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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2020-528735(P2020-528735A)
(43)【公表日】2020年10月1日
(54)【発明の名称】反復伸長変異のためのゲノム編集システム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20200904BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20200904BHJP
C07K 14/205 20060101ALI20200904BHJP
C07K 14/22 20060101ALI20200904BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20200904BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20200904BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20200904BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20200904BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20200904BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20200904BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20200904BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20200904BHJP
A61P 21/02 20060101ALI20200904BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20200904BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20200904BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20200904BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 ZZNA
C12N15/09 110
C07K14/205
C07K14/22
C07K14/315
C12N15/31
C12N15/861 Z
C12N15/863 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12N15/869 Z
C12N15/86 Z
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/761
A61K35/763
A61P43/00 111
A61P25/14
A61P21/02
A61P21/04
A61P25/00
A61P27/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】122
(21)【出願番号】特願2019-569721(P2019-569721)
(86)(22)【出願日】2018年6月14日
(85)【翻訳文提出日】2020年1月30日
(86)【国際出願番号】KR2018006731
(87)【国際公開番号】WO2018230976
(87)【国際公開日】20181220
(31)【優先権主張番号】62/520,098
(32)【優先日】2017年6月15日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516355531
【氏名又は名称】ツールゲン インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＯＯＬＧＥＮ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
(71)【出願人】
【識別番号】517037227
【氏名又は名称】カレッジ オブ メディシン ポチョン チャ ユニバーシティ インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】龍華国際特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】リー、ジェ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソクジョン
(72)【発明者】
【氏名】バエ、ヒースク
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ジファン
(72)【発明者】
【氏名】パク、ヒュン ジュン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084MA56
4C084MA58
4C084MA65
4C084MA66
4C084MA67
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA181
4C084ZA331
4C084ZA941
4C084ZC411
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087MA56
4C087MA58
4C087MA65
4C087MA66
4C087MA67
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA18
4C087ZA33
4C087ZA94
4C087ZC41
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子における人工的操作または改変に関する。より具体的には、過剰増幅反復配列の発現を低減するために人工的に操作された遺伝子を含む、過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムに関する。人工的に操作された遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子を含む。人工的に操作された遺伝子は、遺伝子のゲノム配列における人工的変異を含む。人工的に操作された遺伝子は、機能が低下した、または、発現が低減した遺伝子を含む。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
反復伸長の発現を低減するために人工的に設計された遺伝子を含む、反復伸長の発現を調節するためのシステムであって、
前記人工的に設計された遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子を含み、
前記人工的に設計された遺伝子は、そのゲノムにおいて人工的変異を含み、
前記人工的に設計された遺伝子は、機能異常である、または、発現が低減された遺伝子を含み、
前記遺伝子の発現の前記低減は、その発現産物の量が、人工的に設計されていない遺伝子と比較して低減または抑制されることを特徴とする、
システム。
前記人工的に設計された遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子を含み、
前記人工的に設計された遺伝子は、そのゲノムにおいて人工的変異を含み、
前記人工的に設計された遺伝子は、機能異常である、または、発現が低減された遺伝子を含み、
前記遺伝子の発現の前記低減は、その発現産物の量が、人工的に設計されていない遺伝子と比較して低減または抑制されることを特徴とする、
システム。
【請求項2】
前記ＳＵＰＴ４ＨはＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子を含む、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記遺伝子の前記人工的変異は、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換または挿入のうち少なくとも１つを含む、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記反復伸長は、
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
前記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の発現の前記調節は、前記第２反復部分の発現減少を含む、
反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
前記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の発現の前記調節は、前記第２反復部分の発現減少を含む、
反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
反復伸長の前記発現は、転写、転写後処理、翻訳、翻訳後修飾から成る群から選択される少なくとも１つである、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記反復伸長は、
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１および第２反復部分は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
から選択される１または複数の反復伸長を含む、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１および第２反復部分は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
から選択される１または複数の反復伸長を含む、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
反復伸長変異の発現を調節するための、請求項６に記載のシステム。
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
反復伸長変異の発現を調節するための、請求項６に記載のシステム。
【請求項8】
前記反復伸長の発現は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞、のうちから選択される１または複数の障害の原因である、反復伸長変異の発現を調節するための、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
反復伸長の発現を低減するための遺伝子操作用組成物であって、
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
前記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子である、
遺伝子操作用組成物。
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
前記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子である、
遺伝子操作用組成物。
【請求項10】
前記遺伝子操作は、ヌクレオチドの欠失、置換、または挿入である１または複数の改変を含む、請求項９に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項11】
前記遺伝子操作用組成物は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、請求項９に記載の遺伝子操作用組成物。
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、請求項９に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項12】
前記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項１１に記載の遺伝子操作用組成物。
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項１１に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項13】
前記遺伝子操作用組成物は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうちから選択される１または複数の障害を治療するための組成物である、請求項９に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項14】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列に対するガイド核酸を含む遺伝子操作用組成物。
【請求項15】
前記遺伝子操作用組成物は、前記エディタータンパク質、または、それをコードする核酸を含み、
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項16】
前記標的配列は、プロモーター領域、イントロン領域、エクソン領域、エンハンサー領域、３'‐ＵＴＲ（未翻訳領域）、５'‐ＵＴＲから選択される遺伝子の１または複数の領域に存在する、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項17】
前記標的配列は遺伝子のエクソン領域に存在する、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項18】
前記標的配列は、前記遺伝子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ〜２５ｂｐヌクレオチド配列領域に存在するヌクレオチド配列である、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項19】
前記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
の配列（５'から３'の方向に記載）から成る群から選択される少なくとも１つを含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
の配列（５'から３'の方向に記載）から成る群から選択される少なくとも１つを含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項20】
前記標的配列は、配列識別番号１〜２４から成る群から選択される１または複数の配列である、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項21】
前記標的配列は、配列識別番号１、２、１４、１５、１６、１７から成る群から選択される１または複数の配列である、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項22】
前記組成物は、
配列識別番号１、２、８〜１０、および、１４〜２０から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
配列識別番号１、２、８〜１０、および、１４〜２０から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項23】
前記組成物は、
配列識別番号３〜７、１１〜１３、および、２１〜２４から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
配列識別番号３〜７、１１〜１３、および、２１〜２４から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項24】
前記ガイド核酸は、前記遺伝子の標的配列に対して相補結合を形成可能なガイドドメインを含み、
前記相補結合は、０〜５個のミスマッチ結合を含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
前記相補結合は、０〜５個のミスマッチ結合を含む、
請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項25】
前記ガイドドメインは、前記遺伝子の標的配列に対する相補ヌクレオチド配列を含み、
前記相補ヌクレオチド配列は０〜５個のミスマッチを含む、
請求項２４に記載の遺伝子操作用組成物。
前記相補ヌクレオチド配列は０〜５個のミスマッチを含む、
請求項２４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項26】
前記ガイド核酸は、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメインから成る群から選択される少なくとも１つのドメインを含む、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項27】
前記ガイド核酸および前記エディタータンパク質は、それぞれ、それらをコードするＤＮＡの形態である、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項28】
前記ＤＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターの形態で含まれる、請求項２７に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項29】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項２８に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項30】
前記エディタータンパク質をコードする前記核酸は、ｍＲＮＡの形態で提供される、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項31】
前記エディタータンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の形態である、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項32】
前記組成物はガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形成である、請求項１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項33】
前記組成物は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項34】
前記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項３４に記載の遺伝子操作用組成物。
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項３４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項35】
前記組成物は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうち１または複数の疾患を治療するための組成物である、請求項１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項36】
組成物を対象に投与する段階を含む反復伸長疾患治療方法であって、
前記組成物は、活性成分として遺伝子操作組成物を含み、
前記遺伝子操作組成物は、反復伸長の発現を低減するためのものであり、
前記遺伝子操作組成物は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
前記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、
反復伸長疾患治療方法。
前記組成物は、活性成分として遺伝子操作組成物を含み、
前記遺伝子操作組成物は、反復伸長の発現を低減するためのものであり、
前記遺伝子操作組成物は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
前記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、
反復伸長疾患治療方法。
【請求項37】
組成物を対象に投与する段階を含む反復伸長疾患治療方法であって、
前記組成物は、活性成分として、遺伝子操作用組成物を含み、
前記遺伝子操作用組成物は
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的配列に対するガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸と
を含み、
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、
反復伸長疾患治療方法。
前記組成物は、活性成分として、遺伝子操作用組成物を含み、
前記遺伝子操作用組成物は
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的配列に対するガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸と
を含み、
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、
反復伸長疾患治療方法。
【請求項38】
前記標的配列は、配列識別番号１〜２４から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列である、請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項39】
前記遺伝子操作用組成物は、
配列識別番号１、２、８〜１０、１４〜２０から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
配列識別番号１、２、８〜１０、１４〜２０から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項40】
前記遺伝子操作用組成物は、
配列識別番号３、７、１１〜１３、２１〜２４から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
配列識別番号３、７、１１〜１３、２１〜２４から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項41】
前記組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）法のうち１または複数によって投与される、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項42】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項４１に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項43】
前記ガイド核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの形態で細胞に送達され、
前記エディタータンパク質はポリペプチドの形態で細胞に送達される、または、前記エディタータンパク質をコードする核酸はＤＮＡの形態で細胞に送達される、
請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
前記エディタータンパク質はポリペプチドの形態で細胞に送達される、または、前記エディタータンパク質をコードする核酸はＤＮＡの形態で細胞に送達される、
請求項３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項44】
対象への前記投与方法は、電気穿孔、注射、輸血、インプラント、移植から選択される１または複数の方法である、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項45】
前記投与は局部的または局所的に実行される、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項46】
前記投与は、皮下、皮内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、または腹腔内の方法で実行される、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項47】
前記対象への局部的または局所的投与は、前記対象の
腎臓、
胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系、
心臓、肺、
脳、特にニューロンおよび／または一般に中枢神経系、
網膜組織を含む目、
内耳を含む耳、
皮膚、
筋肉、
骨、
肝臓
のうち少なくとも１つの臓器に対して実行される、請求項４６に記載の反復伸長疾患治療方法。
腎臓、
胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系、
心臓、肺、
脳、特にニューロンおよび／または一般に中枢神経系、
網膜組織を含む目、
内耳を含む耳、
皮膚、
筋肉、
骨、
肝臓
のうち少なくとも１つの臓器に対して実行される、請求項４６に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項48】
前記対象は、ヒト、サル、マウス、ラットを含む哺乳動物である、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項49】
前記反復伸長は、
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
前記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の前記治療は、前記第２反復部分の発現の減少を含む、
請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
前記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
前記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
前記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
前記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の前記治療は、前記第２反復部分の発現の減少を含む、
請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項50】
前記反復伸長疾患は、３ヌクレオチド反復伸長、４ヌクレオチド反復伸長、５ヌクレオチド反復伸長、６ヌクレオチド反復伸長、１２ヌクレオチド反復伸長によって生じる１または複数の疾患である、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項51】
前記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項５０に記載の反復伸長疾患治療方法。
前記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
前記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
前記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
前記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
請求項５０に記載の反復伸長疾患治療方法。
【請求項52】
前記反復伸長疾患は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうち少なくとも１つである、請求項３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子における人工的操作または改変に関する。より具体的には、本明細書は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を人工的に操作するための遺伝子操作用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
反復配列を有する特定のヌクレオチド配列の発現は、反復配列の増幅度に応じて、疾患を生じさせ得る。特に、反復配列の増幅度が高いとき、深刻な遺伝性疾患が対象において生じ得る。例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡ）、フックス角膜ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、および、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）などの疾患の共通の特徴は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子によって生じる遺伝性疾患であるという点である。上述の疾患は致死的な影響を有するので、治療剤を開発する必要性がある。
【0003】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子によって生じる遺伝性疾患の治療剤が出現する必要性がある状況下において、本発明者は、標的特異的遺伝子はさみを使用して、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現の調節に関与する遺伝子である、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子、または、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の発現を調節することによって調節され得ることを確認した。このようにして、本発明者は、過剰増幅反復配列によって生じる疾患を緩和または治療するための遺伝子治療剤、および、疾患を治療するための方法を確認し、それにより、本出願を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本出願によって開示される内容によって達成される目的は、過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムを提供することである。
【0005】
本出願によって開示される内容によって達成される別の目的は、過剰増幅反復配列の発現を低減するための遺伝子操作用組成物を提供することである。
【0006】
本出願によって開示される内容によって達成される更に別の目的は、反復伸長疾患を治療するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上述の目的を実現するために、過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムが提供される。過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムは、過剰増幅反復配列の発現を低減するために人工的に操作された遺伝子を含む過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムであり、人工的に操作された遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子およびＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子を含み、人工的に操作された遺伝子は、遺伝子のゲノム配列における人工的変異を含み、人工的に操作された遺伝子は、機能が低下した、または、発現が低減した遺伝子を含む。
【0008】
上述の別の目的を実現するべく、遺伝子操作用組成物が本出願によって提供される。本出願によって開示される態様によれば、過剰増幅反復配列の発現を低減するための遺伝子操作用組成物が提供され、当該組成物は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ （ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、および、エンドヌクレアーゼのいずれか１つを含み、当該遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子およびＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子である。本出願によって開示される別の態様によれば、遺伝子操作用組成物は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、および、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列に対するガイド核酸を含む遺伝子操作用組成物であり、標的配列は、ガイド核酸と相補的に結合する、または、標的配列は、ガイド核酸と相補的に結合する配列に相補的である。
【0009】
上述の更に別の目的を実現するべく、本出願によって、反復伸長疾患を治療するための方法が提供される。治療方法は、反復伸長疾患を治療するための方法であり、当該方法は、活性成分として上記の組成物を含む組成物を治療対象に投与する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株においてｈＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９遺伝子はさみのスクリーニング結果を示す。
【0011】
【図2】マウスNIH3T3細胞株においてＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９遺伝子はさみのスクリーニング結果を示す。
【0012】
【図3】マウスＦＶＢ／ＮＪ胚の初代神経幹細胞においてＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９遺伝子はさみのスクリーニング結果を示す。
【0013】
【図4】マウスＦＶＢ／ＮＪのハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞において、ｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）またはＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用して、遺伝子操作または編集によるインデル（％）効率を確認する結果を示す。
【0014】
【図5】マウスＦＶＢ／ＮＪのハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞において、ｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用してインデルが生じた後、３継代の間にｍＲｏｓａ２６のリーディングフレームにおける改変が生存に対して選択的効果を有するかどうかを確認する結果を示す。
【0015】
【図6】マウスＦＶＢ／ＮＪのハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞において、ＳｐＣａｓ９遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用してインデルが生じた後、３継代の間にＳｕｐｔ４ａのリーディングフレームにおける変更が生存に対して選択的効果を有するかどうかを確認する結果を示す。
【0016】
【図7】マウスＦＶＢ／ＮＪのハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞において、ｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）またはＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用する遺伝子操作の結果として、抗変異体ＨＴＴ（ＥＭ４８）検出を通じてハンチントン遺伝子の発現量を確認する結果を示す。
【0017】
【図8】マウスＦＶＢ／ＮＪのハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞において、ｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）またはＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用する遺伝子操作の結果として、１Ｃ２（抗ＰｏｌｙＱ）検出を通じてポリグルタミンの発現量を確認する結果を示す。
【0018】
【図9】過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現によって生じる遺伝性疾患を緩和または治療に使用される遺伝子操作用組成物の要素であるガイド核酸およびＣｊＣａｓ９遺伝子を含むベクターの構造を示す。
【0019】
【図10】反復配列の種類、および、過剰増幅反復配列によって生じる遺伝性疾患の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
別の定めが無い限り、明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書において開示される内容に関連する当業者によって一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料が、本明細書において開示される内容の実施または試験において使用できるが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書において言及される、すべての刊行物、特許出願、特許、および、他の参考文献は参照によって、その実体が組み込まれる。加えて、材料、方法および例は、例示を目的としたものに過ぎず、限定を意図するものではない。
【0021】
以降、本出願によって開示される過剰増幅反復配列の発現の調節を詳細に説明する。
【0022】
本明細書によって開示される態様によれば、過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムが提供され得る。
【0023】
過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムは、過剰増幅反復配列の発現を低減するために人工的に操作された遺伝子を含む過剰増幅反復配列の発現を調節するためのシステムであり、人工的に操作された遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子およびＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子を含み、人工的に操作された遺伝子は、遺伝子のゲノム配列における人工的変異を含み、人工的に操作された遺伝子は、機能異常がある、または、発現が低減した遺伝子を含み、遺伝子の発現の低減は、人工的に操作されていない遺伝子と比較して、発現産物の発現量が低減する、または、抑制されることを特徴とする。
【0024】
本明細書において開示される実施形態は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現を調節するためのシステムに関する。
【0025】
「過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子」は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現を調節するための遺伝子であり得る。
【0026】
「過剰増幅反復配列」は、反復配列の重複および過剰重複を含む特定のヌクレオチド配列であり得る。過剰増幅反復配列は、反復配列の重複を含む第１反復部分、および、反復配列の過剰重複を含む第２反復部分を含み得る。
【0027】
「反復配列の重複」は、反復配列の反復度が通常の対象の遺伝子において見られる反復度であり得る。反復配列の重複は、病的対象の遺伝子においてさえ見られる反復度であり得る。
【0028】
「反復配列の過剰重複」は、反復配列の反復度が通常の対象の遺伝子において見られない反復度であり得る。反復配列の過剰重複は、病的対象の遺伝子において見られる反復度であり得る。
【0029】
第１反復部分は、病的対象および通常の対象に含まれる領域であり得る。例えば、ハンチントン病に関連するＨＴＴ遺伝子における第１反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の３５〜４０反復に対応する配列であり得る。別の例において、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）に関連するＡＴＸＮ１遺伝子における第１反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の３５〜４０反復に対応する配列であり得る。更に別の例において、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）に関連するＤＲＰＬＡ遺伝子における第１反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の４５〜５０反復に対応する配列であり得る。
【0030】
第２反復部分は、病的対象の遺伝子に含まれるが、通常の対象の遺伝子に含まれない領域であり得る。例えば、ハンチントン病に関連するＨＴＴ遺伝子における第２反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の３５〜４０反復後の対応する配列であり得る。別の例において、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）に関連するＡＴＸＮ１遺伝子における第２反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の３５〜４０反復後の対応する配列であり得る。更に別の例において、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）に関連するＤＲＰＬＡ遺伝子における第２反復部分は、ＣＡＧヌクレオチド反復単位の４５〜５０反復後の対応する配列であり得る。
【0031】
「過剰増幅反復配列の発現の調節」は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現の減少であり得る。
【0032】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現の調節は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子における過剰増幅反復配列の発現の減少であり得る。
【0033】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現の調節は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子における過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現の減少であり得る。第２反復部分の発現の減少は、第２反復部分の転写の減少を含み得る。
【0034】
「過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子」は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現調節に関連する機能に直接的に関与する、または、間接的に影響するすべての遺伝子を指す。
【0035】
本明細書において開示される過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、遺伝子発現プロセス全体のうち任意の１または複数の調節に直接的に関与する、または、間接的に影響するすべての遺伝子を含む。
【0036】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、例えば、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ遺伝子であり得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子から発現する産物は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質であり得る。
【0037】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ重合プロセスにおける転写調節因子として機能し得る。
【0038】
ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩであり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとして、クラスＩＩプロモーターの下の配列を転写するものであり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとして、クラスＩＩプロモーターの下の反復配列を有するヌクレオチド配列を転写するものであり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとして、クラスＩＩプロモーターの下の過剰増幅反復配列を有するヌクレオチド配列を転写するものであり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩとして、クラスＩＩプロモーターの下の過剰増幅反復配列を有するヌクレオチド配列の第１反復部分および／または第２反復部分を転写するものであり得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写産物は、ｍＲＮＡであり得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力に関与し得る。
【0039】
処理能力は、ポリメラーゼの重合プロセスの間に、産物が鋳型ＤＮＡ鎖から分離することなく合成される度合いに関連し得る。ポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼであり得る。ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩであり得る。
【0040】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの重合プロセスの間に、ＲＮＡ産物が鋳型ＤＮＡ鎖から分離することなく合成される度合いに関連し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力が高いことは、ＤＮＡ鋳型鎖の転写開始配列（＋１）からのＲＮＡの合成において、下流配列までの合成の度合いが高いことを意味し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力が高いことは、ＤＮＡ鋳型鎖の転写開始配列（＋１）からのＲＮＡの合成において、合成が転写開始配列から下流配列まで進行し、より長いＲＮＡ転写産物が合成される度合いが高いことを意味し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力が高いことは、ＤＮＡ鋳型鎖の転写開始配列（＋１）からのＲＮＡの合成において、ＲＮＡが転写開始配列から終結配列またはその周辺部分まで合成される度合いが高いことを意味し得る。
【0041】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの進行調節に関与し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力を維持または増加し得る。
【0042】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、転写調節因子の機能を提供し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、転写調節因子の機能を提供するべく、転写プロセスの開始、伸長、または、終結のうち任意の１または複数のプロセスに関与し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、転写伸長プロセスを調節する因子の機能を提供し得る。
【0043】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、転写伸長因子の機能を提供し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、転写伸長因子として作用するので、ＲＮＡポリメラーゼから、より高い効率でＲＮＡ産物を取得可能な機能を提供し得る。
【0044】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の調節に関与し得る。
【0045】
「過剰増幅反復配列」は、反復配列の重複および過剰重複を含む特定のヌクレオチド配列であり得る。
【0046】
過剰増幅反復配列は、反復配列の重複を含む第１反復部分、および、反復配列の過剰重複を含む第２反復部分を含み得る。第１反復部分は、病的対象および通常の対象に含まれる反復配列である。第２反復部分は、病的対象の遺伝子に含まれるが、通常の対象の遺伝子に含まれない反復配列である。
【0047】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現の調節は、第２反復部分の発現の調節であり得る。発現は、転写、転写後処理、翻訳および翻訳後修飾を含む、任意の１または複数であり得る。
【0048】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現において、第２反復部分の発現を調節し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質が関与する発現の調節は、転写の調節であり得る。
【0049】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現において、第２反復部分の発現を維持または増加し得る。発現は転写であり得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質が関与する発現の維持または増加は、転写の維持または増加であり得る。
【0050】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質による、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現における第２反復部分の発現の調節の結果として、第２反復部分の転写が生じ得る。第２反復部分の転写の結果として、第２反復部分によってコードされるポリペプチドが発現され得る。第２反復部分によってコードされるポリペプチドは、特定のアミノ酸配列の単純反復に対応し得る。特定のアミノ酸配列の単純反復数は、疾患に従って決定され得る。
【0051】
例えば、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質による、ＨＴＴ遺伝子の発現における第２反復部分の発現の調節の結果として、ＨＴＴ遺伝子の第２反復部分であるＣＡＧ‐ヌクレオチドの転写が生じ得る。ポリグルタミンは、第２反復部分の転写産物から発現し得る。
【0052】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の転写はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって生じ得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが過剰増幅される反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスに関与し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが過剰増幅される反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力を強化する機能を提供し得る。ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが過剰増幅される反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスにおいて、転写伸長因子の機能を提供し得る。
【0053】
「過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子」は、例えば、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、および／または、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、哺乳動物に由来するＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子であり得る。
【0054】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子は、ＳＵＰＴ４Ｈ１、ＳＰＴ４、ＳＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ４Ｈ、または、Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子と称され得る。ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、ＳＰＴ５、ＳＰＴ５Ｈ、または、Ｔａｔ‐ＣＴ１遺伝子と称され得る。
【0055】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子からの発現産物は、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質であり得る。
【0056】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子からの発現産物であるＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５またはＳＰＴ４／５タンパク質のものと同等または類似の機能を提供し得る。
【0057】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ重合プロセスにおいて、転写調節因子として機能し得る。
【0058】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力に関与し得る。
【0059】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力の調節に関与し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力を維持または増加し得る。
【0060】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、転写調節因子の機能を提供し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、転写調節因子の機能を提供するべく、転写プロセスの開始、伸長、または、終結のうち任意の１または複数のプロセスに関与し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、転写伸長プロセスを調節する因子の機能を提供し得る。
【0061】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、転写伸長因子の機能を提供し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、転写伸長因子として作用するので、ＲＮＡポリメラーゼから、より高い効率でｍＲＮＡ産物を取得可能な機能を提供し得る。
【0062】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現において、第２反復部分の発現を調節し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質が関与する発現の調節は、転写の調節であり得る。
【0063】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現において、第２反復部分の発現を維持または増加し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質が関与する発現の維持または増加は、転写の維持または増加であり得る。
【0064】
ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質による、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現における第２反復部分の発現の調節の結果として、第２反復部分の転写が生じ得る。第２反復部分の転写の結果として、第２反復部分によってコードされるポリペプチドが発現され得る。第２反復部分によってコードされるポリペプチドは、特定のアミノ酸配列の単純反復に対応し得る。特定のアミノ酸配列の単純反復数は、疾患に従って決定され得る。
【0065】
例えば、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質による、ＨＴＴ遺伝子の発現における第２反復部分の発現の調節の結果として、ＨＴＴ遺伝子の第２反復部分であるＣＡＧ‐ヌクレオチドの転写が生じ得る。ポリグルタミンは、第２反復部分の転写産物から発現し得る。
【0066】
過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の転写はＲＮＡポリメラーゼＩＩによって生じ得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスに関与し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが過剰増幅される反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスにおいて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力を強化する機能を提供し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５ＨまたはＳＵＰＴ４／５Ｈタンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが過剰増幅される反復配列を含む特定の遺伝子を転写するプロセスにおいて、転写伸長因子の機能を提供し得る。
【0067】
遺伝子は、ヒトおよびサルなどの霊長動物、ならびに、ラットおよびマウスなどの齧歯動物などを含む哺乳動物に由来し得る。
【0068】
遺伝子についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）などの公然知られたデータベースから取得され得る。
【0069】
「過剰増幅反復配列の発現の調節」は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現を調節した結果を含み得る。
【0070】
「過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現の調節」は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現の減少であり得る。
【0071】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現の調節は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の操作によって引き起こされ得る。
【0072】
遺伝子の操作は、標的遺伝子に対する１または複数のヌクレオチドの欠失、置換または挿入であり得る。
【0073】
遺伝子の操作は、標的遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳または翻訳後修飾に関与する１要素の変化であり得る。
【0074】
遺伝子の操作は、標的遺伝子における１または複数のヌクレオチドの人工的改変、および／または、発現産物の低減であり得る。発現産物は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質であり得る。
【0075】
発現産物は、人工的に操作されない遺伝子から発現される発現産物と比較して、発現量が減少または抑制される発現産物であり得る。
【0076】
遺伝子の操作は、標的遺伝子からの発現産物の減少を引き起こし得る。発現産物は、標的遺伝子から転写されるＲＮＡであり得る。発現産物は、標的遺伝子から翻訳されるポリペプチドであり得る。発現産物は、標的遺伝子から発現されるタンパク質であり得る。発現産物は、標的遺伝子から発現されるタンパク質のうち、活性を有するタンパク質であり得る。遺伝子の操作は、標的遺伝子のノックダウンまたはノックアウトであり得る。
【0077】
この場合、ノックダウンは、標的遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0078】
この場合、ノックアウトは、標的遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0079】
標的遺伝子のノックダウンは、標的遺伝子の発現を調節し得る。標的遺伝子のノックダウンは、標的遺伝子におけるＲＮＡ干渉を誘導し得る。標的遺伝子のノックダウンは、標的遺伝子のＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を減少させ得る。標的遺伝子のノックダウンは、標的遺伝子から発現されるタンパク質の量を減少させ得る。
【0080】
標的遺伝子のノックアウトは、標的遺伝子の発現を調節し得る。標的遺伝子のノックアウトは、標的遺伝子のＤＮＡを操作し得る。標的遺伝子のＤＮＡは、遺伝子はさみによって操作され得る。遺伝子はさみは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼであり得るが、これらに限定されない。標的遺伝子のノックアウトは、異常ＲＮＡが標的遺伝子のＤＮＡから転写されるように、標的遺伝子を操作し得る。標的遺伝子のノックアウトは、ＲＮＡが標的遺伝子のＤＮＡから転写されないように、標的遺伝子を操作し得る。標的遺伝子のノックアウトは、通常のポリペプチドが標的遺伝子のＤＮＡから翻訳されないように、標的遺伝子を操作し得る。標的遺伝子のノックアウトは、タンパク質が標的遺伝子のＤＮＡから発現されないように、標的遺伝子を操作し得る。標的遺伝子は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子であり得る。
【0081】
遺伝子の操作は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳、または、翻訳後修飾に関与する１要素の変化であり得る。
【0082】
遺伝子の操作は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子からの発現産物の減少を誘導し得る。発現産物は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子から転写されるＲＮＡであり得る。発現産物は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子から翻訳されるポリペプチドであり得る。発現産物は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子から発現されるタンパク質のうち、活性を有するタンパク質であり得る。
【0083】
遺伝子の操作は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトまたはノックダウンであり得る。
【0084】
この場合、ノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0085】
この場合、ノックアウトは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0086】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現を調節し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子におけるＲＮＡ干渉を誘導し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を減少させ得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子から発現されるタンパク質の量を減少させ得る。
【0087】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現を調節し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡを操作し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡは、遺伝子はさみによって操作され得る。遺伝子はさみは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、または、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、異常ＲＮＡが過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡから転写されるように、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を操作し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、ＲＮＡが過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡから転写されないように、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を操作し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、通常のポリペプチドが過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡから翻訳されないように、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を操作し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトは、タンパク質が過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のＤＮＡから発現されないように、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を操作し得る。
【0088】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子であり得る。
【0089】
遺伝子の操作は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳または翻訳後修飾に関与する１要素の変化であり得る。
【0090】
遺伝子の操作は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子からの発現産物の減少を誘導し得る。発現産物は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子から転写されるＲＮＡであり得る。発現産物は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子から翻訳されるポリペプチドであり得る。発現産物は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子から発現されるタンパク質のうち、活性を有するタンパク質であり得る。遺伝子の操作は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトまたはノックダウンであり得る。
【0091】
この場合、ノックダウンは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0092】
この場合、ノックアウトは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0093】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の発現を調節し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子におけるＲＮＡ干渉を誘導し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を減少させ得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子から発現されるタンパク質の量を減少させ得る。
【0094】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子お発現を調節し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡを操作し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡは、遺伝子はさみによって操作され得る。遺伝子はさみは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、異常ＲＮＡがＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡから転写されるように、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子を操作し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、ＲＮＡがＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡから転写されないように、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ遺伝子を操作し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、通常のポリペプチドがＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡから発現されないように、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子を操作し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトは、タンパク質がＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のＤＮＡから発現されないように、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子を操作し得る。
【0095】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得る。
【0096】
遺伝子の操作は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の転写、転写後修飾、翻訳または翻訳後修飾に関与する１要素の変化であり得る。
【0097】
遺伝子の操作は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子からの発現産物の減少を誘導し得る。発現産物は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から転写されるＲＮＡであり得る。発現産物は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から翻訳されるポリペプチドであり得る。発現産物は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から発現されるタンパク質のうち、活性を有するタンパク質であり得る。遺伝子の操作は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンまたはノックアウトであり得る。
【0098】
この場合、ノックダウンは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0099】
この場合、ノックアウトは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の人工的操作または改変による効果であり得る。
【0100】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の発現を調節し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子におけるＲＮＡ干渉を誘導し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの量を減少させ得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から発現されるタンパク質の量を減少させ得る。
【0101】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の発現を調節し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡを操作し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡは、遺伝子はさみによって操作され得る。遺伝子はさみは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、通常のＲＮＡがＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡから転写されないように、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を操作し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、ＲＮＡがＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡから転写されないように、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を操作し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、通常のポリペプチドがＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡから翻訳されないように、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を操作し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトは、タンパク質がＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のＤＮＡから発現しないように、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を操作し得る。ノックアウトは、標的遺伝子に含まれる一部のヌクレオチドの欠失であり得る。
【0102】
ノックアウトは、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子に含まれる一部のヌクレオチドの欠失であり得る。ノックアウトは、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子に含まれる一部のヌクレオチドの欠失であり得る。ノックアウトは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子に含まれる一部のヌクレオチドの欠失であり得る。削除されるヌクレオチドは、２ｂｐ以上のヌクレオチドを含むヌクレオチド断片であり得る。
【0103】
削除されるヌクレオチド断片のサイズは、２ｂｐ〜５ｂｐ、６ｂｐ〜１０ｂｐ、１１ｂｐ〜１５ｂｐ、１６ｂｐ〜２０ｂｐ、２１ｂｐ〜２５ｂｐ、２６ｂｐ〜３０ｂｐ、３１ｂｐ〜３５ｂｐ、３６ｂｐ〜４０ｂｐ、４１ｂｐ〜４５ｂｐまたは４６ｂｐ〜５０ｂｐであり得る。
【0104】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現が調節され得る。
【0105】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の調節の結果として、過剰増幅反復配列の発現は調節され得る。
【0106】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現の調節の結果として、過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現は調節され得る。
【0107】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の発現の調節の結果として、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ重合プロセスは調節され得る。ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩであり得る。
【0108】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は調節され得る。
【0109】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は低減され得る。
【0110】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は低減され得る。
【0111】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにおける転写伸長因子に作用するタンパク質の発現が調節され得る。
【0112】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子として作用するタンパク質の発現は低減され得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写産物は、転写伸長因子の発現の減少に起因して減少し得る。転写産物は過剰増幅反復配列であり得る。転写産物は過剰増幅反復配列における第２反復部分であり得る。
【0113】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子として作用するタンパク質の発現が低減し得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写産物は、転写伸長因子の発現の減少に起因して減少し得る。転写産物は過剰増幅反復配列であり得る。転写産物は過剰増幅反復配列における第２反復部分であり得る。
【0114】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が調節され得る。
【0115】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の第２反復部分の発現が調節され得る。具体的には、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の第２反復部分からのｍＲＮＡ転写が調節され得る。過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の第２反復部分からのポリペプチドの発現が調節され得る。例として、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ｍＲＮＡ転写が、ハンチントン病に関連するＨＴＴ遺伝子の第１反復部分から通常に実行されるが、第２反復部分からのｍＲＮＡ転写が減少し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ポリペプチドが第１反復部分から通常に発現されるが、第２反復部分からのポリペプチドの発現が低減し得る。
【0116】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、遺伝子操作前の長さより短い長さを有し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子から発現されるポリペプチドは、遺伝子操作前の長さより短い長さで発現し得る。例えば、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＨＴＴ遺伝子から転写されるｍＲＮＡは、遺伝子操作前の長さより短い長さを有し得る。過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＨＴＴ遺伝子から発現されるポリペプチドは、前の長さより短い長さで発現し得る。
【0117】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減し得る。
【0118】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の第２反復部分の発現が低減し得る。
【0119】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減し得る。
【0120】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の第２反復部分の発現が低減し得る。
【0121】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が調節されるので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0122】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0123】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0124】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子であり得る。
【0125】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の発現は調節され得る。
【0126】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の発現の調節の結果として、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ重合プロセスは調節され得る。ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩであり得る。
【0127】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は調節され得る。
【0128】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩお処理能力は低減し得る。
【0129】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩお処理能力は低減し得る。
【0130】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子として作用するタンパク質の発現は調節され得る。
【0131】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子に作用するタンパク質の発現は低減し得る。
【0132】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子に作用するタンパク質の発現は低減し得る。
【0133】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現は調節され得る。
【0134】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現は低減し得る。
【0135】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む反復配列の発現は低減し得る。
【0136】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は調節され得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は調節され得る。
【0137】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は減少し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は低減し得る。
【0138】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は減少し得る。ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は低減し得る。
【0139】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が調節されるので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0140】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0141】
ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患が治療または緩和され得る。
【0142】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得る。
【0143】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の発現は調節され得る。
【0144】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の発現の調節の結果として、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ重合プロセスは調節され得る。ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡポリメラーゼＩＩであり得る。
【0145】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は調節され得る。
【0146】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は低減し得る。
【0147】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの処理能力は低減し得る。
【0148】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子として作用するタンパク質の発現は調節され得る。
【0149】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子に作用するタンパク質の発現は低減し得る。
【0150】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトの結果として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの転写伸長因子に作用するタンパク質の発現は低減し得る。
【0151】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現は調節され得る。
【0152】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現は低減し得る。
【0153】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む反復配列の発現は低減し得る。
【0154】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は調節され得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は調節され得る。
【0155】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は減少し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は低減し得る。
【0156】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのｍＲＮＡの転写は減少し得る。ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列に含まれる第２反復部分からのポリペプチドの発現は低減し得る。
【0157】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の遺伝子操作の結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が調節されるので、反復伸長疾患は治療または緩和され得る。
【0158】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックダウンの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患は治療または緩和され得る。
【0159】
ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のノックアウトの結果として、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が低減するので、反復伸長疾患は治療または緩和され得る。
【0160】
「過剰増幅反復配列」は、特定のヌクレオチド配列単位が高度に反復するヌクレオチド配列である。反復配列は、２〜１２ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。反復配列は、３、４、５、６または１２ヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これらに限定されない。
【0161】
過剰増幅反復配列は、特定のヌクレオチド配列または特定の遺伝子において反復配列が高度に反復する配列であり得る。
【0162】
過剰増幅反復配列は、遺伝子のコード領域または非コード領域に存在し得る。コード領域はエクソンを含み得る。エクソンに存在する過剰増幅反復配列は、遺伝子転写産物の翻訳リーディングフレームに存在し得る。エクソンに存在する過剰増幅反復配列は、反復コドンを提供するように機能し得る。反復コドンは、ポリグルタミン（ＰｏｌｙＱ）をコードし得る。ポリグルタミンは、ＣＡＧヌクレオチド配列単位の過剰反復によって生じ得る。反復コドンは非ポリグルタミンであり得る。非コード領域は、プロモーター、３'‐ＵＴＲ、イントロンまたは５'‐ＵＴＲ領域であり得るが、これらに限定されない。過剰増幅反復配列は、ヌクレオチド組成物に関して変動し得る。
【0163】
過剰増幅反復配列は、３ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。３ヌクレオチド配列単位の反復は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐、または、ＧＣＴ‐ヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これらに限定されない。
【0164】
過剰増幅反復配列は４ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。４ヌクレオチド配列単位の反復は、ＣＣＴＧヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これに限定されない。
【0165】
過剰増幅反復配列は５ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。５ヌクレオチド配列単位の反復は、ＡＴＴＣＴまたはＴＧＧＡＡヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これに限定されない。
【0166】
過剰増幅反復配列は、６ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。６ヌクレオチド配列単位の反復は、ＧＧＣＣＴＧまたはＧＧＧＧＣＣヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これに限定されない。
【0167】
過剰増幅反復配列は、１２ヌクレオチド配列単位の反復であり得る。１２ヌクレオチド配列単位の反復は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧヌクレオチド配列単位の反復であり得るが、これに限定されない。
【0168】
遺伝子は、ヒトおよびサルなどの霊長動物、ならびに、ラットおよびマウスなどの齧歯動物などを含む哺乳動物に由来し得る。
【0169】
過剰増幅反復配列は、ＤＮＡ複製ずれによって生成され得る。複製ずれは、複製ずれ事象によって生成され得る。複製ずれのいくつかの反復は、直列配置を含む反復配列においてループを形成することによって、反復配列の重複および過剰重複を生成し得る。
【0170】
過剰増幅反復配列は、体細胞複製プロセスの間に保存され得る。過剰増幅反復配列の数は、体細胞複製プロセスの間に保存され得る、または、増幅され得る。過剰増幅反復配列は、生殖細胞形成プロセスの間に保存され得る。過剰増幅反復配列の数は、生殖細胞形成プロセスの間に保存または増幅され得る。
【0171】
過剰増幅反復配列は継承され得る。過剰増幅反復配列は各世代を通して継承されるが、反復配列の数は保存または増幅され得る。
【0172】
上述の過剰増幅反復配列を含む遺伝子についての情報は、ＧｅｎＢａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）など、公然知られたデータベースから取得され得る。
【0173】
反復配列の過剰重複によって生じる疾患に罹患していない通常の対象でも、反復配列の反復を有し得る。通常の対象では、反復配列の重複は安全なレベルで存在する。安全なレベルは、特定の疾患に応じて変動し得る。例えば、疾患がハンチントン病であるとき、ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧ‐反復配列の重複が約３５〜４０である場合は、安全なレベルとみなされ得る。例えば、ハンチントン病において、ＨＴＴ遺伝子におけるＣＡＧ‐反復配列の重複が約３５および４０以上であるとき、それが疾患を発症させる可能性があるので、これは、非安全なレベルとみなされ得る。反復配列の重複および／または過剰重複の数は、２０％以内の範囲の誤差を含む。
【0174】
過剰増幅反復配列は、遺伝子の異常発現を引き起こす、または、タンパク質の機能に影響するので、障害を発症させ得る。過剰増幅反復配列によって生じる障害は、限定されないが、神経障害の原因として作用し得る。
【0175】
一般に、過剰増幅反復配列の数が大きいほど、疾患が生じる可能性が高くなり得る、または、疾患の重症度が増加し得る。過剰増幅反復配列は継承され、反復配列の数は保存または増幅され得るが、過剰増幅反復配列は各世代を通して継承される。反復配列の数が保存または増幅されるとき、系統において遺伝性疾患は保存または悪化し得る。
【0176】
特定の過剰増幅反復配列によって生じる遺伝性疾患の一覧を下に提供する（テーブル１）。［テーブル１］
過剰増幅反復配列によって生じる遺伝性疾患の一覧
【表1】
【0177】
過剰増幅反復配列によって生じる遺伝性疾患の具体例には、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン病様２、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＡＲＸ変異によって生じるＸ連鎖性精神遅滞（ＸＬＭＲ）フックス角膜ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症２型、手足性器症候群（ＨＦＧＳ）、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞などが含まれ得るが、これに限定されない。
【0178】
過剰増幅反復配列によって引き起こされる遺伝性疾患の具体例は、３ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患であり得る。３ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、特定の遺伝子に関連する３ヌクレオチド配列単位の数が不安定かつ反復的に増加して生じ得る。
【0179】
３ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、ポリグルタミン病、または、非ポリグルタミン病であり得る。
【0180】
ポリグルタミン病は、ＣＡＧヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じ得る。ポリグルタミン病は、エクソンにおけるＣＡＧヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じ得る。その例は、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン病様２（ＨＤＬ２）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）、および、脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）であり得るが、これらに限定されない。
【0181】
非ポリグルタミン病は、コード領域における余分なＣＡＧヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じ得る。更に、非ポリグルタミン病は、非コード領域におけるヌクレオチド配列の過剰増幅によって生じ得る。非ポリグルタミン病は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ、ＦＲＡＸＡ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡ）、脆弱ＸＥ精神遅滞（ＦＲＡＸＥ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、フックス角膜ジストロフィー、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症２型、手足性器症候群（ＨＦＧＳ）、全前脳胞症（ＨＰＥ５）、眼瞼裂狭小症候群（ＢＰＥＳ）、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞（ＭＲＧＨ）、ＡＲＸ変異によって生じるＸ連鎖性精神遅滞（ＸＬＭＲ）であり得るが、これらに限定されない。
【0182】
反復配列の過剰増幅によって生じる遺伝性疾患の具体例は、４ヌクレオチド配列の過剰増幅によって生じる疾患であり得る。４ヌクレオチド配列の過剰増幅によって生じる疾患は、特定の遺伝子に関連する４ヌクレオチド配列単位の数が不安定かつ反復的に増加して生じ得る。４ヌクレオチド配列の過剰増幅によって生じる疾患は、ＣＣＴＣヌクレオチド配列の過剰増幅によって生じる筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）であり得るが、これに限定されない。
【0183】
反復配列の過剰増幅によって生じる遺伝性疾患の具体例は、５ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患であり得る。５ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、特定の遺伝子に関連する５ヌクレオチド配列単位の数が不安定かつ反復的に増加して生じ得る。５ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）であり得る。５ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、ＴＧＧＡＡヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる脊髄小脳失調症３１型（ＳＣＡ３１）であり得るが、これに限定されない。
【0184】
過剰増幅反復配列による遺伝性疾患の具体例は、６ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患であり得る。６ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、特定の遺伝子に関連する６ヌクレオチド配列単位の数が不安定かつ反復的に増加して生じ得る。６ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、ＧＧＣＣＴＧヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）であり得る。６ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、ＧＧＧＧＣＣヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）であり得るが、これに限定されない。
【0185】
過剰増幅反復配列による遺伝性疾患の具体例は、１２ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患であり得る。１２ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、特定の遺伝子に関連する１２ヌクレオチド配列単位の数が不安定かつ反復的に増加して生じ得る。１２ヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる疾患は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧヌクレオチド配列単位の過剰増幅によって生じる進行性ミオクローヌスてんかん（ＰＭＥ）であり得るが、これに限定されない。
【0186】
本明細書によって開示される更に別の態様によれば、過剰増幅反復配列の発現を低減させるための遺伝子操作用組成物、および、その調製方法が提供され得る。
【0187】
本明細書によって開示される内容の実施形態は、過剰増幅反復配列の発現を低減させるための遺伝子操作用組成物に関する。
【0188】
遺伝子操作用組成物は標的特異的遺伝子はさみであり得る。標的特異的遺伝子はさみは、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、エンドヌクレアーゼ、または、それらの混在であり得て、好ましくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり得るが、これに限定されない。
【0189】
遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子およびＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子であり得るが、これに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。
【0190】
本明細書によって開示される内容の別の実施形態は、過剰増幅反復配列の発現を低減させるための別の遺伝子操作用組成物に関する。
【0191】
他の遺伝子操作用組成物は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子およびＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列のガイド核酸を含む遺伝子操作用組成物であり得て、標的配列は、ガイド核酸と相補的に結合する、または、標的配列は、ガイド核酸と相補的に結合する配列と相補的である。
【0192】
「ガイド核酸」という用語は、標的核酸、遺伝子または染色体を認識することが可能であり、エディタータンパク質と相互作用することが可能な核酸を指す。ここで、ガイド核酸は、標的核酸、遺伝子、または、染色体の部分的ヌクレオチド配列と相補結合を形成可能である。加えて、ガイド核酸の部分的核酸配列は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸と相互作用し得て、それにより、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成する。
【0193】
ガイド核酸は、ガイド核酸エディタータンパク質が標的核酸、遺伝子または染色体の標的領域に配置されるように誘導する機能を実行し得る。
【0194】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡ混合物の形態で存在し得て、５〜１５０の核酸配列を有し得る。ガイド核酸は１つの連続する核酸配列であり得る。
【0195】
例えば、１つの連続核酸配列は、（Ｎ）ｍであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧであり、ｍは１〜１５０の整数である。ガイド核酸は２つ以上の連続する核酸配列であり得る。
【0196】
例えば、２つ以上の連続核酸配列は、（Ｎ）ｍおよび（Ｎ）ｏであり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ、または、Ａ、Ｕ、ＣまたはＧを表し、ｍおよびｏは、１〜１５０の整数であり、互いに同一であり得る、または、異なり得る。ガイド核酸は、１または複数のドメインを含み得る。
【0197】
ドメインは、これらに限定されないが、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインまたは尾部ドメインであり得る。
【0198】
ここで、１つのガイド核酸は、２以上の機能ドメインを含み得る。ここで、２以上の機能ドメインは、互いに異なり得る。または、１つのガイド核酸に含まれる２以上の機能ドメインは、互いに同一であり得る。例えば、１つのガイド核酸は、２つ以上の近位ドメインを有し得る。別の例では、１つのガイド核酸は２つ以上の尾部ドメインを有し得る。しかしながら、１つのガイド核酸に含まれる機能ドメインが同一ドメインであることは、２つの機能ドメインの配列が同一であることを意味するものではない。配列が異なる場合でも、２つの機能ドメインは、同一機能を実行するとき、同一ドメインである。以降、機能ドメインを詳細に説明する。
【0199】
「ガイドドメイン」という用語は、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な相補的ガイド配列を有するドメインであり、標的遺伝子または標的核酸と特異的に相互作用するように機能する。例えば、ガイドドメインは、標的遺伝子または標的核酸の特定のヌクレオチド配列を有する領域にガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を誘導する機能を実行し得る。ガイドドメインは、１０〜３５塩基の配列であり得る。
【0200】
例において、ガイドドメインは、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５塩基の配列であり得る。
【0201】
別の例において、ガイドドメインは、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５塩基の配列であり得る。
【0202】
ガイドドメインはガイド配列を有し得て、「ガイド配列」は、標的遺伝子または二本鎖核酸のうち一本鎖の部分的配列と相補結合を形成可能なヌクレオチド配列であり、ガイド配列は、少なくとも５０％以上、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の相補性または完全相補性を有するヌクレオチド配列であり得る。ガイド配列は１０〜２５塩基の配列であり得る。例において、ガイドドメインは、１０〜２５、１５〜２５、または２０〜２５塩基の配列であり得る。別の例において、ガイドドメインは、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜２５塩基の配列であり得る。加えて、ガイドドメインは追加の塩基配列を含み得る。
【0203】
追加の塩基配列は、ガイドドメインの機能を改善または低減するために利用され得る。
【0204】
追加の塩基配列は、ガイド配列の機能を改善または低減するために利用され得る。追加の塩基配列は１〜１０塩基配列であり得る。
【0205】
一例において、追加の塩基配列は、２〜１０、４〜１０、６〜１０、または８〜１０塩基配列であり得る。
【0206】
別の例において、追加の塩基配列は、１〜３、３〜６、または７〜１０塩基配列であり得る。
【0207】
別の例において、追加の塩基配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基配列であり得る。
【0208】
例において、追加の塩基配列は、１塩基配列グアニン（Ｇ）、または、２塩基配列ＧＧであり得る。追加の塩基配列はガイド配列の５'末端に位置し得る。追加の塩基配列はガイド配列の３'末端に位置し得る。
【0209】
「第１相補ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列であり、十分な相補性を有するので、第２相補ドメインと二本鎖を形成する。例えば、第１相補ドメインは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する第２相補ドメインに相補的な核酸配列であり得る。
【0210】
第１相補ドメインは、第２相補ドメインとの相補結合を形成して二本鎖を形成することが可能である。ここで、二本鎖は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸と相互作用し得て、それにより、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成する。第１相補ドメインは５〜３５塩基配列であり得る。
【0211】
一例において、第１相補ドメインは、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0212】
別の例において、第１相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0213】
「リンカードメイン」という用語は、２つ以上の同一または異なるドメインである２以上のドメインを接続する核酸配列である。リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって２以上のドメインに接続され得るか、または、共有結合または非共有結合によって２以上のドメインを接続し得る。リンカードメインは１〜３０塩基配列であり得る。
【0214】
一例において、リンカードメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５または２５〜３０塩基配列であり得る。
【0215】
別の例において、リンカードメインは、１〜３０、５〜３０、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０または２５〜３０塩基配列であり得る。
【0216】
「第２相補ドメイン」という用語は、第１相補ドメインに相補的な核酸配列を含む核酸配列のことであり、十分な相補性を有するので、第１相補ドメインと二本鎖を形成する。例えば、第２相補ドメインは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する第１相補ドメインに相補的な核酸配列であり得る。
【0217】
第２相補ドメインは、第１相補ドメインと相補結合を形成して二本鎖を形成することが可能である。ここで、二本鎖は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸と相互作用し得て、それにより、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を形成する。
【0218】
第２相補ドメインは第１相補ドメインと相補的な塩基配列、および、第１相補ドメインと相補性を有しない塩基配列、例えば、第１相補ドメインと二本鎖を形成しない塩基配列を有し得るので、第１相補ドメインより長い塩基配列を有し得る。第２相補ドメインは５〜３５塩基配列を有し得る。
【0219】
一例において、第２相補ドメインは、１〜３５、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0220】
別の例において、第２相補ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0221】
「近位ドメイン」という用語は、第２相補ドメインに隣接して配置される核酸配列である。
【0222】
近位ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して二本鎖に形成され得る。近位ドメインは、１〜２０塩基配列であり得る。一例として、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０塩基配列であり得る。
【0223】
別の例において、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０塩基配列であり得る。
【0224】
「尾部ドメイン」という用語は、ガイド核酸の両方の末端のうち１または複数の末端に位置する核酸配列である。
【0225】
尾部ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して、二本鎖に形成され得る。尾部ドメインは、１〜５０塩基配列であり得る。
【0226】
一例において、尾部ドメインは、５〜５０、１０〜５０、１５〜５０、２０〜５０、２５〜５０、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【0227】
別の例において、尾部ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、または、４５〜５０塩基配列であり得る。
【0228】
一方、ドメイン、すなわち、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインに含まれる核酸配列の一部または全部は、選択的に、または、追加的に、化学修飾を含み得る。
【0229】
化学修飾は、これらに限定されないが、メチル化、アセチル化、リン酸化、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）、または、２'−Ｏ−メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）であり得る。ガイド核酸は１または複数のドメインを含む。ガイド核酸はガイドドメインを含み得る。ガイド核酸は第１相補ドメインを含み得る。ガイド核酸はリンカードメインを含み得る。ガイド核酸は第２相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は近位ドメインを含み得る。ガイド核酸は尾部ドメインを含み得る。ここでは、１、２、３、４、５または６以上のドメインがあり得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上のガイドドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の第１相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上のリンカードメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の第２相補ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の近位ドメインを含み得る。ガイド核酸は、１、２、３、４、５または６以上の尾部ドメインを含み得る。ここで、ガイド核酸において、１つの種類のドメインが重複し得る。ガイド核酸は、重複がある、または、重複が無い、いくつかのドメインを含み得る。
【0230】
ガイド核酸は、同一の種類のドメインを含み得る。ここで、同一の種類のドメインは、同一の核酸配列または異なる核酸配列を有し得る。
【0231】
ガイド核酸は２種類のドメインを含み得る。ここで、２つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【0232】
ガイド核酸は、３種類のドメインを含み得る。ここで、３つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【0233】
ガイド核酸は、４種類のドメインを含み得る。ここで、４つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【0234】
ガイド核酸は、５種類のドメインを含み得る。ここで、５つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【0235】
ガイド核酸は、６種類のドメインを含み得る。ここで、６つの異なる種類のドメインは、異なる核酸配列または同一の核酸配列を有し得る。
【0236】
例えば、ガイド核酸は、［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−［リンカードメイン］−［第２相補ドメイン］から成り得る。ここで、２つのガイドドメインは、異なる、または、同一の標的に対するガイド配列を含み得て、２つの第１相補ドメインおよび２つの第２相補ドメインは、同一または異なる核酸配列を有し得る。ガイドドメインが、異なる標的に対するガイド配列を含むとき、ガイド核酸は、２つの異なる標的に特異的に結合し得て、ここでは、特異的結合は、同時または順番に実行され得る。加えて、リンカードメインは、特異的酵素によって切断され得て、ガイド核酸は、特異的酵素の存在下で、２または３つの部分に分割され得る。本明細書の具体例として、ガイド核酸はｇＲＮＡであり得る。
【0237】
「ｇＲＮＡ」という用語は、標的遺伝子または標的核酸に関して、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を特異的に標的化可能な核酸を指す。加えて、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合してＣＲＩＳＰＲ酵素を標的遺伝子または標的核酸へ誘導し得る核酸特異的ＲＮＡである。
【0238】
ｇＲＮＡは、複数のドメインを含み得る。各ドメインに起因して、ｇＲＮＡ鎖の３次元構造もしくは活性形態において、または、これらの鎖の間で、相互作用が生じ得る。
【0239】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。
【0240】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'から３'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、リンカードメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインと、近位ドメインと、任意で、尾部ドメインとを含み得る。
【0241】
別の実施形態において、二本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメイン、および、第１相補ドメインを含む第１鎖と、５'から３'の方向に、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメイン、近位ドメイン、任意で、尾部ドメインを含む第２鎖とを含み得る。
【0242】
ここで、第１鎖はｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖はｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。ｃｒＲＮＡは、ガイドドメインおよび第１相補ドメインを含み得て、ｔｒａｃｒＲＮＡは、第２相補ドメイン、近位ドメイン、任意で尾部ドメインを含み得る。
【0243】
更に別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、３'から５'の方向に、ガイドドメイン、すなわち、標的遺伝子または標的核酸との相補結合を形成可能なガイド配列を含むドメインと、第１相補ドメインと、第２相補ドメイン、すなわち、第１相補ドメイン配列に相補的な配列を有し、それにより、第１相補ドメインと共に二本鎖核酸を形成するドメインとを含み得る。
【0244】
ここで、第１相補ドメインは、天然第１相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第１相補ドメインに由来し得る。加えて、第１相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第１相補ドメインの塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインに由来し得るか、または、天然に存在する種に含まれる第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【0245】
例示的な一実施形態において、第１相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの第１相補ドメインとの、または、それらに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【0246】
例えば、第１相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、もしくは、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（Ｘ）ｎ−３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、５〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在であり得る。
【0247】
別の実施形態において、第１相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上、または、完全相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ（Ｘ）ｎ−３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、５〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0248】
別の実施形態において、第１相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラ属（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビサイダ（Ｕ１１２）、カンディダツス・メタノプラズマ・テルミタム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【0249】
例えば、第１相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインであるとき、第１相補ドメインは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、第１相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎを含み得て、５'−（Ｘ）ｎ ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ−３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、１〜５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0250】
ここで、リンカードメインは、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインを連結するように機能するヌクレオチド配列であり得る。
【0251】
リンカードメインは、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインとの共有結合または非共有結合をそれぞれ形成可能である。
【0252】
リンカードメインは、共有結合または非共有結合によって第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し得る。
【0253】
リンカードメインは、一本鎖ｇＲＮＡ分子において使用されるのに好適であり、共有結合または非共有結合により、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖および第２鎖と接続されることによって、または、第１鎖を第２鎖と接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するのに使用され得る。
【0254】
リンカードメインは、二本鎖ｇＲＮＡのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと接続されることによって、または、共有結合または非共有結合でｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡに接続することによって、一本鎖ｇＲＮＡを生成するために使用され得る。
【0255】
加えて、第２相補ドメインは、天然第２相補ドメインとの相同性を有し得る、または、天然第２相補ドメインに由来し得る。加えて、第２相補ドメインは、天然に存在する種に応じて、第２相補ドメインの塩基配列において差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【0256】
例示的な実施形態において、第２相補ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有する第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインを有し得る。
【0257】
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的な、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、ｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0258】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１５の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、ｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0259】
別の実施形態において、第２相補ドメインは、パルクバクテリア・バクテリウム（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、ラクノスピラバクテリウム（ＭＣ２０１７）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチクス、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、アシダミノコッカス属（ＢＶ３Ｌ６）、ポルフィロモナス・マカカエ、ラクノスピラバクテリウム（ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニ、プレボテラ・ディシエンス、モラクセラ・ボーボクリ（２３７）、スミセラ属（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、レプトスピラ・イナダイ、ラクノスピラバクテリウム（ＭＡ２０２０）、フランシセラ・ノビサイダ（Ｕ１１２）、カンディダツス・メタノプラズマ・テルミタム、または、ユウバクテリウム・エリゲンスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【0260】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、それに由来する第２相補ドメインであるとき、第２相補ドメインは、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る（第１相補ドメインと共に二本鎖を形成する塩基配列を下線で示す）。ここで、第２相補ドメインは更に、（Ｘ）ｎおよび／または（Ｘ）ｍを含み得て、５'‐（Ｘ）ｎ ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ（Ｘ）ｍ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎおよびｍの各々は、塩基の数を表し得て、ｎは１〜１０の整数であり得て、ｍは１〜６の整数であり得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。加えて、（Ｘ）ｍは、同一の塩基のｍ回反復、または、ｍ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0261】
ここで、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは相補結合を形成し得て、第１相補ドメインおよび第２相補ドメインは、相補結合によって二本鎖を形成し得る。二本鎖はＣＲＩＳＰＲ酵素と相互作用し得る。
【0262】
選択的に、第１相補ドメインは、第２相補ドメインと相補結合を形成しない追加ヌクレオチド配列を含み得る。
【0263】
ここで、追加ヌクレオチド配列は１〜１５塩基配列であり得る。例えば、追加ヌクレオチド配列は１〜５、５〜１０、または１０〜１５塩基配列であり得る。
【0264】
ここで、近位ドメインは、第２相補ドメインの３'末端方向に位置するドメインであり得る。
【0265】
加えて、近位ドメインは、天然近位ドメインとの相同性を有し得る、または、天然近位ドメインに由来し得る。加えて、近位ドメインは、天然に存在する種に応じて塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる近位ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【0266】
例示的な実施形態において、近位ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの近位ドメイン、または、それらに由来する近位ドメインとの部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【0267】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'との部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0268】
更なる別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインであるとき、近位ドメインは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、近位ドメインは更に（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、１〜４０の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0269】
ここで、尾部ドメインは、一本鎖ｇＲＮＡ、または、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖もしくは第２鎖の３'末端に選択的に追加されることが可能なドメインである。
【0270】
加えて、尾部ドメインは、天然尾部ドメインと相同性を有し得る、または、天然尾部ドメインに由来し得る。加えて、尾部ドメインは、天然に存在する種に応じて塩基配列に差異を有し得て、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインに由来し得て、または、天然に存在する種に含まれる尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る。
【0271】
例示的な一実施形態において、尾部ドメインは、ストレプトコッカス・ピオゲネス、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・サーモフィラス、ストレプトコッカス・アウレウスまたはナイセリア・メニンジティディスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインと、部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性、または、完全相同性を有し得る。
【0272】
例えば、尾部ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、Ａ、Ｔ、ＵおよびＧなどｎ個の塩基の混在を表し得る。
【0273】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインであるとき、尾部ドメインは、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'であり得る、または、５'−ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ−３'と部分的、すなわち、少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。ここで、尾部ドメインは更に（Ｘ）ｎを含み得て、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ（Ｘ）ｎ‐３'となる。Ｘは、塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧから成る群から選択され得て、ｎは、１〜１５の整数である塩基の数を表し得る。ここで、（Ｘ）ｎは、同一の塩基のｎ回反復、または、ｎ個の塩基Ａ、Ｔ、ＵおよびＧの混在を表し得る。
【0274】
別の実施形態において、尾部ドメインは、３'末端において、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する１〜１０塩基配列を含み得る。
【0275】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【0276】
ｇＲＮＡは、上記の複数のドメインを含み得て、このため、核酸配列の長さは、ｇＲＮＡに含まれるドメインに従って調節され得て、各ドメインに起因して、ｇＲＮＡの３次元構造または活性形態の鎖において、または、これらの鎖の間で相互作用が生じ得る。
【0277】
ｇＲＮＡは、一本鎖ｇＲＮＡ（単一ＲＮＡ分子）、または、二本鎖ｇＲＮＡ（１つより多くの、一般には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）と称され得る。二本鎖ｇＲＮＡは、第１鎖および第２鎖から成る。
【0278】
ここで、第１鎖は、５'−［ガイドドメイン］−［第１相補ドメイン］−３'から成り得て、第２鎖は、５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−３'、または、５'−［第２相補ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン］−３'から成り得る。
【0279】
ここで、第１鎖は、ｃｒＲＮＡと称され得て、第２鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡと称され得る。
【0280】
ここで、第１鎖および第２鎖は、選択的に、追加ヌクレオチド配列を含み得る。
【0281】
一例において、第１鎖は、５'‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｑ）ｍ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ａ‐（Ｎｔａｒｇｅｔ）‐（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ‐（Ｘ）ｃ‐３'であり得る。
【0282】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列に応じて変更され得る塩基配列領域である。
【0283】
ここで、（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて変更され得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【0284】
例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはストレプトコッカス・ピオゲネス由来第１相補ドメインの第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0285】
別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニまたはカンピロバクター・ジェジュニ由来第１相補ドメインの第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0286】
更に別の例において、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスまたはストレプトコッカス・サーモフィラス由来第１相補ドメインの第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0287】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃの各々は選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂおよびｃの各々は、塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【0288】
例示的な一実施形態において、第２鎖は、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐３'であり得る。
【0289】
別の実施形態において、第２鎖は、５'‐（Ｚ）ｈ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｆ）ｉ‐３'、または、５'‐（Ｘ）ｄ‐（Ｚ）ｈ‐（Ｘ）ｅ‐（Ｐ）ｋ‐（Ｘ）ｆ‐（Ｆ）ｉ‐３'であり得る。
【0290】
ここで、（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５〜５０の整数である。
【0291】
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0292】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0293】
更に別の例において、第２相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0294】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【0295】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0296】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0297】
更に別の例において、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0298】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は由来の種に応じて改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１〜５０の整数である。
【0299】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0300】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0301】
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0302】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端における１〜１０塩基の配列を含み得る。
【0303】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【0304】
加えて、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅ、（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ｄ、ｅおよびｆの各々は塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【0305】
一本鎖ｇＲＮＡは、２種類、すなわち、第１の一本鎖ｇＲＮＡおよび第２の一本鎖ｇＲＮＡに分類され得る。
【0306】
第１の一本鎖ｇＲＮＡは、二本鎖ｇＲＮＡの第１鎖または第２鎖がリンカードメインによって連結される一本鎖ｇＲＮＡである。
【0307】
具体的には、一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐３'、または、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐３'、または、５'‐［ガイドドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第２相補ドメイン］‐［近位ドメイン］‐［尾部ドメイン］‐３'から成り得る。第１の一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
【0308】
例示的な一実施形態において、第１の一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−３'、
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−３'または
５'−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｑ）ｍ−（Ｌ）ｊ−（Ｚ）ｈ−（Ｐ）ｋ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【0309】
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−３'、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−３'、または、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−（Ｘ）ｂ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｌ）ｊ−（Ｘ）ｄ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｅ−（Ｐ）ｋ−（Ｘ）ｆ−（Ｆ）ｉ−３'
であり得る。
【0310】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列に応じて変更可能な塩基配列領域である。
【0311】
（Ｑ）ｍは、第２相補ドメインと相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列を含む。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて変更され得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【0312】
例えば、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・ピオゲネスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0313】
別の例において、第１相補ドメインが、カンピロバクター・ジェジュニの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＵＵＵＵＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0314】
更に別の例において、第１相補ドメインが、ストレプトコッカス・サーモフィラスの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'、または、５'‐ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＧＵＧＵＵＧＵＵＵＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0315】
加えて、（Ｌ）ｊは、リンカードメインを含む塩基配列であり、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続し、それにより、一本鎖ｇＲＮＡを生成する。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１〜３０の整数である。
【0316】
（Ｚ）ｈは、第１相補ドメインとの相補結合を有することが可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて変更され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり、５〜５０の整数であり得る。
【0317】
例えば、第２相補ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0318】
別の例において、第２相補ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0319】
更に別の例において、第２相補ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの第２相補ドメインまたはそれに由来する第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＣＧＡＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0320】
（Ｐ）ｋは、天然に存在する種の近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し得る近位ドメインを含む塩基配列であり、近位ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて改変され得る。Ｐは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｋは１〜２０の整数である塩基の数であり得る。
【0321】
例えば、近位ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0322】
別の例において、近位ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0323】
更に別の例において、近位ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの近位ドメイン、または、それに由来する近位ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｐ）ｋは、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'であり得る、または、５'‐ＡＡＧＧＣＵＵＡＧＵＣＣＧ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0324】
（Ｆ）ｉは、尾部ドメインを含む塩基配列であり得て、天然に存在する種の尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有し、尾部ドメインの塩基配列は由来の種に応じて改変され得る。Ｆは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｉは塩基の数であり得て、１〜５０の整数である。
【0325】
例えば、尾部ドメインがストレプトコッカス・ピオゲネスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'であり得る、または、５'‐ ＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0326】
別の例において、尾部ドメインがカンピロバクター・ジェジュニの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0327】
更に別の例において、尾部ドメインがストレプトコッカス・サーモフィラスの尾部ドメイン、または、それに由来する尾部ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｆ）ｉは、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'であり得る、または、５'‐ＵＡＣＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＧＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＧＧＵＧＵＵＵＵＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0328】
加えて、（Ｆ）ｉは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ転写法に関与する３'末端における１〜１０塩基の配列を含み得る。
【0329】
例えば、ｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写においてＴ７プロモーターが使用されるとき、尾部ドメインは、ＤＮＡ鋳型の３'末端に存在する任意の塩基配列であり得る。加えて、Ｕ６プロモーターがｉｎ ｖｉｖｏ転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵＵＵであり得て、Ｈ１プロモーターが転写において使用されるとき、尾部ドメインはＵＵＵＵであり得て、Ｐｏｌ‐ＩＩＩプロモーターが使用されるとき、尾部ドメインはいくつかのウラシル塩基または代替的な塩基を含み得る。
【0330】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃ、（Ｘ）ｄ、（Ｘ）ｅ、および、（Ｘ）ｆは、選択的に追加される塩基配列であり得て、Ｘは、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から各々独立に選択され得て、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆの各々は塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。第２の一本鎖ｇＲＮＡは、ガイドドメイン、第１相補ドメイン、第２相補ドメインから成る一本鎖ｇＲＮＡであり得る。
【0331】
ここで、第２の一本鎖ｇＲＮＡは、５'‐［第２相補ドメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'、または、５'‐［第２相補ドメイン］‐［リンカードメイン］‐［第１相補ドメイン］‐［ガイドドメイン］‐３'から成り得る。第２の一本鎖ｇＲＮＡは選択的に、追加の塩基配列を含み得る。
【0332】
例示的な一実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'、または、５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｘ）ｂ‐（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'であり得る。
【0333】
別の実施形態において、一本鎖ｇＲＮＡは、５'−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'、または、
５'−（Ｘ）ａ−（Ｚ）ｈ−（Ｌ）ｊ−（Ｑ）ｍ−（Ｘ）ｃ−（Ｎｔａｒｇｅｔ）−３'
であり得る。
【0334】
ここで、Ｎｔａｒｇｅｔは、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列と相補結合を形成可能な塩基配列であり、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列に応じて変更され得る塩基配列領域である。
【0335】
（Ｑ）ｍは、第２鎖の第２相補ドメインとの相補結合を形成可能な第１相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｑ）ｍは、天然に存在する種の第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第１相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて変更され得る。Ｑは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｍは塩基の数であり得て、５〜３５の整数である。
【0336】
例えば、第１相補ドメインが、パルクバクテリア・バクテリウムの第１相補ドメイン、または、それに由来する第１相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｑ）ｍは、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'、または、５'‐ＵＵＵＧＵＡＧＡＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0337】
（Ｚ）ｈは、第１鎖の第１相補ドメインとの相補結合を形成可能な第２相補ドメインを含む塩基配列である。（Ｚ）ｈは、天然に存在する種の第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有する配列であり得て、第２相補ドメインの塩基配列は、由来の種に応じて改変され得る。Ｚは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｈは塩基の数であり得て、５〜５０の整数である。
【0338】
例えば、第２相補ドメインがパルクバクテリア・バクテリウムの第２相補ドメイン、または、パルクバクテリア・バクテリウム由来第２相補ドメインとの部分的相同性または完全相同性を有するとき、（Ｚ）ｈは、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'、または、５'‐ＡＡＡＵＵＵＣＵＡＣＵ‐３'と少なくとも５０％以上の相同性を有する塩基配列であり得る。
【0339】
加えて、（Ｌ）ｊは、第１相補ドメインを第２相補ドメインに接続するリンカードメインを含む塩基配列である。ここで、Ｌは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ｊは塩基の数であり得て、１〜３０の整数である。
【0340】
加えて、（Ｘ）ａ、（Ｘ）ｂ、（Ｘ）ｃは選択的に、追加の塩基配列であり、Ｘは各々独立に、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧから成る群から選択され得て、ａ、ｂおよびｃの各々は、塩基の数であり得て、０または１〜２０の整数である。
【0341】
本明細書によって開示される内容の実施形態は、ガイド核酸が過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の標的配列と相補的に結合可能なｇＲＮＡに関する。
【0342】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得るが、これに限定されない。
【0343】
ガイド核酸は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の標的配列に対するｇＲＮＡであり得る。「標的配列」は、標的遺伝子または標的核酸のヌクレオチド配列、具体的には、標的遺伝子または標的核酸における標的領域の部分的ヌクレオチド配列であり、「標的領域」は、ガイド核酸エディタータンパク質によって改変できる標的遺伝子または標的核酸における領域である。
【0344】
本出願によって開示される標的遺伝子は、反復伸長発現調節遺伝子であり得る。
【0345】
本出願によって開示される標的遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／または、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得る。
【0346】
以降、標的配列は、２つのヌクレオチド配列情報を指し得る。例えば、標的遺伝子の場合、標的配列は、標的遺伝子のＤＮＡの転写鎖の配列情報を指し得る、または、標的遺伝子のＤＮＡの非転写鎖の配列情報を指し得る。
【0347】
例えば、標的配列は、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'である標的遺伝子Ａの転写鎖のヌクレオチド配列、または、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'である標的遺伝子Ａの非転写鎖のヌクレオチド配列を指し得る。標的配列は５〜５０塩基配列であり得る。
【0348】
一実施形態において、標的配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【0349】
標的配列は、ガイド核酸結合配列またはガイド核酸非結合配列を含む。「ガイド核酸結合配列」は、ガイドドメインに含まれるガイド配列と相補結合を形成可能なガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的または完全相補性を有する。標的配列およびガイド核酸結合配列は、標的遺伝子または標的核酸、すなわち、遺伝子操作または修正の対象に応じて変動し、標的遺伝子または標的核酸に応じて様々な形式で設計され得る。「ガイド核酸非結合配列」は、ガイドドメインに含まれるガイド配列と相補結合を形成可能でないガイドドメインに含まれるガイド配列との部分的相同性または完全相同性を有する。加えて、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列との相補結合を形成可能なガイド核酸結合配列との相補性を有する。
【0350】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の２つの異なるヌクレオチド配列のうち１つであるヌクレオチド配列であり得て、すなわち、一方の配列は、他方と相補結合を形成可能である。ここで、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列とは異なる標的配列の他のヌクレオチド配列であり得る。
【0351】
例えば、標的配列が、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'および５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'（相補配列）である、標的遺伝子Ａの標的領域におけるヌクレオチド配列である場合、ガイド核酸結合配列は、２つの配列５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'または５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'のうち１つであり得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列が５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であるとき、５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であり得る、または、ガイド核酸結合配列が５'‐ＣＧＡＡＣＴＡＧＴＣＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴ‐３'であるとき、５'‐ＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＡＣＴＡＧＴＴＣＧ‐３'であり得る。
【0352】
ガイド核酸結合配列は、標的配列の２つのヌクレオチド配列、すなわち、転写鎖と同一の配列を有するヌクレオチド配列、および、非転写鎖と同一の配列を有するヌクレオチド配列のうち１つから選択され得る。ここで、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列とは異なる、標的配列の他のヌクレオチド配列の１つであり得る。
【0353】
ガイド核酸結合配列の長さは、標的配列の長さと同一であり得る。
【0354】
ガイド核酸非結合配列の長さは、標的配列またはガイド核酸結合配列の長さと同一であり得る。ガイド核酸結合配列は５〜５０塩基配列であり得る。
【0355】
実施形態において、ガイド核酸結合配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。ガイド核酸非結合配列は、５〜５０塩基配列であり得る。
【0356】
実施形態において、ガイド核酸非結合配列は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基配列であり得る。
【0357】
ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と完全、または、部分的相補的結合可能であり、ガイド核酸非結合配列の長さは標的配列またはガイド核酸結合配列の長さと同一であり得る。
【0358】
ガイド核酸結合配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有するガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相補的な核酸配列であり得る。
【0359】
一例において、ガイド核酸結合配列は、ガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列と相補的でない１〜８塩基配列であり得る、または、それを含み得る。
【0360】
ガイド核酸非結合配列は、部分的相同性または完全相同性を有し得て、ガイド核酸非結合配列の長さは、ガイド配列の長さと同一であり得る。
【0361】
ガイド核酸非結合配列は、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相同性または完全相同性を有するガイド核酸のガイドドメインに含まれるガイド配列に相同性な核酸配列であり得る。
【0362】
一例において、ガイド核酸非結合配列は、ガイドドメインに含まれるガイド配列と相同でない追加の１〜８塩基配列を含み得る。
【0363】
ここで、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列との相補結合を形成可能であり、ガイド核酸非結合配列の長さは、ガイド核酸結合配列の長さと同一であり得る。
【0364】
ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列に相補的な核酸配列であり得て、例えば、少なくとも９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
【0365】
一例において、ガイド核酸非結合配列は、ガイド核酸結合配列と相補的でない１〜２塩基配列を含み得る。
【0366】
加えて、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列に隣接する塩基配列であり得る。
【0367】
一例において、ガイド核酸結合配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜５０塩基配列であり得る。
【0368】
加えて、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列に隣接する塩基配列であり得る。
【0369】
一例において、ガイド核酸非結合配列は、エディタータンパク質によって認識されることが可能な核酸配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜５０塩基配列であり得る。
【0370】
一実施形態において、ここで開示されるように、標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0371】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0372】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５塩基核酸配列であり得る。
【0373】
別の例において、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５塩基核酸配列であり得る。
【0374】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５塩基核酸配列であり得る。
【0375】
別の例において、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のプロモーター領域に位置する連続の１０〜２５塩基核酸配列であり得る。
【0376】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のイントロン領域に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0377】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0378】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４のイントロン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0379】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５のイントロン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0380】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈのイントロン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0381】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈのイントロン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0382】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0383】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0384】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0385】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0386】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0387】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のエクソン領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0388】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のエンハンサー領域に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0389】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0390】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４のエンハンサー領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0391】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５のエンハンサー領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0392】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈのエンハンサー領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0393】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈのエンハンサー領域に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0394】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混在に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0395】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0396】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0397】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0398】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0399】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のコード領域または非コード領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0400】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混在に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0401】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0402】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0403】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0404】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0405】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のプロモーター、エンハンサー、３'ＵＴＲまたはポリアデニル（ポリＡ）領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0406】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のエクソン領域またはイントロン領域またはその混在に位置する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0407】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0408】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のエクソン領域またはイントロン領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0409】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のエクソン領域またはイントロン領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0410】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のエクソン領域またはイントロン領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0411】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のエクソン領域またはイントロン領域またはその混在に位置する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0412】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子を含む、または、それに隣接する連続の１０〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0413】
ここで、標的配列は、５〜３５、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５または３０〜３５塩基配列であり得る。または、標的配列は、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０または３０〜３５塩基配列であり得る。
【0414】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0415】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0416】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0417】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を含む、または、それに隣接する連続の１０〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0418】
本出願によって開示される標的配列は、反復伸長発現調節遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜３５塩基ヌクレオチド配列であり得る。「ＰＡＭ配列」は、エディタータンパク質によって認識され得るヌクレオチド配列である。ここで、ＰＡＭ配列は、由来の種、または、エディタータンパク質の種類に応じて変動し得る。ＰＡＭ配列は、以下の配列のうち１または複数である（５'から３'の方向に記載）。ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧであり、ＹはＣまたはＴである）
ＮＮＡＧＡＡＷ（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＷはＡまたはＴである）
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ＲはＡまたはＧである）
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧである）。
【0419】
ここで、ガイドドメインは、１０〜３５、１５〜３５、２０〜３５、２５〜３５、３０〜３５塩基の配列であり得る。または、ガイドドメインは、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５塩基の配列であり得る。
【0420】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0421】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0422】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0423】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0424】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0425】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0426】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0427】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ４遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0428】
例えば、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0429】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0430】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0431】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0432】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0433】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0434】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0435】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＰＴ５遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0436】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0437】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0438】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0439】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0440】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0441】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0442】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0443】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0444】
例えば、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0445】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧ‐３'、５'‐ＮＡＧ‐３'、および／または５'‐ＮＧＡ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0446】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が、５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＧＧＮＧ‐３'および／または５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（ＷはＡもしくはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0447】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）であるとき、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'および／または５'‐ＮＮＮＧＣＴＴ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0448】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（ＶはＧ、ＣもしくはＡ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0449】
別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＡＡＲ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0450】
更に別の例示的な実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＮＮＧＲＲ‐３'、５'‐ＮＮＧＲＲＴ‐３'、および／または５'‐ＮＮＧＲＲＶ‐３'（ＲはＡまたはＧ、ＶはＧ、ＣまたはＡ、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0451】
例示的な一実施形態において、エディタータンパク質によって認識されるＰＡＭ配列が５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）である場合、標的配列は、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のヌクレオチド配列における５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣ）の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の５〜２５塩基ヌクレオチド配列であり得る。
【0452】
以降、本発明の実施形態において使用可能な標的配列の例をテーブル２に示し、テーブル２に列挙された標的配列は、ガイド核酸非結合配列であり、相補的配列、すなわちガイド核酸結合配列はテーブル２に記載の配列から予測できる。［テーブル２］
［過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の標的配列］
【表2】
【0453】
ここで開示される更に別の実施形態は、エディタータンパク質を含む遺伝子操作用組成物に関連し、組成物は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列の遺伝子はさみとして作用し得る。
【0454】
遺伝子操作用組成物は、反復伸長発現調節遺伝子を生成するために使用され得る。
【0455】
遺伝子操作用組成物によって操作される反復伸長発現調節遺伝子は、反復伸長の発現を調節するためのシステムを構築し得る。
【0456】
「人工的に改変、設計、または人工的に設計」という用語は、天然に発生する状態でない、人工的に改変された状態を意味する。以降、非天然の人工的に改変または設計された反復伸長発現調節遺伝子という用語は、人工的な反復伸長発現調節遺伝子という用語と相互交換可能に使用され得る。「過剰増幅反復配列の発現の調節」とは、人工的に操作された過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の機能を変更することによって疾患発現に影響する機構に関与するすべての現象を含む用語であり、そのような過剰増幅反復配列の発現システムに直接的または間接的に関与するすべての物質、組成物、方法および使用を含む。例えば、当該用語は、過剰増幅反復配列の転写、転写後修飾、翻訳、または、翻訳後修飾に関与する遺伝子、ならびに、当該遺伝子を含む細胞および臓器／組織の両方を含む。
【0457】
本出願によって開示される遺伝子操作用組成物は、ガイド核酸およびエディタータンパク質を含み得る。
【0458】
遺伝子操作用組成物は、（ａ）反復伸長発現調節遺伝子の標的配列に対する相補結合を形成可能なガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、（ｂ）１または複数のエディタータンパク質、および、それをコードする核酸配列とを含み得る。反復伸長発現調節遺伝子は上に記載のものと同一である。標的配列は上に記載したものと同一である。遺伝子操作用組成物はガイド核酸‐エディタータンパク質複合体を含み得る。
【0459】
「ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体」という用語は、ガイド核酸とエディタータンパク質との間の相互作用を通して形成される複合体を指す。ガイド核酸は上に記載のものと同一である。
【0460】
「エディタータンパク質」という用語は、核酸に直接結合する、または、直接結合することなく相互作用することが可能なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。核酸は、標的核酸、遺伝子、または染色体に含まれる核酸であり得る。核酸はガイド核酸であり得る。エディタータンパク質は酵素であり得る。
【0461】
酵素とは、核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を切断可能なドメインを含むタンパク質を指す。酵素はヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。エディタータンパク質は完全活性酵素を含み得る。
【0462】
ここで、「完全活性酵素」とは、野性型酵素の機能と同一の機能を有する酵素を指し、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素は、ＤＮＡの二本鎖を全体的に切断する完全な酵素活性を有する。
【0463】
加えて、完全活性酵素は、野性型酵素の機能と比較して機能が改善された酵素を含み、例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する特定の改変または操作されたタイプの野性型酵素は、野性型酵素と比較して改善された完全酵素活性、すなわち、ＤＮＡの二本鎖を切断する活性を有する。エディタータンパク質は、不完全な、または、部分的に活性のある酵素を含み得る。エディタータンパク質は、不完全な、または、部分的に活性のある酵素を含み得る。
【0464】
ここで、「不完全な、または、部分的に活性のある酵素」とは、野性型酵素の機能の一部を有する酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特異的に改変または操作されたタイプは、第１機能を有する酵素、または、第２機能を有する酵素である。ここで、第１機能は、二本鎖ＤＮＡの第１の一本鎖を切断し得て、第２機能は、二本鎖ＤＮＡの第２の一本鎖を切断し得る。ここで、第１機能または第２機能を有する酵素は、不完全な、または部分的に活性のある酵素であり得る。エディタータンパク質は、不活性酵素を含み得る。
【0465】
ここで、「不活性酵素」は、野性型酵素の機能が完全に不活性化された酵素を指す。例えば、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型酵素の特異的に改変または操作されたタイプは、第１および第２機能の両方を失った酵素である。ここで、第１および第２機能の両方を失った酵素は不活性酵素であり得る。エディタータンパク質は融合タンパク質であり得る。
【0466】
ここで、「融合タンパク質」とは、酵素を追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と融合させることによって生成されるタンパク質を指す。
【0467】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素と同一または異なる機能を有する機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【0468】
融合タンパク質は、酵素のＮ末端またはその付近、Ｃ末端またはその付近、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域において、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【0469】
ここで、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性もしくは核酸結合活性を有するドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、または、タンパク質（ペプチドを含む）の単離および精製のためのタグもしくはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
【0470】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。
【0471】
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【0472】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する双節型ヌクレオプラスミンＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【0473】
追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ここで、非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、酵素の機能に影響しない。
【0474】
融合タンパク質は、酵素のアミノ末端（Ｎ末端）またはその近傍、カルボキシル末端（Ｃ末端）またはその近傍、酵素の中央部分、および、それらの組み合わせのうち１または複数の領域に非機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。エディタータンパク質は、天然酵素または融合タンパク質であり得る。
【0475】
エディタータンパク質は、部分的に改変された天然の酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【0476】
エディタータンパク質は、天然に存在しない人工的に生成された酵素または融合タンパク質であり得る。
【0477】
エディタータンパク質は、天然に存在しない、部分的に改変された人工酵素または融合タンパク質の形態で存在し得る。
【0478】
ここで、改変は、エディタータンパク質に含まれるアミノ酸の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【0479】
加えて、改変は、エディタータンパク質をコードする塩基配列におけるいくつかの塩基の置換、除去、追加、または、それらの組み合わせであり得る。
【0480】
本明細書によって開示される内容の別の実施形態は、遺伝子操作用組成物に関し、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列と結合を形成可能なガイド核酸、および、標的配列の遺伝子はさみとして作用可能なエディタータンパク質を含む。遺伝子操作用組成物は、遺伝子操作用組成物であり得る。
【0481】
本出願によって開示される内容の一実施形態として、遺伝子操作用組成物は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。
【0482】
遺伝子操作用組成物は、（ａ）反復伸長発現調節遺伝子の標的配列に対する相補結合を形成可能なｇＲＮＡ、または、それをコードする核酸配列、および、（ｂ）１または複数のＣＲＩＳＰＲ酵素、または、それをコードする核酸配列を含む。反復伸長発現調節遺伝子は上に記載したものと同一である。標的配列は上に記載したものと同一である。遺伝子操作用組成物はｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を含み得る。
【0483】
「ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体」という用語は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素との間の相互作用を通して形成される複合体を指す。ｇＲＮＡは上に記載したものと同一である。
【0484】
「ＣＲＩＳＰＲ酵素」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの主なタンパク質要素であり、ｇＲＮＡと複合体を形成し、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムをもたらす。
【0485】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド（またはタンパク質）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0486】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の結晶構造は、２種類以上の天然の微生物ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素分子に関する研究（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３４３（６１７６）：１２４７９９７， ２０１４）、および、ｇＲＮＡと複合化されたストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）に関する研究（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １５６：９３５−９４９， ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，２０１４， ｄｏｉ： １０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３５７９）に従って決定された。
【0487】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は２つのローブ．すなわち、認識（ＲＥＣ）ローブおよびヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含み、各ローブはいくつかのドメインを含む。
【0488】
ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジへリックス（ＢＨ）ドメイン、ＲＥＣ１ドメインおよびＲＥＣ２ドメインを含む。
【0489】
ここで、ＢＨドメインは、ロングαへリックスおよびアルギニンリッチ領域であり、ＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインは、例えば、一本鎖ｇＲＮＡ、二本鎖ｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡなど、ｇＲＮＡに形成される二本鎖の認識において重要な役割を果たす。
【0490】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメインおよびＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメインを含む。ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＲｕｖＣ様ドメインを含み、または、ＨＮＨドメインは、ＨＮＨ様ドメインを含むように使用される。
【0491】
ここで、ＲｕｖＣドメインは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素を有する、天然に存在する微生物ファミリーのメンバーと構造類似性を共有し、例えば、標的遺伝子または標的核酸の非相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成しない鎖などの一本鎖を切断する。ＲｕｖＣドメインは、当技術分野において、ＲｕｖＣ Ｉドメイン、ＲｕｖＣ ＩＩドメイン、または、ＲｕｖＣ ＩＩＩドメインと呼ばれることがあり、一般に、ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩまたはＲｕｖＣ ＩＩＩと呼ばれる。
【0492】
ＨＮＨドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼと構造類似性を共有し、例えば、標的核酸分子の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する鎖など、一本鎖を切断する。ＨＮＨドメインは、ＲｕｖＣ ＩＩとＩＩＩモチーフとの間に位置する。
【0493】
ＰＩドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）である標的遺伝子または標的核酸における特定の塩基配列を認識する、または、ＰＡＭと相互作用する。ここで、ＰＡＭはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変動し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは、５'−ＮＧＧ−３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＡＧＡＡＷ−３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がナイセリア・メニンジティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＮＧＡＴＴ−３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であるとき、ＰＡＭは５'−ＮＮＮＶＲＹＡＣ−３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってよい。
【0494】
Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓおよびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａなどの様々な微生物に由来し得る。
【0495】
「Ｃａｓ９」という用語は、標的遺伝子または標的核酸上の標的配列または位置を切断または改変するようにｇＲＮＡに結合する酵素であり、核酸鎖を切断してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＨＮＨドメインと、核酸鎖を切断してｇＲＮＡとの相補結合を形成可能なＲｕｖＣドメインと、標的を認識するＲＥＣドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｃａｓ９の特定の構造的特徴については、Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｅｌｌ １５６：９３５−９４９を参照されたい。
【0496】
Ｃａｓ９は、組み換えまたは合成法によって生成される天然または非天然に存在する微生物から単離され得る。加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0497】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインに対応する同様のＲｕｖＣドメインを含み、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＨＮＨドメインの代わりにＮｕｃドメインと、標的を認識するＲＥＣおよびＷＥＤドメインと、ＰＡＭを認識するＰＩドメインとから成り得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の具体的な構造特性については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｅｌｌ １６５：９４９−９６２を参照されたい。
【0498】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡと相互作用し得て、それにより、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し、ｇＲＮＡと協働して、ＰＡＭ配列を含む標的配列にガイド配列が接近することを可能にし得る。ここで、標的遺伝子または標的核酸との相互作用のためのＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の能力は、ＰＡＭ配列に依存する。
【0499】
ＰＡＭ配列は、標的遺伝子または標的核酸に存在する配列であり、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素のＰＩドメインによって認識され得る。ＰＡＭ配列は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変動し得る。すなわち、種に応じて特異的に認識されることが可能な異なるＰＡＭ配列がある。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質であるとき、ＰＡＭ配列は５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）である。しかしながら、上に記載の酵素の由来に応じてＰＡＭ配列が決定されることが一般に理解されるが、ＰＡＭ配列は、酵素の変異体の研究が進むにつれて変動し得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１であり得る。
【0500】
Ｃｐｆ１は、ストレプトコッカス、カンピロバクター、ニトラチフラクター、スタフィロコッカス、パルビバクラム、ローズブリア、ナイセリア、グルコナセトバクター、アゾスピリラム、スフェロケタ、ラクトバチルス、ユーバクテリウム、コリネバクター、カルノバクテリウム、ロドバクター、リステリア、パルディバクター、クロストリジウム、ラクノスピラ、クロストリジアリジウム、レプトトリキア、フランシセラ、レジオネラ、アリシクロバチルス、メタノメチオフィラス、ポルフィロモナス、プレボテラ、バクテロイデス、ヘルココッカス、レトスピラ、デススルホビブリオ、デスルフォナトロナム、オピトゥトゥス、ツベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、メチロバクテリウムまたはアシダミノコッカスに由来し得る。
【0501】
Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様の対応するＲｕｖＣドメイン、Ｃａｓ９のＨＮＨドメイン無しのＮｕｃドメイン、標的を認識するＲＥＣドメイン、ＰＡＭを認識するＷＥＤドメインおよびＰＩドメインから成り得る。Ｃｐｆ１の特定の構造的特徴については、Ｔａｋａｓｈｉ Ｙａｍａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｅｌｌ １６５：９４９−９６２を参照されたい。
【0502】
Ｃｐｆ１は、組み換えまたは合成法によって生成される天然または非天然に存在する微生物から単離され得る。
【0503】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的遺伝子または標的核酸のＤＮＡの二本鎖を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0504】
「完全活性」とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能と同一の機能を有する状態を指し、完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素とは、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能と同一の機能を有する酵素を指す。ここで、「野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能」とは、ＤＮＡの二本鎖を切断する機能である。換言すれば、それは、第１および第２機能の両方を有することを指し、第１機能は、二本鎖ＤＮＡの第１鎖を切断する機能であり、第２機能は、二本鎖ＤＮＡの第２鎖を切断する機能である。
【0505】
完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡの二本鎖を切断する野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0506】
完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡの二本鎖を切断する改変または操作された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントであり得る。
【0507】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列における１または複数のアミノ酸が除去される、または、別のものと置換される酵素であり得る。
【0508】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、１または複数のアミノ酸が野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列に挿入される酵素であり得る。ここで、挿入されるアミノ酸は、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシル末端（Ｃ末端）、または、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の中央に位置し得る。
【0509】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能と比較して機能が改善された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0510】
例えば、改変または操作された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素‐ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＤＮＡ二本鎖と結合することなく、または、一定距離だけ離れた状態を維持しながら、ＤＮＡ二本鎖を切断できる。この場合、改変または操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能活性化と比較して機能活性化が改善された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0511】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能と比較して機能が低減された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0512】
例えば、改変または操作された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素‐ＣＲＩＳＰＲ酵素バリアントは、一定距離における、または、特定の結合の存在において、ＤＮＡ二本鎖を切断できる。この場合、改変または操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能活性化と比較して機能活性化が低減された完全活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0513】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。「不完全または部分的に活性のある」とは、野性型酵素の第１および第２機能から選択された機能を有する状態を指す。ここで、第１機能は、二本鎖ＤＮＡの第１の一本鎖を切断し、第２機能は、二本鎖ＤＮＡの第２の一本鎖を切断する。記載された状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不完全または部分的に活性のあるＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。加えて、不完全または部分的に活性のあるＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼと呼ばれ得る。
【0514】
「ニッカーゼ」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖のうち１本の鎖のみを切断するように操作または改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素を指し、ニッカーゼは、例えば、標的遺伝子または標的核酸のｇＲＮＡに相補的でない、または、相補的な鎖である一本鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。このため、二本鎖を切断するには、２つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
【0515】
例えば、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
【0516】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であれば、ニッカーゼは、改変されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0517】
例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であれば、ニッカーゼは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８４０をヒスチジンからアラニンに変異させることによって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化された、操作されたＳｐＣａｓ９であり得る。それにより生成されたニッカーゼがＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または標的核酸の非相補鎖と相補結合を形成しない鎖、すなわちｇＲＮＡを切断することが可能である。
【0518】
例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であれば、ニッカーゼは、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基５５９をヒスチジンからアラニンに変異させることによって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化された、操作されたＣｊＣａｓ９であり得る。それにより生成されたニッカーゼがＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または標的核酸の非相補鎖と相補結合を形成しない鎖、すなわちｇＲＮＡを切断することが可能である。
【0519】
加えて、ニッカーゼは、ＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインのヌクレアーゼ活性を含み得て、この目的で、ＲｕｖＣドメインは操作または改変され得る。
【0520】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であれば、ニッカーゼは、改変されたＲｕｖＣドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0521】
例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であれば、ニッカーゼは、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０をアスパラギン酸からアラニンに変異させることによって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化された、操作されたＳｐＣａｓ９であり得る。それにより生成されたニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または標的核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補結合を形成する鎖を切断可能である。
【0522】
例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であれば、ニッカーゼは、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８をアスパラギン酸からアラニンに変異させることによって、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化された、操作されたＣｊＣａｓ９であり得る。それにより生成されたニッカーゼは、ＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または標的核酸の相補鎖、すなわち、ｇＲＮＡと相補結合を形成する鎖を切断可能である。ＣＲＩＳＰＲ酵素は不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0523】
「不活性」とは、野性型酵素の機能のすべてを失った状態を指し、当該機能は、二本鎖ＤＮＡの第１の一本鎖を切断する第１機能、および、二本鎖ＤＮＡの第２の一本鎖を切断する第２機能を指す。記載された状態のＣＲＩＳＰＲ酵素は、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素と呼ばれる。不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインにおける変異に起因するヌクレアーゼ不活性を有する。
【0524】
不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインにおける変異に起因するヌクレアーゼ不活性を有する。すなわち、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインに起因するＣＲＩＳＰＲ酵素のヌクレアーゼ活性を含まないことがあり得る。この目的で、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインは操作または改変され得る。
【0525】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるとき、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、改変されたＲｕｖＣドメインおよび改変されたＨＮＨドメインを含むＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0526】
例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＳｐＣａｓ９であれば、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸配列における残基１０および８４０をアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンにそれぞれ変異することによって、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化される、操作されたＳｐＣａｓ９であり得る。それにより生成された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性が不活性化されるので、二本鎖は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖を完全に切断しないことがあり得る。
【0527】
別の例において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素が野性型ＣｊＣａｓ９であれば、不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣｊＣａｓ９のアミノ酸配列における残基８および５５９をアスパラギン酸およびヒスチジンからアラニンにそれぞれ変異することによって、ＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化される、操作されたＳｐＣａｓ９であり得る。それにより生成された不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインによるヌクレアーゼ活性が不活性化されるので、二本鎖は、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖を完全に切断しないことがあり得る。
【0528】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、上述のヌクレアーゼ活性に加えて、エンドヌクレアーゼ活性、エクソヌクレアーゼ活性、または、ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のへリックス構造をアニールする能力を有し得る。
【0529】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ヘリカーゼ活性を完全に、不完全に、または、部分的に活性化するように改変し得る。
【0530】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、人工的に改変または操作された野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
【0531】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、二本鎖ＤＮＡの第１の一本鎖を切断する第１機能および／または二本鎖ＤＮＡの第２の一本鎖を切断する第２機能を改変するように人工的に改変または操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
【0532】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１機能が失われたＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0533】
または、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２機能が失われたＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0534】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の機能、すなわち、第１および第２機能が失われたＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ｇＲＮＡとの相互作用を通してｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体を形成し得る。
【0535】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のｇＲＮＡと相互作用する機能を改変するように、人工的に改変または操作されたＣＲＩＳＰＲ酵素変異体であり得る。
【0536】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較してｇＲＮＡとの相互作用が低減し得る。
【0537】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加し得る。
【0538】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１機能を有しつつ、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が減少し得る。
【0539】
または、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１機能を有しつつ、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加し得る。
【0540】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２機能を有しつつ、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が減少し得る。
【0541】
または、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２機能を有しつつ、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加し得る。
【0542】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１および第２機能を有しないが、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が低減し得る。
【0543】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の第１および第２機能を有しないが、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と比較して、ｇＲＮＡとの相互作用が増加し得る。
【0544】
ここで、様々なｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡとＣＲＩＳＰＲ酵素変異体との間の相互作用力に従って形成され得て、標的配列にアクセスまたは切断する機能は、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体に従って変動し得る。
【0545】
例えば、ｇＲＮＡとの相互作用が低減したＣＲＩＳＰＲ酵素変異体によって形成されるｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体がｇＲＮＡとの完全相補結合を形成する標的配列に近い、または、それに局在化するときだけ、一本鎖または二本鎖を切断し得る。
【0546】
ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が改変されたＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0547】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換されるＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0548】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が欠失されるＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0549】
更に別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が追加されるＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0550】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素のアミノ酸配列の１または複数のアミノ酸が置換、欠失および／または追加されるＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。
【0551】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の元の機能、すなわち、二本鎖ＤＮＡの第１の一本鎖を切断する第１機能、および、二本鎖ＤＮＡの第２の一本鎖を切断する第２機能に加えて、追加的な機能ドメインを選択的に含み得る。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素の元の機能に加えて、追加の機能を有し得る。機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、または、核酸結合活性を有するドメイン、または、（ペプチドを含む）タンパク質を単離および精製するためのタグまたはレポーター遺伝子であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【0552】
タグは、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ‐Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグを含み、レポーター遺伝子は、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、自家蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む）を含むが、本発明はこれらに限定されない。機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はデアミナーゼであり得る。
【0553】
例えば、不完全または部分的ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能ドメインとしてシチジンデアミナーゼを追加的に含み得る。例示的な一実施形態、シチジンデアミナーゼ、例えば、アポリポタンパク質Ｂ編集複合体１（ＡＰＯＢＥＣ１）はＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を産生する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＰＯＢＥＣ１］は、ＣをＴまたはＵにする、または、ＧをＡにする塩基修復または編集において使用され得る。
【0554】
別の例として、不完全または部分的ＣＲＩＳＰＲ酵素は、追加的に、機能ドメインとしてアデノシンデアミナーゼを含み得る。例示的な一実施形態において、アデノシンデアミナーゼ、例えば、ＴａｄＡバリアント、ＡＤＡＲ２バリアント、または、ＡＤＡＴ２バリアントは、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼに追加され得て、それにより、融合タンパク質を生成する。それにより形成される［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＴａｄＡバリアント］、［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＲ２バリアント］または［ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ］‐［ＡＤＡＴ２バリアント］は、ヌクレオチドＡをイノシンに変更し、改変されたイノシンは、ポリメラーゼによってヌクレオチドＧとして認識されるので、ヌクレオチドＡをＧにするように操作または編集する効果を有する。したがって、上に記載の融合タンパク質は、ＡをＧ、または、ＴをＣにする編集において使用され得る。
【0555】
加えて、機能ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、核局在配列もしくはシグナル（ＮＬＳ）、または、核外搬出配列もしくはシグナル（ＮＥＳ）であり得る。
【0556】
ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有する、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミンに由来するＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有する双節型ヌクレオプラスミンＮＬＳ）、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤまたはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ‐ｍｙｃ ＮＬＳ、または、配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチンα由来ＩＢＢドメイン配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ、筋腫Ｔタンパク質配列ＶＳＲＫＲＰＲＰおよびＰＰＫＫＡＲＥＤ、ヒトｐ５３配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ、マウスｃ‐ａｂｌ ＩＶ配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ、インフルエンザウイルスＮＳ１配列ＤＲＬＲＲおよびＰＫＱＫＫＲＫ、Ｄ型肝炎ウイルス抗原配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ、マウスＭｘ１タンパク質配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ、ヒトポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ、または、ステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイド配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【0557】
加えて、ＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を２つ以上の部分に分割することによって調製されたスプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得る。「スプリット」という用語は、タンパク質の機能的または構造的な分割、または、タンパク質を２つ以上の部分にランダムに分割することを指す。
【0558】
ここで、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、完全に、不完全に、または、部分的に、活性酵素または不活性酵素であり得る。
【0559】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基６５６チロシンと残基６５７スレオニンとの間で２つの部分に」分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。加えて、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は選択的に、再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【0560】
スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素は選択的に、再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【0561】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、スプリット型ＣＲＩＳＰＲ酵素を野性型ＣＲＩＳＰＲ酵素と構造的に同一または類似にするように組み立て得る。
【0562】
再構成のための追加のドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＲＢおよびＦＫＢＰ二量体化ドメイン、インテイン、ＥＲＴおよびＶＰＲドメイン、または、特定の条件下でヘテロダイマーを形成するドメインであり得る。
【0563】
例えば、ＳｐＣａｓ９は、残基７１３セリンと残基７１４グリシンとの間で２つの部分に分割され得て、それにより、スプリット型ＳｐＣａｓ９を生成する。ＦＲＢドメインは、２つの部分のうち１つに接続され得て、ＦＫＢＰドメインは他方に接続され得る。それにより生成されるスプリット型ＳｐＣａｓ９において、ＦＲＢドメインおよびＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンが存在する環境において二量体で形成され得て、それにより、再構成されたＣＲＩＳＰＲ酵素を生成する。
【0564】
本発明において説明されるＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体は、ポリペプチド、タンパク質、または、それをコードする配列を有する核酸であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素変異体を導入するべく対象に対してコドン最適化され得る。
【0565】
「コドン最適化」という用語は、宿主細胞における発現を改善するように、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置換しながら、天然アミノ酸配列を維持することによって核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定のバイアスを有し、コドンバイアス（生物間のコドン使用率の差異）は、翻訳されたコドンの特徴、および、特定のｔＲＮＡ分子の利用可能性に従っているとみなされる、ｍＲＮＡの翻訳の効率と頻繁に相関する。細胞において選択されるｔＲＮＡの優位性（ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）は一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンを反映する。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現によりカスタマイズされ得る。
【0566】
ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ酵素、または、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、様々な形式で対象に送達または導入され得る。対象は上に記載されたものと同一である。
【0567】
一実施形態において、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、ベクターによって対象に送達または導入され得る。ベクターは、ｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【0568】
一例において、ベクターは、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素をそれぞれコードする核酸配列を同時に含み得る。別の例において、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含み得る。
【0569】
一例において、ｇＲＮＡに含まれるドメインは、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、異なるベクターに含まれ得る。例えば、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列を含み得る。
【0570】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素の場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。ベクターは、１または複数の調節／制御要素を含み得る。
【0571】
ここで、調節／制御要素は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターは誘導プロモーターであり得る。プロモーターは対象特異的プロモーターであり得る。プロモーターはウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【0572】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に従って好適なプロモーターを使用し得る。
【0573】
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ‐１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ‐１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、または、ＣＡＧプロモーターであり得る。ベクターは、ウイルスベクター、または、組み換えウイルスベクターであり得る。ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【0574】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【0575】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【0576】
一例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が、組み換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【0577】
別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【0578】
更に別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【0579】
更なる別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルスによって、例えば、本明細書において列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって、送達または導入され得る。
【0580】
一実施形態において、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の形成で対象に送達または導入され得る。
【0581】
例えば、ガイド核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混在であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【0582】
一例において、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＡ型ｇＲＮＡおよびタンパク質型ＣＲＩＳＰＲを含むｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ複合体、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形成で対象に送達または導入され得る。
【0583】
ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮またはスクイージング（例えば、文献Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２−６３２７に記載されている）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達、または、それらの組み合わせによって対象に送達または導入され得る。
【0584】
ここで開示されるように、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、標的遺伝子、すなわち、反復伸長発現調節遺伝子の操作または改変において使用され得る。
【0585】
標的遺伝子または標的核酸は、上述のｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわち、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して操作または修正され得る。ここで、標的遺伝子または標的核酸の操作または修正は、ｉ）標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷、および、ｉｉ）損傷した標的遺伝子または標的核酸の修復の段階のすべてを含む。
【0586】
ｉ）標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷、特に、標的遺伝子または標的核酸における標的配列の切断または損傷であり得る。
【0587】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体の標的であり得て、標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって認識されるＰＡＭ配列を含んでも含まなくてもよい。そのような標的配列は、ｇＲＮＡ設計段階における重要な基準を当業者に提供し得る。
【0588】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体のｇＲＮＡによって特異的に認識されることが可能であり得るので、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は認識された標的配列に隣接して配置され得る。
【0589】
標的領域における「切断」という用語は、ポリヌクレオチドの共有結合主鎖の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含むが、本発明はこれに限定されず、また、様々な他の方法を含む。切断は、一本鎖および二本鎖の両方に実行されることが可能であり、二本鎖の切断は、異なる一本鎖切断の結果であり得る。二本鎖切断は、平滑末端、または、付着末端（または粘着末端）を生じさせ得る。
【0590】
一例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷は、標的配列の二本鎖に対する完全な切断または損傷であり得る。
【0591】
例示的な一実施形態において、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は完全に切断され得る。
【0592】
別の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）およびＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得て、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得て、切断は、順番または同時に起き得る。
【0593】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷は、標的配列の一本鎖のみに対する切断または損傷であり得る。ここで、一本鎖は、ｇＲＮＡと相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖、または、ｇＲＮＡと相補結合を形成しない標的配列の非相補一本鎖であり得る。
【0594】
例示的な一実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は、切断されないことがあり得る。
【0595】
別の例示的な実施形態において、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）が使用されるとき、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の相補一本鎖は、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）によって切断され得るが、ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の非相補一本鎖は切断されないことがあり得る。
【0596】
更なる別の例において、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する、標的遺伝子または標的核酸の切断または損傷は、核酸断片の部分的除去であり得る。
【0597】
例示的な一実施形態において、異なる標的配列を有する２つのｇＲＮＡ、および、野性型ＳｐＣａｓ９が使用されるとき、第１ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、第２ｇＲＮＡとの相補結合を形成する標的配列の二本鎖は切断され得て、第１および第２ｇＲＮＡ、ならびに、ＳｐＣａｓ９による、核酸断片の除去をもたらす。
【0598】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断または損傷した標的遺伝子または標的核酸は、ＮＨＥＪおよび相同組換え修復（ＨＤＲ）を通して修復または復元され得る。
【0599】
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断された二本鎖または一本鎖の両方の末端を共に結合することによって、ＤＮＡにおける二本鎖の破損を復元または修復する方法であり、一般に、二本鎖の破損（例えば切断）によって形成される２つの適合する末端が互いに頻繁に接触して２つの末端を完全に連結するとき、破損された二本鎖が復元される。ＮＨＥＪは、細胞周期全体で使用されることが可能な復元方法であり、通常、Ｇ１期など、鋳型として使用される相同ゲノムが細胞に無いときに生じる。
【0600】
ＮＨＥＪを使用する、損傷した遺伝子または核酸の修復プロセスにおいて、核酸配列におけるいくつかの挿入および／または欠失（インデル）がＮＨＥＪ修復領域において生じ、そのような挿入および／または欠失は、リーディングフレームのシフトを引き起こし、トランスクリプトームｍＲＮＡのフレームシフトをもたらす。結果として、ナンセンス媒介分解、または、正常タンパク質の合成の失敗が原因で、先天的機能が失われる。加えて、リーディングフレームが維持される一方で、タンパク質の機能を破損するために、相当量の配列の挿入または欠失が引き起こされる変異が引き起こされ得る。重要な機能ドメインにおける変異は、タンパク質の非重要領域における変異より許容度が低い可能性があるので、変異は、座位依存的である。
【0601】
天然状態においてＮＨＥＪによりインデル変異が生じると予期するのは不可能であるが、所与の切断領域では特定のインデル配列が好適であり、マイクロホモロジーの小さい領域に由来し得る。従来、欠失長は、１ｂｐ〜５０ｂｐの範囲に及び、挿入は、より短い傾向があり、切断領域を直接囲む短い反復配列を頻繁に含む。
【0602】
加えて、ＮＨＥＪは、変異を引き起こすプロセスであり、特定の最終的な配列を生成する必要がないとき、小さい配列のモチーフの欠失に使用され得る。
【0603】
ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的化される遺伝子の特異的なノックアウトは、そのようなＮＨＥＪを使用して実行され得る。標的遺伝子または標的核酸の二本鎖または２つの一本鎖は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して切断され得て、標的遺伝子または標的核酸の破損された二本鎖または２つの一本鎖は、ＮＨＥＪを通してインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または標的核酸の特異的なノックアウトを誘導する。ここで、ＣＲＩＳＰＲ酵素によって切断される標的遺伝子または標的核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得て、加えて、ＮＨＥＪにより復元される標的遺伝子または標的核酸の部位は、非コードまたはコード領域であり得る。
【0604】
一例において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ複合体による標的遺伝子の二本鎖の切断、および、ＮＨＥＪによるそれらの修復を含むプロセスに起因して、修復領域において、様々なインデルが生じ得る。
【0605】
「インデル」という用語は、ＤＮＡ塩基配列におけるいくつかの塩基の間に発生する挿入または欠失変異についての総称である。ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体が、上に記載されたように過剰増幅反復配列の発現調節因子の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を切断するとき、インデルは、ＨＤＲまたはＮＨＥＪ機構による修復の間に標的配列に導入され得る。
【0606】
ＨＤＲは、損傷した遺伝子または核酸を修復または復元するために、および、一般に、切断されたＤＮＡを修復または復元するために、相同性配列を鋳型として使用する、エラーの無い修正方法である。すなわち、細胞の先天的情報を復元するために、改変されていない相補的塩基配列の情報、または、姉妹染色分体の情報を使用して、切断されたＤＮＡが修復される。最も一般的な種類のＨＤＲは相同組換え（ＨＲ）である。ＨＤＲは、活発に分裂している細胞のＳまたはＧ２／Ｍ期に通常生じる修復または復元方法である。
【0607】
細胞の相補的塩基配列または姉妹染色分体を使用する代わりにＨＤＲを使用して、損傷したＤＮＡを修復または復元するために、相補的塩基配列または相同塩基配列の情報を使用して人工的に合成されるＤＮＡ鋳型、すなわち、相補的塩基配列または相同塩基配列を含む核酸鋳型が細胞に提供され得て、それにより、切断されたＤＮＡを修復する。ここで、切断されたＤＮＡを修復するために核酸配列または核酸断片が核酸鋳型に更に追加されるとき、切断されたＤＮＡに更に追加される核酸配列または核酸断片は、ノックインの対象になり得る。更に追加される核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得るが、本発明はこれらに限定されない。フレーム内インデルまたはフレーム外インデルはインデルによって生成され得る。
【0608】
「フレーム内インデル」とは、ＤＮＡのヌクレオチド配置における一部のヌクレオチドが中央に挿入される、または、欠失されるとき、３ｎ（ｎは整数）個のヌクレオチドが挿入または欠失される変異をまとめて指す。フレーム内インデルが誘導される標的遺伝子または標的核酸の二本鎖から転写されるＲＮＡの翻訳の間に、リーディングフレームが維持され得る。標的遺伝子または標的核酸の二本鎖は、ヌクレオチド挿入または欠失座位の周囲の一部のポリペプチドが挿入または欠失される配列に変異され得て、その後のポリペプチドは、フレーム内インデルによるヌクレオチドの挿入または欠失の前と同一のポリペプチドをコードする。
【0609】
「フレーム外インデル」とは、ＤＮＡのヌクレオチド配置における一部のヌクレオチドが中央に挿入される、または、欠失されるとき、３ｎ＋１または３ｎ＋２（ｎは整数）個のヌクレオチドが挿入または欠失される変異をまとめて指す。フレーム外インデルが誘導される標的遺伝子または標的核酸の二本鎖から転写されるＲＮＡの翻訳の間に、リーディングフレームが改変され得る。標的遺伝子または標的核酸の二本鎖は、ヌクレオチド挿入または欠失座位がフレーム外インデルによって置換または削除された後のポリペプチドである、ポリペプチドをコードし得る。
【0610】
一例において、標的遺伝子または標的核酸の二本鎖または一本鎖は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され得て、切断部位に隣接する塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され得て、標的遺伝子または標的核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲを通して修復または復元され得る。
【0611】
ここで、相補的塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、相補的塩基配列の切断された二本鎖または一本鎖を有し得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含み得る。追加の核酸配列または核酸断片は、相補的塩基配列に挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡの切断部位、すなわち、標的遺伝子または標的核酸に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の左右の塩基配列との相補結合を有する塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端との相補結合を有する塩基配列であり得る。相補的塩基配列は、１５〜３０００塩基配列であり得て、相補的塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得る、または、核酸鋳型は鎖状または円状であり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【0612】
別の例において、二本鎖または一本鎖の標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して切断され、切断部位に隣接する塩基配列を有する相同塩基配列を含む核酸鋳型は細胞に提供され、標的遺伝子または標的核酸の切断された塩基配列は、ＨＤＲによって修復または復元され得る。
【0613】
ここで、相同塩基配列を含む核酸鋳型は、切断されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖または一本鎖相同塩基配列であり得て、更に、切断されたＤＮＡに挿入される核酸配列または核酸断片を含む。追加の核酸配列または核酸断片は、相同塩基配列、および、挿入される核酸配列または核酸断片を含む核酸鋳型を使用して、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断部位に挿入され得る。ここで、挿入される核酸配列または核酸断片、および、追加の核酸配列または核酸断片は、変異によって改変された標的遺伝子または標的核酸を正常な遺伝子または核酸に、または、細胞において発現されるべき遺伝子または核酸に修正するための核酸配列または核酸断片であり得る。相同塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、切断された二本鎖塩基配列との相同性を有する塩基配列、または、標的遺伝子または標的核酸の左右の一本鎖塩基配列であり得る。代替的に、相補的塩基配列は、切断されたＤＮＡ、すなわち、標的遺伝子または標的核酸の切断された二本鎖または一本鎖の３'および５'末端との相同性を有する塩基配列であり得る。相同塩基配列は、１５〜３０００塩基配列であり得て、相同塩基配列の長さまたはサイズは、核酸鋳型または標的遺伝子または標的核酸のサイズに従って適切に設計され得る。ここで、核酸鋳型として、二本鎖または一本鎖の核酸が使用され得て、線状または円状であり得るが、本発明はこれに限定されない。
【0614】
ＮＨＥＪおよびＨＤＲ以外に、切断されたＤＮＡを修復または復元する方法がある。例えば、一本鎖アニール（ＳＳＡ）、一本鎖切断修復（ＳＳＢＡ）、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、または、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）。
【0615】
ＳＳＡは、標的核酸に存在する２つの反復配列の間の二本鎖切断を修復する方法であり、一般に、３０より多い塩基の反復配列を使用する。反復配列は、切断された末端の各々において、標的核酸の二本鎖に関して一本鎖を有するように（粘着末端を有するように）切断され、切断後、反復配列を含む一本鎖オーバーハングは、不適切に反復配列を互いにアニールさせることを防止するように、ＲＰＡタンパク質で被覆される。ＲＡＤ５２は、オーバーハング上の各反復配列に結合し、相補的反復配列にアニール可能な配列が配置される。アニール後、オーバーハングの一本鎖フラップが切断され、新規のＤＮＡの合成が特定のギャップを満たし、ＤＮＡ二本鎖を復元する。この修復の結果として、２つの反復の間のＤＮＡ配列が欠失され、欠失長は、ここで使用される２つの反復の位置、切断の進行の経路または度合いを含む様々な因子に依存し得る。
【0616】
ＨＤＲと同様に、ＳＳＡは相補的配列、すなわち、相補的反復配列を利用し、対照的に、標的核酸配列を改変または修正するために核酸鋳型を必要としない。
【0617】
ゲノムにおける一本鎖切断は、上述の修復機構とは別個の機構であるＳＳＢＲを通して修復される。一本鎖ＤＮＡ切断の場合、ＰＡＲＰ１および／またはＰＡＲＰ２は、切断を認識し、修復機構を集める。ＤＮＡ切断部に関するＰＡＲＰ１の結合および活性は一時的であり、ＳＳＢＲは、損傷領域におけるＳＳＢＲタンパク質複合体の安定性を促進することによって促進される。ＳＳＢＲ複合体におけるもっとも重要なタンパク質は、ＤＮＡの３'末端および５'末端処理を促進するタンパク質と相互作用してＤＮＡを安定化するＸＲＣＣ１である。末端処理は一般的に、損傷３'末端をヒドロキシル化状態に、および／または、損傷５'末端をリン酸塩部分に修復することに関与し、末端の処理後、ＤＮＡギャップフィリングが起きる。ＤＮＡギャップフィリングのための２つの方法、すなわち、短いパッチの修復および長いパッチの修復があり、短いパッチの修復は、単一塩基の挿入を伴う。ＤＮＡギャップフィリング後、ＤＮＡリガーゼは末端の連結を促進する。
【0618】
ＭＭＲは、ミスマッチしたＤＮＡ塩基に作用する。ＭＳＨ２／６またはＭＳＨ２／３複合体の各々は、ＡＴＰａｓｅ活性を有し、よって、ミスマッチの認識および修復の開始において重要な役割を果たす。ＭＳＨ２／６は主に、塩基と塩基とのミスマッチを認識し、１または２つの塩基ミスマッチを識別するが、ＭＳＨ２／３は主に、より大きいミスマッチを認識する。
【0619】
ＢＥＲは、細胞周期全体を通してはたらく修復方法であり、小さい非らせん歪み塩基損傷領域をゲノムから除去するのに使用される。損傷したＤＮＡにおいては、塩基をリン酸デオキシリボース主鎖に連結するＮグリコシド結合を切断することによって、損傷した塩基が除去され、次いで、ホスホジエステル主鎖が切断され、よって、一本鎖ＤＮＡにおける切断部を生成する。形成される切断された一本鎖末端はそれにより除去され、除去された一本鎖に起因して生成されるギャップは新規の相補的塩基で充填され、次いで、新規に充填された相補的塩基の末端は、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、損傷したＤＮＡの修復がもたらされる。
【0620】
ＮＥＲは、ＤＮＡから大きいへリックス歪み損傷を除去するために重要な切除機構であり、損傷が認識されるとき、損傷した領域を含む短い一本鎖ＤＮＡセグメントが除去され、２２〜３０塩基の一本鎖ギャップがもたらされる。生成されたギャップは、新しい相補的塩基で充填され、新しく充填された相補的塩基の末端が、ＤＮＡリガーゼによって主鎖とライゲーションされ、損傷したＤＮＡが修復される。
【0621】
標的遺伝子または標的核酸の操作または修正は主に、ノックアウト、ノックダウンの効果につながり得る。
【0622】
「ノックアウト」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の不活性化を指し、「標的遺伝子または標的核酸の不活性化」とは、標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳が生じない状態を指す。疾患を引き起こす遺伝子、または、異常な機能を有する遺伝子の転写および翻訳は、ノックアウトを通して阻害され得て、タンパク質発現の防止がもたらされる。
【0623】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または標的核酸を操作または編集するとき、標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断され得る。損傷した標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を使用してＮＨＥＪを通して修復され得る。損傷した標的遺伝子または標的核酸は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または標的核酸に対する特異的なノックアウトが誘導され得る。
【0624】
別の例として、ＣＲＩＳＰＲ複合体およびドナーを使用して標的遺伝子または標的核酸を操作または編集するとき、標的遺伝子または標的核酸は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断され得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって損傷した標的遺伝子または標的核酸は、ＨＤＲを通してドナーを使用することによって修復され得る。ここで、ドナーは、挿入されるべき相同ヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列を含み得る。ここで、挿入されるべきヌクレオチド配列の塩基の数は、挿入部位または目的に応じて変動し得る。損傷した遺伝子または染色体がドナーによって修復されるとき、挿入されるべきヌクレオチド配列は、損傷されたヌクレオチド配列の一部に挿入される。これは、標的遺伝子または染色体の特異的なノックアウトを誘導し得る。
【0625】
「ノックダウン」という用語は、標的遺伝子または標的核酸の転写および／または翻訳、または、標的タンパク質の発現の減少を指す。ノックダウンを通して遺伝子またはタンパク質の過剰発現を調節することによって、疾患の発現は防止され得る、または、疾患は治療され得る。
【0626】
例えば、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ不活性酵素−転写阻害活性ドメイン複合体、すなわち、転写阻害活性ドメインを含むＣＲＩＳＰＲ不活性複合体を使用して、標的遺伝子または標的核酸が編集または修正されるとき、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体は具体的には、標的遺伝子または標的核酸に結合し得て、標的遺伝子または標的核酸の転写は、ＣＲＩＳＰＲ不活性複合体に含まれる転写阻害活性ドメインによって阻害され得て、それにより、対応する遺伝子または核酸の発現が阻害されるノックダウンを誘導する。
【0627】
別の例として、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体、すなわちＣＲＩＳＰＲ複合体を使用して標的遺伝子または標的核酸が操作または編集されるとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的遺伝子または染色体のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域を切断し得る。ここで、ｇＲＮＡは、標的遺伝子または染色体のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域のヌクレオチド配列の一部を標的配列として認識し得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断または損傷された標的遺伝子または染色体は、ＮＨＥＪを通して修復され得る。損傷された標的遺伝子または染色体は、ＮＨＥＪに起因するインデルを有し得て、それにより、標的遺伝子または染色体に対する特異的なノックアウトが誘導され得る。または、選択的にドナーを使用するとき、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって損傷される標的遺伝子または染色体がＨＤＲを通して修復され得る。損傷した遺伝子または染色体がドナーによって修復されるとき、挿入されるべきヌクレオチド配列は、損傷されたヌクレオチド配列の一部に挿入される。これは、標的遺伝子または染色体の特異的なノックアウトを誘導し得る。
【0628】
一実施形態において、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子を人工的に改変または編集し得る。
【0629】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の標的配列を特異的に認識し得る。
【0630】
標的配列は、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によって特異的に認識され得て、したがって、ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、認識された標的配列に隣接して配置され得る。
【0631】
標的配列は、人工的改変が生じるＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／または、ＳＵＰＴ５Ｈの一部または領域であり得る。
【0632】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈのプロモーター領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0633】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈのイントロン領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0634】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈのエクソン領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0635】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈのエンハンサー領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0636】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈの３'ＵＴＲ領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0637】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈの５'ＵＴＲ領域の連続の１０〜２５塩基配列であり得る。
【0638】
標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈのプロトスペーサ―隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０〜２５の塩基配列であり得る。
【0639】
ここで、ＰＡＭ配列は、以下の配列のうち少なくとも１つである。５'‐ＮＧＧ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）、
５'‐ＮＮＮＮＲＹＡＣ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
５'‐ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
５'‐ＮＮＧＲＲ（Ｔ）‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、（Ｔ）はランダムに追加可能な配列）、
５'‐ＴＴＮ−３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
【0640】
一実施形態において、標的配列は、テーブル１に列挙される配列から選択される１または複数の核酸配列であり得る。ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素から成り得る。
【0641】
ｇＲＮＡは、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の標的配列のガイド核酸結合配列との部分的または完全相補結合を形成可能なガイドドメインを含み得る。
【0642】
ガイド核酸は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の相補性または完全相補性を有する。
【0643】
ガイドドメインは、ＳＰＴ４遺伝子の標的配列のガイド核酸結合配列との相補ヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２個のミスマッチを生じ得る。
【0644】
ガイドドメインは、ＳＰＴ５遺伝子の標的配列のガイド核酸結合配列との相補ヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２個のミスマッチを生じ得る。
【0645】
ガイドドメインは、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の標的配列のガイド核酸結合配列との相補ヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２個のミスマッチを生じ得る。
【0646】
ガイドドメインは、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の標的配列のガイド核酸結合配列との相補ヌクレオチド配列を含み得る。ここで、相補ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２個のミスマッチを生じ得る。
【0647】
ガイド核酸は、第１相補ドメイン、第２相補ドメイン、リンカードメイン、近位ドメインおよび尾部ドメインから成る群から選択される１または複数のドメインを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数であり得る。一例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質またはストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質であり得る。
【0648】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体は、ｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じて、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子に様々な人工的改変または操作を加え得る。
【0649】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に改変または操作されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々の５'‐ＮＧＧ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0650】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に改変または編集されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々のＮＮＮＮＲＹＡＣ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0651】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に改変または編集されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々のＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0652】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に改変または編集されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々の５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0653】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳａＣａｓ９タンパク質であるとき、人工的に改変または編集されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々の５'‐ＮＮＧＲＲ（Ｔ）‐３'（各Ｎは独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、（Ｔ））ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0654】
別の例において、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｐｆ１タンパク質であるとき、人工的に改変または編集されたＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子は、標的遺伝子の標的領域の各々の５'‐ＴＴＮ‐３'（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）ＰＡＭ配列の５'末端および／または３'末端に隣接する、連続の１ｂｐ〜５０ｂｐ、１ｂｐ〜４０ｂｐ、１ｂｐ〜３０ｂｐ、好ましくは、１ｂｐ〜２５ｂｐの塩基配列における１または複数の改変を含み得て、それらは、ｉ）１または複数のヌクレオチドの欠失、ｉｉ）野性型遺伝子とは異なる１または複数のヌクレオチドとの置換、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の組み合わせを含む。
【0655】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によるＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈの人工的操作は、ノックアウトの効果につながり得る。
【0656】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によるＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の人工的操作は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈおよび／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を抑制し得る。
【0657】
ｇＲＮＡ−ＣＲＩＳＰＲ酵素複合体によるＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、および／またはＳＵＰＴ５Ｈの人工的操作は、ノックダウンの効果につながり得る。
【0658】
ガイドドメインは、ガイド核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上相補的、または、完全相補的であり得る。
【0659】
ガイドドメインは、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子の標的配列におけるガイド核酸結合配列と相補的なヌクレオチド配列を含み得る。この場合、相補ヌクレオチド配列は、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２個のミスマッチを含み得る。
【0660】
ガイドＲＮＡは、標的化される遺伝子または核酸の配列と相補的に結合する核酸配列を含み得る。
【0661】
ガイドＲＮＡは、標的化される遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を含むｃｒＲＮＡ、および、ＣＲＩＳＰＲ酵素に結合するｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。
【0662】
この場合、ｃｒＲＮＡは、標的化される遺伝子または核酸の配列と相補的に結合する部分であるガイド配列を含む。ガイド配列は、標的化される遺伝子または核酸の配列と相補的な配列を有し、標的化される遺伝子または核酸の配列を認識するように機能し得る。ガイド配列のサイズは５〜５０ｂｐであり得るが、これに限定されない。
【0663】
ガイド配列の核酸配列は、標的化される遺伝子または核酸の配列または位置に５０〜１００％相補的な核酸配列を含み得るが、これに限定されない。
【0664】
この場合、ガイド配列の核酸配列は、標的遺伝子、例えば、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子と相補的に結合する核酸配列を含み得る。
【0665】
更に、ガイド配列の核酸配列は、標的遺伝子、例えば、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子と相補的に結合する核酸配列を含み得る。
【0666】
加えて、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一部に相補的な配列を有する部分を含み得て、従って、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡと部分的に相補的であり得る。
【0667】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが各々離れて存在するデュアルガイドＲＮＡであり得る。
【0668】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが互いに接続される単一ガイドＲＮＡであり得る。この場合、単一ガイドＲＮＡは、リンカーを含んでよい。さらに、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の種類に応じてｃｒＲＮＡのみを含むものであってよい。
【0669】
ガイドＲＮＡは化学修飾を含み得る。この場合、化学修飾は、ホスホロチオエート結合、架橋型核酸（ＬＮＡ）を含み得て、２'‐Ｏ‐メチル３'ホスホロチオエート（ＭＳ）または２'‐Ｏ‐メチル３'ｔｈｉｏＰＡＣＥ（ＭＳＰ）は、ガイドＲＮＡを含む核酸のうち１または２つ以上の核酸において改変される。ガイドＲＮＡは、５'末端の部分的配列が切り取られたガイドＲＮＡであり得る。
【0670】
ガイドＲＮＡは、標的遺伝子または標的核酸の配列に従って、ガイドＲＮＡの核酸配列を設計し得る。
【0671】
ガイドＲＮＡはベクターに含まれ得て、この場合、ベクターは、ガイドＲＮＡの発現に適切なプロモーターを含み得る。ガイドＲＮＡは、人工的に合成されたガイドＲＮＡであり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸であってよい。
【0672】
ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を有する核酸がベクターに含まれ得る。この場合、ベクターは、ＣＭＶまたはＣＡＧなどのＣＲＩＳＰＲ酵素の発現に適切なプロモーターを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はポリペプチドまたはタンパク質であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、導入される対象に適切であるようにコドン最適化され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素であり得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣｐｆ１酵素であり得る。
【0673】
Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、ナイセリア・メニンジティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）またはそれらのオーソログであり得るが、これらに限定されない。好ましくは、Ｃａｓ９酵素はストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）であり得る。Ｃａｓ９酵素は活性Ｃａｓ９酵素または不活性Ｃａｓ９酵素であり得る。
【0674】
不活性Ｃａｓ９酵素は、完全不活性化Ｃａｓ９酵素および部分的不活性化Ｃａｓ９酵素（例えばニッカーゼ）を含み得る。
【0675】
Ｃａｓ９酵素に関しては、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメインに存在する１、２、または、それより多くのアミノ酸が変異し得る。
【0676】
Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうち、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｄ９８６から成るアミノ酸群、または、それに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１または２またはより多くのアミノ酸の変異を含み得る。
【0677】
Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうち、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５およびＨ９８２から成るアミノ酸群、または、それに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１または２またはより多くのアミノ酸の変異を含み得る。
【0678】
Ｃａｓ９酵素は、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸のうち、Ｇ１１０４、Ｓ１１０９、Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｎ１３１７、Ｒ１３３５およびＴ１３３７から成るアミノ酸群、または、それに対応する他のＣａｓ９オーソログのアミノ酸群における１または２またはより多くのアミノ酸の変異を含み得る。
【0679】
Ｃｐｆ１酵素は、フランシセラ・ノビサイダＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラバクテリウムＣｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）またはそれらのオーソログであり得るが、それに限定されない。Ｃｐｆ１酵素は、活性Ｃｐｆ１酵素または不活性Ｃｐｆ１酵素であり得る。
【0680】
不活性Ｃｐｆ１酵素は、完全不活性化Ｃｐｆ１酵素および部分的不活性化Ｃｐｆ１酵素（例えばニッカーゼ）を含み得る。
【0681】
Ｃｐｆ１酵素に関しては、ＲｕｖＣ、Ｎｕｃ、ＷＥＤ、ＲＥＣおよび／またはＰＩドメインに存在する１、２、または、それより多くのアミノ酸が変異し得る。
【0682】
Ｃｐｆ１酵素は、ＦｎＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ９１７、Ｅ１００６またはＤ１２５５；ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ９０８、Ｅ９９３またはＤ１２６３；ＬｂＣｐｆ１のアミノ酸のうちＤ８３２、Ｅ９２５、Ｄ９４７またはＤ１１８０、または、それに対応する他のＣｐｆ１オーソログのアミノ酸群における１または複数のアミノ酸の変異を含み得る。
【0683】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、遺伝子または核酸の配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識できる。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ酵素の由来に従って変動し得る。
【0684】
例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｐＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは５'‐ＮＧＧ‐３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＳｔＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは５'ＮＮＡＧＡＡＷ‐３'（Ｗ＝ＡまたはＴ）であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＮｍＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは５'‐ＮＮＮＮＧＡＴＴ‐３'であり得て、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣｊＣａｓ９であるとき、ＰＡＭは５'‐ＮＮＮＶＲＹＡＣ‐３'（Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ）であり得て、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、または、Ａ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＦｎＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′ＴＴＮ−３′であってよく、ＣＲＩＳＰＲ酵素がＡｓＣｐｆ１またはＬｂＣｐｆ１である場合、ＰＡＭは５′−ＴＴＴＮ−３′であってよく、この場合、ＮはＡ、Ｔ、ＧもしくはＣ、またはＡ、Ｕ、ＧもしくはＣであり得る。
【0685】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は追加的に、機能ドメインを含み得る。この場合、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、活性ＣＲＩＳＰＲ酵素または不活性ＣＲＩＳＰＲ酵素であり得る。機能ドメインは、非相同機能ドメイン（ＨＦＤ）であり得る。
【0686】
機能ドメインは、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性および分子スイッチ（例えば光誘導性）から成る群から選択され得る。
【0687】
機能ドメインは、メチラーゼ、デメチラーゼ、ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、システインデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼから成る群から選択され得る。
【0688】
機能ドメインをＣＲＩＳＰＲ酵素に連結するべく、ＣＲＩＳＰＲ酵素と機能ドメインとの間のリンカーが追加的に含まれ得る。
【0689】
リンカーは、（Ａ）ｎ、（Ｇ）ｎ、ＧＧＧＳ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、ＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ、ＸＴＥＮ、または、（ＸＰ）ｎであり得て、この場合、ｎは１、２、３、４、５、６、７以上であり得る。しかしながら、リンカーおよびｎはこれらに限定されない。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、核局在配列（ＮＬＳ）を追加的に含んでよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素およびガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の外部で形成されてよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の細胞質内で形成されてよい。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞の核内で形成されてよい。
【0690】
ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的化される遺伝子または核酸の配列に存在するＰＡＭを認識できる。
【0691】
ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ガイドＲＮＡは、標的化される遺伝子または核酸の配列に関して相補的に結合し得る。
【0692】
標的化される遺伝子または核酸の配列にＣＲＩＳＰＲ複合体が結合するとき、標的化される遺伝子または核酸の配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＣＲＩＳＰＲ酵素によって切断または改変できる。
【0693】
別の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ酵素が複合体を形成するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で存在し得る。
【0694】
標的特異的遺伝子はさみは、周知の方法によって細胞または組織に導入され得る。
【0695】
標的特異的遺伝子はさみを細胞内に導入することは、ウイルスベクターシステム、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、ナノ粒子、リポソームなど、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して、トランスフェクションによって実行できるが、導入方法はこれらに限定されない。
【0696】
例えば、導入方法は、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ヌクレオフェクション、電気穿孔、カチオンポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥデキストランまたはポリエチレンイミン）、ウイルストランスフェクション、ウイロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオンリポソームトランスフェクション、免疫リポソームトランスフェクション、非リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネットフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インペールフェクション、ソノポレーション、光トランスフェクション、および、核酸の専用薬剤増強摂取を含む。細胞は、真核細胞または原核細胞であり得て、好ましくは真核細胞であり得る。真核細胞は植物、動物、または、ヒト細胞であり得て、好ましくはヒト細胞であり得る。
【0697】
組織は、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳および筋肉などの動物または人体組織であり得る。
【0698】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムはコドン最適化され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、少なくとも１つの核移行シグナル（ＮＬＳ）のコードを含み得る、または、少なくとも１つのＮＬＳを含み得る。
【0699】
更に、治療剤は追加的に、医薬的に許容される担体またはアジュバントを含み得る。
【0700】
「対象」という用語は、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸‐エディタータンパク質複合体が導入される生物、ガイド核酸、エディタータンパク質またはガイド核酸‐エディタータンパク質複合体がはたらく生物、または、当該生物から取得される標本または試料を指す。
【0701】
対象は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の標的核酸、遺伝子、染色体またはタンパク質を含む生物であり得る。生物は、動物、動物臓器、動物組織、または動物細胞であり得る。生物は、ヒト、ヒト臓器、ヒト組織、またはヒト細胞であり得る。
【0702】
臓器は、腎臓；胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系；心臓；肺；脳、特にニューロン、および／または、一般に中枢神経系；網膜組織を含む目内耳を含む耳；皮膚；筋肉；骨；および／または肝臓であり得る。
【0703】
組織は、眼球、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、筋肉または血液組織などの組織であり得る。
【0704】
細胞は、神経細胞、筋細胞、血球、免疫細胞、脂肪細胞、骨細胞、生殖細胞、肌膚細胞、またはそれらの幹細胞であり得る。
【0705】
好ましくは、対象は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を含む生物であり得る。
【0706】
ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態、または、その混合物の形態で対象に送達または導入され得る。
【0707】
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、または、その混合物の形態は、当技術分野において既知の方法によって対象に送達または導入され得る。
【0708】
または、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物の形態は、ベクター、非ベクターまたはその組み合わせによって対象に送達または導入され得る。ベクターは、ウイルスまたは非ウイルスベクター（例えばプラスミド）であり得る。非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体またはｍＲＮＡであり得る。
【0709】
一実施形態において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列はベクターによって対象に送達または導入され得る。
【0710】
ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【0711】
例えば、ベクターは、ガイド核酸およびエディタータンパク質をそれぞれコードする複数の核酸配列を同時に含み得る。例えば、ベクターは、ガイド核酸をコードする核酸配列を含み得る。
【0712】
例として、ガイド核酸に含まれるドメインはすべて１つのベクターに含まれ得る、または、分割されて、次いで、異なるベクターに含まれ得る。例えば、ベクターは、エディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。
【0713】
一例において、エディタータンパク質の場合、エディタータンパク質をコードする核酸配列は、１つのベクターに含まれ得る、または、分割され、次いで、いくつかのベクターに含まれ得る。ベクターは１または複数の調節／制御要素を含み得る。
【0714】
ここで、調節／制御要素は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、スプライスアセプターおよび／または２Ａ配列を含み得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターであり得る。プロモーターは誘導プロモーターであり得る。プロモーターは対象特異的プロモーターであり得る。プロモーターはウイルスまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
【0715】
プロモーターは、制御領域（すなわち、ガイド核酸またはエディタータンパク質をコードする核酸配列）に従って好適なプロモーターを使用し得る。
【0716】
例えば、ガイド核酸に有用なプロモーターは、Ｈ１、ＥＦ‐１ａ、ｔＲＮＡまたはＵ６プロモーターであり得る。例えば、エディタータンパク質に有用なプロモーターは、ＣＭＶ、ＥＦ‐１ａ、ＥＦＳ、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、またはＣＡＧプロモーターであり得る。ベクターは、ウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターであり得る。ウイルスは、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスであり得る。
【0717】
ここで、ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスまたは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ウイルスであり得る。ここで、ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスであり得る。
【0718】
ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルスまたは単純ヘルペスウイルスであり得るが、本発明はこれらに限定されない。
【0719】
一般的に、ウイルスは、宿主（例えば細胞）に感染し得て、それにより、ウイルスの遺伝情報をコードする核酸を宿主に導入する、または、遺伝情報をコードする核酸を宿主ゲノムに挿入する。ガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、そのような特徴を有するウイルスを使用して対象に導入され得る。ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において一時的に発現され得る。代替的に、ウイルスを使用して導入されたガイド核酸および／またはエディタータンパク質は、対象（例えば細胞）において継続的に長時間（例えば、１、２または３週、１、２、３、６または９か月、１または２年、または、恒久的）発現され得る。
【0720】
ウイルスのパッケージング能力は、ウイルスの種類に従って、少なくとも２ｋｂ〜５０ｋｂ変動し得る。そのようなパッケージング能力に応じて、ガイド核酸またはエディタータンパク質を含むウイルスベクター、または、ガイド核酸およびエディタータンパク質の両方を含むウイルスベクターが設計され得る。代替的に、ガイド核酸、エディタータンパク質、および、追加の要素を含むウイルスベクターが設計され得る。
【0721】
一例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が、組み換えレンチウイルスによって送達または導入され得る。
【0722】
別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、組み換えアデノウイルスによって送達または導入され得る。
【0723】
更に別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列が組み換えＡＡＶによって送達または導入され得る。
【0724】
更なる別の例において、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、ハイブリッドウイルスによって、例えば、本明細書において列挙されるウイルスの１または複数のハイブリッドによって、送達または導入され得る。
【0725】
ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列は、非ベクターを使用して対象に送達または導入され得る。
【0726】
非ベクターは、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列を含み得る。非ベクターは、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ複合体、ｍＲＮＡまたはそれらの混合物であり得る。
【0727】
非ベクターは、電気穿孔、パーティクルボンバードメント、ソノポレーション、マグネットフェクション、一過性細胞圧縮またはスクイージング（例えば、文献Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２‐６３２７］において説明されている）、脂質媒介トランスフェクション、デンドリマー、ナノ粒子、リン酸カルシウム、シリカ、ケイ酸塩（Ｏｒｍｏｓｉｌ）、または、それらの組み合わせによって対象に送達または導入され得る。
【0728】
例として、電気穿孔を通した送達は、細胞と、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質をコードする核酸配列とをカートリッジ、チャンバーまたはキュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
【0729】
別の例において、非ベクターは、ナノ粒子を使用して送達され得る。ナノ粒子は、無機ナノ粒子（例えば、磁気ナノ粒子、シリカなど）、または、有機ナノ粒子（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で被覆された脂質など）であり得る。ナノ粒子の外表面には、結合可能な正荷電ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリンなど）が結合され得る。特定の実施形態において、非ベクターは、脂質シェルを使用して送達され得る。
【0730】
特定の実施形態において、非ベクターは、エキソソームを使用して送達され得る。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを輸送するための内因性のナノ小胞であり、ＲＮＡを脳および別の標的臓器へ送達できる。
【0731】
特定の実施形態において、非ベクターは、リポソームを使用して送達され得る。リポソームは、内側の水性区画を囲む単一または複数の層状の脂質二重層と、比較的非透過性である外側の親油性リン脂質二重層とから構成される球状の小胞構造である。リポソームは複数の異なる種類の脂質からできていることがあり得るが、リン脂質は、薬剤担体としてリポソームを生成するために使用されるのがもっとも一般的である。加えて、非ベクターを送達するための組成物は他の添加剤を含み得る。
【0732】
エディタータンパク質は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形成で対象に送達または導入され得る。
【0733】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態のエディタータンパク質は、当技術分野において周知の方法によって、対象に送達または導入され得る。
【0734】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の形態は、電気穿孔、マイクロインジェクション、一過性細胞圧縮、または、スクイ―ジング（例えば、文献［Ｌｅｅ， ｅｔ ａｌ， （２０１２） Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．， １２， ６３２２‐６３２７］において説明される）、脂質媒介トランスフェクション、ナノ粒子、リポソーム、ペプチド媒介送達、または、それらの組み合わせによって、対象に送達または導入され得る。
【0735】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、ガイド核酸をコードする核酸配列と共に送達され得る。
【0736】
一例において、電気穿孔を通した移入は、エディタータンパク質がガイド核酸と共に、または、ガイド核酸無しで導入されることになる細胞をカートリッジ、チャンバーまたはキュベットにおいて混合し、予め定められた期間および強度で細胞に電気刺激を加えることによって実行され得る。
【0737】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、核酸タンパク質混合物の形態で対象に送達または導入され得る。
【0738】
ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態で、対象に送達または導入され得る。
【0739】
例えば、ガイド核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその混合物であり得る。エディタータンパク質はペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【0740】
一例において、ガイド核酸およびエディタータンパク質は、ＲＮＡ型ガイド核酸、および、タンパク質型エディタータンパク質、すなわち、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を含むガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形態で対象に送達または導入され得る。
【0741】
本明細書において開示される内容は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作のために「遺伝子編集」技術を使用し得る。遺伝子編集技術のもっとも好ましい実施形態として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが使用され得る。
【0742】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の遺伝子操作は、過剰増幅反復配列によって引き起こされる上述の遺伝性疾患のために使用され得る。
【0743】
本明細書において開示される内容において、「過剰増幅反復配列によって引き起こされる遺伝性疾患のための治療剤」は、上の疾患の治療のための遺伝子編集技術、特にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを使用するために使用され得る材料、それを含む組成物、および、それを使用するシステムのすべてを含む概念である。
【0744】
したがって、本明細書において開示される内容の治療剤は、標的特異的遺伝子はさみを含み、「標的特異的遺伝子はさみ」とは、所望の（標的化される、または、標的の）ゲノム上の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の特定の位置を認識および切断できるヌクレアーゼを指す。本明細書において開示される内容において、標的特異的遺伝子はさみは、特定のヌクレアーゼが所望の機能を実行することを可能にするために必要な他の要素を含む概念としても使用される。
【0745】
標的特異的遺伝子はさみは、過剰増幅反復配列の発現に直接的または間接的に関与する遺伝子を標的化することを特徴とする。本明細書において開示される内容において標的化される遺伝子は、過剰増幅反復配列の発現の調節に関与する遺伝子のすべてを含む。
【0746】
標的特異的遺伝子はさみの標的は、例えば、ＳＰＴ４遺伝子および／またはＳＰＴ５遺伝子であり得る。
【0747】
標的特異的遺伝子はさみの標的は、例えば、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子および／またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子であり得る。
【0748】
標的のために、遺伝子の発現は、本明細書において開示される内容の標的遺伝子はさみの作用によって調節され得る。
【0749】
例えば、過剰増幅反復配列の発現にポジティブに関与する遺伝子の発現は、減少または抑制され得る。
【0750】
別の例において、過剰増幅反復配列の発現にネガティブに関与する遺伝子の発現は、増加または促進され得る。
【0751】
本明細書において開示される標的特異的遺伝子はさみ、および、それを含む組成物は、標的遺伝子の発現が目的にとって適切であるように調節されるように、設計および変更され得る。ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体を改変し得る。
【0752】
例えば、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的核酸、遺伝子または染色体の配列における改変を誘導する。その結果、標的核酸、遺伝子または染色体によって発現されるタンパク質を、構造および／または機能について改変できる、または、タンパク質の発現を調節または除去できる。
【0753】
ここで、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または染色体レベルで作用し得る。
【0754】
例えば、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加、または促進）し、タンパク質活性を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）し、または、標的遺伝子の操作または改変を通して改変タンパク質を発現し得る。
【0755】
ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、遺伝子転写および翻訳の段階で作用し得る。
【0756】
一例において、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の転写を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
【0757】
別の例において、ガイド核酸‐エディタータンパク質複合体は、標的遺伝子の翻訳を促進または抑制し得て、それにより、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を調節（例えば、阻害、抑制、低減、増加または促進）する。
【0758】
本明細書において開示される実施形態によれば、過剰増幅反復配列を特徴とする遺伝子発現は、遺伝子操作のための組成物によって調節され得る。
【0759】
過剰増幅反復配列を特徴とする遺伝子は、遺伝子の１つの領域における反復配列過剰増幅を有し得る。
【0760】
遺伝子は、例えば、ＨＴＴ遺伝子、ＦＭＲ１遺伝子、ＦＭＲ２遺伝子、ＦＲＤＡ遺伝子、ＤＭＰＫ／ＳＩＸ遺伝子、ＺＮＦ９遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＡＴＸＮ１０遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子、ＣＳＴＢ遺伝子、ＴＣＦ４遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＡＩＢ１遺伝子、ＫＣＮＮ３遺伝子、ＣＢＦＡ１遺伝子、ＣＯＭＰ遺伝子、ＡＲ遺伝子、ＪＰＨ３遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＡＴＸＮ１遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＡＴＸＮ７遺伝子、ＴＢＰ遺伝子、ＰＡＢＰＮ１遺伝子、ＨＯＸＤ１３遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＨＯＸＡ１３遺伝子、ＺＩＣ２遺伝子、ＦＯＸＬ２遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＡＲＸ遺伝子のうち任意の１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0761】
遺伝子１つの領域は、例えば、エクソン、イントロン、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、および、ポリアデニル化シグナル配列のうち任意の１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0762】
過剰増幅反復配列は、反復配列の重複を含む第１反復部分と、反復配列の過剰重複を含む第２反復部分とを含み、第１反復部分は、病的対象および通常の対象に含まれ、第２反復部分は通常の対象に含まれない。
【0763】
第１反復部分および第２反復部分は、特定のアミノ酸配列の反復をコードする核酸配列であり得る。
【0764】
特定のアミノ酸配列の反復を有するポリペプチドは、第１反復部分および第２反復部分から翻訳され得る。
【0765】
遺伝子操作のための組成物は、過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子を人工的に操作し得る。
【0766】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
【0767】
遺伝子操作のための組成物は、過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現を低減し得る。例えば、遺伝子操作のための組成物は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現を低減し得る。
【0768】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列の転写伸長因子の発現の低減であり得る。例えば、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列の転写伸長因子の発現の低減であり得る。
【0769】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列の発現を低減し得る。過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現を低減し得る。過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の転写を低減し得る。
【0770】
例えば、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列の発現を低減し得る。ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現を低減し得る。ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の転写を低減し得る。
【0771】
過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現の低減は、核酸配列からのｍＲＮＡの転写を低減し得る。本明細書によって開示される実施形態として、操作された動物細胞が提供される。
【0772】
操作された動物細胞は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現が阻害または抑制される動物細胞であり得る。
【0773】
操作された動物細胞は、過剰増幅反復配列のための発現調節因子の発現が阻害または抑制される動物細胞であり得る。
【0774】
操作された動物細胞は、１または複数の人工的に操作または改変された過剰増幅反復配列および／またはその発現産物の発現調節因子を含む人工的に操作された動物細胞であり得る。
【0775】
発現産物は、１または複数の人工的に操作または改変された過剰増幅反復配列の発現調節因子によって発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質であり得る。
【0776】
この場合、過剰増幅反復配列の発現調節因子は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子、すなわち、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子またはＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子によって発現されるポリペプチドまたはタンパク質であり得る。
【0777】
本明細書によって開示される別の実施形態として、操作された動物細胞を含む操作された動物対象が提供される。
【0778】
操作された動物対象は、臓器の１つの領域または全体の領域において操作された動物細胞を含む、操作された動物対象であり得る。
【0779】
操作された動物対象は、過剰増幅反復配列の発現調節因子の発現が臓器の１つの領域または全体の領域において阻害または抑制される操作された動物細胞を含む操作された動物対象であり得る。
【0780】
本明細書において開示される実施形態によれば、過剰増幅遺伝子の発現調節遺伝子の標的配列との結合を形成可能なガイド核酸を含む、遺伝子操作のための組成物の使用が提供され得る。
【0781】
本明細書によって開示される実施形態は、遺伝子操作のための組成物を使用して、過剰増幅反復配列によって引き起こされる疾患を治療するために使用される医薬組成物を提供する。
【0782】
本明細書において開示される内容は、疾患を治療するための、または、薬剤もしくは医薬組成物を調製するための、遺伝子（ゲノム）操作のためのＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ組成物の使用を提供する。
【0783】
医薬における本明細書において開示される内容の配列、ベクター、酵素、または、システムの使用が提供される。更に、遺伝子またはゲノム編集における、上述したものの使用も提供される。
【0784】
加えて、本明細書において開示される内容は、標的特異的遺伝子はさみを使用して、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子によって引き起こされる遺伝性疾患を緩和または治療するための方法を提供する。
【0785】
治療方法は、過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を標的化する標的特異的遺伝子はさみを使用することを特徴とする。
【0786】
治療方法は、標的化される過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子を含む細胞に標的特異的遺伝子はさみを導入することを含むことを特徴とする。
【0787】
治療方法は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子を含む細胞に標的特異的遺伝子はさみを導入することを含むことを特徴とする。
【0788】
例えば、標的特異的遺伝子はさみは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、または、他のプラスミドもしくはウイルスベクターの種類を使用して導入され得る。
【0789】
更に、本明細書において開示される内容は、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子の発現を調節するための組成物またはキットを提供する。
【0790】
この場合、組成物またはキットは、標的特異的遺伝子はさみを含み、標的特異的遺伝子はさみは、過剰増幅反復配列の発現に関与する遺伝子を標的化することを特徴とする。
【0791】
更に、組成物は追加的に、医薬的に許容される担体またはアジュバントを含み得る。
【0792】
本明細書によって開示される別の態様によれば、反復伸長疾患を治療するための方法が提供され得る。
【0793】
本明細書によって開示される実施形態は、反復伸長疾患を治療するための方法であり、当該方法は、活性成分として、過剰増幅反復配列の発現を低減するための、遺伝子操作のための組成物を含む組成物を治療の対象に投与する段階を含み、遺伝子操作のための組成物は、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩおよびエンドヌクレアーゼのうち、いずれか１つを含み、遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子であることを特徴とする。
【0794】
本明細書によって開示される別の実施形態は、反復伸長疾患を治療するための方法であり、当該方法は、活性成分として、過剰増幅反復配列の発現を低減するための、遺伝子操作のための組成物を含む組成物を治療の対象に投与する段階を含み、遺伝子操作のための組成物は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列のガイド核酸、ならびに、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のエディタータンパク質、または、エディタータンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子操作のための組成物である。
【0795】
投与のために、治療の対象への組成物の投与は、電気穿孔、注射、輸血、インプラント、または、移植の方法であり得る。
【0796】
投与は、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、および腹腔内のうち１または複数で組成物を投与することであり得るが、投与経路はこれらに限定されない。
【0797】
投与のために、組成物は、局部的に投与され得る。更に、投与のために、組成物は局所的に投与され得る。
【0798】
ガイド核酸の標的配列は、配列識別番号か１〜２４から選択される１または複数であり得る。
【0799】
治療の対象は、ヒトおよびサルなどの霊長動物、ラットなどの齧歯動物を含む哺乳動物などであり得る。
【0800】
投与のために、組成物は、治療の対象の腎臓；胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系；心臓；肺；脳、特にニューロン、および／または、一般に中枢神経系；網膜組織を含む目内耳を含む耳；皮膚；筋肉；骨；および／または肝臓のうち、任意の１または複数の臓器に投与され得るが、臓器はこれらに限定されない。
【0801】
治療の対象の細胞は、神経細胞、筋細胞、血球、免疫細胞、脂肪細胞、骨細胞、生殖細胞、肌膚細胞、または、それらの幹細胞のうち任意の１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0802】
投与のために組成物は、治療の対象の臓器に投与され得る。例えば、臓器は脳であり得る。脳において、海馬歯状回、視覚皮質、一次運動皮質、一次聴覚皮質、一次体性感覚皮質、小脳、小脳、主嗅球、前頭黒質皮質、内梨状核、扁桃腺、黒質、線条体、淡蒼球、視床、視床下部、傍小脳脚核、上オリーブ核複合体、蝸牛神経核、乳頭核のうち、任意の１または複数を含む他の組織が、一部の実施形態において好ましいことがあり得る。
【0803】
脳の細胞は、神経細胞またはグリア細胞であり得る。神経細胞は、ニューロンであり得て、グリア細胞は、アストロサイト、希突起膠細胞、シュワン細胞、嗅神経鞘細胞、上衣細胞、または衛星細胞であり得るが、これらに限定されない。
【0804】
遺伝子操作のための組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質法のうち１または複数の方法によって投与され得る。
【0805】
方法によって投与される遺伝子操作のための組成物は、例えば、ガイド核酸および／またはエディタータンパク質、または、エディタータンパク質をコードする核酸であり得る。遺伝子操作の組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。ガイド核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態で細胞に送達され得る。エディタータンパク質は、ポリペプチドの形態で細胞に送達され得る。エディタータンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡの形態で細胞に送達され得る。
【0806】
形態のうち、核酸の形態は、１または複数のウイルスベクターを含むベクターシステムに含まれ得る。
【0807】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0808】
本明細書によって開示される更に別の実施形態は、反復伸長疾患を治療するための方法であり、当該方法は、活性成分として、過剰増幅反復配列の発現を低減するための、遺伝子操作のための組成物を含む組成物を治療の対象に投与する段階と、遺伝子操作のための組成物を、治療の対象の細胞に接触させる段階とを含む。
【0809】
接触は、（ａ）治療される対象の細胞と、（ｂ）ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される過剰増幅反復配列の１または複数の発現調節遺伝子を人工的に操作することが可能な遺伝子操作用組成物とを接触させることであり得る。
【0810】
この場合、（ａ）治療される対象の細胞は、神経細胞、筋細胞、血球、免疫細胞、脂肪細胞、骨細胞、生殖細胞、肌膚細胞、または、それらの幹細胞であり得る。治療される対象の細胞は、人体に由来し得る。
【0811】
（ｂ）遺伝子操作のための組成物は、（ｂ'）ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される、過剰増幅反復配列の１または複数の発現調節遺伝子の標的配列に対するガイド核酸と、（ｂ"）ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質およびＣｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のエディタータンパク質とを含み得る。遺伝子組み換えのための組成物の説明は上記の通りである。
【0812】
ガイド核酸の標的配列は、配列識別番号１〜２４から選択される１または複数であり得る。接触段階はｉｎ ｖｉｖｏで実行され得る。
【0813】
接触段階は、（ｂ）遺伝子操作のための組成物を（ａ）動物細胞に導入することを含み得る。方法は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、例えば、人体で実行され得る。ガイド核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態で細胞と接触され得る。エディタータンパク質は、ポリペプチドの形態で細胞と接触され得る。
【0814】
エディタータンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡの形態で細胞と接触され得る。
【0815】
形態のうち、核酸の形態は、１または複数のウイルスベクターを含むベクターシステムに含まれ得る。
【0816】
ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0817】
当該方法に使用される動物細胞は、ヒトおよびサルなどの霊長動物、ならびに、マウスおよびラットなどの齧歯動物を含む哺乳動物に由来する動物細胞であり得る。
【0818】
上述の遺伝子操作または編集による疾患の治療のために、生物の遺伝子を直接操作することによって、動物細胞の遺伝子の発現に影響を与える治療方法があり得る。治療方法は、生物の遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで操作する遺伝子操作のための組成物を直接注射することによって実行され得る。
【0819】
遺伝子操作のための組成物がｉｎ ｖｉｖｏで直接注射されるとき、遺伝子操作のための組成物の投与量の実施形態において、組成物の単回投与（所望の効果を得るための医薬的有効量）は、ヒトに対するものであり、組成物がＡＡＶを通じてｉｎ ｖｉｖｏで送達されるとき、約１×１０８〜約１×１０１８の機能性ＡＡＶ／ｍＬを含む約２０ｍＬ〜約５０ｍＬの生理食塩水が投与され得る。本明細書の実施形態において、ＡＡＶ投与は一般に、約１×１０５〜１×１０５０ゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０ゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶ、または、約１×１０１１〜約１×１０１６ゲノムＡＡＶの範囲の濃度内である。ヒトの用量は、約１×１０１３ゲノムＡＡＶであり得る。濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５ｍｌ〜約５０ｍｌ、または、約１０ｍｌ〜約２５ｍｌの担体溶液で送達され得る。濃度は、当該数値範囲内のすべての整数値から選択され得るが、これらに限定されない。組成物は、投与の対象の年齢、健康、体重、併用療法の種類、該当する場合は治療の頻度、所望の効果の特徴などを考慮して適宜処方され得る。
【0820】
遺伝子操作のための組成物がｉｎ ｖｉｖｏで直接注射されるとき、遺伝子操作のための組成物の投与量の別の実施形態において、組成物の単回投与（所望の効果を得るための医薬的有効量）はヒトに対するものであり、組成物がＲＮＰを通じてｉｎ ｖｉｖｏで送達されるとき、体重ｋｇあたり、約０．０１〜約１ｍｇの用量の組成物がｉｎ ｖｉｖｏで投与されることが考えられ得る。例えば、体重ｋｇあたり、ｉｎ ｖｉｖｏで約０．０１〜０．０５ｍｇ、０．０５〜０．１０ｍｇ、０．１０〜０．２０ｍｇ、０．２０〜０．３０ｍｇ、０．３０〜０．５０ｍｇ、０．５０〜０．７０ｍｇ、または０．７０〜１ｍｇ投与される組成物の用量が投与され得る。濃度は、当該数値範囲内のすべての整数値から選択され得るが、これらに限定されない。組成物は、投与の対象の年齢、健康、体重、併用療法の種類、該当する場合は治療の頻度、所望の効果の特徴などを考慮して適宜処方され得る。
【0821】
投与量は更に、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、抗原性を強化するアジュバント、免疫賦活化合物もしくは分子、および／または、当技術分野において周知の他の化合物を含み得る。本明細書のアジュバントは、サイトカインなどの免疫調節分子、副刺激分子、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫調節ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み得る。そのような投薬は、当業者が容易に確認できる。
【0822】
投薬は更に、１または複数の医薬的に許容可能な塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸塩などの無機塩、および、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を含み得る。追加的に、投薬は、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、着香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤などを含み得る。追加的に、剤形が再構成可能な形態であるとき、１または複数の典型的な医薬成分、例えば、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、抗酸化剤、固化防止剤、賦形剤、キレート剤、コーティング剤、化学安定剤なども存在し得る。適切な成分の例には、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェネチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、および、それらの組み合わせが含まれる。
【0823】
本明細書によって開示される更に別の実施形態は、過剰増幅反復配列を特徴とする遺伝子を含む細胞に、遺伝子操作のための組成物を投与する段階を含む治療方法である。細胞は上記の通りである。
【0824】
過剰増幅反復配列を特徴とする遺伝子は、遺伝子の１つの領域における反復配列過剰増幅を有し得る。
【0825】
遺伝子は、例えば、ＨＴＴ遺伝子、ＦＭＲ１遺伝子、ＦＭＲ２遺伝子、ＦＲＤＡ遺伝子、ＤＭＰＫ／ＳＩＸ遺伝子、ＺＮＦ９遺伝子、ＳＣＡ８遺伝子、ＡＴＸＮ１０遺伝子、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ遺伝子、ＣＳＴＢ遺伝子、ＴＣＦ４遺伝子、Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子、ＡＩＢ１遺伝子、ＫＣＮＮ３遺伝子、ＣＢＦＡ１遺伝子、ＣＯＭＰ遺伝子、ＡＲ遺伝子、ＪＰＨ３遺伝子、ＤＲＰＬＡ遺伝子、ＡＴＸＮ１遺伝子、ＡＴＸＮ２遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子、ＡＴＸＮ７遺伝子、ＴＢＰ遺伝子、ＰＡＢＰＮ１遺伝子、ＨＯＸＤ１３遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＨＯＸＡ１３遺伝子、ＺＩＣ２遺伝子、ＦＯＸＬ２遺伝子、ＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子、ＳＯＸ３遺伝子、ＡＲＸ遺伝子のうち任意の１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0826】
遺伝子１つの領域は、例えば、エクソン、イントロン、３'‐ＵＴＲ、５'‐ＵＴＲ、および、ポリアデニル化シグナル配列のうち任意の１または複数であり得るが、これらに限定されない。
【0827】
過剰増幅反復配列は、反復配列の重複を含む第１反復部分と、反復配列の過剰重複を含む第２反復部分とを含み、第１反復部分は、病的対象および通常の対象に含まれ、第２反復部分は通常の対象に含まれない。
【0828】
第１反復部分および第２反復部分は、特定のアミノ酸配列の反復をコードする核酸配列であり得る。
【0829】
特定のアミノ酸配列の反復を有するポリペプチドは、第１反復部分および第２反復部分から翻訳され得る。
【0830】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子が、遺伝子操作のための組成物によって人工的に操作される効果を提供することが可能である。
【0831】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数であり得る。
【0832】
遺伝子操作のための組成物は、過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現を低減する効果を提供し得る。
【0833】
例えば、遺伝子操作のための組成物は、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現を低減する効果を提供し得る。
【0834】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列の転写伸長因子の発現の低減であり得る。例えば、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列の転写伸長因子の発現の低減であり得る。
【0835】
過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列の発現を低減し得る。過剰増幅反復配列の発現を調節する遺伝子の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現を低減し得る。
【0836】
例えば、ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列の発現を低減し得る。ＳＰＴ４遺伝子、ＳＰＴ５遺伝子、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子のうち任意の１または複数の発現の低減は、過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現を低減し得る。
【0837】
過剰増幅反復配列における第２反復部分の発現の低減は、核酸配列からのｍＲＮＡの転写を低減し得る。
【0838】
本明細書によって開示される更に別の実施形態は、患者の疾患を治療するための方法であり、当該方法は、上述の遺伝子操作のための組成物を、それを必要とする患者に投与する段階を含む。疾患は、過剰増幅反復配列によって生じる疾患であり得る。
【0839】
過剰増幅反復配列によって生じる疾患の具体例には、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン病様２、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＡＲＸ変異によって生じるＸ連鎖性精神遅滞（ＸＬＭＲ）フックス角膜ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症２型、手足性器症候群（ＨＦＧＳ）、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞などが含まれるが、これに限定されない。治療される疾患は、以下の反復配列増幅単位を含み得る。
【0840】
３ヌクレオチド反復配列の過剰増幅によって生じる疾患として、３ヌクレオチド反復配列は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐、または、ＧＣＴ‐ヌクレオチド配列の反復を含み得る。４ヌクレオチド反復配列の過剰増幅によって生じる疾患として、４ヌクレオチド反復配列は、ＣＣＴＧ‐ヌクレオチド配列の反復を含み得る。５ヌクレオチド反復配列の過剰増幅によって生じる疾患として、５ヌクレオチド反復配列は、ＡＴＴＣＴ‐またはＴＧＧＡＡ‐ヌクレオチド配列の反復を含み得る。６ヌクレオチド反復配列の過剰増幅によって生じる疾患として、６ヌクレオチド反復配列は、ＧＧＣＣＴＧ‐またはＧＧＧＧＣＣ‐ヌクレオチド配列の反復を含み得る。１２ヌクレオチド反復配列の過剰増幅によって生じる疾患として、１２ヌクレオチド反復配列は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ‐ヌクレオチド配列の反復を含み得るが、ヌクレオチド反復配列はこれらに限定されない。
【0841】
過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子が、本明細書によって開示される遺伝子操作のための組成物によって人工的に操作および調節されるとき、動物細胞の生存、増殖、および／または持続性、細胞毒性などが改善され得る。更に、本明細書によって開示される医薬組成物、および、医薬組成物を使用する治療方法を通じて、過剰増幅反復配列を含む特定の遺伝子によって生じる遺伝性疾患を緩和または治療することが可能である。以下に、実施例を参照しつつ本発明についてさらに詳細に記載する。
【0842】
例は、本発明を更に詳細に説明するために提供されるに過ぎず、本発明の範囲が以下の例に限定されないことは当業者にとって明らかであろう。
【0843】
［例１ ｇＲＮＡの設計および合成］［１‐１．ｓｇＲＮＡの設計］
ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子（ＳＵＰＴ４Ｈ１；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００３１６８）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域、および、マウスＳｕｐｔ４ａ遺伝子（ＳＵＰＴ４ａ；ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００９２９６）が、ＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）を使用して選択された。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的領域として、ヒトゲノムにおけるオンターゲット領域を除き、０、１、または２ｂｐのミスマッチを有しないＤＮＡ配列がｓｇＲＮＡ標的領域として選択された。
【0844】
［１‐２．ｓｇＲＮＡの合成］２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニールして延長することによって、ｓｇＲＮＡ合成のための鋳型をＰＣＲ増幅した。
【0845】
使用された標的領域配列、標的領域配列を増幅するために使用されたプライマー、および、生成されたｓｇＲＮＡによって標的化された標的ＤＮＡ配列をテーブル３からテーブル８にまとめた。
【0846】
鋳型ＤＮＡ（標的配列の３'末端の「ＮＧＧ」を除く）のために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実行し、製造元の指示に従ってＲＮＡを合成し、その後、ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用することによって鋳型ＤＮＡを除去した。転写されたＲＮＡは、Ｅｘｐｉｎ Ｃｏｍｂｏキット（ＧｅｎｅＡｌｌ）およびイソプロパノール沈殿によって精製した。
【0847】
［１‐３ ＣｊＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶベクターの構築］核移行シグナル（ＮＬＳ）およびそのＣ末端にＨＡタグエピトープを有する小さい改変を起こしたカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）に由来するヒトコドン最適化ＣｊＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをＡＡＶ逆位末端反復ベースベクタープラスミドで送達した。
【0848】
ｓｇＲＮＡ転写をＵ６プロモーターによって誘導し、ＣｊＣａｓ９および赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）の発現をＥＦＳプロモーターによって調節した。ＡＡＶベクターを各ｓｇＲＮＡのスクリーニングに使用した。
【0849】
［例２ 細胞株の培養］［２‐１．細胞株および培地］
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｗｅｌｇｅｎｅ）、１×ペニシリンおよびストレプトマイシンを加えた高濃度グルコースと共に、ヒトＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）細胞株およびマウスＮＩＨ‐３Ｔ３線維芽細胞株をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。
【0850】
［２‐２．Ｅ１２．５ ＹＡＣ１２８マウスの前脳由来神経幹細胞の構築］ハンチントン病モデルマウスであるＹＡＣ１２８ ＨＤトランスジェニックマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州、米国）から購入した。ＹＡＣ１２８ ＨＤトランスジェニックマウス（ＦＶＢＮ／ＮＪバックグラウンド系統）を繁殖および交配させた。前脳由来神経幹細胞（ＮＳＣ）を１２．５日（胎生期１２．５；Ｅ１２．５）のＹＡＣ１２８ ＨＤトランスジェニックマウスおよび野性型マウスの胚脳から取得した。神経幹細胞を構築するために小さい改変を実行した。
【0851】
簡潔に説明すると、マウスの前脳組織を除去し、メスを使用して、非常に小さい断片が残るまで、１〜２分間切り刻み、次に、３７℃で５分間にわたって０．５％トリプシンＥＤＴＡで処理した。その後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｗｅｌｇｅｎｅ）、１×ペニシリン、ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭベース培地において細胞を解離させた。その後、１５μｇ／ｍＬのポリＬオルニチン（ＰＬＯ、Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）および１μｇ／ｍＬのフィブロネクチン（ＦＮ、Ｓｉｇｍａ）で被覆した組織培養ペトリ皿に細胞を塗布した。１日後、培地を、１００×Ｎ２添加物、３００ｍＭ Ｄ‐グルコース、２００ｍＭ Ｌ‐グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ β‐メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬ上皮増殖因子（ＥＧＦ）、１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含むＮＳＣ完全培地と交換した。
【0852】
その後、細胞の増殖が安定化したとき、ＰＳＡ‐ＮＣＡＭ＋マイクロビードを使用して磁気選別を実行し、次に、精製された神経前駆細胞を取得した。５％ＣＯ２加湿インキュベータにおいて、ＮＳＣを３７℃に維持し、１×ｔｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ （Ｇｉｂｃｏ）を使用して反復的に継代培養した。本実験の前に、２４ウェルプレートの個々に被覆されたウェル（１×１０４細胞／ウェル）、または、６０ｍｍ培養皿（３×１０５細胞／培養皿）において細胞を継代培養した。
【0853】
［２‐３．Ｅ１２．５ ＹＡＣ１２８マウスの神経幹細胞の神経細胞への分化］ＮＳＣのニューロンへの分化のために、ＰＬＯ／ラミニン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で被覆した培養皿またはプレートを準備した。上記の２‐２の培養において、上皮増殖因子が除去される条件に培養条件を変更し、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を徐々に減少させた。簡潔に説明すると、分化は以下の手順で進行した。
【0854】
ＥＵＲＯＭＥＤ−Ｎ培地を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２の培地：ニューロン細胞培地＝１：１で置換し、交換した培地を分化培地として使用した。分化培地は、２００×Ｎ２添加物、１００×Ｂ２７、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭ βメルカプトエタノール、３ｍＭ Ｄ‐グルコース、２ｍＭ Ｌ‐グルタミンを含む。ＢＤＮＦの代わりに、増殖因子ＮＧＦを神経誘導のために使用した。分化段階において、神経分化は、ＮＧＦ（２００ｎｇ／ｍＬ）およびｂＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた分化培地において、最初の３日間にわたって実行した。次の３日間では、神経分化は、ＮＧＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）およびｂＦＧＦ−２（６．７ｎｇ／ｍＬ）を加えた分化培地において実行した。分化の７日後、細胞を蛍光抗体法およびウエスタンブロットのために使用した。
【0855】
［例３ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の導入］［３‐１．ＳｐＣａｓ９‐ｇＲＮＡトランスフェクション］
ＣＲＩＳＰＲ／ＳｐＣａｓ要素で上述の細胞をトランスフェクションするために、１５分間にわたって室温で、１ｇのｓｇＲＮＡと共に、４μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ）を培養することによってＲＮＰ複合体を形成した。その後、１０μＬ電気穿孔チップを用いて、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＮＰ複合体を２×１０５個の細胞に電気穿孔した。標的ディープシーケンシングのために、トランスフェクションの４８時間後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を回収した。
【0856】
［３‐２．ＣｊＣａｓ９‐ｇＲＮＡトランスフェクション］上述の細胞をＣＲＩＳＰＲ／ＣｊＣａｓ９要素でトランスフェクトするべく、１０μＬ電気穿孔チップを用いて、Ｎｅｏｎ（登録商標）エレクトロポレーター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ｓｇＲＮＡおよびＣｊＣａｓ９の各々を送達するＡＡＶプラスミドを電気穿孔した。標的ディープシーケンシングのために、トランスフェクションの４８時間後、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を回収した。
【0857】
［例４ ＳＰＴ４遺伝子を標的化する遺伝子はさみのスクリーニング］
【0858】
［４‐１．標的ディープシーケンシング］トランスフェクトされた細胞からｇＤＮＡを抽出し、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）（テーブル３）を使用して、特定のプライマー（配列識別番号２５〜４２）でオンターゲット領域をＰＣＲ増幅した。
［テーブル３］
ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子、ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子のオンターゲット領域特異的プライマー配列
【表3】
【0859】
その後、ＰＣＲの結果生成されたＰＣＲアンプリコンを、Ｍｉ−Ｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してペアエンドディープシーケンシングにかけた。ディープシーケンシングからのデータを、オンラインのＣａｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒツール（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ）を使用して解析した。ＰＡＭ配列から３ｂｐ上流の領域におけるインデルを、Ｃａｓ９によって生じた変異とみなした。
【0860】
［４‐２．ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子のための標的ディープシーケンシング］ｓｇＲＮＡは、オフターゲットがｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースによって最小化された配列を有するヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子の標的配列を標的化するＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９のための遺伝子はさみを選択および設計することによって合成された（テーブル４および５）。その後、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞株における遺伝子はさみによって生じたインデル効率（％）がスクリーニングされた（図１）。
【0861】
以下のテーブル４および５の各々は、ＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列、および、ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子のｓｇＲＮＡ配列の例を開示する。［テーブル４］
［ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例］
【表4】
ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子を標的化するＣｊＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例
【表5】
【0862】
［４‐３．Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子のための標的ディープシーケンシング］マウスＳｕｐｔ４ａ遺伝子の標的配列を標的化する、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９のためのｓｇＲＮＡは、オフターゲットがｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースによって最小化された配列で選択および設計することによって合成された（テーブル６および７）。その後、マウスＣ５７ＢＬ／６細胞株における遺伝子はさみによって生じるインデル効率（％）をスクリーニングした（図２）。
【0863】
以下のテーブル６および７の各々は、マウスＳｕｐｔ４ａ遺伝子の標的配列を標的化するためのＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列およびＣｊＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例を開示する。［テーブル６］
Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例
【表6】
Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＣｊＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例
【表7】
【0864】
［４‐４．ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子のための標的ディープシーケンシング］マウスＳｕｐｔ４ａ遺伝子の標的配列を標的化する、ＳｐＣａｓ９およびＣｊＣａｓ９のためのｓｇＲＮＡは、オフターゲットがｉｎ ｓｉｌｉｃｏベースによって最小化された配列で選択および設計することによって合成された（テーブル８および９）。その後、マウスＦＶＢ／ＮＪ細胞株における遺伝子はさみによって生じるインデル効率（％）をスクリーニングした（テーブル３）。
【0865】
以下のテーブル８および９の各々は、マウスＳｕｐｔ４ａ遺伝子の標的配列を標的化するためのＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列およびＣｊＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例を開示する。［テーブル８］
ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例
【表8】
ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＣｊＣａｓ９のｓｇＲＮＡ配列の例
【表9】
【0866】
［例５ ＦＶＢ／ＮＪマウス（ＹＡＣ１２８）細胞に対する細胞毒性アッセイ］マウスＦＶＢ／ＮＪにおけるハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞におけるｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用して、３継代の間に、ｍＲｏｓａ２６のリーディングフレームの改変が生存に対して選択的効果を及ぼしたかどうかを確認した。
【0867】
マウスＦＶＢ／ＮＪにおけるハンチントン病マウスモデル（ＹＡＣ１２８）の初代神経幹細胞におけるＳｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを使用して、３継代の間に、Ｓｕｐｔ４ａのリーディングフレームの改変が生存に対して選択的効果を及ぼしたかどうかを確認した。
【0868】
ｍＲｏｓａ２６遺伝子（対照）を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみ、または、Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９遺伝子はさみを適用した後に、細胞を３回継代培養した。その後、３回継代培養した各細胞からゲノムＤＮＡを回収することによって標的ディープシーケンシングを実行した。シーケンシング読み取りにおいて、フレーム内インデルおよびフレーム外インデルの数を決定し、割合を計算した。３継代の間、フレーム外インデルおよびフレーム内インデルの比が大幅に変更されたケースは、遺伝子ノックアウトによって生じた細胞毒性とみなした。
【0869】
［例６ ＦＶＢ／ＮＪマウス（ＹＡＣ１２８）細胞のための免疫染色］［６‐１．ウエスタンブロット］
ＮＳＣおよび分化ニューロンを氷冷ＲＩＰＡバッファに溶解した。その後、溶解物を遠心分離し（２０分、１４０００ｇ、４℃）、その上清を新しいチューブに移した。ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を使用してタンパク質を解析した。等量のタンパク質（２０〜５０μｇ）を８〜１２％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにロードした。単離タンパク質を電気泳動によってフッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベドフォード、マサチューセッツ州、米国）に移した。２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ＴＮＥ）を含むトリス緩衝生理食塩水で膜を洗浄し、５％スキムミルクを含むＴＮＥにおいて１時間にわたってブロックした。膜を一次抗体、１Ｃ２（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＥＭ４８（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｓｐｔ４（１：１０００、Ｂｉｏｒｂｙｔ）と共に４℃で一晩培養した。その後、室温で１時間にわたって二次抗体（１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ、アーバイン、カリフォルニア州、米国）と共に膜を培養し、再度洗浄した。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベドフォード、マサチューセッツ、米国）を使用してブロッティングを実行した。定量的解析のために、免疫ブロットバンドの濃度をＩｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して測定した。
【0870】
［６‐２．蛍光抗体法］４ウェルプレートにおいて、ＰＬＯ／ラミニン（５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）で被覆された１２ｍｍ円状カバーガラスでＮＳＣおよび分化ニューロンを調製した。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間にわたって４％パラホルムアルデヒドにおいて固定した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を含む１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１Ｘ ＰＢＳにおいて、室温条件で３０分間培養した。その後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１Ｘ ＰＢＳで細胞を３回洗浄した。洗浄後、細胞を一次抗体、１Ｃ２（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＥＭ４８（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｓｐｔ４（１：１００、Ｂｉｏｒｂｙｔ）と共に４℃で一晩培養した。次に、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１Ｘ ＰＢＳで細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−５５５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｗｙｍａｎ、マサチューセッツ州、米国）およびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｗｙｍａｎ、マサチューセッツ州、米国）を含む適切な二次抗体と共に培養した。Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＬＳＭ８８０共焦点走査型レーザ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、イェーナ、ドイツ）を使用して、染色細胞を確認した。
【0871】
［配列表フリーテキスト］過剰増幅反復配列の発現調節遺伝子の標的配列を記載する。
【0872】
ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子、ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子のオンターゲット部位特異的プライマー配列を記載する。
【0873】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2020年2月17日
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子の核酸配列における１または複数の標的配列を標的化することが可能なガイド核酸であって、
前記１または複数の標的配列に対して相補結合を形成可能な１または複数のガイドドメインと、
第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメインから成る群から選択される１または複数のドメインと
を含み、
前記１または複数の標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子のエクソン１領域に存在する、
ガイド核酸。
前記１または複数の標的配列に対して相補結合を形成可能な１または複数のガイドドメインと、
第１相補ドメイン、リンカドメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメインから成る群から選択される１または複数のドメインと
を含み、
前記１または複数の標的配列は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈ遺伝子から成る群から選択される１または複数の遺伝子のエクソン１領域に存在する、
ガイド核酸。
【請求項2】
前記ガイド核酸の前記１または複数の標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の核酸配列における配列識別番号１〜２４から成る群から選択される１または複数である、請求項１に記載のガイド核酸。
【請求項3】
前記ガイド核酸の前記１または複数の標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の前記核酸配列における配列識別番号１〜２、１４〜１５、および１７から成る群から選択される１または複数である、請求項１に記載のガイド核酸。
【請求項4】
請求項１に記載のガイド核酸、または、それをコードする核酸配列と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列と
を含む遺伝子操作用組成物。
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸配列と
を含む遺伝子操作用組成物。
【請求項5】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレブトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数を含む、請求項４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項6】
前記ガイド核酸の前記１または複数の標的配列は、ＳＵＰＴ４Ｈ遺伝子の前記核酸配列における配列識別番号１〜２、１４〜１５、および１７から成る群から選択される１または複数である、請求項４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項7】
前記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項8】
前記遺伝子操作用組成物は、ウイルスベクターのシステムに含まれる、請求項４に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項9】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項８に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項10】
反復伸長疾患の治療に使用するための、請求項４から９のいずれか一項に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項11】
前記反復伸長疾患は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳変性（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ症候群、ＸＬＭＲ、フックス角膜内皮ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうち１または複数である、請求項１０に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項12】
前記反復伸長疾患はハンチントン病（ＨＤ）である、請求項１０に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項13】
前記遺伝子操作用組成物は、皮下、皮内、眼内、硝子体内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、または腹腔内に投与され、
前記遺伝子操作用組成物は、注射、輸血、またはインプラントによって適用される、
請求項１０に記載の遺伝子操作用組成物。
前記遺伝子操作用組成物は、注射、輸血、またはインプラントによって適用される、
請求項１０に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項14】
前記遺伝子操作用組成物は、ウイルスベクターのシステムに含まれる、請求項１０に記載の遺伝子操作用組成物。
【請求項15】
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから選択される１または複数を含む、請求項１４に記載の遺伝子操作用組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0222】
近位ドメインは、その中に相補的塩基配列を有し得て、相補的塩基配列に起因して二本鎖に形成され得る。近位ドメインは、１〜２０塩基配列であり得る。一例として、近位ドメインは、１〜２０、５〜２０、１０〜２０または１５〜２０塩基配列であり得る。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0223】
別の例において、近位ドメインは、１〜５、５〜１０、１０〜１５、または１５〜２０塩基配列であり得る。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0872】
ヒトＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子、Ｃ５７Ｂｌ／６ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子、ＦＶＢ／ＮＪ ＭＯＵＳＥ Ｓｕｐｔ４ａ遺伝子のオンターゲット部位特異的プライマー配列を記載する。（項目１）
反復伸長の発現を低減するために人工的に設計された遺伝子を含む、反復伸長の発現を調節するためのシステムであって、
上記人工的に設計された遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子を含み、
上記人工的に設計された遺伝子は、そのゲノムにおいて人工的変異を含み、
上記人工的に設計された遺伝子は、機能異常である、または、発現が低減された遺伝子を含み、
上記遺伝子の発現の上記低減は、その発現産物の量が、人工的に設計されていない遺伝子と比較して低減または抑制されることを特徴とする、
システム。
（項目２）
上記ＳＵＰＴ４ＨはＳＵＰＴ４Ｈ１遺伝子を含む、反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目３）
上記遺伝子の上記人工的変異は、１または複数のヌクレオチドの欠失、置換または挿入のうち少なくとも１つを含む、反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目４）
上記反復伸長は、
上記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
上記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
上記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
上記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の発現の上記調節は、上記第２反復部分の発現減少を含む、
反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目５）
反復伸長の上記発現は、転写、転写後処理、翻訳、翻訳後修飾から成る群から選択される少なくとも１つである、反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目６）
上記反復伸長は、
上記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
上記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
上記第１および第２反復部分は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
から選択される１または複数の反復伸長を含む、反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目７）
上記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
上記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
上記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
上記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
上記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
反復伸長変異の発現を調節するための、項目６に記載のシステム。
（項目８）
上記反復伸長の発現は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞、のうちから選択される１または複数の障害の原因である、反復伸長変異の発現を調節するための、項目１に記載のシステム。
（項目９）
反復伸長の発現を低減するための遺伝子操作用組成物であって、
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
上記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子である、
遺伝子操作用組成物。
（項目１０）
上記遺伝子操作は、ヌクレオチドの欠失、置換、または挿入である１または複数の改変を含む、項目９に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１１）
上記遺伝子操作用組成物は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、
１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、項目９に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１２）
上記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
上記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
上記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
上記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
上記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
項目１１に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１３）
上記遺伝子操作用組成物は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうちから選択される１または複数の障害を治療するための組成物である、項目９に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１４）
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される１または複数の遺伝子の標的配列に対するガイド核酸を含む遺伝子操作用組成物。
（項目１５）
上記遺伝子操作用組成物は、上記エディタータンパク質、または、それをコードする核酸を含み、
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される１または複数のタンパク質を含む、
項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１６）
上記標的配列は、プロモーター領域、イントロン領域、エクソン領域、エンハンサー領域、３'‐ＵＴＲ（未翻訳領域）、５'‐ＵＴＲから選択される遺伝子の１または複数の領域に存在する、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１７）
上記標的配列は遺伝子のエクソン領域に存在する、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１８）
上記標的配列は、上記遺伝子を構成する核酸配列におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列の５'末端および／または３'末端に隣接する連続の１０ｂｐ〜２５ｂｐヌクレオチド配列領域に存在するヌクレオチド配列である、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目１９）
上記ＰＡＭ配列は、
ＮＧＧ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＮＮＲＹＡＣ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＮＮＡＧＡＡＷ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＷはＡまたはＴ）、
ＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）、
ＮＮＧＲＲ（Ｔ）（Ｎは各々独立に、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、ＲはＡまたはＧ、ＹはＣまたはＴ）、
ＴＴＮ（ＮはＡ、Ｔ、ＣまたはＧ）
の配列（５'から３'の方向に記載）から成る群から選択される少なくとも１つを含む、
項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２０）
上記標的配列は、配列識別番号１〜２４から成る群から選択される１または複数の配列である、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２１）
上記標的配列は、配列識別番号１、２、１４、１５、１６、１７から成る群から選択される１または複数の配列である、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２２）
上記組成物は、
配列識別番号１、２、８〜１０、および、１４〜２０から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、項目１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２３）
上記組成物は、
配列識別番号３〜７、１１〜１３、および、２１〜２４から選択される１または複数の配列のガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、または、それをコードする核酸と
を含む、項目１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２４）
上記ガイド核酸は、上記遺伝子の標的配列に対して相補結合を形成可能なガイドドメインを含み、
上記相補結合は、０〜５個のミスマッチ結合を含む、
項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２５）
上記ガイドドメインは、上記遺伝子の標的配列に対する相補ヌクレオチド配列を含み、
上記相補ヌクレオチド配列は０〜５個のミスマッチを含む、
項目２４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２６）
上記ガイド核酸は、第１相補ドメイン、リンカードメイン、第２相補ドメイン、近位ドメイン、尾部ドメインから成る群から選択される少なくとも１つのドメインを含む、項目１４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２７）
上記ガイド核酸および上記エディタータンパク質は、それぞれ、それらをコードするＤＮＡの形態である、項目１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２８）
上記ＤＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターの形態で含まれる、項目２７に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目２９）
上記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、項目２８に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３０）
上記エディタータンパク質をコードする上記核酸は、ｍＲＮＡの形態で提供される、項目１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３１）
上記エディタータンパク質は、ポリペプチドまたはタンパク質の形態である、項目１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３２）
上記組成物はガイド核酸‐エディタータンパク質複合体の形成である、項目１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３３）
上記組成物は、
３ヌクレオチド反復伸長、
４ヌクレオチド反復伸長、
５ヌクレオチド反復伸長、
６ヌクレオチド反復伸長、１２ヌクレオチド反復伸長
によって生じる任意の１または複数の障害を治療するための組成物である、項目１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３４）
上記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
上記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
上記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
上記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
上記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
項目３４に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３５）
上記組成物は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうち１または複数の疾患を治療するための組成物である、項目１４または１５に記載の遺伝子操作用組成物。
（項目３６）
組成物を対象に投与する段階を含む反復伸長疾患治療方法であって、
上記組成物は、活性成分として遺伝子操作組成物を含み、
上記遺伝子操作組成物は、反復伸長の発現を低減するためのものであり、
上記遺伝子操作組成物は、Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＦｏｋＩ、または、エンドヌクレアーゼを含み、
上記遺伝子は、ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子である、
反復伸長疾患治療方法。
（項目３７）
組成物を対象に投与する段階を含む反復伸長疾患治療方法であって、
上記組成物は、活性成分として、遺伝子操作用組成物を含み、
上記遺伝子操作用組成物は
ＳＰＴ４、ＳＰＴ５、ＳＵＰＴ４Ｈ、ＳＵＰＴ５Ｈから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的配列に対するガイド核酸と、
エディタータンパク質、または、それをコードする核酸と
を含み、
上記エディタータンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質、カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・サーモフィラス由来Ｃａｓ９タンパク質、ストレプトコッカス・アウレウス由来Ｃａｓ９タンパク質、ナイセリア・メニンジティディス由来Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質から成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、
反復伸長疾患治療方法。
（項目３８）
上記標的配列は、配列識別番号１〜２４から成る群から選択される少なくとも１つの標的配列である、項目３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目３９）
上記遺伝子操作用組成物は、
配列識別番号１、２、８〜１０、１４〜２０から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、項目３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４０）
上記遺伝子操作用組成物は、
配列識別番号３、７、１１〜１３、２１〜２４から選択される少なくとも１つの配列に対するガイド核酸と、
カンピロバクター・ジェジュニ由来Ｃａｓ９タンパク質と
を含む、項目３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４１）
上記組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ナノ粒子、タンパク質移行ドメイン（ＰＴＤ）法のうち１または複数によって投与される、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４２）
上記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスから成る群から選択される少なくとも１つである、項目４１に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４３）
上記ガイド核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの形態で細胞に送達され、
上記エディタータンパク質はポリペプチドの形態で細胞に送達される、または、上記エディタータンパク質をコードする核酸はＤＮＡの形態で細胞に送達される、
項目３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４４）
対象への上記投与方法は、電気穿孔、注射、輸血、インプラント、移植から選択される１または複数の方法である、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４５）
上記投与は局部的または局所的に実行される、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４６）
上記投与は、皮下、皮内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内、リンパ内、または腹腔内の方法で実行される、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４７）
上記対象への局部的または局所的投与は、上記対象の
腎臓、
胃、膵臓、十二指腸、回腸および／または結腸を含む消化器系、
心臓、肺、
脳、特にニューロンおよび／または一般に中枢神経系、
網膜組織を含む目、
内耳を含む耳、
皮膚、
筋肉、
骨、
肝臓
のうち少なくとも１つの臓器に対して実行される、項目４６に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４８）
上記対象は、ヒト、サル、マウス、ラットを含む哺乳動物である、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目４９）
上記反復伸長は、
上記反復配列の重複を含む第１反復部分と、
上記反復配列の過剰重複を含む第２反復部分と
を含み、
上記第１反復部分は、障害のある対象および通常の対象に含まれ、
上記第２反復部分は通常の対象に含まれず、
反復伸長の上記治療は、上記第２反復部分の発現の減少を含む、
項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目５０）
上記反復伸長疾患は、３ヌクレオチド反復伸長、４ヌクレオチド反復伸長、５ヌクレオチド反復伸長、６ヌクレオチド反復伸長、１２ヌクレオチド反復伸長によって生じる１または複数の疾患である、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目５１）
上記３ヌクレオチド反復伸長は、ＣＡＧ‐、ＣＣＧ‐、ＣＴＧ‐、ＣＧＧ‐、ＧＡＡ‐、ＧＡＣ‐、ＧＣＧ‐、ＧＣＡ‐、ＧＣＣ‐およびＧＣＴ‐反復伸長であり、
上記４ヌクレオチド反復伸長はＣＣＴＧ反復伸長であり、
上記５ヌクレオチド反復伸長は、ＡＴＴＣＴ‐およびＴＧＧＡＡ‐反復伸長から選択される１または複数の反復伸長であり、
上記６ヌクレオチド反復伸長は、ＧＧＣＣＴＧ‐およびＧＧＧＧＣＣ‐反復伸長から選択された１または複数の反復伸長であり、
上記１２ヌクレオチド反復伸長は、ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ反復伸長である、
項目５０に記載の反復伸長疾患治療方法。
（項目５２）
上記反復伸長疾患は、ハンチントン病（ＨＤ）、ハンチントン類縁疾患２型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱ＸＥ精神遅滞、ＸＬＭＲ、フックス角膜ジストロフィー、フリートライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）、筋強直性ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（Ｃ９ｏｒｆ７２変異）、鎖骨頭蓋骨異形成症、眼球咽頭型筋ジストロフィー、合多指症型２、手足性器症候群、全前脳胞症、眼瞼裂狭小症候群、先天性中枢性低換気症候群、成長ホルモン欠乏症を伴う精神発達遅滞のうち少なくとも１つである、項目３６または３７に記載の反復伸長疾患治療方法。
【国際調査報告】