もしくは反応性免疫細胞を通常引き起こさないか、または最小レベルのみを引き起こし、個体においてそれ自体に対する免疫応答を通常引き起こさない、その天然状態における内在性成長因子を指す。

【0026】

生体適合性は典型的には、免疫系の少なくとも一部による材料の急性拒絶を指し、すなわち、対象中に植え込んだ非生体適合性材料が、対象において十分に重大であり得る免疫応答を誘発し、免疫系による材料の拒絶は、適当に制御することができず、材料を対象から除去しなくてはならないような程度であることが多い。生体適合性を決定するための１つの単純な試験は、ポリマーを細胞へとｉｎ ｖｉｔｒｏで曝露させることでよい。生体適合性ポリマーは、典型的には中程度の濃度で、例えば、５０マイクログラム／１０^６個の細胞の濃度でかなりの細胞死をもたらさないポリマーである。例えば、生体適合性ポリマーは、細胞、例えば、線維芽細胞または上皮細胞に曝露したとき、たとえこのような細胞によって貪食されるか、そうでなければ取り込まれるかしても、約２０％未満の細胞死をもたらし得る。様々な実施形態において有用であり得る生体適合性ポリマーの非限定的例には、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリヒドロキシブチレート、ポリ（グリセロールセバシン酸）、ポリグリコリド（すなわち、ポリ（グリコール）酸）（ＰＧＡ）、ポリラクチド（すなわち、ポリ（乳）酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン、またはこれらおよび／もしくは他のポリマーを含めたコポリマーまたは誘導体が含まれる。

【0027】

ある特定の実施形態では、企図される生体適合性ポリマーは、生分解性でよく、すなわち、ポリマーは、生理学的環境内、例えば、体内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。本明細書において使用する場合、「生分解性」ポリマーは、細胞中に導入されるとき、細胞の機構によって（生物学的に分解可能）、および／または化学プロセス、例えば、加水分解によって（化学的に分解可能）、細胞に対してかなりの毒性効果を伴わずに細胞が再使用または処分することができる成分へと分解されるものである。一実施形態では、生分解性ポリマーおよびこれらの分解副生成物は、生体適合性であり得る。

【0028】

本明細書において開示されている粒子は、ＰＥＧを含有してもよいか、またはしなくてもよい。さらに、ある特定の実施形態は、ポリ（エステル−エーテル）を含有するコポリマー、例えば、エステル結合（例えば、Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’結合）およびエーテル結合（例えば、Ｒ−Ｏ−Ｒ’結合）によって結合した繰り返し単位を有するポリマーを対象とすることができる。一部の実施形態では、生分解性ポリマー、例えば、カルボン酸基を含有する加水分解性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位とコンジュゲートして、ポリ（エステル−エーテル）を形成し得る。ポリ（エチレングリコール）繰り返し単位を含有するポリマー（例えば、コポリマー、例えば、ブロックコポリマー）はまた、「ペグ化」ポリマーと称することができる。

【0029】

一部の実施形態では、ポリマーは、本明細書において「ＰＬＧＡ」と集団的に称される、乳酸およびグリコール酸単位を含むコポリマー、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ならびに本明細書において「ＰＧＡ」と称される、グリコール酸単位、ならびに本明細書において「ＰＬＡ」と集団的に称される、乳酸単位、例えば、ポリ−Ｌ−乳酸、ポリ−Ｄ−乳酸、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸、ポリ−Ｌ−ラクチド、ポリ−Ｄ−ラクチド、およびポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチドを含むホモポリマーを含めた、ポリエステルであり得る。一部の実施形態では、例示的なポリエステルには、例えば、ポリヒドロキシ酸；ラクチドおよびグリコリドのペグ化ポリマーおよびコポリマー（例えば、ペグ化ＰＬＡ、ペグ化ＰＧＡ、ペグ化ＰＬＧＡ、およびその誘導体）が含まれる。一部の実施形態では、ポリエステルは、例えば、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）ペグ化ポリ（オルトエステル）、ポリ（カプロラクトン）、ペグ化ポリ（カプロラクトン）、ポリリシン、ペグ化ポリリシン、ポリ（エチレンイミン）、ペグ化ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｌ−リシン）、ポリ（セリンエステル）、ポリ（４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンエステル）、ポリ［α−（４−アミノブチル）−Ｌ−グリコール酸］、およびその誘導体を含む。

【0030】

一部の実施形態では、ポリマーは、ＰＬＧＡであり得る。ＰＬＧＡは、乳酸およびグリコール酸の生体適合性および生分解性コポリマーであり、様々な形態のＰＬＧＡは、乳酸：グリコール酸の比によって特性決定することができる。乳酸は、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、またはＤ，Ｌ−乳酸でよい。ＰＬＧＡの分解速度は、乳酸−グリコール酸の比を変化させることによって調節することができる。一部の実施形態では、ＰＬＧＡは、概ね８５：１５、概ね７５：２５、概ね６０：４０、概ね５０：５０、概ね４０：６０、概ね２５：７５、または概ね１５：８５の乳酸：グリコール酸比によって特性決定することができる。一部の実施形態では、粒子のポリマー（例えば、ＰＬＧＡブロックコポリマーまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧブロックコポリマー）中の乳酸のグリコール酸モノマーに対する比を選択して、様々なパラメータ、例えば、水の取込み、治療剤の放出および／またはポリマー分解の反応速度について最適化し得る。

【0031】

ＰＬＡ−ＰＥＧコポリマーの一部としてのＰＥＧは、例えば、リガンドにコンジュゲートされていない場合、終端し、末端基を含む場合もあることが企図される。例えば、ＰＥＧは、ヒドロキシル、メトキシもしくは他のアルコキシル基、メチルもしくは他のアルキル基、アリール基、カルボン酸、アミン、アミド、アセチル基、グアニジノ基、またはイミダゾールで終端し得る。他の企図される末端基には、アジド、アルキン、マレイミド、アルデヒド、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、アルコキシアミン、またはチオール部分が含まれる。

【0032】

当業者は、例えば、開環重合技術（ＲＯＭＰ）などによって、ポリマーをアミンで終端しているＰＥＧ基に反応させるＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）を使用することによって、ポリマーをペグ化するための方法および技術について知っている。

【0033】

開示されている粒子は、例えば、ＰＥＧおよびＰＬ（Ｇ）Ａのジブロックコポリマーを含むことができ、例えば、ＰＥＧ部分は、約１，０００〜２０，０００、例えば、約２，０００〜２０，０００、例えば、約２〜約１０，０００（例えば、約５ｋＤa）の数平均分子量を有してもよく、ＰＬ（Ｇ）Ａ部分は、約５，０００〜約２０，０００、または約５，０００〜１００，０００、例えば、約２０，０００〜７０，０００、例えば、約１５，０００〜５０，０００（例えば、約１６ｋＤa）の数平均分子量を有してもよい。

【0034】

例えば、約１０〜約９９重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、または約２０〜約８０重量パーセント、約４０〜約８０重量パーセント、もしくは約３０〜約５０重量パーセント、もしくは約７０〜約９０重量パーセントのポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーまたはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーを含む例示的な治療用ナノ粒子が本明細書において開示される。例示的なポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約１５〜約２０ｋＤａ、または約１０〜約２５ｋＤａの数平均分子量のポリ（乳）酸および約４〜約６ｋＤａ、または約２ｋＤａ〜約１０ｋＤａの数平均分子量のポリ（エチレン）グリコールを含むことができる。

【0035】

一部の実施形態では、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマーは、約０．６〜約０．９５、一部の実施形態では、約０．７〜約０．９、一部の実施形態では、約０．６〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７〜約０．８、一部の実施形態では、約０．７５〜約０．８５、一部の実施形態では、約０．８〜約０．９、および一部の実施形態では、約０．８５〜約０．９５の数平均分子量比率のポリ（乳）酸を有し得る。ポリ（乳）酸の数平均分子量比率は、コポリマーのポリ（乳）酸成分の数平均分子量を、ポリ（乳）酸成分の数平均分子量およびポリ（エチレン）グリコール成分の数平均分子量の合計で除することによって計算し得ることを理解すべきである。

【0036】

開示されているナノ粒子は、約１〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸（ＰＥＧを含まない）を場合により含んでいてもよいか、または約１〜約５０重量パーセント、もしくは約１０〜約５０重量パーセントもしくは約３０〜約５０重量パーセントのポリ（乳）酸もしくはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸を場合により含んでいてもよい。例えば、ポリ（乳）酸またはポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸は、約５〜約１５ｋＤａ、または約５〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＡは、約５〜約１０ｋＤａの数平均分子量を有し得る。例示的なＰＬＧＡは、約８〜約１２ｋＤａの数平均分子量を有し得る。

【0037】

治療用ナノ粒子は、一部の実施形態では、約１０〜約３０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１０〜約１５重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２０重量パーセント、一部の実施形態では、約１５〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約２５重量パーセント、一部の実施形態では、約２０〜約３０重量パーセント、または一部の実施形態では、約２５〜約３０重量パーセントのポリ（エチレン）グリコールを含有してもよく、ポリ（エチレン）グリコールは、ポリ（乳）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、ポリ（乳）酸−ｃｏ−ポリ（グリコール）酸−ポリ（エチレン）グリコールコポリマー、またはポリ（エチレン）グリコールホモポリマーとして存在し得る。

【0038】

ＥＧＦＲリガンド
本明細書では、ＥＧＦＲリガンドを含み得るナノ粒子が提供される。企図されるＥＧＦＲ部分は、低分子、ペプチド、またはタンパク質を含み得る。標的化部分は、抗体とすることができ、この用語は、抗体の特徴的な部分である抗体断片を含むものとする。抗体断片には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、またはＦ（ａｂ’）２を含めることができる。単鎖標的化部分は、例えば、ファージディスプレイなどの手順を使用して同定することができる。標的化部分は、約５０残基までまたはそれを超える長さを有する、標的化ペプチドまたは標的化ペプチド模倣物でよい。開示されるポリマーコンジュゲートは、適切ないかなるコンジュゲーション技術を使用して形成してもよい。

【0039】

本明細書で開示するＥＧＦＲ標的化部分は、一部の実施形態では、開示されるポリマーまたはコポリマー（例えばＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートさせることができ、そのようなポリマーコンジュゲートが、開示されるナノ粒子の一部を形成する場合もある。例えば、銅を媒介としたアルキン−アジド付加環化化学（ＣｕＡＡＣ）を使用して、ＥＧＦＲ標的化ペプチドをＰＬＡ−ＰＥＧに、例えば、ナノ粒子の表面上のＰＥＧに、コンジュゲートさせることができる。別の実施形態では、歪み促進型アジドアルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）化学を使用してもよい。例えば、（かなり安定であり得る）ＰＥＧ末端に、またナノ粒子表面上に、標的化リガンドそれ自体ではなく、アジド基を呈する、大規模単一バッチのＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドポリマーを合成することができる。このポリマーを用いて形成されたナノ粒子は、ナノ粒子表面上にいくつかのアジド基を有し、対応する歪みアルキン官能基を有するリガンドに、種々の密度で結合させることができる。このようにして、多くの標的化リガンドを１桁のミリグラム量で合成し、ナノ粒子コンジュゲートとしての結合についてスクリーニングすることができる。例えば、ポリマー添加剤および標的化リガンド上のより安定したアジド（Ｎ_３）基を、反応性ジベンゾシクロオクチン部分（ＤＢＣＯ）で官能化することができる。

【0040】

他の実施形態では、ＥＧＦＲリガンドおよび生体適合性ポリマー（例えば、生体適合性ポリマーおよびポリ（エチレングリコール））は、ＥＤＣ−ＮＨＳ化学反応（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド）などの技術、またはチオール、アミン、または同様に官能化されたポリエーテルの１つの末端にコンジュゲートすることができるマレイミドもしくはカルボン酸が関与する反応を使用して一緒にコンジュゲートし得る。ポリマー−標的化部分コンジュゲートまたはポリマー−薬物コンジュゲートを形成させる標的化部分または薬物およびポリマーのコンジュゲーションは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、アセトンなどなどの有機溶媒中で行うことができる。特定の反応条件は、単に通例の実験法を使用して当業者が決定することができる。

【0041】

別の組の実施形態では、コンジュゲーション反応は、カルボン酸官能基（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）を含むポリマーと、アミンを含むポリマーまたは他の部分（例えば、ＥＧＦＲ部分）とを反応させることによって行い得る。例えば、標的化部分は、アミンと反応して、アミン含有部分を形成してもよく、これは次いで、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸にコンジュゲートすることができる。このような反応は、単一ステップの反応として起こり得、すなわち、コンジュゲーションは、中間体、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはマレイミドを使用することなく行われる。一部の実施形態では、ＥＧＦＲ部分は、リンカー、例えばアミン含有リンカーと反応して、アミン含有部分を形成してもよく、次いで、これは上記のようなポリマーのカルボン酸にコンジュゲートすることができる。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマー（例えば、ポリ（エステル−エーテル）化合物）の間のコンジュゲーション反応は、一組の実施形態では、（これらに限定されないが）ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、テトラヒドロフラン、アセトン、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ピリジン、ジオキサン、またはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に可溶化したアミン含有部分を、カルボン酸末端ポリマーを含有する溶液に加えることによって達成し得る。カルボン酸末端ポリマーは、これらに限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはアセトンなどの有機溶媒中に含有し得る。アミン含有部分およびカルボン酸末端ポリマーの間の反応は、場合によって、自発的に起こり得る。コンジュゲートしていない反応物は、このような反応の後に洗い流してもよく、ポリマーは、溶媒、例えば、エチルエーテル、ヘキサン、メタノール、またはエタノール中で沈殿し得る。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、ポリマーのアルコール含有部分およびカルボン酸官能基の間に形成してもよく、これはアミンおよびカルボン酸のコンジュゲートについて上で記載したのと同様に達成することができる。

【0042】

例えば、開示されるナノ粒子の一部としての、本明細書で企図されるＥＧＦＲリガンドには、次の配列（またはその一部分）：ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ、ＬＡＲＬＬＴ、ＣＥＨＧＡＭＥＩＣ、ＡＫＦＮＤＹＷＲＷ、ＴＤＣＶＩＦＧＬＥＴＹＣＬＲ、ＳＧＣＬＤＡＬＷＱＣＶＹ、ＬＰＤＤＳＬＰＥＬＩＣＫＶＲ、ＧＰＣＶＬＩＲＤＹＹＬＬＣＬＥ、ＶＬＣＨＲＹＹＨＰＩＣＹＴ、ＭＦＣＦＲＷＹＡＧＷＳＣＶＳ、ＨＦＹＰＴＫＴＰＧＹ、ＡＡＳＲＡＬＷＡＦＮＳＤ、ＳＹＹＷＧＹＴＶＤＩＲＲＧＧＫ、ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱ、およびＳＥＣＦＰＬＡＰＤＷＬＳＣＩＬを含むペプチドが含まれる。ＥＧＦＲペプチドを、非天然アミノ酸、重水素化アミノ酸などを含むように修飾してもよいことは理解される。例えば、開示される配列のトリプトファンを、フェニルアラニン、アラニン、および／または他の天然もしくは非天然アミノ酸により置き換えることができる。追加の実施形態では、ＥＧＦＲリガンドを、反応性ジベンゾシクロオクチン部分（ＤＢＣＯ）を使用して修飾してもよい。

【0043】

例えば、企図されるＥＧＦＲリガンドには、約１２００〜約１９００のＭＷを有するペプチドが含まれる。例示的な修飾ＥＧＦＲペプチドは、Ａｃ−ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、ＡｃＤＡＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱ、ＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎ、ＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＰｅｎＴＷＥＶＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＰＣＴＷＥＶＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、Ａｃ−ＤＡＣＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＣＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、ＡｃＤＰＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、およびＡｃＤＡＰｅｎＴ（２Ｉｎｄ）ＧＥＶ（５ＭｅＯ）ＷＧＲＥＰｅｎＬＱＧＧＫ（ＤＢＣＯ）−ＣＯＮＨ２、またはこれらの断片からなる群から選択される配列を含む。

【0044】

一実施形態では、（例えば、官能化する／ＥＧＦＲリガンドに直接または間接的に結合（例えば共有結合）させることのできるアジド基で）官能化されたＰＬＡ−ＰＥＧを有するナノ粒子が本明細書において提供される。開示されるナノ粒子には、全ＰＥＧ末端基の約１０％、約２０％、約３０％をナノ粒子表面上に有する、官能化されたＰＬＡ−ＰＥＧ−（例えば、約１０％〜約４０％官能化ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドを含めることができる（例えば、後続のコンジュゲーションによって、アジドで官能化された、リガンドを有するナノ粒子となる）。例えば、開示されるナノ粒子は、例えば、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーを含む）Ｃ末端のリシン側鎖に対して、約４〜約１２％のリガンド密度（例えば、約５％または約１０％のリガンド密度）を有し、次いで、アジドナノ粒子にコンジュゲートさせることができる。開示されるナノ粒子は、例えば、ナノ粒子１個あたり約２００〜約５００個のＥＧＦＲリガンド、または約２２５個、または約４５０個のリガンド（例えば、約２００〜約２３０個のリガンドまたは約４００〜約５０００個のリガンド）を有する場合がある。

【0045】

治療剤
本開示によれば、例えば、治療剤（例えば、抗がん剤）、診断薬（例えば、造影剤、放射性核種、ならびに蛍光、発光、および磁気部分）、予防薬（例えば、ワクチン）、および／または栄養剤（例えば、ビタミン、無機質など）を含むいかなる薬剤も、開示されるナノ粒子によって送達することができる。送達される、かつ／または開示されるナノ粒子の一部を形成する、例示的な薬剤には、限定はしないが、低分子（例えば、細胞傷害性薬剤）、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、およびマイクロＲＮＡ剤）、タンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、脂質、炭水化物、ホルモン、金属、放射性元素および化合物、薬物、ワクチン、免疫薬など、および／またはこれらの組合せが含まれる。

【0046】

活性剤または薬物は、抗新生物剤、例えば、ｍＴｏｒ阻害剤（例えば、シロリムス、テムシロリムス、またはエベロリムス）、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ジテルペン誘導体、またはタキサン、例えば、パクリタキセル（またはその誘導体、例えば、ＤＨＡ−パクリタキセルもしくはＰＧ−パクリタキセル）またはドセタキセルなどの、治療剤でよい。

【0047】

上で論じたとおり、開示されるナノ粒子は、治療剤を含有し得る。企図される薬剤には、タキサン薬剤、キナーゼ阻害剤などの化学療法剤が含まれる。例えば、開示されるナノ粒子は、（例えば、治療剤）ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の１つまたは複数、例えば、ゲフィチニブ、エルロトニンブ（ｅｒｌｏｔｎｉｎｂ）、および／またはラパチニブの１つもしくは複数を含む場合がある。イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ポナチニブ、バフェチニブ（ｂａｆｅｔｉｎｉｂ）などのチロシンキナーゼ阻害剤を含有するナノ粒子も企図される。ナノ粒子のいずれかの実施形態において、ダサチニブを、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ポナチニブ、バフェチニブ、または、例えば、他のいずれかのＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤の代わりに用いてもよいことになる。

【0048】

一組の実施形態において、治療剤は、薬物または２種以上の薬物の組合せである。例示的な組合せまたは単独治療剤には、化学療法剤、例えば、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ゲムシタビン（ｇｅｍｚａｒ）、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、ベノレルビン（ｖｅｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチンやビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、ブレオマイシン、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、カバジタキセル、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、Ｓ−Ｉカペシタビン、フトラフール、５’デオキシフルオロウリジン、ＵＦＴ、エニルウラシル、デオキシシチジン、５−アザシトシン、５−アザデオキシシトシン、アロプリノール、２−クロロアデノシン、トリメトレキセート、アミノプテリン、メチレン−１０−デアザアミノプテリン（ＭＤＡＭ）、オキサプラチン、ピコプラチン、テトラプラチン（ｔｅｔｒａｐｌａｔｉｎ）、サトラプラチン、白金−ＤＡＣＨ、オルマプラチン、ＣＩ−９７３、ＪＭ−２１６、およびそれらの類似体、エピルビシン、リン酸エトポシド、９−アミノカンプトテシン、１０，１１−メチレンジオキシカンプトテシン、カレニテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＴＡＳ１０３、ビンデシン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、イホスファミドメホスファミド、ペルホスファミド、トロホスファミドカルムスチン、セムスチン、エポチロンＡ〜Ｅ、トムデックス、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アムサクリン、リン酸エトポシド、カレニテシン、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アマンタジン、リマンタジン、ラミブジン、ジドブジン、ベバシズマブ、トラスツズマブ、リツキシマブ、５−フルオロウラシル、ならびにこれらの組合せが含まれる。

【0049】

開示されるナノ粒子の一部を形成し得る潜在的に適切な単独または配合薬物の非限定的な例としては、例えば、カバジタキセル、ミトキサントロン、およびミトキサントロン塩酸塩を含む抗がん剤が挙げられる。別の実施形態では、ペイロードは、２０−ｅｐｉ−１、２５ジヒドロキシビタミンＤ３、４−イポメアノール（４−ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）、５−エチニルウラシル、９−ジヒドロタキソール、アビラテロン、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩（ａｃｏｄａｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、アクロニン、アシルフィイルベン（ａｃｙｌｆｉｉｌｖｅｎｅ）、アデシペノール（ａｄｅｃｙｐｅｎｏｌ）、アドゼレシン、アルデスロイキン、全ｔｋ拮抗薬、アルトレタミン、アンバムスチン（ａｍｂａｍｕｓｔｉｎｅ）、アンボマイシン（ａｍｂｏｍｙｃｉｎ）、酢酸アメタントロン（ａｍｅｔａｎｔｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、アミドクス（ａｍｉｄｏｘ）、アミフォスチン、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド（ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｏｌｉｄｅ）、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、アントラマイシン、抗背方化形態形成タンパク質１、抗エストロゲン薬、抗新生物薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィディコリン、アポトーシス遺伝子モジュレーター、アポトーシスレギュレーター、アプリン酸、ＡＲＡ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスパラギナーゼ、アスペルリン（ａｓｐｅｒｌｉｎ）、アスラクリン（ａｓｕｌａｃｒｉｎｅ）、アタメスタン、アトリムスチン（ａｔｒｉｍｕｓｔｉｎｅ）、アキシナスタチン１（ａｘｉｎａｓｔａｔｉｎ１）、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザシチジン、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン（ａｚａｔｙｒｏｓｉｎｅ）、アゼテパ、アゾトマイシン（ａｚｏｔｏｍｙｃｉｎ）、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ベンゾクロリン、ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）、ベンゾイルスタウロスポリン（ｂｅｎｚｏｙｌｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、ベータラクタム誘導体、ベータ−アレチン（ｂｅｔａ−ａｌｅｔｈｉｎｅ）、ベタクラマイシンＢ（ｂｅｔａｃｌａｍｙｃｉｎＢ）、ベツリン酸、ＢＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビサントレン塩酸塩、ビスアズイジニルスペルミン（ｂｉｓａｚｕｉｄｉｎｙｌｓｐｅｒｍｉｎｅ）、ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ）、ジメシル酸ビスナフィド（ｂｉｓｎａｆｉｄｅ ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）、ビストラテンＡ（ｂｉｓｔｒａｔｅｎｅＡ）、ビセレシン、ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、ＢＲＣ／ＡＢＬ拮抗薬、ブレフレート（ｂｒｅｆｌａｔｅ）、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブドチタン（ｂｕｄｏｔｉｔａｎｅ）、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、カンプトテシン誘導体、カナリア痘ＩＬ−２、カペシタビン、カラセライド（ｃａｒａｃｅｒａｉｄｅ）、カバジタキセル、カルベチマー（ｃａｒｂｅｔｉｍｅｒ）、カルボプラチン、カルボキサミド−アミノ−トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）、カレストＭ３（ｃａｒｅｓｔＭ３）、カルムスチン、ｅａｒｎ７００、軟骨由来阻害剤、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン（ｃａｒｚｅｌｅｓｉｎ）、カゼインキナーゼ阻害剤、カスタノスペルニン（ｃａｓｔａｎｏｓｐｅｒｒｎｉｎｅ）、セクロピンＢ、セデフィンゴール（ｃｅｄｅｆｉｎｇｏｌ）、セトロレリクス、クロラムブシル、クロリン、クロロキノキサリンスルホンアミド（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｏｘａｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）、シカプロスト（ｃｉｃａｐｒｏｓｔ）、シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、ｃｉｓ−ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシン（ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン（ｃｏｎａｇｅｎｉｎ）、クランベシジン８１６（ｃｒａｍｂｅｓｃｉｄｉｎ ８１６）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、メシル酸クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ（ｃｕｒａｃｉｎ Ａ）、シクロペンタアントラキノン、シクロホスファミド、シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）、シペマイシン（ｃｙｐｅｍｙｃｉｎ）、シタラビン、シタラビンオクホスフェート（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ ｏｃｆｏｓｆａｔｅ）、細胞溶解因子、シトスタチン（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｎ）、ダカルバジン、ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デヒドロジデムニンＢ（ｄｅｈｙｄｒｏｄｉｄｅｍｎｉｎＢ）、デスロレリン、デキシホスフアミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、デキソルマプラチン（ｄｅｘｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、デクスラゾキサン、デクスベラパミル、デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ）、メシル酸デザグアニン（ｄｅｚａｇｕａｎｉｎｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、ジアジクォン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ジデムニンＢ、ジドキス（ｄｉｄｏｘ）、ジエチヒオルスペルミン（ｄｉｅｔｈｙｈｉｏｒｓｐｅｒｍｉｎｅ）、ジヒドロ−５−アザシチジン、ジオキサマイシン（ｄｉｏｘａｍｙｃｉｎ）、ジフェニルスピロムスチン（ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ）、クエン酸ドロロキシフェン（ｄｒｏｌｏｘｉｆｅｎｅ ｃｉｔｒａｔｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドロナビノール、ズアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）、ズオカンニシンＳＡ（ｄｕｏｃａｎｎｙｃｉｎＳＡ）、エブセレン、エコムスチン（ｅｃｏｍｕｓｔｉｎｅ）、エダトレキセート、エデルホシン（ｅｄｅｌｆｏｓｉｎｅ）、エドレコロマブ、エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）、エフロミチン塩酸塩、エレメン（ｅｌｅｍｅｎｅ）、エルサルニトルシン（ｅｌｓａｒｎｉｔｒｕｃｉｎ）、エミテフール（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、エンロプラチン（ｅｎｌｏｐｌａｔｉｎ）、エンプロメート（ｅｎｐｒｏｍａｔｅ）、エピプロピジン（ｅｐｉｐｒｏｐｉｄｉｎｅ）、エピルビシン、エピルビシン塩酸塩、エプリステリド、エルブロゾール（ｅｒｂｕｌｏｚｏｌｅ）、赤血球遺伝子治療ベクター系、エソルビシン塩酸塩、エストラムスチン、エストラムスチン類似体、リン酸エストラムチンナトリウム、エストロゲン作動薬、エストロゲン拮抗薬、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン（ｅｔｏｐｒｉｎｅ）、エキセメスタン、ファドロゾール、ファドロゾール塩酸塩、ファザラビン（ｆａｚａｒａｂｉｎｅ）、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン（ｆｌｅｚｅｌａｓｔｉｎｅ）、フロクスウリジン、フルアステロン（ｆｌｕａｓｔｅｒｏｎｅ）、フルダラビン、リン酸フルダラビン、フルオロダウノルニシン塩酸塩（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フルオロウラシル、フルロシタビン（ｆｌｕｒｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ホルフェニメキス（ｆｏｒｆｅｎｉｍｅｘ）、ホルメスタン、ホスキドン（ｆｏｓｑｕｉｄｏｎｅ）、フォストリエシン、フォストリエシンナトリウム、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ガニレリクス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム（ｈｅｐｓｕｌｆａｍ）、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒドロキシ尿素、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イダルビシン塩酸塩、イドキシフェン、イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）、イホスファミド、イーノホシン（ｉｈｎｏｆｏｓｉｎｅ）、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫賦活ペプチド、インスリン様成長因子１受容体阻害剤、インターフェロン作動薬、インターフェロンアルファ−２Ａ、インターフェロンアルファ−２Ｂ、インターフェロンアルファ−Ｎｌ、インターフェロンアルファ−Ｎ３、インターフェロンベータ−ＩＡ、インターフェロンガンマ−ＩＢ、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン（ｉｏｂｅｎｇｕａｎｅ）、ヨードドキソルビシン（ｉｏｄｏｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イプロプラトム（ｉｐｒｏｐｌａｔｍ）、イリノテカン、イリノテカン塩酸塩、イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）、イルソグラジン、イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）、イソホモハリコンドリンＢ（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎＢ）、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ（ｋａｈａｌａｌｉｄｅＦ）、ラメラリン−Ｎトリアセテート（ｌａｍｅｌｌａｒｉｎ−Ｎ ｔｒｉａｃｅｔａｔｅ）、ランレオチド、酢酸ランレオチド、レイナマイシン（ｌｅｉｎａｍｙｃｉｎ）、レノグラスチム、硫酸レンチナン、レプトルスタチン（ｌｅｐｔｏｌｓｔａｔｉｎ）、レトロゾール、白血病抑制因子、白血球アルファインターフェロン、酢酸リュープロリド、リュープロリド／エストロゲン／プロゲステロン、リュープロレリン、レバミゾール、リアロゾール、リアロゾール塩酸塩、線状ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリンアミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）、ロバプラチン、ロンブリシン（ｌｏｍｂｒｉｃｉｎｅ）、ロメトレキソール（ｌｏｍｅｔｒｅｘｏｌ）、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、ロニダミン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ロソキサントロン塩酸塩、ロバスタチン、ロキソリビン、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、ルテチウムテキサフィリンリソフィリン（ｌｕｔｅｔｉｕｍ ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）、溶解性ペプチド、マイタンシン（ｍａｉｔａｎｓｉｎｅ）、マンノスタチンＡ（ｍａｎｎｏｓｔａｔｉｎＡ）、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メイタンシン、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルバロン、メルカプトプリン、メテレリン（ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、メチオニナーゼ（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎａｓｅ）、メトトレキセート、メトトレキセートナトリウム、メトクロプラミド、メトプリン（ｍｅｔｏｐｒｉｎｅ）、メツレデパ（ｍｅｔｕｒｅｄｅｐａ）、微細藻類タンパク質キナーゼＣ阻害剤、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、不適正二本鎖ＲＮＡ、ミチンドミド（ｍｉｔｉｎｄｏｍｉｄｅ）、ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）、ミトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、ミトグアゾン、ミトラクトール、ミトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）、マイトマイシン、マイトマイシン類似体、ミトナフィド（ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅ）、ミトスペル（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）、ミトタン、ミトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン、ミトキサントロン、ミトキサントロン塩酸塩、モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホスホリルリピドａ／マイコバクテリウム細胞壁ＳＫ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多重腫瘍抑制因子１を主体とした治療、マスタード抗がん剤、ミカペルオキシドＢ（ｍｙｃａｐｅｒｏｘｉｄｅＢ）、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミコフェノール酸、ミリアポロン（ｍｙｒｉａｐｏｒｏｎｅ）、ｎ−アセチルジナリン、ナファレリン、ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）、ナロキソン／ペンタゾシン、ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）、ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）、ナルトグ
ラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ネリドロン酸（ｎｅｒｉｄｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン（ｎｉｓａｍｙｃｉｎ）、一酸化窒素モジュレーター、窒素酸化物抗酸化剤、ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）、ノコダゾール、ノガラマイシン、ｎ−置換ベンズアミド、Ｏ６−ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン（ｏｋｉｃｅｎｏｎｅ）、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オラシン（ｏｒａｃｉｎ）、経口サイトカイン誘導因子、オルマプラチン（ｏｒｍａｐｌａｔｉｎ）、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン（ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、オキシスラン（ｏｘｉｓｕｒａｎ）、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン（ｐａｌａｕａｍｉｎｅ）、パルミトイルリゾキシン（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｒｈｉｚｏｘｉｎ）、パミドロン酸、パナキシトリオール（ｐａｎａｘｙｔｒｉｏｌ）、パノミフェン（ｐａｎｏｍｉｆｅｎｅ）、パラバクチン（ｐａｒａｂａｃｔｉｎ）、パゼリプチン（ｐａｚｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）、ペグアスパラガーゼ、ペルデシン（ｐｅｌｄｅｓｉｎｅ）、ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）、ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）、硫酸ペプロマイシン、ペルフルブロン、ペルホスフアミド（ｐｅｒｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン（ｐｈｅｎａｚｉｎｏｍｙｃｉｎ）、フェニルアセテート、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、ピロカルピン塩酸塩、ピポブロマン、ピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）、ピラルビシン、ピリトレキシム、ピロキサントロン塩酸塩（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、プルアセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ、プルアセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子、白金錯体、白金化合物、白金−トリアミン錯体、プリカマイシン、プロメスタン（ｐｌｏｍｅｓｔａｎｅ）、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン塩酸塩、プロピルビス−アクリドン、プロスタグランジンＪ２、前立腺癌抗アンドロゲン薬、プロテアソーム阻害剤、タンパク質Ａを主体とした免疫モジュレーター、タンパク質キナーゼＣ阻害剤、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、ピューロマイシン、ピューロマイシン塩酸塩、プルプリン、ピラゾルリン（ｐｙｒａｚｏｒｕｒｉｎ）、ピラゾロアクリジン（ｐｙｒａｚｏｌｏａｃｒｉｄｉｎｅ）、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ＲＡＦ拮抗薬、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ＲＡＳファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＳ−ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン（ｒｅｔｅｌｌｉｐｔｉｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）、エチドロン酸レニウムＲＥ１８６、リゾキシン（ｒｈｉｚｏｘｉｎ）、リボプリン（ｒｉｂｏｐｒｉｎｅ）、リボザイム、ＲＨレチナルニド（ＲＨ ｒｅｔｉｎａｒｎｉｄｅ）、ＲＮＡｉ、ログレトイミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）、ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢｌ（ｒｕｂｉｇｉｎｏｎｅＢｌ）、ルボキシル（ｒｕｂｏｘｙｌ）、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、サイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）、サルクヌ（ｓａｒｃｎｕ）、サルコフィトールＡ（ｓａｒｃｏｐｈｙｔｏｌＡ）、サルグラモスチム、ＳＤＩ１模倣物、セムスチン、老化由来阻害因子１（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１）、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達モジュレーター、シムトラゼン（ｓｉｍｔｒａｚｅｎｅ）、単鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ボロカプト酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン（ｓｏｎｅｒｍｉｎ）、スパルホサフナトリウム（ｓｐａｒｆｏｓａｆｅ ｓｏｄｉｕｍ）、スパルホス酸（ｓｐａｒｆｏｓｉｃ ａｃｉｄ）、スパルソマイシン、スピカマイシンＤ（ｓｐｉｃａｍｙｃｉｎＤ）、スピロゲルマニウム塩酸塩、スピロムスチン（ｓｐｉｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、スピロプラチン（ｓｐｉｒｏｐｌａｔｉｎ）、スプレノペンチン（ｓｐｌｅｎｏｐｅｎｔｉｎ）、スポンギスタチン１（ｓｐｏｎｇｉｓｔａｔｉｎ １）、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド（ｓｔｉｐｉａｍｉｄｅ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ストロメライシン阻害剤、スルフィノシン（ｓｕｌｆｉｎｏｓｉｎｅ）、スロフェヌル（ｓｕｌｏｆｅｎｕｒ）、超活性血管作動性腸ペプチド拮抗薬、スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）、スラミン、スウェインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリソマイシン（ｔａｌｉｓｏｍｙｃｉｎ）、タリムスチン（ｔａｌｌｉｍｕｓｔｉｎｅ）、タモキシフェンメチオジド（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｍｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）、タウロムスチン（ｔａｕｒｏｍｕｓｔｉｎｅ）、タザロテン、テコガランナトリウム（ｔｅｃｏｇａｌａｎ ｓｏｄｉｕｍ）、テガフール、テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）、テロメラーゼ阻害剤、テロキサントロン塩酸塩（ｔｅｌｏｘａｎｔｒｏｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テルオキシロン（ｔｅｒｏｘｉｒｏｎｅ）、テストラクトン、テトラクロロデカオキシド（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｅｃａｏｘｉｄｅ）、テトラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）、タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）、サリドマイド、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオコラリン（ｔｈｉｏｃｏｒａｌｉｎｅ）、チオグアニン、チオテパ、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣物、サイマルファシン、サイモポエチン受容体作動薬、チモトリナン（ｔｈｙｍｏｔｒｉｎａｎ）、甲状腺刺激ホルモン、チアゾフリン、スズエチルエチオプルプリン（ｔｉｎ ｅｔｈｙｌ ｅｔｉｏｐｕｒｐｕｒｉｎ）、チラパザミン、チタノセンジクロリド（ｔｉｔａｎｏｃｅｎｅ ｄｉｃｈｌｏｒｉｄｅ）、トポテカン塩酸塩、トプセンチン（ｔｏｐｓｅｎｔｉｎ）、トレミフェン、クエン酸トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、酢酸トレストロン（ｔｒｅｓｔｏｌｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ）、リン酸トリシリビン（ｔｒｉｃｉｒｉｂｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、トリメトレキセート、グルクロン酸トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、トリプトレリン、トロピセトロン、ツブロゾール塩酸塩（ｔｕｂｕｌｏｚｏｌｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ツロステリド（ｔｕｒｏｓｔｅｒｉｄｅ）、チロシンキナーゼ阻害剤、チロホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、ウラシルマスタード、ウレデパ（ｕｒｅｄｅｐａ）、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体拮抗薬、バプレオチド（ｖａｐｒｅｏｔｉｄｅ）、バリオリンＢ（ｖａｒｉｏｌｉｎＢ）、ベラレソール（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）、ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎ）、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン（ｖｉｎｅｐｉｄｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸ビングリシネート（ｖｉｎｇｌｙｃｉｎａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、硫酸ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、ビノレルビンもしくは酒石ビノレルビン、硫酸ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）、硫酸ビンゾリジン（ｖｉｎｚｏｌｉｄｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）、ボロゾール、ザノテロン（ｚａｎｏｔｅｒｏｎｅ）、ゼニプラチン（ｚｅｎｉｐｌａｔｉｎ）、ジラスコルブ（ｚｉｌａｓｃｏｒｂ）、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、またはゾルビシン塩酸塩などの抗がん薬でよい。

【0050】

一実施形態では、開示されるナノ粒子が、例えば、活性剤に加えて、疎水性酸を含んでもよい。例えば、開示されるナノ粒子は、疎水性酸（脂肪酸および／または胆汁酸など）を含む場合もあり、かつ／または疎水性酸を含むプロセスによって調製されている。この実施形態では、適切ないずれかの疎水性酸、例えば、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘンエイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、ペンタコサン酸、セロチン酸、ヘプタコサン酸、モンタン酸（ｍｏｎｔａｎｉｃ ａｃｉｄ）、ノナコサン酸、メリシン酸、ヘナトリアコンタン酸（ｈｅｎａｔｒｉａｃｏｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ラッセロ酸（ｌａｃｃｅｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、プシルル酸（ｐｓｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ）、ゲダ酸（ｇｅｄｄｉｃ ａｃｉｄ）、セロプラスチン酸（ｃｅｒｏｐｌａｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、ヘキサトリアコンタン酸、およびこれらの組合せなどの飽和脂肪酸が企図される。

【0051】

不飽和脂肪酸の非限定的な例には、ヘキサデカトリエン酸、アルファ−リノレン酸、ステアリドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ヘンエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、テトラコサペンタエン酸、テトラコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ−リノール酸、エイコサジエン酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ドコサジエン酸、アドレン酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサテトラエン酸、テトラコサペンタエン酸、オレイン酸、エイコセン酸、メアド酸（ｍｅａｄ ａｃｉｄ）、エルカ酸、ネルボン酸、ルメン酸（ｒｕｍｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、α−カレンド酸、β−カレンド酸、ジャカル酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、カタルプ酸、プニカ酸、ルメレン酸（ｒｕｍｅｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、ボッセオペンタエン酸（ｂｏｓｓｅｏｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、ピノレン酸、ポドカルプ酸、パルミトオレイン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、およびこれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、疎水性酸は、胆汁酸でもよい。胆汁酸の非限定的な例には、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、ヒコール酸（ｈｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ベータ−ムリコール酸、コール酸、アミノ酸抱合胆汁酸、およびこれらの組合せが含まれる。アミノ酸抱合胆汁酸は、適切ないかなるアミノ酸抱合でもよい。一部の実施形態では、アミノ酸抱合胆汁酸は、グリシン抱合胆汁酸またはタウリン抱合胆汁酸である。

【0052】

開示される治療用ナノ粒子は、ナノ粒子の約０．２〜約２５重量パーセント、または、例えば、約１〜約１０重量パーセント、約０．５〜約６重量パーセント、約０．１〜約３重量パーセント、もしくは約２〜約１２重量パーセントの治療剤を含み得る。

【0053】

一部の実施形態では、治療用ナノ粒子は、ポリマー−薬物コンジュゲートを含み得る。例えば、薬物は、開示されているポリマーまたはコポリマー（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ）にコンジュゲートしていてもよく、このようなポリマー−薬物コンジュゲートは、開示されているナノ粒子の一部を形成し得る。例えば、開示されている治療用ナノ粒子は、約０．２〜約３０重量パーセントのＰＬＡ−ＰＥＧまたはＰＬＧＡ−ＰＥＧを場合により含んでいてもよく、ＰＥＧは、薬物（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧ−薬物）で官能化されている。

【0054】

医薬製剤
本明細書において開示されているナノ粒子は、別の態様によって、薬学的に許容できる担体と合わさり、医薬組成物を形成し得る。当業者が理解するように、担体は、下記のような投与経路、標的組織の場所、送達される薬物、薬物の送達の時間経過などに基づいて選択し得る。

【0055】

医薬組成物は、経口および非経口経路を含めた当技術分野において公知の任意の手段によって患者に投与することができる。用語「患者」は、本明細書において使用する場合、ヒト、ならびに例えば、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、および魚を含めた非ヒトを指す。例えば、非ヒトは、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、霊長類、またはブタ）であり得る。ある特定の実施形態では、非経口経路が、消化管において見出される消化酵素との接触を回避するために望ましい。このような実施形態によると、組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋内、腹腔内注射）、直腸、経膣的、局所的（散剤、クリーム剤、軟膏剤、もしくは点眼剤によるなど）によって、または吸入（スプレーによるなど）によって投与し得る。

【0056】

特定の実施形態では、ナノ粒子は、それを必要とする対象に全身的に、例えば、ＩＶ注入または注射によって投与される。

【0057】

注射可能な調製物、例えば、無菌の注射可能な水性または油性懸濁液は、適切な分散化剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して公知技術によって製剤化し得る。無菌の注射可能な調製物はまた、無毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の無菌の注射可能な溶液、懸濁液、またはエマルジョン、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液でよい。用いることができる許容できるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張食塩液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒として従来用いられる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含めた任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射剤の調製において使用される。一実施形態では、コンジュゲートを、１％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（商標）８０を含む担体液に懸濁させる。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の無菌の注射可能な媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌の固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、無菌化することができる。

【0058】

経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を含む。このような固体剤形において、カプセル化されたか、またはカプセル化されていないコンジュゲートを、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容できる添加剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウム、ならびに／または（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア、（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイ、ならびに（ｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物と混合する。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含む。

【0059】

医薬剤を含有するナノ粒子の正確な投与量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択され、一般に、投与量および投与は、有効量の医薬剤ナノ粒子を処置される患者に提供するように調節されることを認識されたい。本明細書において使用する場合、医薬剤を含有するナノ粒子の「有効量」は、所望の生物学的応答を引き出すのに必要な量を指す。当業者が理解するように、医薬剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達される薬物、標的組織、投与経路などの要因によって変わり得る。例えば、医薬剤を含有するナノ粒子の有効量は、所望の期間にわたり所望の量の腫瘍サイズの低減をもたらす量であり得る。考慮し得るさらなる要因は、病態の重症度；処置される患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；薬物の組合せ；反応感受性；ならびに治療に対する耐性／応答を含む。

【0060】

ナノ粒子は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与量単位形態で製剤化し得る。「投与量単位形態」という表現は、本明細書において使用する場合、処置される患者に適当なナノ粒子の物理的個別単位を指す。しかし、組成物の一日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決められることが理解される。任意のナノ粒子について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて最初に推定することができる。動物モデルをまた使用して、望ましい濃度範囲および投与経路を達成する。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定することができる。ナノ粒子の治療有効性および毒性、例えば、ＥＤ_５０（用量は集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ_５０（用量は集団の５０％まで致死的である）は、細胞培養物または実験動物において標準的な医薬手順によって決定することができる。毒性効果の治療効果に対する用量比は治療指数であり、これは、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物は、一部の実施形態では有用であり得る。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒト使用のための投与量範囲の配合において使用することができる。

【0061】

一部の実施形態では、本明細書において開示されているナノ粒子を含む冷凍に適した組成物が企図され、冷凍に適した溶液、例えば、糖、例えば、単糖類、二糖類、もしくは多糖類、例えば、スクロースおよび／もしくはトレハロース、ならびに／または塩および／もしくはシクロデキストリン溶液を、ナノ粒子懸濁液に加える。糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）は、例えば、粒子が冷凍によって凝集することを防止する凍結防止剤として作用し得る。例えば、複数の開示されているナノ粒子、スクロース、イオン性ハロゲン化物、および水を含むナノ粒子製剤であり、ナノ粒子／スクロース／水／イオン性ハロゲン化物は、約３〜４０％／１０〜４０％／２０〜９５％／０．１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１０〜１５％／８０〜９０％／１〜１０％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）が本明細書において提供される。例えば、このような溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約５重量％〜約２０重量％のスクロースおよび約１０〜１００ｍＭの濃度のイオン性ハロゲン化物、例えば、塩化ナトリウムを含み得る。別の例では、複数の開示されているナノ粒子、トレハロース、シクロデキストリン、および水を含むナノ粒子製剤が本明細書において提供され、ナノ粒子／トレハロース／水／シクロデキストリンは、約３〜４０％／１〜２５％／２０〜９５％／１〜２５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）または約５〜１０％／１〜２５％／８０〜９０％／１０〜１５％（ｗ／ｗ／ｗ／ｗ）である。

【0062】

例えば、企図される溶液は、本明細書に開示されているナノ粒子、約１重量％〜約２５重量％の二糖類、例えば、トレハロースもしくはスクロース（例えば、約５重量％〜約２５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約１０重量％のトレハロースもしくはスクロース、または約１５重量％のトレハロースもしくはスクロース、例えば、約５重量％のスクロース）、および約１重量％〜約２５重量％の濃度のシクロデキストリン、例えば、β−シクロデキストリン（例えば、約５重量％〜約２０重量％、例えば、１０重量％もしくは約２０重量％、または約１５重量％〜約２０重量％のシクロデキストリン）を含み得る。企図される製剤は、複数の開示されているナノ粒子（例えば、ＰＬＡ−ＰＥＧおよび活性剤を有するナノ粒子）、および約２重量％〜約１５重量％（または約４重量％〜約６重量％、例えば、約５重量％）のスクロースおよび約５重量％〜約２０重量％（例えば、約７重量パーセント〜約１２重量％、例えば、約１０重量％）のシクロデキストリン、例えば、ＨＰｂＣＤを含み得る。

【0063】

動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、粒径を測定し得るが、これはブラウン運動に依存し、そのためこの技術は、いくつかのより大きな粒子を検出し得ない。レーザー回折は、粒子および懸濁培地の間の屈折率における差異に依存する。この技術は、サブミクロンからミリメートル範囲にて粒子を検出することができる。相対的に少（例えば、約１〜５重量％）量のより大きな粒子を、ナノ粒子懸濁液中で決定することができる。単一粒子光学検知（ＳＰＯＳ）は、約０．５μｍの個々の粒子を計数する希薄な懸濁液の光遮蔽を使用する。測定した試料の粒子濃度を知ることによって、凝集体の重量パーセントまたは凝集体濃度（粒子／ｍＬ）を計算することができる。

【0064】

一部の実施形態では、１種または複数のイオン性ハロゲン化塩は、糖、例えば、スクロース、トレハロースまたはこれらの混合物に対するさらなる凍結保護剤として使用し得る。糖は、二糖類、単糖類、三糖類、および／または多糖類を含んでいてもよく、かつ他の添加剤、例えば、グリセロールおよび／または界面活性剤を含んでいてもよい。場合により、シクロデキストリンを、単独でまたは他の添加剤に加え、凍結保護剤として含んでいてもよく、例えばシクロデキストリンは、イオン性ハロゲン化塩または糖の代わりに加え得る。代わりに、シクロデキストリンを、イオン性ハロゲン化塩および／または糖に加え得る。

【0065】

適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化亜鉛、またはこれらの混合物を含み得る。さらなる適切なイオン性ハロゲン化塩は、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カルシウム、臭化亜鉛、臭化カリウム、臭化マグネシウム、臭化アンモニウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カルシウム、ヨウ化亜鉛、ヨウ化カリウム、ヨウ化マグネシウム、またはヨウ化アンモニウム、および／またはこれらの混合物を含む。一実施形態では、約１〜約１５重量パーセントのスクロースを、イオン性ハロゲン化塩と共に使用し得る。適切なシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、またはこれらの混合物を含み得る。本明細書において開示されている組成物における使用のために企図される例示的なシクロデキストリンには、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰｂＣＤ）、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチル−β−シクロデキストリン、カルボキシメチルエチル−β−シクロデキストリン、ジエチル−β−シクロデキストリン、トリ−Ｏ−アルキル−β−シクロデキストリン、グルコシル−β−シクロデキストリン、およびマルトシル−β−シクロデキストリンが含まれる。一実施形態では、約１〜約２５重量パーセントのトレハロース（例えば、約１０重量％〜約１５重量％、例えば、５〜約２０重量％）を、シクロデキストリンと共に使用し得る。一実施形態では、凍結乾燥した医薬組成物は、約１〜約２５重量パーセントのβ−シクロデキストリンを含み得る。例示的な組成物は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＥＧＦＲリガンド、活性／治療剤、約４％〜約６％（例えば、約５重量パーセント）のスクロース、および約８〜約１２重量パーセント（例えば、約１０重量％）のＨＰｂＣＤを含むナノ粒子を含み得る。

【0066】

処置方法
一部の実施形態では、標的化ナノ粒子は、疾患、障害、および／または状態を処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに使用することができる。一部の実施形態では、がん、例えば、固形腫瘍がん、および／または、例えば、肺がん（例えば、非小細胞肺癌）、肛門がん、および／または多形性神経膠芽腫の処置に標的化ナノ粒子を使用することができ、例えば、処置は、有効量のある特定の開示されたナノ粒子を投与することを含む。他の実施形態では、それを必要とする患者において、炎症性疾患（例えば、乾癬、湿疹、および／またはアテローム性動脈硬化症）を処置し、かつ／または改善する方法であって、有効量の開示ナノ粒子の投与することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0067】

一態様では、がんまたは他の開示される適応症に罹患している対象に組成物を投与する方法が提供される。用語「がん」は、前悪性および悪性のがんを含む。がんには、これらに限定はしないが、血液（例えば、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性の急性リンパ芽球性白血病、マントル細胞リンパ腫）、前立腺、胃がん、中咽頭がん、子宮頸がん、肛門がん、胆嚢がん、胆管がん、腸のがん、結腸直腸がん、皮膚がん、例えば、黒色腫または基底細胞癌、肺がん（例えば、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がん（例えば、腺癌、扁平上皮癌））、乳がん、頭頸部のがん、気管支がん、膵臓がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、扁桃腺がん、末梢神経系がん、食道がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん（例えば、肝細胞癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌）、睾丸がん、胆道がん、小腸または虫垂がん、胃腸間質腫瘍、唾液腺がん、甲状腺がん（例えば、濾胞性甲状腺がんおよび未分化甲状腺がん）、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液系組織のがん、ＫＲａｓ変異を有するがんの処置、治療抵抗性がんの処置などが含まれる。「がん細胞」は、腫瘍（すなわち、固形腫瘍）の形態であるか、対象内で単独で存在する（例えば、白血病細胞）か、またはがんに由来する細胞株であり得る。開示されるナノ粒子は、腎細胞癌の処置に使用することができる。別の実施形態では、開示されるナノ粒子は、腎臓がん、多形性神経膠芽腫、マントル細胞リンパ腫、または皮膚カポジ肉腫の処置に使用することができる。

【0068】

がんは、種々の身体症状と関連し得る。がんの症状は一般に、腫瘍のタイプおよび場所によって決まる。例えば、肺がんは、咳嗽、息切れ、および胸痛をもたらすことが多く、一方、結腸がんは、下痢、便秘、および血便をもたらす。しかし、数例のみを挙げると、下記の症状は一般に、多くのがんと関連することが多い。発熱、悪寒、寝汗、咳、呼吸困難、体重減少、食欲不振、食欲不振症、悪心、嘔吐、下痢、貧血、黄疸、肝腫大、喀血、疲労、倦怠感、認知機能障害、うつ、ホルモンの障害、好中球減少、疼痛、非治癒性の痛み、腫大したリンパ節、末梢性ニューロパシー、および性的機能障害。開示されるナノ粒子は、がんの身体症状の処置に使用することができる。

【0069】

一態様では、がん（例えば、白血病）を処置する方法が提供される。感染症、炎症、胃腸障害などの他の処置方法は、本明細書で開示するとおりに実現することができると理解すべきである。一部の実施形態では、がんの処置は、それを必要とする対象に、所望の結果を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、治療有効量の開示ナノ粒子を投与することを含む。ある特定の実施形態では、開示されるナノ粒子の「治療有効量」とは、がんを処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに有効な量である。

【0070】

一態様では、がん（例えば、白血病）に罹患している対象に組成物を投与する方法が提供される。一部の実施形態では、所望の結果（すなわち、がんの処置）を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、対象に粒子を投与することができる。一部の実施形態では、所望の結果（すなわち、がんの寛解）を実現するのに必要となるような量で、そのような時間をかけて、対象に粒子を投与することができる。ある特定の実施形態では、開示されているナノ粒子の「治療有効量」とは、開示されている障害を処置し、緩和し、回復させ、軽減し、その発生を遅延させ、その進行を阻害し、その重症度を低減し、かつ／またはその１つもしくは複数の症状または特色の発生率を低減するのに有効な量である。

【0071】

ここでは、臓器移植を受けたことのある患者を、開示されるナノ粒子を投与することにより処置する方法も企図される。ここで企図される他の方法には、結節性硬化症および／または自閉症を有する患者を、有効量の開示ナノ粒子を投与することにより処置する方法が含まれる。

【0072】

本明細書で企図される方法として、例えば、患者、例えば、血管の病変にベアメタルステントが留置されている患者の血管において新生内膜過形成を予防または阻止する方法であって、開示されるナノ粒子を含む組成物を投与することを含む方法が挙げられる。本明細書では、（例えば、ステントが留置されている患者において）再狭窄を処置または予防する方法であって、開示されるナノ粒子を投与することを含む方法も企図される。

【0073】

企図される方法は、クローン病、潰瘍性大腸炎、コラーゲン性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置性大腸炎（ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｌｉｔｉｓ）、ベーチェット病、または分類不能大腸炎などの炎症性腸疾患であり得る炎症性疾患を処置することを含む。他の実施形態では、それを必要とする患者において過敏性大腸症候群を処置する方法が提供される。この方法は、患者に治療有効量のナノ粒子を投与することを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、治療剤を含有する場合がある。例えば、ある特定の実施形態では、治療剤は、上述のものなどの抗炎症剤である場合がある。

【0074】

治療プロトコルは、健康な個体（すなわち、がんのいずれの症状も示していない、かつ／またはがんと診断されたことがない対象）に、治療有効量の開示されるナノ粒子を投与することを含む。例えば、健康な個体は、がんの発病および／またはがんの症状の発症より前に、開示されるナノ粒子で「免疫化」することもでき、リスクのある個体（例えば、がんの家族歴を有する患者、がんの発病と関連する１つまたは複数の遺伝子変異を有する患者、がんの発病と関連する遺伝的多型を有する患者、がんの発病と関連するウイルスに感染した患者、がんの発病と関連する習慣および／または生活様式を有する患者など）は、がんの症状の発症と実質的に同時（例えば、その４８時間以内、２４時間以内、または１２時間以内）に処置することができる。当然のことながら、がんを有することがわかっている個体は、いつでも処置を受けることができる。

【0075】

他の実施形態では、開示されるナノ粒子を使用して、がん細胞、例えば、骨髄性白血病、がん細胞の成長を阻害することができる。本明細書において使用する場合、「がん細胞の成長を阻害する」または「がん細胞の成長を阻害すること」という用語は、がん細胞成長の速度が、未処置対照がん細胞の観察または予想された成長速度と比べて低減されるような、がん細胞増殖および／もしくは遊走の速度のいずれかの緩慢化、がん細胞増殖および／もしくは遊走の抑止、またはがん細胞の死滅を指す。「増殖を阻害する」という用語は、がん細胞または腫瘍のサイズの縮小または消失、ならびにその転移の可能性の低減も指す場合がある。細胞レベルでのこのような阻害が、患者において、がんのサイズを縮小し、その成長を阻止し、その侵襲性を低減し、またはその転移を予防もしくは阻害し得ることが好ましい。がん細胞成長が阻害されているかどうかは、適切な様々な徴候のいずれかによって、当業者が容易に判定することができる。

【0076】

がん細胞成長の阻害は、例えば、がん細胞の細胞周期の特定の期における停止、例えば、細胞周期のＧ２／Ｍ期における停止によって証明することができる。がん細胞成長の阻害は、がん細胞または腫瘍サイズの直接的または間接的測定によって証明することもできる。ヒトがん患者では、このような測定は、一般に、磁気共鳴画像診断、コンピュータ体軸断層撮影、Ｘ線などの、周知の画像診断法を使用してなされる。がん細胞成長は、循環している癌胎児性抗原、前立腺特異的抗原、またはがん細胞成長と互いに関係付けられる他のがん特異的抗原のレベルを決定することなどにより、間接的に判定することもできる。がん成長の阻害は、一般に、対象の生存期間の延長および／または健康および幸福の増進とも互いに関係付けられる。本明細書では、活性剤およびＥＧＦＲ標的化部分を含む、本明細書で開示するナノ粒子を患者に投与する方法であって、患者への投与の際、このようなナノ粒子が、薬剤単独の投与（すなわち、開示されるナノ粒子としてでない）に比べて、分布体積を実質的に縮小し、かつ／または遊離Ｃ_ｍａｘを実質的に低減する方法も提供される。

【0077】

「Ｄｒｕｇ Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」と題された２０１２年６月２６日発行の米国特許第８，２０６，７４７号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【実施例】

【0078】

開示されるナノ粒子について、ここまでは大まかに述べており、以下の実施例を参照することで、これについてより容易に理解されるところとなるが、実施例は、ある特定の態様および実施形態を説明する目的で含めているにすぎず、開示されるナノ粒子を一切限定するものでない。

【0079】

（実施例１）
ナノ粒子エマルジョンプロセス
以下に記載するプロセスでは、油相の固体含有量の増大を使用する。プロセスの全体的なフローチャートを図１に示し、プロセスの流れ図を図２Ａおよび２Ｂに示す。乳化した油相の溶媒含有量を低減することにより、ナノ粒子（ＮＰ）の硬化時にクエンチ流体へと損なわれる薬物は、より少なくなる。過度に粘稠になると、約１００ｎｍの液滴に乳化し得る能力が制限されかねないので、これを回避するために、固体および溶媒系を選択する。比較的小さい分子量のコポリマー（約１６ｋＤａ〜５ｋＤａのＰＬＡ−ＰＥＧ）を使用することで、製剤は、高い固体含有量で十分に低い粘性を保つことが可能になる。薬物を溶液中に高濃度に保つために、適切な溶媒和力を有する溶媒系を選択する。共溶媒系（通常は７９：２１の酢酸エチル：ベンジルアルコール）の使用により、８０：２０のポリマー：活性剤配合で、連続溶液に５０％までの固体が見込まれる。

【0080】

活性剤とポリマー（コポリマーおよびリガンドを有するコポリマー）の混合物から構成される有機相を形成する。有機相を、界面活性剤、およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合する。高い薬物添加量を実現するために、有機相中の約３０％の固体を使用する。

【0081】

活性剤とポリマー（ホモポリマー、コポリマー、およびリガンドを有するコポリマー）の混合物で構成された有機層を形成する。組成および有機溶媒を表１に列挙する。有機相は、界面活性剤、およびいくらかの溶解した溶媒から構成される水相と、概ね１：５の比（油相：水相）で混合される。一次エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成される。次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって微細エマルジョンに形成する。次いで、微細エマルジョンを、脱イオン水に、混合しながら加えることによって、クエンチする。クエンチ：エマルジョン比は、概ね８．５：１である。次いで、２５％（ｗｔ％）のＴｗｅｅｎ８０の溶液をクエンチに加え、全体的に概ね２％のＴｗｅｅｎ８０を達成する。これは、カプセル化されていない遊離の薬物を溶解させるのに役立ち、またこれによって、ナノ粒子単離プロセスが実施可能になる。次いで、遠心分離または限外濾過／ダイアフィルトレーションのいずれかによってナノ粒子を単離する。

【0082】

一連の標準のナノエマルジョン条件を以下のとおりに示す。

【0083】

【表1】

【0084】

（実施例２）
材料および方法
別段指摘しない限り、本明細書における実施例の部に記載するすべての実験に、以下の材料および方法を使用した。

【0085】

ペプチド合成
ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波補助自動ペプチド合成装置において、標準のＦｍｏｃ／ｔＢｕ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を使用して、ペプチド合成を行った。市販品供給元（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ）からすべてのアミノ酸を入手した。Ｒｉｎｋアミド樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）を、活性剤Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｏｘｙｍａ Ｐｕｒｅ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）、および塩基としてのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）と共に使用した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基の除去は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて２０ｖｏｌ％のピペリジンを使用して実現した。別段指摘しない限り、すべてのペプチドが、Ｎ末端においてアセチル化され、Ｃ末端においてアミド化された。アセチル化は、ＤＭＦ中１５ｖｏｌ％の無水酢酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を使用して実施した。ペプチドが合成された後、樹脂を２０ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）で３回洗浄し、真空下で乾燥した。２．５ｖｏｌ％のトリイソプロピルシラン（ＴＩＳ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５ｖｏｌ％の水、２．５ｗｔ％のジチオトレイトール（ＤＴＴ）、および９２．５ｖｏｌ％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）からなる溶液を用い、１〜２時間かけて、ペプチドを切断した。樹脂を濾別し、窒素流を使用してＴＦＡ溶液を濃縮した。約２０体積の冷ジエチルエーテルを使用して、ＴＦＡ溶液からペプチドを沈殿させ、遠心分離によって収集し、冷エーテル（３回、各２０ｍＬ）で摩砕した。

【0086】

ペプチドジスルフィド形成
ペプチドを２０％のＤＭＳＯ／に１ｍｇ／ｍＬで溶解させ、室温で撹拌することにより、システイン含有粗ペプチドを酸化させて、対応するジスルフィドとした。反応をＬＣ／ＭＳによってモニターした。完了後、固相抽出（２ｇのＳｅｐ−Ｐａｋ ｔＣ１８カートリッジ、Ｗａｔｅｒｓ）を使用して粗ペプチドを単離し、凍結乾固した。ペプチドを水／アセトニトリルに溶解させ、０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル／水の勾配を用い、２５０×２１．２ｍｍのＣ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、ＬＣＭＳによって純度が９０％を超えていることを判定した。エレクトロスプレー質量分析を使用して、正確なペプチド構造を確認した。本明細書で報告するすべてのペプチドが、予想されたｍ／ｚ値を有した。

【0087】

ラクタム生成
部位特異的なラクタム形成を確実にするために、本発明者らは、他の側鎖を保護されたままに、ペプチドを固体支持体に結合されたままにしておきながら、緩酸切断を使用して除去することのできる、メチルトリチル（Ｍｔｔ）および２−フェニルイソプロピルオキシ（Ｏ−２ＰｈｉＰｒ）保護基を使用した。９４％のＤＣＭ、５％のＴＩＳ、および１％のＴＦＡの混合物を、ゆっくりと樹脂にかけた。遊離Ｍｔｔは、濃い黄色／橙色の色調を有するので、保護基の遊離は、観察することができる。黄色の色調が認められ、再び薄らぐまで、樹脂に切断溶液をかけた。樹脂をＤＣＭ（２０ｍＬ、３回）およびＤＭＦ（２０ｍＬ、３回）で洗浄した。次に、樹脂を２０ｍＬのＤＭＦに浸した後、ＰｙＢＯＰ（３当量）およびＤＩＥＡ（９当量）を加えた。溶液を６時間震盪し、次いでＤＣＭ（２０ｍＬ、３回）で洗浄し、上述のとおりに切断した。

【0088】

Ｐ_２−ビオチン二量体合成
Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ Ｂｉｏｔｉｎ ＮｏｖａＴａｇ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して、Ｐ_２−ビオチン二量体を合成した。ペプチドを切断し、上で報告したとおりに酸化させ、ＢＳ（ＰＥＧ）５（ＰＥＧ化ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、リシン残基の遊離アミンを介して二量体化した。二量体化反応は、ＤＭＦ中で、塩基としてのＤＩＥＡ（６当量）を用いて実施し、次いで、水に希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、Ｐ_２−ビオチン−二量体を得た。この試薬は、Ｐ_２競合ＥＬＩＳＡにおいて使用した。予測ＭＷは、５１６７．９、逆重畳積分による質量：５１６７．６であり、イオン実測値は、１２９２．９および１７２３．５であった。

【0089】

ペプチドに対するＤＢＣＯコンジュゲーションの典型的な手順
粗ペプチドを、（適用可能であれば）ジスルフィド酸化後の銅不使用クリック化学反応のために、ＤＢＣＯにコンジュゲートさせた。Ｐ_１（２２．９６ｍｇ、１１．８８μｍｏｌ）を１．２ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させた。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（１２．４ｍｇ、１７．８μｍｏｌ、１．５当量）を、０．３ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させ、ペプチド溶液に加えた後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．４ｕＬ、７１．３μｍｏｌ、６当量）を加えた。反応液を、ＬＣＭＳによってモニターしながら、１時間撹拌した。１時間後、出発材料が消費され、生成物を、アセトニトリル（０．１％のＴＦＡ）および水（０．１％のＴＦＡ）を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。

【0090】

ＬＣ−ＭＳによるペプチドのインタクト質量測定
アセトニトリル（０．０２％のＴＦＡ、０．０８％のギ酸）および水（０．０２％のＴＦＡ、０．０８％のギ酸）を移動相として使用するＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣを備えたＣ１８ Ｊｕｐｉｔｅｒ（Ｃ）カラム（２５０×２ｍｍ、５μｍ、３００Å、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に、試料を０．５ｍＬ／分で注入した。方法は、１０分かけて５％〜７５％へのアセトニトリルの線形勾配とし、ペプチドは、３〜１０分の範囲内で溶離させ、Ａｇｉｌｅｎｔ ６２２０ ＴＯＦへと誘導された。エレクトロスプレー条件は、気体温度３５０℃、毛管電圧３５００Ｖ、およびフラグメンター １２０Ｖからなるものとした。ｍ／ｚ質量範囲は、１００〜３０００Ｄａとした。取得ソフトウェアは、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）とした。

【0091】

ＤＢＣＯ−アルデヒドリンカーの合成
ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−アミン（１９．２４ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７００ｕＬ）に溶解させた後、ｐ−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（９．１ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３８．４ｕＬ、０．２２ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で３時間撹拌し、その後、ＬＣＭＳによって完了が示された。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、純粋な生成物を凍結乾燥して、１１．３ｍｇの純粋な生成物を得た（収率４７％）。予測ＭＷは、６５５．７５、ＭＷ＋１実測値＝６５６．２９６であった。

【0092】

ＥＧＦの還元的アルキル化
以前に報告されているものと同様の方法を使用して、組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をＤＢＣＯ−アルデヒドにコンジュゲートさせた。ＥＧＦの溶液（６．４ｍｇ、７．９５ｍＬ、ＰＢＳ中０．８０６ｍｇ／ｍｌ）を１ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ５．５）と合わせた。ＤＢＣＯ−アルデヒド（９．９２ｍｇ、１５当量）を９５０ｕＬのＤＭＦに溶解させ、ＥＧＦ溶液に加えた。反応液を３０分間撹拌した後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｕＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を加えて、最終濃度を１０ｍＭとした。反応液を室温で終夜撹拌した。反応をＬＣＭＳによってモニターし、所望の生成物への概ね７０％の変換がＵＶによって検出されたとき、完了したと判定した（予測ＭＷ ６９８６．９２、実測ＭＷ ６９８６．９）。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ５Ｋ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して反応混合物を濃縮し、所望の生成物をＺｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ、７Ｋ ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で精製した。最終生成物の濃度をＵＶ分析によって決定した。ＤＢＣＯ部分の完全性を、１０当量の４−アジドアニリン塩酸塩との反応によって試験した。ＥＧＦ−ＤＢＣＯのアジドアニリンとの完全な反応が、ＬＣＭＳによって観察された（予測ＭＷ ７１２１．０６、実測ＭＷ ７１２０．８５）。

【0093】

ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドの合成
１３０℃のモノマー融解条件下で２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）を触媒として使用するＤ，Ｌ−ラクチドの開環重合において、市販品として入手可能なα−ヒドロキシ−ω−アジド−ポリエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ−アジド、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ）をマクロ開始剤として使用した。得られるＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドをジクロロメタンに溶解させ、次いで、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）およびヘプタン（７０／３０ｖ／ｖ）中に沈殿させることにより回収した。

【0094】

ＰＬＡ−Ｃｙ５の合成
１０ｋＤａのＰＬＡ−ＣＯＯＨ（１グラム、０．１ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させ、最終濃度を１００ｍｇ／ｍＬとした。これに、Ｃｙ５−アミン（０．０５８ｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（０．０５２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（０．０８７ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。カップリング反応をＬＣＭＳによってモニターし、完了後、生成物をＭＢＴＥ中２０％のヘプタンに沈殿させることにより精製した。得られる青色の固体を濾別し、ＭＴＢＥ中２０％のヘプタンで洗浄した。

【0095】

ナノ粒子調製
ＰＬＡ−Ｃｙ５が添加されたナノ粒子の水性懸濁液中での調製についての一般エマルジョン手順は、次のとおりである。１９．８％のポリマーと０．２％のＰＬＡ−Ｃｙ５とを含む２０％の固体（ｗｔ％）で構成された有機相を形成した。有機溶媒は、酢酸エチル（ＥＡ）およびベンジルアルコール（ＢＡ）であり、ＢＡが有機相の２０％（ｗｔ％）を占める。有機相を、水中０．２５％のコール酸ナトリウムと２％のＢＡと４％のＥＡ（ｗｔ％）とから構成された水相と、概ね１：５の比（有機相：水相）で混合した。一次粗エマルジョンは、単純に混合しながら、またはローターステーターホモジナイザーの使用によって、２つの相の組合せによって形成された。次いで、一次エマルジョンを、高圧ホモジナイザーの使用によって微細エマルジョンに形成した。次いで、微細エマルジョンを、冷えた（０〜５℃）脱イオン水に混合しながら加えることによりクエンチした。クエンチ：エマルジョン比は、概ね１０：１であった。次いで、クエンチにＴｗｅｅｎ−８０の３５％（ｗｔ％）溶液を加えて、Ｔｗｅｅｎ−８０を全体で概ね４％とした。ナノ粒子を、限外濾過／ダイアフィルトレーションによって単離および濃縮した。

【0096】

ポリマーの特徴付け
ポリマーの数平均分子量、重量平均分子量、および多分散性指数を、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥｃｏＳＥＣ（Ｍｏｄｅｌ ＨＬＣ−８３２０ＧＰＣ）におけるサイズ排除クロマトグラフによって決定した。試料をＴＳＫｇｅｌ Ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×１５ｃｍ、３ｕｍ、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃Ｗ０００１３）に注入し（１０ｕＬ、１ｍｇ／ｍＬ）、３５℃にて０．２５ｍＬ／分で実施した。

【0097】

ナノ粒子サイズ分析
Ｗｙａｔｔ ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダーにおいて、１５８°で散乱させた８３０ｎｍレーザーを用いた、２５℃の希薄水性懸濁液の動的光散乱（ＤＬＳ）によって、粒度分布を決定した。粒径分析は、三通りに実施しており、平均粒径の平均値を報告する。すべての試料について、三通りの測定の標準偏差は、３ｎｍ以下であった。

【0098】

ゼータ電位分析
Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＰＡＬＳ Ｚｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて、ゼータ電位を決定した。試料を１ｍＭのＮａＣｌ溶液に希釈して、最終濃度を約１ｍｇ／ｍＬのナノ粒子とした。各試料１．７ｍＬをキュベットに加え、各キュベットをＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ ＺｅｔａＰｌｕｓに入れ、次いで、２５℃で５分間平衡化した後、測定を行った。

【0099】

ＥＬＩＳＡ
組換えヒトＥＧＦＲ（５μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中にて、４℃で一晩かけて、９６ウェルプレート上に捕捉した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡを用い、プレートを室温で２時間かけてブロックした。ＥＧＦＲ結合をめぐってＥＧＦと競合することがわかっている、ＥＧＦＲを標的とするペプチドおよびナノ粒子について、ペプチドおよびナノ粒子（標的化および非標的化）の段階希釈物を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中で０．７ｎＭのビオチン化組換えヒトＥＧＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に室温で９０分間インキュベートした。Ｐ_２リガンドに由来するペプチドおよび標的化ナノ粒子については、ペプチドおよびナノ粒子（標的化および非標的化）の段階希釈物を、アッセイ緩衝液中で１ｎＭのＰ_２−ビオチン二量体および５０ｎＭの組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に室温で９０分間インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１０，０００希釈物と共に、室温で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄し、次いで、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ）と共に室温で１５分間インキュベートした。反応を停止溶液（ＢｉｏＦｘ）で停止させ、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0100】

スクリーニングＥＬＩＳＡ
異なるフォーマットのＥＧＦＲ結合ＥＬＩＳＡを開発して、ＥＧＦとの競合が報告されているペプチドをスクリーニングした。以前に記載したＥＬＩＳＡ法でのように、組換えヒトＥＧＦＲ（５μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中にて、４℃で一晩かけて、９６ウェルプレート上に捕捉した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡを用い、プレートを室温で２時間かけてブロックした。ペプチドを、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中にて、１００ｕＭという１段階の濃度で、０．７ｎＭのビオチン化組換えヒトＥＧＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に、室温で９０分間インキュベートした。ペプチドが１００％ＤＭＳＯ保存液として復元されたため、アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度は、すべての試料について２％となった。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｃｅ）の１：１０，０００希釈物と共に、室温で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄し、次いで、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ）と共に室温で１５分間インキュベートした。反応を停止溶液（ＢｉｏＦｘ）で停止させ、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０ｎｍで吸光度を読み取った。

【0101】

細胞培養
ＥＧＦＲを過剰発現するヒト表皮癌細胞株Ａ４３１（ＡＴＣＣ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ培地（組織培養試薬はすべて、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）において、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で培養した。

【0102】

表面結合
培養したＡ４３１細胞を、２×１０^６細胞／ｍＬでＰＢＳ中５％ＢＳＡに再懸濁した。Ｃｙ５にコンジュゲートさせた標的化および非標的化ナノ粒子を段階希釈したものを、Ｖ底９６ウェルプレートにおいてＡ４３１細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。試料を氷冷ＰＢＳで３回洗浄して、非結合ナノ粒子を除去し、氷冷ＰＢＳに再懸濁した。試料をＡｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。

【0103】

内部移行アッセイ
表面結合アッセイでのように、培養したＡ４３１細胞を、２×１０^６細胞／ｍＬでＰＢＳ中５％ＢＳＡに再懸濁した。Ｃｙ５にコンジュゲートさせた標的化および非標的化ナノ粒子を段階希釈したものを、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、Ａ４３１細胞と共に、３７℃で様々な時間をかけてインキュベートした。試料を氷冷ＰＢＳで３回洗浄して、非結合ナノ粒子を除去した。各試料の半分を氷冷ＰＢＳに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６で分析して、表面に結合したナノ粒子蛍光を発生させた。試料の残りの半分は、０．２Ｍの酢酸および０．５ＭのＮａＣｌ酸洗浄緩衝液で５分間処理した。次いで、試料を遠心分離し、氷冷ＰＢＳに再懸濁し、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６において、保持された蛍光について分析した。

【0104】

ＳＰＲ
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合研究を実施した。概ね１０，０００ＲＵの抗Ｆｃ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）を、ＣＭ５デキストランコーティッド金センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）のフローセル１および２のそれぞれに、アミンカップリングによって固定した。Ｆｃでタグ付けされた組換えヒトＥＧＦＲ（ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４４−ＥＲ−０５０）をＰＢＳ中に１０μｇ／ｍＬで復元し、フローセル２に捕捉した。接触時間および得られたｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ捕捉量は、分析物の性質、すなわち、ペプチドまたはナノ粒子のどちらであったかにより様々であった。ＥＧＦ存在下で分析物の結合を試験するとき、ｒｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３６−ＥＧ）のＰＢＳ中溶液を、ｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃの一面に予備注入してから、分析物を導入した。

【0105】

ペプチド結合アッセイを、０．０５体積％の界面活性剤Ｐ２０および５体積％のＤＭＳＯで補充した１０ｍＭのＰＢＳ緩衝液中にて、２５℃で実施した。ペプチドをｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の全面に６０秒間注入した後、６０秒間解離させ（緩衝液注入）、１０秒パルスの３Ｍ ＭｇＣｌ_２で再生させた。試験する各ペプチドの各濃度について、新たなｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ表面を作製した。ペプチド結合データを、１：１ラングミュア動態モデルに適合させて、相互作用のオンレート（ｋ_ａ）、オフレート（ｋ_ｄ）、および／または平衡結合定数（ＫＤ）を取得することにより分析した。

【0106】

ナノ粒子結合アッセイを、１０ｍＭのＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００６６９）中にて、２５℃で実施した。ナノ粒子をｒｈ ＥＧＦＲ−Ｆｃ表面の全面に６０秒間注入した後、６０秒間解離させ、１０秒パルスの３Ｍ ＭｇＣｌ_２で再生させた。試験する各ナノ粒子の各濃度について、新たなｒｈＥＧＦＲ−Ｆｃ表面を作製した。ナノ粒子センソグラムは、ナノ粒子と標的との間の結合相互作用が多価的な性質をもつために、１：１ラングミュア動態モデルにぴたりと適合させることができなかった。その代わりとして、ナノ粒子結合データを、注入終了後の単一時点における結合応答対濃度のプロットとして示した。

【0107】

Ｃｙ５のｉｎ ｖｉｔｒｏ放出動態
生理的シンク条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＬＡ−Ｃｙ５放出動態を決定した。ナノ粒子をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中１０％のポリソルベート２０に懸濁させ、３７℃の水浴中で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。定期的に、一定分量の懸濁液を除去し、２６４，０００ｇで３０分間超遠心分離した。上清および超遠心分離前の懸濁液の試料を蛍光（ｅｘ６５０ｎｍ、ｅｍ６７０ｎｍ）分析し、上清中に放出されたＰＬＡ−Ｃｙ５濃度を、遠心分離していない試料中の合計濃度と比較することにより、放出パーセントを算出した。

【0108】

（実施例３）
クリック化学反応が可能にしたナノ粒子
臨床開発および大規模製造では、受容体を標的とするナノ粒子が、ＰＥＧ末端において低分子量標的化リガンドに共有結合によってコンジュゲートさせたＰＬＡ−ＰＥＧを含む標的化ポリマーを組み込むことにより生成される。ナノエマルジョン製造プロセスの際、標的化リガンドは、親水性ＰＥＧ鎖と共に、ナノ粒子の表面に配向される。標的化ポリマーの合成は、大規模ナノ粒子生成にとって望ましいものの、これには、数百ミリグラムからグラム量の標的化リガンドと、かなりの化学的な手間が必要となる場合があり、これが、より多種類の分子を評価する妨げとなりかねない。したがって、本発明者らは、ナノ粒子にコンジュゲートさせた異なる標的化分子のより迅速かつリガンド効率のよいスクリーニングを可能にする表面コンジュゲーション戦略を開発した。

【0109】

ナノ粒子表面コンジュゲーションを可能にするために、本発明者らは、ほとんどの標的化リガンド中に見出される官能基に対してオルソゴナルとなっており、ナノ粒子の水性懸濁液と適合しており、ナノ粒子保存液の長期貯蔵に対して安定となるであろう、種々の化学事象を探索した。銅を媒介としたアルキン−アジド付加環化化学（ＣｕＡＡＣ）は、当初は有望な戦略のように思われたが、この手法は、いくつかの反応条件の評価にもかかわらず、典型的にはスクリーニングにかけられた様々なリガンド（低分子、ペプチド、タンパク質）との適合性に一貫性がないことが判明した。反応が効率よく進まなかったこともあれば、反応中に、リガンドを主体とするかなりの不純物が形成されたこともあった。コンジュゲーション後の分子構造の特徴付けがかなりの難題となることによって、リガンド分解の潜在的可能性が高くなり、したがって、この化学事象は、受容体を標的とするナノ粒子の評価に不適切であるとみなされた。

【0110】

最も信頼度が高く効率のよい化学事象は、歪み促進型アジドアルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）であった。この手法では、ＰＥＧ末端に、その後ナノ粒子表面に表出するアジド基を呈する、大規模単一バッチのＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドポリマーが合成された。このポリマーが組み込まれているナノ粒子は、表面上にいくつかのアジド基を有し、対応する歪みアルキン官能基を含有するリガンドに、種々の密度で結合させることができる。本発明者らは、反応性と安定性のバランスがとれており、水への溶解性があり、市販品として入手可能であることから、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を選択した。このようにして、多くの標的化リガンドを１桁のミリグラム量で合成し、ナノ粒子コンジュゲートとしての結合についてスクリーニングすることができる。

【0111】

ＨＯ−ＰＥＧ−アジドからの、オクタン酸スズを触媒とした開環重合（図３Ａおよび３Ｂ）によって、ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドを合成した。ナノ粒子の大部分を占めたポリマーの特性に見合ったポリマー（１６ｋＤａのＰＬＡ、５ｋＤａのＰＥＧ）を作製した。このポリマー上のアジド官能基の完全性は、市販品として入手可能なＤＢＣＯアミンとの反応によって確認した（図４Ａ）。未反応のＤＢＣＯは、紫外線（ＵＶ）Ａ２８０および質量分析の両方によって検出され、生成物のＰＬＡ−ＰＥＧ−アジド−ＤＢＣＯは、クロマトグラムのＰＬＧＡ−ＰＥＧ溶離領域におけるＡ２８０をモニターすることにより検出される。ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジドは、２８０ｎｍの吸光を伴わないため、吸光度の増大は、反応が進行し、ＤＢＣＯ部分のＵＶ特性がポリマーに移動したことを示す（図４Ｂ）。ＤＢＣＯ部分の吸光性は、トリアゾール環が形成されたときに減少しており、したがって、ポリマーＵＶ吸光度は、出発遊離ＤＢＣＯと同じ強度には達しなかったことに留意すべきである。この分析によって、アジド官能基が重合条件の間に変化しなかったことが実証され、ＤＢＣＯアミンの９９％の消費が観察された。

【0112】

フローサイトメトリーおよび他のアッセイにおけるナノ粒子検出を可能にするために、本発明者らは、ナノ粒子構造に蛍光標識を組み込もうと努力を尽くした。クリック化学反応によって、ナノ粒子をリガンドとフルオロフォアの両方で効率よく修飾することが可能になるが、ナノ粒子の表面は、標的化リガンドだけで修飾して、非特異的結合を防ぐことが好ましかった。したがって、ナノ粒子コアに安定してカプセル化することのできるＣｙ５蛍光ペイロードを合成した。１０ｋＤａのＰＬＡ−カルボン酸ポリマーを、Ｃｙ５−アミンフルオロフォア誘導体にコンジュゲートさせた。このポリマーは、疎水性であり、アッセイ条件下で多くはナノ粒子内にカプセル化されたままとなる十分な分子量を有する。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ放出法を使用して確認しており、図２６に示されるとおり、Ｔ＝０時点でのＣｙ５の４％の放出に続いて、４８時間かけて１０％未満のＣｙ５が示された。

【0113】

実施例１および２に記載したとおり、ナノ粒子をナノエマルジョンプロセスによって作製した。簡潔に述べると、ナノ粒子成分（ＰＬＡ−ＰＥＧ、ＰＬＡ−ＰＥＧ−アジド、およびＰＬＡ−Ｃｙ５）をすべて、ベンジルアルコールと酢酸エチルとからなる有機相に溶解させた。有機相を、界面活性剤を含有する水相と乳化させ、エマルジョンを高圧ホモジナイザーに通して、所望の液滴サイズを得た。大幅に過剰の水に希釈して、エマルジョン液滴から溶媒を抽出し、粒子を形成することにより、最終エマルジョンを作り出した。最終ステップは、タンジェンシャルフロー濾過とし、カプセル化されていない成分および溶媒を除去した。表２に示すとおり、３０％（ＰＬＡ−ＰＥＧポリマーに対するモル％）のアジドポリマーおよびＰＬＡ−Ｃｙ５ポリマー（全ポリマーの１重量％）を含めても、粒径または多分散性には、こうした構成要素を含まないナノ粒子に比べて、ほとんど影響がないように思われた。

【0114】

【表2】

【0115】

ナノ粒子の最終水性懸濁液は、ＤＢＣＯ−アミンを代用リガンドとして使用することにより、アジド官能基の表面表出および反応性について特徴付けた。アジド基は、ナノ粒子表面上の全ＰＥＧ末端基の３０％に相当すると予想される。ＰＥＧ鎖のすべてがナノ粒子の表面に表出した場合、化学量論量のＤＢＣＯアミンが完全に消費されるはずである。実際に、反応は、非常に効率的であり、概ね１００％のＤＢＣＯ−アミンが消費され、アジド官能基がナノ粒子表面にほぼ定量的に表出したことが示された（図４Ｃ）。同じ３０％のナノ粒子に対して、より少ない化学量論のＤＢＣＯリガンドを使用して、表面にコンジュゲートされたリガンドのレベルが異なるナノ粒子を生成することができる。本発明者らにより、試験した０．２５％〜３０％の範囲にかけて、ＤＢＣＯリガンドの概ね定量的なコンジュゲーションが観察された。反応液は、４℃で終夜インキュベートして、ナノ粒子分解およびＣｙ５ペイロード放出を最小限に抑えた。

【0116】

したがって、アジドナノ粒子およびＤＢＣＯ試薬の使用が、ナノ粒子表面上に種々のレベルで標的化リガンドを導入する有効な方法であることが決定された。コンジュゲーションの効率が高いことで、余分なリガンドを必要とせずに済み、コンジュゲーション後の精製は、簡略化され、遊離リガンドが結合アッセイの妨げとなるリスクは、最小限に抑えられる。加えて、投入リガンド化学量論を様々にすることにより、所望のリガンドレベルを正確かつ容易に制御することができる。

【0117】

（実施例４）
ＥＧＦ標的化ナノ粒子
こうした研究の陽性対照を設けるために、ＥＧＦＲの天然におけるリガンドである上皮成長因子（ＥＧＦ）を、共有結合によってＤＢＣＯにつないで、ナノ粒子表面へのコンジュゲーションを可能にした（図５）。ＥＧＦは、概ね６ｋＤａの、５３アミノ酸のタンパク質である。（ＮＨＳエステルなどの）アミド結合を形成する試薬を無秩序に使用してＥＧＦアミノ基（リシンおよびＮ末端アミン）を修飾すると、ＥＧＦＲに対するＥＧＦ親和性は、損なわれかねない。ＥＧＦの選択的なＮ末端修飾を、二官能性ＤＢＣＯ−アルデヒドリンカーを用いた還元的アルキル化によって実現した。アルデヒドリンカーを種々の条件下でＥＧＦと反応させ、生成物をＬＣＭＳによって分析した。１０〜１５当量のアルデヒドおよび１０ｍＭのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いたｐＨ５．５での還元的アルキル化では、単一アルキル化ＥＧＦが大部分を占める結果となり、二重アルキル化または無修飾ＥＧＦがそれぞれ１０％〜２０％となった（表３）。反応はすべて、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中１０％のＤＭＦ（ｖ／ｖ）中で進めた。生成物分布は、ＬＣ／ＭＳ（２８０ｎｍでのＵＶ吸収）によって測定した。

【0118】

【表3】

【0119】

還元剤の濃度を増すことで、ＥＧＦの消費はより多くなったものの、これによって、より高い割合の二重アルキル化生成物も生じた。二重アルキル化生成物は、活性がより低い場合もあり、またはナノ粒子の架橋につながりかねなかったため、望ましくなかった。加えて、未修飾ＥＧＦは、ナノ粒子にコンジュゲートされないはずであり、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、その後、除去し得る。得られるＤＢＣＯ−ＥＧＦを、残りの試薬から、脱塩カラムを使用して精製し、次いで、遠心濃縮装置を使用して濃縮した。ＤＢＣＯ部分の完全性は、ＤＢＣＯ−ＥＧＦ生成物をアジド−アニリン塩酸塩（ＡＡＨＣ）と反応させることにより確認した。単一および二重修飾ＤＢＣＯ−ＥＧＦは、ＡＡＨＣに効率よくコンジュゲートされたが、未修飾ＥＧＦは、インタクトなままとなった（図６および表４）。

【0120】

【表4】

【0121】

次に、ＤＢＣＯ−ＥＧＦリガンドを、概ね２．５％のリガンド密度（例えば、１２のうち１つのアジドがＥＧＦリガンドとコンジュゲートされることになる）で、アジドナノ粒子にコンジュゲートさせ、得られるコンジュゲートを、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。単一および二重標識ＤＢＣＯ−ＥＧＦ成分は、ナノ粒子に効率よく結合したが、未修飾ＥＧＦは、そのままとなり、ＳＥＣによって除去された。

【0122】

（実施例５）
ＥＧＦ−ＮＰの組換えＥＧＦＲへの結合
ＥＧＦナノ粒子（ＥＧＦ−ＮＰ）の結合特性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、またはＢｉａｃｏｒｅ）によって、また競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、ナノ粒子または遊離ＥＧＦリガンドを、組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃでコートされた９６ウェルプレート上への結合をめぐって、市販品として入手可能なビオチン−ＥＧＦコンジュゲートと競合させた。組換えヒトＥＧＦＲ（５μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、０．１Ｍの炭酸／炭酸水素緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中にて、４℃で一晩かけて、９６ウェルプレート上に捕捉した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡを用い、プレートを室温（ＲＴ）で２時間かけてブロックした。ペプチドを、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ中２％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）中にて、１００ｕＭで、０．７ｎＭのビオチン化組換えヒトＥＧＦ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に、室温で９０分間インキュベートした。ペプチドが１００％ＤＭＳＯ保存液として復元されたため、アッセイにおけるＤＭＳＯの最終濃度は、すべての試料について２％となった。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｃｅ）の１：１０，０００希釈物と共に、室温で９０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄し、次いで、ＴＭＢ基質（ＢｉｏＦｘ）と共に室温で１５分間インキュベートした。反応を停止溶液（ＢｉｏＦｘ）で停止させ、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５ｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４５０ｎｍで吸光度を読み取った。図７に、この分析の結果を示す。ＥＬＩＳＡによって示されるとおり、ナノ粒子および遊離ＥＧＦ−ＤＢＣＯリガンドは、９６ウェルプレート上にコートされた組換えヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質への結合をめぐって、市販品として入手可能なビオチン−ＥＧＦと競合する。ＤＢＣＯ−ＥＧＦリガンドは、ＥＧＦＲへの結合が未修飾ＥＧＦの概ね２分の１であり（例えば、２倍の高さのＩＣ_５０）、ＤＢＣＯ修飾化学反応が結合親和性に及ぼす影響は最小限に抑えられたことが示された（図７Ａ）。ナノ粒子−ＥＧＦコンジュゲートは、ＩＣ_５０が未修飾ＥＧＦの概ね１０倍の高さであり、ＤＢＣＯ−ＥＧＦの４倍の高さであった。しかし、ナノ粒子表面にコンジュゲートさせたＥＧＦは、ナノ粒子の３次元構造およびサイズのために、すべてがＥＧＦＲと接触するとは予想されなかったことを考えると、これはまったく意外ではない。したがって、ＥＧＦのナノ粒子へのコンジュゲーションは、その結合親和性をそれほど変化させなかった。未修飾アジドナノ粒子は、ＥＧＦＲへの結合をめぐって、ＥＧＦ−ビオチンと競合せず、非特異的ナノ粒子結合は実証されなかった。

【0123】

ＳＰＲをオルソゴナルな方法として使用して、組換えＥＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質に結合する未修飾ＥＧＦおよびＥＧＦ−ナノ粒子コンジュゲートを特徴付けた。図７Ｂに示されるとおり、ＤＢＣＯで修飾したＥＧＦは、ＥＬＩＳＡデータに一致して、センソグラムがわずかに変化している。ＥＧＦナノ粒子では、分析物の分子質量がより大きいために、未修飾ＥＧＦに比べて明確に大きい応答が得られる。非官能化アジドナノ粒子では、ＥＧＦＲ−Ｆｃでコートされた表面への結合が最小限となり、ＥＧＦナノ粒子の応答が、特異的な受容体結合の結果として生じることを示している。ナノ粒子のＥＧＦＲ受容体表面との相互作用が多価的な性質をもち、ナノ粒子の分子量を正確に特徴付けることが困難であるために、この相互作用については平衡結合定数（Ｋ_Ｄ）を決定しなかった。しかし、ＳＰＲ曲線の結合動態から、多価的な結合相互作用に関して予想される、緩徐なオフレートを伴う密な相互作用が示唆される。

【0124】

（実施例６）
低分子量ＥＧＦＲリガンドスクリーニング
ＥＧＦが、ＥＧＦＲに対するナノ粒子標的化の信頼度の高い概念実証リガンドとして働くが、本発明者らは、ナノ粒子製造プロセスに適合する、より低分子量のリガンドを探索した。最初の手法として、天然におけるリガンドＥＧＦおよびＴＧＦα（トランスフォーミング成長因子アルファ）の１０アミノ酸長の重複ペプチド断片を合成し、ＥＧＦＲ競合ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲを使用して、ＥＧＦＲへの結合についてスクリーニングした。残念なことに、また合成された断片のいくつかがＥＧＦＲ結合能を保持したことを示した報告とは対照的に、作製したペプチドはいずれも、どちらの方法によってもＥＧＦＲへの結合を示さなかった（表５および６）。

【0125】

【表5】

【0126】

【表6】

【0127】

文献を見直すと、いくつかのペプチド（ＭＷ範囲１２００〜１９００）がＥＧＦＲに結合すると報告されていたことが明らかになった。そのペプチドのすべてを合成し、ＥＧＦＲ結合について、ＳＰＲを使用して評価した（表７）。すべてがＥＧＦＲへの結合をめぐってＥＧＦと競合すると報告されてはいないので、これらのペプチドのスクリーニングに競合ＥＬＩＳＡは使用しなかった。驚いたことに、報告されたペプチドの少数だけが、ＥＧＦＲへの再現可能な結合を示した。図８Ａおよび８Ｂに、これらペプチドについてのＳＰＲ結合データの概要を示す。合成された１７種のうち５種のペプチドにおいてのみ、ベースラインを上回る結合シグナルが得られ、これらのうち３種だけが、５０μＭ未満の濃度で飽和性結合を示した。全５種の結合性ペプチドおよび抜粋した他の非結合性ペプチドを、Ｃ末端側のリシン側鎖にＤＢＣＯ部分を付けて（Ｇｌｙ−Ｇｌｙスペーサーを含む）再合成し、次いで、５％および１０％のリガンド密度（ナノ粒子１個あたり約２２５個および４５０個のリガンド）で、アジドナノ粒子にコンジュゲートさせた。

【0128】

【表7】

【0129】

ナノ粒子のＥＧＦＲ−Ｆｃへの結合を、ＳＰＲを使用して評価した。図８Ｂに、ナノ粒子コンジュゲートの結合センソグラムを示す。ＥＧＦ−ＮＰに匹敵するナノ粒子結合シグナルが、Ｐ_１について実証され、わずかに弱めの結合がＰ_２について観察された。しかし、他のペプチド−ナノ粒子コンジュゲートについての結合は、こうした条件下で認められなかった。Ｐ_２は、どちらのリガンド密度でもＥＧＦＲに結合しなかったものの、ナノ粒子にコンジュゲートさせたＰ_１の１０ｍｏｌ％での結合応答は、より強くなっており、動態は、５％および１０％でのＰ_２ナノ粒子より急速であるように思われる（オンおよびオフレート）。Ｐ_１が示したより急速な動態によって、Ｐ_１だけがより高い（１０％）リガンド密度でナノ粒子のＥＧＦＲへの結合を媒介することができた理由の説明をつけることができる。本発明者らは、粒子により多く添加することでＰ_１の局所濃度を増大させると、このリガンドが示した実際の動態にもかかわらず、結合する機会がこれによってより多くなると考えている。肝要な結合要素を特定するために、Ｐ_１をさらに研究した。

【0130】

（実施例７）
Ｐ_１の構造活性関係性
ペプチド構造の環状部分内のアミノ酸に対してアラニンスキャンを行って、どのアミノ酸が結合に肝要であったかを判定した。ペプチド内の各アミノ酸を、個々にアラニンにより置き換えた。Ｐ_１は、ＥＧＦとの競合を示したため、ＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡを使用して、ＥＧＦＲへの結合について評価した（図９Ａおよび表８）。データから、アラニンで変異させたペプチドでは結合が低減したため、このペプチド配列におけるほとんどのアミノ酸が、ペプチドのＥＧＦＲへの最適な結合に必要となったことが示された。しかし、１種のアミノ酸（Ｌｅｕ６）は、アラニンに変更されたとき、Ｐ_１よりわずかに高い親和性を有するペプチドをもたらした（Ｐ_１−３）。引き続いて、Ｐ_１−３上の隣接するアミノ酸のアラニンスキャンを行った。４つの隣接する残基のうちの３つも、アラニンで変異させたペプチドにおけるＥＧＦＲ結合の低減によって実証されるとおり、ＥＧＦＲへの結合において重要な役割を果たしていた。しかし、１位におけるアラニンは、Ｐ_１−３に比べてごくわずかな親和性の向上を示した。

【0131】

【表8】

【0132】

すべてのアラニンスキャンペプチドを１０ｍｏｌ％でナノ粒子にコンジュゲートさせ、結合について、ＥＧＦ競合ＥＬＩＳＡを使用して評価した。Ｐ_１−３（Ｌｅｕ６−Ａｌａ）コンジュゲートは、Ｐ_１コンジュゲートに比べて、ＥＧＦＲ結合の増強を示した。図９Ｂに示されるとおり、Ｐ_１−３ナノ粒子の親和性は、Ｐ_１ナノ粒子の概ね２０倍増大し、この単一アミノ酸変異が、遊離リガンド親和性にはそれほど影響を及ぼさないものの、ナノ粒子にコンジュゲートさせたとき、ＥＧＦＲへの結合の予想外の向上につながったことが示された。

【0133】

ＳＰＲ分析を実施して、Ｐ_１およびＰ_１−３ナノ粒子のＥＧＦＲへの結合を比較した。１ｍｇ／ｍＬのナノ粒子濃度でのＰ_１およびＰ_１−３ナノ粒子のセンソグラムは、５％の密度で最小限の結合、１０％のリガンド密度でより強固な結合を実証している（図９Ｃ）。加えて、１０％のＰ_１−３ナノ粒子は、１０％のＰ_１ナノ粒子に比べて著しく緩徐なオフレートを示した。したがって、遊離ペプチド親和性のわずかな向上によって、ナノ粒子結合特性に有意な変化がもたらされた。

【0134】

ＥＧＦＲ結合の促進がＰ_１−３ナノ粒子によって実現されたが、このリガンドは、ＥＧＦとエピトープが共通しており、このため、標的化ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏで天然リガンドと競合するはめになりかねない。加えて、本発明者らは、ナノ粒子表面の装飾が最小限に抑えられるような、より低密度で強固なナノ粒子結合を実現することのできるリガンドを所望したが、これは、粒子の秘匿性および長期循環を維持するために重要となり得る。Ｎ−メチルアミノ酸ならびに他の天然および非天然アミノ酸点変異による置き換えを含む、Ｐ_１−３の追加の類似体を作製したが、得られるペプチドはいずれも、Ｐ_１−３をさらに超えるＥＧＦＲ結合は一切示さなかった（表９）。

【0135】

【表9】

【0136】

（実施例８）
Ｐ_２の構造活性関係性
ナノ粒子結合を媒介することが実証された別の文献ＥＧＦＲ結合性ペプチドであるＰ_２は、ＥＧＦもＥＧＦＲに結合しているとき、親和性の増強を有することが報告された。しかし、本発明者らの手では、このペプチドの親和性のＳＰＲ分析をＥＧＦ存在下または非存在下で行うと、互角のＫ_Ｄが明らかになった（表１０）。

【0137】

【表10】

【0138】

興味深いことに、５％および１０％の両方のリガンド密度でのＰ_２のナノ粒子コンジュゲートは、結合したＥＧＦの存在下で、ＥＧＦＲへの結合の増強を示した（図１０および図１１）。さらに、ＥＧＦとＰ_２の両方を含んだ二重標的化ナノ粒子について、相乗効果が認められた（図１２）。ＥＧＦＲは、ＥＧＦ結合後に安定化される立体構造変化を経て、ＥＧＦＲ二量体化を可能にする、より「開いた」立体配置に変形することが知られている。もとのペプチドは、ＥＧＦ存在下でのファージディスプレイによって発見され、リポソームコンジュゲートとして研究された。したがって、結合エピトープは、結合状態または非結合状態のＥＧＦＲに存在し得るが、エピトープは、ＥＧＦＲがＥＧＦに結合された状態にあるとき、より接触可能になり、より弱い立体的阻害での、ナノ粒子、リポソーム、またはファージ粒子の接近が可能となり得る。

【0139】

標的化ナノ粒子送達には、ＥＧＦと競合しなかったリガンドが望ましかったため、Ｐ_２をさらに評価して、その特性を理解し、結合親和性を最適化した。これらの特色をうまくモジュレートして、ナノ粒子結合が向上するようにした。

【0140】

ＣｕＡＡＣを使用してアジドナノ粒子にコンジュゲートさせることを目的とした、Ｃ末端プロパルギルグリシン部分を有する、ペプチドＰ_２の類似体が、当初作製された。しかし、後の研究において、ＳＰＡＡＣ化学がより効率的であり、コンジュゲーションの際にリガンドの不純物をより発生しにくいことが明らかになったため、アルキンをＤＢＣＯ部分により置き換えた。やはり、このＣ末端部分を含有する遊離リガンドを評価して、ペプチドについての構造活性関係性を評価した。

【0141】

Ｐ_２に関するアラニンスキャン分析によって、ペプチド構造の肝要な成分が強調された（図１３および表１１）。詳細には、環状構造および１つの芳香族残基（Ｔｒｐ８）が、結合にとって最も肝要であった。他の重要な残基には、他の芳香族残基（Ｔｒｐ５）および残基９〜１１（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ）が含まれた。残基４、６、および７、ならびに隣接アミノ酸１、２、１３、および１４（環状部分の外側）は、アラニンに変更されても、結合に対してほとんど乃至まったく影響がなかった。特に、Ｐｒｏ２のアラニンによる置き換え（Ｐ_２−２）は、控えめながらより高い親和性のペプチドをもたらすように思われた。トランケーション分析では、コアに結合する要素が、システインの間の残基内に含有されていたことが示され、これにより、アラニンスキャン分析が裏付けられた（表１２）。

【0142】

【表11】

【0143】

【表12】

【0144】

ある特定の位置を他のアミノ酸にさらに変異させて、各位置において受け容れられ得る同様のアミノ酸の範囲を決定した（表１３）。

【0145】

【表13】

【0146】

予想されたとおり、アラニン置換に寛容であった残基は、結合にほとんど影響を及ぼすことなく、他のアミノ酸に同様に変更することができた。ジスルフィド架橋をモジュレートする、または置き換えることができるかを判定するために、一連のラクタムおよびジスルフィド環化ペプチド類似体を作製した。ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）とアスパラギン酸残基との間の内部アミド結合形成の一例を、図１４に示す。ラクタム環化ペプチドはすべて、かなりの活性を失っており、極性がより強めのアミド結合環化は、ペプチド構造内で十分に許容されなかったことが示された（表１４）。

【0147】

【表14】

【0148】

Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィドを他のジスルフィド結合により置き換えることで、結合の度合いが様々である類似体が作製された。選択されたシステイン類似体を図１５に示し、システイン類似体が結合に及ぼした影響を図１６および表１４に示す。主鎖とジスルフィドとの間に追加のメチレンを有するホモシステイン（ｈｏｍｏｃｙｓ）を含めることは、結合に対して有害であると思われ、より大きな大環状分子は好適でなかったことが示唆された。ペニシラミン（ｐｅｎ）を含めることは、Ｃｙｓと組み合わせた場合のみ許容されたが、しかし、ＰｅｎＰｅｎ類似体は、親Ｃｙｓ−Ｃｙｓペプチドと親和性が互角であった。

【0149】

結合親和性を向上させる試みにおいて、ペプチド結合にとって肝要な芳香族残基を、個々に、種々の芳香族アミノ酸により置き換えした（表１５）。芳香族残基は、ＥＧＦＲとの重要な接触の媒介となるため、受容体との接触が向上しているまたは付加されている代替官能基を導入することにより、結合を増強することが可能となり得る。それほど肝要でないトリプトファン残基においてフェニルアラニンによる置き換えを行うと、結合の一部が保持されたが、しかし、より肝要なＴｒｐ８位では、フェニルアラニンが許容されなかった。各トリプトファンを、個々に、１５種の非天然アミノ酸による置き換えも行った。これらのうちの、各位置における１種のアミノ酸が、わずかな親和性の向上を示した。５位における２−インダノイル−グリシン残基によって、トリプトファンに比べてわずかに増強された結合を得ることができたが、しかし、８位におけるこの残基では、結合が完全に無効になった。８位では、５−メトキシトリプトファンが、トリプトファンより概ね２倍良好であったが、しかし、５位におけるこのアミノ酸の合成は、不成功であった。

【0150】

【表15-1】

【0151】

【表15-2】

【0152】

Ｐ_２ペプチド類似体およびナノ粒子コンジュゲートの評価の際に、追加のアッセイを開発して、ＳＰＲに対してオルソゴナルなアッセイを用意した。これらのペプチドは、ＥＧＦと競合しないため、ビオチン化された新規な二量体型のＰ_２を合成した（図１７）。ＥＧＦ存在下でのこのペプチドは、競合ＥＬＩＳＡフォーマットで使用するための良好なトレーサーである。図１８に、競合する遊離ペプチドＰ_２または１％もしくは５％のリガンド密度のＮＰコンジュゲートからの結果を示す。特に、Ｐ_２は、ナノ粒子にコンジュゲートさせたとき、モル濃度ベースでＥＧＦＲ結合の向上を示しており、親和性がわずかに低下した天然リガンドＥＧＦとは対照的である。ナノ粒子へのコンジュゲーション、および結果として起こる、多価的な結合によるオフレートの低下は、おそらく、急速なオンレートおよび緩徐なオフレートの結果として生じる高親和性結合を有するＥＧＦリガンドに対してよりも、急速なオンレートおよびオフレートを有するペプチドリガンドに対して、より影響力をもつ。別個の動態プロファイルを有するリガンドを組み合わせると、相乗的なナノ粒子結合を得ることができる（図１９）。

【0153】

構造活性関係性研究において作製された多くの類似体のうち、３種をさらに評価した。それら３種のペプチド（Ｐ_２−２、Ｐ_{２−１０２}、およびＰ_２−５５）をＤＢＣＯコンジュゲートとして合成し、親ペプチド（Ｐ_２）と比較した。２つの芳香族変異Ｐ_２−９８およびＰ_{２−１０１}を組み合わせて、１種のペプチド（Ｐ_{２−１０２}）とした。Ｐ_２−２は、アラニンスキャンシリーズから生まれ、Ｐ_２−５５には、Ｐｅｎ−Ｐｅｎ環化が組み込まれている。図２０に示す、これら３種の類似体のＳＰＲ分析では、３種すべてにおいて、親ペプチドより親和性が向上していることが示された（Ｐ_２と比べたＰ_２−２、Ｐ_{２−１０２}、Ｐ_２−５５）。ここでも、ＥＧＦの存在下または非存在下でのＫ_Ｄに、有意差はなかった（表１６）。

【0154】

【表16】

【0155】

これら３種の類似体のナノ粒子コンジュゲートを１％および５％のリガンド密度で調製し、ＳＰＲおよび／またはＰ_２競合ＥＬＩＳＡによって評価した。センソグラムデータを適合させてＫ_Ｄを導こうとするのではなく、ＳＰＲデータを、２分間の注入後に観察された、濃度依存的な結合応答を表す「スナップショット」プロットに変換した（図２１Ａ、２１Ｂ）。こうしたプロットのためのセンソグラム応答データを捕捉レベルで標準化して、実験の差を考慮に入れた。親Ｐ_２にコンジュゲートさせたナノ粒子（５％）についての捕捉正規化された応答を、すべて５％のリガンド密度の新たな類似体と比較すると、ＥＧＦの非存在下では、３種すべての類似体について、結合はそれほど向上せず、ＥＧＦの存在下では、アラニンおよび芳香族類似体についてはそれほど向上せず、Ｐｅｎ類似体については結合が大きく増大したことが明らかになった（図２１Ｃ）。ペニシラミンは、アミノ酸のベータ炭素上にｇｅｍ−ジメチル基を含有しており、このために、立体構造の柔軟性が低減される。このペプチドが、遊離リガンドとして他の類似体に対して優れた結合親和性を表示さなかったことを考えると、このより強固なペプチド構造によって結合動態が変化し、これが、ナノ粒子結合に影響を及ぼし得る可能性がある。

【0156】

【表17】

【0157】

ＥＬＩＳＡデータを、表１７に示している。Ｐ_２競合ＥＬＩＳＡの結果は、ＳＰＲデータと一致した。Ｐ_２ＥＬＩＳＡでは、トレーサーの高親和性結合にＥＧＦが必要となり、したがって、ナノ粒子結合を＋／−ＥＧＦでアセスメントすることができない。結果は、５％のリガンド密度で、３種すべての類似体コンジュゲートについて、親和性が控えめながら向上したことを示している。

【0158】

ナノ粒子コンジュゲートとしての３種すべての類似体で中程度の向上があったことを踏まえて、２種または３種すべての類似体の特色が単一ペプチド配列に組み込まれているハイブリッド配列を合成し、遊離リガンドおよびナノ粒子コンジュゲートとして評価した。遊離リガンドのＫ_Ｄを分析すると、親和性に対してそれほど影響がないことが明らかになる。一般に、芳香族残基を含めると、親和性が向上するように思われ、遊離リガンド親和性はすべて、ＥＧＦの存在に対して非感受性であった（表１６）。

【0159】

ハイブリッドペプチドのナノ粒子コンジュゲートは、対照的に、結合に多少の有意差を示した。図２２に、３種の二重、および１種の三重変異体のＳＰＲスナップショットプロットを示す。最も顕著な傾向は、芳香族残基を含めると、ＥＧＦ結合の非存在下で、ナノ粒子コンジュゲートのＥＧＦＲへの結合が劇的に向上することである。Ａｌａ２とＰｅｎの組合せは、結合にマイナスの影響を及ぼすように思われる。これは、ＰｅｎおよびＡｌａ２置換だけを含有する二重変異体（Ｐ_{２−２／５５}）を、芳香族置換を含むものと比較することで強調される。このナノ粒子は、ＥＧＦの存在下では控えめながらＥＧＦＲ結合を示すが、しかし、単独での受容体への結合は非常に弱い。芳香族置換を含有するすべてのナノ粒子が、ＥＧＦ結合の際に、最小限の結合変化を示し、芳香族置換を有する二重および三重変異体リガンドは、全体的なナノ粒子結合の向上を示す。

【0160】

表１８に示す、Ｐ_２競合ＥＬＩＳＡは、同様の結果を実証し、Ａｌａ２−Ｐｅｎは、５％で、親ペプチド−ナノ粒子コンジュゲートに比べて相対的に変化しなかったが、芳香族置換を含有するハイブリッド類似体は、ＩＣ_５０値がより低くなっていた。芳香族残基を含有するリガンドは、もとの親ペプチドに比べて親和性が向上していたが、単一置換を有するペプチドと実質的に差がなかった（表１６）。したがって、ナノ粒子結合の明白な向上を、単にリガンド親和性だけによって説明することはできない。

【0161】

【表18】

【0162】

（実施例９）
フローサイトメトリー分析
ＰＬＡ−Ｃｙ５が組み込まれているペプチドナノ粒子コンジュゲートを、さらに、ヒト上皮癌Ａ_４３１細胞の表面に発現されたＥＧＦＲへの結合について、フローサイトメトリーによって評価した。ナノ粒子を、ＥＧＦの存在下または非存在下で、Ａ_４３１細胞と共に４℃でインキュベートし、次いで洗浄して、あらゆる非結合ナノ粒子を除去した。ナノ粒子結合をフローサイトメーターで分析した。４℃では、ＥＧＦＲ受容体内部移行が最小限に抑えられ、観察されるシグナルは、主として、細胞表面結合によるものである。

【0163】

図２３Ａ〜２３Ｃに、フローサイトメトリー実験からの代表的なデータを示し、完全なデータを図２４に示す。図２３Ａおよび２３Ｂでは、Ｐｅｎ置換を有するナノ粒子コンジュゲートについての結合曲線が比較される。ＥＧＦの存在下では、すべてのコンジュゲートが十分に結合したが、ＥＧＦの非存在下では、Ｐｅｎ／芳香族および三重変異体だけが十分に結合した。細胞結合データの略式プロットと、ＳＰＲデータである図２２からの略式プロットとの間には、高度な一致がある。ペニシラミンおよび芳香族を含有する二重変異体、ならびに三重変異体は、最も強力な結合性ナノ粒子であり、詳細には、ＥＧＦの存在下または非存在下で、ほぼ同等な結合を示した。

【0164】

ＥＧＦ、Ｐ_１−３、および三重ハイブリッドナノ粒子コンジュゲートを、直接比較した（図２３Ｃ）。同等なリガンド添加量では試験していないものの、結果は、リガンド選択および最適化手法によって、比較的高い親和性の、ＥＧＦＲの天然におけるリガンドにコンジュゲートさせたナノ粒子と同様の程度にＥＧＦＲ発現細胞を結合することのできる、２種のナノ粒子コンジュゲートが生み出されたことを示している。

【0165】

これらのリガンドおよびナノ粒子コンジュゲートを、室温でのＳＰＲおよび４℃でのフローサイトメトリーを使用してスクリーニングおよび最適化した。ＳＰＲとフローサイトメトリーデータの比較的強い相関にもかかわらず、本発明者らは、これらのナノ粒子をｉｎ ｖｉｖｏで評価しようと考え、したがって、生理的温度でのその結合をアセスメントした。本発明者らは、３７℃でのナノ粒子のＡ_４３１細胞への結合および内部移行を評価した。表面に結合した粒子および内部移行した粒子を含めた合計結合ナノ粒子を、３０分間のインキュベート後にアセスメントした（図２５Ａ）。次いで、各試料の一部を酸で処理して、表面に結合したナノ粒子を除去した。ナノ粒子と関連する残りの蛍光シグナルは、内部移行した画分を表す（図２５Ｂ）。興味深いことに、３種すべてのナノ粒子が、３０分までに３０〜６０％内部移行しており、効率よく結合および内部移行することがわかった。

【0166】

（実施例１０）
ペプチドおよびナノ粒子の特徴付け
抜粋した官能化および非官能化ナノ粒子の粒径およびゼータ電位を表１９に示し、選択されたペプチドおよびペプチド−ＤＢＣＯコンジュゲートの予測および実測分子量を表２０に示す。

【0167】

【表19】

【0168】

【表20】

【0169】

均等物
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている開示されるナノ粒子の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、確認することができる。このような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

【0170】

参照による組込み
本明細書において引用した全ての特許、公開された特許出願、ウェブサイト、および他の参照文献の全内容は、参照によりその全体が明確に本明細書において組み込まれている。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【国際調査報告】