特表 2020-521484 人工多能性幹細胞を生成するための基質および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-521484(P2020-521484A)

(43)【公表日】2020年7月27日

(54)【発明の名称】人工多能性幹細胞を生成するための基質および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20200626BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20200626BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 9/04 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20200626BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20200626BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20200626BHJP

   A61L 27/36 20060101ALI20200626BHJP

   C12N 5/074 20100101ALN20200626BHJP

   C07K 14/78 20060101ALN20200626BHJP

   C07K 14/475 20060101ALN20200626BHJP

   C07K 14/65 20060101ALN20200626BHJP

   C07K 14/50 20060101ALN20200626BHJP

   C07K 14/485 20060101ALN20200626BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20200626BHJP

   C12N 15/85 20060101ALN20200626BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20200626BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20200626BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20200626BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20200626BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 FZNA

   C12M1/00 A

   C12N5/10

   A61P25/28

   A61P25/16

   A61P9/00

   A61P3/10

   A61P9/04

   A61P13/12

   A61P35/00

   A61P21/00

   A61P7/06

   A61P11/00

   A61K35/545

   A61L27/38

   A61L27/38 300

   A61L27/36 100

   C12N5/074

   C07K14/78

   C07K14/475

   C07K14/65

   C07K14/50

   C07K14/485

   C12N15/12

   C12N15/85 Z

   C12N15/88 Z

   C12N5/0781

   C12N5/0783

   C12N5/0786

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2019-566085(P2019-566085)

(86)(22)【出願日】2018年5月30日

(85)【翻訳文提出日】2020年1月8日

(86)【国際出願番号】EP2018064296

(87)【国際公開番号】WO2018220081

(87)【国際公開日】20181206

(31)【優先権主張番号】1708554.9

(32)【優先日】2017年5月30日

(33)【優先権主張国】GB

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】502194159

【氏名又は名称】ザ クイーンズ ユニバーシティ オブ ベルファスト

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】マルガリティ，アンドリアナ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィラ−ゴンザレス，マルタ

(72)【発明者】

【氏名】ケライニ，ソフィア

(72)【発明者】

【氏名】スティット，アラン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C081

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029BB11

4B029CC02

4B029GA03

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BA03

4B065BB07

4B065BB12

4B065BB13

4B065BB19

4B065BC46

4B065CA44

4C081BA17

4C081BC01

4C081CD34

4C081EA01

4C087AA01

4C087AA03

4C087BB64

4C087NA20

4C087ZA02

4C087ZA16

4C087ZA36

4C087ZA55

4C087ZA59

4C087ZA81

4C087ZA94

4C087ZB26

4C087ZC35

4H045AA30

4H045BA10

4H045EA60

(57)【要約】

本開示は、体細胞の人工多能性幹細胞への再プログラミングを促進するための組成物および方法に関し、当該組成物はゼラチンとラミニンとを含む。本開示は更に、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法および人工多能性幹細胞を産生するための方法に関し、したがって、研究および治療で使用するための増殖体細胞および人工多能性幹細胞の産生に有用な方法を提供する。よって、本開示は、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法であって、（ｉ）体細胞を試料から単離し、（ｉｉ）体細胞を所定期間増殖させることを含み、当該増殖体細胞がＴＥＲＴ１を発現する方法、ならびに、当該増殖体細胞から人工多能性幹細胞を産生するための方法であって、（ａ）人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を当該増殖体細胞に導入し、（ｂ）当該遺伝要素を含む増殖体細胞を培養し、それにより人工多能性幹細胞を産生する方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

約０．０１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約１μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、体細胞の人工多能性幹細胞への再プログラミングを促進するための組成物。

【請求項2】

約０．０４ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０４ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

約０．０４ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０４ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項5】

約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

約１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項7】

約１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、場合により約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンと、約５０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンとを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ラミニンが組換えヒトラミニンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ゼラチンが組換えヒトゼラチンである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が水性組成物であり、場合により、前記水性組成物が液体またはゲルを含むか、またはそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

溶媒の添加により水性組成物に形成され得る乾燥した組成物または実質的に乾燥した組成物として提供される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記溶媒が、生理食塩水、場合によりリン酸緩衝生理食塩水；細胞培養培地；および水、場合により滅菌水のうちの１つ以上から選択される、請求項１１に記載の組成物。

【請求項13】

１つ以上の追加の細胞外マトリックス成分を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記１つ以上の追加の細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ニドゲン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから選択される、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

１つ以上の成長因子を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記１つ以上の成長因子が、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）から選択される、請求項１５に記載の組成物。

【請求項17】

Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を更に含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２二塩酸塩（ｔｒａｎｓ−４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−４−ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３、４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド）、Ｙ−３０１４１（４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ（２、３−ｂ）ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）、ＲＫＩ−１４４７（Ｎ−［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−Ｎ’−［４−（４−ピリジニル）−２−チアゾリル］尿素二塩酸塩）、ファスジル、およびリパスジル（商標名Ｇｌａｎａｔｅｃ）のうちの１つ以上から選択される、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、約１μＭ〜１ｍＭ、場合により約１μＭ〜１００ｍＭ、場合により約１μＭ〜１ｍＭ、場合により約１μＭ〜１００μＭ、場合により約１μＭ〜５０μＭ、場合により約５μＭ〜５０μＭ、場合により約１０μＭ〜５０μＭ、更に場合により約１０μＭの濃度で前記組成物中に存在する、請求項１７または１８に記載の組成物。

【請求項20】

Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴのうちの１つ以上から選択される人工多能性幹細胞再プログラミング因子を含むか、またはそれからなる遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

前記遺伝要素がＴＥＲＴ１を更に含む、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記遺伝因子が、体細胞へのトランスフェクションに適したプラスミドまたは他のベクターに含まれる核酸コード配列、場合によりＤＮＡヌクレオチド配列を含む、請求項２０または２１に記載の組成物。

【請求項23】

体細胞の内部に遺伝要素を送達するのに適した担体を更に含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記担体が、前記体細胞への遺伝要素のナノ粒子媒介送達のためのナノ粒子を含む、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記担体が脂質ベースのナノ粒子を含み、場合により前記脂質ベースのナノ粒子ナノ粒子がリポソーム、場合によりカチオン性リポソームを含む、請求項２３または２４に記載の組成物。

【請求項26】

体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングするための方法における、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物の使用。

【請求項27】

請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞培養容器。

【請求項28】

請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。

【請求項29】

細胞培養容器を更に含む、請求項２８に記載のキット。

【請求項30】

前記細胞培養容器が前記組成物を含む、請求項２９に記載のキット。

【請求項31】

体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングする方法であって、
（ｉ）前記体細胞を請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物と接触させ、
（ｉｉ）人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を前記体細胞に導入し、
（ｉｉｉ）前記遺伝要素を含む前記増殖体細胞を培養し、それにより人工多能性幹細胞を産生する、
ことを含む、方法。

【請求項32】

工程（ｉ）において、前記体細胞を、前記組成物と接触するときに細胞懸濁培地に懸濁させる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記懸濁培地中に懸濁させた体細胞を組成物と接触させることにより、前記懸濁培地が前記組成物を溶解する、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記体細胞が末梢血単核細胞を含み、場合により、前記末梢血単核細胞が単球を含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する前記遺伝要素を、前記組成物に含まれるナノ粒子を介して前記体細胞に導入する、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記遺伝要素を含む体細胞から産生された人工多能性幹細胞が内皮細胞に分化する、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法であって、
（ｉ）試料から体細胞を単離し、
（ｉｉ）前記体細胞を所定期間増殖させる、
ことを含み、前記増殖させた体細胞がＴＥＲＴ１を発現する、方法。

【請求項38】

前記体細胞を、約１４日未満、場合により約１３日未満、場合により約１２日未満、場合により約１１日未満、場合により約１０日未満、場合により約９日未満、場合により約８日未満、場合により約７日未満、更に場合により約７日間増殖させる、請求項３７記載の方法。

【請求項39】

前記体細胞を、少なくとも約１日、場合により少なくとも約２日、場合により少なくとも約３日、場合により少なくとも約４日、場合により少なくとも約５日、場合により少なくとも約６日、更に場合により少なくとも約７日間増殖させる、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

ＴＥＲＴ１発現が、増殖前の前記体細胞におけるＴＥＲＴ１発現の少なくとも約１０％、場合により少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により約１００％である、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記試料が被験体から得られた生体試料であり、場合により、前記試料が被験体から得られた血液試料である、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記体細胞が末梢血単核細胞であり、場合により、前記末梢血単核細胞が単球である、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記血液試料の容量が、約１０ｍｌ未満、場合により約５ｍｌ未満、場合により約２．５ｍｌ未満、場合により約１ｍｌ未満、更に場合により約１ｍｌである、請求項４１または４２に記載の方法。

【請求項44】

前記被験体がヒト被験体であり、場合により、前記被験体が糖尿病に罹患している、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記末梢血単核細胞が動員されておらず、最適には、前記末梢血単核細胞が外因的に適用された顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で動員されていない、請求項４２〜４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記体細胞を増殖培地で増殖させ、場合により、前記増殖培地がエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、デキサメタゾン、およびホロトランスフェリンのうちの１つ以上を補充した無血清培地（ＳＦＭ）を含む、請求項３７〜４５のいずれか一項記載の方法。

【請求項47】

前記体細胞を、約１〜７日間、場合により約２〜６日間、場合により約２〜５日間、場合により約２〜４日間、場合により２〜３日、更に場合により約３日間の第一増殖期間中、前記増殖培地で増殖させる、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記体細胞を、約１〜７日間、場合により約１〜６日間、場合により約１〜５日間、場合により約１〜４日間、場合により１〜３日、場合により２〜３日、更に場合により約３日間の第二増殖期間中、前記増殖培地で増殖させる、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

（ｉｉｉ）前記増殖体細胞を凍結保存する
ことを更に含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定し、場合により、前記増殖体細胞がＴＥＲＴ１を発現する場合、人工多能性幹細胞を産生するのに適していると判断する、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

人工多能性幹細胞を産生するための方法であって、
（ａ）請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、増殖体細胞に、人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を導入し、
（ｂ）前記遺伝要素を含む前記増殖体細胞を培養し、それにより人工多能性幹細胞を産生する、
ことを含む、方法。

【請求項52】

非ウイルストランスフェクション法により、場合によりエレクトロポレーションにより、前記遺伝要素を前記増殖体細胞に導入する、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記人工多能性幹細胞再プログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴのうちの１つ以上から選択される、請求項５１または５２に記載の方法。

【請求項54】

工程（ｂ）において、前記遺伝要素を含む増殖体細胞を、場合により約２日間、増殖培地で培養する、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

増殖培地で培養した後、前記遺伝要素を含む増殖体細胞を不活性化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に、場合により約１日間播種する、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した後、前記遺伝要素を含む増殖体細胞を前記ＭＥＦから取り除き、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地で、場合により約１日間培養する、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地を、ホウ酸ナトリウムを含む新鮮な再プログラミング培地と毎日交換し、場合により、前記ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地を、約４〜８日、場合により約５〜７日、場合により約６日間毎日、ホウ酸ナトリウムを含む新鮮な再プログラミング培地と交換する、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地を、人工多能性幹細胞を含む１つ以上の細胞コロニーが形成されるまで、ホウ酸ナトリウムおよび塩基性線維芽細胞成長因子を含む馴化培地と毎日交換する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、増殖体細胞。

【請求項60】

ＴＥＲＴ１を発現する、増殖体細胞。

【請求項61】

前記増殖体細胞におけるＴＥＲＴ１発現が、増殖させていない前記体細胞におけるＴＥＲＴ１発現の少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により約１００％である、請求項６０に記載の増殖体細胞。

【請求項62】

前記ＴＥＲＴ１発現を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ウエスタンブロット法および／または免疫蛍光顕微鏡法により測定する、請求項６１に記載の増殖体細胞。

【請求項63】

請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の増殖体細胞。

【請求項64】

請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、人工多能性幹細胞。

【請求項65】

請求項５９〜６３のいずれか一項に記載の増殖体細胞から産生される、人工多能性幹細胞。

【請求項66】

請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の方法に従って産生される、請求項６５に記載の人工多能性幹細胞。

【請求項67】

療法に使用するための、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の人工多能性幹細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞を調製するための基材および方法、ならびに人工多能性幹細胞を産生するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が最初に発見されてから約１０年が経過した。この分野の研究は、現在および将来の健康管理における、個別化医療に大きな重点を置いた多くの疾患に対する個別化治療の一形態としてのｉＰＳ細胞の潜在的な使用により、増大している。Ｗｏｒｒｉｎｇｅｒらによって行われた研究［１］は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４再プログラミング因子を使用すると、ｉＰＳＣ形成効率が１％と低いことを示唆している。体細胞とｉＰＳ細胞との間の再プログラミング効率がなぜ技術改善が行われるほど低いのかを理解しようとさまざまな研究が行われている。多くの研究が、なぜその効率が非常に低いのかを確認し、再プログラミング効率を向上させようとすることによって効率を高めることを目指している。エピジェネティックマークおよび修正の重要性が検討されている。

【0003】

ｉＰＳ細胞には、健康管理および研究分野において多くの潜在的な用途がある。ｉＰＳ細胞は、再生医療または細胞ベース療法、疾患のメカニズムのモデリング、薬物スクリーニングおよび細胞毒性試験に使用することができる。

【0004】

外因性組織の移植は拒絶の危険性を伴い、「受容」を確実にするために免疫抑制薬の長期使用を必要とする。再生医療は、患者自身の細胞を使用してｉＰＳ細胞を作成し、移植のための新たな組織を作成することで、この問題を回避するものである。

【0005】

個別化医療におけるｉＰＳ細胞の可能性は非常に刺激的である。ＹａｍａｎａｋａとＴａｋａｈａｓｈｉが最初にｉＰＳＣを開発してから１０年［２］、メカニズムや潜在的な用途についての理解が更に深まりつつある。非ヒト霊長類を含む動物モデルでの試験は多くの疾患に対して有望であり、患者の黄斑変性症に対する進行中の試験による臨床試験が提案されている。再生医療に応用するための臨床グレードのｉＰＳ細胞が開発されている。これは、ヒト試験への移行における非常に大きな一歩であり、今後数年間にわたってヒトの個別化医療や再生医療においてｉＰＳ細胞の使用がどのように進展するかを見るのは非常に刺激的なことである。しかしながら、ｉＰＳ細胞の生成は依然として非常に低い効率の長期プロセスであり、これらの細胞が臨床で広く使用される可能性をかなり抑止している。この研究において、健康な志願者と糖尿病患者からのわずか数滴の血液からｉＰＳ細胞を生成するための、高速かつ高効率な新規アプローチを開発した。

【0006】

このアプローチは、血管疾患の予防および治療に関して特に有用である。糖尿病などの血管疾患の死亡率は世界中で最も高いものの１つであり、血管疾患の発症および進行を予防するためには、内皮の健康かつ正常な機能を維持することが最も重要である。結果として、血管再生医療の主な焦点および目的は、移植のための機能的内皮細胞（ＥＣ）の生成を含む損傷細胞を修復し、再生することである。損傷した血管の修復を支援するための治療用ＥＣの送達に関して多くの制限があり、それらの１つは疾患の治療に適切かつ効果的な細胞の入手可能性であり、ＥＣ（ｉＰＳ−ＥＣ）を含む体内のあらゆる細胞タイプを生じさせるｉＰＳ細胞は、この障害を克服し、血管疾患の治療に関して大きな期待が見込める可能性がある。実際、ｉＰＳ−ＥＣは、損傷した血管系に組み込み、再内皮化する能力や、血管損傷に対する新生内膜および炎症反応を阻害する能力などの、前臨床研究における顕著な治療上の可能性を示している。再プログラミング方法の進歩を目指して今日研究されている多くのアプローチがあるが、ｉＰＳ細胞の生成とその後の様々な細胞系統への分化の基礎となる細胞再プログラミング機構の多くはいまだ比較的不明のままである。更に、シンプルかつ堅牢なフィーダーフリー方法に基づいてｉＰＳを生成する標準化された方法は存在せず、現在のプロトコルは効率や集団純度に差がある。したがって、効果的な臨床治療へのｉＰＳ細胞の翻訳を確実に成功させるには、ｉＰＳ細胞生成のための堅牢な方法およびキットが必要である。

【0007】

したがって、本研究では、ヒトｉＰＳ細胞を、我々が開発した堅牢かつ高効率のアプローチに基づいて、健康なドナーまたは糖尿病ドナーからのわずか１ｍｌの血液から再プログラミングすると、その後、ｉＰＳ細胞は内皮細胞（ｉＰＳ−ＥＣ）に分化し、これら内皮細胞（ｉＰＳ−ＥＣ）は、典型的なＥＣ特性を示し、血管疾患の予防および治療に有用である。したがって、我々の研究は、フィーダーフリーの条件下で基質−ナノ粒子組成物の使用を含むことができる新規かつ高効率的なアプローチに基づいて、わずか５〜７日間でわずか数滴の血液から初めてヒトｉＰＳ細胞を生成した。

【発明の概要】

【0008】

したがって、１つの態様において、本発明は、体細胞の人工多能性幹細胞への再プログラミングを促進するのに適した組成物を提供し、当該組成物はゼラチンとラミニンとを含む。

【0009】

理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、体細胞が本明細書に記載される組成物を含む基質上で成長すると、体細胞の人工多能性幹細胞への再プログラミング効率が実質的に増加することを見出した。当該組成物は、本発明者らによって体細胞を人工多能性幹細胞へ再プログラミングするための最適条件を提供することが見出された量のゼラチンおよびラミニンを含み、これら最適条件はフィーダーフリーかつゼノフリーであるのが有利である。

【0010】

場合により、組成物は、少なくとも約０．０１ｗ／ｖ％、場合により少なくとも約０．０２ｗ／ｖ％、場合により少なくとも約０．０３ｗ／ｖ％、場合により少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％、更に場合により少なくとも約０．０５ｗ／ｖ％の濃度でゼラチンを含む。

【0011】

場合により、組成物は、最大約１０ｗ／ｖ％、場合により最大約９ｗ／ｖ％、場合により最大約８ｗ／ｖ％、場合により最大約７ｗ／ｖ％、場合により最大約６ｗ／ｖ％、場合により最大約５ｗ／ｖ％、場合により最大約４ｗ／ｖ％、場合により最大約３ｗ／ｖ％、場合により最大約２ｗ／ｖ％、更に場合により最大約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0012】

場合により、組成物は、約０．０１〜１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜９ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜８ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜７ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜６ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜５ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜４ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜３ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜２ｗ／ｖ％、場合により約０．０１〜１ｗ／ｖ％、更に場合により約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0013】

場合により、組成物は、約０．０２〜１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜９ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜８ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜７ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜６ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜５ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜４ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜３ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜２ｗ／ｖ％、場合により約０．０２〜１ｗ／ｖ％、更に場合により約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0014】

場合により、組成物は、約０．０３〜１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜９ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜８ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜７ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜６ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜５ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜４ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜３ｗ／ｖ％、場合により約０．０３〜２ｗ／ｖ％、場合により約０．０３から１ｗ／ｖ％、更に場合により約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0015】

場合により、組成物は、約０．０４〜１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜９ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜８ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜７ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜６ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜５ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜４ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜３ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜２ｗ／ｖ％、場合により約０．０４〜１ｗ／ｖ％、更に場合により約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0016】

場合により、組成物は、約０．０５〜１０ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜９ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜８ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜７ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜６ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜５ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜４ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜３ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜２ｗ／ｖ％、場合により約０．０５〜１ｗ／ｖ％、更に場合により約１ｗ／ｖ％の濃度のゼラチンを含む。

【0017】

場合により、組成物は、少なくとも約０．１μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約１μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約５μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約１５μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約２０μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約２５μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約３０μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約３５μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約４０μｇ／ｍＬ、場合により少なくとも約４５μｇ／ｍＬ、更に場合により少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0018】

場合により、組成物は、最大約１０００μｇ／ｍＬ、場合により最大約５００μｇ／ｍＬ、場合により最大約４００μｇ／ｍＬ、場合により最大約３００μｇ／ｍＬ、場合により最大約２００μｇ／ｍＬ、場合により最大約１００μｇ／ｍＬ、更に場合により最大約５０μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0019】

場合により、組成物は、約０．１〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により、１〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約２０〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約２５〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約３０〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約３５〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約４０〜１０００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜１０００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜１０００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0020】

場合により、組成物は、約０．１〜５００μｇ／ｍＬ、場合により約１〜５００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜５００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜５００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜５００μｇ／ｍＬ、場合により約２０から５００μｇ／ｍＬ、場合により約２５から５００μｇ／ｍＬ、場合により約３０から５００μｇ／ｍＬ、場合により約３５から５００μｇ／ｍＬ、場合により約４０から５００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜５００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜５００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0021】

場合により、組成物は、約０．１〜４００μｇ／ｍＬ、場合により約１〜４００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜４００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜４００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜４００μｇ／ｍＬ、場合により約２０から４００μｇ／ｍＬ、場合により約２５から４００μｇ／ｍＬ、場合により約３０から４００μｇ／ｍＬ、場合により約３５から４００μｇ／ｍＬ、場合により約４０から４００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜４００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜４００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0022】

場合により、組成物は、約０．１〜３００μｇ／ｍＬ、場合により約１〜３００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜３００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜３００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜３００μｇ／ｍＬ、場合により約２０から３００μｇ／ｍＬ、場合により約２５から３００μｇ／ｍＬ、場合により約３０から３００μｇ／ｍＬ、場合により約３５から３００μｇ／ｍＬ、場合により約４０から３００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜３００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜３００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0023】

場合により、組成物は、約０．１〜２００μｇ／ｍＬ、場合により約１〜２００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜２００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜２００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜２００μｇ／ｍＬ、場合により約２０から２００μｇ／ｍＬ、場合により約２５から２００μｇ／ｍＬ、場合により約３０から２００μｇ／ｍＬ、場合により約３５から２００μｇ／ｍＬ、場合により約４０から２００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜２００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜２００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0024】

場合により、組成物は、約０．１〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約１〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約５〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約１０〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約１５〜１００μｇ／ｍＬ、場合により約２０から１００μｇ／ｍＬ、場合により約２５から１００μｇ／ｍＬ、場合により約３０から１００μｇ／ｍＬ、場合により約３５から１００μｇ／ｍＬ、場合により約４０から１００μｇ／ｍＬ、場合により約４５〜１００μｇ／ｍＬ、更に場合により約５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度のラミニンを含む。

【0025】

場合により、ラミニンは組換えヒトラミニンである。場合により、ラミニンは、ラミニン５２１、ラミニン５２２、ラミニン５２３、ラミニン５１１、ラミニン４２３、ラミニン４２１、ラミニン４１１、ラミニン３２１（ラミニン３Ａ２１）、ラミニン３１１（ラミニン３Ａ１１）、ラミニン３Ｂ３２、ラミニン−３３２（ラミニン−３Ａ３２）、ラミニン２２１、ラミニン２１３、ラミニン２１１、ラミニン１２１、およびラミニン１１１のうちの１つ以上から選択される。場合により、ラミニンは、組換えヒトラミニン５２１、組換えヒトラミニン５２２、組換えヒトラミニン５２３、組換えヒトラミニン５１１、組換えヒトラミニン４２３、組換えヒトラミニン４２１、組換えヒトラミニン４１１、組換えヒトラミニン３２１（ラミニン３Ａ２１）、組換えヒトラミニン３１１（ラミニン３Ａ１１）、組換えヒトラミニン３Ｂ３２、組換えヒトラミニン−３３２（ラミニン−３Ａ３２）、組換えヒトラミニン２２１、組換えヒトラミニン２１３、組換えヒトラミニン２１１、組換えヒトラミニン１２１、および組換えヒトラミニン１１１のうちの１以上から選択される。

【0026】

場合により、ゼラチンは組換えヒトゼラチンである。

【0027】

特定実施形態において、本発明は、体細胞の人工多能性幹細胞への再プログラミングを促進するのに適した組成物を提供し、当該組成物は、少なくとも約０．０１ｗ／ｖ％、０．０２ｗ／ｖ％、０．０３ｗ／ｖ％、０．０４ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０６ｗ／ｖ％、０．０７ｗ／ｖ％、０．０８ｗ／ｖ％、０．０９ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．４ｗ／ｖ％または０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約０．８ｗ／ｖ％、０．９ｗ／ｖ％、１ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、７ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％または１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、少なくとも約１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬ、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0028】

場合により、組成物は、少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％、０．０５ｗ／ｖ％、０．０６ｗ／ｖ％、０．０７ｗ／ｖ％、０．０８ｗ／ｖ％、０．０９ｗ／ｖ％、０．１ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％、０．３ｗ／ｖ％、０．４ｗ／ｖ％または０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大濃度約０．０８ｗ／ｖ％、０．０９ｗ／ｖ％、１ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、３ｗ／ｖ％、４ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、６ｗ／ｖ％、７ｗ／ｖ％、８ｗ／ｖ％、９ｗ／ｖ％または１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、７０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、９０μｇ／ｍＬ、または１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬの濃度まで、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ、１０００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミミンと、を含む。

【0029】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0030】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％の濃度で、かつ最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0031】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0032】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．０４ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0033】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0034】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0035】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0036】

場合により、組成物は、
少なくとも約０．５ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0037】

場合により、組成物は、
少なくとも約１ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0038】

場合により、組成物は、
少なくとも約１ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0039】

場合により、組成物は、
少なくとも約１ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約１０ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0040】

場合により、組成物は、
少なくとも約１ｗ／ｖ％の濃度で、かつ、最大約５ｗ／ｖ％の濃度で存在するゼラチンと、
少なくとも約５０μｇ／ｍＬの濃度で、かつ、最大約１００μｇ／ｍＬの濃度で存在するラミニンと、を含む。

【0041】

場合により、ゼラチンおよびラミニンは、別々にまたは組み合わせて、組成物の固形分の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、すべてまたは実質的にすべてを形成する。場合により、ゼラチンおよびラミニンは、別々にまたは組み合わせて、組成物に含有される細胞外マトリックス内容物の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、すべてまたは実質的にすべてを形成する。場合により、細胞外マトリックス内容物は、組換えヒト、細胞外マトリックス成分などの天然物および／または合成物を含む。

【0042】

場合により、組成物は水性組成物である。場合により、水性組成物は、液体またはゲルを含むか、またはそれからなる。場合により、組成物は、溶媒の添加により水性組成物に形成され得る乾燥した組成物または実質的に乾燥した組成物として提供される。場合により、溶媒は、組成物のゼラチンおよび／またはラミニンなどの固体成分を溶解するように作用する。場合により、組成物は、溶媒中でゼラチンとラミニンを別々に、連続的に、または同時に混合する、場合により溶解することにより形成される。場合により、組成物は、ゲル様組成物を形成するように、溶媒中でゼラチンおよびラミニンを別々に、連続的に、または同時に混合する、場合により溶解することにより形成される。「ゲル様」により、組成物が細胞培養容器表面などの表面に組成物をコーティングする、さもなければ適用するのに適したコンシステンシーまたは粘度を有することが理解される。場合により、溶媒は、組成物のゼラチンおよび／またはラミニンなどの固体成分を溶解するように作用する。場合により、溶媒は生理食塩水、場合によりリン酸緩衝生理食塩水、または細胞培養培地である。場合により、溶媒は水であり、場合により滅菌水である。場合により、組成物は液体組成物またはゲル組成物として提供される。

【0043】

場合により、組成物は、１つ以上の追加の細胞外マトリックス成分、場合により１つ以上の追加の細胞外マトリックス成分を更に含む。場合により、１つ以上の追加の細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ニドゲン、およびヘパラン硫酸プロテオグリカンから選択される。場合により、または追加的に、組成物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）、および／またはＣｕｌｔｒｅｘ ＢＭＥ（商標）を更に含む。場合により、または追加的に、組成物は１つ以上の成長因子を更に含む。場合により、１つ以上の成長因子は、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）のうちの１つ以上から選択される。

【0044】

場合により、組成物は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を更に含む。場合により、ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２二塩酸塩（ｔｒａｎｓ−４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−４−ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）、ＧＳＫ４２９２８６Ａ（Ｎ−（６−フルオロ−１Ｈ−インダゾール−５−イル）−６−メチル−２−オキソ−４−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−３、４−ジヒドロ−１Ｈ−ピリジン−５−カルボキサミド）、Ｙ−３０１４１（４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（１Ｈ−ピロロ（２、３−ｂ）ピリジン−４−イル）シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）、ＲＫＩ−１４４７（Ｎ−［（３−ヒドロキシフェニル）メチル］−Ｎ’−［４−（４−ピリジニル）−２−チアゾリル］尿素二塩酸塩）、ファスジル、およびリパスジル（商標名Ｇｌａｎａｔｅｃ）のうちの１つ以上から選択される。

【0045】

場合により、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１μＭ〜１ｍＭ、場合により約１μＭ〜５００μＭ、場合により約１μＭ〜１００μＭ、場合により約１μＭ〜５０μＭ、場合により約５μＭ〜５０μＭ、場合により約１０μＭ〜５０μＭ、場合により約１０μＭ〜２０μＭ、更に場合により約１０μＭの濃度で組成物中に存在する。

【0046】

場合により、組成物は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＮａｎｏｇおよびＳＶ４０ラージＴのうちの１つ以上から選択される人工多能性幹細胞再プログラミング因子を含むか、またはそれからなる遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を更に含む。場合により、遺伝要素は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴからなる人工多能性幹細胞再プログラミング因子を含むか、またはそれからなる。場合により、遺伝要素はＴＥＲＴ１を更に含む。

【0047】

遺伝要素は、前述の再プログラミング因子および／またはＴＥＲＴ１のうちの１つ以上をコードする核酸配列を含むことが理解されよう。場合により、核酸コード配列、場合によりＤＮＡヌクレオチド配列は、体細胞へのトランスフェクションに適したプラスミドまたは他のベクターに含まれる。当該プラスミドまたは他の好適なベクターは、組成物と接触した体細胞への核酸コード配列のトランスフェクションを可能にするのに適しており、場合により、体細胞における核酸コード配列の発現を可能にするのに適していることが理解されよう。

【0048】

場合により、組成物は、遺伝要素が複合体を形成する担体を更に含む。場合により、担体は体細胞内に遺伝要素を送達するのに適している。場合により、担体は、ナノ粒子、ナノカプセル、ミセル系のうちの１つ以上から選択される。場合により、担体は、体細胞への核酸配列のナノ粒子媒介送達のためのナノ粒子を含む。記載された組成物は、負荷、場合により遺伝要素を含む負荷を体細胞に送達するのに適した任意のタイプのナノ粒子を含み得ることが理解されるであろう。したがって、場合により、ナノ粒子は脂質ベースのナノ粒子を含む。場合により、脂質ベースのナノ粒子は、リポソーム、場合によりカチオン性リポソームを含む。場合により、ナノ粒子は、カーボンナノチューブ、磁性ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、金属ナノ粒子、および量子ドット、場合によりナノ結晶量子ドットなどの無機ナノ粒子を含む。場合により、金属ナノ粒子は金ナノ粒子および／または銀ナノ粒子を含む。場合により、ナノ粒子はポリマーベースのナノ粒子を含み、場合によりナノ粒子は高分子ナノ粒子を含む。場合により、ポリマーベースのナノ粒子は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリＤ、Ｌ−グリコリド（ＰＬＧ）、ポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、および／またはポリシアノアクリレート（ＰＣＡ）を含むか、またはそれらからなる。場合により、ナノ粒子はミセル、場合により高分子ミセルを含む。場合により、ナノ粒子はデンドリマーナノ粒子を含む。場合により、ナノ粒子は、リポソーム−ポリカチオン−ＤＮＡナノ粒子および多層ナノ粒子などのハイブリッドナノ粒子を含む。場合により、ナノ粒子の表面はアニオン性官能基を含む。場合により、生体適合性ナノ粒子の表面はカチオン性官能基を含む。

【0049】

場合により、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、場合により１〜５００ｎｍ、場合により１〜４００ｎｍ、場合により１〜３００ｎｍ、場合により１〜２００ｎｍ、場合により１０〜２００ｎｍの範囲のサイズ、場合により更に任意で１０〜１１０ｎｍの平均サイズを有する。場合により、該サイズはナノ粒子の直径に対応する。

【0050】

場合により、核酸配列は、核酸配列がナノ粒子と複合体を形成するのに十分な時間、無血清細胞培養培地でナノ粒子と核酸配列を混合することにより、ナノ粒子に連結される。場合により、核酸配列は、少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、無血清細胞培養培地中でナノ粒子と混合される。場合により、核酸配列は、約１０〜３０℃の間、場合により約１８〜２５℃の間、約２０〜２３℃の間、場合によりほぼ室温でナノ粒子と混合される。場合により、核酸配列は、無血清細胞培養培地中でナノ粒子と最大約１２０分間、場合により最大約９０分間、場合により最大約６０分間、更に場合により最大約３０分間混合される。場合により、無血清培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）である。場合により、無血清培地は、ＨＥＰＥＳおよび炭酸水素ナトリウムで緩衝され、ヒポキサンチン、チミジン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、微量元素および成長因子を補充したイーグル最小必須培地である。

【0051】

理解されるように、本発明は、化学的に定義されたフィーダーフリーおよびゼノフリーの幹細胞培養システムにおいて人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の自己再生を確実に促進するラミニンおよびゼラチンを含む新規基質を提供する。

【0052】

したがって、更なる態様において、本発明は、体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングするための方法における、本明細書に記載される組成物の使用を提供する。

【0053】

更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される組成物を含む細胞培養容器を提供する。細胞培養容器は、細胞培養、特に体細胞培養および／または幹細胞培養で使用するための当技術分野で公知の任意の好適な容器であり得る。場合により、細胞培養容器は、９６ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレート、６ウェルプレート、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラスコ、Ｔ１７５フラスコのうちの１つ以上から選択される。スライド、場合により細胞培養スライドおよび細胞培養顕微鏡スライドは、細胞培養容器と見なすことができる。

【0054】

更なる態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物を含むキットを提供する。場合により、キットは、本明細書に記載される細胞培養容器を更に含む。場合により、キットは、本明細書に記載される組成物を含む細胞培養容器を更に含む。したがって、キットに含まれる細胞培養容器は、本明細書に記載される組成物を含み得る、すなわち、本明細書に記載される組成物を、細胞培養容器の表面、場合により細胞成長表面にコーティングし得ることが理解される。場合により、キットは、キットの使用説明書を更に含む。場合により、キットは、別個の成分として、またはキットのエンドユーザーが組み合わせることができる成分の組み合わせとして、例えばゼラチン、ラミニン、担体および／またはＲＯＣＫ阻害剤を含む、本明細書に記載される組成物の成分を含む。有利なことに、このキットにより、ユーザーは体細胞と好適な細胞培養培地とを基質に簡単に添加し、体細胞の人工多能性幹細胞への効率的かつ信頼性の高い再プログラミングを達成することができる。プログラミングは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、ＳＶ４０ラージＴ、および場合によりＴＥＲＴ１を含むまたはそれらからなる遺伝要素を体細胞に導入することにより達成し得る。遺伝要素の導入は、当該分野で既知の標準的なトランスフェクション技術によって達成することができる。有利なことに、トランスフェクションは、本明細書に記載されるように、体細胞への核酸配列のナノ粒子媒介送達を使用して達成される。すなわち、核酸配列を含み、本明細書に記載の組成物に埋め込まれたナノ粒子は、核酸配列を体細胞に送達し、核酸配列を体細胞内にトランスフェクトすることにより、細胞の再プログラミングを大幅に簡略化することができる。また、これにより、組成物およびキットを滅菌製品として製造および提供できるため、培養細胞の汚染の可能性が減少する。更に、再プログラミング効率は、本明細書において実証されるように改善することができる。

【0055】

したがって、更なる態様において、本発明は、体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラミングする方法であって、
（ｉ）体細胞を本明細書に記載される組成物と接触させ、
（ｉｉ）人工多能性幹細胞再プログラミング因子および場合によりＴＥＲＴ１を発現する遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を体細胞に導入し、
（ｉｉｉ）遺伝要素を含む該増殖体細胞を培養し、それにより人工多能性幹細胞を産生する、
ことを含む方法を提供する。

【0056】

場合により、工程（ｉ）において、体細胞を、組成物と接触するときに細胞懸濁培地に懸濁させる。場合により、細胞懸濁培地は細胞培養培地である。場合により、懸濁培地に懸濁させた体細胞を組成物と接触させることにより、懸濁培地が組成物を溶解させる。ナノ粒子および遺伝要素を含む組成物において、懸濁培地による組成物の溶解は、体細胞とナノ粒子および遺伝要素との間のアクセスを改善できることが理解されるであろう。

【0057】

場合により、体細胞は、以下に記載されるように人工多能性幹細胞を産生するために調製される。場合により、体細胞は以下に記載される細胞である。

【0058】

場合により、人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素は、以下に記載されるように体細胞に導入される。あるいは、人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素を、上記組成物に含まれるナノ粒子を介して体細胞に導入する。

【0059】

任意に、遺伝要素を含む体細胞を、以下に記載されるように更に培養する。遺伝要素を含む体細胞から産生された人工多能性幹細胞は内皮細胞に分化する。場合により、人工多能性幹細胞は、場合によりＢＭＰ４、アクチビンＡ、ＣＨＩＲ９９０２１およびｂＦＧＦ２、ならびに場合によりＶＥＧＦおよびＬＹ３６４９４７から選択される成長因子とともに人工多能性幹細胞を培養することにより、当技術分野で既知の技術によって内皮細胞に分化する。

【0060】

別の態様において、本発明は、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法であって、
（ｉ）試料から体細胞を単離し、
（ｉｉ）該体細胞を所定期間増殖させる、ことを含み、
当該増殖させた体細胞がＴＥＲＴ１を発現する方法を提供する。

【0061】

場合により、体細胞は、約１４日未満、場合により約１３日、場合により約１３日未満、場合により約１２日、場合により約１２日未満、場合により約１１日、場合により約１１日未満、場合により約１０日、場合により約１０日未満、場合により約９日、場合により約９日未満、場合により約８日、場合により約８日未満、場合により約７日、更に場合により約７日未満の所定期間増殖させる。

【0062】

場合により、体細胞は、少なくとも約１日、場合により約１日、場合により少なくとも約２日、場合により約２日、場合により少なくとも約３日、場合により約３日、場合により少なくとも約４日、場合により約４日、場合により少なくとも約５日、場合により約５日、場合により少なくとも約６日、場合により約６日、場合により少なくとも約７日、更に場合により約７日の所定期間増殖させる。

【0063】

場合により、体細胞は、２〜１３日、場合により２〜１２日、場合により２〜１１日、場合により２〜１０日、場合により２〜９日、場合により２〜８日、更に場合により２〜７日の所定期間増殖させる。

【0064】

場合により、体細胞は、３〜１３日、場合により３〜１２日、場合により３〜１１日、場合により３〜１０日、場合により３〜９日、場合により３〜８日、更に場合により３〜７日の所定期間増殖させる。

【0065】

場合により、体細胞は、４〜１３日、場合により４〜１２日、場合により４〜１１日、場合により４〜１０日、場合により４〜９日、場合により４〜８日、更に場合により４〜７日の所定期間増殖させる。

【0066】

場合により、体細胞は、５〜１３日、場合により５〜１２日、場合により５〜１１日、場合により５〜１０日、場合により５〜９日、場合により５〜８日、更に場合により５〜７日の所定期間増殖させる。

【0067】

場合により、体細胞は、６〜１３日、場合により６〜１２日、場合により６〜１１日、場合により６〜１０日、場合により６〜９日、場合により６〜８日、更に場合により６〜７日の所定期間増殖させる。

【0068】

場合により、体細胞は、７〜１３日、場合により７〜１２日、場合により７〜１１日、場合により７〜１０日、場合により７〜９日、場合により７〜８日、更に場合により７日の所定期間増殖させる。

【0069】

場合により、ＴＥＲＴ１発現は、所定期間増殖させる前の体細胞におけるＴＥＲＴ１の発現の少なくとも約１０％、場合により少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により少なくとも約９５％、場合により約１００％である。言い換えると、ＴＥＲＴ１発現は、増殖させていない体細胞、すなわち、上記増殖工程（ｉｉ）を受ける前の単離された体細胞におけるＴＥＲＴ１発現の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％である。

【0070】

理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、体細胞の増殖中にＴＥＲＴ１発現が減少し、体細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングにＴＥＲＴ１発現が必要であることを発見した。したがって、本明細書に記載される方法に従って産生される増殖体細胞は、増殖させた細胞が人工多能性幹細胞の作成に適しているようにＴＥＲＴ１を発現する。

【0071】

場合により、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡレベルおよび／またはＴＥＲＴ１タンパク質レベルを測定することにより、増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定する。場合により、増殖させた細胞のＴＥＲＴ１発現を増殖させていない細胞のＴＥＲＴ１発現と比較して、ＴＥＲＴ１の相対的発現レベルを判断する。言い換えれば、増殖細胞におけるＴＥＲＴ１発現は、非増殖細胞におけるＴＥＲＴ１発現に対して正規化され、ＴＥＲＴ１の相対的発現レベルを示す。場合により、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって、場合により体細胞からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＴＥＲＴ１プライマーを使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって測定する。場合により、体細胞から抽出したタンパク質を使用してＴＥＲＴ１タンパク質発現を測定し、必要に応じてＴＥＲＴ１特異的抗体を使用してタンパク質抽出物をウエスタンブロットして、ＴＥＲＴ１発現を検出する。場合により、体細胞の体細胞中のＴＥＲＴ１に結合するフルオロフォアを含むＴＥＲＴ１特異的抗体を使用し、蛍光顕微鏡下で該結合を観察してＴＥＲＴ１の発現レベルを判断することにより、ＴＥＲＴ１タンパク質発現を測定する。抗テロメラーゼ逆転写酵素抗体［Ｙ１８２］（ａｂ３２０２０）などのＴＥＲＴ１特異的抗体は、当技術分野で周知である。フルオロフォアは当技術分野で周知であり、フルオレセイン、Ｃｙ５などが含まれる。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで遺伝子発現を検出する方法は当技術分野で知られており、本明細書に記載されるＴＥＲＴ１発現を測定するために使用できることが理解されよう。

【0072】

場合により、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法は、増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定する工程を更に含む。場合により、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法は、増殖させたおよび増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定し、ＴＥＲＴ１の相対的発現レベルを判断することを更に含む。場合により、人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法は、増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定して、人工多能性幹細胞を産生するための増殖細胞の適合性を決定する工程を更に含み、当該増殖体細胞がＴＥＲＴ１を発現する場合、増殖体細胞は人工多能性幹細胞の産生に適していると判断される。場合により、ＴＥＲＴ１発現が、本明細書に記載のように所定期間増殖させる前の体細胞におけるＴＥＲＴ１の発現の少なくとも約１０％、場合により少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により少なくとも約９５％、場合により約１００％である場合、場合により、増殖体細胞は人工多能性幹細胞の産生に適していると判断される。換言すると、ＴＥＲＴ１の発現は、増殖させていない体細胞、例えば 上記増殖工程（ｉｉ）を受けていない単離した体細胞における、ＴＥＲＴ１の発現の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％である。

【0073】

場合により、体細胞は哺乳動物細胞であり、更に場合によりヒト細胞である。場合により、体細胞は初代細胞または不死化細胞である。場合により、体細胞は、被検体、場合によりヒト被検体から得られた生体試料から単離される。場合により、生体試料は組織の試料であり、場合によりヒト組織である。場合により、当該組織は、血液、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓、尿道、および他の尿器官組織のうちの１つ以上から選択される。場合により、体細胞は、単球およびリンパ球（ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＢおよびＴリンパ球）などの末梢血単核細胞、好中球、好塩基球および好酸球などの赤血球、マクロファージ、セルトリ細胞、内皮細胞、顆粒膜上皮、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、および心筋細胞などの筋肉細胞から選択される。場合により、体細胞は、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの成体幹細胞を含む。

【0074】

場合により、試料は血液試料であり、該血液試料の容量は、約１０ｍｌ未満、場合により約５ｍｌ未満、場合により約２．５ｍｌ未満、場合により約１ｍｌ未満、更に場合により約１ｍｌである。

【0075】

場合により、被検体はヒト被検体であり、該被検体は糖尿病に罹患している。場合により、該糖尿病は１型糖尿病、２型糖尿病、または妊娠糖尿病である。

【0076】

場合により、末梢血単核細胞は、被検体から試料を得る前には動員されていない。更に最適には、被検体から試料を取得する前、末梢血単核細胞は、外因的に適用された顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で動員されていない。

【0077】

場合により、体細胞は好適な増殖培地で増殖され、場合により、増殖培地は１つ以上の成長因子を補充した無血清培地（ＳＦＭ）を含み、場合により、該成長因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、デキサメタゾン、およびホロトランスフェリンから選択される。

【0078】

場合により、単離された体細胞を、約２〜４日間、場合により約２〜３日間、更に場合により約３日間の第一増殖期間にわたって増殖培地で増殖させる。場合により、単離された体細胞を、１ｍｌあたり約２〜６ｘ１０^６細胞、１ｍｌあたり約３〜５ｘ１０^６細胞、１ｍｌあたり約４ｘ１０^６細胞の密度でプレーティングし、約２〜４日間、場合により約２〜３日間、更に場合により約３日間の第一増殖期間中に増殖培地で増殖させる。場合により、第一増殖期間中に増殖させた体細胞を２〜４日間、場合により２〜３日間、更に場合により約３日間の第二増殖期間中に更に増殖させる。場合により、第一増殖期間に増殖させた体細胞を、その後１ｍｌあたり約０．５〜２ｘ１０^６細胞、１ｍｌあたり約０．５〜１．５ｘ１０^６細胞、１ｍｌあたり約１ｘ１０^６細胞の密度でプレーティングし、約２〜４日間、場合により約２〜３日間、更に場合により約３日間の第二増殖期間中に培地で増殖させる。

【0079】

場合により、本方法は、（ｉｉｉ）増殖体細胞を凍結保存することを更に含む。場合により、本方法は、（ｉｉｉ）膨張した体細胞を凍結培地に凍結保存することを更に含み、場合により、当該凍結培地は約５０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、約４０％の無血清培地（ＳＦＭ）および約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。

【0080】

更なる態様において、本発明は、人工多能性幹細胞を産生するための増殖体細胞の適合性を判断する方法であって、
（ｉ）増殖体細胞におけるＴＥＲＴ１の発現を測定し、
（ｉｉ）測定したＴＥＲＴ１の発現に基づいて、人工多能性幹細胞を産生するための増殖体細胞の適合性を判断すること、を含む方法を提供する。

【0081】

場合により、増殖体細胞がＴＥＲＴ１を発現する場合、増殖体細胞は、人工多能性幹細胞の産生に適していると判断される。場合により、ＴＥＲＴ１発現が、本明細書に記載のように所定期間増殖させる前の体細胞におけるＴＥＲＴ１の発現の少なくとも約１０％、場合により少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により少なくとも約９５％、場合により約１００％である場合、増殖体細胞は人工多能性幹細胞の産生に適していると判断される。換言すると、ＴＥＲＴ１の発現は、増殖させていない体細胞、例えば上記増殖工程（ｉｉ）を受けていない単離した体細胞における、ＴＥＲＴ１の発現の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％である。

【0082】

場合により、ＴＥＲＴ１発現を、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡレベルおよび／またはＴＥＲＴ１タンパク質レベルを測定することにより、場合により本明細書に記載されるようにＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡレベルおよび／またはＴＥＲＴ１タンパク質レベルを測定することにより、増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞において測定する。

【0083】

場合により、体細胞を、本明細書に記載されるように所定期間増殖させる。

【0084】

場合により、体細胞は、本明細書に記載される体細胞から選択される。

【0085】

更なる態様において、本発明は、人工多能性幹細胞を産生するための方法であって、
（ａ）人工多能性幹細胞再プログラミング因子を発現する遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を当該増殖体細胞に導入し、
（ｂ）遺伝要素を含む該増殖体細胞を培養し、それにより人工多能性幹細胞を産生する、
ことを含む方法を提供する。

【0086】

場合により、非ウイルストランスフェクション法により、場合によりエレクトロポレーションにより、遺伝要素を増殖体細胞に導入する。場合により、脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用して、増殖体細胞に遺伝要素を導入し、場合により、該脂質ベースのトランスフェクション試薬はＥｎｄｏｆｅｃｔｉｎ（商標）である。

【0087】

場合により、遺伝要素は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＮａｎｏｇおよびＳＶ４０ラージＴのうちの１つ以上から選択される人工多能性幹細胞再プログラミング因子を含むか、またはそれからなる。場合により、遺伝要素は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、Ｎａｎｏｇ、およびＳＶ４０ラージＴからなる人工多能性幹細胞再プログラミング因子を含むか、またはそれからなる。

【0088】

場合により、工程（ｂ）において、遺伝要素を含む増殖体細胞は増殖培地で増殖され、場合により、増殖培地は１つ以上の成長因子を補充した無血清培地（ＳＦＭ）を含み、場合により、該成長因子はエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、デキサメタゾン、およびホロトランスフェリンから選択される。場合により、遺伝要素を含む増殖体細胞を、少なくとも約１〜３日間、場合により約１〜３日間、更に場合により約２日間、増殖培地で培養する。場合により、遺伝要素を含む増殖体細胞を、細胞成長表面３．８ｃｍ^２あたり約１〜３×１０^６個の細胞、任意に細胞成長表面３．８ｃｍ^２あたり約２×１０^６個の細胞の密度でプレーティングし、少なくとも約１〜３日間、場合により約１〜３日間、更に場合により約２日間増殖培地で培養する。細胞成長表面は、典型的には、細胞の接着および成長に適した細胞培養プレートの基部またはそのウェルの基部を含むことが理解されるであろう。

【0089】

場合により、増殖培地で培養した後、遺伝要素を含む増殖体細胞を不活化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に播種し、再プログラミング培地で培養する。場合により、再プログラミング培地は、遺伝要素を含む増殖体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングさせるのに適した培地である。場合により、再プログラミング培地は、アミノ酸（グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなど）、ビタミンおよび／または酸化防止剤（チアミン、還元グルタチオン、アスコルビン酸２−ＰＯ_４など）、微量元素（Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ⁻、Ｉ⁻、Ｆ⁻、Ｍｎ^２＋、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、Ｚｒ^４＋など）および／またはタンパク質（トランスフェリン（鉄飽和）、インスリン、脂質リッチアルブミンなど）、ならびに、ｂＦＧＦ、β−メルカプトエタノールおよびＭＥＭ（最小必須培地）非必須アミノ酸（ＭＥＭ ＮＥＡＡ）を含む血清代替組成物（ノックアウト血清代替など）のうちの１つ以上を補充した無血清培地（ノックアウトＤＭＥＭなどのＳＦＭ）を含む。場合により、増殖培地で培養した後、遺伝要素を含む増殖体細胞を不活化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に播種し、再プログラミング培地で少なくとも約１〜２日間、場合により約１〜２日間、更に場合により約１日間培養する。場合により、増殖培地で培養した後、遺伝要素を含む増殖体細胞を不活化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に播種し、再プログラミング培地で、細胞成長表面３．８ｃｍ^２あたり１ｘ１０^４〜１ｘ１０^６個の細胞、場合により８ｘ１０^４〜１ｘ１０^５個の細胞の密度で少なくとも約１〜２日間、場合により約１〜２日間、更に場合により約１日間培養する。

【0090】

場合により、不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養した後、遺伝要素を含む増殖体細胞をＭＥＦから取り除き、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地で培養する。場合により、不活化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）で培養した後、遺伝要素を含む増殖体細胞をＭＥＦから除去し、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地で少なくとも約１〜２日間、場合により約１〜２日間、更に場合により約１日間培養する。場合により、ホウ酸ナトリウムは、約０．０２５〜２．５ｍＭ、場合により約０．１〜１ｍＭ、更に場合により約０．２５ｍＭの濃度で再プログラミング培地中に存在する。

【0091】

場合により、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地を、ホウ酸ナトリウムを含む新鮮な再プログラミング培地と毎日交換する。場合により、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地は、約４〜８日間、場合により約５〜７日間、更に場合により約６日間、ホウ酸ナトリウムを含む新鮮な再プログラミング培地と毎日交換する。

【0092】

場合により、ホウ酸ナトリウムを含む再プログラミング培地を、人工多能性幹細胞を含む１つ以上の細胞コロニーが形成されるまで、ホウ酸ナトリウムおよび塩基性線維芽細胞成長因子を含む馴化培地と毎日交換する。場合により、塩基性線維芽細胞成長因子、ホウ酸ナトリウムは、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、場合により約０．１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、更に場合により約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で再プログラミング培地に存在し、ホウ酸ナトリウムは、再プログラミング培地中に約０．０２５〜２．５ｍＭ、場合により約０．１〜１ｍＭ、更に場合により約０．２５ｍＭの濃度で存在する。

【0093】

更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される人工多能性幹細胞を産生するための体細胞の調製方法に従って産生される増殖体細胞を提供する。

【0094】

更なる態様において、本発明は、ＴＥＲＴ１を発現する増殖体細胞を提供する。場合により、ＴＥＲＴ１を発現する増殖体細胞において、ＴＥＲＴ１発現は、増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現の少なくとも約１０％、場合により少なくとも約２０％、場合により少なくとも約３０％、場合により少なくとも約４０％、場合により少なくとも約５０％、場合により少なくとも約６０％、場合により少なくとも約７０％、場合により少なくとも約８０％、場合により少なくとも約９０％、場合により約１００％である。場合により、ＴＥＲＴ１を発現する増殖体細胞は、本明細書に記載される人工多能性幹細胞を産生するための体細胞調製方法に従って産生される。

【0095】

場合により、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡレベルおよび／またはＴＥＲＴ１タンパク質レベルを測定することにより、増殖させたおよび／または増殖させていない体細胞におけるＴＥＲＴ１発現を測定する。場合により、増殖させた細胞のＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現を増殖させていない細胞のＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現と比較して、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡレベルの相対的発現レベルを判断する。言い換えれば、増殖細胞におけるＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現は、非増殖細胞におけるＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現に対して正規化されたＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現に対応して正規化され、ＴＥＲＴ１の相対的発現レベルを示す。場合により、ＴＥＲＴ１ ｍＲＮＡ発現を、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって、場合により体細胞からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＴＥＲＴ１プライマーを使用してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって測定する。場合により、体細胞から抽出したタンパク質を使用してＴＥＲＴ１タンパク質発現を測定し、必要に応じてＴＥＲＴ１特異的抗体を使用してタンパク質抽出物をウエスタンブロットして、ＴＥＲＴ１発現を検出する。場合により、体細胞の体細胞中のＴＥＲＴ１に結合するフルオロフォアを含むＴＥＲＴ１特異的抗体を使用し、蛍光顕微鏡下で該結合を観察して１の発現レベルを判断することにより、ＴＥＲＴ１タンパク質発現を測定する。抗テロメラーゼ逆転写酵素抗体［Ｙ１８２］（ａｂ３２０２０）などのＴＥＲＴ１特異的抗体は、当技術分野で周知である。フルオロフォアは当技術分野で周知であり、フルオレセイン、Ｃｙ５などが含まれる。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで遺伝子発現を検出する方法は当技術分野で知られており、本明細書に記載されるＴＥＲＴ１発現を測定するために使用できることが理解されよう。

【0096】

更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される人工多能性幹細胞を産生するための方法に従って産生された人工多能性幹細胞胞を提供する。

【0097】

更なる態様において、本発明は、本明細書に記載される増殖体細胞から産生された人工多能性幹細胞を提供する。場合により、人工多能性幹細胞は、本明細書に記載される人工多能性幹細胞を産生するための方法に従って産生される。

【0098】

更なる態様において、本発明は、療法に使用するための本明細書に記載の人工多能性幹細胞を提供する。場合により、本明細書に記載される人工多能性幹細胞は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、心血管疾患、糖尿病、糖尿病合併症、心不全、腎臓および生命疾患、がん、筋萎縮性側索硬化症、またはファンコニ貧血や嚢胞性線維症などの遺伝的症状の治療に使用するためのものである。本明細書に記載される人工多能性幹細胞は、幹細胞療法に適した他の状態および疾患の治療に使用できることが理解されよう。

【0099】

更なる態様において、本発明は、研究、場合により実験研究で使用するための、本明細書に記載される増殖体細胞および／または本明細書に記載される人工多能性幹細胞を提供する。

【0100】

本発明の態様の特徴の上記の説明から理解されるように、任意の特徴は、明示的に述べられていなくても、任意の組み合わせで組み合わせることができる。便宜上および簡潔にするために、任意の特徴がそのように列挙されているが、記載された発明の様々な態様における特徴の組み合わせを決して限定するものではない。特徴の組み合わせは、本発明の目的を達成するための化学的、物理的または構造的な非互換性、および適合性によってのみ制限され、その決定は、本開示に基づく熟練した読者の知識および能力の範囲内である。

【0101】

本明細書で使用される際、「増殖させる」、「増殖」などは、細胞培養分野の単語の通常の意味に従って、単離した体細胞を制御された条件下で成長させ、複製させて、細胞数を増加させることを意味する。体細胞が増殖され得る期間は、体細胞をプレーティングするか、さもなければ培養液中で増殖させる瞬間から計算され、この期間は、試料から体細胞を単離した後、または凍結保存などの保存期間の後、単離した細胞をプレーティングするか、さもなければ培養液中で増殖させる前に起こり得ることが理解されるであろう。増殖期間の終了は、増殖体細胞がその後の保存のため、またはそこからの人工多能性幹細胞の産生のために収穫されるか、さもなければ収集されるときに起こる。

【0102】

本明細書で使用される際、「培養」、「培養する」などは、細胞培養の分野での言葉の通常の意味に従って、制御された条件下、例えば、好適な培地、雰囲気、温度で、遺伝要素、場合によりエピソーム遺伝要素を含む単離した体細胞を成長させ、場合により複製させることを意味する。

【0103】

本明細書で使用する際、「約」は、記載された値が、正確に記載された値、場合により記載された値の±５％、場合により記載された値の±１０％、場合により記載された値の±１５％、場合により記載された値の±２０％、場合により記載された値の±３０％、場合により記載された値の±４０％、更に場合により記載された値の±５０％であることを意味する。本明細書で使用される際、「約」は、指定された日数に関連して使用される場合、記載された日数が、記載された値、場合により±３日、場合により±２日、場合により±１日、場合により±１８時間、場合により±１２時間、場合により±６時間、更に場合により±３時間であることを意味する。

【0104】

「含む」は、開示された特徴が、代替的に、特徴の記載された１つ以上の構成要素からなるか、または本質的になることが理解される。

【0105】

本発明の実施形態を、例として、添付の図面を参照して説明する。

【図面の簡単な説明】

【0106】

【図1】ＴＥＲＴ１がｉＰＳ細胞の再プログラミングの重要なメディエーターであることを実証する。（Ａ）ＴＥＲＴ１の発現レベルは、健康な志願者および糖尿病患者から得られた単核細胞（ＭＮＣ）を１４日間培養した後に予想外に消失する。（Ｂ）７日間のＭＮＣにおいてｓｈＲＮＡによりＴＥＲＴ１がノックダウンされた場合、再プログラミング効率が０％に低下し、これは、ＴＥＲＴ１発現がｉＰＳ細胞生成の重要なメディエーターであることを示す。（Ｃ）ＴＥＲＴ１レベルが正常な対照ＭＮＣにより、多能性幹細胞マーカーを発現するｉＰＳ細胞コロニーが生成された。これらの知見に基づいて、本明細書に記載されているように、多能性幹細胞を生成する新しいプロトコルが開発された。わずか数滴の血液から得られたＭＮＣを、わずか７日間増殖させ、ｉＰＳの再プログラミングに供した。このプロトコルは、再現可能かつ効率的な方法でｉＰＳ細胞コロニーを１週間以内に生成する。そのような新規の短いプロトコルの確立は、個別化された再生医療のための強力なツールである。

【図2】現在開示されている新規のアプローチに基づいて数滴の血液から得られたｉＰＳ細胞の生成および特徴付けを示している。（Ａ）健康志願者および糖尿病患者から得られた数滴の血液試料からのｉＰＳＣ生成を説明する図。（Ｂ）ｉＰＳＣは、定められた境界を有する円形コロニーを形成する。（Ｃ）免疫蛍光アッセイは、ｉＰＳＣがＣＤｙ１（インビトロライブ染色）、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびＬｉｎ２８などの多能性マーカーを発現することを示している。（Ｄ）ｉＰＳＣはＯｃｔ４、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇをｍＲＮＡレベルで発現する。（Ｅ）ｉＰＳＣは、タンパク質レベルでＴＲＡ−１−６０、Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８を発現する。（Ｆ）ｉＰＳＣは生体内で奇形腫を形成する。これらのデータは、これらの細胞が実際に多能性幹細胞であることを裏付けている。

【図3】ｉＰＳ細胞の機能的内皮細胞への分化を示す。（Ａ）内皮細胞（ＥＣ）系統へのｉＰＳ細胞分化の図。（Ｂ）ｉＰＳ−ＥＣの形態。（Ｃ）ｉＰＳ−ＥＣがｍＲＮＡレベルで内皮マーカーを発現することを示すｑＰＣＲデータ。（Ｄ）分化すると、ｉＰＳ−ＥＣはタンパク質レベルでＶＥ−カドヘリンを発現し、多能性マーカーＯＣＴ４の発現を停止する。（Ｅ）ｉＰＳ−ＥＣは、インビトロで密着結合を形成し、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、およびＺＯ−１を発現する。（Ｆ）ｉＰＳ−ＥＣはＬＤＬを取り込み、インビトロチューブ形成アッセイで血管構造を形成する。これらのデータは、これらの細胞が機能的なＥＣであり、薬物スクリーニングおよび細胞ベース療法のための強力なツールであることを裏付けている。

【図4】単眼細胞からのｉＰＳ細胞の生成に潜在的に関与する様々な因子の発現レベルをプロファイルするスクリーニングアッセイの結果を示す。増殖後９および１４日目の単眼細胞の発現レベルを測定した。

【図5】（Ａ）非統合エピソームプラスミドベクターｐＥＢ−Ｃ５（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＬｉｎ２８を過剰発現）、およびＴＥＲＴ１を補充したｐＥＢ−Ｔｇベクター（ＳＶ４０ラージＴ抗原を過剰発現）をトランスフェクトし、新しい基質上で成長させた増殖単眼細胞から生成されたｉＰＳ細胞を示す。明確に定められた円形の境界を持つ典型的なｉＰＳ細胞コロニーが観察される。（Ｂ）多能性マーカーＣＤｙ１に対して陽性染色されたｉＰＳ細胞コロニーを示す。

【発明を実施するための形態】

【0107】

材料および方法
血液単核細胞（ＭＮＣ）の単離および増殖
１〜２０ｍｌの非動員末梢血を、ＥＤＴＡコーティングされた４ｍｌチューブに静脈穿刺により採取した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液（１：１比）に重層し、室温で、５５０ｇで３０分間回転させることにより、勾配遠心分離によって血液を分離した。単核細胞（ＭＮＣ）は、プラズマ層とＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ緩衝層との間に軟層を形成する。上清を廃棄し、細胞を１ｍｌのＭＮＣ培地に再懸濁した。この培地には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−３、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、デキサメタゾン、およびホロトランスフェリンを補充した無血清培地（ＳＦＭ）が含まれる。具体的には、ＳＦＭ（１００ｍｌ用）は、４９ｍｌのＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１０５６０２３）、４９ｍｌのＦ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１７６５０２９）、１ｍｌのＩＴＳ−Ｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ４１４０００４５）、１ｍｌの化学的に定義された脂質濃縮物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１９０５０３１）、１ｍｌのペニシリン／ストレプトアビジン、１ｍｌのグルタマックス、５ｍｇアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ Ａ８９６０）、０．５ｇのＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ Ａ９４１８）、１．８μｌの１−チオグリセロール（ＳＩＧＭＡ Ｍ６１４５）を含む。ＭＮＣは、２Ｕｍｌの組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２８７−ＴＣ−５００）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３（ＩＬ−３；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号２００−０３）、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒト幹細胞因子（ＳＣＦ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号３００−０７）、４０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ番号１００−１１）、１μＭのデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ２９１５）、および１００μｇ／ｍｌのヒトホロトランスフェリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９１４−ＨＴ−１００ＭＧ）で補われますSFMを含む。細胞をカウントし、１２ウェル（ウェルあたり１ｍｌ）または６ウェル（ウェルあたり１〜４ｍｌ）プレートに１ｍｌあたり約４００万個の密度でプレーティングした。プレーティング後３日目に、すべての細胞を収集し、２５０ｇで５分間回転させることにより、培地を変更した。細胞を凍結培地（５０％ＦＢＳ、４０％ＳＦＭ、および１０％ＤＭＳＯ）で７日目から凍結保存するか、ただちに再プログラミングに使用した。

【0108】

再プログラミング
Ｌｏｎｚａ ＣＤ３４ヌクレオフェクターキットおよびＡｍａｘａヌクレオフェクター（プログラムＴ−０１６）を使用したエレクトロポレーションにより、１０μｇのプラスミド（８μｇのｐＥＢ−Ｃ５および２μｇのｐＥＢ−抗原Ｔ）で2百万細胞をトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、細胞を１２ウェルプレートのウェル内に２ｍｌのＭＮＣ培地、すなわちウェルあたり２００万個の細胞をプレーティングした。トランスフェクション後２日目に、細胞を収集し、カウントし、１２ウェルプレートのウェルあたり１００，０００〜８０，０００細胞の密度で再プログラミング培地に不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）に播種した（つまり、各ウェルの成長表面はおよそ３．８ｃｍ^２である）。再プログラミング用メディアには、ノックアウトＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＳＫＵ−１０８２９−０１８）、２０％ノックアウト血清代替品（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳＫＵ １０８２８−０２８）、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９３−８３７）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール、および０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＭＥＭ ＮＥＡＡ）を含む。トランスフェクション後３日目に、培地をチューブに集め、３００ｇで５分間遠心分離した。ペレットを新しい培地の残りの容量で再懸濁し、ウェルに戻してプレーティングした。コロニーが採取されるまで、ホウ酸ナトリウム（ＮａＢ）を０．２５ｍＭの濃度で培地に加えた。再プログラミング培地（ＮａＢを含む）は、新しい再プログラミング培地（ＮａＢを含む）で毎日変更した。トランスフェクション後９日目以降、再プログラミング培地（ＮａＢを含む）をＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＮａＢ（０．２５ｍＭ）を含む馴化培地と交換した。培地は毎日変更した。つまり、培地をＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）とＮａＢ（０．２５ｍＭ）を含む新鮮な馴化培地と交換した。７〜１０日目からコロニーが出現した。コロニーを採取したら、細胞系を樹立し、ＦＧＦ２［１０ｎｇ／ｍｌ］を補充した再プログラミング培地で培養した。

【0109】

本方法の更なる発展において、健康なドナーから得られ、上記のように約７日間増殖させた単核血液細胞（ＭＮＣ）を、標準の解凍プロトコルに従ってＭＮＣ培地で解凍した。６ウェルプレートのウェルを異なる基質（表４を参照）で４℃で一晩コーティングした。６ウェルプレートの各ウェルの成長表面積は通常、約９．５ｃｍ^２である。基質は、ゼラチン１％、ラミニン５０μｇ／ｍＬを含む本発明の新規基質であり、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を加え、ゼラチンおよびラミニンをＰＢＳ（ＥＳ）マトリゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含むゼラチン、細胞マトリックス（ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘ基底膜マトリックスゲル（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ−３０３５（商標）））、細胞マトリックスを含むＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＣｅｌｌＭａｔｒｉｘ基底膜マトリックスゲル（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ−３０３５（商標）））、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を混合することにより、濃いゲル状溶液に処方した。翌日、上記のように、非統合エピソームプラスミドベクターｐＥＢ−Ｃ５（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＬｉｎ２８を過剰発現）、およびｐＥＢ−Ｔｇベクター（ＳＶ４０ラージＴを過剰発現）（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．［５］およびＤｏｗｅｙ ｅｔ ａｌ．［６］）を使用して、２，０００，０００個のＭＮＣをトランスフェクトし、場合によりＴＥＲＴ１を補充した。ＴＥＲＴ１をベクターにクローニングし（ＮＭ＿１９８２５３．２から得られたクローニング配列）、当技術分野で知られている標準的なクローニング技術を使用して、ＴＥＲＴ１を過剰発現するプラスミドを生成した。２，０００，０００個のトランスフェクトＭＮＣを、２ｍｌＭＮＣ培地の６ウェルプレートの各ウェルに加えた。ＭＮＣ培地およびＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（商標）培地は、製造元の指示に従って加えた。ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、完全な、定義済みの、無血清かつゼノフリーの再プログラミング培地である。この培地は、線維芽細胞やその他の細胞型などの体細胞からｉＰＳ細胞を生成する際に、フィーダーフリーの条件下で、メーカーの指示に従って（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｄｎ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｆｉｌｅｓ／ｐｉｓ／ＤＸ２０２１７−ＰＩＳ＿１＿３＿０．ｐｄｆ？＿ｇａ＝２．２１６７０８１１６．３４３３９７０１１．１５ ２７１５８８０６−１５０４６１５２６９．１５２７１５８８０６）使用される。Ｒｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を３日目に添加した。ＲＯＣＫ阻害剤であるＹ−２７６３２二塩酸塩（ｔｒａｎｓ−４−［（１Ｒ）−１−アミノエチル］−Ｎ−４−ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩）は、ＴＯＣＲＩＳ（カタログ番号１２５４）から入手した。１０ｍＭのストック溶液を使用中に更に１：１０００に希釈した。５日目からコロニーが観察された。５日目から、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ培地を毎日交換し（２ｍｌ）、ＲＯＣＫ阻害剤（使用中に１０ｍＭ原液を１：１０００に希釈）を補充し、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で知られている標準プロトコルに従ってコロニーを選択し、増殖させ、特徴付けし、凍結させた。

【0110】

再度、本方法の更なる開発において、ナノ粒子を介して再プログラミング因子をＭＮＣに導入した。つまり、２ｍＭストックのナノ粒子を５％デキストロースで１：２に希釈して、１ｍＭの溶液を得た。ナノ粒子およびプラスミドの正しい量を、使用する細胞数に基づいて決定する。０．２５μｇのプラスミドＤＮＡを含む１．５μＬの１ｍＭナノ粒子溶液を使用することで、良好な結果が得られた（約１μｇのＤＮＡが約１ｘ１０^６個の細胞のトランスフェクションに適している）。まず、必要な量のＤＮＡ（再プログラミングプラスミド）に１２５μＬまで（６ウェルプレートの１ウェルに対して）無血清Ｏｐｔｉｍｅｍを加えた。無血清Ｏｐｔｉｍｅｍも最大１２５μＬのナノ粒子の容量まで加えた。次に、１２５μＬのＤＮＡ−Ｏｐｔｉｍｅｍを１２５μＬのナノ粒子−Ｏｐｔｉｍｅｍに滴下する。ＤＮＡ−ナノ粒子混合物を室温で３０分間インキュベートする。次に、ＤＮＡ−ナノ粒子混合物を基質に添加し、ナノ粒子に含まれる再プログラミング因子が埋め込まれた基質を含む製品を製造する。

【0111】

理解されるように、ＤＮＡは、それ自体、高分子電解質−ＤＮＡの負に帯電した糖リン酸骨格が、とりわけ以下のものに影響を及ぼす：（ｉ）溶液中のＤＮＡの立体配座とダイナミクス、（ｉｉ）小分子と大分子の両方との化学的および物理的相互作用の性質、ならびに（ｉｉｉ）表面および界面での吸着方法。上記の考慮事項により、ＤＮＡの送達に対する多くのアプローチは、正に帯電したポリマーの設計に焦点をあてている。カチオン性ポリマーは、静電相互作用を介して溶液中のＤＮＡと相互作用して、サイズ、電荷、および細胞によるＤＮＡの内在化および処理を促進できるその他の特性を持つ凝集体または集合体を形成することができる。

【0112】

基質は、本明細書に記載されるようなＲＯＣＫ阻害剤、例えば、Ｙ−２７６３２二塩酸塩をおよそ１０〜２０μＭの濃度で更に含んでもよい。

【0113】

奇形腫形成アッセイ
ｉＰＳ細胞（１ｘ１０^６個）をＭａｔｒｉｇｅｌと混合し、重度の複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに皮下注射した。８週間後、プラグを採取し、ＨＥ染色および奇形種形成のために切片を観察した。

【0114】

細胞分化
フィーダーフリー条件下で培養されたヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、解離培地を使用して切り離し、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）＋１０％ＦＢＳ中マウスコラーゲンＩＶ（ＢＤマウスコラーゲンＩＶ−５μｇ／ｍｌ）コーティングプレートに播種した。溶解培地は、ヒトｉＰＳコロニーを単一細胞に解離する試薬（ＲＣＨＥＴＰ００２、Ｒｅｉｎｎｅｒｖａｔｅ）を含んでいる。２５ｎｇ／ｍｌＢＭＰ４、１２ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、８μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（ｂＦＧＦ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９３−８３７）を培地に添加した（分化０日目）。４８時間後（２日目）、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＬＹ３６４９４７（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＧＭ−２＋１０％ＦＢＳと当該培地を交換し、１日おきに新しくした。分化の６日目に、ＣＤ１４４発現細胞のＭＡＣＳ媒介選択を実施し、選択した細胞をマウスコラーゲンＩＶコーティングプレートに播種した。ＭＡＣＳ（登録商標）技術は、試料内の目的の細胞をＭＡＣＳマイクロビーズで磁気標識し、試料をＭＡＣＳセパレータに配置されたＭＡＣＳカラムに適用し、カラム上に磁気的に捕捉して収集することにより、混合細胞集団から任意の細胞型を分離するべくマイクロビーズ技術を利用する。使用した培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１０μＭのＬＹ３６４９４７を補充した１０％ＦＢＳを含むＥＧＭ−２であった。

【0115】

ＲＮＡ抽出、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイムＰＣＲ
細胞を収穫し、冷ＰＢＳで洗浄し、Ｑｉａｚｏｌで溶解し、製造元の指示に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを精製した。ＲＮＡ収量は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して決定した。全ＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに変換した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行い、サーモサイクラーＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０シーケンス検出器（Ｒｏｃｈｅ）を使用して検出を行った。プライマー配列を表１に列挙する。標的遺伝子の発現を、参照遺伝子ＧＡＰＤＨに対して正規化した。

【表1】

【0116】

免疫蛍光染色
細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、ＰＢＳで０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間透過処理し、ＰＢＳ中５％ロバ血清で室温にて３０分間ブロックした。細胞を一次抗体とともに３７℃で１時間インキュベートした。当該抗体は次のとおりである：ウサギ抗ＶＥ−カドヘリン；ウサギ抗ＣＤ３１（ヒト特異的）；ウサギ抗ＫＤＲ；およびマウス抗ＳＭ２２。二次抗体との次のインキュベーションは、抗ウサギＡｌｅｘａ４８８および１０個の抗マウスＡｌｅｘａ５９４を使用して、３７℃で４５分間行われた。細胞を４’−６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色し、スライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２イメージング；Ｚｅｉｓｓ）またはＳＰ５共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ）で検査した。

【0117】

免疫ブロッティング
細胞を回収し、冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、超音波処理（２回、各６秒）（Ｂｒａｄｓｏｎ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ１５０）により溶解して、全細胞溶解液を得た。タンパク質濃度は、Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して決定した。５０μｇの全溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、Ｈｙｂｏｎｄ ＰＶＤＦ膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ）に転写し、次いで標準的な免疫ブロッティング手順を行った。結合した一次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体およびＥＣＬ検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して検出した。

【0118】

ＦＡＣＳ分析
ｉＰＳ−ＥＣをＦＡＣＳで分析して、フローサイトメーターのＣＤ１４４、ＫＤＲおよびその他の内皮マーカーの割合を決定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ分析を実行した。

【0119】

Ａｃ−ＬＤＬ取り込みアッセイ
アセチル化低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込みを検出するために、細胞をＤｉｌ−ａｃ−ＬＤＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）と共に４時間インキュベートし、蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｐｌａｎ２ ｉｍａｇｉｎｇ；Ｚｅｉｓｓ）で検査および撮影した。

【0120】

インビトロチューブ形成アッセイ
５ｘ１０^４のｉＰＳ、ｉＰＳ−ＥＣまたはＨＵＶＥＣを含有する細胞懸濁液を８ウェルチャンバースライドの５０μｌ／ウェルマトリゲル（ＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）の上に置き、３７℃で３０〜６０分間インキュベートしてゲルを固化させた。

【0121】

結果および考察
ＴＥＲＴ１はｉＰＳ細胞の再プログラミングの重要なメディエーターである
健康志願者および糖尿病患者から人工多能性幹細胞を生成する堅牢なプロトコルを開発する試みで、血液１ｍｌから単核細胞（ＭＮＣ）を分離した。細胞を細胞の再プログラミングに反応させる単核細胞増殖の最適な時点を定義するために、９日目および１４日目の単眼細胞の大規模なスクリーニングアッセイプロファイリングを行った（図４）。この大規模なスクリーニングアッセイには再プログラミング遺伝子、エピジェネティックモジュレーター、血管前駆細胞、ならびに初期および後期の内皮細胞系統遺伝子が含まれる。驚くべきことに、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ１）は、体細胞の再プログラミングにテロメア外機能を有していると思われ、ｉＰＳ細胞の再プログラミングの重要なメディエーターであることがわかっている。テロメラーゼ逆転写酵素（ヒトではＴＥＲＴ、ＴＥＲＴ１、またはｈＴＥＲＴと略される）は、酵素テロメラーゼの触媒サブユニットであり、テロメラーゼＲＮＡ成分（ＴＥＲＣ）とともに、テロメラーゼ複合体の最も重要な単位を構成する。図１Ａに示すように、ＴＥＲＴ１の発現レベルは、培養ＭＮＣの１４日後に完全に消失し（図１Ａ）、その時点での再プログラミング効率はほぼゼロになる。以下の表２は、７日間の増殖後のコロニー形成を示しているが、１４日間増殖させたＭＮＣからは単一のコロニーのみが形成された。

【表2】

【0122】

細胞の再プログラミングにおけるＴＥＲＴ１の役割を確認するために、７日間のＭＮＣでｓｈＲＮＡによりＴＥＲＴ１がノックダウンされ（図１Ｂ）、再プログラミング効率が０％に低下し（表３）、ＴＥＲＴ１発現がｉＰＳ細胞生成の重要なメディエーターであることを示している。ＴＥＲＴ１レベルが正常な対照ＭＮＣによりｉＰＳ細胞コロニーが生成され（表３）、これらの細胞はＣＤｙ１などの多能性幹細胞マーカーを発現する（図１Ｃ）。これらの発見に基づいて、多能性幹細胞を生成する新しいプロトコルが開発された。わずか数滴の血液から得られたＭＮＣを、わずか７日間増殖させ、ｉＰＳの再プログラミングに供した。このプロトコルは、初めて、再現可能かつ効率的な方法でｉＰＳ細胞コロニーを１週間以内に生成する。そのような新規の短いプロトコルの確立は、個別化された再生医療のための強力なツールである。

【表3】

【0123】

新規アプローチに基づく数滴の血液から得られたｉＰＳ細胞の生成および特徴付け
数滴の血液からのこの強力で高速かつ高効率の再プログラミング方法が生成され、得られたｉＰＳ細胞が完全に特徴付けられた。図２Ａには、健康志願者および糖尿病患者からの数滴の血液試料から得られたｉＰＳＣ生成を説明する図が示されている。ｉＰＳ細胞は、定められた境界を持つ円形コロニーを形成し、多能性幹細胞の典型的な形態を明らかにする（図２Ｂ）。ｉＰＳ細胞がＣＤｙ１（インビトロライブ染色）、Ｏｃｔ４、ＴＲＡ−１−６０およびＬｉｎ２８などの多能性マーカーを発現することを示す免疫蛍光染色が行われた。図２Ｃを参照のこと。更に、ｉＰＳ細胞はＯｃｔ４、Ｌｉｎ２８およびＮａｎｏｇをｍＲＮＡレベルで発現する（図２Ｄ）。重要なことに、ｉＰＳ細胞はタンパク質レベルでＴＲＡ−１−６０、Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８を発現する（図２Ｅ）。最後に、新規アプローチに基づいて得られたｉＰＳ細胞の多能性を、ＳＣＩＤマウスで奇形腫の形成を行うことによりインビボで試験した。実際、ｉＰＳ細胞はインビボで６〜８週間以内に奇形腫を形成した（図２Ｆ）。これらの結果は、健康志願者および糖尿病患者からの数滴の血液から、高速かつ高効率な新規方法に基づいてｉＰＳ細胞が生成されることを強調している。

【0124】

体細胞（ＭＮＣ）を成長させてｉＰＳ細胞に再プログラミングする好適なフィーダーフリーおよびゼノフリーの基質を特定するために、実験を行った。様々な濃度のゼラチンおよびラミニンを好適な緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）と混合し、硬化させた。表４に示すように、ゼラチンおよびラミニンの組み合わせを含む特定の基質のみが、示された量で、好適なゲルコンシステンシーを生成し、ｉＰＳ細胞のコロニーを生成することを発見した。

【表4】

【0125】

また、コーティング基質、播種密度、トランスフェクション法、および／または高継代ＭＮＣの使用を変更したフィーダーフリー培地を使用して実験を実施した。高継代細胞（つまり、再プログラミングの１４日以上前に拡張させた体細胞（ＭＮＣ））を使用してもコロニーは得られなかった。また、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）やＦｕｇｅｎｅ（登録商標）６などの他のトランスフェクション法ではコロニーは得られなかった（データは示さず）。６ウェルプレートのウェルあたり約１〜２×１０^６個の細胞の播種密度により、再プログラミング効率が最良となった。表５からわかるように、標準のコーティング基質はｉＰＳ細胞コロニーをまったく、またはほとんど生成しなかったが、新規基質はわずか５〜７日後にコロニーを生成した。

【表5】

【0126】

したがって、５〜７日目頃に、十分に定義された多能性関連マーカーの評価により、明確な円形限界を持つ典型的なｉＰＳ細胞コロニーが新規基質上で観察された（図５Ａを参照）。ｉＰＳ細胞コロニーは、多能性マーカーＣＤｙ１に対して陽性染色した（図５Ｂ）。

【0127】

機能的内皮細胞へのｉＰＳ細胞の分化
次の工程は、ｉＰＳ細胞を内皮細胞（ＥＣ）系統に分化させることであった。図３Ａには、ＥＣへのｉＰＳ細胞の分化の模式図が示されている。簡潔に言うと、ｉＰＳ細胞をフィーダーフリー条件下で培養し、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）１０％ＦＢＳのマウスコラーゲンＩＶコーティングプレートに播種した。培地には、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１２ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ Ａ、８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した。４８時間後（２日目）、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ_２および１０μＭのＬＹ３６４９４７（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＧＭ−２＋１０％ＦＢＳと当該培地を交換し、１日おきに新しくした。分化の６日目に、ＣＤ１４４発現細胞のＭＡＣＳ媒介選択を実施し、選択した細胞をマウスコラーゲンＩＶコーティングプレートに播種した。使用した培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１０μＭのＬＹ３６４９４７を補充した１０％ＦＢＳを含むＥＧＭ−２であった。得られたｉＰＳ−ＥＣは、ＥＣの典型的な形態を明らかにする（図３Ｂ）。ｉＰＳ−ＥＣがｍＲＮＡレベルでＫＤＲ、ＣＤ１４４、ｅＮＯＳなどのＥＣマーカーを発現することもリアルタイムデータで示されている（図３Ｃ）。重要なことに、ＥＣの分化時に、ｉＰＳ−ＥＣはＶＥ−カドヘリンをタンパク質レベルで発現し、多能性マーカーＯＣＴ４の発現を停止する（図３Ｄ）。驚くべきことに、ｉＰＳ−ＥＣは、インビトロで密着結合を形成し、ＶＥ−カドヘリン、ＰＥＣＡＭ−１、およびＺＯ−１を発現する（図３Ｅ）。機能的には、ｉＰＳ−ＥＣはＬＤＬを取り込み、インビトロチューブ形成アッセイで血管構造を形成する（図３Ｆ）。これらの結果は、機能的ＥＣがもたらされ、薬物スクリーニングおよび細胞ベース療法のための強力なツールであることを明確に実証する。

【0128】

更なる開発では、フィーダーフリー条件下で培養されたヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、解離溶液（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）を使用して切り離し、ＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）１０％ＦＢＳ中マウスコラーゲンＩＶ（Ｃｕｌｔｒｅｘ Ｍｏｕｓｅ Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＶ（３４１０−０１０−０１、Ｒ＆Ｄ））に播種した。培地には、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、１２ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ Ａ、８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、および２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加した（ＭＡＣＳ）。４８時間（分化２日目）後、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ_２および１０μＭのＬＹ３６４９４７（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥＧＭ−２ １０％ＦＢＳと当該培地を交換し、１日おきに新しくした。分化６日目に、以前に示したように（Ｃｏｃｈｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４４発現細胞のＭＡＣＳを介した磁気選択を行った。陽性選択した細胞を、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦおよび１０μＭのＬＹ３６４９４７を補充したＥＧＭ−２ １０％ＦＢＳ培地でマウスコラーゲンＩＶコーティングプレートに播種した。

【0129】

考察
この研究では、新規で高速かつ高効率の戦略に基づいてｉＰＳ細胞を生成する再プログラミング方法を初めて開発した。当研究室には、体細胞集団（線維芽細胞または単核細胞）のｉＰＳ細胞［３］および部分ｉＰＳ細胞（ＰｉＰＳ）［４］への再プログラミングの豊富な経験がある。このプロセスでは、糖尿病患者および健康な対照の体細胞を使用し、ＤＮＡを含まない統合技術を利用している。この研究では、ｉＰＳ細胞の再プログラミングに対する新規の短いアプローチを提案することにより、更に進んでいる。幹細胞ベース療法は、医療研究に新たな分野をもたらし、健康管理に革命をもたらす可能性があり、組織拒絶や免疫抑制薬の使用に伴うリスクなしに、個別化医療を適用する能力を提供する。定義により、幹細胞は、自己再生能力が高く、相対的な周囲の化学環境または「ニッチ」に応じて、多数の異なる細胞型に分化する生得的な能力を有する。幹細胞の用途は、心血管疾患（ＣＶＤ）、様々な悪性腫瘍、およびアルツハイマー病の治療にまで及ぶ。一般的に、幹細胞は、その効力、つまり、身体の様々な細胞型に分化する相対的な能力に応じて分類できる。多能性と記述されているものは、体のすべての細胞系統を形成することができるが、多能性状態のものは更に最終分化し、結果的に、採用できる細胞型のレパートリーに関してより制限されている。したがって、最も強力なそれらの細胞は細胞ベースの治療戦略に最も有用であるということになる。胚性幹細胞は、唯一の天然の多能性ヒト幹細胞であり、通常、体細胞核移植および結果として生じる胚盤胞の内部細胞塊からの抽出後に単離される。それにもかかわらず、腫瘍形成、ヒト胚の相対的な供給および一般市民の倫理的懸念に関する懸念を含む、前者の細胞の適用には多くの障壁が残っている。しかしながら、科学者たちは、胚性幹細胞における多能性の維持に関与するまさに同じ要因が体細胞のそのような効力を潜在的に促す可能性があると推論している。驚くべきことに、マウス線維芽細胞培養から人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を生成するには、わずか４つの選択因子の組み合わせで十分であることがわかった。これらの要因には、遺伝子調節タンパク質、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ−Ｍｙｃが含まれる。その後、成人皮膚線維芽細胞からのヒトｉＰＳ細胞の生成が可能であることが、やはり同じ４つの因子の異所性発現を通して見出された。その後の分析により、ヒトｉＰＳ細胞は、増殖能、多能性細胞特異的遺伝子のエピジェネティックな状態、および医療用途にとって非常に重要な３つの胚葉を生成する能力など、ヒト胚細胞と多くの特徴を共有していることが明らかになった。そのような知見は、ヒトｉＰＳ細胞が体細胞系から実際に生成され得るという決定的な証拠を提供するのに役立つ。他の研究により、これらの表面上典型的な因子の発現時に多能性状態を採用するヒト体細胞の能力が再確認された。信じられないことに、２００９年には、単一の山中転写因子であるＯｃｔ４の過剰発現が、成体マウス神経幹細胞のｉＰＳ細胞への再プログラミングに十分であることが報告された。山中因子によって規制されている正確なグローバルターゲットおよびシグナルネットワークの包括的な説明は、前述の因子を含む９つの転写因子の正確なシス作用性標的が特定された、後の２つの研究の組み合わせによって定義され、更なる標的プロモーターが特定され、この研究をマウス胚細胞中で山中因子によって制御されるシグナル伝達カスケードの分析まで拡張した。関与するシグナル伝達カスケードのアレイを考慮すると、これらの経路が非常に複雑であることが分かる。再生医療の分野に関して、これらの細胞には大きな可能性があり、現代社会に影響を及ぼす最も衰弱させる疾患のいくつかを治療する可能性がある。それら細胞の適用が創造性によってのみ制限される場合が非常によくある。臨床環境での使用を超えて、ｉＰＳ細胞は疾患モデリングおよび新規薬物スクリーニング試験のための貴重なツールとなる可能性がある。

【0130】

体細胞の再プログラミング
過去１０年以内に、様々なヒト体細胞系からｉＰＳ細胞を産生するためにいくつかの方法が採用されてきた。レトロウイルの遺伝子導入を改善するために、更に複雑なベクターが考案および作成された。すなわち、レンチウイルスをベースとするベクターであり、更なる研究で採用された。

【0131】

前述のプロトコルが明らかに成功したにもかかわらず、レトロウイルスベクターは信じられないほど非効率的であり、感染した体細胞に実質的な遺伝的異質性を生み出し、わずか０．００１〜０．１％の細胞しかその後の多能性状態を獲得するものがない。これらの非効率性を考慮して、薬物誘導性レンチウイルスベクターシステムが開発され、初期の方法と比較して、２桁以上の効率の向上が報告された。それにもかかわらず、再プログラミング因子の多くは癌遺伝子であり、レトロウイルスベクターの使用は挿入変異誘発のリスクを高め、かなりの発癌性形質転換のリスクをもたらす。その結果、レトロウイルスベクターによるｉＰＳ細胞の生成は、疾患の病因のモデリングなどのインビトロ研究に適用される場合にのみ適切である。より少ない因子でのｉＰＳ細胞の産生は、腫瘍形成を潜在的に回避する可能性があると推測でき、実際、選択研究はｃ−ｍｙｃ癌遺伝子の排除の成功を実証している。しかしながら、これは重要なことではなく、その後の再プログラミング効率の低下により、有害な変異の蓄積の増加を招く。

【0132】

このように、非変異レンチウイルスベクターが開発され、それにより、より適切な治療用ｉＰＳ細胞が生成され、挿入変異誘発が減少し、細胞株間の悪性腫瘍の発生が同時に減少した。

【0133】

したがって、より短い時間枠で、かつ、より高効率な方法でｉＰＳ細胞を生成するには、より高度な戦略が緊急に必要である。本研究では、７日間のＭＮＣが高レベルのエピジェネティック遺伝子ＴＥＲＴ１を発現し、それにより、細胞が細胞再プログラミングに応答し、非常に短時間でｉＰＳ細胞に向かって迅速かつ効率的に「形質転換」されることを見出した。初めて、少量の血液から分離した細胞を使用してｉＰＳ細胞を生成する堅牢な方法が実証された。しかしながら、ｉＰＳ細胞は血液細胞から導出することができるが、再プログラミング効率の低さと安全性に関連する大きな問題があり、それは大量の血液量、場合によっては顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を使用した血球の薬物誘導動員のための要件に関連する。現在、ｉＰＳ細胞を迅速かつ安全に生成できる血液ベースのキットは限られている。この研究では、より低侵襲性のｉＰＳ細胞生成の新規アプローチを開発した。患者／ドナーに特異的な細胞再プログラミングのための血液単核細胞（ＭＮＣ）の使用は、線維芽細胞の使用よりも被検体に対して低侵襲であり、重要なことには血液を動員することなく、わずか１ｍｌの血液しか必要としない。ドナーの以前の成長因子治療を必要とせず、末梢血は静脈穿刺によって抽出される。健康なドナーと糖尿病患者の両方の試料に適用可能性がある。これは、その状態により治癒が困難な糖尿病患者にとって特に重要である。迅速なアプローチである：わずか７日間で増殖する非常に少量の血液細胞（１ｍｌ）から細胞を再プログラミングすることができ、再プログラミングのわずか９日後に完全に再プログラミングされたｉＰＳ細胞コロニーを生成する。より高速かつ効率的である：ＭＮＣを、７日間で最大２．５倍まで増殖させることができる。高効率的である：ＭＮＣの再プログラミング効率は最大０．０２％であり、これは、統合フリーおよびウイルスフリーの遺伝子送達方法を使用する他のプロトコルによって得られる効率と比較して高い。完全に再プログラミングされたｉＰＳ細胞コロニーの確立は、現在のプロトコル全体で報告されている：他のプロトコルは、特徴付けまたは分化工程に失敗する部分的に再プログラミングされた細胞の生成につながるため、これは非常に重要である。この方法で得られたｉＰＳ細胞は、完全に再プログラミングされた多能性幹細胞として特徴付けられ、ＥＣへと正常に分化した。本方法はウイルスフリーである：細胞に再プログラミング遺伝子を送達するためにウイルスを使用する必要はなく、代わりに非統合エピソームベクターを使用することができる。これにより、再プログラミングされた細胞の変異が減少し、それらの細胞が再生医療でより安全に使用される。本方法はフィーダーフリーである。ヒト胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞を使用する必要はない。これは、ヒトｉＰＳ細胞を成長させるときに一般的に使用される。したがって、外部汚染のリスクがない。これは、ヒトの疾患を研究したり、それを患者の治療に変換したり、将来の臨床使用に適用したりする際に大きな利点である。費用効果が高い：エピソームベクターの複製および使用は、センダイウイルスやエピソームベクタートランスフェクションキットなどの細胞再プログラミングのための他の非統合遺伝子送達方法と比較した場合、非常に費用対効果が高い。最後に、柔軟な方法である：ベクターの作成および使用に、特定のキットは必要ない。

【0134】

薬物スクリーニングおよび細胞ベース療法のために患者特異的ｉＰＳ細胞を生成するために本方法を広く使用することができる
重要なことに、この研究では、糖尿病患者からのｉＰＳ細胞が生成され、ＥＣに分化した。２０２５年までに、３億８千万人の糖尿病患者が存在し、２０３０年までに糖尿病が死因の第７位になると予測されている。糖尿病は、若年死亡の世界的に主要な原因である。糖尿病は、心臓発作、脳卒中、下肢切断、腎不全および失明の主要な原因であり、それらはすべて生活の質に深刻な影響を与え、死を引き起こす荒廃した状態である。２型糖尿病患者の約半分は心血管系の原因で若年死亡し、およそ１０％は腎不全で死亡する。１型糖尿病と２型糖尿病の両方から生じる大血管および微小血管合併症の病原性の基礎は複雑で多因子であるが、進行性のＥＣ機能不全は重要である。糖尿病環境を特徴付ける高血糖症、高血圧症および脂質異常症の結果として、酸化ストレス、軽度の炎症、および血小板過活動を伴う血管内皮で、イベントの悪循環が発生する可能性がある。特に高血糖が内皮機能障害にどのように影響するかは、完全には理解されていない。したがって、先駆的なアイデアや、ｉＰＳ細胞の優れた技術を通じて糖尿病患者からＥＣを導出する可能性などの新しいツールに基づいて実施する研究が非常に緊急に必要である。ｉＰＳ細胞は、糖尿病の下流の原因因子に対する治療戦略のターゲティングに関して非常に大きな可能性を秘めており、それは顕著なＥＣ機能不全である。実際、糖尿病の過程で失われたまたは損傷したものを置換し、糖尿病の合併症を防ぐ機能的な血管組織の生成は、特にＥＣの自発的な再生が非常に遅いという事実を考慮すると、治療が非常に困難な疾患であった。この血管の再内皮化に加えて、細胞ベース療法も脈管形成に向けられる可能性があり、糖尿病の主要な合併症である急性心筋梗塞後の虚血組織内の血管新生をサポートする。したがって、糖尿病患者から得られたＥＣは、ペトリ皿内の患者固有の細胞を表す独特なツールであり、病気の原因を初めて調べる、無限の数の潜在的な薬物をスクリーニングする、新規療法を開発する、そして、細胞ベース療法に使用される機能細胞を生成するために使用することができる。糖尿病および糖尿病の合併症は、新規方法が甚大な大きな影響を与え得る一例にすぎない。リストは無限であり、無数の患者がこの有望かつ強力な戦略に基づいた新規治療を待っている。

【0135】

本発明は、本明細書に記載される実施形態に限定されず、本発明の範囲から逸脱することなく補正または修正することができる。

【0136】

参考文献
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【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【手続補正書】

【提出日】2020年1月29日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]

【国際調査報告】