特表 2019-536480 Ｔ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのＣＤ７発現およびキメラ抗原受容体の遮断

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2019-536480(P2019-536480A)

(43)【公表日】2019年12月19日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのＣＤ７発現およびキメラ抗原受容体の遮断

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20191122BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20191122BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20191122BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20191122BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20191122BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20191122BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20191122BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20191122BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20191122BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20191122BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20191122BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10ZNA

   C12N5/078

   A61K35/17 Z

   A61P35/00

   A61P37/04

   A61P35/02

   C12N15/13

   C12N15/62

   C07K19/00

   C07K16/00

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】72

(21)【出願番号】特願2019-547605(P2019-547605)

(86)(22)【出願日】2017年11月22日

(85)【翻訳文提出日】2019年6月24日

(86)【国際出願番号】US2017063048

(87)【国際公開番号】WO2018098306

(87)【国際公開日】20180531

(31)【優先権主張番号】62/543,696

(32)【優先日】2017年8月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/425,398

(32)【優先日】2016年11月22日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】509034605

【氏名又は名称】ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】カンパーナ，ダリオ

(72)【発明者】

【氏名】ビナニカ，ナターシャ

(72)【発明者】

【氏名】神谷 尚宏

(72)【発明者】

【氏名】ピン，イ，ティアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BA03

4B065BC03

4B065CA44

4C085AA13

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4C085BB01

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4C085BB36

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4C085BB42

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4C085CC03

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG06

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087MA56

4C087MA66

4C087MA67

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

【課題】本発明は、Ｔ細胞悪性腫瘍の免疫療法のためのＣＤ７発現およびキメラ抗原受容体の遮断に関する。
【解決手段】本発明は、抗ＣＤ７キメラ活性化受容体（ＣＡＲ）および抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーを含む組成物、ならびに癌治療においてそのような組成物を使用する方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記標的結合分子が、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、核酸と、
ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ＣＡＲが、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞。

【請求項2】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第１の抗体が、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項3】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第２の抗体が、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１または２に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項4】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項5】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項6】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項7】

前記局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項8】

前記局在化ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む、請求項７に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項9】

前記局在化ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項７に記載の遺伝子操作細胞。

【請求項10】

前記４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項11】

前記ＣＡＲが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項12】

前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項13】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項14】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項15】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項16】

前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項17】

ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子であって、前記標的結合分子が、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、標的結合分子と、
ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記ＣＡＲが、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体と、を含む、ＣＡＲと、を含む、遺伝子操作免疫細胞。

【請求項18】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第１の抗体が、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１７に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項19】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第２の抗体が、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１７または１８に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項20】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項21】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項22】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項23】

前記局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項24】

前記局在化ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項25】

前記局在化ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項２３に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項26】

前記４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項27】

前記ＣＡＲが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項28】

前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項29】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項30】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項31】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項32】

前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項１７〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子操作免疫細胞。

【請求項33】

請求項１〜３２のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作免疫細胞と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項34】

請求項１〜３２のいずれか一項に記載の前記遺伝子操作免疫細胞を作製する方法であって、前記方法が、
ｉ）免疫細胞に、
ａ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、前記標的結合分子が、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、第１の核酸と、
ｂ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、前記ＣＡＲが、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体と、を含む、第２の核酸と、を導入することと、
ｉｉ）前記局在化ドメインに連結された前記標的結合分子および前記ＣＡＲを含む遺伝子操作免疫細胞を単離することと、を含む、方法。

【請求項35】

治療を必要とする被験体の癌を治療する方法であって、治療量の遺伝子操作免疫細胞を前記被験体に投与することと、それによって治療を必要とする被験体の癌を治療することと、を含み、
前記遺伝子操作免疫細胞が、
ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記標的結合分子が、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、核酸と、
ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ＣＡＲが、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体と、を含む、核酸と、を含む、方法。

【請求項36】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第１の抗体が、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

ＣＤ７に特異的に結合する前記第２の抗体が、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項３５または３６に記載の方法。

【請求項38】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記局在化ドメインが、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記局在化ドメインが、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記局在化ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記ＣＡＲが、ヒンジおよび膜貫通ドメインをさらに含む、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記ヒンジおよび膜貫通ドメインが、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記遺伝子操作細胞が、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である、請求項３５〜４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記遺伝子操作免疫細胞が、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によって前記被験体に投与される、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記癌が、Ｔ細胞悪性腫瘍である、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記Ｔ細胞悪性腫瘍が、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である、請求項５２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１６年１１月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４２５，３９８号、２０１７年８月１０日に出願された同第６２／５４３，６９６号の利益を主張するものであり、あらゆる目的のためにその全体が参照により明示的に組み込まれる。
配列表

【0002】

本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年１１月２１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、名称が１１９４１９−５００２−ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズが２０，９２８バイトである。

【背景技術】

【0003】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍細胞を特異的に認識して殺傷するように免疫細胞を転換することができる。ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介してシグナル伝達分子に連結された抗体の一本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）によって構成された人工多分子タンパク質である。ｓｃＦｖがその同種抗原と連結すると、シグナル伝達が引き起こされ、ＣＡＲ発現細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍細胞の殺傷をもたらす（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＣＡＲ発現自己Ｔリンパ球を用いた臨床試験は、Ｂ細胞不応性白血病およびリンパ腫の患者において陽性反応を示した（例えば、非特許文献６、非特許文献７）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Ｅｓｈｈａｒ Ｚ，Ｗａｋｓ Ｔ，ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ．９０（２）：７２０−７２４，１９９３

【非特許文献2】Ｇｅｉｇｅｒ ＴＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１０）：５９３１−５９３９，１９９９

【非特許文献3】Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ＲＪ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．９（３）：２７９−２８６，２００３

【非特許文献4】Ｃｏｏｐｅｒ ＬＪ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １０１（４）：１６３７−１６４４，２００３

【非特許文献5】Ｉｍａｉ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．１８：６７６−６８４，２００４

【非特許文献6】Ｔｉｌｌ Ｂ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１９（１７）：３９４０−３９５０，２０１２

【非特許文献7】Ｍａｕｄｅ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３７１（１６）：１５０７−１５１７，２０１４

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

Ｔ細胞悪性腫瘍を標的とするためのＣＡＲ技術の開発は、それらのＢ細胞対応物についてなされた進歩にかなり遅れている。Ｔ細胞悪性腫瘍に対する新規治療法が必要とされているが、現在までの進歩は遅い。特に、有効な免疫療法の選択肢は欠如しており、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）の治療は、集中的な化学療法および造血幹細胞移植に依存している。これらのアプローチの罹患率および死亡率にもかかわらず、結果は満足できるものではない。

【0006】

要するに、Ｔ細胞悪性腫瘍患者のための新規治療選択肢に対する未だ満たされていない大きな必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本発明は、（ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、その標的結合分子は、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、核酸と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体は、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体は、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0009】

いくつかの実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。いくつかの実施形態では、標的結合分子（例えば、ｓｃＦｖ）のプロテアソーム局在化は、ｓｃＦｖ配列を三要素モチーフ含有２１（ＴＲＩＭ２１）標的ドメイン配列に連結し、ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする核酸配列を共発現することによって達成される。

【0011】

いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。

【0015】

別の態様では、本発明は、（ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子であって、その標的結合分子は、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、標的結合分子と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体を含む、ＣＡＲと、を含む、遺伝子操作免疫細胞を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体は、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体は、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0017】

いくつかの実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。

【0023】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。

【0024】

別の態様では、本発明は、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞を作製する方法を提供する。本方法は、（ｉ）免疫細胞に、（ａ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む第１の核酸であって、前記標的結合分子は、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、第１の核酸と、（ｂ）ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む第２の核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体を含む、第２の核酸と、を導入することと、（ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子およびＣＡＲを含む遺伝子操作免疫細胞を単離し、それによって遺伝子操作免疫細胞を作製することと、を含む。

【0025】

さらに別の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体（例えば、患者）における癌を治療する方法を提供し、その方法は、治療量の遺伝子操作免疫細胞を患者に投与することと、それによって治療を必要とする被験体の癌を治療することと、を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、（ｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、その標的結合分子は、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体である、核酸と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体を含む、核酸と、を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第１の抗体は、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。特定の実施形態では、ＣＤ７に特異的に結合する第２の抗体は、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。

【0027】

いくつかの実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。特定の実施形態では、第１の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）保持配列、ゴルジ体保持配列、プロテアソーム局在化配列、およびＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳまたはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、配列番号８または配列番号９のアミノ酸配列を含む小胞体（ＥＲ）保持配列を含む。他の実施形態では、局在化ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン配列に由来する膜貫通ドメイン配列を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、ヒンジおよび膜貫通ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。さらに他の実施形態では、第２の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインと、を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。

【0033】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、または髄腔内投与によってその被験体（例えば、患者）に投与される。

【0034】

いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍である。一実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。

【0035】

本開示は、Ｔ細胞血液悪性腫瘍を治療するための遺伝子操作免疫細胞およびその使用方法を提供する。当業者は、ＣＡＲ Ｔ細胞の自己殺傷または同族殺傷および正常Ｔ細胞の殺傷が、ＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞がＴ細胞白血病を治療するために使用されるときに起こり得ることを認識する。そのようにして、Ｔ細胞同族殺傷を最小化または排除する遺伝子操作免疫細胞および治療方法が必要とされている。

【0036】

本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞および治療方法は、遺伝子操作された抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ細胞および抗ＣＤ７ ＣＡＲ−Ｔ細胞などの新規同族殺傷耐性ＣＡＲ−Ｔ細胞を利用する。遺伝子操作免疫細胞は、再発性Ｔ細胞悪性腫瘍を含むＴ細胞悪性腫瘍患者において強力かつ持続的な治療効果を引き出すことができる。そのような細胞は、顕著なエフェクターＴ細胞同族殺傷なしで悪性Ｔ細胞の効率的な標的化および殺傷をもたらすことができる。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】図１Ａ〜図１Ｄ。Ｔ−ＡＬＬにおけるＣＤ７発現を例示する図である。診断時、再発時、および化学療法中（ＭＲＤ）にＣＤ７を発現するＡＬＬ細胞の割合であり、それぞれの段階で試験した骨髄試料の数を示す（図１Ａ）。同じ試料からのＴ−ＡＬＬ細胞および残存正常Ｔ細胞におけるＣＤ７平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ｎ＝１９、対応のあるｔ検定によりＰ＜０．０００１）（図１Ｂ）。診断時または再発時のＴ−ＡＬＬ細胞（「Ｄ／Ｒ」）およびＭＲＤを有する追跡骨髄試料におけるＣＤ７ ＭＦＩである（ｎ＝１８）（図１Ｃ）。フローサイトメトリー等高線図は、代表的な１人の患者における診断時、ＭＲＤおよび再発時のＴ−ＡＬＬ細胞（ＣＤ３陰性）および正常Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）におけるＣＤ７発現を示す（図１Ｄ）。

【図2】図２Ａ〜図２Ｅ。抗ＣＤ７ ＣＡＲの設計、発現およびシグナル伝達を示す図である。抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物の模式図である（図２Ａ）。ＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）またはＧＦＰに加えて抗ＣＤ７ ＣＡＲのいずれかで形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞のフローサイトメトリー分析である。ドットプロットは、ＧＦＰ蛍光、ならびにビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）による染色後のＣＡＲ発現を示す（図２Ｂ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析である（図２Ｃ）。ｍｃｋ形質導入およびＣＡＲ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞の細胞溶解物を、還元条件下または非還元条件下で１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトＣＤ３ζ抗体（８Ｄ３，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプローブとして精査した。抗体結合は、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて明らかにした。抗ＣＤ７ ＣＡＲは、連結時に活性化マーカーの発現を誘導する。バーは、ＣＤ７＋ ＭＯＬＴ−４細胞の存在下または非存在下で２４時間後のＣＡＲ形質導入およびｍｏｃｋ形質導入Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ２５およびＣＤ６９ ＭＦＩの平均（±ＳＤ）を示す。ｔ検定によるＰ値を有意差について示す（＊＝０．０１６、＊＊＊＜０．００１）（図２Ｄ）。図２Ｅは、図２Ｄに示す実験の代表的なフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。

【図3-1】図３Ａ〜図３Ｉ。ヒト末梢血Ｔ細胞における抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現が、ＣＤ７の下方制御によって防止される同族殺傷をもたらすことを示す図である。抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後の２４時間に回収した生存Ｔ細胞の割合である（ｎ＝７）（図３Ａ）。生存細胞をフローサイトメトリーによって計数した。ＧＦＰ単独で形質導入された同一ドナー由来の細胞（「Ｍｏｃｋ」）と比較して、レトロウイルスベクターによるＣＡＲ形質導入後の２４時間に回収した生存Ｔ細胞の割合である（ｎ＝１０）（図３Ｂ）。形質導入後の週の間に回収した、ＣＡＲ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入した生存Ｔ細胞の割合である（図３Ｃ）。図３Ｂに示した１０の実験のうち５つについての追跡結果を示す。抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後のＴ細胞中のＣＤ１０７ａの割合である（図３Ｄ）。３回測定の平均（±ＳＤ）を示す。抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）構築物の概略図（図３Ｅ）。代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、３種の抗ＣＤ７ ＰＥＢＬのレトロウイルス形質導入後のＴリンパ球、またはｍｏｃｋ形質導入ＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）におけるＣＤ７発現を示す（図３Ｆ）。

【図3-2】Ｔ細胞を抗ＣＤ７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ７０１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−１がレトロウイルスで形質導入された、またはｍｏｃｋ形質導入されたＴ細胞におけるＣＤ７発現の割合（ｎ＝５）である（図３Ｇ）。フローサイトメトリードットプロットは、ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でのエレクトロポレーション後の１２時間の抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの発現と共に、ＰＥＢＬ形質導入によるＴ細胞におけるＣＤ７発現の下方制御を示す（図３Ｈ）。細胞をビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションされたが抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを含まないベクターで形質導入された細胞と比較して、抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡのエレクトロポレーション後の２４時間に回収した抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで形質導入された生存Ｔ細胞の割合である（ｎ＝６）（図３Ｉ）。生存細胞数をフローサイトメトリーにより測定した。＊＊、Ｐ＜０．０１。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。

【図4-1】図４Ａ〜図４Ｆ。ＰＥＢＬによるＣＤ７下方制御がＴ細胞表現型、増殖および機能性を変化させなかったことを示す図である。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬまたはＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）のいずれかによるレトロウイルス形質導入後の７〜１４日目のＣＤ４およびＣＤ８細胞の割合である（図４Ａ）。それぞれの記号は、異なるＴ細胞ドナーに対応する。（３人のドナー由来の）ＰＥＢＬ形質導入およびｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞の増殖速度は、２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２で１４日間維持された（図４Ｂ）。記号は、３回測定の平均値（±ＳＤ）を表す。ＰＥＢＬ形質導入およびｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下またはｍＲＮＡの非存在下のいずれかでエレクトロポレーションした（図４Ｃ）。フローサイトメトリードットプロットは、エレクトロポレーション後の１２時間のＧＦＰおよびＣＡＲ発現を示す。ＣＡＲは、ビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体およびストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。

【図4-2】抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションしたＰＥＢＬ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞のＣＤ１９＋ ＡＬＬ細胞（ＯＰ−１）に対する細胞傷害性である（図４Ｄ）。バーは、１：１ Ｅ：Ｔにおける４時間の細胞傷害性の平均（±ＳＤ）を示す。図４Ｅは、図４Ｄに記載された実験と同一の実験からのＴ細胞におけるＣＤ１０７ａ発現を示す。図４Ｆは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションし、Ｅ：Ｔ １：１で６時間、ＯＰ−１と共培養した、ＰＥＢＬ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞におけるＩＦＮγ産生を示す。バーは、３回の実験の平均（±ＳＤ）を表す。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。

【図5-1】図５Ａ〜図５Ｆ。抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現後、ＰＥＢＬによって下方制御されたＣＤ７を有するＴ細胞がＣＤ７＋白血病細胞に対して強力な細胞傷害性を獲得することを示す図である。抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞のＣＤ７＋細胞株に対する細胞傷害性である（図５Ａ）。１：１ Ｅ：Ｔにおける４時間アッセイのデータを示す。記号は、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔについて４人のドナー由来、ならびにＬｏｕｃｙおよびＫＧ１ａについて５人のドナー由来のＴ細胞をそれぞれ用いた３回の測定の平均を示す（それぞれの比較についてＰ＜０．００１）。Ｔ−ＡＬＬ患者由来の初代白血病細胞に対する、抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞の細胞傷害性である（図５Ｂ）。示されたＥ：Ｔにおける４時間アッセイのデータを示す。記号は、３回の測定の平均（±ＳＤ）を指す。図５Ｃは、抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡによるエレクトロポレーション後、５つのＣＤ７＋細胞株に対する、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬまたはＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）のいずれかで形質導入されたＴ細胞の全体的な特異的細胞傷害性を示す。３人のドナー由来のＴ細胞を１：１ Ｅ：Ｔにおいて４時間アッセイで試験した。それぞれの記号は、ｍＲＮＡ非存在下でエレクトロポレーションした同じＴ細胞で得られたパーセント細胞傷害性を差し引いた後の、ＣＤ７＋細胞株に対する特異的パーセント細胞傷害性を表す。水平バーは、それぞれのグループの中央値を示す。３人のドナー由来の抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を、抗ＣＤ７ ＣＡＲ ｍＲＮＡの存在下または非存在下でエレクトロポレーションした（図５Ｄ）。ＭＯＬＴ−４に対する細胞傷害性は、１：１ Ｅ：Ｔにおいて４時間アッセイで試験した。抗ＣＤ１０７ａ−ＰＥ（Ｈ４Ａ３，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。バーは、３回の実験の平均（±ＳＤ）を表す。

【図5-2】抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞を抗ＣＤ７ ＣＡＲ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入のいずれかでレトロウイルス形質導入し、Ｔ−ＡＬＬ患者由来の初代白血病細胞に対して試験した（図５Ｅ）。それぞれの記号は、３回の実験の平均（±ＳＤ）を表す。抗ＣＤ７ ＣＡＲの存在下または非存在下で順次形質導入されたｍｏｃｋ形質導入またはＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞を、単独でまたはＳｔｒｅｃｋ処理ＭＯＬＴ−４細胞の存在下で培養し、１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を毎週添加した（図５Ｆ）。記号は、３回の培養における投入細胞数に対する細胞回収率の平均（±ＳＤ）を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１、＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１

【図6】図６Ａ〜図６Ｄ。抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲを発現するＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞が異種移植片に抗腫瘍活性を及ぼすことを示す図である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにルシフェラーゼで標識された１×１０^６個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。２×１０^７個のＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞を、白血病細胞注入後７日目（図６Ａ）、または３日目および７日目（図６Ｂ）に、それぞれ３匹および５匹のマウスに静脈内投与した。残りのマウスは、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞、または細胞の代わりにＲＰＭＩ−１６４０（「対照」）のいずれかを受けた。全てのマウスは、２日に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）に２０，０００ＩＵのＩＬ−２を受けた。Ｄ−ルシフェリン腹腔内注入後の白血病細胞増殖のインビボイメージングを示す。図６Ｂの３日目のマウスの腹部画像は、全てのマウスにおいてＣＣＲＦ−ＣＥＭ生着を明示するために感度を高めて示されている。発光画像の完全な組を図１４に示す。図６Ｃは、図６Ａおよび図６Ｂに示したマウスにおける、１秒当たりの光子数として表した白血病細胞増殖を示す。それぞれの記号は、それぞれのマウスにおける生物発光測定値に対応し、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入前の全てのマウスにおける腹側プラス背側シグナルの平均に対して正規化されている。カプラン−マイヤー曲線は、異なる群（それぞれの群において８匹）におけるマウスの全生存率を示す（図６Ｄ）。総生物発光シグナルが毎秒１×１０^１０光子に達したときにマウスを安楽死させた。ログランク検定によって計算されたＰ値である。

【図7-1】図７Ａ〜図７Ｅ。患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおけるＥＴＰ−ＡＬＬに対するＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞活性を示す図である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおいて事前に増殖させた初代ＥＴＰ−ＡＬＬ細胞を、１０匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにマウス当たり２×１０^６細胞で静脈内（ｉ．ｖ．）注入した（図７Ａ）。５匹のマウス（「対照」）は未処置のままにした。残りの５匹のマウスは、示された時点（灰色の矢印）でＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の単回静脈内注入（ＰＥＢＬ−ＣＡＲ＃１では２×１０^７個、残りの４匹のマウスでは２×１０^６個）および２日ごとに２０，０００ＩＵのＩＬ−２を受け、５匹の対照マウスのうち２匹にＩＬ−２もまた投与した。黒い記号（左ｙ軸）は、末梢血中で計数されたＥＴＰ−ＡＬＬ細胞数／ｍＬを示す。灰色の記号（右ｙ軸）は、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の数を示す。血液単核細胞中のＥＴＰ−ＡＬＬ細胞の割合が≧８０％に到達したとき、マウスを安楽死させた。５匹の未処置マウスの様々な臓器におけるＥＴＰ−ＡＬＬ（分母、全ヒト＋マウスＣＤ４５＋細胞）の割合である（図７Ｂ）。Ｔ細胞注入後７日目の処置（ＰＥＢＬ−ＣＡＲ＃１）および未処置のＥＴＰ−ＡＬＬの血液塗抹標本であり、汚れ細胞は、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞後の血中で顕著であった（図７Ｃ）。

【図7-2】フローサイトメトリードットプロットは、ＥＴＰ−ＡＬＬを有する未処置対照マウスの組織におけるＣＤ７＋ ＣＤ３− ＥＴＰ−ＡＬＬ細胞の存在、およびＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞により処置したＰＥＢＬ−ＣＡＲ＃１マウスにおけるＣＤ７− ＣＤ３＋ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の存在を示す（図７Ｄ）。処置マウスではＥＴＰ−ＡＬＬ（＜０．０１％）が検出されなかった。示した事象は、対照マウスに示した対応するプロットについて得られた事象に対して正規化した。処置マウス（ＰＥＢＬ−ＣＡＲ＃１）および未処置マウスの脾臓である（図７Ｅ）。

【図8】図８Ａ〜図８Ｃ。抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの特異性および機能を示す図である。ＯＰ−１（ＣＤ７−）およびＭＯＬＴ−４（ＣＤ７＋）は、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖで形質導入された、またはＧＦＰ単独を含有するベクターで形質導入された（「対照」）、Ｊｕｒｋａｔ細胞から採取した上清と共にインキュベートした（図８Ａ）。洗浄後、細胞をビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共にインキュベートした。フローサイトメトリーヒストグラムは、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＭＯＬＴ−４への結合を示すが、ＯＰ−１への結合は示さない。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲ、抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲ、またはＧＦＰ単独を含有するベクターで形質導入された（図８Ｂ）。これらの細胞を１：１ Ｅ：ＴにおいてＣＤ７＋ ＭＯＬＴ−４またはＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞、またはＣＤ７−細胞ＯＰ−１と共培養した。標的細胞をカルセイン赤橙色ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。３０分のインキュベーション後、細胞ダブレットの百分率をフローサイトメトリーによって測定した。バーは、３回測定の平均（±ＳＤ）を示す。図８Ｃは、標的細胞を可溶性形態の抗ＣＤ７ ｓｃＦｖと共にプレインキュベートすることによって、ＣＡＲ媒介細胞凝集が阻害されることを示す。＊＊＊ Ｐ＜０．００１。

【図9】図９Ａ〜図９Ｂ。ヒト末梢血Ｔリンパ球における抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの発現を示す図である。図９Ａは、ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＩＬ−２で７日間活性化し、抗ＣＤ７ ＣＡＲで形質導入されたＴリンパ球の代表的なフローサイトメトリードットプロットを提示する。フローサイトメトリードットプロットは、ＧＦＰ蛍光およびＣＡＲ発現を示し、後者では、ビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体、続いてストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色することにより明らかにされた。図９Ｂは、ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析を示す。ｍｏｃｋ形質導入およびＣＡＲ形質導入Ｔ細胞の細胞溶解物を、還元条件下または非還元条件下で１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトＣＤ３ζ抗体（８Ｄ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプローブとして精査した。抗体結合は、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて明らかにした。

【図10】図１０Ａ〜図１０Ｂ。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬによるＣＤ７タンパク質発現の下方制御を示す図である。フローサイトメトリードットプロットは、ＧＦＰ発現（ｘ軸）、ＣＤ７発現（ｙ軸、上段）、および細胞内抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−１発現（ｙ軸、下段）を示す（図１０Ａ）。Ｔリンパ球を抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−１またはＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）を含むベクターによりレトロウイルス形質導入した。Ｔ細胞をフィコエリトリンに結合した抗ＣＤ７抗体（Ｍ−Ｔ７０１，ＢＤ Ｂｉｏｃｉｅｎｃｅｓ）により染色した。ＰＥＢＬ−１の細胞内発現を、ＥＲ結合モチーフに組み込まれた配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４０）に結合するＰＥ結合抗Ｍｙｃ抗体（９Ｂ１１；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて試験した。抗体標識の前に、細胞を８Ｅ試薬（出願人の研究室で開発された透過処理試薬）で透過処理した。図１０Ｂは、ＣＤ７ ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＰＥＢＬ１−３、ＧＦＰ単独（「ｍｏｃｋ」）で形質導入された、または形質導入されていない（「ＷＴ」）Ｊｕｒｋａｔ細胞から抽出した全ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを鋳型として使用した。ＣＤ７ ｃＤＮＡ（７２３ｂｐ）を以下のプライマーを用いて増幅した。フォワードは、ＡＴＧＧＣＣＧＧＧＣＣＴＣＣＧ（配列番号３８）、リバースは、ＴＣＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧ（配列番号３９）である。ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて１％アガロースゲル上で電気泳動を行った。テンプレート対照もまた示していない。対照として、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の８７ｂｐ（６７６〜７６２番目のヌクレオチド）領域を並行して増幅した。

【図11】図１１Ａ〜図１１Ｂ。抗ＣＤ７ ＣＡＲシグナルが、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬによるＣＤ７ノックダウン発現を伴うＴ細胞においてより高いサイトカイン分泌を誘発したことを示す図である。３人のドナー由来のＴリンパ球を抗ＣＤ７ ＰＥＢＬまたはＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）で形質導入し、抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ｍＲＮＡ存在下またはｍＲＮＡ非存在下のいずれかでエレクトロポレーションした。ＭＯＬＴ４と６時間共培養した後のＴ細胞における細胞内ＩＦＮγ（図１１Ａ）およびＴＮＦα（図１１Ｂ）の発現を測定した。バーは三重のＭＦＩ測定値の平均（±ＳＤ）を表す。＊＊、Ｐ＜０．０１。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。

【図12】抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲを発現するＣＤ７陰性Ｔ細胞がＣＤ７＋細胞株に対して抗腫瘍細胞傷害性を及ぼしたことを示す図である。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで形質導入し、次いでＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζまたはＧＦＰ単独（「Ｍｏｃｋ」）のいずれかで形質導入されたＴ細胞により実施した４時間細胞傷害性アッセイの結果を示す。記号は、示されたＥ：Ｔ比における３回の実験の平均（±ＳＤ）を表す。全ての比較についてＰ＜０．００１である。

【図13-1】図１３Ａ〜図１３Ｅ。抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζおよび抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの機能比較を示す図である。図１３Ａは、予め抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで形質導入された末梢血Ｔ細胞における抗ＣＤ１９および抗ＣＤ７ ＣＡＲ（ｍＣｈｅｒｒｙ含有ベクター中）の発現を示す。フローサイトメトリードットプロットは、ｍＣｈｅｒｒｙ発現と、ビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２抗体、続いてアロフィコシアニンに結合されたストレプトアビジンによるＴ細胞の染色と、を示す（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。ｍＣｈｅｒｒｙ単独（「Ｍｏｃｋ」）を含むベクターで形質導入されたＴ細胞を用いた結果もまた示した。ＣＤ１９およびＧＦＰを含有するベクターで形質導入されたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１９の発現である（図１３Ｂ）。ＣＤ１９を抗ＣＤ１９ ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で検出した。異なるＥ：Ｔ比で抗ＣＤ１９または抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞によりＣＤ１９＋ ＣＣＲＦ−ＣＥＭまたはＣＤ１９＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞を標的とする４時間細胞傷害性アッセイである（図１３Ｃ）。記号は、３回測定の平均（±ＳＤ）を示す。全てのＥ：Ｔ比において、ＣＡＲ対ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞のいずれかを用いたデータについて、Ｐ＜０．００１である。

【図13-2】ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた生細胞画像分析によって測定された、異なるＥ：Ｔ比での抗ＣＤ１９または抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の長期細胞傷害性である（図１３Ｄ）。記号は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を含むか、またはＴ細胞を含まないウェル中のＣＤ１９＋ ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（上）またはＣＤ１９＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞（下）の３回の測定の平均値（±ＳＤ）を示す。測定を４時間間隔で行った。ＣＤ１９＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞との共培養を伴うか、また伴わない抗ＣＤ１９および抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖能である（図１３Ｅ）。抗ＣＤ１９または抗ＣＤ７ ＣＡＲまたはｍＣｈｅｒｒｙ単独で順次形質導入した抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞を、単独でまたは照射ＣＤ１９＋ Ｊｕｒｋａｔ細胞の存在下で培養し、毎週１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を添加した。記号は、３回の培養における投入細胞数に対する細胞回収の平均（±ＳＤ）百分率を示す。

【図14-1】図１４Ａ〜図１４Ｃ。マウスモデルにおいて抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲを発現するＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞が抗腫瘍活性を及ぼしたことを示す図である。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにルシフェラーゼで標識された１×１０^６個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を静脈内注入した。２×１０^７個のＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞を、白血病細胞注入後７日目（図１４Ａ）または３日目および７日目（図１４Ｂ）に、それぞれ３匹および５匹のマウスに静脈内投与した。残りのマウスは、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞、または細胞の代わりにＲＰＭＩ−１６４０（「対照」）のいずれかを受けた。全てのマウスは、２日に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）に２０，０００ＩＵのＩＬ−２を受けた。白血病細胞増殖のインビボイメージングを、Ｄ−ルシフェリンの腹腔内注入後に行った。図１４Ｂの３日目のマウスの腹部画像は、全てのマウスにおいて白血病細胞の生着を明示するために感度を高めて示されている。

【図14-2】白血病細胞増殖は、ＣＡＲ−Ｔ細胞注入前の全てのマウスにおける腹側シグナルと背側シグナルとの加算の平均に対して正規化された、経時的な毎秒光子数として表された（図１４Ｃ）。それぞれの記号は、それぞれのマウスの生物発光測定に対応する。

【図15】図１５Ａ〜図１５Ｂ。抗ＣＤ７−４１ＢＢＣＤ３ζ ＣＡＲを発現するＰＥＢＬ形質導入Ｔ細胞が、マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を及ぼし、再発時に採集された細胞に対する活性を維持したことを示す図である。図１５Ａは、ルシフェラーゼで標識したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を静脈内注入し、次いで、図６Ｃについて記載したように、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞、または細胞の代わりにＲＰＭＩ−１６４０（「対照」）のいずれかで静脈内処置したＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウス由来の血液中の白血球中のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の割合を示す。「対照」および「Ｍｏｃｋ」については、白血病細胞注入後１７〜２３日目の１０^１０光子／秒の生物発光閾値に達した安楽死させたマウスから血液を得た。ＰＥＢＬ−ＣＡＲマウスについては、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ注入後２４日目に頬穿刺を介して血液を得た。ＰＥＢＬ−ＣＡＲで処置したマウスの脾臓および肝臓から再発時に採集したＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を２日間培養した（図１５Ｂ）。次にそれらを注入に本来使用されたＰＥＢＬ−ＣＡＲ形質導入またはｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞を使用するＥ：Ｔ １：１での４時間細胞傷害性アッセイにおける標的として使用した。異種移植片を作製するために使用された同じバッチのＣＣＲＦ−ＣＥＭ発現ルシフェラーゼ細胞でもまた比較を行った。パーセント細胞傷害性は、ＢｒｉｇｈｔＧｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加後、生物発光シグナルのプレート測定から決定した。バーは、３回測定値の平均（±ＳＤ）を示し、白および灰色のバーのそれぞれは、１匹のマウス由来の細胞に対応する。

【図16】診断時およびＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおける増殖後のＥＴＰ−ＡＬＬの免疫表現型の特徴を示す図である。フローサイトメトリー等高線図は、この研究においてＰＤＸモデルを開発するために使用されたＥＴＰ−ＡＬＬの免疫表現型診断骨髄試料、および図７に示した対照マウスのうちの１匹の脾臓から回収されたＥＴＰ−ＡＬＬ細胞の免疫表現型診断骨髄試料を示す。以下の抗体を使用した。全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣＤ７−ＰＥ、ＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７、ＣＤ３４−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８−ＢＶ５１０、ＣＤ５−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ（細胞質染色用）、ＣＤ３−Ｖ４５０（表面染色用）、ＣＤ３３−ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１ａ−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。象限は、同じ蛍光色素に結合されたアイソタイプ一致非反応性抗体による染色に基づいて描かれた。

【図17】本発明の例示的な実施形態の概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本発明の例示的な実施形態の説明は、以下の通りである。

【0039】

本発明は、Ｔ細胞悪性腫瘍の一次マーカーであり、早期Ｔ細胞前駆細胞急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）を含むＴ細胞ＡＬＬの全症例において高度に発現される、４０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質である、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の設計に部分的に基づく。本明細書に記載されたように、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、Ｔ細胞がＴ細胞悪性腫瘍に対して特異的な細胞傷害性を及ぼすように誘導する。さらに、抗ＣＤ７ ＣＡＲをエフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方制御と組み合わせて使用したとき、Ｔ細胞の細胞傷害性が著しく増加することが示された。本明細書に明示されたように、ＣＤ７の下方制御（例えば、除去、減少、および／または再局在化）は、対応する抗ＣＤ７ ＣＡＲによって及ぼされる同族殺傷効果を防ぎ、標的抗原（例えば、ＣＤ７）を保持した細胞と比較してＣＡＲ発現後のＴ細胞回収をより多くし、Ｔ白血病／リンパ腫細胞に対するより効果的な細胞傷害性をもたらす。

【0040】

したがって、一態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞に関し、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に特異的に結合する抗体と、を含む。本発明のＣＡＲは、本明細書において「抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ」と称する場合がある。例示的な実施形態を図１７に示す。

【0041】

本明細書で使用される場合、「遺伝子操作」免疫細胞は、天然に存在する免疫細胞と比較して遺伝的に改変されている免疫細胞を含む。例えば、本発明の方法に従って製造された遺伝子操作Ｔ細胞は、そのヌクレオチド配列が由来するＴ細胞中に天然には存在しないヌクレオチド配列を含む核酸を保有する。

【0042】

特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞である。本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、複数のヌクレオチドモノマー（例えば、リボヌクレオチドモノマーまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を含むポリマーを指す。「核酸」には、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子が挙げられる。核酸分子は、天然に存在するもの、組換え型のもの、または合成のものであり得る。さらに、核酸分子は一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得る。特定の実施形態では、核酸分子を修飾することができる。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、分子のいずれかの鎖または両方の鎖を指すことができる。

【0043】

核酸に関して「ヌクレオチド配列」という用語は、リン結合（例えば、ホスホジエステル、アルキルホスホナートおよびアリールホスホナート、ホスホロチオアート、ホスホトリエステル結合）および／または非リン結合（例えば、ペプチド結合および／またはスルファマート結合）などの共有結合によって連結されている連続した一連のヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、例えば、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、非相同配列（例えば、異なる種または細胞型起源のものである遺伝子）である。

【0044】

用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオチドモノマー」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドモノマー、ならびに天然に存在しないそれらの誘導体および類似体を指す。したがって、ヌクレオチドは、例えば、天然に存在する塩基（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、イノシン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、またはデオキシシチジン）を含むヌクレオチドおよび当技術分野で公知の修飾塩基を含むヌクレオチドを含むことができる。

【0045】

当業者に理解されるように、いくつかの態様では、核酸は、プラスミド配列をさらに含む。プラスミド配列は、例えば、プロモーター配列、選択マーカー配列、または遺伝子座標的化配列のうちの１つ以上の配列を含むことができる。

【0046】

本明細書で使用される場合、「抗体」とは、改変されているかもしくは遺伝子操作されている、またはヒト抗体である、インタクトな抗体または抗原結合フラグメントを含む、インタクトな抗体または抗体の抗原結合フラグメントを意味する。改変されたまたは遺伝子操作された抗体の例は、キメラ抗体、ヒト化抗体、多パラトピック抗体（例えば、バイパラトピック抗体）、および多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、ミニボディおよびダイアボディが挙げられる。

【0047】

「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的な（または選択的な）免疫反応性」という用語は、タンパク質またはペプチドを指すとき、多くの場合、タンパク質とその他の生物製剤との不均一集団において、タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンドの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍から１００倍を超える量で特定のタンパク質に結合する。そのような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対する抗体の特異性について選択された抗体を必要とする。例えば、ポリクローナル抗体は、選択された抗原と特異的に免疫反応し、かつ他のタンパク質とは免疫反応しないポリクローナル抗体のみを得るために選択することができる。この選択は、他の分子と交差反応する抗体を差し引くことによって達成されてもよい。様々なイムノアッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択してもよい。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するために日常的に使用されている（例えば、特異的免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明について、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９８）を参照のこと）。

【0048】

特定の実施形態では、ＣＤ７に結合する抗体は、一本鎖可変フラグメント抗体（「ｓｃＦｖ抗体」）である。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体フラグメントを指し、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。全般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。また、国際出願ＰＣＴ／ＷＯ８８／０１６４９号ならびに米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号を参照されたい。当業者には理解されるように、様々な好適なリンカーを、当技術分野で提供されているように、また本明細書に開示されているように、最適な機能について設計かつ試験することができる。

【0049】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１および配列番号２に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性をそれぞれ有するアミノ酸配列を有する、可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号１のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号２のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。いくつかの場合では、重鎖可変領域は、配列番号１に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号１に記載の配列中に１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号２に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、軽鎖可変領域は、配列番号２に記載の配列中に１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号２３に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態では、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号２４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0050】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１４および配列番号１５に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性をそれぞれ有する配列を有する、可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号１４のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号１５のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。

【0051】

場合によっては、重鎖可変領域は、配列番号１４に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号１４に記載の配列中に１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号１５に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号１５に記載の配列中に１０個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）の置換を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号２５に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態では、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号２６に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0053】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１６および配列番号１７に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性をそれぞれ有する配列を有する、可変重鎖（重鎖可変領域またはＶＨ）および可変軽鎖（軽鎖可変領域またはＶＬ）を含む。重鎖可変領域は、配列番号１６のＶＨ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。軽鎖可変領域は、配列番号１７のＶＬ配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含み得る。

【0054】

いくつかの場合では、重鎖可変領域は、配列番号１６に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号１６に記載の配列中に１３個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個）の置換を含む。いくつかの場合では、軽鎖可変領域は、配列番号１７に記載の配列中に少なくとも１個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上）のアミノ酸置換を含む。特定の場合では、重鎖可変領域は、配列番号１７に記載の配列中に５個以下のアミノ酸（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１個）の置換を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨをコードする核酸配列は、配列番号２７に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。他の実施形態では、ＶＬをコードする核酸配列は、配列番号２８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ７抗体の可変重鎖配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のｓｃＦｖは、抗ＣＤ７抗体の可変軽鎖配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む。例えば、抗ＣＤ７抗体は、当業者によって認識されている任意のそのような抗体であり得る。

【0056】

【表1】

【0057】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【0058】

「配列同一性」という用語は、デフォルトギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列されたとき、２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列が少なくとも７０％の配列同一性、または少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも８５％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性、または少なくとも９５％以上の配列同一性を共有することを意味する。配列比較のために、一般的には、一方の配列は、参照配列（例えば、親配列）の役割を果たし、その参照配列に対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列および参照配列は、コンピューターに入力され、必要な場合、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。

【0059】

比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性法の検索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実装、または目視検査（全般的には、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、このアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公的に入手可能である（国立衛生研究所ＮＣＢＩインターネットサーバを通して公的にアクセス可能）。一般的に、デフォルトのプログラムパラメータを使用して配列比較を実行することができるが、カスタマイズされたパラメータもまた使用することができる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９８９）を参照されたい）。

【0060】

当業者には理解されるように、特定の実施形態では、本明細書に開示されている様々な構成要素の任意の配列（例えば、ｓｃＦｖ、細胞内シグナル伝達ドメイン、ヒンジ、リンカー、局在化配列、およびそれらの組み合わせ）は、本明細書に開示される特定の対応する配列に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。例えば、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢは、所望の機能を有する限り、配列番号３に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。特定の実施形態では、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３に記載の配列（ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ）を含む。

【0061】

別の例として、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン４−１ＢＢは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＡＦ１、またはＣＤ２などの共刺激分子由来の別の細胞内シグナル伝達ドメインで置換することができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＡＦ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。

【0062】

別の例として、特定の場合では、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインはまた、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＡＦ１、またはＣＤ２などの共刺激分子由来の別の細胞内シグナル伝達ドメイン（またはその一部）を含むことができる。いくつかの実施形態では、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＡＦ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインに対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。他の実施形態では、追加の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＡＦ１、またはＣＤ２の細胞内シグナル伝達ドメインフラグメント（複数可）に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む。

【0063】

別の例として、特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインＣＤ３ζは、所望の機能を有する限り、配列番号４に対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。特定の実施形態では、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４に記載の配列（ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ）を含む。

【0064】

いくつかの事例では、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）またはその一部を含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭに対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含むことができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、所望の機能を有する限り、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＯＸ４０またはＨ２−Ｋｂに対して、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有することができる。

【0065】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。本発明での使用に好適なヒンジおよび膜貫通配列は、当技術分野において公知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１６／１２６２１３号により提供されている。特定の実施形態では、ヒンジ配列は、配列番号５に記載の配列（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ）を含む。特定の実施形態では、膜貫通配列は、配列番号６に記載の配列（ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲのヒンジおよび膜貫通ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＦＧＦＲ２Ｂ、または他の膜貫通タンパク質由来のシグナル伝達ドメイン（例えば、膜貫通ドメイン）を含むことができる。

【0066】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、ＣＤ８αシグナルペプチド（ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＬＬＨＬＡＡＲＰ、配列番号７）をさらに含む。本明細書に記載の実施形態を含む抗ＣＤ７ ＣＡＲの概略図を図１７に示す。

【0067】

本発明の特定の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３７が挙げられるが、これらに限定されない、細胞の表面に発現される分子に結合することができる。

【0068】

本明細書に記載されたように、抗ＣＤ７ ＣＡＲがエフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方制御と組み合わせて使用されたとき、Ｔ細胞の細胞傷害性が顕著に増加することが示された。本明細書に明示されたように、ＣＤ７の下方制御（例えば、除去、減少、および／または再局在化）は、対応する抗ＣＤ７ ＣＡＲによって及ぼされる同族殺傷効果を防ぎ、標的抗原（例えば、ＣＤ７）を保持した細胞と比較してＣＡＲ発現後のＴ細胞回収をより多くし、Ｔ白血病／リンパ腫細胞に対するより効果的な細胞傷害性をもたらす。当業者が理解するように、エフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方制御は、例えば、（国際公開第２０１６／１２６２１３号に記載されているような）ＣＤ７に対する「細胞内発現抗体」、ＣＤ７に対するＲＮＡｉ、または、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集方法を含む様々な既知の方法に従って達成することができる。

【0069】

特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。「局在化ドメインに連結された標的結合分子」は、本明細書においてタンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）と称する場合もあれば、または場合によっては、その教示が参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２０１６／１２６２１３号に記載されているように、「細胞内発現抗体」と称する。ＰＥＢＬの例示的な実施形態を図３Ｅおよび図１７に示す。

【0070】

本明細書で使用される場合、タンパク質発現ブロッカーの文脈において「連結される」とは、１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に隣接して直接インフレームで（例えば、リンカーなしで）標的結合分子をコードする遺伝子を指す。あるいは、標的結合分子をコードする遺伝子は、例えば、国際公開第２０１６／１２６２１３号に記載されているように、リンカー配列を介して１つ以上の局在化ドメインをコードする１つ以上の遺伝子に接続されてもよい。当業者には理解されるように、そのようなリンカー配列およびそのようなリンカー配列の変異体は、当技術分野において公知である。リンカー配列を組み込んだ構築物を設計する方法および機能性を評価する方法は、当業者には容易に利用可能である。

【0071】

特定の実施形態では、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＶＨ配列と、配列番号２に記載のＶＬ配列と、を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４に記載のＶＨ配列と、配列番号１５に記載のＶＬ配列と、を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１６に記載のＶＨ配列と、配列番号１７に記載のＶＬ配列と、を含む。本明細書に記載のように、特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１および配列番号２、それぞれ配列番号１４および配列番号１５、またはそれぞれ配列番号１６および配列番号１７に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、それぞれ少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有するＶＨおよびＶＬを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号２３の核酸配列および抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号２４の核酸配列を使用して、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーが作製される。他の実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号２５の核酸配列および抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号２６の核酸配列を使用して、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーが作製される。特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする配列番号２７の核酸配列および抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする配列番号２８の核酸配列を使用して、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーが作製される。

【0073】

特定の実施形態では、本明細書に記載したように、ＣＡＲの文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、標的結合分子の文脈においてＣＤ７に結合する抗体（ＰＥＢＬ）とは異なり得る。単なる例示として、ＣＡＲの文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、配列番号１に記載のＶＨ配列と、配列番号２に記載のＶＬ配列、を含むことができるが、ＰＥＢＬの文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、配列番号１４に記載のＶＨ配列と、配列番号１５に記載のＶＬ配列と、を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したように、ＣＡＲの文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、標的結合分子（ＰＥＢＬ）の文脈においてＣＤ７に結合する抗体と同一であり得る。

【0074】

特定の実施形態では、ＰＥＢＬの局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体保持配列と、プロテオソーム局在化配列と、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列と、を含む。特定の実施形態では、局在化ドメインは、本明細書に記載されたように、小胞体（ＥＲ）保持ペプチドＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＫＤＥＬ（配列番号８）、（ＧＧＧＧＳ）_４ＡＥＫＤＥＬ（配列番号９）、またはＫＹＫＳＲＲＳＦＩＤＥＫＫＭＰ（配列番号１１）が続くＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ）（配列番号１０）を含む。局在化ドメインは、用途に応じて、ＰＥＢＬをゴルジ体または小胞体、プロテアソーム、または細胞膜などの特定の細胞区画に誘導することができる。ＥＲまたはゴルジ体保持配列は、アミノ酸配列ＫＤＥＬ（配列番号１８）、ＫＫＸＸ（配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号１９）、（ＫＸＤまたはＫＸＥなどの）ＫＸＤ／Ｅ（配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号２０）、またはＹＱＲＬ（配列番号２１）を含む。プロテアソーム局在化配列は、ＰＥＳＴ（配列番号２２）モチーフを含むことができる。

【0075】

いくつかの実施形態では、プロテアソーム局在化は、ｓｃＦｖ配列を三要素モチーフ含有２１（ＴＲＩＭ２１）標的ドメイン配列に連結し、ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質をコードする配列を共発現することによって達成される。ＴＲＩＭ２１は、抗体のＦｃドメインに高い親和性で結合し、ユビキチン−プロテオソーム複合体を動員して抗体に結合した分子（例えば、タンパク質およびペプチド）を分解することができる。ＴＲＩＭ２１標的ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４などのヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）遺伝子の群から選択されるアミノ酸配列をコードし、ｓｃＦｖドメインおよびＦｃドメインを含む融合タンパク質を形成するために使用される。この実施形態では、外因的に発現されたＴＲＩＭ２１タンパク質は、標的タンパク質（例えば、ＣＤ７）に結合したｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質に結合し、複合体を分解のためにプロテアソームに誘導する。

【0076】

ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３リガーゼタンパク質のアミノ酸配列の詳細は、例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．Ｎｏ．ＮＰ００３１３２．２でＮＣＢＩタンパク質データベースに見出すことができる。ヒトＴＲＩＭ２１ Ｅ３リガーゼタンパク質をコードする核酸配列の詳細は、例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．Ｎｏ．ＮＭ＿００３１４１．３でＮＣＢＩタンパク質データベースに見出すことができる。

【0077】

特定の実施形態では、タンパク質発現ブロッカーは、国際公開第２０１６／１２６２１３号に開示されているような任意の１種以上の抗ＣＤ７ ＰＥＢＬであり、その開示は、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞は、国際公開第２０１６／１２６２１３号に記載されているように、ＣＤ７に結合するＰＥＢＬ（局在化ドメインに連結された標的結合分子）を含むことができる。図２、ならびに国際公開第２０１６／１２６２１３号の表１および表２に記載されているような、抗ＣＤ７細胞内発現抗体の成分の配列である。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬの例示的な実施形態を図３Ｅおよび図１７に図示する。

【0078】

【表3】

【0079】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列と、ＶＨ−ＶＬリンカーと、を含む。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり得、ｎは、１〜６の範囲、例えば、１、２、３、４、５、または６であり得る。一実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号８、配列番号９、または配列番号１３に記載のいずれか１つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号７に記載のＣＤ８αシグナルペプチドなどのＣＤ８αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号１０に記載のＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１４のアミノ酸配列と、配列番号１５のアミノ酸配列と、ＶＨ−ＶＬリンカーと、を含む。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり得、ｎは、１〜６の範囲、例えば、１、２、３、４、５、または６であり得る。一実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１４のアミノ酸配列と、配列番号１５のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１４に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１５のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１４のアミノ酸配列と、配列番号１５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１４に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号５に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号８、配列番号９、または配列番号１３に記載のいずれか１つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号７に記載のＣＤ８αシグナルペプチドなどのＣＤ８αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号１０に記載のＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１６のアミノ酸配列と、配列番号１７のアミノ酸配列と、ＶＨ−ＶＬリンカーと、を含む。ＶＨ−ＶＬリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり得、ｎは、１〜５の範囲、例えば、１、２、３、４、５、または６（配列番号２９）であり得る。一実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１６のアミノ酸配列と、配列番号１７のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１７のアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。特定の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１６のアミノ酸配列と、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。他の実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１６に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１２のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの事例では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、配列番号８、配列番号９、または配列番号１３に記載のいずれか１つの配列から選択される局在化ドメインを含む。場合によっては、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号７に記載のＣＤ８αシグナルペプチドなどのＣＤ８αシグナルペプチドを含む。他の場合では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーはまた、限定されるものではないが、配列番号１０に記載のＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインなどのＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードする核酸配列は、表４に記載の１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号２３に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、ＰＥＢＬの抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号２４に対して、少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。

【0083】

【表4-1】

【表4-2】

【0084】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーの局在化ドメインをコードする核酸配列は、配列番号３２、配列番号３３、もしくは配列番号３４から選択される配列、またはそれらのコドン最適化変異体を含む。

【0085】

本発明の特定の態様では、タンパク質発現ブロッカーは、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、およびＣＤ１３７が挙げられるが、これらに限定されない、細胞の表面上に発現される分子に結合することができる。

【0086】

本発明のいくつかの態様では、糖タンパク質のＣＤ１ファミリーのメンバー、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ９９、ＣＤ１２７、またはＣＤ１３７の発現は、これらに限定されるものではないが、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはジンクフィンガーヌクレアーゼなどの遺伝子編集技術を用いて下方制御することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ７発現は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集を用いてノックアウトされる。他の実施形態では、ＣＤ５発現は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集を用いてノックアウトされる。

【0087】

上記のように、エフェクターＴ細胞上のＣＤ７発現の下方制御は、例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子編集方法を含む様々な他の公知の方法に従って達成することができる。したがって、特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、改変ＣＤ７遺伝子をさらに含み、その改変は、ＣＤ７遺伝子またはタンパク質を非機能的にする。例として、本発明の遺伝子操作免疫細胞は、ＣＤ７の発現を妨げるかまたは減少させる、かつ／または別の方法で（例えば、構造的に）ＣＤ７タンパク質が抗ＣＤ７ ＣＡＲによって認識されるのを妨げる、改変された（例えば、非機能的）ＣＤ７遺伝子（例えば、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて改変された）をさらに含む。そのような方法を用いて遺伝子発現を改変する方法は、容易に利用可能であり、当該分野において周知である。

【0088】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ６技術を使用して免疫細胞中の標的遺伝子を不活性化する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２７２９９９号、同第２０１７／０２０４３７２号および同第２０１７／０１１９８２０号に記載されている。

【0089】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的とした遺伝子操作（ゲノム改変）を誘導するためのシステムである。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）内の「シード」配列およびｇＲＮＡ結合領域の上流にある保存されたマルチヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を必要とする。それによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞株、初代細胞、および遺伝子操作細胞中のｇＲＮＡを再設計することによって実質的に任意のＤＮＡ配列を切断するように遺伝子操作することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単一のＣａｓ９タンパク質を２つ以上のｇＲＮＡと同時発現させることによって複数のゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができ、このシステムが複数遺伝子編集または標的遺伝子の相乗的活性化に特異的に好適であるようになる。遺伝子発現を阻害するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの例は、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号ならびに米国特許第８，６９７，３５９号および同第８，７７１，９４５号に記載されている。このシステムは、ＲＮＡ誘導Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用してＤＮＡ二本鎖切断を導入する永久的な遺伝子破壊を誘導し、これがエラーを起こしやすい修復経路を引き起こしてフレームシフト変異を引き起こす。場合によっては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても既知）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓｘＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｔ７、Ｆｏｋ１、当技術分野において公知の他のヌクレアーゼ、それらの同族体、またはそれらの改変体を含む他のエンドヌクレアーゼもまた使用されてもよいが、これらに限定されない。

【0090】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なｇＲＮＡ配列およびＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入することを可能にする複合体を形成するときに生じる。いくつかの事例では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列および標的遺伝子に特異的なガイド核酸配列を含む、１つ以上の発現ベクターを含む。ガイド核酸配列は、遺伝子に特異的であり、その遺伝子をＣａｓエンドヌクレアーゼ誘導二本鎖切断について標的化する。ガイド核酸配列の配列は、遺伝子の遺伝子座内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイド核酸配列は、ヌクレオチド長が少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、またはそれ以上である。ガイド核酸配列には、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、それらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）などの合成ヌクレオチドを伴う配列が挙げられる。ガイド核酸配列は、単一分子または二重分子であり得る。一実施形態では、ガイド核酸配列は、単一のガイドＲＮＡを含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを介して改変され、ヒトＣＤ７遺伝子を不活性化することができる。ヒトＣＤ７遺伝子のゲノム構造および配列の詳細は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎｅデータベースのＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．９２４に見出すことができる。

【0092】

特定の標的遺伝子のノックアウトのための市販のキット、ｇＲＮＡベクターおよびドナーベクターは、例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＡＢＭ；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｏｍｂｉａ）、ＢｉｏＣａｔ（Ｈｅｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などから入手可能である。例えば、ＣＲＩＳＰＲによるＣＤ７のノックアウトのための市販のキットまたはキット構成要素は、例えば、それぞれＯｒｉｇｅｎｅから入手可能な、カタログ番号ＫＮ２０１２３１、ＫＮ２０１２３１Ｇ１、ＫＮ２０１２３１Ｇ２、およびＫＮ２０１２３１Ｄとして入手可能なもの、ならびにＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手可能な、カタログ番号ｓｃ−４０７２８４７、ｓｃ−４０７２８４７−ＫＯ−２、ｓｃ−４０７２８４７−ＨＤＲ−２、ｓｃ−４０７２８４７−ＮＩＣ、ｓｃ−４０７２８４７ＨＤＲ−２、およびｓｃ−４０７２８４７−ＮＩＣ−２として入手可能なものを含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のキメラ抗原受容体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてヒトＣＤ７遺伝子座に導入することができる。

【0094】

特定の実施形態では、ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に特異的に結合する抗体と、を含む、核酸と、ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞が提供される。特定の実施形態では、ＣＡＲの文脈においてかつ標的結合分子の文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、配列番号１に記載のＶＨ配列および配列番号２に記載のＶＬ配列、配列番号１４に記載のＶＨ配列および配列番号１５に記載のＶＬ配列、または配列番号１６に記載のＶＨ配列および配列番号１７に記載のＶＬ配列、を含む。本明細書に記載されたように、特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１および配列番号２、それぞれ配列番号１４および配列番号１５、またはそれぞれ配列番号１６および配列番号１７に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、それぞれ少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む配列を有するＶＨおよびＶＬを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲの文脈においてＣＤ７に結合する抗体は、本明細書に記載されたように、標的結合分子（タンパク質発現ブロッカーまたはＰＥＢＬ）の文脈においてＣＤ７に結合する抗体とは異なり得る。特定の実施形態では、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３に記載の配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４に記載の配列を含む。

【0095】

別の態様では、本明細書に記載されたように、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸もまた提供され、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に結合する抗体と、を含む。

【0096】

特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＶＨ配列および配列番号２に記載の可変軽鎖ＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１４に記載のＶＨ配列および配列番号１５に記載の可変軽鎖ＶＬ配列を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１６に記載のＶＨ配列および配列番号１７に記載の可変軽鎖ＶＬ配列を含む。本明細書に記載されたように、特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、それぞれ配列番号１および配列番号２、それぞれ配列番号１４および配列番号１５、またはそれぞれ配列番号１６および配列番号１７に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列に対して、それぞれ少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９１％の配列同一性、少なくとも９２％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９４％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、少なくとも９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を含む配列を有するＶＨおよびＶＬを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。

【0097】

特定の実施形態では、本発明の単離された核酸は、表５によるＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表５によるＣＡＲの構成成分をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0098】

【表5】

【0099】

いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列と、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ８ヒンジおよび膜貫通ドメインと、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ＣＡＲはまた、これらに限定されるものではないが、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーなどのＶＨ−ＶＬリンカーであり得、ｎは、１〜６の範囲、例えば、１、２、３、４、５、または６であり得る。

【0100】

一実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１のアミノ酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸配列と、配列番号１０のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸配列と、配列番号１０のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸配列と、配列番号１０のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸配列と、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１０のアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３のアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸配列と、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、を含む。

【0101】

特定の実施形態では、本発明の単離された核酸は、表６の１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、表６に記載のＣＡＲの成分のヌクレオチド配列を含む。

【0102】

【表6-1】

【表6-2】

【0103】

特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、核酸は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性）を有するＶＨ配列と、配列番号２の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有するＶＬ配列と、を含む。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＶＨ配列と、配列番号２に記載のＶＬ配列と、を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＨドメインは、配列番号２３のヌクレオチド配列を含み、抗ＣＤ７ ｓｃＦｖのＶＬドメインは、配列番号２４のヌクレオチド配列を含む。

【0104】

他の態様では、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する治療量の遺伝子操作免疫細胞を被験体に投与し、それによって治療を必要とする被験体において癌を治療することを含む、治療を必要とする被験体における癌の治療方法もまた提供される。

【0105】

特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、方法は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含み、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に結合する抗体と、を含む。

【0106】

特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー）をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をさらに含む、治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含む。

【0107】

特定の実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍、例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、セザリー症候群、原発性皮膚γδＴ細胞リンパ腫、他に特定されない末梢Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫などの、Ｔ細胞白血病またはＴ細胞リンパ腫である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。

【0108】

本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、臨床的に許容できる基準に従って、病状が改善される程度まで病状（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍に関連する状態）を和らげることを指す。

【0109】

本明細書で使用される場合、「被験体」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス）を指す。特定の実施形態では、被験体は、ヒトである。「治療を必要とする被験体」とは、悪性Ｔ細胞に対する特定の細胞傷害性を及ぼすようにＴ細胞を誘導することによって治療（例えば、向上、改善、予防）することができる疾患もしくは症状を有するか、または発症する危険がある被験体（例えば、患者）を指す。

【0110】

本明細書で定義されるように、「治療量」は、被験体に投与されたときに、投与条件下で被験体において所望の治療効果を達成する（Ｔ細胞悪性腫瘍に関連する状態を治療する）のに十分な量を指す。投与されることとなる薬剤の有効量は、本明細書に提供される指針および当該分野で公知の他の方法を用いて当業者によって決定することができ、例えば、選択された特定の薬剤、被験体の年齢、感受性、薬物に対する耐性、および全般的健康を含むいくつかの要因に依存する。

【0111】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、治療、例えば癌治療を必要とする被験体にとって自己由来である。他の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、治療を必要とする被験体に対して同種である。

【0112】

特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、手術後の腫瘍への直接注入および／または腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与、および眼内投与によって被験体に投与される。

【0113】

特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、被験体への注入によって投与される。免疫細胞（例えば、同種免疫細胞または自己免疫細胞）を注入する方法は当技術分野において公知である。疾患の症状を改善するために十分な数の細胞がレシピエントに投与される。通常、１０^７〜１０^１０細胞の用量は、単回設定、例えば、１０^９細胞の用量で注入される。注入は、単回１０^９細胞用量またはいくつかの１０^９細胞用量への分割のいずれか一方で投与される。注入の頻度は、毎日、２〜３０日ごと、または必要に応じてもしくは指示がある場合にはさらに長い間隔であり得る。注入の量は、一般的に、許容されるように、または疾患症状が改善されるまで、被験体当たり少なくとも１回の注入、好ましくは、少なくとも３回の注入である。細胞は、５０〜２５０ｍＬ／時の速度で静脈内注入することができる。他の適切な投与様式としては、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与が挙げられる。本発明をそのような送達様式に適合させる方法は、当業者には容易に利用可能である。

【0114】

特定の実施形態では、本発明による癌を治療する方法は、少なくとも１つの他の公知の癌療法、例えば、放射線療法、化学療法、または他の免疫療法と組み合わされる。

【0115】

他の態様では、癌を治療するための本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する遺伝子操作免疫細胞の使用もまた提供され、それは治療量の遺伝子操作免疫細胞を治療を必要とする被験体に投与することを含む。特定の実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。

【0116】

特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、手術後の腫瘍への直接注入および／または腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、および髄腔内投与によって被験体に投与される。

【0117】

別の態様では、本明細書に記載の実施形態のいずれかを有する遺伝子操作免疫細胞の産生方法もまた提供され、その方法は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することを含み、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に結合する抗体と、を含む。

【0118】

特定の実施形態では、方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカーまたは抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することをさらに含む。特定の実施形態では、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドに導入される。

【0119】

様々な態様では、本明細書に記載された遺伝子操作免疫細胞を産生するためのキットもまた提供される。現在のキットは、例えば、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介細胞傷害活性を有する同種または自己由来のＴ細胞を産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、キットは、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介細胞傷害活性を有する同種エフェクターＴ細胞を産生するために有用である。特定の実施形態では、キットは、抗ＣＤ７ ＣＡＲ媒介細胞傷害活性を有する自己エフェクターＴ細胞を産生するために有用である。

【0120】

したがって、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むキットが本明細書で提供され、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に結合する抗体と、を含む。抗ＣＤ７ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載の実施形態のいずれかに従って設計することができる。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、図１Ａの概略図に従って抗ＣＤ７ ＣＡＲをコードする（「抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物」）。

【0121】

特定の実施形態では、本明細書に記載されたように、キットは、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、本明細書に記載の抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ分子）をコードするヌクレオチド配列を有する核酸をさらに含む。局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載された実施形態のいずれかに従って設計することができる。

【0122】

特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および／または抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、例えば、クローニングおよび／または発現を可能にする配列（例えば、プラスミド配列またはベクター配列）をさらに含む。例えば、ヌクレオチド配列は、例えば、細胞（例えば、免疫細胞）へのトランスフェクション、形質導入、またはエレクトロポレーションのために他のプラスミドおよび／またはベクター（発現ベクターまたはウイルス発現ベクター）へのクローニングを容易にするためのプラスミドの一部として提供することができる。特定の実施形態では、抗ＣＤ７ ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列および抗ＣＤ７ ＰＥＢＬをコードするヌクレオチド配列は、単一のプラスミドまたはベクター（例えば、抗ＣＤ７ ＣＡＲおよび抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを含む単一の構築物）上に提供される。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、別々のプラスミドまたはベクター（発現ベクターまたはウイルス発現ベクター）上に提供される。

【0123】

一般的には、キットは、使用を容易にするために区画化されており、試薬を伴う１つ以上の容器を含むことができる。特定の実施形態では、キット構成要素の全ては、一緒に包装されている。あるいは、キットの１つ以上の個々の構成要素は、他のキット構成要素とは別のパッケージで提供することができる。キットはまた、キット構成要素を使用するための説明書を含むことができる。

【0124】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞が本明細書で提供され、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に結合する抗体と、を含む。特定の実施形態では、抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの場合では、ｓｃＦｖは、配列番号１に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、配列番号２に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列と、を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、これらに限定されるものではないが、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒンジおよび膜貫通ドメインなどのヒンジおよび膜貫通配列をさらに含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、遺伝子操作Ｔ細胞、遺伝子操作ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、遺伝子操作ＮＫ／Ｔ細胞、遺伝子操作単球、遺伝子操作マクロファージ、または遺伝子操作樹状細胞である。

【0127】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸をさらに含む。特定の実施形態では、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１に記載のＶＨ配列と、配列番号２に記載のＶＬ配列と、を含む。いくつかの実施形態では、局在化ドメインは、小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体保持配列と、プロテオソーム局在化配列と、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、またはＦＧＦＲ２Ｂに由来する膜貫通ドメイン配列と、を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に結合する抗体と、を含む、核酸と、（ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含み、ＣＤ７に結合する抗体は、配列番号１に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む、核酸と、を含む、遺伝子操作免疫細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号３に記載の配列を含み、ＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４に記載の配列を含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞の治療量を被験体に投与することと、それによって治療を必要とする被験体において癌を治療することと、を含む、治療を必要とする被験体における癌の治療方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与によって被験体に投与される。

【0130】

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が本明細書で提供され、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に結合する抗体と、を含む。

【0131】

他の実施形態では、治療を必要とする被験体に治療量の遺伝子操作免疫細胞を投与することを含む、癌を治療するための本明細書に記載された遺伝子操作免疫細胞のそれが、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、癌は、Ｔ細胞悪性腫瘍である。特定の実施形態では、Ｔ細胞悪性腫瘍は、早期Ｔ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）である。特定の実施形態では、遺伝子操作免疫細胞は、静脈内注入、動脈内注入、腹腔内注入、腫瘍への直接注入および／または手術後の腫瘍床の灌流、人工足場における腫瘍部位への移植、髄腔内投与によって被験体に投与される。

【0132】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞を産生するための方法が、本明細書で提供される。方法は、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することであって、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に結合する抗体と、を含むことと、それによって遺伝子操作免疫細胞を産生することと、を含むことができる。方法は、局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を免疫細胞に導入することをさらに含むことができる。

【0133】

本発明は、ＣＤ７に対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本明細書に明示したように、エフェクターＴ細胞などの免疫細胞における抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現は、Ｔ細胞がＴ細胞悪性腫瘍に対して特異的な細胞傷害性を及ぼすように誘導する。この細胞傷害性効果は、下方制御のためにＣＤ７を標的とする抗体ベースの分子（タンパク質発現ブロッカーまたはＰＥＢＬ）を用いてエフェクターＴ細胞上のＣＤ７の発現が下方制御されたときに増強されることが示された。したがって、本発明は、癌、例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍を治療するための免疫療法的方法を提供する。

【0134】

いくつかの態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む遺伝子操作免疫細胞を提供し、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、分化群７（ＣＤ７）に結合する抗体と、を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説された遺伝子操作免疫細胞はまた、局在化ドメインに連結された標的結合分子（例えば、タンパク質発現ブロッカーまたはＰＥＢＬ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。そのような遺伝子操作免疫細胞を産生するための方法およびキットもまた、本明細書に概説されている。

【0135】

いくつかの態様では、本発明は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する抗体と、を含む、核酸と、（ｉｉ）局在化ドメインに連結された標的結合分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、標的結合分子は、ＣＤ７に結合する抗体であり、局在化ドメインは、小胞体保持配列を含み、ＣＤ７に結合する抗体は、配列番号１に記載の可変重鎖（ＶＨ）配列と、配列番号２に記載の可変軽鎖（ＶＬ）配列と、を含む、核酸と、を含む遺伝子操作免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を提供する。

【0136】

他の態様では、本発明は、治療を必要とする被験体において癌（例えば、Ｔ細胞悪性腫瘍）を治療する方法を提供する。方法は、治療量の本明細書に記載の遺伝子操作免疫細胞のいずれかを被験体に投与することと、それにより治療を必要とする被験体において癌を治療することと、を含む。本開示はまた、癌を治療するための本明細書に概説された遺伝子操作免疫細胞のうちのいずれかの使用を記載する。

【0137】

他の態様では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、ＣＡＲは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ７に特異的に結合する抗体と、を含む。

【実施例】

【0138】

実施例１：Ｔ細胞悪性腫瘍の有効なキメラ抗原受容体標的化のためのＴ細胞におけるＣＤ７発現の遮断
この実施例は、第二世代のＣＡＲと組み合わせた新規方法によるＣＤ７発現の遮断を例示し、非常に強力な抗ＣＤ７ ＣＡＲ−Ｔ細胞をもたらした。この実用的な戦略は、ＥＴＰ−ＡＬＬを含む高リスクＴ細胞悪性腫瘍患者に新しい治療法の選択肢を提供する。
概要

【0139】

Ｔ細胞悪性腫瘍に対する効果的な免疫療法が不足している。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）転換Ｔリンパ球に基づく新規アプローチが考案された。ＣＤ７は、最も攻撃的なサブタイプである早期Ｔ細胞前駆体（ＥＴＰ）−ＡＬＬを含むＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）におけるその一貫した発現のため、標的として選択された。４９個の診断用Ｔ−ＡＬＬ試料（１４個のＥＴＰ−ＡＬＬを含む）では、ＣＤ７発現中央値は、＞９９％であり、ＣＤ７発現は、再発時（ｎ＝１４）および化学療法中（ｎ＝５４）に高いままであった。ＣＤ７は、第二世代のＣＡＲ（抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ）により標的化されたが、Ｔ細胞自体にＣＤ７が存在するために、Ｔリンパ球におけるＣＡＲ発現は、同族殺傷を引き起こした。ＣＤ７を下方制御し、同族殺傷を制御するために、細胞内保持ドメインと結合された抗ＣＤ７一本鎖可変フラグメントに基づく新規方法（タンパク質発現ブロッカー、ＰＥＢＬ）を適用した。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬの形質導入は、全ての形質導入Ｔ細胞において表面のＣＤ７発現の実質的に即効性の抑制をもたらし、２．０％±１．７％は、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞の９８．１％±１．５％に対してＣＤ７＋であった（ｎ＝５、Ｐ＜０．０００１）。ＰＥＢＬ発現は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮγおよびＴＮＦα分泌、または細胞傷害性を損なわず、ＣＡＲ媒介同族殺傷を排除しなかった。ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビトロでＣＤ７＋白血病細胞に対して非常に細胞傷害性であり、同族殺傷を免れるＣＤ７＋ Ｔ細胞よりも一貫してより強力であった。それらはまた、細胞株由来および患者由来のＴ−ＡＬＬ異種移植片において強い抗白血病活性を示した。ここで説明する戦略は、既存の臨床グレードの細胞製造プロセスに良好に適合し、高リスクのＴ細胞悪性腫瘍患者の治療のために迅速に実行することができる。
序論

【0140】

Ｔリンパ球は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を介して腫瘍細胞を特異的に認識し、殺傷するように誘導することができる^１−５。この技術の効果的な応用の中心は、ＣＡＲに適する標的の特定である。標的は、腫瘍細胞によって高度に発現されなければならず、かつ正常細胞には存在すべきではないか、または一時的な非存在が臨床的に管理可能である正常細胞によってのみ発現されるべきである^６。したがって、Ｂ細胞由来の白血病およびリンパ腫は、通常Ｂリンパ様細胞によってのみ発現される^９，１０、ＣＤ１９^５，７またはＣＤ２２^８に対するＣＡＲで標的化することができる。Ｂ細胞不応性白血病およびリンパ腫の患者における抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現する自己Ｔ細胞の注入は、主要な臨床反応をもたらした^{１１−１８}。これらの刺激的な結果は、この技術の力の明白な証拠を提供し、腫瘍学におけるより広い応用の可能性を示唆している。

【0141】

Ｔ細胞悪性腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ細胞療法の開発は、それらのＢ細胞対応物の開発よりもはるかに遅れている。いくつかのＴ細胞白血病およびリンパ腫サブタイプに関連した予後不良のために、この分野における効果的な治療法の必要性は特に緊急性がある。例えば、初期のＴ細胞前駆体急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ−ＡＬＬ）の小児および青年は、全てのＡＬＬ患者の中で初期治療に対する反応が最も悪い^{１９−２１}。集中化学療法および／または同種造血幹細胞移植は、治療抵抗性の再発を予防しない場合が多く、これらの患者、および成人年齢などの他の危険性の高い機能を持つ患者にとっては、治療の選択肢が不足している^{１９，２２−２５}。

【0142】

Ｔ細胞悪性腫瘍に対する有効なＣＡＲ−Ｔ細胞の開発に対する大きな障害は、（一般的にＣＤ１９またはＣＤ２２発現を欠く）悪性Ｔ細胞の表面マーカープロファイルが、活性化Ｔリンパ球の表面マーカープロファイルと大部分重複することである^{１９−２６}。そのような標的に対するＣＡＲは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の自己排除を導く可能性が高い^{２７，２８}。ＥＴＰ−ＡＬＬおよび他のＴ−ＡＬＬ細胞サブタイプのＣＡＲ−Ｔ細胞療法のための実用的な技術の開発および適用が、本明細書に記載されている。第一に、ＣＤ７に対するＣＡＲが作製された。認識されているように、ＣＤ７は、Ｔ細胞悪性腫瘍の一次マーカーである４０ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質であり^{２９−３２}、ＥＴＰ−ＡＬＬを含むＴ細胞ＡＬＬの全ての場合において高度に発現される^１９。第二に、Ｔ細胞におけるＣＤ７発現を迅速かつ効果的に下方制御する方法が開発された。この方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の同族殺傷効果を回避し、遺伝子編集を伴わず、そして臨床応用に直ちに移行することができるため選択された。
材料および方法

【0143】

細胞および培養条件

【0144】

白血病細胞系Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＯＬＴ４およびＫＧ１ａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。Ｂ系列ＡＬＬ細胞株ＯＰ−１は、出願人の研究室で開発された^３３。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有するネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）−内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レトロウイルスベクター（Ｓｔ．Ｊｕｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨｏｓｐｉｔａｌのＶｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ）から入手）で形質導入された。同じベクターを使用して、ＲＳ４；１１ Ｂ細胞株（ＡＴＣＣ）のｃＤＮＡからクローニングされたＣＤ１９遺伝子をＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＪｕｒｋａｔ細胞に形質導入した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）中で維持した。

【0145】

末梢血試料は、シンガポール国立大学病院血液銀行の健常成人ドナー由来の血小板提供の廃棄された匿名副産物から得られた。診断免疫表現型検査および治療反応のモニタリングのために、ＡＬＬ患者の骨髄穿刺液を採取した^{１９，２６}。いくつかの実験では、シンガポール国立大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認を得て、保存された余剰材料を使用した。単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度段階（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）での遠心分離により分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗浄した。Ｔ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で濃縮し、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、およびインターロイキン−２（ＩＬ−２；１２０ＩＵ／ｍＬ；Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で培養した。

【0146】

遺伝子クローニングおよびレトロウイルス導入

【0147】

抗ＣＤ７モノクローナル抗体ＴＨ６９の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）^３４は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ならびに以前に出願人の研究室で開発された抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内ドメインに結合された^５。同じｓｃＦｖはまた、ＣＤ８αシグナルペプチドおよび小胞体（ＥＲ）／ゴルジ保持ペプチドＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＫＤＥＬ（配列番号８）、（ＧＧＧＧＳ）_４ＡＥＫＤＥＬ（配列番号９）、または局在化配列（配列番号１３）が続くＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメインをコードする配列にも結合された。これらをＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙの存在下または非存在下でＭＳＣＶベクターにサブクローニングした。

【0148】

レトロウイルス上清の調製および形質導入は、以前に記載されたように実施した^５，３５。簡単に説明すると、ｐＭＳＣＶレトロウイルスベクター馴化培地をＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）でコーティングしたポリプロピレン製チューブに添加し、遠心分離および上清の除去後、Ｔ細胞をチューブに添加し、３７℃で１２時間放置し、新鮮なウイルス上清をその後２日間連続して添加した。Ｔリンパ球をＦＢＳ、抗生物質および２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。

【0149】

一過性ＣＡＲ発現のために、抗ＣＤ７および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物をｐＶＡＸＩベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌ部位にサブクローニングし、Ｔ７ ｍＳｃｒｉｐｔ（ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｍＲＮＡに転写した^３６。ｍＲＮＡエレクトロポレーションのために、細胞を２００μｇのＣＡＲ ｍＲＮＡを含むエレクトロポレーション緩衝液（Ａｍａｘａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｖ；Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に懸濁し、プログラムＸ−００１を用いてＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂ（Ｌｏｎｚａ）でエレクトロポレーションした^{３６，３７}。ｍＲＮＡ不存在下でエレクトロポレーションした細胞を対照として使用した。

【0150】

ＣＡＲ、ＰＥＢＬ、表面マーカーの検出

【0151】

ＣＡＲをビオチン結合ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）_２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、続いてアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）により検出した。フィコエリトリン（ＰＥ）またはＡＰＣ結合抗ＣＤ７（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ３（ＳＫ７）、および非反応性アイソタイプ一致抗体は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から入手し、ＣＤ１９（ＬＴ１９）は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した。細胞染色は、Ｄｉｖａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦｌｏｗ Ｊｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）により、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６、ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

【0152】

ウェスタンブロッティングは、以前に記載されたように行った^３５。簡単に説明すると、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によるタンパク質定量の前に、ＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ細胞溶解試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて細胞溶解物を抽出した。細胞溶解物を４×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で希釈し、還元条件または非還元条件下での電気泳動によって１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ブロットした膜を、マウス抗ヒトＣＯ３抗体（８Ｄ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、およびＣｌａｒｉｔｙウェスタンＥＣＬ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をプローブとして精査した。染色は、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて可視化した。

【0153】

細胞凝集アッセイ、細胞傷害性アッセイおよびサイトカイン産生

【0154】

細胞−細胞凝集を測定するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞をカルセインレッドオレンジＡＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識したＣＤ７＋またはＣＤ７−細胞と３０分間共培養し、細胞ダブレットをフローサイトメトリーによって計数した。いくつかの実験では、膜貫通配列またはシグナル伝達配列を含まないｓｃＦｖからなる構築物で形質導入されたＪｕｒｋａｔまたは２９３Ｔ細胞の上清から得た可溶性抗ＣＤ７ ｓｃＦｖと共培養する前に、標的細胞を１０分間プレインキュベートした。

【0155】

細胞傷害性を試験するために、標的細胞をカルセイン赤橙色ＡＭで標識し、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に入れた。Ｔ細胞を標的細胞とは異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で標的細胞と共に添加し、３７℃および５％ＣＯ２で４時間培養した。生存可能な標的細胞をフローサイトメトリーで計数した。３８溶解性顆粒のエキソサイトーシスを測定するために、抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＰＥ（Ｈ４Ａ３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を共培養物に添加した。１時間後、モネンシン（ＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ）を添加し、フローサイトメトリー分析の前に更に３時間培養を続けた。

【0156】

細胞増殖を評価するために、Ｔ細胞を単独で、または１：１ Ｅ：ＴのＭＯＬＴ−４細胞の存在下で、ＦＢＳおよび１２０ＩＵ／ｍＬ ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ−１６４０中、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。増殖を阻害するために、照射したまたはＳｔｒｅｃｋ細胞保存剤（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）で処理した標的細胞を７日ごとに培養物に添加した。生存ＧＦＰ＋またはｍＣｈｅｒｒｙ＋ Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより計数した。ＩＦＮγおよびＴＮＦα産生のために、標的細胞およびエフェクター細胞を１：１ Ｅ：Ｔで上記のようにプレート培養した。１時間後、ブレフェルジンＡ（ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ）を培養物に添加し、培養をさらに５時間継続した。続いて、フローサイトメトリー分析の前に、抗ＩＦＮγ−ＰＥ（クローン２５７２３．１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または抗ＴＮＦα−ＰＥ（６４０１．１１１１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による細胞内染色を行った。

【0157】

異種移植モデル

【0158】

ルシフェラーゼで形質導入されたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞をＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）にマウス当たり１×１０^６細胞で静脈内（ｉ．ｖ．）注入した。３日後および／または７日後、マウスは、マウス当たり２×１０^７Ｔ細胞において下方制御されたＣＤ７および抗ＣＤ７ ＣＡＲ発現を有するＴ細胞を受けた。他のマウスには、Ｔ細胞の代わりにＧＦＰ単独、または１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０で形質導入されたＴ細胞を与えた。全てのマウスは、２日ごとに２０，０００ＩＵのＩＬ−２を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。水性Ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を腹腔内注入した後（マウス当たり２ｍｇ）、Ｘｅｎｏｇｅ ＩＶＩＳ−２００システム（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて腫瘍負荷を決定した。発光をＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ３．０ソフトウェアで分析した。発光が毎秒１×１０^１０光子に達したとき、または安楽死を正当化する身体的徴候が現れた場合はそれ以前に、マウスを安楽死させた。

【0159】

患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）モデルについては、初代ＥＴＰ−ＡＬＬ細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌ中に静脈内注入し、次の７〜８世代に渡って増殖させた。次いで、ＥＴＰ−ＡＬＬ細胞を、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理するかまたは未処理のままにしたＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌに再注入した。末梢血および組織をフローサイトメトリーによりＡＬＬ細胞の存在についてモニターした^{１９，２６}。赤血球を溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解した後、細胞を抗マウスＣＤ４５−ＰＥ−シアニン７（３０−Ｆ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、および抗ヒトＣＤ４５−ＡＰＣ−Ｈ７（２Ｄ１）、ＣＤ７−ＰＥ（Ｍ−Ｔ７０１）、ＣＤ３−ＡＰＣ（ＳＫ７）、ＣＤ３４−ペリジニンクロロフィルタンパク質（８Ｇ１２）（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、およびＣＤ３３−ブリリアントバイオレット４２１（ＷＭ５３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞は、ＤｉｖａおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した。

【0160】

結果

【0161】

白血病におけるＣＡＲ−Ｔ細胞療法の標的としてのＣＤ７の検証

【0162】

４９人のＴ−ＡＬＬ患者（ＥＴＰ−ＡＬＬを持つ１４人を含む）から得られた診断用骨髄試料由来の白血病細胞において、ＣＤ７発現の中央値パーセントは、＞９９％（範囲、７９％〜＞９９％）であった。わずか３事例（６．１％）で、ＣＤ７は、９９％未満であり、２事例で９８％、１事例で７９％であった（図１Ａ）。１４人の再発Ｔ−ＡＬＬ患者から採集された試料においてもまた、高いＣＤ７発現が観察された（図１Ａ）。診断時または再発時の白血病細胞中のＣＤ７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、同じ試料中の残存正常Ｔ細胞において測定されたＭＦＩを常に超えていた。中央値（範囲）ＭＦＩは、Ｔ−ＡＬＬ細胞において２０，６１７（４，１０５〜６６，６７４）であるのに対して、正常Ｔ細胞において３，０３２（１，３０１〜９，５８２）であった（ｎ＝１９、Ｐ＜０．０００１）（図１Ｂ）。

【0163】

化学療法がＣＤ７発現に影響を与えるかどうかを判断するために、治療中に採集された、最小残存病変（ＭＲＤ）を含む骨髄試料を調べた。（２１人の患者由来の）５４個の試料全てにおいて、残存白血病細胞の＞９９％は、ＣＤ７＋であった（図１Ａ）。１８人の患者において、ＣＤ７レベルは、疾患の経過中モニターされた。図１Ｃおよび図１Ｄに示すように、ＣＤ７は、治療中に高いままであった。これらの結果は、ＣＤ７がＴ−ＡＬＬにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞療法の標的として有効であることを証明している。

【0164】

抗ＣＤ７ ＣＡＲの設計および発現

【0165】

ＣＤ７を標的とするために、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメインを介して４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインに接合された抗ＣＤ７抗体ＴＨ６９のｓｃＦｖからなる抗ＣＤ７ ＣＡＲ（図２Ａ）を設計した。Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるこの構築物のレトロウイルス形質導入は、抗ＣＤ７ ＣＡＲの高発現をもたらし（図２Ｂ）、ウェスタンブロッティングによりモノマー、ダイマーおよびオリゴマーとして現れた（図２Ｃ）。

【0166】

ＴＨ６９ ｓｃＦｖがＣＤ７を結合し得ることを確認するために、それは可溶性形態で産生され、ＣＤ７＋ ＭＯＬＴ−４細胞およびＣＤ７−ＯＰ−１細胞上で試験され、ＭＯＬＴ−４細胞を標識したが、ＯＰ−１は、標識しなかった（図８Ａ）。さらに、ＭＯＬＴ−４細胞を抗ＣＤ７ ｓｃＦｖ上清とプレインキュベートした場合、抗ＣＤ７モノクローナル抗体による染色は、有意に減少し、ＣＤ７ ＭＦＩ（±ＳＤ）は、３１，７３０±１，１４４から５，９８７±２４１（ｎ＝３）に変化した。抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＤ７＋ ＭＯＬＴ−４細胞と凝集体を形成したが、ＧＦＰ単独または抗ＣＤ１９ ＣＡＲで形質導入された細胞は、形成せず、それとは逆に、抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、ＣＤ１９＋ ＯＰ−１細胞との細胞凝集を誘導したが、抗ＣＤ７ ＣＡＲは、誘導しなかった（図８Ｂ）。ＭＯＬＴ−４またはＣＣＲＦ−ＣＥＭを可溶性抗ＣＤ７ ｓｃＦｖとプレインキュベートすると、凝集体の形成が妨げられた（図８Ｃ）。

【0167】

抗ＣＤ７ ＣＡＲが機能的であるかどうかを決定するために、活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９のレベルを、ＭＯＬＴ４と２４時間共培養した後にＪｕｒｋａｔ細胞において測定した。抗ＣＤ７ ＣＡＲを発現する細胞において、両方の活性化マーカーの明らかな上方制御があった（図２Ｄおよび図２Ｅ）。要するに、抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲは、その同族抗原に結合することができ、連結の際に活性化シグナルを伝達する。

【0168】

Ｔ細胞における抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現は、同族殺傷を引き起こす

【0169】

末梢血Ｔリンパ球における抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲの効果を決定するために、それを発現させるために２つの異なる方法、すなわちレトロウイルス形質導入（図９Ａ）およびｍＲＮＡエレクトロポレーションを用いた。しかし、それはＴ細胞生存率を著しく低下させた。ｍＲＮＡエレクトロポレーションの２４時間後の平均（±ＳＤ）Ｔ細胞回収率は、ｍＲＮＡ不存在下のエレクトロポレーション後に３９．８％±１３．０（ｎ＝７）の回収率であり（図３Ａ）、ＣＡＲがウイルス形質導入によって導入された場合、細胞回収率は、ｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞の２５．１％±１６．２％（ｎ＝１０）の回収率であり（図３Ｂ）、全体として、ＣＡＲ発現は、２４時間後に細胞回収率を３１．１％±１６．３％（ｎ＝１７）まで減少させた。長期の細胞培養は、ＣＡＲ形質導入細胞とｍｏｃｋ形質導入細胞との間の数の差を全体的にさらに増大させた（図３Ｃ）。標的細胞の非存在下でのＣＡＲ発現は、ＣＤ１０７ａ発現によって明らかにされた溶解顆粒のエキソサイトーシスを誘導し（図３Ｄ）、これは細胞回復の障害が同族殺傷によって引き起こされたことを示唆する。

【0170】

ＣＤ７の下方制御は、Ｔ細胞同族殺傷を防ぎ、Ｔ細胞機能に影響を及ぼさない

【0171】

貧弱なＴ細胞回収率が、Ｔ細胞によって発現されたＣＤ７へのＣＡＲ結合によって媒介される同族殺傷によって引き起こされた場合、それはＣＡＲ発現前にＣＤ７を下方制御することによって改善されるはずである。この予測をテストするために、ＥＲ保持ドメインＫＤＥＬまたはＫＫＭＰを含むアミノ酸配列に連結された抗ＣＤ７ ｓｃＦｖの発現に基づいて最近開発された迅速かつ実用的な方法［抗ＣＤ７タンパク質発現ブロッカー（ＰＥＢＬ）］を適用した。（図３Ｅ）。これらは、構築物をＥＲ／ゴルジ体に固定し、標的タンパク質の分泌または膜発現を妨げる^{３９，４０}。３種の抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ構築物を試験し、ＰＥＢＬ−１は、次の実験のための選択ＰＥＢＬ−１であった（図３Ｅおよび図３Ｆ）。ＣＤ７表面発現は、この構築物で形質導入された全てのＴ細胞において本質的に無効にされたが、ＣＤ７ ｍＲＮＡ発現は、保持され（図３Ｆ、図１０Ａおよび図１０Ｂ）、５つの実験では、９８．１％±１．５％のｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞は、ＣＤ７＋であったのに対して、抗２．０％±１．７％は、ＣＤ７ ＰＥＢＬで形質導入されたＴ細胞であった（Ｐ＜０．０００１）（図３Ｇ）。下方制御されたＣＤ７を有する細胞においてエレクトロポレーションによって抗ＣＤ７ ＣＡＲが発現されたとき、その発現は、フローサイトメトリーによって明らかに検出可能であった（図３Ｈ）。ＣＤ７ノックダウンを有する細胞においてＣＡＲを発現させることによって、Ｔ細胞生存率は、著しく改善され（図３Ｉ）、６対の実験において、ＣＡＲ ｍＲＮＡエレクトロポレーション後の生存細胞回収率は、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで予め形質導入されていたＴ細胞において一貫して優れていた（Ｐ＝０．００８）。

【0172】

抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ形質導入後、ＣＤ４細胞とＣＤ８細胞との比率は、ｍｏｃｋ形質導入細胞の比率と類似していた（図４Ａ）。表面膜上のＣＤ７発現の不存在は、培地中のＴ細胞生存に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ）。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで形質導入されたＴ細胞の機能的能力をさらに精査するために、抗ＣＤ１９−ＣＡＲを発現するように細胞を遺伝子操作した（図ＣＡ）。細胞傷害性を及ぼし、細胞傷害性顆粒を放出し、そしてＣＤ１９＋ ＡＬＬ細胞の存在下でＩＦＮγを分泌するそれらの能力を試験した。図４Ｄ、図４Ｅおよび図４Ｆに示すように、ＰＥＢＬ形質導入および表面ＣＤ７の欠如は、ＣＡＲ媒介細胞機能を変化させなかった。

【0173】

抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲは、ＣＤ７＋白血病細胞に対する強力な細胞傷害性を誘導する

【0174】

抗ＣＤ７ ＰＥＢＬを用いてＣＤ７陰性Ｔ細胞を調製し、抗ＣＤ７−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲ ｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。それらの抗白血病能力は、ＣＤ７＋白血病細胞系ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｊｕｒｋａｔ、ＬｏｕｃｙまたはＫＧ１ａとの共培養において評価された。図５Ａに示すように、細胞傷害性は、ＣＡＲ発現によって劇的に増加した。ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞はまた、患者から得られた初代Ｔ−ＡＬＬ細胞に対しても非常に有効であった（図５Ｂ）。

【0175】

ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＰＥＢＬで形質導入されていない細胞におけるＣＡＲエレクトロポレーション後に回収された残存Ｔ細胞の細胞傷害性と比較した。３人のドナー由来の細胞を用いた４５回の実験では、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ細胞の細胞傷害性は、非ＰＥＢＬ Ｔ細胞の細胞傷害性を一貫して超えていた（図５Ｃ）。ＣＤ１０７ａ（図５Ｄ）、ＩＦＮγ（図１１Ａ）およびＴＮＦα（図１１Ｂ）の発現を比較すると、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ細胞の優れた活性もまた観察された。連続レトロウイルス形質導入によるＰＥＢＬおよびＣＡＲの発現もまた、患者由来のＴ−ＡＬＬ細胞（図５Ｅ）および細胞株（図１２）に対して強力な細胞傷害性をもたらした。ＣＤ７＋標的細胞の存在下での抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖は、ＰＥＢＬによるＣＤ７下方制御なしのＣＡＲ−Ｔの増殖よりもはるかに高かった（Ｐ＜０．０１）（図５Ｆ）。最後に、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞によって及ぼされる細胞傷害性を、同じ標的細胞に対する抗ＣＤ１９−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ ＣＡＲ^５を発現するＴ細胞の細胞傷害性と比較した。この目的のために、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞をＣＤ１９で形質導入し、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬで予め形質導入された細胞においていずれのＣＡＲもまた発現した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。抗ＣＤ７および抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、同様の短期細胞傷害性および長期細胞傷害性を有し（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）、ＣＤ１９＋ ＣＤ７＋標的細胞の存在下における長期増殖能力は、抗ＣＤ７ ＣＡＲ−Ｔ細胞についてわずかに低く（図１３Ｅ）、これは、標的細胞上のＣＤ７の発現がＣＤ１９に対してより低いことにより説明できるであろう（図１３Ｂ）。

【0176】

Ｔ−ＡＬＬのマウスモデルにおける抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の抗白血病活性

【0177】

抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍能力をさらに評価するために、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌにＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を移植した。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬおよび抗ＣＤ７ ＣＡＲでレトロウイルス形質導入されたＴ細胞は、白血病細胞負荷の顕著な減少および白血病細胞増殖の減少を伴って、顕著な抗白血病効果を生じた（図６Ａ〜図６Ｃ、図１４Ａおよび図１４Ｂ）。白血病細胞注入の３週間後、フローサイトメトリーによる末梢血中のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の中央値百分率は、対照マウスで６８％（ｎ＝５）であり、ＧＦＰ単独Ｔ細胞を受けたマウスでは６７％（ｎ＝５）であったが、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスでは検出されなかった（図１５Ａ）。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞治療後に生じる再発は、ＣＤ７を欠くＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞サブセットによるものではなく、白血病細胞は、高レベルのＣＤ７を発現し続け、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞が再発マウスの肝臓もしくは脾臓に由来するか、または元の細胞培養物に直接由来するかにかかわらず、抗ＣＤ７ＣＡＲ細胞傷害性に対する感受性は、高いままであった（図１５Ｂ）。

【0178】

インビボで初代白血病細胞に対してＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞を試験するために、ＥＴＰ−ＡＬＬのＰＤＸモデルを使用した。ＰＤＸモデルは、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ ＩＬ２ＲＧｎｕｌｌマウスにおける診断時にＥＴＰ−ＡＬＬの患者に由来する白血病細胞の増殖を可能にする。白血病細胞は、ＣＤ７、ＣＤ３４、ＣＤ３３を発現し、かつ表面ＣＤ３、ＣＤ１ａ、ＣＤ８およびＣＤ５が非存在で、診断時に決定された免疫表現型一致を保持し（図１６）、細胞は、エクスビボで生存することも増殖することもできず、増殖のためにマウスに注入する必要があった。全てのマウスは、ＣＡＲ−Ｔ処置時に末梢血中にＥＴＰ−ＡＬＬを有していた（図７Ａ）。図７Ｂに示すように、ＥＴＰ−ＡＬＬ細胞は、骨髄、脾臓肝臓および肺における白血球の大部分を占めていた。ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞投与後（１匹のマウスでは２×１０^７個、残りの４匹では２×１０^６個）、末梢血中の白血病細胞数は、劇的に減少した一方で、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、全てのマウスにおいて検出可能になった（図７Ａ）。血液塗抹標本では、汚れ細胞が顕著であり、これは白血病細胞溶解を示唆していた（図７Ｃ）。白血病は、５匹の対照マウス全てで進行し、対照マウスは、ＥＴＰ−ＡＬＬが末梢血単核細胞の＞８０％となった時点で安楽死させた。２×１０^７個のＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスは、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ−Ｔ細胞注入の２３日後に見かけの移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）により死亡した。血液、骨髄、肝臓、脾臓、肺および脳ではＥＴＰ−ＡＬＬが検出されなかったが、ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞は、全ての組織で検出可能であった（図７Ｄおよび図７Ｅ）。２×１０^６個のＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウス４匹は、注入後２５日目（ｎ＝１）〜３９日目（ｎ＝３）に生存しており、ＧｖＨＤの徴候は見られない。
考察

【0179】

Ｂ細胞白血病およびリンパ腫の患者の寛解は、ＣＡＲ−Ｔ細胞により達成することができるが、Ｔ細胞悪性腫瘍患者については、効果的な選択肢が不足している。このギャップを埋めるために、臨床的介入に迅速に移行することができるであろうＣＡＲ−Ｔ細胞アプローチが開発され、本明細書に記載された。化学療法にさらされたＴ−ＡＬＬ細胞においてさえ非常に安定である広く発現された表面Ｔ細胞マーカーのＣＤ７が標的とされた。第二世代の抗ＣＤ７ ＣＡＲが設計された。Ｔ細胞におけるＣＤ７表面発現の抑制が必須であると判定され、その抑制がなければ、ＣＡＲは、重度のＴ細胞減少を引き起こし、ＣＡＲ−Ｔ細胞の完全な機能的可能性は達成できなかったであろう。抗ＣＤ７ ＰＥＢＬの形質導入は、事実上即効性のＣＤ７発現の抑制をもたらした。そのような細胞における抗ＣＤ７ ＣＡＲの発現は、インビトロにおいて、ならびにＴ−ＡＬＬの異種移植片およびＰＤＸモデルにおいて、強力な抗白血病活性を生じた。したがって、この戦略を使用することによって、多数のＣＡＲ−Ｔ細胞が迅速に作製され、最もアグレッシブな形態の１つであるＥＴＰ−ＡＬＬを含む、Ｔ細胞悪性腫瘍に対して安定かつ特異的な細胞傷害性を及ぼすために使用された。

【0180】

内在性ＣＤ７を下方制御するための本明細書に記載のＰＥＢＬ技術は、ＥＲ／ゴルジ体保持モチーフと結合された標的抗原に対するｓｃＦｖの使用に基づいている。このようにして、新たに合成されたＣＤ７はいずれも、ＥＲおよび／またはゴルジ体に固定されたままであり、その表面発現は、妨げられる。この方法は、ＣＤ７を下方制御し、ＣＡＲ媒介同族殺傷を抑制するのに著しく有効であった。重要なことに、ＣＤ７の細胞内保持は、Ｔ細胞機能を変化させず、正常な増殖、サイトカイン分泌、および細胞傷害性を可能にした。これは、リンパ系組織において正常なリンパ球集団を示したＣＤ７欠損マウスを用いた研究の結果と一致する^{４１，４２}。ＣＤ７を下方制御するための別のアプローチは、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などの遺伝子編集方法を適用することであろう^４３。この目的のために、最近の研究は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓによるＣＤ７遺伝子欠失を有するＴ細胞において発現された抗ＣＤ７ ＣＡＲを報告した^９，４４。臨床的影響を及ぼしてもよい共刺激分子（本明細書に記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８の代わりに４−１ＢＢを有する）の違いに加えて^{４５，４６}、ＰＥＢＬ戦略の高い特異性および実際的性質は、それを現在の臨床用途にとって特に魅力的なものにしている。この方法は、２つの連続形質導入または両方の構築物を担持するバイシストロン性ベクターによる単一の形質導入のいずれかとして、ＣＡＲを担持する同じウイルスベクターによる単純な形質導入を必要とする。その形質導入は、確立された臨床グレードの細胞製造プロセスによく適合し、標的外活性に関連して起こりうる規制上の懸念を生じさせない^{４７，４８}。

【0181】

ＣＤ７は、初期Ｔ細胞分化に特徴的な分子であり、Ｔ−ＡＬＬにおいてほぼ普遍的に発現され、正常細胞の中では、その発現は、Ｔ細胞に限定される^{１９，２９−３２}。Ｔ細胞リンパ腫患者における抗ＣＤ７−リシン−Ａ鎖免疫毒素を用いた臨床試験では、用量制限毒性は、他の毒素複合体で見られた副作用の血管漏出症候群であり、抗ＣＤ７の結合は、様々な組織の内皮細胞において見られなかった^４９。それにもかかわらず、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによるＣＡＲの一過性発現は、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の急性毒性の可能性を評価する初期の研究において考慮される場合もある。抗ＣＤ７ＣＡＲ療法の懸念は、注入された細胞による正常Ｔ細胞の減少であり、これは免疫不全症につながる。高リスクＴ−ＡＬＬ患者においてＭＲＤを減少させるための手段として、この技術の最初の適用を想定することができ、それ故に同種造血幹細胞移植の成功を最大化することができる^５０。そのような場合、抗ＣＤ７ ＣＡＲ Ｔ細胞は、移植馴化およびドナー幹細胞から再構成されたＴ細胞区画によって排除されるであろう。移植環境以外では、白血病根絶が達成されれば「自殺遺伝子」を活性化することができる^５１。最終的に、（それらの内因性ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を保持する）注入された抗ＣＤ７ Ｔ細胞は、十分に広いＴ細胞レパートリーを再構成する場合があるため、これを問題としなくてもよい。この目的のために、ＣＤ７を発現しないヒト血液リンパ球中のＣＤ４記憶Ｔ細胞およびＣＤ８エフェクターＴ細胞のサブセットが記載されていること^{５２，５３}、Ｔ−ＡＬＬ細胞が正常Ｔ細胞よりも高いレベルでＣＤ７を発現することに留意されたい。したがって、ＣＤ７−ｄｉｍサブセットは、ＣＤ７を標的とした治療後でさえもＴ細胞レパートリーの再構築に役立つ場合がある。

【0182】

Ｔ−ＡＬＬの標準的な治療法は、高リスク疾患患者に対する集中化学療法に加えて造血幹細胞移植に主に依存する。結果は、満足できるものではなく、かなりの罹患率と死亡率を示す^{５４，５５}。本明細書に提示された知見は、抗ＣＤ７ ＰＥＢＬ−ＣＡＲ Ｔ細胞の注入が既存の化学療法および移植に基づく戦略を大幅に増強するか、またはおそらく置き換えることができることを示唆する。おそらく、Ｔ細胞における標的抗原の下方制御を伴うＣＡＲ発現は、Ｔ細胞リンパ増殖性新生物において発現が優勢であるＣＤ３、ＣＤ２、およびＣＤ５などの他のＴ細胞マーカーにもまた適用可能であるはずである。高リスクの急性骨髄性白血病の一部がＣＤ７を発現するため^{１９，３０，５６}、この白血病サブタイプについて抗ＣＤ７ ＣＡＲ−Ｔ細胞の可能性をテストすることも求められる。
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【0234】

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【0235】

５３．Ａａｎｄａｈｌ ＥＭ，Ｓａｎｄｂｅｒｇ ＪＫ，Ｂｅｃｋｅｒｍａｎ ＫＰ，Ｔａｓｋｅｎ Ｋ，Ｍｏｒｅｔｔｏ ＷＪ，Ｎｉｘｏｎ ＤＦ．「ＣＤ７ ｉｓ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｔｈａｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｓｕｂｓｅｔｓ．」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１７０（５）：２３４９−２３５５．

【0236】

５４．Ｒａｅｔｚ ＥＡ，Ｔｅａｃｈｅｙ ＤＴ．「Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．」Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｍ Ｓｏｃ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｅｄｕｃ Ｐｒｏｇｒａｍ ２０１６；２０１６（１）：５８０−５８８．

【0237】

５５．Ｊａｂｂｏｕｒ Ｅ，Ｏ‘Ｂｒｉｅｎ Ｓ，Ｋｏｎｏｐｌｅｖａ Ｍ，Ｋａｎｔａｒｊｉａｎ Ｈ．「Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａｄｕｌｔ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．」Ｃａｎｃｅｒ ２０１５；１２１（１５）：２５１７−２５２８．

【0238】

５６．Ｋｉｔａ Ｋ，Ｍｉｗａ Ｈ，Ｎａｋａｓｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ＣＤ７ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．」Ｔｈｅ Ｊａｐａｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｌｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ １９９３；８１（９）：２３９９−２４０５．

【0239】

本明細書に引用された全ての特許、公開された出願および参考文献の教示は、その全体が参照によって組み込まれる。

【0240】

本発明をその例示的な実施形態を参照して具体的に図示し、かつ説明したが、特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細を様々に変更できることが当業者には理解されよう。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

2019536480000001.app

【国際調査報告】