特表 2019-514915 組成物、クロシン系活性成分及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2019-514915(P2019-514915A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(54)【発明の名称】組成物、クロシン系活性成分及びその用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7024 20060101AFI20190517BHJP

   A61K 36/744 20060101ALI20190517BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20190517BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20190517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20190517BHJP

   C07H 1/08 20060101ALI20190517BHJP

   C07H 13/04 20060101ALI20190517BHJP

   A23L 33/10 20160101ALN20190517BHJP

   A23L 33/105 20160101ALN20190517BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7024

   A61K36/744

   A61P25/28

   A61K45/00

   A61P43/00 121

   C07H1/08CSP

   C07H13/04

   A23L33/10

   A23L33/105

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】29

(21)【出願番号】特願2018-556347(P2018-556347)

(86)(22)【出願日】2017年3月16日

(85)【翻訳文提出日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】CN2017076910

(87)【国際公開番号】WO2017185899

(87)【国際公開日】20171102

(31)【優先権主張番号】201610284549.7

(32)【優先日】2016年4月29日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】512000260

【氏名又は名称】ジナン・ユニバーシティ

【氏名又は名称原語表記】Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

(74)【代理人】

【識別番号】100112737

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 考晴

(74)【代理人】

【識別番号】100136168

【弁理士】

【氏名又は名称】川上 美紀

(74)【代理人】

【識別番号】100196117

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 利恵

(72)【発明者】

【氏名】シンシェン ヤオ

(72)【発明者】

【氏名】ダン チャン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ユ

(72)【発明者】

【氏名】シウチ バオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン ニ

(72)【発明者】

【氏名】ツァイシア チャン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C057

4C084

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018LB08

4B018LB10

4B018MD07

4B018MD08

4B018MD42

4B018MD61

4B018ME14

4B018MF01

4C057AA06

4C057BB02

4C057BB03

4C057DD02

4C057HH02

4C084AA22

4C084NA05

4C084ZA151

4C084ZA152

4C084ZA161

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA03

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZC75

4C088AB14

4C088AC04

4C088BA09

4C088BA10

4C088BA11

4C088CA06

4C088CA12

4C088CA14

4C088MA02

4C088NA14

4C088ZA15

4C088ZA16

4C088ZC75

(57)【要約】

組成物及びクチナシから抽出したクロシン系活性成分であって、クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシド、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８’−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドを主に含む。薬理学的実験結果によると、前記クロシン系活性成分がスコポラミンとβ アミロイドによるマウスの学習・記憶の障害を効果的に改善することができることを示した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の構造式を有するｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ及びクロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドを含む、ことを特徴とする組成物。

【化1】

【請求項2】

クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシド、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物中の各成分の含有量がそれぞれ以下に示すとおりである請求項５に記載の組成物。
クロセチンジ-β-D-ゲンチオビオシド 8.0％−12.0％
クロセチン-β-D-ピラノグルコシル-β-D-ゲンチオビオシド(2) 3.5％−5.5％
クロセチンジ-β-D-ピラノグルコシド(3) 0.5％−2.5％
13Z-クロセチンジ-β-D-ゲンチオビオシド(4) 6.0％−8.0％
ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ(5) 5.5％−7.5％
クロセチンモノ-β-D-ゲンチオビオシド(6) 40.0％−50.0％
13Z-クロセチン-8-O-β-D-ゲンチオビオシド(7) 4.0％−5.0％
13Z-クロセチン-8'-O-β-D-ゲンチオビオシド(8) 8.0％−10.0％
クロセチンモノ-β-D-ピラノグルコシド(9) 1.0％−3.0％

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、ことを特徴とするクロシン系活性成分。

【請求項8】

前記クロシン系活性成分がクチナシから抽出して得られる、ことを特徴とする請求項７に記載のクロシン系活性成分。

【請求項9】

前記クロシン系活性成分のＵＰＬＣ特性グラフに主に９個のクロマトグラフィーピークを含み、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間を１として、各クロマトグラフィーピークの相対的保留時間をそれぞれ求めると、クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．３８±０．０２、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．４８±０．０２、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシドの保留時間が０．６０±０．０２、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．７８±０．０２、ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂの保留時間が０．８９±０．０２、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．００、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．１３±０．０２、１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．１４±０．０２、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドの保留時間が１．１９±０．０２である、ことを特徴とする請求項７に記載のクロシン系活性成分。

【請求項10】

前記クロシン系活性成分のＵＰＬＣ特性グラフは、逆相超高速液体クロマトグラフィーによるものであり、クロマトグラフィー条件として、流速０．６ｍＬ／分、検出波長４４０ｎｍ、カラム温度３５℃であり、オクタデシルシラン結合とシリカゲルを固定相とし、０．１％ギ酸含有アセトニトリル−水溶液を移動相として、勾配溶出する、ことを特徴とする請求項９に記載のクロシン系活性成分。

【請求項11】

（１）クチナシの乾燥果実を適度に粉砕した後、エタノール、メタノール又は水を用いて、異なる抽出回数及び時間で、熱抽出又は超音波抽出によって抽出し、抽出物を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得る工程と、
（２）前記クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーによって、水及び／又は３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を回収し、７０％エタノール溶出液を減圧濃縮し、クロシン系活性成分を得る工程によって製造されることを特徴とするクロシン系活性成分。

【請求項12】

（１）クチナシの乾燥果実を適度に粉砕した後、エタノール、メタノール又は水を用いて、異なる抽出回数及び時間で、熱抽出又は超音波抽出によって抽出し、抽出物を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得る工程と、
（２）前記クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーによって、水及び／又は３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を回収し、減圧濃縮し、クロシン系活性成分を得る工程を含む、ことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分の製造方法。

【請求項13】

前記工程（１）において、４倍量の６０％エタノールで、２時間／回に３回加熱還流し、前記工程（２）において、水、３０％エタノール、５０％エタノール、７０％エタノール、９５％エタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶出液を減圧濃縮してクロシン系活性成分を得ることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。

【請求項14】

請求項７〜１１のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分の学習記憶能力を改善するための医薬品の製造への応用。

【請求項15】

請求項７〜１１のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分のアルツハイマー病を予防・治療するための医薬品の製造への応用。

【請求項16】

請求項７〜１１のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分、一種又は複数種の他の中枢神経保護作用を有する医薬品及び適当な医薬品佐剤を含む、ことを特徴とする医薬品組成物。

【請求項17】

請求項１６に記載の医薬品組成物の中枢神経退行性疾患を予防・治療するための医薬品の製造への応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は組成物に関し、さらに漢方薬抽出物に関する。具体的に、クチナシから抽出したクロシン系活性成分及びそれのアルツハイマー病などの疾患への予防・治療の応用に関し、さらに、クチナシクロシン系活性成分及びそれが含む活性成分のアルツハイマー病などの老人性認知症関連疾患を予防・治療する医薬品又はヘルスケア製品の製造応用に関する。

【背景技術】

【0002】

クロシンは構造が特別な水溶性のカロテノイドであり、クロセチン及びその異なるグリコシル基と結合してなる糖エステルを含み、サフラン及びクチナシにおける共有色素成分である。それの良好な水溶性のため、クロシンはアルコール、料理及びペストリーの着色剤として広く使用されている。サフラン粗抽出液、クチナシ黄色色素及びモノマー成分であるクロシンビスゲンチオビオシド、クロセチンが中枢神経系保護（非特許文献１〜４を参照）、心血管系・脳血管系保護（非特許文献５〜６を参照）、及び悪性腫瘍の拮抗（非特許文献７〜９を参照）などの面で高効率、低毒性の薬理学的活性を示すことが、多くの研究により表明された。

【0003】

サフランは南ヨーロッパ、地中海、イランで原産され、イランのサフラン生産量は世界全体の９５％を占め、中国の浙江省、江蘇省、山東省、北京などで少ない量で栽培される。サフランはスティグマで薬品として使用され、その収量は非常に低く（１ｍｕあたり１ｋｇ未満）、高価（＄２，０００／ｋｇ）であるので「プラントゴールド」と呼ばれる。クロシン系成分の薬用及び食用の要求が増加していくにつれて、クロシン系成分が豊富な他の植物を探して発見することが重要な意義を持っている。

【0004】

ガーデニアジャスミノイデスなどとも呼ばれるクチナシは、中国の中部及び南部の地域に広く分布するヘメロカリス（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）属の属である。クチナシは、『シェン・ノンのハーブ・クラシック（Ｓｈｅｎｇ Ｎｏｎｇ’ｓ ｈｅｒｂａｌ ｃｌａｓｓｉｃ）』に初めて記載され、中国の歴代の薬局方とマテリア・メディカにいずれも記載され、保健省によって公布された食品と医療のための二重使用の最初のリソースである。クチナシは、服用したら病原性の怒り・焦りを除き、熱を除いて利尿し、血液を冷却し、解毒する効果があり、外部使用は捻挫や挫傷を治療することができる。工業では天然色素を抽出する良好な原材料である。現代の化学及び薬理学的な検討によれば、クチナシに、イリドイド、クロシン、トリテルペン、フラボン及びキナ酸などの化学成分を含有することを見出した。そのうち、イリドイド及びクロシンは、代表的な成分である（非特許文献１０〜１１を参照）。クチナシの薬理学的作用は主に、抗炎・鎮痛、利胆・肝臓保護、抗酸化及び抗腫瘍などとして現れる（非特許文献１０〜１１を参照）。

【0005】

クチナシは常用の漢方薬材として、植付けの分布が広く、生産量が高く（クチナシ乾燥果実の１ｍｕの生産量が２００ｋｇに達し、中国での年間生産量が５０００ｔに達する）、安価であり（販売価額が１５元／ｋｇ）、それに含まれるクロシン系成分の相対的含有量が高く、類型が豊かであるので、クチナシはサフランを補助してクロシンを抽出する理想的な植物になる望みである。

【0006】

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は記憶障害、認知障害、及び人格変化を特徴とする老化に伴う進行性の神経変性疾患である。ＡＤは、老人性認知症の最も一般的なタイプであり、ＡＤ患者の初期症状は記憶喪失であり、方向力、理解力、判断力及び記憶力の低下に進展し、患者の後期は全面的な衰退状態になり、知能は完全に失われ、運動や言語の障害がますます明らかになり、一日中ベッドにいて、自身を世話できなく、最終的に二次感染と不全で死亡することが多い。

【0007】

世界的な老年化の激化につれて、ＡＤの発生率が年々急速に増加され、各国、特に発展途上国の社会及び人々に重い経済的、家族的な負担をもたらす。１９０６年、ドイツの医者Ａｌｚｈｅｉｍｅｒが始めてこの疾患を記述してから今までの１００年以上にわたって、ＡＤはやはり不可逆的疾患であり、国際的にはこの疾患を治療する方法と医薬品がないと認めている。ここから分かるように、理想的な治療薬が存在しない場合、抗アルツハイマー薬のスクリーニング及び研究開発は、非常に広い市場の見通しと深い社会的意義を有する。

【0008】

また、特許文献ＣＮ１０４４９１０７５Ａに、マクロポーラス樹脂カラム及びデキストランゲルカラムを併用して、クチナシから富化されたクロシン成分を抽出し、ストレス抑うつ実験によりうつ病の治療におけるその効果を検証する方法が報告されている。しかしながら、この特許文献は５０％エタノール部位に注目し、また、マクロポーラス樹脂カラムとデキストランゲルカラム併用の併用もそのプロセスが複雑である。さらに、この特許文献の富化されたクロシン成分の組成及び含有量は不明であり、実施例での有効用量も高く（１００〜４００ｍｇ）、これは恐らく富化されたクロシン成分の純度が低いためである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋａｒａｋａｎｉ Ａ．−Ｍ．、Ｒｉａｚｉ Ｇ．、Ｍａｈｍｏｏｄ Ｇ．−Ｓ．、ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｒｃｉｎ ｏｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ １Ｎ／４Ｒ ｈｕｍａｎ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｉｒａｎｉａｎｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ．２０１５、１８（５）、４８５−９２．

【非特許文献2】Ｐａｐａｎｄｒｅｏｕ Ｍ．−Ａ．、Ｋａｎａｋｉｓ Ｃ．−Ｄ．、Ｐｏｌｉｓｓｉｏｕ Ｍ．−Ｇ．、ｅｔａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ａｍｙｌｏｉｄ−βＡｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓｓａｔｉｖｕｓ Ｓｔｉｇｍａｓ Ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｒｏｃｉｎ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄＦｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６、５４（２３）、８７６２−８７６８．

【非特許文献3】Ａｋｈｏｎｄｚａｄｅｈ Ｓ．、Ｓａｂｅｔ Ｍ．−Ｓ．、Ｈａｒｉｒｃｈｉａｎ Ｍ．−Ｈ．、ｅｔ ａｌ．Ａ２２−ｗｅｅｋ、ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ、ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ、ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ ｉｎｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｌｄ−ｔｏ−ｍｏｄｅｒａｔｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１０、２０７（４）、６３７−６４３．

【非特許文献4】Ｆａｒｏｋｈｎｉａ Ｍ．、Ｓｈａｆｉｅｅ Ｓ．−Ｍ．、Ｉｒａｎｐｏｕｒ Ｎ．、ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ．Ｗｉｔｈ ｍｅｍａｎｔｉｎｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒａｔｅｔｏ ｓｅｖｅｒｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ：ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ［Ｊ］．ＨｕｍａｎＰｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１４、２９（４）、３５１−３５９．

【非特許文献5】Ｚｈｅｎｇ Ｙ．−Ｑ．、Ｌｉｕ Ｊ．−Ｘ．、Ｗａｎｇ Ｊ．−Ｎ．、ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆｃｒｏｃｉｎ ｏｎ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ＿ｎｉｔｒａｔｉｖｅ ｉｎｊｕｒｙ ｔｏ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓａｆｔｅｒ ｇｌｏｂａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００７、１１３８、８６−９４．

【非特許文献6】Ｈｉｇａｓｈｉｎｏ Ｓ．、Ｓａｓａｋｉ Ｙ．、Ｇｉｄｄｉｎｇｓ Ｊ．−Ｃ．、ｅｔ ａｌ．Ｃｒｏｃｅｔｉｎ、ａＣａｒｏｔｅｎｏｉｄ ｆｒｏｍ Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ Ｅｌｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ａｎｄ ＣｅｒｅｂｒａｌＴｈｒｏｍｂｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｓｔｒｏｋｅ−ｐｒｏｎｅ Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１４、２８（９）、１３１５−１３１９．

【非特許文献7】Ｓｈｅｎｇｙｕ ＤＯＮＧ、 Ｆｕｍｅｉ ＬＩＵ、 Ｘｉａｎｇｙｏｎｇ ＬＩ；ＣＮＥ２細胞の増殖と移動に対するクロシンの阻害作用［Ｊ］；湖北民族学院刊行物・医学版；２０１３、３０（２）、６〜１２．

【非特許文献8】Ｘｉｎｘｉｎｇ ＷＡＮＧ、Ｚｈｅｎｇｈｏｎｇ ＹＵ、 Ｓｈｕｌｕ ＳＨＩなど；クロシンのヒト肺腺癌ＳＰＣ−Ａ１細胞への増殖抑制効果及びメカニズムの研究［Ｊ］；臨床腫瘍学会雑誌．２０１３、１８（４）、２９５−２９９．

【非特許文献9】Ｆｕｘｉｏｎｇ ＣＨＥＮ、Ｊｉａ ＴＡＯ、Ｓｕｉ ＨＵＡＮＧなど；ＥＢウイルス感染の小児におけるＩＭ及びＥＢＶ−ＡＨＳの臨床研究及びウイルス感染特性［Ａ］；中国医師会、中国医師会小児科会；第１７回全国医学会全国小児科学会編集（第１巻）［Ｃ］；中国医師会、中国医師会小児科会；２０１２：１．

【非特許文献10】Ｘｉａｎｇｌｅ ＭＥＮＧ、 Ｈｏｎｇｗｅｉ ＬＩ、 Ｙａｎ ＬＩなど；クチナシの化学成分及びその薬理的作用に関する研究の進展［Ｊ］。中国新薬雑誌．２０１１、２０（１１）、９５９−９６７

【非特許文献11】Ｙａｎｇ ＹＵ； クチナシの抗老化認知症の活性成分に関する研究。瀋陽製薬大学、２０１０

【非特許文献12】Ｃａｌｓｔｅｒｅｎ Ｍ．−Ｒ．−Ｖ．、Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ Ｍ．Ｃ．、Ｃｏｒｍｉｅｒ Ｆ．、ｅｔ ａｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｃｅｔｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｒｏｍ Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ ａｎｄ Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９７、４５（４）、１０５５−１０６１．

【非特許文献13】Ｈａｉｂｏ ＬＩ、Ｙａｎｇ ＹＵ、Ｚｈｅｎｚｈｏｎｇ ＷＡＮＧなど；Ｒｅｄｕｎｉｎｇ注射液の化学成分に関する研究（ＩＩ）（Ｊ）、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｅｒｂａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１５、４６（１１）、１５９７−１６０２

【非特許文献14】Ｈｏｎｇ ＣＨＥＮ、Ｙｏｎｇｑｉｎｇ ＸＩＡＯ、Ｌｉ ＬＩなど；クチナシの化学成分に関する研究［Ｊ］。中国漢方薬雑誌．２００７，３２（１１）、１０４１−１０４３。

【発明の概要】

【0010】

上記の従来技術に存在する問題を鑑みて、本発明は、新規構造のクロシン系化合物を含む組成物を提供することを１つの目的とする。

【0011】

また、本発明は、クチナシから抽出した成分と含有量が明確なクロシン系活性成分及びそれのアルツハイマー病などに関連する認知性疾患を予防・治療するための医薬品、食品又は食品添加剤の製造への応用を提供する。

【0012】

さらに、本発明の別の目的は、クチナシのクロシン系活性成分及び中枢神経保護作用を有する医薬品、伝統漢方薬、天然物を含む組成物、及びこの組成物がアルツハイマー病などの老人性認知症関連疾患を予防・治療するための医薬品又はヘルスケア製品の製造への応用を提供する。

【0013】

上記の目的に達成するために、本発明は以下の技術案を採用する。

【0014】

［１］ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ（５）及びクロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（１）を含む、ことを特徴とする組成物。

【0015】

［２］項［１］に記載の組成物であって、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（６）をさらに含むことを特徴とする組成物。

【0016】

［３］項［１］に記載の組成物であって、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（４）をさらに含むことを特徴とする組成物。

【0017】

［４］項［１］に記載の組成物であって、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（２）をさらに含むことを特徴とする組成物。

【0018】

［５］項［１］に記載の組成物であって、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（２）、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシド（３）、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（４）、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（６）、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（７）、１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド（８）、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシド（９）をさらに含むことを特徴とする組成物。

【0019】

［６］項［５］に記載の組成物であって、前記組成物中の各成分の含有量がそれぞれ以下に示すとおりである組成物。
クロセチンジ-β-D-ゲンチオビオシド 8.0％−12.0％
クロセチン-β-D-ピラノグルコシル-β-D-ゲンチオビオシド(2) 3.5％−5.5％
クロセチンジ-β-D-ピラノグルコシド(3) 0.5％−2.5％
13Z-クロセチンジ-β-D-ゲンチオビオシド(4) 6.0％−8.0％
ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ（５） 5.5％−7.5％
クロセチンモノ-β-D-ゲンチオビオシド(6) 40.0％−50.0％
13Z-クロセチン-8-O-β-D-ゲンチオビオシド(7) 4.0％−5.0％
13Z-クロセチン-8'-O-β-D-ゲンチオビオシド(8) 8.0％−10.0％
クロセチンモノ-β-D-ピラノグルコシド(9) 1.0％−3.0％。

【0020】

ここで、上記の各化合物の構造式はそれぞれ以下に示すとおりである。

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【0021】

［７］請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む、ことを特徴とするクロシン系活性成分。

【0022】

［８］項［７］に記載のクロシン系活性成分であって、前記クロシン系活性成分がクチナシから抽出して得られる、ことを特徴とするクロシン系活性成分。

【0023】

［９］項［７］に記載のクロシン系活性成分であって、前記クロシン系活性成分のＵＰＬＣ特性グラフに主に９個のクロマトグラフィーピークを含み、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間を１として、各クロマトグラフィーピークの相対的保留時間をそれぞれ求めると、クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．３８±０．０２、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．４８±０．０２、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシドの保留時間が０．６０±０．０２、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が０．７８±０．０２、ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂの保留時間が０．８９±０．０２、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．００、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．１３±０．０２、１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドの保留時間が１．１４±０．０２、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドの保留時間が１．１９±０．０２である、ことを特徴とするクロシン系活性成分。

【0024】

［１０］項［９］に記載のクロシン系活性成分であって、前記クロシン系活性成分のＵＰＬＣ特性グラフは、逆相超高速液体クロマトグラフィーによるものであり、クロマトグラフィー条件として、流速０．６ｍＬ／分、検出波長４４０ｎｍ、カラム温度３５℃であり、オクタデシルシラン結合とシリカゲルを固定相とし、０．１％ギ酸含有アセトニトリル−水溶液を移動相として、勾配溶出する、ことを特徴とするクロシン系活性成分。

【0025】

［１１］（１）クチナシの乾燥果実を適度に粉砕した後、エタノール、メタノール又は水を用いて、異なる抽出回数及び時間で、熱抽出又は超音波抽出によって抽出し、抽出物を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得る工程と、
（２）前記クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーによって、水及び／又は３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を回収し、７０％エタノール溶出液を減圧濃縮し、クロシン系活性成分を得る工程によって製造されることを特徴とするクロシン系活性成分。

【0026】

［１２］（１）クチナシの乾燥果実を適度に粉砕した後、エタノール、メタノール又は水を用いて、異なる抽出回数及び時間で、熱抽出又は超音波抽出によって抽出し、抽出物を減圧濃縮してクチナシの全抽出物を得る工程と、
（２）前記クチナシの全抽出物を適量の水で溶解し、遠心分離し、上清をマクロポーラス吸着樹脂オープンカラムクロマトグラフィーによって、水及び／又は３０％〜９５％エタノールで適量のベッド容量を溶出して、溶出液を回収し、減圧濃縮し、クロシン系活性成分を得る工程を含む、ことを特徴とする項［７］〜［１０］のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分の製造方法。

【0027】

［１３］工程（１）において、４倍量の６０％エタノールで、２時間／回に３回加熱還流し、工程（２）において、水、３０％エタノール、５０％エタノール、７０％エタノール、９５％エタノールで順に溶出し、各勾配で４つのベッド容量で溶出し、７０％エタノール溶出液を減圧濃縮してクロシン系活性成分を得ることを特徴とする項［１２］に記載の方法。

【0028】

［１４］項［７］〜［１１］のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分の学習記憶能力を改善するための医薬品の製造への応用。

【0029】

［１５］項［７］〜［１１］のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分のアルツハイマー病を予防・治療するための医薬品の製造への応用。

【0030】

［１６］項［７］〜［１１］のいずれか一項に記載のクロシン系活性成分、一種又は複数種の他の中枢神経保護作用を有する医薬品及び適当な医薬品佐剤を含む、ことを特徴とする医薬品組成物。

【0031】

［１７］項［１６］に記載の医薬品組成物の中枢神経退行性疾患を予防・治療するための医薬品の製造への応用。

【発明の効果】

【0032】

（１）本発明の組成物は、いくつかの新規構造のクロシン系化合物からなる。

【0033】

（２）本発明のクロシン系活性成分は、２つの新規構造のクロシン系化合物をさらに含む。

【0034】

（３）本発明の製造プロセスは簡単であり、また本発明は国際的に認められているＡＤ薬理学評価モデルを採用して、本発明のクロシン系活性成分が低用量で優れたＡＤ治療効果を有することを証明している。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】液相のＵＰＬＣ分析によって確定されたクロシン系活性成分の特性グラフである。

【図2】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物１のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図3】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物２のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図4】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物３のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図5】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物４のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図6】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物５のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図7】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物６のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図8】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物７のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図9】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物８のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図10】同じＵＰＬＣ条件下でクロシン系活性成分の活性部分から分離された化合物９のクロマトグラフィーピークの識別グラフである。

【図11】クチナシクロシン活性成分ＧＪ−４のスコポラミンによるマウスの学習と記憶の障害への保護作用を示す図である。

【図12】クチナシクロシン活性成分ＧＪ−４のＡβ_{２５−３５}脳室内注射によるマウスの学習と記憶の障害への保護作用（プラットフォームテスト）を示す図である。

【図13】クチナシクロシン活性成分ＧＪ−４のＡβ_{２５−３５}脳室内注射によるマウスの学習と記憶の障害への保護作用（モリス水迷路）を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下、実施例を挙げて本発明の技術案をさらに説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

【0037】

実施例１：クチナシクロシン系活性成分の製造方法
クチナシの乾燥・成熟した果実４０．０ｋｇを採取し、適切な粉砕の後、４倍量の６０％エタノールで加熱還流して３回抽出した。毎回は２時間であった。抽出液を合わせて減圧下で溶媒を蒸留して、クチナシ全部抽出物として６．２ｋｇを得た。抽出物を適量の水に溶解して遠心分離し、マクロポーラス樹脂オープンカラムのクロマトグラフィー（２０．０×９０ｃｍ）を行った。４倍のベッド容量の水、３０％、５０％、７０％、９５％のエタノールで勾配溶出し、各溶出液を回収し、それぞれ減圧下で溶媒を回収して、約４．５ｋｇの水の溶出と３０％エタノールの溶出を組合わせたものを得、７１０．０ｇの５０％エタノール溶出されたものを得、１５０．０ｇの７０％エタノール溶出されたものを得、１１２．０ｇの９５％エタノール溶出されたものを得た。７０％エタノール溶出されたものがクチナシクロシン活性成分ＧＪ−４であった。

【0038】

実施例２：クチナシクロシン系活性成分における主要成分の分離及び検定
実施例１で製造されたクチナシクロシン系活性成分のＵＰＬＣ特性グラフは図１に示すようである。特性グラフの教示で、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー、ＲＰ−ＨＰＬＣ製造液相等の分離手段により、ＵＶ、ＭＳ、ＮＭＲ等の分析検定方法を利用して、クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシド、１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂ、クロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシド、クロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドの９つの化合物の構造を検定した。

【0039】

クチナシクロシン系活性成分ＵＰＬＣ特性グラフと同じＵＰＬＣ条件下で、分離された化合物を識別した。具体的な識別過程は図２〜図１０に示す。

【0040】

２．１分離過程
得られたクチナシクロシン系活性成分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、クロロホルム−メタノール−水８：２：０．２で溶出して化合物６（約７．０ｇ）を得、クロロホルム−メタノール−水９：１：０．１で溶出して化合物９（１３６．５ｍｇ）を得た。ＯＤＳオープンカラムクロマトグラフィー分離で、５０％メタノール−水で溶出して化合物１（５４５．１ｍｇ）を得、５５％メタノール−水で溶出して化合物２（１４３．７ｍｇ）を得、５０％メタノール−水で溶出して化合物３（３１５．７ｍｇ）を得た。製造型高速液相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー分離で、６０％メタノール−水で溶出して化合物４（２６５．７ｍｇ、ｔ_Ｒ＝１６．６ｍｉｎ）を得、６８％メタノール−酸水（０．１％ＣＨ_３ＣＯＯＨ）で溶出して化合物５（５２０．９ｍｇ、ｔ_Ｒ＝９．５ｍｉｎ）を得、４２％アセトニトリル−酸水（０．１％ＣＨ_３ＣＯＯＨ）で分離して化合物７（８．０ｍｇ、ｔ_Ｒ＝１７．９ｍｉｎ）及び化合物８（１６．０ｍｇ、ｔ_Ｒ＝２１．５ｍｉｎ）を得た。

【0041】

２．２化合物構造解析
２．２．１化合物１
赤色アモルファス粉末である。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳがｍ／ｚ９９９．３６８０［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値９９９．３６８５）を示し、分子式がＣ_４４Ｈ_６４Ｏ_２４であることを確定し、算出による不飽和度が１３である。

【0042】

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、特性となるクロセチンのアルケン水素シグナル［δ７．３５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．８７（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．８、２．４Ｈｚ）、６．８２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．０Ｈｚ）、６．６７（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１５．０、１２．６Ｈｚ）、６．５３（２Ｈ、ｂｒ．ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、］、４対の２つ毎に重ねた糖末端基シグナル［δ５．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、４．１７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）］及び４対の２つ毎に重ねたメチル水素シグナル［δ２．００（６Ｈ、ｓ）、１．９７（６Ｈ、ｓ）］を示した。

【0043】

非特許文献［１１］との対比により、化合物１がクロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであることを確定し、化合物１の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0044】

２．２．２化合物２
赤色アモルファス粉末である。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳがｍ／ｚ８３７．３１６６［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値８３７．３１５７）を示し、分子式がＣ_３８Ｈ_５４Ｏ_１９であることを確定し、算出による不飽和度が１２である。

【0045】

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、特性となるクロセチンのアルケン水素シグナル［δ７．３５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ）、６．８６（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、３．０Ｈｚ）、６．８２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１４．４Ｈｚ）、６．８１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．０Ｈｚ）、６．６６（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１５．０、１２．０Ｈｚ）、６．５４（２Ｈ、ｂｒ．ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）］、４つのメチル水素シグナル［δ１．９９（６Ｈ、ｓ）、１．９７（６Ｈ、ｓ）］及び３つの糖末端基プロトンシグナル［δ５．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、４．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）］を示した。

【0046】

非特許文献［１１］との対比により、化合物２がクロセチン−β−Ｄ−ピラノグルコシル−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであることを確定し、化合物２の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0047】

２．２．３化合物３
赤色アモルファス粉末である。ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）がｍ／ｚ６７５［Ｍ＋Ｎａ］^＋、１３２７［２Ｍ＋Ｎａ］^＋を示し、その分子量が６５２であると推定する。

【0048】

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、特性となるクロセチンのアルケン水素シグナル［δ７．３５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ）、６．８６（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、３．０Ｈｚ）、６．８１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．０Ｈｚ）、６．６７（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝１５．０、１１．４Ｈｚ）、６．５４（２Ｈ、ｂｒ．ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）］；２つの重ねた糖末端基シグナル［δ５．４２（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）］及び４対の２つ毎に重ねたメチル水素シグナル［δ２．００（６Ｈ、ｓ）、１．９７（６Ｈ、ｓ）］を示した。

【0049】

非特許文献［１２］との対比により、化合物３がクロセチンジ−β−Ｄ−ピラノグルコシドであることを確定し、化合物３の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0050】

２．２．４化合物４
赤色アモルファス粉末である。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳがｍ／ｚ９９９．３６６５［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値９９９．３６８５）を示し、分子式がＣ_４４Ｈ_６４Ｏ_２４であることを確定し、算出による不飽和度が１３である。

【0051】

化合物４と化合物１は異性体であり、両者を対比すると１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）であり、化合物４のアルケン水素領域での変化が大きく、他のシグナルは化合物１とほぼ一致されている。化合物４の^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ｉｎ
ＤＭＳＯ−ｄ_６）において、１３位二重結合の立体配置の変化によって化合物の高度の対称構造が破壊され、複数の重ねたオレフィン炭素シグナルが２つのシグナルになり、且つ２０位のメチル炭素シグナルが低磁場にδ２０．０まで変位し、８位の炭素と連結した糖の末端基の水素シグナルが５．４２から５．４４に変化する。

【0052】

非特許文献［１１］との対比により、化合物４が１３Ｚ−クロセチンジ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであることを確定し、化合物４の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0053】

２．２．５化合物５
赤色アモルファス粉末である。ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）がｍ／ｚ１０１１［Ｍ＋Ｎａ］^＋を示し、化合物の分子量が９８８であることを示した。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳが９８９．３６４２［Ｍ＋Ｈ］^＋（算出値が９８９．３６５４）を示し、化合物の分子式がＣ_４８Ｈ_６０Ｏ_２２であることを確定し、算出による不飽和度が１９である。

【0054】

化合物５の^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）グラフは、低磁場領域で一組のトランスアルケン水素シグナル［δ７．４４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ、Ｈ−３″′）、６．１６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１６．２Ｈｚ、Ｈ−２″′）］；一組の相互結合した芳香プロトンシグナル［δ７．０３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ−５″′）、６．９８（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．４、１．８Ｈｚ、Ｈ−９″′）、６．７４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｈ−８″′）］を示し、^１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ、ｉｎ
ＤＭＳＯ−ｄ_６）シグナル：δ１４８．５（Ｃ−７″′）、１４５．６（Ｃ−６″′）、１２５．２（Ｃ−４″′）、１２１．６（Ｃ−９″′）、１１５．７（Ｃ−８″′）及び１１４．９（Ｃ−５″′）と組合わせると、構造に１、３、４−トリ置換ベンゼン環が存在することを示す。アルケン水素プロトンシグナルＨ−３″′／Ｃ−４″′、Ｃ−５″′、Ｃ−９″′、Ｃ−１″′；Ｈ−２″′／Ｃ−１″′、Ｃ−４″′のＨＭＢＣ遠距離相関は、１つのＣ_６−Ｃ_３カフェオイル基のフラグメントを含有することを示す。

【0055】

糖末端基プロトンシグナル［δ５．４２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｈ−１）及び４．１７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、Ｈ−１′）］は、２つのグルコース残基の立体配置がいずれもβ型を示す。ＨＭＢＣグラフにおいて、関連ピークＨ−６／Ｃ−１′、Ｈ−１′／Ｃ−６は、２つのグルコシルが１→６接続であり、１つのゲンチオビオース基を形成することを示す。糖加水分解誘導体化実験によれば、グルコースの絶対立体配置がＤ配置であることを示す。

【0056】

２つのグルコース残基、１つのＣ_６−Ｃ_３カフェオイルフラグメントの他に、既知の文献と対比すると、その構造における特性のクロセチンシグナルを帰属することができる。

【0057】

^１Ｈ−^１Ｈ ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ及びＨＭＢＣグラフにより構造に３−カフェオイルキナ酸の構造フラグメントが存在することが検定され、ＨＭＢＣグラフによりこのカフェイン酸の４位がクロセチンと接続されている［非特許文献１３を参照］ことを推定する。

【0058】

検索によると、化合物５は報告されていない新規化合物であり、ｎｅｏｃｒｏｃｉｎ Ｂと命名する。化合物５の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0059】

２．２．６化合物６
赤色アモルファス粉末である。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳが６７５．２６２５の［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値が６７５．２６２９）を示し、分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１４であることを確定し、算出による不飽和度が１１である。

【0060】

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、特性となるクロセチンのアルケン水素シグナル、２つの糖末端基シグナル及び４つのメチル水素シグナルを示した。

【0061】

非特許文献［１４］との対比により、化合物６がクロセチンモノ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであることを確定し、化合物６の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0062】

２．２．７化合物７
赤色アモルファス粉末である。ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）がｍ／ｚ６７５［Ｍ＋Ｎａ］^＋、ｍ／ｚ１３２７［２Ｍ＋Ｎａ］^＋を示し、分子量が６５２であることを示した。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳが６７５．２６１７の［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値が６７５．２６２９）を示し、分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１４であることを確定し、算出による不飽和度が１１である。

【0063】

化合物７は化合物６のシス−幾何異性体であり、異なるのは、化合物６の構造自体が非対称であるため、そのシス−幾何異性体が２つの場合がある。^１Ｈ、^１３Ｃ−ＮＭＲ及び二次元核磁気のデータ解析により、化合物７が１３Ｚ−クロセチン−８−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであることを確定し、化合物７の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0064】

２．２．８化合物８
赤色アモルファス粉末である。ＥＳＩ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）がｍ／ｚ６７５［Ｍ＋Ｎａ］^＋、ｍ／ｚ１３２７［２Ｍ＋Ｎａ］^＋を示し、分子量が６５２を示す。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳが６７５．２６１７の［Ｍ＋Ｎａ^＋］（算出値が６７５．２６２９）を示し、分子式がＣ_３２Ｈ_４４Ｏ_１４であることを確定し、算出による不飽和度が１１である。

【0065】

化合物８は化合物６の他の幾何異性体である。一次元及び二次元核磁気のデータ解析により、化合物８が１３Ｚ−クロセチン−８′−Ｏ−β−Ｄ−ゲンチオビオシドであると検定され、検索によると、化合物８は報告されていない新規化合物であり、その^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0066】

２．２．９化合物９
赤色アモルファス粉末である。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳが５１３．２０９５［Ｍ＋Ｎａ］^＋（算出値が５１３．２１０１）、１００３．４３０３［２Ｍ＋Ｎａ］^＋を示し、分子式がＣ_２６Ｈ_３４Ｏ_９であることを確定し、算出による不飽和度が１０である。

【0067】

^１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ｉｎ ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、特性となるクロセチンのアルケン水素シグナル、１つの糖末端基シグナル及び４つのメチル水素シグナルを示した。

【0068】

非特許文献［１１］との対比により、化合物９がクロセチンモノ−β−Ｄ−ピラノグルコシドであることを確定し、化合物９の^１３Ｃ−ＮＭＲは表１に示す。

【0069】

２．３クチナシクロシン系活性成分のＵＰＬＣ−Ｑ／ＴＯＦ−ＭＳ分析
２．３．１クロマトグラフィー条件
ＢＥＨ Ｃ１８（３．０ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）；移動相：溶剤Ａ（水、０．１％ギ酸）及び溶剤Ｂ（アセトニトリル、０．１％ギ酸）、勾配溶出（０ｍｉｎ−２０％Ｂ、０．５ｍｉｎ−２０％Ｂ、１９ｍｉｎ−５０％Ｂ、２０ｍｉｎ−１００％Ｂ、２３ｍｉｎ−１００％Ｂ、２４ｍｉｎ−２０％Ｂ）、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：３５℃、検出波長：４４０ｎｍ。

【0070】

２．３．２質量分析条件
エレクトロスプレー陽イオンモードであり、毛細管電圧：２．０ｋＶ；脱溶剤気流：Ｎ_２、流速６００Ｌ／ｈ、脱溶剤温度３００℃；コーンホール気流：Ｎ_２、流速５０Ｌ／ｈ；イオン源温度：１００℃；Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ：４．００Ｖ；衝突ガス：アルゴン。９つの主要クロマトグラフィーピークの質量分析は表２に示す。

【0071】

【表1】

【0072】

【表2】

【0073】

実施例３：クチナシクロシン系活性成分ＧＪ−４のスコポラミンによるマウスの学習および記憶障害の改善（ステップダウン実験）

【0074】

３．１ステップダウン実験のメカニズム
ステップダウン実験設備は長方形反射ボックスであり、サイズ：１０ｃｍ×１０ｃｍ×６０ｃｍ、黒いプラスティック板で５つの部屋に分かれ、底面に０．５ｃｍ間隔で銅グリッドを敷設し、通電でき、電圧強度は変圧器によって制御される。部屋ごとに右隅に高度と直径がいずれも４．５ｃｍの木製プラットフォームを置き、実験に３６Ｖ ＡＣを使用した。マウスがショックを受けた後、正常の反応は、傷害的刺激を避けるために安全プラットフォームにジャンピングする。最初の日は通電しなく、マウスを反射ボックスに入れ５分間自由活動して、環境を熟知する。２４時間後、銅グリッド電源（３６Ｖ ＡＣ）をオンにし、各組のマウスのショックから安全プラットフォームへ始めてジャンピングするまでの時間（反応時間）および５分以内に安全プラットフォームから飛び跳したエラーの数（基本エラー数）を学習テストスコアとして記録する。翌日、上記の手順を繰り返し、各組のマウスが初めて安全プラットフォームに飛び跳した時間（レーテントピリオド）および５分間のショックの数（エラー数）を記憶テストスコアとして記録する。実験中、マウスが安全プラットフォーム上に５分超え留まっていた場合、レーテントピリオドを５分として算出する。

【0075】

３．２ステップダウン実験の方案
雄性のＩＣＲマウス１６０匹を２０匹／組毎に対照組、モデル組、ドネペジル（５ｍｇ／ｋｇ）組、メマンチン（５ｍｇ／ｋｇ）組、ＧＪ−４（１２．５ｍｇ／ｋｇ）組、ＧＪ−４（２５ｍｇ／ｋｇ）組、ＧＪ−４（５０ｍｇ／ｋｇ）組、およびＧＪ−４（１００ｍｇ／ｋｇ）組の８組に分ける。マウスに事前に７日間連続して投与し、５日目および６日目にマウスをステップダウン実験の訓練を行い、７日目にモデル組および各投与組にスコポラミン（２ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射し、３０分後、ステップダウン法により行動テストを行って、マウスの最初の飛び跳した時間（レーテントピリオド）と５分間の飛び跳した数（エラーの数）を記録する。データは図１１に示す。

【0076】

実験結果によれば、クチナシクロシン系活性成分ＧＪ−４が良好なスコポラミンによる動物の認知への改善作用を表した。ＧＪ−４は、マウスのステップダウンのレーテントピリオドを明らかに延長し、且つステップダウンエラーの数を減少させることができる。ここで、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ用量組は、一定の用量効果関係を示した。中量組および大量組の有効性は、陽性対照医薬品ドネペジルの効力に匹敵し、実験結果は再現性があり、実験では、すべての投与組で投与に伴う毒性反応は観察されなかった。

【0077】

実施例４：クチナシクロシン系活性成分ＧＪ−４の側脳室へのＡβ_{２５−３５}注射によるマウスの学習及び記憶障害の改善（ステップダウン実験及びモリス水迷路実験）

【0078】

４．１マウス側脳室注射手術、組分けおよび投与
Ａβ_{２５−３５}を滅菌蒸留水で５μｇ／μＬに調製する。３７℃のインキュベーターに７日間置きて凝集させ、−２０℃の冷蔵庫に保存する。ＩＣＲマウスを適応的に摂食した２日後、４％クロロアルデヒド水和物（１０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して麻酔した後、立体の位置決め装置に固定し、手術用はさみでマウスの頭皮を中線に沿って切断し、ブレグマとヘリンボーンを露出し、脳膜を損傷しないように、頭骨を電気ドリルで左側脳室で穿孔する。相対的座標はブレグマの後２ｍｍ、中線の左側２ｍｍ、硬脳膜下１．７ｍｍであった。マウスの左側側脳室にＡβ_{２５−３５}２μＬ（１０μｇ）／匹で注射し、１分間をかけて注射完了する。針を３分間止めた後、針をゆっくり抜き取り、切開部を手術用縫合線で縫合し、アンピシリン（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射し、マウスをケージに入れた。偽手術組のマウスは、座標：ブレグマの後２ｍｍ、中線の左側２ｍｍ、硬脳膜下１．７ｍｍで、マウスの左側側脳室に２μＬ滅菌蒸留水を注射した。手術後、側脳室にＡβ_{２５−３５}を注射したマウスを１５匹／組毎に、ランダムにモデル組、ＧＪ−４（２５ｍｇ／ｋｇ）組、ＧＪ−４（５０ｍｇ／ｋｇ）組、ＧＪ−４（１００ｍｇ／ｋｇ）組、及びドネペジル（５ｍｇ／ｋｇ）組に分けた。手術後、マウスを３日間休憩させ、各組に胃内投与により相応の用量の医薬品を投与し、偽手術組とモデル組には同一用量の生理食塩水を１日１回１２日間連続投与した。

【0079】

４．２ 行動学テスト
４．２．１ ステップダウン実験
投与７日目に、マウスの学習および記憶能力をステップダウン実験によって測定した。ステップダウン実験設備は長方形反射ボックスであり、サイズ：１０ｃｍ×１０ｃｍ×６０ｃｍ、黒いプラスティック板で５つの部屋に分かれ、底面に０．５ｃｍ間隔で銅グリッドを敷設し、通電でき、電圧強度は変圧器によって制御される。部屋ごとに右隅に高度と直径がいずれも４．５ｃｍの木製プラットフォームを置き、実験に３６Ｖ ＡＣを使用した。マウスがショックを受けた後、正常の反応は、傷害的刺激を避けるために安全プラットフォームにジャンピングする。５日投与するが通電しなく、マウスを反射ボックスに入れ５分間自由活動して、環境を熟知する。２４時間後、銅グリッド電源（３６Ｖ ＡＣ）をオンにし、各組のマウスのショックから安全プラットフォームへ始めてジャンピングするまでの時間（反応時間）および５分間に安全プラットフォームから飛び跳したエラーの数（基本エラー数）を学習テストスコアとして記録する。投与７日目に、上記の手順を繰り返し、各組のマウスが初めて安全プラットフォームに飛び回った時間（レーテントピリオド）および５分間のショックの数（エラー数）を記憶テストスコアとして記録する。実験中、マウスが安全プラットフォーム上に５分超え留まっていた場合、レーテントピリオドを５分として算出する。結果は図１２に示す。

【0080】

４．２．２ モリス水迷路実験
ステップダウン実験の後、翌日に（即ち、投与８日目）にモリス水迷路実験によってさらにマウスの学習及び記憶能力（各組におけるマウスの空間的な位置感覚と方向感覚の学習と記憶の能力のテスト）を測定した。モリス水迷路実験装置は、直径１２０ｃｍ、水深４０ｃｍの裏面に黒色テープが貼っている円形のプールであり、水温を２３〜２５℃に制御し、室内温度を２６〜２８℃に制御する。水タンクをランダムに４つの象限に分け、実験のときプラットフォームの位置が固定され変化されないように第二象限の中央に置き、水面より１〜２ｃｍ低い。マウスがマークに基づいて標記により方向を識別できるように、室内の周りの壁に明らかな標記を付く。実験中、マウスへの干渉を避けるように、室内のすべての物体の配置位置を固定する。実験は５日間続き、１日２回実施した。最初の４日間は位置決め航行実験であり、マウスをプールの壁に面して２つの象限から水中にそっと置き、ストレスとマウスの頭の水入れを避ける。同時に、マウスの1分以内に安全プラットフォームを見付けたレーテントピリオドを記録し、安全プラットフォーム上に３０秒間留まった後、取り出してケージに戻れた。マウスが１分以内に安全プラットフォームを見つけられない場合は、３０秒間安全プラットフォームに置き、レーテントピリオドを６０秒と記録する。マウスが毎日２回安全プラットフォームを見つけたレーテントピリオドの平均値をマウスのこの日の水泳の結果として、統計学分析を行う。結果は図１３に示す。５日目に空間探索実験を行い、安全プラットフォームを取り外し、１つの象限を選択してマウスの頭を池の壁に向けて水に入れ、マウスの１分間のプラットフォームの所在位置を通る回数と、プラットフォームのある象限の水泳時間を記録して、統計分析を行い、図１３に示す。

【0081】

ステップダウン実験において、クチナシクロシン系活性成分ＧＪ−４がマウスのステップダウンのレーテントピリオドを明確に延長し、且つステップダウンのエラー数を減少させる。水迷路実験において、ＧＪ−４は、プラットホームを見つけるためのマウスのレーテントピリオドを大幅に短縮し、プラットフォームを通る回数を増やし、プラットフォームの所在象限での水泳時間を延長する。実験結果によると、ＧＪ−４は良好なマウスの学習及び記憶障害の改善作用を表し、各用量組において、一定の用量-効果関係を示し、大量組の有効性は、陽性対照医薬品ドネペジルの効力に匹敵するばかりでなく、ひいては陽性医薬品より優れ、実験では、すべての用量組で投与に伴う毒性反応は観察されなかった。

【0082】

実施例５：クチナシにおけるクロシン単体のＬ−グルタミン酸誘発ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞傷害モデルにおける神経保護効果

【0083】

５．１ ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞培養法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ神経細胞をＤＭＥＭ培地（５体積％ウシ胎児血清を含む）で培養し、５％ＣＯ_２を含むインキュベーター内で３７℃で培養し、３〜４日ごとに継代した。実験は、対数増殖期細胞を取って行った。

【0084】

５．２ Ｌ−グルタミン酸損傷モデルスクリーニング法
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を９６ウェルプレートに５×１０^３の濃度で接種し、２４時間続いて培養し、Ｌ−グルタミン酸を含む医薬品液体培地１００μＬを９６ウェルプレートに加えて、Ｌ−グルタミン酸の最終濃度を１６０ｍＭにし、医薬品の最終濃度を１０μＭ、１μＭおよび０．１μＭにして各濃度について平行の３つのウェルを設定し、培養を２４時間続けた。２４時間後、上清を吸引し、１００μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを４時間続け、上清を吸引した。各ウェルに１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、１０分間振とうし、５７０ｎｍの波長を選択して、マイクロプレートリーダーで吸光度値［非特許文献１３を参照］を測定する。（有効率％＝（ＯＤ_医薬品−ＯＤ_モデル）／（ＯＤ_{コントラスト}−ＯＤ_モデル）＊１００）、スクリーニング結果を表３に示す。

【0085】

【表3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【国際調査報告】