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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2020-510415(P2020-510415A)
(43)【公表日】2020年4月9日
(54)【発明の名称】核酸ハイブリダイゼーションアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20200313BHJP
G01N 37/00 20060101ALI20200313BHJP
C12Q 1/6848 20180101ALI20200313BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20200313BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
G01N37/00 102
C12Q1/6848 Z
G01N21/64 G
G01N21/64 F
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】70
(21)【出願番号】特願2019-543091(P2019-543091)
(86)(22)【出願日】2018年2月8日
(85)【翻訳文提出日】2019年10月7日
(86)【国際出願番号】US2018017494
(87)【国際公開番号】WO2018148463
(87)【国際公開日】20180816
(31)【優先権主張番号】62/456,598
(32)【優先日】2017年2月8日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/457,084
(32)【優先日】2017年2月9日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/456,904
(32)【優先日】2017年2月9日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/457,075
(32)【優先日】2017年2月9日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/459,337
(32)【優先日】2017年2月15日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/459,303
(32)【優先日】2017年2月15日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/459,267
(32)【優先日】2017年2月15日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/460,052
(32)【優先日】2017年2月16日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/460,083
(32)【優先日】2017年2月16日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518048123
【氏名又は名称】エッセンリックス コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100114889
【弁理士】
【氏名又は名称】五十嵐 義弘
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】チョウ スティーブン ワイ．
(72)【発明者】
【氏名】ディン ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チャン ユファン
(72)【発明者】
【氏名】リー ジ
(72)【発明者】
【氏名】チー ジ
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA01
2G043BA14
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA05
2G043DA06
2G043EA01
2G043EA03
2G043FA01
2G043GA07
2G043GB01
2G043GB16
2G043LA03
4B063QA08
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
本明細書では、均一な核酸検出アッセイを実施するための方法およびデバイスが提供される。デバイスは一対のプレートを含むことができ、プレートの一方は、（ｉ）表面増幅表面と、（ｉｉ）前記増幅表面上に固定されており、かつ標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブとを含み、第２のプレートは、標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む。いくつかの実施形態では、結合していない標識をデバイスの表面から洗浄することなく、デバイスを読み取ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項1】
均一な核酸検出アッセイを実施するための方法であって、
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
前記第１のプレートおよび前記第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第１のプレートが、その試料接触領域上に、
（ｉ）表面増幅表面と、
（ｉｉ）前記増幅表面上に固定されており、前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を含み、
前記第２のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
（ｃ）前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）（ｃ）の後、前記プレートを前記閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取ることにより前記標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、（ｉｉ）前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記表面増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の１つは、前記２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
前記第１のプレートおよび前記第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第１のプレートが、その試料接触領域上に、
（ｉ）表面増幅表面と、
（ｉｉ）前記増幅表面上に固定されており、前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を含み、
前記第２のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
（ｃ）前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）（ｃ）の後、前記プレートを前記閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取ることにより前記標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、（ｉｉ）前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記表面増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の１つは、前記２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
【請求項2】
均一な試料を分析するためのデバイスであって、
第１のプレート、第２のプレート、および結合部位を備え、
（ａ）前記第１のプレートおよび前記第２のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
（ｂ）前記第１のプレート上の前記試料接触領域が、
（ｉ）近接依存性信号増幅層と、
（ｉｉ）標的核酸の一部に結合する、前記近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を有し、
（ｃ）前記第２のプレート上の前記試料接触領域が、前記標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
前記構成の１つは開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にある閉鎖構成であり、
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および前記近接依存性信号増幅層の増幅率は、前記標的特異的核酸プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。
第１のプレート、第２のプレート、および結合部位を備え、
（ａ）前記第１のプレートおよび前記第２のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
（ｂ）前記第１のプレート上の前記試料接触領域が、
（ｉ）近接依存性信号増幅層と、
（ｉｉ）標的核酸の一部に結合する、前記近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を有し、
（ｃ）前記第２のプレート上の前記試料接触領域が、前記標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
前記構成の１つは開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にある閉鎖構成であり、
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および前記近接依存性信号増幅層の増幅率は、前記標的特異的核酸プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。
【請求項3】
サーマルサイクラーおよび請求項２に記載のデバイスを備える、装置。
【請求項4】
サーマルサイクラー、請求項２に記載のデバイス、およびリアルタイムＰＣＲ用の読み取り器を備える、装置。
【請求項5】
迅速な核酸検出アッセイのための方法であって、
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
前記第１のプレートおよび前記第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第１のプレートが、その試料接触領域上に結合部位を含み、前記結合部位が、前記部位上に固定されておりかつ前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブを含み、
前記第２のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
（ｃ）一定期間のインキュベーションのために前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）前記プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたって前記プレートを再度押圧し、次いで前記洗浄スポンジを解放するステップと、
（ｅ）（ｄ）の後、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、（ｉｉ）前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記近接依存性増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の１つは、前記２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
前記第１のプレートおよび前記第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
前記第１のプレートが、その試料接触領域上に結合部位を含み、前記結合部位が、前記部位上に固定されておりかつ前記標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブを含み、
前記第２のプレートが、前記標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）前記プレートが開放構成にあるときに、前記プレートの一方または両方の上に前記試料を置くステップと、
（ｃ）一定期間のインキュベーションのために前記プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）前記プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたって前記プレートを再度押圧し、次いで前記洗浄スポンジを解放するステップと、
（ｅ）（ｄ）の後、読み取りデバイスで前記試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、（ｉｉ）前記閉鎖構成における前記試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）前記近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して前記核酸プローブに間接的に結合している標識が、前記近接依存性増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
前記構成の１つは、前記２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
前記構成のうちの別の構成は、前記試料の少なくとも一部が前記２つのプレートの間にあり、かつ前記プレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
【請求項6】
前記閉鎖構成における前記第１のプレートと前記第２のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が３００秒以下になるように構成されている、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項7】
前記閉鎖構成における前記第１のプレートと前記第２のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が３００秒以下になるように構成されている、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項8】
前記閉鎖構成における前記第１のプレートと前記第２のプレートとの間の間隔が、前記標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が６０秒以下になるように構成されている、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項9】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡである、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項10】
ステップ（ｂ）から結果を得るまでの時間が１０分未満である、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項11】
前記閉鎖構成での前記試料の厚さ、前記閉鎖構成における前記試料に溶解した前記標識の濃度、および前記表面増幅層の増幅率は、前記プローブに直接的または間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく、前記閉鎖構成において可視化されるように構成されている、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項12】
前記近接依存性増幅表面に結合した前記標識が、６０秒未満で可視化される、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項13】
前記近接依存性増幅表面に結合した前記標識が、６０秒未満で可視化される、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項14】
前記貯蔵部位が、前記閉鎖構成において前記第１のプレート上の前記結合部位のほぼ上方にある、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項15】
前記標的特異的核酸プローブおよび前記標的特異的核酸検出剤が、前記標識を含むサンドイッチを形成する、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項16】
前記信号が、前記増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を除去するための洗浄ステップを使用せずに読み取られる、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項17】
前記増幅表面に結合した前記標識が、個々の結合事象を計数することにより読み取られる、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項18】
前記増幅表面に結合した前記標識が、一括読み取り法によって読み取られる、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項19】
前記アッセイが、０．１ｎＭ以下の検出感度を有する、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項20】
前記アッセイが、スポンジを使用して、前記増幅表面に結合していない生体物質または標識を除去することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項21】
前記信号増幅層がＤ２ＰＡを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項22】
前記信号増幅層が金属材料層を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項23】
前記信号増幅層が、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られた連続金属フィルムを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項24】
異なる金属層が、光信号を増強するために、局所的に増強するかもしくは反射体として機能するかまたはその両方である、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項25】
前記信号増幅層が、金属材料層、および前記金属材料層の上部の誘電材料を含み、前記捕捉剤が前記誘電材料上にある、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項26】
前記金属材料層が、均一な金属層、ナノ構造金属層、または組み合わせである、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項27】
プラズモン増強により信号を増幅する、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項28】
アッセイが、ラマン散乱により前記標識を検出することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項29】
前記第１のプレートの前記試料接触領域が、前記近接依存性増幅表面を含むが前記標的特異的核酸プローブを含まない部位をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項30】
前記アッセイが、前記近接依存性増幅表面を含むが前記標的特異的核酸プローブを含まない前記部位を読み取ることによりバックグラウンド信号を計算することを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイス、装置、または方法。
【請求項31】
前記デバイスが、前記プレートの１つの上に固定されたスペーサーをさらに備え、前記スペーサーが、前記閉鎖構成における前記第１のプレートと前記第２のプレートとの間の間隔を調節する、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイスまたは方法。
【請求項32】
前記表面増幅層の前記増幅率が、前記捕捉剤に直接的または間接的に結合した単一の標識からの前記光信号を可視化するように調整される、前記請求項のいずれか一項に記載のデバイスまたは方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照本出願は、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６，５９８号（ＥＳＸ−０３２ＰＲＶ）、２０１７年２月１５日に出願された同第６２／４５９，３３７号（ＥＳＸ−０３３ＰＲＶ２）、２０１７年２月９日に出願された同第６２／４５７，０８４号（ＥＳＸ−０１７ＰＲＶ）、２０１７年２月１５日に出願された同第６２／４５９，２６７号（ＥＳＸ−０１７ＰＲＶ２）、２０１７年２月９日に出願された同第６２／４５６，９０４号（ＥＳＸ−０２７ＰＲＶ）、２０１７年２月１５日に出願された６２／４５９，３０３号（ＥＳＸ−０２７ＰＲＶ２）、２０１７年２月９日に出願された同第６２／４５７，０７５号（ＥＳＸ−０３５ＰＲＶ）、２０１７年２月１６日に出願された同第６２／４６０，０５２号（ＥＳＸ−０３５ＰＲＶ２）、および２０１７年２月１６日に出願された同第６２／４６０，０８３号（ＥＳＸ−０３５ＰＲＶ３）の利益を主張し、それらの出願はそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
分野特に、本発明は、限定するものではないがアッセイなどの生物学的および化学的アッセイを実施するデバイスおよび方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景従来の核酸ハイブリダイゼーションアッセイは複雑で、時間がかかり、面倒であり、実験室設備および多量の試料が必要である。例えば、サザンブロットは通常、完了するまでに数時間かかる。さらに、従来の核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、比較的大量の試料（典型的には＞１００μＬ）が必要であり、これは試料が限られているかまたは不足している多くの状況では適用できない。したがって、ほんの少しの試料しか必要としない、高速で、正確で、持ち運び可能で、および／または安価である核酸ハイブリダイゼーションアッセイを開発することが望ましい。さらに、専門家でない者がアッセイを実施することができることが望ましい。本発明はこれらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【0004】
【図面の簡単な説明】
【0005】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみのためであることを理解するであろう。図面は、決して本教示の範囲を限定することを意図していない。図面は完全に縮尺通りのものではない。実験データ点を提示する図では、データ点を接続する線は、データの表示を手引きするためだけのものであり、他の意味はない。
【0006】
【図1】第１のプレートおよび第２のプレートを備える、ＱＭＡＸ（Ｑ：定量化、Ｍ：増大（ｍａｇｎｉｆｙｉｎｇ）、Ａ：試薬の添加、Ｘ：加速（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）；圧縮調節オープンフロー（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｐｅｎ ｆｌｏｗ）（ＣＲＯＦ）としても既知である）デバイスの実施形態を示す。パネル（Ａ）は、プレートが分離しているときの開放構成のプレートの斜視図を示し、パネル（Ｂ）は、開放構成において第１のプレート上に試料を置いた斜視図および断面図を示し、パネル（Ｃ）は、閉鎖構成のＱＭＡＸデバイスの斜視図および断面図を示す。
【図2-1】本発明のいくつかの実施形態による例示的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの説明図である。
【図2-2】本発明のいくつかの実施形態による例示的な核酸ハイブリダイゼーションアッセイの説明図である。
【図3】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図5】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図7】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図9】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図11】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図13】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図15】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図17】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図19】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図21】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図23】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図25】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図27】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図29】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図31】本発明の核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例示的なアッセイスキームを示す。
【図32】ｍｉＲ２１核酸配列およびミスマッチ配列の設計例を示す。
【図35】スペーサーを使用してどのようにデバイスを実装することができるのかを示している。
【図36】ＱＭＡＸの第１のプレートのウェルの例示的な実施形態の概略図である：（ａ）（ｉ）正方格子での丸形、（ｉｉ）正方格子での長方形、（ｉｉｉ）六角形格子での三角形、（ｉｖ）非周期性での丸形の、第１のプレート上のウェルの上面図。（ｂ）（ｉ）金属コーティングを有さない、（ｉｉ）ウェルの底部に金属コーティングを有する、（ｉｉｉ）ウェルの側壁に金属コーティングを有する、（ｉｖ）ウェルの底部および側壁の両方に金属コーティングを有する、第１のプレート上のウェル配列の上面図。
【図37】方法の実施を示すフローチャートである。
【図38】核酸配列決定のための第１のプレートの調製ステップの例を示す。
【図39】標的核酸を捕捉するための閉鎖構成のＱＭＡＸデバイスの例示的な実施形態の概略図である。
【図40】（ａ）１ｐＭ濃度の１μＬの標的核酸試料を使用したＱＭＡＸでの標的ＤＮＡを捕捉するための代表的な時間経過研究である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
例示的な実施形態の詳細な説明以下の詳細な説明は、限定ではなく例示として本発明のいくつかの実施形態を示す。本明細書で使用される節の見出しおよび任意のサブタイトルは、構成目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するものとして決して解釈するべきではない。節の見出しおよび／またはサブタイトル下の内容は、節の見出しおよび／またはサブタイトルに限定されず、本発明の説明全体に適用される。
【0008】
任意の公開物の引用は出願日前のその開示に対してのものであり、本特許請求の範囲が先行発明のためにそのような公開物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は実際の公開日とは異なる場合があり、これを個別に確認する必要があり得る。
【0009】
ＱＭＡＸデバイスおよびアッセイ生物学的および化学的アッセイ（すなわち、検査）において、アッセイ操作を簡素化するか、またはアッセイ速度を加速するデバイスおよび／もしくは方法は、しばしば非常に価値がある。
【0010】
ＱＭＡＸ（Ｑ：定量化、Ｍ：増大、Ａ：試薬の添加、Ｘ：加速；圧縮調節オープンフロー（ＣＲＯＦ）としても既知である）アッセイプラットフォームにおいて、ＱＭＡＸカードは、２つのプレートを使用して、（例えば圧縮により）試料の形状を操作して薄層とする（図１に示す）。特定の実施形態では、プレートの操作は、ヒトの手または他の外力により、２つのプレートの相対位置（プレート構成と呼ぶ）を数回変更する必要がある。手操作を簡単かつ迅速にするようにＱＭＡＸカードを設計する必要がある。
【0011】
ＱＭＡＸアッセイでは、プレート構成の１つは開放構成であり、該構成では、２つのプレートは完全にまたは部分的に分離されており（プレート間の間隔はスペーサーによって制御されない）、試料を置くことができる。別の構成は閉鎖構成であり、該構成では、開放構成において置かれた試料の少なくとも一部が２つのプレートによって圧縮されて非常に均一な厚さの層となり、層の均一な厚さはプレートの内側面によって制限され、プレートおよびスペーサーによって調節される。
【0012】
ＱＭＡＸアッセイ操作では、オペレーターは、最初に２つのプレートを開放構成にして試料を置くことができるようにし、次いでプレートの一方または両方の上に試料を置き、最後にプレートを近接した位置にまで閉じる。特定の実施形態では、ＱＭＡＸカードの２つのプレートは、最初は互いの上部にあり、試料を置くためには分離されて開放構成にする必要がある。プレートの１つが薄いプラスチックフィルム（厚さ１７５μｍのＰＭＭＡ）である場合、このような分離は手で行うのが困難であり得る。本発明は、ＱＭＡＸカードアッセイなどの特定のアッセイの操作を容易かつ迅速にするデバイスおよび方法を提供することを意図している。
【0013】
本発明の一態様は、プレートが本と同じように開閉することができるように、２つ以上のプレートを一緒に接続するヒンジを有することである。
【0014】
本発明の別の態様は、ヒンジがプレート間の角度を調整後に自己維持する（ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔａｉｎ）ことができるように、ヒンジの材料を構成することである。
【0015】
本発明の別の態様は、ＱＭＡＸカードを閉鎖構成に維持して、２つのプレートを偶発的に分離させることなく、ＱＭＡＸカード全体をカードスロットにスライドインおよびスライドアウトすることができるように、ヒンジの材料を構成することである。
【0016】
本発明の別の態様は、限定するものではないがプレートのエッジにおけるノッチまたはプレートに取り付けられたストリップなどのオープニング用機構を提供することであり、これにより、限定するものではないが手によってプレートを分離するなど、ユーザーがプレートの位置調整をより簡単に操作することができるようになる。
【0017】
本発明の別の態様は、３つ以上のプレートの回転を制御することができるヒンジを提供することである。
【0018】
「圧縮オープンフロー（ＣＯＦ）」という用語は、（ｉ）試料の少なくとも一部の上部に他のプレートを配置し、（ｉｉ）次いで２つのプレートを互いに向かって押圧することにより２つのプレート間で試料を圧縮することにより、プレート上に置かれた流動性試料の形状を変える方法を指し、上記圧縮によって試料の少なくとも一部の厚さが減少し、試料がプレート間のオープンスペースに流れ込む。「圧縮調節オープンフロー」または「ＣＲＯＦ」（または「自己較正（ｓｅｌｆ−ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）圧縮オープンフロー」もしくは「ＳＣＯＦ」もしくは「ＳＣＣＯＦ」）（ＱＭＡＸとしても既知である）という用語は、特定のタイプのＣＯＦを指し、圧縮後の試料の一部または全体の最終的な厚さがスペーサーによって「調節」され、スペーサーは２つのプレート間に配置される。ここで、ＣＲＯＦデバイスは、ＱＭＡＸデバイスと交換可能に使用される。
【0019】
「スペーサー」または「ストッパー」という用語は、別段の指示がない限り、２つのプレート間に配置された際に、２つのプレートを一緒に圧縮したときに達成することができる２つのプレート間の最小間隔についての制限を設定する機械的物体を指す。すなわち、圧縮において、スペーサーは、２つのプレートの相対的な動きを停止させて、プレートの間隔が予め設定された（すなわち所定の）値よりも小さくなるのを防ぐ。
【0020】
「スペーサーは所定の高さを有する」および「スペーサーは所定のスペーサー間距離を有する」という用語はそれぞれ、ＱＭＡＸプロセスの前にスペーサーの高さおよびスペーサー間の距離の値が分かっていることを意味する。ＱＭＡＸプロセスの前にスペーサーの高さおよびスペーサー間の距離の値が分かっていない場合、それは所定ではない。例えば、ビーズがプレートのランダムな位置に着地するビーズがスペーサーとしてプレート上にスプレーされる場合、スペーサー間の距離は事前に決められていない。スペーサー間距離があらかじめ決められていない別の例は、ＱＭＡＸプロセス中にスペーサーが移動することである。
【0021】
ＱＭＡＸプロセスで「スペーサーがそれぞれのプレート上に固定される」という用語は、スペーサーがプレートの位置に取り付けられ、その位置への取り付けがＱＭＡＸプロセス中に維持されることを意味する（つまり、それぞれのプレートのスペーサーの位置は変化しない）。「スペーサーがそれぞれのプレートに固定されている」例は、スペーサーがプレートの材料片で一体的に作られ、ＱＭＡＸプロセス中にプレート表面に対してスペーサーの位置が変化しないことである。「スペーサーがそれぞれのプレートに固定されていない」例は、スペーサーが接着剤でプレートに接着されているが、ＱＭＡＸプロセス中のプレート使用中に、接着剤はスペーサーをプレート表面上の元の位置に保持できず、スペーサーがプレート表面上の元の位置から移動して離れることである。
【0022】
ＱＭＡＸプロセスにおける２つのプレートの「開放構成」という用語は、２つのプレートが部分的または完全にかのいずれかで分離され、プレート間の間隔がスペーサーによって調節されていない構成を意味する。
【0023】
ＱＭＡＸプロセスにおける２つのプレートの「閉鎖構成」という用語は、プレートが互いに向き合い、スペーサーおよび関連する体積の試料がプレート間にあり、プレート間の関連する間隔、したがって関連する体積の試料の厚さがプレートおよびスペーサーによって調節され、関連する体積は試料の全体積の少なくとも一部である、構成である。
【0024】
ＱＭＡＸプロセスにおける「試料の厚さはプレートおよびスペーサーによって調節される」という用語は、プレート、試料、スペーサー、およびプレート圧縮方法の所与の条件に対して、プレートの閉鎖構成における試料のうちの少なくとも一部の厚さを、スペーサーおよびプレートの特性から予め決定することができることを意味する。
【0025】
ＱＭＡＸデバイスのプレートの「内側面（ｉｎｎｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ）」または「試料表面」という用語は、試料に接触するプレートの表面を指すのに対し、プレートの（試料に接触しない）他の表面を「外側面」と呼ぶ。
【0026】
ＱＭＡＸプロセスにおける物体の「高さ」または「厚さ」という用語は、別段の指示がない限り、プレートの表面に対して垂直な方向にある物体の寸法を指す。例えば、スペーサーの高さは、プレートの表面に対して垂直な方向のスペーサーの寸法であり、スペーサーの高さおよびスペーサーの厚さは同じことを意味する。
【0027】
ＱＭＡＸプロセスにおける物体の「領域」という用語は、別段の指示がない限り、プレートの表面に平行な物体の領域を指す。例えば、スペーサー領域は、プレートの表面に平行なスペーサーの領域である。
【0028】
ＱＭＡＸデバイスという用語は、試料についてＱＭＡＸ（例えばＣＲＯＦ）プロセスを実施し、２つのプレートを接続するヒンジを有するまたは有さない、デバイスを指す。
【0029】
「ヒンジを備えるＱＭＡＸデバイスおよび「ＱＭＡＸカード」という用語は交換可能である。
【0030】
「角度を自己維持する」、「角度の自己維持」、または「回転角度の自己維持」という用語は、プレートを最初の角度からその角度に動かす外力が取り除かれた後に２つのプレート間の角度を実質的に維持するヒンジの特性を指す。
【0031】
「近接依存性（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）信号増幅層」、「近接依存性信号増幅層」、または「表面信号増幅層／表面」という用語は、分析物または標識分析物（例えば、発光標識）からの信号を近接依存性の様式で増幅する信号増幅層を指す。そのような層の使用において、分析物または標識された分析物からの信号は、分子が信号増幅層の表面に近づくほど増加する。明らかであるように、そのような層に近接する第１の標識分子によって生成される信号の大きさは、この層に対して遠位にある第２の標識分子によって生成される信号より大きくなる。例えば、近接依存性信号増幅層の１００ｎｍ以内の標識分子の信号は、近接依存性増幅層から１μｍ以上離れた標識分子の信号より大きくなる。
【0032】
信号は、「一括（ｌｕｍｐ−ｓｕｍ）」法および「ピクセル計数（ｐｉｘｅｌ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ）」法の両方を使用して検出することができる。一括法は、複数の結合事象によって生成される信号の合計を決定する方法である。ピクセル計数法は、個々の結合事象を識別し、それらをデジタル的に計数する方法である。
【0033】
特定の実施形態では、ＱＭＡＸデバイスは、０．１ｎＭ以下、例えば１０ｐＭ以下、もしくは１ｐＭ以下、または１００ｆＭ以下、例えば１０ｆＭ以下（１ｆＭ以下、もしくは０．５ｆＭ以下、もしくは１００ａＭ以下、もしくは５０ａＭ以下、または２０ａＭ以下を含む）の検出感度を有するように構成される。特定の実施形態では、ＱＭＡＸデバイスは、１０ａＭ〜０．１ｎＭ、例えば２０ａＭ〜１０ｐＭ、５０ａＭ〜１ｐＭ（１００ａＭ〜１００ｆＭを含む）の範囲の検出感度を有するように構成される。いくつかの場合では、ＱＭＡＸデバイスは、１ｎｇ／ｍＬ以下、例えば、１００ｐｇ／ｍＬ以下（１０ｐｇ／ｍＬ以下、１ｐｇ／ｍＬ以下、１００ｆｇ／ｍＬ以下、１０ｆｇ／ｍＬ以下、または５ｆｇ／ｍＬ以下を含む）の濃度の分析物を検出することができるように構成される。いくつかの場合では、ＱＭＡＸデバイスは、１ｆｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、例えば、５ｆｇ／ｍＬ〜１００ｐｇ／ｍＬ（１０ｆｇ／ｍＬ〜１０ｐｇ／ｍＬを含む）の範囲の濃度の分析物を検出することができるように構成される。特定の実施形態では、ＱＭＡＸデバイスは、５桁以上、例えば、６桁以上（７桁以上を含む）のダイナミックレンジを有するように構成される。
【0034】
洗浄を行わない均一なＱＭＡＸデバイスの例これらの実施形態では、基板の上面近くに増幅区域があり、該区域では、基板に結合した標識または基板に非常に近い標識のみが増強された。
【0035】
プレートは、異なる構成になるように互いに対して移動可能である。構成の１つは、２つのプレートが部分的または完全に分離され、プレート間の間隔がスペーサーによって調節されていない、開放構成である。いくつかの実施形態では、それぞれのプレートの内側面は、内側面全体の一部を占める試料接触領域を含む。特定の実施形態では、スペーサーは、試料接触領域内に位置付けられる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、プレートのいずれかに固定されてはなく、試料中に混合されている。
【0036】
試料は、検査を必要とする任意の液体である。いくつかの実施形態では、試料は、処理または希釈を行ったまたは行っていない体液である。例えば、体液は、全血、血漿、血清、尿、唾液、汗、または呼気凝縮液であり得る。いくつかの実施形態では、試料は血液である。特定の実施形態では、試料は血漿を含む。特定の実施形態では、試料は全血を含む。特定の実施形態では、試料は、０．５回、１回、２回、３回、４回、５回回、６回、７回、８回、９回、１０回、２０回、３０回、４０回、５０回、６０回、７０回、８０回、９０回、１００回、２００回、３００回、４００回、５００回、６００回、７００回、８００回、９００回、１，０００回、５，０００回、１０，０００回、５０，０００回、１００，０００回、５００，０００回、もしくは１，０００，０００回またはいずれかの２つの値の間の範囲で、緩衝液で希釈された血液または血漿である。いくつかの実施形態では、試料は、任意の配列の標的核酸、例えば、ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｃｆＲＮＡ、ｍｉｒｎａなどを含む。
【0037】
本方法およびデバイスの使用を制限することを意図することなく、いくつかの実施形態では、該方法は、臨床試料由来の微生物病原体を同定するために用いてもよい。これらの実施形態では、標的配列は、どの病原体が感染症の原因であるかが分からない複数の異なる病原体（例えば、少なくとも１０種または少なくとも１００種の異なる病原体）に由来してもよく、本方法、組成物、およびキットを使用して同定され得る微生物には、複数種のグラム（＋）細菌、複数種のグラム（−）細菌、腸内細菌科の複数種の細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の複数種の細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の複数の細菌種、およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属の複数の細菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、様々な株の大腸菌、例えば、Ｋ１２−ＭＧ１６５５、ＣＦＴ０７３、Ｏ１５７：Ｈ７ ＥＤＬ９３３、Ｏ１５７：Ｈ７ ＶＴ２−Ｓａｋａｉなど、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．デュブリニエンシス（Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）、Ｃ．ビスワナチイ（Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ）、Ｃ．パラプローシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）を含む複数のカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、複数のマイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｍ．ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、Ｍ．ボビス ＢＣＧ、Ｍ．スクロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ケロネー（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｍ．ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、Ｍ．ゲナベンス（Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ）、Ｍ．ゼノイ（Ｍ．ｘｅｎｏｉ）、Ｍ．シミエ（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、Ｍ．フォーチュイタム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、Ｍ．マルモエンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、Ｍ．セラツム（Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ）、Ｍ．ヘモフィルム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ）、およびＭ．アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）種、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）種、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）種、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、対象の方法は、微生物の属、種、亜種、株、またはバリアントのレベルまで微生物の同定を可能にする。
【0038】
いくつかの実施形態では、試料中の標的核酸配列の例は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（ＬＦ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、全大腸菌群（糞便性大腸菌群（ｆｅｃａｌ ｃｏｌｉｆｏｒｍ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む）、ウイルス（腸）ブドウ球菌（例えば、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および黄色ブドウ球菌（エンテロトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、細胞、ＴＳＳＴ−１）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌、大腸菌（志賀様毒素、Ｆ４、Ｆ５、Ｈ、Ｋ、Ｏ、バクテリオファージＫ１、Ｋ５、Ｋ１３）、他のグラム陽性菌、およびグラム陰性桿菌、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）（ＧP９００、ｐ６８、またはクリプトペイン（ｃｒｙｐｔｏｐａｉｎ）、オーシスト）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、炭疽菌、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）、バチルス・グロビギー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、ノロウイルス、リステリア・モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、レプトスピラ・インターロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・ビフレクサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｂｉｆｌｅｘａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・パラシチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、エボラウイルス、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、グラム陽性菌、グラム陰性菌（例えば、緑膿菌、肺炎桿菌、サルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、エンテロバクター・エロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・ヘルマニイ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｅｒｍａｎｉｉ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびソンネ菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ））、ポリオウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、疾患特異的プリオン（ＰｒＰ−ｄ）、Ａ型肝炎ウイルス、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）に由来してもよい。
【0039】
本発明のデバイス、システム、および方法を使用して診断用試料で検出することができる他の病原体には、水痘帯状疱疹（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ ｚｏｓｔｅｒ）；表皮ブドウ球菌、大腸菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＳＲＡ）、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス、緑膿菌、スタフィロコッカス・キャピティス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ）、スタフィロコッカス・ワーネリー（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｒｎｅｒｉ）、肺炎桿菌、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、肺炎連鎖球菌、およびカンジダ・アルビカンス； 淋病（淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｒｒｈｏｅａｅ））、梅毒（梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｎａ ｐａｌｌｉｄｕｍ））、クラミジア（トラコーマクラミジア（Ｃｌａｍｙｄａ ｔｒａｃｏｍｉｔｉｓ））、非淋菌性尿道炎（ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ））、軟性下疳（軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ））、トリコモナス症（腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ））；緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＳＲＡ）、肺炎桿菌、インフルエンザ菌、黄色ブドウ球菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ヘモフィルス・パラヘモリティカス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・クロアセ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌｏａｃａｅ）、カンジダ・アルビカンス、カタル球菌（Ｍｏｒａｘｉｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、肺炎連鎖球菌、シトロバクター・フロインデイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、エンテロコッカス・フェシウム、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｓｃｅｎｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） 在郷軍人病菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）などが含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
特定の実施形態では、試料は、細胞、組織、体液、および排泄物などの生体試料から取得されてもよい。目的の体液には、羊水、房水、硝子体液、血液（例えば、全血、分画血液、血漿、血清）、母乳、脳脊髄液（ＣＳＦ）、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ液、外リンパ液、糞便、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（鼻水および痰を含む）、心膜液、腹膜液、胸膜液、膿、粘膜分泌物（ｒｈｅｕｍ）、唾液、皮脂（皮表脂質）、精液、喀痰、汗、滑液、涙、嘔吐物、尿、および呼気凝縮液が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、試料は、対象、例えばヒトから得られてもよく、対象のアッセイで使用する前に処理されてもよい。例えば、分析前において、組織試料からタンパク質／核酸を使用前に抽出してもよく、その方法は既知である。特定の実施形態では、試料は、臨床試料、例えば患者から収集された試料であってもよい。
【0041】
標識は、該標識が上記捕捉剤への結合前または結合後のいずれかで、直接的または間接的に、発光標識または光学的に検出可能な標識である。標識は、ラマン散乱、色度、ルミネセンス、蛍光、エレクトロルミネセンス、ケミルミネセンス、および／または電気化学ルミネセンスの信号を伴った標識である。本明細書で使用される場合、「発光標識」という用語は、外部励起下のときに発光することができる標識を指す。これはルミネセンスであり得る。蛍光標識（色素分子または量子ドットを含む）、およびルミネセンス標識（例えば、エレクトロルミネセンスまたはケミルミネセンス標識）は、発光標識の類型である。外部励起は、蛍光では光（光子）、エレクトロルミネセンスでは電流、ケミルミネセンスでは化学反応である。外部励起は、上記の組み合わせにすることができる。「標識分析物」という語句は、標識の存在を評価することによって分析物を検出することができるように、発光標識で検出可能に標識された分析物を指す。標識分析物は直接的に標識されてもよく（すなわち、分析物自体は、例えば強い結合、例えば共有結合または非共有結合を介して、標識に直接結合されてもよい）、または標識分析物は間接的に標識されてもよい（すなわち、分析物は、直接的に標識された二次捕捉剤によって結合される）。
【0042】
増幅層は、標的分析物または標識が増幅層から１ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、１μｍ、２μｍ、５μｍ、１０μｍ、またはいずれかの２つの値の間の範囲、および１ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜２００ｎｍ、２００ｎｍ〜５００ｎｍの好ましい範囲にあるときに、標的分析物または標的分析物の標識からの信号を増幅する。
【0043】
「増幅する」という用語は、信号の大きさの増加、例えば、信号の少なくとも１０倍の増加、少なくとも１００倍の増加、少なくとも１，０００倍の増加、少なくとも１０，０００倍の増加、または少なくとも１００，０００倍の増加を指す。
【0044】
いくつかの実施形態では、近接依存性信号増幅層には、２０１０年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／３４７，１７８号、２０１２年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６２２，２２６号、２０１２年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６１／７０８，３１４号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８００，９１５号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０１，９３３号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０１，０９６号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／８０１，４２４号、２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９４，３１７号、２０１４年１２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／０９０，２９９号、２０１４年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／０６６，７７７号、２０１５年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／２３４，５３８号、２０１３年６月１３日に出願された米国実用新案特許出願第１３／６９９，２７０号、２０１３年３月１５日に出願された米国実用新案特許出願第１３／８３８，６００号、２０１４年８月１３日に出願された米国実用新案特許出願第１４／４５９，２３９号、２０１４年８月１３日に出願された米国実用新案特許出願第１４／４５９，２５１号、２０１４年３月１６日に出願された米国実用新案特許出願第１４／８５２，４１２号、２０１５年９月３０日に出願された米国実用新案特許出願第１４／８７１，６７８号、２０１５年１０月５日に出願された米国実用新案特許出願第１４／４３１，２６６号、２０１５年３月２５日に出願された米国実用新案特許出願第１４／６６８，７５０号、２０１５年９月１１日に出願された米国実用新案特許出願第１４／７７５，６３４号、２０１５年９月１１日に出願された米国実用新案特許出願第１４／７７５，６３８号、２０１５年９月１１日に出願された米国実用新案特許出願第１４／８５２，４１７号、２０１５年１２月９日に出願された米国実用新案特許出願第１４／９６４，３９４号、２０１１年５月２０日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３７４５５号、２０１３年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２３４７号、２０１３年１０月１日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０６２９２３号、２０１４年３月１６日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３０１０８号、２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９６７５号、２０１４年３月１４日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２８４１７号、２０１４年３月１５日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９９７９号、２０１５年１０月２０日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５６５１８号、２０１６年９月２７日に出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５４０２５号に記載される近接依存性信号増幅層が含まれ、そられの完全な開示は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0045】
信号増幅層は、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られた連続金属フィルムを含んでもよい。信号増幅層は、高増幅領域および低増幅領域を含み、高増幅領域は上記表面で低増幅領域よりも信号を増幅し、層の低増幅領域は選択的に遮蔽され、信号増幅層は、（ｉ）２つ以上の突起物（ｐｒｏｔｒｕｓｉｏｎ）、（ｉｉ）２つ以上の金属製金属構造体、および（ｉｉｉ）金属構造体の間の２つ以上の間隙（ｇａｐ）を含み、これにより、標的分析物が高増幅領域に結合して検出される確率を高める。
【0046】
信号増幅層は、（ｉ）基板上の実質的に連続した金属バックプレーンと、
（ｉｉ）金属バックプレーンから延びる、またはバックプレーンの穴を通って基板から延びる、１つ以上の誘電体柱または半導体柱と、
（ｉｉｉ）柱上部の金属ディスクであって、ディスクのエッジの少なくとも一部が、間隙によって金属バックプレーンから離れている、金属ディスクと、を含んでもよく、
間隙および金属エッジの一部は、高信号増幅領域の一部であり、金属ディスクは、円形、多角形、ピラミッド形、楕円形、細長い棒形状、またはそれらの任意の組み合わせを有する。金属ディスクは、０．５〜３０ｎｍの範囲の距離で金属フィルムから離れており、ディスクの平均横寸法は、２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲であり、信号増幅層は、円形、多角形、ピラミッド形、楕円形、細長い棒形状、またはそれらの任意の組み合わせからなる形状群から選択された形状を有する１つ以上の金属ディスクを含み、ディスクの平均横寸法は、２０ｎｍ〜２５０ｎｍの範囲であり、隣接するディスク間の間隙は、０．５〜３０ｎｍの範囲であり、
金属構造体は、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られる。
柱は周期的もしくは非周期的であり、または金属構造体はランダムな形状を有し、
増幅される信号は、ラマン散乱、色度、ルミネセンス、蛍光、エレクトロルミネセンス、化学ルミネセンス、および／または電気化学ルミネセンスである。
【0047】
ＱＭＡＸデバイスの第１のプレートは、さらに、上記捕捉剤を上記信号増幅層と連結する分子連結層をさらに含んでもよく、上記分子接着層は、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）であり、ＳＡＭの各分子は、３つの部分：（ｉ）信号増幅層に対して特異的な親和性を持つ頭基（ｈｅａｄ ｇｒｏｕｐ）と、（ｉｉ）捕捉剤に対して特異的な親和性を持つ末端基と、（ｉｉｉ）頭基と末端基とを連結するリンカーと、を含み、リンカーの長さは、金属信号増幅層と付着された捕捉剤との間の平均間隔を決定し、デバイスの光増幅に影響を与え得る。
【0048】
ＱＭＡＸデバイスの第２のプレートの試料接触領域は、試料に接触すると試料に溶解して試料中に拡散する検出剤を収容する、貯蔵部位を含んでもよく、各捕捉剤、標的分析物、および対応する検出剤は、第１のプレートの結合部位において捕捉剤−標的分析物−検出剤サンドイッチを形成することができる。
【0049】
第２のプレートの試料接触領域が、試料に接触すると試料に溶解して試料中に拡散する検出剤を収容する、貯蔵部位を含み、該検出剤が、捕捉剤に結合し、捕捉剤と標的分析物との間の結合を競合的に阻害する、先行する段落のいずれかに記載のデバイス。
【0050】
いくつかの実施形態では、蛍光標識の増強機構はプラズモン増強（Ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）として既知である。金属ナノ構造体の近接により増強される蛍光強度により、蛍光分子でタグ付けされた非常に低濃度のバイオマーカーをセンサー測定（ｓｅｎｓｉｎｇ）形式または組織画像化のいずれかで検出することが可能になる。金属増強蛍光（ＭＥＦ）は、フルオロフォアが受ける局所電場の増強およびフルオロフォアと近接する金属ナノ粒子との電磁結合に起因する、励起速度の増加から生じる。したがって、金属ナノ構造体は、蛍光量子収量の増加、寿命の短縮、フルオロフォアの光安定性の向上などの望ましい効果を生じさせることができる。過去１０年間に、ＭＥＦによりフルオロフォアの蛍光強度および光安定性の両方を改善するために設計された多くの既存および新規のナノ粒子ならびに構造体が文献に現れた。金属ナノ構造体は、入射光を操作する能力があることから、長い間研究されてきた。局在表面プラズモン（ＬＳＰ）は、金属ナノ構造体およびナノ粒子に閉じ込められた電荷密度振動である。粒子を考慮すると、外部場により、固定されたイオンコアに対して金属ナノ粒子中の自由電子を移動させることが可能となる。この移動は、電荷密度のコヒーレント振動を引き起こす復元力を生じさせる。これは、局在表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）と呼ばれる。ＬＳＰＲは、電磁場の増強の原因であり、これが表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）を生じさせると考えられる。蛍光分子がこのプラズモン効果の存在下で放射の増強を示したことが観察されたとき、ＭＥＦの場が生まれた。光が金属ナノ粒子によって吸収および散乱されたときに発生する異なる光学応答の描写を見ることができる。上記の機構により、プラズモン効果および関連する増強は、１０ｎｍ〜２００ｎｍでの表面の近くである。
【0051】
上記のように、いくつかの実施形態では、本方法は洗浄なしで行われ、洗浄ステップは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはいずれかの２つの値の間の範囲の、結合ステップ後における第１のプレート上の結合していない標的分析物を除去するプロセスである。典型的には、洗浄ステップには、プレートを緩衝液で１回、２回、３回洗浄することが含まれる。
【0052】
いくつかの実施形態では、第２のプレートの試料接触領域は、試料に接触すると試料に溶解して試料中に拡散する検出剤を収容する、貯蔵部位を含み、各捕捉剤、標的分析物、および対応する検出剤は、第１のプレートの結合部位において捕捉剤−標的分析物−検出剤サンドイッチを形成することができる。
【0053】
洗浄を行わない均一なＱＭＡＸアッセイの感度の理論的分析基板（第１のプレート）上の標的分析物（標識を有する）の最終捕捉密度（ＬｏＤまたはアッセイ感度に直接関連する）がｄｃであると定義し、
液体中の標識密度がＤＬであると定義し、
増幅率がＡであると定義し、
増幅率が基板のＬＡ内では均一であると定義し、
液体の高さがＸ−プレートではＬＸ（ＬＸ＞＞ＬＡ）であると定義し、
液体の標識信号強度の標準偏差（ｓｄ）がσであると定義し、
捕捉フルオロフォアからの信号は、（１＋３×ｓｄ）×液体からのバックグラウンド信号より大きくなければならないので、以下である：
Ａｄｃ≧（１＋３σ）（ＤｌＬＸ＋ＡＤｌＬＡ）。
この方法において検出可能な最小捕捉密度（ＬｏＤに比例する）は、以下の通りである：
【0054】
明らかに、基板の増幅率（Ａ）を増加させて、ＱＭＡＸの厚さ（ＬＸ）を減少させると、ＱＭＡＸカード形式での洗浄を行わない均一アッセイの性能（感度）を改善することができる。しかし、ＱＭＡＸの厚さを減少させると、結合量が減少する可能性がある。したがって、ＱＭＡＸ間隙サイズまたは液体の厚さのパラメーターにはトレードオフがある。
【0056】
アッセイプロセスの簡単な概要（Ａ）．チップの調製：捕捉プローブを基板表面上に固定した。
（Ｂ）．チップのブロッキング：チップをブロッカーでブロッキングした。
（Ｃ）．試料の導入：遊離核酸または細胞／粒子に含有される核酸のいずれかの形態の目的の標的を含む生体液（全血、血漿、血清、唾液、尿、汗など）を、基板表面に添加した。
（Ｄ）ＱＭＡＸカードの閉鎖および押圧：マイクロスケール構造側を下に向けたＱＭＡＸカードをチップの上部に配置し、押圧した。必要な細胞溶解試薬、タンパク質変性試薬、ハイブリダイゼーション試薬、および標識された検出プローブを、マイクロスケール構造を有するＱＭＡＸカードの側面上で乾燥させた；
（Ｅ）〜（Ｆ）．細胞または粒子の溶解、標的配列の捕捉および検出：乾燥させた試薬を生体液中に溶解した。必要に応じて、細胞（または粒子）を溶解試薬で溶解して、標的核酸配列を放出させた。次いで、放出されたまたは遊離の標的核酸配列を基板表面上の固定された捕捉プローブによって捕捉し、ハイブリダイゼーションを介して、標識された検出プローブによって検出した。
（Ｇ）．洗浄：ＱＭＡＸカードを剥がし、好適な洗浄溶液を含有する吸収材で基板表面を洗浄した。
（Ｈ）．信号の検出：標識された検出プローブからの信号を検出器によって検出した。
【0057】
簡単な実験手順図２（Ａ）に見ることができるように、標的核酸配列の領域に相補的な特定の配列を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（捕捉プローブ）を基板表面上にコーティングした。「捕捉プローブ（１）」と呼ぶＤＮＡオリゴヌクレオチドは、通常１０〜５０ｂｐの長さで、基板へのコーティングを容易にするために３’末端が修飾される。一般に使用される３’末端修飾には、チオール、ジチオール、アミン、ビオチンなどが含まれるが、これらに限定されない。基板は、捕捉プローブの固定化のために使用され、金表面、ＰＭＭＡ、ＰＳなどを含むが、これらに限定されない。基板上にコーティングされる捕捉プローブの密度は、捕捉プローブのアクセス性に非常に重要であり、したがってアッセイの感度に影響を及ぼす。ある用途では、単一の標的核酸配列に特異的である単一タイプの捕捉プローブを基板上に固定化することができる。別の用途では、異なる標的核酸配列または単一の標的核酸配列の異なる領域に特異的である異なるタイプの捕捉プローブを基板上に固定化することができる。コーティングは室温で一晩行うのが理想的であったが、短くすることもできる。コーティング後、ＰＢＳＴ緩衝液を使用して、コーティングされていない捕捉プローブを洗い流した。
【0058】
図２（Ｂ）に見ることができるように、次いで基板表面をブロッカー溶液でブロッキングした。好適なブロッカーには、６−メルカプトヘキサノールなどの小分子ブロック、またはウシ血清アルブミン、カゼイン、粉乳などのタンパク質ブロッカーが含まれるが、これらに限定されない。ブロッキングを室温で少なくとも３０分間行った。次いで、基板表面をＰＢＳＴで洗浄し、すぐに使用することができるようにした。
【0059】
図２（Ｃ）に見ることができるように、捕捉プローブがコーティングされた基板表面上に生体試料を添加する。生体試料は、基板表面上に直接滴下することにより導入されるか、または移送ツールにより容易化されることができる。適用することができる生体試料には、ニートの全血、血漿、血清、尿、唾液、汗などが含まれるが、これらに限定されない。目的の標的は、遊離核酸、核酸とタンパク質との複合体の形態であるか、またはヒト細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、ウイルス粒子などの内部に存在し得る。目的の標的には、直鎖状核酸、環状核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸などが含まれるが、これらに限定されない。
【0060】
［１］本明細書で使用される「核酸」という用語は、任意のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子、もしくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、またはＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡの混合物を指す。したがって、「核酸」という用語は、ゲノムまたは染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および低分子ＲＮＡを含むことを意図しているが、これらに限定されない。「核酸」という用語はまた、天然のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子、または合成ＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ分子を含むことも意図している。いくつかの実施形態では、無細胞核酸が試料中に存在し、本明細書で使用される場合、「無細胞」は、核酸がいかなる細胞構造にも含まれていないことを示す。いくつかの他の実施形態では、核酸は、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、真菌細胞、および／またはウイルス粒子を含むがこれらに限定されない、細胞構造内に含有される。無細胞核酸の形態の、もしくは細胞構造内の、またはそれらの組み合わせのいずれかの核酸は、試料中に存在し得る。いくつかのさらなる実施形態では、核酸は、第１のプレートの内側面上に導入される前に精製される。さらなる実施形態では、核酸は、タンパク質および脂質などの他の分子に関連する複合体内に存在し得る。
【0061】
図２（Ｄ）に見ることができるように、いくつかの実施形態では、細胞溶解試薬、タンパク質変性試薬、核酸ハイブリダイゼーション緩衝液、および標識された検出プローブなどを含むがこれらに限定されない、必要な試薬を、マイクロスケール構造を有するＸプレート（いくつかの実施形態では、ＱＭＡＸカードとしての特徴付けられる）の側面上にスポッティングしたか、または該側面上で直接乾燥させた。試料を導入した後、乾燥した試薬（８）側を下に向けたＸプレートを試料上および基板に押圧した。
【0062】
いくつかの実施形態では、細胞溶解試薬には、塩、界面活性剤、酵素、および他の添加物が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における「塩」という用語には、リチウム塩（例えば、塩化リチウム）、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）、カリウム（例えば、塩化カリウム）、トリス（Ｔｒｉｓ）、およびヘペス（ＨＥＰＥＳ）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書における「界面活性剤」という用語は、アニオン性およびカチオン性、非イオン性または両性イオン性を含む、イオン性であり得る。本明細書で使用される「イオン性界面活性剤」という用語は、水に溶解したときに部分的または完全にイオン形態である任意の界面活性剤を含む。好適な陰イオン界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もしくは他のアルカリ金属アルキル硫酸塩もしくは同様の界面活性剤、サルコシル、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本明細書における「酵素」という用語には、リゾチーム、セルラーゼ、およびプロテイナーゼが含まれるが、これらに限定されない。さらに、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、および他のポリアミノカルボン酸を含むがこれらに限定されないキレート剤、およびジチオトレイトール（ｄＴＴ）などのいくつかの還元剤も細胞溶解試薬に含めることができる。
【0063】
図２（Ｅ）に見ることができるように、Ｘプレートを基板に押圧した後、乾燥した試薬を生体液中に溶解させた。細胞溶解試薬は、細胞壁および細胞膜の破壊を促進して、標的核酸分析物を放出する。ＳＤＳなどのタンパク質変性試薬は、核酸を結合している結合タンパク質を変性させて、遊離核酸を放出する。乾燥したハイブリダイゼーション試薬の組成は、好適な塩濃度を提供して、ハイブリダイゼーション複合体の強度を維持し、生体試料由来の非特異的結合を低減させるためにも重要である。例えば、塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを添加して、ハイブリダイゼーション緩衝液中で理想的なイオン強度を提供した。フィコールおよびポリビニルプロリジン（ＰＶＰ）は、ハイブリダイゼーションプロセスを早めるために添加することができる。ウシ血清アルブミンは、生体試料からの干渉を低減するために添加される。標的核酸配列に対して特異的な相補配列を有する標識された検出プローブを使用して、ハイブリダイゼーションを介して、標的核酸配列を検出する。
【0064】
図（Ｆ）に見ることができるように、無細胞標的核酸配列および／または放出された標的核酸分析物を、配列特異的ハイブリダイゼーションを介して、捕捉プローブによって捕捉した。一方、捕捉された標的核酸配列を、配列特異的ハイブリダイゼーションを介して、標識された検出プローブによって検出した。Ｘプレートを特定の期間にわたって基板に押圧することができる。実験データは、捕捉された標的核酸配列が２分後に平衡に達することを示した。
【0065】
図２（ｇ）に見ることができるように、Ｘプレートを基板から剥がした。好適な洗浄緩衝液、好ましくは５×ＳＳＣおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するスポンジなどの吸収材を配置し、基板表面上に軽く押圧した。洗浄中に、細胞片、タンパク質、非特異的核酸などを基板表面から除去した。
【0066】
いくつかの実施形態では、異なるイオン強度を有する緩衝液を適用して、信号対コントラスト比を増大させてもよい。例には、０．１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、２×ＳＳＣ、または５×ＳＳＣが含まれるが、これらに限定されない。洗浄ステップは、典型的にはプレートを１回、２回、もしくは３回またはそれ以上洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、各洗浄ステップは同じタイプの洗浄緩衝液を使用してもよい。いくつかの実施形態では、各洗浄ステップにおいて異なる洗浄緩衝液を使用してもよい。
【0067】
いくつかの実施形態では、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を使用した。いくつかの実施形態では、他の界面活性剤を使用してもよい。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、アニオン性およびカチオン性、非イオン性または両性イオン性を含む、イオン性であり得る。本明細書で使用される「イオン性界面活性剤」という用語は、水に溶解したときに部分的または完全にイオン形態である任意の界面活性剤を含む。好適な陰イオン界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もしくは他のアルカリ金属アルキル硫酸塩もしくは同様の界面活性剤、サルコシル、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0068】
図２（Ｈ）に示すように、吸収材を基板から剥がした。標識された検出プローブから得られる信号強度を好適な検出器によって測定した。
【実施例】
【0069】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの例および結果実施例１：９６ウェルプレートを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上のＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイ
アッセイの詳細（図３を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金Ｍプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●各ウェルに５０μＬのｍｉＲ２１標的（ＴＥ緩衝液で希釈）を添加し、５０μＬの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●室温で２時間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0070】
アッセイの結果（図４を参照）：●正規化された信号強度とＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●２時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Ｍプレート上でのＴＥ緩衝液中の５１０ｆＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●６桁のダイナミックレンジを達成した。
【0071】
実施例２：９６ウェルプレートを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上の１０％血漿中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図５を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金Ｍプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●各ウェルに５０μＬのｍｉＲ２１標的（１０％血漿中に混ぜる）を添加し、５０μＬの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●室温で２時間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0072】
アッセイの結果（図６を参照）：●正規化された信号強度と１０％血漿中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●２時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Ｍプレート上での１０％血漿中の８２０ｆＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●６桁のダイナミックレンジを達成した。
●１０％血漿でのアッセイ感度はＴＥ緩衝液と同様であり、これは血漿マトリックスでの干渉が有意でないことを示している。
【0073】
実施例３：９６ウェルプレートを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図７を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金Ｍプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●各ウェルに５０μＬのｍｉＲ２１標的（ニートの全血中に混ぜる）を添加し、５０μＬの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●室温で２時間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0074】
アッセイの結果（図８を参照）：●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●２時間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、Ｍプレート上のニートの全血中の９．７ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●６桁のダイナミックレンジを達成した。
●ニートの全血でのアッセイ感度はＴＥ緩衝液および１０％血漿に匹敵し、これは全血のマトリックス中での堅固なアッセイ性能を示している。
【0075】
実施例４：時間経過研究−−−３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブによって検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図９を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面上に０．５μｌの１μＭ ｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で様々な時間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0076】
アッセイの結果（図１０を参照）：●ｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイにおいてＩＲ８００標識検出プローブを使用し、３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧したとき、信号強度は１分間のハイブリダイゼーション時間と比較して２分間のハイブリダイゼーション時間でより高くなる。
●２分後、信号強度は飽和する。
●したがって、ＩＲ８００標識検出プローブおよび３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用するさらなる核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、２分間のハイブリダイゼーション時間を使用する。
【0077】
実施例５：時間経過研究−−−３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ストレプトアビジン−４０ｎｍビーズにより検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図１１を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μＬのｍｉＲ２１標的（ＴＥ緩衝液で希釈）を滴下し、０．５μＬの１μＭビオチン化検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●１μＬのストレプトアビジン−４０ｎｍビーズ（４％ＢＳＡで１：１０希釈）を滴下する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で様々な時間待つ。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャーで３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用して一括信号測定を行う。
【0078】
アッセイの結果（図１２参照）：●ｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイにおいてＩＲ８００標識検出プローブを使用し、３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧したとき、信号強度は１分間のハイブリダイゼーション時間と比較して２分間のハイブリダイゼーション時間でより高くなる。
●信号強度は５分でピークに達した。
●したがって、ストレプトアビジン−４０ｎｍビーズおよび３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用したさらなる核酸ハイブリダイゼーションアッセイには、５分間のハイブリダイゼーション時間を使用する。
【0079】
実施例６：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出される金薄膜上のＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図１３を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μＬのｍｉＲ２１標的（ＴＥ緩衝液で希釈）を滴下し、０．５μＬの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0080】
アッセイの結果（図１４を参照）：●正規化された信号強度とＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ＴＥ緩衝液中の８６１ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●３桁のダイナミックレンジを達成した。
【0081】
実施例７：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ビオチン化検出プローブおよびストレプトアビジン−４０ｎｍビーズにより検出される金薄膜上のＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図１５を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μＬのｍｉＲ２１標的（ＴＥ緩衝液で希釈）を滴下し、０．５μＬの１μＭビオチン化検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●１μＬのストレプトアビジン−４０ｎｍビーズ（４％ＢＳＡで１：１０希釈）を滴下する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で５分待つ。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャーで３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0082】
アッセイの結果（図１６を参照）：●正規化された信号強度とＴＥ緩衝液中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ＴＥ緩衝液中の２８ｎＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●１桁のダイナミックレンジを達成した。
【0083】
実施例８：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図１７を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0084】
アッセイの結果（図１８を参照）：●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の８．４１ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●５桁のダイナミックレンジを達成した。
●ＱＭＡＸカードを使用すると、金薄膜上でほぼ同じ感度（８．４１ｐＭと比較して９．７ｐＭ）を伴ってアッセイ時間が著しく（２時間〜２分間に）短縮される。
【0085】
実施例９：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ビオチン化検出プローブおよびストレプトアビジン−４０ｎｍビーズにより検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図１９を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭビオチン化検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●１μＬのストレプトアビジン−４０ｎｍビーズ（４％ＢＳＡで１：１０希釈）を滴下する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で５分待つ。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャーで３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0086】
アッセイの結果（図２０参照）：●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●２分間のハイブリダイゼーションプロトコルを使用して、ニートの全血中の８．８ｎＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●２桁のダイナミックレンジを達成した。
【0087】
実施例１０：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ビオチン化検出プローブおよびストレプトアビジン−４０ｎｍビーズにより検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図２１を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭビオチン化検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●１μＬのストレプトアビジン−４０ｎｍビーズ（４％ＢＳＡで１：１０希釈）を滴下する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で５分待つ。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャーで３回すすぐ。
●倒立顕微鏡を使用してピクセル化（ＰＩＸｅｌａｔｅｄ）測定を行う。
【0088】
アッセイの結果（図２２を参照）●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の８７ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した
●２桁のダイナミックレンジを達成した。
【0089】
実施例１１：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ビオチン化検出プローブおよびストレプトアビジン−Ｃｙ５により検出される金薄膜上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図２３を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを金薄膜上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭビオチン化検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●１μＬの５００ｎｇ／ｍｌストレプトアビジン−Ｃｙ５を滴下する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間待つ。
●チップ表面をＤＮＡウォッシャーで３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0090】
アッセイの結果（図２４を参照）●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の６８ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した
●４桁のダイナミックレンジを達成した。
●ストレプトアビジン−Ｃｙ５を検出標識として使用したアッセイ感度（６８ｐＭ）は、ＩＲ８００を標識として使用した場合（８．４１ｐＭ）ほど良好ではない。
【0091】
実施例１２：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図２５を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを室温で一晩Ｍプレート上にコーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0092】
アッセイの結果（図２６を参照）●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の１０ｐＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●５桁のダイナミックレンジを達成した。
●再度、ＱＭＡＸカードを使用すると、金薄膜上でほぼ同じ感度（８．４１ｐＭと比較して１０ｐＭ）を伴ってアッセイ時間が著しく（２時間〜２分間に）短縮される。
●しかしながら、Ｍプレートを使用しても、恐らくＭプレートの品質が低いことに起因して、アッセイの感度は改善しなかった。
【0093】
実施例１３：３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図２７を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブを室温で一晩Ｍプレート上にコーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●倒立顕微鏡を使用してピクセル化（ＰＩＸｅｌａｔｅｄ）測定を行う。
【0094】
アッセイの結果（図２８を参照）●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用し、ピクセル化測定法を使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の３５０ｆＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●ピクセル化法で測定した場合（３５０ｆＭ）、同じアッセイの一括測定法（１０ｐＭ）よりも感度が約２桁高い。
【0095】
実施例１４：ＩＲ８００標識検出プローブにより検出される３０μｍ Ｘウェル上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイアッセイの詳細（図２９を参照）：
●１μＭのチオール化捕捉プローブをＸウェルに室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●チップ表面に０．５μｌのｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を滴下し、０．５μｌの１μＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●ＰＥＴフィルムで押圧し、室温で２分間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＸウェルをＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0096】
アッセイの結果（図３０を参照）●正規化された信号強度とニートの全血中のｍｉＲ２１標的の濃度との相関が観察された。
●３０μｍスペーサーを備えたＱＭＡＸカードを使用して、２分間のハイブリダイゼーション下において、ニートの全血中の１４０ｆＭ ｍｉＲ２１標的のＬｏＤを達成した。
●ＰＥＴフィルムで押圧すると、ＬｏＤがわずかに改善された（押圧ありではＬｏＤ＝１４０ｐＭに対して、押圧なしではＬｏＤ＝３３６ｐＭ）。
【0097】
実施例１５：９６ウェルプレートを使用した、ＩＲ８００標識検出プローブにより検出されるＭプレート上のニートの全血中のｍｉＲ２１ハイブリダイゼーションアッセイにおける、単一塩基対の差別化アッセイの詳細（図３１および３２を参照）：
●５００ｎＭのチオール化捕捉プローブを金Ｍプレート表面上に室温で一晩コーティングした。
●ＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０μＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
●各ウェルに５０μＬの１０ｎＭ ｍｉＲ２１標的（ニートの全血で希釈）を添加し、５０μＬの１００ｎＭ ＩＲ８００標識検出プローブ（Ｈ７１４０ハイブリダイゼーション緩衝液で希釈）と混合する。
●室温で２時間ハイブリダイゼーションを行う。
●ＭプレートをＤＮＡウォッシャー（１×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回すすぐ。
●ラマン顕微鏡を使用した一括信号測定を行う。
【0098】
アッセイの結果（図３３および３４を参照）●完全に一致したｍｉＲ２１標的は、検査した全てのミスマッチ標的の中で最高の信号強度をもたらした。
●ミスマッチ塩基対の信号強度への影響は場所に依存する。
●ハイブリダイゼーション領域の中心に位置するミスマッチ塩基対は、ハイブリダイゼーション領域の末端にあるミスマッチ塩基対よりも顕著な影響を与える。
●ハイブリダイゼーション領域の末端に単一のミスマッチ塩基対を導入しただけでも、信号強度が約３倍減少した。
【0099】
実験条件の概要【0100】
全ての実験において、分析物はmiR21核酸である。
【0101】
本発明の例Ａ１．核酸ハイブリダイゼーションアッセイ用のデバイスであって、
第１のプレート、第２のプレート、およびスペーサーを備え、
ｉ．プレートは、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、
ｉｉ．各プレートはそれぞれ、核酸分析物を含む試料と接触するための試料接触領域を有する内側面を含み、
ｉｉｉ．スペーサーは、所定の実質的に均一な高さを有し、
ｉｖ．第１のプレートは、第１のプレートの内側面上にコーティングされた核酸捕捉プローブを含み、
ｖ．第２のプレートは、第２のプレートの内側面上にコーティングされた核酸検出プローブを含み、
構成の１つは、２つのプレートが部分的または完全に分離され、プレート間の間隔がスペーサーによって調節されてなく、試料がプレートの一方または両方の上に置かれる、開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、開放構成で試料を置いた後に構成される閉鎖構成であり、閉鎖構成では、少なくとも１つのスペーサーが２つのプレートの間にあり、置かれた試料の少なくとも一部が、プレートによって圧縮されて非常に均一な厚さの層となり、かつプレートに対して実質的に動かず、層の均一な厚さが、２つのプレートの内側面によって制限され、かつプレートおよびスペーサーによって調節され、
捕捉プローブは、分析物の一部に相補的に結合し、分析物を第１のプレートの内側面に固定するように構成され、
検出プローブは、均一な厚さの層へと拡散して、分析物の別の部分に相補的に結合し、検出可能な信号を生成するように構成されている、デバイス。
【0102】
Ｂ１．核酸分析方法であって、（ａ）核酸分析物を含む液体試料を取得することと、
（ｂ）Ａ１〜Ａ１２の項目のいずれかのデバイスを取得することと、
（ｃ）プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くことと、
（ｄ）（ｃ）の後、２つのプレートを合わせ、プレートを押圧して閉鎖構成にすることと、
（ｅ）均一な厚さの層からの信号を検出および測定し、それによって核酸分析物の存在および／または量を決定することと、を含む、方法。
【0103】
Ａ２．第１のプレートが、第１のプレートの内側面上にコーティングされたブロッカーをさらに含む、実施形態Ａ１のデバイス。
【0104】
Ａ３．第１のプレートおよび／または第２のプレートが、それぞれのプレートの内側面上にコーティングされた安定剤をさらに含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0105】
Ａ４．安定剤が、糖、ポリマー、グリセロール、およびそれらの混合物から選択される、実施形態Ａ３のデバイス。
【0106】
Ａ５．安定剤が、スクロースまたはグルコースである、実施形態Ａ３のデバイス。
【0107】
Ａ６．捕捉プローブが、第１のプレートの内側面に共有結合している、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0108】
Ａ７．捕捉プローブが、チオール結合を介して第１のプレートの内側面に結合している、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0109】
Ａ８．付着試薬がプロテインＡである、実施形態Ａ７のデバイス。
【0110】
Ａ９．試料が全血を含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0111】
Ａ１０．試料が血清を含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0112】
Ａ１１．スペーサーが、第２のプレートの内側面上に固定されている、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0113】
Ａ１２．検出プローブおよび／または捕捉プローブが１０〜４０ｂｐの長さを有する、先行する実施形態のいずれかのデバイス。
【0114】
Ｂ２．第１のプレートが、第１のプレートの内側面上にコーティングされたブロッカーをさらに含む、実施形態Ｂ１の方法。
【0115】
Ｂ３．第１のプレートおよび／または第２のプレートが、それぞれのプレートの内側面上にコーティングされた安定剤をさらに含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0116】
Ｂ４．安定剤が、糖、ポリマー、グリセロール、およびそれらの混合物から選択される、実施形態Ｂ３の方法。
【0117】
Ｂ５．安定剤がスクロースまたはグルコースである、実施形態Ｂ３の方法。
【0118】
Ｂ６．捕捉プローブが、第１のプレートの内側面に共有結合している、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0119】
Ｂ７．捕捉プローブが、内側面と捕捉プローブに結合した付着試薬上の無極性残基との間の疎水性相互作用を介した受動的吸収（ｐａｓｓｉｖｅ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）によって第１のプレートの内側面に付着されている、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0120】
Ｂ８．付着試薬はプロテインＡである、実施形態Ｂ７の方法。
【0121】
Ｂ８．試料が全血を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0122】
Ｂ９．試料が血漿を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0123】
Ｂ１０．スペーサーが、第２のプレートの内側面上に固定されている、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0124】
Ｂ１１．ステップ（ｅ）の前かつステップ（ｄ）の後に、均一な厚さの層を所定の期間にわたってインキュベートすることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0125】
Ｂ１２．所定の期間が、検出プローブが均一な厚さの層を横切って試料中に拡散するのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い、実施形態Ｂ１１の方法。
【0126】
Ｂ１３．試料が第１のプレート上に置かれる、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0127】
Ｂ１４．ステップ（ｄ）の前かつステップ（ｃ）の後に、第１のプレート上の試料を所定の期間にわたってインキュベートすることをさらに含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0128】
Ｂ１５．所定の期間が、捕捉プローブと分析物との間の結合が平衡に達するのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い、実施形態Ｂ１４の方法。
【0129】
Ｂ１６．ステップ（ｄ）の前かつステップ（ｃ）の後に、第１のプレートの内側面を洗浄することをさらに含む、上記実施形態の方法。
【0130】
Ｂ１７．ステップ（ｅ）の前かつステップ（ｄ）の後に、プレートを開放構成に切り替え、第１のプレートの内側面を洗浄することをさらに含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0131】
Ｂ１８．第１のプレートの内側面をスポンジに吸収された洗浄液で洗浄する、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0132】
Ｂ１９．スポンジを押しつぶして第１のプレートの内側面上に洗浄液を放出し、スポンジを解放して洗浄液を再吸収させることにより洗浄を行う、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0133】
Ｂ２０．洗浄により、検出可能な信号の検出限界（ＬＯＤ）が改善される、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0134】
関連文書本発明は、様々な実施形態を含み、これらは、様々な構成要素が互いに矛盾しない限り、複数の様式で組み合わせることができる。実施形態は、別個独立としてではなく、単一の発明出願とみなされるべきであり、各出願は、参照として他の出願を有し、また、あらゆる目的のためにその全体が参照される。これらの実施形態は、本出願の開示だけでなく、本明細書において参照され、組み込まれ、または優先権が主張される文書も含む。
【0135】
（１）定義本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法を説明するために使用される用語は、本出願、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に定義されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0136】
「ＣＲＯＦカード（またはカード）」、「ＣＯＦカード」、「ＱＭＡＸカード」、「Ｑカード」、「ＣＲＯＦデバイス」、「ＣＯＦデバイス」、「ＱＭＡＸデバイス」、「ＣＲＯＦプレート」、「ＣＯＦプレート」、および「ＱＭＡＸプレート」は、いくつかの実施形態では、ＣＯＦカードはスペーサーを備えていないことを除いて、互換性があり、これらの用語は、異なる構成（開放構成および閉鎖構成を含む）になるように互いに対して移動可能である第１のプレートおよび第２のプレートを備え、プレート間の間隔を調節するスペーサーを備える（ＣＯＦカードのいくつかの実施形態を除く）、デバイスを指す。「Ｘプレート」という用語は、ＣＲＯＦカードの２つのプレートのうちの１つを指し、スペーサーはこのプレートに固定されている。ＣＯＦカード、ＣＲＯＦカード、およびＸプレートのより詳細は、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号に提供され、これはあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【0137】
（２）Ｑカード、スペーサー、および均一な試料の厚さ本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカード、スペーサー、および均一な試料の厚さの実施形態を含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、試料の少なくとも一部を均一性の高い層にするのに役立つスペーサーを備える。スペーサーの構造、材料、機能、バリエーション、および寸法、ならびにスペーサーおよび試料層の均一性は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0138】
（３）ヒンジ、オープニング用ノッチ、凹型エッジ、およびスライダー本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、Ｑカードの操作および試料の測定を容易にするのに役立つヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダー（ｓｌｉｄｅｒ）を備える。ヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーの構造、材料、機能、バリエーション、寸法は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0139】
（４）Ｑカード、スライダー、およびスマートフォン検出システム本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、カードがスマートフォン検出システムによって読み取られることを可能にするスライダーとともに使用される。Ｑカード、スライダー、およびスマートフォン検出システムの構造、材料、機能、バリエーション、寸法、および接続は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0140】
（５）検出方法本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々なタイプの検出方法を含むか、または使用することができる。検出方法は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0141】
（６）標識本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、分析物検出に使用される様々なタイプの標識を使用することができる。標識は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0142】
（７）分析物本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な種類の分析物（バイオマーカーを含む）の操作および検出に適用することができる。分析物は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0143】
（８）用途（分野および試料）本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な用途（分野および試料）に使用することができる。用途は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0144】
（９）クラウド本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、データ転送、ストレージ、および／または分析のためのクラウド技術を使用することができる。関連するクラウド技術は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４２６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0145】
柱状スペーサーの平らな上部本発明の特定の実施形態では、スペーサーは、１つのプレート上に固定された平らな上部および足部を有する柱であり、平らな上部は、微小な表面変動を伴う平滑性（ｓｍｏｏｔｈｎｅｓｓ）を有し、変動は５未満、１０ｎｍ未満、２０ｎｍ未満、３０ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、１０００ｎｍ未満、またはいずれかの２つの値の間の範囲である。好ましい平らな柱上部の滑らかさは、５０ｎｍ以下の表面変動である。
【0146】
さらに、表面の変動はスペーサーの高さに対して相対的であり、スペーサーの高さに対する柱の平らな上面の変動の比は、０．５％未満、１％未満、３％未満、５％未満、７％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、またはいずれかの２つの値の間の範囲である。好ましい平らな柱上部の平滑性は、２％未満、５％未満、または１０％未満であるスペーサー高さに対する柱の平らな上部の表面変動の比を有する。
【0147】
柱状スペーサーの側壁角本発明の特定の実施形態では、スペーサーは側壁角を有する柱である。いくつかの実施形態では、側壁角は、５度未満（表面の垂直線から測定される）、１０度未満、２０度未満、３０度未満、４０度未満、５０度未満、７０度未満、またはいずれかの２つの値の間の範囲内である。好ましい実施形態では、側壁角は、５度未満、１０度未満、または２０度未満である。
【0148】
厳密でない力の押圧による均一な流体（ｆｌｕｉｄｉｃ）薄層の形成本発明の特定の実施形態では、厳密でない力による押圧を使用することにより、均一な流体試料薄層が形成される。詳細を加えることなく、次いで、厳密でない押圧力の定義を加える、「厳密でない押圧力」という用語。本明細書で使用される場合、力との関連における「厳密でない」という用語（例えば「厳密でない押圧力」）は、（ａ）力が加えられた時点において正確には分かっていないか、または正確に予測できない大きさを有し、（ｂ）０．０１ｋｇ／ｃｍ２（センチメートル平方）〜１００ｋｇ／ｃｍ２の範囲の圧力を有し、（ｃ）力が加えられるごとに大きさが変動し、および（ｄ）（ａ）および（ｃ）の力の非厳密さ（すなわち変動）が、実際に加えられる力の合計の少なくとも２０％である、力を指す。
【0149】
厳密でない力は、例えば、親指と人差し指との間で物体をつまんだり、または親指と人差し指との間で物体をつまんで擦ったりすることにより、ヒトの手で加えることができる。
【0150】
いくつかの実施形態では、手で押圧することによる厳密でない力は、０．０１ｋｇ／ｃｍ２、０．１ｋｇ／ｃｍ２、０．５ｋｇ／ｃｍ２、１ｋｇ／ｃｍ２、２ｋｇ／ｃｍ２、ｋｇ／ｃｍ２、５ｋｇ／ｃｍ２、１０ｋｇ／ｃｍ２、２０ｋｇ／ｃｍ２、３０ｋｇ／ｃｍ２、４０ｋｇ／ｃｍ２、５０ｋｇ／ｃｍ２、６０ｋｇ／ｃｍ２、１００ｋｇ／ｃｍ２、１５０ｋｇ／ｃｍ２、２００ｋｇ／ｃｍ２、またはいずれかの２つの値の間の範囲の圧力、および０．１ｋｇ／ｃｍ２〜０．５ｋｇ／ｃｍ２、０．５ｋｇ／ｃｍ２〜１ｋｇ／ｃｍ２、１ｋｇ／ｃｍ２〜５ｋｇ／ｃｍ２、５ｋｇ／ｃｍ２〜１０ｋｇ／ｃｍ２の好ましい範囲（圧力）を有する。
【0151】
スペーサー充填率「スペーサー充填率」または「充填率」という用語は、総プレート面積に対するスペーサー接触面積の比を指し、ここで、スペーサー接触面積は、閉鎖構成においてスペーサーの上面がプレートの内側面と接触する接触面積を指し、総プレート面積は、スペーサーの平らな上部が接触するプレートの内側面の総面積を指す。２つのプレートがあり、各スペーサーは１つのプレートにそれぞれ接触する２つの接触面を有するので、充填率は最小の充填率である。
【0152】
例えば、スペーサーが、正方形（１０μｍ×１０μｍ）の平らな上部、ほぼ均一な断面、２μｍの高さを有する柱であり、スペーサーが、１００μｍの周期で周期的になっている場合、スペーサーの充填率は１％である。上記の例において、柱状スペーサーの足部が１５μｍ×１５μｍの正方形である場合、充填率は定義により１％のままである。
【0153】
スペーサーが柱形状およびほぼ均一な断面を有する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0154】
スペーサー間距離（ＳＤ）が約１２０ｕｍ（マイクロメートル）以下である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0155】
スペーサー間距離（ＳＤ）が約１００ｕｍ（マイクロメートル）以下である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0156】
スペーサー間距離（ＩＳＤ）の４乗を可撓性プレートの厚さ（ｈ）およびヤング率（Ｅ）で除算したもの（ＩＳＤ４／（ｈＥ））が５×１０６ｕｍ３／ＧＰａ以下である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0157】
スペーサー間距離（ＩＳＤ）の４乗を可撓性プレートの厚さ（ｈ）およびヤング率（Ｅ）で除算したもの（ＩＳＤ４／（ｈＥ））が５×１０５ｕｍ３／ＧＰａ以下である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0158】
スペーサーが、柱形状、実質的に平らな上面、所定の実質的に均一な高さ、および分析物のサイズより少なくとも約２倍大きい所定の一定のスペーサー間距離を有し、スペーサーのヤング率にスペーサーの充填率を掛けたものが２ＭＰａ以上であり、充填率が総プレート面積に対するスペーサー接触面積の比であり、各スペーサーにおいて、スペーサーの高さに対するスペーサーの横寸法の比が少なくとも１である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0159】
スペーサーが、柱形状、実質的に平らな上面、所定の実質的に均一な高さ、および分析物のサイズより少なくとも約２倍大きい所定の一定のスペーサー間距離を有し、スペーサーのヤング率にスペーサーの充填率を掛けたものが２ＭＰａ以上であり、充填率がスペーサーの接触面積と総プレート面積との比であり、各スペーサーにおいて、スペーサーの高さに対するスペーサーの横寸法の比が少なくとも１であり、スペーサー間距離（ＩＳＤ）の４乗を可撓性プレートの厚さ（ｈ）およびヤング率（Ｅ）で除算したもの（ＩＳＤ４／（ｈＥ））が５×１０６ｕｍ３／ＧＰａ以下である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0160】
スペーサーの平均幅に対するスペーサーのスペーサー間距離の比が２以上であり、スペーサーの充填率にスペーサーのヤング率を乗じたものが２ＭＰａ以上である、上記デバイス実施形態のいずれかのデバイス。
【0161】
分析物が、タンパク質、ペプチド、核酸、合成化合物、または無機化合物である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0162】
試料が、羊水、房水、硝子体液、血液（例えば、全血、分画血液、血漿、血清）、母乳、脳脊髄液（ＣＳＦ）、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳糜、糜粥、内リンパ液、外リンパ液、糞便、呼気、胃酸、胃液、リンパ液、粘液（鼻水および痰を含む）、心膜液、腹膜液、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、呼気凝縮液、皮脂、精液、喀痰、汗、滑液、涙、嘔吐物、および尿から選択される生体試料である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0163】
スペーサーが柱形状を有し、柱の高さに対する幅の比が１以上である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0164】
プレートの一方または両方の上に置かれる試料が未知の体積を有する、先行する実施形態のいずれかの方法。
【0165】
スペーサーが柱形状を有し、柱が実質的に均一な断面を有する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0166】
試料が、特定の疾患の段階と相関する化合物または生体分子の検出、精製、および定量化のためである、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0167】
試料が、感染症および寄生虫病、傷害、心血管疾患、癌、精神障害、神経精神障害、肺疾患、腎疾患、ならびに他の臓器疾患に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0168】
試料が、微生物の検出、精製、および定量化に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0169】
試料が、環境、例えば水、土壌に由来するウイルス、真菌、および細菌、または生体試料に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0170】
試料が、食品の安全性または国の安全に危険を及ぼす化合物または生体試料、例えば有毒廃棄物、炭疽菌の検出、定量化に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0171】
試料が、医療用または生理学的モニタリングの重要なパラメーターの定量化に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0172】
試料が、グルコース、血液、酸素レベル、総血球数に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0173】
試料が、生体試料由来の特定のＤＮＡまたはＲＮＡの検出および定量化に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0174】
試料が、ゲノム分析のための染色体およびミトコンドリアのＤＮＡ遺伝子配列の配列決定および比較に関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0175】
試料が、例えば医薬品の合成中または精製中に反応生成物を検出することに関連する、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0176】
試料が、細胞、組織、体液、および排泄物である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0177】
試料が、ヒト、獣医学、農業、食品、環境、および薬物検査の分野の試料である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0178】
試料が、毛髪、指の爪、耳垢、呼気、結合組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織、軟骨、癌試料、または骨から選択される生体試料である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0179】
スペーサー間距離が５ｕｍ〜１２０ｕｍの範囲である、先行する実施形態のいずれかの方法またはデバイス。
【0180】
スペーサー間距離が１２０ｕｍ〜２０ｕｍの範囲である、先行する実施形態のいずれかのデバイスまたは方法。
【0181】
可撓性プレートが２０ｕｍ〜２５０ｕｍの範囲の厚さおよび０．１〜５ＧＰａの範囲のヤング率を有する、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0182】
可撓性プレートについて、可撓性プレートの厚さに可撓性プレートのヤング率を掛けたものが６０〜７５０ＧＰａ−ｕｍの範囲である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0183】
均一な厚さの試料の層が、少なくとも１ｍｍ２の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0184】
均一な厚さの試料の層が、少なくとも３ｍｍ２の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0185】
均一な厚さの試料の層が、少なくとも５ｍｍ２の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0186】
均一な厚さの試料の層が、少なくとも１０ｍｍ２の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0187】
均一な厚さの試料の層が、少なくとも２０ｍｍ２の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0188】
均一な厚さの試料の層が、２０ｍｍ２〜１００ｍｍ２の範囲の横方向面積にわたって均一である、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0189】
均一な厚さの試料の層が、最大±５％の厚さまたはそれより良好な均一な厚さを有する、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0190】
均一な厚さの試料の層が、最大±１０％の厚さまたはそれより良好な均一な厚さを有する、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0191】
均一な厚さの試料の層が、最大±２０％の厚さまたはそれより良好な均一な厚さを有する、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0192】
均一な厚さの試料の層が、最大±３０％の厚さまたはそれより良好な均一な厚さを有する、上記デバイス実施形態のデバイス。
【0193】
追加の留意事項本開示による本発明対象のさらなる例は、以下の列挙された段落に記載されている。
【0194】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、「単一」という語が使用される場合などの文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、「分析物」についての言及は、単一の分析物および複数の分析物を含み、「捕捉剤」についての言及は、単一の捕捉剤および複数の捕捉剤を含み、「検出剤」についての言及は、単一の検出剤および複数の検出剤を含み、「剤」についての言及には、単一の剤および複数の剤が含まれる。
【0195】
本明細書で使用される場合、「適合させる」および「構成される」という用語は、要素、構成要素、または他の対象物が所与の機能を果たすように設計および／または意図されることを意味する。したがって、「適合される」および「構成される」という用語の使用は、特定の要素、構成要素、または他の対象物が特定の機能を単に果たす「ことができる」ことを意味すると解釈されるべきではない。同様に、特定の機能を果たすように構成されるとして記載されている対象物は、さらにまたはあるいは、その機能を果たすように作動するものとして説明され得る。
【0196】
本明細書で使用される場合、「例えば」という句、「例として」という句、および／または「例」もしくは「例示的な」という用語は、本開示による１つ以上の構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法に関して使用される場合、記載された構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法が、本開示による構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法の例示的で非排他的な例であることを伝えることを意図している。したがって、記載される構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法は、限定されること、必須とされること、または排他的／網羅的であることを意図しておらず、構造的および／もしくは機能的に類似するならびに／または同等である構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法を含む他の構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法もまた、本開示の範囲内である。
【0197】
本明細書で使用される場合、２つ以上の実体（ｅｎｔｉｔｙ）の列挙に関して「のうちの少なくとも１つ」および「１つ以上」という句は、実体の列挙中における実体のうちの任意の１つ以上を意味し、実体のリストに具体的に列挙されているあらゆる実体のうちの少なくとも１つに限定されない。例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（もしくは、同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡおよびＢの組み合わせであってもよい。
【0198】
本明細書で使用される場合、第１の実体と第２の実体との間に置かれる「および／または」という用語は、（１）第１の実体、（２）第２の実体、および（３）第１の実体および第２の実体のうちの１つを意味する。「および／または」を用いて列挙された複数の実体は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された実体のうちの「１つ以上」と解釈すべきである。「および／または」の句によって具体的に特定された実体以外に、具体的に特定されたそれらの実体に関連するかどうかに関わらず、他の実体が任意選択で存在してもよい。
【0199】
数値範囲が本明細書で言及される場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、および一方の端点が含まれ、かつ他方が除外される実施形態を含む。別段の指示がない限り、両方の端点が含まれると見なすべきである。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り。
【0200】
任意の特許、特許出願、または他の参考文献が参照により本明細書に組み込まれ、（１）本開示の組み込まれない部分または他の組み込まれた参考文献のいずれかに矛盾する様式で用語を定義する場合において、および／または（２）その他の点でそれらと矛盾する場合において、本開示の組み込まれていない部分が支配するものとし、その中の用語または組み込まれた開示は、用語が定義されている、および／または組み込まれた開示が元々存在していた参考文献に関してのみ支配するものとする。
【0201】
例示的な実施形態の詳細な説明以下の詳細な説明は、限定ではなく例示として本発明のいくつかの実施形態を示す。本明細書で使用される節の見出しおよび任意のサブタイトルは、構成目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するものとして決して解釈するべきではない。節の見出しおよび／またはサブタイトル下の内容は、節の見出しおよび／またはサブタイトルに限定されず、本発明の説明全体に適用される。
【0202】
任意の公開物の引用は出願日前のその開示に対してのものであり、本特許請求の範囲が先行発明のためにそのような公開物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される公開日は実際の公開日とは異なり得、これを個別に確認する必要があり得る。
【0203】
「ＣＲＯＦカード（またはカード）」、「ＣＯＦカード」、「ＱＭＡＸカード」、「Ｑカード」、「ＣＲＯＦデバイス」、「ＣＯＦデバイス」、「ＱＭＡＸデバイス」、「ＣＲＯＦプレート」、「ＣＯＦプレート」、および「ＱＭＡＸプレート」は、いくつかの実施形態では、ＣＯＦカードはスペーサーを備えていないことを除いて、互換性があり、これらの用語は、異なる構成（開放構成および閉鎖構成を含む）になるように互いに対して移動可能である第１のプレートおよび第２のプレートを備え、かつ、プレート間の間隔を調節するスペーサーを備える（ＣＯＦのいくつかの実施形態を除く）、デバイスを指す。「Ｘプレート」という用語は、ＣＲＯＦカードの２つのプレートのうちの１つを指し、スペーサーはこのプレートに固定されている。ＣＯＦカード、ＣＲＯＦカード、およびＸプレートのより詳細は、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、および２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に記載されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0204】
配列決定のための核酸を捕捉するためのＱＭＡＸデバイス図１は、配列決定のための核酸を捕捉するために使用することができるＱＭＡＸ（Ｑ：定量化、Ｍ：増大、Ａ：試薬の添加、Ｘ：加速；圧縮調節オープンフロー（ＣＲＯＦ）としても既知である）デバイスの例示的な実施形態の概略図である。図１において、ＱＭＡＸデバイスは開放構成である。（ａ）ＱＭＡＸは、第１のプレート、第２のプレート、および第２のプレート上のウェルを備える。（ｂ）第１のプレート上のウェルアレイの上面図。（ｃ）第２のプレート上の柱状アレイの上面図。
【0205】
配列決定のための核酸を捕捉するためのＱＭＡＸデバイスであって、第１のプレート、第２のプレート、およびウェルを備え、
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する流体試料と接触するための試料接触領域を有し、
（ｂ）第２のプレートが、試料接触領域において複数のウェルを有し、各ウェルは、（ｉ）５０μｍ以下のウェル深さ、（ｉｉ）試料の体積よりも実質的に小さいウェル体積、（ｉｉｉ）結合部位であって、捕捉プローブがその部位に固定されており、かつ捕捉プローブが標的プローブを捕捉する、結合部位を有し、
構成の１つは、第１のプレートの内側面と第２のプレートのウェルの縁（ｒｉｍ）との間の平均間隔が少なくとも３００μｍであり、試料がプレートの一方または両方の上に置かれる、開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、開放構成において試料が置かれた後の構成である閉鎖構成であり、閉鎖構成では、試料の少なくとも一部がウェル内側にあり、第１のプレートの内側面と第２のプレートのウェルの縁との間の平均間隔が開放構成での平均間隔の１／１０（１０分の１）未満である、ＱＭＡＸデバイス。
【0206】
図３６は、ＱＭＡＸの第１プレート上のウェルの例示的な実施形態の概略図である。（ａ）（ｉ）正方格子での丸形、（ｉｉ）正方格子での長方形、（ｉｉｉ）六角形格子での三角形、（ｉｖ）非周期性での丸形の、第１のプレート上のウェルの上面図。（ｂ）（ｉ）金属コーティングを有さない、（ｉｉ）ウェルの底部に金属コーティングを有する、（ｉｉｉ）ウェルの側壁に金属コーティングを有する、（ｉｖ）ウェルの底部および側壁の両方に金属コーティングを有する、第１のプレート上のウェル配列の上面図。
【0207】
いくつかの実施形態では、第１のプレート上のウェルは、１ｎｍ、１０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍの周期（ウェル中心間の平均距離）またはいずれかの２つの値の間の範囲、および１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０ｕｍ、または１０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲（周期）を有する。
【0208】
いくつかの実施形態では、第１プレート上のウェルは、１ｎｍ、１０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍまたはいずれかの２つの値の間の範囲のウェルサイズ（平均の長さもしくは直径）、および１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０ｕｍ、または１０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲（サイズ）を有する。
【0209】
いくつかの実施形態では、第１のプレート上のウェルは、１ｎｍ、１０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍまたはいずれかの２つの値の間の範囲の深さ、および１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０ｕｍ、または１０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲（深さ）を有する。
【0210】
いくつかの実施形態では、ウェルの深さは０であり、これは第１のプレート上にウェルがないことを意味する。
【0211】
いくつかの実施形態では、ウェルは、代替的には「柱」であり、柱の高さは１ｎｍ、１０ｎｍ、１００ｎｍ、５００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍまたはいずれかの２つの値の間の範囲、および１０ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０ｕｍ、または１０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲（柱の高さ）である。
【0212】
いくつかの実施形態では、ウェルは、（ｉ）金属コーティングを有さない、（ｉｉ）ウェルの底部（柱の上部）に金属コーティングを有する、（ｉｉｉ）ウェルの側壁（柱の側方）に金属コーティングを有する、（ｉｖ）ウェルの底部および側壁の両方に金属コーティングを有する。
【0213】
いくつかの実施形態では、コーティング金属は、金、アルミニウム、銀、銅、スズ、および／またはそれらの組み合わせである。
【0214】
いくつかの実施形態では、ウェル面積比（表面の総面積に対するウェル面積の比）は、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９９％、またはいずれかの２つの値の間の範囲である。
【0215】
いくつかの実施形態では、第１プレート上のウェル数は、試料中の核酸プローブ数より大きい。例えば、第１のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が１μＬの体積で１ｆＭである場合、６００の１〜２倍、２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍、１０００〜１００００倍である。
例えば、第１のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が１ｕＬの体積で１ｐＭである場合、６００，０００の１〜２倍、２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍、１０００〜１００００倍である。
例えば、第１のプレート上の総ウェル数は、核酸プローブ濃度が１ｕＬの体積で１ｎＭである場合、６００，０００，０００の１〜２倍、２〜５倍、５〜１０倍、１０〜１００倍、１００〜１０００倍、１０００〜１００００倍である。
いくつかの実施形態では、ウェル数は、核酸捕捉ステップの後に、ウェルの大部分がただ１つの標的核酸プローブを捕捉することを達成するような様式である。
【0216】
表１は、１ｆＭ〜１００ｐＭの濃度の１ｕＬ試料中のＤＮＡプローブ数の一例を示している。
【0217】
表２は、１ｕｍ〜１ｍｍのウェルピッチを有する２ｃｍ×２ｃｍ面積中のウェル数の一例を示す。
【0218】
例えば、ウェルピッチが１００ｕｍの場合、４ｃｍ２のサイズの第１のプレート上のウェル数は４００００である。このようなウェルプレートを使用して、６００個のＤＮＡプローブを有する１μＬ試料中の１ｆＭ ＤＮＡ試料を測定する場合、統計的に各ウェルの分子はただ１つになるであろう。
【0219】
いくつかの実施形態では、第２のプレートはＸプレートである。
【0220】
いくつかの実施形態では、第１のプレートは、平らなまたは加工された固体表面を有する任意の材料であり得る。第１のプレートの例には、プラスチック、シリコン、ＰＭＭＡ、金、ガラスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２のプレートは、平らなまたは加工された固体表面を有する任意の材料であり得る。第１のプレートの例には、プラスチック、シリコン、ＰＭＭＡ、金、ガラスが含まれるが、これらに限定されない。
【0221】
いくつかの実施形態では、第１のプレートは、炭素、ゲルマニウム、セレン、シリコン、ガリウムヒ素（ＧａＡｓ）、窒化ガリウム（ＧａＮ）、リン化インジウム（ＩｎＰ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）、および炭化ケイ素（ＳｉＣ）を含む半導体；金、アルミニウム、銀、銅、スズおよび／またはそれらの組み合わせを含む金属で作られる。
【0222】
いくつかの実施形態では、第２のプレートに面する第１のプレートの表面は、第１のプレートの内側面として定義され、第１のプレートに面する第２のプレートの表面はまた、第２のプレートの内側面として定義される。いくつかの実施形態では、それぞれのプレートの内側面は、核酸を含む試料と接触するための試料接触領域を含む。試料接触領域は、それぞれの内側面の一部または全体を占めることができる。図３５に示すように、第２のプレートは、第２のプレートの内側面上に固定されたスペーサーを備えることができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、スペーサーは、第１のプレートの内側面上に固定され、他の実施形態では、第２のプレートおよび第１のプレートの両方の内側面上に固定されることに留意すべきである。
【0223】
図３５は、開放構成のプレートの断面図を示し、該構成では、第１のプレートと第２のプレートが部分的または完全に分離され、試料をプレートの一方または両方の上に置くことができる。
【0224】
第１のプレートおよび第２のプレートは、異なる構成になるように互いに対して移動可能である。構成の１つは、２つのプレートが部分的または完全に分離され、プレート間の間隔がスペーサーによって調節されていない、開放構成である。図３５は、試料を第１のプレート、第２のプレート、または両方のプレートに添加することができる、開放構成のプレートを示している。いくつかの実施形態では、それぞれのプレートの内側面は、内側面全体の一部を占める試料接触領域を含む。特定の実施形態では、スペーサーは、試料接触領域内に位置付けられる。いくつかの実施形態では、スペーサーは、プレートのいずれかに固定されてはなく、試料中に混合されている。
【0225】
配列決定のための核酸を捕捉するためのＱＭＡＸデバイスを使用する方法図３７は、ＱＭＡＸデバイスを使用した、核酸配列決定における核酸プローブ捕捉ステップを実施するための例示的プロセスの基本的ステップを示すフローチャートである。
【0226】
配列決定のための核酸プローブを捕捉する方法であって、（ａ）捕捉プローブをコーティングすることにより、第１のプレートを調製することと、
（ｂ）請求項１に記載のデバイスを取得することと、
（ｃ）標的核酸を含有する試料を取得することと、
（ｄ）プレートが開放構成で構成されているときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くことであって、第１のプレートの内側面と第２のプレートのウェルの縁との間の平均間隔は少なくとも３００ｕｍである、置くことと、
（ｅ）（ｄ）の後、請求項１に記載のデバイスの２つのプレートを閉鎖構成へと移動させることであって、試料の少なくとも一部がウェル内部にあり、第１のプレートの内側面と第２のプレートのウェルの縁との間の平均間隔が開放構成における平均間隔の１／１０（１０分の１）未満である、移動させることと、
（ｆ）第２のプレートを剥がし、第１のプレートを洗浄することと、
（ｇ）その後、核酸配列決定ステップを行うこと、を含む、方法。
【0227】
本明細書で使用される場合、「核酸」および「ヌクレオチド」という用語は、当該技術分野におけるそれらの使用と合致し、天然に存在する種またはその機能的類似体を含むことを意図している。核酸の特に有用な機能的類似体は、配列特異的な様式で核酸にハイブリダイズすることができ、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然に存在する核酸は、一般に、ホスホジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体の構造は、当該技術分野で既知である様々なもののいずれかを含む、代替の骨格結合を有することができる。天然に存在する核酸は、一般に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出される）またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見出される）を有する。核酸は、当該技術分野で既知であるこれらの糖部分の様々な類似体のいずれかを有するヌクレオチドを含有することができる。核酸は、天然または非天然ヌクレオチドを含むことができる。これに関して、天然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、またはグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有することができる。核酸またはヌクレオチドに含まれ得る有用な非天然の塩基は、当該技術分野で既知である。「プローブ」または「標的」という用語は、核酸に関して使用される場合、本明細書に記載の方法または組成物との関連における核酸の意味論的識別子として意図され、別段で明示的に指示されているものを超えて核酸の構造または機能を必ずしも制限するものではない。「プローブ」および「標的」という用語は、タンパク質、小分子、細胞などの他の分析物にも同様に適用することができる。
【0228】
本明細書で使用される場合、「捕捉プローブ」という用語は、相補的配列を有する核酸にハイブリダイズする核酸を指す。
【0229】
本明細書で使用される「相補的」という用語は、目的の標的核酸への水素結合によって塩基対合するヌクレオチド配列を指す。標準的なワトソン−クリック塩基対合では、ＤＮＡ中でアデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と塩基対を形成し、同様にグアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンはウラシル（Ｕ）に置き換えられる。したがって、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。典型的には、「相補的」とは、配列中の全てのヌクレオチドが、対応する位置における標的核酸中の全てのヌクレオチドと相補的であるように、目的の標的に完全に相補的なヌクレオチド配列を指す。ヌクレオチド配列が非標的配列に完全に相補的（１００％相補的）ではないが、非標的配列に対するヌクレオチド配列の特定のストレッチの相補性に起因して非標的配列になおも塩基対合することができる場合、相補性パーセントを計算して、非特異的（オフ標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ））結合の可能性を評価することができる。一般に、５０％以下の相補性は、非特異的結合を生じさせる。さらに、７０％以下の相補性は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非特異的結合を生じさせない場合がある。
【0230】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第１のプレートの表面に付着される。特定の実施形態では、捕捉プローブは、第１のプレートの内側面上に固定することができる。
【0231】
本明細書で使用される場合、「コーティングする」という用語は、動詞として使用される場合には、表面上に層を提供するまたは被覆することを意味することを意図している。表面の少なくとも一部に層または被覆を提供することができる。いくつかの場合では、表面全体に層または被覆を提供することができる。代替の場合では、表面の一部のみに層または被覆を提供することができるであろう。「コーティングする」という用語は、表面と材料との関係を説明するために使用される場合には、材料が表面上に層または被覆として存在することを意味することを意図している。材料は表面をシールすることができ、例えば、液体または気体が表面と接触するのを防ぐ。しかし、材料はシールを形成する必要はない。例えば、材料は、液体、気体、または液体もしくは気体で運ばれる１つ以上の成分に対して多孔性であり得る。表面をコーティングすることができる例示的な材料には、ゲル、ポリマー、有機ポリマー、液体、金属、第２の表面、プラスチック、シリカ、または気体が含まれるが、これらに限定されない。
【0232】
本明細書で使用される場合、「付着される」という用語は、互いに接合、固定、接着、接続、または結合されている２つの物の状態を指す。例えば、核酸などの分析物を、共有結合または非共有結合によって、ゲルまたは固体支持体などの材料に付着させることができる。共有結合は、原子間での電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を伴わない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用、および疎水性相互作用を含むことができる。
【0233】
いくつかの実施形態では、第１のプレートに付着されたプライマー核酸は、鋳型核酸の捕捉および／または増幅に使用することができる。プライマーは、ライブラリー中の異なる標的核酸に結合されたユニバーサルアダプター配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマーであり得る（つまり、各標的核酸はライブラリー中の他の標的核酸と異なる標的領域を含み、ライブラリー中のいくつかの標的核酸は同じユニバーサルアダプター配列を有する）。いくつかの実施形態では、標的核酸をゲル材料に付着させることができ、プライマー（溶液中であるかまたはゲルにも付着させるかに関わらない）を使用して、付着した標的核酸を増幅することができる（すなわち、標的核酸は増幅の鋳型として作用することができる）。
【0234】
より詳細には、ステップ（ａ）において、いくつかの実施形態では、第１のプレートは、第１のプレートの内側面上に完全にまたは部分的にコーティングされた捕捉プローブを含む。
【0235】
いくつかの実施形態では、第１のプレートは、第１のプレート上のウェル内部に完全にまたは部分的にコーティングされた捕捉プローブを含む。
【0236】
いくつかの実施形態では、第１のプレートは、第１のプレート上のウェル内部の金属上に完全にまたは部分的にコーティングされた捕捉プローブを含む。
【0237】
いくつかの実施形態において、捕捉プローブは、印刷、噴霧、浸漬、または捕捉プローブの均一層を適用する他の方法により、表面に適用することができる。特定の実施形態では、捕捉プローブは、第１プレート上で乾燥される。
【0238】
より詳細には、本明細書で使用されるステップ（ｃ）において、「ライブラリー」という用語は、異なる化学組成を有する分析物の集合を指す。典型的には、ライブラリー中の分析物は、属またはクラスの共通の特徴または特性を有する異なる種であるが、それ以外の点では何らかの形で異なる。例えば、ライブラリーは、ヌクレオチド配列は異なるが、糖リン酸骨格を有することに関して類似している核酸種を含むことができる。
【0239】
本明細書で使用する「異なる」という用語は、核酸に関して使用する場合、核酸が互いに同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の核酸は、それらの全長にわたって異なるヌクレオチド配列を有することができる。あるいは、２つ以上の核酸は、それらの長さの実質的な部分にわたって異なるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、２つ以上の核酸は、２つ以上の分子のための異なる標的ヌクレオチド配列部分を有することができると同時に、２つ以上の分子で同じユニバーサル配列部分も有することができる。
【0240】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ステップ（ｆ）の前かつステップ（ｅ）の後に、均一な厚さの層を所定の期間インキュベートすることをさらに含む。
【0241】
特定の実施形態では、所定の期間は、標的核酸が均一な厚さの層を横切って試料中に拡散するのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い。
【0242】
特定の実施形態では、所定の期間は、標的核酸が均一な厚さの層を横切って試料中に拡散し、捕捉プローブにより捕捉されるのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い。
【0243】
特定の実施形態では、所定の期間は、標的核酸が均一な厚さの層を横切って試料中に拡散し、捕捉プローブにより捕捉され、増幅されて、各々のウェル中の個々の核酸のクローン集団を生成するのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い。
【0244】
本明細書で使用される「クローン集団」という用語は、特定のヌクレオチド配列に関して均一な核酸の集団を指す。均一な配列は、典型的には少なくとも１０ヌクレオチド長であるが、さらに長くすることができ、例えば、少なくとも５０、１００、２５０、５００、１０００、または２５００ヌクレオチド長を含む。クローン集団は、単一の標的核酸または鋳型核酸に由来し得る。クローン集団は、標的ヌクレオチド配列の少なくとも２、５、１０、１００、１０００またはそれ以上のコピーを含むことができる。コピーは、例えばコンカテマーとして、単一の核酸分子中に存在することができ、またはコピーは、別個の核酸分子中に存在することができる（すなわち、クローン集団は、少なくとも２、５、１０、１００、１０００またはそれ以上の、同じ標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を含むことができる）。典型的には、クローン集団中の全ての核酸は同じヌクレオチド配列を有するであろう。クローン集団では、クローン性（ｃｌｏｎａｌｉｔｙ）から逸脱することなく、ごくわずかな数の汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔ）核酸または変異（例えば、増幅アーチファクトに起因する）が発生し得ることが理解されるであろう。したがって、集団は少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％のクローンであり得る。いくつかの場合では、１００％純粋なクローン集団が存在し得る。
【0245】
本明細書に記載の方法は、様々な増幅技術のいずれかを使用することができる。使用することができる例示的な技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、増幅に使用される１つ以上のプライマーをゲル材料に付着させることができる。ＰＣＲの実施形態では、増幅に使用されるプライマーの一方または両方をゲル材料に付着させることができる。二本鎖アンプリコンが、コピーされた鋳型配列に隣接する（ｆｌａｎｋ）２つの付着されたプライマー間に橋のような構造を形成するため、２種の付着されたプライマーを利用する形式はしばしばブリッジ増幅と称される。ブリッジ増幅に使用することができる例示的な試薬および条件は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許公開第２００４／００９６８５３号、米国特許公開第２００４／０００２０９０号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号、および米国特許公開第２００８／０００９４２０号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＲ増幅はまた、ゲル材料に付着された増幅プライマーの１つおよび溶液中の第２のプライマーを使用して行うこともできる。１つの固相付着プライマーおよび液相プライマーの組み合わせを使用する例示的な形式は、例えば、Ｄｒｅｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：８８１７−８８２２（２００３）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許公開第２００５／０１３０１７３号もしくは同２００５／００６４４６０号に記載されるようなエマルジョンＰＣＲであり、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。エマルジョンＰＣＲは形式の例示であり、本明細書に記載の方法の目的のためには、エマルジョンの使用は任意選択であり、実際、いくつかの実施形態ではエマルジョンは使用されないことが理解されよう。さらに、プライマーは、ｅＰＣＲの参考文献に記載されているように固体支持体に直接付着させる必要はなく、代わりに、本明細書に記載のゲル材料に付着させることができる。一部の固相ＰＣＲまたはブリッジ増幅形式では、標的核酸をゲル材料に付着させ、増幅鋳型として使用することができる。
【0246】
ＲＣＡ技術は、本開示の方法で使用するために改変することができる。ＲＣＡ反応で使用することができる例示的な成分およびＲＣＡがアンプリコンを生成する原理は、例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００７／００９９２０８Ａ１号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＲＣＡに使用されるプライマーは、溶液中にあるか、ゲル材料に付着され得る。
【0247】
本開示の方法における使用のために、ＭＤＡ技術を改変することができる。ＭＤＡのいくつかの基本的原理および有用な条件は、例えば、Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１−６６（２００２）、Ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４−３０７（２００３）、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．，１９９５、Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６（１９９２）、米国特許第５，４５５，１６６号、同５，１３０，２３８号、および同６，２１４，５８７号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。ＭＤＡに使用されるプライマーは、溶液中にあるか、ゲル材料に付着され得る。
【0248】
特定の実施形態では、上記で例示した増幅技術の組み合わせを使用することができる。例えば、ＲＣＡおよびＭＤＡを組み合わせて使用することができ、ここでは、ＲＣＡを溶液中のコンカテマーアンプリコンを生成するために使用する（例えば、液相プライマーを使用する）。アンプリコンは、ゲル材料に付着されたプライマーを使用したＭＤＡの鋳型として使用することができる。この例では、ＲＣＡおよびＭＤＡを組み合わせたステップ後に生成されたアンプリコンがゲル材料に付着されるであろう。アンプリコンは、一般に、標的ヌクレオチド配列のコンカテマーリピートを含有する。
【0249】
上記に例示したものなどの増幅技術を使用して、標的核酸の複数コピーを有するゲル含有特徴を生み出すことができる。ウェルなどの個々の特徴物は、ＲＣＡによって生成されるものなどの単一分子のコンカテマーの形で、またはブリッジＰＣＲによって生成されるものなどの同じ配列を有する多数の核酸分子の形で、ヌクレオチド配列のクローン集団を有することができる。一般に、増幅された標的の数コピーを有する核酸がゲル材料に付着されるであろう。
【0250】
特定の実施形態では、所定の期間は、１０秒未満、２０秒未満、３０秒未満、４５秒未満、１分未満、１．５分未満、２分未満、３分未満、４分未満、５分未満、６分未満、７分未満、８分未満、９分未満、１０分未満、１５分未満、２０分未満、３０分未満、６０分未満、またはいずれかの２つの値の間の範囲内である。
【0251】
いくつかの実施形態では、本発明の方法のために、試料は第１のプレート上に置かれる。特定の実施形態では、ステップ（ｅ）の前、ステップ（ｄ）の後に、試料は、第１のプレート上で所定の期間インキュベートされる。特定の実施形態では、所定の期間は、捕捉抗体と分析物との間の結合が平衡に達するのに必要な時間と等しいかまたはそれより長い。特定の実施形態では、所定の期間は、１０秒未満、２０秒未満、３０秒未満、４５秒未満、１分未満、１．５分未満、２分未満、３分未満、４分未満、５分未満、６分未満、７分未満、８分未満、９分未満、１０分未満、１５分未満、２０分未満、３０分未満、６０分未満、またはいずれかの２つの値の間の範囲内である。
【0252】
いくつかの実施形態では、本発明の方法のために、ステップ（ｅ）の後、第１のプレートの内側面を洗浄して結合していない分子を除去することができる。このアプローチでは、プレートを閉鎖構成に切り替える前に洗浄が行われる。いくつかの実施形態では、本発明の方法のために、ステップ（ｅ）の前かつステップ（ｄ）の後、ステップ（ｆ）の前かつステップ（ｅ）の後、プレートを開放構成に切り替えることができ（例えば、第２のプレートを取り除くことによる）、第１のプレートの内側面を洗浄することができる。このアプローチでは、プレートを閉鎖構成に切り替える前に洗浄が行われる。特定の実施形態では、そのようなステップは、非特異的結合を低減し、信号ノイズを低減する。特定の実施形態では、洗浄ステップの各々は、１回のみまたは複数の洗浄を含む。いくつかの実施形態では、両方の洗浄ステップが行われる。いくつかの実施形態では、洗浄ステップのうちの１回のみが行われる。
【0253】
いくつかの実施形態では、スポンジに吸収された洗浄溶液で内側面を洗浄することができる。いくつかの実施形態では、洗浄は、スポンジを押しつぶして第１のプレートの内側面上に洗浄液を放出し、スポンジを解放して洗浄液を再吸収させることにより行われる。いくつかの実施形態では、洗浄により、検出可能な信号の検出限界（ＬＯＤ）が改善される。
【0254】
ステップ（ｆ）に続いて、第１のプレート上で捕捉された核酸は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＢＳ）技術などの配列決定手順を含む、多くの生物学的用途で使用することができる。簡単に述べると、ＳＢＳは、標的核酸を１つ以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどと接触させることにより開始することができる。標的核酸を鋳型として使用してプライマーを伸長するそれらの特徴により、検出が可能な標識されたヌクレオチドが組み込まれる。任意選択で、標識されたヌクレオチドは、ヌクレオチドをプライマーに加えるとさらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに加えて、脱ブロッキング剤が送達されて上記部分が除去されるまでその後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態では、（検出する前または後に）脱ブロッキング試薬をフローセルに送達することができる。様々な送達ステップの間に洗浄を行うことができる。次いで、サイクルをｎ回繰り返して、プライマーをｎヌクレオチド伸長し、それにより長さｎの配列を検出する。本開示の方法によって生成されるアレイでの使用に容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３−５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７，０５７，０２６号、同７，３２９，４９２号、同７，２１１，４１４号、同７，３１５，０１９号、または同７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【0255】
パイロシーケンシングなどのサイクリック反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれるときの無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ｒｏｎａｇｈｉ， ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１），８４−９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．１１（１），３−１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５），３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、同６，２５８，５６８号、および同６，２７４，３２０号、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシーケンシングでは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することにより、放出されたＰＰｉを検出でき、結果として生じたＡＴＰをルシフェラーゼが生成した光子により検出することができる。したがって、配列決定反応は、ルミネセンス検出システムによりモニタリングすることができる。蛍光ベースの検出システムに使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手順には必要ない。本開示のアレイへのパイロシーケンシングの適用に使用することができる有用な流体システム、検出器、および手順は、例えば、ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８Ａ１号、米国特許第７，５９５，８８３号、および米国特許第第７，２４４，５５９号に記載され、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【0256】
例えば、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１７２８−１７３２（２００５）、米国特許第５，５９９，６７５号、および米国特許第５，７５０，３４１号（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものを含む、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ反応も有用である。いくつかの実施形態は、例えば、Ｂａｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３５（３），３０３−７（１９８８）、Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，５４−５８（１９９８）、Ｆｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１（４９９５），７６７−７７３（１９９５）、およびＷＯ１９８９／１０９７７に記載されるような、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ手順を含むことができ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。Sｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ手順およびｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ手順の両方において、ゲルを含有するウェル（または他の凹形の特徴物）に存在する核酸は、オリゴヌクレオチドの送達および検出の繰り返しサイクルに供される。本明細書または本明細書で引用される参考文献に記載されるＳＢＳ法のための流体システムは、ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ手順またはｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ手順での試薬の送達のために容易に適合させることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識され、本明細書または本明細書で引用される参考文献におけるＳＢＳ手順に関して記載されているものと同様の蛍光検出器を使用して検出することができる。
【0257】
いくつかの実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの組み込みは、フルオロフォアを保有するポリメラーゼとγ−リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用により、またはゼロモード導波路（ｚｅｒｏｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ）を用いて検出することができる。ＦＲＥＴに基づく配列決定の手法および試薬は、例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，６８２−６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６−１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５，１１７６−１１８１（２００８）に記載され、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0258】
いくつかのＳＢＳの実施形態は、ヌクレオチドが伸長生成物に取り込まれるときに放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定は、電気的検出器およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（コネチカット州ギルフォード、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている関連技術、または米国特許公開第２００９／００２６０８２Ａ１号、同２００９／０１２７５８９Ａ１号、同２０１０／０１３７１４３Ａ１号、もしくは同２０１０／０２８２６１７Ａ１号に記載される配列決定方法およびシステムを使用することができ、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、放出されたプロトンを検出するために使用される電気的検出器は、ウェルを含むように改変することができ、ウェルは、本明細書に記載のゲル材料を含有することができる。
【0259】
ＱＭＡＸのいくつかの実施形態では、プレートの一方または両方の試料接触領域は、ＣＯＦ後にどれだけのフローが発生したかをモニタリングするように構成された圧縮オープンフローモニタリング表面構造（ＭＳＳ）を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＳＳは、試料中の成分（例えば、血液中の血球）に摩擦を引き起こす浅い正方形のアレイを含む。試料のいくつかの成分の分布を確認することにより、ＣＯＦ下での試料およびその成分のフローに関連する情報を取得することができる。
【0260】
ＭＳＳの深さは、スペーサーの高さの１／１０００、１／１００、１／１００、１／５、１／２またはいずれかの２つの値の範囲であり、突起またはウェル形態のいずれかであり得る。
【0261】
本発明の例図３８は、核酸配列決定のための第１のプレートの調製ステップの例を示している。
【0262】
この例における第１のプレートは、厚さ１ｍｍのアクリル基板上に製造された３ｕｍ×３ｕｍのサイズ、５ｕｍの周期、１ｕｍの深さを有する正方形のウェルである。各ウェルの底には、１００ｎｍの金および１ｎｍのチタンが置かれている。このデバイスでは、１ｍｍ２面積の第１のプレートは各々、４０，０００個のウェルを有する。ナノインプリントリソグラフィ、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）、電子ビーム蒸着などを含む大面積ナノ加工法によるこのナノ構造の製造。
【0263】
室温で一晩、ウェル底部の金上にコーティングされた１ｕＭのチオール化捕捉プローブを選択した。次いで、第１のプレートをＰＢＳＴで３回すすぎ、次いで５０ｕＭ ＭＣＨで３０分間ブロッキングし、次いでＰＢＳＴで３回すすいだ。
図３９は、標的核酸を捕捉するための閉鎖構成のＱＭＡＸデバイスの例示的実施形態の概略図である。
【0264】
１μＬの標的プローブ（濃度はＴＥ緩衝液で希釈された１ｐＭよりもはるかに低く、これは、試料中の核酸プローブの総数が第１のプレート上のウェル数よりもはるかに少ないことを確認するためである）を、開放構成において第１のプレートに添加する。いくつかの実施形態では、標的プローブは、結合プローブの以下の測定および評価を容易にするために標識に結合される。標識は、該標識が上記捕捉剤への結合前または結合後のいずれかで、直接的または間接的に、発光標識または光学的に検出可能な標識である。標識は、ラマン散乱、色度、ルミネセンス、蛍光、エレクトロルミネセンス、ケミルミネセンス、および／または電気化学ルミネセンスの信号を伴った標識である。本明細書で使用される場合、「発光標識」という用語は、外部励起下のときに発光することができる標識を指す。これはルミネセンスであり得る。蛍光標識（色素分子または量子ドットを含む）、およびルミネセンス標識（例えば、エレクトロルミネセンスまたはケミルミネセンス標識）は、発光標識の類型である。外部励起は、蛍光では光（光子）、エレクトロルミネセンスでは電流、ケミルミネセンスでは化学反応である。外部励起は、上記の組み合わせにすることができる。「標識分析物」という語句は、標識の存在を評価することによって分析物を検出することができるように、発光標識で検出可能に標識された分析物を指す。標識分析物は直接的に標識されてもよく（すなわち、分析物自体は、例えば強い結合、例えば共有結合または非共有結合を介して、標識に直接結合されてもよい）、または標識分析物は間接的に標識されてもよい（すなわち、分析物は、直接的に標識された二次捕捉剤によって結合される）。
【0265】
液体の上部において第２のプレートを手で押圧し、ＱＭＡＸを閉鎖構成にする。ここで使用される第２のプレートは、１７５ｕｍのＰＭＭＡ基板上に３０×４０ｕｍの柱サイズ、８０ｕｍの間隔距離、３０ｕｍの柱高さを有するＸプレートである。
【0266】
ＱＭＡＸデバイスを１分間インキュベートし、第２のプレートを剥がす。ＤＮＡウォッシャー（５×ＳＳＣ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を含有するスポンジで第１のプレートを３回すすぐ。
第１のプレートは、以下の核酸配列決定ステップの準備がされている。
【0267】
結果の例図４０は、（ａ）１ｐＭ濃度の１μＬの標的核酸試料を使用したＱＭＡＸ、（ｂ）１０ｆＭ濃度の１００ｕＬの核酸試料を使用した通常の９６マイクロウェルプレート、（ｃ）１ｐＭ濃度の１００ｕＬの標的核酸試料を使用した通常の９６マイクロウェルプレートでの標的ＤＮＡを捕捉するための代表的な時間経過研究を示している。ｘ軸は、インキュベーション時間である。ｙ軸は、捕捉された核酸に結合したＩＲ−８００色素からの蛍光信号である。実験プロセスは図３７のフローチャートに従う。
【0268】
明らかに、ＱＭＡＸデバイスでは、インキュベーション飽和時間が最速（約１分）であり、必要な試料量が最小（１ｕＬ）である。低濃度（１０ｆＭ）の１００ｕＬの試料を使用した通常の９６マイクロウェルの第１のプレートをインキュベートした際には、捕捉プロセスは１２０分以内に飽和せず、第１のプレートははるかに低い信号を有する。高濃度（１ｐＭ）の１００ｕＬの同じ試料を使用した通常の９６マイクロウェルの第１のプレートをインキュベートした際には、捕捉プロセスはＱＭＡＸデバイスほど速く飽和せず、ＱＭＡＸデバイスよりも１００倍の試料量を必要とする。
【0269】
実施例によって示されるように、いくつかの実施形態では、本発明は、高速で、簡素で、持ち運び可能で、わずか１ｕＬ以下の試料しか必要としない、配列決定のための核酸を捕捉するためのプラットフォームを提供する。本発明では、試料量および捕捉時間を正確に制御することができるように指定されたパラメーターを使用して、浅い密閉空間で核酸の捕捉を行うことができる。いくつかの実施形態では、分子のブラウン運動は浅い空間では制限され、したがって分子結合の平衡に速く達することができる。このプラットフォームは、従来のマイクロタイタープレートで行われる任意の核酸配列決定に適合させることができ、したがって幅広い用途を有する。
【0270】
追加の例本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍまたはいずれかの２つの値の間の範囲、および５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０μｍまたは１０ｕｍ〜３０ｕｍ、３０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲の高さを有することができる。
【0271】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では０．１秒未満、核酸（２０ｂｐ）では０．１秒未満である。
【0272】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、２ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では０．３秒未満、核酸（２０ｂｐ）では０．１秒未満である。
【0273】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、５ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では２秒未満、核酸（２０ｂｐ）では１秒未満である。
【0274】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では１０秒未満、核酸（２０ｂｐ）では５秒未満である。
【0275】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、３０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では６０秒未満、核酸（２０ｂｐ）では３０秒未満である。
【0276】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、５０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質で２分未満、核酸（２０ｂｐ）で１分未満である。
【0277】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１００ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質で１０分未満、核酸（２０ｂｐ）で５分未満である。
【0278】
本明細書に記載のデバイスまたは方法では、試料を飽和結合時間にわたってインキュベートすることができる。いくつかの実施形態では、飽和結合時間は、標的実体が閉鎖構成における均一厚層の厚さを横切って拡散するのにかかる時間と等しいかまたはそれより長い。いくつかの実施形態では、飽和結合時間は、標的実体が閉鎖構成における均一厚層の厚さを横切って拡散し、結合部位に結合するのにかかる時間と等しいかまたはそれより長い。いくつかの実施形態では、飽和結合時間は、標的実体が結合部位の最小横寸法を横切って横方向に拡散するのにかかる時間よりも著しく短い。いくつかの実施形態では、飽和結合時間は、インキュベーション終了時には、結合部位に結合している標的実体の大部分が関連する体積の試料に由来するものである。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、標的実体が結合部位に結合することを可能にし、関連する体積は、閉鎖構成における結合部位の上方にある試料の一部である。
【0279】
特定の実施形態では、インキュベーション時間は１秒〜１０秒の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は１０秒〜３０秒の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は３０秒〜６０秒の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は１分〜５分の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は５分〜１０分の範囲である。特定の実施形態では、インキュベーション時間は１０分〜３０分の範囲である。
【0280】
本実施形態均一な核酸検出アッセイを実施するための方法であって、
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
第１のプレートおよび第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
第１のプレートが、その試料接触領域上に、
（ｉ）表面増幅表面と、
（ｉｉ）該増幅表面上に固定されており、標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を含み、
第２のプレートが、標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くステップと、
（ｃ）プレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）（ｃ）の後、プレートを閉鎖構成のままにしながら、かつ任意の洗浄ステップなしで、読み取りデバイスで試料接触領域を読み取ることにより標的核酸を検出して、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）閉鎖構成での試料の厚さ、（ｉｉ）閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して核酸プローブに間接的に結合している標識が、表面増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
構成の１つは、２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が２つのプレートの間にあり、かつプレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
【0281】
均一な試料を分析するためのデバイスであって、第１のプレート、第２のプレート、および結合部位を備え、
（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートが、異なる構成になるように互いに対して移動可能であり、そのそれぞれの表面上に、標的分析物を含有する試料と接触するための試料接触領域を有し、
（ｂ）第１のプレート上の試料接触領域が、
（ｉ）近接依存性信号増幅層と、
（ｉｉ）標的核酸の一部に結合する、近接依存性信号増幅層に付着した標的特異的核酸プローブと
を含む結合部位を有し、
（ｃ）第２のプレート上の試料接触領域が、標的核酸の別の部分に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含み、
構成の１つは開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が２つのプレートの間にある閉鎖構成であり、
閉鎖構成での試料の厚さ、閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および近接依存性信号増幅層の増幅率は、標的特異的核酸プローブに間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく可視化されるように構成されている、デバイス。
【0282】
サーマルサイクラーおよび実施形態２のデバイスを備える、装置。
【0283】
サーマルサイクラー、実施形態２のデバイス、およびリアルタイムＰＣＲ用の読み取り器を備える、装置。
【0284】
迅速な核酸検出アッセイのための方法であって、（ａ）第１のプレートおよび第２のプレートを備えるＱＭＡＸデバイスを取得するステップであって、
第１のプレートおよび第２のプレートがそれぞれ、１つ以上の標的核酸を含有する試料と接触するための試料接触領域を含み、
第１のプレートが、その試料接触領域上に結合部位を含み、結合部位が、該部位上に固定されておりかつ標的核酸の一部に特異的に結合する標的特異的核酸プローブを含み、
第２のプレートが、標的核酸の別の部分に特異的に結合する標的特異的核酸検出剤を含む試薬貯蔵部位を含む試料接触領域を含む、ステップと、
（ｂ）プレートが開放構成にあるときに、プレートの一方または両方の上に試料を置くステップと、
（ｃ）一定期間のインキュベーションのためにプレートを閉じて閉鎖構成にするステップと、
（ｄ）プレートを開き、洗浄溶液を有する洗浄スポンジで一定期間にわたってプレートを再度押圧し、次いで洗浄スポンジを解放するステップと、
（ｅ）（ｄ）の後、読み取りデバイスで試料接触領域を読み取って、信号の画像を生成するステップと
を含み、
（ｉ）閉鎖構成での試料の厚さ、（ｉｉ）閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および（ｉｉｉ）近接依存性増幅表面の増幅率は、標的核酸を介して核酸プローブに間接的に結合している標識が、近接依存性増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を洗い流すことなく可視化されるように構成され、
構成の１つは、２つのプレートの内側面の間の平均間隔が少なくとも２００ｕｍである開放構成であり、
構成のうちの別の構成は、試料の少なくとも一部が２つのプレートの間にあり、かつプレートの内側面の間の平均間隔が２００ｕｍ未満である、閉鎖構成である、方法。
【0285】
閉鎖構成における第１のプレートと第２のプレートとの間の間隔は、標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が３００秒以下になるように構成されている、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0286】
閉鎖構成における第１のプレートと第２のプレートとの間の間隔は、標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が３００秒以下になるように構成されている、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0287】
閉鎖構成における第１のプレートと第２のプレートとの間の間隔は、標的分析物の捕捉剤への飽和結合時間が６０秒以下になるように構成されている、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0288】
標的核酸が、ゲノムＤＮＡ、ｃｆＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡを含む、ＤＮＡまたはＲＮＡである、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0289】
ステップ（ｂ）から結果を得るまでの時間が１０分未満である、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0290】
閉鎖構成での試料の厚さ、閉鎖構成における試料に溶解した標識の濃度、および表面増幅層の増幅率は、プローブに直接的または間接的に結合している標識のいずれもが、結合していない標識を洗い流すことなく、閉鎖構成において可視化されるように構成されている、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0291】
近接依存性増幅表面に結合した標識が、６０秒未満で可視化される、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0292】
近接依存性増幅表面に結合した標識が、６０秒未満で可視化される、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0293】
貯蔵部位が、閉鎖構成において第１のプレート上の結合部位のほぼ上方にある、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0294】
標的特異的核酸プローブおよび標的特異的核酸検出剤が、標識を含むサンドイッチを形成する、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0295】
信号が、増幅表面に結合していない任意の生体物質または標識を除去するための洗浄ステップを使用せずに読み取られる、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0296】
増幅表面に結合した標識が、個々の結合事象を計数することにより読み取られる、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0297】
増幅表面に結合した標識が、一括読み取り法によって読み取られる、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0298】
アッセイが、０．１ｎＭ以下の検出感度を有する、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0299】
アッセイが、スポンジを使用して、増幅表面に結合していない生体物質または標識を除去することを含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0300】
信号増幅層がＤ２ＰＡを含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0301】
信号増幅層が金属材料層を含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0302】
信号増幅層が、金、銀、銅、アルミニウム、それらの合金、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料で作られた連続金属フィルムを含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0303】
異なる金属層が、光信号を増強するために、局所的に増強するかもしくは反射体として機能するかまたはその両方である、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0304】
信号増幅層が、金属材料層、および金属材料層の上部の誘電材料を含み、捕捉剤が誘電材料上にある、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0305】
金属材料層が、均一な金属層、ナノ構造金属層、または組み合わせである、上記実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0306】
プラズモン増強により信号を増幅する、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0307】
アッセイが、ラマン散乱により標識を検出することを含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0308】
第１のプレートの試料接触領域が、近接依存性増幅表面を含むが標的特異的核酸プローブを含まない部位をさらに含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0309】
アッセイが、近接依存性増幅表面を含むが標的特異的核酸プローブを含まない部位を読み取ることによりバックグラウンド信号を計算することを含む、先行する実施形態のいずれかのデバイス、装置、または方法。
【0310】
デバイスが、プレートの１つの上に固定されたスペーサーをさらに備え、スペーサーが、閉鎖構成における第１のプレートと第２のプレートとの間の間隔を調節する、先行する実施形態のいずれかのデバイスまたは方法。
【0311】
表面増幅層の増幅率が、捕捉剤に直接的または間接的に結合した単一の標識からの光信号を可視化するように調整される、先行する実施形態のいずれかのデバイスまたは方法。
【0312】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１００ｎｍ、１ｕｍ、５ｕｍ、１０ｕｍ、２０ｕｍ、５０ｕｍ、５００ｕｍ、１ｍｍまたはいずれかの２つの値の間の範囲、および５００ｎｍ〜１ｕｍ、１ｕｍ〜１０ｕｍまたは１０ｕｍ〜３０ｕｍ、３０ｕｍ〜５０ｕｍの好ましい範囲の高さを有することができる。
【0313】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは１ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では０．１秒未満、核酸（２０ｂｐ）では０．１秒未満である。
【0314】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、２ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では０．３秒未満、核酸（２０ｂｐ）では０．１秒未満である。
【0315】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、５ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では２秒未満、核酸（２０ｂｐ）では１秒未満である。
【0316】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では１０秒未満、核酸（２０ｂｐ）では５秒未満である。
【0317】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、３０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質では６０秒未満、核酸（２０ｂｐ）では３０秒未満である。
【0318】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、５０ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質で２分未満、核酸（２０ｂｐ）で１分未満である。
【0319】
本明細書に記載のデバイスまたは方法において、スペーサーは、１００ｕｍ以下の高さを有することができ、それにより、飽和インキュベーション時間（または飽和結合時間）は、タンパク質で１０分未満、核酸（２０ｂｐ）で５分未満である。
【0320】
関連文書本発明は、様々な実施形態を含み、これらは、様々な構成要素が互いに矛盾しない限り、複数の様式で組み合わせることができる。実施形態は、別個独立としてではなく、単一の発明出願とみなされるべきであり、各出願は、参照として他の出願を有し、また、あらゆる目的のためにその全体が参照される。これらの実施形態は、本出願の開示だけでなく、本明細書において参照され、組み込まれ、または優先権が主張される文書も含む。
【0321】
（１０）定義本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法を説明するために使用される用語は、本出願、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に定義されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0322】
「ＣＲＯＦカード（またはカード）」、「ＣＯＦカード」、「ＱＭＡＸカード」、「Ｑカード」、「ＣＲＯＦデバイス」、「ＣＯＦデバイス」、「ＱＭＡＸデバイス」、「ＣＲＯＦプレート」、「ＣＯＦプレート」、および「ＱＭＡＸプレート」は、いくつかの実施形態では、ＣＯＦカードはスペーサーを備えていないことを除いて、互換性があり、これらの用語は、異なる構成（開放構成および閉鎖構成を含む）になるように互いに対して移動可能である第１のプレートおよび第２のプレートを備え、プレート間の間隔を調節するスペーサーを備える（ＣＯＦカードのいくつかの実施形態を除く）、デバイスを指す。「Ｘプレート」という用語は、ＣＲＯＦカードの２つのプレートのうちの１つを指し、スペーサーはこのプレートに固定されている。ＣＯＦカード、ＣＲＯＦカード、およびＸプレートのより詳細は、２０１７年２月７日に出願された仮出願シリアル番号第６２／４５６０６５号に提供され、これはあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【0323】
（１１）Ｑカード、スペーサー、および均一な試料の厚さ本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカード、スペーサー、および均一な試料の厚さの実施形態を含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、試料の少なくとも一部を均一性の高い層にするのに役立つスペーサーを備える。スペーサーの構造、材料、機能、バリエーション、および寸法、ならびにスペーサーおよび試料層の均一性は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0324】
（１２）ヒンジ、オープニング用ノッチ、凹型エッジ、およびスライダー本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、Ｑカードの操作および試料の測定を容易にするのに役立つヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーを備える。ヒンジ、ノッチ、凹部、およびスライダーの構造、材料、機能、バリエーション、寸法は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0325】
（１３）Ｑカード、スライダー、およびスマートフォン検出システム本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、試料の検出、分析、および定量化のためにＱカードを含むか、または使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｑカードは、カードがスマートフォン検出システムによって読み取られることを可能にするスライダー（ｓｌｉｄｅｒ）とともに使用される。Ｑカード、スライダー、およびスマートフォン検出システムの構造、材料、機能、バリエーション、寸法、および接続は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0326】
（１４）検出方法本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々なタイプの検出方法を含むか、または使用することができる。検出方法は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0327】
（１５）標識、捕捉エージェント、および検出エージェント本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、分析物検出に使用される様々なタイプの標識、捕捉剤、および検出剤を使用することができる。標識は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0328】
（１６）分析物本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な種類の分析物（バイオマーカーを含む）の操作および検出に適用することができる。分析物は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0329】
（１７）用途（分野および試料）本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、様々な用途（分野および試料）に使用することができる。用途は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0330】
（１８）クラウド本明細書に開示されるデバイス、システム、および方法は、データ転送、ストレージ、および／または分析のためにクラウド技術を使用することができる。関連するクラウド技術は、本明細書に開示されているか、または２０１６年８月１０日および２０１６年９月１４日にそれぞれ出願されたＰＣＴ出願（米国を指定）第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５４３７号および第ＰＣＴ／ＵＳ０２１６／０５１７７５号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６０６５号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６２８７号、２０１７年２月８日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６５０４号に列挙、記載、および要約されており、それらの全ての出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0331】
本方法およびデバイスの使用を制限することを意図することなく、いくつかの実施形態では、該方法は、臨床試料由来の微生物病原体を同定するために用いてもよい。これらの実施形態では、標的配列は、どの病原体が感染症の原因であるかが分からない複数の異なる病原体（例えば、少なくとも１０種または少なくとも１００種の異なる病原体）に由来してもよく、本方法、組成物、およびキットを使用して同定され得る微生物には、複数種のグラム（＋）細菌、複数種のグラム（−）細菌、腸内細菌科の複数種の細菌、エンテロコッカス属の複数種の細菌、スタフィロコッカス属の複数の細菌種、およびカンピロバクター属の複数の細菌種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、様々な株の大腸菌、例えば、Ｋ１２−ＭＧ１６５５、ＣＦＴ０７３、Ｏ１５７：Ｈ７ ＥＤＬ９３３、Ｏ１５７：Ｈ７ ＶＴ２−Ｓａｋａｉなど、肺炎連鎖球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．トロピカリス、Ｃ．デュブリニエンシス、Ｃ．ビスワナチイ、Ｃ．パラプローシスを含む複数のカンジダ属種、肺炎桿菌、複数のマイコバクテリウム属種、例えば、結核菌、Ｍ．ボビス、Ｍ．ボビス ＢＣＧ、Ｍ．スクロフラセウム、Ｍ．カンサシ、Ｍ．ケロネー、Ｍ．ゴルドナエ、Ｍ．ウルセランス、Ｍ．ゲナベンス、Ｍ．ゼノイ、Ｍ．シミエ、Ｍ．フォーチュイタム、Ｍ．マルモエンス、Ｍ．セラツム、Ｍ．ヘモフィルム、およびＭ．アフリカヌム、リステリア属種、クラミジア属種、マイコプラズマ属種、サルモネラ属種、ブルセラ属種、エルシニア属種などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、対象の方法は、微生物の属、種、亜種、株、またはバリアントのレベルまで微生物の同定を可能にする。
【0332】
追加の留意事項本開示による本発明対象のさらなる例は、以下の列挙された段落に記載されている。
【0333】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、「単一」という語が使用される場合などの文脈がそうではないことを明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。例えば、「分析物」についての言及は、単一の分析物および複数の分析物を含み、「捕捉剤」についての言及は、単一の捕捉剤および複数の捕捉剤を含み、「検出剤」についての言及は、単一の検出剤および複数の検出剤を含み、「剤」についての言及には、単一の剤および複数の剤が含まれる。
【0334】
本明細書で使用される場合、「適合させる」および「構成される」という用語は、要素、構成要素、または他の対象物が所与の機能を果たすように設計および／または意図されることを意味する。したがって、「適合される」および「構成される」という用語の使用は、特定の要素、構成要素、または他の対象物が特定の機能を単に果たす「ことができる」ことを意味すると解釈されるべきではない。同様に、特定の機能を果たすように構成されるとして記載されている対象物は、さらにまたはあるいは、その機能を果たすように作動するものとして説明され得る。
【0335】
本明細書で使用される場合、「例えば」という句、「例として」という句、および／または「例」もしくは「例示的な」という用語は、本開示による１つ以上の構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法に関して使用される場合、記載された構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法が、本開示による構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法の例示的で非排他的な例であることを伝えることを意図している。したがって、記載される構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法は、限定されること、必須とされること、または排他的／網羅的であることを意図してなく、構造的および／もしくは機能的に類似するならびに／または同等である構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法を含む他の構成要素、特徴、詳細、構造、実施形態、および／または方法もまた、本開示の範囲内である。
【0336】
本明細書で使用される場合、２つ以上の実体（ｅｎｔｉｔｙ）の列挙に関して「のうちの少なくとも１つ」および「１つ以上」という句は、実体の列挙中における実体のうちの任意の１つ以上を意味し、実体の列挙内に具体的に列挙されている各々および全ての実体のうちの少なくとも１つに限定されない。例えば、「ＡおよびＢのうちの少なくとも１つ」（もしくは、同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、Ａのみ、Ｂのみ、またはＡおよびＢの組み合わせであってもよい。
【0337】
本明細書で使用される場合、第１の実体と第２の実体との間に置かれる「および／または」という用語は、（１）第１の実体、（２）第２の実体、および（３）第１の実体および第２の実体のうちの１つを意味する。「および／または」を用いて列挙された複数の実体は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された実体のうちの「１つ以上」と解釈すべきである。「および／または」の句によって具体的に特定された実体以外に、具体的に特定されたそれらの実体に関連するかどうかに関わらず、他の実体が任意選択で存在してもよい。
【0338】
数値範囲が本明細書で言及される場合、本発明は、端点が含まれる実施形態、両方の端点が除外される実施形態、および一方の端点が含まれ、かつ他方が除外される実施形態を含む。別段の指示がない限り、両方の端点が含まれると見なすべきである。さらに、別段の指示がない限り、または文脈および当業者の理解から明らかでない限り。
【0339】
任意の特許、特許出願、または他の参考文献が参照により本明細書に組み込まれ、（１）本開示の組み込まれない部分または他の組み込まれた参考文献のいずれかに矛盾する様式で用語を定義する場合において、および／または（２）その他の点でそれらと矛盾する場合において、本開示の組み込まれていない部分が支配するものとし、その中の用語または組み込まれた開示は、用語が定義されている、および／または組み込まれた開示が元々存在していた参考文献に関してのみ支配するものとする。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【国際調査報告】