特表 2020-521807 細菌感染を処置するための手段および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-521807(P2020-521807A)

(43)【公表日】2020年7月27日

(54)【発明の名称】細菌感染を処置するための手段および方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20200626BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20200626BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20200626BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20200626BHJP

   A61K 49/06 20060101ALI20200626BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20200626BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/06ZNA

   A61K38/16

   A61P31/04

   A61K51/08

   A61K49/06

   A61K49/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】98

(21)【出願番号】特願2020-512912(P2020-512912)

(86)(22)【出願日】2018年5月9日

(85)【翻訳文提出日】2020年1月6日

(86)【国際出願番号】EP2018062152

(87)【国際公開番号】WO2018206732

(87)【国際公開日】20181115

(31)【優先権主張番号】17170233.5

(32)【優先日】2017年5月9日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】17170252.5

(32)【優先日】2017年5月9日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】514185600

【氏名又は名称】ブイアイビー ブイゼットダブリュ

【氏名又は名称原語表記】ＶＩＢ ＶＺＷ

(71)【出願人】

【識別番号】519399408

【氏名又は名称】ルーヴェン カトリック大学，ケー．ユー． ルーヴェン アールアンドディー

【氏名又は名称原語表記】ＫＡＴＨＯＬＩＥＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＬＥＵＶＥＮ，Ｋ．Ｕ．ＬＥＵＶＥＮ Ｒ＆Ｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和 清司

(72)【発明者】

【氏名】スヒムコウイッツ，ユースト

(72)【発明者】

【氏名】ルソー，フレデリック

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

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4C084CA59

4C084DA42

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4C084NA14

4C084ZB351

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4C085HH03

4C085HH07

4C085HH11

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4C085KA29

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4C085KB07

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4C085LL20

4H045AA10

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4H045AA30

4H045BA10

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA17

4H045BA18

4H045BA19

4H045BA20

4H045BA40

4H045EA29

4H045FA20

(57)【要約】

本発明は、天然に存在しない抗菌ペプチドに関する。より具体的には、ペプチドは、多剤耐性菌の感染を処置するために用いることができる。加えて、本発明は、抗菌ペプチドを生成するための方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細菌の１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導するように、例えば前記細菌における前記１つ以上の一次標的タンパク質を含む封入体を形成するように、設計された、天然に存在しない抗菌ペプチドであって、ここで、前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質は、３−フェニルプロピオネート−ジヒドロジオール／桂皮酸−ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（Ｈｃａｂ）タンパク質を含む、前記天然に存在しない抗菌ペプチド。

【請求項2】

前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質が、
− シャペロンタンパク質ｓｋｐ（Ｓｋｐ）、リン酸レギュロンセンサータンパク質（ＰｈｏＲ）、ジペプチド・トリペプチドパーミアーゼＡ（Ｄｔｐａ）、有望なセンサー様ヒスチジンキナーゼＹｅｄＶ（probable sensor-like-histidine kinase）（ＹｅｄＶ）、特徴づけられていないＮａ（＋）／Ｈ（＋）交換体ＹｊｃＥ（ＹｊｃＥ）、浸透圧センサータンパク質ＥｎｖＺ（ＥｎｖＺ）、センサータンパク質ＲｓｔＢ（ＲｓｔＢ）、センサータンパク質ＺｒａＳ（ＺｒａＳ）、推定の特徴づけられていないタンパク質ＹｂｆＯ（ＹｂｆＯ）、センサーヒスチジンキナーゼＤｃｕＳ（ＤｃｕＳ）、シグナル伝達ヒスチジン−タンパク質キナーゼＡｔｏＳ（ＡｔｏＳ）、ギ酸ハイドロゲンリアーゼサブユニット４（ｈｙｃＤ）、芳香族アミノ酸エクスポーターＹｄｄＧ（ＹｄｄＧ）、ＵＰＦ０２２６タンパク質ＹｆｃＪ（ＹｆｃＪ）、および内膜タンパク質ｙｆｅＺ（ＹｆｅＺ）；
− 表８において列記されるタンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；および／または
− 表９において列記されるタンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質
をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。

【請求項3】

前記１つ以上の一次標的タンパク質において、１つ以上の凝集傾向領域（ＡＰＲ）と共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する、請求項１または２に記載のペプチド。

【請求項4】

前記１つ以上のＡＰＲのアミノ酸配列が、ＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）であるか、またはＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）と比較して単一のミスマッチを示す、請求項３に記載のペプチド。

【請求項5】

ＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）、ＧＬＧＬＡＬＡ（配列番号２０２）、ＧＬＧＬＡＩＶ（配列番号２０３）、ＧＬＧＬＡＭＶ（配列番号２０４）、ＧＬＧＬＳＬＶ（配列番号２０５）、ＧＬＡＬＡＬＶ（配列番号２０６）、ＧＬＧＬＡＶＶ（配列番号２０７）、ＧＬＰＬＡＬＶ（配列番号２０８）、ＧＶＧＬＡＬＶ（配列番号２０９）、ＧＬＧＬＡＬＳ（配列番号２１０）、ＧＬＬＬＡＬＶ（配列番号２１１）、ＧＬＧＬＡＬＱ（配列番号２１２）、ＧＩＧＬＡＬＶ（配列番号２１３）からなる群より選択される１つ以上のＡＰＲと共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する、請求項３または４に記載のペプチド。

【請求項6】

細菌が、グラム陰性であり、好ましくは大腸菌属またはアシネトバクター属、より好ましくは、大腸菌、Acinetobacter radioresistensまたはAcinetobacter baumaniiである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項7】

前記細菌に対して３２μｇ／ｍｌ未満、例えば２５μｇ／ｍＬ以下、１２μｇ／ｍＬ以下、または６μｇ／ｍＬ以下の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項8】

前記１つ以上のＡＰＲと共凝集するように設計された配列Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７を含み、ここで、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項9】

１つ以上のＤ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項10】

以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含み、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各々のＡ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項11】

各々のＡ_２ｉ−１およびＡ_２ｉが、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｐから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または１〜３の非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択される、請求項１０に記載のペプチド。

【請求項12】

各々のＺ_ｉが、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である、請求項１０または１１に記載のペプチド。

【請求項13】

Ａ_２ｉ−１、Ａ_２ｉ、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７、および／またはＺ_ｉのうちの１つ以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項14】

請求項１〜１３のいずれか一項に記載のペプチドから生成された、ペプチド模倣物。

【請求項15】

検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項16】

半減期の延長を増大させる分子をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項17】

分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項18】

１つより多くの細菌分類群、例えば１つより多くの細菌の属、種または株に対して抗菌効果を示す、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項19】

医薬としての使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項20】

抗菌剤としての使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項21】

診断剤としての使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物。

【請求項22】

請求項１〜１８のいずれか一項に記載のペプチドまたはペプチド模倣物および薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。

【請求項23】

細菌の１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導するように、例えば前記細菌における前記１つ以上の一次標的タンパク質を含む封入体を形成するように、設計された、天然に存在しない抗菌ペプチドであって、ここで、前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質は、表４において列記されるタンパク質から選択されるタンパク質を含む、前記天然に存在しない抗菌ペプチド。

【請求項24】

前記１つ以上の一次標的タンパク質において、１つ以上の凝集タンパク質セグメント（ＡＰＲ）と共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する、請求項２３に記載のペプチド。

【請求項25】

前記１つ以上のＡＰＲのアミノ酸配列が、表４において列記されるとおりであるか、またはそれと比較して単一のミスマッチを示す、請求項２４に記載のペプチド。

【請求項26】

細菌が、グラム陰性であり、好ましくは大腸菌属またはアシネトバクター属、より好ましくは、大腸菌、Acinetobacter radioresistensまたはAcinetobacter baumaniiである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項27】

前記細菌に対して３２μｇ／ｍｌ未満、例えば２５μｇ／ｍＬ以下、１２μｇ／ｍＬ以下、または６μｇ／ｍＬ以下の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項28】

以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）ｎを含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のペプチドであって、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− ＡＰＲ中に含まれるペプチドの名称は、表５において表され（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表され、ここで、ＡＰＲは、天然のアミノ酸を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するペプチド配列において存在するアミノ酸の非天然のアミノ酸アナログを含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸のペプチド配列におけるＤ−アミノ酸置換を含み、
およびここで、ＡＰＲ中のアミノ酸は、直列または逆方向リピートであってよく、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである、
前記ペプチド。

【請求項29】

各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉが、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｐから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または１〜３の非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択される、請求項２８に記載のペプチド。

【請求項30】

各々のＺ_ｉが、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である、請求項２８または２９に記載のペプチド。

【請求項31】

Ａ_２ｉ−１、Ａ_２ｉ、ＡＰＲ、および／またはＺ_ｉのうちの１つ以上のアミノ酸が、Ｄ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項32】

検出可能な標識をさらに含む、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項33】

半減期の延長を増大させる分子をさらに含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項34】

分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項35】

医薬としての使用のための、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項36】

抗菌剤としての使用のための、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項37】

診断剤としての使用のための、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項38】

請求項２３〜３４のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。

【請求項39】

以下のステップ：
（ｉ）５〜１４アミノ酸、例えば５〜１２アミノ酸、または６〜１４アミノ酸、例えば６〜１２アミノ酸、例えば６〜１０アミノ酸の長さを有する凝集傾向領域（ＡＰＲ）のin silicoのリストを作製すること、ここで、ＡＰＲは、細菌プロテオームにおいて同定される、
（ｉｉ）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎに基づくＡＰＲを含む、２０〜２００個の数の異なるペプチドを合成すること、ここで、ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択される、
（ｉｉｉ）抗菌効果について前記ペプチドを試験すること、および抗菌ペプチドを生成すること
を含む、抗菌ペプチドを産生する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の分野
本発明は、天然に存在しない抗菌ペプチドに関する。より具体的には、ペプチドは、多剤耐性菌の感染を処置するために用いることができる。加えて、本発明は、抗菌ペプチドを生成するための方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

本発明への導入
複数の薬物に対して耐性の微生物は、主要な関心事であり、その結果は、細菌感染に特に罹患しやすい小児において最も重篤であり得る。発展途上国における最も一般的な小児細菌疾患である肺炎、他の呼吸器感染症および赤痢は、古い抗生物質の多くによっては、もはや治癒可能ではない。結果は破壊的である：例えば細菌による急性呼吸器感染症は、毎年３００万人を超える小児を死亡させる。これらの疾病のうちの多くの症例は、一般的な抗生物質に対していまや耐性となった株により引き起こされる。より裕福な国においては、病院は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）の爆発的増加に振り回されている。１９７４〜２００４年に、ＭＲＳＡの有病率は、多くの米国の病院において、ブドウ球菌感染のうちのおよそ２パーセント〜５０パーセント超まで増加し、数万人の死亡者をもたらした。抗生物質に対する耐性はまた、患者の治療のコストに対して驚異的な影響を有する。多くの貧困国においては、薬物のための支出は、保健医療のコスト全体のうちの大部分を占め、保健に対する総支出のうちの２０〜６０パーセントにわたる。第一選択の薬物が失敗した場合、第二選択の代替的な薬物は、ほとんど常に、はるかにより高価であり、より大きな医学的監視を必要とする。例えば、１人の広範に薬剤耐性のＴＢの患者を治療するために、２００人の感受性ＴＢの患者を治療するのと同じだけのコストがかかる。既知の病原体の他に、比較的最近の、本質的に多くの薬物に対して耐性の日和見生物の出現もまた、医療技術においてもたらされてきた進歩を複雑化している。より多数の免疫無防備状態の患者と共に、より長い期間を免疫無防備状態において過ごすことにより、いくつかの生物は「特化した」病原体となっており、これは典型的には、最も受攻性の患者のみを攻撃する。これらの日和見病原体のうちには、腸球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、緑膿菌およびAcinetobacter baumaniiがある。

【0003】

本発明において、本発明者らは、広範囲にわたるタンパク質恒常性の崩壊により細菌を殺傷するためにタンパク質凝集を利用する新規のデザイナー抗生物質のパラダイムを開示する。タンパク質の恒常性またはタンパク質恒常性（proteostasis）の喪失^１は、高度に込み合った細胞内環境が、それらのネイティブの立体配置を得るために誤りがちなフォールディング反応を受ける必要がある多様なポリペプチドを近接させることに起因して^２、あらゆる生細胞にとっての不断の脅威である。この脅威を制御するために、細胞は、分子シャペロン、プロテアーゼおよび他の特化した分子の複雑なネットワークを進化させてきた^３。この機構の基本的な構成成分は生命の全ての界において保存されているが、細菌は、真核細胞において観察される、より精巧なバージョンと比較して、相対的に単純なタンパク質恒常性のネットワークを有する^４。これらの細胞性応答の機序にかかわらず、ヒトのタンパク質フォールディングの病理学は、（例えば変異の結果としての）凝集性タンパク質への持続的な暴露下において、タンパク質恒常性ネットワークはやがて崩壊し、これが最終的に細胞死をもたらすことを明らかにしてきた^５。一方、タンパク質凝集は、高度に規則正しく特異的なプロセスであることが明らかとなる：凝集は、無関係のポリペプチドの間よりも、類似するポリペプチドの間でより効率的である^６〜８。機械論的なレベルにおいては、タンパク質凝集は、短い凝集傾向のある配列セグメント（ＡＰＲと称される）により媒介され、これは、平均して、一次ポリペプチド配列において、１００アミノ酸ごとにほぼ１回起こる。これらのＡＰＲは、一般に（必ずではないが）、球状のタンパク質の疎水性コアまたはタンパク質−タンパク質相互作用境界面を構成する配列セグメントである。残念ながら、これらの三次タンパク質相互作用の様式を提供するための物理化学的要件はまた、タンパク質凝集にも有利である^９。実際に、ネイティブのタンパク質の最も安定な部分を形成する一方で、（部分的に）アンフォールドされたタンパク質において、ＡＰＲはまた、別のタンパク質からの同一のＡＰＲと自己集合して、さらにより安定なベータ構造の凝集体を形成することができる^１０。凝集のリスクは、したがって、翻訳中にタンパク質がそのネイティブの立体配置を得る前に、最も高くなる^１１。全体的に、細菌プロテオームは、より高次の生物よりも高い固有の凝集感受性を示す^１４。加えて、細菌におけるタンパク質のターンオーバーは、それらの高い代謝および細胞分裂の速度を支持するためにより迅速である必要があり、これが、細菌におけるタンパク質凝集の可能性をさらに増大させる。細菌のタンパク質恒常性は、新規の抗生物質のための薬物標的として、ますます研究されてきている^１５。例えば、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）であるオンコシン（oncocin）は、リボソームの出口チャネルに結合することにより、その抗菌活性を発揮する^１６。興味深いことに、ペプチドのアミロイドを形成する傾向と、それらの抗菌活性との間には、注目すべきオーバーラップが存在し^{１７、１８}、本発明者らは、先に、グラム陽性表皮ブドウ球菌の凝集性タンパク質フラグメントに由来するペプチドが、これらの細菌に対して特異的に毒性であり得ることを観察した^１９。

【0004】

タンパク質凝集は、配列特異的プロセスであり、このことが、あるタンパク質が、その自己の凝集の鋳型となるが、異種配列の凝集の鋳型とはならないことを可能にしている。本発明者らは、以前に、この特色を、ウェスタンブロットにおける特異的なタンパク質検出のために^８、または標的タンパク質の短い凝集傾向のある配列フラグメント（ＡＰＲ）を用いて特異的タンパク質ノックダウンを誘導するために利用した。本発明者らは、標的ＡＰＲに融合したトランスジェニックＧＦＰキャリアを用いて、シロイヌナズナおよびトウモロコシの両方において特異的な機能喪失型表現型を作製し、これらはそれぞれ植物のサイズの増大およびデンプン含有量の増加をもたらした^２１。本発明者らはまた、合成ペプチドを用いて同じ効果を得ることが可能であることを見出し、最近になって、ヒト細胞により内部移行され、凝集により特異的にＶＥＧＦＲ−２の不活化を誘導する、バシン（vascin）と命名されたペプチドを設計した。さらに、バシンは、同質遺伝子的マウスモデルにおいてＶＥＧＦＲ−２依存的腫瘍増殖を阻害するin vivoでの活性を示す^４７。最近になって、本発明者らはまた、グラム陽性ブドウ球菌の内因性ＡＰＲを保有する合成ペプチドが、in vitroで凝集に関連する細菌の死を誘導することができるか否かを調査し、in vivoでＭＲＳＡに対して活性である数種を見出した^１９。

【発明の概要】

【0005】

特にグラム陰性細菌において迅速に増大している抗菌剤耐性の問題に即して、本発明者らは、ここで、高レベルの毒素を産生し、感染により血性下痢および腎不全をもたらす^２０腸管出血性E. coli株O157:H7に対する新規の抗菌性ペプチドの開発に着手する。薬剤耐性の発生は、複数の標的を有する薬物に対してはより困難であるという仮定の下に、本発明者らは、複数の細菌タンパク質のミスフォールディングまたは凝集を引き起こすことができるペプチドを探索した。この目的のために、本発明者らは、E. coliプロテオームにおいて高度な重複性を有した１２５個の凝集性配列をスクリーニングした。この様式において、このＡＰＲを含む１つのペプチドが、高度に類似したＡＰＲを含む多くのタンパク質のフォールディングに潜在的に影響を及ぼし得た。この戦略を用いて、本発明者らは、病原性E.coliにおいて殺菌性のタンパク質凝集および封入体形成を効率的に誘導する数種のペプチドを同定した。これらのうちの１つの代表的なものは、本明細書においてコルぺプチン（colpeptin）１と命名され、哺乳動物細胞に対してはほとんどまたは全く毒性を示さなかったが、また、多数の他の細菌性病原体に対しては活性であり（表２を参照）、マウス膀胱感染症モデルにおいてin vivoでE. coliに対して有効であった。本発明者らは、コルぺプチン１などの非天然のペプチドの内部移行の後に、コルぺプチン１の一次標的により促進される複数のタンパク質の迅速な凝集カスケードが起こり、細菌のタンパク質恒常性の崩壊をもたらすことを示す。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1-1】抗菌性凝集性ペプチドの活性、細胞毒性および凝集。（Ａ）ＭＩＣ濃度で処置されたE. coli株O157に対する選択されたペプチドの時間−殺傷曲線（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。（Ｂ、Ｃ、Ｄ）樹脂中に包埋されたE coli O157の横断面の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）。

【図1-2】Ｂは、偽処置されたものであり、ＣはＰ２処置された、ＤはＰ１０５処置されたE coli O157である（２ｈ）。

【図1-3】（Ｅ）ペプチドまたはアンピシリンの致死量以下の用量（ＭＩＣの５０％）で３６日間にわたり維持された培養のＭＩＣ値をモニタリングすることによる自然な耐性の発達のモニタリング。（Ｆ）選択されたペプチドによるヒト赤血球の濃度依存的溶血（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。

【図1-4】（Ｇ）CellTiter Blueアッセイ（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）、および（Ｈ）ＬＤＨ放出アッセイ（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）によって測定された、ヒトＨｅＬａ細胞に対するコルぺプチン１の細胞毒性。（Ｉ）５０ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ７）中１００μＭの最終ペプチド濃度まで単量体を希釈した２分後に存在する、コルぺプチン１単量体（１）〜９量体（９）のESI‐IMS‐MS Driftscopeプロット。ESI‐IMS‐MS Driftscopeプロットは、ＩＭＳのドリフト時間・対・質量／電荷（ｍ／ｚ）・対・強度（ｚ、平方根スケール）を示す。データは、３回再現された単一の実験からのものである。（Ｊ）あらたに溶解されたコルぺプチン１の記録されたＤＬＳデータから、直鎖状ポリマーを粒子モデルとして用いて計算された、粒子のサイズ分布のヒストグラム。

【図1-5】（Ｋ）２５０．０００ｇでの２時間にわたる超遠心の後のペプチド試料の溶解度（４回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。（Ｌ）先のパネルにおいて得られた不溶性画分のＦＴＩＲスペクトル（４回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。（Ｍ）コルぺプチン１の調製物に添加されたアミロイド特異的色素ｐＦＴＡＡの蛍光強度を、アルツハイマーベータ−ペプチドのアミロイド線維により同じ濃度で単量体単位において観察された強度に対して正規化したもの（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。

【図1-6】（Ｎ）コルぺプチン１の代表的な透過型電子顕微鏡画像（酢酸ウラニルによるネガティブ染色）。（Ｏ）１ｍＭのヘキサホスフェートの存在下においてｐＦＴＡＡ蛍光によりモニタリングされたコルぺプチン１の凝集動態学（４回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。

【0007】

【図2-1】クロスシーディングおよびin vivoでの活性。（Ａ）E coli O157と混合されＦＩＴＣ標識コルぺプチン１で処置されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡画像（緑色のチャネル）。青色のチャネルは、ＤＡＰＩであり、赤色はCellMask Deep Red細胞膜色素である。

【図2-2】（Ｄ）ヒト血清の存在下における細菌の増殖に対するコルぺプチン１の阻害剤効果（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）。（Ｅ）１８日間にわたり３０ｍｇ／ｋｇのコルぺプチン１で処置された動物の血清を用いての、固定されたコルぺプチン１に対するＥＬＩＳＡ（３個体のマウスからの３回再現）。

【図2-3】（Ｆ〜Ｉ）経尿道的にE coli O157に感染したマウスの臓器における、コルぺプチン１（Ｐ２）および対照（アンピシリン、バッファーおよびＰ２−Ｐｒｏ、１５動物／群）による処置の後の、（Ｆ）腎臓、（Ｇ）結腸、（Ｈ）膀胱および（Ｉ）尿管における細菌の負荷量。詳細については、材料および方法を参照。

【0008】

【図3-1】取り込みおよび封入体形成。（Ａ〜Ｅ）以下のＦＩＴＣ蛍光（ｘ軸）およびヨウ化プロピジウム蛍光（ｙ軸）を測定する、１０，０００個のE coli O157細胞の蛍光励起細胞選別（ＦＡＣＳ）分析：（Ａ）未処置の細菌と熱により不活化された細菌とを１：１で混合したもの、（Ｂ）１５分間にわたりＦＩＴＣ標識コルぺプチン１で処置された細菌のもの。

【図3-2】（Ｃ）１時間にわたり処置されたもの。（Ｄ）３時間にわたり処置されたもの。（Ｅ）６時間にわたり処置されたもの。（Ｆ）Ａ〜Ｅにおいて示されるような４回の独立した実験からのＦＩＴＣ陽性細胞の平均集合サイズ。

【図3-3】（Ｇ）ＦＩＴＣ−コルぺプチン１で１５分間にわたり、および（Ｈ）１時間にわたり処置されたE. coliの蛍光顕微鏡画像。（Ｉ）コルぺプチン１およびｐＦＴＡＡで処置されたE. coli O157の蛍光顕微鏡画像。（Ｊ）バッファー、非凝集性Ｐ２−Ｐｒｏおよびコルぺプチン１（Ｐ２）で処置されたE. coli O157におけるアミロイド特異的色素ｐＦＴＡＡの蛍光発光スペクトル（３回の繰り返しの平均）。（Ｋ）コロニー形成に対するコルぺプチン１のタイミング依存的効果。（Ｌ）Ａ〜Ｅにおいて示されるような４回の独立したＦＡＣＳ実験からのＰＩ陽性細胞の平均集合サイズ。（Ｍ〜Ｏ）E coli O157の走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）。（Ｍ）は、偽処置された細菌の、（Ｎ）Ｐ１０５処置された、および（Ｏ）Ｐ１４処置されたE. coli O157の画像である。

【0009】

【図4-1】コルぺプチン１およびｐ５３ＣＤ封入体の特徴づけ。（Ａ）ｐ５３ＣＤを過剰発現する細菌および非形質転換対照の増殖曲線（３回再現の平均値およびｓ．ｄ．）、（Ｄ）コルぺプチン１、Ｐ２Ｐｒｏまたはバッファーで処置されたE coli O157、および比較のために、ヒトのｐ５３タンパク質のコアドメインを通常および一過性に過剰発現するE coli BL21から精製された封入体のＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー染色。

【図4-2】（Ｅ）Ｄにおけるものと同じ試料のウェスタンブロット分析。（Ｆ）ＤｎａＫの蛍光融合物（ｍＣｅｒ）を安定して発現するE coli細胞を、コルぺプチン１で処置したものの蛍光画像。（Ｈ）組み換え産生されたＨｃａＢに対して産生された抗体を用いての、コルぺプチン１で処置された細菌の可溶性および不溶性の画分のウェスタンブロット。（Ｊ）コルぺプチン１と共凝集すると予測されるタンパク質の、計算された翻訳効率（Tullerら^３５に従う）。

【0010】

【図5】コルぺプチン１により処置されたマウスの、ＩＰを介する１８日間の注射の後の体重。

【図6】３０ｍｇ／ｋｇのコルぺプチン１で連続した１８日間にわたり処置されたマウスの組織切片の病態学的分析。

【図7】コルぺプチン１の単回注射（１０ｍｇ／ｋｇ）の３時間後のex vivoでの臓器の蛍光イメージング。

【図8】配列が表４において表される２８のペプチドのセットを、E. coli BL2株、Acinetobacter baumannii、肺炎桿菌および緑膿菌に投与した。ＭＩＣ値を表す。

【0011】

【図9-1】上のパネルは、E. coliの多数の臨床分離株に対するコルぺプチン１（図中、Ｐ２）の活性（ＭＩＣ値）を列記する。１２種の異なる抗生物質に対する臨床分離株の感受性（Ｓ）または耐性（Ｒ）または中程度の耐性（Ｉ）を、パネルにおいて表す（特定の抗生物質に対するＣＬＳＩ基準に従うデータ）。ＭＩＣ値＜３２μｇ／ｍｌを、活性とみなす。３２μｇ／ｍｌのコルぺプチン１が、試験した最も高い濃度であった。

【図9-2】下のパネルは、A. baumanniiの多数の臨床分離株に対するコルぺプチン１（図中、Ｐ２）の活性（ＭＩＣ値）を列記する。１２の異なる抗生物質に対する臨床分離株の感受性（Ｓ）または耐性（Ｒ）または中程度の耐性（Ｉ）を、パネルにおいて表す（特定の抗生物質に対するＣＬＳＩ基準に従うデータ）。ＭＩＣ値＜３２μｇ／ｍｌを、活性とみなす。３２μｇ／ｍｌのコルぺプチン１が、試験した最も高い濃度であった。Ｐ２変異体についての参照は、表１において記載するコルぺプチン１から誘導されたバリアント非活性配列を意味する。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
本発明は、特定の態様に関して、および特定の図面を参照して記載されるが、本発明は、それらに限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。請求の範囲における任意の引用記号は、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。無論、必ずしもすべての側面または利点が、本発明の任意の特定の態様のとおりに達成され得るものではないことが理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、本発明は、必ずしも本明細書において教示または示唆され得るような他の側面または利点を達成することなく、本明細書において教示されるような１つの利点または利点の群を達成または最適化する様式において具現または実行し得ることを理解するであろう。

【0013】

本発明は、組織および操作の方法の両方について、それらの特色および利点と一緒に、以下の詳細な説明を、添付の図面と組み合わせて読み参照することにより最良に理解され得る。本発明の側面および利点は、本明細書において後に記載される態様（単数または複数）から明らかであるか、またはこれらを参照することにより解明されるであろう。本明細書全体にわたる「一態様（one embodiment）」または「一態様（an embodiment）」への言及は、当該態様に関連して記載された特定の特色、構造または特徴が、本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、句「一態様において（in one embodiment）」または「一態様において（in an embodiment）」の出現は、本明細書全体にわたる多様な場所において、必ずしも全て同じ態様を指すものではないが、同じ態様を指す場合もある。同様に、本発明の例示的な態様の記載において、本発明の多様な特色は、ときに、多様な発明の側面のうちの１つ以上の開示の合理化および理解の補助を目的として、単一の態様、図面、またはその説明において、一緒にグループ化されることが、理解されるべきである。この開示の方法は、しかし、請求された発明が、各請求項において明示的に列記されるものより多くの特色を必要とするという意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の請求の範囲が反映するとおり、本発明の側面は、単一の前述の開示された態様の全ての特色よりも少ないものにおいて存在する。

【0014】

単数形の名詞を参照する際に、不定冠詞または定冠詞、例えば「a」または「an」、「the」が用いられる場合、これは、何か別段に特に記述されない限り、その名詞の複数形を含む。用語「含むこと（comprising）」が、本説明および請求の範囲において用いられる場合、それは、他の要素またはステップを除外しない。さらに、第１、第２、第３などの用語は、本説明および請求の範囲において、類似の要素の間を区別するために用いられ、必ずしも、連続的または経時的な順序を記載するためのものではない。そのように用いられる用語は、適切な状況下においては交換可能であり、本明細書において記載される本発明の態様は、本明細書において記載または説明されているもの以外の順序における操作が可能であることが、理解されるべきである。以下の用語または定義は、本発明の理解において補助するためにのみ提供される。本明細書において特に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての用語は、本発明の分野における当業者にとって有するであろう意味と同じ意味を有する。実施者は、当該分野の定義および用語について、特にSambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第４版、Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York（2012）；およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology（補遺114）、John Wiley & Sons, New York（2016）を教示される。本明細書において提供される定義は、当業者により理解されるものよりも狭い範囲を有するものと解釈されるべきではない。

【0015】

「約」とは、本明細書において用いられる場合、例えば量、時間的期間などの測定可能な値を指す場合、特定された値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、およびなおより好ましくは±０．１％のバリエーションを包含することを意図される。なぜならば、かかるバリエーションは、開示される方法を実施するために適切であるからである。

【0016】

用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、さらに本明細書において交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーおよびその合成アナログおよびバリアントを指す。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が合成の天然に存在しないアミノ酸、例えば対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログであるアミノ酸ポリマーに当てはまるのみならず、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも当てはまる。この用語はまた、グリコシル化、リン酸化、アミド化、酸化およびアセチル化などの、ポリペプチドの翻訳後修飾を含む。「組み換えポリペプチド」によってとは、組み換え技術を用いて、すなわち、組み換えまたは合成ポリヌクレオチドの発現を通して作成されたポリペプチドが意味される。用語「発現」または「遺伝子発現」とは、１つの特定の遺伝子または複数の特定の遺伝子または特定の遺伝子コンストラクトの転写を意味する。用語「発現」または「遺伝子発現」は、特定の意味において、１つの遺伝子または複数の遺伝子または遺伝子コンストラクトの、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの、その後の後者のタンパク質への翻訳を伴わない、転写を意味する。プロセスは、ＤＮＡの転写および生じたｍＲＮＡ生成物のプロセッシングを含む。用語「組み換え宿主細胞」、「操作された細胞」、「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」とは、本明細書において用いられる場合、組み換えベクターおよび／またはキメラ遺伝子コンストラクトが導入された細胞を指すことを意図される。かかる用語は、特定の対象細胞のみならず、かかる細胞の子孫をも指すことが意図されることが、理解されるべきである。特定の修飾は、変異または環境の影響に起因して、後に続く世代において起こり得るので、かかる子孫は、実際に、親細胞とは同一でない場合があるが、本明細書において用いられる場合は、用語「宿主細胞」の範囲内になお含まれる。用語「調節する（modulate）」、「調節する（modulates）」、または「調節（modulation）」とは、特定のレベルまたは活性の増強（例えば増大）または阻害（例えば減少）を指す。用語「増強する（enhance）」または「増大させる（increase）」とは、特定のパラメーターの、少なくとも約１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、または１５倍もの増大を指す。

【0017】

用語「阻害する（inhibit）」または「低下させる（reduce）」またはこれらの文法的バリエーションは、本明細書において用いられる場合、特定のレベルまたは活性の少なくとも約１５％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くの減少または減弱を指す。特定の態様において、阻害または減少は、検出可能な活性を、ほとんどもたらさないか、または本質的にもたらさない（最大でも、顕著でない量、例えば、約１０％未満またはわずか５％）。

【0018】

用語「接触させる（contact）」またはその文法的バリエーションは、本発明の天然に存在しないペプチドまたはそのバリアントおよび細菌単離株に関して用いられる場合、天然に存在しないペプチド（またはそのバリアント）と細菌単離株とを、互いに対して生物学的効果を発揮するために十分に、互いの近傍に置くことを指す。いくつかの態様において、接触させるという用語は、特化した天然に存在しないペプチドの、細菌単離株への結合を意味する。「治療有効」量とは、本明細書において用いられる場合、対象に何らかの改善または利益を提供する量である。言い換えると、「治療有効」量とは、対象における少なくとも１つの臨床的症状の何らかの軽減、緩和または減少を提供するであろう量である。当業者は、対象に何らかの利益が提供される以上は、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。用語「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」、または「〜の処置（treatment of）」により、対象の状態の重篤度が、低下するか、または少なくとも部分的に改善または改変されること、および、少なくとも１つの臨床的症状の何らかの軽減、緩和または減少が達成されることが意図される。本明細書において用いられる場合、「機能的」ペプチドとは、そのペプチドに通常関連している少なくとも１つの生物学的活性（例えば、細菌に結合してその増殖を阻害する（または細菌を殺傷する）こと）を実質的に保持するものである。特定の態様において、「機能的」ペプチドとは、未修飾のペプチドが有する活性の全てを実質的に保持する。生物学的活性を「実質的に保持する」によってとは、ペプチドが、ネイティブのポリペプチドの生物学的活性のうちの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを保持すること（およびさらにネイティブのペプチドより高いレベルの活性を有し得ること）が意味される。タンパク質結合および細菌阻害活性などの生物学的活性は、本明細書において記載されるアッセイおよび当該分野において周知の他のアッセイを用いて測定することができる。

【0019】

本明細書において用いられる場合、用語「保存的アミノ酸置換」とは、ペプチド配列において通常存在するアミノ酸を、類似のサイズ、電荷または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを意味する。保存的置換の例として、イソロイシン、バリンおよびロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基に対する置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、１つの極性（親水性）残基の、別のものに対する、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンの間、およびグリシンとセリンとの間の置換が挙げられる。加えて、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの塩基性残基の、別のものに対する置換、または、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の酸性残基に対する置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリジンなどの極性（親水性）残基に対する、および／または極性残基の、非極性残基に対する置換が挙げられる。

【0020】

本発明は、広範囲にわたるタンパク質恒常性の崩壊により病原性細菌の増殖を阻害する（および／またはこれを殺傷する）ために凝集を利用する、新規のデザイナー抗生物質のパラダイムを提供する。特に、本発明者らは、E. coliのプロテオームにおいて重複する短い凝集−核形成性配列を含む、多数の天然に存在しないペプチドを同定した。本明細書においてさらにコルぺプチン１として指定される特定の代表的なメンバーの作用の様式の分析により、細胞のうちの９８％が１５分以内に陽性であったことから、ペプチドが、E. coliにより迅速的かつ効率的に内部移行することが明らかとなった。コルぺプチン１の取り込みは、大きな極性の封入体の形成および細菌細胞死を容易にもたらし、約５０％の細胞死は１５分以内であり、１時間後には８０％を超えた。ここで観察された迅速かつ致死性の凝集に関連する細菌細胞死は、ＩＢ形成が一般には細菌における急性のストレスに対する非致死性かつ可逆性の応答であることから、驚くべきことであった。さらに、致死量以下の濃度（ＭＩＣの５０％）の活性ペプチドにおける、３６日間の期間にわたる細菌の繰り返しの継代は、対照抗生物質アンピシリンとは対照的に、耐性の発達をもたらさなかった。加えて、ペプチドはin vivoで活性であり、実際に、コルぺプチン１は、マウス膀胱感染モデルにおいて、その宿主に対して有害効果をもたらすことなく、細菌の負荷量を効果的に低下させた。本発明は、コルぺプチン１およびそのバリアントなどの天然に存在しないペプチド、ならびに病原性細菌を処置するための、例えば処置することが困難な病原性細菌と戦うための、バリアントまたは類似のペプチドを生成するための方法を提供する。実際に、本発明は、いくつかのタンパク質標的に同時に打撃を与えて、それにより迅速な細菌細胞死をもたらすために、細菌におけるタンパク質における凝集傾向のあるペプチドセグメントの配列特異性を利用することが可能であることを示す。このアプローチは、したがって、新規のクラスの抗生物質を開発するための興味深いパラダイムを代表する。

【0021】

したがって、本発明は、第１の側面において、細菌の１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導するように、例えば前記細菌における前記１つ以上の一次標的タンパク質を含む封入体を形成するように、設計された、天然に存在しない抗菌ペプチドであって、ここで、前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質は、３−フェニルプロピオネート−ジヒドロジオール／桂皮酸−ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（Ｈｃａｂ）タンパク質を含む、前記天然に存在しない抗菌ペプチドを提供する。

【0022】

ある態様において、前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質は、以下をさらに含む：
− シャペロンタンパク質ｓｋｐ（Ｓｋｐ）、リン酸レギュロンセンサータンパク質（ＰｈｏＲ）、ジペプチド・トリペプチドパーミアーゼＡ（Ｄｔｐａ）、有望なセンサー様ヒスチジンキナーゼ（probable sensor-like-histidine kinase）ＹｅｄＶ（ＹｅｄＶ）、特徴づけられていないＮａ（＋）／Ｈ（＋）交換体ＹｊｃＥ（ＹｊｃＥ）、浸透圧センサータンパク質ＥｎｖＺ（ＥｎｖＺ）、センサータンパク質ＲｓｔＢ（ＲｓｔＢ）、センサータンパク質ＺｒａＳ（ＺｒａＳ）、推定の特徴づけられていないタンパク質ＹｂｆＯ（ＹｂｆＯ）、センサーヒスチジンキナーゼＤｃｕＳ（ＤｃｕＳ）、シグナル伝達ヒスチジン−タンパク質キナーゼＡｔｏＳ（ＡｔｏＳ）、ギ酸ハイドロゲンリアーゼサブユニット４（ｈｙｃＤ）、芳香族アミノ酸エクスポーターＹｄｄＧ（ＹｄｄＧ）、ＵＰＦ０２２６タンパク質ＹｆｃＪ（ＹｆｃＪ）、および内膜タンパク質ｙｆｅＺ（ＹｆｅＺ）；
− 表８において列記されるタンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質；および／または
− 表９において列記されるタンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質。

【0023】

ある態様において、ペプチドは、前記１つ以上の一次標的タンパク質において、１つ以上の凝集傾向領域（ＡＰＲ）と共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する。ある態様において、前記１つ以上のＡＰＲのアミノ酸配列は、ＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）であるか、またはＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）と比較して単一のミスマッチを示す。

【0024】

ある態様において、ペプチドは、ＧＬＧＬＡＬＶ（配列番号１２８）、ＧＬＧＬＡＬＡ（配列番号２０２）、ＧＬＧＬＡＩＶ（配列番号２０３）、ＧＬＧＬＡＭＶ（配列番号２０４）、ＧＬＧＬＳＬＶ（配列番号２０５）、ＧＬＡＬＡＬＶ（配列番号２０６）、ＧＬＧＬＡＶＶ（配列番号２０７）、ＧＬＰＬＡＬＶ（配列番号２０８）、ＧＶＧＬＡＬＶ（配列番号２０９）、ＧＬＧＬＡＬＳ（配列番号２１０）、ＧＬＬＬＡＬＶ（配列番号２１１）、ＧＬＧＬＡＬＱ（配列番号２１２）、ＧＩＧＬＡＬＶ（配列番号２１３）からなる群より選択される１つ以上のＡＰＲと共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する。

【0025】

ある態様において、細菌は、グラム陰性であり、好ましくは大腸菌属またはアシネトバクター属、より好ましくは、大腸菌、Acinetobacter radioresistensまたはAcinetobacter baumaniiである。
ある態様において、ペプチドは、前記細菌に対して、３２μｇ／ｍｌ未満、例えば２５μｇ／ｍＬ以下、１２μｇ／ｍＬ以下、または６μｇ／ｍＬ以下の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。

【0026】

ある態様において、ペプチドは、前記１つ以上のＡＰＲと共凝集するように設計された配列Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７を含み、ここで、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸である。
ある態様において、ペプチドは、１つ以上のＤ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸を含む。

【0027】

ある態様において、ペプチドは、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含み、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである。

【0028】

したがって、関連する側面としてまた提供されるのは、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドであって、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである。

【0029】

ある態様において、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｐから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または１〜３の非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択される。
ある態様において、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。
ある態様において、Ａ_２ｉ−１、Ａ_２ｉ、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７および／またはＺ_ｉのうちの１つ以上のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸である。

【0030】

また提供されるのは、前記ペプチドから生成されるペプチド模倣物である。
ある態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、検出可能な標識をさらに含む。
ある態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、半減期の延長を増大させる分子をさらに含む。
ある態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む。
ある態様において、ペプチドまたはペプチド模倣物は、１つより多くの細菌分類群、例えば１つより多くの細菌の属、種または株に対する抗菌効果を示す。

【0031】

さらに提供されるのは、独立して、
− 医薬としての使用のためのペプチドまたはペプチド模倣物；
− 抗菌剤としての使用のためのペプチドまたはペプチド模倣物；およびペプチドまたはペプチド模倣物を用いる対応する細菌感染の処置の方法；
− 診断剤としての使用のためのペプチドまたはペプチド模倣物；およびペプチドまたはペプチド模倣物を用いる対応する診断の方法；あるいは、
− ペプチドまたはペプチド模倣物および薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物
である。

【0032】

本発明は、第二の側面において、細菌の１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導するように、例えば前記細菌における前記１つ以上の一次標的タンパク質を含む封入体を形成するように、設計された、天然に存在しない抗菌ペプチドであって、ここで、前記細菌の１つ以上の一次標的タンパク質は、表４において列記されるタンパク質から選択されるタンパク質を含む、前記天然に存在しない抗菌ペプチドを、さらに提供する。
ある態様において、ペプチドは、前記１つ以上の一次標的タンパク質における１つ以上の凝集タンパク質セグメント（ＡＰＲ）と共凝集させることにより、前記細菌の前記１つ以上の一次標的タンパク質の凝集を誘導する。

【0033】

ある態様において、前記１つ以上のＡＰＲのアミノ酸配列は、表４において列記されるとおりであるか、またはそれと比較して単一のミスマッチを示す。
ある態様において、細菌は、グラム陰性であり、好ましくは大腸菌属またはアシネトバクター属、より好ましくは、大腸菌、Acinetobacter radioresistensまたはAcinetobacter baumaniiである。
ある態様において、ペプチドは、前記細菌に対して、３２μｇ／ｍｌ未満、例えば２５μｇ／ｍＬ以下、１２μｇ／ｍＬ以下、または６μｇ／ｍＬ以下の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。

【0034】

ある態様において、ペプチドは、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含み、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− ＡＰＲ中に含まれるペプチドの名称は、表５において表され（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表され、ここで、ＡＰＲは、天然のアミノ酸を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するペプチド配列において存在するアミノ酸の非天然のアミノ酸アナログを含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸のペプチド配列におけるＤ−アミノ酸置換を含み、
およびここで、ＡＰＲ中のアミノ酸は、直列または逆方向リピートであってよく、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである。

【0035】

したがって、関連する側面としてまた提供されるのは、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドであって、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、１〜３の連続したゲートキーパーから選択され、ここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーは、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーは、任意にアミド化され、
− ＡＰＲ中に含まれるペプチドの名称は、表５において表され（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表され、ここで、ＡＰＲは、天然のアミノ酸を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するペプチド配列において存在するアミノ酸の非天然のアミノ酸アナログを含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸のペプチド配列におけるＤ−アミノ酸置換を含み、
およびここで、ＡＰＲ中のアミノ酸は、直列または逆方向リピートであってよく、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーである。

【0036】

ある態様において、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｐから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または１〜３の非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択される。
ある態様において、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。
ある態様において、Ａ_２ｉ−１、Ａ_２ｉ、ＡＰＲ、および／またはＺ_ｉのうちの１つ以上のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸および／または非天然のアミノ酸である。

【0037】

ある態様において、ペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。
ある態様において、ペプチドは、半減期の延長を増大させる分子をさらに含む。
ある態様において、ペプチドは、分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む。

【0038】

さらに提供されるのは、独立して、
− 医薬としての使用のためのペプチド；
− 抗菌剤としての使用のためのペプチド、およびペプチドを用いる対応する細菌感染の処置の方法；
− 診断剤としての使用のためのペプチド；およびペプチドを用いる対応する診断の方法；または
− ペプチドおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物
である。

【0039】

本発明は、一態様において、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドをさらに提供し、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または３−メチルプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、２−［（２Ｓ）−２−（ヒドラジンカルボニル）ピロリジン−１−イル］−２−オキソ酢酸、ベータ−ホモプロリン、アルファ−メチル−プロリン、ヒドロキシプロリン、４−オキソ−プロリン、ベータ，ベータ−ジメチル−プロリン、５，５−ジメチル−プロリン、４−シクロヘキシル−プロリン、４−フェニル−プロリン、３−フェニル−プロリン、４−アミノプロリン、４−メルカプトプロリン、２−アミノ−アジピン酸（ホモグルタミン酸）、２−アミノ−ヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）、２−アミノ−オクタン二酸（アミノスベリン酸）、２−アミノ−４−カルボキシ−ペンタン二酸（４−カルボキシグルタミン酸）、グリオキサル−ヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサル−ヒドロイミダゾロン、Ｎ−アルファ−メチル−アルギニン、オメガ−メチル−アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ホモアルギニン、ベータ−ホモアルギニン、２−アミノ−３−ウレイド−プロピオン酸、２−アミノ−６−（１−カルボキシエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（２−（フラン−２−イル）−２−オキソエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（ホルミル−５−ヒドロキシメチル−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸、ｃ−アルファ−メチル−リジン、ベータ，ベータ−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ホルミル−リジン、Ｎ−イプシロン−メチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ｉ−プロピル−リジン、Ｎ−イプシロン−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−トリメチルアンモニウム−リジン（N-epsilon-trimethylamonium-lysine）、Ｎ−イプシロン−ニコチニル−リジン、｛［５−アミノ−１−（ヒドラジンカルボニル）ペンチル］カルバモイル｝ギ酸、Ｎ−アルファ−メチル−リジン、ホモリジン、ベータ−ホモリジン、２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸、ノルバリン、アルファ-メチル-ノルバリン、ヒドロキシノルバリン（hydroxinorvaline）、オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−Ｎ−デルタ−ジメチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−ｉ−プロピル−オルニチン、ｃ−アルファ−メチル−オルニチン、ベータ，ベータ−ジメチル−オルニチン、カナバニン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−ブチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−フェニル−オルニチン、デルタ−（２−メチルピロリジン）−オルニチン、デルタ−ピペリジル−オルニチン、ガンマ−アミノ−デルタ−ピペリジル−吉草酸およびデルタ−アゼパニル−オルニチンから選択される１〜３つの非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはアミノ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはカルボキシ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意に、アミド化され；
− ＡＰＲ中に含まれるペプチドの名称は、表５において表され（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表され、ここで、ＡＰＲは、天然のアミノ酸を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸の保存的アミノ酸置換を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するペプチド配列において存在するアミノ酸の非天然のアミノ酸アナログを含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸のペプチド配列におけるＤ−アミノ酸置換を含み、
およびここで、ＡＰＲ中のアミノ酸は、直列または逆方向リピートであってよく、ここで、ｎは、２〜４であり；
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0040】

さらに別の態様において、本発明は、表５において表される配列（Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）を提供し、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表される。

【0041】

本発明は、さらなる態様において、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）ｎを含むペプチドを提供し、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各_{Ａ２ｉ−１}およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸および／または３−メチルプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、２−［（２Ｓ）−２−（ヒドラジンカルボニル）ピロリジン−１−イル］−２−オキソ酢酸、ベータ−ホモプロリン、アルファ−メチル−プロリン、ヒドロキシプロリン、４−オキソ−プロリン、ベータ，ベータ−ジメチル−プロリン、５，５−ジメチル−プロリン、４−シクロヘキシル−プロリン、４−フェニル−プロリン、３−フェニル−プロリン、４−アミノプロリン、４−メルカプトプロリン、２−アミノ−アジピン酸（ホモグルタミン酸）、２−アミノ−ヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）、２−アミノ−オクタン二酸（アミノスベリン酸）、２−アミノ−４−カルボキシ−ペンタン二酸（４−カルボキシグルタミン酸）、グリオキサル−ヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサル−ヒドロイミダゾロン、Ｎ−アルファ−メチル−アルギニン、オメガ−メチル−アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ホモアルギニン、ベータ−ホモアルギニン、２−アミノ−３−ウレイド−プロピオン酸、２−アミノ−６−（１−カルボキシエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（２−（フラン−２−イル）−２−オキソエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（ホルミル−５−ヒドロキシメチル−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸、ｃ−アルファ−メチル−リジン、ベータ，ベータ−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ホルミル−リジン、Ｎ−イプシロン−メチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ｉ−プロピル−リジン、Ｎ−イプシロン−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−トリメチルアンモニウム−リジン、Ｎ−イプシロン−ニコチニル−リジン、｛［５−アミノ−１−（ヒドラジンカルボニル）ペンチル］カルバモイル｝ギ酸、Ｎ−アルファ−メチル−リジン、ホモリジン、ベータ−ホモリジン、２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸、ノルバリン、アルファ−メチル−ノルバリン、ヒドロキシノルバリン、オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−Ｎ−デルタ−ジメチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−ｉ−プロピル−オルニチン、ｃ−アルファ−メチル−オルニチン、ベータ，ベータ−ジメチル−オルニチン、カナバニン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−ブチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−フェニル−オルニチン、デルタ−（２−メチルピロリジン）−オルニチン、デルタ−ピペリジル−オルニチン、ガンマ−アミノ−デルタ−ピペリジル−吉草酸およびデルタ−アゼパニル−オルニチンから選択される１〜３つの非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはアミノ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはカルボキシ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0042】

本発明のペプチド中のリンカー部分、Ｚ_ｉの性質は、本発明にとって極めて重要ではないが、長い可撓性のリンカーは、好ましくは用いられない。特定の態様により、各々のＺ_ｉは、独立して、０〜２０個の同一または非同一の単位のストレッチから選択され、ここで、単位はアミノ酸、単糖、ヌクレオチドまたはモノマーである。非同一の単位は、同じ性質の非同一の単位であってよい（例えば、異なるアミノ酸、またはいくつかのコポリマー）。それらはまた、異なる性質の非同一の単位、例えばアミノ酸およびヌクレオチド単位、または２つ以上の異なるモノマー種を含むヘテロポリマー（コポリマー）を有するリンカーであってもよい。特定の態様により、少なくとも１つ、および特にＺ_ｎ以外の各々のＺ_ｉの長さは、少なくとも１単位である。他の特定の態様により、Ｚ_ｎは、０単位である。特定の態様により、Ｚ_ｎ以外の全てのＺ_ｉリンカーは、同一である。さらなる態様により、全てのＺ_ｉ部分は、同一である。

【0043】

特定の態様により、少なくとも１つ、および特にすべてのＺ_ｉは、同じ性質の０〜１０単位のもの、特に同じ性質の０〜５単位のものである。特定の態様により、少なくとも１つのＺ_ｉ部分、および特にＺ_ｎを除くすべてのＺ_ｉ部分は、ペプチドまたはポリペプチドリンカーである。かかるリンカーの特に想起される配列として、これらに限定されないが、ＰＰＰ、ＰＰまたはＧＳが挙げられる。リンカーはまた、化学的性質のものであってもよい。特に想起される化学リンカーとして、ＰＥＧおよびＴｔｄｓ（別名４，７，１０−トリオキサトリデカン−１３−スクシンアミド酸）が挙げられる。

【0044】

典型的には、長いリンカーは用いられない。しかし、凝集促進性部分が１つより多くのタンパク質の凝集を誘導する領域に対応する特定の態様により、長いリンカーが用いられ得ることが想起される。実際に、分子が確実に、（例えば同時に）１つより多くのタンパク質と相互作用し得るようにするために、立体障害に起因して相互作用が妨げられないように、標的が異なる凝集促進性部分の間の距離を増大させることは、有益であり得る。これらの場合において、Ｚ_ｉリンカーは、０〜１００個の同一または非同一の単位のストレッチであってよく、ここで、単位は、アミノ酸、単糖、ヌクレオチドまたはモノマーである；あるいは、０〜９０、０〜８０、０〜７０、０〜６０、０〜５０、０〜４０、０〜３０または０〜２０のものである。特に、Ｚ_ｉリンカーの最小の長さは、少なくとも１単位、少なくとも２単位、少なくとも３単位、少なくとも４単位、または少なくとも５単位である。

【0045】

さらに別の態様において、本発明は、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドを提供し、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択されるか、および／またはここで、アミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0046】

さらに別の態様において、本発明は、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）ｎを含むペプチドを提供し、ここで、
− ｎは、１〜３の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、アミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0047】

さらに別の態様において、本発明は、以下の構造：Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉを含むペプチドを提供し、ここで、
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、アミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0048】

さらに別の態様において、本発明は、以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドを提供し、ここで、
− ｎは、は、１〜２の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、アミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0049】

さらに別の態様において、本発明は、その配列が配列番号１において表されるコルぺプチン１（Ｐ２）を提供する。
配列番号１：アミノ−ＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲＰＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲ−カルボキシル

【0050】

さらに別の態様において、Ｘ_１およびＸ_３は、グリシン、またはＮ−アルファ−メチル−グリシン（サルコシン）、シクロプロピルグリシンおよびシクロペンチルグリシンからなる群より選択されるグリシンの非天然のバリアントから選択され、Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_６は、ロイシン、またはバリン、または２−アミノ−３，３−ジメチル−酪酸（ｔ−ロイシン）、アルファ−メチルロイシン、ヒドロキシロイシン、２，３−デヒドロ−ロイシン、Ｎ−アルファ−メチル−ロイシン、２−アミノ−５−メチル−ヘキサン酸（ホモロイシン）、３−アミノ−５−メチルヘキサン酸（ベータ−ホモロイシン）、２−アミノ−４，４−ジメチル−ペンタン酸（４−メチル−ロイシン、ネオペンチルグリシン）、４，５−デヒドロ−ノルロイシン（アリルグリシン）、Ｌ−ノルロイシン、Ｎ−アルファ−メチル−ノルロイシンおよび６−ヒドロキシ−ノルロイシンからなる群より選択されるロイシンの非天然のバリアントから選択され、Ｘ_５は、アラニン、または２−アミノ−イソ酪酸（２−メチルアラニン）、２−アミノ−２−メチルブタン酸（イソバリン）、Ｎ−アルファ−メチル−アラニン、２−アミノ−２−メチルペント−４−エン酸（アルファ−アリルアラニン）、ベータ−ホモアラニン、２−インダニル−グリシン、ジ−ｎ−プロピル−グリシン、ジ−ｎ−ブチル−グリシン、ジエチル−グリシン、（１−ナフチル）アラニン、（２−ナフチル）アラニン、シクロヘキシルグリシン、アダマンチル−グリシン、ベータ−ホモアリルグリシンからなる群より選択されるアラニンの非天然のバリアントから選択され、およびＸ_７は、バリン、またはロイシン、またはｃ−アルファ−メチル−バリン（２，３−ジメチルブタン酸）、２，３−デヒドロ−バリン、３，４−デヒドロ−バリン、３−メチル−Ｌ−イソバリン（メチルバリン）、２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（ヒドロキシバリン）、ベータ−ホモバリンおよびＮ−アルファ−メチル−バリンからなる群より選択されるロイシンの非天然のバリアントから選択される。

【0051】

用語「本発明のペプチド」は、本明細書において、本明細書において開示されるような本発明の原理を具体化する任意のペプチドおよびペプチドバリアント、例えば、限定することなく、コルぺプチン１（coleptin 1）およびそのバリアントに基づくペプチドを包含するように、便利に用いられる。

【0052】

特に、本発明のペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのアラニンを、アラニンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントペプチドを開発するために用いることができるアラニンアナログを、表Ｉにおいて表す：

【化1-1】

【化1-2】

表Ｉ：アラニンアナログ

【0053】

特に、ペプチドにおける構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのアルギニンを、アルギニンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるアルギニンアナログを、表ＩＩにおいて表す：

【化2-1】

【化2-2】

表ＩＩ：アルギニンアナログ

【0054】

特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのグリシンを、グリシンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるグリシンアナログを、表ＩＩＩにおいて表す：

【化3】

表ＩＩＩ：グリシンアナログ

【0055】

ある態様において、特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのグリシンを置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるグリシンアナログは、ベータ−アラニンまたは表ＩＩＩにおいて表されるアナログを含んでもよく、好ましくは、ベータ−アラニンであってよい。

【0056】

特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのロイシンを、ロイシンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるロイシンアナログを、表ＩＶにおいて表す：

【化4】

表ＩＶ：ロイシンアナログ

【0057】

ある態様において、特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのロイシンを、ロイシンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるロイシンアナログを、以下に表す：

【化5】

【0058】

ある態様において、特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのロイシンを、ロイシンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるロイシンアナログは、ノルバリンまたはアルファ−メチル−ノルバリンであってよい。

【0059】

特に、ペプチドの構造における、例えば配列番号１の構造における少なくとも１つのバリンを、バリンのアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるバリンアナログを、表Ｖにおいて表す：

【化6】

表Ｖ：バリンアナログ

【0060】

特に、ゲートキーパー残基リジン（Ｋ）をリジン（Ｋ）のアナログに対して置き換えることにより、本発明のペプチドを開発するために用いることができるリジンアナログを、表ＶＩにおいて表す：

【化7-1】

【化7-2】

【化7-3】

【化7-4】

表ＶＩ：リジンアナログ

【0061】

ある態様において、特に、ゲートキーパー残基リジン（Ｋ）をリジン（Ｋ）のアナログに対して置き換えることによる、本発明のペプチドを開発するために用いることができるリジンアナログは、Ｎ−イプシロン−ホルミル−リジン、Ｎ−イプシロン−メチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ｉ−プロピル−リジン、Ｎ−イプシロン−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−トリメチルアンモニウム−リジン、Ｎ−イプシロン−ニコチニル−リジン、｛［５−アミノ−１−（ヒドラジンカルボニル）ペンチル］カルバモイル｝ギ酸、Ｎ−アルファ−メチル−リジン、ホモリジン、ベータ−ホモリジン、２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸、ヒドロキシノルバリン、オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−Ｎ−デルタ−ジメチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−ｉ−プロピル−オルニチン、ｃ−アルファ−メチル−オルニチン、ベータ，ベータ−ジメチル−オルニチン、カナバニン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−ブチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−フェニル−オルニチン、デルタ−（２−メチルピロリジン）−オルニチン、デルタ−ピペリジル−オルニチン、ガンマ−アミノ−デルタ−ピペリジル−吉草酸またはデルタ−アゼパニル−オルニチンであってよい。

【0062】

特に、請求項１において表されるようなゲートキーパーにおけるプロリンを、人工のプロリン（Ｐ）に対して置き換えることによる、本発明のペプチドのバリアント、例えば配列番号１のバリアントを開発するために用いることができるプロリンアナログを、表ＶＩＩにおいて表す：

【化8-1】

【化8-2】

表ＶＩＩ：プロリンアナログ

【0063】

さらに別の態様において、本発明のペプチド中のリンカーＺ_ｉは、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン、ベータ−（２−ベンゾチアゾリル）−アラニン、３−（２−フリル）−アラニンまたはベータ−（２−チエニル）−アラニンからなる。
さらに別の態様において、本発明は、アミノ末端およびカルボキシ末端の非天然のゲートキーパー残基（Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉ）の間に環構造を形成することにより産生される環状ペプチドを提供する。

【0064】

さらに別の態様において、本発明のペプチドは、検出可能な標識をさらに含む。
本発明はまた、同位体標識されたペプチドを含み、これらは、１つ以上の原子が、天然において通常見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられるという事実について以外は、本明細書において定義されるものと同一である。本発明のペプチド中に組み込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ^２Ｈ、^３Ｈ、^１３Ｃ、^１１Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｏ、^１７Ｏ、^３１Ｐ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１８Ｆおよび^３６ＣＩが挙げられる。本発明のペプチドならびに前記ペプチドの薬学的に受入可能な塩または前述の同位体および／もしくは他の原子の他の同位体を含むものは、本発明の範囲内である。特定の同位体標識された本発明のペプチド、例えば^３Ｈおよび^１４Ｃなどの放射活性同位体が組み込まれるものは、薬物および／または基質の組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム標識されたもの、すなわち^３Ｈ、炭素−１４、すなわち^１４Ｃ同位体は、それらの調製の容易性および検出能力のために、特に好ましい。さらに、重水素、すなわち^２Ｈなどの、より重い同位体による置換は、より高い代謝安定性、例えば増大したin vivoでの半減期、または低下した投与量要求から生じる、特定の治療上の利点をもたらし得、したがって、いくつかの状況においては好ましい場合がある。本発明の式Iの同位体標識されたペプチドは、一般に、以下の例において開示される手順を実施することにより、容易に入手可能な同位体標識された試薬を、非同位体標識試薬を置き換えることにより、調製することができる。

【0065】

さらに別の態様において、本発明のペプチドは、半減期の延長を増大させる分子をさらに含む。
さらに別の態様において、本発明のペプチドは、ペプチドの溶解度を増大させる部分をさらに含む。

【0066】

他の特定の態様により、分子は、例えばそれらのin vivoでの半減期を延長するために、他の部分に融合していてもよい。安定性を増大させることの他に、かかる部分はまた、それらが融合している分子の溶解度を増大させ得る。ゲートキーパー（番号付けされたＸ部分）の存在は、原理的には、分子の早すぎる凝集を防止して、それらを溶液中に保持するためには十分であるが、溶解度を増大させる（すなわち凝集を防止する）部分のさらなる添加は、分子のより容易な取り扱いをもたらし得、特に、安定性および有効期間を改善し得る。かかる部分の周知の例は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である。この部分は、リンカーとしてのみならず、可溶化性部分としても用いられ得るので、特に想起される。他の例として、ペプチドおよびタンパク質またはタンパク質ドメイン、またはさらに完全なタンパク質（例えばＧＦＰ）が挙げられる。このことに関して、ＰＥＧのように、１つ部分が様々な機能または効果を有し得ることに注意すべきである。例えば、ｆｌａｇタグ（配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ）は、標識として用いられ得るペプチド部分であるが、その電荷密度に起因して、それはまた、可溶化を増強するであろう。ＰＥＧ化は、生物製剤の溶解度を増大させることが、既にしばしば示されている（例えば、Veronese and Mero, BioDrugs. 2008; 22(5):315-29）。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインタグを目的の分子に付加することは、当該分野において広範に記載されている。例として、これらに限定されないが、シヌクレインに由来するペプチド（例えば、Park et al., Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17:251-260）、ＳＥＴ（溶解度増強タグ、Zhang et al., Protein Expr Purif 2004; 36:207‐216）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、N-Utilization substance（ＮｕｓＡ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、ジスルフィド結合Ｃ（disulfide bond C：ＤｓｂＣ）、Seventeen kilodalton protein（Ｓｋｐ）、ファージＴ７タンパク質キナーゼフラグメント（Ｔ７ＰＫ）、タンパク質Ｇ Ｂ１ドメイン、タンパク質Ａ ＩｇＧ ＺＺリピートドメイン、および細菌免疫グロブリン結合ドメイン（Hutt et al., J Biol Chem.; 287(7):4462-9, 2012）が挙げられる。タグの性質は、当業者により決定され得る適用に依存するであろう。例えば、本明細書において記載される分子のトランスジェニック発現のために、細胞の機構による早すぎる分解を防止するために、分子を、より大きなドメインに融合させることが想起され得る。他の適用は、分子の特性を改変しすぎないように、より小さな可溶化タグ（例えば、３０アミノ酸未満、または２０アミノ酸未満、またはわずか１０アミノ酸未満）への融合を想起し得る。

【0067】

半減期を延長することの他に、分子は、他のまたはさらなる薬物動態学的および薬力学的特性を改変する部分に融合させてもよい。例えば、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、アルブミン結合ドメインまたは合成アルブミン結合ペプチドへの融合は、様々な治療用タンパク質の薬物動態学および薬力学を改善することが知られている（Langenheim and Chen, Endocrinol.; 203(3):375-87, 2009）。しばしば用いられる別の部分は、抗体のフラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region：Ｆｃ）である。これらの部分の性質は、本発明のためには極めて重要ではなく、適用に依存して当業者により決定されてよい。

【0068】

さらに別の態様において、本発明のペプチドは、前記ペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端において、少なくとも１つのＤ−アラニンをさらに含む。
さらに別の態様において、本発明は、医薬としての使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、抗菌剤としての使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、グラム陽性細菌を処置するための使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、グラム陰性細菌を処置するための使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、薬剤耐性菌株を処置するための使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、多剤耐性菌株を処置するための使用のための本発明のペプチドを提供する。
さらに別の態様において、本発明は、カルバペネム耐性腸内細菌（Enterobacteriaceae）、薬剤耐性淋菌、多剤耐性アセチノバクター（Acetinobacter）、薬剤耐性カンピロバクター、広域スペクトルベータ−ラクタマーゼ産生腸内細菌、多剤耐性緑膿菌、薬剤耐性非チフス性サルモネラ菌、薬剤耐性チフス菌および薬剤耐性赤痢菌を含むリストから選択される多剤耐性菌株を処置するための使用のための本発明のペプチドを提供する。

【0069】

さらに別の態様において、本発明は、診断剤としての使用のための本発明のペプチドの使用を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチドおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む医薬組成物を提供する。

【0070】

さらに別の態様において、本発明は、抗菌ペプチドを産生するための方法を提供し、該方法は、以下のステップを含む：
ｉ）５〜１４アミノ酸、例えば５〜１２アミノ酸、または６〜１４アミノ酸、例えば６〜１２アミノ酸の長さを有する、凝集傾向領域（ＡＰＲ）のin silicoのリストを作製すること、ここで、ＡＰＲは、細菌プロテオームにおいて同定される、
ｉｉ）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎ，に基づくＡＰＲを含む、２０〜２００個の数の異なるペプチドを合成すること、ここで、ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択される、
ｉｉｉ）抗菌効果について前記ペプチドを試験すること、および抗菌ペプチドを生成すること。

【0071】

タンパク質中のかかる配列を同定する、特にプロテオーム中に存在するタンパク質中のＡＰＲ配列を同定する一つの特に便利な方法は、ベータ−凝集を予測するアルゴリズムを用いることによる。かかるアルゴリズムは、典型的には、生物物理学的パラメーターを考慮し得る。TangoおよびZyggregatorは、かかるアルゴリズムの一般的な例であるが、多くの他のものが、当該分野において記載されており、これらは、限定されないが、以下により記載されるものを含む：Bryan et al., PLoS Comput Biol. 5(3):e1000333, 2009；Caflish, Curr Opin Chem Biol. 10(5):437-44, 2006；Conchillo-Sole et al., BMC Bioinformatics 8:65, 2007；Galzitskaya et al., PLoS Comput Biol. 29;2(12):e177, 2006；Goldschmidt et al., PNAS 107(8):3487-92, 2010；Maurer-Stroh et al., Nat Methods 7(3):237-42, 2010；Rojas Quijano et al., Biochemistry 45(14):4638-52, 2006；Saiki et al., Biochem Biophys Res Commun 343(4):1262-71, 2006；Sanchez de Groot et al., BMC Struct Biol 5:18, 2005；Tartaglia et al., Protein Sci. 14(10):2723-34, 2005；Tartaglia et al., J Mol Biol. 380(2):425-36, 2008；Thompson et al., PNAS 103(11):4074-8, 2006；Trovato et al., Protein Eng Des Sel. 20(10):521-3, 2007；Yoon and Welsh, Protein Sci. 13(8):2149-60, 2004；Zibaee et al., Protein Sci. 16(5):906-18, 2007。これらのうちの多くは、主にアミロイド凝集性配列に関係し、無定形のベータ−凝集のみと関係するわけではない。両方の凝集の形態の配列空間は、重複し得（Rousseau et al., Current Opinion in Structural Biology 16:118‐126, 2006）、反応の動態学および条件が目的のタンパク質（単数または複数）の凝集に有利である限り、両方の凝集の形態が想起される。

【0072】

いくつかの態様において、本発明のペプチドは、アミノおよび／またはカルボキシル末端において１つ以上のさらなる残基を含んでもよい。いくつかの態様において、１つ以上のさらなる残基は、Ｄ−アラニンである。例えば、ペプチドは、アミノおよび／またはカルボキシル末端において１つまたは２つのＤ−アラニンを含んでもよい。

【0073】

同様に、当業者は、本発明はまた、特化した天然に存在しないペプチドを含む融合ポリペプチドを包含することを理解するであろう。代替として、融合タンパク質は、レポーター分子を含んでもよい。他の態様において、融合タンパク質は、ペプチドの活性と同じであるかまたはこれと異なる機能または活性、例えばターゲティング性、結合性または酵素活性または機能を提供するポリペプチドを含んでもよい。同様に、本明細書において特に開示されるペプチドは、典型的には、アミノ酸配列における置換を耐容し、生物学的活性を実質的に保持するであろうことが、理解されるであろう。本明細書において特に開示されるもの以外の本発明のペプチドを同定するために、アミノ酸置換は、当該分野において公知の任意の特徴に基づくものであってよく、これは、例えばアミノ酸側鎖置換基、それらの疎水性、親水性、電荷サイズなどの相対的な類似性または相違を含む。

【0074】

当該分野において公知であるとおり、ポリペプチドが、既知の配列に対して配列同一性または類似性を有するか否かを同定するために、多数の異なるプログラムを用いることができる。配列同一性または類似性は、当該分野において公知の標準的な技術を用いて決定することができ、これは、限定されないが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるもの、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性方法の検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によるもの（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Drive, Madison, Wis.におけるGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387 (1984)により記載されるBest Fit配列プログラムによるものを含み、好ましくはデフォルトの設定を用いるか、または検査による。通常のアルゴリズムの一例は、PILEUPである。PILEUPは、漸進的なペアワイズアラインメントを用いて、関連する配列の群から複数の配列アラインメントを作成する。それはまた、アラインメントを作成するために用いられるクラスタリング関係を示す樹形図をプロットすることもできる。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351 (1987)の漸進的なアラインメント方法の簡略化を用いる；当該方法は、Higgins & Sharp, CABIOS 5:151 (1989)により記載されるものと類似する。有用なアルゴリズムの別の例は、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 (1993)において記載されるBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、WU-BLAST-2プログラムであり、これは、Altschul et al., Meth. Enzymol., 266:460 (1996)；blast.wustl/edu/blast/README.htmlから入手した。WU-BLAST-2は、いくつかの検索パラメーターを用い、これらは好ましくはデフォルト値に設定される。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の組成および目的の配列を検索する対象となる特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体により確立される；しかし、感受性を増大させるために、値を調節してもよい。さらなる有用なアルゴリズムは、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)により報告されるとおりのgapped BLASTである。マッチする同一残基の数を、アラインメントされる領域中の「より長い」配列の残基の総数で除算することにより、アミノ酸配列同一性のパーセンテージの値が決定される。「より長い」配列とは、アラインメントされる領域において実際に最も多い残基を有するものである（アラインメントスコアを最大にするためにWU-Blast-2により導入されるギャップは無視される）。アラインメントは、アラインメントされるべき配列におけるギャップの導入を含んでもよい。加えて、本明細書において特に開示されるペプチドより多い、またはこれより少ないアミノ酸を含む配列については、一態様において、配列同一性のパーセンテージは、アミノ酸の総数に関する同一アミノ酸の数に基づいて決定されるであろうことが、理解される。したがって、例えば、本明細書において特に開示される配列より短い配列の配列同一性は、一態様においては、当該より短い配列中のアミノ酸の数を用いて決定されるであろう。パーセント同一性の計算において、相対重量は、例えば挿入、欠失、置換などの配列バリエーションの多様な現れ方に帰するものではない。

【0075】

特定の態様において、本発明のペプチドは、適切なポリペプチドのin vivoでの残存を促進するために、アミノおよび／またはカルボキシル末端におけるブロッキング剤の付加により、in vivoでの使用のために修飾することができる。これは、ペプチド末端が、細胞による取り込みの前にプロテアーゼにより分解される傾向がある状況において、有用であり得る。かかるブロッキング剤は、限定することなく、さらなる関係するまたは無関係のペプチド配列を含んでもよく、これは、投与されるべきペプチドのアミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合していてもよい。これは、ペプチドの合成の間に化学的に、または組み換えＤＮＡ技術により、任意の好適な方法により、行うことができる。例えば、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸、例えばＤ−アラニンなどを、末端に付加させてもよい。あるいは、ピログルタミン酸または当該分野において公知の他の分子などのブロッキング剤を、アミノおよび／またはカルボキシル末端残基に結合させてもよく、または、アミノ末端におけるアミノ基もしくはカルボキシル末端におけるカルボキシル基を、異なる部分で置き換えてもよい。加えて、ペプチド末端を、例えばＮ末端のアセチル化および／またはＣ末端のアミド化により修飾してもよい。同様に、ペプチドを、投与の前に、薬学的に受入可能な「キャリア」タンパク質に、共有結合により、または非共有結合的に、カップリングしてもよい。

【0076】

本発明のペプチド−本発明のペプチドを含む医薬組成物の投与
一態様において、本発明のペプチドは、対象に直接投与される。一般に、本発明の化合物は、薬学的に受入可能なキャリア（例えば、生理食塩水）中に懸濁させて、経口で、または静脈内注入により投与されるか、または、皮下で、筋肉内で、髄腔内、腹腔内で、直腸内で、膣内で、鼻内で、胃内で、気管内で、もしくは肺内で投与されるであろう。別の態様において、気管内または肺内送達は、標準的なネブライザー、ジェットネブライザー、ワイヤーメッシュネブライザー、乾燥粉末吸入器、または定量噴霧式吸入器を用いて達成することができる。それらは、例えば肺、腎臓、膀胱または腸などの細菌感染の部位に直接送達してもよい。必要とされる投与量は、投与の経路の選択肢；処方物の性質；患者の疾病の性質；対象のサイズ、重量、表面積、年齢および性別；投与されている他の薬物；ならびに主治医の判断に依存する。好適な投与量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。多様なペプチドおよび可能なバリアント、ならびに多様な経路の投与の異なる効率を考慮して、必要とされる投与量の広範なバリエーションが予測される。例えば、経口投与は、ｉ．ｖ．注射による投与よりも高い投与量を必要とすることが予測されるであろう。これらの投与レベルのバリエーションは、当該分野においてよく理解されているような最適化のための標準的な実験ルーチンを用いて調整することができる。投与は、単一であっても複数であってもよい（例えば、２倍、３倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、またはそれより多く）。

【0077】

ある態様において、本発明のペプチドは、例えばペプチドを分解に対して保護するために、少なくとも１つの修飾された末端を含む。いくつかの態様において、Ｎ末端をアセチル化するか、および／またはＣ末端をアミド化する。ある態様において、本発明のペプチドは、少なくとも１つの非天然のアミノ酸（例えば１つ、２つ、３つもしくはそれより多く）、または少なくとも１つの末端修飾（例えば１つもしくは２つ）を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１つの非天然のアミノ酸および少なくとも１つの末端修飾を含む。

【0078】

本発明のペプチドは、任意に、他の治療剤と組み合わせて送達してもよい。さらなる治療剤を、本発明のペプチドと同時に送達してもよい。本明細書において用いられる場合、「同時に（concurrently）」という語は、組み合わせ効果を産生するために十分に時間的に近いことを意味する（すなわち、同時に（concurrently）とは、同時に（simultaneously）であってもよく、または、それは、２つ以上のイベントが、互いの前後の短期間のうちに起こることであってもよい）。本発明の一態様において、天然に存在しないペプチドは、天然に存在しないペプチドと抗生剤との組み合わせ活性が、より優れた活性を細菌のみに対して有する場合に、細菌の増殖を調節する抗生物質と同時に患者に送達される。本発明の別の側面は、本発明からのペプチドを含むキットに関し、本発明の方法を実施するために有用である。キットは、方法を実施するためのさらなる剤（例えば、バッファー、容器、さらなる治療剤）、ならびに説明をさらに含んでもよい。さらなる側面として、本発明は、上で議論される治療効果のうちのいずれか（例えば、殺菌）を達成するために、医薬処方物およびこれを投与する方法を提供する。医薬処方物は、上で議論される試薬のうちのいずれかを、薬学的に受入可能なキャリア、例えば天然に存在しないペプチドまたはそのバリアント中に含んでもよい。「薬学的に受入可能な」により、生物学的または別段に望ましくなくない材料、すなわち、毒性などの任意の望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与することができる材料が意味される。本発明の処方物は、任意に、薬用剤、医薬剤、キャリア、アジュバント、分散剤、希釈剤などを含んでもよい。本発明のペプチドは、既知の技術に従って、医薬用キャリア中で投与のために処方することができる。例えば、Remington, The Science And Practice of Pharmacy（Ed. 2014）を参照。本発明による医薬処方物の製造において、ペプチド（その生理学的に受入可能な塩を含む）は、典型的には、特に、受入可能なキャリアと混合される。キャリアは、固体または液体、または両方であってよく、好ましくは、ペプチドの重量により０．０１または０．５％〜９５％または９９％を含んでもよい単位用量処方物、例えば錠剤として、ペプチドと共に処方される。１つ以上のペプチドを、本発明の処方物中に組み込むことができ、これは、周知の製薬の技術のうちのいずれかにより調製することができる。本発明のさらなる側面は、対象をin vivoで処置する方法であって、該方法は、本発明のペプチドを薬学的に受入可能なキャリア中に含む医薬組成物を対象に投与することを含み、ここで、医薬組成物は、治療有効量において投与される。本発明のペプチドの、それを必要とするヒト対象または動物への投与は、化合物を投与するための当該分野において公知の任意の手段によるものであってよい。本発明の処方物は、経口、直腸、局所、頬側（例えば舌下）、膣、非経口（例えば、皮下、骨格筋、心筋、横隔膜の筋肉および平滑筋を含む筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内）、局所（すなわち、気道表面を含む皮膚および粘膜の両方の表面）、鼻内、経皮、関節内、気管内、および吸入投与、門脈内送達による肝臓への投与、ならびに直接的な臓器注射（例えば、肝臓内へ、中枢神経系への送達のために脳内へ、膵臓内へ、または腫瘍もしくは腫瘍の周囲の組織中へ）のために好適なものを含む。任意の所与の場合における最も好適な経路は、処置されている状態の性質および重篤度に、ならびに、用いられている特定のペプチドの性質に依存するであろう。

【0079】

注射のために、キャリアは、典型的には、無菌のパイロジェンフリー水、無菌の生理食塩水、高張食塩水、パイロジェンフリーリン酸緩衝化食塩水溶液などの液体であろう。投与の他の方法のために、キャリアは、固体または液体のいずれであってもよい。
経口投与のために、ペプチドは、カプセル、錠剤および粉末などの固体投与形態において、またはエリキシル剤、シロップおよび懸濁液などの液体投与形態において、投与することができる。ペプチドは、不活性成分および粉末化されたキャリア、例えばグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどと一緒に、ゼラチンカプセル中に封入してもよい。望ましい色、味、安定性、緩衝化能力、分散または他の公知の望ましい特色を提供するために添加することができるさらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。類似の希釈剤は、圧縮錠剤を製造するために用いることができる。錠剤およびカプセルはいずれも、数時間の期間にわたり薬品の連続的な放出をもたらすために、持続放出用製品として製造することができる。圧縮錠剤は、任意の不快な味を遮蔽して、錠剤を雰囲気から保護するために、糖コーティングまたはフィルムコーティングされていても、または胃腸管における選択的崩壊のために、腸溶性コーティングされていてもよい。経口投与のための液体投与形態は、患者のアクセプタンスを増大するために、着色剤および香味剤を含んでもよい。頬側（舌下）投与のために好適な処方物として、香味付けされた基剤（通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント）中に化合物を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性な基剤中に化合物を含むトローチが挙げられる。非経口投与のために好適な本発明の処方物は、無菌の水性および非水性のペプチドの注射溶液を含み、この調製物は、好ましくは、意図されるレシピエントの血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい。水性および非水性の無菌の懸濁液は、懸濁剤および濃縮剤を含んでもよい。処方物は、単位／用量または複数用量の容器、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に存在してもよく、凍結乾燥（freeze-dry／lyophilize）状態において貯蔵してもよく、これは、使用の直前に、無菌の液体キャリア、例えば食塩水または注射用水の添加のみを必要とする。

【0080】

即時注射溶液および懸濁液は、先に記載される種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。例えば、本発明の一側面において、密封された容器中の単位投与形態における、本発明のペプチドを含む、注射可能な、安定な無菌組成物が提供される。ペプチドまたは塩は、好適な薬学的に受入可能なキャリアにより再構成して、対象中へのその注射のために好適な液体組成物を形成することができる、凍結乾燥物の形態において提供される。単位投与形態は、典型的には、約１ｍｇ〜約１０グラムのペプチドまたは塩を含む。ペプチドまたは塩が、実質的に非水溶性である場合、十分量の薬学的に受入可能な乳化剤を、当該ペプチドまたは塩を水性キャリア中で乳化するために十分な量で使用することができる。１つのかかる有用な乳化剤は、ホスファチジルコリンである。直腸投与のために好適な処方物は、好ましくは、単位用量の坐剤として提示される。これらは、ペプチドを、１つ以上の便利な固体キャリア、例えばカカオバターと混合して、次いで、生じた混合物を成形することにより、調製することができる。皮膚への局所適用のために好適な処方物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルの形態をとる。用いることができるキャリアとして、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、皮膚浸透増強剤（transdermal enhancer）、およびこれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。経皮投与のために好適な処方物は、レシピエントの表皮との密接な接触を長期間にわたり保持するように適応させた個別のパッチとして提示してもよい。経皮投与のために好適な処方物はまた、イオン泳動により送達することができ（例えばTyle, Pharm. Res. 3:318 (1986)を参照）、典型的には、任意に、緩衝化されたペプチドの水溶液の形態をとってよい。好適な処方物は、クエン酸またはビス／トリスバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１〜０．２Ｍの化合物を含む。ペプチドは、代替的に、鼻内投与のために処方してもよく、別段に、任意の好適な手段により、対象の肺に投与しても、例えば、対象が吸入するペプチド含有呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液により投与してもよい。呼吸用粒子は、液体であっても固体であってもよい。用語「エアロゾル」は、細気管支または鼻孔中に吸入されることができる任意の気体媒介性の懸濁相を含む。特に、エアロゾルは、気体媒介性の液滴の懸濁液を含み、これは、定量噴霧式吸入器またはネブライザーにおいて、またはミストスプレー器において、産生することができる。エアロゾルはまた、空気または他のキャリアガス中に懸濁された乾燥粉末組成物を含み、これは、例えば吸入デバイスからガス注入により送達することができる。ペプチドを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるとおりの任意の好適な手段により、例えば圧力駆動式エアロゾルネブライザーまたは超音波式ネブライザーにより、産生することができる。ペプチドを含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、製薬の分野において公知の技術により、任意の固体粒子医薬用エアロゾル発生器により産生することができる。あるいは、全身性の様式ではなくむしろ局所性の様式において、例えばデポーまたは持続放出処方物において、ペプチドを投与してもよい。

【0081】

さらに、本発明は、本明細書において開示されるペプチドおよびその塩のリポソーム処方物を提供する。リポソーム懸濁液を形成するための技術は、当該分野において周知である。ペプチドまたはその塩が水溶性の塩である場合、従来のリポソーム技術を用いて、前記ペプチドまたはその塩を、脂質小胞中に組み込むことができる。かかる場合において、ペプチドまたはその塩の水溶性に起因して、当該ペプチドまたはその塩は、実質的に、リポソームの親水性の中心またはコア内に搭載されるであろう。使用される脂質層は、任意の従来の組成のものであってよく、コレステロールを含むものであっても、コレステロールフリーであってもよい。目的のペプチドまたはその塩が非水溶性である場合、やはり、従来のリポソーム形成技術を使用して、当該塩を、実質的に、リポソームの構造を形成する疎水性脂質二重層中に搭載することができる。いずれの場合においても、産生されるリポソームは、標準的な超音波処理および均質化技術の使用を通して、サイズを縮小してもよい。本明細書において開示されるペプチドまたはその塩を含むリポソーム処方物を、凍結乾燥して、凍結乾燥物を産生してもよく、これは、水などの薬学的に受入可能なキャリアにより再構成して、リポソーム懸濁液を再生することができる。非水溶性ペプチドの場合、医薬組成物は、非水溶性ペプチドを、例えば水性基剤などのエマルジョン中で含んで調製してもよい。かかる場合において、組成物は、所望される量のペプチドを乳化するために十分な量の薬学的に受入可能な乳化剤を含むであろう。特に有用な乳化剤として、ホスファチジルコリンおよびレシチンが挙げられる。特定の態様において、ペプチドは、その用語が上で定義されるとおり、治療有効量において対象に投与される。薬学的に活性なペプチドの投与量は、当該分野において公知の方法により決定することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciencesを参照。任意の特定のペプチドの治療有効投与量は、ペプチドごと、および患者ごとに変化し、患者の状態および送達の経路に依存するであろう。一般的な提案として、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量は、治療効果を有するであろう。ここで、全ての重量は、塩が使用される場合を含めて、ペプチドの重量に基づいて計算される。より高いレベルにおける毒性の懸念は、静脈内での投与量をより低いレベル、例えば約１０ｍｇ／ｋｇまでに限定し得、ここで、全ての重量は、塩が使用される場合を含めて、ペプチドの重量に基づいて計算される。約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量が、経口投与のために使用することができる。典型的には、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの投与量が、筋肉内注射のために使用することができる。それぞれ、静脈内または経口投与のために、特定の投与量は、約１μｍｏｌ／ｋｇ〜５０μｍｏｌ／ｋｇであり、ことさらには約２２μｍｏｌ／ｋｇまで、および３３μｍｏｌ／ｋｇまでのペプチドである。本発明の特定の態様において、治療効果を達成するために、１回より多くの投与（例えば２回、３回、４回またはそれより多くの投与）を、多様な時間間隔にわたり（例えば１時間毎、１日毎、１週間毎、１か月毎など）、使用することができる。本発明は、獣医学および医学的適用において用途を見出す。好適な対象として、鳥類および哺乳動物の両方が挙げられ、哺乳動物が好ましい。用語「鳥類」は、本明細書において用いられる場合、これらに限定されないが、ニワトリ、カモ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウ、およびキジを含む。用語「哺乳動物」は、本明細書において用いられる場合、これらに限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類などを含む。ヒトの対象は、新生児、幼児、青少年および成人を含む。

【0082】

ペプチドの合成
特定の態様において、本発明のペプチドは、当該分野において公知のいくつかのペプチド合成方法に従って産生することができる。ペプチド合成方法は、例えば、固相合成プロセスおよび液相合成プロセスのうちのいずれかであってよい。すなわち、目的のペプチドは、化合物（Ｉ）を構成することができる部分的なペプチドまたはアミノ酸と、残りの部分（これは、２つ以上のアミノ酸により構成することができる）の縮合を、所望される配列に従って繰り返すことにより、産生することができる。望ましい配列を有する生成物が保護基を有する場合、目的のペプチドは、保護基を除去することにより生成することができる。知られるべき縮合する方法および保護基を除去する方法の例は、以下の（１）〜（５）において記載される方法を含む。（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)、（２）Schroeder and Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1965)、（３）Nobuo Izumiya, et al.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide synthesis), published by Maruzen Co. (1975)、（４）Haruaki Yajima and Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Ex-periment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977)、および（５）Haruaki Yajima, ed.: Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, published by Hirokawa Shoten。反応後に、ペプチドは、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶化など、従来の精製の方法を用いて精製および単離することができる。上述の方法により得られたペプチドが、遊離の形態である場合、それは、既知の方法により好適な塩に変換することができる；逆に、ペプチドが塩の形態で得られる場合、当該塩は、既知の方法により遊離の形態または他の塩に変換することができる。出発化合物もまた、塩であってもよい。かかる塩の例として、以下に記述されるペプチドの塩として例示されるものが挙げられる。保護されたアミノ酸またはペプチドの縮合のために、ペプチド合成のために使用可能な多様な活性化試薬を用いることができ、これらは、特に好ましくは、トリスホスホニウム（trisphosphonium）塩、テトラメチルウロニウム塩、カルボジイミドなどである。トリスホスホニウム塩の例として、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、ブロモトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）、７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）が挙げられ、テトラメチルウロニウム塩の例として、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−（５−ノルボルナン−２，３−ジカルボキシイミド）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル（succimidyl））−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）が挙げられ、カルボジイミドの例として、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ．ＨＣｌ）などが挙げられる。これらを用いる縮合のために、ラセミ化阻害剤（例えば、ＨＯＮＢ、ＨＯＢｔ、ＨＯＡｔ、ＨＯＯＢｔなど）の添加を用いることができる。縮合のために用いられるべき溶媒は、ペプチド縮合反応のために使用可能であることが知られるものから適切に選択される。例えば、酸アミド、例えば無水または含水性のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセタミド、Ｎ−メチルピロリドンなど、ハロゲン化炭化水素、例えば塩化メチレン、クロロホルムなど、アルコール、例えばトリフルオロエタノール、フェノールなど、スルホキシド、例えばジメチル−スルホキシドなど、三級アミン、例えばピリジンなど、エーテル、例えばジオキサン、テトラヒドロフランなど、ニトリル、例えばアセトニトリル、プロピオンニトリルなど、エステル、例えば酢酸メチル、酢酸エチルなど、これらの適切な混合物などを用いることができる。反応温度は、ペプチド結合反応のために使用可能であることが知られている範囲から適切に選択され、通常、約−２０℃（「℃」は、「摂氏」を表す）〜５０℃の範囲から選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は、通常、１．５〜６倍の過剰量において用いられる。相合成において、ニンヒドリン反応を用いる試験により縮合が不十分であることが明らかとなる場合、十分な縮合は、限定することなく、保護基の縮合反応を繰り返すことにより行うことができる。反応を繰り返した後で縮合がまだ不十分である場合、その後の反応に対する影響を回避することができるように未反応のアミノ酸を、無水酢酸、アセチルイミダゾールなどによりアシル化することができる。出発アミノ酸のアミノ基のための保護基の例として、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−−Ｚ、Ｂｒ−−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃ、トリチルなどが挙げられる。出発アミノ酸のためのカルボキシル保護基の例として、上述のＣ_１−６アルキル基、Ｃ_３−１０シクロアルキル基、Ｃ_７−１４アラルキル基に加えて、アリル、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。セリンまたはスレオニンのヒドロキシル基は、例えば、エステル化またはエーテル化により保護することができる。エステル化のために好適な基の例として、低級（Ｃ_２−４）アルカノイル基、例えばアセチル基など、アロイル基、例えばベンゾイル基など、および有機酸などから誘導される基が挙げられる。加えて、エーテル化のために好適な基の例として、ベンジル、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｕ．ｓｕｐ．ｔ）、トリチル（Ｔｒｔ）などが挙げられる。チロシンのフェノールのヒドロキシル基のための保護基の例として、Ｂｚｌ、２，６−ジクロロベンジル、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−−Ｚ、ｔｅｒｔ−ブチルなどが挙げられる。ヒスチジンのイミダゾールのための保護基の例として、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。

【0083】

アルギニンのグアニジノ基のための保護基の例として、Ｔｏｓ、Ｚ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル（ＭＢＳ）、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）、メシチレン−２−スルホニル（Ｍｔｓ）、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）、Ｂｏｃ、Ｚ、ＮＯ２などが挙げられる。リジンの側鎖アミノ基の保護基の例として、Ｚ、Ｃｌ−−Ｚ、トリフルオロアセチル、Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｔｒｔ、Ｍｔｒ、４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデニル（Ｄｄｅ）などが挙げられる。トリプトファンのインドリルのための保護基の例として、ホルミル（Ｆｏｒ）、Ｚ、Ｂｏｃ、Ｍｔｓ、Ｍｔｒなどが挙げられる。アスパラギンおよびグルタミンのための保護基の例として、Ｔｒｔ、キサンチル（Ｘａｎ）、４，４‘−ジメトキシベンズヒドリル（Ｍｂｈ）、２，４，６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）などが挙げられる。出発物質中の活性化カルボキシル基の例として、対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコールとのエステル（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（hydroxysuccimide）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ））］などが挙げられる。出発材料中の活性化アミノ基の例として、対応する亜リン酸アミドが挙げられる。保護基を取り除く（除去する）ための方法の例として、Ｐｄ−ブラックまたはＰｄ−カーボンなどの触媒の存在下における水素流中での触媒による還元；無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、トリメチルシリルブロミド（ＴＭＳＢｒ）、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート、テトラフルオロホウ酸、トリス（トリフルオロ）ホウ酸、三臭化ホウ素、またはこれらの混合溶液を用いる酸処置；ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどを用いる塩基処置；および液体アンモニア中のナトリウムによる還元などが挙げられる。上記の酸処置による除去反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度において行われる；酸処置は、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾールおよびパラクレゾールなどのカチオンスカベンジャー；ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどを添加することにより、効率的に行われる。また、ヒスチジンのイミダゾールの保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノール処置により取り除かれる；トリプトファンのインドールの保護基として用いられるホルミル基は、１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下における酸処置による、ならびに希釈水酸化ナトリウム、希釈アンモニアなどによるアルカリ処置による脱保護により取り除かれる。

【0084】

加えて、本発明のペプチドは、溶媒和物（例えば水和物）であっても非溶媒和物（例えば非水和物）であってもよい。ペプチドは、同位体（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）などにより標識されていてもよい。さらに、ペプチドは、^１Ｈが^２Ｈ（Ｄ）に変換されている重水素変換形態であってもよい。同位体により標識または置換されたペプチドは、例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）における使用のためのトレーサー（ＰＥＴトレーサー）として用いることができ、医学的診断などの分野において有用である。
本明細書において記述されるペプチドについて、従来のペプチドのマーキングに従って、左末端はＮ末端（アミノ末端）であり、右末端はＣ末端（カルボキシル末端）である。ペプチドのＣ末端は、アミド（−ＣＯＮＨ_２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボン酸（−ＣＯＯ⁻）、アルキルアミド（−ＣＯＮＨＲ）、およびエステル（−ＣＯＯＲ）のうちのいずれかであってよい。特に、アミド（−ＣＯＮＨ_２）が好ましい。化合物は、塩の形態であってもよい。かかる塩の例として、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。

【0085】

ある態様において、ペプチドはまた、プロドラッグ形態であってもよい。プロドラッグとは、生体内の生理学的条件下において、酵素、胃酸などに起因する反応により本発明の機能的ペプチドに変換される化合物、すなわち、酵素による酸化、還元、加水分解などにより、本発明のペプチドに変換される化合物；胃酸などに起因する加水分解などにより本発明のペプチドに変換される化合物を意味する。本発明のペプチドのプロドラッグの例として、ペプチドのアミノが、アシル化、アルキル化またはリン酸化されている化合物（例えば、ペプチドのアミノが、エイコサノイル化、アラニル化、ペンチルアミノカルボニル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メトキシカルボニル化、テトラヒドロフラニル化、ピロリジルメチル化、ピバロイルオキシメチル化またはｔｅｒｔ−ブチル化されている化合物など）；ペプチドのヒドロキシが、アシル化、アルキル化、リン酸化またはホウ酸化されている化合物（例えば、ペプチドのヒドロキシが、アセチル化、パルミトイル化、プロパノイル化、ピバロイル化、スクシニル化、フマリル化、アラニル化またはジメチルアミノメチルカルボニル化されている化合物）；ペプチドのカルボキシが、エステル化またはアミド化されている化合物（例えば、ペプチドのカルボキシが、Ｃ１−６アルキルエステル化、フェニルエステル化、カルボキシメチルエステル化、ジメチルアミノメチルエステル化、ピバロイルオキシメチルエステル化、エトキシカルボニルオキシエチルエステル化、フタリジルエステル化、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチルエステル化、シクロヘキシルオキシカルボニルエチルエステル化またはメチルアミド化されている化合物）などが挙げられる。他のものの中でも、化合物（Ｉ）のカルボキシが、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのＣ１−６アルキルによりエステル化されている化合物が、好ましくは用いられる。これらの化合物は、それ自体公知の方法により、ペプチドから産生することができる。本発明のペプチドのプロドラッグはまた、IYAKUHIN no KAIHATSU（Development of Pharmaceuticals）、第７巻、Design of Molecules、p. 163-198、Published by HIROKAWA SHOTEN（1990年）において記載されるものなどの生理学的条件下において、本発明のペプチドに変換されるものであってよい。本明細書において、プロドラッグは、塩を形成してもよい。かかる塩の例として、本発明のペプチドの塩として例示されるものが挙げられる。本発明のペプチドは、結晶を形成してもよい。単一の結晶形態または複数の結晶形態の混合物を有する結晶もまた、本発明のペプチドにおいて含まれる。結晶は、それ自体公知の結晶化方法に従って本発明のペプチドを結晶化することにより生成することができる。加えて、本発明のペプチドは、薬学的に受入可能な共結晶または共結晶の塩であってもよい。ここで、共結晶または共結晶の塩とは、室温で固体であって、各々が異なる物理学的特性（例えば、構造、融点、融解熱、吸湿性、溶解度、安定性など）を有する２つ以上の特定の物質からなる、結晶性物質を意味する。共結晶および共結晶の塩は、それ自体公知の共結晶化により生成することができる。本発明のペプチドの結晶は、物理化学的特性（例えば、融点、溶解度、安定性）および生物学的特性（例えば、薬物動態（吸収、分布、代謝、排出）、効率の表出）において優れ、したがって、医薬として極めて有用である。

【0086】

さらなる側面および態様において、本発明はまた、以下の（１）〜（１４）のうちのいずれか１つおよび全てにおいて記載されるとおりの主題を提供する：
（１）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）ｎを含むペプチドであって、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸、および／または、３−メチルプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、２−［（２Ｓ）−２−（ヒドラジンカルボニル）ピロリジン−１−イル］−２−オキソ酢酸、ベータ−ホモプロリン、アルファ−メチル−プロリン、ヒドロキシプロリン、４−オキソ−プロリン、ベータ，ベータ−ジメチル−プロリン、５，５−ジメチル−プロリン、４−シクロヘキシル−プロリン、４−フェニル−プロリン、３−フェニル−プロリン、４−アミノプロリン、４−メルカプトプロリン、２−アミノ−アジピン酸（ホモグルタミン酸）、２−アミノ−ヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）、２−アミノ−オクタン二酸（アミノスベリン酸）、２−アミノ−４−カルボキシ−ペンタン二酸（４−カルボキシグルタミン酸）、グリオキサル−ヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサル−ヒドロイミダゾロン、Ｎ−アルファ−メチル−アルギニン、オメガ−メチル−アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ホモアルギニン、ベータ−ホモアルギニン、２−アミノ−３−ウレイド−プロピオン酸、２−アミノ−６−（１−カルボキシエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（２−（フラン−２−イル）−２−オキソエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（ホルミル−５−ヒドロキシメチル−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸、ｃ−アルファ−メチル−リジン、ベータ，ベータ−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ホルミル−リジン、Ｎ−イプシロン−メチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ｉ−プロピル−リジン、Ｎ−イプシロン−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−トリメチルアンモニウム−リジン、Ｎ−イプシロン−ニコチニル−リジン、｛［５−アミノ−１−（ヒドラジンカルボニル）ペンチル］カルバモイル｝ギ酸、Ｎ−アルファ−メチル−リジン、ホモリジン、ベータ−ホモリジン、２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸、ノルバリン、アルファ−メチル−ノルバリン、ヒドロキシノルバリン、オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−Ｎ−デルタ−ジメチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−ｉ−プロピル−オルニチン、ｃ−アルファ−メチル−オルニチン、ベータ，ベータ−ジメチル−オルニチン、カナバニン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−ブチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−フェニル−オルニチン、デルタ−（２−メチルピロリジン）−オルニチン、デルタ−ピペリジル−オルニチン、ガンマ−アミノ−デルタ−ピペリジル−吉草酸およびデルタ−アゼパニル−オルニチンから選択される１〜３つの非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはアミノ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはカルボキシ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− Ｘ_１は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_２は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_３は、グリシンまたはグリシンの保存的アミノ酸置換またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはグリシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはグリシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_４は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_５は、アラニンまたはアラニンの保存的アミノ酸置換またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントまたはアラニンのＤ−アミノ酸またはアラニンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはアラニンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_６は、ロイシンまたはロイシンの保存的アミノ酸置換またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントまたはロイシンのＤ−アミノ酸またはロイシンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはロイシンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
− Ｘ_７は、バリンまたはバリンの保存的アミノ酸置換またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントまたはバリンのＤ−アミノ酸またはバリンの保存的アミノ酸置換のＤ−アミノ酸またはバリンの非天然のアミノ酸バリアントのＤ−アミノ酸であり、
およびここで、Ｘ_１−Ｘ_２−Ｘ_３−Ｘ_４−Ｘ_５−Ｘ_６−Ｘ_７およびＸ_７−Ｘ_６−Ｘ_５−Ｘ_４−Ｘ_３−Ｘ_２−Ｘ_１は、リピート中で交換可能に用いられ、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0087】

（２）（１）によるペプチドであって、ここで、
− Ｘ_１およびＸ_３は、グリシン、Ｎ−アルファ−メチル−グリシン（サルコシン）、シクロプロピルグリシンおよびシクロペンチルグリシンから選択され、
− Ｘ_２、Ｘ_４およびＸ_６は、ロイシン、バリン、２−アミノ−３，３−ジメチル−酪酸（ｔ−ロイシン）、アルファ−メチルロイシン、ヒドロキシロイシン、２，３−デヒドロ−ロイシン、Ｎ−アルファ−メチル−ロイシン、２−アミノ−５−メチル−ヘキサン酸（ホモロイシン）、３−アミノ−５−メチルヘキサン酸（ベータ−ホモロイシン）、２−アミノ−４，４−ジメチル−ペンタン酸（４−メチル−ロイシン、ネオペンチルグリシン）、４，５−デヒドロ−ノルロイシン（アリルグリシン）、Ｌ−ノルロイシン、Ｎ−アルファ−メチル−ノルロイシンおよび６−ヒドロキシ−ノルロイシンから選択され、
− Ｘ_５は、アラニン、２−アミノ−イソ酪酸（２−メチルアラニン）、２−アミノ−２−メチルブタン酸（イソバリン）、Ｎ−アルファ−メチル−アラニン、２−アミノ−２−メチルペント−４−エン酸（アルファ−アリルアラニン）、ベータ−ホモアラニン、２−インダニル−グリシン、ジ−ｎ−プロピル−グリシン、ジ−ｎ−ブチル−グリシン、ジエチル−グリシン、（１−ナフチル）アラニン、（２−ナフチル）アラニン、シクロヘキシルグリシン、アダマンチル−グリシン、ベータ−ホモアリルグリシンから選択され、
− Ｘ_７は、バリン、ロイシン、ｃ−アルファ−メチル−バリン（２，３−ジメチルブタン酸）、２，３−デヒドロ−バリン、３，４−デヒドロ−バリン、３−メチル−Ｌ−イソバリン（メチルバリン）、２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸（ヒドロキシバリン）、ベータ−ホモバリンおよびＮ−アルファ−メチル−バリンからから選択される。

【0088】

（３）（１）または（２）によるペプチドであって、ここで、Ｚ_ｉは、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル（penyl）−ピロリジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン、ベータ−（２−ベンゾチアゾリル）−アラニン、３−（２−フリル）−アラニンまたはベータ−（２−チエニル）−アラニンからなる。
（４）（１）〜（３）のうちのいずれか１つによる環状ペプチドであって、ここで、アミノ末端およびカルボキシ末端ゲートキーパーアミノ酸Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、環構造を形成する。

【0089】

（５）（１）、（２）、（３）または（４）によるペプチドから生成される、ペプチド模倣物。
（６）検出可能な標識をさらに含む、（１）〜（５）のうちのいずれか１つによるペプチドまたはペプチド模倣物。
（７）半減期の延長を増大させる分子をさらに含む、（１）〜（５）のうちのいずれか１つによるペプチドまたはペプチド模倣物。
（８）分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む、（１）〜（５）のうちのいずれか１つによるペプチドまたはペプチド模倣物。
（９）アミノ末端および／またはカルボキシ末端において、少なくとも１つのＤ−アラニンをさらに含む、（１）〜（５）のうちのいずれか１つによるペプチドまたはペプチド模倣物。

【0090】

（１０）医薬としての使用のための、（１）〜（９）のいずれか１つによる分子。
（１１）抗菌剤としての使用のための、（１）〜（９）のいずれか１つによる分子。
（１２）診断剤としての使用のための、（１）〜（９）のいずれか１つによる分子。
（１３）（１）〜（９）のいずれか１つによるものおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。

【0091】

（１４）さらに別の態様において、本発明は、抗菌ペプチドを産生するための方法を提供し、該方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）６〜１２アミノ酸の長さを有する凝集傾向領域（ＡＰＲ）のin silicoのリストを生成すること、ここで、ＡＰＲは、細菌プロテオームにおいて同定される、
（ｉｉ）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎに基づくＡＰＲを含む、２０〜２００個の数の異なるペプチドを合成すること、ここで、ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択される、
（ｉｉｉ）抗菌効果について前記ペプチドを試験すること、および抗菌ペプチドを産生すること。

【0092】

さらなる側面および態様において、本発明はまた、以下の（１^*）〜（１２^*）のうちのいずれか１つおよび全てにおいて記載される主題を提供する：
（１^*）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎを含むペプチドであって、ここで、
− ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し；
− 各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸、または３−メチルプロリン、３，４−デヒドロ−プロリン、２−［（２Ｓ）−２−（ヒドラジンカルボニル）ピロリジン−１−イル］−２−オキソ酢酸、ベータ−ホモプロリン、アルファ−メチル−プロリン、ヒドロキシプロリン、４−オキソ−プロリン、ベータ，ベータ−ジメチル−プロリン、５，５−ジメチル−プロリン、４−シクロヘキシル−プロリン、４−フェニル−プロリン、３−フェニル−プロリン、４−アミノプロリン、４−メルカプトプロリン、２−アミノ−アジピン酸（ホモグルタミン酸）、２−アミノ−ヘプタン二酸（２−アミノピメリン酸）、２−アミノ−オクタン二酸（アミノスベリン酸）、２−アミノ−４−カルボキシ−ペンタン二酸（４−カルボキシグルタミン酸）、グリオキサル−ヒドロイミダゾロン、メチルグリオキサル−ヒドロイミダゾロン、Ｎ−アルファ−メチル−アルギニン、オメガ−メチル−アルギニン、ノルアルギニン、ホモアルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−ホモアルギニン、ベータ−ホモアルギニン、２−アミノ−３−ウレイド−プロピオン酸、２−アミノ−６−（１−カルボキシエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（２−（フラン−２−イル）−２−オキソエチルアミノ）ヘキサン酸、２−アミノ−６−（ホルミル−５−ヒドロキシメチル−ピロール−１−イル）−ヘキサン酸、ｃ−アルファ−メチル−リジン、ベータ，ベータ−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ホルミル−リジン、Ｎ−イプシロン−メチル−リジン、Ｎ−イプシロン−ｉ−プロピル−リジン、Ｎ−イプシロン−ジメチル−リジン、Ｎ−イプシロン−トリメチルアンモニウム−リジン、Ｎ−イプシロン−ニコチニル−リジン、｛［５−アミノ−１−（ヒドラジンカルボニル）ペンチル］カルバモイル｝ギ酸、Ｎ−アルファ−メチル−リジン、ホモリジン、ベータ−ホモリジン、２−アミノ−６−ジアゾ−５−オキソカプロン酸、ノルバリン、アルファ−メチル−ノルバリン、ヒドロキシノルバリン、オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−Ｎ−デルタ−ジメチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−ｉ−プロピル−オルニチン、ｃ−アルファ−メチル−オルニチン、ベータ，ベータ−ジメチル−オルニチン、カナバニン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−ブチル−オルニチン、Ｎ−デルタ−メチル−Ｎ−デルタ−フェニル−オルニチン、デルタ−（２−メチルピロリジン）−オルニチン、デルタ−ピペリジル−オルニチン、ガンマ−アミノ−デルタ−ピペリジル−吉草酸およびデルタ−アゼパニル−オルニチンから選択される１〜３の非天然のゲートキーパーアミノ酸から選択され、およびここで、ペプチド構造中のアミノ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはアミノ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアセチル化されるか、および／またはここで、ペプチド配列中のカルボキシ末端ゲートキーパーのアミノ酸もしくはカルボキシ末端の非天然のゲートキーパーのアミノ酸は、任意にアミド化され、
− ＡＰＲ中に含まれるペプチドの名称は、表５において表され（Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、Ｐ１２、Ｐ１４、Ｐ１６、Ｐ１８、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２９、Ｐ３３、Ｐ３９、Ｐ４０、Ｐ４９、Ｐ５０、Ｐ５８、Ｐ７２、Ｐ７６、Ｐ７９、Ｐ８０、Ｐ８７、Ｐ８８、Ｐ８９、Ｐ９０、Ｐ９１、Ｐ９２、Ｐ９３、Ｐ９９、Ｐ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０５、Ｐ１１１、Ｐ１１２、Ｐ１１３、Ｐ１１４、Ｐ１１５、Ｐ１１６、Ｐ１１７、ｐ１１８、Ｐ１２３、Ｐ１２４およびＰ１２５）、これらのペプチドについての対応するアミノ酸配列は、表４において表され、ここで、ＡＰＲは、天然のアミノ酸を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲの保存的アミノ酸置換を含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するペプチド配列において存在するアミノ酸の非天然のアミノ酸アナログを含むか、またはＡＰＲは、ＡＰＲ中に存在するアミノ酸のペプチド配列におけるＤ−アミノ酸置換を含み、
およびここで、ＡＰＲ中のアミノ酸は、直列または逆方向リピートであってよく、ここで、ｎは、２〜４であり、
ならびに、各々のＺ_ｉは、リンカーであり、およびここで、各々のＺ_ｉは、独立して、１〜５単位のストレッチから選択され、ここで、単位は、ＰＥＧ、アミノ酸または非天然のアミノ酸である。

【0093】

（２^*）（１^*）によるペプチドであって、ここで、Ｚ_ｉは、プロリン、４−ヒドロキシプロリン、（２Ｒ，５Ｓ）−５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン、ベータ−（２−ベンゾチアゾリル）−アラニン、３−（２−フリル）−アラニンまたはベータ−（２−チエニル）−アラニンからなる。
（３^*）（１^*）〜（２^*）のうちのいずれか１つによる環状ペプチドであって、ここで、アミノ末端およびカルボキシ末端ゲートキーパーアミノ酸Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、環構造を形成する。

【0094】

（４^*）検出可能な標識をさらに含む、（１^*）〜（３^*）のうちのいずれか１つによるペプチド。
（５^*）半減期の延長を増大させる分子をさらに含む、（１^*）〜（４^*）のうちのいずれか１つによるペプチド。
（６^*）分子の溶解度を増大させる部分をさらに含む、（１^*）〜（３^*）のうちのいずれか１つによるペプチド。
（７^*）アミノ末端および／またはカルボキシ末端において、少なくとも１つのＤ−アラニンをさらに含む、（１^*）〜（３^*）のうちのいずれか１つによるペプチド。

【0095】

（８^*）医薬としての使用のための、（１^*）〜（７^*）のうちのいずれか１つによる分子。
（９^*）抗菌剤としての使用のための、（１^*）〜（７^*）のうちのいずれか１つによる分子。
（１０^*）診断剤としての使用のための、（１^*）〜（７^*）のうちのいずれか１つによる分子。
（１１^*）（１^*）〜（７^*）のうちのいずれか１つによるものおよび薬学的に受入可能なキャリアを含む、医薬組成物。

【0096】

（１２^*）以下のステップを含む、抗菌ペプチドを産生するための方法：
（ｉ）６〜１０アミノ酸の長さを有する凝集傾向領域（ＡＰＲ）のin silicoのリストを作製すること、ここで、ＡＰＲは、細菌プロテオームにおいて同定される、
（ｉｉ）以下の構造：（Ａ_２ｉ−１−ＡＰＲ−Ａ_２ｉ−Ｚ_ｉ）_ｎに基づくＡＰＲを含む、２０〜２００個の数の異なるペプチドを合成すること、ここで、ｎは、１〜４の整数であり、ｉは、各リピート毎に１〜ｎまで増加し、各Ａ_２ｉ−１およびＡ_２ｉは、独立して、Ｒ、Ｋ、Ｄ、ＥおよびＰから選択される１〜３の連続したゲートキーパーアミノ酸から選択される、
（ｉｉｉ）抗菌効果について前記ペプチドを試験すること、および抗菌ペプチドを産生すること。

【0097】

本明細書においては、本発明による操作されたペプチドおよび方法についての特定の態様、特定の立体配置、ならびに材料および／または分子が議論されてきたが、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、形態および詳細についての多様な変更または改変を行うことができることが、理解されるべきである。以下の例は、特定の態様をより良く説明するために提供され、それらは、本願を限定するものとみなされるべきではない。本願は、請求の範囲によってのみ限定される。

【0098】

例
１．E. coli特異的凝集性ペプチドの設計およびスクリーニング
本発明において、本発明者らは、統計学的熱力学アルゴリズムTANGOを用いて、E. coli株O157:H7のプロテオームにおける凝集傾向領域（ＡＰＲ）を同定した。これにより、長さが少なくとも６アミノ酸である３５３５個の配列および少なくとも２０％のTANGOスコアを得た。効率的な凝集シーズを作製するために、本発明者らは、先に考案されたタンデムリピートデザインを使用し^{１９、２１}、ここで、ＡＰＲは１回繰り返され、リンカーにより分離されている。収率および純度に関して固相ペプチド合成における長さの限定を考慮して、本発明者らは、７アミノ酸の長さを有する１５４２個のＡＰＲに焦点を当てた。これらのペプチドがE. coliにおいて凝集を誘導する能力を最大化するために、本発明者らは、ＡＰＲを、E. coliプロテオーム全体にわたるそれらの発生の頻度により順位付けし、単一のアミノ酸ミスマッチは許容し、このリストから初めの７５個の最も頻繁に生じる配列を選択した（表４）。設計パターンにおいて、およびこれらの凝集性ペプチドのコロイド安定性を増大するために、ＡＰＲを、凝集動態学を低下させることが先に示されている残基のクラスである凝集ゲートキーパーに隣接させた^{２２〜２４}。正に荷電した残基は、細菌による取り込みを補助することが示されているので^２５、本発明者らは、以下のペプチドレイアウト：Ｒ−ＡＰＲ−ＲＲを得るために、アルギニンを選択した。タンデム型を作製するために、本発明者らは、単一のプロリン残基を、ゲートキーパーに隣接したＡＰＲの間のリンカーとして用いた。この様式において生成された７５個のペプチドに加えて、本発明者らは、ペプチドの凝集傾向をさらに調節するために、第１のＡＰＲリピート中の１つの残基をアルギニンに無作為に変異させることにより、リスト中の初めの２５個のペプチドの各々の２つのバリアントを加えた（表４）。全てのペプチドは、固相合成を用いて２００ナノモルのスケールにおいて生成し、ＤＭＳＯ中で、２ｍＭの理論上のストック濃度に溶解した（１００％の合成効率を仮定して）。E. coli O157:H7の増殖に対するペプチド活性を、１、６、１２および２５μｇ／ｍＬの濃度に対応するペプチドの希釈において測定した。最も高い希釈において細菌の増殖を阻害することができたペプチドは存在しなかったが、これらのうちの４３個は、２５μｇ／ｍＬにおいてE. coliに対して活性であり、そのうちの１１個は、１２μｇ／ｍＬにおいて活性であり、６個は、６μｇ／ｍＬの見かけの最小阻害濃度（ＭＩＣ）値を有した（表５）。本発明者らは、既知のＡＭＰを同定するように訓練されるCAMPソフトウェア予測アルゴリズム^２６を用いて本発明者らの配列を分析し、本発明者らがそれらを活性であると見出したか活性でないと見出したか（６５％は不活性であった）に関わらず、９０％が抗菌性であると予測されることを見出した。測定された活性によるマシューズ相関関係（ＭＣＣ）は、１２μｇ／ｍＬにおいては０．１、２５μｇ／ｍＬにおいては０．２４であった。このことは、機械学習アルゴリズムにより捕捉される既知のＡＭＰの疎水性および電荷などの重要な特性は、凝集性ペプチドの抗菌活性を予測するためには十分ではないこと、ならびに、本発明者らのペプチドは、現行の予測アルゴリズムには組み込まれていない機序により作用することを示す。

【0099】

２．E. coli由来の凝集性ペプチドの活性および選択性
本発明者らは、スクリーニングからのいくつかのペプチド、すなわちＰ２（ＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲＰＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲ、配列番号１）、Ｐ５（ＲＡＬＬＴＴＬＬＲＲＰＲＡＬＬＴＴＬＬＲＲ、配列番号３）、Ｐ１４（ＲＧＬＬＡＬＬＡＲＲＰＲＧＬＬＡＬＬＡＲＲ、配列番号６）ならびにＰ１０５（ＲＡＬＬＲＴＬＬＲＲＰＲＡＬＬＴＴＬＬＲＲ、配列番号５）を再合成およびＨＰＬＣ精製し、ＨＰＬＣグレードに精製されたペプチドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）の値が、６〜１２μｇ／ｍＬとなることを確認した（表１を参照）。E. coli O157:H7に対するペプチドの殺菌活性の速度の分析（ＭＩＣ濃度において）は、ペプチドが、３０分間〜２時間以内に完全な殺菌効果を発揮することを示した（図１Ａ）。ペプチド処置された細菌の横断面の透過型電子顕微鏡観察は、E. coliにおけるタンパク質凝集の特徴である大きな封入体の広範囲にわたる存在を明らかにし、このことは、ペプチドが、細菌のタンパク質恒常性に干渉することにより作用することを示唆している（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）。大型極性凝集物（Large Polar Aggregates）とも称されるこれらの封入体は、大抵は細菌細胞の極に位置する。このことは、核様体閉鎖（nucleoid occlusion）に起因するそれらの構造から予測されるとおりである^２７。興味深いことに、致死量以下の濃度（ＭＩＣの５０％）の活性なペプチドに対して３６日間の期間にわたり細菌を繰り返し継代した場合、耐性の発生は観察されなかったが、一方、対照抗生物質アンピシリンについての場合においては耐性が発生した（図１Ｅ）。ペプチドの特異性の初めの徴候として、本発明者らは、ヒト赤血球に対するそれらの溶血活性を評価し（図１Ｆ）、これにより、Ｐ２ペプチド（ＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲＰＲＧＬＧＬＡＬＶＲＲ、配列番号１）が、E. coli株O157:H7に対して好ましい（特に、最も特異性が高い）毒性プロフィールを有することが明らかとなった。このことを、ＨｅＬａ細胞に対するCellTiter Blue（図１Ｇ）およびＬＤＨ放出（図１Ｈ）アッセイによりさらに確認した。E. coli O157:H7に対するＰ２の特異性は、細菌の増殖が５０％阻害される濃度（ＩＣ５０＝１．５μｇ／ｍＬ）を決定して、当該ペプチドがヒト赤血球の５０％溶解を誘導する濃度（ＬＣ５０＝１１００μｇ／ｍＬ）と比較することにより概算し、７３０の治療比率を得た。この観察に基づいて、Ｐ２を、さらなる特徴づけのために選択し、これ以降、コルぺプチン１と称するであろう。対照として、本発明者らは、コルぺプチン１の変異体を生成し、これにおいて、本発明者らは、ＡＰＲ中の異なる位置においてプロリン置換を誘導し（表１）、これは、疎水性を保存するが、ベータ−シート傾向を妨害し、それによりペプチドの凝集傾向を低下させる。変異体ペプチドの疎水性および電荷の保存に起因して、CAMP予測ソフトウェアは、やはり、これらの対照を抗菌性であると分類する。しかし、本発明者らが細菌を対照ペプチドで処置した場合、本発明者らは、２００μｇ／ｍＬを超えるＭＩＣ値を得、このことは、ベータ−構造形成が、本発明者らのペプチドの抗菌活性のために重要であることを示し、他のＡＭＰの作用の様式は、本発明者らの配列により観察される抗菌活性にとっては予測的でないことを確認している。次のステップにおいて、本発明者らは、多様な菌株に対するコルぺプチン１の活性を評価し、これを、当該菌株中に存在するＨｃａＢタンパク質の配列保存と相関させた。データを、表２において示す。

【0100】

３．コルぺプチン１は、無定形凝集物に成熟する可溶性オリゴマー性ベータ構造凝集物を形成する
イオンモビリティ質量分析と連結されたエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＩＭＳ−ＭＳ）^２８によるコルぺプチン１の分析により、１００ｍＭの酢酸アンモニウムバッファー中でのコルぺプチン１の可溶化の直後に、ペプチドは、単量体のみではなく、可溶性のオリゴマーを容易に形成し、これは二量体から九量体までの範囲であり、より高次となる可能性もあることが明らかとなった（図１Ｉ）。このことと一致して、溶解後に動的光分散（ＤＬＳ）により観察される主要な種は、約１〜２ｎｍの明らかな水力学的な半径を有し、これは、数時間以内にすみやかに大きな粒子に成長する（図１Ｊ）。コルぺプチン１溶液の組成は、経時的により大きな種へと進化し、これは、質量分析計において、より小さな種の消費と平行している（より大きなものは装置の検出範囲外となる）。超遠心を用いる経時的なペプチドの溶解度の研究もまた凝集を示し、溶解後の３０分間の超遠心により、ペプチドのうちの６０％未満が溶液中に残存した（図１Ｋ）。この様式において回収された不溶性画分を、懸濁液中に戻し（元の容積の１０％において）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を用いて二次構造含有量を分析し、これは、１６２２および１６４１周辺に主要なピークを示し、これは、ベータ−構造の形成と一致する（図１Ｌ）。成熟した凝集物は、アミロイド特異的色素である五量体ホルミルチオフェン酢酸（ｐ−ＦＴＡＡ）^{２９〜３１}に対して、わずかに温和に陽性であった（図１Ｍ）。透過型電子顕微鏡によると、成熟した凝集物は、主にアミロイド様凝集物を形成し、これは時折、規則正しい原線維に集合した（図１Ｎ）。まとめると、これらの特色は、徐々に不溶性の線維様凝集物へと転換するβ構造の可溶性オリゴマーを形成するコルぺプチン１に一致する。E. coliにおけるリン酸の天然に豊富な形態であってアミロイド形成を促進することが先に示されている^３２ポリリン酸への、コルぺプチン１の暴露により、当該ペプチドは、典型的なアミロイド−凝集動態学を示すことが、ｐＦＴＡＡ蛍光を用いて測定される（図１Ｏ）。コルぺプチン１のプロリン置換された不活性な対照（Ｐ−コルぺプチン１と称される）の分析により、同一条件下における可溶化の後で、Ｐ−コルぺプチン１は、ほぼ完全に可溶性であり、ベータ−構造の立体配置をとらないがことが示されたが、沈降分析によっては、なお、より長い時間スケールにおいて、凝集が明らかとなる（図１Ｋ＆Ｌ）。

【0101】

４．膀胱感染モデルにおいて、コルぺプチン１はE. coliに対してin vivoでの活性を示す
コルぺプチン１のin vivoでの可能性を試験するために、本発明者らは、哺乳動物（ＨｅＬａ）細胞とE. coli O157:H7との共培養物をコルぺプチン１で処置し、コルぺプチン１は細菌中で優先的に蓄積するが、哺乳動物細胞においてはそうではないことを観察した（図２Ａ）。最後に、本発明者らは、２５％または５０％のヒト血清中で２時間にわたりインキュベートされたコルぺプチン１が、２５μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬにおいて、なお細菌の増殖を阻害することができることを見出した（図２Ｄ）。これらの正の結果を考慮して、本発明者らは、次いで、用量漸増実験を行うことにより、ペプチドに対するスイスマウスの耐性を確立した。本発明者らは、３０ｍｇ／ｋｇまでのコルぺプチン１の腹腔内投与の後で、動物の基本的な生理学的および行動学的パラメーターに対して、全濃度範囲にわたり急性の有害効果を観察した。観察されたパラメーターは、体重、食餌および水の消費、ホームケージでの活動および移動運動を含んだ。本発明者らは、次に、６個体のマウスのコホートを、明らかな有害効果を伴うことなく、１８日間にわたる最大耐容用量における毎日の注射により処置した。マウスを３日間にわたり回復させ、その時点で、それらを安楽死させ、主要な臓器の調査を行い、これにより、重要な形態学的な毒性の兆候がないことが明らかとなった（表６、７および図５、６）。加えて、これらの動物の血清に対するＥＬＩＳＡアッセイにより、コルぺプチン１ペプチドに対する特異的抗体応答がないことが明らかとなった（図２Ｅ）。健康な動物における、１０ｍｇ／ｋｇのＦＩＴＣ標識コルぺプチン１の単一用量の注射（ＩＰまたは尿路）の後の、限定された体内分布の研究により、注射の後少なくとも３時間にわたる蛍光材料の明確な分布、および２４時間後ペプチドの総クリアランスが明らかとなった（図７）。これらの観察に基づいて、本発明者らは、マウス膀胱感染モデルにおいてコルぺプチン１の抗菌効力を試験した。このモデルにおいて、５０μＬの１０^８のＣＦＵ／ｍＬのE. coli O157:H7の懸濁液の接種材料は、健康なスイスマウスの尿道を介して膀胱へ送達された。感染の１時間後、本発明者らは、コルぺプチン１の単一の注射を、１０ｍｇ／ｋｇで、尿道（ｎ＝１５）または腹腔内（ｎ＝１５）のいずれかを介して投与した。処置の２４時間後、動物を安楽死させて、浸漬して柔らかくした組織に播種することにより、腎臓、結腸、膀胱および尿管における細菌の力価を決定した（図２Ｆ〜Ｉ）。これらの実験により、コルぺプチン１処置された動物の様々な臓器における細菌の力価の、腹腔内および尿道送達の両方の後での２対数倍を超える著しい低下が明らかとなった（バッファー対照と比較してｐ−ｖａｌ＜１０^−４、および非凝集性Ｐ−コルぺプチン１対照と比較してｐ−ｖａｌ＜１０^−４、Tukey事後検定によるＡＮＯＶＡ）。効果は、対照として用いられた経口投与されたアンピシリン（２０ｍｇ／ｋｇ）のものに匹敵し、このことは、E. coliに対するコルぺプチン１の抗菌活性がin vivoで維持されることを示している。

【0102】

５．コルぺプチン１の取り込みはＩＢ形成および増殖阻害をもたらす
その作用の様式を研究するために、本発明者らは、コルぺプチン１を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で誘導体化し、コンジュゲートがその抗菌活性を保持したことを確立し（E. coli O157: H7に対してＭＩＣ＝３μｇ／ｍＬ）、コルぺプチン１の取り込みをフローサイトメトリーにより定量した。E. coli O157:H7によるコルぺプチン１の取り込みの分析は、１５分後に既に細胞の９７．７±２．９％（Ｎ＝４）が（図３Ｂ＆Ｆ）、１時間後以降にはほぼ１００％までがＦＩＴＣに対して陽性であることを示した（図３Ｃ〜Ｆ）。平行して、ＭＩＣ濃度で処置されたE. coli O157:H7の蛍光顕微鏡観察によっては、細胞膜におけるＦＩＴＣ−コルぺプチン１の濃縮は確認されず、むしろ、１５分以降に、細胞内の極性の封入体（ＩＢ）における蛍光の明らかな蓄積を示し（図３Ｇ）、これは、より後の時点においても持続した（図３Ｈ）。加えて、コルぺプチン１により誘導されたＩＢは、アミロイド様凝集物ならびに疾患関連タンパク質封入体に特に結合する色素であるｐ−ＦＴＡＡ^３１により染色することができ、このことにより、これらの封入体の規則正しいベータ−シートが豊富な凝集したタンパク質構造が確認された（図３Ｉ＆Ｊ）。このことは、コルぺプチン１の取り込みおよびＩＢ形成が、緊密に連続して起こることを示す。コルぺプチン１処置後のＣＦＵ決定により測定される細菌細胞死の動態学（図３Ｋ）もまた、ペプチドの内部移行の後に緊密に続き、１５分間の処置の後に、ＩＢの出現と同時発生する（１５分後に５０％）。一方、膜の易透化（permeabilisation）の結果としてのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取り込みによりモニタリングされる細菌細胞死は、よりゆっくりと増加し（１５分後の２．１±１．３％から３時間後の８５±１３．２％へ、図３Ａ〜Ｅ＆３Ｌ）、このことは、短い処置時間においては、ＩＢ形成と同時発生的であるが、膜の透過性が観察され得るより以前に、著しい増殖抑制が確立されることを示している。このことと一致して、４×ＭＩＣで２時間にわたり処置された細菌、および未処置の対照の、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、図３Ｍ、Ｎ、Ｏ）を用いた形態学的分析は、コルぺプチン１処置された細菌が、縮んだように見えるが、細胞からの漏出は見られないことを示す。まとめると、これらのデータは、コルぺプチン１の内部移行がコルぺプチン１を含むＩＢの形成および細菌の増殖阻害と同時発生的であるイベントの連鎖を示唆する。

【0103】

６．コルぺプチン１は、致死性の細菌のタンパク質恒常性の崩壊を誘導する
細菌のＩＢ形成は、熱への暴露および組み換えタンパク質の（過剰）発現を含む細胞ストレスと関連する、一般的なイベントである。このプロセスは、しかし、しばしば一過性かつ可逆性であり、必ずしも細菌細胞の死をもたらさない。実際に、細菌における組み換えタンパク質の産生は、細菌がＩＢに対処する能力に広範に依拠する。一例として、本発明者らは、組み換えタンパク質産生のために慣用的に用いられるE. coli BL21細胞の増殖に対する、ヒトｐ５３タンパク質（ｐ５３ＣＤ）の凝集傾向が高いコアドメインの過剰発現の帰結を測定した（図４Ａ）。ｐ５３ＣＤの発現は、対数増殖期の遅延をもたらし、これは、過剰発現から生じる細胞ストレスに一致したが、コロニー形成に対しては何らの効果も存在せず、このことは、当該ストレスが致死性ではないことを示している。コルぺプチン１により誘導されるＩＢ形成が不可逆的に毒性である理由を理解するために、本発明者らは、ＭＩＣ濃度におけるコルぺプチン１で１時間処置されたE. coli O157:H7細胞から精製したＩＢの組成を、ｐ５３ＣＤを一晩過剰発現したE. coli株BL21から精製したＩＢと比較した。生じた試料のＴＥＭによる検査により、これらのＩＢの首尾よい精製を確認した（図４Ｃ）。ＩＢの組成を、その後、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図４Ｄ）。クーマシー染色全体的なパターンにより、多数の類似する細菌のタンパク質が、コルぺプチン１処置E. coli O157:H7およびｐ５３過剰発現E. coli BL21の両方のＩＢ中に捕捉されているが、未処置の細菌においてはそうではないことが明らかとなり、このことは、ＩＢ形成に関連する共通する分子機構を示唆している。ＩＢに捕捉されたタンパク質の中で、封入体において生じることが知られている多数の分子シャペロンを検出することができた。これは、細菌のＨｓｐ７０ホモログＤｎａＫ、Ｈｓｐ６０シャペロニンＧｒｏＥＬ、リボソーム関連シャペロンであるトリガー因子（ＴＦ）および細菌のＨｓｐ４０ ＤｎａＪを含む（図４Ｅ）。コルぺプチン１に暴露されたE. coli K12 MG1655細胞における、蛍光により追跡可能なＤｎａＫ−mCerulean3融合タンパク質（後者の部分は青色蛍光タンパク質を含む）の極局在により、ＤｎａＫとＩＢとの関連が確認された（図４Ｆ）。本発明者らのデータは、コルぺプチン１およびｐ５３ＣＤのＩＢが、ＩＢの一般的な構成要素である多くのシャペロンおよびリボソームタンパク質を含む、多数のタンパク質を共有することを示す。第２に、この共通のコアに加えて、本発明者らは、コルぺプチン１のＩＢが、ｐ５３ＣＤのＩＢより多くのさらなるタンパク質を含むことを見出す。このことは、コルぺプチン１処置の毒性の影響が、ｐ５３ＣＤの過剰発現の効果より大規模なプロテオミクスの影響に対応することを示す。この観察は、複数のタンパク質の凝集によりタンパク質恒常性の崩壊を誘導することを目的とする、本発明者らの初期の設計の仮説に則している。

【0104】

７．コルぺプチン１は、直接的な配列標的の同時翻訳的凝集を誘導する
本発明者らの設計により、コルぺプチン１ ＡＰＲは、E. coliプロテオームにおいて高度に重複し、単一のミスマッチを有する１８個の他のE. coliのタンパク質（表８）および二重のミスマッチを有する１５８個のタンパク質においても見出すことができる。コルぺプチン１の場合、その直接的なＡＰＲマッチは、ＨｃａＢからのＧ_１７ＬＧＬＡＬＶ_２４配列である。ＨｃａＢ（３−フェニルプロピオネート−ジヒドロジオール／桂皮酸−ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）は、芳香族化合物の代謝における非必須の酵素であって、非常に低い量において存在する（ＰａｘＤＢ^３３によれば０．０１５ｐｐｍ）。Taguchiおよび共同研究者らは、先に、細胞フリーの翻訳系を用いてＨｃａＢを含む全E. coliプロテオームの溶解度を決定し、ＨｃａＢが凝集傾向が高いタンパク質であって、フォールディングのためにＧｒｏＥＬ／ＥＳに高度に依存することを示している^３４。次のステップにおいて、本発明者らは、ＨｃａＢを組み換え発現のために誘導性ベクター中にクローニングして、ＨｃａＢを過剰発現するE. coli BL21:DE3細胞のライセートからタンパク質をクロマトグラフィーにより精製した。この材料を用いて、本発明者らは、マウスにおいて免疫化スキームを行い（材料および方法を参照）、ＨｃａＢに対する抗血清を得、ウェスタンブロットにおいて、正しい分子量におけるバンド、ならびに、２つのオフターゲットのバンドが明らかとなった（図４Ｈ）。この抗血清を用いて、本発明者らは、ＨｃａＢを内因的に過剰発現するE. coli O157:H7およびＨｃａＢを過剰発現するE. coli BL21細胞の可溶性および不溶性画分において、ＨｃａＢの存在に対するコルぺプチン１処置（１時間、ＭＩＣ濃度において）の効果を比較し（図４Ｈ）、コルぺプチン１処置細胞の封入体画分におけるＨｃａＢの蓄積を確認した。このことは、コルぺプチン１による処置の後でＨｃａＢが凝集することを確認する。個々のコドンの典型的なデコード時間を用いるTuller法^３５に基づいてこれらの遺伝子の翻訳効率を計算する場合、本発明者らは、コルぺプチン１の標的タンパク質の翻訳効率は、未検出の推定の標的についてのものよりも有意に高い（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．００１、図４Ｊ）ことを見出し、このことは、高い翻訳速度が、コルぺプチン１により誘導される凝集を促進し得ることを示唆している。この仮説を検証するために、本発明者らは、リボソームにおけるポリペプチドの出口チャネルを遮断することにより作用する静菌薬であるマクロライド系抗生物質エリスロマイシンの存在下における、コルぺプチン１のＭＢＣ値を測定した。驚くべきことに、本発明者らは、細胞を１００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンで２時間にわたり前処置してコルぺプチン１への暴露の間の翻訳を遮断した後で、コルぺプチン１に対する細菌の著しい脱感作を観察し（E. coli O157）（ＭＢＣ＞１００μｇ／ｍＬ）、このことは、作用の様式としてのタンパク質凝集の同時翻訳的誘導を強力に支持している。

【0105】

コルぺプチン１ ＡＰＲは、Acinetobacter baumanniiのプロテオームにおいて高度に重複しており、単一のミスマッチを有する１８個の他のA. baumanniiのタンパク質、および二重のミスマッチを有する２６８個のタンパク質においてもまた見出すことができ（表９）、このことは、E.coliおよびA. baumaniiの両方に対して観察されたコルぺプチン１の殺菌活性を支持している（図９）。

【0106】

８．コルぺプチン１は、多標的凝集カスケードを誘導し、タンパク質恒常性の崩壊をもたらす
コルぺプチン１の凝集およびその検出された標的が、どのようにコルぺプチン１ ＩＢにおいて見出される他のタンパク質の凝集に関係するのかという問題は、なお残る。第１の可能性は、コルぺプチン１により誘導されるタンパク質恒常性の崩壊が、細菌シャペロンの飽和から生じるということである。この可能性を試験するために、本発明者らは、E. coli K-12 BW25113株における主要な細菌シャペロンおよびプロテアーゼ（KEIOコレクション^３７）の、コルぺプチン１の活性に対する効果を決定し、E. coliのタンパク質恒常性の主要な構成成分の個々のノックアウトから、ＤｎａＫのみが、コルぺプチン１の活性に対して温和な効果を有したことを見出した（表３）。さらに、表皮ブドウ球菌において致死性の凝集を誘導する、正の電荷に隣接する株特異的ＡＰＲのタンデムリピートを用いて先に設計されたペプチド１９は、これらのペプチドが内部移行したとしても、グラム陰性のE. coliに対して活性ではなく、逆もまた真なりである。まとめると、これらのデータは、凝集性ペプチドによるシャペロンおよびタンパク質恒常性系の飽和は、コルぺプチン１の主要な作用の機構ではないことを示唆する。あるいは、および本発明者らの仮説と一致して、ＡＰＲの重複性は、配列特異的なタンパク質凝集のカスケードにより、タンパク質恒常性の崩壊を駆動する。本発明者らは、一次的なコルぺプチン１の標的は、それらの配列中にさらなるＡＰＲを有し、これらがコルぺプチン１により誘導される共凝集したタンパク質を形成し、これらはまた、これらのＩＢ中にも存在し、それら自体におけるタンパク質が、一次的なコルぺプチン１の標的における二次的なＡＰＲにより決定される凝集カスケードにより、さらに連結され得ると考えた。さらに１ステップ進むと、なおさらなる多数のタンパク質が、第３層により類似の様式において連結され、最終的に、細胞中で連結されていないタンパク質はほとんど残らない。

【0107】

比較すると、ｐ５３ＣＤは、TANGOによれば、１つのドミナントなＡＰＲを有し（ＩＬＴＩＩＴＬ、配列番号２２３）^３８、これは、E coli O157:H7のプロテオームにおいて正確なマッチを有さないが、１個の変異を有するＡＰＲを有する３個のタンパク質、および変異２個分離れたＡＰＲを有する５０個のタンパク質を有する。これらのタンパク質のうちのいずれも、ＩＢ中で検出され得ず（データは示さず）、このことは、ｐ５３ＣＤの凝集が、配列空間において、はるかにより離れたイベントであることを示している。ｐ５３ＣＤのＩＢにおいて検出されるタンパク質は、一方、主にシャペロンクライアント^{３９〜４６}からなり、このことから、ｐ５３ＣＤの凝集はタンパク質恒常性ストレスを構成するが、これはコルぺプチン１とは反対にタンパク質恒常性の崩壊を引き起こさず、細菌細胞にとって致死性ではないことが確認される。

【0108】

９．細菌のセットに対する２８個の異なるペプチドについてのＭＩＣ値の決定
本実験において、そのアミノ酸配列が表４において表される２８個のペプチドのセットを、E. coli BL2株、Acinetobacter baumannii、肺炎桿菌および緑膿菌に投与した。ＭＩＣ値を決定し、図８において表す。

【0109】

１０．コルぺプチン１は、種内での広範な反応性を有し、病原体耐性プロフィールにより影響を受けない
本実験において、本発明者らは、E. coliの多数の臨床分離株およびAcinetobacter baumanniiの多数の臨床分離株（２つの参照株を含む）に対するコルぺプチン１の効力を評価した。図９（上のパネル）は、E. coliの多数の臨床分離株に対するコルぺプチン１のＭＩＣ値（図８においてＰ２として示される）を列記する。図９（下のパネル）は、コルぺプチン１のＭＩＣ値（図９においてＰ２として示される）を列記する。１２の異なる抗生物質に対する臨床分離株の感受性（Ｓ）または耐性（Ｒ）または中程度の耐性（Ｉ）を、パネルにおいて表す（特定の抗生物質に対するＣＬＳＩ基準に従うデータ）。本発明者らのデータは、コルぺプチン１が、種内での広範な反応性を有すること、およびE. coliおよびAcinetobacter baumanniiの両方について、ＭＩＣ値は、抗生物質病原体耐性プロフィールにより影響を受けないことを示す。

【0110】

材料および方法
１．バイオインフォマティクス分析
多様な菌株についてのタンパク質配列を、UniProt（Nucleic Acid Res. (2008) 36, D190-5）から得、cd-hitアルゴリズム（Fu L. et al (2012) Bioinformatics 28, 3150）を用いて重複性を取り除いた。本発明者らは、この文書における全てのＡＰＲの同定についてTANGOアルゴリズムを用いた。本発明者らは、TANGOスコアに対して、残基１つあたり５のカットオフを用いた。なぜならば、これは、予測と実験との間で、０．９２のマシューズ相関係数をもたらすからである（Fernandez-Escamilla AM et al (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1302）。TANGOのセッティングは、温度＝２９８Ｋ、ｐＨ＝７．５、イオン強度＝０．１０Ｍであった。

【0111】

２．ペプチド合成
スクリーニングの段階の間に、標準的な固相ペプチド合成を用いてペプチドを合成した（JPT, Berlin, Germany）。的中したペプチドは、インハウスでIntavis Multipep RSi合成ロボットを用いて、より高いスケールにおいて再合成し、Prominence HPLC（Shimadzu, Japan）においてZorbax SB-C3セミ分取カラム（Agilent, USA）を用いて、９５％までＨＰＬＣ精製した。ペプチドを、凍結乾燥し、使用前は−２０℃で貯蔵した。

【0112】

３．菌株および増殖条件
グラム陰性の菌株は、Luria-Bertani（ＬＢ）ブロス（Difco）中で培養し、グラム陽性の菌株は、富栄養培地である脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロス（Difco, Sparks, MD）中で、３７℃で培養した。必要である場合にはいつでも、培地またはプレートに、増殖培地に適切な抗生物質を添加した。クローニングおよびプラスミド増幅のために、大腸菌DH5αを用いた。抗生物質耐性コロニーの選択のために、プラスミドを運搬しているE. coliを、２５μｇ／ｍＬのアンピシリンまたは１００μｇ／ｍＬのエリスロマイシン（sigma）を添加したＬＢ培地中で培養した。細菌のＣＦＵ計数は、血液寒天プレート（BD Biosciences）上で行った。全ての臨床分離株についての種の同定およびアンチバイオグラムを、MALDI-TOFおよびVITEK（登録商標）２自動化システム（bioMerieux）を用いて行った。

【0113】

４．ＭＩＣの決定
活性ペプチドのＭＩＣは、EUCASTガイドラインに従って、ブロス微量希釈アッセイを介して決定し、これは、９６ウェルのポリスチレン平底マイクロタイタープレート（BD Biosciences）において行った。簡単に述べると、単一のコロニーを、５ｍＬのＬＢ培地中に接種し、振盪インキュベーター中で３７℃で、対数増殖終了期まで増殖させた。培養物を、その後、フレッシュなＬＢ培地中で０．００２のＯＤ_６００まで希釈した（１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）。１００μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬの範囲の様々な濃度のペプチドを含む１００μＬのＬＢ培地を、無菌の９６ウェルプレートに対して連続希釈した（各プレート中少なくとも３ウェル）。その後、１００μＬの希釈菌を、様々な濃度のペプチドを含む９６ウェルプレート中にピペッティングした。各プレートにおいて、最大濃度のキャリアおよび培地により増殖した細菌を、それぞれ陽性および陰性の対照とみなした。その後、９６ウェルプレートを、静かに一晩３７℃でインキュベートし、細菌を増殖させた。多目的ＵＶ／ＶＩＳプレートリーダーにより、ＯＤ_５９０ｎｍで、１秒間の振盪において、Perkin Elmer分光光度計（1420 Multilabel Counter Victor 3）を用いて、増殖した細菌の吸光度を測定した。

【0114】

５．抗体および抗生物質製品コード
抗CLPB（Aviva、カタログ＃ARP53790_P050）、抗DnaK（Aviva、カタログ＃OAED00201）、抗Trigger Factor（Clontech、カタログ＃M201）、抗groEL（Abcam、カタログ＃ab82592）、抗DnaJ（Enzo Life Sciences、カタログ＃ADI-SPA-410-D）。アンピシリンナトリウム、ＣＡＳ番号69-52-3、Duchefa Biochemie、カタログ＃A0104。エリスロマイシン、ＣＡＳ番号114-07-8、Sigma Aldrich、ＣＡＳ番号114-07-8、カタログ＃E5389。

【0115】

６．生物物理学的特徴づけ
動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、室温で、８３０ｎｍのレーザー源を備えたDynaPro DLSプレートリーダー装置（Wyatt, Santa Barbara, CA, USA）により、行った。試料（１００μＬのＰＢＳバッファー、２ｍＭのペプチド）を、平底９６ウェルマイクロクリアプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany）中に配置した。９０°の角度における散乱光の強度の自己相関を１０秒間にわたり記録し、４０回の記録にわたる平均を求めることにより、単一のデータポイントを得る。Wyatt Dynamicsソフトウェアを用いて、球状粒子の形状を推定することにより、水力学的な半径を計算した。Bio-ATR IIアクセサリーを備えたBruker Tensor 27赤外分光光度計を用いて、減弱化全反射フーリエ変換赤外分光法（Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared Spectroscopy：ATR FTIR）を行った。１２０回のデータ獲得を蓄積することにより、９００〜３５００ｃｍ^−１の範囲において、４ｃｍ^−１のスペクトル解像度において、スペクトルを記録した。分光光度計は、乾燥した空気で持続的にパージした。空電についてのスペクトルを記録し、基線を差し引き、アミドＩＩ領域において再計測した（１５００〜１６００ｃｍ^−１）。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）のために、ペプチド調製物からのアリコートを、炭素被覆されたFormvar 400-メッシュの銅グリッド（Agar Scientific）に１分間にわたり吸着させた。グリッドを、ブロットし、洗浄し、１％（ｗｔ．ｖｏｌ^−１）の酢酸ウラニルで染色した。試料を、JEOL JEM-1400顕微鏡（JEOL Tokyo, Japan）で、８０ｋＶにおいて調べた。

【0116】

７．時間−殺傷動態学アッセイ
ペプチドの時間−殺傷の動態学研究を行い、十分な暴露の時点における細菌の殺傷速度を評価した。本研究は、抗菌活性の評価のための標準的なガイドに従って、時間−殺傷動態学の手順を用いて行った。剤の濃度の選択は、ＭＩＣのエンドポイントにより導かれた。

【0117】

簡単に述べると、２０μＬの凍結されたE. coli O157:H7の培養物を、５ｍＬのＬＢ中に接種し、振盪インキュベーター中で３７℃で、対数増殖終了期まで増殖させた。培養物を、その後、フレッシュなＬＢ培地（１ｍＬ）中で、ＯＤ_６００＝０．００２まで希釈した（１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）。凝集因子の経時的な効果を評価するために、細菌を、様々な濃度のペプチドに、ＭＩＣ値において、様々な期間にわたり（５分、１０分、３０分、１時間、６時間まで）供した。定義された接触期間の後で、５０μｌの各培養物を、連続希釈し、血液寒天プレート上に播種した。プレートを、振盪せずに、３７℃で一晩インキュベートした 。陽性および陰性の対照は、それぞれ、使用された最大量のバッファーおよびＬＢ培地で処置された細菌であった。生存生体の数は、ＣＦＵ／ｍｌとして計数した。

【0118】

８．多段階の耐性の発達の研究
ＭＩＣ値の半分の活性なペプチドの存在下において３０日間にわたり繰り返し継代培養することにより、標的株が活性な化合物に対して耐性を発達させる能力を評価した。簡単に述べると、E. coli O157の培養物を、Luriaブロス（ＬＢ）培地中で増殖させた；次いで、細菌の光学密度を、０．００２のＯＤ６００に調整した（１×１０^８ＣＦＵ／ｍＬに等しい）。次いで、細菌を、ＭＩＣ濃度の半分においてＰ２ペプチドにより処置し、２４時間のインキュベーション期間の後で、EUCASTガイドラインに従って、微量希釈アッセイによりＭＩＣを試験し、細菌を、ＭＩＣ値の半分量のそれぞれの凝集因子の存在下において再培養した。この実験において、アンピシリンを陽性対照として用いた。

【0119】

９．走査型電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）のために、E. coli O157細菌を、対数増殖終了期において、１０^８ＣＦＵ／ｍＬの密度まで希釈し、ＭＩＣ濃度より上の量のペプチドで処置した。２時間の処置の後で、細菌を、２％のグルタルアルデヒドで１時間にわたり固定した。０．１Ｍのカコジル酸ナトリウムバッファー中、１％の四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）を、１時間にわたり後固定として用いた。試料を、カコジル酸バッファー（０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム）で１０分間、室温において、３回洗浄した。試料を、段階的エタノールシリーズ（５０％、７０％、９６％、１００％のアルコール）で脱水した。脱水のステップの後で、試料を、ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）により１時間にわたり乾燥させ、試料台上にマウントし、金でスパッタ被覆した。３０ｋＶの加速電圧を有するSEM-FEG顕微鏡（JEOL JSM 6700F）を用いた。

【0120】

１０．横断面の透過型電子顕微鏡
E. coliを、対数増殖終了期において、２回洗浄し、生理的水で希釈し、その後、４×ＭＩＣ値の特異的凝集因子（aggregator）ペプチド（コルぺプチン１もしくはＰ２Ｐｒｏ２）またはバッファー（対照群）のいずれかにより、２時間にわたり３７℃で処置した。２時間後、細菌を、６０００ｒｐｍで４分間にわたり遠心分離し、ペレットを、０．１ＭのＮａ−カコジル酸バッファーｐＨ＝７．２〜７．４［＋２．５ｍＭのＣａＣｌ２＋１ｍＭのＭｇＣｌ２］中、２．５％のグルタルアルデヒドにより１時間にわたり固定した。次いで、ペレットを、カコジル酸バッファーで洗浄し、コジル酸バッファー中、１．５％の低融点アガロース（Sigma A4018）中で再懸濁し（４０℃）、６０００ｒｐｍで４分間遠心分離した。遠心管を、１５分間にわたり氷上に置き、その後、ペレットを含有するチップを切り取り、ペレットをカコジル酸バッファーの液滴中に取り除いた。ペレットを、１ｍｍ^３の管中で切断し（４℃）、蒸留水中、１％の四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）で２時間にわたり後固定し、蒸留水で２回洗浄した。その後、試料を、段階的エタノールシリーズ（３０、５０、７０、９０、１００％）中で、各ステップ５分間、４℃で、ゆっくりと回転させながら脱水した（エタノール１００％、３回繰り返した）。最後に、細胞を、プロピレンオキシドにより２回、１５分間、４℃で処置し、エポキシ樹脂とプロピレンオキシドとの１：１の混合物を浸潤させ（６０‘＠４℃、ゆっくりと回転させる）、その後、ドラフト下において、キャップをせずに、２：１のエポキシ樹脂とプロピレンオキシドとの混合物中で一晩静置した。翌朝、試料を、１００％のフレッシュなエポキシ樹脂中に配置し、夜にBEEMカプセル中に包埋し、２日間にわたりオーブン中で６０℃において重合させた。Leica ultracut UCTウルトラミクロトームを用いて超薄切片を切り出し、８０ｋＶにおいて作動させ、Olympus Quemesa 11Mpxlカメラを備えたJEOL JEM1400透過型電子顕微鏡において観察した。

【0121】

１１．In vitroでの溶血活性試験
ペプチドの溶血活性を、ヒト赤血球に対する溶血により決定した。プールしたフレッシュな血液を得、３０００ｒｐｍでの５分間にわたる遠心分離により、赤血球を回収した（Anticoagulated by EDTAK）（Cristina et al. 2015）。ペレットを、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中８％の濃度まで希釈した。１００μＬの８％の赤血球細胞溶液を、９６ウェルプレート（BD Biosciences）中で１００μＬのＰＢＳバッファー中のペプチドの連続希釈と混合した。反応混合物を、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。その後、プレートを、１０分間にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離し、１００μＬの上清を、滅菌９６ウェルプレート（平底）に移した。４０５ｎｍにおける上清の吸光度を測定することにより、ヘモグロビンの放出を決定した。溶血活性は、溶血を引き起こした最小ペプチド濃度として決定した（最小溶血濃度、ＭＨＣ）。１％のTritonおよび最大の使用された濃度のビヒクル中の赤血球を、それぞれ、１００％および０％溶血の対照として用いた。

【0122】

１２．In vitroでの哺乳動物細胞毒性
ＬＤＨ放出（Roche, Mannheim, Germany）およびCellTiter Blue（Promega）法を用いて、哺乳動物細胞毒性を測定した。簡単に述べると、ＨｅＬａ細胞（Bart De Strooper研究室から得られ、マイコプラズマフリーであることを試験したもの）を、９６ウェル丸底プレート中に、ダルベッコ改変イーグル培地中３×１０^５細胞／ｍＬの濃度において播種し、様々な濃度のペプチドにより処置した。１％のTriton（商標）X-100およびビヒクルで処置した細胞を、それぞれ陽性および陰性対照とみなした。マイクロプレートを、３７℃で、５％ＣＯ２および９０％の湿度において、４時間にわたりインキュベートした。マイクロプレートを、１３５０ｒｐｍで１０分間にわたり遠心分離した。１００μＬの上清を、透明な９６ウェル平底マイクロプレート中に移した。上清中のＬＤＨ活性を測定するために、１００μｌの反応ミックス（触媒および色素溶液）を各ウェルに加え、３０分間にわたりＲＴで暗所でインキュベートし、１００ｕｌの停止（Stop）溶液を添加することにより、ＬＤＨ反応を停止させた。４９０ｎｍにおける試料の吸光度を測定した。式：（ｅｘｐ．値−陰性対照値）／（陽性対照値−陰性対照値）^*１００を用いて、細胞の生存率を計算した。吸光の量は、生細胞の数に比例し、細胞の代謝活性に対応する。

【0123】

１３．E. coli ATCC 25922株におけるhcaB遺伝子のクローニングおよび発現
E. coli O157のＨｃａＢのコード領域を、加えてクローニングを目的としてＳａｌＩおよびＳｍａＩ制限酵素切断部位を含むhcaB特異的プライマー（ＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡＡＣＧＡ（配列番号２２４）、ＡＴＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＴＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号２２５）、ＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＡＡＧＡＴＣＣＡＡＣＣＣＡＧＣＣＧ（配列番号２２６））を用いて増幅した。一方が標的とされる遺伝子部分であるＡＰＲであり、他の一方が標的領域を含まない、遺伝子の２つの短縮型バージョンを設計した。細菌E. coli O157株、臨床分離株のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、鋳型として用いた。アンプリコンを、ＳａｌＩ／ＳｍａＩで消化したpCN68 E. coli−Staphylococcusシャトルベクター中にライゲーションし、異なる短縮型バージョンpCN-hcaBを得た。このプラスミドにおいて、PblaZがプロモーターである。アンピシリン（２５μｇ／ｍＬ）またはエリスロマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を、選択マーカーとして用いた。クローニングの正確性は、初めに制限酵素消化、ＰＣＲ、および挿入物のヌクレオチド配列分析により、次いでシークエンシングにより確認した。

【0124】

１４．マクロライドとペプチドとの相互作用
エリスロマイシンの存在下におけるペプチドの効果を評価するために、E. coli O157を、５ｍｌのＬＢ（Luria-Bertani）中で増殖させた。対数期の培養物を、次いで、１０８細胞／ｍｌまで希釈した。増殖を停止させるために、細菌を、１００ｕｇ／ｍｌの濃度のエリスロマイシンにより、２時間にわたり３７℃で振盪することなく処置した。様々な濃度のペプチド（１００ｕｇ／ｍｌ〜０．７５ｕｇ／ｍｌ）またはバッファーを、少なくとも３回の複製ウェル（５０ｕｌ）を用いて、９６ウェル中に播種した。５０ｕｌのエリスロマイシン処置細菌を、各ウェルに加え、９６ウェルプレートを、２時間にわたり３７℃でインキュベートした。２時間後、細菌を連続希釈し、血液寒天プレート上で培養した。プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。ＣＦＵ計数により、生細胞の数を定量した。

【0125】

ＦＩＴＣ標識ペプチドに共役した、細菌と哺乳動物細胞との共培養物の蛍光顕微鏡
イメージングを目的として、ヒトHELA細胞を、ガラス底を有するスモールセルビュー細胞ディッシュ（small cell view cellular dish）（Greiner Bio-One/ GmbH/ 35mm ref: 627860）上で増殖させ、コンフルエントな単層を形成させた。その後、細胞に、２００μＬのE. coli O157株の一晩培養物を、ＦＩＴＣペプチド（３×ＭＩＣ）と共に、２４時間にわたり感染させた。細胞を、CellMask Deep Red細胞膜色素および１μｌのNucBlue試薬（Invitrogen）で３０分間にわたり染色し、次いで、培地を取り除いて、２ｍｌの４％パラホルムアルデヒドを、固定のためにプレートに加えた。プレートを、６時間にわたりＲＴでインキュベートした。共培養した細胞を、１ｍＬの食塩水で３回洗浄し、その後イメージングした。

【0126】

１５．発光共役オリゴマー（ＬＣＯ）による染色
２００μＬの対数増殖終了時の培養E. coli O157を、ＰＢＳで３回洗浄し、細菌数を１０^８細胞に調整し、その後、細菌を、ペプチドで（ＭＩＣで）、または対照としてＰｒｏ２ペプチドで、２時間にわたり処置した。２時間後、細胞を、１μＬのＬＣＯ色素ｐ−ＦＴＡＡと共に１時間および３０分間にわたりインキュベートした。吸光度および発光スペクトルを、４８０〜６００ｎｍにおいて測定した。

【0127】

１６．標識されたペプチドおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いる細菌のフローサイトメトリー分析
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）およびＦＩＴＣペプチドによる二重染色技術を用いて、殺傷速度およびペプチドの取り込みを、二次元分析において評価した。簡単に述べると、対数増殖終了期のE. coli O157細胞（１０^８ＣＦＵ／ｍＬ）を、ＰＢＳで洗浄し、ＭＩＣ値のペプチド（コルぺプチン１１またはＰｒｏ２／ＦＩＴＣ標識されたもの）により、様々な期間にわたり処置した。処置された細菌を、再び、ＰＢＳバッファーで３回洗浄した。１ｕｌのＰＩ（Invitrogen）を細菌に加え、５分間にわたりインキュベートした後、混合物からＦＡＣｓ管中にアリコート（５００μＬ）を分取した。ペプチドの活性を細胞死と相関させるために、Gallios（商標）フローサイトメーターを用いて、２つのチャネルにおいて蛍光強度を測定した。ＰＩ：励起５３６ｎｍおよび発光６１７ｎｍ、ＦＩＴＣ：励起４９０ｎｍおよび発光５２５ｎｍ。

【0128】

１７．封入体精製
２０ｍＬの細菌の一晩培養物を、３０分間にわたり６０００ｒｐｍで遠心分離し、生理的水により洗浄した。細菌を、ＭＩＣのペプチドにより、半殺傷時間（half killing time）にわたり処置し、その後、細菌ペレットを、１０ｍＬのバッファーＡ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、１．０ｍＭのＥＤＴＡ）により洗浄し、４℃で３０分間にわたり６ｋｒｐｍで遠心分離した。上清を廃棄し、２０ｍＬのバッファーＢ（バッファーＡプラス１μｇ／ｍＬのロイぺプチン、０．１ｍｇ／ｍＬのＡＥＢＳＦ）を、細菌のペレットに加えた。細胞を破壊するために、２００００〜２５０００ｐｓｉに設定した圧力により、Glen Creston細胞ホモジェナイザーを用いて、加えて、懸濁液を、氷上で交互に２分間（２分間の合計超音波処理時間を完了するまで、５０％の出力において１５パルス、および氷上で３０秒間の休止）超音波処理した（Branson Digital sonifier 50/60HZ）。溶解した細胞を、４℃で３０分間にわたり１０ｋｒｐｍで遠心分離した。沈殿した画分を、その後、１０ｍＬのバッファーＤ（バッファーＡプラス：０．８％Ｖ／ＶのTriton X-100、１％のデオキシコール酸ナトリウム）で再懸濁し、ペレットが確実に完全に溶解するように、懸濁液を超音波処理した。このステップを、３回繰り返した。遠心分離を、４℃で３０分間にわたり１０．０００ｒｐｍにおいて行った。最後に、ＩＢを可溶化するために、ペレットを、沈殿した画分１グラムあたり１ｍＬのバッファーＦ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、８．０Ｍの尿素）中で懸濁した。

【0129】

１８．血清の存在下におけるペプチドの活性および安定性
簡単に述べると、ヒト血清を得るために、フレッシュな血液を、ＲＴ（室温）で２０分間にわたり静置し、凝血させた。次いでチューブを３０００ｐｍで１０分間にわたり遠心分離し、血清を分離した。血清を、ＲＰＭＩ培地（５０％）中で希釈し、５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬの様々な濃度を有するペプチドを、各ウェルに加えた。２時間のインキュベーションの後、対数増殖終了時のE. coli O157培養物を、ＰＢＳで３回洗浄し（８０００ｒｐｍ、１０分間）。次いで、細菌の数を、ＲＰＭＩ培地中で、血清を用いて、またはこれに用いずに、９×１０^８細胞に調整した。２時間のインキュベーションの後、細菌を連続希釈し、血液寒天プレート上で培養した。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。生細菌の数は、ＣＦＵ／ｍｌ（コロニー形成単位）の数として定量した

【0130】

１９．ＨｃａＢ精製および抗体産生
E. coli hcaBの完全コード遺伝子（SE2232、分類ＩＤ：83333）を、hcaB特異的プライマー：

【数1】

と、これに加えてクローニングの目的のためにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素切断部位（下線および斜体）を用いて増幅した。タンパク質精製を容易にするために、抗6X His（太字）タグを、組み換えタンパク質上のタグとして用いた。
E. coli株O157のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、鋳型として用いた。アンプリコンを、E. coliにおけるタンパク質発現のための系の構成成分として、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化したpET11Cプラスミド中にライゲーションし、pET-his-hcaBを得た。このプラスミドにおいて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（高度に活性な構成的プロモーター）が、プロモーターであった。選択マーカーとして、アンピシリンを用いた。全ての組み換えプラスミドを、BL21 pET-his-hcaBを有するように、E. coli BL21中で複製した。制限酵素消化および挿入物のヌクレオチド配列分析により、クローニングの正確性を確認した。

【0131】

タンパク質を、先に記載されるように精製した（Luminy and Cedex 2011）。簡単に述べると、E. coli BL21 pET-his-hcaBを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む１ＬのLuria-Bertani（ＬＢ）ブロス中で、３７℃において一晩振盪しながら増殖させた。その後、遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）により、細胞を採取して２５ｍｌの溶解バッファー（ＰＢＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのｂ−メルカプトエタノールプラス１タブレットのプロテアーゼ阻害剤Mini、ＥＤＴＡフリーの溶解バッファー（EDTA-freelyse））中で再懸濁し、細菌をフレンチプレスにより溶解し、ＤｎａｓｅＩを添加して４℃で撹拌し、全タンパク質を精製した。凝集物を取り除くため、本発明者らは、タンパク質を氷上に静置し、次いでろ過した。ＨｃａＢタンパク質精製は、完全自動化された液体クロマトグラフィー系であるAKTA FPLC系により行い、ここで、ＨｃａＢタンパク質は、HiPrepTM HPの５ｍｌカラムを用いて精製した。実際の精製を始める前に、AKTAを取り外し、帯電させ、ブランクにした。精製は、AKTA Xpress中のプログラムにより行った。精製されたタンパク質を、異なる管から収集し、画分を組み合わせて４℃に保った。精製したタンパク質を、ＳＤＳゲル上を流すことによりチェックした。３個体のスイスマウスを、腹腔内で２回、１０日間以内に免疫した。最初の注射を、ＨｃａＢタンパク質（５０ｕｇ／マウス）と完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；Sigma）との混合物（１：１）により投与した。１０日目において、LISAにより抗体の滴定を行った後で、追加免疫注射（タンパク質および不完全アジュバント（ＩＦＡ；Sigma）を行った。次いで、製造者の指示に従って、タンパク質Ｇカラム（GE Healthcare）への吸収により、全免疫グロブリンＧｓ（ＩｇＧ）を精製した。

【0132】

２０．実験動物
５〜８週齢（２０〜２３ｇ）のメスのスイスマウスを、実験のために用いた。動物は、実験用ケージへの３日間の順化の期間の後で、規則的な１２時間の明暗期間および２０℃の環境温度により、実験において用いた。

【0133】

２１．In vivoでの毒性試験
アッセイにおいて用いられた手順は、地域の動物倫理委員会により承認され、動物愛護の国際標準に従う（ルーベン大学の倫理委員会の承認番号P067/2015）。３０ｍｇ／ｋｇの用量の安全濃度は、段階的増大実験から達成され、腹腔内投与の後で何らの急性の有害効果も観察されなかった。
簡単に述べると、５〜６週齢のスイスメス個体を３群に分け（６動物／群）、３０ｍｇ／ｋｇのコルぺプチン１（群Ａ）またはビヒクル（生理的水（ｐＨ７．５））（群ｂ）を、１日１回、１８日間にわたり、ＩＰ注射を介して投与した。処置期間の間に、体重、食餌および水の消費、身体状態のスコア、ホームケージでの活動および移動運動を含む、臨床的、生理学的および行動学的パラメーターを、常にモニタリングおよび記録した。

【0134】

最後の投与の３日後に、動物に麻酔し、標準的な後眼窩穿刺を用いて、各々の動物から血液を採取した。次に、マウスを安楽死させ、肉眼での検査および臓器の重量を伴う完全な解剖を行った。臓器（心臓、肝臓、脾臓、腎臓、骨髄、脳、肺）を、サンプリングし、４％パラホルムアルデヒド中で浸漬固定した。ホルマリン固定された組織を、脱水後に、慣用的に処理して、組織病理学的検査のために、パラフィンブロック中に包埋した。これらのブロックから取得された５μｍ厚の切片（Thermo Scientific Microm HM355Sミクロトーム）は、次いで、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色され（Leica ST5010 Autostainer XL）、委員会認定の獣医病理学者によりLeica DM 2500光学顕微鏡下において評価された。自動化高解像度フローサイトメーター、Abbott Cell-Dyn 3700を用いて、血液学検査を行った。

【0135】

２２．尿路感染モデル
先に記載されるような４尿路感染モデルのために、８週齢のスイスメスマウスを用いた。簡単に述べると、マウスを、１０％のネンブタール の腹腔内投与により麻酔し、次いで、指で、マウスの膀胱をやさしくマッサージして、残尿を排出させるように押し出した。その後、麻酔したマウスに、経尿道的に、５０μｌの細菌懸濁液を（１×１０^８ｃｆｕ／ｍｌ）、膀胱中の滅菌カテーテルにより、手術用顕微鏡を通しての膀胱尿管逆流を回避するために５秒間より長い時間において、ゆっくりと接種した。本発明者らは、試料サイズを以下のとおり概算した：０．０５のＩ型エラー率、ＩＩ型エラー０．２を許容し、１対数ＣＦＵにおけるＣＦＵ決定の最大標準偏差を概算し、本発明者らは、１５の試料サイズが、処置群と未処置群との間の１対数ＣＦＵの差の効果サイズを確実に検出することを可能にするであろうと計算した。１時間後、マウスを無作為化し、５つの群に分けた（１５マウス／群）。群ＡおよびＢは、１０ｍｇ／ｋｇのコルぺプチンを、それぞれ腹腔内でまたは経尿道的に投与された。群Ｃは、Ｐ２Ｐｒｏ２ペプチド（プロリン置換）を経尿道を介して投与された。群Ｄは、陽性対照としてアンピシリンを経口で投与され、群Ｄは、ビヒクルを投与された（生理学的水）。次いで、接種の後すぐにカテーテルを除去した。感染の２４時間後に、マウスを安楽死させ、腎臓、膀胱、尿管、結腸をＰＢＳで洗浄し、ホモジェナイズした。ホモジェナイズした組織を、連続希釈して、血液寒天プレート上で培養した。プレートを、３７℃で一晩静置した。細菌の割合を、ＣＦＵ値により測定した。盲検法：試料の調製および動物の処置は、Ｌ．Ｋ．およびＬ．Ｋ．により行われ、Ｌ．Ｋ．およびＬ．Ｋ．は、ＣＦＵの決定も行ったが、しかし、処置と読み取りとの間に、動物は、Ｐ．Ｃ．により無作為にシャッフルされ、グループ分けのためのキイは、全ての結果が入力された後まで明らかとされなかった。

【0136】

２３．E. coli MG1655 dnaK-mCer3の構築
E. coli MG1655 dnaK-mCer3を構築するために、プライマー５’−ＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡ−３’（Ｆｗ）（配列番号２２９）および５’−ＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡ−３’（Ｒｅｖ）（配列番号２３０）により生成したmCer3アンプリコンを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を用いてpGBKDparSpMT1５中に組み込むことにより、プラスミドpGBKD-mCer3を初めに構築した。それぞれの制限酵素切断部位をアンプリコンの末端に付加することに加えて、これらのプライマーペアはまた、これらの配列により構築された蛍光融合タンパク質のフォールディングを促進する可撓性のリンカー（ＧＳＧＳＧＳをコードする６）を付加する。mCer3-frt-cat-frtカセットを、その後、プラスミドpGBKD-mCer3から、プライマーペア：
５’−ＡＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＴＴＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡ−３’（Ｆｗ）（配列番号２３１）
および
５’−ＡＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＣＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＡＣＣＣＧＴＴＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’（Ｒｅｖ）（配列番号２３２）を用いてＰＣＲで増幅した。

【0137】

アンプリコンを、その後、MG1655中に挿入し、Ｃ末端DnaK-mCer3融合物を作製した。catカセットを、その後、この株にプラスミドpCP20^７を一過性に装備させることによりフリップアウトし、所望されるMG1655 dnaK-mCer3株を生じた。

【0138】

２４．ＭＳ分析のためのＳＤＳゲルからのタンパク質精製
精製された封入体をＳＤＳゲル（４〜１５％のMini-PROTEAN（登録商標）TGX（商標）Precastタンパク質ゲル、１０ウェル、５０μｌ）にロードし、クーマシーブルー（R250）で染色した。切り抜いたバンドを、層流下において滅菌メスで切断した。ゲルスライスを、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム／ＡＣＮ（アセトニトリル）（１：１）中で、１０分間にわたり、室温で、青色の染色がなくなるまでインキュベートし、バッファーを１００％のＡＣＮにより置き換えて、５分間にわたりインキュベートすることにより、数回のサイクルにおいて洗浄した。最後のサイクルの後、speedvacにより試料を乾燥させ、２５０ｎｇの改変トリプシン（Promega）により、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファー（ｐＨ８．３）中で、一晩、３７℃で消化した。５％のＡＣＮ＋０．１％のギ酸、その後、１０％のＡＣＮ＋０．１％のＦＡ、および０．５％のＦＡ中の９５％のＡＣＮを添加することによりペプチドを抽出し、Speedvacにより乾燥させた。抽出したペプチドを、Pierce C18スピンカラム（Thermo Fisher Scientific）を製造者の指示に従って用いることにより洗浄した。試料を、ＭＳ機器における注入のために、１０μＬにおいて、５％のＡＣＮ＋０．１％のＦＡで希釈した。

【0139】

２５．統計学
統計学的計算は、別段に示されない限り、Prismを用いて行った。
感染モデルのＡＮＯＶＡ分析（図２Ｆ〜Ｉ）のために、群が類似の標準偏差を有するという仮定をBartlett検定を用いて試験し、これは、尿管データ（これは、未処置群の標準偏差の低下により引き起こされたものであるので、本発明者らは無視した）を除いて、標準偏差の間に有意差を示さなかった。

【0140】

表１−E. coli O157に対するＨＰＬＣグレードで精製された選択されたペプチドのＭＩＣおよびＭＢＣ値

【表1】

表２−多様な細菌株に対するコルぺプチン１の活性プロフィールならびにＨｃａＢタンパク質および標的ＡＰＲの配列保存。

【表2】

表３：シャペロン欠失株についてのコルぺプチン１の最小阻害濃度

【表3】

【0141】

表４−ペプチドの設計およびスクリーニング
１ E. coli O157:H7プロテオーム中のマッチする配列の数（１変異を許容する）。
２ CAMPソフトウェア８を用いての抗菌活性の予測

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【表4-6】

【表4-7】

【表4-8】

【表4-9】

【表4-10】

【表4-11】

【表4-12】

【0142】

表５−２５ｕｇ／ｍｌ下においてE. coli O157に対して活性なペプチド

【表5-1】

【表5-2】

【0143】

表６−３０ｍｇ／ｋｇのコルぺプチン１で処置されたマウスの、連続した１８日間の注射の後の臓器の重量

【表6】

表７−コルぺプチン１で処置されたマウスの、連続した１８日間の注射の後の血液学的数値（平均値＋ＳＤ）

【表7】

【0144】

ＷＢＣ、白血球細胞または白血球カウント。ＮＥＵ、好中球絶対数カウント、％Ｎ−好中球パーセント。ＬＹＭ、リンパ球絶対数カウント、％Ｌ−リンパ球パーセント。ＭＯＮＯ、単球絶対数カウント％Ｍ−単球パーセント。ＥＯＳ、好酸球絶対数カウント、％Ｅ−好酸球パーセント。ＢＡＳＯ、好塩基球絶対数カウント、％Ｂ−好塩基球パーセント。ＲＢＣ、赤血球細胞または赤血球カウント。ＨＧＢ、ヘモグロビン濃度。ＨＣＴ。ヘマトクリット。ＭＣＶ、平均赤血球容積。ＭＣＨ、平均赤血球ヘモグロビン量。ＭＣＨＣ、平均赤血球ヘモグロビン濃度。ＰＬＴ、血小板（Platelet）または血小板（Thrombocyte）カウント。ＭＰＶ、平均血小板容積。ＰＤＷ、血小板分布幅。ＰＣＴ、血小板クリット。

【0145】

表８−コルぺプチン１のＡＰＲに類似する（同一である、または１つのミスマッチ（８５．７１％同一性））配列セグメントを有するE coliプロテオームからのタンパク質

【表8-1】

【表8-2】

【0146】

【表9-1】

【表9-2】

【0147】

参考文献
1 Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A. & Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science 319, 916-919, doi:319/5865/916 [pii]
10.1126/science.1141448 (2008).
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【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【配列表】

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【国際調査報告】