特表 2019-534038 ＢＣＭＡ特異的フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを有するキメラ抗原受容体、及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2019-534038(P2019-534038A)

(43)【公表日】2019年11月28日

(54)【発明の名称】ＢＣＭＡ特異的フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを有するキメラ抗原受容体、及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20191101BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20191101BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20191101BHJP

   C12N 1/13 20060101ALI20191101BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20191101BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20191101BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20191101BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20191101BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20191101BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C12N15/63 Z

   C12N15/62 Z

   C12N1/13

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

   C07K14/78

   C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2019-535196(P2019-535196)

(86)(22)【出願日】2017年9月11日

(85)【翻訳文提出日】2019年5月10日

(86)【国際出願番号】US2017050888

(87)【国際公開番号】WO2018052828

(87)【国際公開日】20180322

(31)【優先権主張番号】62/394,329

(32)【優先日】2016年9月14日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100186897

【弁理士】

【氏名又は名称】平川 さやか

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】チン，チェン ニ

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】マッケィブ，ティモシー

(72)【発明者】

【氏名】ムーニー，ジル

(72)【発明者】

【氏名】ネィソ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ストロール，ウィリアム

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BB19

4B065CA24

4B065CA44

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA21

4H045BA41

4H045CA40

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

ＢＣＭＡ特異的フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、ＦＮ３ドメインを有するＢＣＭＡ標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞について記載する。ＦＮ３ドメイン及びＣＡＲをコードする核酸及び発現ベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、並びに遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物についても記載する。ＦＮ３ドメイン、ＣＡＲ、及び遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、並びにがんを含む疾患を治療するために遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法についても記載する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＣＭＡに特異的に結合する、単離フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項2】

配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記ＦＮ３ドメインが、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ未満のＫＤでヒトＢＣＭＡに結合する、請求項１に記載の単離ＦＮ３ドメイン。

【請求項3】

配列番号７の前記アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ＦＮ３ドメイン。

【請求項4】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ＦＮ３ドメイン。

【請求項5】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つの前記アミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離ＦＮ３ドメイン。

【請求項6】

請求項１〜５のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインをコードする、単離ポリヌクレオチド。

【請求項7】

請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項8】

請求項６に記載の単離ポリヌクレオチド又は請求項７に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項9】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
請求項１〜５のいずれかに記載のＦＮ３ドメインを有する細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、
前記ＣＡＲが、場合により、アミノ末端におけるシグナルペプチドと、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域と、を更に含む、単離ポリヌクレオチド。

【請求項10】

前記ＣＡＲが、
シグナルペプチドと、
配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、請求項９に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項11】

前記細胞外ドメインが、配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を有し、
前記ヒンジ領域が配列番号３の前記アミノ酸配列を有し、
前記膜貫通ドメインが配列番号４の前記アミノ酸配列を有し、
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号５の前記アミノ酸配列及び配列番号６の前記アミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項９〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項13】

請求項９〜１１のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は請求項１２に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、その配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１７年８月３１日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０９７ＷＯＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは１３８，６７１バイトである。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、ＢＣＭＡ特異的フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、ＦＮ３ドメインを有するＢＣＭＡ標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及びＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞に関する。また、ＦＮ３ドメイン及びＣＡＲをコードする核酸及び発現ベクター、当該ベクターを含む組み換え細胞、並びにＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを発現する遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物も提供される。ＦＮ３ドメイン、ＣＡＲ、及び遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、並びにがんを含む状態を治療するために遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法も提供される。

【背景技術】

【0003】

標的に特異的なかたちで腫瘍細胞に特異的に結合して殺傷するようにＴ細胞を遺伝子操作することによって、遺伝子操作Ｔ細胞治療と呼ばれる、がん患者に対する新たな治療選択肢が確立されている。このような標的化は、一般的には、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードした組み換えＤＮＡ分子を用いて患者由来Ｔ細胞を遺伝子操作することによってもたらされる。ＣＡＲは、リンカーペプチドに連結された細胞外標的化ドメイン、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインからなる合成受容体である。従来、細胞外ドメインは、特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は細胞表面標的に特異的な抗体（ｓｃＦｖ）の一本鎖Ｆｖフラグメントからなるものである。細胞外ｓｃＦｖドメインがＣＡＲの腫瘍特異性を付与するのに対して、シグナル伝達ドメインは、ＴＡＡ／標的の結合に際してＴ細胞を活性化する。これらの遺伝子操作されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）はがん患者に再注入され、ＣＡＲのＴＡＡ標的を発現する細胞と特異的に結合し、殺傷する（Ｍａｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１４ Ａｐｒ ２４；１２３（１７）：２６２５〜３５；Ｃｕｒｒａｎ ａｎｄ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１５ Ｍａｙ ２０；３３（１５）：１７０３〜６）。

【0004】

抗体の可変領域及び数千種の非抗体タンパク質に免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドが見られる。このようなＩｇタンパク質の１つである、ヒトフィブロネクチンの第１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）リピートは、全体的なＩｇフォールド構造を保持しつつも、表面に露出したループ内の多くの変異を許容し得ることが示されている。アミノ酸変異体のライブラリがこれらのループに組み込まれ、多くの異なる標的に対する特異的な結合物質が選択されている。かかる遺伝子操作されたＦＮ３ドメインは、重要な生物物理特性を保持しつつ、高い親和性で標的に結合することが見出されている。例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号及びその中の参照文献を参照されたい。

【0005】

血液悪性疾患におけるＣＡＲ−Ｔ治療の有望な使用について報告している臨床研究の多くは、ＣＤ１９又はＣＤ２０を標的化することによりＢ細胞悪性疾患に重点を置いている。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は強力な治療として台頭しつつあるものの、例えば、ＣＡＲシグナル伝達の最適化、最適な標的抗原の同定、細胞の製造方法の最適化、ＣＡＲ Ｔ細胞治療の安全性の向上、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療可能性を改善するためのコンビナトリアル戦略の最適化などの特定の治療の側面を改善する必要性が依然として存在する（Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０１６ Ｊａｎ ２７；１０８（７））。

【0006】

多発性骨髄腫（ＭＭ）は、クローン性形質細胞の蓄積を特徴とするがんである。ＭＭは、２番目に多い血液悪性疾患であり、すべてのがんによる死亡の２％をも占める。ＭＭは異質性疾患であり、広範な侵攻性及び治療抵抗性を特徴とする。診断後１０年以上生存する患者がいる一方で、２年以内に急速な治療抵抗性が進行し、死亡する患者もいる。新たな治療法の開発における進歩にもかかわらず、現在のところ、ＭＭに対する治療は存在していない。現在の治療法はしばしばＭＭの寛解につながるが、疾患は、いずれはほぼすべての患者において再発し、最終的に致死的である（Ｎａｙｍａｇｏｎ ａｎｄ Ａｂｄｕｌ−Ｈａｙ，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ３０；９（１）：５２）。更に、化学療法及び放射線治療を含む従来の治療方法は、有害な副作用のためにその有用性は限定的である。このため、ＭＭを治療するためのより効果的な治療方法が当該技術分野で求められている。

【0007】

ＭＭ治療の潜在的標的は、成熟Ｂ細胞で主に発現される腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である（Ｃｏｑｕｅｒｙ ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；３２（４）：２８７〜３０５）。ＢＣＭＡは、そのリガンドであるＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合すると、細胞生存促進性（Ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）のシグナルを与える。ＢＣＭＡは、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫシグナル伝達に依存するＢ細胞の抗原提示を誘発する。健康な個体では、ＢＣＭＡは、長期の体液性免疫を維持する形質細胞の生存を媒介する役割を果たしているが、その発現は、多くのがん、自己免疫疾患、及び感染症にも関連している。例えば、ＭＭ細胞及び他のリンパ腫においてＢＣＭＡ ＲＮＡが普遍的に検出され、ＭＭ患者からの形質細胞の表面にＢＣＭＡたんぱく質が検出されている（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４ Ｊａｎ １５；１０３（２）：６８９〜９４；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｏｃｔ １；１３（１９）：５９０３−９；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ Ｍａｙ １５；１０５（１０）：３９４５〜５０；Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４ Ａｐｒ １５；１０３（８）：３１４８〜５７）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

ＢＣＭＡ発現細胞を特異的かつ効果的に標的化する効果的な治療法が当該技術分野で求められている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明は、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン、ＦＮ３ドメインを含むＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞、その作製方法及び使用方法を提供することによってこの要請に応えるものである。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲがｐａｎ Ｔ細胞の表面上に発現されている場合、この細胞は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞株を特異的に殺傷する。したがって、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを用いることでＴ細胞を効果的に再標的化して、高度に特異的なかたちでＢＣＭＡ発現細胞を殺傷することができる。

【0010】

理論に束縛されるものではないが、ｓｃＦｖは本質的により生物物理的問題を生じやすいことから、ＣＡＲの細胞外ドメインとしてｓｃＦｖの代わりにＦＮ３ドメインを使用することで、より安定的で制御可能なＣＡＲ分子を得ることが可能になると考えられる。更に、ＦＮ３ドメインの小さいサイズは、ＴＡＡの高度に特異的なドメインを標的とするためにより効果的な免疫シナプス最適化及びより高い柔軟性を与える。

【0011】

一般的な一態様では、本発明は、ＢＣＭＡ、好ましくはＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインに関する。いくつかの実施形態では、ＦＮ３は、テンコン（Tencon）由来のものである。

【0012】

一実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＦＮ３ドメインは、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ未満のＫＤでヒトＢＣＭＡに結合する。

【0013】

別の実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。

【0014】

別の実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＦＮ３は、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を含む。

【0015】

他の一般的態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチド、本発明のＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のＦＮ３ドメインをコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本発明はまた、本発明のＦＮ３ドメインを生産する方法であって、ＦＮ３ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、ＦＮ３ドメインを産生する条件下で培養することと、細胞又は細胞培養物からＦＮ３ドメインを回収することとを含む、方法に関する。

【0016】

別の一般的態様によれば、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを有する細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドに関する。

【0017】

ＣＡＲは、アミノ末端におけるシグナルペプチドと、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域とを更に含んでもよい。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドは、
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号８〜４４及び配列番号５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインのような、本発明のＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0019】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＣＡＲ、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のＣＡＲをコードするベクター又は単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、ＣＡＲを産生するための条件下で培養することと、ＣＡＲを回収することとを含む、本発明のＣＡＲを生産する方法にも関する。ＣＡＲは、宿主細胞又は宿主細胞から単離された細胞膜と関連付けることができる。

【0020】

別の一般的な態様によれば、本発明は、本発明のＣＡＲを含む遺伝子操作された免疫細胞に関する。好ましくは、遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞受容体ノックアウト免疫細胞である。好ましくは、遺伝子操作された免疫細胞は、ＨＬＡ Ｉ／Ｂ２−ミクログロブリンノックアウト免疫細胞である。場合により、ＨＬＡ Ｉ／Ｂ２−ミクログロブリンノックアウト免疫細胞は更に、宿主患者からの同種異系免疫応答を欠くＨＬＡ ＩＩノックアウト免疫細胞であってもよい。遺伝子操作された免疫細胞は、ＢＣＭＡとは異なる標的に特異的に結合する細胞外ドメインを有する第２のＣＡＲを含むことができる。遺伝子操作された免疫細胞はまた、少なくとも１つの抗がん化学療法に対する耐性を有してもよい。

【0021】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を含む医薬組成物に関する。

【0022】

別の一般的な態様では、本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｂ細胞に関連した病態の治療を要する対象における、Ｂ細胞に関連した病態を治療する方法に関する。好ましい実施形態では、Ｂ細胞に関連した病態は多発性骨髄腫である。

【0023】

別の一般的な態様では、本発明は、免疫細胞を得ることと、本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドを細胞内に導入することとを含む、本発明の免疫細胞を遺伝子操作する方法に関する。

【0024】

別の一般的態様では、本発明は、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物の製造方法に関する。

【0025】

本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び付属の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0026】

これまでの「課題を解決するための手段」並びに以降の「発明を実施するための形態」は、添付の図面と併せて読むことでより良好に理解されるであろう。本発明は、図面に示される実施形態そのものに限定されない点は理解されるべきである。

【0027】

図面は、以下のとおりである。

【図1】本発明の一実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲのドメイン構造を示し、Ｎ末端におけるシグナルペプチド（ｈｕＣＤ８ｓｐ）が成熟型ＣＡＲタンパク質では切断される。

【図2】ヒトＢＣＭＡを一過性発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する結合についての、本発明の実施形態に基づく抗ＢＣＭＡ ＦＮ３ドメインの用量反応曲線（ＤＲＣ）評価から得られた正規化及び較正したデータを示し、データに結合飽和、１部位、特異的結合の条件でＰＲＩＳＭ曲線フィット分析を行ったものである。

【図3】本発明の実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲの初代Ｔ細胞における発現を示す。

【図4】本発明の実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲの初代Ｔ細胞における発現、及びＴ細胞によるＢＣＭＡ発現細胞の特異的殺傷を示し、Ｕ２９３２細胞はＣＤ１９^＋／ＢＣＭＡ^＋であり、Ｈ９２９細胞はＣＤ１９⁻／ＢＣＭＡ^＋であり、Ｋ５６２細胞はＣＤ１９⁻／ＢＣＭＡ⁻である。なお、エフェクター：標的比は絶対細胞数に基づいたものであり、表面発現について正規化していない。

【図5】本発明の実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲの初代Ｔ細胞における発現、及びＴ細胞によるＢＣＭＡ発現細胞の特異的殺傷を示す。

【図6】本発明の実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲの初代Ｔ細胞における発現、及びＴ細胞によるＢＣＭＡ発現細胞の特異的殺傷を示す。

【図7】本発明の実施形態に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲの初代Ｔ細胞における発現、及びＴ細胞によるＢＣＭＡ発現細胞の特異的殺傷を示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

発明の背景において、また、明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献のそれぞれをその全容において参照により本明細書に援用するものである。本明細書に含まれる文書、操作、材料、装置、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又はすべてが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0029】

別の定義がなされない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用するすべての特許、公開された特許出願及び公開公報は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして援用するものである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意しなければならない。

【0030】

特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、すべての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は一般的に、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、すべての可能な部分範囲、その範囲内のすべての個々の数値を明示的に含む。

【0031】

本明細書で使用するところの「単離された」なる用語は、生物学的構成成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの構成成分が天然に存在する生物の他の生物学的構成成分（すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質）から実質的に分離されるか、これらの他の成分とは別に生成されるか、又はこれらの他の成分から精製されたものであることを意味する。このため、「単離」されている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。

【0032】

本明細書で使用するところの「単離された」ＦＮ３ドメインとは、異なる抗原特異性を有する他のＦＮ３ドメインを実質的に含まないＦＮ３ドメインを指すものとする（例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインは、ＢＣＭＡ以外の抗原に特異的に結合するＦＮ３ドメインを実質的に含まない）。ただし、ＢＣＭＡのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する単離されたＦＮ３抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連する抗原（例えば、ＢＣＭＡの種間ホモログ）に対する交差反応性を有してもよい。

【0033】

本明細書で使用するところの「フィブロネクチンＩＩＩドメイン」又は「ＦＮ３ドメイン」なる用語は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体及び原核生物酵素を含むタンパク質にしばしば存在するドメイン（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０〜１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９〜１５６６５，１９９０）、又はこれらの誘導体を指す。例示的なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び非天然の合成ＦＮ３ドメインがある（例えば米国特許第８２７８４１９号に記載される）。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質名で呼ばれる（例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０））。

【0034】

本明細書で使用するところの「テンコン」（Ｔｅｎｃｏｎ）とは、配列番号１に示され、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記載される配列を有する合成ＦＮ３ドメインのタンパク質を指す。

【0035】

本明細書で使用するところの「特異的に結合する」又は「特異的な結合」なる用語は、所定の標的と、約１×１０^−６Ｍ又はより強く、例えば約１×１０^−７Ｍ以下、約１×１０^−８Ｍ以下、約１×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下、約１×１０^−１１Ｍ以下、約１×１０^−１２Ｍ以下、又は約１×１０^−１３Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する本発明のＦＮ３ドメインの能力のことを指す。ＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて測定することができる。例えば、ＦＮ３ドメインタンパク質のＫＤは、例えばバイオセンサーシステム（例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム又はＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社））を使用することによって、又はＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムのようなバイオレイヤーインターフェロメトリー技術を使用することによって、表面プラズモン共鳴を用いて測定することができる。一般的に、ＦＮ３ドメインは、例えばＰｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用した表面プラズモン共鳴によって測定した場合に、非特異的標的に対するＫ_Ｄよりも少なくとも１０倍低いＫ_Ｄで所定の標的（すなわちヒトＢＣＭＡ）に結合する。しかしながら、ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、他の関連する標的、例えば、マカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、又はパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）（チンパンジー）などの他種由来の同じ所定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。

【0036】

本明細書で使用するところの「ＢＣＭＡ」なる用語は、形質細胞上及び成熟Ｂ細胞上で発現される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーであるＢ細胞成熟抗原タンパク質（ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＣＭ又はＣＤ２６９とも呼ばれる）のことを指す。例えば、ヒトＢＣＭＡは、ヌクレオチド９９４個の長さの一次ｍＲＮＡ転写産物によりコードされるアミノ酸１８４個の長さのタンパク質である（ＮＭ＿００１１９２．２）。ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１８３．２に示される。本明細書で使用するところの「ＢＣＭＡ」なる用語は、例えば、完全長の野生型ＢＣＭＡの点突然変異、フラグメント、挿入、欠失、及びスプライス変異体などの突然変異を有するタンパク質を含む。「ＢＣＭＡ」なる用語には、ＢＣＭＡのアミノ酸配列の翻訳後修飾も含まれる。翻訳後修飾としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−及びＯ−結合グリコシル化が挙げられる。

【0037】

本明細書で使用するところの「ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン」とは、ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを指す。

【0038】

本明細書で使用するところの「ランダム化する」、又は「ランダム化された」、又は「多様化された」、又は「多様化する」なる用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に少なくとも１つの置換、挿入、又は欠失を行うことを指す。本明細書で使用するところの「ライブラリ」なる用語は、変異体のコレクションのことを指す。ライブラリは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの変異体で構成されてよい。本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、例えば、置換、挿入、又は欠失などの１つ以上の改変によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用するところの「置換する」、又は「置換された」、又は「突然変異する」、又は「突然変異した」なる用語は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列中の１個以上のアミノ酸又はヌクレオチドを変化させるか、欠失させるか、又はポリペプチド又はポリヌクレオチド配列中に１個以上のアミノ酸又はヌクレオチドを挿入することによってその配列の変異体を生成することを指す。

【0039】

本明細書で使用するところの「テンコンライブラリ」とは、テンコンの変異体のコレクションを指す。テンコンライブラリ内の分子は「センチリン」とも呼ばれる。

【0040】

本明細書で使用するところの「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）なる用語は、少なくとも、抗原又は標的に特異的に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞受容体活性化シグナル伝達ドメインと、を含む組み換えポリペプチドを指す。ＣＡＲの細胞外ドメインと標的細胞の表面上の標的抗原との結合によって、ＣＡＲはクラスター化し、ＣＡＲ保有細胞に活性化刺激が与えられる。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を新たに方向付け、主要組織適合性（ＭＨＣ）とは独立したかたちで、標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る増殖、サイトカイン産生、貪食作用、及び／又は分子の産生を誘導する。

【0041】

本明細書で使用するところの「シグナルペプチド」なる用語は、新生ＣＡＲタンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）におけるリーダー配列であって、新生タンパク質を翻訳と同時又は翻訳後に小胞体に誘導した後、表面発現させる配列のことを指す。

【0042】

本明細書で使用するところの「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、又は「細胞外リガンド結合ドメイン」なる用語は、細胞膜の外側に位置し、抗原、標的、又はリガンドに結合することができるＣＡＲの部分を指す。

【0043】

本明細書で使用するところの「ヒンジ領域」なる用語は、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接するドメイン、例えば、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するＣＡＲの部分を指す。

【0044】

本明細書で使用するところの「膜貫通ドメイン」なる用語は、細胞膜を横切って延在し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの部分を指す。

【0045】

本明細書で使用するところの「細胞内Ｔ細胞受容体活性化シグナル伝達ドメイン」、「細胞質シグナル伝達ドメイン」、又は「細胞内シグナル伝達ドメイン」なる用語は、細胞膜の内側に位置し、エフェクター信号を伝達することができるＣＡＲの部分を指す。

【0046】

本明細書で使用するところの「刺激分子」なる用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面において、刺激によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を与える、Ｔ細胞によって発現される分子を指す。刺激分子は、抗原依存的な一次活性化を開始する配列（「一次シグナル伝達ドメイン」と呼ばれる）と、抗原と独立して作用することで二次又は共刺激シグナルを与える配列（「共刺激シグナル伝達ドメイン」と呼ばれる）の２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。

【0047】

本明細書で使用するところの「ポリヌクレオチド」なる用語は、同義的に、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」とも称され、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」としては、これらに限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより一般的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であってよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに行うことができる。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。

【0048】

本明細書で使用するところの「ベクター」なる用語は、別の核酸セグメントを機能的に挿入することによってそのセグメントの複製又は発現を行うことができるレプリコンのことである。

【0049】

本明細書で使用するところの「宿主細胞」なる用語は、本発明の核酸分子を含む細胞のことを指す。「宿主細胞」は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞のいずれのタイプの細胞であってもよい。一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の核酸分子をトランスフェクトした細胞である。別の実施形態では、「宿主細胞」は、かかるトランスフェクトされた細胞の子孫又は潜在的な子孫である。ある細胞の子孫は、例えば、後続の世代で生じ得る突然変異若しくは環境の影響、又は宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組み込みによって、親細胞と同じではない場合がある。

【0050】

本明細書で使用するところの「発現」なる用語は、遺伝子産物の生合成のことを指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、あらゆる天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現されるＦＮ３ドメイン又はＣＡＲは、宿主細胞の細胞質中、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。

【0051】

本明細書で使用するところの「免疫細胞」又は「免疫エフェクター細胞」なる用語は、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞のことを指す。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、及び骨髄由来食細胞が挙げられる。特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞はＴ細胞であり、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されていることから、ＣＡＲ−Ｔ細胞と呼ばれる。

【0052】

本明細書で使用するところの「遺伝子操作された免疫細胞」なる用語は、細胞の全遺伝物質にＤＮＡ又はＲＮＡの形の更なる遺伝物質を加えることによって遺伝子改変された免疫細胞（免疫エフェクター細胞とも呼ばれる）のことを指す。本明細書の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞は、本発明に基づくＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたものである。

【0053】

本明細書で使用するところの「担体」なる用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野では周知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決る点は理解されよう。本明細書で使用するころの「薬学的に許容される担体」なる用語は、本発明に基づく組成物の効果又は本発明に基づく組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。

【0054】

本明細書で使用するところの「対象」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。特定の実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0055】

本明細書で使用するところの「治療的有効量」なる用語は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を誘導する有効成分又は要素の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ一般的な方法で決定することができる。

【0056】

本明細書で使用するところの「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はいずれも、がん又は自己免疫に関連した少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはより好ましくはがんなどの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。

【0057】

ＦＮ３の配列に基づいたライブラリ
テンコンは、ヒトテネイシンＣの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然には存在しないＦＮ３ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７〜１１７，２０１２、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。テンコンの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である、７個のβ鎖をつなぐ６個の表面露出ループを示し、β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれている（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：８９９０〜８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基をランダム化することでＦＮ３ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて、ＢＣＭＡに結合する新規分子を選択することができる。表１は、テンコン（配列番号１）の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。

【0058】

【表1】

【0059】

したがって、テンコン配列に基づいて設計されたライブラリは、ループ又はストランドのうちの１つ以上にランダム化された配列を有することができる。例えば、テンコンに基づくライブラリは、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、及びＦＧループのうちの１つ以上にランダム化配列を有することができる。例えば、テンコンのＢＣループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＢＣループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＣＤループはアミノ酸６個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＣＤループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＥＦループはアミノ酸５個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＥＦループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＦＧループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＦＧループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンライブラリのループにおける更なる多様性を、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることができる。例えば、ＢＣ、ＣＤ、ＥＦ及び／又はＦＧループをアミノ酸１〜２２個だけ伸長することができ、又はアミノ酸１〜３個だけ減少させることができる。テンコンのＦＧループがアミノ酸７個の長さを有するのに対して、抗体重鎖の対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を得るためには、残基４〜２８個の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応するように、ＦＧループの配列及び長さを多様化させることができる。例えば、更に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸によってループを伸長することにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることができる。

【0060】

テンコン配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成する、２個以上のβ鎖と少なくとも１つのループを含む、ランダム化された別の表面を有してもよい。そのような別の表面の１つは、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。テンコンの別のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計については、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。テンコン配列に基づいて設計されたライブラリには、１１、１７、４６、及び／又は８６位（残基の番号付けは配列番号１に対応する）の残基の置換を有し、熱安定性が向上したテンコン変異体などのテンコン変異体に基づいて設計されたライブラリが含まれる。代表的なテンコン変異体が米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、配列番号１のテンコンと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換を有するテンコン２７（配列番号４５）が含まれる。

【0061】

テンコンライブラリ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、ランダムな又は既定のアミノ酸の組を用いて、選択された残基の位置でランダム化することができる。例えば、ランダムな置換を有するライブラリの変異体は、天然に存在する２０種すべてのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化のスキームでは、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするためにＤＶＫコドンを用いることができる。あるいは、ＮＮＳコドンを用いて２０種すべてのアミノ酸残基を生じさせると同時に終止コドンの頻度を低減することもできる。多様化させる位置でアミノ酸の偏った分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な普遍的構成単位として機能する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを用いたものである。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要とされるすべての可能な配列組み合わせを表す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードに基づく。

【0062】

ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン及びその使用
一般的な一態様では、本発明は、ＢＣＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインに関する。

【0063】

本発明の実施形態によれば、単離ＦＮ３ドメインは、ヒトＢＣＭＡの残基１〜５４内の配列のようなＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する。

【0064】

いくつかの実施形態では、単離されたＢＣＭＡに特異的なＦＮ３ドメインは、分子のＮ末端に連結された開始メチオニン（Ｍｅｔ）を有する。

【0065】

いくつかの実施形態では、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、このＦＮ３ドメインは、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ未満のＫＤでＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに結合する。例えば、ＦＮ３ドメインは、バイオセンサーシステム、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して測定した場合に１×１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１×１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、又は１×１０^−１３Ｍ未満のＫＤでヒトＢＣＭＡに結合する。

【0066】

他のいくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに特異的に結合する単離ＦＮ３ドメインは、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0067】

本発明の他の実施形態によれば、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８〜４４及び５８〜１４５からなる群から選択される１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、当該ＦＮ３ドメインは、ＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離されたＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインは、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列と比較した場合に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個の置換を有する。好ましくは、単離ＦＮ３ドメインは、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のアミノ酸配列のうちの１つを含む。

【0068】

特定の実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインは、Ａ鎖、Ｂ鎖、ＢＣループ、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｄ鎖、ＥＦループ、Ｆ鎖、ＦＧループ及び／又はＧループが、記載されるＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン配列（すなわち、配列番号８〜４４及び５８〜１４５）のいずれかのＡ鎖、Ｂ鎖、ＢＣループ、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｄ鎖、ＥＦループ、Ｆ鎖、ＦＧループ及び／若しくはＧループの配列のそれぞれの組に、又は記載されるＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン配列（すなわち、配列番号８〜４４及び５８〜１４５）のいずれかのＡ鎖、Ｂ鎖、ＢＣループ、Ｃ鎖、ＣＤループ、Ｄ鎖、ＥＦループ、Ｆ鎖、ＦＧループ及び／若しくはＧループの配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する配列に置き換えられた、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つに示される配列の変異体を含むことができる。

【0069】

本発明の実施形態に基づく、ヒトＢＣＭＡなどのＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、本開示を考慮することで当業者には周知の方法を用いて、任意のＦＮ３ドメインをテンプレートとして使用してライブラリを生成し、ＢＣＭＡに特異的に結合する分子についてライブラリをスクリーニングすることで作製することができる。使用可能な例示的なＦＮ３ドメインとしては、テナシンＣの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、フィブコン、及びフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０）がある。例えば、米国特許第９２００２７３号を参照されたい。

【0070】

標準的なクローニング及び発現法を用いてベクターにライブラリをクローニングするか、又はライブラリの二本鎖ｃＤＮＡカセットを合成することによって、インビトロでライブラリを発現又は翻訳させる。例えば、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９４，４９３７〜４９４２，１９９７）、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９４，１２２９７〜１２３０２，１９９７）、又は他の無細胞系（米国特許第５６４３７６８号）を使用することができる。ＦＮ３ドメインの変異体のライブラリは、例えば任意の適当なバクテリオファージの表面にディスプレイされた融合タンパク質として発現させることができる。バクテリオファージの表面に融合ポリペプチドをディスプレイするための方法は周知のものである（米国特許出願公開第２０１１／０１１８１４４号、国際公開第２００９／０８５４６２号、米国特許第６９６９１０８号、同第６１７２１９７号、同第５２２３４０９号、同第６５８２９１５号、同第６４７２１４７号）。

【0071】

本発明の一実施形態によれば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、ｃｉｓディスプレイを用いて、ＦＮ３スカフォールドタンパク質をコードするＤＮＡフラグメントをＲｅｐＡをコードするＤＮＡフラグメントにライゲートすることで、各タンパク質がそれをコードするＤＮＡと安定的に結合された、インビトロ翻訳後に生成されるタンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを生成することにより、テンコンライブラリのようなＦＮ３ライブラリを作製し（米国特許第７８４２４７６号、Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ １０１，２８０６〜２８１０，２００４）、当該技術分野においては周知の、実施例に記載されるいずれかの方法によって、ヒトＢＣＭＡへの特異的結合についてライブラリをアッセイすることによって単離することができる。使用可能な例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合的及び非競合的アッセイである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する特定されたＦＮ３ドメインは、所望の特性にしたがって更に特徴付けられる。

【0072】

ヒトＢＣＭＡなどのＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、熱安定性並びに熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性を改善するなどの特性を改善するために改変することができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を高めるために、高度に類似した熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、α−へリックス性向を高める突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの方法が応用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１〜３７５，２００１）。高熱安定性は、発現されるタンパク質の収率を高め、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小に抑えることができる。テンコン（配列番号１）の熱安定性を高めるために置換することができる残基としては、これらに限定されるものではないが、参照により本明細書に援用するところの米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載される配列番号１の１１、１４、１７、３７、４６、７３及び８６位の１つ以上の残基が挙げられる。これらの残基に対応する置換を、本発明の実施形態に基づくＦＮ３ドメインに組み込むことができる。

【0073】

本発明の実施形態に基づく、ヒトＢＣＭＡなどのＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインは、治療目的、診断目的、又はＢＣＭＡへの特異的結合が望ましい他のあらゆる目的で使用することができる。例えば、ＦＮ３ドメインを診断目的で使用して、生体試料中のＢＣＭＡの存在を検出するか又はその濃度を定量することができる。ＦＮ３ドメインはまた、本明細書に開示されるものなどのＢＣＭＡに関連する疾患又は障害を予防又は治療するための治療目的で使用することもできる。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメインと、本明細書に開示されるものなどの薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。ＦＮ３ドメインは、更に、例えば、本発明に基づくＣＡＲの細胞外ドメイン中の１つ以上の他の構成要素と共に使用することができる。

【0074】

ＢＣＭＡ標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
他の一般的な態様では、本発明は、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを含むＢＣＭＡ標的化ＣＡＲに関する。

【0075】

一態様では、本発明は、
ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを有する細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むＣＡＲに関する。

【0076】

いくつかの実施形態では、新生ＣＡＲでは、細胞外ドメインの先にはＮ末端にシグナルペプチドが付いている。任意の適当なシグナルペプチドを本発明で使用することができる。シグナルペプチドは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。一実施形態によれば、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＣＤ３δシグナルペプチド、ヒトＣＤ３εシグナルペプチド、ヒトＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ヒト４１−ＢＢシグナルペプチド、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号５０〜５３のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５０〜５３のうちの１つのアミノ酸配列を有する。シグナルペプチドは、移行中又は移行の完了後にシグナルペプチダーゼによって切断されることで、シグナルペプチドを含まない成熟ＣＡＲを生成することができる。

【0077】

本発明の実施形態によれば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを含む。本明細書に記載されるものを含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態に基づく任意のＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを、ＣＡＲの細胞外ドメインに用いることができる。

【0078】

本発明の実施形態によれば、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含むことができる。ヒンジ領域は、遺伝子操作された免疫細胞の表面から離れるように細胞外ドメインを動かして、適切な細胞／細胞間の接触、標的又は抗原との結合、及び活性化を可能とする機能を有する（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２〜４１９）。任意の適当なヒンジ領域を本発明のＣＡＲに使用することができる。ヒンジ領域は、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲのヒンジ領域は、６ｘＧＳペプチド、若しくはそのフラグメント、若しくはＣＤ８タンパク質に由来するヒンジ領域、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。

【0079】

任意の適当な膜貫通ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＧＭＣＳＦＲなどの分子の膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５４〜５７のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５４〜５７のうちの１つのアミノ酸配列を有する。

【0080】

任意の適当な細胞内シグナル伝達ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられる。他の特定の実施形態では、エフェクターシグナルを伝達するシグナル伝達ドメインの切頭部分が用いられる。本発明の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、これらに限定されるものではないが、増殖、活性化、及び／又は分化を含む、ＣＡＲ保有細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。特定の実施形態では、シグナルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性、ヘルパー活性、及び／又はサイトカイン分泌を促進する。

【0081】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ−４０としても知られる）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭドメイン、又はＣＤ６６ｄなどに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。

【0082】

特定の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0083】

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ由来の機能性シグナル伝達ドメインを有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有する。

【0084】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定の実施形態では、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を有する。

【0085】

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号４９のアミノ酸配列を有する。

【0086】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン（センチリン）、ヒトＣＤ８ヒンジ領域、ヒトＣＤ８膜貫通領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内ドメイン、及びヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む、図１に示される構造を有する。新生ＣＡＲはヒトＣＤ８シグナルペプチドを更に含み、このペプチドはその後、成熟したＣＡＲでは切断される。

【0087】

一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞に付随する。

【0088】

別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の単離細胞膜中に存在する。

【0089】

更に別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の他の構成成分から精製又は単離される。

【0090】

ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
他の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチド及びベクター、並びにベクターを含有する組み換え細胞に関する。

【0091】

本明細書に開示される様々なタンパク質又はポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成するか又は本開示を考慮して当該技術分野における他の方法を用いて合成することができる。コドンの使用を選択することで、細胞における発現を改善することができる。このようなコドン使用は、選択される細胞のタイプに依存する。特化したコドンの使用パターンが、大腸菌及び他の細菌、並びに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞用に開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ．２００３ １００（２）：４３８〜４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００２（１）：９６〜１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１（５）：４４６〜９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ．１９９６ ６０（３）：５１２〜３８；及びＳｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．Ｙｅａｓｔ．１９９１ ７（７）：６５７〜７８を参照されたい。

【0092】

核酸操作の一般的な技術は、当業者の技術の範囲内であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１〜３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ ｅｄ．，１９８９又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及び定期的な最新報告にも記載されており、これらを参照により援用するものである。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルス、又は昆虫遺伝子由来の適当な転写又は翻訳調節エレメントに機能的に連結される。このような調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の停止を制御する配列を挙げることができる。通常は複製起点によって与えられる、宿主内で複製する能力及び形質転換体の識別を容易とする選択遺伝子が、更に組み込まれる。適当な調節エレメントは、当該技術分野では周知のものである。

【0093】

当業者であれば、あるタンパク質のコード配列は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は理解されよう。したがって、本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードする核酸配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解されるであろう。

【0094】

一実施形態では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードする単離核酸を含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示を考慮して当業者には周知のいずれのベクターも使用することができる。一実施形態では、ベクターは、プロモーター配列、場合により１つ以上の他の調節配列に機能的に連結された本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードしたポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。

【0095】

別の実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードしたｍＲＮＡによる本発明のＣＡＲの一過性の発現に関する。一態様では、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、組み込まれない導入遺伝子の発現が数時間、数日間、又は数週間にわたって発現される一過性トランスフェクションの形態として免疫エフェクター細胞に導入されるが、その発現期間は、その遺伝子がゲノムに組み込まれるか又は宿主細胞内の安定的なプラスミドレプリコン内に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。一態様では、ｍＲＮＡは、ＰＣＲで生成された鋳型を用いたインビトロ転写によって生成される。

【0096】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本発明の核酸分子を安定的又は一過的に宿主細胞にトランスフェクトすることができる。

【0097】

適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳類細胞、又は細菌細胞が挙げられる。適当な細菌としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌又はバチルス属の菌種が挙げられる。酵母、好ましくはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロマイセス属の種の酵母を、ポリペプチドの産生に使用することもできる。様々な哺乳動物又は昆虫細胞の培養系を用いて組み換えタンパク質を発現させることもできる。昆虫細胞で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系については、Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）により概説されている。場合によっては、グリコシル化を行う目的などで脊椎動物細胞内でタンパク質を産生することが望ましく、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は通常の手順となっている。適当な哺乳類宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。

【0098】

本発明の宿主細胞は、下記に詳細に述べる、遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞とすることができる。

【0099】

タンパク質生産
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメインを産生する条件下でＦＮ３ドメインをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から（例えば、上清から）ＦＮ３ドメインを回収することと、を含む、本発明のＦＮ３ドメインを生産する方法に関する。発現されたＦＮ３ドメインは、本開示を考慮して当該技術分野で周知の従来技術にしたがって、細胞又は細胞培養物から収穫し、精製することができる。

【0100】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＣＡＲを産生する条件下でＣＡＲをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、ＣＡＲを回収することと、を含む、本発明のＣＡＲを生産する方法に関する。発現されたＣＡＲは、当該技術分野で周知の従来技術にしたがって、また、本明細書に記載されるように、細胞から収穫し、精製することができる。

【0101】

宿主細胞は、タンパク質産生用の発現又はクローニングベクターで形質転換され、例えば、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する、などを目的として適宜改変された従来の栄養培地で培養される。

【0102】

本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。Ｈａｍ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。更に、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４７６７７０４号、同第４６５７８６６号、同第４９２７７６２号、同第４５６０６５５号、同第５１２２４６９号、国際公開第９０／０３４３０号、同第８７／００１９５号、又は米国再発行特許第ＵＳＲＥ３０９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）剤など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を添加することができる。他の任意の必要な添加物質が、当業者には周知の適当な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨといった培養条件は、発現用に選択される宿主細胞と共に以前より用いられているものであり、当業者には明らかであろう。

【0103】

本明細書に開示されるタンパク質は、インビトロの細胞翻訳系を利用して生産することもできる。かかる目的のため、タンパク質をコードする核酸は、インビトロでの転写を可能にしてｍＲＮＡを産生し、かつ、利用される特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能とするように改変する必要がある。真核細胞を含まない翻訳系の例としては、例えば、哺乳類又は酵母細胞を含まない翻訳系が挙げられ、原核細胞を含まない翻訳系の例としては、例えば、細菌細胞を含まない翻訳系が挙げられる。

【0104】

本明細書に開示されるタンパク質は、化学合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社（イリノイ州ロックフォード）に記載の方法によって）により製造することもできる。タンパク質の修飾も、化学合成によって行うことができる。

【0105】

本明細書に開示されるタンパク質は、タンパク質化学分野で一般的に知られるタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。その非限定的な例としては、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、タンパク質は、異なるバッファー中に交換するか、かつ／又は、これらに限定されるものではないが、濾過及び透析を含む当該技術分野では周知の様々な方法のいずれかによって濃縮することができる。

【0106】

精製タンパク質は、好ましくは少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９８％である。

【0107】

遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞、組成物及びその方法
別の一般的態様では、本発明は、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞、遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物、及び多発性骨髄腫などの疾患を治療するために、遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法に関する。

【0108】

一般的な一態様では、本発明は、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作された免疫細胞に関する。

【0109】

いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は、例えば国際公開第２０１３／１７６９１５号に記載されるようなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の構成要素を発現する少なくとも１つの遺伝子の不活性化を、ＨＬＡ Ｉ／Ｂ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質をコードするか又はその発現を調節する遺伝子の不活性化と組み合わせることができることによって、同種性をより低めることができる。したがって、移植片対宿主症候群及び移植片拒絶のリスクが大幅に低くなる。「ＴＣＲノックアウト（TCR knockout）」又は「ＴＣＲノックアウト（TCR-KO）」細胞と呼ばれる機能性ＴＣＲを欠くＴ細胞は、その表面に機能性ＴＣＲをいっさい発現しないように遺伝子操作するか、機能性ＴＣＲを構成する１つ以上のサブユニットを発現しないように遺伝子操作する（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＴＣＲε、及び／又はＴＣＲζを発現しない（又はその発現が低減される）ように遺伝子操作する）か、又はその表面上にごくわずかな機能性ＴＣＲを生成するように遺伝子操作することができる。あるいは、Ｔ細胞は、例えばＴＣＲのサブユニットの１つ以上の突然変異型又は切断型を発現させることによって、実質的に機能不全のＴＣＲ（すなわち、宿主に有害な免疫反応を誘発しないＴＣＲ）を発現することもできる。機能性ＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍを発現しない改変Ｔ細胞は、ＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（クラスター化された一定間隔で配置された短い回文配列リピート）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いたＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍのノックダウンを有することができる。

【0110】

特定の実施形態では、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞、好ましくはヒトＴ細胞又はヒトＮＫ細胞、より好ましくはＴＣＲノックアウト細胞、最も好ましくはヒトＴＣＲノックアウト細胞及び／又はＨＬＡ Ｉ／Ｂ２Ｍノックアウト細胞である。他の実施形態では、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、ＴＡＬＬ−１０４Ｔ細胞株（すなわち、ＣＤ８及びＣＤ３を発現するがＣＤ１６は発現しないＩＬ−２依存性ヒト非制限細胞毒性Ｔ細胞株）などの遺伝子操作されたＴ細胞である。

【0111】

本発明の免疫エフェクター細胞は、自家（すなわち、「自己」、例えば自己原性）又は非自家（すなわち、「非自己」、例えば同種、同系、異種）であってよい。自家とは、その物質が後で再導入される個体と同じ個体に由来する任意の物質を指す。非自家とは、その物質が後で再導入される個体と同じ種の異なる個体に由来する任意の物質を指す。

【0112】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞の作製方法に関する。ＣＡＲをコードするベクターは、免疫細胞に直接形質導入することができる。あるいは、ＣＡＲをコードするインビトロで転写されたＲＮＡ又は合成ＲＮＡを免疫細胞に導入することもできる。

【0113】

特定の実施形態によれば、遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞を作製する方法は、免疫エフェクター細胞が本発明の実施形態に基づく１つ以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクト又は形質導入することを含む。免疫治療用の免疫細胞の調製方法は、例えば、参照により本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／１３０６３５号、同第２０１３／１７６９１６号、及び同第２０１３／１７６９１５号に記載されている。遺伝子操作された免疫細胞を調製するために使用することが可能な個々の工程は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／０３９５２３号、同第２０１４／１８４７４１号、同第２０１４／１９１１２８号、同第２０１４／１８４７４４号、及び同第２０１４／１８４１４３号に開示されている。

【0114】

特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本発明のＣＡＲにより遺伝子改変された（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターにより形質導入された）後、インビトロで活性化及び増殖される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６３５２６９４号、同第６５３４０５５号、同第６９０５６８０号、同第６６９２９６４号、同第５８５８３５８号、同第６８８７４６６号、同第６９０５６８１号、同第７１４４５７５号、同第７０６７３１８号、同第７１７２８６９号、同第７２３２５６６号、同第７１７５８４３号、同第５８８３２２３号、同第６９０５８７４号、同第６７９７５１４号、同第６８６７０４１号、米国特許出願公開第２００６／１２１００５号に記載される方法を用いて、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前又は後で活性化及び増殖させることができる。Ｔ細胞は、インビトロ又はインビボで増殖させることができる。一般的に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させた表面と接触させることによって増殖させることができる。非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体、若しくはその抗原結合フラグメント、又は表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、又はタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触とカルシウムイオノフォアとの組み合わせによって、又はＣＡＲ自体の活性化などによって、刺激することができる。Ｔ細胞の表面のアクセサリ分子を共刺激するには、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適した条件としては、例えば、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／若しくＩＬ−２１、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦｂ、並びに／又は当業者には周知の細胞の増殖用の他の任意の添加物質を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適当な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又は、Ｘ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ社））が挙げられる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６０４０１７７号、同第５８２７６４２号、及び国際公開第２０１２１２９５１４号に記載される方法などの方法を用いて、フィーダー細胞及び適当な抗体及びサイトカインによって活性化及び刺激して増殖させることができる。

【0115】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、同じ標的又は異なる標的に特異的に結合する細胞外ドメインを有する第２のＣＡＲを更に含むことができる。好ましくは、免疫細胞は２つの異なる標的に特異的に結合する２つのＣＡＲを発現するか、又は免疫細胞は、２つの異なる標的（すなわち、ＢＣＭＡ及び同じ対象疾患に関連する別の標的）に特異的に結合する２個のＦＮ３ドメインを含むＣＡＲのような二重特異性受容体を発現する。例えば、他の標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＳ−１、κ軽鎖、ＣＤ１３８、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、又はＣＤ３８などの多発性骨髄腫に関連したものであってもよい（Ｇａｒｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，１７（９１）：３７〜４６）。より好ましくは、２種類のＣＡＲもまた、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有し、例えば、第１のＣＡＲが共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインは有さず、第２のＣＡＲは一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインは有さない、又はその逆である。４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７ ＩＣＯＳ、又はＯＸ−４０に由来するものなどの共刺激シグナル伝達ドメインを一方のＣＡＲに配置し、ＣＤ３ζに由来するものなどの一次シグナル伝達ドメインを他方のＣＡＲに配置することにより、両方の標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を制限することで、例えば特異性を高めることができる。

【0116】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞に基づいた治療を制限し、腫瘍外毒性（off-tumor toxicity）を回避するための自己調節式の安全スイッチとしての阻害性ＣＡＲを更に含むことができる。例えば、阻害性ＣＡＲは、正常細胞にみられる標的に特異的に結合するが、標的癌細胞にみられる標的には結合しない細胞外ドメインを含むことができる。阻害性ＣＡＲには、これらに限定されるものではないが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えばＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、及びＴＧＦＲβを含む阻害性分子の細胞内ドメインなどの阻害性受容体シグナル伝達ドメインを有する細胞内ドメインも含まれる。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを発現している細胞は、正常細胞に出合うと抑制されるが、正常細胞の標的を発現していない腫瘍細胞に出合うと活性化される。

【0117】

他のいくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞の活性を高める薬剤を更に含むことができる。例えば、かかる薬剤は、本明細書に記載されるものなどの阻害性分子の宿主細胞中での活性を阻害することができる。

【0118】

特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫ＣＡＲ発現細胞は、少なくとも１つの抗がん化学療法に対して耐性を示すように更に遺伝子操作される。この薬剤耐性は、ＢＣＭＡ発現細胞を選択的に標的化しつつ、遺伝子操作された免疫細胞が薬剤の存在下で生存することを可能にするものである。

【0119】

いくつかの実施形態によれば、薬剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子を発現するようにＣＡＲ発現細胞を遺伝子操作することによって、ＣＡＲ発現細胞に与えることができる。本発明の薬剤耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞毒性抗生物質、抗イムノフィリン剤、それらの類似体又は誘導体などに対する耐性をコードすることができる。本発明の遺伝子操作された免疫ＣＡＲ発現細胞に薬剤耐性を付与するために使用することができる、いくつかの薬剤耐性遺伝子が特定されている。例えば、Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００１ Ｊａｎ；３（１）：８８〜９６．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．２００３ Ｍａｙ；５（５）：３６６〜７６；Ｚｉｅｌｓｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００３ Ｎｏｖ；１１２（１０）：１５６１〜７０；Ｎｉｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４ Ｆｅｂ；５３（２）：１０７〜１５；Ｂａｒｄｅｎｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００５ Ｄｅｃ；１９（１２）：２２８１〜８；Ｋｕｓｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００７ Ｊａｎ；２８（１）：２０７〜１４を参照されたい。細胞で発現させることができる薬剤耐性遺伝子の例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の変異体又は修飾型、イノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰＤＨ２）の変異体又は修飾型、多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）、カルシニューリン、メチルグアニントランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１、抗生物質耐性遺伝子であるｂｌｅ及びｍｃｒＡなどが挙げられる。特定の実施形態によれば、かかる薬剤耐性遺伝子は、例えば、少なくとも１つのベクターによってコードされる導入遺伝子を細胞に導入することを含む、任意の適当な手段によって細胞内で発現させることができる。

【0120】

抗がん化学療法に対する耐性も、例えば、薬剤に対する細胞の感受性をもたらす遺伝子を不活性化することによって付与することができる。細胞に薬剤耐性を付与するために不活性化することができる遺伝子の例としては、例えば、ＣＤ５２、糖質コルチコイド受容体、ＣＤ３、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）などが挙げられる。抗がん剤に対する細胞の感度に関与する遺伝子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮを用いた遺伝子のノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段によって、不活性化することができる。

【0121】

別の一般的な態様において、本発明は、本発明の遺伝子操作されたＢＣＭＡ標的化免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本開示を考慮すると、ＣＡＲ−Ｔの医薬組成物での使用に適したいずれの薬学的に許容される担体も本発明で使用することができる。

【0122】

別の一般的な態様では、本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｂ細胞関連疾患の治療を要する対象におけるＢ細胞関連疾患を治療する方法に関する。Ｂ細胞関連疾患としては、不適当なＢ細胞活性及びＢ細胞悪性疾患に関連する疾患、障害若しくは病態、例えば、がん若しくは悪性疾患などの増殖性疾患、前がん状態、又はＢＣＭＡを発現する細胞に関連する非がん状態が挙げられる。特定の実施形態によれば、本発明は、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、多発性骨髄腫の治療を要する対象における多発性骨髄腫を治療する方法に関する。

【0123】

本発明の実施形態によれば、治療有効量の医薬組成物は、免疫応答の刺激を要する対象の免疫応答を刺激し、好ましくは、疾患、障害、若しくは病態の治療をもたらすか、疾患、障害、若しくは病態を予防若しくはその進行を遅らせるか、又は免疫疾患、障害、若しくは病態に関連する症状を軽減若しくは完全に緩和する。

【0124】

特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、過剰増殖性疾患である。他の特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、がん若しくは腫瘍、又は悪性過増殖性疾患であり、好ましくは固体腫瘍、血液がん、膀胱がん、胆管がん、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、頭部がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、多発性骨髄腫、頸部がん、卵巣がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、唾液腺がん、胃がん、胸腺上皮がん、及び甲状腺がんからなる群から選択されるがんである。好ましくは、治療される疾患、障害又は病態は、がん若しくは悪性疾患、又は骨髄異形成症、骨髄異形成症候群若しくは前白血病のうちの１つ以上から選択される前がん状態である。

【0125】

いくつかの実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）のうちの１つ以上から選択される急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛細胞白血病、小細胞又は大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症；前立腺がん、膵臓がん、肺がん、又は形質細胞増殖性疾患、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞質腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、及びＰＯＥＭＳ症候群、又はこれらの組み合わせである。

【0126】

一実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、多発性骨髄腫である。特定の実施形態によれば、多発性骨髄腫は、定型多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質胞腫、及び髄外形質細胞腫からなる群から選択される。

【0127】

特定の実施形態によれば、治療有効量のＢＣＭＡ標的化免疫細胞組成物は、治療を要する対象において、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するうえで充分である。すなわち、（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を低減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状の退縮を生じること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進展又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。特定の実施形態では、治療有効量とは、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するうえで充分な治療薬の量を指す。すなわち、（ｉ）腫瘍体積を減少させること、（ｉｉ）腫瘍細胞の数を減少させること、（ｉｉｉ）転移の回数を減少させること、（ｉｖ）余命を延ばすこと、（ｖ）腫瘍細胞の増殖を低下させること、（ｖｉ）腫瘍細胞の生存率を低下させること、（ｖｉｉ）がん状態に関連する生理学的症状を改善すること、及び／又は（ｖｉｉｉ）腫瘍の発生を予防すること。

【0128】

治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び有効性を最適化するために最適に滴定される。正確な用量は、周知の技術を用いて当業者により確認することができる。一般に、ＢＣＭＡ標的化免疫細胞は、体重１ｋｇ当たり約１０^５〜１０^８個の細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、細胞の総用量は、分割投与、例えば、１回、２回、３回、又はそれ以上の別々の部分用量の投与によって対象に投与することができる。

【0129】

特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に適した形で製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に適した形で製剤化することができる。

【0130】

特定の実施形態によれば、がんの治療に使用される組成物は、これらに限定されるものではないが、化学療法、リンパ球枯渇療法、放射線治療、他のがん免疫療法剤、標的化療法、がんワクチン、又は他の抗がん剤を含む別の治療と併用することができる。

【0131】

本明細書で使用するところの「併用される」なる用語は、対象への２種以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療の使用を指す。「併用される」なる用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。

【0132】

別の一般的な態様では、本発明は、免疫細胞を新たに方向付けて、治療を要する対象におけるＢＣＭＡ提示細胞の殺傷を標的とする方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。

【0133】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＢＣＭＡ標的化免疫細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、ＢＣＭＡ標的化免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法に関する。

【0134】

本発明は以下の非限定的な実施形態を更に提供する。

【0135】

実施形態
実施形態１は、ＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、単離ＦＮ３ドメインである。

【0136】

実施形態２は、単離ＦＮ３ドメインが、ヒトＢＣＭＡの残基１〜５４内の配列のような、ＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態１の単離ＦＮ３ドメインである。

【0137】

実施形態３は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＦＮ３ドメインが、バイオセンサーシステム、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）などを使用して、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１×１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、又は１×１０^−１３Ｍ未満のＫＤでＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに結合する、実施形態１の単離ＦＮ３ドメインである。

【0138】

実施形態４は、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１の単離ＦＮ３ドメインである。

【0139】

実施形態５は、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１の単離ＦＮ３ドメインである。

【0140】

実施形態６は、実施形態１〜５のいずれか１つのＦＮ３ドメインをコードする単離ポリヌクレオチドである。

【0141】

実施形態７は、実施形態６のポリヌクレオチドを含むベクターである。

【0142】

実施形態８は、実施形態６のポリヌクレオチド又は実施形態７のベクターを含む宿主細胞である。

【0143】

実施形態９は、ＦＮ３ドメインをコードする核酸を含む宿主細胞を、ＦＮ３ドメインを産生する条件下で培養することと、細胞又は細胞培養物からＦＮ３ドメインを回収することと、を含む、実施形態１〜５のいずれかのＦＮ３ドメインを生産する方法である。

【0144】

実施形態１０は、実施形態１〜５のいずれかのＦＮ３ドメインと薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

【0145】

実施形態１１は、生体試料中のＢＣＭＡを検出する方法であって、生体試料を実施形態１〜５のいずれかのＦＮ３ドメインと接触させることと、ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを検出することと、を含み、好ましくはＦＮ３ドメインが標識されたものである、方法である。

【0146】

実施形態１２は、治療有効量の実施形態１０の医薬組成物を対象に投与することを含む、ＢＣＭＡに関連する疾患の治療を要する対象におけるＢＣＭＡに関連する疾患を治療する方法である。

【0147】

実施形態１３は、ＢＣＭＡ標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを有する細胞外ドメインと、
膜貫通ドメインと、
細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドである。

【0148】

実施形態１４は、ＦＮ３ドメインが、ヒトＢＣＭＡの残基１〜５４内の配列のようなＢＣＭＡの細胞外ドメインに特異的に結合する、実施形態１３の単離ポリヌクレオチドである。

【0149】

実施形態１５は、ＦＮ３ドメインが、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＦＮ３ドメインが、バイオセンサーシステム、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）などを使用して、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１×１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、又は１×１０^−１３Ｍ未満のＫＤでＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに結合する、実施形態１３の単離ポリヌクレオチドである。

【0150】

実施形態１６は、ＦＮ３ドメインが、配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１３の単離ポリヌクレオチドである。

【0151】

実施形態１７は、ＦＮ３ドメインが、配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を含む、実施形態１３の単離ポリヌクレオチドである。

【0152】

実施形態１８は、ＣＡＲが細胞外ドメインを膜貫通ドメインに連結するヒンジ領域を更に含み、好ましくはヒンジ領域が配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、ヒンジ領域が配列番号３のアミノ酸配列を含む、実施形態１３〜１８のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0153】

実施形態１９は、ＣＡＲがアミノ末端におけるシグナルペプチドを更に含み、好ましくは、シグナルペプチドが配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、シグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を含む、実施形態１３〜１８のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0154】

実施形態２０は、膜貫通ドメインが配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、より好ましくは、膜貫通ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含む、実施形態１３〜１９のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0155】

実施形態２１は、細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ−４０としても知られる）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭドメイン、又はＣＤ６６ｄなどに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１３〜２０のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0156】

実施形態２２は、細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態１３〜２１のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0157】

実施形態２３は、細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含み、より好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列を有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１３〜２２のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0158】

実施形態２４は、細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含み、より好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列を有する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態１３〜２３のいずれかの単離ポリヌクレオチドである。

【0159】

実施形態２５は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦＮ３ドメインであって、バイオセンサーシステム、例えば、Ｐｒｏｔｅｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ社）などを使用して、表面プラズモン共鳴を用いて測定した場合に１×１０^−６Ｍ、５×１０^−７Ｍ、１×１０^−７Ｍ、５×１０^−８Ｍ、１×１０^−８Ｍ、５×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、５×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、５×１０^−１１Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、５×１０^−１２Ｍ、１×１０^−１２Ｍ、５×１０^−１３Ｍ、又は１×１０^−１３Ｍ未満のＫＤでＢＣＭＡ、好ましくはヒトＢＣＭＡに結合する、ＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドである。

【0160】

実施形態２６は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインであって、好ましくは、ＦＮ３ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含み、ＦＮ３がＢＣＭＡに特異的に結合する、細胞外ドメインと、
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドである。

【0161】

実施形態２７は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインであって、ＦＮ３がＢＣＭＡに特異的に結合する、細胞外ドメインと、
配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、単離ポリヌクレオチドである。

【0162】

実施形態２８は、シグナルペプチドが配列番号２のアミノ酸配列を有し、細胞外ドメインが配列番号８〜４４及び５８〜１４５のうちの１つのアミノ酸配列を有し、ヒンジ領域が配列番号３のアミノ酸配列を有し、膜貫通ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を有し、細胞内シグナル伝達ドメインが配列番号５のアミノ酸配列及び配列番号６のアミノ酸配列を含む、実施形態２７の単離ポリヌクレオチドである。

【0163】

実施形態２９は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドである。

【0164】

実施形態３０は、実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは、実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含む発現ベクターである。

【0165】

実施形態３１は、実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチド又は実施形態３０のベクターを含む宿主細胞である。

【0166】

実施形態３２は、実施形態３１の宿主細胞の単離細胞膜である。

【0167】

実施形態３３は、単離細胞膜を調製する方法であって、
実施形態３１の宿主細胞を、ＣＡＲを産生する条件下で培養することと、
細胞膜を宿主細胞から単離することと、を含む、方法である。

【0168】

実施形態３４は、実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチド又は実施形態３０のベクターを含む遺伝子操作された免疫細胞であって、実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結されている、遺伝子操作された免疫細胞である。

【0169】

実施形態３５は、免疫細胞が、遺伝子操作されたＴ細胞受容体ノックアウト免疫細胞である、実施形態３４の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0170】

実施形態３６は、免疫細胞が、ＢＣＭＡとは異なる第２の標的に特異的に結合する細胞外ドメインを有する第２のＣＡＲを更に発現する、実施形態３４又は３５の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0171】

実施形態３７は、第２の標的が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＳ−１、κ軽鎖、ＣＤ１３８、Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原、ＣＤ３８などの多発性骨髄腫に関連する標的である、実施形態３６の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0172】

実施形態３８は、第２の標的が、正常細胞で発現されるががん細胞では発現しない標的であり、第２のＣＡＲが、阻害性受容体シグナル伝達ドメインを有する細胞内ドメインを含む、実施形態３６の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0173】

実施形態３９は、細胞が、少なくとも１つの抗がん化学療法に対する耐性を有する、実施形態３４〜３８のいずれかの遺伝子操作された免疫細胞である。

【0174】

実施形態４０は、細胞が、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、イノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰＤＨ２）の変異体又は修飾型、多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）、カルシニューリン、メチルグアニントランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１、抗生物質耐性遺伝子であるｂｌｅ及びｍｃｒＡなどからなる群から選択されるものなどの、１つ以上の薬剤耐性遺伝子を更に発現する、実施形態３９の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0175】

実施形態４１は、細胞が、ＣＤ５２、糖質コルチコイド受容体、ＣＤ３、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）などからなる群から選択される不活性化遺伝子などの、薬剤に対する細胞の感受性に関与する１つ以上の不活性化遺伝子を更に発現する、実施形態３９の遺伝子操作された免疫細胞である。

【0176】

実施形態４２は、実施形態３４〜４１のいずれかの遺伝子操作された免疫細胞と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。

【0177】

実施形態４３は、治療有効量の実施形態４２の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｂ細胞に関連する病態の治療を要する対象におけるＢ細胞に関連する病態を治療する方法である。

【0178】

実施形態４４は、Ｂ細胞に関連する病態が、がん若しくは悪性疾患、又は骨髄異形成症、骨髄異形成症候群若しくは前白血病のうちの１つ以上から選択される前がん状態である、実施形態４３の方法である。

【0179】

実施形態４５は、Ｂ細胞に関連する病態が、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、リンパ性白血病（ＡＬＬ）のうちの１つ以上から選択される急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、毛細胞白血病、小細胞又は大細胞濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、ワルデンストレームマクログロブリン血症；前立腺がん、膵臓がん、肺がん、又は形質細胞増殖性疾患、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、形質細胞質腫、全身性アミロイド軽鎖アミロイドーシス、及びＰＯＥＭＳ症候群、又はこれらの組み合わせである、実施形態４３の方法である。

【0180】

実施形態４６は、Ｂ細胞に関連する病態が、定型多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質胞腫、及び髄外形質細胞腫、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される多発性骨髄腫などの多発性骨髄腫である、実施形態４５の方法である。

【0181】

実施形態４７は、化学療法、リンパ球枯渇療法、放射線治療、別のがん免疫療法剤、標的化療法、又は別の抗がん剤などの別の治療を対象に投与することを更に含む、実施形態４３〜４６の方法である。

【0182】

実施形態４８は、免疫細胞を遺伝子操作する方法であって、（ａ）免疫細胞を得ることと、（ｂ）実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチド又は実施形態３０のベクターを当該細胞内に導入することとを含む、方法である。

【0183】

実施形態４９は、実施形態３４〜４１のいずれかの遺伝子操作された免疫細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物を製造する方法である。

【0184】

実施形態５０は、Ｂ細胞に関連する病態の治療を要する対象におけるＢ細胞に関連する病態の治療のための実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチド、実施形態３０のベクター、実施形態３４〜４１のいずれかの遺伝子操作された免疫細胞、又は実施形態４２の医薬組成物の使用であって、好ましくは、Ｂ細胞に関連する病態が多発性骨髄腫である、使用である。

【0185】

実施形態５１は、Ｂ細胞に関連する病態の治療を要する対象におけるＢ細胞に関連する病態を治療するための実施形態１３〜２９のいずれかのポリヌクレオチド、実施形態３０のベクター、実施形態３４〜４１のいずれかの遺伝子操作された免疫細胞、又は実施形態４２の医薬組成物であって、好ましくは、Ｂ細胞に関連する病態が多発性骨髄腫である、ポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子操作された免疫細胞、又は医薬組成物である。

【実施例】

【0186】

以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は付属の請求項によって定められる点を理解されたい。

【0187】

実施例１−ＣＩＳディスプレイによる組み換えＢＣＭＡタンパク質に対するＦＮ３ドメインライブラリのパンニング
ＢＣＭＡ組み換えタンパク質標的抗原の２つのコンストラクトをＡＢ Ｂｉｏｓｉｅｎｃｅｓ社から購入した。一方はＢＣＭＡタンパク質単独（カタログ番号Ｐ０１１Ｘｐ）であり、他方はマウスＩｇＧ２ａのＦｃドメイン（カタログ番号Ｐ００１Ｆ）と融合されたＢＣＭＡであった。

【0188】

ＦＮ３ドメインのＣＩＳ−ディスプレイによるライブラリ選択
ＣＩＳディスプレイを用いて、ＴＣＬ１８、ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、ＴＣＬ２３、及びＴＣＬ２４ライブラリからＢＣＭＡと結合するＦＮ３ドメインを選択した。

【0189】

ＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、及びＴＣＬ２３テンコンライブラリ（配列番号４６）は、Ｃ鎖及びＦ鎖内並びにＣＤループ及びＦＧループ内の各位置でランダム化されたものであり、これらの位置におけるアミノ酸の分布が表２に示されるようなものである。ＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１は、すべての位置で、システイン及びメチオニンのみを除く１８種類の天然アミノ酸の等しい分布（それぞれ５．５５％）を有するように設計した。ＴＣＬ２３は、ランダム化された各位置が、システイン及びメチオニンを除いて、機能性の抗体のＣＤＲ−Ｈ３ループに見られるアミノ酸分布（Ｂｉｒｔａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ａｐｒ １１；３７７（５）：１５１８〜２８）に近くなるように設計した。ＴＣＬ２４テンコンライブラリ（配列番号４７）は、ライブラリＴＣＬ１９、ＴＣＬ２１、及びＴＣＬ２３と比較して、４つの更なるランダム化テンコン位置を含むように設計した。これらの位置には、Ｄ鎖のＮ４６及びＴ４８と、Ｇ鎖のＳ８４及びＩ８６が含まれる。これらの位置は、これらの残基の側鎖がＤ及びＧβ鎖から表面露出しており、Ｃ及びＦ鎖のランダム化した部分に構造的に隣接して位置しており、そのため、標的タンパク質と結合するためにアクセス可能な表面積が大きくなることから選択された。ＴＣＬ２４の各位置で用いたアミノ酸分布は、表２でＴＣＬ１９及びＴＣＬ２１について述べたものと同じである。

【0190】

【表2】

【0191】

ＴＣＬ１８テンコンライブラリ（配列番号４８）はＢＣループ及びＦＧループ内でランダム化され、ランダム化されたＢＣループの長さ６〜９個の残基と、ランダム化されたＦＧループの長さ７〜１２個の残基との組み合わせからなる。

【0192】

インビトロ転写及び翻訳（ＩＴＴ）を行うため、３μｇのライブラリＤＮＡを、０．１ｍＭの完全アミノ酸、１ｘＳ３０プレミクス成分、及び１５μＬのＳ３０エクストラクト（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と５０μＬの全体積で、３０℃でインキュベートした。１時間後、３７５μＬのブロッキング溶液（１ｘＴＢＳ、ｐＨ７．４、２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ）を加え、反応混合物を氷上で１５分間インキュベートした。ＩＴＴ反応液を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃドメインに融合したビオチン化組み換えＢＣＭＡタンパク質（ＡＢ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カタログ番号Ｐ０１１Ｆ）とインキュベートした。４μＭのマウスＩｇＧ２ａ（ＣＮＴＯ１０３７）を用いた競合結合アッセイを行って、マウスＦｃの代わりにＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを濃縮した。

【0193】

ビオチン化組み換えタンパク質及び結合したライブラリのメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に捕捉した。未結合のライブラリのメンバーを、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで順に洗浄して除去した。洗浄後、ＤＮＡを、８５℃で１０分間加熱することにより標的タンパク質から溶出し、更なるパニングのラウンドを行うためにＰＣＲにより増幅した。各ラウンドにおいて、標的ＢＣＭＡ−ｍＦｃタンパク質の濃度を４００ｎＭから１００ｎＭに順次低下させて、洗浄のストリンジェンシーを上げることによって、高親和性の結合物質を単離した。５回の連続した選択のラウンドを行った。

【0194】

オフレート選択（Off-rate selection）
選択の５回目のラウンドからの生成物に、４ラウンドのオフレート選択を行った。ＩＴＴ反応混合物を、マウスＩｇＧ２ａのＦｃに融合したビオチン化組み換えＢＣＭＡ細胞外ドメインタンパク質とインキュベートした。ビオチン化標的タンパク質の濃度を最初の２ラウンドの２５ｎＭから最後の２ラウンドの２．５ｎＭにまで順次下げて、ＦＮ３ドメインの標的タンパク質との高い親和性についてＦＮ３ドメインを選択した。２．５μＭのマウスＩｇＧ２ａ（ＣＮＴＯ１０３７）を用いた競合結合アッセイを行って、マウスＦｃの代わりにＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを濃縮した。

【0195】

ビオチン化組み換えタンパク質及び結合したライブラリのメンバーを、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズ上に捕捉し、ＴＢＳＴでよく洗った。次いで、結合した複合体を５μＭの低温の組み換えＢＣＭＡ−ｍＦｃタンパク質で１時間洗浄し、ＴＢＳＴ及びＴＢＳで順次洗浄した後、ＤＮＡを溶出して、より遅い解離速度のＦＮ３ドメインを選択した。

【0196】

パニングのラウンド５クローニング
パニングからの生成物をｐＥＴ１５ｂベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質導入した。自動コロニーピッカーを使用してシングルコロニーをピックし、２ｍＬの９６ウェルプレート中、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で６時間増殖させた。細菌増殖物を用いて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン＋Ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地中に培養物を接種した。２４時間後、細菌を遠心分離によりペレット化し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ＋０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）で溶解した。

【0197】

パニングのラウンド５スクリーニング
Ｎｕｎｃマキシソーププレートを、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬのニュートラアビジンにより１００μＬ／ウェルで一晩コーティングした。翌日、プレートをＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャー（３ｘ３００μＬ ＴＢＳＴ）を用いて洗浄し、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０（Ｔｈｅｒｍｏ社）で１時間ブロッキングした。プレートを３ｘ３００μＬ ＴＢＳＴで洗浄した。抗原（１μｇ／ｍＬのｂｔ−ＢＣＭＡ、１μｇ／ｍＬのｂｔ−ＢＣＭＡ−ｍＦｃ、又は５μｇ／ｍＬのＣＮＴＯ１０３７コントロール）を、１００μＬのＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｔ２０／ウェル中で１時間コーティングした。

【0198】

新鮮な細菌ライセートを調製し、１：５の希釈率でＥＬＩＳＡプレートに１時間添加した。次いで、プレートを更に１回洗浄し、１００μＬの抗テンコン２５抗体ｐＡｂ２５−ＨＲＰを１：５０００の希釈率で更に１時間添加した。プレートを最後に１回洗浄し、５０μＬのＰＯＤ基質（Ｒｏｃｈｅ社）を１：１００の希釈率で各プレートに１つずつ添加した後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ５プレートリーダーで発光を読み取った。

【0199】

バックグラウンド（Ｂ）に対するシグナル（Ｓ）を３ＤＸで分析し、Ｓ／Ｂが１０倍未満かつ相対発光単位（ＲＬＵ）が５０，０００未満のクローンを廃棄した。合計７ヒットがＦｃタグなしのｂｔ−ＢＣＭＡ抗原を用いて特定されたのに対して、２８１ヒットがｂｔ−ＢＣＭＡ−ｍＦｃを用いて特定された。配列解析後、１４２個の固有の配列が特定された。

【0200】

パニングのラウンド９クローニング
パニングからの生成物をｐＤ４４４−ＣＨベクターにＩｎｆｕｓｉｏｎクローニングし、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｇｏｌｄコンピテント細胞に形質導入した。自動コロニーピッカーを使用してシングルコロニーをピックし、２ｍＬの９６ウェルプレート中、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で６時間増殖させた。細菌増殖物を用いて、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン＋Ａｕｔｏ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地中に培養物を接種した。２４時間後、細菌を遠心分離によりペレット化し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ ＨＴ＋０．２ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）で溶解した。

【0201】

パン２９０ラウンド９スクリーニング
１０，０００倍のライセート希釈液を使用し、ｂｔ−ＢＣＭＡ−ｍＦｃ（１μｇ／ｍＬ）及びｂｔ−ＣＮＴＯ１０３７（２μｇ／ｍＬ）抗原のみを使用した点を除いて、Ｒ５について上記に述べた方法を用いて生成物をスクリーニングした。この希釈率でＳ／Ｂが１０倍未満のクローンを廃棄した。合計１４５ヒットを特定し、配列決定した。配列解析後、７７個の固有の配列を特定した（例えば、配列番号８〜４４及び５８〜１４５を参照）。

【0202】

実施例２−ヒトＢＣＭＡを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞との結合についてのＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインのスクリーニング
ｈＢＣＭＡ発現ＨＥＫ２９３Ｆ及びＭｏｃｋ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の細胞数及び細胞生存率を測定し、２５×１０^６個の各細胞タイプを１７５ｇで５分間スピンダウンした。培地を吸引し、２５ｍＬのＦＡＣＳバッファーに置き換えた。各細胞タイプにつき２枚のＶ底９６ウェルプレートに各ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、各プレートを、実験を通して氷上に保持した。各試料は以下のように設定した。
ｈＢＣＭＡ細胞：２μＭで処理
ｈＢＣＭＡ細胞：０．２μＭで処理
モック細胞：２μＭで処理
Ｍｏｃｋ細胞：０．２μＭで処理

【0203】

ポジティブ及びネガティブ抗体コントロールを含めた。１２．５μＬのコントロール抗体を２３８．５μＬのＦＡＣＳバッファーに加え、処理体積１００μＬ当たり５μＬの抗体（２．５μｇ）を得た。バッファーコントロールも含めた。バッファーコントロールウェルには、２５０μＬのＦＡＣＳバッファーのみを入れた。

【0204】

プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、１００μＬの希釈ＦＮ３ドメイン又はコントロールを細胞に加え、ピペットで混合した。プレートを裏返した後、ウェル内にはいくらかの残留液が残っていたが、その量はウェル間で概ね一定であった。

【0205】

プレートを氷上で１時間インキュベートした。その後、細胞を「Ｍｏｃｋ：２μＭで処理」プレートのうちの１つの４個のウェルから回収し、Ｖｉ−ＣｅｌｌシステムでＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを使用して細胞数及び生存率を確認した。生存率＞９０％で細胞数は約７５，０００個／ウェルであった。

【0206】

１時間後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、１００ｕＬのＦＡＣＳバッファーを各ウェルに加えた。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄を更に２回繰り返した。プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化し、プレートを裏返してバッファーを捨てた。

【0207】

ＦＡＣＳバッファー中５０μＬの二次抗体を各ウェルに加えた。抗マウスｍＡｂを１／１０００の希釈率で加えた二次抗体コントロールウェル又はバッファーコントロールウェル以外のすべてのウェルに、抗Ｈｉｓ ｍＡｂを１／１００の希釈率で加えた。プレートを氷上で１時間インキュベートした。その後、細胞を「Ｍｏｃｋ：２μＭで処理」プレートのうちの１つの４個のウェルから回収し、Ｖｉ−ＣｅｌｌシステムでＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを使用して細胞数及び生存率を確認した。生存率９６％で細胞数は約６７，０００個／ウェルであった。

【0208】

１時間後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、１００ｕＬのＦＡＣＳバッファーを各ウェルに加えた。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄を更に２回繰り返した。プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化し、プレートを裏返してバッファーを捨てた。

【0209】

細胞を３０μＬのＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔバッファー（ＦＡＣＳバッファー、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＳｙｔｏＸ Ｒｅｄ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｓｔａｉｎ、希釈率１：１０００）中に再懸濁し、よく混合して塊を壊した。プレートを氷上に保持し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔプレートリーダーで読み取った。細胞を以下の順序でゲート化した：（ａ）細胞、（ｂ）単一細胞、（ｃ）生細胞。Ａｌｅｘａ４８８チャンネルの幾何平均を計算し、生存細胞の割合を計算した。データは、ｈＢＣＭＡ／Ｍｏｃｋ Ａｌｅｘａ４８８シグナルの比を参照エンドポイントとして用いて表に収集した。データに基づき、１４個のＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを更なる分析用に選択した。

【0210】

実施例３−ヒトＢＣＭＡを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞との結合についての抗ＢＣＭＡＦＮ３ドメインの用量反応曲線（ＤＲＣ）評価
１０個のＦＮ３ドメインの３倍希釈物を、開始濃度５μＭでＢＤ ＦＡＣＳバッファーで滴定した。コントロール試料はＦＡＣＳバッファーで希釈した。ヒトＢＣＭＡを一過性に発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞にオーバーレイするために、それぞれが７個のＦＮ３ドメインを単点用量滴定で有するソースプレートを非特異的テンコン２５のコントロールと並行して作製した。アッセイコントロールは以下を含んだ。

【0211】

非特異的結合を測定するための各プレート上の一連のテンコン２５用量反応曲線；
非特異的標識を測定するための抗Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ−４８８で染色した未処理細胞；
絶対バックグラウンドを測定するための抗Ｈｉｓ抗体染色を行わない非処理細胞；
シグナル強度のプレート間のばらつきを調節するための参照として使用した、「Ｇ１０」と呼ばれるＦＮ３ドメイン１ｕＭのポジティブコントロール；及び
明らかに低い生存率を調整するための生存率試験ウェル。

【0212】

ｈＢＣＭＡ発現ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の細胞数及び細胞生存率を測定し、４５×１０^６個のｈＢＣＭＡ発現細胞を１７５ｇで５分間スピンダウンした。培地を吸引し、２５ｍＬのＦＡＣＳバッファーに置き換えた。４枚のＶ底９６ウェルプレートに各ウェル当たり１００，０００個の細胞を播種し、プレートを、実験を通して氷上に保持した。プレーティングに使用しない５×１０^６細胞は、後の比較生存率試験のために氷上に維持した。

【0213】

プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、６０μＬの希釈ＦＮ３ドメイン又はコントロールを細胞に加え、プレートをボルテックスして静かに混合した。

【0214】

プレートを氷上で１時間インキュベートした。１時間後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、１００ｕＬのＦＡＣＳバッファーを各ウェルに加えた。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄を更に２回繰り返した。プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化し、プレートを裏返してバッファーを捨てた。プレートをボルテックスして細胞を静かに混合した。

【0215】

ＦＡＣＳバッファー中５０μＬの二次抗体を各ウェルに加えた。ＦＡＣＳバッファーのみのネガティブコントロールウェル以外のすべてのウェルに、抗Ｈｉｓ ｍＡｂを１／１００の希釈率で加えた。プレートを氷上で１時間インキュベートした。その後、４枚のプレートすべての２個のウェルから細胞を回収して加え合わせ、Ｖｉ−ＣｅｌｌシステムでＴｒｙｐａｎ ｂｌｕｅを使用して細胞数及び生存率を確認した。生存率９６．６％で細胞数は約６７，５００個／ウェルであった。比較用に氷上に維持したコントロール細胞の細胞数は、生存率９５．１％で１×１０^６／ｍＬであった。

【0216】

１時間の染色後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化した。プレートを裏返してバッファーを捨て、１００ｕＬのＦＡＣＳバッファーを各ウェルに加えた。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄を更に２回繰り返した。プレートを１２００ｒｐｍで５分間、４℃でスピンして細胞をペレット化し、プレートを裏返してバッファーを捨てた。

【0217】

細胞を３０μＬのＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔバッファー（ＦＡＣＳバッファー、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＳｙｔｏＸ Ｒｅｄ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｓｔａｉｎ、希釈率１：１０００）中に再懸濁し、プレートをボルテックスして静かに混合した。プレートを氷上に保持し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔプレートリーダーで読み取った。細胞を以下の順序でゲート化した：（ａ）細胞、（ｂ）単一細胞、（ｃ）生細胞。Ａｌｅｘａ４８８チャンネルの幾何平均を計算し、生存する単一細胞の割合を計算した。正規化及び較正されたデータの結果を、図２（結合飽和、一部位特異的結合曲線フィッティングプログラムを使用したＰＲＩＳＭ曲線フィット分析）、及びＰＲＩＳＭソフトウェアを使用して計算したＢｍａｘ及び解離定数（Ｋｄ）を示す表３に示す。

【0218】

【表3】

【0219】

実施例４−ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン保有ＣＡＲの作製
２３種類のＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン（配列番号８〜１９及び５８〜６８）を１２５種類（配列番号８〜４４及び５８〜１４５）のリストから選択し、図１に示すドメイン構造にしたがってＣＡＲコンストラクトに遺伝子操作により組み込んだ。

【0220】

ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲコンストラクトの各構成要素のアミノ酸配列は、表４に示すとおりであった。

【0221】

【表4】

【0222】

ｍＲＮＡ合成用の５’Ｔ７プロモーターを含むｄｓＤＮＡ ＰＣＲテンプレートを増幅するために、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ遺伝子のそれぞれについてプライマーを合成した。ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ ｍＲＮＡは、市販のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して生成した。

【0223】

実施例５−ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを発現する遺伝子操作した免疫細胞の作製及び分析
ｍＲＮＡを、正常なヒト血液（正常血液ドナーサービス−ＴＳＲＩ）に由来するｐａｎ Ｔ細胞に、ＥＣＭ ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ社）を用いてエレクトロポレートした。５×１０^６個のｐａｎ Ｔ細胞に、１０μｇのＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下又は非存在下で、製造者のプロトコールにしたがって単一の電気パルス（５００Ｖ、７５０μ秒）を与えた。ポリクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体を用いて、ＣＡＲの表面発現を２４時間後に評価した。結果を図３に示す。

【0224】

次いで、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ細胞を、クロム放出細胞毒性アッセイにより評価した。

【0225】

エフェクターは、ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ発現Ｔ細胞、ｓｃＦｖ−発現Ｔ細胞、ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞、及び野生型Ｔ細胞とした。Ｔ細胞に、対応するｍＲＮＡをエレクトロポレートしたところ、約９０％の表面発現が得られた。

【0226】

使用した標的細胞は、Ｕ２９３２（ＣＤ１９^＋／ＢＣＭＡ^＋Ｂ細胞リンパ腫細胞株）、Ｈ９２９（ＣＤ１９⁻／ＢＣＭＡ^＋形質細胞腫骨髄腫細胞株）、及びＫ５６２（ＣＤ１９⁻／ＢＣＭＡ⁻慢性骨髄性白血病細胞株）とした。

【0227】

標的に腫瘍標的細胞１０×１０^６個当たり１００μＣｉのＣｒ５１を３７℃で１時間ロードした後、３回洗浄した。次いで、１０，０００個の標的細胞を、腫瘍標的に対する遺伝子操作したエフェクターＴ細胞の示される比（Ｅ：Ｔ）で約１３〜１４時間インキュベートした。「最大放出」試料は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いてインキュベートした標的であり、「Ｔ細胞なし、自然放出」試料は、標的のみのものである。カウントを６０秒間収集し、アッセイを３重で設定した。細胞毒性率（％）の計算は以下のとおりに行った。
細胞毒性率（％）＝（実験ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ）×１００％／（最大放出ＣＰＭ−自発放出ＣＰＭ）

【0228】

図４〜７に示されるデータを分析し、Ｐｒｉｓｍでグラフ化し、平均細胞毒性率（％）±ＳＥＭとして示した。

【0229】

これらの結果は、初代Ｔ細胞上のＦＮ３ドメイン保有ＣＡＲの発現が、ＴＡＡ特異的な細胞殺傷を誘発し得ることを示すものである。

【0230】

以上、本発明を詳細に、かつその具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更及び改変を行い得る点は明らかであろう。

【0231】

参考文献
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

2019534038000001.app

【国際調査報告】