特表 2019-534706 抗ＥＤＢ抗体および抗体−薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2019-534706(P2019-534706A)

(43)【公表日】2019年12月5日

(54)【発明の名称】抗ＥＤＢ抗体および抗体−薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20191108BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20191108BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20191108BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20191108BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20191108BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20191108BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20191108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191108BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20191108BHJP

   A61K 31/537 20060101ALI20191108BHJP

   A61K 31/407 20060101ALI20191108BHJP

   C07D 498/18 20060101ALN20191108BHJP

   C07D 519/00 20060101ALN20191108BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/18

   C12N15/63 Z

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K39/395 C

   A61K39/395 L

   A61K47/68

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61K38/07

   A61K38/08

   A61K31/537

   A61K31/407

   C07D498/18

   C07D519/00 311

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】94

(21)【出願番号】特願2019-520386(P2019-520386)

(86)(22)【出願日】2017年10月3日

(85)【翻訳文提出日】2019年6月12日

(86)【国際出願番号】IB2017056093

(87)【国際公開番号】WO2018073680

(87)【国際公開日】20180426

(31)【優先権主張番号】62/409,081

(32)【優先日】2016年10月17日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】アンドレア テレーズ フーパー

(72)【発明者】

【氏名】キンバリー アン マルケット

(72)【発明者】

【氏名】チャクラパニー サブラマンヤム

(72)【発明者】

【氏名】ハンス−ピーター ガーバー

(72)【発明者】

【氏名】チャド マイケル メイ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C072

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C072AA03

4C072AA06

4C072BB03

4C072BB06

4C072CC02

4C072CC12

4C072DD10

4C072EE06

4C072FF15

4C072GG06

4C072GG07

4C072MM01

4C072UU01

4C076AA95

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF32

4C076FF34

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA10

4C084BA16

4C084BA23

4C084BA41

4C084BA42

4C084NA13

4C084NA14

4C084NA15

4C084ZB26

4C084ZB27

4C085AA21

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086CB03

4C086CB22

4C086FA06

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086NA14

4C086NA15

4C086ZB26

4C086ZB27

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、フィブロネクチン１のエクストラドメインＢスプライスバリアントに結合する抗体および抗体−薬物コンジュゲート、ならびにそれらを調製および使用するための方法を提供する。
【図１】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）フィブロネクチンのエクストラドメインＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項2】

前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域ならびに配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項3】

前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号１または２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１から２のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項4】

前記抗体または抗原結合性断片が、
配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域；または
配列番号２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項5】

前記抗体または抗原結合性断片が、配列番号８、１７、１９、２３、２５、２７または２９を含む重鎖および配列番号１５または３１を含む軽鎖を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項6】

前記抗体または抗原結合性断片が、
配列番号８を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号８を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号１７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号１７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号１９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号１９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号２３を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号２３を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号２５を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号２７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；
配列番号２７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；
配列番号２９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；または
配列番号２９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項7】

前記抗体または抗原結合性断片が、部位特異的コンジュゲーションのために操作されたシステイン残基を含む重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項8】

前記重鎖定常領域が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含む、請求項７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項9】

前記軽鎖定常領域が、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）を含む、請求項７に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項10】

前記重鎖定常領域が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含み、前記軽鎖定常領域が、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項11】

前記抗体または抗原結合性断片が、前記抗体中に挿入されたまたは前記抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸を置き換える操作されたグルタミン含有タグを含む重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項12】

前記操作されたグルタミン含有タグが、Ｅ２９４〜Ｎ２９７位において前記抗体中に挿入される、請求項１１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項13】

前記グルタミン含有タグが、アミノ酸配列ＬＬＱＧ（配列番号４０）を含む、請求項１２に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項14】

前記重鎖定常領域が、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２２２位におけるリジン（Ｋ）を置換するアルギニン（Ｒ）（Ｋ２２２Ｒ）をさらに含む、請求項１１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項15】

前記抗体または抗原結合性断片が、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、９４位におけるリジン（Ｋ）を置換するアルギニン（Ｒ）（Ｋ９４Ｒ）を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項16】

前記リンカーが切断可能なリンカーである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項17】

前記切断可能なリンカーが、ｖｃ、ｄｉＳ、ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯおよびＡｃＬｙｓ−ｖｃからなる群から選択される、請求項１６に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項18】

前記薬物が細胞傷害剤である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項19】

前記細胞傷害剤がアウリスタチンである、請求項１８に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項20】

前記アウリスタチンが、０１０１、１５６９、９４１１および４５７４からなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項21】

前記細胞傷害剤がＣＰＩダイマーである、請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項22】

前記ＣＰＩダイマーが、ＣＰＩ−８３１４またはＣＰＩ−０３２６である、請求項２１に記載の抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項23】

（ａ）配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域ならびに配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項24】

（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項25】

（ａ）配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲート。

【請求項26】

請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。

【請求項27】

複数の請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび任意選択により薬学的担体を含む組成物であって、３から５までの範囲の平均ＤＡＲを有する組成物。

【請求項28】

複数の請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび任意選択により薬学的担体を含む組成物であって、１から３までの範囲の平均ＤＡＲを有する組成物。

【請求項29】

請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸。

【請求項30】

重鎖をコードする配列番号９、１８、２０、２４、２６、２８もしくは３０のいずれか、または軽鎖をコードする配列番号１６もしくは３２のいずれかの核酸。

【請求項31】

請求項２９から３０のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項32】

請求項２９から３０のいずれか一項に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項33】

請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、
（ａ）前記リンカーを前記薬物に連結させるステップ；
（ｂ）前記リンカーおよび薬物を前記抗体にコンジュゲートするステップ；および
（ｃ）前記抗体−薬物コンジュゲートを精製するステップ
を含むプロセス。

【請求項34】

前記コンジュゲートするステップが、前記抗体上の１つまたは複数の操作されたシステイン残基および／または操作されたグルタミン残基上で部位特異的である、請求項３３に記載のプロセス。

【請求項35】

ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患を処置する方法であって、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。

【請求項36】

ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患ががんである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記がんが、固形腫瘍または血液がんである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記固形腫瘍が、甲状腺がん、肉腫、乳がん、膵臓がん、神経膠芽腫、胆嚢がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮がん、中皮腫、結腸直腸がん、頭頚部がん、卵巣がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、肝臓がん、内分泌がん、胸腺がん、脳腫瘍、副腎がん、眼がん、子宮頚がんおよび肺がんである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記血液がんが、白血病、リンパ腫または骨髄腫である、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

対象におけるＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患の処置のための医薬の製造における、請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートの使用。

【請求項41】

前記ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患ががんである、請求項４０に記載の使用。

【請求項42】

前記がんが、固形腫瘍または血液がんである、請求項４１に記載の使用。

【請求項43】

前記固形腫瘍が、甲状腺がん、肉腫、乳がん、膵臓がん、神経膠芽腫、胆嚢がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮がん、中皮腫、結腸直腸がん、頭頚部がん、卵巣がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、肝臓がん、内分泌がん、胸腺がん、脳腫瘍、副腎がん、眼がん、子宮頚がんおよび肺がんである、請求項４２に記載の使用。

【請求項44】

前記血液がんが、白血病、リンパ腫または骨髄腫である、請求項４３に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。本発明は、がんなどのＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害の処置のためにかかる抗体およびＡＤＣを使用する方法にさらに関する。

【背景技術】

【0002】

フィブロネクチンは、血漿および他の体液中に可溶性形態で存在し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に不溶性形態で存在する高分子量接着性糖タンパク質である。フィブロネクチン１のエクストラドメインＢスプライスバリアント（ＥＤＢ＋ＦＮまたはＥＤＢ）は、非内部移行性のＥＣＭタンパク質である。ＥＤＢは、組織リモデリングが起きる際には常に一次転写物のレベルでの選択的スプライシングの機構によってフィブロネクチン分子中に挿入される、９１アミノ酸のＩＩＩ型相同性ドメインである。ＥＤＢ＋ＦＮは、腫瘍および他の病理における新たな血管の周囲の間質中に選択的に蓄積するが、正常な成人脈管構造中にはほとんど存在しないことが示されている。Ｚａｒｄｉら、Ｅｍｂｏ Ｊ．６（８）：２３３７〜４２（１９８７）。ＥＤＢ＋ＦＮは、多くの高悪性度腫瘍において発現され、腫瘍型に依存して、主に血管性または散在性間質パターンのいずれかの発現を示す。Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８（３）：１１３９〜４８（１９８９）。

【0003】

フィブロネクチン（ＦＮ）のＥＤＢドメインに特異的に結合する抗体であるＬ１９抗体が、ファージディスプレイテクノロジーによって単離されている。Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６８（３）：３９７〜４０５（１９９６）；Ｎｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１２）：１２７１〜５．（１９９７）；Ｐｉｎｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３４）：２１７６９〜７６（１９９８）。Ｌ１９抗体は、広範な実験腫瘍モデルにおいて、ならびにヒト腫瘍および他の血管新生性障害の切片上で、腫瘍血管を染色することができる。Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０８（３）：１１３９〜４８（１９８９）；Ｋａｃｚｍａｒｅｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５９（１）：１１〜６（１９９４）；Ｂｅｒｎｄｔら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９（３）：２４９〜５５（１９９８）。

【0004】

種々の標的化戦略が、がんの処置において異なる形式のＬ１９抗体を使用して調査されてきた。例えば、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）モノクローナル抗体断片、Ｂｉｒｃｈｌｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９８４〜８（１９９９）、ｓｃＦｖ（Ｌ１９）と融合したインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−アルファ）を含む融合タンパク質、Ｈａｌｉｎ Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３（１２）：３２０２〜１０（２００３）、ならびにＬ１９小免疫タンパク質（ＳＩＰ）単独、および光感受性物質にコンジュゲートさせたもの、Ｆａｂｂｒｉｎｉ Ｍ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１８（７）：１８０５〜１３（２００６）。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

種々のＬ１９抗体ベースの治療が開示されているが、ＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんなどのＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患を有する患者のための、さらに改善および最適化されたＥＤＢ＋ＦＮ標的化治療、例えば、抗体−薬物コンジュゲートの開発の著しい臨床的必要性が依然として存在している。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、（ａ）フィブロネクチン（ＦＮ）のエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に結合する抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を含む抗体−薬物コンジュゲートを提供する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域ならびに配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含み得る抗体または抗原結合性断片を含む。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、配列番号１または２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含み得る抗体または抗原結合性断片を含む。

【0007】

本発明は、配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域；または配列番号２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含み得る抗体または抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、配列番号８、１７、１９、２３、２５、２７または２９を含む重鎖および配列番号１５または３１を含む軽鎖を含む抗体または抗原結合性断片を含む。

【0008】

本発明は、配列番号８を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号８を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；または配列番号２９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖を含む抗体または抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。

【0009】

本発明は、部位特異的コンジュゲーションのために操作されたシステイン残基を含む重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を有する抗体または抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含む重鎖定常領域を有する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）を含む軽鎖定常領域を有する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含む重鎖定常領域、およびＫａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）を含む軽鎖定常領域を有する。

【0010】

本発明は、抗体中に挿入されたまたは抗体中の１つもしくは複数の内因性アミノ酸を置き換える操作されたグルタミン含有タグを含む重鎖定常領域を含む抗体または抗原結合性断片を有する抗体−薬物コンジュゲートをさらに提供する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、Ｅ２９４〜Ｎ２９７位において抗体中に挿入された操作されたグルタミン含有タグを有する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、アミノ酸配列ＬＬＱＧ（配列番号４０）を含むグルタミン含有タグを有する。一部の態様では、抗体−薬物コンジュゲートは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２２２位におけるリジン（Ｋ）を置換するアルギニン（Ｒ）（Ｋ２２２Ｒ）をさらに含む重鎖定常領域を有する。

【0011】

本発明は、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、９４位におけるリジン（Ｋ）を置換するアルギニン（Ｒ）（Ｋ９４Ｒ）を含む重鎖可変領域を含む抗体または抗原結合性断片を有する抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。

【0012】

本発明は、切断可能なリンカーであるリンカーを有する抗体−薬物コンジュゲートをさらに提供する。一部の態様では、この切断可能なリンカーは、ｖｃ、ｄｉＳ、ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯおよびＡｃＬｙｓ−ｖｃからなる群から選択される。

【0013】

本発明は、細胞傷害剤である薬物を有する抗体−薬物コンジュゲートをさらに提供する。一部の態様では、この細胞傷害剤はアウリスタチンである。一部の態様では、このアウリスタチンは、０１０１、１５６９、９４１１および４５７４からなる群から選択される。一部の態様では、この細胞傷害剤はＣＰＩダイマーである。一部の態様では、このＣＰＩダイマーは、ＣＰＩ−８３１４またはＣＰＩ−０３２６である。

【0014】

本発明は、（ａ）配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域ならびに配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片、（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。

【0015】

本発明は、（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。

【0016】

本発明は、（ａ）配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）ｖｃリンカー、ならびに（ｃ）０１０１薬物を含む抗体−薬物コンジュゲートもまた提供する。

【0017】

本発明は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物をさらに提供する。本発明は、複数の本発明の抗体−薬物コンジュゲートおよび任意選択により薬学的担体を含む組成物であって、３から５までの範囲の平均ＤＡＲを有する組成物もまた提供する。本発明は、複数の請求項１から２５のいずれか一項に記載の抗体−薬物コンジュゲートおよび任意選択により薬学的担体を含む組成物であって、１から３までの範囲の平均ＤＡＲを有する組成物もまた提供する。

【0018】

本発明は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖をコードする核酸を提供する。一部の態様では、この核酸は、重鎖をコードする配列番号９、１８、２０、２４、２６、２８もしくは３０を含み得る、または軽鎖をコードする配列番号１６もしくは３２を含み得る。本発明は、本発明の任意の核酸を含むベクターをさらに提供する。また、本発明は、本発明の任意の核酸を含む宿主細胞を提供する。

【0019】

本発明は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを産生するためのプロセスであって、（ａ）リンカーを薬物に連結させるステップ；（ｂ）リンカーおよび薬物を抗体にコンジュゲートするステップ；および（ｃ）抗体−薬物コンジュゲートを精製するステップを含むプロセスを提供する。一部の態様では、コンジュゲートするステップは、抗体上の１つまたは複数の操作されたシステイン残基および／または操作されたグルタミン残基上で部位特異的である。

【0020】

本発明は、ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患を処置する方法であって、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法もまた提供する。一部の態様では、このＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患はがんである。一部の態様では、このがんは、固形腫瘍または血液がんである。一部の態様では、この固形腫瘍は、甲状腺がん、肉腫、乳がん、膵臓がん、神経膠芽腫、胆嚢がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮がん、中皮腫、結腸直腸がん、頭頚部がん、卵巣がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、肝臓がん、内分泌がん、胸腺がん、脳腫瘍、副腎がん、眼がん、子宮頚がんおよび肺がんである。一部の態様では、この血液がんは、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。

【0021】

本発明は、対象におけるＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患の処置のための医薬の製造における、本発明の抗体−薬物コンジュゲートの使用をさらに提供する。一部の態様では、このＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患はがんである。一部の態様では、このがんは、固形腫瘍または血液がんである。一部の態様では、この固形腫瘍は、甲状腺がん、肉腫、乳がん、膵臓がん、神経膠芽腫、胆嚢がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮がん、中皮腫、結腸直腸がん、頭頚部がん、卵巣がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、肝臓がん、内分泌がん、胸腺がん、脳腫瘍、副腎がん、眼がん、子宮頚がんおよび肺がんである。一部の態様では、この血液がんは、白血病、リンパ腫または骨髄腫である。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、［Ａ］ＥＤＢ−Ｌ１９、ＥＤＢ−ＰＦＥおよびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）抗体；ならびに［Ｂ］ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−２９０Ｃ）抗体の結合特性を示す。

【図2】図２は、ヒト患者由来異種移植（ＰＤＸ）がんモデルにおけるＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を使用したＥＤＢ＋ＦＮ発現を示す。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、［Ａ］ＥＤＢ−Ｌ１９抗体およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣならびにＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−２９０Ｃ）抗体およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣ；ならびに［Ｂ］ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）抗体およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣならびにＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）抗体およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１ ＡＤＣについてのＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

【図4】図４は、ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ−２９細胞におけるウエスタンブロットによるＥＤＢ＋ＦＮ発現を示す。

【図5-1】図５Ａ

【図5-2】図５Ｂ、図５Ｃ

【図5-3】図５Ｄ

【図5-4】図５Ｅ、図５Ｆ：図５Ａ〜５Ｆは、各個々の腫瘍保有マウスについての腫瘍成長阻害曲線としての、［Ａ］０．３、０．７５、１．５および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１；［Ｂ］３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１および１０ｍｇ／ｋｇのジスルフィド連結されたＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１；［Ｃ］１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１ならびに５ｍｇ／ｋｇのジスルフィド連結されたＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯ−１５６９；［Ｄ］それぞれ０．３、１および３ｍｇ／ｋｇならびに１．５ｍｇ／ｋｇの用量の、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ならびに慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）；［Ｅ］０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量の、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１；ならびに［Ｆ］３ｍｇ／ｋｇで投薬したＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群の、ヒトがんの高ＥＤＢ＋ＦＮ発現性ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルであるＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２における抗腫瘍有効性を示す。

【図6-1】図６Ａ

【図6-2】図６Ｂ、図６Ｃ

【図6-3】図６Ｄ

【図6-4】図６Ｅ、図６Ｆ：図６Ａ〜６Ｆは、［Ａ］０．３、０．７５、１．５および３ｍｇ／ｍｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１；［Ｂ］０．３、１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９；［Ｃ］それぞれ０．５、１．５および３ｍｇ／ｋｇならびに０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇの、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１ならびにＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩ−８３１４；［Ｄ］０．５、１．５および３ｍｇ／ｋｇの、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１および慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１；［Ｅ］１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１；ならびに［Ｆ］１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の、ヒトがんの中程度〜高ＥＤＢ＋ＦＮ発現性ＮＳＣＬＣ細胞株異種移植（ＣＬＸ）モデルであるＨ−１９７５における抗腫瘍有効性を示す。

【図7】図７は、３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１の、ヒトがんの中程度ＥＤＢ＋ＦＮ発現性結腸ＣＬＸモデルであるＨＴ２９における抗腫瘍有効性を示す。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、［Ａ］中程度〜高ＥＤＢ＋ＦＮ発現性膵臓ＰＤＸであるＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５；および［Ｂ］低〜中程度のＥＤＢ＋ＦＮ発現性膵臓ＰＤＸであるＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４における、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。

【図9】図９は、ヒトがんの中程度ＥＤＢ＋ＦＮ発現性リンパ腫ＣＬＸモデルであるＲａｍｏｓにおける、１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、各個々の腫瘍保有マウスについての腫瘍成長阻害曲線としての、［Ａ］４．５ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１；および［Ｂ］４．５ｍｇ／ｋｇで投薬したＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群の、マウス同系乳癌モデルであるＥＭＴ−６における抗腫瘍有効性を示す。

【図11】図１１は、６ｍｇ／ｋｇの部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ４）と比較した、５ｍｇ／ｋｇの慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１についての好中球の絶対数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、相互交換可能に「ＥＤＢ＋ＦＮ」または「ＥＤＢ」と呼ばれるフィブロネクチン（ＦＮ）のエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に結合する抗体および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。本発明は、抗ＥＤＢ抗体、リンカーおよび薬物（ペイロード）を使用してＡＤＣを調製するためのプロセスもまた提供する。本発明は、慣習的および／または部位特異的コンジュゲーションテクノロジーを使用して生成されたＡＤＣをさらに提供する。本発明の抗体およびＡＤＣは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現を特徴とするまたはＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する過剰増殖障害、例えばがんの診断、予防および／または処置において使用され得る、医薬などの組成物の調製および製造に有用である。本発明は、ＥＤＢ ＡＤＣを作製する際に使用される抗ＥＤＢ抗体をコードする核酸もまた提供する。

【0024】

ＡＤＣは、典型的にはリンカーの使用を介して薬物にコンジュゲートされた抗体構成要素を含む。慣習的コンジュゲーションテクノロジーによって生成されたＡＤＣは、抗体重鎖および／または軽鎖上に内因性に存在するリジンまたはシステイン残基を介して、薬物を抗体にランダムに連結する。従って、かかるＡＤＣは、異なる薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有する種の不均質な混合物である。部位特異的コンジュゲーションテクノロジーによって生成されたＡＤＣは、抗体重鎖および／または軽鎖上の特定の操作された残基において、薬物を抗体に連結する。このように、部位特異的コンジュゲートされたＡＤＣは、規定された薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有する種から構成されるＡＤＣの均質な混合物である。従って、部位特異的コンジュゲートされたＡＤＣは、改善された薬物動態、体内分布および安全性プロファイルを生じる均一な化学量論を実証する。

【0025】

本発明のＡＤＣは、リンカーを介して１つまたは複数の薬物にコンジュゲートされた抗ＥＤＢ抗体を含む（即ち、リンカー−薬物部分を形成する）。本発明は、（ａ）ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を有するＡＤＣを提供する。本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のＡＤＣをさらに提供し、式中、（ａ）Ａｂは、ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。別の態様では、本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐのＡＤＣを提供し、式中、（ａ）Ａｂは、ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、抗体に結合したリンカー−薬物部分の数である。

【0026】

抗体に結合したリンカー−薬物部分の数は、ＡＤＣの開発のために好ましい任意の数であり得る。一部の態様では、抗体１つ当たりのリンカー−薬物部分の数は、４である。他の態様では、抗体１つ当たりのリンカー−薬物部分の数は、３である。別の態様では、抗体１つ当たりのリンカー−薬物部分の数は、２である。別の態様では、抗体１つ当たりのリンカー−薬物部分の数は、１である。他の態様では、抗体１つ当たりのリンカー−薬物部分の数は、抗体１つ当たり、４個よりも多い、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個の、または１２個よりも多いリンカー−薬物部分である。

【0027】

さらに、本発明は、リンカー−薬物部分が、慣習的または部位特異的コンジュゲーションテクノロジーを介して抗体に結合される、ＡＤＣを提供する。一部の態様では、抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書にさらに記載される細胞傷害剤、細胞分裂停止剤および／または治療剤などの薬物にコンジュゲートまたは連結される。例えば、細胞傷害剤は、細胞傷害剤の標的化された局所的送達のために、本明細書に記載される抗ＥＤＢ抗体に連結またはコンジュゲートされ得る。かかるＡＤＣを調製および製造する方法、ならびに臨床適用におけるその使用もまた提供される。

【0028】

内部移行性の細胞表面発現されたタンパク質を標的化するために開発されている他のＡＤＣとは対照的に、本発明のＡＤＣは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）において発現されるタンパク質であるＥＤＢを標的化する。ＥＣＭにおいて発現されるタンパク質を標的化することは、腫瘍細胞上で発現されるタンパク質を標的化することを超える利益を提供し得る。ＡＤＣは、多くの処置が困難なヒトがんにおいて共通する間質およびＥＣＭ障壁を透過する必要なしに、標的に直接アクセスし得る。さらに、ＥＣＭ中のＥＤＢをＡＤＣで標的化することは、腫瘍微小環境中の標的化が困難な多くの細胞型にアクセスする具体的な機構を提供する。これは、細胞傷害性ペイロードまたは薬物の細胞外放出を生じ得、バイスタンダー機構による腫瘍細胞および／または間質細胞の細胞死／細胞周期停止などの機構を介した、種々の細胞の死滅を生じる。さらに、さらなる機構には、調節不全の血管新生もしくは細胞傷害性血管標的化／虚脱、血管正常化、免疫調節および細胞分化の誘導ならびに／または上皮間葉転換の妨害が含まれるがこれらに限定されない。

【0029】

本明細書で提供される実施例は、抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ ＡＤＣ生成の間に得られる改善された特徴、例えば、免疫原性を低減させるためのアロタイプ最適化、産物の均質性を増加させるためのＣＯＯＨ末端リジンの除去、ならびに潜在的な糖化傾向を緩和するためおよび不均質性を減少させるための変異の導入を実証する（実施例１および２を参照のこと）。さらに、実施例に示されるように、種々の慣習的および部位特異的コンジュゲーションテクノロジー（即ち、システイン、リジンおよび／またはアシルドナーグルタミン含有（「Ｑ」）タグ）ならびに種々のリンカー−薬物部分を使用して生成されたＥＤＢ ＡＤＣは、ロバストなｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ有効性を実証している（実施例６〜８を参照のこと）。本明細書で提供される実施例は、操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションを使用して生成されたＥＤＢ ＡＤＣが、システイン残基を介した慣習的コンジュゲーションを使用して生成されたＥＤＢ ＡＤＣと比較して改善された特徴、例えば、改善された薬物動態（ＰＫ）プロファイル（即ち、より少ないオフターゲット毒性効果をもたらす、増加した曝露およびコンジュゲーション安定性）、好ましい熱安定性およびプロファイリングされた非臨床的安全性（即ち、骨髄抑制の軽減）を実証したことも示した（それぞれ、実施例９、１０および１１を参照のこと）。さらに、部位特異的コンジュゲーションテクノロジーを用いて生成されたＥＤＢ ＡＤＣの改善された特徴は、ヒト処置におけるより高い投薬量を可能にし得、従って、増加した有効性を提供し得る。一部の態様では、これらのＥＤＢ ＡＤＣは、部位特異的コンジュゲーションを可能にするために、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域中の２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）におけるリジン（Ｋ）の、反応性システイン（Ｃ）による置換（Ｋ２９０Ｃ）、および／またはヒトカッパ軽鎖定常領域中の１８３位（Ｋａｂａｔに従う）におけるリジン（Ｋ）の、反応性システイン（Ｃ）による置換（κＫ１８３Ｃ）を含み得る。

【0030】

フィブロネクチンのエクストラドメインＢ
本明細書で使用する場合、「ＥＤＢ＋ＦＮ」および「ＥＤＢ」は、相互交換可能に使用され、エクストラドメインＢ（ＥＤＢ）を含むフィブロネクチン（ＦＮ）を指す。さらに、「抗ＥＤＢ抗体」および「抗ＥＤＢ＋ＦＮ抗体」は、相互交換可能に使用され、ＥＤＢに結合する抗体を指す。「抗ＥＤＢ抗体−薬物コンジュゲート」、「ＥＤＢ抗体−薬物コンジュゲート」、「抗ＥＤＢ ＡＤＣ」、「ＥＤＢ ＡＤＣ」は、相互交換可能に使用され、ＥＤＢに結合し、薬物にコンジュゲートまたは連結された抗体またはその抗原結合性断片を含むＡＤＣを指す。ＦＮは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に存在する高分子量糖タンパク質であり、胚発生、創傷治癒、血液凝固、宿主防御および転移を含む、細胞接着および遊走プロセスに関与する。ＦＮは、典型的には、一対のジスルフィド結合によってそれらのＣ末端近傍で共有結合した２つのほぼ同一の約２５０ｋＤａのサブユニットによって形成されるダイマーとして存在する。各モノマーは、３つの型の反復単位：Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型ＦＮリピートからなる。単一の７５ｋｂ遺伝子がＦＮをコードするが、ヒトでは２０種のタンパク質バリアントが観察される。ＦＮ遺伝子の選択的スプライシングは、３つの領域で生じ、エクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）と呼ばれる２つのＩＩＩ型リピートのうちいずれか１つの、ならびにＩＩＩ型コネクティングセグメント（ＩＩＩＣＳ）と呼ばれる、２つの他のＩＩＩ型リピートを接続するセグメントの、内包または排除を生じる。ＥＤＢは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、カニクイザルおよびヒトにおいて１００％同一な、９１アミノ酸の配列である。代表的なＥＤＢ＋ＦＮヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１３０６１２９．１の下で提供され、対応するアミノ酸配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００１２９３０５８．１の下で提供される。ＥＤＢおよび組換えヒト７−ＥＤＢ−８−９のアミノ酸配列は、表１に提供される。組換えヒト７−ＥＤＢ−８−９は、ＥＤＢのアミノ末端でドメイン７（下線）が隣接し、カルボキシ末端にドメイン８（ボックス）およびドメイン９（イタリック）が隣接するＥＤＢを含む。

【0031】

【表1】

【0032】

抗ＥＤＢ抗体
本発明の抗体は、ＥＤＢに特異的に結合する。本発明のＡＤＣの調製のために、抗体またはその抗原結合性断片は、ＥＤＢに特異的に結合する任意の抗体（本明細書に記載される抗体を含む）またはその抗原結合性断片であり得る。この抗体またはその抗原結合性断片は、ＥＤＢ ＡＤＣの調製における使用のために、単離、精製または誘導体化され得る。

【0033】

本明細書で使用する場合、「抗体」または「Ａｂ」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、特異的標的または抗原、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどを認識しそれに結合することが可能な免疫グロブリン分子を指す。この用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、「抗原結合性断片」（または部分）、例えば、所与の抗原（例えば、ＥＤＢ）に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｃなど、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、それらの変異体、抗体またはその抗原結合性断片（例えば、ドメイン抗体）を有する融合タンパク質、単鎖（ＳｃＦｖ）および単一ドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ科動物抗体）、マキシボディ（maxibody）、ミニボディ（minibody）、イントラボディ（intrabody）、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（９）：１１２６〜１１３６を参照のこと）、ヒト化抗体、キメラ抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアントおよび共有結合的に改変された抗体を含む、必要とされる特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置が含まれるがこれらに限定されない、任意の型の抗体を包含し得る。これらの抗体は、マウス、ラット、ヒトまたは任意の他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であり得る。本発明の一部の態様では、開示されたＥＤＢ ＡＤＣの抗体またはその抗原結合性断片は、キメラ、ヒト化もしくは組換えヒト抗体、またはそれらのＥＤＢ結合性断片である。

【0034】

ネイティブまたは天然に存在する抗体およびネイティブ免疫グロブリンは、典型的には、２つの同一の軽鎖（ＬＣ）および２つの同一の重鎖（ＨＣ）から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質である。各重鎖は、「ＣＨドメイン」と呼ばれるいくつかの定常ドメインまたは領域（例えば、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）が後に続く可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）、および「ＣＬドメイン」と呼ばれる定常ドメインを有する。抗体の「定常領域」または「定常ドメイン」という用語は、単独または組み合わせてのいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。これらの定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与、オプソニン化、補体依存性細胞傷害の開始、およびマスト細胞脱顆粒を示す。ＥＤＢ抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、それらの任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのＩｇＧ）、ならびにそれらのサブクラスおよび変異バージョンのいずれか１つの定常領域に由来し得る。

【0035】

ＣＨ１ドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って約１１８〜２１５位に伸びる免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、免疫グロブリン重鎖分子のＶＨドメインに隣接し、ヒンジ領域に対してアミノ末端側にあり、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の一部を形成しない。

【0036】

ヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、およそ２５残基を含み、可撓性であり、従って、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン：上部、中部および下部ヒンジドメインへと下位分割され得る。

【0037】

ＣＨ２ドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って約２３１〜３４０位に伸びる、重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、もう１つのドメインと緊密に対形成しないという点で、独自である。むしろ、２つのＮ結合型分岐鎖炭水化物鎖が、インタクトなネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に置かれる。一部の態様では、本発明の抗体（またはその断片）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのＩｇＧ分子に由来するＣＨ２ドメインを含む。一部の態様では、このＩｇＧはヒトＩｇＧである。

【0038】

ＣＨ３ドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って約３４１〜４４７位に、ＣＨ２ドメインのＣ末端からおよそ１１０残基伸びる、重鎖免疫グロブリン分子の部分を含む。ＣＨ３ドメインは、典型的には、抗体のＣ末端部分を形成する。しかし、一部の免疫グロブリンでは、さらなるドメインが、分子のＣ末端部分を形成するように、ＣＨ３ドメインから伸び得る（例えば、ＩｇＭのμ鎖およびＩｇＥのε鎖におけるＣＨ４ドメイン）。一部の態様では、本発明の抗体（またはその断片）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４などのＩｇＧ分子に由来するＣＨ３ドメインを含む。一部の態様では、このＩｇＧはヒトＩｇＧである。

【0039】

ＣＬドメインは、例えば、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って約１０８〜２１４位に伸びる、免疫グロブリン軽鎖の定常領域ドメインを含む。ＣＬドメインは、ＶＬドメインに隣接する。一部の態様では、本発明の抗体（またはその断片）は、カッパ軽鎖定常ドメイン（ＣＬκ）を含む。一部の態様では、抗体（またはその断片）は、ラムダ軽鎖定常ドメイン（ＣＬλ）を含む。ＣＬκは、公知の多型遺伝子座ＣＬκ−Ｖ／Ａ４５およびＣＬκ−Ｌ／Ｖ８３（Ｋａｂａｔ番号付けを使用する）を有し、従って、多型Ｋｍ（１）：ＣＬκ−Ｖ４５／Ｌ８３；Ｋｍ（１，２）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｌ８３；およびＫｍ（３）：ＣＬκ−Ａ４５／Ｖ８３を可能にする。本発明のポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、これらの軽鎖定常領域のいずれかを有する抗体構成要素を有し得る。

【0040】

Ｆｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位におけるアミノ酸残基からまたはＰｒｏ２３０位から（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）、そのカルボキシル末端まで延びると定義される。Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１）。

【0041】

抗体の「可変領域」は、単独または組み合わせてのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当該分野で公知のように、重鎖および軽鎖の可変領域は各々、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって非常に近位にされ、他方の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。

【0042】

可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔら、１９９２、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＮＩＨ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７〜８８３、（１９８９））、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の集積、ＡｂＭ定義（Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標））を使用して導出される）、接触定義（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５、（１９９６）に示される、観察された抗原接触に基づく）および／もしくはコンフォメーション定義（Ｍａｋａｂｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６、２００８）、または当該分野で周知のＣＤＲ決定の任意の方法に従って定義され得る。本明細書で使用する場合、ＣＤＲとは、アプローチの組み合わせを含む、当該分野で公知の任意のアプローチによって定義されるＣＤＲを指し得る。本発明について、以下の表２に示されるＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義を使用して導出した。本発明の抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片は、１つまたは複数のＣＤＲ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てのＣＤＲ）を含む。

【0043】

標的または抗原（例えば、ＥＤＢタンパク質）に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書で相互交換可能に使用される）抗体、ＡＤＣまたはポリペプチドは、当該分野で十分に理解される用語であり、かかる特異的または優先的結合を決定するための方法もまた当該分野で周知である。分子は、代替的な細胞または物質との場合よりも、特定の細胞または物質と、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／またはより高い親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を示すと言われる。他の物質に結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、抗体は、標的または抗原に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ＥＤＢエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体は、他のＥＤＢエピトープまたは非ＥＤＢエピトープに結合するよりも、より高い親和性、結合力で、より容易に、および／またはより長い持続時間でこのエピトープを結合する抗体である。

【0044】

用語「結合親和性」または「Ｋ_Ｄ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を指す意図である。Ｋ_Ｄは、会合の速度、即ち、「オンレート（on-rate）」または「ｋ_ａ」に対する、「オフレート（off-rate）」または「ｋ_ｄ」とも呼ばれる解離の速度の比である。従って、Ｋ_Ｄは、ｋ_ｄ／ｋ_ａに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。Ｋ_Ｄが小さいほど、結合親和性が強いということになる。従って、１μＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して、弱い結合親和性を示す。抗体についてのＫ_Ｄ値は、当該分野で十分確立された方法を使用して決定され得る。抗体のＫ_Ｄを決定するための１つの方法は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを典型的には使用する、表面プラズモン共鳴を使用することによる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー分析を含む、標的に対する抗体などのリガンドの結合能を評価するための他の標準的なアッセイが、当該分野で公知である。

【0045】

「単離された抗体」とは、本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＥＤＢを特異的に結合する単離された抗体は、ＥＤＢ以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。この定義を読むことにより、例えば、第１の標的に特異的にまたは優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的にまたは優先的に結合してもしなくてもよいこともまた、理解される。

【0046】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、ヒトＥＤＢへの結合について、本明細書に記載される抗体もしくはその抗原結合性断片と競合する抗体、および／または本明細書に記載される抗体もしくはその抗原結合性断片と同じエピトープを結合する抗体を含む。

【0047】

抗体に関して、用語「競合する」は、本明細書で使用する場合、第１の抗体とその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に減少されるように、第１の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の結合と十分に類似の様式でエピトープに結合することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合もまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少される選択肢が当てはまり得るが、当てはまらなくてもよい。即ち、第１の抗体は、第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を第２の抗体が阻害することなしに、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害できる。しかし、各抗体がその同族エピトープまたはリガンドと他の抗体との結合を検出可能に阻害する場合、同じ程度までであれ、より高い程度までであれ、より低い程度までであれ、これらの抗体は、そのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合について、互いに「交差競合する」と言われる。競合する抗体および交差競合する抗体の両方が、本発明によって包含される。かかる競合または交差競合が生じる機構（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または共通のエピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書で提供される教示に基づいて、かかる競合する抗体および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書で開示される方法に有用であり得ることを理解する。

【0048】

本明細書で「ＥＤＢ−Ｌ１９」抗体とも呼ばれる「Ｌ１９」抗体は、ＥＤＢを結合するヒト抗体である。Ｌ１９抗体は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ１９９７／０４５５４４、ＷＯ１９９９／０５８５７０およびＷＯ２００１／０６２８００において開示および特徴付けられ、Ｌ１９−ＥＤＢ配列は、表２中に本明細書で提供される（配列番号１〜１６）。

【0049】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣを調製するために使用される抗体は、モノクローナル抗体であり得る。用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対して指向され、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるとして抗体の特徴を示すが、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈すべきではない。

【0050】

本発明の一部の態様では、本発明のＡＤＣを調製するために使用される抗体は、一価であり得る、即ち、１分子当たり１つの抗原結合部位を有し得る（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）。一部の例では、一価抗体は、１つよりも多い抗原結合部位を有し得るが、これらの結合部位は、異なる抗体由来である。本発明の一部の態様では、本発明のＡＤＣの抗体またはその抗原結合性断片は、「二価抗体」を含み得る、即ち、１分子当たり２つの抗原結合部位を有し得る（例えば、ＩｇＧ）。一部の例では、これら２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。あるいは、二価抗体は、二重特異性であり得る。「二重特異性（bispecific）」、「二重特異性（dual-specific）」または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体の２つの抗原結合部位は、同じまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。

【0051】

用語「キメラ抗体」は、可変領域配列の一部または全てが１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指す意図である。

【0052】

本明細書で使用する場合、「ヒト化」または「ＣＤＲ移植した」抗体とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２または他の抗原結合性サブ配列）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントの１つまたは複数のＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラットまたはウサギの１つまたは複数のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0053】

本発明の抗体は、当該分野で周知の技術、例えば、組換えテクノロジー、ファージディスプレイテクノロジー、合成テクノロジー、またはかかるテクノロジーもしくは当該分野で容易に公知の他のテクノロジーの組み合わせを使用して産生され得る（例えば、Ｊａｙａｓｅｎａ，Ｓ．Ｄ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４５：１６２８〜５０（１９９９）およびＦｅｌｌｏｕｓｅ，Ｆ．Ａ．ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．、３７３（４）：９２４〜４０（２００７）を参照のこと）。さらなるガイダンスは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９８）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）において見出され得る。

【0054】

本発明のＡＤＣを調製するために使用される抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、発現または拡大増殖のためにベクター中にクローニングされ得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中で維持され得、次いで、この宿主細胞は、さらなる使用のために、拡大および凍結され得る。細胞培養物における組換えモノクローナル抗体の産生は、当該分野で公知の手段により、Ｂ細胞からの抗体遺伝子のクローニングを通じて実施され得る。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９：１１２〜１２４、２００８；米国特許第７，３１４，６２２号を参照のこと。

【0055】

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、目的の１つまたは複数の遺伝または配列を送達すること、好ましくは宿主細胞中でそれらを発現させることが可能な構築物を指す。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核生物細胞、例えば、産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。

【0056】

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の組み込みのためのベクター（複数可）のレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親細胞と完全に同一（形態学において、またはゲノムＤＮＡ相補体において）である必要は必ずしもない。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。

【0057】

当該分野で公知のように、「ポリヌクレオチド」、「核酸／ヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で相互交換可能に使用され、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド、それらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に取り込まれ得る任意の基質の、ポリマー形態を含む。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を実行し得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成、組換え、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。

【0058】

本発明で議論される全ての重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、配列決定された最初のヒトｌｇＧ１である骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載するＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８〜８５に最初に記載されたＥｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎらのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａにも示されている。従って、「Ｋａｂａｔに示されるＥＵインデックス」または「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」とは、Ｋａｂａｔ １９９１に示されるような、ＥｄｅｌｍａｎらのヒトｌｇＧ１ Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。

【0059】

軽鎖定常領域アミノ酸配列に使用される番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ １９９１に示されるものである。

【0060】

本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、慣習的システインテクノロジーまたは部位特異的コンジュゲーションテクノロジーを使用して、薬物／ペイロードにコンジュゲートされ得る。操作されたシステインを介した部位特異的コンジュゲーションを受け入れるために、定常ドメインは、１つまたは複数の特異的部位において操作された反応性システイン残基を提供するように改変され得る（「Ｃｙｓ」変異体とも呼ばれる）。トランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションを介した部位特異的コンジュゲーションを受け入れるために、アシルドナーグルタミン含有（「Ｑ」）タグまたは内因性グルタミンは、トランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのポリペプチド操作によって、反応性にされる。

【0061】

本発明は、非免疫原性抗体の生成によるＬ１９−ＥＤＢ抗体の最適化を提供する。一部の態様では、３５６位におけるアスパラギン酸（Ｄ）および３５８位におけるロイシン（Ｌ）を有するＧ１ｍ（ａ）アロタイプを含むＬ１９−ＥＤＢヒトＩｇＧ１定常領域は、３５６位におけるグルタミン酸（Ｅ）および３５８位におけるメチオニン（Ｍ）を有する非Ｇ１ｍ（ａ）アロタイプで置換され得る（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従う）。

【0062】

さらに、潜在的な化学的傾向および推定タンパク質糖化部位を結合する抗原を低減させるために、本発明の抗ＥＤＢ抗体は、９４位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従う）におけるリジン（Ｋ）のアルギニン（Ｒ）への変異、例えば（Ｋ９４Ｒ）を含む重鎖可変領域を有し得る。

【0063】

操作されたシステインを介した部位特異的コンジュゲーションについて、抗ＥＤＢ抗体重鎖定常ドメインは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における反応性の操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含み得る。さらなるシステイン置換が導入され得る。別の態様では、抗ＥＤＢ抗体軽鎖定常ドメインは、Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における反応性の操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）を含み得る。さらなるシステイン置換が導入され得る。

【0064】

操作されたグルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションについて、抗ＥＤＢ抗体重鎖定常ドメインは、操作されたＨ１６−グルタミン含有タグＬＬＱＧ（配列番号４０）を含み得る。さらに、この部位特異的コンジュゲーションを最適化するために、重鎖上の２２２位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）におけるリジン（Ｋ）アミノ酸は、アルギニン（Ｒ）で置換され得る、例えば（Ｋ２２２Ｒ）。

【0065】

アミノ酸改変は、当該分野で公知の任意の方法によって行われ得、多くのかかる方法、例えば、変異、置換、欠失および／または付加は、当業者にとって周知であり、慣用的である。例えば、限定としてではなく、アミノ酸置換、欠失および挿入は、任意の周知のＰＣＲベースの技術を使用して達成され得る。アミノ酸置換は、部位特異的変異誘発によって行われ得る（例えば、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００；ならびにＫｕｎｋｅｌ、１９８５、ＰＮＡＳ ８２：４８８を参照のこと）。

【0066】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、本明細書で開示される重鎖または軽鎖のいずれかに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖を有する抗体またはその抗原結合性断片を含む。変更された残基は、抗体の可変領域中または定常領域中に存在し得る。一部の態様では、１、２、３、４または５つ以下の残基が、本明細書で開示される重鎖または軽鎖のいずれかと比較して変更されている。

【0067】

用語「パーセント同一」は、アミノ酸配列に関して、最大の対応のためにアラインさせた場合に同じである、２つの配列中の残基の数を意味する。アミノ酸パーセント同一性を測定するために使用され得る、当該分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する（即ち、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ即ちＢＬＡＳＴ（登録商標））。特記しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターが使用される。

【0068】

ＥＤＢ ＡＤＣの調製における使用のために、本明細書に記載される抗体は、実質的に純粋、即ち、少なくとも５０％純粋（即ち、汚染物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋であり得る。

【0069】

表２および３は、本発明の抗ＥＤＢ抗体のアミノ酸（タンパク質）配列および関連する核酸（ＤＮＡ）配列を提供する。ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによって定義されたとおりである。影付きの残基は、抗体最適化に関連するアミノ酸変異、置換および／または挿入を特定し、下線付きの残基は、部位特異的コンジュゲーションテクノロジーに関連するアミノ酸変異、置換および／または挿入を特定する。

【0070】

【表2-1】

【0071】

【表2-2】

【0072】

【表2-3】

【0073】

【表2-4】

【0074】

【表2-5】

【0075】

【表2-6】

【0076】

【表2-7】

【0077】

【表2-8】

【0078】

【表2-9】

【0079】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、フィブロネクチン（ＦＮ）のエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。

【0080】

本発明の一部の態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、このＶＨは、配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを有する。本発明の一部の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、このＶＬは、配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを有する。抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３、５および７を含む３つのＣＤＲを有するＶＨ；ならびに配列番号１２、１３および１４を含む３つのＣＤＲを有するＶＬを有し得る。

【0081】

別の態様では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５のＶＨ ＣＤＲ２および配列番号７のＶＨ ＣＤＲ３（Ｋａｂａｔに従う）、または配列番号４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号６のＶＨ ＣＤＲ２および配列番号７のＶＨ ＣＤＲ３（Ｃｈｏｔｈｉａに従う）、または配列番号３もしくは４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５もしくは６のＶＨ ＣＤＲ２および配列番号７のＶＨ ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を有し得る。別の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ３（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａに従う）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し得る。さらなる態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号３または４のＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５または６のＶＨ ＣＤＲ２および配列番号７のＶＨ ＣＤＲ３ならびに配列番号１２のＶＬ ＣＤＲ１、配列番号１３のＶＬ ＣＤＲ２および配列番号１４のＶＬ ＣＤＲ３を有し得る。

【0082】

本発明の一部の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１もしくは２１を含む重鎖可変領域および／または配列番号１０を含む軽鎖可変領域を有し得る。抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号２１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号１０に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；配列番号１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域；または配列番号２１を含む重鎖可変領域および配列番号１０を含む軽鎖可変領域を含み得る。

【0083】

本発明の別の態様では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８、１７、１９、２３、２５、２７および２９のいずれか１つを含む重鎖ならびに／または配列番号１５または３１を含む軽鎖を有し得る。

【0084】

本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号８に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号１７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号１７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号１９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号１９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；配列番号２７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号３１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖；または配列番号２９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号１５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖を含み得る。

【0085】

本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号８を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号８を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；または配列番号２９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖を含み得る。

【0086】

抗ＥＤＢ抗体重鎖および軽鎖可変領域をコードする代表的なＤＮＡは、それぞれ、配列番号２および２２ならびに配列番号１１を含む。抗ＥＤＢ抗体重鎖および軽鎖をコードする代表的なＤＮＡは、それぞれ、配列番号９、１８、２０、２４、２６、２８および３０、ならびに配列番号１６および３２を含む。

【0087】

【表3】

【0088】

薬物
開示されたＥＤＢ ＡＤＣの調製において有用な薬物には、生物学的または検出可能な活性を有する任意の物質、例えば、治療剤、検出可能な標識、結合剤など、およびｉｎ ｖｉｖｏで活性な薬剤へと代謝されるプロドラッグが含まれる。薬物は、薬物誘導体であってもよく、このとき、薬物は、本発明の抗体とのコンジュゲーションを可能にするように官能化されている。

【0089】

治療剤は、がん細胞または活性化された免疫細胞に対して細胞傷害、細胞分裂停止および／または免疫調節効果を発揮する薬剤である。治療剤の例には、細胞傷害剤、化学療法剤、細胞分裂停止剤および免疫調節剤が含まれる。細胞傷害効果とは、標的細胞（複数可）の枯渇、排除および／または死滅を指す。細胞傷害剤とは、細胞に対する細胞傷害および／または細胞分裂停止効果を有する薬剤を指す。細胞分裂停止効果とは、細胞増殖の阻害を指す。細胞分裂停止剤とは、細胞に対する細胞分裂停止効果を有し、それによって、細胞の特定のサブセットの成長および／または拡大を阻害する薬剤を指す。化学療法剤とは、がんの処置において有用な化学化合物である薬剤を指す。免疫調節剤とは、直接的に、または別の薬剤をより効果的にすることによって間接的にのいずれかで、サイトカインおよび／もしくは抗体の産生、ならびに／またはＴ細胞機能の改変を介して免疫応答を刺激し、それによって、細胞（即ち、腫瘍細胞）のサブセットの成長を阻害または低減させる薬剤を指す。

【0090】

一部の態様では、この薬物は、膜透過性薬物である。かかる態様では、ペイロードは、バイスタンダー効果を誘発し得、このとき、ＥＤＢ＋ＦＮを発現しないまたはそれらの表面に結合したＥＤＢ＋ＦＮを有さない場合があるが、ＡＤＣによって結合される細胞を取り囲む細胞は、細胞透過性ペイロードによって死滅される。これは、ペイロードが抗体から（即ち、切断可能なリンカーの切断によって）放出され、細胞膜を横切り、拡散に際して周囲の細胞の死滅を誘導する場合に生じる。

【0091】

開示された方法によれば、（ａ）ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を有するＥＤＢ ＡＤＣが、産生または生成され得る。薬物対抗体比（ＤＡＲ）または薬物負荷は、抗体１つ当たりのコンジュゲートされた薬物分子の数を示す。複数のＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、種々の慣習的手段、例えば、ＵＶ分光測定、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣによって決定され得る。

【0092】

本発明の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、１のＤＡＲ、２のＤＡＲ、３のＤＡＲ、４のＤＡＲ、５のＤＡＲ、６のＤＡＲ、７のＤＡＲ、８のＤＡＲ、９のＤＡＲ、１０のＤＡＲ、１１のＤＡＲ、１２のＤＡＲ、または１２よりも大きいＤＡＲを有し得る。本発明の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、１個の薬物分子、または２個の薬物分子、または３個の薬物分子、または４個の薬物分子、または５個の薬物分子、または６個の薬物分子、または７個の薬物分子、または８個の薬物分子、または９個の薬物分子、または１０個の薬物分子、または１１個の薬物分子、または１２個の薬物分子、または１２個よりも多い分子を有し得る。

【0093】

本発明の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、約２〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約６の範囲の平均ＤＡＲ、または約５〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約６〜約８の範囲の平均ＤＡＲ、または約７〜約９の範囲の平均ＤＡＲ、または約８〜約１０の範囲の平均ＤＡＲ、または約９〜約１１の範囲の平均ＤＡＲ、または約１０〜約１２の範囲の平均ＤＡＲなどを有し得る。一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約１の平均ＤＡＲ、または約２の平均ＤＡＲ、約３の平均ＤＡＲ、または約４の平均ＤＡＲ、または約５の平均ＤＡＲ、または約６の平均ＤＡＲ、または約７の平均ＤＡＲ、または約８の平均ＤＡＲ、または約９の平均ＤＡＲ、または約１０の平均ＤＡＲ、または約１１の平均ＤＡＲ、または約１２の平均ＤＡＲ、または１２よりも大きい平均ＤＡＲを有し得る。平均ＤＡＲの上述の範囲において使用する場合、用語「約」は、＋／−０．５％を意味する。

【0094】

ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば、約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、約３〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。さらに、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば、３〜５の範囲の平均ＤＡＲ、３〜４の範囲の平均ＤＡＲ、または４〜５の範囲の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0095】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約１．０の平均ＤＡＲ、または１．０の平均ＤＡＲ、または１．１の平均ＤＡＲ、または１．２の平均ＤＡＲ、または１．３の平均ＤＡＲ、または１．４の平均ＤＡＲ、または１．５の平均ＤＡＲ、または１．６の平均ＤＡＲ、または１．７の平均ＤＡＲ、または１．８の平均ＤＡＲ、または１．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約２．０の平均ＤＡＲ、または２．０の平均ＤＡＲ、または２．１の平均ＤＡＲ、または２．２の平均ＤＡＲ、または２．３の平均ＤＡＲ、または２．４の平均ＤＡＲ、または２．５の平均ＤＡＲ、または２．６の平均ＤＡＲ、または２．７の平均ＤＡＲ、または２．８の平均ＤＡＲ、または２．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約３．０の平均ＤＡＲ、または３．０の平均ＤＡＲ、または３．１の平均ＤＡＲ、または３．２の平均ＤＡＲ、または３．３の平均ＤＡＲ、または３．４の平均ＤＡＲ、または３．５の平均ＤＡＲ、または３．６の平均ＤＡＲ、または３．７の平均ＤＡＲ、または３．８の平均ＤＡＲ、または３．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約４．０の平均ＤＡＲ、または４．０の平均ＤＡＲ、または４．１の平均ＤＡＲ、または４．２の平均ＤＡＲ、または４．３の平均ＤＡＲ、または４．４の平均ＤＡＲ、または４．５の平均ＤＡＲ、または４．６の平均ＤＡＲ、または４．７の平均ＤＡＲ、または４．８の平均ＤＡＲ、または４．９の平均ＤＡＲ、または５．０の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0096】

別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、１２以下の平均ＤＡＲ、１１以下の平均ＤＡＲ、１０以下の平均ＤＡＲ、９以下の平均ＤＡＲ、８以下の平均ＤＡＲ、７以下の平均ＤＡＲ、６以下の平均ＤＡＲ、５以下の平均ＤＡＲ、４以下の平均ＤＡＲ、３以下の平均ＤＡＲ、２以下の平均ＤＡＲ、または１以下の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0097】

他の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、１１．５以下の平均ＤＡＲ、１０．５以下の平均ＤＡＲ、９．５以下の平均ＤＡＲ、８．５以下の平均ＤＡＲ、７．５以下の平均ＤＡＲ、６．５以下の平均ＤＡＲ、５．５以下の平均ＤＡＲ、４．５以下の平均ＤＡＲ、３．５以下の平均ＤＡＲ、２．５以下の平均ＤＡＲ、１．５以下の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0098】

本発明の一部の態様では、本明細書で開示されるシステイン残基を介した慣習的コンジュゲーションのための方法および精製条件は、約３〜５の範囲の、好ましくは約４の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0099】

本発明の一部の態様では、本明細書で開示される操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのための方法および精製条件は、約３〜５の範囲の、好ましくは約４の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0100】

本発明の一部の態様では、本明細書で開示されるトランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションを介した部位特異的コンジュゲーションのための方法および精製条件は、約１〜３の範囲の、好ましくは約２の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＥＤＢ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0101】

細胞傷害剤の例には、アントラサイクリン、アウリスタチン、ＣＣ−１０６５、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、マイタンシン、ピューロマイシン、タキサン、ビンカアルカロイド、ＳＮ−３８、チューブリシン（tubulysin）、ヘミアステリン、およびそれらの立体異性体、アイソスター、アナログまたは誘導体が含まれるがこれらに限定されない。植物毒素、他の生理活性タンパク質、酵素（即ち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光感受性物質（即ち、光線力学的治療のため）もまた使用され得る。

【0102】

アントラサイクリンは、細菌ストレプトマイセスに由来し、広範ながん、例えば、白血病、リンパ腫、乳、子宮、卵巣および肺がんを処置するために使用されてきた。例示的なアントラサイクリンには、ダウノルビシン、ドキソルビシン（即ち、アドリアマイシン）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシンおよびミトキサントロンが含まれるがこれらに限定されない。

【0103】

ドラスタチンならびにそれらのペプチド性アナログおよび誘導体であるアウリスタチンは、抗がんおよび抗真菌活性を有することが示されている、高度に強力な抗有糸分裂剤である。例えば、米国特許第５，６６３，１４９号およびＰｅｔｔｉｔら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１〜２９６５、（１９９８）を参照のこと。例示的なドラスタチンおよびアウリスタチンには、ドラスタチン１０、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、ＭＭＡＤ（モノメチルアウリスタチンＤまたはモノメチルドラスタチン１０）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−フェニルアラニン）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥまたはＮ−メチルバリン−バリン−ドライソロイシン−ドラプロリン−ノルエフェドリン）、５−ベンゾイル吉草酸−ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）および他の新規物質が含まれるがこれらに限定されない。

【0104】

一部の態様では、薬物／ペイロードは、アウリスタチンである。アウリスタチンは、チューブリン重合の阻害を介して有糸分裂の間に微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０７２８１３は、本発明のＥＤＢ ＡＤＣにおいて有用なアウリスタチンを開示し、アウリスタチンを産生する方法を提供する。例えば、構造：

【0105】

【化1】

を有するペイロード０１０１、構造：

【0106】

【化2】

を有するペイロード１５６９、構造：

【0107】

【化3】

を有するペイロード９４１１、構造：

【0108】

【化4】

を有するペイロード４５７４、構造：

【0109】

【化5】

を有するペイロードＤＭ１および構造：

【0110】

【化6】

を有するペイロードセマドチン。

【0111】

デュオカルマイシンおよびＣＣ−１０６５は、細胞傷害効力を有するＤＮＡアルキル化剤として作用するＣＰＩベースのモノマーである。ＢｏｇｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、ＰＮＡＳ ９２：３６４２〜３６４９、１９９５を参照のこと。例示的なドラスタチンには、（＋）−デュオカルマイシンＡおよび（＋）−デュオカルマイシンＳＡ、ならびに（＋）−ＣＣ−１０６５が含まれるがこれらに限定されない。

【0112】

一部の態様では、薬物／ペイロードは、ＣＰＩまたはＣＢＩダイマーである。ＣＰＩダイマーは、鎖間ＤＮＡ架橋および強力な細胞傷害性を誘導する。その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１５／１１０９３５は、本発明のＥＤＢ ＡＤＣにおいて有用なＣＰＩおよびＣＢＩダイマーを開示し、ＣＰＩおよびＣＢＩダイマーを産生する方法を提供する。例えば、構造：

【0113】

【化7】

を有するペイロードＣＰＩ−８３１４ダイマーおよび構造：

【0114】

【化8】

を有するペイロードＣＰＩ−０３２６。

【0115】

エンジインは、９員および１０員環、またはコンジュゲートされた三重−二重−三重結合の環系の存在のいずれかを特徴とする抗腫瘍細菌産物のクラスである。例示的なエンジインには、カリチアマイシン、エスペラミシンおよびダイネミシン（dynemicin）が含まれるがこれらに限定されない。ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体とも呼ばれるカリチアマイシン、例えば、β−カリチアマイシン、γ−カリチアマイシンまたはＮ−アセチル−γ−カリチアマイシン（ガンマ−カリチアマイシン（γ_１））は、土壌生物ミクロモノスポラ・エキノスポラ種カリケンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ ｓｓｐ．ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓ）由来の天然産物として元々単離されたエンジイン抗生物質である（Ｚｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７；２４０（４８５６）：１１９８〜１２０１、１９８８）；これは、標的細胞において二本鎖ＤＮＡ切断を生成し、アポトーシスを引き続いて誘導する（Ｚｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７；２４０（４８５６）：１１９８〜１２０１、１９８８；Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．９月；１（１）：５７〜６６、１９９４；Ｐｒｏｋｏｐら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：９１０７〜９１２０、２００３）。ジスルフィドアナログは、Ｎ−アセチル−γ−カリチアマイシンジメチルヒドラジドである。

【0116】

ゲルダナマイシンは、Ｈｓｐ９０（ヒートショックタンパク質９０）に結合するベンゾキノンアンサマイシン抗生物質であり、抗腫瘍薬物として使用されてきた。例示的なゲルダナマイシンには、１７−ＡＡＧ（１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）および１７−ＤＭＡＧ（１７−ジメチルアミノエチルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）が含まれるがこれらに限定されない。

【0117】

マイタンシンまたはそれらの誘導体であるマイタンシノイドは、チューブリンの重合の阻害を介して有糸分裂の間に微小管形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜１００５、１９７５を参照のこと。例示的なマイタンシンおよびマイタンシノイドには、メルタンシン（ＤＭ１）およびその誘導体、ならびにアンサマイトシン（ansamitocin）が含まれるがこれらに限定されない。

【0118】

タキサンは、抗チューブリン剤または有糸分裂阻害剤として作用するジテルペンである。例示的なタキサンには、パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））が含まれるがこれらに限定されない。

【0119】

ビンカアルカロイドもまた、抗チューブリン剤である。例示的なビンカアルカロイドには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンが含まれるがこれらに限定されない。

【0120】

本発明の一部の態様では、この薬剤は、免疫調節剤である。免疫調節剤の例には、ガンシクロビル、エタネルセプト、タクロリムス、シロリムス、ボクロスポリン、シクロスポリン、ラパマイシン、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート、グルココルチコイドおよびそのアナログ、サイトカイン、キサンチン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、造血因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と称される幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチン、またはそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。

【0121】

本発明において有用な免疫調節剤には、腫瘍に対するホルモン作用を遮断する抗ホルモン薬、およびサイトカイン産生を抑制し、自己抗原発現を下方調節し、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤もまた含まれる。代表的な抗ホルモン薬には、例えばタモキシフェンを含む抗エストロゲン薬、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ １１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン；ならびに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；ならびに抗副腎剤が含まれる。代表的な免疫抑制剤には、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド、例えば、グルココルチコステロイド、サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト（例えば、抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、ならびにＴ細胞受容体抗体が含まれる。

【0122】

本発明の一部の態様では、この薬物は、毒素、ホルモン、酵素および増殖因子が含まれるがこれらに限定されない治療的タンパク質である。

【0123】

毒素タンパク質（またはポリペプチド）の例には、ジフテリア（例えば、ジフテリアＡ鎖）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素および内毒素、リシン（例えば、リシンＡ鎖）、アブリン（例えば、アブリンＡ鎖）、モデシン（modeccin）（例えば、モデシンＡ鎖）、アルファ−サルシン（sarcin）、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サボンソウ阻害剤、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、トリコテシン、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ペプチド（例えば、セラトトキシン（ceratotoxin））およびコノトキシン（例えば、ＫＩＩＩＡまたはＳｍＩＩＩａ）が含まれるがこれらに限定されない。

【0124】

ホルモンの例には、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチンおよびコルチコステロイドが含まれるがこれらに限定されない。

【0125】

本発明の一部の態様では、この薬物は、オリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。

【0126】

本発明において有用なさらなる薬物には、血管形成を阻害する抗血管新生剤、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（例えば、２−メトキシエストラジオールビス−スルファメート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジン（metallospondin）タンパク質、クラスＩインターフェロン、インターロイキン１２、プロタミン、アンジオスタチン、ラミニン、エンドスタチンおよびプロラクチン断片が含まれる。

【0127】

抗増殖剤およびアポトーシス促進剤には、ＰＰＡＲ−ガンマの活性化因子（例えば、シクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧ））、レチノイド、トリテルペノイド（例えば、シクロアルタン（cycloartane）、ルパン（lupane）、ウルサン（ursane）、オレアナン、フリエデラン（friedelane）、ダンマラン、ククルビタシンおよびリモノイドトリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体の（例えば、ＨＥＲ４）阻害剤、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（登録商標）（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレーター（例えば、３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ））、アポプチン（apoptin）（ニワトリ貧血ウイルス由来のウイルスタンパク質３−ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナル伝達の活性化因子、ならびにＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナル伝達の阻害剤（例えば、ＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）が含まれる。

【0128】

代表的な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドパ（meturedopa）およびウレドパ（uredopa）；エチレンイミン、ならびにアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むメチルメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリチアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン（denopterin）、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＥＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン（calusterone）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトレキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジコン（diaziquone）；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム（spirogermanium）；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；ならびにカペシタビンが含まれる。

【0129】

本発明に従って使用され得るさらなる治療剤には、光線力学的治療のための感光剤、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００２０１９７２６２号および米国特許第５，９５２，３２９号；温熱療法のための磁性粒子、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００３２９９５号；結合剤、例えば、ペプチド、リガンド、細胞接着リガンドなど、ならびにより高活性の細胞傷害性遊離薬物へと変換され得るプロドラッグ、例えば、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。

【0130】

抗ＥＤＢ抗体を使用する診断方法について、薬物には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＥＤＢ＋ＦＮ発現性ＥＣＭまたは細胞の存在について検出するために使用される検出可能な標識が含まれ得る。ｉｎ ｖｉｖｏで検出可能な放射性同位体、例えば、シンチグラフィー、磁気共鳴画像化または超音波を使用して検出可能な標識が、臨床診断適用において使用され得る。有用なシンチグラフィー標識には、ポジトロン放射体およびγ−放射体が含まれる。磁場源画像化のための代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤である。超音波検出のために、気体または液体は、マイクロバブル造影剤として放出される多孔性無機粒子中に捕捉され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ検出のために、有用な検出可能な標識には、フルオロフォア、検出可能なエピトープまたは結合剤、および放射活性標識が含まれる。

【0131】

従って、本発明の一部の態様では、この薬物は、画像化剤（例えば、フルオロフォアまたはＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）標識、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影）標識）、またはＭＲＩ（磁気共鳴画像化）標識である。

【0132】

用語「標識」とは、本明細書で使用する場合、「標識された」抗体を生成するように抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）または、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物または組成物の化学的変更を触媒し得る。検出可能な標識として機能し得る放射性核種には、例えば、Ｉ−１３１、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｒｅ−１８６、Ａｔ−２１１、Ｃｕ−６７、Ｂｉ−２１２およびＰｄ−１０９が含まれる。標識はまた、毒素などの非検出可能な実体であり得る。

【0133】

フルオロフォアの例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（例えば、５−ＦＩＴＣ）、フルオレセインアミダイト（fluorescein amidite）（ＦＡＭ）（例えば、５−ＦＡＭ）、エオシン、カルボキシフルオレセイン、エリスロシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（例えば、Ａｌｅｘａ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００または７５０）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（例えば、５，−ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）およびスルホローダミン（ＳＲ）（例えば、ＳＲ１０１）が含まれるがこれらに限定されない。

【0134】

治療的または診断的放射性同位体または他の標識（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ標識）も、本明細書に記載される抗ＥＤＢ抗体へのコンジュゲーションのために、薬剤中に組み込むことができる。同位体は、例えば、抗体中に存在するシステイン残基において、抗体に直接結合され得、またはキレーターが、抗体と放射性同位体との結合を媒介するために使用され得る。放射線療法に適切な放射性同位体には、α−放射体、β−放射体およびオージェ電子が含まれるがこれらに限定されない。診断適用のために、有用な放射性同位体には、ポジトロン放射体およびγ−放射体が含まれる。本発明の抗ＥＤＢ抗体は、抗体の検出または治療効果を促進するために、例えば、抗体のチロシン残基上でさらにヨウ素化され得る。

【0135】

放射性同位体または他の標識の例には、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１５Ｏ、^３５Ｓ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇａ、^７５Ｓｅ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９４Ｔｃ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^９９Ｔｃ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^１０９Ｐｄ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１２１Ｔｅ、^１２２Ｔｅ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１２５Ｔｅ、^１２６Ｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^１３３Ｉ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１５３Ｐｂ、^１５３Ｓｍ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｔｍ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１６９Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８９Ｒｅ、^１９７Ｐｔ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｈｇ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^２１２Ｐｂ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２４Ａｃおよび^２２５Ａｃが含まれるがこれらに限定されない。

【0136】

リンカー
本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、薬物を抗体に直接的または間接的に連結またはコンジュゲートするためにリンカーを使用して調製され得る。リンカーは、ＡＤＣを形成するために薬物と抗体とを連結する二機能性化合物である。かかるＡＤＣは、特異的抗原またはタンパク質に結合する抗体を介した薬物の選択的送達を可能にする。適切なリンカーには、例えば、切断可能なおよび切断不能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは、典型的には、特定の細胞内および細胞外条件による薬物の切断および放出に対して感受性である。コンジュゲートされた薬物が細胞内で抗体から切断され得る主要な機構には、リソソームの酸性ｐＨにおける加水分解（ヒドラゾン、アセタールおよびシス−アコニタート様アミド）、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元が含まれる。コンジュゲートされた薬物は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において、カテプシンなどのプロテアーゼによって抗体から細胞外で切断され得る。切断のためのこれらの異なる機構の結果として、薬物を抗体に連結する機構も広く変動し、任意の適切なリンカーが使用され得る。

【0137】

適切なリンカーには、任意の切断可能なリンカーが含まれ得る。一部の態様では、適切なリンカーは、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）リンカー、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカーもしくはマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーを含み、またはトランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションテクノロジーに適切な、さらなる犠牲（immolation）要素に結合したジペプチド、例えば、Ｎ〜２〜−アセチル−Ｌ−リジル−Ｌ−バリル−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチル−ＣＯ−（ＡｃＬｙｓ−ｖｃ）リンカーを含む。別の態様では、適切なリンカーには、ジスルフィドリンカー、例えば、スルファニルピリジン（ｄｉＳ）リンカーおよび２−（ピリジン−２−イルジスルファニル）エチルカルバモイル（ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯ）リンカーが含まれる。別の態様では、このリンカーは、切断不能なリンカー、例えば、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミド−ヘプタノイル（ｍｅ）およびマレイミド−Ｐｅｇ６Ｃ２（ＭａｌＰｅｇ６Ｃ２）であり得る。他の態様では、適切なリンカーには、特定のｐＨまたはｐＨ範囲において加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが含まれる。

【0138】

このリンカーは、例えば、リンカー上に存在するマレイミドまたはハロアセトアミドと、抗体上に存在するネイティブまたは操作されたシステイン残基との反応によって、チオエステル連結を介して抗体に共有結合され得る。別の態様では、このリンカーは、例えば、リンカー上に存在するＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド活性化カルボン酸と、リジン残基の遊離アミンとの反応によって、抗体上に存在するリジン残基へのアミド連結を介して、抗体に共有結合され得る。別の態様では、このリンカーは、例えば、グルタミン残基の側鎖アミドとの、リンカー上に存在する一級アミンからの新たなアミド連結を創出するトランスグルタミナーゼ酵素によって触媒される酵素反応によって、抗体中に存在するまたは抗体中に操作されたグルタミン残基の側鎖へのアミド連結を介して、抗体に共有結合され得る。

【0139】

一部の態様では、本発明のリンカーには、構造：

【0140】

【化9】

を有する「ｍｃ−ｖｃ−ＰＡＢＣ」または「ｖｃ−ＰＡＢＣ」または「ｖｃ」リンカー、構造：

【0141】

【化10】

を有する「ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＰＡＢＣ−ＤＭＡＥ−ＣＯ」または「ＡｃＬｙｓ−ｖｃ」リンカー、構造：

【0142】

【化11】

を有するｄｉＳリンカーおよび構造：

【0143】

【化12】

を有するｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯリンカーが含まれる。

【0144】

ＥＤＢ ＡＤＣを調製する方法
本発明のＥＤＢ ＡＤＣを調製するための方法が、本明細書で提供される。本発明は、本明細書で開示される慣習的におよび部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ ＡＤＣを産生または生成するためのプロセスをさらに提供し、（ａ）リンカーを薬物に連結させるステップ；（ｂ）リンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートするステップ；および（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製するステップを含み得る。実施例３および４を参照のこと。

【0145】

一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片の１つまたは複数のシステイン残基を介したリンカー−ペイロード部分の慣習的な非特異的コンジュゲーションを使用して、生成され得る。

【0146】

別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、抗ＥＤＢ抗体定常ドメイン中に操作された１つまたは複数の反応性システイン残基を介したリンカー−ペイロード部分の部位特異的コンジュゲーションを使用して、生成され得る。操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのために抗体を調製する方法は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９に記載されている。

【0147】

抗ＥＤＢ抗体重鎖の１つまたは複数のアミノ酸残基は、薬物またはペイロードへのコンジュゲーションを目的として、システイン残基などの別のアミノ酸に置換され得る。一態様では、本発明は、以下の位置における操作されたシステイン残基を含む抗体重鎖定常領域を含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する：ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、１１８（Ｋａｂａｔに従えば１１４）、２４６、２４９、２６５、２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９０、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３２７、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３もしくは４４４、またはそれらの任意の組み合わせ。特に、１１８（Ｋａｂａｔに従えば１１４）、２９０、３３４、３４７、３７３、３７５、３８０、３８８、３９２、４２１、４４３位、またはそれらの任意の組み合わせが使用され得る。さらなるシステイン置換が導入され得る。

【0148】

別の態様では、本発明は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスの番号付けに従って、２９０位における操作されたシステイン残基（Ｋ２９０Ｃ）を含む重鎖定常ドメインを含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

【0149】

抗ＥＤＢ抗体軽鎖定常ドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基は、薬物またはペイロードへのコンジュゲーションを目的として、システイン残基などの別のアミノ酸に置換され得る。一態様では、本発明は、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０、１１１、１２５、１４９、１５５、１５８、１６１、１８３、１８５、１８８、１８９、１９１、１９７、２０５、２０７、２０８もしくは２１０位、またはそれらの任意の組み合わせにおける操作されたシステイン残基；（ｉｉ）定常ドメインを配列番号３７（カッパ軽鎖）とアラインさせた場合、配列番号３７の残基４、４２、８１、１００、１０３、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置における操作されたシステイン残基；または（ｉｉｉ）定常ドメインを配列番号３８（ラムダ軽鎖）とアラインさせた場合、配列番号３８の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、またはそれらの任意の組み合わせに対応する位置における操作されたシステイン残基を含む抗体軽鎖定常領域を含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。さらなるシステイン置換が導入され得る。

【0150】

別の態様では、本発明は、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１１、１４９、１８８、２０７、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１１もしくは２１０）における操作されたシステイン残基；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号３７とアラインさせた場合、配列番号３７の残基４、４２、８１、１００、１０３、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４もしくは１０３）に対応する位置における操作されたシステイン残基を含む抗体カッパ軽鎖定常領域を含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

【0151】

別の態様では、本発明は、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１１０、１１１、１２５、１４９、１５５、１５８、１６１、１８５、１８８、１８９、１９１、１９７、２０５、２０６、２０７、２０８、２１０位、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは１１０、１１１、１２５、１４９もしくは１５５）における操作されたシステイン残基；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号３８とアラインさせた場合、配列番号３８の残基４、５、１９、４３、４９、５２、５５、７８、８１、８２、８４、９０、９６、９７、９８、９９、１０１、もしくはそれらの任意の組み合わせ（好ましくは残基４、５、１９、４３もしくは４９）に対応する位置における操作されたシステイン残基を含む抗体ラムダ軽鎖定常領域を含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

【0152】

別の態様では、本発明は、（ｉ）Ｋａｂａｔの番号付けに従って、１８３位における操作されたシステイン残基（κＫ１８３Ｃ）；または（ｉｉ）定常ドメインを配列番号３７とアラインさせた場合、配列番号３７の残基７６に対応する位置における操作されたシステイン残基を含む軽鎖定常ドメインを含む抗ＥＤＢ抗体またはその抗原結合性断片を提供する。

【0153】

配列番号３７（Ｃκ定常ドメイン）
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号３８（Ｃλ定常ドメイン）
ＧＱＰＫＡＮＰＴＶＴ ＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱ ＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩ ＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶ ＡＷＫＡＤＧＳＰＶＫ ＡＧＶＥＴＴＫＰＳＫ ＱＳＮＮＫＹＡＡＳＳ ＹＬＳＬＴＰＥＱＷＫ ＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴ ＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶ ＡＰＴＥＣＳ

【0154】

別の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、抗ＥＤＢ抗体定常領域中の、１つもしくは複数の操作されたアシルドナーグルタミン含有タグ、または反応性にされた内因性グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションテクノロジーを使用して生成され得る。アシルドナーグルタミン含有タグまたはグルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのために抗体を調製する方法は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０５９８８２に記載されている。

【0155】

一部の態様では、このアシルドナーグルタミン含有タグは、少なくとも１つのグルタミン（Ｑ）を含み、重鎖および／または軽鎖の異なる位置（即ち、Ｎ末端、Ｃ末端または内部）に結合され得る。別の態様では、このアシルドナーグルタミン含有タグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号３９）、ＬＬＱＧ（配列番号４０）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号４１）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４２）、ＧＬＬＱＧ（配列番号４３）、ＬＬＱ、ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号４４）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号４５）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号４６）、ＧＬＬＱ（配列番号４７）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号４８）、ＬＬＱＧＡ（配列番号４９）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号５０）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号５１）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号５２）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号５３）、ＳＬＬＱＧ（配列番号５４）、ＬＬＱＬＱ（配列番号５５）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号５６）およびＬＬＱＧＲ（配列番号５７）から選択されるアミノ酸配列を含み得る。一部の態様では、アシルドナーグルタミン含有タグは、重鎖定常ドメイン中の野生型アミノ酸位置を置き換える。一部の態様では、抗ＥＤＢ抗体は、重鎖のＥ２９４〜Ｎ２９７位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）におけるアミノ酸を置き換える、アミノ酸配列ＬＬＱＧ（配列番号４０）を有するアシルグルタミン含有タグを含み得る。

【0156】

ＡＤＣの生成のための最適な反応条件は、反応変数、例えば、温度、ｐＨ、リンカー−ペイロード部分投入量および添加剤濃度の変動によって経験的に決定され得る。他の薬物のコンジュゲーションに適切な条件は、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。ＥＤＢ ＡＤＣをコンジュゲートおよび特徴付けるための代表的な方法は、実施例３および４に記載されている。

【0157】

コンジュゲーション後、それらのコンジュゲートは、慣習的な方法によって、コンジュゲートされていない反応物および／または凝集形態のコンジュゲートから分離され得、精製され得、特徴付けられ得る。これには、例えば、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、クロマトフォーカシング（ＣＦ）、部位特異的変異誘発、蛍光標識、Ｘ線結晶解析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグラフィーまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であるがこれらに限定されないプロセスが含まれる。適切なＨＩＣ媒体には、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ ＨＩＣ媒体が含まれるがこれらに限定されない。

【0158】

表１３は、本明細書に記載されるコンジュゲーションおよび精製方法に従って産生され、実施例で提供されるデータを生成するために使用されるＥＤＢ ＡＤＣを提供する。

【0159】

本発明の一部の態様では、本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、（ａ）ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を含む。

【0160】

本発明の別の態様では、本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、（ａ）ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を含み、このリンカーは、切断可能なまたは切断不能なリンカーである。一部の態様では、このリンカーは、ｖｃ、ｄｉＳ、ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯまたはＡｃＬｙｓ−ｖｃである。

【0161】

本発明の別の態様では、本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、（ａ）ＥＤＢに結合する抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、および（ｃ）薬物を含み、この薬物は細胞傷害剤である。一部の態様では、この薬物はアウリスタチンである。一部の態様では、この薬物は、ＣＰＩまたはＣＢＩダイマーである。一部の態様では、このアウリスタチンは、０１０１、１５６９、９４１１または４５７４である。一部の態様では、このＣＰＩダイマーは、ＣＰＩ−８３１４またはＣＰＩ−０３２６である。

【0162】

本発明の一部の態様では、本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、（ａ）配列番号８を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号８を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号１９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２３を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２５を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；配列番号２７を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖；配列番号２９を含む重鎖および配列番号１５を含む軽鎖；または配列番号２９を含む重鎖および配列番号３１を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合性断片；（ｂ）リンカー、ならびに（ｃ）薬物を含む。一部の態様では、このリンカーは、切断可能なまたは切断不能なリンカーである。一部の態様では、このリンカーは、ｖｃ、ｄｉＳ、ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯまたはＡｃＬｙｓ−ｖｃである。一部の態様では、この薬物は細胞傷害剤である。一部の態様では、この薬物はアウリスタチンである。一部の態様では、この薬物は、ＣＰＩまたはＣＢＩダイマーである。一部の態様では、このアウリスタチンは、０１０１、１５６９、９４１１または４５７４である。一部の態様では、このＣＰＩダイマーは、ＣＰＩ−８３１４またはＣＰＩ−０３２６である。

【0163】

ＥＤＢ ＡＤＣの使用
本発明の抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ ＡＤＣは、治療的処置方法および診断的処置方法が含まれるがこれらに限定されない種々の適用において有用である。

【0164】

本発明は、対象においてＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害または疾患、例えば、ＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する非がんもしくはがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんを処置するための方法を提供する。本発明は、対象においてＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害、例えば、ＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する非がんもしくはがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんを処置するための方法における使用のための、本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣまたは医薬組成物もまた提供する。本発明は、対象においてＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害、例えばＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する非がんもしくはがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんを処置するための医薬の製造における、本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣまたは医薬組成物の使用をさらに提供する。

【0165】

一部の態様では、本発明は、ＥＤＢ発現性障害、例えばＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する非がんもしくはがんおよび／またはＥＤＢ発現性がんを有する対象において、腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、１つまたは複数の本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。本発明の他の態様では、対象においてＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがん細胞および／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんの転移を阻害する方法であって、１つまたは複数の本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。本発明の他の態様では、対象においてＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連する腫瘍および／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんの退縮を誘導する方法であって、１つまたは複数の本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。

【0166】

一部の態様では、このＥＤＢ＋ＦＮ発現は、腫瘍細胞に隣接する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）において検出され得る。ＥＤＢ＋ＦＮは、腫瘍細胞を含む、腫瘍微小環境中の線維芽細胞以外の細胞によって発現され得る。次いで、分泌されたＥＤＢ＋ＦＮは、腫瘍細胞に隣接するマトリックス中または腫瘍細胞の原形質膜上に沈着され得る。他の態様では、本発明は、上記方法における使用のための、１つまたは複数の本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣを含む医薬組成物を提供する。他の態様では、本発明は、上記方法における使用のための医薬の製造における、１つもしくは複数の本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣ、または本明細書に記載されるＥＤＢ ＡＤＣを含む医薬組成物の使用を提供する。

【0167】

ＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんには、一般に、組織リモデリングと関連する任意のがんが含まれ得る。さらに、ＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんには、固形腫瘍および血液がんが含まれ得るがこれらに限定されない。一部の態様では、固形腫瘍には、甲状腺がん、肉腫、乳がん、膵臓がん、神経膠芽腫、胆嚢がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮がん、中皮腫、結腸直腸がん、頭頚部がん、卵巣がん、膀胱がん、精巣がん、前立腺がん、肝臓がん、内分泌がん、胸腺がん、脳腫瘍、副腎がん、眼がん、子宮頚がんおよび肺がんが含まれるがこれらに限定されない。別の態様では、血液がんには、白血病、リンパ腫および骨髄腫が含まれるがこれらに限定されない。

【0168】

本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害、例えばＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんを処置する際に有用である。本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、高いレベルのＥＤＢ＋ＦＮ、中程度のレベルのＥＤＢ＋ＦＮまたは低いレベルのＥＤＢ＋ＦＮを発現するがんを処置するために使用され得る。

【0169】

従って、本発明のＥＤＢ ＡＤＣで処置される患者は、バルク腫瘍サンプルのｍＲＮＡ（ｑＰＣＲ）、および腫瘍起源または組織学ではなく、富化された標的発現について選択された患者集団において生じるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質の上昇した発現が含まれるがこれらに限定されないバイオマーカー発現に基づいて選択され得る。標的発現は、細胞染色の強度と組み合わせた、細胞染色の数の関数として測定され得る。

【0170】

がん成長または異常増殖とは、より発達したがん形態または障害状態への細胞内の変化を示唆するいくつかの指標のうちいずれか１つを指す。がん細胞または非新生物性増殖性障害の細胞の成長の阻害は、当該分野で公知の方法、例えば、遅延した腫瘍成長および転移の阻害によってアッセイされ得る。がん成長の阻害を測定するための他の指標には、がん細胞生存における減少、腫瘍体積または形態学的における減少（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査または他の画像化方法を使用して決定される）、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型過敏症皮膚試験における改善された成績、細胞傷害性Ｔリンパ球の活性における増加、および腫瘍特異的抗原のレベルにおける減少が含まれる。

【0171】

開示された治療方法の所望の転帰は、一般に、対照またはベースライン測定値と比較した、定量化可能な尺度である。本明細書で使用する場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加させる」または「低減させる」は、対照または比較分子、例えば、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下での対照個体（または複数の対照個体）における測定値と比較した値を示す。代表的な対照個体は、処置される個体と同じ形態のがんに罹患し、処置される個体と約同じ年齢である個体である（処置された個体および対照個体における障害のステージが同等であることを確実にするため）。

【0172】

治療に応答した変化または改善は、一般に、統計的に有意である。本明細書で使用する場合、用語「有意性」または「有意な」は、２つ以上の実体間の非ランダムな関係が存在する確率の統計分析に関する。関係性が「有意」であるまたは「有意性」を有するか否かを決定するためのデータの統計的操作が「ｐ値」であり得る。ユーザーが定義したカットオフポイントより下のｐ値は、有意とみなされる。０．１またはそれ未満、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。

【0173】

ｉｎ ｖｉｖｏ検出および診断
別の態様では、ＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害、例えばＥＤＢ＋ＦＮ発現と関連するがんおよび／またはＥＤＢ＋ＦＮ発現性がんを検出、診断および／またはモニタリングする方法が提供される。例えば、本明細書に記載される抗ＥＤＢ抗体は、検出可能な部分、例えば、画像化剤および酵素−基質標識で標識され得る。本明細書に記載される抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断アッセイ、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）、または染色試薬にも使用され得る。

【0174】

薬物が検出可能な標識であるＥＤＢ ＡＤＣの対象への投与後、および結合のための十分な時間の後、抗体が結合したＥＤＢ＋ＦＮタンパク質の体内分布が可視化され得る。開示された診断方法は、処置方法と組み合わせて使用され得る。さらに、本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、検出および治療の二重の目的のために投与され得る。

【0175】

代表的な非侵襲性検出方法には、シンチグラフィー（例えば、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影）、ＰＥＴ（ポジトロン断層撮影）、ガンマカメラ画像化および直線移動形スキャニング）、磁気共鳴画像化（例えば、従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ））および超音波が含まれる。

【0176】

製剤
本発明は、本明細書で開示されるＥＤＢ ＡＤＣのいずれかおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物をさらに提供する。さらに、これらの組成物は、１つよりも多い本明細書で開示されるＥＤＢ ＡＤＣを含み得る。

【0177】

本発明において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含み得る。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニン抗酸化剤を含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。「薬学的に許容できる塩」とは、本明細書で使用する場合、分子または高分子の薬学的に許容できる有機または無機塩を指す。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書にさらに記載される。

【0178】

薬学的に許容できる賦形剤を含む製剤が含まれるがこれらに限定されない、ＥＤＢ ＡＤＣの種々の製剤が、投与のために使用され得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当該分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは堅牢性を与え得、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、カプセル化剤、緩衝液ならびに皮膚浸透増強剤が含まれるがこれらに限定されない。非経口および経口（nonparenteral）薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に示されている。

【0179】

本発明の一部の態様では、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化され得る。従って、これらの薬剤は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などと組み合わされ得る。特定の投薬レジメン、即ち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。

【0180】

本発明に従って使用されるＥＤＢ ＡＤＣの治療的製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５）と混合することによって、貯蔵のために調製され得る。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；塩、例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。

【0181】

治療的ＥＤＢ ＡＤＣ組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。本発明に従う組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与のための単位投薬形態、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁物、または坐剤であり得る。

【0182】

適切な表面活性剤には、特に、非イオン性薬剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が含まれる。表面活性剤を含む組成物は、０．０５％と５％との間の表面活性剤を簡便には含み、０．１％と２．５％との間であり得る。必要に応じて、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルが添加され得ることが理解される。

【0183】

適切な乳濁物は、市販の脂肪乳濁物、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、事前混合された乳濁物組成物中に溶解され得、またはあるいは、油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）およびリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）と水とを混合して形成される乳濁物中に溶解され得る。乳濁物の浸透圧を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースが添加され得ることが理解される。適切な乳濁物は、典型的には、最大で２０％の油、例えば、５％と２０％との間の油を含む。脂肪乳濁物は、０．１μｍと１．０μｍとの間、特に、０．１μｍと０．５μｍとの間の脂肪滴を含み得、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有し得る。乳濁物組成物は、ＥＤＢ ＡＤＣを、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製される組成物であり得る。

【0184】

本発明は、本発明の方法における使用のためのキットもまた提供する。本発明のキットは、本明細書に記載されるＥＤＢ抗体またはＥＤＢ ＡＤＣを含む１つまたは複数の容器、および本明細書に記載される本発明の方法のいずれかに従う使用のための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上記診断的または治療的処置のためのＥＤＢ抗体またはＥＤＢ ＡＤＣの投与の説明を含む。

【0185】

本明細書に記載されるＥＢＤ抗体またはＥＤＢ ＡＤＣの使用に関する指示書は、一般に、意図した処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。これらの容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）またはサブ単位用量であり得る。本発明のキット中に供給される指示書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）上に書かれた指示書であるが、機械可読な指示書（例えば、磁気または光学記憶ディスク上で運搬される指示書）も許容できる。

【0186】

本発明のキットは、適切な包装材料中にある。適切な包装材料には、バイアル、ビン、広口ビン、可撓性包装材料（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、インヘラー、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザー）または注入デバイス、例えば、ミニポンプと組み合わせた使用のための包装もまた企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性な薬剤は、ＥＤＢ抗体またはＥＤＢ ＡＤＣである。この容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。

【0187】

キットは、任意選択により、さらなる構成要素、例えば、緩衝液および解釈的情報を提供し得る。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器と関連するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。

【0188】

用量および投与
本発明は、有効投薬量で投与されるＥＤＢ ＡＤＣを提供する。語句「有効投薬量」または「有効量」とは、本明細書で使用する場合、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の治療結果を達成するために必要な、ＡＤＣ、薬物、ペイロード、化合物または医薬組成物の量を指す。予防的使用について、有益なまたは所望の結果には、障害の生化学的、組織学的および／または行動的症状、障害の発達の間に存在するその合併症および中間の病理学的表現型を含め、障害のリスクを排除もしくは低減させること、その重症度を低下させること、またはその発生を遅延させることが含まれる。治療的使用について、有益なまたは所望の結果には、臨床結果、例えば、がんなどの種々のＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害の１つもしくは複数の症状の発生率を低減させることもしくはそれを軽快させること、障害を処置するために必要とされる他の薬物療法の用量を減少させること、別の薬物療法の効果を増強すること、および／または患者のＥＤＢ＋ＦＮ発現性障害の進行を遅延させることが含まれる。

【0189】

有効投薬量は、１回または複数の投与で投与され得る。ＡＤＣ、薬物、化合物または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併せて達成されてもされなくてもよい。従って、「有効投薬量」は、１種または複数の治療剤を投与する観点から検討され得、単一の薬剤は、１種または複数の他の薬剤と併せて所望の結果が達成され得るまたは達成される場合、有効量で与えられるとみなされ得る。

【0190】

例えば、がん保有対象に投与される場合、有効量は、がん細胞細胞溶解、がん細胞増殖の阻害、がん細胞アポトーシスの誘導、がん細胞抗原の低減、腫瘍成長の遅延および／または転移の阻害を含む抗がん活性を誘発するのに十分な量を含む。腫瘍収縮は、有効性についての臨床的代用マーカーとして、十分に許容される。有効性についての別の十分に許容されるマーカーは、無増悪生存である。

【0191】

本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、任意の適切な経路を介して個体に投与され得る。本明細書に記載される例は、限定ではなく、利用可能な技術の例示であることを意図するものであることを、当業者は理解すべきである。従って、本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続的注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液嚢内で、吹送、くも膜下腔内、経口、吸入または外用経路を介して、個体に投与される。投与は、全身性、例えば、静脈内投与、または限局性であり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販のネブライザーが、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧され得、凍結乾燥粉末は、復元後に噴霧され得る。あるいは、ＥＤＢ ＡＤＣは、フルオロカーボン製剤および計量用量インヘラーを使用してエアロゾル化され得、または凍結乾燥および製粉された粉末として吸入され得る。

【0192】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、部位特異的または標的化された局所的送達技術を介して投与される。部位特異的または標的化された局所的送達技術の例には、ＥＤＣ ＡＤＣの種々のインプラント可能なデポー供給源、または局所的送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテルもしくは針カテーテル、合成グラフト、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他のインプラント可能なデバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が含まれる。

【0193】

本発明の目的のために、ＥＤＢ ＡＤＣの適切な投薬量は、使用される特定のＥＤＢ ＡＤＣ（またはその組成物）、処置される症状の型および重症度、薬剤が治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、投与された薬剤についての患者のクリアランス速度、ならびに担当医の慎重さに依存し得る。臨床医は、所望の結果を達成するおよびそれを越える投薬量に到達するまで、ＥＤＢ ＡＤＣを投与し得る。用量および／または頻度は、処置の過程にわたって変動し得るが、一定のままであってもよい。半減期などの経験的検討事項は、一般に、投薬量の決定に寄与するはずである。例えば、ヒト免疫系と適合性の抗体、例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、抗体の半減期を延長させるため、および宿主の免疫系によって抗体が攻撃されるのを防止するために使用され得る。投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整され得、必ずではないが一般に、症状の処置および／または抑制および／または軽快および／または遅延、例えば、腫瘍成長の阻害または遅延などに基づく。あるいは、ＥＤＢ ＡＤＣの連続的徐放製剤が適切であり得る。徐放を達成するための種々の製剤およびデバイスは、当該分野で公知である。

【0194】

本発明の目的のために、典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約３μｇ／ｋｇから、３０μｇ／ｋｇまで３００μｇ／ｋｇまで３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれ以上までのいずれかの範囲であり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇおよび約２５ｍｇ／ｋｇの投薬量が使用され得る。数日間またはそれよりも長い期間にわたる反復投与について、障害に依存して、処置は、症状の所望の抑制が生じるまで、または例えば、腫瘍成長／がん細胞の進行もしくは転移を阻害するもしくは遅延させるのに十分な治療的レベルが達成されるまで、持続される。例示的な投薬レジメンは、漸増用量（例えば、１ｍｇ／ｋｇの初回用量、および１週間毎またはより長い期間毎の、１つまたは複数のより高い用量への漸進的増加）を投与することを含み得る。他の投薬レジメンもまた、実務者が達成を望む薬物動態減衰のパターンに依存して、有用であり得る。例えば、本発明の一部の態様では、１週間に１回〜４回の投薬が企図される。他の態様では、１カ月に１回または隔月で１回もしくは３カ月毎に１回の投薬、ならびに毎週、隔週および３週間毎の投薬が企図される。この治療の進行は、慣習的な技術およびアッセイによって容易にモニタリングされ得る。投薬レジメン（使用されるＥＤＢ ＡＤＣを含む）は、経時的に変動し得る。

【0195】

本発明の一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣの投薬量は、ＥＤＢ ＡＤＣの１回または複数の投与が与えられた個体において、経験的に決定され得る。個体には、ＥＤＢ ＡＤＣの増分投薬量が与えられ得る。有効性を評価するために、障害の指標は以下のとおりであり得る。

【0196】

本発明の方法に従うＥＤＢ ＡＤＣの投与は、例えば、レシピエントの生理学的障害、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、および当業者に公知の他の因子に依存して、連続的または間欠的であり得る。ＥＤＢ ＡＤＣの投与は、事前選択された期間にわたって本質的に連続的であり得、または一連の間隔をあけた用量であり得る。

【0197】

併用治療
本発明の一部の態様では、本明細書に記載される方法は、さらなる形態の治療を用いて対象を処置するステップをさらに含む。一部の態様では、このさらなる形態の治療は、化学療法、放射線、手術、ホルモン治療および／またはさらなる免疫療法において使用されるものが含まれるがこれらに限定されない、さらなる抗がん治療である。

【0198】

開示されたＥＤＢ ＡＤＣは、初回処置として、または慣習的治療に対して非応答性であるがんの処置のために投与され得る。さらに、ＥＤＢ ＡＤＣは、それによって相加的もしくは強化された治療効果を誘発するため、および／または一部の抗がん剤の細胞傷害性を低減させるために、他の治療（例えば、外科的切除、放射線、さらなる抗がん薬物など）と併用され得る。本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、さらなる薬剤と共投与もしくは共製剤化され得、または任意の順序でのさらなる薬剤との継続的投与のために製剤化され得る。

【0199】

本発明のＥＤＢ ＡＤＣは、治療的抗体、ＡＤＣ、免疫調節剤、細胞傷害剤および細胞分裂停止剤が含まれるがこれらに限定されない他の治療剤と併用して使用され得る。併用治療に有用な代表的な薬剤には、「薬物」の小見出しの下にＥＤＢ ＡＤＣの調製に有用として本明細書に上記される薬物のいずれかも含まれる。

【0200】

治療剤には、化学療法剤、ワクチン、ＣＡＲ−Ｔ細胞ベースの治療、放射線療法、サイトカイン治療、ワクチン、二重特異性抗体、ＡＤＣ、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、Ｔ細胞活性化因子、代謝経路の阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、アデノシン経路の阻害剤、インライタ、ＡＬＫ阻害剤およびスニチニブが含まれるがこれらに限定されないチロシンキナーゼ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤、エピジェネティック改変因子、Ｔｒｅｇ細胞および／または骨髄系由来サプレッサー細胞の阻害剤または枯渇因子、ＪＡＫ阻害剤、ＳＴＡＴ阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、生物療法剤（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体が含まれるがこれらに限定されない）、免疫原性薬剤（例えば、弱毒化がん性細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば、腫瘍由来の抗原または核酸でパルスした樹状細胞、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、および例えばＧＭ−ＣＳＦであるがこれに限定されない免疫刺激性サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトされた細胞）の投与が含まれるがこれらに限定されない。

【0201】

単独で使用され得るまたはＡＤＣとして使用され得るさらなる代表的な抗体には、抗５Ｔ４抗体（例えば、Ａ１、Ａ２およびＡ３）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ３３抗体（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標））、抗ＣＤ３３抗体−薬物コンジュゲート、抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体（例えば、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗ＨＥＲ−２抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧ（登録商標）（ペルツズマブ、ｒｈｕＭＡｂ２Ｃ４））、抗ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標））、抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ））、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ））、抗ＤＮＡ／ヒストン複合体抗体（例えば、ｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗ＣＥＡ抗体（例えば、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗ＣＤ４７抗体（例えば、６Ｈ９）、抗ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼインサートドメイン含有受容体、ＫＤＲ）抗体（例えば、ＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（例えば、ＩＮＧ−１）、抗ＦＡＰ抗体（例えば、シブロツズマブ（sibrotuzumab））、抗ＤＲ４抗体（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗プロゲステロン受容体抗体（例えば、２Ｃ５）、抗ＣＡ１９．９抗体（例えば、ＧＩＶＡＲＥＸ（登録商標））および抗フィブリン抗体（例えば、ＭＨ−１）が含まれるがこれらに限定されない。

【0202】

化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパおよびウレドパ；エチレンイミン、ならびにアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含むメチルメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン（bullatacinone））；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン（callystatin）；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（pancratistatin）；サルコジクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン（spongistatin）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ１およびカリチアマイシンｐｈｉＭ、例えば、Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照のこと；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連の色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ（pyrrolino）−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、ペグ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジコン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン（losoxantrone）；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン（rhizoxin）；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベルカリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体が含まれる。

【0203】

腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン（droloxifene）、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１ １７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾールおよびアナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン；ならびに上のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸または誘導体もまた含まれる。

【0204】

一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、クリゾチニブ、パルボシクリブ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、ＦＯＬＦＯＸ、フォリン酸、オキサリプラチン、アキシチニブ、スニチニブリンゴ酸塩、トファシチニブ、ベバシズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブと併用して使用され得る。

【0205】

一態様では、ＥＤＢ ＡＤＣによる処置後、腫瘍浸潤リンパ球における増加、ＣＤ８／ＣＤ４比における増加、Ｆ４／８０＋マクロファージにおける増加、ならびに／もしくは免疫調節タンパク質、例えば、ＰＤＬ１および４１ＢＢにおける増加、またはそれらの任意の組み合わせが生じ得る。従って、ＥＤＢ ＡＤＣと免疫チェックポイント阻害剤またはＩＯ剤、例えば、抗４１ＢＢアゴニストおよび／または抗ＰＤＬ１アンタゴニストモノクローナル抗体との併用は、有効であり得る（実施例１２を参照のこと）。さらに、本発明のＥＤＢ ＡＤＣ単独は、免疫調節機構、および免疫腫瘍（ＩＯ）剤を可能にする機構を有し得、これは、併用治療を用いて増加され得る。

【0206】

一部の態様では、ＥＤＢ ＡＤＣは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ８、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ４、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｈ１）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、４−ＢＢＬ、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ）、ＳＬＡＭＣＦ７（ＣＳ１）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＡＭＦ９（ＣＤ２Ｆ）、ＣＤ２８、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１−３ＡＳ ＣＥＡＣＡＭ３Ｃ２、ＣＥＡＣＡＭ１−１５、ＰＳＧ１−１１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｃ１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓ、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＣＲ２、ＣＤ３９−ＣＤ７３−アデノシン経路（Ａ２ＡＲ）、ＢＴＫ、ＴＩＫ、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ５、ＶＥＧＦ経路、ＣＳＦ−１を標的化する薬剤（例えば、抗体）、または自然免疫応答モジュレーターが含まれるがこれらに限定されない、免疫チェックポイントモジュレーターを標的化する１種または複数の他の治療剤と併用して使用され得る。

【0207】

併用治療について、ＥＤＢ ＡＤＣおよび／または１種もしくは複数のさらなる治療剤は、意図した治療の成績に適切な任意の時間枠内に投与される。従って、単一の薬剤が、実質的に同時に（即ち、単一の製剤として、または数分もしくは数時間以内に）、または任意の順序で継続的に投与され得る。例えば、単一薬剤処置は、互いに約１年以内、例えば、約１０、８、６、４もしくは２カ月以内、または４、３、２もしくは１週間以内、または約５、４、３、２もしくは１日以内に投与され得る。

【0208】

開示された併用治療は、相乗的治療効果、即ち、その個々の効果または治療的転帰の合計よりも大きい効果を誘発し得る。例えば、相乗的治療効果は、単一の薬剤によって誘発される治療効果、または所与の併用の単一の薬剤によって誘発される治療効果の合計よりも少なくとも約２倍大きい、または少なくとも約５倍大きい、または少なくとも約１０倍大きい、または少なくとも約２０倍大きい、または少なくとも約５０倍大きい、または少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。相乗的治療効果は、単一の薬剤によって誘発される治療効果、または所与の併用の単一の薬剤によって誘発される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも１００％、またはそれよりも大きい、治療効果における増加としても観察され得る。相乗的効果は、治療剤が併用して使用される場合に、それらの投薬の低減を可能にする効果でもある。

【実施例】

【0209】

本発明を実施するための具体的態様の以下の実施例は、例示目的のために提供されているにすぎず、本発明の範囲を決して限定しない意図である。実際、本明細書に示され記載されるものに加えた、本発明の種々の改変が、上述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。

【0210】

（実施例１）
抗ＥＤＢ抗体の生成およびコンジュゲーションのための調製
抗ＥＤＢ抗体の生成
ＥＤＢに結合する種々の完全ヒト抗体をコードするｃＤＮＡを、標準的な分子生物学の方法論を使用して構築し、ＥＤＢに特異的に結合するＬ１９ヒトモノクローナル抗体（本明細書で以後「抗ＥＤＢ−Ｌ１９」または「ＥＤＢ−Ｌ１９」抗体）から誘導した。ＥＤＢ−Ｌ１９抗体は、３５６位におけるアスパラギン酸（Ｄ）および３５８位におけるロイシン（Ｌ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）を有するＧ１ｍ（ａ）アロタイプを有するヒトＩｇＧ１定常領域、ならびにヒトカッパ軽鎖定常領域を含む。ＥＤＢ−Ｌ１９抗体重鎖および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１および１０に示され、重鎖および軽鎖は、それぞれ配列番号８および１５に示される。

【0211】

非免疫原性抗体を産生するために、３５６位におけるグルタミン酸（Ｅ）および３５８位におけるメチオニン（Ｍ）（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）を有する非Ｇ１ｍ（ａ）アロタイプを、ＥＤＢ−Ｌ１９重鎖中に導入した。重鎖を生成するために、ＥＤＢ−Ｌ１９重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を、Ｇｌｍ^ｚ、非（ａ）、非（ｘ）アロタイプを有するヒトＩｇＧ１定常領域ｃＤＮＡに融合させた。一部の態様では、これらの抗体を、ＥＤＢ−Ｌ１９抗体ＩｇＧ１定常領域のＣ末端リジン（Ｋ）を排除してさらに変更して、ＥＤＢ−ＰＦＥ ＨＣ（配列番号１７）を生成することによって、抗体の電荷バリアントを減少させ、均質性を増加させた。ＥＤＢ−ＰＦＥ抗体重鎖および軽鎖は、それぞれ配列番号１７および１５に示される。

【0212】

表４に示されるように、Ｐｒｉｎｃｅ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを備えたｉＣＥ３を使用して画像化キャピラリー電気泳動（ｉＣＥ）を実施して、抗体調製物についての電荷バリアントのパーセントを決定した。ＥＤＢ−Ｌ１９抗体は、ＥＤＢ−ＰＦＥ抗体と比較して、細胞培養の間の不完全なＣ末端リジンプロセシングの結果として、塩基性種におけるかなりの増加および抗体の主要ピークの減少を有した。

【0213】

【表4】

【0214】

操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのための抗体
反応性の操作されたシステイン残基を介した種々のリンカー−ペイロードへの部位特異的コンジュゲーションのために抗ＥＤＢ抗体を調製するための方法を、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９に記載されるように、一般に実施した。重鎖上の１つまたは複数の残基、例えば、Ｋ２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）、または軽鎖上の１つまたは複数の残基、例えば、Ｋ１８３位（Ｋａｂａｔに従う）を、部位特異的変異誘発によって、システイン（Ｃ）残基に変更した。

【0215】

一部の態様では、ＥＤＢ−ＰＦＥ抗体のヒトＩｇＧ１重鎖定常領域中のＫ２９０位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）を、反応性システイン（Ｃ）で置換して、ＥＤＢ−（Ｋ２９０Ｃ）ＨＣ（配列番号１９）を生成する部位特異的コンジュゲーションを可能にした。他の態様では、ヒトカッパ軽鎖定常領域中の残基Ｋ１８３（Ｋａｂａｔに従う）を、反応性システイン（Ｃ）に置換して、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ）ＬＣ（配列番号３１）を生成する部位特異的コンジュゲーションを可能にした。

【0216】

操作されたグルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのための抗体
種々のリンカー−ペイロードへのコンジュゲーションのために、種々のアミノ酸位置においてグルタミン含有（「Ｑ」）タグなどの反応性グルタミン残基で操作したヒトＩｇＧ１サブタイプを有する抗ＥＤＢ抗体を発現させた。反応性グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのために抗ＥＤＢ抗体を調製するための方法を、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ２０１２／０５９８８２に記載されるように、一般に実施した。

【0217】

一部の態様では、Ｈ１６−グルタミンタグＬＬＱＧ（配列番号４０）を、ＥＤＢ−ＰＦＥ抗体のヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域内に操作して、ＤＡＲ ２トランスグルタミナーゼ媒介性部位特異的コンジュゲーションを可能にした。例えば、ＥＤＢ−ＰＦＥ抗体重鎖では、Ｅ２９４〜Ｎ２９７位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）におけるアミノ酸を、Ｈ１６−グルタミン含有タグＬＬＱＧ（配列番号４０）で置き換えた。他の態様では、これらの抗体を、操作されたＨ１６−グルタミン含有タグへのコンジュゲーションの特異性を増加させるためにさらに変更した。重鎖上の２２２位（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）におけるリジン（Ｋ）アミノ酸を、アルギニン（Ｒ）で置換して、ＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）ＨＣ（配列番号２７）を生成した。Ｋ２２２Ｒ置換は、均質なＡＤＣにおける増加、抗体とリンカー−ペイロードとの間の改善された分子間架橋、および／または抗体軽鎖のＣ末端上のＨ１６−グルタミン含有タグとの鎖間架橋における有意な減少を提供した。

【0218】

潜在的な化学的傾向
特にＣＤＲ内の潜在的な化学的傾向は、分子不均質性に影響を与え得、推定タンパク質糖化部位を結合する抗原を生じ得る。タンパク質糖化は、細胞培養の間に組換え抗体において生じ得る非酵素的グリコシル化であり、糖化されたタンパク質は、終末糖化産物と集合的に呼ばれる、あまり特徴付けられていない不均質な産物を生成する、さらなる反応を受け得る。潜在的な糖化傾向を緩和するために、ＥＤＢ−Ｌ１９重鎖可変領域中のＣＤＲ３に隣接するＫ９４位（Ｋａｂａｔの番号付け）をアルギニン（Ｒ）に変異させて、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）ＶＨ（配列番号２１）を生成し、次いで、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合させて、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）ＨＣ（配列番号２３）を生成した。Ｋ９４Ｒ糖化変異もまた、部位特異的コンジュゲーションのために操作されたＥＤＢ−（Ｋ２９０Ｃ）およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）重鎖内に導入して、それぞれ、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）ＨＣ（配列番号２５）およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ−Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）ＨＣ（配列番号２９）を生成した。

【0219】

（実施例２）
ＥＤＢ抗体バリアント結合特性の特徴付け
結合親和性分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、組換えヒト、カニクイザルおよびラット７−ＥＤＢ−８９（それぞれ、配列番号３４、配列番号３５および配列番号３６）に対する抗ＥＤＢ抗体バリアントの結合速度論を特徴付け、Ｋ９４Ｒ糖化変異を有する抗ＥＤＢ抗体の結合特性が完全に保持されていたことを確認した。結合は、表面から屈折してくるレーザー光の表面ＳＰＲによって検出する。シグナル速度論オンレート（ｋａ）およびオフレート（ｋｄ）の分析は、非特異的相互作用と特異的相互作用との間の識別を可能にする。

【0220】

抗ヒトＩｇＧ抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、製造業者のプロトコールに従って、約１０，０００共鳴単位（ＲＵ）の密度になるように、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランコーティングセンサーチップの４つ全てのフローセル上に共有結合的にアミンカップリングさせ、次いで、各抗ＥＤＢ抗体バリアントを、およそ６０〜９０ＲＵのレベルまで捕捉した。使用したランニングおよびサンプル緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０ ｐＨ７．４）であった。６００ｎＭ〜１１．１ｎＭの濃度範囲の７−ＥＤＢ−８９の３倍段階希釈シリーズを、６０秒間の会合および１２０秒間の解離にわたって、５０μＬ／分の流速で表面上に注入した。次いで、この表面を、３Ｍ ＭｇＣｌ_２の３０秒間パルス、イオン性再生緩衝液（０．４６Ｍ ＫＳＣＮ、１．８３Ｍ ＭｇＣｌ２、０．９２Ｍ尿素および１．８３Ｍグアニジン−ＨＣｌ ｐＨ７．４）の３０秒間パルスで再生し、次いで、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液の３０秒間パルスで平衡化した。全てのＳＰＲアッセイを、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１Ｈｚのデータ収集速度で２５℃で実施した。得られたセンサーグラムを、対照表面および緩衝液注入の両方を使用して二重参照した（Ｍｙｓｚｋａ，Ｄ．Ｇ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、１２：２７９〜２８４、１９９９）。速度定数を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００評価ソフトウェアｖ２．０および等式Ｋ_Ｄ＝ｋ_ｄ／ｋ_ａを用いて、１：１ラングミュアモデルにデータを当てはめることによって決定した。各実験を二連で実施し、平均Ｋ_Ｄを決定した。表５に示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）抗体は、ヒト７−ＥＤＢ−８９に対して同等の結合を示す。ｔ１／２＝半減期、Ｒｍａｘ＝最大応答、ＲＵ＝共鳴単位。

【0221】

【表5】

【0222】

さらに、ヒト、カニクイザルおよびラット７−ＥＤＢ−８９に対するＥＤＢ−Ｌ１９およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体の結合親和性を決定した。表６に示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体の結合親和性は、類似していた。表７に示されるように、ヒト、カニクイザルおよびラット７−ＥＤＢ−８９に対するＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体の結合親和性は同等であり、これにより、異種間反応性が、部位特異的コンジュゲーションおよび推定糖化部位の除去を可能にするためにＥＤＢ−Ｌ１９抗体を操作した後に保持されていたことが確認された。

【0223】

【表6】

【0224】

【表7】

【0225】

ＥＬＩＳＡによる競合的結合
ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体の結合特性を、ビオチン化ＥＤＢ−Ｌ１９との競合ＥＬＩＳＡを使用してさらに評価して、ＥＤＢへの結合が完全に維持されたことを確認した。ヒト７−ＥＤＢ−８９（配列番号３４）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に固定化し（１００ｎｇ／ウェル）、２０ｎｇ／ｍＬビオチン化ＥＤＢ−Ｌ１９抗体を添加して、変動する濃度の改変抗ＥＤＢ抗体サンプルと競合させ、結合を、抗ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を使用して検出した。

【0226】

図１Ａおよび表８に示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）抗体は、類似の最大半量阻害濃度値を有した。図１Ｂおよび表９は、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体もまた、類似の最大半量阻害濃度値を有したことを示している。これは、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）改変抗体が、ＥＤＢ結合特性を保持したこと、ならびに重鎖の（Ｋ９４Ｒ）改変および／または部位特異的コンジュゲーションのための反応性の操作されたシステインの導入が、ＥＤＢへの結合を変更しなかったことを示している。

【0227】

【表8】

【0228】

【表9】

【0229】

結合力分析
ＥＤＢを結合するＥＤＢ−Ｌ１９抗体についての親和性は、約２３０ｎＭで、低い結合相互作用であることが決定された。従って、ＳＰＲを使用して、腫瘍微小環境内ので結合に、結合力が差示的標的レベルまで影響したかどうかを調査した。変動する密度のヒト７−ＥＤＢ−８９（配列番号３４）を、ＣＭ５カルボキシメチル化デキストランコーティングセンサーチップの個々のフローセル上に共有結合的にアミンカップリングさせた。ランニングおよびサンプル緩衝液は、結合親和性分析について上記したとおりであった。６ｎＭ〜０．０７４ｎＭの濃度範囲のＥＤＢ−Ｌ１９抗体の３倍段階希釈シリーズを、１１０秒間の会合および９００秒間の解離にわたって、５０μＬ／分の流速で注入した。次いで、この表面を、イオン性再生緩衝液（０．４６Ｍ ＫＳＣＮ、１．８３Ｍ ＭｇＣｌ２、０．９２Ｍ尿素および１．８３Ｍグアニジン−ＨＣｌ ｐＨ７．４）の３０秒間パルス２回で再生し、次いで、ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニング緩衝液の３０秒間パルスで平衡化した。各実験を二連で実施し、平均ｋａ、ｋｄおよびＫ_Ｄを決定した。

【0230】

表１０に示されるように、結果は、固定化されたヒト７−ＥＤＢ−８９のレベルが増加する場合、オフレート（ｋｄ）が緩徐化し、引き続いて親和性が増加したことを示した。見かけのＫ_Ｄ値は、ヒト７−ＥＤＢ−８９の固定化レベルと比例し、ＥＤＢ−Ｌ１９抗体が大きい結合力成分でＥＤＢを結合することが確認された。

【0231】

【表10】

【0232】

抗ＥＤＢ抗体の多重反応性
多重反応性は、ｉｎ ｖｉｖｏでの迅速なクリアランス（Ｈｏｔｚｅｌら、ｍＡｂｓ ４（６）：７５３〜７６０、２０１２）および望ましくないタンパク質−タンパク質相互作用（Ｘｕら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６（１０）：６６３〜６７０（２０１３）と関連している。ＤＮＡおよびインスリン直接結合ＥＬＩＳＡは、臨床的に検証された抗体の公知の薬物動態（ＰＫ）と相関することが示されている。四連の１０μｇ／ｍＬで始まる抗体の段階希釈を、ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングされたＤＮＡまたはインスリンのいずれかへの結合について、低いストリンジェンシーのアッセイで評価した。

【0233】

表１１に示されるように、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体は共に、最適なＰＫ特性を有する陰性対照と同等のまたはそれよりも良好な、非常に低い多重反応性スコアを有する。さらに、多重反応性スコアは、不良なＰＫを有し、迅速なクリアランスを生じる陽性対照抗体よりも、有意に低かった。

【0234】

【表11】

【0235】

ＦｃＲｎクロマトグラフィー
ＦｃＲｎクロマトグラフィーを利用して、ＦｃＲｎ依存的薬物動態に対する、野生型ＩｇＧ１定常領域中への反応性の操作されたシステインの導入の、潜在的な荷電媒介性の影響を調査した。ＦｃＲｎカラム方法論を使用した抗体の評価は、溶出時間が、ヒトおよび非ヒト霊長類クリアランスと正の相関を示したことを実証している（Ｓｃｈｏｃｈ Ａ．ら、ＰＮＡＳ、２０１５、１１２巻）。ＦｃＲｎアフィニティカラムを、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒら、ＭＡｂｓ ５（４）：５７６〜５８６、２０１３に従って調製した。次に、５０μｇのＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体またはＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣを注入し、次いで、２０ｍＭ ＭＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．８を溶離液として使用して、６０分以内のｐＨ５．５〜８．８の線形ｐＨ勾配（３０ＣＶ）によって溶出した。

【0236】

表１２に示されるように、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣのＦｃＲｎカラム相対溶出時間は、許容できるＰＫパラメーターと一致していた。これらのデータは、ＩｇＧ１定常領域中に反応性の操作されたシステイン残基Ｋ２９０Ｃを組み込んでも、ＦｃＲｎ結合に影響しないことを実証している。

【0237】

【表12】

【0238】

（実施例３）
ＥＤＢ ＡＤＣのバイオコンジュゲーション
本発明の抗ＥＤＢ抗体を、リンカーを介して薬物／ペイロードにコンジュゲートさせて、ＥＤＢ ＡＤＣを生成した。使用したコンジュゲーション方法は、慣習的コンジュゲーション（即ち、ランダムなシステイン残基を介する）または部位特異的コンジュゲーション（即ち、操作されたシステイン残基または操作されたグルタミン残基を介する）のいずれかであった。表１３は、種々のＥＤＢ ＡＤＣに使用したコンジュゲーション方法を示す。

【0239】

方法Ａ：システイン残基を介した慣習的コンジュゲーション
ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２７ｍｇ／ｍｌの抗ＥＤＢ抗体を、２．３〜２．６倍（ｍ／ｍ）のＴＣＥＰを用いて３７℃で２時間還元し、次いで、コンジュゲートさせた。モル比は一般に２．５倍であったが、抗体コンジュゲートの量に依存して最適化して、約４．０の最適な最終平均ＤＡＲを達成した。部分的に還元された抗体を、１０％ＤＭＡを有するＰＢＳ中６〜７倍（ｍ／ｍ）のリンカー−ペイロードと、２５℃で１時間コンジュゲートさせた。過剰なリンカー−ペイロードを、２５℃で１５分間、Ｌ−システインでクエンチした。粗製ＡＤＣを、４〜６℃でＰＢＳ中で一晩透析した。

【0240】

粗製ＡＤＣを、ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製し、収集したモノマーピークを、４〜６℃で貯蔵し、または２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、ｐＨ５．８中で透析し；無菌濾過し、−７０℃で凍結した。陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８抗体を、同じ方法によってコンジュゲートさせた。

【0241】

方法Ｂ：操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーション
反応性の操作されたシステイン残基を伴って生成された２グラムの抗ＥＤＢ抗体、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２７．２ｍｇ／ｍｌを、１５倍（ｍ／ｍ）のＴＣＥＰを用いて３７℃で７時間還元し、ＰＢＳ中Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５で脱塩して、過剰なＴＣＥＰを除去した。鎖間システインを、４〜６℃で一晩、３０倍のＤＨＡ（ｍ／ｍ）で酸化した。ＤＨＡを、ＰＢＳ中Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５で脱塩することによって除去した。部位特異的システインの好ましいシステインキャッピングの代わりにより高い程度のグルタチオンキャッピングを有するＡＤＣについては、１００倍のＴＣＥＰ（ｍ／ｍ）を還元に使用した。

【0242】

還元および酸化した抗体を、１０％ＤＭＡを有するＰＢＳ中９倍（ｍ／ｍ）のリンカー−ペイロードと、２５℃で２時間コンジュゲートさせた。過剰なリンカー−ペイロードを、２５℃で１５分間、９倍（ｍ／ｍ）のＬ−システインでクエンチした。粗製ＡＤＣを、４〜６℃でＰＢＳ中で一晩透析した。

【0243】

粗製ＡＤＣを、ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００でのＳＥＣによって精製し、収集したモノマーピークを、２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、ｐＨ５．８中で透析し；無菌濾過し、−７０℃で凍結した。陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８抗体を、同じ方法によってコンジュゲートさせた。

【0244】

方法Ｃ：操作されたグルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーション
反応性の操作されたグルタミン残基を伴って生成された抗ＥＤＢ抗体を、反応緩衝液；１００ｍＭリン酸塩、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で透析した。２０ｍｇ／ｍｌの抗体を、１００ｍＭリン酸カリウム、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＤＭＳＯ中で混合しながら、抗体１ｍｇ当たり１単位の市販の精製トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を使用して、リンカー−ペイロード（１０倍ｍ／ｍ）に、室温で１５時間コンジュゲートさせた。粗製ＡＤＣを遠心分離し、上清をＳＥＣによって精製した。

【0245】

粗製ＡＤＣを、ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００でのＳＥＣによって精製し、収集したモノマーピークを、２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、ｐＨ５．８中で透析し；無菌濾過し、−７０℃で凍結した。陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８抗体を、同じ方法によってコンジュゲートさせた。

【0246】

方法Ｄ：ジスルフィドリンカーを使用する、システイン残基を介した慣習的コンジュゲーション
ＰＢＳ、ｐＨ７．２中２７ｍｇ／ｍｌの抗ＥＤＢ抗体を、５倍（ｍ／ｍ）のＴＣＥＰを用いて３７℃で２時間、部分的に還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５ ＳＥＣを使用して脱塩した。

【0247】

部分的に還元された抗体を、０．７ｍＭ ＤＴＰＡおよび７％ＤＭＡを有する６７ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中１２〜１５倍（ｍ／ｍ）の還元されたリンカー−ペイロードと、２５℃で１５分間コンジュゲートさせた。過剰なリンカー−ペイロードを、２５℃で１５分間、２０倍のＮＥＭ（ｍ／ｍ）でクエンチした。

【0248】

粗製ＡＤＣを、５０ｍＭ ＤＨＡおよび５０ｍＭ ＤＴＰＡを有するＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００でのＳＥＣによって精製し、収集したモノマーピークを、４〜６℃で貯蔵した。陰性対照を、同じ方法によってコンジュゲートさせた。

【0249】

【表13-1】

【0250】

【表13-2】

【0251】

（実施例４）
ＥＤＢ ＡＤＣの特徴付け
本発明のＥＤＢ ＡＤＣを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＬＣ−ＭＳおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の組み合わせを使用して特徴付けた。平均薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、質量分析（ＭＳ）によって決定した。表１４は、種々のＥＤＢ ＡＤＣの分析的特徴を提供する。

【0252】

ＬＣ−ＭＳ：カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００−Ｃ４、２．１×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ＝１８６００４４９６）；機器＝ＳＱＤ２質量分析検出器を備えたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ；流速＝０．７ｍＬ／分；温度＝８０℃；緩衝液Ａ＝水＋０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ギ酸。勾配は、２分間かけて３％Ｂから９５％Ｂにし、９５％Ｂで０．７５分間維持し、次いで、３％Ｂで再平衡化する。サンプルを、注入の直前に、ＴＣＥＰまたはＤＴＴで還元する。溶出物を、ＬＣＭＳ（４００〜２０００ダルトン）によってモニタリングし、タンパク質ピークを、ＭａｘＥｎｔ１を使用してデコンボリューションする。ＤＡＲは、以前に記載されたとおり、重量平均負荷として報告する。

【0253】

ＳＥＣ：カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（５／１５０ ＧＬ）；移動相：２％アセトニトリルを含有するリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４；流速＝０．２５ｍＬ／分；温度＝周囲；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ。

【0254】

ＨＩＣ：カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｂｕｔｙｌ ＮＰＲ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ（Ｐ／Ｎ＝Ｓ０５５７−８３５）；緩衝液Ａ＝１０ｍＭリン酸塩を含有する１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７；緩衝液Ｂ＝１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７＋２０％イソプロピルアルコール；流速＝０．８ｍＬ／分；温度＝周囲；勾配＝１２分間かけて０％Ｂ〜１００％Ｂ、１００％Ｂで２分間維持、次いで、１００％Ａで再平衡化；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ。

【0255】

【表14】

【0256】

（実施例５）
ＥＤＢ＋ＦＮ発現
ＥＤＢ ＡＤＣベースの治療のためのがん適応症の広い調査を実施するために、ＥＤＢ＋ＦＮ発現を、ヒト腫瘍およびＰＤＸモデルにおいてタンパク質およびｍＲＮＡレベルで分析した。

【0257】

ＥＤＢ＋ＦＮ発現のＲＮＡ−Ｓｅｑ分析
３１の腫瘍型に及ぶＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＨＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）の一部として収集された１０６６０の個々の腫瘍サンプルからのＲＮＡ−Ｓｅｑデータを分析した。アイソフォームレベル発現データを、ＯｍｉｃＳｏｆｔソフトウェア（Ｃａｒｙ、ＮＣ）から得た。ＥＤＢ＋ＦＮ発現を、ＥＤＢを保有するフィブロネクチン（ＦＮ１）のアイソフォームの発現レベルの合計として計算した。発現レベルを、１００万読み取り当たりの転写物１キロベース当たり断片（fragment per kilobase of transcript per million reads）（ＦＰＫＭ）によって測定した。各腫瘍型についてのＥＤＢ＋ＦＮ発現レベルの要約統計量は、表１５に示される。一般に、遺伝子は、ＦＰＫＭが約１以上である場合、発現されたとみなされる。

【0258】

表１５は、ヒト腫瘍におけるＥＤＢ＋ＦＮのＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を示す。ＥＤＢ＋ＦＮ発現は、甲状腺癌、肉腫、乳癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、胆管細胞癌、肺腺癌、腎癌、黒色腫、子宮癌肉腫、中皮腫、肺扁平上皮癌、直腸および結腸腺癌、肝臓肝細胞癌、結腸癌、卵巣漿液性嚢胞腺癌、ならびに膀胱癌が含まれるがこれらに限定されない、広範なヒト腫瘍適応症において実証される。

【0259】

【表15】

【0260】

遺伝子発現の定量化を、ＲＳＥＭプログラムを使用して、乳がん、卵巣がん、頭頚部がん、結腸直腸がん、黒色腫、膵臓、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および小細胞肺がん由来の１６０のＰｆｉｚｅｒ内部患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデルのＲＮＡ−Ｓｅｑデータに対して実施した。Ｌｉら、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１２：３２３、２０１１を参照のこと。ＥＤＢ＋ＦＮ発現を、ＥＤＢを保有するフィブロネクチン（ＦＮ１）のアイソフォームの発現レベルの合計として計算した。図２に示されるように、ＥＤＢ＋ＦＮは、分析した全ての腫瘍型にわたって、変動するレベルで発現された（全てのサンプルは、レベル＞１を有した）。データは、１００万読み取り当たりの転写物１キロベース当たり断片（ＦＰＫＭ）として示される。

【0261】

ＥＤＢ＋ＦＮ発現の免疫組織化学（ＩＨＣ）検出
ヒトがんにおけるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質発現を、凍結切片においてＥＤＢ−Ｌ１９抗体を使用するＩＨＣによって検証した。Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ Ｏ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）中に包埋された８ミクロンの新鮮な凍結組織切片を、アセトン対１００％エタノールの３：１混合物中で４分間固定し、次いで、１０％中性緩衝ホルマリン中に２０秒間浸漬した。スライドをＴＢＳ中でリンスした。内因性ペルオキシダーゼ活性を、Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ １（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で１０分間不活性化した。非特異的タンパク質相互作用を、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｐｕｎｉｓｈｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で１０分間ブロッキングした。ＥＤＢ−Ｌ１９抗体またはアイソタイプ陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８抗体を、それぞれ、３μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌの最終濃度のウサギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と、室温で１時間、事前複合体化させた。事前複合体化させた混合物を、過剰な全ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温で１５分間インキュベートし、スライドに添加し１時間おいた。切片を、ＴＢＳ中で洗浄し、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ Ｂｏｏｓｔ Ｒａｂｂｉｔ ＨＲＰ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。発色シグナルを、ＤＡＢ＋（Ｄａｋｏ）で５分間生じさせ、引き続いて、蒸留Ｈ_２Ｏでクエンチした。スライドを、ＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）で短時間対比染色し、水中で洗浄し、段階的アルコール中で脱水し、キシレン中で透徹し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＦｉｓｈｅｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いてカバーガラスをかけた。発現の分析を実施し、確認した。

【0262】

表１６に示されるように、ＥＤＢ＋ＦＮタンパク質は、頭頚部癌（データ示さず）、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌および乳癌を含む、プロファイリングした全てのヒトがん適応症にわたって、中程度〜高いレベルで発現された。全ての腫瘍における発現は、優位に間質性（線維芽細胞性、および脈管構造と関連するものを含む）であったが、腫瘍細胞のいくらかの染色も観察された。

【0263】

【表16】

【0264】

（実施例６）
ＥＤＢ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合
抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ ＡＤＣのＥＤＢに対する相対的結合を評価するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェルプレートを、ＰＢＳ中０．５または１μｇ／ｍｌのヒト７−ＥＤＢ−８９（配列番号３４）でコーティングし、穏やかに振盪しながら４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを空にし、２００μｌ ＰＢＳで洗浄し、１００μｌのブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温で３時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＥＬＩＳＡアッセイ緩衝液（ＥＡＢ；０．５％ＢＳＡ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）中で段階希釈（４倍）した抗ＥＤＢ抗体またはＥＤＢ ＡＤＣ １００μｌと共にインキュベートした。プレートの最初のカラムを空のままにし、プレートの最後のカラムに、ブランク対照としてＥＡＢを満たした。プレートを室温で３時間インキュベートした。試薬を除去し、プレートを、２００μｌのＰＢＳ中０．０３％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で洗浄した。ＥＡＢ中に１：５０００希釈した抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ）を、１００μｌとしてウェルに添加し、室温で１５分間インキュベートした。プレートを２００μｌのＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１００μｌのＢｉｏＦＸ ＴＭＢ（Ｆｉｓｈｅｒ）を添加し、室温で４分間発色させた。反応を、１００μｌの０．２Ｎ硫酸で停止させ、４５０ｎｍにおける吸光度を、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で読み取った。

【0265】

表１７は、ＥＬＩＳＡ形式で９６ウェルプレートに結合したヒト７−ＥＤＢ−８９タンパク質断片に対する抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ ＡＤＣの相対的結合を提供する。ＥＤＢを標的化する全ての抗体およびＡＤＣは、１９ｐＭ〜５８ｐＭの範囲の類似の親和性で、標的タンパク質に結合した。対照的に、非ＥＤＢ標的化抗体およびＡＤＣは、＞１０，０００ｐＭの高いＥＣ_５０値を有した。代表的なＥＬＩＳＡ結合曲線は、図３Ａおよび３Ｂに示される。

【0266】

【表17】

【0267】

（実施例７）
ＥＤＢ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性
細胞培養
ＷＩ３８−ＶＡ１３は、ＡＴＣＣから得られるＳＶ４０で形質転換されたヒト肺線維芽細胞であり、１０％ＦＢＳ、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％ピルビン酸ナトリウム、１００単位／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンおよび２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＭＥＭイーグル培地（Ｃｅｌｌ−Ｇｒｏ）中で維持する。ＨＴ２９は、ヒト結腸直腸癌（ＡＴＣＣ）に由来し、１０％ＦＢＳおよび１％グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地中で維持する。

【0268】

ＥＤＢ＋ＦＮ転写物の検出
ＥＤＢ＋ＦＮの遺伝子発現および転写物分析のために、接着性増殖性ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞を、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞培養フラスコから解離させた。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、収集された細胞ペレットから総ＲＮＡを精製した。残留ＤＮＡを、ＲＮＡ精製の間にＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって除去した。Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、総ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写に使用した。ｃＤＮＡを、ＵＮＧを含むＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。ＥＤＢ＋ＦＮシグナルを、ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ０１５６５２７１＿ｍ１によって検出し、ＡＣＴＢ（ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ９９９９９９０３＿ｍ１）およびＧＡＰＤＨ（ＴａｑＭａｎプライマーＨｓ９９９９９９０５＿ｍ１）からの両方のシグナルの平均で標準化した。全てのプライマーは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのものであった。代表的な実験からのデータが示される。

【0269】

ウエスタンブロッティングによるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質の検出
ウエスタンブロッティングによるＥＤＢ＋ＦＮの検出のために、接着性増殖性ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞を、細胞剥離によって回収した。細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で調製した。腫瘍溶解物を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ溶解緩衝液または２×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のいずれか中で調製した。タンパク質溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のウエスタンブロッティングによって分析した。タンパク質を、ニトロセルロースメンブレンに移し、次いで、５％ミルク／ＴＢＳでブロッキングし、その後、ＥＤＢ−Ｌ１９抗体および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、抗ＥＤＢブロットを、ＥＣＬ ＨＲＰ連結された抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＥＤＢ＋ＦＮシグナルを、Ｐｉｅｒｃｅ ＥＣＬ ２ウエスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって発色させ、Ｘ線フィルムによって検出した。抗ＧＡＰＤＨブロットを、ブロッキング緩衝液中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０コンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＧＡＰＤＨシグナルを、ＬＩ−ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍによって検出した。ＥＤＢ＋ＦＮウエスタンブロットの濃度測定分析を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＧＳ−８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを使用して実施し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅバージョン４．６．９ソフトウェアを使用して定量化した。代表的な実験からのデータが示される。

【0270】

図４は、ＷＩ３８−ＶＡ１３およびＨＴ２９細胞におけるウエスタンブロットによるＥＤＢ＋ＦＮ発現を示す。ＥＤＢ＋ＦＮは、ＷＩ３８−ＶＡ１３細胞株において発現され、ＨＴ２９結腸癌細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させた場合には陰性である。

【0271】

フローサイトメトリーによるＥＤＢ＋ＦＮタンパク質の検出
ＥＤＢ−Ｌ１９抗体を使用して、フローサイトメトリーによってＷＩ３８−ＶＡ１３またはＨＴ２９細胞の細胞表面上のＥＤＢ＋ＦＮの発現を測定した。細胞を、非酵素的細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）によって解離させ、ブロッキングのために氷上で冷フロー緩衝液（ＦＢ、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ＋Ｃａ＋Ｍｇ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を、ＦＢ中氷上で一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、冷ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇで洗浄し、次いで、製造業者の手順に従って、生存度染色（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートして、生細胞および死細胞を識別した。シグナルを、ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析し、データを、ＢＤ ＦＡＣＳ ＤＩＶＡソフトウェアを使用して分析した。代表的な実験からのデータが示される。

【0272】

表１８は、ウエスタンブロット、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリーからの結果をまとめる。このデータは、ＷＩ３８−ＶＡ１３がＥＤＢ＋ＦＮ陽性であり、ＨＴ２９がＥＤＢ＋ＦＮ陰性であることを実証している。

【0273】

【表18】

【0274】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
増殖性ＷＩ３８−ＶＡ１３またはＨＴ２９細胞を、非酵素的細胞解離緩衝液を用いて培養フラスコから回収し、加湿チャンバー（３７℃、５％ＣＯ２）中１０００細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で一晩培養した。次の日、細胞を、１０個の濃度において二連で５０μｌの３×ストックを添加することによって、ＥＤＢ ＡＤＣまたはアイソタイプ対照非ＥＤＢ結合性ＡＤＣで処理した。一部の実験では、細胞を、１５００細胞／ウェルでプレートし、同じ日に処理した。次いで、細胞を、ＥＤＢ ＡＤＣまたはアイソタイプ対照非ＥＤＢ結合性ＡＤＣと共に４日間インキュベートした。回収日に、５０μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加し、室温で０．５時間インキュベートした。発光を、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で測定した。相対的細胞生存度を、未処理の対照ウェルの百分率として決定した。ＩＣ_５０値を、ＸＬｆｉｔ ｖ４．２（ＩＤＢＳ）を用いて４パラメーターロジスティックモデル＃２０３を使用して計算した。

【0275】

表１９は、ＷＩ３８−ＶＡ１３（ＥＤＢ＋ＦＮ陽性腫瘍細胞株）およびＨＴ２９結腸癌細胞（ＥＤＢ＋ＦＮ陰性腫瘍細胞株）に対して実施した細胞傷害性アッセイにおけるＥＤＢ ＡＤＣ処理のＩＣ_５０（抗体のｎｇ／ｍｌ）を示す。ＥＤＢ ＡＤＣは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現性細胞株において細胞死を誘導した。ＩＣ_５０値は、およそ１８４ｎｇ／ｍｌ〜２１６ｎｇ／ｍｌの範囲で、ｖｃ−０１０１リンカー−ペイロードを有する全てのＥＤＢ ＡＤＣ（ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１）について類似していた。陰性対照ｖｃ−０１０１ ＡＤＣはかなり弱く、ＩＣ_５０値は、ＥＤＢ−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣよりもおよそ７０〜２００倍高かった。全てのｖｃ−０１０１ ＡＤＣは、ＥＤＢ＋ＦＮ陰性腫瘍細胞株ＨＴ２９において、４６〜８３倍高いＩＣ_５０値を有した。従って、ＥＤＢ ＡＤＣは、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性について、ＥＤＢ＋ＦＮ発現に依存していた。

【0276】

「ｖｃ」プロテアーゼ−切断可能なリンカーを有する他のアウリスタチンベースのＥＤＢ ＡＤＣであるＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９もまた、対応する陰性対照ＡＤＣと比較して約５０〜１８０倍の高い選択性および非発現細胞株と比較して約２５〜１４０倍の選択性で、ＷＡ３８−ＶＡ１３細胞において強力な細胞傷害性を示した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１ ＡＤＣは、ｖｃ−０１０１ ＡＤＣと類似の効力を有したが、陰性対照ＡＤＣ（約３倍）およびＨＴ２９細胞（約０．９倍）と比較して、選択性はかなり低かった。

【0277】

【表19】

【0278】

表２０に示されるように、コンジュゲートされていないペイロードは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現とは無関係に、両方の細胞株において高度に強力であり、これは、これらの細胞が、ＡＤＣペイロードとして使用された細胞傷害剤に対して感受性であることを示している。

【0279】

【表20】

【0280】

（実施例８）
ＥＤＢ ＡＤＣのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
ＥＤＢ ＡＤＣを、細胞株異種移植（ＣＬＸ）、患者由来異種移植（ＰＤＸ）および同系腫瘍モデルにおいて評価した。ＥＤＢ＋ＦＮの発現を、本明細書に以前に記載されたように免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを使用して検出した。

【0281】

ＣＬＸモデルを生成するために、８×１０^６〜１０×１０^６細胞のＨ−１９７５、ＨＴ２９またはＲａｍｏｓ腫瘍系統を、雌性胸腺欠損ヌードマウス中に皮下でインプラントした。接種のためのＲａｍｏｓおよびＨ−１９７５細胞を、それぞれ、５０％および１００％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に懸濁した。Ｒａｍｏｓモデルについて、動物は、細胞接種前に全身照射（４Ｇｙ）を受けて、腫瘍の樹立を促進した。平均腫瘍体積がおよそ１６０〜３２０ｍｍ^３に達したところで、各群中８〜１０匹のマウスで、動物を処置群にランダム化した。ＡＤＣまたはビヒクル（ＰＢＳ）を、０日目に静脈内投与し、次いで、動物に、４〜８用量にわたって４日毎に１回投薬した。腫瘍を、１週間に１回または２回測定し、腫瘍体積を、体積（ｍｍ^３）＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。動物の体重を４〜９週間モニタリングしたが、動物の体重減少は、いずれの処置群でも観察されなかった。

【0282】

ＰＤＸモデルを生成するために、腫瘍をドナー動物から収集し、およそ３×３ｍｍの腫瘍断片を、１０ゲージのトロカールを使用することによって、雌性胸腺欠損ヌードマウス（ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２モデルについて）またはＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４モデルについて）の脇腹に皮下でインプラントした。平均腫瘍体積がおよそ１６０〜２６０ｍｍ^３に達したところで、各群中７〜１０匹のマウスで、マウスを処置群にランダム化した。ＡＤＣまたはビヒクル（ＰＢＳ）投薬レジームおよび投与経路ならびに腫瘍測定手順は、ＣＬＸモデルについて上記したものと同じである。動物の体重を５〜１４週間モニタリングしたが、動物の体重減少は、いずれの処置群でも観察されなかった。腫瘍成長阻害は、腫瘍サイズの平均±平均の標準誤差としてプロットされる。

【0283】

ＥＤＢ＋ＦＮの発現
表２１に示されるように、Ｈ−１９７５、ＨＴ２９およびＲａｍｏｓ ＣＬＸモデル、ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２、ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４ ＰＤＸモデルならびにＥＭＴ−６同系腫瘍モデルにおけるＥＤＢ＋ＦＮの発現を、ＥＤＢ−Ｌ１９抗体の結合およびＩＨＣアッセイにおける引き続く検出によって測定した。ＣＬＸ ＨＴ−２９は、中程度の発現性ＣＬＸであったが、ＣＬＸにおけるタンパク質発現のほとんどが腫瘍間質に由来することに起因して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した場合には陰性であった。

【0284】

【表21】

【0285】

ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２ ＮＳＣＬＣ ＰＤＸ
種々のＡＤＣの効果を、高いレベルのＥＤＢ＋ＦＮを発現するヒトがんのＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルであるＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２において評価した。図５Ａは、０．３、０．７５、１．５および３ｍｇ／ｋｇにおける、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１についての抗腫瘍活性を示す。このデータは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１が、３ｍｇ／ｋｇおよび１．５ｍｇ／ｋｇにおいて、用量依存的様式で腫瘍退縮を示したことを実証している。

【0286】

ｖｃ連結されたＡＤＣの抗腫瘍有効性を、ジスルフィド連結されたＡＤＣと比較した。図５Ｂおよび５Ｃは、それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇのジスルフィド連結されたＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１と比較した３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍活性、ならびに５ｍｇ／ｋｇのジスルフィド連結されたＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−Ｃ_２ＯＣＯ−１５６９と比較した１および３ｍｇ／ｋｇのＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍活性を示す。図５Ｂおよび５Ｃに示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１は、アイソタイプ陰性対照ＡＤＣ、ならびにジスルフィドリンカーを使用して生成したＡＤＣであるＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉＳ−ＤＭ１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｄｉｓ−Ｃ_２ＯＣＯ−１５６９と比較して、より高い有効性を実証した。さらに、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１で処置した腫瘍保有動物は、１ｍｇ／ｋｇにおいて遅延した腫瘍成長を有し、３ｍｇ／ｋｇにおいて完全な退縮を有した。このデータは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１（ＡＤＣ１）が、用量依存的様式でＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２ ＮＳＣＬＣ異種移植片の成長を阻害することを実証している。

【0287】

部位特異的および慣習的にコンジュゲートされたＡＤＣの活性を評価した。図５Ｄは、１．５ｍｇ／ｋｇの用量における慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１と比較した、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量における部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。用量レベルベースの有効性は同等であり、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１は、用量依存的様式で腫瘍退縮をもたらした。

【0288】

種々の変異を有するｖｃ−０１０１ ＥＤＢ ＡＤＣの活性を評価した。図５Ｅは、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇの用量における、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１は、１および３ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍退縮を誘導した。図５Ｆは、図５Ｅの３ｍｇ／ｋｇで投薬したＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群中の１０匹の個々の腫瘍保有マウスについての腫瘍成長阻害曲線を示す。３ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍退縮は、研究の最後（９５日）に、１０匹のマウスのうち８匹（８０％）において完全であり、耐久性があった。

【0289】

Ｈ−１９７５ ＮＳＣＬＣ ＣＬＸ
種々のｖｃ連結されたアウリスタチンおよびＣＰＩ ＡＤＣの効果を、ヒトがんの中程度〜高いＥＤＢ＋ＦＮ発現性ＮＳＣＬＣ ＣＬＸモデルであるＨ−１９７５において評価した。図６Ａは、０．３、０．７５、１．５および３ｍｇ／ｍｇにおいて抗腫瘍活性について評価したＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１を示す。このデータは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１が、３ｍｇ／ｋｇにおいて、および１．５ｍｇ／ｋｇの低さにおいて、用量依存的様式で腫瘍退縮を示したことを実証している。図６Ｂは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９を、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇにおいて抗腫瘍活性について評価したことを示す。このデータは、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−１５６９が、用量依存的様式で腫瘍退縮を示したことを実証している。

【0290】

ｖｃ連結されたアウリスタチンＡＤＣの抗腫瘍活性を、ＣＰＩ ＡＤＣと比較した。図６Ｃに示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩ−８３１４を、それぞれ、０．５、１．５および３ｍｇ／ｋｇならびに０．１、０．３および１ｍｇ／ｋｇにおいて評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｈ１６−Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓ−ｖｃ−ＣＰＩ−８３１４は共に、評価した最も高い用量において腫瘍退縮を示した。

【0291】

部位特異的および慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ ＡＤＣの活性を評価した。図６Ｄは、０．５、１．５および３ｍｇ／ｋｇの用量における、慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１と比較した、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。用量レベルベースの有効性は同等であり、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１は、用量依存的様式で腫瘍退縮をもたらした。

【0292】

種々の変異を有するｖｃ−０１０１ ＥＤＢ ＡＤＣの活性を評価した。図６Ｅは、１および３ｍｇ／ｋｇにおける、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。図６Ｆは、１および３ｍｇ／ｋｇにおける、部位特異的ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を示す。４つのＡＤＣは、それらがκＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃおよび／またはＫ９４Ｒ変異を含んだかどうかにかかわらず、Ｈ−１９７５モデルにおいて類似の有効性を実証した。さらに、試験した全てのＡＤＣは、３ｍｇ／ｋｇにおいて、腫瘍退縮を含むロバストな抗腫瘍有効性を生じた。これらのデータは、κＫ１８３Ｃ−Ｋ２９０Ｃおよび／またはＫ９４Ｒ変異の導入が、ＡＤＣの有効性に負の影響を与えなかったことを実証している。

【0293】

ＨＴ２９結腸ＣＬＸ
種々のｖｃ連結されたアウリスタチンＡＤＣの効果を、ヒトがんの中程度のＥＤＢ＋ＦＮ発現性結腸ＣＬＸモデルであるＨＴ２９において評価した。図７に示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１を、３ｍｇ／ｋｇにおいて抗腫瘍活性について試験した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−９４１１は共に、３ｍｇ／ｋｇ用量において経時的に腫瘍退縮を示した。

【0294】

ＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５およびＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４膵臓ＰＤＸ
ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を、ヒト膵臓ＰＤＸモデルにおいて評価した。図８Ａに示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１を、中程度〜高いＥＤＢ＋ＦＮ発現性膵臓ＰＤＸであるＰＤＸ−ＰＡＸ−１３５６５において、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇにおいて評価した。図８Ｂに示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１を、低い〜中程度のＥＤＢ＋ＦＮ発現性膵臓ＰＤＸであるＰＤＸ−ＰＡＸ−１２５３４において、０．３、１および３ｍｇ／ｋｇにおいて評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１は、評価した両方の膵臓ＰＤＸモデルにおいて、用量依存的様式で腫瘍退縮を実証した。

【0295】

Ｒａｍｏｓリンパ腫ＣＬＸ
ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を、中程度のＥＤＢ＋ＦＮ発現性リンパ腫ＣＬＸモデルであるＲａｍｏｓにおいて評価した。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１を、１および３ｍｇ／ｋｇにおいて抗腫瘍活性について評価した。図９に示されるように、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１は、３ｍｇ／ｋｇ用量において、用量依存的様式で腫瘍退縮を示した。

【0296】

ＥＭＴ−６乳癌同系モデル
ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の抗腫瘍有効性を、免疫適格背景にあるマウス同系乳癌モデルであるＥＭＴ−６において評価した。図１０Ａに示されるように、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１は、４．５ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍成長阻害を実証した。腫瘍成長阻害を、１１匹の腫瘍保有動物における腫瘍サイズの平均±平均の標準誤差としてプロットした。図１０Ｂは、４．５ｍｇ／ｋｇで投薬したＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１群中の１１匹の個々の腫瘍保有マウスについての腫瘍成長阻害曲線を示す。４．５ｍｇ／ｋｇ群における腫瘍退縮は、研究の最後（３４日）に、１１匹のマウスのうち９匹（８２％）において完全であり、耐久性があった。

【0297】

卵巣
ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の活性を、ＥＤＢ＋ＦＮを発現する卵巣および乳癌ヒトＰＤＸモデルにおいて試験した。活性は、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルにおいて観察された（データ示さず）。

【0298】

（実施例９）
薬物動態（ＰＫ）
慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１および部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１コンジュゲートされた抗体薬物コンジュゲートの曝露を、カニクイザルにおいて、それぞれ、５または６ｍｇ／ｋｇのいずれかの静脈内（ＩＶ）ボーラス用量投与後に決定した。総抗体（総Ａｂ；コンジュゲートされたｍＡｂおよびコンジュゲートされていないｍＡｂの両方の測定）、ＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたｍＡｂ）の濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して測定し、放出されたペイロード０１０１の濃度を、質量分析を使用して測定した。総ＡｂおよびＡＤＣ濃度の定量化を、蛍光検出を用いるＧｙｒｏｌａｂ（登録商標）ワークステーションを使用するリガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）によって達成した。使用したビオチン化捕捉タンパク質は、ヒツジ抗ｈＩｇＧであり、検出抗体は、総抗体についてはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ヤギ抗ｈＩｇＧであり、またはＡＤＣについてはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗０１０１ｍＡｂであった（データは、Ｗａｔｓｏｎ ｖ７．４ ＬＩＭＳシステムによって処理した）。ｉｎ ｖｉｖｏサンプルを、タンパク質沈殿を使用して、コンジュゲートされていないペイロード分析のために調製し、陽性Ｔｕｒｂｏ ＩｏｎＳｐｒａｙエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用して、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ５５００（ＱＴＲＡＰ）質量分析器上に注入した。７４３．６→１８８．０および７５１．６→１８８．０の転移を、それぞれ、分析物および重水素化内部標準に使用した。データの取得および処理を、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアバージョン１．５．２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、Ｃａｎａｄａ）を用いて実施した。

【0299】

ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ）およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）を投薬したカニクイザルからの、総Ａｂ、ＡＤＣおよび放出されたペイロードの薬物動態が、表２２に示される。部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣの曝露は、慣習的コンジュゲートと比較した場合、増加した曝露（用量標準化ＡＵＣによって測定した場合、約２．３×の増加）および増加したコンジュゲーション安定性の両方を示した。コンジュゲーション安定性を、慣習的ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣと比較した、部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣについての、それぞれ、より高いＡＤＣ／Ａｂ比（８４％対７５％）およびより低い放出されたペイロード曝露（用量標準化ＡＵＣ；０．００５８対０．００８２μｇ^＊時間／ｍＬ）の両方によって評価した。ＮＡ＝適用なし。

【0300】

【表22】

【0301】

（実施例１０）
ＥＤＢ ＡＤＣについての熱安定性評価
示差走査熱量測定（ＤＣＳ）を使用して、抗ＥＤＢ抗体バリアントならびに対応する慣習的および部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ ＡＤＣの熱安定性を決定した。ＰＢＳ−ＣＭＦ ｐＨ７．２中で処方したサンプルを、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ ｗｉｔｈ Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）のサンプルトレイ中に分配し、１０℃で５分間平衡化し、次いで、１時間当たり１００℃の速度で、１１０℃までスキャンした。１６秒間のフィルタリング期間を選択した。生データをベースライン補正し、タンパク質濃度を標準化した。Ｏｒｉｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、適切な数の転移で、データをＭＮ２−Ｓｔａｔｅモデルに当てはめた。

【0302】

表２３に示されるように、部位特異的および慣習的の両方のコンジュゲーションテクノロジーを使用する、種々の抗ＥＤＢ抗体およびＥＤＢ ＡＤＣを評価したところ、これらは、第１の融解転移（Ｔｍ１）＞６５℃によって決定される好ましい熱安定性を示した。これらの結果は、操作されたシステイン残基を組み込んだＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）抗体およびκＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣが、熱的に安定であったことを実証している。

【0303】

【表23】

【0304】

（実施例１１）
毒性研究
慣習的コンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１および部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の非臨床的安全性プロファイルを、Ｗｉｓｔａｒ−Ｈａｎラットおよびカニクイザルにおける探索性反復用量（Ｑ３Ｗ×３）研究において特徴付けた。ラットおよびカニクイザルを、ヒトＥＤＢとのタンパク質配列相同性が１００％であり、実施例２において実証されたようにＢｉａｃｏｒｅアッセイによるラット、ヒトおよびサルに対する抗体ＥＤＢ−Ｌ１９およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）の結合親和性が類似していたので、毒性評価のための薬理学的に適切な非臨床種とみなした。

【0305】

ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１を、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラットおよびカニクイザルにおいて、それぞれ１０および５ｍｇ／ｋｇ／用量まで評価し、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１を、カニクイザルにおいて、１２ｍｇ／ｋｇ／用量まで評価した。ラットまたはサルに、３週間毎に１回（１、２２および４３日目に）静脈内投薬し、４６日目（３回目の用量の３日後）に安楽死させた。動物を、臨床徴候、体重における変化、摂食量、臨床病理パラメーター、臓器重量、ならびに巨視的および微視的観察について評価した。死亡率も、動物の臨床状態における有意な変化も、これらの研究では認められなかった。

【0306】

ラットおよびサルでは、ＥＤＢ＋ＦＮ発現性組織／臓器における標的依存的毒性の徴候は存在しなかった。両方の種において、主要な毒性は、関連する血液学的変化を伴う、可逆的な骨髄抑制であった。サルでは、表２４および図１１に示されるように、顕著な一過的な好中球減少症が、５ｍｇ／ｋｇ／用量の慣習的にコンジュゲートされたＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１で見られたが、６ｍｇ／ｋｇ／用量の部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１では、好中球数に対する最小の影響のみが見られた。点は平均を示し、エラーバーは、平均からの±１標準偏差（ＳＤ）を示す。

【0307】

このデータは、部位特異的コンジュゲーションによる骨髄抑制の有意な軽減を実証している。ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の毒性プロファイルは、これらのコンジュゲートの標的非依存的効果と一致し、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１についての重篤な毒性が発現しない最大用量（highest non-severely toxic dose）（ＨＮＳＴＤ）は、それぞれ、≧５ｍｇ／ｋｇ／用量および≧１２ｍｇ／ｋｇ／用量であると決定された。

【0308】

【表24】

【0309】

（実施例１２）
ＩＯ併用
がん細胞が死ぬと、それらは、樹状細胞（ＤＣ）によって取り込みおよび提示される抗原を放出する。これらの腫瘍細胞における変異に起因して、これらの抗原の一部は、成熟ＤＣによってＴ細胞に提示され、それによってそれらを活性化し、抗腫瘍標的化を誘導する潜在力を有するがんネオエピトープを含む。しかし、負の調節機構ががん患者において上方調節される。例えば、チェックポイント、例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を介したシグナル伝達は、ネオエピトープの認識およびＴ細胞の活性化を制限し得る。

【0310】

ＡＤＣ形式で抗体にコンジュゲートされたペイロードは、樹状細胞成熟化経路を作動させるように関与し得、Ｔ細胞プライミングおよび増加した腫瘍Ｔ細胞標的化を可能にする増加した腫瘍抗原交差提示を生じる。種々のペイロード、例えば、ペイロード−０１０１を含む本発明のＥＤＢ ＡＤＣを利用して、免疫原性腫瘍環境を創出することによって腫瘍ネオ抗原の免疫認識を改善した。ＥＤＢ ＡＤＣと免疫腫瘍剤とが併用して与えられる場合、これらの環境は、負の調節経路を遮断する免疫腫瘍剤に対して応答性になる。

【0311】

ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１で処置したＥＭＴ６同系腫瘍の有効性研究からのデータは、ペイロード−０１０１に対するエフェクター応答が誘導されたことを示唆している。ＣＤ３＋Ｔ細胞の増加した浸潤が、ビヒクル対照と比較して、ＥＤＢ−Ｌ１９−ｖｃ−０１０１処置した腫瘍において観察された。さらに、処置された腫瘍におけるＰＤＬ１の増加した発現が観察され、これは、増加したエフェクターＴ細胞応答に起因するＩＦＮγ放出を示唆している。

【0312】

ＥＤＢ ＡＤＣを、免疫調節経路を標的化する薬剤、例えば、抗ＰＤＬ１アンタゴニスト抗体または抗４１ＢＢアゴニスト抗体と併用することは、抗腫瘍有効性を改善し、より耐久性がある応答を提供する可能性が高い。

【0313】

（実施例１３）
バイオマーカー／作用機構
ＮＳＣＬＣ ＰＤＸモデルＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２を、以前に記載されたように、ヌードマウスにおいて発達させた。ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１、ＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１およびＮｅｇ−ｖｃ−０１０１ ＡＤＣを、３ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射によって投与した（１群当たり１時点当たり４匹の動物）。単一の投与の９６時間後に、動物を麻酔し、生理食塩水で灌流した。生理食塩水灌流の後、腫瘍を取り出し、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を介した抗体およびＡＤＣの測定のために調製し、または免疫組織化学（ＩＨＣ）のために調製した。

【0314】

リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）
ＬＢＡアッセイについて、５×緩衝液を腫瘍サンプルに添加した。組織抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、６×の最終希釈で、１％プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）（ｖ／ｗ）を含有していた（μｇ／ｍＬホモジネート→μｇ／ｇ組織）。ステンレス鋼ビーズを添加し、組織を、Ｍｉｎｉ−Ｂｅａｄｂｅａｔｅｒ−９６（ＢｉｏＳｐｅｃ）を使用してホモジナイズした。ホモジネート（サンプルサイズに依存して約１００〜３００μＬ）を、適切なバイアル（Ｍａｒｓｈチューブ）に移し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（４℃）。遠心分離したホモジネートを、分析プロトコールに従う分析のためにＳｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（商標）で希釈した（ＭＲＤ）。

【0315】

表２５に示されるように、リガンド結合アッセイを使用して、ＥＤＢ ＡＤＣの単一用量投与後の、平均の総抗体およびＡＤＣの血漿濃度（μｇ／ｍＬ）と腫瘍濃度（μｇ／ｇ）を決定した。このデータは、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１が、Ｎｅｇ−ｖｃ−０１０１と比較して、総抗体およびＡＤＣによって測定されるように増加したレベルで腫瘍の部位において検出されたことを実証している。さらに、Ｎｅｇ−ｖｃ−０１０１と比較して、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１について、ＡＤＣおよび総抗体の両方について血漿対腫瘍比の減少が観察されており、これは、ＥＤＢ標的化ＡＤＣの腫瘍特異的標的化の増加した効率を示している。

【0316】

【表25】

【0317】

免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＡＤＣ分布、および応答の下流バイオマーカーの免疫組織化学的検出のために、サンプルを、１０％中性緩衝ホルマリン中で４８時間固定した。固定後、サンプルをパラフィン中に包埋し、５μＭで切片化した。切断したパラフィン切片を、キシレン代替品中で脱パラフィン処理し、蒸留水まで段階的アルコールで再水和した。抗原を、圧力鍋（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、ホスホ−ヒストンＨ３および切断型カスパーゼ３検出については１０ｍＭクエン酸塩緩衝液ｐＨ６．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または抗ヒトＩｇＧ検出および抗０１０１検出についてはＢｏｒｇ Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ緩衝液ｐＨ９．５（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中で回収し、室温に冷却した。内因性ペルオキシダーゼを、３％過酸化水素で１０分間ブロッキングした。非特異的タンパク質相互作用を、タンパク質ブロック（ＤＡＫＯ）で２０分間ブロッキングした。組織切片を、一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。一次抗体は以下のとおりであった：０．３μｇ／ｍＬ抗ヒト汎ＩｇＧ抗体（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ）；１０μｇ／ｍＬ抗０１０１ Ａｂ；０．１３μｇ／ｍＬ抗ホスホヒストンＨ３（ｐＨＨ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；１．３μｇ／ｍＬ抗切断型カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。マウス対マウスの検出を回避するために、抗０１０１アイソタイプ抗体を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８タンパク質標識キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８で標識した。未標識の一次抗体を、Ｓｉｇｎａｌｓｔａｉｎ Ｂｏｏｓｔ試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で３０分間検出した。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８標識した一次抗体を、１μｇ／ｍｌウサギ抗ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて室温で４５分間検出し、その後、Ｓｉｇｎａｌｓｔａｉｎ Ｂｏｏｓｔ試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で３０分間インキュベートした。ＤＡＢ＋（３’，３’−ジアミノベンジジン；Ｄａｋｏ）を使用して、５分間発色させた。切片を、ヘマトキシリン中で短時間対比染色し、水中で洗浄し、段階的アルコール中で脱水し、キシレン代替品中で透徹し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍを用いてカバーガラスをかけた。

【0318】

単一の用量の９６時間後に、慣習的ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１および部位特異的コンジュゲートされたＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１は共に、ＰＤＸ−ＮＳＸ−１１１２２ ＰＤＸモデルにおいて抗ヒトＩｇＧ ＩＨＣによって同様に検出された。有糸分裂停止のマーカーであるｐＨＨ３陽性細胞における増加が、陰性対照ＡＤＣ（Ｎｅｇ−ｖｃ−０１０１）で処置した腫瘍と比較して、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１の両方で処置した腫瘍において観察された。ｐＨＨ３有糸分裂停止マーカーを保有する細胞の大部分は、新生物性細胞であり、これは、バイスタンダー効果を示唆している。切断型カスパーゼ３染色は、陰性対照ＡＤＣ（Ｎｅｇ−ｖｃ−０１０１）で処置した腫瘍と比較して、ＥＤＢ−（Ｋ９４Ｒ）−ｖｃ−０１０１（およびＥＤＢ−（κＫ１８３Ｃ−Ｋ９４Ｒ−Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ−０１０１）で処置した腫瘍において、増加したアポトーシスを示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】