特表 2020-513810 クロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する、Ｈｉｐｐｏエフェクターである優性活性Ｙａｐ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-513810(P2020-513810A)

(43)【公表日】2020年5月21日

(54)【発明の名称】クロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する、Ｈｉｐｐｏエフェクターである優性活性Ｙａｐ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20200424BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 9/06 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20200424BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20200424BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20200424BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20200424BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20200424BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C12N5/10

   A61P21/04

   A61P9/00

   A61P27/02

   A61P27/16

   A61P9/06

   A61P9/04

   A61P9/10

   A61P9/12

   A61K35/34

   A61K35/30

   A61L27/38

   A61L27/38 100

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2019-550762(P2019-550762)

(86)(22)【出願日】2018年3月14日

(85)【翻訳文提出日】2019年11月11日

(86)【国際出願番号】US2018022496

(87)【国際公開番号】WO2018170172

(87)【国際公開日】20180920

(31)【優先権主張番号】62/471,204

(32)【優先日】2017年3月14日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．Ｉｇｅｐａｌ

(71)【出願人】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】特許業務法人 ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】モンロー、タナー

(72)【発明者】

【氏名】リーチ、ジョン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン、ジェームズ、エフ．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C081

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA44

4C081AB18

4C081BA12

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087MA13

4C087MA17

4C087MA22

4C087MA23

4C087MA24

4C087MA28

4C087MA31

4C087MA37

4C087MA43

4C087MA56

4C087MA57

4C087MA58

4C087MA59

4C087MA60

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZA33

4C087ZA34

4C087ZA36

4C087ZA37

4C087ZA42

4C087ZA45

4C087ZA94

(57)【要約】

本開示は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を有する既存細胞から細胞または組織を作製する方法を包含する。具体的な実施形態では、本開示は、分裂して新たな心筋細胞を生じさせる１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体による既存心筋細胞の治療に関する。具体的な事例では、突然変異型Ｙａｐ変異体は、Ｙａｐの１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のセリンに、セリンからアラニンへの置換を有する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に供給する工程を含む、個体において細胞を再生する方法。

【請求項2】

再生される前記細胞が、心筋細胞、網膜細胞、または耳の有毛細胞である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記突然変異型変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換が存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記個体が、心臓病態、網膜病態、または耳の病態を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジーを有する、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

前記心臓病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる群から選択される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記個体に組成物が複数回供給される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記組成物が前記個体の全身に供給される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記組成物が前記個体の局所に供給される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を作製する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

病態の追加療法を前記個体に提供する、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

個体の医学的病態を治療する方法であって、治療有効量の突然変異型Ｙａｐ変異体を前記個体に供給する工程を含む、前記方法。

【請求項20】

前記突然変異型Ｙａｐ変異体が、セリンに１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれ以上のアミノ酸置換がセリンに存在する、請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

Ｌａｔｓキナーゼによりリン酸化されるセリンに、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換が存在する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

セリンに５つのアミノ酸置換が存在する、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

１つ以上のアミノ酸置換がアラニンへの置換である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記突然変異型Ｙａｐ変異体がＫ２６５Ｒ突然変異を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記医学的病態が心臓病態である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記個体における前記心臓病態により、前記個体が心筋細胞の再生を必要とする、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記個体の心臓が心筋細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／またはオートファジーを有する、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記医学的病態が、心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈からなる群から選択される心臓病態である、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記個体がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記個体に前記組成物が複数回供給される、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記組成物が前記個体の全身に供給される、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記組成物が前記個体の局所に供給される、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記突然変異型Ｙａｐ変異体をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に曝露させて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を作製する、請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

有効量の前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来細胞を前記個体に供給する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記医学的病態の追加療法を前記個体に提供する、請求項１９〜３５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１７年３月１４日出願の米国仮特許出願第６２／４７１，２０４号に対する優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（連邦政府支援の研究または開発に関する声明）
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されたＨＬ１２７７１７に基づく政府支援を受けて実施された。政府は本発明において、ある一定の権利を有する。

【0003】

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、生化学、心臓学、及び医学の分野に関連する。

【背景技術】

【0004】

完全なヒト心筋細胞の供給は生後１か月以内に確立され、成人の心筋細胞は年間約１％の割合で再生されることが、Ｃ^１４年代測定実験で示された^１。成体マウスの心筋細胞も同様に再生率が低い^２。Ｈｉｐｐｏ経路は進化的に保存されたキナーゼカスケードであり、Ｌａｒｇｅ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ（Ｌａｔｓ）１および２キナーゼによる転写コアクチベーターＹａｐのリン酸化及び阻害をもたらす^３。Ｈｉｐｐｏ経路の構成要素を出生後に除去すると、セリン（Ｓ）からアラニン（Ａ）への単一の突然変異をもつ活性型Ｙａｐを発現できるように、ＣＭの再生を適度に増加させることができる^４〜７。

【0005】

Ｌａｔｓ１／２は、５つの共通するＮＤＲ（核Ｄｂｆ２関連）キナーゼファミリーモチーフＨＸＲＸＸＳのＳ残基のリン酸化によりＹａｐを阻害する。ｉｎ ｖｉｔｒｏレポーターアッセイでは、Ｈｉｐｐｏ阻害の多くはＳ１２７のリン酸化（ヒトにおいてはＳ１２７、マウスにおいてはＳ１１２）によるものであるが、Ｙａｐの阻害には他のＳリン酸化事象も寄与することが示されている^８。

【0006】

本開示は、心臓修復を含めた心筋細胞再生の技術分野で長年にわたり切望されたニーズを満たす。

【発明の概要】

【0007】

本開示の実施形態には、例えば心臓、網膜、中枢神経系のニューロン、及び耳の有毛細胞におけるものを含めた、あらゆる種類の組織再生のための方法及び組成物を含む。本開示の実施形態には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなどの哺乳動物個体における１つ以上の病態の治療に対するものを含めた、細胞の再生に関連する方法及び組成物を含む。本開示の実施形態には、細胞を再生することを必要とする１つ以上の個体において細胞を再生するための方法及び組成物を含む。個体は、細胞再生を必要とする何らかの種類の病態を有する場合があるか、あるいはその病態に罹患しやすい、または罹患のリスクがある。具体的な実施形態では、哺乳動物個体における１つ以上の病態の治療に対するものを含めた、心筋細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳（内耳または外耳を含む）の有毛細胞の再生に関連する方法及び組成物が提供される。網膜での具体的な事例では、ミュラーグリア細胞にＹａｐ突然変異体を曝露させ、それによりこの細胞を網膜のニューロンへと分化させる。心筋細胞の再生の事例では、個体は心臓の病態を有しているか、またはそのリスクがある場合がある。個体は、個人歴及び／または家族歴、喫煙者、肥満または過体重であるために、またはそれらの組み合わせなどのために、心臓病態のリスクが生じる場合がある。

【0008】

具体的な実施形態では、方法及び組成物は、１つ以上のＹａｐ突然変異体に関連する。ある特定の実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、関連する医学的病態の改善につながる、細胞（心筋細胞、網膜細胞、中枢神経系のニューロン、または耳の有毛細胞を含む）再生を促進する活性を有する。代替的実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、医学的病態は改善するが、細胞再生を検出可能に促進しない。しかしながら、具体的な実施形態では、１つ以上のＹａｐ突然変異体は、クロマチンの全体的な再編成を刺激して細胞再生を促進する。具体的な事例では、突然変異体は１個、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＹａｐ突然変異体である。置換はセリンに対してであってもなくてもよく、場合によってはアミノ酸のセリンのアラニンへの置換である。特定の態様では、一例として、Ｌａｔｓキナーゼでの主要なリン酸化部位に、セリンからアラニンへの５つの置換を有する突然変異体Ｙａｐ５ＳＡは、成体心筋細胞においてクロマチンの全体的な再編成を刺激して心筋細胞の再生を促進する。そのようなＹａｐ突然変異体または他のＹａｐ突然変異体を、網膜細胞または有毛細胞の再生の促進にも類似的に使用することができる。Ｙａｐ突然変異体は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとして個体に提供することができる。

【0009】

上記は、以降の本発明の詳細な説明をよりよく理解できるように、本発明の特徴及び技術的利点をかなり大まかに概説したものである。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明のさらなる特徴及び利点を以下に説明する。開示される概念及び具体的な実施形態は、本発明の同じ目的を実施するために、それらに変更を加えるか、または他の構造を設計するための基礎として容易に利用できることが当業者には理解されるはずである。また、そのような等価な構造が、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の趣旨及び範囲から逸脱しないことも当業者には認識されているはずである。本発明の特徴であると考えられる新規の特徴は、その構成及び動作方法の両方に関して、さらなる目的及び利点も合わせ、添付の図面と関連付けて考察すると、以下の説明からよりよく理解されるであろう。しかしながら、各図は例示及び説明のみを目的として提供され、本発明の限定を規定する意図はないことを明確に理解されるべきである。

【0010】

本発明をより完全に理解するために、ここで添付の図面と併せて下記の説明が考慮される。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１Ａ〜１Ｅ。Ｙａｐ５ＳＡ導入遺伝子の設計及び発現。図１Ａ．（上）条件付きＹａｐ５ＳＡ対立遺伝子の構造。（下）下線のセリン残基がアラニンに変異している過剰発現されたＹａｐ変異体のヒトタンパク質配列。図１Ｂ．発達期の心臓にＧＦＰ発現を有する代表的なｅ９．５ Ｔｇ（Ｊｏｊｏ＿Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭマウス。図１Ｃ．Ｐ０新生児から採取した対照及びトランスジェニック心臓でのＧＦＰ蛍光の画像。図１Ｄ．（左上）成体ＣＭでＹａｐ５ＳＡを発現させるための生殖及び誘導戦略。（左下）ＦｌａｇＹａｐ５ＳＡ発現を示すウェスタンブロット。左側に分子量マーカーを示す。（右）ウェスタンブロットによるＹａｐ発現の定量化を平均＋／−ＳＥＭとして示す。ｎ＝３マウス／遺伝子型。図１Ｅ．抗Ｙａｐ抗体及びＤＡＰＩで染色された、単離した対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心筋細胞の免疫蛍光画像。（右）平均＋／−ＳＥＭとして示されるＹａｐ免疫蛍光の核／サイトゾル比の定量化。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による全統計。対照ｎ＝３（心臓）、６０（細胞）。Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝３（心臓）、６７（細胞）。

【図2】図２Ａ〜２Ｊ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスの求心性心不全及び死亡。図２Ａ．対照（ｎ＝８）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ（ｎ＝７）マウスを表すカプランマイヤー生存分析。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定により算出された統計。図２Ｂ．対照及び瀕死状態のＹａｐ５ＳＡ心臓から得たマッソンのトリクローム染色（７日目）。図２Ｃ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での同じ動物の左心室の代表的なＢモード画像。図２Ｄ〜２Ｅ．収縮期（図２Ｄ）及び拡張期（図２Ｅ）における左心室後自由壁の厚さ。図２Ｄ〜２Ｅは、平均＋／−ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射前対照ｎ＝６、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝１０、注射後対照ｎ＝９）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。図２Ｆ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の代表的なＭモード心エコー検査。図２Ｇ．収縮終期の左心室腔直径。図２Ｈ．拡張終期の左心室腔直径。図２Ｉ．内径短縮率。図２Ｊ．駆出率。図２Ｇ〜２Ｊのデータは、平均＋／−ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４、注射前対照ｎ＝３、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射後対照ｎ＝７）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。

【図3】図３Ａ〜３Ｋ．分化した心筋細胞の増殖。図３Ａ．単離ＣＭの面積を示すヒストグラム。ｎ＝３マウス／群。約１００細胞／心臓。図３Ｂ．異なる組織深度でのＬＶの切片及び面積、ｎ＝６／群。平均＋／−ＳＥＭ。＊はＰ＜０．０５を示す。図３Ｃ．ＬＶ容積。図３Ｄ．ＬＶ腔容積ｎ＝６／群。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｅ．ＬＶの重量と体重との比（ｎ＝６／条件）。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｆ．（左）ＬＶの筋細胞数。（ｎ＝５／群）平均＋／− ＳＥＭ。（右）ＰＣＭ１（＋）ＣＭ核（黄色の矢印で例を示した）。図３Ｇ．ＣＭ核形成。６心臓／群。４００〜５００ＣＭ／心臓。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｈ．（左）ＥｄＵを含むＣＭの例。（右）誘導／ＥｄＵ標識戦略及びＥｄＵ取り込みの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝４心臓／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ｉ．代表的なＡｕｒｏｒａＢ染色切片（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＡｕｒｏｒａＢ（＋）ＣＭの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ｊ．ＰＨＨ３染色切片の例（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＰＨＨ３（＋）ＣＭの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ａ〜３Ｊは、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による統計である。図３Ａ〜３Ｊは、タモキシフェンプロトコルの２日後のマウスによるものである。図３Ｋ．異なる時点での１回の低用量タモキシフェン投与後のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ｌａｃｚ（＋）ＣＭの数をｌｏｇ２形式（左）及び生データ（右）で示す。平均＋／−ＳＥＭ。Ｎ（ｔ）＝ｌａｃｚ（＋）細胞数／心筋層面積。ｔ＝時間（日）。ｔＤ＝倍加時間。ｎ＝３マウス／時点。ｌｏｇ２変換後の線形フィットＲ２＝０．９６。

【図4】図４Ａ〜４Ｇ。ＣＭ増殖遺伝子プログラムのエピジェネティックな活性化。図４Ａ．（上）ＣＭ核濃縮プロトコル。（左下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＲＮＡ−ｓｅｑのボルケーノプロット。１，３５２個の遺伝子が上昇、７４８個が下降（調整Ｐ値＜０．１）。（右下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＡＴＡＣ−ｓｅｑのボルケーノプロット。Ｙａｐ５ＳＡの大幅なｌｏｇ_２倍数変化により、１６，１８９個のピークが上昇、１３，３５３個が下降。２試料／遺伝子型。図９に再現性。図４Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した上位のＡＴＡＣ−ｓｅｑモチーフ。（右）すべてのＴＥＡＤモチーフピークのヌクレオソームシグナル。これを０〜１に標準化した（図４Ｃ）。以下のエンハンサーとプロモーターの比率：遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの合計（図１２）；Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク；及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク。＊Ｐ＜０．００１、対照の比率と比較した、カイ二乗検定、イエーツの補正。図４Ｄ．対照またはＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭそれぞれの上位ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整済みｐ≦０．０３５）を中心とした、発達期及び成体の心臓からのＨ３Ｋ２７Ａｃ断片のカバレッジ。ｎは調査したピークの数。図４Ｅ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ上方制御ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整ｐ値＜１ｅ−５）及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピーク（ＨＯＭＥＲのピークスコアカットオフが２０）に対応する、高信頼度のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ上方制御遺伝子（ＲＮＡ−ｓｅｑ調整ｐ値＜０．０１）。（右）カテゴリーごとの高度に濃縮されたＧＯ期。図４Ｆ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子にわたるＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナル（ＴはＴＥＡＤモチーフの目印；ＹはＹａｐ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの目印）。図４Ｇ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子のプロモーターにおけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナル。プロモーターのＣｈｉｐ−ｓｅｑピークを緑色の矢印で示した。

【図5】図５Ａ〜５Ｆ．Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ筋細胞は正常な生理機能をもち、導入遺伝子を発現しないＣＭに結合する。図５Ａ．タモキシフェン前後の対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥマウスからの代表的なＥＣＧトレース。Ｔ波の逆転を示す。図５Ｂ．（上）Ｔ波逆転したマウスの割合。＊Ｐ＝．０２８６（フィッシャーの正確確率検定）。（下）Ｔ波の曲線下の相対面積。平均＋／−ＳＥＭ。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により算出した統計。対照ｎ＝３、Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４。図５Ｃ．β−ガラクトシダーゼ（淡青緑）及びコネキシン４３（赤）の免疫染色は、再結合したβ−ｇａｌ（＋）ＣＭと、再結合しなかったＣＭ（染色なし、黒）とのギャップジャンクションによる結合を示している。黄色の矢印は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭをもつシンシチウムのβ−ｇａｌ（−）ＣＭを示す。挿入図は拡大図である。図５Ｄ．（左）サルコメア短縮の代表的なプロット。（中）安静時のＣＭサルコメア長。平均で示す。（右）サルコメア短縮率。図５Ｅ〜５Ｆ．平均＋／−ＳＥＭとして示す。統計的差異なし、対照ｎ＝５動物、２７細胞。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝５動物、３１細胞。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定。

【図6】図６Ａ〜６Ｃ．細胞周期段階のフローサイトメトリー分析。図６Ａ．ＤＡＰＩで染色した、対照心臓及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓から単離された心臓核のフローサイトメトリーから得た代表的なヒストグラム。円グラフの対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝４。円グラフのデータは平均を示す。Ｐ値は、分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した。Ｐ＜．０５をアスタリスクで示す。図６Ｂ．Ａで参照したＦＡＣＳによるＣＭ ＤＮＡ含量から得た代表的なドットプロット。図６Ｃ．ＦＡＣＳ ＤＮＡ含量分析、平均及びＳＥＭ、ｎ＝４／遺伝子型。分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計。

【図7】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭの細胞アポトーシスの増加は認められない。ＴＵＮＥＬ染色は、対照心臓とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓との間に有意差を示していない（ｎ＝４心臓／遺伝子型）。ペアワイズ分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計を平均＋／−ＳＥＭで示す。

【図8】Ｙａｐ ５ＳＡ ＯＥ心臓には線維化が認められない。ピクロシリウスレッド染色は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓も対照も線維化表現型をもたないことを示している。比較のために線維性損傷のある代表的な心臓も示す。

【図9】シーケンシングの品質管理。（上）両方のＡＴＡＣ−ｓｅｑセットに高再現性。（下）ＲＮＡ−ｓｅｑセット間に高再現性。示された各実験からのリードを、正規化された対数変換で変換し、散布図として表し、複製データセットの関係を示した。注：データセットの試料は一致している（例：対照−１ ＡＴＡＣ−ｓｅｑと対照−１核ＲＮＡは同じ生物学的試料に由来する）。

【図10A】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓での上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子の遺伝子オントロジー分析（ｐ＜０．０１）。

【図10B】ＲＮＡ−ｓｅｑから選択した遺伝子のヒートマップ

【図11】図１１Ａ〜１１Ｂ．Ｙａｐ５ＳＡは、無益な負のフィードバックループを誘発する。図１１Ａ．ＲＮＡ−ｓｅｑで示されたＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭで上方制御される遺伝子の経路濃縮分析。強調表示はＨｉｐｐｏ経路である。（経路分析はｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて実施）図１１Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓における内因性Ｙａｐリン酸化の増加を示すウェスタンブロット。（右）平均＋／−ＳＥＭとして示される、バンド強度の定量化（対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝３、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定によるＰ＜．０１）。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｂ．ＴＳＳに対する遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの幾何学ドットプロット。図１２Ａ．両方の遺伝子型にわたる、遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離の合計（対照：３４７３８ピーク；Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ：４０，３３３ピーク）。図１２Ｂ．上方制御された遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑ及びＣｈＩＰ−ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離。

【図13】図１３Ａ．１〜１３Ａ．３及び図１３Ｂ〜１３Ｄ．高信頼度のＹａｐ５ＳＡ標的（図１３Ａ１〜１３Ａ３）（左）クロマチンがすでに開いている領域でＹａｐ５ＳＡによって直接上方制御された９７個の遺伝子のリスト。（中）新たなオープンクロマチンと上方制御されたＲＮＡをもつ１０６個の遺伝子のリスト。（右）オープンクロマチンが増加した、Ｙａｐ５ＳＡによって直接上方制御された７６個の遺伝子のリスト。図Ｂ．Ａのリストで最も濃縮がみられた遺伝子オントロジー期。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子のＴＳＳを中心としたＡＴＡＣ−ｓｅｑリード及びＲＮＡ−ｓｅｑリードの平均。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子に対応するＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを中心としたＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣＨＩＰ−ｓｅｑ断片のカバレッジ

【図14】図１４Ａ〜１４Ｃ．心筋細胞増殖を活性化するＹａｐ５ＳＡのモデル。図１４Ａ．ある特定の事例では、Ｙａｐが標的遺伝子のオープンプロモーターに直接結合し、転写を増加させる。そのようなプロセスでは、新たなオープンクロマチンのリードは生じない。図１４Ｂ．主に、Ｙａｐ５ＳＡはエンハンサー領域に結合し、標的遺伝子のゲノム近傍を開く、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体などのクロマチンリモデリング因子を動員する。次に、Ｙａｐ自体または他の転写因子が自由に転写を促進する。図１４Ｃ．（左パネル）これら２つの直接的な活性化スキームの間に、Ｙａｐ５ＳＡは次の３つのプロセスによって増殖を促進する：１．Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子、Ｅ２Ｆ転写因子、サイクリン、及びＰｏｌｏ様キナーゼを介した細胞周期の活性化。２．フォルミン、プロテインキナーゼＣイオタ、Ｅｃｔ２、Ｉｎｃｅｎｐ、及びＥｐｈｅｘｉｎ４による細胞骨格の再配列及び細胞質分裂の促進。３．プロテインキナーゼＤ１、Ａｌｃａｍ、及びＤｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ２などの胎児の心臓発達に関連する遺伝子の再出現。（右パネル）これら３つのプロセスは、最小限のまたは有害な機能を独立して有する。簡略化のため、色で示す直接のＣｈＩＰ−ｓｅｑ標的のみが左パネルに含まれている。右パネルには、直接的な上方制御遺伝子に加え、色で示す間接的に（上方または下方）制御された転写物（図４Ａ及び図４Ｄに従って含まれる遺伝子）を含む。

【図15】図１５Ａ〜１５Ｂ．Ｙａｐ Ｋ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い。図１５Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び６時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１３）。示されている抗体をイムノブロットした。図１５Ｂ．Ｐ１９細胞、及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有する２つの異なるＰ１９コロニーからの溶解物を示されている抗体でイムノブロット分析した。

【図16】Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定を実証する。２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞。示されている抗体をイムノブロットした。

【図17】図１７Ａ〜１７Ｂ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定。図１７Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１１）。示されている抗体をイムノブロットした。図１７Ｂ．Ｙａｐの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＧＡＰＤＨで標準化してプロットした。

【図18】図１８Ａ〜１８Ｃ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の代謝回転率の決定。図１８Ａ．２０ｕＭ／ｍｌ Ｍｇ１３２で０時間、１時間、２時間、及び４時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１１）。示されている抗体をイムノブロットした。図１８Ｂ及び図１８Ｃ．Ｙａｐ及びβ−カテニンの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＧＡＰＤＨで標準化してプロットした。

【図19】図１９Ａ〜１９Ｄ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の核局在化の決定。図１９Ａ及び１９Ｂ．２．０×１０^６個の細胞を１０ｃｍ皿に播種し、１８時間後に細胞を回収し、分画してウェスタンブロット分析を行った。図１９Ｃ及び図１９Ｄ．Ｙａｐの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＨＤＡＣ２（核画分の場合）またはＧＡＰＤＨ（サイトゾル画分の場合）で標準化してプロットした。

【発明を実施するための形態】

【0012】

長年にわたる特許法の慣例に従って、「ａ」及び「ａｎ」という語は、特許請求の範囲を含め、構成している用語と合わせて本明細書で使用される場合、「１つ以上」を意味する。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／または方法からなるか、または本質的になる場合がある。本明細書に記載の任意の方法または組成物は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物と関連付けて実施できると考えられる。

【0013】

本明細書で使用される場合、用語「約」または「ほぼ」とは、定量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さが、基準とする定量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度変動することを意味する。特定の実施形態では、用語「約」または「ほぼ」が数値に先行する場合、上下１５％、１０％、５％、または１％の範囲の値を示す。

【0014】

本明細書全体を通して、文脈上、特に必要がない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、指定されたステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群を包含するが、いかなる他のステップもしくは要素、またはステップ群もしくは要素群も除外しないことを意味するものと理解されよう。「からなる」とは、語句「からなる」に続くものはすべて含むこと、かつそれに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる」は、列挙された要素が必要または必須であり、他の要素はいっさい存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、語句の後ろに列挙された任意の要素に加え、列挙された要素に関して本開示で指定された挙動または作用を妨害しないか、またはそれらに寄与しない他の要素に限って含むことを意味する。したがって、語句「から本質的になる」は、列挙された要素は必要または必須であることを示すが、他の要素は任意選択ではなく、かつ列挙された要素の挙動または作用に影響を及ぼすかどうかに応じて存在する場合もあれば存在しない場合もあることを示す。

【0015】

本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所に出現する前述の語句が、必ずしもすべて同じ実施形態を指しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性を、１つ以上の実施形態において好適な任意の方法で組み合わせてもよい。

【0016】

本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、「治療有効用量」または「有効用量」と同義語であり、それを必要とする個体において医師が求める生物学的応答または臨床的応答を誘発するであろうＹａｐ突然変異体タンパク質またはポリペプチドの量を指す。非限定的な例として、有効量は、細胞または組織を再生するのに十分な量である。

【0017】

Ｉ．Ｙａｐ突然変異体の例
本開示の実施形態は、Ｙａｐの１つ以上の突然変異体、ならびに臨床目的及び／または研究目的でのそれらの使用を含む。突然変異体（複数可）は、例えば以下：アミノ酸の置換（複数可）；欠失（複数可）；挿入（複数可）；それらの組み合わせなどの１つ以上を含み得る。具体的な実施形態では、Ｙａｐの１つ以上のアミノ酸が、別の１つ以上のアミノ酸で置換されている。１つ以上の特定の突然変異を用いて、突然変異体Ｙａｐの生物学的活性を減少させることができる。そのような突然変異を別の突然変異と組み合わせて、同じ突然変異型Ｙａｐタンパク質に使用する場合もあればしない場合もある。本開示に包含される任意の突然変異型Ｙａｐタンパク質は非天然であってもよい。Ｙａｐ突然変異体に関連する任意のタンパク質またはＤＮＡは、自然界から単離されたものでもよい。

【0018】

Ｙａｐ突然変異体タンパク質は、タンパク質中の１つ以上のセリンに置換を有してもよい。具体的な事例では、Ｌａｔｓキナーゼの主要なリン酸化部位である１個、２個、３個、４個、または５個のセリンが置換される。どのセリンも他のどのアミノ酸でも置換できるが、具体的な事例ではアラニンで置換される。

【0019】

本明細書で使用される場合、具体的な実施形態では、突然変異型ヒトＹａｐ変異体は、少なくとも以下のこの野生型配列で下線が引かれたセリンの１つに突然変異を含む。これらの下線が引かれたセリン残基は、Ｌａｔｓによってリン酸化されることが公知であるか、またはリン酸化されると予測されるものである。（配列番号１）：

【0020】

上記の配列内の１つ以上のセリンに対する１つ以上の突然変異に加えて、またはその代わりに、セリンに対してではない１つ以上の突然変異が配列内に存在してもよい。そのような突然変異は、アミノ酸の置換（保存的であるかどうかを問わない）、欠失、及び／または逆位などであり得る。具体的な実施形態では、突然変異型のＹａｐは、単一のアミノ酸置換として、５つの突然変異をそれぞれセリンに有する。具体的な事例では、１つ以上のセリンがアラニンに突然変異されるが、セリン（複数可）は、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、アルギニン、システイン、グルタミン、グリシン、プロリン、チロシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸などの異なるアミノ酸に突然変異されていてもよい。いずれの場合も、単一の突然変異体Ｙａｐタンパク質において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のセリンが変異していてもよい。

【0021】

突然変異体Ｙａｐタンパク質の一例は以下の通りである（下線はセリンがアラニンで置換された部位を示し、太字はＬａｔｓ認識配列を示す）。

【0022】

配列番号２には、Ｆｌａｇタグなどの任意の型のタグは含まれない。

【0023】

Ｆｌａｇタグを有するＹａｐ突然変異体タンパク質の一例（配列番号３）は以下の通りである：

【0024】

Ｙａｐ突然変異体タンパク質をコードするＤＮＡの一例（配列番号４）は以下の通りである：

【0025】

いくつかの実施形態では、Ｙａｐ突然変異体は１つ以上の突然変異を有することで、そのような１つ以上の突然変異がない場合に比べ安定性が低い。

【0026】

一実施形態では、Ｙａｐ突然変異体は２６５位に突然変異を有し、２６５位がリジンなどである（ヒトでは２８０位のリジン）。具体的な実施形態では、２６５位のリジン（ヒトでは２８０位）が、任意の他のアミノ酸であり得る別のアミノ酸に突然変異されるが、具体的な事例では、この突然変異はＫ２６５Ｒであり、これはヒト配列における２８０位のリジンと同様である。

【0027】

本開示は、突然変異型Ｙａｐ変異体を含む、タンパク質及びそれをコードする核酸を包含する。場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はポリペプチド形態で送達され、場合によっては、突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）はタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして送達される。ポリヌクレオチド形態で送達される場合、ポリヌクレオチドは、好適なベクターに発現構築物を含んでいてもよい。ベクターは、非ウイルス性またはウイルス性などの任意の好適な種類のものであり得る。ベクターが非ウイルス性である場合、ベクターはプラスミドまたはＲＮＡの線状配列であり得る。ベクターがウイルス性である場合、ベクターはアデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴、レトロウイルスなどであり得る。発現構築物中のプロモーターによって制御される場合、プロモーターは、例えば構成的、誘導性、または組織特異的であり得る。特定の実施形態では、突然変異型Ｙａｐ変異体は、アデノ随伴ウイルス構築物で、または修飾ＲＮＡとして送達される^９。

【0028】

ＩＩ．使用方法の例
本開示の実施形態には、少なくとも心臓、網膜、及び耳の有毛細胞におけるものを含めた、対象となる組織での組織再生の方法を含む。特定の実施形態では、細胞再生または組織再生の必要性がある個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。

【0029】

成体哺乳動物の心筋細胞（ＣＭ）の再生は非効率的である。損傷したＣＭは増殖できず、代わりに倍数性を増加させる核内倍加を活性化する。結果として、心臓はヒトの主たる死因である機能不全を起こしやすい。特定の実施形態では、本発明者らは、Ｈｉｐｐｏ阻害の影響を受けない成体ＣＭにおいて、Ｙａｐ５ＳＡと呼ぶＨｉｐｐｏエフェクターＹａｐ型を発現させた。Ｙａｐ５ＳＡは、倍加時間３３時間でのＣＭの増殖、心室壁の肥厚、１５％を超えるＣＭでの有糸分裂の再開を誘発した。クロマチンアクセシビリティのゲノムワイド特性解析により、Ｙａｐ５ＳＡが遠位エンハンサーの開放と強力な有糸分裂遺伝子プログラムの発現を促進することが明らかになった。本明細書で明らかにされた、ＣＭ増殖を促進する遺伝子及びエンハンサーは、心臓再生の刺激に有用である。したがって、本開示の実施形態には、Ｈｉｐｐｏ経路を標的とすることによるものを含めた、心筋細胞の再生のための方法及び組成物を含む。特定の実施形態では、心筋細胞再生の必要性がある個体に、有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を提供する。ある特定の実施形態では、個体の望ましい場所で細胞を再生する方法があり、これには、有効量のＹａｐ突然変異体タンパク質（複数可）及び／またはＹａｐ突然変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチド（複数可）をその場所に送達するステップを含む。

【0030】

特定の実施形態では、治療有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に送達することにより、医学的病態を治療する方法がある。任意の医学的病態の少なくとも１つの症状を、１つ以上の突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）及び／またはそれをコードする核酸（複数可）を投与して改善することができる。

【0031】

本開示のある特定の実施形態は、治療有効量の１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を個体に提供することにより、個体において心筋細胞を再生する方法を含む。少なくともいくつかの場合、突然変異型変異体は、セリンに１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸置換を含むが、この置換はアラニンへの置換であってもなくてもよい。突然変異型Ｙａｐに他のセリン以外の突然変異が含まれていてもよい。ある特定の方法は、心筋細胞の再生を必要とする１つ以上の個体、例えば心臓に損傷があるか、または心臓への損傷リスクがある個体に実施することができる。個体は、心筋細胞の再生を必要とする損傷した心筋組織を有する場合がある。特定の実施形態では、１つ以上の突然変異型Ｙａｐタンパク質及び／またはそれをコードする核酸（複数可）の投与により、個体の既存の心筋細胞から心筋細胞の再生を生じさせる。

【0032】

本開示の実施形態は、例えば心筋の再生及び心筋の虚血性傷害の回復のための方法及び／または組成物を含む。特定の実施形態では、例えば急性虚血性傷害などの心臓病態を有していた哺乳動物の心臓に存在する成体心臓前駆細胞または心筋細胞の増殖を刺激する方法がある。ある特定の実施形態では、そのような方法は、１つ以上の突然変異型Ｙａｐ変異体を含む組成物を用いて、個体に実行される。

【0033】

本開示の実施形態は、１つ以上の心臓病態の治療及び／または予防に関連する方法及び／または組成物を対象とする。本開示の実施形態は、心筋組織などの筋組織を含む組織の再生に関連する。ある特定の実施形態は、心臓病態の逆転（またはその少なくとも１つの症状の改善）に関連し、心臓病態には、少なくとも心臓疾患、心筋症、心臓弁の問題、心膜炎、不整脈、心停止、先天性心障害、心不全、心疾患、心毒性、うっ血性心不全、虚血性心疾患、急性心筋梗塞、心房細動、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、高血圧性心疾患、及び不整脈が含まれる。冠動脈疾患（冠動脈性心疾患及び虚血性心疾患としても知られる）；心筋症（心筋の疾患）；心不全；肺性心；心律動異常；炎症性心疾患；心内膜炎；炎症性心肥大；心筋炎；心臓弁膜症；脳血管疾患；末梢動脈疾患；先天性心疾患；及びリウマチ性心疾患などの、特定の種類の心血管疾患を治療または予防することができる。特定的であるが例示的に示される本開示の実施形態には、少なくとも、１）うっ血性心不全；２）心室リモデリングまたは心筋梗塞の動脈瘤の予防；及び／または３）心筋症の用途を含む。具体的な実施形態では、本開示の方法及び組成物は、確定された心臓病態の逆転、または心臓病態の予防、または発症の遅延、または重症度の軽減に十分である心筋細胞の再生を提供する。

【0034】

心筋症の事例では、（アドリアマイシンのような）化学療法薬またはモノクローナル抗体などの薬剤によって病態が誘発される場合がある^{１０、１１}。心筋症は、虚血性または非虚血性の心筋症であり得る。心筋症は、長期の高血圧、心臓弁の問題、以前の心臓発作による心臓組織の損傷、慢性の高心拍数、代謝障害、栄養不良、妊娠、アルコール乱用、薬物乱用、化学療法薬、ウイルス感染、ヘモクロマトーシス、遺伝的病態、コレステロール値の上昇、肺高血圧症、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる場合がある。

【0035】

本開示の特定の態様は、組織内のある特定の細胞の増殖、細胞死（アポトーシス）の阻害、及び／または分化を目的とした、ある特定の組織へのＹａｐ突然変異体のポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはそれらの混合物の送達に関連する。組織はどの種類であってもよいが、具体的な事例では、心臓組織、網膜組織、または耳の有毛細胞を含む筋組織である。特定の実施形態では、本開示の方法及び組成物は、既存の成体心筋細胞の再生を可能にする。場合によっては、本発明の組成物（複数可）の送達により、病理学的リモデリングに対して細胞はより抵抗性になり、初期損傷以降のさらなる損傷が阻止される。

【0036】

本開示の実施形態には、細胞（心筋細胞を含む筋細胞など）及び／または組織（心臓組織を含む）の再生を刺激する１つ以上のＹａｐ突然変異体ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドの送達を含む。そのような実施形態の特定の態様は、１つ以上の心臓関連の医学的病態の逆転をもたらす。そのような実施形態のある特定の態様は、心臓関連の医学的病態、眼の医学的病態、または耳の医学的病態などの医学的病態の少なくとも１つの症状の改善をもたらす。

【0037】

具体的な実施形態では、Ｙａｐ突然変異体のポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはそれらの混合物は、例えば心臓組織などの筋組織を含めた、対象となる特定の組織を標的とする。

【0038】

場合によっては、本開示の方法及び組成物は、１つ以上の心臓関連の医学的病態の予防、または１つ以上の心臓関連の医学的病態の発症の遅延、または１つ以上の心臓関連の医学的病態の１つ以上の症状の程度の軽減のために使用される。特定の事例では、そのような予防、発症の遅延、または１つ以上の症状の程度の軽減は、心臓関連の医学的病態のリスクがある個体において起こる。例示的な危険因子には、年齢、性別（男性、ただし女性にも発生する）、高血圧、高血清コレステロール値、喫煙、過度のアルコール消費、糖消費、家族歴、肥満、運動不足、心理社会的要因、糖尿病（真性）、過体重、遺伝的素因、及び／または大気汚染への曝露のうち１つ以上が含まれる。

【0039】

治療される任意の個体は、成人、青年、小児、幼児であってよく、または子宮内で処置される場合もある。

【0040】

突然変異体Ｙａｐタンパク質（複数可）及び／またはそれをコードする核酸（複数可）の個体への送達は、全身的であっても局所的であってもよい。具体的な例では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質またはポリヌクレオチドの使用法に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の心筋細胞が個体に送達される。他の事例では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質またはポリヌクレオチドは心臓内にｉｎ ｖｉｖｏ送達される。これは、例えば、Ｙａｐを使用して、患者由来（または非患者由来）の人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（または胚性幹細胞由来の心筋細胞）を培養で拡張した後、患者に移植すること；またはＹａｐを使用して、幹細胞由来の心筋細胞を拡張した後、小分子駆動プロモーターを使用して患者に移植するか、もしくは幹細胞由来の心筋細胞に操作を加える他のＹａｐ誘導スキームを用いることにより機能させることができる。

【0041】

本明細書に包含される治療を受ける個体は、例えば心臓の医学的病態を含め、医学的病態と診断されていてもいなくてもよい。個体は、例えば以前の診断がなくても心臓の医学的病態を有する１つ以上の症状を示していてもいなくてもよい。

【0042】

ＩＩＩ．医薬製剤
本発明の医薬組成物は、有効量の１つ以上のＹａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド、または薬学的に許容される担体に溶解もしくは分散された追加薬剤を含む。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与したときに、副作用、アレルギー反応、または他の有害反応を生じさせない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのＹａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド、または追加活性成分を含有する医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５により例示されているように、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物（例えばヒト）投与の場合、製剤はＦＤＡ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要があるものと理解される。

【0043】

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、当業者に公知であろうような、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、同様の材料、及びそれらの組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９−１３２９を参照）。任意の従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。

【0044】

Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、固体、液体、またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、及び注射のような投与経路の場合に滅菌性である必要があるかどうかに応じて、種類の異なる担体を含み得る。本発明は、当業者に公知であろうような、静脈内に、皮内に、経皮に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所に、筋肉内に、皮下に、粘膜に、口腔に、局所に、局部に、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸漬させる局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えばリポソーム）で、または他の方法もしくは前述の任意の組み合わせにより投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照）。

【0045】

Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、遊離塩基、中性、または塩形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩には、酸付加塩、例えばタンパク質組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸のような有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩を、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。製剤化されると、溶液は投与製剤に適合する方法で、かつ治療に有効であるような量で投与される。製剤は、注射溶液、もしくは肺への送達のためのエアロゾルなどの非経口投与用に製剤化された剤形、または薬物放出カプセルなどのような栄養投与用に製剤化された剤形など、さまざまな剤形で容易に投与される。

【0046】

さらに、本発明によれば、投与に適した本発明の組成物は、不活性希釈剤を含むかまたは含まない薬学的に許容される担体で提供される。担体は吸収可能でなければならず、これには液体、半固体（すなわちペースト）、または固体の担体を含む。任意の従来の媒体、薬剤、希釈剤、または担体がレシピエントにとって、またはそこに含有される組成物の治療効果にとって有害である場合を除き、本発明の方法を実施する際に使用する投与可能な組成物におけるその使用は適切である。担体または希釈剤の例としては、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、充填剤など、またはそれらの組み合わせが挙げられる。組成物はまた、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために様々な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤及び抗真菌剤などの防腐剤によってもたらすことができ、これにはパラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。

【0047】

本開示によれば、組成物は、任意の便利なかつ実用的な方法、すなわち溶解、懸濁、乳化、混合、被包化、吸収などによって担体と混合される。そのような手順は、当業者には慣例となっている。

【0048】

本開示の具体的な実施形態では、組成物は、半固体担体または固体担体と混合されるか、または完全に混和される。混和は、粉砕などの任意の便利な方法で実施することができる。治療活性の損失、すなわち胃での変性から組成物を保護するために、混和プロセスに安定剤を加えることもできる。組成物に使用する安定剤の例として、緩衝液、グリシン及びリジンなどのアミノ酸、デキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物が挙げられる。

【0049】

さらなる実施形態では、本発明は、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド、１つ以上の脂質、及び水性溶媒を含む、医薬脂質ビヒクル組成物の使用に関連する場合がある。本明細書で使用される場合、用語「脂質」は、特性上、水に不溶性であり、有機溶媒で抽出可能である広範囲にわたる物質のいずれかを含むものと規定されることになる。この広範なクラスの化合物は当業者に周知されており、また用語「脂質」が本明細書で使用される場合、任意の特定の構造に限定されない。例として、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する化合物が挙げられる。脂質は、天然であっても合成（すなわち人間が設計または作製したもの）であってもよい。ただし、脂質は通常、生物学的物質である。生物学的脂質は当技術分野で周知されており、例えば中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、スルファチド、エーテル及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、ならびに重合可能な脂質、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。当然ながら、本明細書に具体的に記載されるもの以外の、当業者が脂質と認識している化合物も、本発明の組成物及び方法に包含される。

【0050】

当業者は、脂質ビヒクルに組成物を分散させるために使用できる技術の範囲を熟知しているであろう。例えば、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドを、脂質を含有する溶液に分散する、脂質で溶解する、脂質で乳化する、脂質と混和する、脂質と混合する、脂質と共有結合させる、脂質に懸濁液として含有する、ミセルもしくはリポソームと含有するもしくは複合体化する、またはそれ以外の当業者に公知の任意の手段により脂質もしくは脂質構造と会合することができる。分散により、リポソームが形成されてもされなくてもよい。

【0051】

動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、病態の重症度、治療される疾患の種類、過去または同時期の治療介入、患者の特発性疾患、及び投与経路などの物理的及び生理学的要因によって決定することができる。投与量及び投与経路に応じて、好ましい投与量及び／または有効量の投与回数を、対象の反応に従って変更してもよい。いずれの場合も、投与を担当する医師が、組成物中の活性成分（複数可）の濃度及び個々の対象の適切な用量（複数可）を決定することになる。

【0052】

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。他の実施形態では、活性化合物は、例えば単位重量の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、及びそれ以内で推論可能な任意の範囲を含み得る。必然的に、各治療上有用な組成物中の活性化合物（複数可）の量は、化合物の任意の所与の単位用量において適切な投与量が得られるような方法で調製することができる。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬理学的考慮事項は、そのような医薬製剤を調製する当業者が検討することになり、したがって様々な投与量及び治療レジメンが望ましい場合がある。

【0053】

他の非限定的な例において、用量はまた、投与あたり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重またはそれ以上、及びそれ以内で推論可能な任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から推論可能な範囲の非限定的な例では、上記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。

【0054】

Ａ．栄養組成物及び製剤
本発明の好ましい実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、栄養経路を介して投与されるように製剤化される。栄養経路には、組成物が消化管と直接接触する可能性のあるすべての投与経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物は、口腔、頬側、直腸、または舌下に投与することができる。したがって、これらの組成物は、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と製剤化することも、硬質または軟質のシェルゼラチンカプセルに封入することも、錠剤に圧縮することも、食事の食物とともに直接摂取することもできる。

【0055】

ある特定の実施形態では、活性化合物を賦形剤と混合して、経口摂取用錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる^{１２、１３}（米国特許第５，６４１，５１５号；同第５，５８０，５７９号及び同第５，７９２，４５１号。それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含有してもよい：例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそれらの組み合わせなどの結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、またはそれらの組み合わせなどの賦形剤；例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、またはそれらの組み合わせなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；例えばスクロース、ラクトース、サッカリン、またはそれらの組み合わせなどの甘味剤；例えばペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、オレンジ香料などの香味剤。投与単位剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加えて液体担体を含有してもよい。コーティング剤として、またはそれ以外で投与単位の物理的形態を変更する、他の様々な材料が存在していてもよい。例えば錠剤、丸剤、またはカプセルを、セラック、糖、またはその両方でコーティングしてもよい。剤形がカプセル剤である場合、上記の種類の材料に加えて液体担体などの担体を含有してもよい。ゼラチンカプセル、錠剤、または丸剤は腸溶性コーティングされていてもよい。腸溶性コーティングは、ｐＨが酸性である胃または上腸での組成物の変性を防止する。例えば米国特許第５，６２９，００１号を参照のこと。小腸に到達すると、小腸内の塩基性ｐＨによりコーティングが溶解されて、組成物が放出され、特殊な細胞、例えば腸管上皮細胞及びパイエル板Ｍ細胞による吸収が可能になる。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びチェリー香料またはオレンジ香料などの香味剤を含有してもよい。当然ながら、任意の投与単位剤形の調製に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用量において実質的に非毒性であるべきである。さらに活性化合物は、徐放性の調製物及び製剤に配合されていてもよい。

【0056】

経口投与の場合、その代わりに本発明の組成物は、洗口剤、歯磨剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与製剤の形態で１種以上の賦形剤と混合されていてもよい。例えば、洗口剤は、ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などの適切な溶媒に、必要量の活性成分を配合して調製することができる。あるいは、活性成分を、ホウ酸ナトリウム、グリセリン、及び重炭酸カリウムを含有するものなどの経口溶液に配合しても、または歯磨剤に分散させても、または水、結合剤、研磨剤、香味剤、発泡剤、及び湿潤剤を含み得る組成物に治療有効量で添加してもよい。あるいは、組成物を、舌下に置くか、またはその他の方法で口腔内で溶解できるような錠剤または溶液形態にしてもよい。

【0057】

他の栄養投与様式に適した追加の製剤として坐剤が挙げられる。坐剤は、直腸に挿入するためのさまざまな重量及び形状である、通常は薬用の固体剤形である。挿入後、坐剤は体腔液で軟化、融解、または溶解する。一般に、坐剤の場合の従来の担体には、例えばポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、坐剤は、例えば約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。

【0058】

Ｂ．非経口組成物及び製剤
さらなる実施形態では、Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドは、非経口経路を介して投与することができる。本明細書で使用される場合、用語「非経口」には、消化管を経由しない経路を含む。具体的には、本明細書に開示される医薬組成物は、例えば静脈内、皮内、筋肉内、動脈内、髄腔内、皮下、または腹腔内に投与できるが、これらに限定されない。米国特許第６，７５３７，５１４号、同第６，６１３，３０８号、同第５，４６６，４６８号、同第５，５４３，１５８号；同第５，６４１，５１５号；及び同第５，３９９，３６３号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）。

【0059】

遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、水中でヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混和して調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で分散液を調製することもできる。通常の保管条件及び使用条件下では、これらの調製物に微生物の増殖を防止する防腐剤が含有される。注射使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液、及び滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）。いかなる場合にも、形態は滅菌性でなければならず、注射しやすい程度に流動性でなければならない。形態は製造条件及び保管条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（すなわちグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び／または植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、必要な粒子サイズの維持（分散液の場合）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの、様々な抗菌剤及び抗真菌剤によってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンといった吸収遅延剤を組成物に使用することによりもたらすことができる。

【0060】

例えば水溶液での非経口投与の場合、必要に応じて溶液を適切に緩衝液処理し、液体希釈剤を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にする必要がある。このような特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用可能である滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者には公知であろう。例えば１回の投与量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解して、皮下注射液を追加するか、または予定する注入部位に注入することができる（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ページ１０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照）。必然的に、治療される対象の病態に応じて投与量に多少の変動が生じることになる。いずれの場合も、投与を担当する者が、個々の対象に適した用量を決定することになる。さらに、ヒト投与の場合、製剤はＦＤＡ生物基準局が要求する無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を満たす必要がある。

【0061】

滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分とともに適切な溶媒に配合した後、濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基礎分散媒と、上記に列挙したもののうち必要とされる他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに配合することにより調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の追加の目的成分である粉末を、それらの事前に滅菌濾過した溶液から得る真空乾燥及び凍結乾燥技術である。粉末化組成物は、安定剤の有無にかかわらず、例えば水または生理食塩水などの液体担体と混合される。

【0062】

Ｃ．多種多様な医薬組成物及び製剤
本発明の他の好ましい実施形態では、活性化合物Ｙａｐ突然変異体タンパク質及び／またはそれをコードするポリヌクレオチドを、例えば局所（すなわち経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣内など）、及び／または吸入といった多種多様な経路を介する投与用に製剤化することができる。

【0063】

局所投与用の医薬組成物には、軟膏、ペースト、クリーム、または粉末など、薬用塗布用に製剤化された活性化合物を含み得る。軟膏には、局所塗布用のあらゆる油性、吸着性、エマルジョン、及び水溶性ベースの組成物が含まれ、対してクリーム及びローションは、エマルジョン基剤のみを含むそのような組成物である。局所投与される医薬品には、皮膚からの活性成分の吸着を促進する浸透促進剤が含有される場合がある。好適な浸透促進剤として、グリセリン、アルコール、アルキルメチルスルホキシド、ピロリドン、及びラウロカプラムが挙げられる。局所塗布用の組成物の可能な基剤として、ポリエチレングリコール、ラノリン、コールドクリーム、及びワセリン、ならびに任意の他の好適な吸収性、エマルジョン、または水溶性の軟膏基剤が挙げられる。局所製剤はまた、活性成分を保存し、均一な混合物を提供するために必要とされる乳化剤、ゲル化剤、及び抗菌性防腐剤を含んでもよい。本発明の経皮投与は、「パッチ」の使用も含み得る。例えばパッチは、１つ以上の活性物質を所定の速度で、かつ一定期間にわたって持続的に供給することができる。

【0064】

ある特定の実施形態では、医薬組成物は、点眼剤、鼻腔内スプレー、吸入剤、及び／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達される場合がある。経鼻エアロゾルスプレーによる組成物の肺への直接送達方法は、例えば米国特許第５，７５６，３５３号及び同第５，８０４，２１２号（それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂^１４及びリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）を使用した薬物の送達もまた製薬業界では周知されている。同様に、ポリテトラフルオロエチレン担持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達が、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。

【0065】

エアロゾルという用語は、微粉化固体の液体粒子が液化ガスまたは加圧ガス噴射剤中に分散されたコロイド系を指す。吸入用の本発明の典型的なエアロゾルは、液体噴射剤中または液体噴射剤と好適な溶媒との混合物中の活性成分の懸濁液からなる。好適な噴射剤として、炭化水素及び炭化水素エーテルが挙げられる。好適な容器は、噴射剤の加圧要件に応じて異なることになる。エアロゾルの投与は、対象の年齢、体重、ならびに症状の重症度及び反応に応じて異なることになる。

【0066】

ＩＶ．本開示のキット
本明細書に記載のいずれの組成物も、キットに含むことができる。非限定的な例において、突然変異体Ｙａｐポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド（またはその生成のためのオリゴヌクレオチド）をキットに含むことができる。

【0067】

水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでキットの成分をパッケージ化してもよい。キットの収容手段には一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の収容手段を含み、その中に成分を入れることができ、好ましくは好適にアリコートできるものである。キットに複数の成分が存在する場合、キットは一般に、追加成分を個別に入れることができる第２、第３、または他の追加容器も含むことになる。ただし、１つのバイアルに成分の様々な組み合わせが含まれる場合がある。本開示のキットはまた、典型的には、市販用に厳重に密閉して１つ以上の組成物を収容するための手段を含むと考えられる。そのような容器には、その中に目的とするバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。

【0068】

組成物は注射可能な組成物に製剤化される場合がある。その場合、収容手段はそれ自体が注射器、ピペット、及び／または他の同様の器具であり得、そこから製剤を身体の感染領域に適用する、動物に注射する、及び／またはさらにキットの他の成分に加える及び／またはそれと混合することもできる。ただし、キットの成分が乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬及び／または成分が乾燥粉末として提供される場合、好適な溶媒の添加により粉末を再構成することができる。溶媒を別の収容手段で提供することも想定される。

【0069】

本開示のキットはまた、典型的には、市販用に厳重に密閉したバイアルを収容するための手段を含むと考えられ、例えば、その中に目的とするバイアルが保持される、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器などである。

【0070】

特定の実施形態では、キットは、個体が心臓関連の医学的病態を有することを判断するための試薬及び／またはツールを含む。いくつかの実施形態では、キットは、心臓関連の医学的病態の１つ以上の追加療法、例えばＡＣＥ阻害剤、アルドステロン阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬（ＡＲＢ）；ベータ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール低下薬、ジゴキシン、利尿薬、強心剤療法、カリウム、マグネシウム、血管拡張剤、抗凝固薬、アスピリン、及びそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

【実施例】

【0071】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために記載する。以下に示す実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって発見された技術を代表するものであり、したがってその実施にとって好ましい形態を構成するとみなし得ることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な実施形態に多数の変更を加えることができ、それでもなお本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができるものと理解されたい。

【0072】

（実施例１）
（優性活性型ＹＡＰはクロマチンアクセシビリティ及び心筋細胞の再生を誘発する）
ＹａｐＳ１２７Ａ突然変異がＬａｔｓ依存性Ｙａｐ阻害をすべて説明できるわけではないことを特性から明らかにし、かつＨｉｐｐｏ活性をもたない心臓をモデリングするために、５つすべてのＬａｔｓ１／２リン酸化部位をＡに突然変異させたＹａｐ５ＳＡを条件付きで過剰発現するトランスジェニックマウス系統を作製した^８。

【0073】

ＣＡＧ駆動型誘導性Ｙａｐ５ＳＡ導入遺伝子には、ＬｏｘＰに挟まれたＳＴＯＰとｅＧＦＰがあり、その後ろにＦｌａｇタグ付きＹａｐ５ＳＡ及びＩＲＥＳ ＬａｃＺを含んでいた（図１Ａ）。この導入遺伝子は、組換え前の胚及び出生後の心臓にｅＧＦＰ発現を誘導した（図１Ｂ、図１Ｃ）。本発明者らは、Ｙａｐ５ＳＡマウスをタモキシフェン誘導性心筋細胞特異的ＣｒｅドライバーであるαＭｙＨＣ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２（図１Ｄ）^１５と交配させて、Ｙａｐ５ＳＡ過剰発現（ＯＥ）マウスを作製した。タモキシフェンを４日間連続して注入（４０μｇ／ｇ）することにより、成体ＣＭに組換えを誘導した。成体心臓抽出物に対するウェスタンブロットは、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓においてＹａｐレベルが５倍に増加することを示した（図１Ｄ）。免疫蛍光試験により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのサイトゾルに対するＹａｐの核濃縮は２．５倍であることが明らかになった。対照ＣＭは、サイトゾルと核の両方にＹａｐを発現した（図１Ｅ）。

【0074】

Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスは、最後のタモキシフェン注射の７２時間後に死亡した（図２Ａ）。組織学により、左心室壁の厚さが増加するとともに、左心室腔が筋肉でほぼ閉塞されていることが明らかになった（図２Ｂ）。タモキシフェンの注入前と注入から１日後の心エコー検査では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の心室壁の肥厚、心腔サイズの縮小、及び駆出率の増加を示した（図２Ｃ〜２Ｊ及び複数の動画）。この表現型は、タモキシフェン後の対照αＭＨＣ−ｍｅｒＣｒｅｍｅｒマウスにおける心毒性心室拡張とは対照的である^１６。

【0075】

不整脈を監視するために、遠隔測定装置を同腹子対照及びＹａｐ５ＳＡＯＥマウスに埋め込んだ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスでは不整脈の検出はなく、むしろ試験したすべてのαＭｙＨＣ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスに観察されたタモキシフェン誘発性不整脈（Ｔ波逆転）を防いだ（図５Ａ、５Ｂ；ｎ＝３）。さらに、コネキシン４３免疫蛍光（図５Ｃ）によって示されるように、Ｙａｐ５ＳＡを発現する（β−ガラクトシダーゼ陽性）心筋細胞はギャップジャンクションによって対照ＣＭと結合しており、Ｙａｐ５ＳＡを発現するＣＭが野生型ＣＭと電気的に結合することが示唆された。最後のタモキシフェン注射の２４時間後に心筋細胞を単離し、個々の細胞レベルでＣＭの収縮性を調べた。タモキシフェン投与対照ＣＭと比較して、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは小さかったが、安静時サルコメア長及び電場刺激に対する収縮性は同様であった（図３Ａ、図５Ｄ）。

【0076】

立体解析によってＣＭ数を決定するために、拡張期に固定した心臓を、タモキシフェン注射の２日後に、心尖から大動脈へ７μｍ刻みで切片化し、本発明者らが自ら、左心室面積を異なる組織深度で測定した。左心室面積を心臓内の位置の関数としてプロットし、曲線下面積を積分することにより、基準となる左心室の容積を算出した。ＣＭを明確に識別することは困難な可能性があるため、本発明者らは中心体周辺物質１（ＰＣＭ−１）マーカーを使用して、左心室のＣＭ核を識別した^１。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの心臓は、対照の心臓と比較して、左心室壁面積が増加し、心筋の容積が増加し、心腔の容積が減少した（図３Ｂ〜３Ｄ）。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓は、体重に対する左心室の重量比も増加した（図３Ｅ）。

【0077】

左心室ＣＭの総数を評価するために、本発明者らは、ＰＣＭ−１陽性ＣＭ核の密度を、対照（７２，１００＋／−２３００ＣＭ核／ｍｍ^３）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓（７０，６００＋／−１３００ＣＭ核／ｍｍ^３）において算出した^１、１７。ＣＭ核の密度は、Ａｌｋａｓｓらの最近のマウス立体解析データと一致していた（図１Ｂを参照^１７）。ＣＭ数を得るために、本発明者らは、ＣＭ密度に総心臓容積を乗じ、ＣＭの核形成について補正した（以下を参照）^１、１７。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥの左心室は、対照と比較してＣＭ数が大幅に増加した（対照：１，８８０，０００＋／−７８，０００対Ｙａｐ５ＳＡ：２，６８０，０００＋／−５４，０００；分散分析とＢｏｎｆｅｒｏｎｉの事後分析ｐ＜．０００１；図３Ｆ）。対照のＣＭ数データも以前に公開されたマウスのデータと一致している^１８。

【0078】

フローサイトメトリーにより、単離されたＰＣＭ−１陽性ＣＭ核のＤＮＡ含量を定量化すると、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭは４Ｎ核でわずかな増加を示したが、４Ｎを超える核に有糸分裂カタストロフのモデル^１９で見られるようなＤＮＡ含量の増加はなかった（図６）。Ｇ２／Ｍの２倍体細胞は、４Ｎ ＤＮＡ含量が４倍体細胞と同じであるため、Ｙａｐ５ＳＡの４Ｎ核の増加が高倍数化ではなく正常な細胞周期進行によることをデータは示唆している^２０。単離したＣＭでＣＭ核の数を測定したところ、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓において単核ＣＭの増加はあったが、二核ＣＭに変化はなかった（図３Ｇ）。また、Ｙａｐ５ＳＡ心臓では、核が４つのＣＭの比率が減少しており、非生産的な核分裂が少ないことを示唆した（図３Ｇ）。

【0079】

本発明者らは、Ｙａｐ５ＳＡ誘導後の２日間に、ＥｄＵを飲料水で適宜供給して、単離ＣＭのＥｄＵを染色し、非損傷成体ＣＭにおけるＳ期進入を試験した（図３Ｈ）。以前の観察と同様に、非損傷対照ＣＭへのＥｄＵの取り込みは検出されなかった（図３Ｈ）^２。対照的に、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのうち約１６％はＥｄＵ陽性であった（図３Ｈ）。さらに、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭは有糸分裂マーカーを発現し、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭの約１１％がＡｕｒｋｂ陽性、６％がＰＨＨ３陽性であった（図３Ｉ〜３Ｊ）。ＣＭの倍加時間（ｔ_Ｄ）を算出するために、１回の低用量タモキシフェンで低頻度の組換えを誘導し、異なる時点でＬａｃＺ陽性ＣＭを計数した。本発明者らは、対数式に変換した後、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭでは、ｔ_Ｄが１．３７日であることを見出した（図３Ｋ）。重要な点として、Ｙａｐ５ＳＡはＣＭアポトーシスまたは間質性線維症を誘発しなかった（図７、図８）。合わせて、データによると、Ｙａｐ５ＳＡは新しいＣＭの発生とともに成体ＣＭの増殖を誘発することを示している。

【0080】

成体ＣＭ再生に関連してＹａｐ５ＳＡ標的遺伝子に対する考察を得るために、タモキシフェン注射の４８時間後にＣＭ特異的核のＲＮＡ−ｓｅｑを実施した^{２１、２２}。Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて、合計１，３５２個の遺伝子が大幅に上方制御され、７４８個が下方制御された（調整ｐ値＜０．０１）（図４Ａ、図９）。無作為の遺伝子オントロジー分析により、遺伝子発現の変化が増殖性ＣＭ表現型と一致することが明らかになった（図１０Ａ）。上方制御された転写産物には、セントロメア遺伝子Ｃｅｎｐｅ及びＣｅｎｐｆ、ならびにサイクリンＣｃｎｄ１及びＣｃｎａ２が含まれていた。他の遺伝子には、細胞骨格のリモデリング及び細胞増殖を促進する、Ｒｈｏファミリーのグアニンヌクレオチド交換因子であるＤｏｃｋ２が含まれていた^２３。下方制御された遺伝子には、分化したＣＭ表現型の特徴であるミオシン及びイオンチャネルをコードする遺伝子が含まれていた（図１０Ｂ）。興味深いことに、Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭで最も顕著に増加した転写産物の１つであった（図１１）。コアＨｉｐｐｏ経路遺伝子Ｌａｔｓ２及びＫｉｂｒａ（Ｗｗｃ１）は、Ｙａｐ阻害因子Ｃｒｂ２、Ａｍｏｔ、及びＶｇｌｌ２〜４をコードする遺伝子と同様に上方制御された（図１０Ｂ、図１１）。

【0081】

Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭのクロマチンランドスケープを調べるために、ＰＣＭ−１単離ＣＭ核で、トランスポザーゼの接近可能なクロマチン（ＡＴＡＣ）−ｓｅｑについてアッセイを実施した^２４。合計して、Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて１６，１８９個のピークがアクセシビリティの増加を示したが、対照ＣＭと比較してＡＴＡＣピークは１３，３５３個減少した（図４Ａ、図９）。ｄｅ ｎｏｖｏモチーフの発見により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭにおいて、新たに明らかになったＡＴＡＣピークのうち上位３つの濃縮モチーフすべてが、周知のＹａｐインタラクター^２５である転写因子ＴＥＡＤ（図４Ｂ）に属していることが明らかになった。他の濃縮モチーフは、以前のＹａｐ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと一致するＡＰ−１要素と、病理学的心臓リモデリングを防止する役割を有するＡｔｆ３であった^{２６〜２８}。Ｎｕｃｌｅｏ−ＡＴＡＣアルゴリズムを適用して、ＴＥＡＤ ＤＮＡ結合モチーフに対するクロマチンの開放状態を示し、ＴＥＡＤモチーフでのヌクレオソームの除去を見出した。これは転写因子占有率の増加と一致していた^２９（図４Ｂ）。

【0082】

遺伝子間ＡＴＡＣピークを、直近の転写開始部位（ＴＳＳ）に対してプロットすると、対照とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭ両方においてプロモーター領域（ＴＳＳから１ｋｂ未満）及び遠位遺伝子座（１０ｋｂ超）で構成される二峰性分布があった（図１２Ａ）。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭにおいて、上方制御された、新たに接近可能なＡＴＡＣのピーク（調整ｐ値＜１ｅ−５）は、推定エンハンサー内の主に遠位に位置していた^２４。同様に、活発に転写される遺伝子にマップするＡＴＡＣピークも遠位領域に濃縮された（図４Ｃ、図１２Ｂ）。以前の研究により、Ｙａｐ−Ｔｅａｄ結合部位は、活性クロマチンのマーカーであるＨ３Ｋ２７Ａｃに濃縮されることが明らかになった^５。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータと、発達中及び成体の心臓からの既存のＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータとの比較により、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭからのＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０３５）が胚Ｈ３Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮されていることが明らかになった。対照的に、対照ＣＭからのＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整ｐ値≦０．０３５）は、成体Ｈ３Ｋ２７Ａｃクロマチンマークに濃縮を示した^３０（図４Ｄ）。これらのデータは、Ｙａｐ５ＳＡが発生促進因子に対するクロマチンアクセシビリティを促進したことを示唆している。

【0083】

Ｙａｐ５ＳＡ Ｆｌａｇエピトープに対する抗体を使用してＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施し、Ｙａｐ５ＳＡ結合クロマチンを沈降させた。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータと一貫して、Ｙａｐ５ＳＡのＣｈＩＰ−ｓｅｑにより、Ｙａｐ５ＳＡが約６．３対１の比で遠位エンハンサー領域に優先的に結合したことが明らかになった（図４Ｃ）^{２６、３１}。Ｙａｐはまた、接近可能なプロモーターと結合し、通常はサイレントな遺伝子の転写を正に制御した^３１。

【0084】

Ｙａｐ５ＳＡ ＣＭにおいて転写的に上方制御された遺伝子をＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと比較すると、１７３個の遺伝子がＹａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子であった。Ｙａｐ５ＳＡの直接標的遺伝子座のうち、７６個の遺伝子座はまた、ＡＴＡＣ−ｓｅｑによって決定されたようにクロマチンアクセシビリティが増加したが、他のＹａｐ５ＳＡ標的遺伝子座はオープンクロマチンシグネチャーを既に有していた（図４Ｅ、図１３Ａ）。各遺伝子のＴＳＳを中心とした周辺１ｋｂ域のＲＮＡ−ｓｅｑとＡＴＡＣ−ｓｅｑ両方の平均断片深度をプロットして、これらの遺伝子座での高いプロモーターアクセシビリティ及び転写増加のパターンを明らかにした（図１３Ｃ）。

【0085】

Ｙａｐ５ＳＡによって直接制御される７６個の遺伝子の中にはＨｉｐｐｏ経路の構成要素があり、これはＹａｐが負のフィードバックループを直接活性化してＣＭの増殖を妨げることを示している（図４Ｇ、図１１Ａ〜１１Ｂ）。Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子は、Ｌａｔｓ２、Ｖｇｌｌ２、Ｖｇｌｌ３、及びＷｗｃ１を含んでいた^８、３２（図４Ｆ；図１３Ａ）。ウェスタンブロットにより、内因性の低分子量Ｙａｐが、Ｈｉｐｐｏ活性の上方制御を示す、セリン１１２のリン酸化を増加させたことが明らかになった（図１１）。Ｙａｐ５ＳＡが直接制御する他の遺伝子には、Ｐｋｃｉなどの有糸分裂及び細胞質分裂遺伝子を含んでいた^３３。接近可能なＹａｐ５ＳＡ標的の主要カテゴリーは、エンドソーム選別構成要素をコードする遺伝子であった。このカテゴリーには、レトロマー構成要素をコードするＳｎｘ２、Ｓｎｘ７を含んでいた。エンドサイトーシスアダプタータンパク質をコードするＤａｂ２はＷｎｔ阻害因子として機能するが、Ｗｎｔリガンドのエンドソーム輸送にはＷｌｓが不可欠である^{３４、３５}（図１３Ａ１〜１３Ａ３、図１３Ｂ）。

【0086】

Ｎｅｃｔｉｎ１、Ｐｌｅｋｈａ７、Ｍｔｓｓ１、及びＣｔｎｎｄ１などの、アドヘレンスジャンクションのアセンブリを促進する遺伝子もＹａｐ５ＳＡの接近可能な標的であり、新しいＣＭが機能的に心臓に統合されるという知見をさらに裏づけた^３６。アクチン細胞骨格を制御する複数の遺伝子も、Ｙａｐ５ＳＡの接近可能な標的に見いだされた。Ｅｐｈｅｘｉｎ及びＰａｋ３は、Ｒｈｏ活性の増強にとって重要なタンパク質をコードする。他の遺伝子は、コードアクチン核形成因子をコードするＣｏｂｌ、及び創傷治癒中のストレスファイバーの形成に重要であるＣｎｎ３などである（図１３Ａ１〜１３Ａ３、図１３Ｂ）。

【0087】

図１４Ｃに、細胞周期に直接関与する、Ｙａｐ５ＳＡによって差次的に制御される遺伝子をまとめるとともに、成体の心筋細胞での細胞周期の開始について記述された、または試みられた以前の文献をまとめる。キー（記号）は、ＲＮＡ−ｓｅｑによって決定される、Ｙａｐ５ＳＡ心筋細胞で差次的に上方または下方に制御される遺伝子；Ｙａｐ５ＳＡクロマチン免疫沈降と、それに続くシーケンシングによって決定されるＹａｐ５ＳＡの直接的な標的である遺伝子（すなわちＣｈＩＰ−ｓｅｑ（＋））；及びトランスポザーゼが接近可能なクロマチンについてのアッセイで決定される、対照の心筋細胞ではエピジェネティックに抑制されたが、Ｙａｐ５ＳＡの存在下では抑制されない遺伝子（すなわち、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ（上方））を示す。

【0088】

この知見は、分化したＣＭの増殖能力が、遠位制御要素の除去によって効果的に妨害されることを明らかにしている。Ｙａｐ５ＳＡを過剰発現させることにより、Ｙａｐが有糸分裂を介した進行を促進する遺伝的プログラムを活性化できることを確認した。重要な点として、Ｙａｐ５ＳＡ標的遺伝子には、細胞周期遺伝子が含まれるが、生産的な細胞分裂に重要であるエンドソーム選別タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

【0089】

本発明者らによって作成された動画は、タモキシフェン投与前のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓、ならびに同じ心臓であるがタモキシフェン投与の１日後及び４日後の短軸Ｂモード心エコー検査を示す。また、動画は、最後のタモキシフェン投与の２日後、及びその動物が死亡する２４時間前の、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の短軸Ｂモード心エコー検査を示している。心室腔は縮小した。タモキシフェン前のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓、ならびに同じ心臓であるがタモキシフェン２日後、及びさらに５日後の長軸Ｂモード心エコー検査。心筋層の肥厚が明らかであった。

【0090】

（補足資料）
（材料及び方法）
（実験用動物）
マウス試験は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設内動物管理使用委員会に従って実施された。本発明者らは、例として、Ｋｕｎｌｉａｎｇ Ｇｕａｎ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２７３７１）由来のｐＣＭＶ−ｆｌａｇ ＹＡＰ２ ５ＳＡを利用して、ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ｅＧＦＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＩＲＥＳ−βＧａｌ発現構築物にクローニングした。この構築物は、５つの標準的なＬａｔｓ依存性リン酸化モチーフに、アラニンに変異された８つのセリン残基（Ｓ６１Ａ、Ｓ１０９Ａ、Ｓ１２７Ａ、Ｓ１２８Ａ、Ｓ１３１Ａ、Ｓ１６３Ａ、Ｓ１６４Ａ、Ｓ３８１Ａ）をもつヒトＹａｐ変異体をコードする。導入遺伝子をコードする線状ＤＮＡ（図１Ａ）をＦＶＢ／Ｎマウス由来受精卵母細胞へ前核注入した後、これを偽妊娠ＩＣＲマウスに移植することで、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ（Ｔｇ（Ｊｏｊｏ−Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭ）マウスを作製した。Ｃ５７Ｂ１／６のバックグラウンドが保持された、ホモ接合αＭｙＨＣ−Ｃｒｅ−ＥＲＴ２マウスと単交配を実施した。対照動物はすべて同腹仔または同齢の同胞であった。尾部皮膚におけるｅＧＦＰ発現、及びＰＣＲジェノタイピングの両方により、視覚的に遺伝子型を決定した（Ｆ：ＡＡＧＣＣＴＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＴＴＡＧ（配列番号５）、Ｒ：ＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＣ；配列番号６）。成体実験はすべて、７〜１０週齢の雌雄マウスで実施した。Ｃｒｅのタモキシフェン誘導は、Ｈｅａｌｌｅｎらによる以前の刊行物と同様に、腹腔内注射（４０ｍｇ／ｋｇ）、４日間毎日^４）で行った。

【0091】

（超音波心エコー検査）
Ｍモード及びＢモード心エコー検査は、ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ ７７０システムの３０ＭＨｘスキャンヘッド（ＲＭＶ７００７Ｂ）を使用して、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｏｒｅの確立されたプロトコルに従って実施した。

【0092】

（１細胞の形態学的及び生理学的測定）
４回目のタモキシフェン注射の翌日、他の箇所に記載されているような、コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）の逆行性灌流により心筋細胞を単離した^３７。細胞の一部を固定し（１０％ホルマリン、１０分）、細胞サイズを定量化した。この定量化は、プレーティングした細胞の静止画像を撮影して（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ ＤＳＦｉ１カメラに装備）、これをｉｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）でアウトライン処理し、ＣＭ ２Ｄプロファイル領域を定量化することにより行った。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。ＩｏｎＯｐｔｉｘ Ｍｙｏｃｙｔｅ Ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して、生理学的ライブイメージングを実施した。１．８ｍＭ Ｃａ^２＋を含有するタイロード溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝処理、ｐＨ７．４）中で心筋細胞を平板培養し、（組換え後）ＧＦＰが非存在または最小であるものを選別し、ＭｙｏＰａｃｅｒ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ，Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用して２０Ｖ／ｃｍで電界刺激した。２分間、１Ｈｚのペーシングプロトコルの最後２０秒間、Ｉｏｎｏｐｔｉｘ ＩｏｎＷｉｚａｒｄソフトウェアを使用してサルコメア周期のフーリエ変換によりサルコメアの短縮を定量化した。

【0093】

（光学マッピング）
マウスをイソフルランで麻酔して手術レベルの麻酔下にし、ヘパリンを腹腔内に注射（１００単位）した後、頸部を脱臼する。次に、心臓を摘出し、酸素添加した（９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）冷タイロード溶液で洗浄した。次に、大動脈に２１ゲージのカニューレを挿入した。カニューレ挿入後、大動脈圧を８０〜１２０ｍｍＨｇに維持して、心臓にタイロード溶液を逆行性に灌流させた。電極（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）を右心房の表面に配置し、ＰｏｗｅｒＬａｂ ２６Ｔ（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって生成されたペーシング刺激（１０Ｈｚ、１２Ｈｚ、及び１４Ｈｚ）を与えた。収縮アーチファクトを除去するために、心臓にブレビスタチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂ０５６０−５ｍｇ、ＤＭＳＯ中２．５ｍｇ／ｍｌを５０ｕｌ）を供給した。次に本発明者らは、電圧感受性色素であるジ−４−ＡＮＥＰＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄ−１１９９、ＤＭＳＯ中２．５ｍｇ／ｍｌを２０ｕｌ）で心臓を灌流した。励起にはＬＥＤライトを使用した（波長：５３０ｎｍ）。Ｖｍを示す蛍光発光をロングパスフィルターで処理し（＞５９０ｎｍ、５９０ＦＧ０５−５０、Ａｎｄｏｖｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｆｉｌｔｅｒ）、ＭｉＣＡＭＯ ＣＭＯＳカメラ（ＳｃｉＭｅｄｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。実験中、ＬａｂＣｈａｒｔを使用して体表面ＥＣＧ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をモニターした。伝導速度及び活性化マップをＲｈｙｔｈｍソフトウェアで算出した^３８。

【0094】

（組織学、免疫蛍光、凍結切片、及びＥｄＵイメージング）
新たに摘出した胚及び出生後心臓を、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＣａｍ Ｈｒｃを搭載したＺｅｉｓｓ ＳｔｅＲＥＯ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．Ｖ１２で内因性蛍光について解析し、画像化した。固定のため、心停止用の２０ｍＭ ＫＣｌ−ＰＢＳで心臓を逆行性に灌流した後、１０％中性緩衝ホルマリンを灌流させ、その後パラフィンで包埋した。７ミクロンの横断切片に切断し、帯電したポリリジンスライド（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ ＵｌｔｒａＣｌｅａｒ Ｐｌｕｓ、白色つや消し加工）にマウントした。一部はマッソンのトリクローム染色で染色し、一部はピクロシリウスレッドで染色した。免疫組織化学は、最初に切片を脱パラフィンし、再水和した後、抗原賦活化して実施した。切片をブロッキング（ＰＢＳ中１０％ロバ血清、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０）し、さらに一晩（個別、順次）染色した後、イメージングした（一次：抗ＣＸ４３、Ｓｉｇｍａウサギ１：２００；抗β−ｇａｌ、Ａｂｃａｍニワトリ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲートＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。核はＤＡＰＩで染色した。ＤｅａｄＥｎｄ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、パラフィン包埋組織にＴＵＮＥＬ染色を実施した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＯｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｏｒｓｃｏｐｙ ｃｏｒｅにて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。

【0095】

凍結切片を切断する際は、心臓を抽出して、３０％スクロース、２０ｍＭ ＫＣｌ−ＰＢＳで灌流し、次いでＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物に入れた後、ドライアイスで凍結した。次に１６ミクロンの切片を切り出し、スライドガラスにマウントした。免疫蛍光染色の際は、切片を４２℃に温めてから−２０℃のアセトン中に２０分間静置した後、ロバ血清でブロッキングすることにより抗原賦活化を実施し、次に、一次抗体（ＰＨＨ３、ウサギＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎ１：４００；ＡｕｒｏｒａＢ、ウサギＡｂｃａｍ１：２００；ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）と４℃で一晩、続いて、二次（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ；抗マウスＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓビオチン化１：２００、続いてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ）抗体と室温にて３０分間、インキュベートした。核はＤＡＰＩで染色した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。イメージングはすべて、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＯｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｖｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｃｏｒｅにて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。

【0096】

免疫細胞化学法標準プロトコルを用いて実施した。簡潔には、ランゲンドルフ摘出ＣＭを１０％ホルマリン中で室温にて１０分間固定した。０．５％トリトン−１００で２０分間透過処理し、２％ＦＢＳ及び２％ＢＳＡでブロッキングした後、抗体を一晩（個別、順次）インキュベートしてからイメージングした（抗Ｙａｐ、ウサギＮｏｖｕｓ１：２００、ｃＴｎＴ、マウスＴｈｅｒｍｏ１：２００）（二次：標準的な蛍光色素コンジュゲートＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗体）。ＥｄＵ染色は、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｌｉｃｋ−ｉｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７イメージングキット（Ｃ１０３４０）によるＣｌｉｃｋ−ｉｔテクノロジーを用いて実施した。個々の心筋細胞に存在する実際のＥｄＵは、共焦点ｚスタックによって決定した。ＤＡＰＩで染色し、共焦点Ｚスタックにより細胞あたりの核の数を計数することにより、この単離した心筋細胞の核数を定量化した。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。イメージングはすべて、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７８０共焦点顕微鏡で実施した。

【0097】

（ウェスタンブロッティング）
ＨＥＰＥＳ、ＥＤＴＡ、トリトン緩衝液中の心臓をビーズでホモジナイズして、ウェスタンブロッティングを実施した。次に、溶解物に還元ｔｒｉｓ系ＳＤＳ試料緩衝液（８０μｇ／ウェル）を充填し、ＰＶＤＡ膜に転写し、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用してイメージングした。一次抗体：Ｎｏｖｕｓウサギ抗Ｙａｐ（１：１０００）；Ｓｉｇｍａマウス抗Ｍ２ｆｌａｇ（１：１０００）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマウス抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００）；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ抗Ｐ−Ｙａｐ（Ｓ１２７−マウスホモログＳ１１２））、（１：１０００）。Ｌｉ−Ｃｏｒ蛍光二次抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０００）。定量化はＦｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）のゲル分析機能を使用して実施した。

【0098】

（ｉｎ ｖｉｖｏ電気生理学）
以前に記載されたように^３９、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ誘導プロトコルにわたる５日間、連続して心電図を記録した。歩行可能なマウスの腹腔に遠隔測定送信機（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を埋め込んだ。ｓ．ｃ．電極をリード線ＩＩ配置に取り付け、バージョン４．１のＤａｔａｑｕｅｓｔソフトウェアを使用して記録した。Ｔ波測定は、曲線下面積を算出することにより実施した。

【0099】

（ＬＶサイズ及び筋細胞の総数の定量化）
左心室の心筋細胞の総数を決定するにあたり、本発明者らは、最初に心臓を切除し、それをＫＣｌ、続いて１０％ホルマリンでの逆行性灌流、さらに１０％ホルマリンで滴下固定して、拡張期に固定した。心臓をパラフィンで包埋し、心尖から大動脈へ７ミクロン刻みで切片化した。次に本発明者らは、顕微鏡スライド上のＬＶ心筋層の面積を組織深度の関数としてプロットし、さらに次いでその曲線下面積を積分することにより、各心臓の左心室の容積を算出した。その容積から、１．０５３ｇ／ｍＬの筋肉密度を用いて容積を質量に変換することにより、ＬＶ重量と体重との比を算出した^４０。次に、さまざまな組織深度の７ミクロン切片を抗ＰＣＭ１、ＤＡＰＩ、及びＷＧＡで染色して、ＣＭ核、すべての核、及び細胞境界を標識した。共焦点顕微鏡を使用して各切片の厚さ全体にわたり画像化した後、本発明者らがイメージングフレーム内のＰＣＭ１（＋）核の数を計数した。フレームの下端と左端の部分核は計数しなかったが、上端と右端の部分核は計数した。Ｚスタックは、異なる組織深度から得た切片にわたってランダムに取得した（４０Ｚスタック／心臓）。ＰＣＭ１とＤＡＰＩの両方が陽性であり、ＰＣＭ１がＤＡＰＩを包囲している場合のみ、核を計数した（図３Ｆ）。ＣＭの総数を検出するため、容積あたりの計数された核の数から、核形成密度を算出し、さらにこれを心筋層の全体容積に外挿し、次に、他の箇所に記載するように、各遺伝子型の筋細胞の平均核形成で補正した（対照：２．０４核／ＣＭ；Ｙａｐ５ＳＡ：１．９２核／ＣＭ、図３Ｇ）^４１。画像を定量化する者には、遺伝子型を知らせなかった。

【0100】

（フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析）
心筋細胞をランゲンドルフ灌流により単離した後、１０％ホルマリンで固定した。以前に記載されたように核を単離した^４２。細胞を懸濁し、ＨＢ緩衝液（ｐＨ７．４ １５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．３４Ｍスクロース、１５ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭ ＫＣｌ、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭ ＥＧＴＡ、プロテイナーゼ阻害剤を含む）中で、３０回ダウンス型でホモジナイズした。次に、ＰＢＴＢ緩衝液（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ）中で、１８−Ｇ針により１５回穿刺して核を放出させた。ＣＭ特異的核を標識するため、核をＰＣＭ１抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ；二次：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａｌｅｘａ抗ウサギ５４６）とインキュベートし、ＤＮＡをＤＡＰＩで標識した。次に、核をセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＡＲＩＡ ＩＩ ＳＯＲＰ）に通し、ＰＣＭ１（＋）心筋細胞核のＤＮＡ含量をＤＡＰＩ蛍光強度として定量化し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して細胞周期段階について分析した。

【0101】

（ＬａｃＺレポーター倍加時間分析）
心臓を摘出し、２０ｍＭ ＫＣｌ中２０％グリセロールで灌流し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物に包埋し、ドライアイスで凍結した。次に、それらを１６μｍの切片に切断し、ＰＢＳ中０．０２％グルタルアルデヒドで１５分間固定した。ｘ−ｇａｌとの反応を３７℃で４８時間進行させた。

【0102】

細胞分裂により生じる細胞数は、Ｎ（ｔ）＝Ｎ_０２^{２ｔ／ｔＤ}で表すことができる。ここで、Ｎ（ｔ）は所与の時点での細胞数であり、Ｎ_０は開始時の細胞数であり、ｔはＮ_０からＮ（ｔ）に移行するまでに要した時間量であり、ｔ_Ｄは倍加時間である。１回の低用量（１０μｇ／ｇ）タモキシフェンの注射を実施した後、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスを時間依存的に屠殺した。次に、本発明者らは、心臓を切片化し、切片あたりのＬａｃＺ（＋）細胞の数を定量化した。次に、その合計を切片の面積で除算した。次に、本発明者らは、これらの値のｌｏｇ_２をプロットし、

【数1】

で表される線形関数にデータを当てはめた。Ｎ_０及びＮ（ｔ）のデータを挿入して整列し直し、ｔ_Ｄを求めることにより、倍加時間（ｔ_Ｄ）を決定した。イメージングは、Ｎｉｋｏｎ ＤＳＦｉ１カメラを装備したＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ８０ｉ顕微鏡で実施した。画像を定量化する者には、どの時点かを知らせなかった。

【0103】

（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑのためのＰＣＭ１の核単離：）
核単離は、以下の変更を加え、Ｍｏ ｅｔ ａｌ．に従って実施した^４３。簡潔には、氷上で新鮮な心臓組織を採取し、直ちにＢｉｏｇｅｎ Ｓｅｒｉｅｓ ＰＲＯ２００（ＰＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でホモジナイズした後、ダウンス型でホモジナイズした。オプティプレップ密度勾配培地（Ｓｉｇｍａ）を用いた密度勾配遠心分離により、核を単離した。３０〜４０％の界面から単離された核はすべて、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で事前に清澄化した。次に、核を抗ＰＣＭ１（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０２３３７０）抗体及びＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓと免疫沈降し、心筋細胞核を濃縮した^２１。

【0104】

（ＡＴＡＣ−ｓｅｑ）
約５０，０００個のビーズに結合したＰＣＭ１＋核をＡＴＡＣ−ｓｅｑのインプットとして使用した。ＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを（Ｂｕｅｎｒｏｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ，２０１３）^２４に従って作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌｉｎｋ）でペアエンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。デフォルトのペアエンド設定でＢｏｗｔｉｅ２を使用して、リードをマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした^４４。次に、核以外のすべてのリード、及び不適切にペアになったリードを破棄した。次に、重複したリードをｐｉｃａｒｄ ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓで除去した。ＭＡＣＳ２（ｃａｌｌｐｅａｋ−ｎｏｍｏｄｅｌ−ｂｒｏａｄ）でピークコールを実行した。ブラックリスト領域をｍｍ９からマウスゲノムｍｍ１０へ変換し、シーケンシング品質の低いピーク（ｑ３０超が必要）とともにこれを除去した。ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｍｕｌｔｉｃｏｖモジュール）を使用して、包括的なピークファイル（Ｙａｐ５ＳＡ及び対照の複製物がマージされたもの）から条件ごとにリードを計数した^４５。ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータセットの分位点標準化をＣＱＮ^４６で実施し、オフセットをＤＥＳｅｑ２に供給して、アクセシビリティ差を定量化した^４７。ヌクレオソームのコールは、ＮｕｃｌｅｏＡＴＡＣ^２９で実施した。モチーフ濃縮分析は、Ｈｏｍｅｒ（ｆｉｎｄＭｏｔｉｆｓＧｅｎｏｍｅ．ｐｌ）を使用して実施した。

【0105】

（ＲＮＡ−ｓｅｑ）
ＲＮＥａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ビーズに結合したＰＣＭ１＋核からＲＮＡを回収した。カスタムのＹ字型アダプターを備えたＳｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ｓｅｑ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ Ｒｉｂｏ Ｅｒａｓｅ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で核ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ装置（ＤＮＡ Ｌｉｎｋ）でＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーに対してペアエンドの２ｘ７５ｂｐシーケンシングを実施した。ＳＴＡＲ^４８を使用して、最初にリードをマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。次に、ＤＥＳｅｑ２^４７を用いて発現差解析を実施した。Ｍｅｔａｓｃａｐｅを使用して遺伝子オントロジーを実施した。ｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒ^{４９、５０}を使用してｄｅ ｎｏｖｏ経路分析を実施した。

【0106】

Ｈ３Ｋ２７ＡｃのＣｈＩＰ−ｓｅｑ
公開データ：ＧＳＭ１２６４３７０、ＧＳＭ１２６４３７２、ＧＳＭ１２６４３７２、及びＧＳＭ１２６４３７２を、ｂｏｗｔｉｅ２のデフォルトパラメーターを用いてマウスゲノム（ビルドｍｍ１０）にマッピングした。マッピング後、心臓Ｅ１１．５ Ｈ３Ｋ２７Ａｃの複製物ＧＳＭ１２６４３７０及びＧＳＭ１２６４３７２をマージして分析した。遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表示した。

【0107】

ＹａｐのＣｈＩＰ−ｓｅｑ
心室を摘出して冷ＤＰＢＳに入れ、血液を除去した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を補充したＰＢＳ中で細砕した。次に、ＢｉｏＧｅｎ Ｐｒｏ２００及び５ｍｍジェネレーターで迅速にホモジナイズした。ローテーター上で１％ホルムアルデヒド中にて室温で１０分間架橋させ、１５０ｍＭグリシンにより室温で１０分間クエンチした。細胞をペレット化し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−ＰＢＳで２回すすいだ。次に、５ｍＬの細胞溶解緩衝液（５ｎＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−Ｆｒｅｅ Ｒｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）中にて、氷上で２０分間インキュベートすることにより溶解させた後、ダウンス型でホモジナイズした。溶解物をペレット化し、細胞溶解緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。次に、本発明者らは細胞及び核を４℃で１０分間、２ｋＧでペレット化した後、６００ｕＬ核溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．３％ＳＤＳ、完全ＥＤＴＡフリーＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、超音波処理した。１５ｕｇにせん断したクロマチンを使用して、Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ１８０４）またはＩｇＧ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ １２−３７１）及びプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｅｉｒｃｅ）と、ローテーター上で、４℃で一晩ＣｈＩＰ処理した。ローテーター上で、４℃で５分間ビーズを洗浄し、洗浄して、脱架橋し、ＤＮＡを精製した。Ｋａｐｐａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、ＫＫ８３０１）を使用して、シーケンシングライブラリーを作成した。Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｎで配列決定したＹＡＰ５ＳＡ−ＦＬＡＧ ＣｈＩＰ−ｓｅｑライブラリーを、Ｔｏｒｒｅｎｔ ＳｕｉｔｅアライナーＴｍａｐ（０．２．３）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｍｍ１０マウスゲノムアセンブリにマッピングした。３つの生物学的複製を実施し、一意にマッピングされたリードのみを保持した。複合ＹＡＰ５ＳＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータセットからピークをコールし、ＨＯＭＥＲ（ｆｉｎｄＰｅａｋｓ及びａｎｎｏｔａｔｅＰｅａｋｓ．ｐｌ）を用いてアノテーションした。遺伝子トラックはＵＣＳＣゲノムブラウザーを使用して表示した。

【0108】

（実施例２）
ＹＡＰＫ２６５Ｒの安定性
本発明者らは、Ｙａｐ Ｋ２６５Ｒ（Ｙａｐの２６５位アミノ酸のリジンがアルギニンへ変異したもの）ホモ接合突然変異を有する２つのＰ１９細胞株（番号１１及び番号１３）を作製した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の半減期を確認するために、６ウェルプレート中のＷＴ Ｐ１９細胞及びＰ１９細胞にＹａｐ Ｋ２６５Ｒ突然変異体（番号１３）を播種した。翌日、細胞の集密度が約６０％〜７０％に達したら、２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で２時間、４時間、または６時間、細胞を処理した（ＤＭＳＯで処理した細胞は０時間とする）。処理後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液１００ｕｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、ならびにプロテアーゼ阻害剤及びリン酸化阻害剤）で回収した。Ｙａｐ、Ｓ１２７リン酸化を伴うＹａｐ（ｐ−Ｙａｐ）、及びβ−カテニンの発現を試験するために、細胞溶解物をウェスタンブロッティングで分析した。ＧＡＰＤＨの発現を内部対照として利用した（図１５Ａ）。ＣＨＸはタンパク質合成を阻害することができる。これは、処理後に新生タンパク質が補充されず、Ｙａｐ、ｐ−Ｙａｐ、及びβ−カテニンのタンパク質レベルが経時的に減少するためである。ＷＴ Ｙａｐと比較して、ＹａｐＫ２６５Ｒはより急速に減少した。これはＫ２６５Ｒ突然変異をもつＹａｐの安定性が低いことを意味する（図１５Ａ）。ｐ−Ｙａｐ及びβ−カテニンもまた、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞では安定性が低い（図１５Ａ）。ＣＨＸ処理しない場合、Ｙａｐ及びｐ−Ｙａｐの基底レベルはＷＴ Ｐ１９細胞と比較してＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞でわずかに低い（図１Ｂ）。興味深いことに、β−カテニンの発現は、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異をもつＰ１９細胞で増加した（図１Ａ及び図１Ｂ）。

【0109】

これらの試験を２回繰り返し、一貫した結果を得た（図１６及び図１７）。統計結果を図１７Ｂに示す。Ｙａｐのタンパク質の代謝回転率を試験するために、プロテアソーム阻害剤であるＭｇ１３２、２０ｕｍ／ｍｌで細胞を処理した。分解ができないため、タンパク質レベルは経時的に増加した。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体Ｐ１９細胞でのＹａｐタンパク質の蓄積の増加は、ＷＴ Ｙａｐと比較してＹａｐＫ２６５Ｒの代謝回転率が高いことを示している。言い換えれば、ＹａｐＫ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。しかしながら、β−カテニンの代謝回転率はＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体細胞では変化しなかった（図１８Ａ及び図１８Ｃ）。

【0110】

Ｙａｐは、核内のＤＮＡ結合パートナーと協働して遺伝子発現を制御する転写補助因子である。ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体の核局在化を試験するために、Ｐ１９細胞を溶解し、核画分及びサイトゾル画分を回収してウェスタンブロット分析を行った。Ｙａｐタンパク質の量は、ＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異体細胞の核画分では少ないが、サイトゾル画分では変化しないことから、ＹａｐＫ２６５Ｒの核局在化が少ないことが示唆される（図１９）。この実験を合計３つの複製物で２回実施した（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。統計結果を図１９Ｃ及び図１９Ｄに示す。

【0111】

抗体の例：Ｙａｐ（１：１０００、Ｎｏｖａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＮＢ１１Ｏ−５８３５８）；β−カテニン（１：１０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ−７９６３）；ｐ−Ｙａｐ（Ｓ１２７）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃４９１１）；ｐ−Ｙａｐ（Ｓ３８１）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃１３６１９）；ＧＡＰＤＨ（１：３０００、Ａｂｅａｍ、ａｂ９４８５）；ＨＤＡＣ２（１：５０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ１−８６１）

【0112】

（参考文献）
本明細書で引用するすべての特許、特許出願、及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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50 Reimand,J.et al.g:Profiler-a web server for functional interpretation of gene lists(2016 update).Nucleic acids research 44,9,doi:10.1093/nar/gkwl99(2016).

【0113】

本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び改変が本明細書でなされ得るものと理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載のプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、及び工程に関する特定の実施形態に限定されることを意図しない。当業者であれば本発明の開示から容易に理解されるであろうが、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を実行するか、または実質的に同じ結果を達成する、現存するまたは今後開発されるプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、または工程を本発明に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、そのようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法、または工程をその範囲内に包含することを意図する。

【図1-1】

【図1-2】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

2020513810000001.app

【手続補正書】

【提出日】2019年12月19日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2020年2月14日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0011】

【図1】図１Ａ〜１Ｅ。Ｙａｐ５ＳＡ導入遺伝子の設計及び発現。図１Ａ．（上）条件付きＹａｐ５ＳＡ対立遺伝子の構造。（下）下線のセリン残基がアラニンに変異している過剰発現されたＹａｐ変異体のヒトタンパク質配列。図１Ｂ．発達期の心臓にＧＦＰ発現を有する代表的なｅ９．５ Ｔｇ（Ｊｏｊｏ＿Ｆｌａｇ：：Ｙａｐ５ＳＡ）５ＪＦＭマウス。図１Ｃ．Ｐ０新生児から採取した対照及びトランスジェニック心臓でのＧＦＰ蛍光の画像。図１Ｄ．（左上）成体ＣＭでＹａｐ５ＳＡを発現させるための生殖及び誘導戦略。（左下）ＦｌａｇＹａｐ５ＳＡ発現を示すウェスタンブロット。左側に分子量マーカーを示す。（右）ウェスタンブロットによるＹａｐ発現の定量化を平均＋／−ＳＥＭとして示す。ｎ＝３マウス／遺伝子型。図１Ｅ．抗Ｙａｐ抗体及びＤＡＰＩで染色された、単離した対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心筋細胞の免疫蛍光画像。（右）平均＋／−ＳＥＭとして示されるＹａｐ免疫蛍光の核／サイトゾル比の定量化。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による全統計。対照ｎ＝３（心臓）、６０（細胞）。Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝３（心臓）、６７（細胞）。

【図2】図２Ａ〜２Ｊ。Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥマウスの求心性心不全及び死亡。図２Ａ．対照（ｎ＝８）及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ（ｎ＝７）マウスを表すカプランマイヤー生存分析。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定により算出された統計。図２Ｂ．対照及び瀕死状態のＹａｐ５ＳＡ心臓から得たマッソンのトリクローム染色（７日目）。図２Ｃ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での同じ動物の左心室の代表的なＢモード画像。図２Ｄ〜２Ｅ．収縮期（図２Ｄ）及び拡張期（図２Ｅ）における左心室後自由壁の厚さ。図２Ｄ〜２Ｅは、平均＋／−ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射前対照ｎ＝６、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝１０、注射後対照ｎ＝９）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。図２Ｆ．４回目のタモキシフェン注射の前及び１日後での対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓の代表的なＭモード心エコー検査。図２Ｇ．収縮終期の左心室腔直径。図２Ｈ．拡張終期の左心室腔直径。図２Ｉ．内径短縮率。図２Ｊ．駆出率。図２Ｇ〜２Ｊのデータは、平均＋／−ＳＥＭとして示され（注射前Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４、注射前対照ｎ＝３、注射後Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝７、注射後対照ｎ＝７）、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により統計を算出した。

【図3】図３Ａ〜３Ｋ．分化した心筋細胞の増殖。図３Ａ．単離ＣＭの面積を示すヒストグラム。ｎ＝３マウス／群。約１００細胞／心臓。図３Ｂ．異なる組織深度でのＬＶの切片及び面積、ｎ＝６／群。平均＋／−ＳＥＭ。＊はＰ＜０．０５を示す。図３Ｃ．ＬＶ容積。図３Ｄ．ＬＶ腔容積ｎ＝６／群。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｅ．ＬＶの重量と体重との比（ｎ＝６／条件）。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｆ．（左）ＬＶの筋細胞数。（ｎ＝５／群）平均＋／− ＳＥＭ。（右）ＰＣＭ１（＋）ＣＭ核（黄色の矢印で例を示した）。図３Ｇ．ＣＭ核形成。６心臓／群。４００〜５００ＣＭ／心臓。平均＋／−ＳＥＭ。図３Ｈ．（左）ＥｄＵを含むＣＭの例。（右）誘導／ＥｄＵ標識戦略及びＥｄＵ取り込みの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝４心臓／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ｉ．代表的なＡｕｒｏｒａＢ染色切片（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＡｕｒｏｒａＢ（＋）ＣＭの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ｊ．ＰＨＨ３染色切片の例（陽性細胞を黄色の矢印で示した）。（右）ＰＨＨ３（＋）ＣＭの定量化。平均＋／−ＳＥＭ。ｎ＝３マウス／群。２００〜３００ＣＭ／心臓。図３Ａ〜３Ｊは、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定による統計である。図３Ａ〜３Ｊは、タモキシフェンプロトコルの２日後のマウスによるものである。図３Ｋ．異なる時点での１回の低用量タモキシフェン投与後のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ｌａｃｚ（＋）ＣＭの数をｌｏｇ２形式（左）及び生データ（右）で示す。平均＋／−ＳＥＭ。Ｎ（ｔ）＝ｌａｃｚ（＋）細胞数／心筋層面積。ｔ＝時間（日）。ｔＤ＝倍加時間。ｎ＝３マウス／時点。ｌｏｇ２変換後の線形フィットＲ２＝０．９６。

【図4】図４Ａ〜４Ｇ。ＣＭ増殖遺伝子プログラムのエピジェネティックな活性化。図４Ａ．（上）ＣＭ核濃縮プロトコル。（左下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＲＮＡ−ｓｅｑのボルケーノプロット。１，３５２個の遺伝子が上昇、７４８個が下降（調整Ｐ値＜０．１）。（右下）対照と比較したＹａｐ５ＳＡ ＡＴＡＣ−ｓｅｑのボルケーノプロット。Ｙａｐ５ＳＡの大幅なｌｏｇ_２倍数変化により、１６，１８９個のピークが上昇、１３，３５３個が下降。２試料／遺伝子型。図９に再現性。図４Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した上位のＡＴＡＣ−ｓｅｑモチーフ。（右）すべてのＴＥＡＤモチーフピークのヌクレオソームシグナル。これを０〜１に標準化した（図４Ｃ）。以下のエンハンサーとプロモーターの比率：遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの合計（図１２）；Ｙａｐ５ＳＡが濃縮した遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク；及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ−Ｓｅｑピーク。＊Ｐ＜０．００１、対照の比率と比較した、カイ二乗検定、イエーツの補正。図４Ｄ．対照またはＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭそれぞれの上位ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整済みｐ≦０．０３５）を中心とした、発達期及び成体の心臓からのＨ３Ｋ２７Ａｃ断片のカバレッジ。ｎは調査したピークの数。図４Ｅ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ上方制御ＡＴＡＣ−ｓｅｑピーク（調整ｐ値＜１ｅ−５）及びＹａｐ５ＳＡ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピーク（ＨＯＭＥＲのピークスコアカットオフが２０）に対応する、高信頼度のＹａｐ５ＳＡ ＯＥ上方制御遺伝子（ＲＮＡ−ｓｅｑ調整ｐ値＜０．０１）。（右）カテゴリーごとの高度に濃縮されたＧＯ期。図４Ｆ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子にわたるＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナル（ＴはＴＥＡＤモチーフの目印；ＹはＹａｐ ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークの目印）。図４Ｇ．Ｙａｐ５ＳＡ上方制御遺伝子のプロモーターにおけるＣｈＩＰ−ｓｅｑ及びＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナル。プロモーターのＣｈｉｐ−ｓｅｑピークを緑色の矢印で示した。

【図5】図５Ａ〜５Ｄ．Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ筋細胞は正常な生理機能をもち、導入遺伝子を発現しないＣＭに結合する。図５Ａ．タモキシフェン前後の対照及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥマウスからの代表的なＥＣＧトレース。Ｔ波の逆転を示す。図５Ｂ．（上）Ｔ波逆転したマウスの割合。＊Ｐ＝．０２８６（フィッシャーの正確確率検定）。（下）Ｔ波の曲線下の相対面積。平均＋／−ＳＥＭ。分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定により算出した統計。対照ｎ＝３、Ｙａｐ５ＳＡ ｎ＝４。図５Ｃ．β−ガラクトシダーゼ（淡青緑）及びコネキシン４３（赤）の免疫染色は、再結合したβ−ｇａｌ（＋）ＣＭと、再結合しなかったＣＭ（染色なし、黒）とのギャップジャンクションによる結合を示している。黄色の矢印は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭをもつシンシチウムのβ−ｇａｌ（−）ＣＭを示す。挿入図は拡大図である。図５Ｄ．（左）サルコメア短縮の代表的なプロット。（中）安静時のＣＭサルコメア長。平均で示す。（右）サルコメア短縮率。

【図6】図６Ａ〜６Ｃ．細胞周期段階のフローサイトメトリー分析。図６Ａ．ＤＡＰＩで染色した、対照心臓及びＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓から単離された心臓核のフローサイトメトリーから得た代表的なヒストグラム。円グラフの対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝４。円グラフのデータは平均を示す。Ｐ値は、分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した。Ｐ＜．０５をアスタリスクで示す。図６Ｂ．Ａで参照したＦＡＣＳによるＣＭ ＤＮＡ含量から得た代表的なドットプロット。図６Ｃ．ＦＡＣＳ ＤＮＡ含量分析、平均及びＳＥＭ、ｎ＝４／遺伝子型。分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計。

【図7】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭの細胞アポトーシスの増加は認められない。ＴＵＮＥＬ染色は、対照心臓とＹａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓との間に有意差を示していない（ｎ＝４心臓／遺伝子型）。ペアワイズ分散分析後にＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定をして算出した統計を平均＋／−ＳＥＭで示す。

【図8】Ｙａｐ ５ＳＡ ＯＥ心臓には線維化が認められない。ピクロシリウスレッド染色は、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓も対照も線維化表現型をもたないことを示している。比較のために線維性損傷のある代表的な心臓も示す。

【図9】シーケンシングの品質管理。（上）両方のＡＴＡＣ−ｓｅｑセットに高再現性。（下）ＲＮＡ−ｓｅｑセット間に高再現性。示された各実験からのリードを、正規化された対数変換で変換し、散布図として表し、複製データセットの関係を示した。注：データセットの試料は一致している（例：対照−１ ＡＴＡＣ−ｓｅｑと対照−１核ＲＮＡは同じ生物学的試料に由来する）。

【図10A】Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓での上方制御遺伝子及び下方制御遺伝子の遺伝子オントロジー分析（ｐ＜０．０１）。

【図10B】ＲＮＡ−ｓｅｑから選択した遺伝子のヒートマップ

【図11】図１１Ａ〜１１Ｂ．Ｙａｐ５ＳＡは、無益な負のフィードバックループを誘発する。図１１Ａ．ＲＮＡ−ｓｅｑで示されたＹａｐ５ＳＡ ＯＥ ＣＭで上方制御される遺伝子の経路濃縮分析。強調表示はＨｉｐｐｏ経路である。（経路分析はｇ：Ｐｒｏｆｉｌｅｒを用いて実施）図１１Ｂ．（左）Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ心臓における内因性Ｙａｐリン酸化の増加を示すウェスタンブロット。（右）平均＋／−ＳＥＭとして示される、バンド強度の定量化（対照ｎ＝４、Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ ｎ＝３、分散分析とＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定によるＰ＜．０１）。

【図12】図１２Ａ〜１２Ｂ．ＴＳＳに対する遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークの幾何学ドットプロット。図１２Ａ．両方の遺伝子型にわたる、遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離の合計（対照：３４７３８ピーク；Ｙａｐ５ＳＡ ＯＥ：４０，３３３ピーク）。図１２Ｂ．上方制御された遺伝子間ＡＴＡＣ−ｓｅｑ及びＣｈＩＰ−ｓｅｑピークのＴＳＳまでの距離。

【図13】図１３Ａ．１〜１３Ａ．３及び図１３Ｂ〜１３Ｄ．高信頼度のＹａｐ５ＳＡ標的（図１３Ａ１〜１３Ａ３）（左）クロマチンがすでに開いている領域でＹａｐ５ＳＡによって直接上方制御された９７個の遺伝子のリスト。（中）新たなオープンクロマチンと上方制御されたＲＮＡをもつ１０６個の遺伝子のリスト。（右）オープンクロマチンが増加した、Ｙａｐ５ＳＡによって直接上方制御された７６個の遺伝子のリスト。図Ｂ．Ａのリストで最も濃縮がみられた遺伝子オントロジー期。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子のＴＳＳを中心としたＡＴＡＣ−ｓｅｑリード及びＲＮＡ−ｓｅｑリードの平均。図Ｃ．オープンクロマチンの増加を示す７６個のＹａｐ標的遺伝子に対応するＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを中心としたＨ３Ｋ２７Ａｃ ＣＨＩＰ−ｓｅｑ断片のカバレッジ。

【図14】図１４Ａ〜１４Ｃ．心筋細胞増殖を活性化するＹａｐ５ＳＡのモデル。図１４Ａ．ある特定の事例では、Ｙａｐが標的遺伝子のオープンプロモーターに直接結合し、転写を増加させる。そのようなプロセスでは、新たなオープンクロマチンのリードは生じない。図１４Ｂ．主に、Ｙａｐ５ＳＡはエンハンサー領域に結合し、標的遺伝子のゲノム近傍を開く、ＳＷＩ／ＳＮＦ複合体などのクロマチンリモデリング因子を動員する。次に、Ｙａｐ自体または他の転写因子が自由に転写を促進する。図１４Ｃ．（左パネル）これら２つの直接的な活性化スキームの間に、Ｙａｐ５ＳＡは次の３つのプロセスによって増殖を促進する：１．Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子、Ｅ２Ｆ転写因子、サイクリン、及びＰｏｌｏ様キナーゼを介した細胞周期の活性化。２．フォルミン、プロテインキナーゼＣイオタ、Ｅｃｔ２、Ｉｎｃｅｎｐ、及びＥｐｈｅｘｉｎ４による細胞骨格の再配列及び細胞質分裂の促進。３．プロテインキナーゼＤ１、Ａｌｃａｍ、及びＤｉｓａｂｌｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇ ２などの胎児の心臓発達に関連する遺伝子の再出現。（右パネル）これら３つのプロセスは、最小限のまたは有害な機能を独立して有する。簡略化のため、色で示す直接のＣｈＩＰ−ｓｅｑ標的のみが左パネルに含まれている。右パネルには、直接的な上方制御遺伝子に加え、色で示す間接的に（上方または下方）制御された転写物（図４Ａ及び図４Ｄに従って含まれる遺伝子）を含む。

【図15】図１５Ａ〜１５Ｂ．Ｙａｐ Ｋ２６５ＲはＷＴ Ｙａｐよりも安定性が低い。図１５Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び６時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１３）。示されている抗体をイムノブロットした。図１５Ｂ．Ｐ１９細胞、及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有する２つの異なるＰ１９コロニーからの溶解物を示されている抗体でイムノブロット分析した。

【図16】Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定を実証する。２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞。示されている抗体をイムノブロットした。

【図17】図１７Ａ〜１７Ｂ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の安定性の決定。図１７Ａ．２０ｕｇ／ｍｌシクロヘキシミドで０時間、２時間、４時間、及び８時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１１）。示されている抗体をイムノブロットした。図１７Ｂ．Ｙａｐの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＧＡＰＤＨで標準化してプロットした。

【図18】図１８Ａ〜１８Ｃ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の代謝回転率の決定。図１８Ａ．２０ｕＭ／ｍｌ Ｍｇ１３２で０時間、１時間、２時間、及び４時間処理し、０．５％ＮＰ４０溶解緩衝液で回収した、ＷＴ Ｐ１９細胞及びＹａｐＫ２６５Ｒ突然変異を有するＰ１９細胞（番号１１）。示されている抗体をイムノブロットした。図１８Ｂ及び図１８Ｃ．Ｙａｐ及びβ−カテニンの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＧＡＰＤＨで標準化してプロットした。

【図19】図１９Ａ〜１９Ｄ．Ｙａｐ突然変異体タンパク質の核局在化の決定。図１９Ａ及び１９Ｂ．２．０×１０^６個の細胞を１０ｃｍ皿に播種し、１８時間後に細胞を回収し、分画してウェスタンブロット分析を行った。図１９Ｃ及び図１９Ｄ．Ｙａｐの相対量をデンシトメトリーで定量化し、ＨＤＡＣ２（核画分の場合）またはＧＡＰＤＨ（サイトゾル画分の場合）で標準化してプロットした。

【国際調査報告】