特表 2020-530858 肝疾患を治療する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-530858(P2020-530858A)

(43)【公表日】2020年10月29日

(54)【発明の名称】肝疾患を治療する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20201002BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201002BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/53 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/7076 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/551 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/661 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/5386 20060101ALI20201002BHJP

   A61K 31/529 20060101ALI20201002BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20201002BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20201002BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   A61P43/00 111

   A61P1/16ZNA

   A61K31/5377

   A61K31/519

   A61K31/53

   A61K31/7076

   A61K31/18

   A61K31/551

   A61K31/661

   A61K31/5386

   A61K31/529

   C12N15/12

   C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】122

(21)【出願番号】特願2020-509450(P2020-509450)

(86)(22)【出願日】2018年8月14日

(85)【翻訳文提出日】2020年3月30日

(86)【国際出願番号】US2018046634

(87)【国際公開番号】WO2019036430

(87)【国際公開日】20190221

(31)【優先権主張番号】62/544,968

(32)【優先日】2017年8月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/653,744

(32)【優先日】2018年4月6日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520051908

【氏名又は名称】キャンプ４ セラピューティクス コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】バムクロット デイビッド エイ．

(72)【発明者】

【氏名】セーガル アルフィカ

(72)【発明者】

【氏名】シゴバ アラ

(72)【発明者】

【氏名】シュワルツ ブライアン エリオット

(72)【発明者】

【氏名】ウィッセル ギャビン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065BA30

4B065BD21

4B065CA44

4C084AA17

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZC021

4C084ZC022

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC73

4C086CB05

4C086CB22

4C086CB30

4C086DA38

4C086EA18

4C086GA02

4C086GA07

4C086GA12

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA75

4C086ZC02

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA11

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206MA86

4C206NA14

4C206ZA75

4C206ZC02

(57)【要約】

本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び／またはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）などのＰＮＰＬＡ３に関連する１つ以上の病態を有する患者を治療するための方法及び組成物を提供する。遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することによって、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整するための方法及び組成物もまた提供される。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）関連障害を有する対象を治療する方法であって、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる有効量の化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。

【請求項2】

前記化合物が、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＢＭＬ−２７５、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＭＬ３４７、ＳＩＳ３、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記化合物が、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記化合物が、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＡＺＤ８０５５、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＣ−２２３、クリソファン酸、ＣＺ４１５、ダクトリシブ（ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＧＤＣ−０３４９、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＩＮＫ１２８（ＭＬＮ０１２８）、ＫＵ−００６３７９４、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩ−１０３、ＰＰ１２１、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−８６６９）、ＳＦ２５２３、タクロリムス（ＦＫ５０６）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ６８３８６４）、トリン１、トリン２、トリキニブ（ＰＰ２４２）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ２０１４）、ボクスタリシブ（Ｖｏｘｌａｌｉｓｉｂ）（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９）、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記化合物が、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記化合物が、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記化合物が、Ｒ７８８、タマチニブ（Ｒ４０６）、エントスプレチニブ（ｅｎｔｏｓｐｌｅｔｉｎｉｂ）（ＧＳ−９９７３）、ニルバジピン、ＴＡＫ−６５９、ＢＡＹ−６１−３６０６、ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−０６０３１８、ＰＲＴ０６２６０７（Ｐ５０５−１５、ＢＩＩＢ０５７）、ＰＲＴ２７６１、ＲＯ９０２１、セルデュラチニブ（ｃｅｒｄｕｌａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ（ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ）、ＴＧＲ−１２０２、ＧＳ−９８２０、ＡＣＰ−３１９、ＳＦ２５２３、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記化合物が、Ｒ７８８、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記化合物が、ＧＳＫ３経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記化合物が、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記化合物が、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記化合物が、ＡＣＨＰ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ１１−７０８５、Ｂａｙ１１−７８２１、ベンガミドＢ、ＢＩ６０５９０６、ＢＭＳ３４５５４１、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ１２、セラストロール、ＣＩＤ２８５８５２２、ＦＰＳ ＺＭ１、グリオトキシン、ＧＳＫ３１９３４７Ａ、ホノキオール、ＨＵ２１１、ＩＫＫ１６、ＩＭＤ０３５４、ＩＰ７ｅ、ＩＴ９０１、ルテオリン、ＭＧ１３２、ＭＬ１２０Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ１３０、パルテノリド、ＰＦ１８４、ピセアタンノール、ＰＲ３９（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ１１４５ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ１０６−９９２０、ＳＣ５１４、ＳＰ１０００３０、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−１、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記化合物が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−０４９６５８４２、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ８６８、フェドラチニブ、ＡＣ４３０、ＡＴ９２８３、ａｔｉ−５０００１及びａｔｉ−５０００２、ＡＺ９６０、ＡＺＤ１４８０、ＢＭＳ−９１１５４３、ＣＥＰ−３３７７９、セルデュラチニブ（ｃｅｒｄｕｌａｔｉｎｉｂ）（ＰＲＴ０６２０７０、ＰＲＴ２０７０）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−５０９）、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３、ＴＧ１０１３４８）、ＦＬＬＬ３２、ＦＭ−３８１、ＧＬＰＧ０６３４類似体、Ｇｏ６９７６、ＪＡＮＥＸ−１（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ０１５Ｋ、ＪＮＪ−５４７８１５３２）、ＰＦ−０６６５１６００、ＰＦ−０６７００８４１、Ｒ２５６（ＡＺＤ０４４９）、ソルシチニブ（ＧＳＫ２５８６１８４もしくはＧＬＰＧ０７７８）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）、ＴＧ１０１２０９、トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、ＸＬ０１９、ＺＭ３９９２３ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記化合物が、アムバチニブ、ＢＭＳ−７５４８０７、ＢＭＳ−９８６０９４、ＬＹ２９４００２、ピフィスリン−μ、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記化合物が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ３、ＡＣＶＲ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記化合物が、前記対象におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、少なくとも約３０％低減される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記対象が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中に１つ以上の突然変異を有する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記対象が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中にＩ１４８Ｍ突然変異を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記化合物が、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現も低減する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記化合物が、ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現も低減する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

ＰＮＰＬＡ３関連障害が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ＰＮＰＬＡ３関連障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

ＰＮＰＬＡ３関連障害が、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

ＰＮＰＬＡ３遺伝子のシグナル伝達中心に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる有効量の化合物を細胞に導入することを含む、前記細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整する方法。

【請求項32】

前記１つ以上のシグナル伝達分子が、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｍｙｃ、ＯＮＥＣＵＴ２及びＹＹ１、ＴＣＦ４、ＨＩＦ１ａ、ＨＮＦ１、ＥＲａ、ＧＲ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＶＤＲ、ＮＦ−κＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、ｐ５３、ＳＭＡＤ４、ならびにＦＯＳからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記化合物が、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＢＭＬ−２７５、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＭＬ３４７、ＳＩＳ３、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項36】

前記化合物が、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項37】

前記化合物が、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＡＺＤ８０５５、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＣ−２２３、クリソファン酸、ＣＺ４１５、ダクトリシブ（ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＧＤＣ−０３４９、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＩＮＫ１２８（ＭＬＮ０１２８）、ＫＵ−００６３７９４、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩ−１０３、ＰＰ１２１、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−８６６９）、ＳＦ２５２３、タクロリムス（ＦＫ５０６）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ６８３８６４）、トリン１、トリン２、トリキニブ（ＰＰ２４２）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ２０１４）、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９）、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記化合物が、ＷＹＥ−１２５１３２、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項39】

前記化合物が、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項40】

前記化合物が、Ｒ７８８、タマチニブ（Ｒ４０６）、エントスプレチニブ（ＧＳ−９９７３）、ニルバジピン、ＴＡＫ−６５９、ＢＡＹ−６１−３６０６、ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−０６０３１８、ＰＲＴ０６２６０７（Ｐ５０５−１５、ＢＩＩＢ０５７）、ＰＲＴ２７６１、ＲＯ９０２１、セルデュラチニブ、イブルチニブ、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ、ＴＧＲ−１２０２、ＧＳ−９８２０、ＡＣＰ−３１９、ＳＦ２５２３、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記化合物が、Ｒ７８８、またはその誘導体もしくは類似体を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項42】

前記化合物が、ＧＳＫ３経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項43】

前記化合物が、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記化合物が、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項45】

前記化合物が、ＡＣＨＰ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ１１−７０８５、Ｂａｙ１１−７８２１、ベンガミドＢ、ＢＩ６０５９０６、ＢＭＳ３４５５４１、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ１２、セラストロール、ＣＩＤ２８５８５２２、ＦＰＳ ＺＭ１、グリオトキシン、ＧＳＫ３１９３４７Ａ、ホノキオール、ＨＵ２１１、ＩＫＫ１６、ＩＭＤ０３５４、ＩＰ７ｅ、ＩＴ９０１、ルテオリン、ＭＧ１３２、ＭＬ１２０Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ１３０、パルテノリド、ＰＦ１８４、ピセアタンノール、ＰＲ３９（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ１１４５ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ１０６−９９２０、ＳＣ５１４、ＳＰ１０００３０、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−１、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記化合物が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項47】

前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−０４９６５８４２、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ８６８、フェドラチニブ、ＡＣ４３０、ＡＴ９２８３、ａｔｉ−５０００１及びａｔｉ−５０００２、ＡＺ９６０、ＡＺＤ１４８０、ＢＭＳ−９１１５４３、ＣＥＰ−３３７７９、セルデュラチニブ（ＰＲＴ０６２０７０、ＰＲＴ２０７０）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−５０９）、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３、ＴＧ１０１３４８）、ＦＬＬＬ３２、ＦＭ−３８１、ＧＬＰＧ０６３４類似体、Ｇｏ６９７６、ＪＡＮＥＸ−１（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ０１５Ｋ、ＪＮＪ−５４７８１５３２）、ＰＦ−０６６５１６００、ＰＦ−０６７００８４１、Ｒ２５６（ＡＺＤ０４４９）、ソルシチニブ（ＧＳＫ２５８６１８４もしくはＧＬＰＧ０７７８）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）、ＴＧ１０１２０９、トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、ＸＬ０１９、ＺＭ３９９２３ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記化合物が、アムバチニブ、ＢＭＳ−７５４８０７、ＢＭＳ−９８６０９４、ＬＹ２９４００２、ピフィスリン−μ、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項49】

前記化合物が、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ３、ＡＣＶＲ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項50】

前記化合物が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減する、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現が、少なくとも約３０％低減される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記細胞が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中に１つ以上の突然変異を有する、請求項３１〜５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記細胞が、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中にＩ１４８Ｍ突然変異を有する、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記化合物が、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現も低減する、請求項３１〜５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記化合物が、ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現も低減する、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項３１〜５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞が、マウス細胞である、請求項５６に記載の方法。

【請求項59】

前記細胞が、肝細胞である、請求項３１〜５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

前記細胞が、肝星細胞である、請求項３１〜５８のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１４日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＬＩＶＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ」と題される米国仮特許出願第６２／５４４，９６８号、及び２０１８年４月６日出願の「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＬＩＶＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ」と題される米国仮特許出願第６２／６５３，７４４号に対する優先権を主張し、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、配列表とともに電子形式で出願されている。「ＳＥＱ＿ＬＳＴ＿２０９３１００７ＰＣＴ．ｔｘｔ」と題される配列表ファイルは、２０１８年８月１３日に作成され、サイズは３１，４４５バイトである。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0003】

発明の分野
本発明は、ヒトにおける肝疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び／またはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）を治療するために、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）を調整する化合物の使用に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、世界で最も一般的な肝障害のうちの１つである。米国では、推定８０００万人〜１億人に影響を及ぼす。ＮＡＦＬＤは、あらゆる年齢群において発生するが、特に４０代及び５０代の人々において発生する。ＮＡＦＬＤは、アルコール乱用によって引き起こされる損傷に似た肝損傷につながり得る、肝臓中の過剰な脂肪の蓄積であるが、これはアルコールをほとんどまたは全く飲まない人々において発生する。この病態はまた、増加した腹部脂肪、不良なホルモンインスリンを使用する能力、高血圧及びトリグリセリドの高血中濃度を含む、有害な代謝結果に関連する。

【0005】

場合によっては、ＮＡＦＬＤは、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）と称される肝臓の炎症につながる。ＮＡＳＨは、肝線維症につながる肝臓中の脂肪蓄積を特徴とする進行性肝疾患である。ＮＡＳＨを有する人々の約２０パーセントは、線維症に進行する。ＮＡＳＨは、米国においておよそ２６００万人に影響を及ぼす。継続した炎症を伴い、線維症は、より多くの肝組織を取り込むように広がり、ほとんどの重症例において肝臓癌及び／または末期肝不全につながる。ＮＡＳＨは、肥満、糖尿病及び関連代謝障害に高度に相関する。遺伝因子及び環境因子はまた、ＮＡＳＨの発症の一因となる。

【0006】

現在、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨに対する薬物治療は存在しない。病態は、ライフスタイルの修正（例えば、身体運動、減量、及び健康な食事）を通して主に早期に管理され、これはアドヒアランス不良に遭遇し得る。減量は、非アルコール性脂肪性肝疾患の一因となる病態に対処する。減量手術はまた、多量の体重を減少させる必要がある者に対するオプションである。高糖尿病薬、ビタミンまたは栄養補助食品は、病態を制御するために有用であり得る。ＮＡＳＨに起因する硬変を有する者には、肝移植がオプションであり得る。これは、米国における肝移植の三番目に一般的な理由であり、３年以内に最も一般的な理由になることが見込まれる。

【0007】

アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）は、西欧諸国において慢性肝疾患の大部分を占める。脂肪肝、アルコール性肝炎、及びアルコール性硬変を含む、アルコール過剰消費の肝臓発現の範囲を包含する。アルコール性肝硬変は、ＡＬＤの最も進行した形態であり、肝不全、肝細胞癌及び肝臓関連死亡原因の主な原因のうちの１つである。アルコール摂取の制限は、ＡＬＤの一次治療である。他の治療オプションとしては、支持療法（例えば、健康な食事、ビタミンサプリメント）、コルチコステロイドの使用、及び時として肝移植が挙げられる。

【0008】

したがって、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ及び／またはＡＬＤの治療のための有効な治療薬を開発する必要性がある。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ及びＡＬＤなどの肝疾患に関連している、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワーク（複数可）のマッピング及び特定を開示する。遺伝子シグナル伝達ネットワーク（複数可）の構成成分を摂動させることによって、本発明者は、ＰＮＰＬＡ３発現を調整するために利用され得る新規の標的、化合物及び／または方法を特定した。そのような方法及び組成物を使用して、ＰＮＰＬＡ３関連障害（例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨまたはＡＬＤ）のため様々な治療法を開発して、そのような疾患の症状を予防及び／または緩和することができる。

【0010】

したがって、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる有効量の化合物を対象に投与することによって、ＰＮＰＬＡ３関連障害を有する対象を治療する方法が、本明細書に提供される。そのような化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するための対象に投与される化合物は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物としては、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−０４９６５８４２、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ８６８、フェドラチニブ、ＡＣ４３０、ＡＴ９２８３、ａｔｉ−５０００１及びａｔｉ−５０００２、ＡＺ９６０、ＡＺＤ１４８０、ＢＭＳ−９１１５４３、ＣＥＰ−３３７７９、セルデュラチニブ（ｃｅｒｄｕｌａｔｉｎｉｂ）（ＰＲＴ０６２０７０、ＰＲＴ２０７０）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−５０９）、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３、ＴＧ１０１３４８）、ＦＬＬＬ３２、ＦＭ−３８１、ＧＬＰＧ０６３４類似体、Ｇｏ６９７６、ＪＡＮＥＸ−１（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ０１５Ｋ、ＪＮＪ−５４７８１５３２）、ＰＦ−０６６５１６００、ＰＦ−０６７００８４１、Ｒ２５６（ＡＺＤ０４４９）、ソルシチニブ（ＧＳＫ２５８６１８４もしくはＧＬＰＧ０７７８）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）、ＴＧ１０１２０９、トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、ＸＬ０１９、ＺＭ３９９２３ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを挙げることができる。一実施形態では、化合物は、モメロチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。一実施形態では、化合物は、パクリチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物としては、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＡＺＤ８０５５、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＣ−２２３、クリソファン酸、ＣＺ４１５、ダクトリシブ（ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＧＤＣ−０３４９、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＩＮＫ１２８（ＭＬＮ０１２８）、ＫＵ−００６３７９４、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩ−１０３、ＰＰ１２１、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−８６６９）、ＳＦ２５２３、タクロリムス（ＦＫ５０６）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ６８３８６４）、トリン１、トリン２、トリキニブ（ＰＰ２４２）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ２０１４）、ボクスタリシブ（Ｖｏｘｌａｌｉｓｉｂ）（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９）、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを挙げることができる。一実施形態では、化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、Ｒ７８８、タマチニブ（Ｒ４０６）、エントスプレチニブ（ｅｎｔｏｓｐｌｅｔｉｎｉｂ）（ＧＳ−９９７３）、ニルバジピン、ＴＡＫ−６５９、ＢＡＹ−６１−３６０６、ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−０６０３１８、ＰＲＴ０６２６０７（Ｐ５０５−１５、ＢＩＩＢ０５７）、ＰＲＴ２７６１、ＲＯ９０２１、セルデュラチニブ、イブルチニブ、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ（ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ）、ＴＧＲ−１２０２、ＧＳ−９８２０、ＡＣＰ−３１９、ＳＦ２５２３、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。一実施形態では、化合物は、Ｒ７８８、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＧＳＫ３経路の阻害剤の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するための対象に投与される化合物は、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＢＭＬ−２７５、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＭＬ３４７、ＳＩＳ３、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、化合物は、であり得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＡＣＨＰ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ１１−７０８５、Ｂａｙ１１−７８２１、ベンガミドＢ、ＢＩ６０５９０６、ＢＭＳ３４５５４１、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ１２、セラストロール、ＣＩＤ２８５８５２２、ＦＰＳ ＺＭ１、グリオトキシン、ＧＳＫ３１９３４７Ａ、ホノキオール、ＨＵ２１１、ＩＫＫ１６、ＩＭＤ０３５４、ＩＰ７ｅ、ＩＴ９０１、ルテオリン、ＭＧ１３２、ＭＬ１２０Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ１３０、パルテノリド、ＰＦ１８４、ピセアタンノール、ＰＲ３９（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ１１４５ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ１０６−９９２０、ＳＣ５１４、ＳＰ１０００３０、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−１、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0017】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、アムバチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＢＭＳ−７５４８０７、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＢＭＳ−９８６０９４、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＬＹ２９４００２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ピフィスリン−μ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。

【0018】

いくつかの実施形態では、対象に投与される化合物は、形質転換増殖因子β受容体１（ＴＧＦＲ１）の活性を阻害するアミノピリジルオキシピラゾール化合物、ＬＹ５８２５６３、ｍＦＬＩＮＴ、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドまたはＮ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３、５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３、５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリル、２−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］プロパン−１−スルホンアミドまたは２−メトキシ−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］エタンスルホンアミド、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン、４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールまたは（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノール、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、エンザスタウリン、テトラ置換ピリダジン、１，４−二置換フタラジン、二置換フタラジン、ウイノキサリン−５，８−ジオン誘導体、ラロキシフェン、置換インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ナフタレン、及びジヒドロナフタレンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み得る。

【0019】

代替実施形態では、対象に投与される化合物は、ＰＮＰＬＡ３発現を調節することが特定されたシグナル伝達分子に対して１種以上のＲＮＡｉ剤を含み得る。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ３、ＡＣＶＲ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0020】

上に開示される実施形態のうちのいずれか１つにおいて、化合物は、対象におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも３０％低減される。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、対象の肝臓において低減される。対象は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中に１つ以上の突然変異を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中にＩ１４８Ｍ突然変異を有する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、対象の肝細胞において低減される。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、対象の肝星細胞において低減される。

【0021】

上に開示される実施形態のうちのいずれか１つにおいて、化合物はまた、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を低減し得る。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現は、対象の肝臓において低減される。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現は、対象の肝細胞において低減される。いくつかの実施形態では、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現は、対象の肝星細胞において低減される。

【0022】

上に開示される実施形態のうちのいずれか１つにおいて、化合物はまた、ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現を低減し得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現は、対象の肝臓において低減される。

【0023】

上に開示される実施形態のいずれか１つにおいて、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。他の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）である。

【0024】

また本明細書では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子のシグナル伝達中心に関連する１つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる有効量の化合物を細胞に導入することによって、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整する方法が提供される。そのような化合物は、小分子、ポリペプチド、抗体、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド、またはゲノム編集剤であり得る。

【0025】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含有する絶縁近傍の組成及び／または構造を変更し得る。絶縁近傍で特定されるクロマチンマークまたはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、ｐ３００、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ｍｅ３が挙げられる。絶縁近傍に関与する転写因子としては、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｍｙｃ、ＯＮＥＣＵＴ２及びＹＹ１が挙げられる。絶縁近傍に関与するシグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ４、ＨＩＦ１ａ、ＨＮＦ１、ＥＲａ、ＧＲ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＶＤＲ、ＮＦ−κＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、ｐ５３、ＳＭＡＤ４、及びＦＯＳが挙げられる。これらのシグナル伝達中心及び／またはシグナル伝達分子の任意の構成成分、または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成及び／または構造を変えるように標的化または変更され得、それによってＰＮＰＬＡ３の発現を調整する。

【0026】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物としては、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−０４９６５８４２、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ８６８、フェドラチニブ、ＡＣ４３０、ＡＴ９２８３、ａｔｉ−５０００１及びａｔｉ−５０００２、ＡＺ９６０、ＡＺＤ１４８０、ＢＭＳ−９１１５４３、ＣＥＰ−３３７７９、セルデュラチニブ（ＰＲＴ０６２０７０、ＰＲＴ２０７０）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−５０９）、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３、ＴＧ１０１３４８）、ＦＬＬＬ３２、ＦＭ−３８１、ＧＬＰＧ０６３４類似体、Ｇｏ６９７６、ＪＡＮＥＸ−１（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ０１５Ｋ、ＪＮＪ−５４７８１５３２）、ＰＦ−０６６５１６００、ＰＦ−０６７００８４１、Ｒ２５６（ＡＺＤ０４４９）、ソルシチニブ（ＧＳＫ２５８６１８４もしくはＧＬＰＧ０７７８）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）、ＴＧ１０１２０９、トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、ＸＬ０１９、ＺＭ３９９２３ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを挙げることができる。一実施形態では、化合物は、モメロチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。一実施形態では、化合物は、パクリチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0027】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物としては、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＡＺＤ８０５５、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＣ−２２３、クリソファン酸、ＣＺ４１５、ダクトリシブ（ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＧＤＣ−０３４９、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＩＮＫ１２８（ＭＬＮ０１２８）、ＫＵ−００６３７９４、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩ−１０３、ＰＰ１２１、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−８６６９）、ＳＦ２５２３、タクロリムス（ＦＫ５０６）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ６８３８６４）、トリン１、トリン２、トリキニブ（ＰＰ２４２）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ２０１４）、ボクスタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９）、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを挙げることができる。一実施形態では、化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0028】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、Ｒ７８８、タマチニブ（Ｒ４０６）、エントスプレチニブ（ＧＳ−９９７３）、ニルバジピン、ＴＡＫ−６５９、ＢＡＹ−６１−３６０６、ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−０６０３１８、ＰＲＴ０６２６０７（Ｐ５０５−１５、ＢＩＩＢ０５７）、ＰＲＴ２７６１、ＲＯ９０２１、セルデュラチニブ、イブルチニブ、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ、ＴＧＲ−１２０２、ＧＳ−９８２０、ＡＣＰ−３１９、ＳＦ２５２３、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。一実施形態では、化合物は、Ｒ７８８、またはその誘導体もしくは類似体を含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＧＳＫ３経路の阻害剤の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0030】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＢＭＬ−２７５、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、ＭＬ３４７、ＳＩＳ３、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0031】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＡＣＨＰ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ１１−７０８５、Ｂａｙ１１−７８２１、ベンガミドＢ、ＢＩ６０５９０６、ＢＭＳ３４５５４１、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ１２、セラストロール、ＣＩＤ２８５８５２２、ＦＰＳ ＺＭ１、グリオトキシン、ＧＳＫ３１９３４７Ａ、ホノキオール、ＨＵ２１１、ＩＫＫ１６、ＩＭＤ０３５４、ＩＰ７ｅ、ＩＴ９０１、ルテオリン、ＭＧ１３２、ＭＬ１２０Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ１３０、パルテノリド、ＰＦ１８４、ピセアタンノール、ＰＲ３９（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ１１４５ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ１０６−９９２０、ＳＣ５１４、ＳＰ１０００３０、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−１、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【0032】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、アムバチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＢＭＳ−７５４８０７、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＢＭＳ−９８６０９４、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＬＹ２９４００２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ピフィスリン−μ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。

【0033】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、形質転換増殖因子β受容体１（ＴＧＦＲ１）の活性を阻害するアミノピリジルオキシピラゾール化合物、ＬＹ５８２５６３、ｍＦＬＩＮＴ、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドまたはＮ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３、５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３、５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリル、２−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］プロパン−１−スルホンアミドまたは２−メトキシ−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］エタンスルホンアミド、４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンズアゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミド、８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オン、（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミン、４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド、（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノロール（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノール、５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリル、エンザスタウリン、テトラ置換ピリダジン、１，４−二置換フタラジン、二置換フタラジン、ウイノキサリン−５，８−ジオン誘導体、ラロキシフェン、置換インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ナフタレン、及びジヒドロナフタレンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含み得る。

【0034】

代替実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＰＮＰＬＡ３発現を調節することが特定されたシグナル伝達分子に対して１種以上のＲＮＡｉ剤を含み得る。いくつかの実施形態では、化合物は、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ３、ＡＣＶＲ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される１つ以上の遺伝子を標的とする１つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0035】

上に開示される細胞方法のうちのいずれか１つにおいて、化合物は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減する。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、少なくとも３０％低減される。細胞は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中に１つ以上の突然変異を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中にＩ１４８Ｍ突然変異を有する。

【0036】

上に開示される細胞方法のうちのいずれか１つにおいて、化合物はまた、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子の発現を低減し得る。

【0037】

上に開示される細胞方法のうちのいずれか１つにおいて、化合物はまた、ＰＮＰＬＡ５遺伝子の発現を低減し得る。

【0038】

上に開示される細胞方法のうちのいずれか１つにおいて、細胞は、哺乳類細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝星細胞である。

【0039】

本明細書では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することによって、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整する方法がさらに提供される。絶縁近傍は、４３，７８２，６７６〜４５，０２３，１３７位における染色体２２上の領域を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の上流近傍遺伝子は、ＭＰＰＥＤ１、ＥＦＣＡＢ６、ＳＵＬＴ４Ａ１、及びＰＮＰＬＡ５のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の下流近傍遺伝子は、ＳＡＭＭ５０、ＰＡＲＶＢ、及びＰＡＲＶＧのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝星細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0040】

前述のならびに他の目的、特徴及び利点は、付属の図面において図示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも原寸に比例するとは限らず、代わりに、本発明の様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれている。

【0041】

【図1】核中の染色体のパッケージング、染色体が組織化される局在性トポロジカルドメイン、ＴＡＤ中の絶縁近傍、及び最後に特定の疾患遺伝子の周りのシグナル伝達中心（複数可）の配置の例を示す。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、絶縁近傍のＣＴＣＦ境界の線形及び３Ｄ配置を示す。

【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、直列絶縁近傍及びそのような絶縁近傍に形成された遺伝子ループを示す。

【図4】より大きな絶縁近傍内に含まれる絶縁近傍の概念、及び各々において起こり得るシグナル伝達を示す。

【図5】転写因子、シグナル伝達タンパク質、及び／またはクロマチン調節因子を含む、シグナル伝達中心の構成成分を示す。

【図6】一次ヒト肝細胞中のモメロチニブの用量反応曲線を示す。

【図7】肝星細胞中のモメロチニブの用量反応曲線を示す。

【図8】ＨｅｐＧ２細胞中のモメロチニブの用量反応曲線を示す。

【図9】マウス肝臓中のＰＮＰＬＡ３発現に対するモメロチニブ治療の効果を示す。

【図10】マウス肝臓中のＣＯＬ１Ａ１発現に対するＷＹＥ−１２５１３２治療の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0042】

発明の詳細な説明
Ｉ．序論
本発明は、ヒトにおける肝疾患の治療のための組成物及び方法を提供する。特に、本発明は、ＰＮＰＬＡ３関連疾患、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）及び／またはアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）の治療のために、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）を調整する化合物の使用に関する。

【0043】

本発明はまた、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の変更、摂動及び最終的な調節制御を包含する。そのような遺伝子シグナル伝達ネットワークは、生物系のゲノムの絶縁近傍内で見出されるゲノムシグナル伝達中心を含む。ＰＮＰＬＡ３発現を調整する化合物は、１つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調整することによって作用し得る。

【0044】

本明細書で使用される場合、「遺伝子シグナル伝達ネットワーク」または「ＧＳＮ」は、特定の遺伝子、例えば、遺伝子中心ネットワークからのシグナル伝達事象のうちのいずれかまたは全てに関連する生体分子のセットを含む。ヒトゲノム中に２０，０００を超えるタンパク質コード遺伝子が存在するため、少なくともこの多くの遺伝子シグナル伝達ネットワークが存在する。またいくつかの遺伝子が非コード遺伝子である範囲で、数は大幅に増加する。遺伝子シグナル伝達ネットワークは、標準タンパク質カスケード及びフィードバックループとしてマップされる正準シグナル伝達経路とは異なる。

【0045】

伝統的に、シグナル伝達経路は、標準生化学技法を使用して特定され、大部分は、カスケード中の次のタンパク質生成物により駆動される事象をシグナル伝達する１つのタンパク質生成物を有する線形カスケードである。これらの経路は、二股に分かれ得るか、またはフィードバックループを有し得るが、焦点は、もっぱらタンパク質レベルに置かれている。

【0046】

本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）は、タンパク質コード及び非タンパク質コードシグナル伝達分子、ゲノム構造、染色体占有率、染色体リモデリング、生物系の状態、ならびにそのような遺伝子シグナル伝達ネットワークを含む任意の生物系の摂動に関連する成果の範囲を考慮して、生物学的シグナル伝達を定義するための異なるパラダイムを表す。

【0047】

ゲノムアーキテクチャは、静的ではないが、本発明のＧＳＮのフレームワークを定義することにおいて重要な役割を果たす。そのようなアーキテクチャは、染色体組織化及び修飾の概念、トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）、絶縁近傍（ＩＮ）、ゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）、シグナル伝達分子及びそれらの結合モチーフまたは部位、ならびに当然のことながら、ゲノムアーキテクチャ内でエンコードされる遺伝子を含む。

【0048】

本発明は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子に関連するＧＳＮの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び／またはＡＬＤを含むＰＮＰＬＡ３関連疾患に対処するための微調整された機構を提供する。

【0049】

ゲノムアーキテクチャ
細胞は、細胞シグナル伝達をゲノムのアーキテクチャに結合する数千のエレメントを使用して遺伝子発現を制御する。ゲノムシステムアーキテクチャは、ＤＮＡ、ＲＮＡ転写物、クロマチンリモデラー、及びシグナル伝達分子を含む。

【0050】

染色体
染色体は、ヒトのＤＮＡの大部分を含むゲノムアーキテクチャの最大サブユニットである。特定の染色体構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，２０１６に記載されるように、遺伝子対照において重要な役割を果たすことが観察された。イントロンを含む「非コード領域」は、タンパク質結合部位及び他の調節構造を提供するが、エクソンは、非コード領域と相互作用して遺伝子発現を調節するシグナル伝達分子（例えば、転写因子）などのタンパク質をエンコードする。染色体上の非コード領域内のＤＮＡ部位はまた、互いに相互作用して、ループ状構造を形成する。これらの相互作用は、発達を通して保存され、遺伝子活性化及び抑制において重要な役割を果たす染色体足場を形成する。相互作用は、染色体間でめったに起こらず、通常は染色体の同じドメイン内に存在する。

【0051】

原位置ハイブリダイゼーション技法及び顕微鏡は、各相間染色体が、核の小部分のみを占有する傾向があり、この細胞小器官全体に広がらないことを明らかにした。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｒｅｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒｅｍｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２，ａ００３８８９，２０１０を参照されたい。この制限された表面占有面積は、染色体間の相互作用を低減し得る。

【0052】

トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）
トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）（あるいはトポロジカルドメインとしても知られる）は、哺乳類染色体構造のサブユニットである階層ユニットである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｆｉｌｉｐｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：１４，２０１４、Ｇｉｂｃｕｓ ａｎｄ Ｄｅｋｋｅｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，４９（５）：７７３−８２，２０１３、Ｎａｕｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２（６１６１）：９４８−５３，２０１３を参照されたい。ＴＡＤは、遺伝子及び調節エレメントが生産的ＤＮＡ−ＤＮＡ接触を成すのを可能にする微小環境を画定する、メガベースサイズの染色体領域である。ＴＡＤは、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用頻度によって定義される。ＴＡＤの境界は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｎｏｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３８１−５，２０１２に記載されるように、比較的少ないＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用が起こる領域からなる。ＴＡＤは、遺伝子発現調節因子として機能する構造的染色体ユニットを表す。

【0053】

ＴＡＤは、約７つ以上のタンパク質コード遺伝子を含有し、異なる細胞型によって共有される境界を有し得る。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｍａｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５（３）：３８７−９４，２０１３を参照されたい。単一ＴＡＤ内の遺伝子の発現は通常相関しているため、いくつかのＴＡＤは、活性遺伝子を含有し、他のものは抑制された遺伝子を含有する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｖａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０（３）：２９０−９，２０１３を参照されたい。ＴＡＤ内の配列は、互いを高頻度で見出し、一致したＴＡＤワイドヒストンクロマチンシグネチャー、発現レベル、ＤＮＡ複製タイミング、ラミナ会合、及び染色中心会合を有する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｌｅ Ｄｉｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２８：２１５１−６２，２０１４、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｗｉｊｃｈｅｒｓ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：９５８−６９，２０１５を参照されたい。

【0054】

ＴＡＤ内の遺伝子ループ及び他の構造は、転写因子（ＴＦ）、コヒーシン、及び１１−ジンクフィンガータンパク質（ＣＴＣＦ）、転写リプレッサーの活性に影響を及ぼす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｒａｎｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１１（３）：８８９−９，２０１４を参照されたい。ＴＡＤ内の構造は、エンハンサー結合ＴＦが、順にプロモーター部位においてＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合する共因子、例えば、メディエーターに結合したときに産生されるコヒーシン関連エンハンサー・プロモーターループを含む。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ，Ｃｅｌｌ，１５２（６）：１２３７−５１，２０１３、Ｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｒｏｅｄｅｒ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４６：４３−６８，２００５、Ｓｐｉｔｚ ａｎｄ Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３（９）：６１３−２６，２０１２、Ｄｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９（２）：３７４−３８７，２０１４、Ｌｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４６：４３−６８，２０１２を参照されたい。コヒーシン負荷因子Ｎｉｐｐｅｄ−Ｂ様タンパク質（ＮＩＰＢＬ）は、メディエーターに結合し、これらのエンハンサー・プロモーターループにおいてコヒーシンを負荷する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋａｇｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１４）：４３０−５，２０１０を参照されたい。

【0055】

ＴＡＤは、調べた全てのヒト細胞型において同様の境界を有し、エンハンサー・遺伝子相互作用を拘束する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８：３３１−３３６，２０１５、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５：３７６−３８０，２０１２を参照されたい。ゲノムのこのアーキテクチャは、なぜ大部分のＤＮＡ接触がＴＡＤ内で起こり、エンハンサー・遺伝子相互作用が染色体間でめったに起こらないかを説明するのを助ける。しかしながら、ＴＡＤは、ＴＡＤ内で特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に影響を及ぼす分子機構に対する部分的な洞察を提供するにすぎない。

【0056】

長期のゲノム接触は、ＴＡＤを活性区画と非活性区画とに分離する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ａｉｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２６：２８９−９３，２００９を参照されたい。ＴＡＤ境界の間に形成されたループは、特定の配列対の間に安定して再現性よく形成された最長範囲の接触を表すと思われる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２を参照されたい。

【0057】

いくつかの実施形態では、本発明の方法を使用して、ＴＡＤ中に位置する遺伝子からの遺伝子発現を変更する。いくつかの実施形態では、ＴＡＤ領域を修飾して、本明細書に定義されるように、または本明細書に記載される方法を使用して定義可能であるように、非正準経路の遺伝子発現を変更する。

【0058】

絶縁近傍
本明細書に記載される場合、「絶縁近傍」（ＩＮ）は、染色体配列中の２つの相互作用部位のルーピングによって形成された染色体構造として特定される。これらの相互作用部位は、ＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）を含み得る。これらのＣＴＣＦ部位は、多くの場合、コヒーシンによって共占有される。これらのコヒーシン関連染色体構造の完全性は、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響する。「近傍遺伝子」は、絶縁近傍内に位置する遺伝子である。近傍遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。

【0059】

絶縁近傍アーキテクチャは、一緒になって直接または間接的にＤＮＡループを形成する少なくとも２つの境界によって定義される。任意の絶縁近傍の境界は、一次上流境界及び一次下流境界を含む。そのような境界は、任意の絶縁近傍の最も外側の境界である。しかしながら、任意の絶縁近傍ループ内では、二次ループが形成され得る。そのような二次ループは、存在する場合、一次絶縁近傍に対して、二次上流境界及び二次下流境界によって定義される。一次絶縁近傍が複数の内部ループを含有する場合、ループは、一次ループの一次上流境界に対して、例えば、二次ループ（一次ループ内の第１のループ）、三次ループ（一次ループ内の第２のループ）、四次ループ（一次ループ内の第３のループ）等と付番される。

【0060】

絶縁近傍は、トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）及び他の遺伝子ループ内に位置し得る。最大の絶縁近傍は、ＴＡＤであり得る。ＴＡＤは、ＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用頻度によって定義され、平均０．８Ｍｂであり、およそ７タンパク質コード遺伝子を含有し、生物の異なる細胞型によって共有される境界を有する。Ｄｏｗｅｎによれば、ＴＡＤ内の遺伝子の発現は、ある程度相関しており、したがっていくつかのＴＡＤは活性遺伝子を有する傾向があり、他のものは抑制された遺伝子を有する傾向がある。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１４ Ｏｃｔ ９；１５９（２）：３７４−３８７を参照されたい。

【0061】

絶縁近傍は、染色体に沿って連続した実体として存在し得るか、または非絶縁近傍配列領域によって分離され得る。絶縁近傍は、ＤＮＡルーピング領域が接合された場合にのみ定義されるように線形に重複し得る。絶縁近傍は、３〜１２遺伝子を含み得るが、それらは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３またはそれ以上の遺伝子を含有し得る。

【0062】

「最小絶縁近傍」は、少なくとも１つの近傍遺伝子、及び関連した調節配列領域（ＲＳＲ）または近傍遺伝子の発現もしくは抑制を促進する領域、例えばプロモーター及び／またはエンハンサー及び／またはリプレッサー領域等を有する絶縁近傍である。場合によっては、調節配列領域は、絶縁近傍境界と一致またはさらには重複し得ることが企図される。本明細書で使用される場合、調節配列領域としては、限定されないが、染色体に沿った領域、区分、部位または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。本明細書で使用される場合、「シグナル伝達分子」は、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、有機小分子、脂質、糖または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態である。調節配列領域（ＲＳＲ）はまた、ＧＳＣの結合部位として機能するＤＮＡの部分を指し得る。

【0063】

特殊化シグナル伝達分子の１つのカテゴリーは、転写因子である。「転写因子」は、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を変更（増加または減少）するシグナル伝達分子である。

【0064】

本発明に従い、近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する１つ以上、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の上流及び／または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。

【0065】

本発明は、遺伝子または遺伝子変異体の浸透度を変更する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「浸透度」は、その変異体遺伝子の関連した特性（表現型）も呈する遺伝子の特定の変異体（例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子または一般遺伝子型）を担持する個体の割合である。いくつかの疾患の状況において、疾患を引き起こす突然変異の浸透度は、臨床症状を呈する突然変異を有する個体の割合として測定した。結果として、任意の遺伝子または遺伝子変異体の浸透度は、連続体上に存在する。

【0066】

絶縁近傍は、同じ制御機構下で遺伝子をグループ分けすることができる機能的単位であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９：３７４−３８７（２０１４）に記載されている。絶縁近傍は、図１に示されるＴＡＤなどの、より高次の染色体構造の機構的背景を提供する。絶縁近傍は、図２Ｂに示されるコヒーシンによって共占有される２つの相互作用するＣＴＣＦ部位のルーピングによって形成された染色体構造である。これらの構造の完全性は、局所遺伝子の適切な発現に重要である。一般に、１〜１０の遺伝子は、各遺伝子内に３つの遺伝子の中央値を有する各近傍においてクラスター化される。同じ絶縁近傍によって制御される遺伝子は、ＤＮＡの二次元図から容易に明らかではない。ヒトにおいて、中央サイズが１８６ｋｂである２５ｋｂ〜９４０ｋｂのサイズ範囲内に約１３，８０１の絶縁近傍が存在する。絶縁近傍は、異なる細胞型の間で保存される。より大きなＩＮ内で発生するより小さなＩＮは、ネスト絶縁近傍（ＮＩＮ）と称される。ＴＡＤは、図１に示されるように単一のＩＮからなり得るか、または図２Ｂに示されるように１つのＩＮ及び１つのＮＩＮ及び２つのＮＩＮからなり得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、「境界」という用語は、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。したがって、「絶縁近傍境界」は、染色体上の絶縁近傍の範囲を定める境界を指す。本発明に従い、絶縁近傍は、少なくとも２つの絶縁近傍境界、一次上流境界及び一次下流境界によって定義される。「一次上流境界」は、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。「一次下流境界」は、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。同様に、図２Ｂに示されるように二次ループが存在する場合、それらは、二次上流境界及び下流境界によって定義される。「二次上流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界であり、「二次下流境界」は、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界である。二次境界の方向性は、一次絶縁近傍の方向性に従う。

【0068】

絶縁近傍境界の構成成分は、２つの境界のルーピングを容易にするアンカー領域及び関連因子（例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン）においてＤＮＡ配列を含み得る。アンカー領域におけるＤＮＡ配列は、少なくとも１つのＣＴＣＦ結合部位を含み得る。ＣｈＩＰ−ｅｘｏ技法を使用する実験は、４つのＣＴＣＦ結合モジュールを含有する５２ｂｐのＣＴＣＦ結合モチーフを明らかにした（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｎｇ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２８３−２９３，２０１１の図１を参照）。絶縁近傍境界におけるＤＮＡ配列は、絶縁体を含有し得る。場合によっては、絶縁近傍境界はまた、エンハンサー・プロモーター相互作用部位などの調節配列領域と一致または重複し得る。

【0069】

本発明のいくつかの実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界における特定のＤＮＡ配列（例えば、ＣＴＣＦ結合部位）を変更することによって達成され得る。例えば、絶縁近傍境界における既存のＣＴＣＦ結合部位は、欠失、突然変異、または逆転され得る。代替として、新たなＣＴＣＦ結合部位は、新たな絶縁近傍を形成するために導入され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界におけるヒストン修飾（例えば、メチル化、脱メチル化）を変更することによって達成され得る。他の実施形態では、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、境界へのＣＴＣＦ及び／またはコヒーシンの結合を変更（例えば、ブロッキング）することによって達成され得る。絶縁近傍境界が調節配列領域と一致または重複する場合、絶縁近傍境界の崩壊または変更は、調節配列領域（ＲＳＲ）またはＲＳＲ関連シグナル伝達分子の結合を変更することによって達成され得る。

【0070】

絶縁近傍からの発現を制御する：シグナル伝達中心
歴史的に、「シグナル伝達中心」という用語は、細胞環境の変化に反応する細胞の群を説明するために使用されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７２：１１５−１２５（１９９５）を参照されたい。同様に、「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子（例えば、転写因子）などの定義された生体分子のセットと相互作用して、遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する生存生物の定義された領域を指す。

【0071】

具体的に、「ゲノムシグナル伝達中心」、すなわち「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、その絶縁近傍内または複数の絶縁近傍中の遺伝子の調節に関与するシグナル伝達分子／シグナル伝達タンパク質の状況特異的複合アセンブリに結合することができる領域を含む絶縁近傍内の領域を指す。

【0072】

シグナル伝達中心は、絶縁近傍の活性を調節することが発見された。これらの領域は、ヒトゲノム中でどの遺伝子が発現されるか、及び発現のレベルを制御する。シグナル伝達中心の構造的完全性の喪失は、遺伝子発現の脱調節の一因となり、潜在的に疾患を引き起こす。

【0073】

シグナル伝達中心は、転写因子の高度に状況特異的な複合アセンブリによって結合されたエンハンサーを含む。これらの因子は、細胞シグナル伝達を通して部位に動員される。シグナル伝達中心は、相互作用して三次元転写因子ハブマクロ複合体を形成する複数の遺伝子を含む。シグナル伝達中心は、一般に、生物学的機能によって組織化されたループ中の１〜４遺伝子に関連している。

【0074】

各シグナル伝達中心の組成物は、転写因子のアセンブリ、転写装置、及びクロマチン調節因子を含む固有の組成物を有する。シグナル伝達中心は、高度に状況特異的であり、シグナル伝達経路を標的とすることによって薬物が反応を制御できるようにする。

【0075】

複数のシグナル伝達中心は、相互作用して、同じ絶縁近傍内で異なる遺伝子の組み合わせを制御することができる。

【0076】

シグナル伝達分子の結合部位
シグナル伝達分子について、一連のコンセンサス結合部位、または結合部位の結合モチーフは、本発明者によって特定された。これらのコンセンサス配列は、シグナル伝達分子の、または１つ以上のシグナル伝達分子を含む複合体の染色体、遺伝子、またはポリヌクレオチドに沿った結合部位を反映する。

【0077】

いくつかの実施形態では、結合部位は、複数のシグナル伝達分子または分子の複合体に関連している。

【0078】

エンハンサー
エンハンサーは、ヒトにおける細胞型特異的遺伝子発現プログラムを制御する遺伝子調節エレメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｗｙｓｏｃｋａ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ ２８，２７６−２８４，２０１２、Ｈｅｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６：１４４−１５４，２０１５、Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５７：１３−２５，２０１４、Ｏｎｇ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２：２８３−２９３，２０１１、Ｒｅｎ ａｎｄ Ｙｕｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｙ，８０：１７−２６，２０１５を参照されたい。エンハンサーは、共活性化因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員して遺伝子を標的とする複数の転写因子によって占有され得る、一般に数百塩基対の長さであるＤＮＡのセグメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｌｇｅｒ ａｎｄ Ｇｒｏｕｄｉｎｅ，Ｃｅｌｌ，１４４：３２７−３３９，２０１１、Ｓｐｉｔｚ ａｎｄ Ｆｕｒｌｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１３：６１３−６２６，２０１２、Ｔｊｉａｎ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ，７７：５−８，１９９４を参照されたい。ＤＮＡのこれらの領域から転写されたエンハンサーＲＮＡ分子はまた、ＤＮＡ及びＲＮＡに結合することができる転写因子を「捕捉」する。複数のエンハンサーを有する領域は、「スーパーエンハンサー」である。

【0079】

絶縁近傍は、正常な遺伝子の活性化及び抑制の両方に極めて重要な特定のエンハンサー・遺伝子相互作用のための微小環境を提供する。転写エンハンサーは、２０，０００を超えるタンパク質コード遺伝子を制御して、全てのヒト細胞中の細胞型特異的遺伝子発現プログラムを維持する。数万のエンハンサーが、任意の所与のヒト細胞型で活性であると推定される。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ＥＮＣＯＤＥ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８９，５７−７４，２０１２、Ｒｏａｄｍａｐ Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８，３１７−３３０，２０１５を参照されたい。エンハンサー及びそれらの関連因子は、これらの遺伝子のプロモーターにルーピングすることによって、上流または下流に位置する遺伝子の発現を調節し得る。細胞識別子の転写制御と染色体構造の制御との間の関係に関する洞察を得るために実行されたコヒーシンＣｈＩＡ−ＰＥＴ研究は、スーパーエンハンサー及びそれらの関連遺伝子の大部分が、コヒーシンによって共占有されたＣＴＣＦ部位と相互作用することによって接続された大きなループ内で起こることを明らかにする。そのようなスーパーエンハンサードメイン（ＳＤ）は、通常、ＳＤ内の１つの遺伝子に対してループする１つのスーパーエンハンサーを含有し、ＳＤは、ＳＤ内の遺伝子に対するスーパーエンハンサー活性を制限すると思われる。絶縁近傍中のスーパーエンハンサー及びそれらの標的遺伝子の正しい会合は、単一スーパーエンハンサーの誤標的が、疾患を引き起こすのに十分であるため、極めて重要である。Ｇｒｏｓｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５７（２）：３６９−８１，２０１４を参照されたい。

【0080】

疾患関連非コード変化の大部分は、エンハンサーの近位で起こり、したがってこれらのエンハンサー標的遺伝子に影響を及ぼし得る。したがって、エンハンサーに対する特異性を付与する特徴を解読することは、調整性遺伝子発現に重要である。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｅｒｎｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７３，４３−４９，２０１１、Ｆａｒｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８，３３７−３４３，２０１５、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５５，９３４−９４７，２０１３、Ｍａｕｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，１１９０−１１９５，２０１２を参照されたい。研究は、エンハンサー・遺伝子相互作用の特異性の一部が、エンハンサーにおけるＤＮＡ結合転写因子と、プロモーターにおける特定のパートナー転写因子との相互作用に起因し得ることを示唆する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｋａｄｏｎａｇａ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，２５１５−２５１９，２００１、Ｃｈｏｉ ａｎｄ Ｅｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ，５５，１７−２６，１９８８、Ｏｈｔｓｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２，５４７−５５６，１９９８を参照されたい。エンハンサー中及びプロモーター近位領域中のＤＮＡ配列は、単一細胞中で発現される様々な転写因子に結合する。これら２つの部位において結合される多様な因子は、大きな共因子複合体と相互作用し、互いに相互作用してエンハンサー・遺伝子特異性をもたらす。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚａｂｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５１８：５５６−５５９，２０１５を参照されたい。

【0081】

いくつかの実施形態では、エンハンサー領域を標的化して、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化することができる。

【0082】

絶縁体
絶縁体は、エンハンサーが、それらの間に位置しているときに遺伝子を活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する調節エレメントである。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４：５０５−５１４，１９９３、Ｇｅｙｅｒ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１８６５−１８７３，１９９２、Ｋｅｌｌｕｍ ａｎｄ Ｓｃｈｅｄｌ，Ｃｅｌｌ ６４：９４１−９５０，１９９１、Ｕｄｖａｒｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １８５：３４１−３５８，１９８５を参照されたい。絶縁体は、転写因子ＣＴＣＦによって結合されるが、全てのＣＴＣＦ部位が絶縁体として機能するとは限らない。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９８：３８７−３９６，１９９９、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３：１９８−２０３，２０１５を参照されたい。絶縁体として機能するＣＴＣＦ部位のサブセットを区別する特徴は、以前に理解されていない。

【0083】

エンハンサー、プロモーター及び絶縁体に結合するタンパク質のゲノムワイドマップは、これらのエレメントの間で起こる物理的接触の知識とともに、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用を生じる機構の理解に対するさらなる洞察を提供する。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｐｅｌｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４９０−５０３，２０１２、ＤｅＭａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３：１２２４−１２３４，２０１３、Ｄｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５９：３７４−３８７，２０１４、Ｆｕｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６：１８６５−１８７３，２００９、Ｈａｎｄｏｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４３：６３０−６３８，２０１１、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３：１２８１−１２９５，２０１３、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３：１６１１−１６２７，２０１５を参照されたい。エンハンサー結合タンパク質は、それらがこれらのＣＴＣＦ−ＣＴＣＦループ内の遺伝子のみと相互作用する傾向があるように制約される。したがって、これらのループアンカーを形成するＣＴＣＦ部位のサブセットは、図３Ｂに示されるように、ループの外側のエンハンサー及び遺伝子から、ループ内のエンハンサー及び遺伝子を絶縁するように機能する。いくつかの実施形態では、絶縁体領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化するために標的され得る。

【0084】

コヒーシン及びＣＴＣＦ関連ループ及びアンカー部位／領域
ＣＴＣＦ相互作用は、ループを形成する同じ染色体上の部位を結合し、それらは一般に、１Ｍｂ未満の長さである。転写は、ループ内及び外側の両方で起こるが、この転写の性質は、２つの領域間で異なる。研究は、エンハンサー関連転写が、ループ内でより顕著であることを示す。したがって、絶縁体状態は、ＣＴＣＦループアンカーにおいて特異的に富化される。したがって、ＣＴＣＦループは、遺伝子がループ内の中心に位置する傾向を有する遺伝子不良領域を包囲するか、またはＣＴＣＦループの外側の遺伝子密集領域を除外するかのいずれかである。図２Ａ及び図２Ｂは、ループの線形構造を三次元（３Ｄ）構造と比較する。

【0085】

ＣＴＣＦループは、それらの隣接領域に対して低減したエクソン密度を呈する。遺伝子オントロジー分析は、ＣＴＣＦループ内に位置する遺伝子が、刺激への反応のために、また細胞外血漿膜及び小嚢細胞局在のために富化されることを明らかにする。一方で、ループのちょうど外側に接する隣接領域内に存在する遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と同様の発現パターンを呈する。すなわち、これらの遺伝子は、平均してループに包囲された遺伝子よりも高度に発現され、それらの発現パターンにおいてあまり細胞株特異的ではなく、細胞株にわたってそれらの発現レベルの変化が少ない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｔｉ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１７：２５２，２０１６を参照されたい。

【0086】

アンカー領域は、絶縁近傍の立体配座に影響を及ぼすＣＴＣＦの結合部位である。アンカー部位の欠失は、通常は転写的にサイレントである遺伝子の活性化をもたらし得、それによって疾患表現型をもたらす。実際に、体細胞突然変異は、発がん関連絶縁近傍のループアンカー部位において共通している。ループアンカー領域のＣＴＣＦ ＤＮＡ結合モチーフは、がん細胞の最も変更されたヒト転写因子結合配列であることが観察された。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，２０１６を参照されたい。

【0087】

アンカー領域は、細胞発達中に大部分が維持され、特にヒト及び霊長類の生殖系において保存されることが観察された。実際に、アンカー領域のＤＮＡ配列は、絶縁近傍の一部ではないＣＴＣＦ結合部位よりもＣＴＣＦアンカー領域において保存される。したがって、コヒーシンをＣｈＩＡ−ＰＥＴの標的として使用して、両方の位置を特定することができる。

【0088】

コヒーシンはまた、ゲノムのＣＴＣＦ結合領域と関連付けられ、これらのコヒーシン関連ＣＴＣＦ部位のうちのいくつかは、遺伝子活性化を促進するが、他のものは絶縁体として機能し得る。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４８５（７３９８）：３７６−８０，２０１２、Ｐａｒｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３２（３）：４２２−３３，２００８、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ−Ｃｒｅｍｉｎｓ ａｎｄ Ｃｏｒｃｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，５０（４）：４６１−７４，２０１３）、Ｓｅｉｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２３（１２）：２０６６−７７，２０１３、Ｗｅｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５１（７１８０）：７９６−８０１，２００８）を参照されたい。コヒーシン及びＣＴＣＦは、ＴＡＤ内の大きなループ下部構造と関連付けられ、コヒーシン及びメディエーターは、ＣＴＣＦ結合領域内で形成するより小さいループ構造と関連付けられる。参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、ｄｅ Ｗｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０１（７４６６）：２２７−３１，２０１３、Ｃｒｅｍｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３（６）：１２８１−９５，２０１３、Ｓｏｆｕｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，３２（２４）：３１１９−２９，２０１３を参照されたい。いくつかの実施形態では、コヒーシン及びＣＴＣＦ関連ループ及びアンカー部位／領域は、遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更または明確化するために標的され得る。

【0089】

遺伝子変異体
シグナル伝達中心内の遺伝子変異は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，２０１６に記載されているように、染色体上のタンパク質結合を崩壊させることによって疾患の一因となることが知られている。絶縁近傍の形成を干渉する絶縁近傍境界部位のＣＴＣＦアンカー領域の配列の変異は、遺伝子活性化及び抑制の脱調節をもたらすことが観察される。様々な遺伝的機構及び後成的機構によって引き起こされるＣＴＣＦ機能不全は、発病につながり得る。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の前向きな治療結果をもたらすために、そのような変異体駆動型病因学と関連付けられる任意の１つ以上の遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）を変更することが有益である。

【0090】

単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）
ＳＮＰの９４．２％は、エンハンサー領域を含む非コード領域中で発生する。いくつかの実施形態では、ＳＮＰは、１つ以上のＧＳＮからのシグナル伝達を研究及び／または変更するために変更される。

【0091】

シグナル伝達分子
シグナル伝達分子は、正準であるか、または本明細書に定義される、もしくは本明細書に記載される方法を使用して定義可能である遺伝子シグナル伝達ネットワーク経路細胞かにかかわらず、細胞シグナル伝達経路において機能する任意のタンパク質を含む。転写因子は、シグナル伝達分子のサブセットである。シグナル伝達及びマスター転写因子のある特定の組み合わせをエンハンサー領域と関連付けて、遺伝子の発現に影響を及ぼす。マスター転写因子は、特定の組織中の転写因子を指向する。例えば、血液中では、ＧＡＴＡ転写因子が、Ｗｎｔ細胞シグナル伝達経路のＴＣＦ７Ｌ２を指向するマスター転写因子である。肝臓中では、ＨＮＦ４Ａが、系統組織及びパターンにおけるＳＭＡＤを指向するマスター転写因子である。

【0092】

転写調節は、所与の遺伝子がどのくらいの頻度で転写されるかを制御するのを可能にする。転写因子は、転写開始の条件を多少好ましいものにすることによって転写物が産生される速度を変更する。転写因子は、シグナル伝達経路を選択的に変更し、順にゲノムシグナル伝達中心によって制御される遺伝子に影響を及ぼす。ゲノムシグナル伝達中心は、転写調節因子の構成成分である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子は、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークのシグナル伝達を明確化または変更するために使用または標的され得る。

【0093】

参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／３１０５６号の表２２は、様々な細胞シグナル伝達経路において機能する転写因子（ＴＦ）及び／またはクロマチンリモデリング因子（ＣＲ）として作用するものを含む、シグナル伝達分子の一覧を提供する。本明細書に記載される方法を使用して、絶縁近傍内でエンコードされる一次近傍遺伝子の調節配列領域に関連する１つ以上のシグナル伝達分子の発現を阻害または活性化することができる。したがって、これらの方法は、未治療対照と比較して、治療剤による治療時に差次的に発現される１つ以上の一次近傍遺伝子のシグナル伝達シグネチャーを変更することができる。

【0094】

転写因子
転写因子は、一般に、エンハンサーに結合し、共活性化因子及びＲＮＡポリメラーゼＩＩを動員して遺伝子を標的とすることによって遺伝子発現を調節する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｈｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１５３（２）：３０７−３１９，２０１３を参照されたい。転写因子は、「エンハンサー」に結合して、ゲノム全体に分散された調節エレメントに結合することによって細胞特異的転写プログラムを刺激する。

【0095】

ヒトゲノム中に約１８００の既知の転写因子が存在する。リボソームＲＮＡ複合体などのタンパク質または核酸分子の結合部位を提供する染色体のＤＮＡ上にエピトープが存在する。マスター調節因子は、上記の細胞シグナル伝達及び下記のＤＮＡを通して転写因子の組み合わせを指向する。これらの特徴は、次のシグナル伝達中心の位置の決定を可能にする。いくつかの実施形態では、転写因子を使用するかまたは標的として、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。

【0096】

マスター転写因子
マスター転写因子は、細胞型特異的エンハンサーを結合及び確立する。マスター転写因子は、追加のシグナル伝達タンパク質、例えば他の転写因子をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。２３３ヒト細胞型及び組織の候補マスターＴＦの地図は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄ′Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５，７６３−７７５（２０１５）に記載されている。いくつかの実施形態では、マスター転写因子を使用するかまたは標的として、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。

【0097】

シグナル伝達転写因子
シグナル伝達転写因子は、それらがそうすることを可能にするタンパク質ドメインを含むため、細胞間を移動するホメオタンパク質などの転写因子である。Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、Ｈｏｘａ５、Ｈｏｘｂ４、Ｈｏｘｃ８、Ｅｍｘ１、Ｅｍｘ２、Ｏｔｘ２及びＰａｘ６などのホメオタンパク質は、シグナル伝達転写因子として作用することができる。ホメオタンパク質Ｅｎｇｒａｉｌｅｄは、他のホメオタンパク質において同様に存在すると考えられる内在化及び分泌シグナルを有する。この特性は、転写因子であることに加えて、ホメオタンパク質がシグナル伝達分子として作用するのを可能にする。ホメオタンパク質は、特徴付けられた細胞外機能を欠いており、それらのパラクリン標的が細胞内であるという認識につながる。ホメオタンパク質が転写、及び場合によっては翻訳を調節する能力は、パラクリン作用に影響を及ぼす可能性が最も高い。Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ ａｎｄ Ｊｏｌｉｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３を参照されたい。いくつかの実施形態では、シグナル伝達転写因子を使用するかまたは標的として、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。

【0098】

クロマチン修飾
クロマチンリモデリングは、ヒストン修飾に関連する１０００を超えるタンパク質によって調節される。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１２（１２）：３８４１−３８４６（２０１５）を参照されたい。クロマチン調節因子は、修飾されたヒストンでマークされたゲノム領域に関連する特定のタンパク質のセットである。例えば、ヒストンは、ある特定のリジン残基：Ｈ３Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、及びＨ３Ｋ９ｍｅ３において修飾され得る。ある特定のヒストン修飾は、シグナル伝達分子によって結合するために使用可能であるゲノムの領域をマークする。例えば、以前の研究は、活性エンハンサー領域がＨ３Ｋ２７ａｃを有するヌクレオソームを含み、活性プロモーターがＨ３Ｋ２７ａｃを有するヌクレオソームを含むことを観察した。さらに、転写された遺伝子は、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２を有するヌクレオソームを含む。ＣｈＩＰ−ＭＳを実施して、特定のヒストン修飾に関連するクロマチン調節因子タンパク質を特定することができる。ある特定の修飾されたヒストンに特異的な抗体を有するＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用して、シグナル伝達分子によって結合されたゲノムの領域を特定することもできる。いくつかの実施形態では、クロマチン修飾酵素またはタンパク質を使用するかまたは標的として、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。

【0099】

調節配列領域に由来するＲＮＡ
タンパク質コード遺伝子のエンハンサー、シグナル伝達中心、及びプロモーターからの領域などの多くの活性調節配列領域（ＲＳＲ）は、非コードＲＮＡを産生することが知られている。活性調節配列領域またはその近位で産生される転写物は、付近の遺伝子の転写調節において実装されている。最近の報告は、エンハンサー関連ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）は、エンハンサー活性の強力な指標であることを実証した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１６ Ａｐｒ；１７（４）：２０７−２３を参照）。さらに、活性調節配列領域からの非コードＲＮＡは、これらの領域への転写因子の結合を促進することに関与することが示されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５ Ｎｏｖ ２０；３５０（６２６３）：９７８−８１）。これは、そのようなＲＮＡが、シグナル伝達中心のアセンブリ及び近傍遺伝子の調節に重要であり得ることを示唆している。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の調節配列領域に由来するＲＮＡを使用するかまたは標的として、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、エンハンサー関連ＲＮＡ（ｅＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、プロモーター関連ＲＮＡであり得、プロモーター上流転写（ＰＲＯＭＰＴ）、プロモーター関連長ＲＮＡ（ＰＡＬＲ）、及びプロモーター関連小ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡとしては、転写開始部位（ＴＳＳ）関連ＲＮＡ（ＴＳＳａ−ＲＮＡ）、転写開始ＲＮＡ（ｔｉＲＮＡ）、及びターミネーター関連小ＲＮＡ（ＴＡＳＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）（すなわち、＞２００ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、中間非コードＲＮＡ（すなわち、約５０〜２００ヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡは、短い非コードＲＮＡ（すなわち、約２０〜５０ヌクレオチド）であり得る。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物によって調整され得るｅＲＮＡは、以下の特徴のうちの１つ以上を特徴とし得る。（１）ヒストン３のリジン４上の高レベルのモノメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ１）及びヒストン３のリジン４上の低レベルのトリメチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３）を有する領域から転写される、（２）ヒストン３のリジン２７上の高レベルのアセチル化（Ｈ３Ｋ２７ａｃ）を有するゲノム領域から転写される、（３）ヒストン３のリジン３６上の低レベルのトリメチル化（Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３）を有するゲノム領域から転写される、（４）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）について富化されたゲノム領域から転写される、（５）ｐ３００共活性化因子などの転写共調節因子について富化されたゲノム領域から転写される、（６）低密度のＣｐＧ島を有するゲノム領域から転写される、（７）それらの転写がＰｏｌ ＩＩ結合部位から開始され、二方向に伸長される、（８）ｅＲＮＡをエンコードする進化的に保存されたＤＮＡ配列、（９）短い半減期、（１０）低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、（１１）シグナル伝達時に動的に調節される、（１２）ｍＲＮＡ発現付近のレベルに正に相関する、（１３）極めて高い組織特異性、（１４）選好的に核及びクロマチン結合される、及び／または（１５）エキソソームによって分解される。

【0103】

例示的なｅＲＮＡとしては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｊｅｂａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ｓｅｐ ６；４８９（７４１４）（例えば、図５ａの補足データファイル）及びＡｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４ Ｍａｒ ２７；５０７（７４９３）：４５５−４６１（例えば、補足表Ｓ３、Ｓ１２、Ｓ１３、Ｓ１５、及び１６）に記載されるものが挙げられる。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法または化合物によって調整され得るプロモーター関連ＲＮＡは、以下の特徴のうちの１つ以上を特徴とし得る。（１）高レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ１及び低〜中レベルのＨ３Ｋ４ｍｅ３を有する領域から転写される、（２）高レベルのＨ３Ｋ２７ａｃを有するゲノム領域から転写される、（３）Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３を有しないか、または低レベルのＨ３Ｋ３６ｍｅ３を有するゲノム領域から転写される、（４）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）について富化されたゲノム領域から転写される、（５）高密度のＣｐＧ島を有するゲノム領域から転写される、（６）それらの転写は、Ｐｏｌ ＩＩ結合部位から開始され、センス鎖（すなわち、ｍＲＮＡ）から反対方向または二方向に伸長される、（７）短い半減期、（８）低減レベルのスプライシング及びポリアデニル化、（９）選好的に核結合及びクロマチン結合される、及び／または（１０）エキソソームによって分解される。

【0105】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡを調整し、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更または明確化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡの産生及び／または機能を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを使用して、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）もしくはＲＮａｓｅ Ｈ媒介性切断を介して関心対象のＲＮＡの活性を阻害するか、またはＲＮＡへの様々なシグナル伝達分子の結合を物理的にブロックすることができる。例示的なハイブリダイジングオリゴヌクレオチドとしては、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，５１８，２６１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０４０７４２号に記載されるものを挙げることができる。ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されたまたは未修飾のＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、またはＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせ、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチドをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、ＲＮＡの転写を制御するか、またはＲＮＡ自体を分解する調節配列領域中の特定のＤＮＡエレメントを削除することができる。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、調節配列領域中の特定のエレメントに結合し、関心対象のＲＮＡの転写をブロックすることができる。さらなる実施形態では、ブロモドメイン及び末端外ドメイン（ＢＥＴ）阻害剤（例えば、ＪＱ１、Ｉ−ＢＥＴ）を使用して、ＢＥＴタンパク質Ｂｒｄ４によるヒストンアセチル化の阻害を通してＲＮＡ転写を低減することができる。

【0106】

代替実施形態では、本明細書に記載される方法及び化合物を使用して、調節配列領域に由来するＲＮＡの産生及び／または機能を増加することができる。いくつかの実施形態では、関心対象のＲＮＡを模倣する外因性合成ＲＮＡは、細胞に導入され得る。合成ＲＮＡは、ＲＮＡ、ＲＮＡをエンコードする核酸ベクター、またはそのようなベクターを担持するウイルスとして提供され得る。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのゲノム編集ツールを使用して、外因性合成ＲＮＡを調節配列領域中の特定部位につなぐことができる。そのようなＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のガイドＲＮＡに融合することができる。

【0107】

いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡの調整は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、調節配列領域に由来するＲＮＡの調整は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を低減する。

【0108】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物によって調整されるＲＮＡとしては、肝臓細胞（例えば、肝細胞または星細胞）中のＰＮＰＬＡ３の調節配列領域に由来するＲＮＡが挙げられる。

【0109】

ゲノム系の摂動
本明細書に記載されるＰＮＰＬＡ３に関連した遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）、ゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）、及び／または絶縁近傍（ＩＮ）の１つ以上の構成成分の挙動は、そのような特徴を含む系を摂動刺激と接触させることによって変更され得る。潜在的刺激としては、小分子、抗体、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪、核酸等の外因性生体分子、または放射線、ｐＨ、温度、イオン強度、音、光等の環境刺激を挙げることができる。

【0110】

本発明は、より良く定義された遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の明確化だけでなく、結果として生物系に関するより良い理解のための発見ツールとして役立つ。本発明は、潜在的な治療成果の演繹的な予測、ＰＮＰＬＡ３関連疾患または病態の治療、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性または薬物動態的もしくは薬力学的リスクの欠失または喪失などの新たな薬物または既知の薬物に関連する１つ以上の治療負債の低減または除去において実装されたことがない新規の化合物または標的の特定を可能にする方法で、遺伝子レベルでＰＮＰＬＡ３の遺伝子シグナル伝達を適切に定義する能力を可能にする。

【0111】

正準細胞シグナル伝達経路の遺伝子発現を変更することによる疾患の治療は、有効であることが示されている。遺伝子発現の小さな変化でさえ、疾患に対して大きな影響を有し得る。例えば、細胞死抑制に影響を及ぼすシグナル伝達経路につながるシグナル伝達中心の変化が疾患に関連している。本発明は、ＧＳＮの結合性のより決定的なセットを明確化することによって、遺伝性疾患を含む疾患に対処するための微調整された機構を提供する。疾患を治療する方法は、その疾患に関連する遺伝子に関与するシグナル伝達中心を修飾することを含み得る。そのような遺伝子は、本明細書に記載される方法を使用して明確化されることを除いて、現在は疾患に関連していない場合がある。

【0112】

摂動刺激は、小分子、既知の薬物、生物学的刺激、ワクチン、薬草調製物、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）、遺伝子もしくは細胞療法製品、または他の治療製品であり得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、摂動刺激を印加して、ＰＮＰＬＡ３遺伝子に関連するＧＳＮ、ゲノムシグナル伝達中心、及び／または絶縁近傍を摂動させることを含む、ＰＮＰＬＡ３発現の変化を引き起こす摂動刺激は、関連したＧＳＮの結合性を通知し、ＰＮＰＬＡ３関連障害に対する潜在的な標的及び／または治療を提供することができる。

【0114】

下流標的
ある特定の実施形態では、遺伝子シグナル伝達ネットワークの遺伝子の下流産生物を標的とする刺激が投与される。代替として、刺激は、少なくとも１つの下流標的の下流発現に影響を及ぼす遺伝子シグナル伝達ネットワークを崩壊させる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＰＮＰＬＡ３である。

【0115】

ｍＲＮＡ
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワークの摂動は、コヒーシンを含むアンカー部位の喪失に起因して、絶縁近傍の境界を変更することによって単一の遺伝子または複数の遺伝子セットの転写に影響を及ぼし得る。具体的に、ＧＳＣの摂動はまた、単一の遺伝子または複数の遺伝子セットの転写に影響を及ぼし得る。摂動刺激は、ＲＮＡ発現及び／またはｍＲＮＡ内の一次転写物中の配列、すなわち、エクソンもしくはスプライシングによって除去されるエクソン、すなわちイントロン間のＲＮＡ配列の修飾をもたらし得る。結果として、そのような変化は、遺伝子の遺伝子シグナル伝達ネットワーク内のシグナル伝達分子のセットのメンバーを変更することができ、それによって遺伝子シグナル伝達ネットワークの変異体を定義する。

【0116】

タンパク質
単一の絶縁近傍に関連する、または複数の絶縁近傍にわたる単一または複数の遺伝子シグナル伝達ネットワークの摂動は、単一の遺伝子またはゲノムシグナル伝達中心の一部である複数の遺伝子セット、ならびにゲノムシグナル伝達中心の下流にあるものの翻訳に影響を及ぼし得る。具体的に、ゲノムシグナル伝達中心の摂動は、翻訳に影響を及ぼし得る。摂動は、翻訳されたタンパク質の阻害をもたらし得る。

【0117】

最近傍遺伝子
摂動刺激は、一次近傍遺伝子の上流または下流に位置し得る一次最近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用を引き起こし得る。近傍遺伝子は、染色体に沿って任意の数の上流または下流遺伝子を有し得る。任意の絶縁近傍内に、一次近傍遺伝子に対する１つ以上、例えば、１、２、３、４またはそれ以上の上流及び／または下流近傍遺伝子が存在し得る。「一次近傍遺伝子」は、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子である。一次近傍遺伝子の上流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。一次近傍遺伝子の下流近傍遺伝子は、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る。

【0118】

正準細胞シグナル伝達経路
当該技術分野において詳述される正準経路と本明細書に定義される遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）との間にいくらかの重複が存在し得ることが理解される。

【0119】

正準経路は、経路をわたってある程度のメンバーの混乱（クロストーク）を許容するが、本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークの（ＧＳＮ）は、遺伝子レベルにおいて定義され、その遺伝子を発現する細胞、組織、臓器、または臓器系の任意の数の刺激または摂動に基づいて特徴付けられる。したがって、ＧＳＮの性質は、構造的（例えば、遺伝子）かつ状況的（例えば、機能、例えば、発現プロファイル）に定義される。また２つの異なる遺伝子シグナル伝達ネットワークは、メンバーを共有し得るが、依然として摂動の性質がそれらを区別し得ることにおいて固有である。したがって、治療的研究及び開発を支持する生物系の機能の明確化におけるＧＳＮの価値。

【0120】

正準経路と遺伝子シグナル伝達ネットワークとの間の関連付けが、これまで行われたことがないことを意図しないことを理解すべきであり、実際に、反対も同様である。さらなる化学的洞察のための２つのシグナル伝達パラダイムをつなげるために、正準シグナル伝達経路パラダイムを本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークと比較することは有益となるであろう。

【0121】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、転写（ＳＴＡＴ）経路のヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナル伝達因子及び活性化因子を変更することを伴う。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、多様なサイトカイン及び増殖因子の主要なメディエーターである。サイトカインは、免疫反応を調整する調節分子である。ＪＡＫは、通常はサイトカイン受容体などの細胞表面受容体と関連付けられる細胞内の非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。哺乳動物は、４つのＪＡＫ：ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、及びチロシンキナーゼ２（ＴＹＫ２）を有することが知られている。細胞表面におけるサイトカインまたは増殖因子の、それぞれの受容体への結合は、ＪＡＫのトランスリン酸化を開始し、それが下流ＳＴＡＴを活性化する。ＳＴＡＴは、活性化されるまで細胞質中に常駐する潜伏性転写因子である。７つの哺乳類ＳＴＡＴ：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５（ＳＴＡＴ５Ａ及びＳＴＡＴ５Ｂ）、ならびにＳＴＡＴ６が存在する。活性化されたＳＴＡＴは核に転位し、ここでそれらが他の核タンパク質と複合体化し、特定の配列に結合して標的遺伝子の発現を調節する。したがって、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、細胞外シグナルを転写反応に翻訳する直接機序を提供する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって調節される標的遺伝子は、免疫性、増幅、分化、アポトーシス及び発がんに関与する。ＪＡＫの活性化はまた、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を活性化することもできる。

【0122】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ｐ５３媒介性アポトーシス経路を変更することを含む。腫瘍タンパク質ｐ５３は、細胞周期を調節し、したがってがんを予防するための腫瘍抑制因子として機能する。ｐ５３は、ＤＮＡ修復タンパク質活性化し、細胞周期を保持することにより細胞増殖を停止し、アポトーシスを開始することによって、アポトーシス、血管新生の阻害及びゲノム安定性において重要な役割を果たす。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷、浸透圧ショック、酸化ストレス、または他の無数のストレッサーに反応して活性化される。活性化ｐ５３は、ｐ２１を含むＤＮＡに結合することによって、いくつかの遺伝子の発現を活性化する。ｐ２１は、Ｇ１／Ｓ移行のための重要な分子である、Ｇ１−Ｓ／ＣＤＫ複合体に結合し、次いで細胞周期の停止を引き起こす。ｐ５３は、２つの主要なアポトーシス経路：外部経路及び内部経路を通してアポトーシスを促進する。外部経路は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーに属する特定の細胞表面死受容体の活性化を伴い、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成を通して、カスパーゼ８及びカスパーゼ３を含むカスパーゼの活性化のカスケードにつながり、順にアポトーシスを誘導する。内部経路では、ｐ５３は、Ｂｃｌ−２ファミリー（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ）のマルチドメインメンバーに関与し、それと相互作用して、ミトコンドリア外膜透過を誘導する。

【0123】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔシグナル伝達経路を変更することを含む。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路は、代謝、増殖、増幅、生存、転写及びタンパク質合成を含む様々な細胞機能を調節することにおいて重要な役割を果たす。シグナル伝達カスケードは、受容体チロシンキナーゼ、インテグリン、Ｂ及びＴ細胞受容体、サイトカイン受容体、Ｇ−タンパク質共役受容体、ならびにＰＩ３Ｋによるホスファチジルイノシトール（３，４，５）トリスリン酸塩（ＰＩＰ３）の産生を誘導する他の刺激によって活性化される。セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔ（タンパク質キナーゼＢまたはＰＫＢとしても知られる）は、これらのリン脂質と相互作用し、内膜へのその転位を引き起こし、ここでそれはリン酸化され、ピルビン酸ジヒドロゲナーゼキナーゼＰＤＫ１及びＰＤＫ２によって活性化される。活性化されたＡｋｔは、細胞生存、細胞周期進行及び細胞増殖の調節に関与する多くの基質の機能を調整する。

【0124】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）依存性シグナル伝達経路を変更することを含む。Ｓｙｋは、マクロファージを含む様々な炎症細胞に関連するタンパク質チロシンキナーゼである。Ｓｙｋは、Ｆｃ受容体及びＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を活性化するシグナル伝達において重要な役割を果たす。ＩｇＧ Ｉ、ＩＩＡ、及びＩＩＩＡのＦｃ受容体がそれらのリガンドに結合する場合、受容体複合体は活性化され、免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化をトリガする。これは、様々な遺伝子を活性化し、これが単球／マクロファージ系統の細胞中で食作用を媒介する細胞骨格再配置につながる。Ｓｙｋは、Ｆｃ受容体媒介性シグナル伝達及び炎症伝播において重要な役割を果たすため、関節リウマチ及びリンパ腫などの様々な自己免疫病態の阻害のための良い標的であると考慮される。

【0125】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）／インスリン受容体（ＩｎｓＲ）シグナル伝達経路を変更することを含む。インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）は、細胞代謝、増幅、分化、及びアポトーシスなどの多くの生物学的過程を制御する。これらの効果は、それらの受容体ＩＧＦ−１Ｒに本質的なチロシンキナーゼ活性のリガンド活性化を通して媒介される。ＩｎｓＲ基質１及び２（ＩＲＳ１及びＩＲＳ２）は、重要なシグナル伝達中間物であり、それらの既知の下流エフェクターは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ１である。シグナル伝達の結果は、一時的な転写反応をもたらし、細胞増幅及び生存を含む広範囲の生物学的過程につながる。

【0126】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（ＦＬＴ３）シグナル伝達経路を変更することを含む。ＦＬＫ２（胎児肝臓キナーゼ−２）及びＳＴＫ１（ヒト肝細胞キナーゼ１）としても知られるＦＬＴ３は、受容体チロシンキナーゼクラスＩＩＩに属するサイトカイン受容体である。多くの造血性前駆細胞の表面上に発現される。ＦＬＴ３のシグナル伝達は、造血性肝細胞及び前駆細胞の正常な発達に重要である。ＦＬＴ３へのＦＬＴ３リガンドの結合は、ＰＩ３Ｋ及びＲＡＳ経路をトリガし、増加した細胞増殖及びアポトーシスの阻害につながる。

【0127】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を変更することを含む。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、組織再生、肝細胞自己更新及び臓器サイズ制御において重要な役割を果たす。細胞増幅及びアポトーシスの調節を通して、動物における臓器サイズを制御する。哺乳類無菌２０様キナーゼ（ＭＳＴ１及びＭＳＴ２）は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の重要な構成成分である。

【0128】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）経路を変更することを含む。ｍＴＯＲ経路は、細胞代謝、増殖、増幅及び生存の中心的調節因子である。ｍＴＯＲは、２つの別個の複合体：ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）及びｍＴＯＲＣ２中に存在する非典型的なセリン／トレオニンキナーゼである。ｍＴＯＲＣ１は、栄養素／エネルギー／酸化還元センサーとして機能し、タンパク質合成を制御する。増殖因子、エネルギーレベル、細胞ストレス、及びアミノ酸を含む多様な栄養要因及び環境要因を感知し、統合する。ｍＴＯＲＣ２は、アクチン細胞骨格の重要な調節因子として機能することが示されている。加えて、ｍＴＯＲＣ２はまた、ＩＧＦ−ＩＲ及びＩｎｓＲの活性化にも関与する。異常なｍＴＯＲシグナル伝達は、がん、心血管疾患、及び糖尿病を含む多くのヒト疾患につながっている。

【0129】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ３）経路を変更することを含む。ＧＳＫ３は、グリコーゲン代謝、遺伝子転写、タンパク質翻訳、細胞増幅、アポトーシス、免疫反応、及び微小管安定性を含む多くの細胞機能に関与する、構成的に活性であり、高度に保存されたセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである。ＧＳＫ３は、ＷＮＴ、増殖因子、インスリン、Ｒｅｅｌｉｎ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ヘッジホッグ経路、及びＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）への細胞反応を含む、様々なシグナル伝達経路に関与する。ＧＳＫ３は、主に細胞質中に局在するが、その細胞内局在は、刺激に反応して変化する。

【0130】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）／ＳＭＡＤシグナル伝達経路を変更することを含む。ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、細胞ホメオスタシス及び他の細胞機能を含む、成体生物及び発達中の胚の両方における多くの生物学的過程に関与する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンドとしては、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、増殖及び分化因子（ＧＤＦ）、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、アクチビン、ノーダル及びＴＧＦ−βが挙げられる。それらは、複数の細胞内経路を活性化する特定の受容体を介して作用し、一般的なメディエーターＳＭＡＤ４に関連する受容体調節ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化をもたらす。そのような複合体は、核に転位し、ＤＮＡに結合し、多くの遺伝子の転写を調節する。ＢＭＰは、骨形成、ニューロン形成、及び腹側中胚葉の特定に関与するｍＲＮＡの転写を引き起こし得る。ＴＧＦ−βは、アポトーシス、細胞外マトリクス新生及び免疫抑制に関与するｍＲＮＡの転写を引き起こし得る。それはまた、細胞周期におけるＧ１停止に関与する。アクチビンは、性腺増殖、胚分化及び胎盤形成に関与するｍＲＮＡの転写を引き起こし得る。ノーダルは、左軸及び右軸の特定、中胚葉及び内胚葉誘導に関与するｍＲＮＡの転写を引き起こし得る。ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの役割は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １３（５）：３２８−４１においてレビューされている。

【0131】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）シグナル伝達経路を変更することを含む。ＮＦ−κＢは、全ての細胞型において見出される転写因子であり、ストレス及びサイトカインなどの刺激に対する細胞反応に関与する。ＮＦ−κＢシグナル伝達は、炎症、先天性及び適応性免疫反応及びストレスにおいて重要な役割を果たす。刺激されていない細胞では、ＮＦ−κＢ二量体は、κＢの阻害剤（ＩκＢ）と呼ばれるタンパク質複合体によって細胞質中で不活的に隔離される。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）によるそのリン酸化によって開始される過程である、ＩκＢの分解を介して起こる。これは、活性なＮＦ−κＢ転写因子サブユニットが、核に転位し、標的遺伝子発現を誘導するのを可能にする。ＮＦ−κＢ活性化は、ＩκＢα遺伝子の発現をオンにして、負のフィードバックループを形成する。ＮＦ−κＢシグナル伝達の脱調節は、炎症及び自己免疫疾患及びがんにつながり得る。炎症におけるＮＦ−κＢ経路の役割は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２００９；１（６）：ａ００１６５１においてレビューされている。

【0132】

ＩＩ．パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の特徴及び特性
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３（ＰＮＰＬＡ３）遺伝子の発現を調整することを含む。ＰＮＰＬＡ３はまた、アディポヌトリン、カルシウム非依存性ホスホリパーゼＡ２−ε、アシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼ、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質３、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３、クロモソーム２２オープンリーディングフレーム２０、ＩＰＬＡ（２）ε、ＩＰＬＡ２ε、ＩＰＬＡ２−ε、Ｃ２２ｏｒｆ２０、ＡＤＰＮ、ＥＣ２．７．７．５６、ＥＣ４．２．３．４、ＥＣ３．１．１．３、及びＥＣ２．３．１．と称され得る。ＰＮＰＬＡ３は、２２ｑ１３．３１の細胞遺伝的位置を有し、ゲノム配座は、位置４３，９２３，７３９−４３，９６４，４８８における順鎖上の染色体２２上にある。ＰＮＰＬＡ５（ＥＮＳＧ０００００１００３４１）は、順鎖上のＰＮＰＬＡ３の上流にある遺伝子であり、ＳＡＭＭ５０（ＥＮＳＧ０００００１００３４７）は、順鎖上のＰＮＰＬＡ３の下流にある遺伝子である。ＰＮＰＬＡ３は、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ８０３３９、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＮＳＴ１及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子ＩＤ ＥＮＳＧ０００００１００３４４を有する。ＰＮＰＬＡ３のヌクレオチド配列は、配列番号１に示される。

【0133】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含有する絶縁近傍の組成物及び／または構造を変更することを含む。本発明は、一次ヒト肝細胞中のＰＮＰＬＡ３遺伝子を含む絶縁近傍を特定した。ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含む絶縁近傍は、位置４３，７８２，６７６〜４５，０２３，１３７における染色体２２上にあり、およそ１，２４０ｋｂのサイズを有する。絶縁近傍内のシグナル伝達中心の数は、１２である。絶縁近傍は、ＰＮＰＬＡ３及び７つの他の遺伝子、つまりＭＰＰＥＤ１、ＥＦＣＡＢ６、ＳＵＬＴ４Ａ１、ＰＮＰＬＡ５、ＳＡＭＭ５０、ＰＡＲＶＢ、及びＰＡＲＶＧを含む。絶縁近傍で特定されるクロマチンマークまたはクロマチン関連タンパク質としては、Ｈ３ｋ２７ａｃ、ＢＲＤ４、ｐ３００、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１及びＨ３Ｋ４ｍｅ３が挙げられる。絶縁近傍に関与する転写因子としては、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４ａ、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６、Ｍｙｃ、ＯＮＥＣＵＴ２及びＹＹ１が挙げられる。絶縁近傍に関与するシグナル伝達タンパク質としては、ＴＣＦ４、ＨＩＦ１ａ、ＨＮＦ１、ＥＲａ、ＧＲ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ３、ＶＤＲ、ＮＦ−κＢ、ＳＭＡＤ２／３、ＳＴＡＴ１、ＴＥＡＤ１、ｐ５３、ＳＭＡＤ４、及びＦＯＳが挙げられる。これらのシグナル伝達中心及び／またはシグナル伝達分子の任意の構成成分、または絶縁近傍内もしくはその付近の任意の領域は、絶縁近傍の組成物及び／または構造を変えるように標的または変更され得、それによってＰＮＰＬＡ３の発現を調整する。

【0134】

ＰＮＰＬＡ３は、脂肪滴関連の炭水化物調節された脂質生成及び／または脂質分解酵素をエンコードする。ＰＮＰＬＡ３は、主に肝臓（肝細胞及び肝星細胞）ならびに脂肪組織中で発現される。肝星細胞（ＨＳＣ、類洞周囲細胞またはＩｔｏ細胞とも呼ばれる）は、肝臓中の肝細胞と小血管との間に常駐する収縮細胞である。ＨＳＣは、肝線維症の過程において主要なマトリクス産生細胞として特定された。ＰＮＰＬＡ３は、グリセロリン脂質生合成、トリアシルグリセロール生合成、脂肪生成、及びエイコサノイド合成などの様々な代謝経路に関与することが知られている。

【0135】

ＰＮＰＬＡ３の変化は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、脂肪肝、アルコール性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール性脂肪肝、肝臓癌、脂質蓄積疾患、肥満及び他の遺伝性代謝障害などの代謝障害に関連する。これらの障害のうちのいずれか１つ以上は、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して治療され得る。

【0136】

残基１４８におけるイソロイシンからメチオニンへの置換（Ｉ１４８Ｍ）をエンコードする、ＰＮＰＬＡ３の多型変異ｒｓ７３８４０９ｃ／Ｇは、ＮＡＦＬＤ、脂肪肝、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ならびにその病態生物学的後遺症の線維症、硬変、及び肝細胞癌と関連付けられている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋｒａｗｃｚｙｋ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．２０１３ Ｎｏｖ；３３（４）：３６９−７９）。研究は、変更されたタンパク質が、肝臓中の脂肪の産生の増加及び分解の減少につながることを示唆している。ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍは、脂肪滴からのトリグリセリドの解放を損なうことによって脂肪肝を強化する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｒｅｐｏ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１６ Ａｕｇ；６５（２）：３９９−４１２）。最近のデータはまた、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍタンパク質が、分解を回避し、脂肪滴上に蓄積することを示唆している（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＢａｓｕＲａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１７ Ｏｃｔ；６６（４）：１１１１−１１２４）。Ｉ１４８Ｍ変異体は、成人及び子供の両方においてＮＡＦＬＤに関連するが、男性ではなく女性において優勢である。ＮＡＦＬＤの発達及び進行におけるＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ変異体の特定の機構は、以前として不明である。しかしながら、ＰＮＰＬＡ３ Ｉ１４８Ｍ変異体が、ヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化することによって、線維化の発達を促進することができ、これが順に、肝星細胞の活性化及び増幅、ならびに肝臓内細胞外マトリクスの過剰な生成及び堆積につながると考えられる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ ＬＺ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５ Ｊａｎ ２１；２１（３）：７９４−８０２）。

【0137】

Ｉ１４８Ｍ変異体はまた、アルコール性肝疾患及び臨床的に明らかなアルコール性硬変と相関している（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４２，２１−２３（２０１０））。さらに、それはアルコール性硬変を有する患者における肝細胞癌の顕著なリスク因子として特定されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｉｓｃｈａｌｋｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（１１）：ｅ２７０８７）。

【0138】

Ｉ１４８Ｍ変異体はまた、インスリン分泌レベル及び肥満に影響を及ぼす。肥満対象において、ボディマス指数及び胴囲は、変異体対立遺伝子のキャリアにおいてより高い（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＬＥ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００８ Ｎｏｖ；１５９（５）：５７７−８３）。Ｉ１４８Ｍキャリアは、経口耐糖能試験に反応して、減少したインスリン分泌を示す。Ｉ１４８Ｍ対立遺伝子キャリアは、より低いボディマス指数でよりインスリン耐性であると思われる。

【0139】

突然変異型ＰＮＰＬＡ３タンパク質は、伝統的な抗体または小分子アプローチによってアクセス可能ではなく、肝細胞及び星細胞にわたるその発現は、オリゴモダリティに対する重要な送達課題につながる。本発明は、突然変異体ＰＮＰＬＡ３の発現レベルを変更することによって、ＰＮＰＬＡ３を標的とするための新規の治療オプションを提供する。

【0140】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、コラーゲンＩ型アルファ１鎖（ＣＯＬ１Ａ１）遺伝子の発現を調整することを含む。ＣＯＬ１Ａ１は、Ｉ群コラーゲン（原線維形成コラーゲン）のメンバーである。損傷した肝臓中の肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化は、コラーゲン（ＣＯＬ１Ａ１など）の分泌及び瘢痕組織の形成につながり、これが慢性線維症または硬変の一因となる。ＰＮＰＬＡ３の発現は、活性化の初期相中に増加し、完全に活性化されたＨＳＣ中で上昇したままである。新興の証拠は、ＰＮＰＬＡ３が、ＨＳＣ活性化に関与し、その遺伝子変異体Ｉ１４８Ｍが、増加した炎症促進サイトカイン分泌などの線維化促進特徴を増強することを示唆している。ＰＮＰＬＡ３の低減は、ＣＯＬ１Ａ１レベルを含むＨＳＣ中の線維性表現型に影響を及ぼすことが報告されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒｕｓｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１７；６５（６）：１８７５−１８９０）。

【0141】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質５（ＰＮＰＬＡ５）遺伝子の発現を調整することを含む。ＧＳ２様タンパク質としても知られるＰＮＰＬＡ５は、パタチン様ホスホリパーゼファミリーのメンバーである。本発明の方法の発明者は、ＰＮＰＬＡ５が、一次肝細胞中のＰＮＰＬＡ３と同じ絶縁近傍に位置し、ＰＮＰＬＡ３と同様の化合物処理に反応することを発見した。実際に、ＰＮＰＬＡ３は、マウスにおけるＰＮＰＬＡ５と同様に定量的に発現され、調節されることを報告した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２００５；４６（１１）：２４７７−８７）。Ｌａｋｅらはまた、ＰＮＰＬＡ３発現が、絶食条件及び給餌条件の両方でＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスの肝臓中で検出不可能であったが、ｏｂ／ｏｂマウスの肝臓中で強力に誘導されたことを観察し、肝脂質生成における役割を示唆した。

【0142】

ＩＩＩ．本発明の組成物及び方法
本発明は、ＰＮＰＬＡ３の発現を調整して１つ以上のＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載される組成物及び方法のうちのいずれか１つを使用して、対象におけるＰＮＰＬＡ３関連障害を治療することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法の組み合わせを使用して、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療することができる。

【0143】

本明細書で使用される場合、「ＰＮＰＬＡ３関連障害」という用語は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現及び／またはＰＮＰＬＡ３遺伝子産生物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）の機能に関連する任意の障害、疾患、または状態を指す。そのような障害としては、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、脂肪肝、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）、アルコール性肝硬変、アルコール性脂肪肝、肝臓癌、脂質蓄積疾患、肥満、及び他の遺伝性代謝障害が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、ＮＡＦＬＤである。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、ＮＡＳＨである。いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害は、アルコール性肝疾患を含むＡＬＤである。

【0144】

「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本発明による組成物での治療が提供される動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0145】

いくつかの実施形態では、対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び／またはＡＬＤが診断され得るか、またはその症状を有し得る。他の実施形態では、対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び／またはＡＬＤにかかりやすい場合がある。対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３の発現の脱調節及び／またはＰＮＰＬＡ３タンパク質の異常な機能を有し得る。対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子内または付近に突然変異を担持し得る。いくつかの実施形態では、対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子中の突然変異Ｉ１４８Ｍを担持し得る。対象または患者は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の１つまたは２つのＩ１４８Ｍ対立遺伝子を担持する。

【0146】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して、細胞または対象におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を減少させることができる。遺伝子発現の変化は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される様々な技法、例えばＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで評価され得る。遺伝子発現の変化は、治療した細胞または対象におけるＰＮＰＬＡ３発現のレベルを、未治療または対照の細胞または対象における発現のレベルと比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、約２５％〜約５０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約８０％、８０％超、またはさらには９０％、９５％、もしくは９９％超のＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現の低減を引き起こす。

【0147】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物及び方法によって誘導されるＰＮＰＬＡ３発現の低減は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び／またはＡＬＤの少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または緩和するのに十分であり得る。

【0148】

小分子
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現を調整するために使用される化合物は、小分子を含み得る。本明細書で使用される場合、「小分子」という用語は、５０００ダルトン以下の分子量を有する任意の分子を指す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つの小分子化合物をゲノム系に適用して、絶縁近傍の境界を変更する、及び／またはシグナル伝達中心を崩壊させ、それによってＰＮＰＬＡ３の発現を調整する。

【0149】

小分子スクリーニングを実施して、絶縁近傍のシグナル伝達中心を通して作用する小分子を特定して、疾患遺伝子の選択群の発現を調整し得る遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更することができる。例えば、既知のシグナル伝達アゴニスト／アンタゴニストが投与され得る。信用できるヒットは、シグナル伝達中心を通して作用し、標的遺伝子ＰＮＰＬＡ３の発現を調整することが知られている小分子によって特定され、検証される。

【0150】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を調整することができる小分子化合物としては、アムバチニブ、ＢＭＳ−７５４８０７、ＢＭＳ−９８６０９４、ＬＹ２９４００２、モメロチニブ、パクリチニブ、ピフィスリン−μ、Ｒ７８８、ＷＹＥ−１２５１３２、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはその誘導体もしくは類似体が挙げられるが、これらに限定されない。そのような化合物のうちのいずれか１つ以上を対象に投与して、ＰＮＰＬＡ３関連障害、例えば、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、及び／またはＡＬＤを治療することができる。

【0151】

アムバチニブ
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、アムバチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＭＰ−４７０またはＨＰＫ５６としても知られているアムバチニブは、潜在的な抗新生物活性を有する経口で生物学的に利用可能な合成カルボチオアミドである。ＣＡＳ番号８５０８７９−０９−３及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ１１２８２２８３を有する。アムバチニブの構造を以下に示す。

【0152】

アムバチニブは、それぞれ１０ｎＭ、４０ｎＭ、及び８１ｎＭのＩＣ５０を有する幹細胞増殖因子受容体（ＳＣＦＲまたはｃ−Ｋｉｔ）、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）、及びＦＬＴ３の強力な多標的阻害剤である。アムバチニブはまた、多くの場合がんに関連するｃ−Ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、及びＦＬＴ３の臨床的突然変異体形態を阻害する。機械的に、アムバチニブは、そのＡＴＰ結合ドメインを占有することによってチロシンキナーゼ受容体ｃ−Ｋｉｔを阻害し、ＤＮＡ修復タンパク質Ｒａｄ５１の抑制ならびにＤＮＡ損傷誘導剤と組み合わせた相乗効果を通してＤＮＡ修復を崩壊させる。アムバチニブは、ＧＩＳＴ−４８ヒト細胞株などのいくつかのヒトがん細胞株に対する抗腫瘍活性を呈する。

【0153】

アムバチニブは、現在、固形腫瘍を治療するための単剤としてまたは化学療法と組み合わせて、第１／２相臨床治験中である。

【0154】

ＢＭＳ−７５４８０７
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＢＭＳ−７５４８０７、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＢＭＳ−７５４８０７は、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）／インスリン受容体（ＩｎｓＲ）ファミリーキナーゼの可逆的な経口的に利用可能な二重阻害剤である。ＣＡＳ番号００１３５０−９６−４及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ３２９７７４３５１を有する。ＢＭＳ−７５４８０７の構造を以下に示す。

【0155】

ＢＭＳ−７５４８０７は、それぞれ１．８ｎＭ及び１．７ｎＭのＩＣ_５０を有するＩＧＦ−１Ｒ及びＩｎｓＲを阻害する。一連の他のチロシン及びセリン／トレオニンキナーゼに対して最小効果を有する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２，７６３０−７３６３（２００９））。ＢＭＳ−７５４８０７は、ＩＧＦ−１Ｒの触媒ドメインを制限することによって、ＩＧＦ−１Ｒの可逆的ＡＴＰ競合アンタゴニストとして作用する。ＢＭＳ−７５４８０７は、複数の異種移植片腫瘍モデル（例えば、上皮、間葉、及び造血性）における腫瘍増殖を阻害する。ＢＭＳ−７５４８０７を用いた複合研究は、複数のヒト腫瘍細胞型及びマウスモデル上で行ったところ、細胞毒性剤、ホルモン剤、及び標的剤と組み合わせたときに、相乗作用（併用係数、＜１．０）を示した。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｗａｓｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １１（１２），２６４４−２６５３（２０１２）、Ｃａｒｂｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００９ Ｄｅｃ；８（１２）：３３４１−９を参照されたい。

【0156】

ＢＭＳ−９８６０９４
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＢＭＳ−９８６０９４、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＩＮＸ−０８１８９、ＩＮＸ−１８９、またはＩＤＸ−１８９としても知られるＢＭＳ−９８６０９４は、グアノシンヌクレオチド類似体（２′−Ｃ−メチルグアノシン）のプロドラッグである。ＣＡＳ番号１２３４４９０−８３−５及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ４６７００７４４を有する。ＢＭＳ−９８６０９４の構造を以下に示す。

【0157】

ＢＭＳ−９８６０９４は、もともとＩｎｈｉｂｉｔｅｘ（２０１２年にＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂによって買収される）によって開発されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５Ｂ）阻害剤である。それは、Ｃ型肝炎ウイルス感染の治療のための第ＩＩ相臨床治験中であった。しかしながら、この研究は、予想外の心臓及び腎臓の有害事象に起因して中止された。

【0158】

ＬＹ２９４００２
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＬＹ２９４００２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。２−モルホリン−４−イル−８−フェニルクロメン−４−オン、ＳＦ１１０１、またはＮＳＣ６９７２８６としても知られるＬＹ２９４００２は、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の細胞透過性広域スペクトル阻害剤である。ＣＡＳ番号１５４４４７−３６−６及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ３９７３を有する。ＬＹ２９４００２の構造を以下に示す。

【0159】

ＬＹ２９４００２は、それぞれ無細胞アッセイにおいて０．５μＭ／０．５７μＭ／０．９７μＭのＩＣ_５０を有するＰＩ３Ｋα／δ／βを阻害する。ＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位の競合阻害剤として作用する。ＬＹ２９４００２は、５０μＭにおいてもＥＧＦ受容体キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ、ＰＫＣ、ＰＩ４−キナーゼ、Ｓ６キナーゼ及びＳｒｃの活性に影響を及ぼさない（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖｌａｈｏｓ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９，５２４１−８）。ＬＹ２９４００２は、ＰＩ３Ｋ依存性Ａｋｔリン酸化及びキナーゼ活性をブロックすることが示されている。オートファーゴソームをブロックするオートファジー阻害剤としても確立されている。ＰＩ３Ｋの他に、ＬＹ２９４００２は、カゼインキナーゼＩＩなどの多くの他のタンパク質、及びＢＥＴブロモドメインの強力な阻害剤である。

【0160】

モメロチニブ
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、モメロチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。Ｎ−（シアノメチル）−４−｛２−［４−（モリホリン−４−イル）アニリノ］ピリミジン−４−イル｝ベンズアミド、ＣＹＴ−３８７、ＣＹＴ−１１３８７、またはＧＳ−０３８７としても知られるモメロチニブは、ヤヌスキナーゼＪＡＫ１及びＪＡＫ２のＡＴＰ競合阻害剤である。ＣＡＳ番号１０５６６３４−６８−４及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ２５０６２７６６を有する。モメロチニブの構造を以下に示す。

【0161】

モメロチニブは、それぞれ１１ｎＭ及び１８ｎＭのＩＣ_５０を有するＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐａｒｄａｎａｎｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００９，２３（８），１４４１−１４４５）。活性は、ＪＡＫ３（ＩＣ_５０＝１６０ｎＭ）を含む、他のキナーゼに対して著しく低い。ＪＡＫ１／２活性化の阻害は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害、したがってアポトーシスの誘導につながる。モメロチニブは、ＩＬ−３刺激Ｂａ／Ｆ３細胞中で抗増幅効果を示す。また、Ｂａ／Ｆ３−ＭＰＬＷ５１５Ｌ細胞、ＣＨＲＦ−２８８−１１細胞及びＢａ／Ｆ３−ＴＥＬ−ＪＡＫ２細胞を含む、ＪＡＫ２またはＭＰＬシグナル伝達によって構成的に活性化されたいくつかの細胞株中で細胞増幅の阻害を引き起こす。マウス骨髄増殖性腫瘍モデルにおいて、モメロチニブは、血液学的反応を誘導し、生理的レベルの炎症性サイトカインを修復する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｙｎｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１５（２５），５２３２−５２４０）。

【0162】

モメロチニブはまた、約２０ｎＭのＩＣ_５０を有するＴＹＫ２、ならびに１００ｎＭ未満のＩＣ_５０を有するＣＤＫ２、ＪＮＫ１、ＰＫＤ３、ＰＫＣｕ、ＲＯＣＫ２及びＴＢＫ１を含む他のキナーゼのスペクトルを阻害することも知られている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｙｎｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１５（２５），５２３２−５２４０）。ＴＢＫ１は、ｍＴＯＲ経路に関連付けられている。最近では、モメロチニブはまた、８ｎＭのＩＣ_５０を有する、アクチビン受容体様キナーゼ−２（ＡＬＫ２）とも呼ばれるＢＭＰＲキナーゼアクチビンＡ受容体Ｉ型（ＡＣＶＲ１）を阻害することが実証された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｓｓｈｏｆｆ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１７ １２９：１８２３−１８３０）。ＡＣＶＲ１は、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤシグナル伝達経路に関与することが知られている。

【0163】

モメロチニブは、膵臓癌及び非小細胞肺癌、ならびに骨髄増殖性障害（骨髄線維症、本態性血小板血症、真性多血症を含む）の治療のための第ＩＩＩ相治験において、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発されている。

【0164】

パクリチニブ
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、パクリチニブ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＳＢ１５１８としても知られるパクリチニブは、ＣＴｉ ＢｉｏＰｈａｒｍａによって開発された経口チロシンキナーゼ阻害剤である。ＣＡＳ番号９３７２７２−７９−２及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ４６２１６７９６を有する。パクリチニブの構造を以下に示す。

【0165】

パクリチニブは、それぞれ無細胞アッセイにおいて２３ｎＭ及び２２ｎＭの報告ＩＣ_５０値を有するヤヌス関連キナーゼ２（ＪＡＫ２）及びＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）を阻害することが知られている。酵素のＪＡＫファミリーは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介してサイトカイン媒介性シグナルを伝達する細胞内非受容体チロシンキナーゼのファミリーである。パクリチニブは、細胞ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に対する強力な効果を有し、ＪＡＫ２（Ｙ２２１）及び下流ＳＴＡＴ上のチロシンリン酸化を阻害する。パクリチニブは、ＪＡＫ２依存性細胞中のアポトーシス、細胞周期停止及び抗増幅効果を誘導する。パクリチニブはまた、ＦＬＴ３リン酸化、ならびに下流ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達を阻害する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，５４（１３），４６３８−４６５８、Ｈａｒｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１１，２５（１１），１７５１−１７５９、Ｈａｒｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ，２０１１，１（１１），ｅ４４を参照されたい。

【0166】

パクリチニブは、骨髄線維症を有する患者に対する第１相及び第２相研究において、有望な結果を実証し、症状の有効な治療を通して他のＪＡＫ阻害剤よりメリットをもたらし得る一方で、現在承認されている、また開発中のＪＡＫ阻害剤において見られるよりも、治療により現れる血小板減少症及び貧血症が少ない。

【0167】

ピフィスリン−μ
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ピフィスリン−μ、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。２−フェニルエチンスルホンアミドまたはＰＦＴ−μとしても知られるピフィスリン−μは、ｐ５３媒介性アポトーシスの阻害剤である。ＣＡＳ番号６４９８４−３１−２及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ２４７２４５６８を有する。ピフィスリン−μの構造を以下に示す。

【0168】

ピフィスリン−μは、ミトコンドリアに結合するｐ５３を干渉し、γ線に反応してマウス胸腺細胞の一次細胞培養物の急速なｐ５３依存性アポトーシスを阻害する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒｏｍ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００６，２（９），４７４−４７９）。ピフィスリン−μは、ミトコンドリア表面における抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２に対するｐ５３の結合親和性を低減する一方で、ｐ５３のトランス活性化または細胞周期チェックポイント制御機能に対する効果を示さない。ピフィスリン−μは、致死的な造血症候群を引き起こすγ線の投与からマウスを保護する。ピフィスリン−μは、ＭＤＭ２／ｐ５３結合を阻害し、ｐ５３媒介性増殖の停止及びアポトーシスを増強する、ｎｕｔｌｉｎ−３によってトリガされるアポトーシスを低減する（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｓｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ８（１１），１７１１−１７１９（２００９））。ピフィスリン−μはまた、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）と選択的に相互作用し、ＨＳＰ７０とそのコシャペロン及び基質タンパク質のうちのいくつかとの結合の崩壊につながる（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｌｅｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ３６（１），１５−２７（２００９））。

【0169】

Ｒ７８８
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、Ｒ７８８、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。フォスタマチニブ二ナトリウム六水和物、タマチニブフォスジウム、ＮＳＣ−７４５９４２としても知られるＲ７８８、またはＲ−９３５７８８は、酵素脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の経口で生物学的に利用可能な阻害剤である。ＣＡＳ番号１０２５６８７−５８−４及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ２５００８１２０を有する。Ｒ７８８の構造を以下に示す。

【0170】

Ｒ７８８は、４１ｎＭのＩＣ_５０を有するＳｙｋのＡＴＰ競合阻害剤である、活性代謝物Ｒ４０６のメチレンプロドラッグである（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂｒａｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００６，３１９（３），９９８−１００８）。Ｒ４０６は、マスト細胞中のＴ細胞及びＢ細胞中のＢ細胞リンカータンパク質ＳＬＰ６５の活性化のためのＳｙｋ基質リンカーのリン酸化を阻害する。Ｒ４０６はまた、Ｆｃ受容体シグナル伝達の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）及びＩｇＧ媒介性活性化の強力な阻害剤である。Ｒ４０６は、単球／マクロファージ及び好中球のＳｙｋ依存性Ｆｃ受容体媒介性活性化、ならびにＢリンパ球のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）媒介性活性化をブロックする。びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株の大集団において、Ｒ４０６は、０．８〜８．１μＭの範囲のＥＣ_５０値を有する細胞増幅を阻害した（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２００８，１１１（４），２２３０−２２３７）。Ｒ７８８は、ＢＣＲシグナル伝達をインビボで効果的に阻害し、悪性Ｂ細胞の増幅及び生存を低減し、治療したマウスにおける生存を著しく延長することが示された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｕｌｊａｇｉｃ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６（２３），４８９４−４９０５）。

【0171】

Ｒ７８８は、Ｒｉｇｅｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって開発され、現在は、関節リウマチ、自己免疫血小板減少症、自己免疫血友性貧血、ＩｇＡ腎症、及びリンパ腫を含む、いくつかの自己免疫疾患について臨床治験中である。

【0172】

ＷＹＥ−１２５１３２
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＷＹＥ−１２５１３２、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＷＹＥ−１３２としても知られるＷＹＥ−１２５１３２は、高度に強力なＡＴＰ競合哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤である。ＣＡＳ番号１１４４０６８−４６−１及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ２５２６０７５７を有する。ＷＹＥ−１２５１３２の構造を以下に示す。

【0173】

ＷＹＥ−１２５１３２は、０．１９ｎＭのＩＣ_５０を有するｍＴＯＲを特異的に阻害する。ｍＴＯＲ対ＰＩ３ＫまたはＰＩ３Ｋ関連キナーゼｈＳＭＧ１及びＡＴＲに対して高度に選択的である。ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）のみに対するアロステリック結合を通してｍＴＯＲを阻害するラパマイシンとは異なり、ＷＹＥ−１３２は、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方を阻害する。ＷＹＥ−１３２は、ＭＤＡ３６１乳房、Ｕ８７ＭＧグリオーマ、Ａ５４９及びＨ１９７５肺、ならびにＡ４９８及び７８６−Ｏ腎腫瘍を含む、様々な腫瘍細胞株に対する抗増殖活性を示す。ＷＹＥ−１３２は、タンパク質合成及び細胞サイズの阻害、アポトーシスの誘導、ならびに細胞周期の進行を引き起こす。

【0174】

ＸＭＵ−ＭＰ−１
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整することができる化合物は、ＸＭＵ−ＭＰ−１、またはその誘導体もしくは類似体を含み得る。ＡＫＯＳ０３０６２１７２５、ＺＩＮＣ４９８０３５５９５、ＣＳ−５８１８、またはＨＹ−１００５２６としても知られるＭＵ−ＭＰ−１は、哺乳類無菌２０様キナーゼ１及び２（ＭＳＴ１／２）の可逆的で強力な選択的阻害剤である。ＣＡＳ番号２０６１９８０−０１−４及びＰｕｂＣｈｅｍ化合物ＩＤ１２１４９９１４３を有する。ＸＭＵ−ＭＰ−１の構造を以下に示す。

【0175】

ＸＭＵ−ＭＰ−１は、それぞれ７１．１±１２．９ｎＭ及び３８．１±６．９ｎＭのＩＣ_５０値を有するＭＳＴ１及びＭＳＴ２を阻害する。ＭＳＴ１及びＭＳＴ２は、組織再生、肝細胞自己更新及び臓器サイズ制御において重要な役割を果たすＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の中心的構成成分である。ＭＳＴ１／２キナーゼ活性の阻害は、下流エフェクターＹｅｓ関連タンパク質を活性化し、細胞増殖につながる。ＸＭＵ−ＭＰ−１は、優れたインビボ薬物動態を示し、腹腔内注入を介して、１〜３ｍｇ／ｋｇの用量で急性及び慢性両方の肝傷害マウスモデルにおけるマウス腸修復ならびに肝臓修復及び再生を促進する。ＸＭＵ−ＭＰ−１治療は、ビヒクル治療された対照よりもＦａｈ欠損マウスモデルにおいてヒト肝細胞の実質的に優れた再増殖率を呈し、ＸＭＵ−ＭＰ−１治療がヒト肝臓再生を促進し得ることを示す。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６，８（３５２）：３５２ｒａ１０８を参照されたい。

【0176】

他の化合物
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、他の肝疾患、障害、またはがんを治療するために使用される化合物を含み得る。例えば、化合物は、形質転換増殖因子β受容体１（ＴＧＦＲ１）の活性を阻害するアミノピリジルオキシピラゾール化合物などのＷＯ２０１６０５７２７８Ａ１；ＬＹ５８２５６３などのＷＯ２００３０５０１２９Ａ１；ｍＦＬＩＮＴなどのＷＯ１９９９０５０４１３Ａ２；４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−（（２Ｓ）−１−（（９−メトキシ−３，３−ジメチル−５−オキソ−２，３，５，６−テトラヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−６−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）ブタンアミドまたはＮ−（（２Ｓ）−１−（（８，８−ジメチル−６−オキソ−６，８，９，１０−テトラヒドロ−５Ｈ−ピリド［３，２−ｆ］ピロロ［１，２−ａ］アゼピン−５−イル）アミノ）−１−オキソプロパン−２−イル）−４，４，４−トリフルオロブタンアミドなどのＷＯ２０１７００７７０２Ａ１；Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミド、５−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−フルオロ−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル］−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（３，３−ジフルオロ−（４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、５−（５，５−ジメチル−６−オキソ−１，４−ジヒドロピリダジン−３−イル）−Ｎ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）チオフェン−２−スルホンアミド、またはＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（１Ｒ，３Ｒ）−３−ヒドロキシシクロペンチル］チオフェン−２−スルホンアミド、またはＮ−（６−フルオロ−１−オキソ−１，２−ジヒドロイソキノリン−７−イル）−５−［（３Ｒ）−３−ヒドロキシピロリジン−１−イル］チオフェン−２−スルホンアミドなどのＷＯ２０１６０８９６７０Ａ１；８−メチル−２−［４−（ピリミジン−２−イルメチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、８−メチル−２−［４−（１−ピリミジン−２−イルエチル）ピペラジン−１−イル］−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−クロロピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（４−メトキシピリミジン−２−イル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−ブロモ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−クロロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、２−［４−［（３−フルオロ−２−ピリジル）メチル］ピペラジン−１−イル］−８−メチル−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−４−オン、または２−［［４−（８−メチル−４−オキソ−３，５，６，７−テトラヒドロピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−２−イル）ピペラジン−１−イル］メチル］ピリジン−３−カルボニトリルなどのＷＯ２０１５０６９５１２Ａ１；２−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］プロパン−１−スルホンアミドまたは２−メトキシ−Ｎ−［２−［２−（３−ピリジルオキシ）アセチル］−３，４−ジヒドロ−１Ｈ−イソキノリン−６−イル］エタンスルホンアミドなどのＷＯ２０１５０５４０６０Ａ１；４，４，４−トリフルオロ−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−５−（２−ヒドロキシエチル）−６−オキソ−７Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］［３］ベンザゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソ−エチル］ブタンアミドなどのＷＯ２０１３０１６０８１Ａ１；８−［５−（１−ヒドロキシ−１−メチルエチル）ピリジン−３−イル］−１−［（２Ｓ）−２−メトキシプロピル］−３−メチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−２−オンなどのＷＯ２０１２０９７０３９Ａ１；（Ｒ）−［５−（２−メトキシ−６−メチル−ピリジン−３−イル）−２Ｈ−ピラゾール−３−イル］−［６−（ピペリジン−３−イルオキシ）−ピラジン−２−イル］−アミンなどのＷＯ２０１２０６４５４８Ａ１；４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンザミドなどのＷＯ２０１０１４７９１７Ａ１；（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールまたは（Ｒ）−（Ｅ）−２−（４−（２−（５−（１−（３，５−ジクロロピリジン−４−イル）エトキシ）−１Ｈ−インダゾール−３−イル）ビニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）エタノールなどのＵＳ８，２６８，８６９Ｂ２；５−（５−（２−（３−アミノプロポキシ）−６−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）ピラジン−２−カルボニトリルなどのＷＯ２０１００７７７５８Ａ１；エンザスタウリンなどのＷＯ２０１００７４９３６Ａ２；四置換ピリダジンなどのＷＯ２０１００５６５８８Ａ１及びＷＯ２０１００５６６２０Ａ１；１，４−二置換フタラジンなどのＷＯ２０１００６２５０７Ａ１；二置換フタラジンなどのＷＯ２００９１３４５７４Ａ２；突然変異体ＲａｓへのＧＴＰ結合の阻害剤としてのウイノキサリン−５，８−ジオン誘導体などのＷＯ１９９９０５２３６５Ａ１；ラロキシフェンなどのＵＳ５，６８６，４６７Ａ、ＵＳ５，５７４，０４７Ａ、ならびに置換インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ナフタレン、またはジヒドロナフタレンなどのＵＳ６，１２４，３１１に示される肝線維症、肝不全、肝硬変、または肝臓癌の治療のために企図されるものから選択され得る（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ヤヌスキナーゼ阻害剤であり得、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−０４９６５８４２、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ８６８、フェドラチニブ、ＡＣ４３０、ＡＴ９２８３、ａｔｉ−５０００１及びａｔｉ−５０００２、ＡＺ９６０、ＡＺＤ１４８０、ＢＭＳ−９１１５４３、ＣＥＰ−３３７７９、セルデュラチニブ（ＰＲＴ０６２０７０、ＰＲＴ２０７０）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−５０９）、フェドラチニブ（ＳＡＲ３０２５０３、ＴＧ１０１３４８）、ＦＬＬＬ３２、ＦＭ−３８１、ＧＬＰＧ０６３４類似体、Ｇｏ６９７６、ＪＡＮＥＸ−１（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、モメロチニブ（ＣＹＴ３８７）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ０１５Ｋ、ＪＮＪ−５４７８１５３２）、ＰＦ−０６６５１６００、ＰＦ−０６７００８４１、Ｒ２５６（ＡＺＤ０４４９）、ソルシチニブ（ＧＳＫ２５８６１８４またはＧＬＰＧ０７７８）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４）、ＴＧ１０１２０９、トファシチニブ（ＣＰ−６９０５５０）、ＷＨＩ−Ｐ１５４、ＷＰ１０６６、ＸＬ０１９、ＺＭ３９９２３ＨＣｌ、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、ｍＴＯＲ経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ｍＴＯＲキナーゼ阻害剤であり得、アピトリシブ（ＧＤＣ−０９８０、ＲＧ７４２２）、ＡＺＤ８０５５、ＢＧＴ２２６（ＮＶＰ−ＢＧＴ２２６）、ＣＣ−２２３、クリソファン酸、ＣＺ４１５、ダクトリシブ（ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＧＤＣ−０３４９、ジェダトリシブ（ＰＦ−０５２１２３８４、ＰＫＩ−５８７）、ＧＳＫ１０５９６１５、ＩＮＫ１２８（ＭＬＮ０１２８）、ＫＵ−００６３７９４、ＬＹ３０２３４１４、ＭＨＹ１４８５、オミパリシブ（ＧＳＫ２１２６４５８、ＧＳＫ４５８）、ＯＳＩ−０２７、パロミド５２９（Ｐ５２９）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＰＩ−１０３、ＰＰ１２１、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−８６６９）、ＳＦ２５２３、タクロリムス（ＦＫ５０６）、テムシロリムス（ＣＣＩ−７７９、ＮＳＣ６８３８６４）、トリン１、トリン２、トリキニブ（ＰＰ２４２）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ２０１４）、ボキシタリシブ（ＳＡＲ２４５４０９、ＸＬ７６５）類似体、ボキシタリシブ（ＸＬ７６５、ＳＡＲ２４５４０９）、ＷＡＹ−６００、ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）、ＷＹＥ−３５４、ＷＹＥ−６８７、ＸＬ３８８、ゾタロリムス（ＡＢＴ−５７８）、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0179】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、Ｓｙｋ経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、Ｓｙｋ阻害剤であり得、Ｒ７８８、タマチニブ（Ｒ４０６）、エントスプレチニブ（ＧＳ−９９７３）、ニルバジピン、ＴＡＫ−６５９、ＢＡＹ−６１−３６０６、ＭＮＳ（３，４−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−０６０３１８、ＰＲＴ０６２６０７（Ｐ５０５−１５、ＢＩＩＢ０５７）、ＰＲＴ２７６１、ＲＯ９０２１、セルデュラチニブ、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤であり得、イブルチニブ、ＯＮＯ−４０５９、ＡＣＰ−１９６、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＰＩ３Ｋ阻害剤であり得、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ、ＴＧＲ−１２０２、ＧＳ−９８２０、ＡＣＰ−３１９、ＳＦ２５２３、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、ＧＳＫ３経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＧＳＫ３阻害剤であり得、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、及び本明細書に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0181】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＡＣＶＲ１阻害剤であり得、モメロチニブ、ＢＭＬ−２７５、ＤＭＨ−１、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ０２２８８、ＬＤＮ−１９３１８９、ＬＤＮ−２１２８５４、及びＭＬ３４７が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＳＭＡＤ３阻害剤であり得、ＳＩＳ３が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＳＭＡＤ４阻害剤であり得る。

【0182】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害の治療のための化合物は、ＮＦ−κＢ経路を阻害する化合物を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような化合物は、ＡＣＨＰ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ１１−７０８５、Ｂａｙ１１−７８２１、ベンガミドＢ、ＢＩ６０５９０６、ＢＭＳ３４５５４１、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ１２、セラストロール、ＣＩＤ２８５８５２２、ＦＰＳ ＺＭ１、グリオトキシン、ＧＳＫ３１９３４７Ａ、ホノキオール、ＨＵ２１１、ＩＫＫ１６、ＩＭＤ０３５４、ＩＰ７ｅ、ＩＴ９０１、ルテオリン、ＭＧ１３２、ＭＬ１２０Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ１３０、パルテノリド、ＰＦ１８４、ピセアタンノール、ＰＲ３９（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ１１４５ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ１０６−９９２０、ＳＣ５１４、ＳＰ１０００３０、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−１、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ２００８０４３１５７Ａ１の表１〜３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0183】

ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を変更するための化合物は、ポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産生物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述の他の同等物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であり得るか、または二量体、三量体、もしくは四量体などの多分子複合体であり得る。それらはまた、一本鎖または多鎖ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ポリペプチドという用語はまた、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

【0184】

抗体
いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を変更するための化合物は、抗体を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体、抗体断片、それらの変異体または誘導体を含む本発明の抗体は、遺伝子シグナル伝達ネットワークまたはＰＮＰＬＡ３を含有する絶縁近傍に関連するネットワークの少なくとも１つの分子と特異的に免疫反応性である。抗体または抗体の断片を含む本発明の抗体はまた、ＰＮＰＬＡ３上の標的部位に結合し得る。

【0185】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の生物活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（（例えば、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、及びダイアボディなどの抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、主にアミノ酸系分子であるだけでなく、糖部分を有するなど、１つ以上の修飾も含み得る。

【0186】

「抗体断片」は、無傷抗体の一部分を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を産生する。残基「Ｆｃ」断片もまた産生され、その名前は、それが容易に結晶化する能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有しながら依然として抗原に架橋し得る、Ｆ（ａｂ′）_２断片が得られる。本発明の抗体は、これらの断片のうちの１つ以上を含み得る。本明細書の目的に関しては、「抗体」は、重及び軽可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含み得る。

【0187】

「未変性抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、いくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。

【0188】

本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」という用語は、配列が抗体間で大きく異なり、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用される特定の抗体ドメインを指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含有する抗体断片を指す。この領域は、緊密な非共有結合性会合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。

【0189】

任意の脊椎動物種由来の抗体「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κとλと呼ばれる２つの明確に異なる型のいずれかに割り当てることができる。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てられ得る。無傷抗体には５つの主要なクラス、すなわち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。

【0190】

本明細書で使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは一緒に、単一のポリペプチド鎖に結合される。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする。

【0191】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメインＶ_Ｌに接続した重鎖可変ドメインＶ_Ｈを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させて、２つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに詳述されており、これらの各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

【0192】

本発明の抗体は、当該技術分野において既知の方法によって産生されるか、または本出願に記載されるポリクローナルまたはモノクローナルまたは組み換えであり得る。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の細胞（またはクローン）の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じエピトープに結合するが、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体は除外され、そのような変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。

【0193】

「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されないものとする。本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または同種である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体の断片が含まれる。

【0194】

「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の抗体からの超可変領域からの残基によって置き換えられる、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。

【0195】

「超可変領域」という用語は、抗体を参照して本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む抗体の抗原結合ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」は、その標的抗原またはエピトープに相補的である構造を含む抗体の領域を指す。

【0196】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、抗体模倣体であり得る。「抗体模倣体」という用語は、抗体の機能または効果を模倣し、それらの分子標的に特異的に高い親和性で結合する任意の分子を指す。そのようなものとして、抗体模倣体は、ナノボディ等を含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、抗体模倣体は、当該技術分野において既知のものであり得、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ及びＫｕｎｉｔｚ、ならびにドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、抗体模倣体は、１つ以上の非ペプチド領域を含み得る。

【0198】

本明細書で使用される場合、「抗体変異体」という用語は、未変性抗体と比較してアミノ酸配列、組成物または構造にいくつかの相違を含む、構造及び／または機能において抗体に似ている生体分子を指す。

【0199】

モノクローナルであるかポリクローナルであるかにかかわらず、抗体の調製は当該技術分野において既知である。抗体の産生のための技法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ″Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ″Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ″Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９に記載されている。

【0200】

本発明の抗体は、それらの標的分子（複数可）、それらを生成するために使用される抗原、それらの機能（アゴニストとしてもしくはアンタゴニストとして）及び／またはそれらが機能する細胞ニッチを特徴とし得る。

【0201】

抗体機能の測定は、インビトロまたはインビボで正常な生理的条件下、標準に対して行われ得る。測定はまた、抗体の存在または非存在に対して行われ得る。そのような測定方法には、血清または血液などの組織または流体中の標準測定、例えば、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、活性アッセイ、レポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アレイ、遺伝子アレイ、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲ等が含まれる。

【0202】

本発明の抗体は、結合を介して（可逆的または不可逆的に）１つ以上の標的部位にそれらの効果を及ぼす。理論に束縛されるものではないが、抗体の結合部位を表す標的部位は、最も多くの場合、タンパク質またはタンパク質ドメインまたは領域によって形成される。しかしながら、標的部位はまた、糖、脂質、核酸分子または任意の他の形態の結合エピトープなどの生体分子を含み得る。

【0203】

代替として、または追加として、本発明の抗体は、結合またはコンジュゲートされた薬物ペイロードを特定の標的部位に送達または輸送するように作用する、リガンド模倣体または非伝統的なペイロードキャリアとして機能し得る。

【0204】

本発明の抗体によって引き出される変化は、細胞中の新形態変化をもたらし得る。本明細書で使用される場合、「新形態変化」は、新たなまたは異なる変化または変更である。そのような変化は、細胞外、細胞内及び細胞間シグナル伝達を含む。

【0205】

いくつかの実施形態では、本発明の化合物または薬剤は、タンパク分解性事象を変更または制御するように作用する。そのような事象は、細胞内または細胞外であり得る。

【0206】

本発明の化合物、ならびにそれらを生成するために使用される抗原は、主にアミノ酸系分子である。これらの分子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」であり得る。

【0207】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、２〜５０個以上のアミノ酸を有するアミノ酸系分子を指す。特別な指示語が、より小さいペプチドに適用され、「ジペプチド」は、２つのアミノ酸分子を指し、「トリペプチド」は、３つのアミノ酸分子を指す。５０を超える連続アミノ酸を有するアミノ酸系分子は、ポリペプチドまたはタンパク質とみなされる。

【0208】

「アミノ酸」及び「アミノ酸」という用語は、全て天然に存在するＬ−α−アミノ酸ならびに非天然に存在するアミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のような１文字または３文字のいずれかの指示語によって特定され：アスパラギン酸（Ａｓｐ：Ｄ）、イソロイシン（Ｉｌｅ：Ｉ）、トレオニン（Ｔｈｒ：Ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ：Ｌ）、セリン（Ｓｅｒ：Ｓ）、チロシン（Ｔｙｒ：Ｙ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ：Ｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ：Ｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ：Ｈ）、グリシン（Ｇｌｙ：Ｇ）、リジン（Ｌｙｓ：Ｋ）、アラニン（Ａｌａ：Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ：Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ：Ｃ）、トリプトファン（Ｔｒｐ：Ｗ）、バリン（Ｖａｌ：Ｖ）、グルタミン（Ｇｌｎ：Ｑ）、メチオニン（Ｍｅｔ：Ｍ）、アスパラギン（Ａｓｎ：Ｎ）、アミノ酸は、最初にそれぞれ３文字コード及び１文字コードによって挿入句的に列挙される。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＷＯ２００７０４４４１１及びＷＯ２０１５１００１０４Ａ１に示されるものなどの抗体を使用して、ＮＡＳＨを治療することができる。

【0210】

ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション機構を介して機能するものを含むオリゴヌクレオチドは、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ構築物（ｓｉＲＮＡ、ｓａＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ等を含む）、アプタマー及びリボザイムなどの一本鎖または二本鎖にかかわらず、ＰＮＰＬＡ３に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワークを変更するために、または摂動刺激として使用され得る。

【0211】

いくつかの実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＰＮＰＬＡ３発現を調節する経路に関与するシグナル伝達分子をノックダウンすることができ、それによりＰＮＰＬＡ３発現は、シグナル伝達分子の非存在下で低減される。例えば、経路がＰＮＰＬＡ３発現を正に調節することが特定されると、その経路の構成成分（例えば、受容体、タンパク質キナーゼ、転写因子）は、ＲＮＡｉ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）でノックダウンされ、ＰＮＰＬＡ３発現の活性化を低減することができる。

【0212】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＪＡＫ１をノックダウンする。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＪＡＫ２をノックダウンする。

【0213】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、Ｓｙｋ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＳＹＫをノックダウンする。

【0214】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ｍＴＯＲ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ｍＴＯＲをノックダウンする。

【0215】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ＰＤＧＦＲ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＰＤＧＦＡをノックダウンする。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＰＤＧＦＲＢをノックダウンする。

【0216】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ＧＳＫ３経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＧＳＫ３をノックダウンする。

【0217】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＡＣＶＲ１をノックダウンする。別の実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＳＭＡＤ３をノックダウンする。さらに別の実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＳＭＡＤ４をノックダウンする。

【0218】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３発現を低減するために本発明のハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）で標的とされる経路は、ＮＦ−κＢ経路である。一実施形態では、ハイブリダイジングオリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＮＦ−κＢをノックダウンする。

【0219】

いくつかの実施形態では、上記のハイブリダイジングオリゴヌクレオチドを別のハイブリダイジングオリゴヌクレオチドと一緒に使用して、同じ経路において複数の構成成分を標的とするか、または異なる経路からの複数の構成成分を標的として、ＰＮＰＬＡ３発現を低減することができる。そのような複合療法は、ＰＮＰＬＡ３発現を正に調節する複数のシグナル伝達分子及び／または経路を同時にブロックすることによって、付加的または相乗的効果を達成することができる。

【0220】

そのようなオリゴヌクレオチドはまた、治療薬としても役立ち得るため、それらの治療負債及び治療成果は、それぞれ本発明の遺伝子シグナル伝達ネットワークを調べることによって改善または予測され得る。

【0221】

ゲノム編集アプローチ
ある特定の実施形態では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現は、ＰＮＰＬＡ３に関連する絶縁近傍（複数可）及び／またはゲノムシグナル伝達中心（複数可）を定義する染色体領域を変更することによって調整され得る。例えば、ＰＮＰＬＡ３産生は、ＰＮＰＬＡ３を含有する絶縁近傍に関連する遺伝子シグナル伝達ネットワーク（複数可）の分子のメンバーのうちのいずれか１つを標的とすることによって低減または排除され得る。

【0222】

絶縁近傍に付随する遺伝子発現を変更する方法は、シグナル伝達中心を変更すること（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを使用して、シグナル伝達中心結合部位を変化させるか、または突然変異した場合に修復／置換する）ことを含む。これらの変更は、早期の／不適切な細胞死経路の活性化（多くの免疫障害の鍵となる）、過少／過剰な遺伝子産生物の産生（可変抵抗器仮説としても知られる）、過少／過剰な酵素の細胞外分泌の産生、系統分化の防止、系統経路の切り替え、幹細胞性の促進、自己調節フィードバックループで開始または干渉、細胞代謝におけるエラーの開始、不適切な刷り込み／遺伝子サイレンシング、及び傷のあるクロマチン状態の形成を含む、様々な結果をもたらし得る。追加として、当該技術分野において周知のものを含むゲノム編集アプローチを使用して、コヒーシンネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすことによって新たなシグナル伝達中心を作成することができる。

【0223】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるゲノム編集アプローチは、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、ゲノム内の特定の位置に一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断を導入する方法を含み得る。そのような切断は、相同指向型修復（ＨＤＲ）及び非相同末端接合（ＮＨＥＪ）などの内因性細胞プロセスであり得、定期的に修復される。ＨＤＲは、本質的に、相同ＤＮＡ配列の存在下で二本鎖ＤＮＡ切断を修復する誤りのない機構である。ＨＤＲの最も一般的な形態は、相同組換えである。それは、特定のＤＮＡ配列を切断ポイントで挿入または置換するためのテンプレートとして、相同配列を利用する。相同ＤＮＡ配列のテンプレートは、内因性配列（例えば、姉妹染色分体）または外因性もしくは供給された配列（例えば、プラスミドもしくはオリゴヌクレオチド）であり得る。そのようなものとして、ＨＤＲを利用して、所望の領域における置換または挿入などの精密な変更を導入することができる。対照的に、ＮＨＥＪは、二本鎖切断から生じるＤＮＡ末端を直接接合する誤りがちな修復機構であり、切断部位においていくつかのヌクレオチドを喪失、付加または突然変異させる可能性がある。得られる小さな欠失または挿入（「インデル」と呼ばれる）または突然変異は、遺伝子発現を崩壊または強化し得る。追加として、同じＤＮＡ上に２つの切断が存在する場合、ＮＨＥＪは、介在セグメントの欠失または逆転につながり得る。そのため、ＮＨＥＪを利用して、切断部位に挿入、欠失または突然変異を導入することができる。

【0224】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ＣＴＣＦアンカー部位を欠失し、そのアンカー部位に関連する絶縁近傍内の遺伝子発現を調整することができる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｈｎｉｓｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １７，２０１６を参照されたい。絶縁近傍の境界の崩壊は、関連したシグナル伝達中心の適切な機能に必要な相互作用を防止する。欠失した近傍境界に直ぐ隣接する発現遺伝子の変化もまた、そのような崩壊に起因して観察されている。

【0225】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、既存のＣＴＣＦアンカー部位を修飾することができる。例えば、既存のＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを有するＮＨＥＪを誘導することによって突然変異もしくは逆転され得るか、または触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及び１つ以上のガイドＲＮＡと標的結合することによってマスクされ得る。既存のＣＴＣＦアンカー部位の変更は、既存の絶縁近傍の形成を崩壊させ、これらの絶縁近傍内に位置する遺伝子の発現を変更し得る。

【0226】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、新たなＣＴＣＦアンカー部位を導入することができる。ＣＴＣＦアンカー部位は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ、１つ以上のガイドＲＮＡ、及びＣＴＣＦアンカー部位の配列を含有するドナーテンプレートを有する選択部位にＨＤＲを誘導することによって導入され得る。新たなＣＴＣＦアンカー部位の導入は、新たな絶縁近傍を作成する、及び／または既存の絶縁近傍を変更することができ、それがこれらの絶縁近傍の隣に位置する遺伝子の発現に影響を及ぼし得る。

【0227】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、シグナル伝達中心結合部位を変えることによってシグナル伝達中心を変更することができる。例えば、シグナル伝達中心結合部位が、関連した転写因子とのシグナル伝達中心のアセンブリに影響を及ぼす突然変異を含む場合、突然変異部位は、供給された訂正ドナーテンプレートの存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ及び１つ以上のガイドＲＮＡを使用して、突然変異またはその付近に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することによって修復され得る。

【0228】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、絶縁近傍（例えば、エンハンサー）内の領域に結合することによって近傍遺伝子の発現を調整し、転写をブロックすることができる。そのような結合は、シグナル伝達中心への転写因子の動員及び転写の開始を防止し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＤＮＡを切断しない触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であり得る。

【0229】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、これらの遺伝子のコード領域における短い欠失の導入を介して近傍遺伝子の発現をノックダウンすることができる。修復されたとき、そのような欠失は、フレームシフトをもたらし、遺伝子によって産生されたｍＲＮＡ中に早期停止コドン、続いてナンセンス変異依存分解機構を介してｍＲＮＡ分解を導入する。これは、シグナル伝達経路の活性化及び抑制構成成分の発現の調整に有用であり得、ＰＮＰＬＡ３などの疾患遺伝子を含むこれらの経路の制御下で、遺伝子発現の減少または増加をもたらす。

【0230】

他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、結合ネックレスを変更するか、または遺伝子及びエンハンサーを動かすこともできる。

【0231】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼを利用して、特定の配列を標的とし、標的核酸を分解する細菌適応免疫系である。それらは、ゲノム編集及び／または転写調整の分野における様々な適用における使用のために適応されている。当該技術分野において既知または本明細書に開示される酵素またはオルソログのうちのいずれかを、ゲノム編集のために本明細書における方法で利用することができる。

【0232】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系であり得る。Ｃａｓ９は、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）及びＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と一緒に機能して、二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。２つのＲＮＡを操作して、ｃｒＲＮＡの３′端をｔｒａｃｒＲＮＡの５′端にリンカーループを用いて接続することによって、単一分子ガイドＲＮＡを形成することができる。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＲＮＡプログラム可能なゲノム編集に有用であることを示し、国際特許出願第ＷＯ２０１３／１７６７７２は、部位特異的遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ系の多くの例及び適用を提供し、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓに由来するものが含まれる。

【0233】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系であり得る。Ｃｐｆ１は、単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり、ＩＩ型系と対照的にｔｒａｃｒＲＮＡが欠如している。Ｃｐｆ１は、４または５ヌクレオチド５′オーバーハングを有するねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断を産生する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｏｃｔ ２２；１６３（３）：７５９−７１は、ゲノム編集適用において使用され得るＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの例を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系には、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、及びラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に由来するものが含まれる。

【0234】

ある特定の実施形態では、１つまたは他のヌクレアーゼドメインを不活化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのニッカーゼ変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ゲノム編集の特異性を高めることができる。ニッカーゼは、ＨＤＲ対ＮＨＥＪを促進することが示されている。ＨＤＲは、個々のＣａｓニッカーゼから向けられることもあれば、標的エリアに隣接するニッカーゼの対を用いて向けられることもある。

【0235】

ある特定の実施形態では、触媒不活性のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、標的領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）に結合し、それらの機能を干渉し得る。Ｃａｓ９及びＣｐｆ１などのＣａｓヌクレアーゼは、２つのヌクレアーゼドメインを包含する。触媒部位における重要な残基を突然変異させることは、標的部位にのみ結合するが、切断をもたらさらない変異体を作成する。染色体領域（例えば、ＣＴＣＦアンカー部位またはエンハンサー）への結合は、絶縁近傍またはシグナル伝達中心の適切な形成を崩壊させ、したがって標的領域の隣に位置する遺伝子の変化した発現につながり得る。

【0236】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは酵素に融合された追加の機能的ドメイン（複数可）を含み得る。機能的ドメインは、転写活性化、転写抑制、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、及び／またはクロマチンリモデリングを含むが、これらに限定されないプロセスに関与し得る。そのような機能的ドメインには、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４もしくはＫＲＡＢ、ＳＩＤもしくはＳＩＤ４Ｘ）、転写リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能ドメインまたは化学的誘導性／制御可能ドメインが含まれるが、これらに限定されない。

【0237】

ある特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼまたは酵素は、以下のうちの１つまたは組み合わせとして細胞または患者に投与され得る：１つ以上のポリペプチド、ポリペプチドをエンコードする１つ以上のｍＲＮＡ、またはポリペプチドをエンコードする１つ以上のＤＮＡ。

【0238】

ガイド核酸
ある特定の実施形態では、ガイド核酸を使用して、関連したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を標的核酸内の特定の標的配列に指向することができる。ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素とのそれらの結合によって、ガイド核酸及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体に対する標的特異性を提供し、したがってガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の活性を指向することができる。

【0239】

一態様では、ガイド核酸は、ＲＮＡ分子であり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡであり得る。一態様では、ガイドＲＮＡは、化学的に修飾され得る。

【0240】

ある特定の実施形態では、複数のガイドＲＮＡは、ゲノム内の異なる部位において複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性活性を媒介するために提供され得る。

【0241】

ある特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、１つ以上のＲＮＡ分子またはＲＮＡ配列をエンコードする１つ以上のＤＮＡとして細胞または患者に投与され得る。

【0242】

リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素及びガイド核酸は各々、細胞または患者に別個に投与され得る。

【0243】

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、１つ以上のガイド核酸と予め複合体化され得る。次に、予め複合体化された材料を細胞または患者に投与することができる。このような予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られている。

【0244】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ある特定の実施形態では、本発明のゲノム編集アプローチは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用を伴う。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ＤＮＡ切断ドメインに結合している遺伝子操作ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインから構成されたモジュラータンパク質である。典型的なＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインである。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能することから、ＺＦＮの対は、対向ＤＮＡ鎖上の同族の標的「半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に対し、それら２つが触媒活性のＦｏｋＩドメインが二量体化できるようにするための正確な間隔を開けて結合するように操作されなければならない。それ自体は配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量体化すると、ＺＦＮ半部位間でゲノム編集の開始ステップとしてのＤＮＡ二本鎖切断がもたらされる。

【0245】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ある特定の実施形態では、本発明のゲノム編集アプローチは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を伴う。ＴＡＬＥＮは、別のフォーマットのモジュラーヌクレアーゼに相当し、これはＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合することによって生成され、同時並行的に作動して標的化されたＤＮＡ切断を達成する。ＺＦＮ中のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーモチーフからなるが、ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質に由来し、これは本来植物病原性微生物のキサントモナス種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）において説明されている。ＴＡＬＥは、３３〜３５アミノ酸リピートの直列アレイから構成され、各リピートは、典型的には長さ最大２０ｂｐの標的ＤＮＡ配列（標的配列の全長は最大４０ｂｐとなる）内で単一の塩基対を認識する。各リピートのヌクレオチド特異性は、位置１２及び１３にちょうど２つのアミノ酸を含む反復可変２残基（ＲＶＤ）によって決定される。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、それぞれ４つのＲＶＤ：Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって主に認識される。これは、ジンクフィンガーの場合よりもはるかに簡略な認識コードを構成するため、ヌクレアーゼ設計に関してはジンクフィンガーをしのぐ優位性に相当する。それでもＺＦＮと同様、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用は特異性において絶対的ではないため、ＴＡＬＥＮも、ＦｏｋＩドメインの偏性ヘテロ二量体変異体の使用による恩恵を受けてオフターゲット活性を低減している。

【0246】

ＩＶ．製剤及び送達
薬学的組成物
本発明に従い、組成物は薬学的組成物として調製され得る。そのような組成物は、１つ以上の活性成分、及び最も多くの場合、薬学的に許容される賦形剤を含む必要がある。

【0247】

本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

【0248】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物は、少なくとも１つのペイロードを含み得る。非限定例として、薬学的組成物は、１、２、３、４または５つのペイロードを含み得る。

【0249】

本明細書に提供される薬学的組成物に関する説明は、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を主に対象としているが、そのような組成物が、一般に任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることは、当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投に好適にするためのヒトへの投与に好適な薬学的組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣薬理学者は、存在する場合は単に通常の実験によって、そのような修飾を設計及び／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットなどの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／または七面鳥などの商業的に関連する鳥類を含む鳥類が含まれるが、これらに限定されない。

【0250】

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。

【0251】

製剤
本発明の製剤には、限定されないが、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象中への移動または移植のための）及びそれらの組み合わせが含まれ得る。

【0252】

本明細書に記載される薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分及び任意に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を指す。

【0253】

一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付けるステップを含む。

【0254】

本明細書に記載される組成物の製剤は、薬理学の分野において既知の、または今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を１つ以上の賦形剤及び／または１つ以上の他の補助成分と関連付け、その後、必要であれば、及び／または望ましい場合、製品を所望の単回もしくは多回投与単位に成形及び／または梱包するステップを含む。

【0255】

本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、梱包、及び／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別量を指す。活性成分の量は、対象に投与されるであろう活性成分の投与量及び／または例えば、そのような投与量の半分もしくは３分の１などのそのような投与量の便利な画分にほぼ等しい。

【0256】

本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の識別、サイズ、及び／または病態に応じて、さらには組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

【0257】

賦形剤及び希釈剤
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医用途の使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たし得る。

【0258】

賦形剤には、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態に適するように、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤等が含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための様々な賦形剤及びその組成物を調製するための技法は、当該技術分野において既知である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照）。従来の賦形剤媒体の使用は、例えば任意の望ましくない生物学的効果をもたらすか、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害に相互作用することによって、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と両立し得ない場合を除いて、本開示の範囲内で企図され得る。

【0259】

例示的な希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉糖等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

【0260】

不活性成分
いくつかの実施形態では、薬学的組成物製剤は、少なくとも１つの不活性成分を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる薬学的組成物の活性成分の活性に寄与しない１つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本発明の製剤で使用され得る不活性成分のうちの全てまたはいくつかが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され得るか、どれも承認されない場合がある。

【0261】

一実施形態では、薬学的組成物は、限定されないが、１，２，６−ヘキサントリオール、１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｓ−（１−グリセロール））、１，２−ジミリストイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジパルミトイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））、１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｒａｃ−（１−グリセロール））、１，２−ジステアロイル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１−Ｏ−トリルビグアニド、２−エチル−１，６−ヘキサンジオール、酢酸、氷酢酸、酢酸無水物、アセトン、アセトン重亜硫酸ナトリウム、アセチル化ラノリンアルコール、アセチル化モノグリセリド、アセチルシステイン、アセチルトリプトファン、ＤＬ−、アクリレートコポリマー、アクリル酸−イソオクチルアクリレートコポリマー、アクリル系接着剤７８８、活性炭、Ａｄｃｏｔｅ ７２Ａ１０３、接着テープ、アジピン酸、Ａｅｒｏｔｅｘ樹脂３７３０、アラニン、凝集アルブミン、コロイド状アルブミン、ヒトアルブミン、アルコール、脱水アルコール、変性アルコール、希釈アルコール、Ａｌｆａｄｅｘ、アルギン酸、アルキルアンモニウムスルホン酸ベタイン、アルキルアリールスルホン酸ナトリウム、アラントイン、アリルα−イオノン、アーモンド油、α−テルピネオール、α−トコフェロール、α−トコフェロール酢酸塩、Ｄｌ−、α−トコフェロール、Ｄｌ−、酢酸アルミニウム、クロロヒドロキシアラントイン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウム−水和スクロース、水酸化アルミニウムゲル、水酸化アルミニウムゲルＦ ５００、水酸化アルミニウムゲルＦ５０００、モノステアリン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、アルミニウムポリエステル、ケイ酸アルミニウム、アルミニウムデンプンオクテニルコハク酸塩、ステアリン酸アルミニウム、塩基性酢酸アルミニウム、無水硫酸アルミニウム、Ａｍｅｒｃｈｏｌ Ｃ、Ａｍｅｒｃｈｏｌ−Ｃａｂ、アミノメチルプロパノール、アンモニア、アンモニア溶液、強アンモニア溶液、酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ノノキシノール−４硫酸アンモニウム、Ｃ−１２−Ｃ−１５直鎖第一級アルコールエトキシレートのアンモニウム塩、硫酸アンモニウム、Ａｍｍｏｎｙｘ、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−２、Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ−９、Ａｎｅｔｈｏｌｅ、無水クエン酸、無水デキストロース、無水ラクトース、無水クエン酸三ナトリウム、アニス油、Ａｎｏｘｉｄ Ｓｂｎ、消泡剤、アンチピリン、アパフルラン、杏仁油Ｐｅｇ−６エステル、Ａｑｕａｐｈｏｒ、アルギニン、Ａｒｌａｃｅｌ、アルコルビン酸、パルミチン酸アルコルビル、アスパラギン酸、ペルーバルサム、硫酸バリウム、蜜蝋、合成蜜蝋、ベヘネス−１０、ベントナイト、塩化ベンザルコニウム、ベンゼンスルホン酸、塩化ベンゼトニウム、ベンゾドデシニウムブロミド、安息香酸、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、塩化ベンジル、Ｂｅｔａｄｅｘ、ビバプシチド、次没食子酸ビスマス、ホウ酸、Ｂｒｏｃｒｉｎａｔ、ブタン、ブチルアルコール、ビニルメチルエーテルのブチルエステル／マレイン酸無水物コポリマー（１２５０００Ｍｗ）、ステアリン酸ブチル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチレングリコール、ブチルパラベン、酪酸、Ｃ２０−４０ Ｐａｒｅｔｈ−２４、カフェイン、カルシウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、グルセプト酸カルシウム、水酸化カルシウム、乳酸カルシウム、カルコブトロール、カルジアミドナトリウム、カロキセト酸三ナトリウム、カルテリドールカルシウム、カナダバルサム、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、カプリル酸／カプリン酸／ステアリン酸トリグリセリド、カプタン、Ｃａｐｔｉｓｏｌ、カラメル、カルボマー１３４２、カルボマー１３８２、カルボマー９３４、カルボマー９３４ｐ、カルボマー９４０、カルボマー９４１、カルボマー９８０、カルボマー９８１、カルボマーホモポリマーＢ型（架橋アリルペンタエリスリトール）、カルボマーホモポリマーＣ型（架橋アリルペンタエリスリトール）、二酸化炭素、カルボキシビニルコポリマー、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシポリメチレン、カラギーナン、カラギーナン塩、ひまし油、セダーリーフ油、セルロース、微結晶セルロース、Ｃｅｒａｓｙｎｔ−Ｓｅ、セレシン、セテアレス−１２、セテアレス−１５、セテアレス−３０、セテアリールアルコール／セテアレス−２０、セテアリールエチルヘキサノエート、セテス−１０、セテス−２、セテス−２０、セテス−２３、セトステアリルアルコール、塩化セトリモニウム、セチルアルコール、セチルエステル蝋、パルミチン酸セチル、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロブタノール半水和物、クロロブタノール無水物、クロロクレゾール、クロロキシレノール、コレステロール、コレス、コレス−２４、クエン酸塩、クエン酸、クエン酸一水和物、水和クエン酸、コカミド硫酸エーテル、コカミンオキシド、ココベタイン、ココジエタノールアミド、ココモノエタノールアミド、ココアバター、ココ−グリセリド、ココナッツ油、水素化ココナッツ油、水素化ココナッツ油／パーム核油グリセリド、ココイルカプリロカプレート、コーラ・ニチダ種抽出物、コラーゲン、着色懸濁液、コーン油、綿実油、クリームベース、クレアチン、クレアチニン、クレゾール、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、硫酸銅、無水硫酸銅、シクロメチコン、シクロメチコン／ジメチコンコポリオール、システイン、塩酸システイン、無水塩酸システイン、システイン、Ｄｌ−、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．２８、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３３、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３６、Ｄ＆ＣレッドＮｏ．３９、Ｄ＆ＣイエローＮｏ．１０、ダルファムプリジン、Ｄａｕｂｅｒｔ １−５ Ｐｅｓｔｒ（Ｍａｔｔｅ）１６４ｚ、デシルメチルスルホキシド、Ｄｅｈｙｄａｇ Ｗａｘ Ｓｘ、デヒドロ酢酸、Ｄｅｈｙｍｕｌｓ Ｅ、安息香酸デナトニウム、デオキシコール酸、デキストラン、デキストラン４０、デキストリン、デキストロース、デキストロース一水和物、デキストロース溶液、ジアトリゾ酸、ジアゾリジニル尿素、ジクロロベンジルアルコール、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ジエタノールアミン、ジエチルピロカーボネート、セバシン酸ジエチル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、フタル酸ジエチルヘキシル、アミノ酢酸ジヒドロキシアルミニウム、ジイソプロパノールアミン、アジピン酸ジイソプロピル、ジリノール酸ジイソプロピル、ジメチコン３５０、ジメチコンコポリオール、ジメチコンＭｄｘ４−４２１０、ジメチコン医療用流体３６０、ジメチルイソソルビド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアミノエチルメタクリレート−ブチルメタクリレート−メチルメタクリレートコポリマー、ジメチルジオクタデシルアンモニウムベントナイト、ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサンコポリマー、ジノセブアンモニウム塩、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、Ｄｌ−、ジプロピレングリコール、ココアンホジ酢酸二ナトリウム、スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム、スルホコハク酸ラウリル二ナトリウム、スルホサリチル酸二ナトリウム、ジソフェニン、ジビニルベンゼンスチレンコポリマー、Ｄｍｄｍヒダントイン、ドコサノール、ドクサートナトリウム、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ２８０−２５１６、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ３８７−２５１６、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８０−１１９６、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２０７０、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２１９４、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２２８７、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２２９６、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２８８８、Ｄｕｒｏ−Ｔａｋ ８７−２９７９、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、無水エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸、卵リン脂質、エントスホン、エントスホンナトリウム、エピラクトース、塩酸エピテトラシクリン、エッセンスブーケ９２００、塩酸エタノールアミン、酢酸エチル、オレイン酸エチル、エチルセルロース、エチレングリコール、エチレン酢酸ビニルコポリマー、エチレンジアミン、二塩酸エチレンジアミン、エチレン−プロピレンコポリマー、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（２８％酢酸ビニル）、エチレン−酢酸ビニルコポリマー（９％酢酸ビニル）、ヒドロキシステアリン酸エチルヘキシル、エチルパラベン、ユーカリプトール、エキサメタジム、食用脂、固い脂肪、脂肪酸エステル、脂肪酸ペンタエリスリトールエステル、脂肪酸、脂肪アルコールクエン酸塩、脂肪アルコール、Ｆｄ＆ＣブルーＮｏ．１、Ｆｄ＆ＣグリーンＮｏ．３、Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４、Ｆｄ＆ＣレッドＮｏ．４０、Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．１０（Ｄｅｌｉｓｔｅｄ）、Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．５、Ｆｄ＆ＣイエローＮｏ．６、塩化鉄、酸化鉄、風味８９−１８６、風味８９−２５９、風味Ｄｆ−１１９、風味Ｄｆ−１５３０、風味強化剤、イチジク風味８２７１１８、ラズベリー風味Ｐｆｃ−８４０７、風味Ｒｈｏｄｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｏ．Ｒｆ４５１、フルオロクロロ炭化水素、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド溶液、分画化ココナッツ油、芳香３９４９−５、芳香５２０ａ、芳香６．００７、芳香９１−１２２、芳香９１２８−Ｙ、芳香９３４９８ｇ、芳香Ｂａｌｓａｍ Ｐｉｎｅ Ｎｏ．５１２４、芳香ブーケ１０３２８、芳香Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ６４０１−Ｂ、芳香Ｃｈｅｍｏｄｅｒｍ６４１１、芳香クリームＮｏ．７３４５７、芳香Ｃｓ−２８１９７、芳香Ｆｅｌｔｏｎ０６６ｍ、芳香Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ４７３７３、芳香Ｇｉｖａｕｄａｎ Ｅｓｓ９０９０／１ｃ、芳香Ｈ−６５４０、芳香ハーブ１０３９６、芳香Ｎｊ−１０８５、芳香Ｐ Ｏ Ｆｌ−１４７、芳香Ｐａ５２８０５、芳香Ｐｅｒａ Ｄｅｒｍ Ｄ、芳香Ｒｂｄ−９８１９、芳香Ｓｈａｗ Ｍｕｄｇｅ Ｕ−７７７６、芳香Ｔｆ ０４４０７８、芳香Ｕｎｇｅｒｅｒ Ｈｏｎｅｙｓｕｃｋｌｅ Ｋ ２７７１、芳香Ｕｎｇｅｒｅｒ Ｎ５１９５、フルクトース、ガドリニウムオキシド、ガラクトース、γシクロデキストリン、ゼラチン、架橋ゼラチン、ゲルフォームスポンジ、ゲランガム（低アシル）、Ｇｅｌｖａ ７３７、ゲンチシン酸、ゲンチシン酸エタノールアミド、グルセプテートナトリウム、グルセプテートナトリウム二水和物、グルコノラクトン、グルクロン酸、グルタミン酸、Ｄｌ−、グルタチオン、グリセリン、水素化ロジンのグリセロールエステル、クエン酸グリセリル、イソステアリン酸グリセリル、ラウリン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル、オレイン酸グリセリル／プロピレングリコール、パルミチン酸グリセリル、リシノール酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸グリセリル−ラウレス−２３、ステアリン酸グリセリル／ステアリン酸Ｐｅｇ、ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−１００ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセリル／Ｐｅｇ−４０ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセリル−ステアラミドエチルジエチルアミン、トリオレイン酸グリセリル、グリシン、塩酸グリシン、ジステアリン酸グリコール、ステアリン酸グリコール、塩酸グアニジン、グアーガム、ヘアーコンディショナー（１８ｎ１９５−１ｍ）、ヘプタン、ヘタスターチ、ヘキシレングリコール、高密度ポリエチレン、ヒスチジン、ヒトアルブミン微小球、ヒアルロン酸ナトリウム、炭化水素、可塑化炭化水素ゲル、塩酸、希釈塩酸、ヒドロコルチゾン、ヒドロゲルポリマー、過酸化水素、水素化ひまし油、水素化パーム油、水素化パーム／パーム核油Ｐｅｇ−６エステル、水素化ポリブテン６３５−６９０、水酸化イオン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシオクタコサニル、ヒドロキシステアリン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース２９０６、ヒド
ロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒプロメロース２２０８（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）、ヒプロメロース２９１０（１５０００Ｍｐａ．Ｓ）、ヒプロメロース、イミド尿素、ヨウ素、ヨードキサミン酸、塩酸イオフェタミン、アイリッシュモス抽出物、イソブタン、イソセテス−２０、イソロイシン、イソオクチルアクリレート、イソプロピルアルコール、イソステアリン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル−ピリスチルアルコール、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸、イソステアリルアルコール、等張塩化ナトリウム溶液、Ｊｅｌｅｎｅ、カオリン、Ｋａｔｈｏｎ Ｃｇ、Ｋａｔｈｏｎ ＣｇＩＩ、乳酸塩、乳酸、Ｄｌ−乳酸、Ｌ−乳酸、ラクトビオン酸、ラクトース、ラクトース一水和物、水和ラクトース、Ｌａｎｅｔｈ、ラノリン、ラノリンアルコール−鉱物油、ラノリンアルコール、無水ラノリン、ラノリンコレステロール、ラノリン非イオン性誘導体、エトキシル化ラノリン、水素化ラノリン、塩化ラウラルコニウム、ラウラミンオキシド、加水分解ラウルジモニウム動物コラーゲン、硫酸ラウレス、ラウレス−２、ラウレス−２３、ラウレス−４、ラウリン酸ジエタノールアミド、ラウリン酸ミリスチン酸ジエタノールアミド、ラウロイルサルコシン、乳酸ラウリル、硫酸ラウリル、ラベンダー花頂、レシチン、未漂白レシチン、卵レシチン、水素化レシチン、水素化ダイズレシチン、大豆レシチン、レモン油、ロイシン、レブリン酸、リドフェニン、軽鉱物油、軽鉱物油（８５Ｓｓｕ）、リモネン（＋／−）−、リポコールＳｃ−１５、リジン、酢酸リジン、リジン一水和物、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム水和物、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、マレイン酸、マンニトール、Ｍａｐｒｏｆｉｘ、メブロフェニン、医療用接着剤修正Ｓ−１５、医療用消泡剤Ａ−Ｆエマルジョン、メドロン酸二ナトリウム、メドロン酸、メグルミン、メントール、メタクレゾール、メタリン酸、メタンスルホン酸、メチオニン、メチルアルコール、メチルグルセス−１０、メチルグルセス−２０、メチルグルセス−２０セスキステアリン酸塩、メチルグルコースセスキステアリン酸塩、ラウリン酸メチル、ピロリドンメチル、サリチル酸メチル、ステアリン酸メチル、メチルボロン酸、メチルセルロース（４０００Ｍｐａ．Ｓ）、メチルセルロース、メチルクロロイソチアゾリノン、メチレンブルー、メチルイソチアゾリノン、メチルパラベン、微結晶蝋、鉱物油、モノグリセリド及びジグリセリド、クエン酸モノステアリル、モノチオグリセロール、マルチステロール抽出物、ミリスチルアルコール、乳酸ミリスチル、ミリスチル−γ−塩化ピコリニウム、Ｎ−（カルバモイル−メトキシＰｅｇ−４０）−１，２−ジステアロイル−セファリンナトリウム、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ナイアシンアミド、ニオキシム、硝酸、窒素、ノノキシノールヨウ素、ノノキシノール−１５、ノノキシノール−９、ノルフルラン、オートミール、オクタデセン−１／マレイン酸コポリマー、オクタン酸、Ｏｃｔｉｓａｌａｔｅ、オクトキシノール−１、オクトキシノール−４０、オクトキシノール−９、オクチルドデカノール、オクチルフェノールポリメチレン、オレイン酸、Ｏｌｅｔｈ−１０／Ｏｌｅｔｈ−５、Ｏｌｅｔｈ−２、Ｏｌｅｔｈ−２０、オレイルアルコール、オレイン酸オレイル、オリーブ油、オキシドロン酸二ナトリウム、オキシキノリン、パーム核油、パルミタミンオキシド、パラベン、パラフィン、ホワイトソフトパラフィン、パルファムクリーム４５／３、ピーナッツ油、精製ピーナッツ油、ペクチン、Ｐｅｇ６−３２ステアリン酸塩／ステアリン酸グリコール、Ｐｅｇ植物油、Ｐｅｇ−１００ステアリン酸塩、Ｐｅｇ−１２ラウリン酸グリセリル、Ｐｅｇ−１２０ステアリン酸グリセリル、Ｐｅｇ−１２０ジオレイン酸メチルグルコース、Ｐｅｇ−１５コカミン、Ｐｅｇ−１５０ジステアリン酸塩、Ｐｅｇ−２ステアリン酸塩、Ｐｅｇ−２０イソステアリン酸ソルビタン、Ｐｅｇ−２２メチルエーテル／ドデシルグリコールコポリマー、Ｐｅｇ−２５ステアリン酸プロピレングリコール、Ｐｅｇ−４ジラウレート、Ｐｅｇ−４ラウレート、Ｐｅｇ−４０ひまし油、Ｐｅｇ−４０ジイソステアリン酸ソルビタン、Ｐｅｇ−４５／ドデシルグリコールコポリマー、Ｐｅｇ−５オレイン酸塩、Ｐｅｇ−５０ステアリン酸塩、Ｐｅｇ−５４水素化ひまし油、Ｐｅｇ−６イソステアリン酸塩、Ｐｅｇ−６０ひまし油、Ｐｅｇ−６０水素化ひまし油、Ｐｅｇ−７メチルエーテル、Ｐｅｇ−７５ラノリン、Ｐｅｇ−８ラウレート、Ｐｅｇ−８ステアリン酸塩、Ｐｅｇｏｘｏｌ ７ステアリン酸塩、ペンタデカラクトン、ペンタエリスリトールココエート、ペンテト酸五ナトリウム、ペンテト酸カルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、ペパーミント油、ペルフルトレン、香料２５６７７、香料ブーケ、香料Ｅ−１９９１、香料Ｇｄ ５６０４、香料Ｔａｎａ ９０／４２ Ｓｃｂａ、香料Ｗ−１９５２−１、ペトロラタム、ホワイトペトロラタム、石油蒸留物、フェノール、液化フェノール、フェノニップ、フェノキシエタノール、フェニルアラニン、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、卵ホスファチジルグリセロール、リン脂質、卵リン脂質、ホスホリポン９０ｇ、リン酸、パインニードル油（Ｐｉｎｕｓ Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、ピペラジン六水和物、プラスチベース−５０ｗ、ポラクリリン、塩化ポリドロニウム、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２３７、ポロキサマー４０７、ポリ（ビス（Ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパン無水物）：セバシン酸、ポリ（ジメチルシロキサン／メチルビニルシロキサン／メチル水素シロキサン）ジメチルビニルまたはジメチルヒドロキシまたはトリメチルエンドブロック、ポリ（Ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸）、（５０：５０、ポリ（Ｄｌ−乳酸−コ−グリコール酸）、エチルエステル末端、（５０：５０、ポリアクリル酸（２５００００Ｍｗ）、ポリブテン（１４００Ｍｗ）、ポリカルボフィル、ポリエステル、ポリエステルポリアミンコポリマー、ポリエステルレーヨン、ポリエチレングリコール１０００、ポリエチレングリコール１４５０、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール１５４０、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール３００−１６００、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール５４０、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリエチレングリコール９００、ポリエチレン高密度含有酸化鉄黒（＜１％）、ポリエチレン低密度含有硫酸バリウム（２０〜２４％）、ポリエチレンＴ、ポリエチレンテレフタレート、ポリグラクチン、ポリグリセリル−３オレイン酸塩、ポリグリセリル−４オレイン酸塩、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリイソブチレン、ポリイソブチレン（１１０００００Ｍｗ）、ポリイソブチレン（３５０００Ｍｗ）、ポリイソブチレン１７８−２３６、ポリイソブチレン２４１−２９４、ポリイソブチレン３５−３９、低分子量ポリイソブチレン、中分子量ポリイソブチレン、ポリイソブチレン／ポリブテン接着剤、ポリラクチド、ポリオール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン１８００、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンプロピレン、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル３５ひまし油、ポリオキシル４０水素化ひまし油、ポリオキシル４０ステアリン酸塩、ポリオキシル４００ステアリン酸塩、ポリオキシル６及びポリオキシル３２パルミトステアリン酸塩、ジステアリン酸ポリオキシル、ステアリン酸ポリオキシルグリセリル、ポリオキシルラノリン、パルミチン酸ポリオキシル、ステアリン酸ポリオキシル、ポリプロピレン、ポリプロピレングリコール、ポリクオタニウム−１０、ポリクオタニウム−７（７０／３０アクリルアミド／Ｄａｄｍａｃ、ポリシロキサン、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリウレタン、酢酸ポリビニル、ポリビニルアルコール、塩化ポリビニル、塩化ポリビニル−酢酸ポリビニルコポリマー、ポリビニルピリジン、ポピーシード油、Ｐｏｔａｓｈ、酢酸カリウム、カリウムミョウバン、重炭酸カリウム、亜硫酸水素ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸カリウム、水酸化カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、リン酸カリウム二塩基性、リン酸カリウム一塩基性、カリウム石鹸、ソルビン酸カリウム、ポビドンアクリレートコポリマー、ポビドンヒドロゲル、ポビドンＫ１７、ポビドンＫ２５、ポビドンＫ２９／３２、ポビドンＫ３０、ポビドンＫ９０、ポビドンＫ９０ｆ、ポビドン／エイコセンコポリマー、ポビドン、Ｐｐｇ−１２／Ｓｍｄｉコポリマー、Ｐｐｇ−１５ステアリルエーテル、Ｐｐｇ−２０メチルグルコースエーテルジステアリン酸塩、Ｐｐｇ−２６オレイン酸塩、製品Ｗａｔ、プロリン、Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ Ｄ、Ｐｒｏｍｕｌｇｅｎ Ｇ、プロパン、推進薬Ａ−４６、没食子酸プロピル、炭酸プロピレン、プロピレングリコール、二酢酸プロピレングリコール、ジカプリル酸プロピレングリコール、モノラウリン酸プロピレングリコール、モノパルミトステアリン酸プロピレングリコール、パルミトステアリン酸プロピレングリコール、リシノレイン酸プロピレングリコール、プロピレングリコール／ジアゾリジニル尿素／メチルパラベン／プロピルパルベン、プロピルパラベン、硫酸プロタミン、タンパク質加水分解物、Ｐｖｍ／Ｍａコポリマー、クオタニウム−１５、クオタニウム−１５シス−形態、クオタニウム−５２、Ｒａ−２３９７、Ｒａ−３０１１、サッカリン、サッカリンナトリウム、無水サッカリンナトリウム、サフラワー油、Ｓｄアルコール３ａ、Ｓｄアルコール４０、Ｓｄアルコール４０−２、Ｓｄアルコール４０ｂ、Ｓｅｐｉｎｅｏ Ｐ６００、セリン、ゴマ油、シアバター、Ｓｉｌａｓｔｉｃブランド医療グレードチュービング、Ｓｉｌａｓｔｉｃ医療用接着剤、シリコーンＡ型、歯科シリカ、ケイ素、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、シリコーン、シリコーン接着剤４１０２、シリコーン接着剤４５０２、シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ Ｑ７−４２０１、シリコーン接着剤Ｂｉｏ−Ｐｓａ Ｑ７−４３０１、シリコーンエマルジョン、シリコーン／ポリエステルフィルム、シメチコン、シメチコンエマルジョン、Ｓｉｐｏｎ Ｌｓ ２０ｎｐ、ソーダ灰、酢酸ナトリウム、無水酢酸ナトリウム、硫酸アルキルナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム十水和物、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム十水和物、炭酸ナトリウム一水和物、セトステアリル硫酸ナトリウム、塩素酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化ナトリウム注入、静菌性塩化ナトリウム注入、コレステリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ココイルサルコシン酸ナトリウム、デソキシコール酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、次亜塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、乳酸ナトリウム、Ｌ−乳酸ナトリウム、ラウレスナトリウム−２硫酸塩、ラウレスナトリウム−３硫酸塩、ラウレスナトリウム−５硫酸塩、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性無水リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リ
ン酸ナトリウム、一塩基性無水リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、ポリアクリル酸ナトリウム（２５０００００Ｍｗ）、リン酸ナトリウム、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム六水和物、硫酸ナトリウム、無水硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム十水和物、亜硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ナトリウムウンデシレン酸モノアルキロールアミド、酒石酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、チオマレイン酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、無水チオ硫酸ナトリウム、トリメタリン酸ナトリウム、キシレンスルホン酸ナトリウム、Ｓｏｍａｙ ４４、ソルビン酸、ソルビタン、イソステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、ソルビトール、ソルビトール溶液、大豆粉、大豆油、スペアミント油、鯨蝋、スクアラン、安定化オキシクロロ複合体、第一スズ２−エチルヘキサノエート、塩化第一スズ、無水塩化スズ、フッ化スズ、酒石酸スズ、デンプン、デンプン１５００アルファ化、トウモロコシデンプン、塩化ステアラルコニウム、ステアラルコニウムヘクトライト／炭酸プロピレン、ステアラミドエチルジエチルアミン、ステアレス−１０、ステアレス−１００、ステアレス−２、ステアレス−２０、ステアレス−２１、ステアレス−４０、ステアリン酸、ステアリン酸ジエタノールアミド、ステアロキシトリメチルシラン、加水分解ステアルトリモニウム動物コラーゲン、ステアリルアルコール、吸入用の無菌水、スチレン／イソプレン／スチレンブロックコポリマー、サクシマー、コハク酸、スクラロース、スクロース、ジステアリン酸スクロース、スクロースポリエステル、スルファセタミドナトリウム、スルホブチルエーテルβ−シクロデキストリン、二酸化硫黄、硫酸、亜硫酸、Ｓｕｒｆａｃｔｏｌ Ｑ、Ｄ−タガトース、タルク、トール油、牛脂脂肪酸グリセリド、酒石酸、Ｄｌ−酒石酸、Ｔｅｎｏｘ、Ｔｅｎｏｘ−２、Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、Ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、Ｔｅｒｔ−ブクヒルヒドロキノン、テトラキス（２−メトキシイソブチルイソシアニド）銅（Ｉ）テトラフルオロホウ酸塩、テトラプロピルオルトシリケート、テトロフォスミン、テオフィリン、チメロサール、トレオニン、チモール、スズ、二酸化チタン、トコフェロール、トコフェルソラン、完全非経口高栄養法、脂質エマルジョン、トリアセチン、トリカプリリン、トリクロロモノフルオロメタン、トリデセス−１０、トリエタノールアミン硫酸ラウリル、トリフルオロ酢酸、トリグリセリド、中鎖、トリヒドロキシステアリン、Ｔｒｉｌａｎｅｔｈ−４リン酸塩、Ｔｒｉｌａｕｒｅｔｈ−４リン酸塩、クエン酸三ナトリウム二水和物、三ナトリウムＨｅｄｔａ、Ｔｒｉｔｏｎ ７２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−２００、トロラミン、トロマンタジン、トロメタミン（ＴＲＩＳ）、トリプトファン、チロキサポール、チロシン、ウンデシレン酸、Ｕｎｉｏｎ ７６ Ａｍｓｃｏ−Ｒｅｓ ６０３８、尿素、バリン、植物油、水素化植物油グリセリド、水素化植物油、Ｖｅｒｓｅｔａｍｉｄｅ、Ｖｉｓｃａｒｉｎ、ビスコース／綿、ビタミンＥ、乳化蝋、Ｗｅｃｏｂｅｅ Ｆｓ、白セレシン蝋、白蝋、キサンタンガム、亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、及び酸化亜鉛などの少なくとも１つの不活性成分を含む。

【0262】

本明細書に開示される薬学的組成物製剤は、カチオンまたはアニオンを含み得る。一実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋及びそれらの組み合わせなどの金属カチオンを含む。非限定例として、製剤は、ポリマー及び金属カチオンとの複合体を含み得る（例えば、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号を参照）。

【0263】

本発明の製剤はまた、１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、本化合物は、既存の酸または塩基部分を（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）その塩形態に変換することによって修飾される。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の好物または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸等が含まれるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素塩、塩化水素塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ性土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含む、非毒性アンモニウム、４級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。

【0264】

溶媒は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ′−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩等である。水が溶媒である場合、溶媒和物は、「水和物」と称される。

【0265】

Ｖ．投与及び投薬
投与
「投与する」及び「導入する」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細胞または対象への薬学的組成物の送達を指す。対象への送達の場合、薬学的組成物は、肝細胞などの所望の部位における導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって送達され、それにより所望の効果（複数可）がもたらされる。

【0266】

方法の一態様では、薬学的組成物は、限定されないが、経腸（腸の中）、胃腸、硬膜外（ｅｐｉｄｕｒａｌ）（硬膜の中）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外（ｐｅｒｉｄｕｒａｌ）、脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、上皮（皮膚の上に適用）、皮内（皮膚自体の中）、皮下（皮膚の下）、経鼻投与（鼻を通して）、静脈内（静脈の中）、静脈内ボーラス、点滴、動脈内（動脈の中）、筋内（筋肉の中）、心内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹腔の中に注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通して）、空洞内注射（病理的空洞の中）、腔内（陰茎の基部の中）、膣内投与、子宮内、羊水外投与、経皮（全身分配のための無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経腟、吹送（スノーティング）、舌下、口唇下、坐薬、点眼薬（結膜の上）、点耳薬中、耳（耳の中または耳を介して）、頬（頬に向かって指向される）、結膜、皮膚、歯（１本または複数の歯に）、電気浸透、洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹部内、羊水内、動脈内、胆管内、気管支内、髄液嚢内、軟骨内（軟骨内）、仙骨内（馬尾内）、槽内（大槽小脳延髄槽内）、角膜間（角膜内）、歯冠内、冠内（冠状動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性空間内）、円板内（ディスク内）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸内）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、上皮内（上皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃内）、歯肉内（歯肉内）、回腸内（省庁の遠位部分内）、病変内（局在化病変内または直接導入）、腔内（管の腔内）、リンパ内（リンパ内）、髄内（骨の髄腔内）、髄膜内（髄膜内）、心筋内（心筋内）、眼内（目内）、卵巣内（卵巣内）、心膜内（心膜内）、胸膜内（胸膜内）、前立腺内（前立腺内）、肺内（肺またはその気管支内）、鼻腔内（鼻または眼窩腔内）、脊髄内（脊柱内）、関節滑液嚢内（関節の滑液腔内）、腱内（腱内）、精巣内（精巣内）、髄腔内（任意のレベルの脳脊髄軸での脳脊髄液内）、胸腔内（胸郭内）、管内（臓器の管内）、腫瘍内（腫瘍内）、鼓室内（中耳内）、血管内（１本または複数の血管内）、心室内（心室内）、イオン泳動（可溶性塩のイオンが身体の組織中に移行する電流によって）、灌水（開放創または体腔を浸すまたは洗い流す）、喉頭（咽頭の上に直接）、鼻腔胃（鼻を通して胃の中に）、密封包帯法（後に領域を密封する包帯によって被覆される局所経路投与）、眼部（外眼部に）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（局所または全身効果のために経口的または経鼻的に吸入することによって気道内）、眼球後（脳端の後ろまたは眼球の後ろ）、心筋内（心筋に入る）、軟組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通るかまたは胎盤全体）、経気管（気管の壁を通る）、経鼓膜（鼓室全体または鼓室を通る）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、フォトフェレーシス及び脊柱などの経路を介して投与され得る。

【0267】

投与様式には、注射、注入、点滴、及び／または摂取が含まれる。「注射」には、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入が含まれる。いくつかの例において、経路は静脈内である。細胞の送達に関しては、注射または注入による投与を行うことができる。

【0268】

細胞は、全身的に投与することができる。「全身投与」、「全身的に投与される」、「末梢投与」及び「末梢的に投与される」という表現は、標的部位、組織、または臓器に直接ではない形で投与することを指し、それにより、代わりに対象の循環系に侵入し、したがって代謝及び他の類似プロセスに供される。

【0269】

投薬
「有効量」という用語は、特定の疾患及び／または病態の少なくとも１つ以上の徴候または症状を予防または軽減するために必要な活性成分の量を指し、所望の効果を提供するための組成物の十分な量に関連する。そのため、「治療有効量」という用語は、典型的な対象に投与したときに特定の効果を促進するのに十分である活性成分を含む、活性成分または組成物の量を指す。また、有効量は、疾患の症状発生の予防または遅延、疾患の症状の経過の変更（例えば、以下に限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせること）、または疾患の症状の反転に十分な量も含むと考えられる。任意の所与の場合について、適切な「有効量」は、当業者により、通常の実験を用いて決定され得ると理解されている。

【0270】

本発明の薬学的、診断的、または予防的組成物は、疾患、障害及び／または病態を予防、治療、管理、または診断するために有効な任意の量及び任意の投与経路を使用して対象に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の人種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式等に応じて対象ごとに異なり得る。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。本発明による組成物は、典型的には、投与の容易性及び投与量の均一性のために単一剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の総１日使用量は、合理的な医療判断の範囲内で担当医師により決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の個体についての具体的な治療有効用量レベル、予防有効用量レベル、または適切な診断用量レベルは、治療される障害及び障害の重篤度；用いられる具体的なペイロードの活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与の時間及び投与の経路；治療の期間；活性成分と組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野で周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。

【0271】

ある特定の実施形態では、本発明による薬学的組成物は、１日あたり対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを、１日１回以上送達して、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために十分な投与量レベルで投与され得る。

【0272】

本発明の組成物の所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、多回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。多回投与を用いる場合、本明細書に記載されるものなどの分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または全日用量の２用量以上への分割、例えば「単一単位用量」の２回以上の投与である。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療約の用量である。

【0273】

ＶＩ．定義
「類似体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物に構造的に関連し、基準化合物と共通の機能的活性を共有する化合物を指す。

【0274】

「生物学的」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物、植物、動物、またはヒト細胞などの様々な天然源から作製された医薬製品を指す。

【0275】

「境界」という用語は、本明細書で使用される場合、特徴、エレメント、または特性が終了または開始する場所を示す点、限界、または範囲を指す。

【0276】

「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、単剤もしくはその薬学的に許容される塩、または生物活性剤もしくは薬物を指す。

【0277】

「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、基準化合物とは構造が異なるが、基準分子の本質的特性を保持する。

【0278】

「下流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の下流にある遺伝子を指す。

【0279】

「薬物」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患の診断、治癒、軽減、治療、または予防における使用のために意図され、身体の構造または任意の機能に影響を及ぼすことが意図される食品以外の物質を指す。

【0280】

「エンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、転写因子によって結合されたときに、関連遺伝子の転写を強化する調節ＤＮＡ配列を指す。

【0281】

「遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物、例えば染色体のゲノムアーキテクチャの単位またはセグメントを指す。遺伝子は、コードまたは非コードであり得る。遺伝子は、連続または非連続ポリヌクレオチドとしてエンコードされ得る。遺伝子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

【0282】

「ゲノムシグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、その絶縁近傍内の遺伝子の調節に関与するシグナル伝達分子の状況特異的複合アセンブリに結合することができる領域を含む絶縁近傍内の領域を指す。

【0283】

「ゲノム系アーキテクチャ」という用語は、本明細書で使用される場合、個体のゲノムの組織化を指し、染色体、トポロジカル関連ドメイン（ＴＡＤ）、及び絶縁近傍を含む。

【0284】

「薬草調製物」という用語は、本明細書で使用される場合、植物の一部、または他の植物材料、または組み合わせを活性成分として含有する生薬を指す。

【0285】

「絶縁近傍」（ＩＮ）という用語は、本明細書で使用される場合、コヒーシンによって共占有されるＣＣＣＴＣ結合因子（ＣＴＣＦ）を含み、絶縁近傍中の遺伝子ならびに絶縁近傍の近位にある遺伝子の発現に影響を及ぼし得る、染色体配列中の２つの相互作用部位のルーピングによって形成される染色体構造を指す。

【0286】

「絶縁体」という用語は、本明細書で使用される場合、エンハンサーが、それらの間に位置しているときに遺伝子を活性化する能力をブロックし、特定のエンハンサー・遺伝子相互作用に寄与する調節エレメントを指す。

【0287】

「マスター転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を変更（増加または減少）し、細胞型特異的エンハンサーを確立する、シグナル伝達分子を指す。マスター転写因子は、他の転写因子などの追加のシグナル伝達タンパク質をエンハンサーに動員して、シグナル伝達中心を形成する。

【0288】

「最小絶縁近傍」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの近傍遺伝子、及びプロモーター及び／またはエンハンサー及び／またはリプレッサー領域などの近傍遺伝子の発現または抑制を促進する、関連した調節配列領域（ＲＳＲ）（複数可）を指す。

【0289】

「調整する」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子産生物の標的遺伝子及び／または活性の発現における変更（例えば、増加または減少）を指す。

【0290】

「近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、絶縁近傍内に位置する遺伝子を指す。

【0291】

「浸透度」という用語は、本明細書で使用される場合、その変異体遺伝子の関連した特性（表現型）も呈する遺伝子の特定の変異体（例えば、野生型であるか否かにかかわらず、突然変異、対立遺伝子または一般遺伝子型）を担持する個体の割合を指し、いくつかの状況では、臨床症状を呈する、したがって連続体上に存在する突然変異を有する個体の割合として測定される。

【0292】

「ポリペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、最も多くの場合、ペプチド結合によって一緒に結合される（天然または非天然の）アミノ酸残基のポリマーを指す。本明細書で使用される場合、この用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。場合によっては、エンコードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸よりも小さく、ポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基長となる。

【0293】

「一次近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、染色体に沿った特定の絶縁近傍内で最も一般に見出される遺伝子を指す。

【0294】

「一次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の下流に位置する絶縁近傍境界を指す。

【0295】

「一次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子の上流に位置する絶縁近傍境界を指す。

【0296】

「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を定義し、どのＤＮＡ鎖が転写されるかを示す転写の方向を定義するＤＮＡ配列を指す。

【0297】

「調節配列領域」という用語は、本明細書で使用される場合、限定されないが、染色体に沿った領域、区分または区域が挙げられ、それによって近傍遺伝子の発現を変更するために、シグナル伝達分子との相互作用が起こる。

【0298】

「リプレッサー」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡに結合する任意のタンパク質を指し、転写の速度を減少させることによって遺伝子の発現を調節する。

【0299】

「二次下流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの下流境界を指す。

【0300】

「二次上流境界」という用語は、本明細書で使用される場合、一次絶縁近傍内の二次ループの上流境界を指す。

【0301】

「シグナル伝達中心」という用語は、本明細書で使用される場合、シグナル伝達タンパク質またはシグナル伝達分子（例えば、転写因子）などの定義された生体分子のセットと相互作用して、遺伝子発現を状況特異的な方法で調節する生存生物の定義された領域を指す。

【0302】

「シグナル伝達分子」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、有機小分子、脂質、糖または他の分子にかかわらず、染色体上の調節配列領域と直接または間接的に相互作用する、任意の実態を指す。

【0303】

「シグナル伝達転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば近傍遺伝子の転写を増加するかまたは減少するかにかかわらず変更し、細胞−細胞シグナル伝達分子としても作用する、シグナル伝達分子を指す。

【0304】

「小分子」という用語は、本明細書で使用される場合、生物学的過程の調節を助けることができる低分子量薬物、すなわち、およそ１０〜９ｍのサイズを有する９００ダルトン未満の有機化合物を指す。

【0305】

「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、本発明による組成物での治療が提供される動物を指す。

【0306】

「スーパーエンハンサー」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞同一性を定義する遺伝子の発現を駆動する転写エンハンサーの大きなクラスターであることを指す。

【0307】

「治療剤」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を治癒するか、または疾患の症状を改善する能力を有する物質を指す。

【0308】

「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）成果」という用語は、本明細書で使用される場合、ＧＳＣまたはＧＳＮの摂動の結果として生じる任意の結果または効果（正、負またはヌル）を指す。治療成果の例には、疾患もしくは障害に関連する望ましくない病態もしくは負の病態の改良もしくは改善、副作用もしくは症状の軽減、疾患もしくは障害の治癒、またはＧＳＣもしくはＧＳＮの摂動に関連する任意の改良が含まれるが、これらに限定されない。

【0309】

「トポロジカル関連ドメイン」（ＴＡＤ）という用語は、本明細書で使用される場合、染色体のモジュラー組織化を表し、異なる細胞型の生物によって共有される境界を有する構造を指す。

【0310】

「転写因子」という用語は、本明細書で使用される場合、標的遺伝子、例えば、近傍遺伝子の転写を変更（増加または減少）するシグナル伝達分子である。

【0311】

「治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）負債」という用語は、本明細書で使用される場合、望ましくない有害である、または治療法の正の成果を軽減する治療または治療レジームに関連する特徴または特性を指す。治療負債の例には、例えば、毒性、不良な半減期、不良な生物学的利用能、有効性または薬物動態もしくは薬力学的リスクの欠失または喪失が含まれる。

【0312】

「上流近傍遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、一次近傍遺伝子と同じ絶縁近傍内に位置し得る一次近傍遺伝子の上流にある遺伝子を指す。

【0313】

肝疾患（例えば、ＮＡＳＨ）の治療のためのゲノムシグナル伝達中心（ＧＳＣ）または全体遺伝子シグナル伝達ネットワーク（ＧＳＮ）の摂動のための組成物及び方法が、本明細書に記載される。本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、添付の以下の記載で説明される。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の材料及び方法を本発明の実践または試験において使用することもできるが、好ましい材料及び方法は、これから説明される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、その説明から明らかになるであろう。この説明において、単数形は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数形も含む。他に特段の定めのない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合、本説明が制御する。

【0314】

本発明はさらに、以下の非限定的な実施例によって説明される。

【実施例】

【0315】

実施例１．実験手順
Ａ．ヒト肝細胞細胞培養
ヒト肝細胞は、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌからの２名のドナー（すなわち、ＭＧＨ５４及びＭＧＨ６３）、ならびにＬｏｎｚａからの１名のドナー（すなわちＨＵＭ４１１１Ｂ）から取得した。凍結保存した肝細胞を、平板培地中で１６時間培養し、維持培地に４時間移した。無血清培地上で２時間培養し、次いで化合物を添加した。遺伝子発現分析の前に、肝細胞を無血清培地上で１６時間維持した。一次ヒト肝細胞を、液体窒素冷凍庫（約−１３０℃）の気相中で保存した。

【0316】

一次ヒト肝細胞を播種するために、細胞のバイアルをＬＮ_２冷凍庫から回収し、３７℃の水浴中で回答し、氷のかけらのみが残るまで優しく旋回させた。１０ｍＬの血清学的ピペットを使用して、細胞をバイアルから優しく分注し、２０ｍＬの冷解凍培地を含有する５０ｍＬのコニカルチューブの側面下に優しく分注した。バイアルを約１ｍＬの解凍培地ですすぎ、リンスをコニカルチューブに添加した。最大２バイアルを、２０ｍＬの解凍培地の１つのチューブに添加することができる。

【0317】

コニカルチューブ（複数可）を優しく２〜３回反転させ、４℃で１０分間１００ｇで制動力を低減して（例えば、９のうち４）遠心分離した。解凍培地をゆっくりゆっくり吸引して、ペレットを避ける。４ｍＬの冷平板培地を、側面の下にゆっくり添加し（２バイアルを１つのチューブに複合する場合、８ｍＬ）、バイアルを優しく数回反転させて細胞を再懸濁した。

【0318】

１００μＬの十分に混合された細胞が４００μＬの希釈トリパンブルーに添加されるまで、細胞を氷上で保持し、優しく反転させることによって混合した。血球計数器（またはＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞をカウントし、生存性及び１ｍＬあたりの生細胞を記録した。細胞を所望の濃度に希釈し、コラーゲンＩで被覆したプレート上に播種した。細胞をゆっくり優しくプレートの上に、一度に１〜２ウェルのみに分注した。残りの細胞を、優しく反転させることによって頻繁にチューブ内で混合した。細胞を、６ｍＬの冷平板培地（１０ｃｍ）中にプレートあたり約８．５×１０^６細胞で播種した。代替として、６ウェルプレートの場合ウェルあたり１．５×１０^６（１ｍＬ培地／ウェル）、１２ウェルプレートの場合ウェルあたり７×１０^５（０．５ｍＬ／ウェル）、または２４ウェルプレートの場合ウェルあたり３．７５×１０^５（０．５ｍＬ／ウェル）。

【0319】

全ての細胞及び培地をプレートに添加した後、プレートをインキュベーターに移し（３７℃、５％ ＣＯ_２、約９０％湿度）、前後に、次いで左右に各々数回揺らして、細胞をプレートまたはウェル全体に均一に分布させた。プレート（複数可）をプレーティング後最初の１時間にわたって１５分ごとに再度揺らした。プレーティングの約４時間後（または細胞を午後にプレーティングした場合は朝一番に）、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、完全維持培地を添加した。一次ヒト肝細胞を維持培地中で維持し、毎日新鮮な培地に移した。

【0320】

Ｂ．ヒト肝細胞の枯渇及び化合物処理
上記のように培養したヒト肝細胞を、２４ウェルフォーマットでプレーティングし、５００μＬの量の平板培地中にウェルあたり３７５，０００細胞を添加した。治療の４時間前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を新鮮な遺伝培地（完全）または修飾された維持培地のいずれかに変えた。

【0321】

化合物ストックを、１０００×最終濃度で調製し、２段階希釈で培地に添加して、細胞に添加したときに化合物が溶液から沈殿するリスクを低減し、妥当なピペット量を保証した。１つずつ、各化合物を温かい（約３７℃）修飾された維持培地中で最初に１０倍希釈し（初期希釈＝ＩＤ）、ボルテックスすることによって混合し、ＩＤを細胞培養物中に１００倍希釈した（例えば、０．５ｍＬの培地を含有する２４ウェルプレートの１ウェル中に５．１μＬ）。プレートを慎重に旋回させることによって混合し、全てのウェルを処理した後、インキュベーターに一晩戻した。所望される場合、別個のプレート／ウェルをビヒクルのみの対照及び／または正の対照で処理した。マルチウェルプレートを使用する場合、対照を各プレート上に含めた。約１８時間後、細胞をさらなる分析、例えば、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ等のために採取した。

【0322】

Ｃ．マウス肝細胞細胞培養及び化合物処理
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝細胞（Ｆ００５１５２冷凍保存）を、４５ドナーのプールとしてＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから購入した。細胞を、０．５ｍＬ培地中２００Ｋ細胞／ウェルで２４時間、コラーゲンで被覆した２４ウェルプレート上のＩｎｖｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ齧歯類培地（Ｚ９９００２８）及びＴｏｒｐｅｄｏ齧歯類抗生物質ミックス（Ｚ９９０２７）中にプレーティングした。１０ｍＭ ＤＭＳＯ中の化合物ストックを、１０μＭに（１％ ＤＭＳＯの最終濃度で）希釈し、生物学的三重複で細胞上に適用した。２０時間後に培地を取り除き、細胞をさらなる分析、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲのために処理した。

【0323】

Ｄ．星細胞培養及び化合物処理
ヒト一次星細胞（ＨＳＣ）（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌカタログ番号５３００）は、もともと１５歳の女性ドナーの肝臓から単離された。細胞を、２μｇ／ｃｍ^２ＰｏｌｙＬＬｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌカタログ番号０４１３）で被覆された黒色透明底プレート（ＧＲＥＩＮＥＲ ＢＩＯ−ＯＮＥ：８２０５０−７３０）上の星細胞培地（ＳｔｅＣＭ）（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ番号５３０１）中にプレーティングした。細胞を、９６ウェルプレート中に１７０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、細胞培養培地を示された濃度（複数可）の化合物で１８時間補充した。全てのウェルは、１％ ＤＭＳＯを有していた。１８時間後に培地を取り除き、細胞をさらなる分析、例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲのために処理した。

【0324】

Ｅ．ＨｅｐＧ２細胞培養及び化合物処理
ＨｅｐＧ２細胞を、５００μＬのＤＭＥＭ中１００，０００細胞／ウェルで２４ウェルフォーマットでプレーティングした。４８時間後、培地を取り除き、１０μＭのモメロチニブまたはＤＭＳＯを含有する新鮮な培地と置き換えた。翌朝、細胞をＲＮＡ抽出のために採取した。

【0325】

Ｆ．培地組成
解凍培地は、６ｍＬの等張パーコール及び１４ｍＬの高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１９６５または同様のもの）を含有していた。平板培地は、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、ならびに５ｍＬのＦＢＳ、１０μＬのデキサメタゾン、及び３．６ｍＬのプレーティング／維持カクテルを含有するＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ平板培地からの補足パック＃ＣＭ３０００を含有していた。ストックトリパンブルー（０．４％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１５２５０）を、ＰＢＳ中で１：５に希釈した。Ｎｏｒｍｏｃｉｎを、解凍培地及び平板培地の両方に１：５００で添加した。

【0326】

ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ完全維持培地は、補足パック＃ＣＭ４０００（１μＬのデキサメタゾン及び４ｍＬの維持カクテル）ならびに１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）を含有していた。

【0327】

修飾された維持培地は、刺激因子（デキサメタゾン、インスリン等）を有しておらず、１００ｍＬのＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ａ１２１７６０１、フェノールレッドなし）、２ｍＭまで１ｍＬのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｇ７５１３）、１５ｍＭまで１．５ｍＬのＨＥＰＥＳ（ＶＷＲ ＃Ｊ８４８）、及び各々５０Ｕ／ｍＬの最終濃度まで０．５ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１５１４０）を含有していた。

【0328】

Ｇ．ＤＮＡ精製
ＤＮＡ精製は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１２（１２）：３８４１−３８４６（２０１５）補助情報に記載されるように行った。１ミリリットルの２．５Ｍグリシンを、固定細胞の各プレートに添加し、５分間インキュベートしてホルムアルデヒドをクエンチした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を４℃で５分間、１，３００ｇでペレット化した。次いで、４×１０^７細胞を各チューブ内で収集した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有する１ｍＬの氷冷Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０溶解緩衝液で、氷上で５分間優しく溶解した（緩衝液レシピは以下に提供される）。細胞溶解物を、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０溶解緩衝液中の２４％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロースで形成された２．５量のスクロースクッションの上に積層した。この試料を４℃で１０分間、１８，０００ｇで遠心分離して、核ペレットを単離した（上澄みは、細胞質画分を表していた）。核ペレットをＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄した。核ペレットを０．５ｍＬのグリセロール緩衝液で優しく再懸濁し、続いて等量の核溶解緩衝液で氷上で２分間インキュベートした。この試料を４℃で２分間、１６，０００ｇで遠心分離して、クロマチンペレットを単離した（上澄みは、核可溶性画分を表していた）。クロマチンペレットをＰＢＳ／１ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄した。クロマチンペレットを−８０℃で保存した。

【0329】

Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０溶解緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有していた。グリセロール緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．８５ｍＭのＤＴＴ、及び５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）グリセロールを含有していた。核溶解緩衝液は、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．６）、１ｍＭのＤＴＴ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＮａＣｌ、１Ｍの尿素、及び１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有していた。

【0330】

Ｈ．クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ−ｓｅｑ）
一次肝細胞及びＨｅｐＧ２細胞について以下のプロトコルを使用してＣｈＩＰ−ｓｅｑを実施して、組成物を決定し、シグナル伝達中心の位置を確認した。

【0331】

ｉ．細胞架橋
２×１０^７細胞を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑの各実行に使用した。２ｍＬの新鮮な１１％ホルムアルデヒド（ＦＡ）溶液を、１５ｃｍプレート上の２０ｍＬの培地に添加して、１．１％の最終濃度に到達させた。プレートを短時間旋回させ、室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。インキュベーションの最後に、ＦＡを、１ｍＬの２．５Ｍグリシンをプレートに添加し、室温で５分間インキュベートすることによってクエンチした。培地を１Ｌビーカーに破棄し、細胞を２０ｍＬの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳ（１０ｍＬ）をプレートに添加し、細胞をプレートから掻き落とした。細胞を１５ｍＬのコニカルチューブに移し、チューブを氷上に置いた。プレートを、追加の４ｍＬのＰＢＳで洗浄し、１５ｍＬのチューブ内で細胞と複合した。チューブを５分間、１，５００ｒｐｍ、４℃で卓上遠心分離機で遠心分離した。ＰＢＳを吸引し、細胞を液体窒素中で急速冷凍した。ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃で保存した。

【0332】

ｉｉ．予ブロック磁気ビーズ
３０μＬのタンパク質Ｇビーズ（反応あたり）を、１．５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに添加した。ビーズを、磁気分離によって室温で３０秒間収集した。ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。５μｇの抗体を、ブロッキング溶液中の２５０μＬのビーズに添加した。混合物を透明なチューブに移し、４℃で一晩回転させた。翌日に、抗体を含有する緩衝液を取り除き、ビーズを、４℃で１０分間、回転器上でビーズをインキュベートし、ビーズを磁石で収集することによって、１．１ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄した。ビーズを、５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、使用準備が整うまで氷上で保持した。

【0333】

ｉｉｉ．細胞溶解、ゲノム断片化、及びクロマチン免疫沈降
ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルを、使用前に溶解緩衝液１（ＬＢ１）に添加した。５０ｘ溶液の場合、１錠を１ｍＬのＨ_２Ｏに溶解した。カクテルをアリコートで−２０℃で保存した。細胞を、各チューブ内で８ｍＬのＬＢ１中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。核を、４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心沈殿した。ＬＢ１を吸引し、細胞を、各チューブ内での８ｍＬのＬＢ２中に再懸濁し、４℃で１０分間、回転器上でインキュベートした。

【0334】

ＣＯＶＡＲＩＳ（登録商標）Ｅ２２０ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ（商標）超音波処理器を、高細胞数についての製造元の推奨に従ってプログラムした。ＨｅｐＧ２細胞を１２分間音波処理し、一次肝細胞試料を１０分間音波処理した。溶解物を清潔な１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、チューブを４℃で１０分間、２０，０００ｇで遠心分離して残屑をペレット化した。上澄みを、予め結合された抗体を有する予めブロックされたタンパク質Ｇビーズを含有する２ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。５０μＬの上澄みをインプットとして保存した。インプット材料を、使用準備が整うまで−８０℃で保持した。チューブを４℃で一晩、ビーズで回転させた。

【0335】

ｉｖ．洗浄、溶出、及び架橋逆転
全ての洗浄ステップは、チューブを４℃で５分間回転させることによって実施した。洗浄ステップごとに、ビーズを清潔なＰｒｏｔｅｉｎ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。ビーズを、磁石を使用して１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で収集した。ビーズを１．１ｍＬの音波処理緩衝液で２回洗浄した。磁気スタンドを使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液２で２回洗浄し、磁気スタンドを再度使用して、磁気ビーズを収集した。ビーズを１．１ｍＬの洗浄緩衝液３で２回洗浄した。全ての残留洗浄緩衝液３を取り除き、ビーズを１．１ｍＬのＴＥ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００緩衝液で１回洗浄した。残留ＴＥ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００緩衝液を取り除き、ビーズをＴＥ緩衝液で毎回３０秒間にわたって２回洗浄した。残留ＴＥ緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁した。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を、５０μＬのインプットに添加し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させた。インプット試料を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートした。

【0336】

ｖ．クロマチン抽出及び沈降
インプット及び免疫沈降（ＩＰ）試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液をＩＰ及びインプット試料に添加して、ＳＤＳを希釈した。ＲＮａｓｅ Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ ＣａＣｌ_２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１．５時間インキュベートした。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速での遠心分離によって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物中でＭａＸｔｒａｃｔチューブに移した。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させた。水相を２つの清潔なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１．５μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加した。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させ、４℃で２０分間、最大速度で遠心沈殿させた。エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄した。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させた。２５μＬのＨ_２Ｏを各免疫沈降（ＩＰ）及びインプットペレットに添加し、５分間放置し、短時間ボルテックスした。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、各試料について５０μＬのＩＰ及び５０μＬのインプットＤＮＡを得た。１μＬのこのＤＮＡを使用し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ｑ３２８５４）を使用してプルダウンＤＮＡの量を測定した。免疫沈降材料の全量は、数ｎｇ（ＴＦの場合）〜数百ｎｇ（クロマチン修飾の場合）の範囲であった。６μＬのＤＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲを使用して分析して、富化を決定した。必要に応じてＤＮＡを希釈した。富化が良好であった場合、残りをＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製に使用した。

【0337】

ｖｉ．ＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製
Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｒｉｇｏｓ（ＮＥＢ、＃６６０９Ｓ）を使用するＩｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＤＮＡライブラリー調製キット（ＮＥＢ、＃Ｅ７６４５）を使用して、製造元の指示に従い、以下の修正とともにライブラリーを調製した。ライブラリー調製のための残りのＣｈＩＰ試料（約４３μＬ）及び１μｇのインプット試料を、プロトコルの末端修復部分の前に５０μＬの量にした。接着プレートシール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ０５５８）で密封し、少なくとも１つの空のウェルを異なる試料の間に残した９６ウェルの半スカート状ＰＣＲプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＢ１４００）において、加熱した蓋を有するＰＣＲマシンで末端修復反応を実行した。未希釈のアダプターをインプット試料に使用し、１：１０に希釈したアダプターを５〜１００ｎｇのＣｈＩＰ材料に使用し、１：２５に希釈したアダプターを５ｎｇ未満のＣｈＩＰ材料に使用した。加熱した蓋を取り外したＰＣＲマシンで連結反応を実行した。アダプター連結されたＤＮＡを、清潔なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移し、Ｈ_２Ｏを使用して量を９６．５μＬにした。

【0338】

ＳＰＲＩｓｅｌｅｃｔ磁気ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ｂ２３３１７）を使用して、２００〜６００ｂｐのＣｈＩＰ断片を選択した。３０μＬのビーズを９６．５μＬのＣｈＩＰ試料に添加して、６００ｂｐより長い断片に結合させた。より短い断片を新鮮なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。１５μＬのビーズを添加して、２００ｂｐより長いＤＮＡに結合し、新鮮に調製された７５％エタノールを使用して、ビーズをＤＮＡで２回洗浄した。１７μＬの０．１Ｘ ＴＥ緩衝液を使用して、ＤＮＡを溶出した。約１５μＬを収集した。

【0339】

３μＬのサイズ選択されたインプット試料及びＣｈＩＰ試料の全て（１５μＬ）をＰＣＲに使用した。サイズ選択されたＤＮＡの量は、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイを使用して測定した。約５〜１０ｎｇのサイズ選択されたＤＮＡを有するインプット試料及びＣｈＩＰ試料については７サイクル、及び５ｎｇ未満のサイズ選択されたＤＮＡを有する場合は１２サイクルにわたってＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産生物（２５μＬ）の半分を、製造元の指示に従い、２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、＃Ａ６３８８０）で精製した。ＰＣＲ産生物を、１７μＬの０．１Ｘ ＴＥ緩衝液で溶出し、ＰＣＴ産生物の量をＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイを使用して測定した。５ｎｇ未満のＰＣＲ産生物を有する試料の残りの半分について、追加の４サイクルのＰＣＲを実行し、ＤＮＡを２２．５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製した。濃度を測定して、収率の増加が存在したかどうかを決定した。両方の半分を複合し、Ｈ_２Ｏを使用して量を最大５０μＬにした。

【0340】

２回目のＤＮＡの精製は、１７μＬの０．１Ｘ ＴＥ中の４５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して実行し、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイを使用して、最終収率を測定した。このプロトコルは、２０ｎｇから１ｍｇのＰＣＲ産生物を産生する。ライブラリーの質を、必要に応じて、製造元の推奨に基づいて高感度ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、＃５０６７−４６２６）を使用し、１μＬの各試料をＨ_２Ｏで希釈することによって検証した。

【0341】

ｖｉｉ．試薬
１１％のホルムアルデヒド溶液（５０ｍＬ）は、１４．９ｍＬの３７％ホルムアルデヒド（最終濃度１１％）、１ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ（最終濃度０．１Ｍ）、１００μＬの０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度１ｍＭ）、５０μＬの０．５Ｍ ＥＧＴＡ（ｐＨ８）（最終濃度０．５ｍＭ）、及び２．５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）（最終濃度５０ｍＭ）を含有していた。

【0342】

ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中の０．５％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び１００ｍＬ ＰＢＳ中の５００ｍｇのＢＳＡを含有していた。ブロッキング溶液は、使用の最大約４日前に調製してもよい。

【0343】

溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％ ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0344】

溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0345】

音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0346】

プロテイナーゼ阻害剤は、ＬＢ１、ＬＢ２、及び音波処理緩衝液に含まれていた。

【0347】

洗浄緩衝液２（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ ＳＤＳを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0348】

洗浄緩衝液３（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％ ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有していた。ｐＨを８．０に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0349】

ＣｈＩＰ溶出緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ_２Ｏを含有していた。ｐＨを７．５に調節した。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存した。ｐＨを使用直前に再チェックした。

【0350】

Ｉ．ＣｈＩＰ−ｓｅｑ結果の分析
各試料から得られた全ての読み出し値を、Ｐｈｒｅｄスコア≧２０及び読み出し長≧３０を必要とするｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ０．４．１を使用してトリミングした。トリミングした読み出し値を、Ｂｏｗｔｉｅ（バージョン１．１．２）を使用し、パラメーター：−ｖ ２ −ｍ １ −Ｓ −ｔを用いてヒトゲノム（ｈｇ１９ビルド）に対してマップした。全てのマップされていない読み出し値、固有にマップされていない読み出し値及びＰＣＲ重複を取り除いた。全てのＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを、ＭＡＣＳ２を使用し、パラメーター：−ｑ ０．０１ −ＳＰＭＲを用いて特定した。ＣｈＩＰ−ｓｅｑシグナルを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーにおいて可視化した。注釈の付いたプロモーター（ＲｅｆＳｅｑ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ及びＵＣＳＣ Ｋｎｏｗｎ Ｇｅｎｅデータベースの複合）から少なくとも２ｋｂ離れたＣｈＩＰ−ｓｅｑピークを、遠位ＣｈＩＰ−ｓｅｑピークとして選択した。

【0351】

Ｊ．ＲＮＡ−ｓｅｑ
このプロトコルは、以下のプロトコルの修飾バージョンである。ＭａｇＭＡＸ ｍｉｒＶａｎａ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キットユーザーガイド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃ＭＡＮ００１１１３１ Ｒｅｖ Ｂ．０）、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール（Ｅ７４９０）、及びＩｌｌｕｍｉｎａ用ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｅ７４２０）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＃Ｅ７４９０１）。

【0352】

ＭａｇＭａｘ ｍｉｒＶａｎａキット指示書（１４〜１７頁の「細胞からＲＮＡを単離する」と題されるセクション）を、培養物中の細胞から全ＲＮＡを単離するために使用した。接着細胞を含有するマルチウェルプレート（通常は２４ウェルプレート）のウェルあたり２００μＬの溶解結合混合物を使用した。

【0353】

ｍＲＮＡ単離及びライブラリー調製のために、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ磁気単離モジュール及びＤｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ Ｐｒｅｐキットを使用した。上記の細胞から単離されたＲＮＡを定量化し、５０μＬのヌクレアーゼ不含水中５００μｇの各試料中で調製した。このプロトコルは、微量遠心管または９６ウェルプレート中で実行することができる。

【0354】

８０％エタノールを新たに調製し、全ての溶出を０．１Ｘ ＴＥ緩衝液中で行う。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズを必要とするステップの場合、ビーズを使用前に室温にした。試料の量を最初に測定し、ビーズを分注した。セクション１．９Ｂ（１．９Ａではない）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＮＥＢＮｅｘｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｏｌｉｇｏｓ（＃Ｅ６６０９）に使用した。ＰＣＲ富化を開始する前に、Ｑｕｂｉｔ（ＤＮＡ高感度キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ｑ３２８５４）を使用して、ｃＤＮＡを定量化した。ＰＣＲ反応を１２サイクルにわたって実行した。

【0355】

ＰＣＲ反応の精製（ステップ１．１０）後、Ｑｕｂｉｔ ＤＮＡ高感度キットを使用して、ライブラリーを定量化した。１μＬの各試料を１〜２ｎｇ／μＬに希釈して、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＤＮＡ高感度キット、Ａｇｉｌｅｎｔ ＃５０６７−４６２６）上で実行した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒが清浄でなかった場合（およそ３００ｂｐの１つの狭いピーク）、０．９Ｘまたは１．０Ｘのビーズ：試料比を使用して、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズクリーンアップステップを繰り返した。次いで、試料をＱｕｂｉｔで再度定量化し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で再度実行した（１〜２ｎｇ／μＬ）。

【0356】

ＩＮＴＡＣＴ精製された核または新皮質核全体からの核ＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、Ｎｕｇｅｎ Ｏｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ−ｓｅｑ Ｓｙｓｔｅｍ Ｖ２で増幅させた。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００を使用してシーケンシングした。

【0357】

Ｋ．ＲＮＡ−ｓｅｑデータ分析
各試料から得られた全ての読み出し値を、ＳＴＡＲ＿２．５．２ｂを使用してヒトゲノム（ｈｇ１９ビルド）に対してマップし、これが読み出し値の分割によってスプライス部位にわたるマッピングを可能にする（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１２）２９（１）：１５−２１）。固有にマップされた読み出し値を後に、参照アノテーションによってガイドされる転写物（ＲｅｆＳｅｑ遺伝子モデル）中に（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｐｒｕｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２ Ｊａｎ； ４０（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１３０−Ｄ１３５）、Ｃｕｆｆｎｏｒｍ ｖ２．２．１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｒａｐｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，５６２−５７８（２０１２））を用いてアセンブルした。各遺伝子の発現レベルを、正規化したＦＰＫＭ（１００万個のマップされた断片あたりのエクソンのキロベースあたりの断片）を用いて定量化した。差次的に発現された遺伝子を、Ｃｕｆｆｄｉｆｆ ｖ２．２．１を使用し、ｑ値＜０．０１及びｌｏｇ２変化倍率＞＝１または＜＝−１を用いて呼び出した。

【0358】

Ｌ．ＡＴＡＣ−ｓｅｑ
肝細胞を一晩播種し、次いで血清及び他の因子を取り除いた。２〜３時間後、細胞を化合物で処理し、一晩インキュベートした。細胞を採取し、核を転位反応のために調製した。５０，０００ビーズ結合した核を、Ｍｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎｅｕｒｏｎ ８６，１３６９−１３８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、）に記載されるように、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＦＣ−１２１−１０３０）を使用して転位させた。９〜１２サイクルのＰＣＲ増幅後、ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２０００上でシーケンシングした。バーコード化されたプライマーを使用して、７２℃で５分間の伸長でＰＣＲを実施し、次いで最終ＰＣＲ産生物をシーケンシングした。

【0359】

各試料から得られた全ての読み出し値を、データ分析にＰｈｒｅｄスコア≧２０及び読み出し長≧３０を必要とするｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ０．４．１を使用してトリミングした。トリミングした読み出し値を、Ｂｏｗｔｉｅ２（バージョン２．２．９）を使用し、パラメーター：−ｔ −ｑ −Ｎ １ −Ｌ ２５ −Ｘ ２０００ ｎｏ−ｍｉｘｅｄ ｎｏ−ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔを用いて、ヒトゲノム（ｈｇ１９ビルド）に対してマップした。全てのマップされていない読み出し値、固有にマップされていない読み出し値及びＰＣＲ重複を取り除いた。全てのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、ＭＡＣＳ２を使用し、パラメーター：−−ｎｏｌａｍｂｄａ−ｎｏｍｏｄｅｌ−ｑ ０．０１−−ＳＰＭＲを用いて呼び出した。ＡＴＡＣ−ｓｅｑシグナルを、ＵＣＳＣゲノムブラウザーにおいて可視化した。注釈の付いたプロモーター（ＲｅｆＳｅｑ、Ｅｎｓｅｍｂｌｅ及びＵＣＳＣ Ｋｎｏｗｎ Ｇｅｎｅデータベースの複合）から少なくとも２ｋｂ離れたＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを、遠位ＡＴＡＣ−ｓｅｑピークとして選択した。

【0360】

Ｍ．ｑＲＴ−ＰＣＲ
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７（４０）１７３１５−１７３２０（２０１０）に記載されるように、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の前に、細胞培地を取り除き、ＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットカタログ番号７４１７１）と置き換えた。ＲＮｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１８２）を使用し、ＲＮＡ抽出のために細胞を処理した。Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ分析の場合、製造元の指示に従い、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ：４３６８８１３または４３６８８１４）を使用してｃＤＮＡを合成した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ｃＤＮＡを用いて、ＢｉｏＲａｄからのｉＱ５マルチカラーｒｔＰＣＲ検出システムを使用し、６０℃のアニーリングによって実施した。各標的についてＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからの以下のＴａｑｍａｎプローブを使用して、試料を増幅させた：Ｈｓ０１５５２２１７＿ｍ１（ヒトＰＮＰＬＡ３）、Ｍｍ００５０４４２０＿ｍ１（マウスＰＮＰＬＡ３）、Ｈｓ００１６４００４＿ｍ１（ＣＯＬ１Ａ１）、Ｈｓ０１０７８１３６＿ｍ１（ＪＡＫ２）、Ｈｓ００８９５３７７＿ｍ１（ＳＹＫ）、Ｈｓ００２３４５０８＿ｍ１（ｍＴＯＲ）、Ｈｓ００９９８０１８＿ｍ１（ＰＤＧＦＲＡ）、Ｈｓ００９０９２３３＿ｍ１（ＧＦＡＰ）、４３５２３４１Ｅ（ＡＣＴＢ）、４３２６３２０Ｅ（ＧＵＳＢ）、４３２６３１９Ｅ（Ｂ２Ｍ）、及び４３２６３１７Ｅ（ＧＡＰＤＨ）。

【0361】

ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される発現の変化倍率の分析を、以下の技法を使用して実施した。対照はＤＭＳＯであり、処理は選択された化合物（ＣＰＤ）であった。内部対照は、ＧＡＰＤＨまたはＢ−アクチン（もしくは別途示される）であり、関心対象の遺伝子は標的である。最初に、正規化のために以下４つの条件：ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ、ＤＭＳＯ：標的、ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ、及びＣＰＤ：標的の平均を計算した。次に、（ＤＭＳＯ：標的）−（ＤＭＳＯ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ対照及び（ＣＰＤ：標的）−（ＣＰＤ：ＧＡＰＤＨ）＝ΔＣＴ実験を使用して対照及び処理の両方のΔＣＴを計算して、内部対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。次いで、ΔＣＴ実験−ΔＣＴ対照によってΔΔＣＴを計算した。２−（ΔΔＣＴ）によって発現変化倍率（またはＲＱと省略される相対定量化）を計算した（本明細書に提供されるＲＮＡ−Ｓｅｑ結果によって２倍発現変化が示された）。

【0362】

いくつかの例では、ＲＱ最小値及びＲＱ最大値もまた報告される。ＲＱ最小及びＲＱ最大は、それぞれ試験試料中の遺伝子発現の最小及び最大相対レベルである。それらは分析設定における信頼レベルセットを使用して計算され、信頼レベルは１標準偏差（ＳＤ）に設定された。これらの値は、以下のように標準偏差を使用して計算した：ＲＱ最小＝２−（ΔΔＣＴ−ＳＤ）、及びＲＱ最大＝２−（ΔΔＣＴ＋ＳＤ）

【0363】

Ｎ．端部対タグシーケンシング（ＣｈＩＡ−ＰＥＴ）によるクロマチン相互作用分析
ＣｈＩＡ−ＰＥＴは、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｐｅｌｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２２，４９０−５０３、Ｆｕｌｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６２，５８−６４、Ｇｏｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３７９１／３７７０、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １４８，８４−９８、及びＤｏｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｅｌｌ １５９，３７４−３８７において以前に記載されているように実施される。手短に言えば、胚幹（ＥＳ）細胞（最大１×１０^８細胞）を、室温で２０分間１％ホルムアルデヒドで処理し、次いで０．２Ｍグリシンを使用して中和する。架橋クロマチンは、音波処理によって３００〜７００ｂｐのサイズ長に断片化される。抗ＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ、Ａ３００−０５５Ａ）を使用して、ＳＭＣ１結合されたクロマチン断片を富化する。ＣｈＩＰ ＤＮＡの部分を、濃度定量化のため、及び定量的ＰＣＲを使用する富化分析のために抗体で被覆されたビーズから溶出される。ＣｈＩＡ−ＰＥＴライブラリー構築の場合、ＣｈＩＰ ＤＮＡ断片は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して末端修復される。ＣｈＩＰ ＤＮＡ断片を２アリコートに分割し、リンカーＡまたはリンカーＢのいずれかを断片端部に連結する。２つのリンカーは、ヌクレオチドバーコードとして使用される２つのヌクレオチドが異なる（リンカーＡはＣＧ、リンカーＢはＡＴ）。リンカー連結後、２つの試料を複合し、２０ｍＬ量で希釈して、異なるＤＮＡ−タンパク質複合体間の連結を最小化することによって近位連結のために調製される。近位連結反応は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）で実施し、２２℃で２０時間揺らすことなくインキュベートする。近位連結中に、同じリンカー配列を有するＤＮＡ断片は、同じクロマチン複合体内で連結され、これがホモ二量体リンカー組成を有する連結産生物を生成した。しかしながら、異なるクロマチン複合体からＤＮＡ断片間のキメラ連結もまた起こり得、したがってヘテロ二量体リンカー組成を有する連結産生物を産生する。これらのヘテロ二二量体リンカー産生物を使用して、非特異的連結の頻度を評価し、次いで取り除かれる。

【0364】

ｉ．１日目
ＣｈＩＰについて記載されるように細胞を架橋する。冷凍細胞ペレットを、使用準備が整うまで−８０℃の冷凍庫で保存した。このプロトコルは、６つの１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブ中で冷凍された少なくとも３×１０^８細胞（チューブあたり５０００万細胞）を必要とする。６つの１００μＬタンパク質Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（各ＣｈＩＡ−ＰＥＴ試料について）を、氷上の６つの１．５ｍＬエッペンドルフチューブに添加する。ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄し、各洗浄ステップの間に４℃で１０分間回転させながらインキュベートして、効率的なブロッキングを可能にする。タンパク質Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、６つのチューブの各々において２５０μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、１０μｇのＳＭＣ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ａ３００−０５５Ａ）を各チューブに添加する。ビーズ・抗体混合物を、４℃で回転させながら一晩インキュベートする。

【0365】

ｉｉ．２日目
ビーズを１．５ｍＬのブロッキング溶液で３回洗浄して、未結合のＩｇＧを取り除き、毎回４℃で１０分間、回転させながらインキュベートする。Ｓｍｃ１結合されたビーズを、１００μＬのブロッキング溶液中に再懸濁し、４℃で保存する。最終溶解緩衝液１（試料あたり８ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液１（ＬＢ１）（１：５０）に添加することによって調製する。８ｍＬの最終溶解緩衝液１を、各冷凍細胞ペレット（試料あたり８ｍＬ×６）に添加した。細胞を完全に再懸濁し、上下にピペットすることによって氷上で解凍する。細胞懸濁液は、４℃で１０分間回転させながら再度インキュベートする。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心分離する。同時に、最終溶解緩衝液２（試料あたり８ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１：５０）に添加することによって調製する。

【0366】

遠心分離後、上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を８ｍＬの最終溶解緩衝液２中に完全に再懸濁する。細胞懸濁液は、４℃で１０分間回転させながらインキュベートする。懸濁液を４℃で５分間、１，３５０ｇで遠心分離する。インキュベーション及び遠心分離中に、最終溶解緩衝液（試料あたり１５ｍＬ）を、５０ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液を音波処理緩衝液（１：５０）に添加することによって調製する。上澄みを破棄し、上下にピペットすることによって、核を１５ｍＬの最終音波処理緩衝液中に完全に再懸濁する。核抽出物を、氷上の１５の１ｍＬ Ｃｏｖａｒｉｓ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｅ２２０音波処理チューブに抽出する。１０μＬのアリコートを使用して、ゲル上の音波処理されていないクロマチンのサイズをチェックする。

【0367】

Ｃｏｖａｒｉｓ音波処理器を、製造元の指示に従ってプログラムする（２０００万細胞あたり１２分＝１２×１５＝３時間）。試料を上記のように順次シーケンシングする。目標は、クロマチンＤＮＡを２００〜６００ｂｐに切断することである。音波処理断片が大きすぎる場合、擬陽性がより頻繁になる。音波処理された核抽出物を、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ中に分注する。１．５ｍＬの試料を４℃で１０分間、完全速度で遠心分離する。上澄み（ＳＮＥ）を新しい予め冷却された５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中にプールし、音波処理緩衝液で１８ｍＬの量にする。２つの５０μＬのチューブを、インプットとして、また断片のサイズをチェックするために取った。２５０μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液を添加し、逆架橋は６５℃で一晩、オーブン内で起こる。架橋の逆転後、音波処理断片のサイズをゲル上で決定する。

【0368】

３ｍＬの音波処理抽出物を、６つの清潔な１５ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブの各々において、ＳＭＣ１抗体を有する１００μＬのタンパク質Ｇビーズに添加する。ＳＮＥ・ビーズ混合物を含有するチューブを、４℃で一晩回転させながらインキュベートする（１４〜１８時間）。

【0369】

ｉｉｉ．３日目
ＳＮＥ・ビーズ混合物の量の半分（１．５ｍＬ）を、６つの予め冷却されたチューブの各々に添加し、磁石を使用してＳＮＥを取り除く。チューブを以下のように順次洗浄する。１）１．５ｍＬの音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除いた（ステップを２回実施した）；２）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除く（ステップを２回実施する）；３）１．５ｍＬの高塩音波処理緩衝液を添加し、ビーズを再懸濁して、結合するために４℃で５分間回転させた後、液体を取り除く（ステップを２回実施した）；４）１．５ｍＬのＬｉＣｌ緩衝液を添加し、細胞を再懸濁して、結合するために５分間回転させながらインキュベートした後、液体を取り除く（ステップを２回実施した）；５）１．５ｍＬの１Ｘ ＴＥ＋０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を使用して、結合するために５分間細胞を洗浄した後、液体を取り除き、１．５ｍＬの氷冷ＴＥ緩衝液を使用して、結合するために３０秒間細胞を洗浄した後、液体を取り除く（ステップを２回実施した）。６つのチューブ全てからのビーズを、１Ｘ氷冷ＴＥ緩衝液の１つの１，０００μＬチューブ中に順次再懸濁する。

【0370】

ＣｈＩＰ−ＤＮＡを以下のプロトコルを使用して定量化する。ビーズの１０（体積）パーセントまたは１００μＬを、磁石を使用して新たな１．５ｍＬチューブに移す。ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液に再懸濁し、チューブを６５℃で１時間、ビーズで回転させる。ビーズを含むチューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移した。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートする。免疫沈降試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を免疫沈降及びインプット試料に添加して希釈する。５μＬのＲＮａｓｅ Ａ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、チューブを３７℃で３０分間インキュベートする。

【0371】

インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ ＣａＣｌ_２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１．５時間インキュベートする。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速でそれらを遠心分離することによって調製した。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを、核プロテイナーゼＫ反応に添加する。約１．２ｍＬの混合物をＭａＸｔｒａｃｔチューブに移す。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させる。水相を２つの清潔なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加する。混合物を−２０℃で一晩または−８０℃で１時間沈降させる。

【0372】

混合物を４℃で２０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除き、チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄する。エタノールの残余を全て取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させる。Ｈ_２Ｏを各チューブに添加する。各チューブを５分間放置し、短時間ボルテックスする。両方のチューブからのＤＮＡを組み合わせ、５０μＬのＩＰ及び１００μＬのインプットＤＮＡを得る。

【0373】

収集されたＤＮＡの量を、Ｑｕｂｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃Ｑ３２８５６）を使用してＣｈＩＰによって定量化する。１μＬのインターカレーター色素を各測定１μＬの試料と複合する。キットに付随する２つの標準物を使用する。ビーズのわずか１０％からのＤＮＡが測定されている。９００μＬのビーズ懸濁液中の約４００ｎｇのクロマチンを、ｑＰＣＲによって測定されるエンハンサー及びプロモーターにおける良好な富化によって得る。

【0374】

ｉｖ．３日目または４日目
ＣｈＩＰ−ＤＮＡの末端鈍化を、以下のプロトコルを使用してビーズ上で実施する。残りのクロマチン／ビーズを、ピペットによって分割し、４５０μＬのビーズ懸濁液を２つのチューブに分注する。ビーズを磁石上で収集する。上澄みを取り除き、次いでビーズを以下の反応混合物中に再懸濁する：７０μＬの１０Ｘ ＮＥＢ緩衝液２．１（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）、７μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、６１５．８μＬのｄＨ_２Ｏ、及び７．２μＬの３Ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０３Ｌ）。ビーズを３７℃で４０分間回転させながらインキュベートする。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。

【0375】

Ｏｎ−Ｂｅａｄ Ａ−テーリングを、下記のようにＫｌｅｎｏｗ（３′〜５′エキソ−）マスターミックスを調製することによって実施した：７０μＬの１０Ｘ ＮＥＢ緩衝液２、７μＬ １０ｍＭ ｄＡＴＰ、６１６μＬ ｄＨ２０、及び７μＬの３Ｕ／μＬ Ｋｌｅｎｏｗ（３′〜５′エキソ−）（ＮＥＢ、Ｍ０２１２Ｌ）。混合物を３７℃で５０分間回転させながらインキュベートする。ビーズを磁石で収集し、次いでビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。

【0376】

リンカーを氷上で優しく解凍する。リンカーを、優しくピペットすることによって水と、次いでＰＥＧ緩衝液と十分混合した後、優しくボルテックスする。次いで、チューブあたり１３９４μＬのマスターミックス及び６μＬのリガーゼを添加し、反転によって混合する。パラフィルムをチューブ上に置き、チューブを１６℃で一晩（少なくとも１６時間）回転させながらインキュベートする。ビオチニル化リンカーを、以下の反応混合物を設定し、試薬を１１１０μＬのｄＨ_２Ｏ、４μＬの２００ｎｇ／μＬのビオチニル化ブリッジリンカー、ＰＥＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有する２８０μＬの５Ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、及び６μＬの３０Ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の順に添加することによって、ビーズ上でＣｈＩＰ−ＤＮＡに連結した。

【0377】

ｖ．５日目
エキソヌクレアーゼλ／エキソヌクレアーゼＩ Ｏｎ−Ｂｅａｄ消化を、以下のプロトコルを使用して実施した。ビーズを磁石で収集し、１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。洗浄緩衝液をビーズから取り除き、次いで以下の反応混合物中に再懸濁する：７０μＬの１０Ｘ λヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、６１８μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ２０、６μＬの５Ｕ／μＬ λエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２６２Ｌ）、及び６μＬのエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、Ｍ０２９３Ｌ）。反応物を３７℃で１時間回転させながらインキュベートする。ビーズを磁石で収集し、ビーズを１ｍＬの氷冷ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液で３回洗浄する（各洗浄あたり３０秒）。

【0378】

全ての残留緩衝液を取り除き、ビーズを３００μＬのＣｈＩＰ溶出緩衝液中に再懸濁することによって、クロマチン複合体をビーズから溶出する。ビーズを含むチューブを６５℃で１時間回転させる。チューブを磁石上に置き、溶出液を新鮮なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄエッペンドルフチューブに移す。溶出液を６５℃のオーブンで一晩、回転させずにインキュベートする。

【0379】

ｖｉ．６日目
溶出された試料を新鮮なチューブに移し、３００μＬのＴＥ緩衝液を添加してＳＤＳを希釈する。３μＬのＲＮａｓｅ Ａ（３０ｍｇ／ｍＬ）をチューブに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、３μＬの１Ｍ ＣａＣｌ_２及び７μＬの２０ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫを添加し、チューブを５５℃で１．５時間再度インキュベートする。ＭａＸｔｒａｃｔ高密度２ｍＬゲルチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）を、室温で３０秒間、全速でそれらを遠心分離することによって沈降させる。６００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各プロテイナーゼＫ反応に添加し、約１．２ｍＬの混合物中でＭａＸｔｒａｃｔチューブに移す。チューブを室温で５分間、１６，０００ｇで回転させる。

【0380】

水相を２つの清潔なＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに移し（各チューブに３００μＬ）、１μＬのグリコーゲン、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、及び９００μＬのエタノールを添加する。混合物を−８０℃で１時間沈降させる。チューブを４℃で３０分間、最大速度で遠心沈降させ、エタノールを取り除く。チューブを４℃で５分間、最大速度で遠心沈殿させることによって、ペレットを１ｍＬの７５％エタノールで洗浄する。エタノールの残余を取り除き、ペレットを室温で５分間乾燥させる。３０μＬのＨ_２Ｏをペレットに添加し、５分間放置する。ペレット混合物を短時間ボルテックスし、遠心沈降させてＤＮＡを収集する。

【0381】

Ｑｕｂｉｔ及びＤＮＡ高感度ＣｈＩＰを実施して、近位連結されたＤＮＡ産生物を定量化し、その質を評価する。約１２０ｎｇの産生物が得られる。

【0382】

ｖｉｉ．７日目
次いで、Ｎｅｘｔｅｒａ断片化（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の構成成分を調製する。１００ｎｇのＤＮＡを、１２．５μＬの２Ｘ断片化緩衝液（Ｎｅｘｔｅｒａ）、１μＬのヌクレアーゼ不含ｄＨ_２０、２．５μＬのＴｎ５酵素（Ｎｅｘｔｅｒａ）、及び９μＬのＤＮＡ（２５ｎｇ）を含有する４つの２５μＬ反応物中に分割する。反応物の各々の断片化を、品質管理のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で分析する。

【0383】

反応物を５５℃で５分間、次いで１０℃で１０分間インキュベートする。２５μＬのＨ_２Ｏを添加し、断片化されたＤＮＡをＺｙｍｏカラムを使用して精製する。３５０μＬの結合緩衝液を試料に添加し、混合物をカラム中に装填して、１３，０００ｒｐｍで３０秒間回転させる。フロースルーを再適用し、カラムを再度回転させる。カラムを２００μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、１分間回転させて膜を乾燥させる。カラムを清潔なエッペンドルフチューブに移し、２５μＬの溶出緩衝液を添加する。チューブを１分間遠心沈降させる。このステップを別の２５μＬの溶出緩衝液で繰り返す。全ての断片化されたＤＮＡを１つのチューブに複合する。

【0384】

ＣｈＩＡ−ＰＥＴを、以下のステップを使用してストレプトアビジンビーズ上で固定化する。２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ）を、核酸のカップリングのために以下のように調製する：４００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１０ｍＭ最終）、８０μＬの１Ｍ ＥＤＴＡ（１ｍＭ最終）、１６ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ（２Ｍ最終）、及び２３．５２ｍＬのｄＨ_２Ｏ。１Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液（４０ｍＬ全量）を、２０ｍＬのｄＨ_２Ｏを２０ｍＬの２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加することによって調製する。

【0385】

ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０を３０分間室温にし、３０μＬのビーズを新たな１．５ｍＬチューブに移す。ビーズを１５０μＬの２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄する。ビーズを１００μＬのｉＢｌｏｃｋ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ）中に再懸濁し、混合する。混合物を室温で４５分間、回転器上でインキュベートする。

【0386】

Ｉ−ＢＬＯＣＫ試薬を、０．２％のＩ−Ｂｌｏｃｋ試薬（０．２ｇ）、１Ｘ ＰＢＳまたは１Ｘ ＴＢＳ（１０ｍＬの１０Ｘ ＰＢＳまたは１０Ｘ ＴＢＳ）、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０（５０μＬ）、及びＨ_２Ｏを１００ｍＬまで含有するように調製する。１０Ｘ ＰＢＳ及びＩ−ＢＬＯＣＫ試薬をＨ_２Ｏに添加し、混合物を４０秒間マイクロ波処理（沸騰させない）した後、撹拌する。溶液を冷却した後、Ｔｗｅｅｎ−２０を添加する。溶液は不透明なままであるが、粒子は溶解される。使用するために溶液を室温に冷ます。

【0387】

ビーズのインキュベーション中に、５００ｎｇの剪断ゲノムＤＮＡを５０μＬのＨ_２Ｏ及び５０μＬの２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液に添加する。ビーズがｉＢＬＯＣＫ緩衝液でのインキュベーションを終えたとき、それらを２００μＬの１Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄する。洗浄緩衝液を破棄し、１００μＬの剪断ゲノムＤＮＡを添加する。混合物を室温で３０分間回転させながらインキュベートする。ビーズを２００μＬの１Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄する。断片化ＤＮＡを、等量の２Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液とともにビーズに添加し、室温で４５分間、回転させながらインキュベートする。ビーズを５００μＬの２ｘ ＳＳＣ／０．５％ ＳＤＳ緩衝液（毎回３０秒）で５回洗浄し、続いて５００ｍＬの１Ｘ Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄し、各洗浄後に室温で５分間、回転させながらインキュベートする。ビーズを優しく再懸濁し、チューブを磁石上に置くことによって、Ｑｉａｇｅｎキットからの１００μＬの溶出緩衝液（ＥＢ）で１回洗浄する。上澄みをビーズから取り除き、それらを３０μＬのＥＢ中に再懸濁する。

【0388】

対合端シーケンシングライブラリーを、以下のプロトコルを使用してビーズ上に構築する。１０μＬのビーズを、１０サイクルの増幅でＰＣＲにより試験する。５０μＬのＰＣＲ混合物は、１０μＬのビーズＤＮＡ、１５μＬのＮＰＭ混合物（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａキットから）、５μＬのＰＰＣ ＰＣＲプライマー、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー１（ｉ７）、５μＬのＩｎｄｅｘプライマー２（ｉ５）、及び１０μＬのＨ_２Ｏを含有する。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施する：７２℃で３分間、次いで９８℃で１０秒間、６３℃で３０秒間、及び７２℃で５０秒間の１０〜１２サイクル、ならびに７２℃で５分間の最終延長の１０〜１２サイクルでＤＮＡを変性させる。サイクルの数を調整して、４つの２５μＬの反応物とともに合計約３００ｎｇのＤＮＡを得る。ＰＣＲ産生物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。

【0389】

ＰＣＲ産生物を、ＡＭＰｕｒｅビーズを使用してクリーンアップした。ビーズを使用する前に３０分間室温にする。５０μＬのＰＣＲ反応物を新たなＬｏｗ−Ｂｉｎｄチューブに移し、（１．８ｘ量）９０μＬのＡＭＰｕｒｅビーズを添加する。混合物を十分にピペットし、室温で５分間インキュベートする。磁石を３分間使用してビーズを収集し、上澄みを取り除く。３００μＬの新鮮に調製された８０％エタノールを磁石上のビーズに添加し、エタノールを慎重に破棄する。洗浄を繰り返し、次いで全てのエタノールを取り除く。ビーズを磁石ラック上で１０分間乾燥させる。１０μＬのＥＢをビーズに添加し、十分に混合して、室温で５分間インキュベートする。溶出液を収集し、１μＬの溶出液をＱｕｂｉｔ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒに使用する。

【0390】

ライブラリーをクローン化して、以下のプロトコルを使用して複雑性を検証する。１μＬのライブラリーを１：１０で希釈する。ＰＣＲ反応を下記のように実施する。Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターにアニールするプライマーを選択する（Ｔｍ＝５２．２℃）。ＰＣＲ反応混合物（全量：５０μＬ）は、以下を含有する：１０μＬの５Ｘ ＧｏＴａｑ緩衝液、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、５μＬの１０μＭプライマーミックス、０．２５μＬのＧｏＴａｑポリメラーゼ、１μＬの希釈したテンプレートＤＮＡ、及び３２．７５μＬのＨ_２Ｏ。以下のサイクル条件を使用して、ＰＣＲを実施する：９５℃で２分間、ならびに以下の条件：９５℃で６０秒間、５０℃で６０秒間、及び７２℃で３０秒間、７２℃で５分間の最終延長を含む２０サイクルでＤＮＡを変性させる。ＰＣＲ産生物は、不明確な量の時間にわたって４℃で保持され得る。

【0391】

ＰＣＲ産生物を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）プロトコルで連結する。５μＬの２Ｘ Ｔ４ Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液、１μＬのｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ−Ｅａｓｙベクター、１μＬのＴ４リガーゼ、１μＬのＰＣＲ産生物、及び２μＬのＨ_２Ｏを、全量１０μＬまで複合する。産生物を室温で１時間インキュベートし、２μＬを使用して星コンピテント細胞を形質転換する。２００μＬの５００μＬの細胞をＳＯＣ培地にプレーティングする。翌日、Ｔ７プロモータープライマーを使用して、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングのための２０コロニーを選択する。６０％クローンは、完全なアダプターを有し、１５％が部分的アダプターを有していた。

【0392】

ｖｉｉｉ．試薬
１０試料のタンパク質ＧＤｙｎａｂｅａｄｓは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｙｎａｌカタログ番号１０００３Ｄからのものである。ブロッキング溶液（５０ｍＬ）は、５０ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶解された０．２５ｇのＢＳＡ（０．５％ ＢＳＡ、ｗ／ｖ）を含有し、使用前に４℃で２日間保存する。

【0393】

溶解緩衝液１（ＬＢ１）（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１００％グリセロール溶液、２５ｍＬの１０％ ＮＰ−４０、及び１２．５ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する。ｐＨを７．５に調節する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。溶解緩衝液２（ＬＢ２）（１０００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、及び２ｍＬの０．５Ｍ ＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する。ｐＨを８．０に調節する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。

【0394】

音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１４ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ ＳＤＳを含有する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。高塩音波処理緩衝液（５００ｍＬ）は、２５ｍＬの１Ｍ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、３５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、及び５ｍＬの１０％ ＳＤＳを含有する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。

【0395】

ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（５００ｍＬ）は、１０ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１２５ｍＬの１Ｍ ＬｉＣｌ溶液、２５ｍＬの１０％ ＮＰ−４０、及び５０ｍＬの５％ Ｎａ−デオキシコール酸塩を含有する。ｐＨを８．０に調節する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。

【0396】

溶出緩衝液（５００ｍＬ）を使用して、２５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０ｍＬの１０％ ＳＤＳ、及び４１５ｍＬのｄｄＨ_２Ｏを含有するＣｈＩＰ ＤＮＡの量を定量化する。ｐＨを８．０に調節する。緩衝液を無菌濾過し、４℃で保存する。ｐＨを使用直前に再チェックする。

【0397】

ＣｈＩＡ−ＰＥＴ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（最終１０ｍＭ）、１００μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（最終１ｍＭ）、５ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ（最終５００ｍＭ）、及び４４．４ｍＬのｄＨ_２Ｏを含有する。

【0398】

Ｏ．ＨｉＣｈＩＰ
ＣｈＩＡ−ＰＥＴの代替として、ＨｉＣｈＩＰを使用して、クロマチン相互作用及び立体配座を分析した。ＨｉＣｈＩＰは、ＣｈＩＡ−ＰＥＴよりも少ない細胞を必要とする。

【0399】

ｉ．細胞架橋
上のＣｈＩＰプロトコルに記載されるように細胞を架橋した。架橋した細胞を、−８０℃でペレットとして保存するか、または細胞を急速冷凍した直後にＨｉＣｈＩＰに使用した。

【0400】

ｉｉ．溶解及び制限
１５００万個の架橋細胞を５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液中に再懸濁し、４℃で３０分間回転させた。１５００万より多くの細胞量の場合、ペレットを接触生成のために半分に分割し、次いで音波処理のために組み合えた。細胞を２５００ｇで５分間遠心沈降し、上澄みを破棄した。ペレット化した核を、５００μＬの氷冷Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液で１回洗浄した。上澄みを取り除き、ペレットを１００μＬの０．５％ ＳＤＳ中に再懸濁した。再懸濁液を６２℃で１０分間インキュベートし、次いで２８５μＬのＨ_２Ｏ及び５０μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加して、ＳＤＳをクエンチした。再懸濁液を十分に混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。５０μＬの１０Ｘ ＮＥＢ緩衝液２及び３７５ＵのＭｂｏＩ制限酵素（ＮＥＢ、Ｒ０１４７）を混合物に添加して、３７℃で２時間回転させることによってクロマチンを消化した。より下位の出発物質の場合、より少ない制限酵素を使用し、１５μＬを１０００〜１５００万細胞に使用し、８μＬを５００万細胞、及び４μＬを１００万細胞に使用した。熱（６２℃で２０分間）を使用して、ＭｂｏＩを不活化した。

【0401】

ｉｉｉ．ビオチン組み込み及び近位連結
制限断片オーバーハングを満たし、ＤＮＡ端部をビオチンでマークするために、３７．５μＬの０．４ｍＭビオチン−ｄＡＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ １９５２４０１６）、１．５μＬの１０ｍＭ ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびに１０μＬの５Ｕ／μＬ ＤＮＡポリメラーゼＩ、大きな（Ｋｌｅｎｏｗ）断片（ＮＥＢ、Ｍ０２１０）を複合することによって、５２μＬの充填マスターミックスを反応させた。混合物を、３７℃で１時間回転させながらインキュベートした。

【0402】

９４８μＬの連結マスターミックスを添加した。連結マスターミックスは、１０ｍＭ ＡＴＰを含む１５０μＬの１０Ｘ ＮＥＢ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ、Ｂ０２０２）、１２５μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３μＬの５０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１０μＬの４００Ｕ／μＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２）、及び６６０μＬの水を含有する。混合物を、室温で４時間回転させながらインキュベートした。核を２５００ｇで５分間ペレット化し、上澄みを取り除いた。

【0403】

ｉｖ．音波処理
音波処理の場合、ペレットを核溶解緩衝液中で最大１０００μＬにした。試料をＣｏｖａｒｉｓミリチューブに移し、ＤＮＡを製造元の推奨するパラメーターでＣｏｖａｒｉｓ（登録商標）Ｅ２２０Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（商標）を使用して剪断した。各チューブ（１５００万細胞）を以下の条件下で４分間音波処理した。充填レベル５、デューティサイクル５％、ＰＩＰ１４０、及びサイクル／バースト２００。

【0404】

ｖ．プレクリアリング、免疫沈降、ＩＰビーズ捕捉、及び洗浄
試料を４℃で１５分間、１６，１００ｇで清澄化した。試料を各々約４００μＬの２チューブに分割し、７５０μＬのＣｈＩＰ希釈緩衝液を添加する。Ｓｍｃ１ａ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ａ３００−０５５Ａ）の場合、試料をＣｈＩＰ希釈緩衝液中で１：２に希釈して、０．３３％のＳＤＳ濃度を達成する。６０μＬのタンパク質Ｇビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに洗浄した。ビーズ（プレクリアリング及び捕捉のため）及び抗体の量を、異なる量の細胞出発物質について直線的に調節した。タンパク質Ｇビーズをチューブあたり５０μＬ（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）の希釈緩衝液中に再懸濁した。試料を４℃で１時間回転させた。試料を磁石上に置き、上澄みを新たなチューブに移した。７．５μｇの抗体を１０００万細胞ごとに添加し、混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベートした。別の６０μＬのタンパク質Ｇビーズを、ＣｈＩＰ希釈緩衝液中１０００万細胞ごとに添加した。タンパク質Ｇビーズを、５０μＬの希釈緩衝液（ＨｉＣｈＩＰあたり１００μＬ）中に再懸濁し、試料に添加して、４℃で２時間回転させた。ビーズを低塩洗浄緩衝液、高塩洗浄緩衝液、及びＬｉＣｌ洗浄緩衝液で各々３回洗浄した。５００μＬの洗浄緩衝液を添加し、試料を磁石に対して動かすことによってビーズを前後に２回振り、次いで上澄みを取り除くことによって、磁石上で室温で洗浄を実施した。

【0405】

ｖｉ．ＣｈＩＰ ＤＮＡ溶出
ＣｈＩＰ試料ビーズを１００μＬの新鮮なＤＮＡ溶出緩衝液中に再懸濁した。試料ビーズを室温で１０分間回転させながらインキュベートし、続いて３７℃で３分間振とうさせながらインキュベートした。ＣｈＩＰ試料を磁石上に置き、上澄みを新鮮なチューブに取り除いた。別の１００μＬのＤＮＡ溶出緩衝液をＣｈＩＰ試料に添加し、インキュベーションを繰り返した。ＣｈＩＰ試料の上澄みを再度取り除き、新たなチューブに移した。約２００μＬのＣｈＩＰ試料が存在していた。１０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各試料に添加し、５５℃で４５分間振とうさせながらインキュベートした。温度を６７℃に高め、試料を少なくとも１．５時間振とうさせながらインキュベートした。ＤＮＡをＺｙｍｏ精製し（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃Ｄ４０１４）、１０μＬの水に溶出した。ポストＣｈＩＰ ＤＮＡを定量化して、ライブラリーを正しいサイズ分布で生成するために必要とされるＴｎ５の量を推定した。これは、接触ライブラリーを適切に生成し、試料を過剰に音波処理せず、材料をストレプトアビジンビーズ上で頑強に捕捉したと推測した。１０００万細胞でのＳＭＣ１ ＨｉＣｈＩＰは、１５ｎｇ〜５０ｎｇのポストＣｈＩＰ ＤＮＡの予想収率を有していた。１５０ｎｇより多くのポストＣｈＩＰ ＤＮＡを有するライブラリーの場合、材料を除外し、最大１５０ｎｇをビオチン捕捉ステップに取り入れた。

【0406】

ｖｉｉ．Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのビオチンプルダウン及び調製
ビオチンプルダウンのための調製のために、５μＬのストレプトアビジンＣ−１ビーズをＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液で洗浄した。ビーズを１０μＬの２Ｘビオチン結合緩衝液中に再懸濁し、試料に添加した。ビーズを室温で１５分間、回転させながらインキュベートした。ビーズを磁石上で分離し、上澄みを破棄した。５００μＬのＴｗｅｅｎ洗浄緩衝液を添加することによってビーズを２回洗浄し、５５℃で２分間振とうさせながらインキュベートした。ビーズを１００μＬの１Ｘ（２Ｘから希釈した）ＴＤ緩衝液中で洗浄した。ビーズを２５μＬの２Ｘ ＴＤ緩衝液、各５０ｎｇのポストＣｈＩＰ ＤＮＡについて２．５μＬのＴｎ５、及び水中で５０μＬの量まで再懸濁した。

【0407】

Ｔｎ５は、４μＬの最大量を有していた。例えば、２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、１．２５μＬのＴｎ５を添加し、一方で１２５ｎｇのＤＮＡ転位の場合、４μＬのＴｎ５を使用した。正しい量のＴｎ５を使用して、適切なサイズ分布をもたらした。過剰転位された試料は、より短い断片を有し、より低いアラインメント率を呈していた（接合部は断片端部に近かった）。過小転位された試料は、大き過ぎてＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサー上で適切にクラスター化することができない断片を有する。ライブラリーを５サイクルで増幅させ、ライブラリーの転位のレベルに関係なく、深くシーケンシングされ、適切なサイズ分布を達成するために十分な複雑性を有していた。

【0408】

ビーズを５５℃で１０分間、合間に振とうさせながらインキュベートした。試料を磁石上に置き、上澄みを取り除いた。５０ｍＭ ＥＤＴＡを試料に添加し、５０℃で３０分間インキュベートした。次いで、試料を迅速に磁石上に置き、上澄みを取り除いた。試料を５０℃で３分間、５０ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を５５℃で２分間、Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、次いで磁石から迅速に取り除いた。試料を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【0409】

ｖｉｉｉ．ＰＣＲ及びＰＣＲ後サイズ選択
ビーズを５０μＬのＰＣＲマスターミックス中に懸濁した（デュアルＩｎｄｅｘアダプター＃１５０５５２８９を有するＩｌｌｕｍｉｎａからのＮｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡライブラリー調製キット＃１５０２８２１２を使用する）。ＰＣＲを以下のプログラムを使用して実施した。２つの方法のうちの１つを使用して、サイクル数を推定した。（１）最初の５サイクル（７２℃で５分間、９８℃で１分間、９８℃で１５秒間、６３℃で３０秒間、７２℃で１分間）を、通常のＰＣＲ上で実施し、次いで産生物をビーズから取り除く。次いで、０．２５Ｘ ＳＹＢＲグリーンを添加し、試料をｑＰＣＲ上で実行する。試料を指数的増幅の開始時に取り出す。または（２）反応をＰＣＲ上で実行し、ポストＣｈＩＰ Ｑｕｂｉｔからの材料の量に基づいてサイクル数を推定する（５０ｎｇ超は５サイクルで実行するが、およそ５０ｎｇは６サイクルで実行され、２５ｎｇは７サイクルで実行され、１２．５ｎｇは８サイクルで実行される等）。

【0410】

ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。ライブラリーをＺｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈからのキットを使用して精製し、１０μＬの水に溶出した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて両側サイズ選択を実施した。ＰＣＲ後、ライブラリーを磁石上に置き、新たなチューブに溶出した。次いで、２５μＬのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを添加し、上澄みを保持して７００ｂｐ未満の断片を捕捉した。上澄みを新たなチューブに移し、１５μＬの新鮮なビーズを添加して、３００ｂｐより大きい断片を捕捉した。ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズから１０μＬの水中に最終溶出を実施した。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してライブラリーの質を検証した。

【0411】

ｉｘ．緩衝液
Ｈｉ−Ｃ溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０μＬの５Ｍ ＮａＣｌ、２００μＬの１０％ ＮＰ−４０、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び９．６８ｍＬの水を含有する。核溶解緩衝液（１０ｍＬ）は、５００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１ｍＬの１０％ ＳＤＳ、２００μＬの５０Ｘプロテアーゼ阻害剤、及び８．３ｍＬの水を含有する。ＣｈＩＰ希釈緩衝液（１０ｍＬ）は、１０μＬの１０％ ＳＤＳ、１．１ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２４μＬの５００ｍＭ ＥＤＴＡ、１６７μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、３３４μＬの５Ｍ ＮａＣｌ、及び８．３６５ｍＬの水を含有する。低塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％ ＳＤＳ、１ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００μＬの５Ｍ ＮａＣｌ、及び８．３６ｍＬの水を含有する。高塩洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１０％ ＳＤＳ、１ｍＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、４０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、及び７．６６ｍＬの水を含有する。ＬｉＣｌ洗浄緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５００μＬの５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＬの１０％ ＮＰ−４０、１ｍＬの１０％ Ｎａ−デオキシコール酸塩、２０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、及び７．３８ｍＬの水を含有する。

【0412】

ＤＮＡ溶出緩衝液（５ｍＬ）は、２５０μＬの新鮮な１Ｍ ＮａＨＣＯ_３、５００μＬの１０％ ＳＤＳ、及び４．２５ｍＬの水を含有する。Ｔｗｅｅｎ洗浄緩衝液（５０ｍＬ）は、２５０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１０ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、２５０μＬの１０％ Ｔｗｅｅｎ−２０、及び３９．４５ｍＬの水を含有する。２Ｘビオチン結合緩衝液（１０ｍＬ）は、１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０μＬの０．５Ｍ、４ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ、及び５．８８ｍＬの水を含有する。２Ｘ ＴＤ緩衝液（１ｍＬ）は、２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２、２００μＬの１００％ジメチルホルムアミド、及び７７０μＬの水を含有する。

【0413】

Ｐ．肝細胞への投与のための薬物希釈
肝細胞の化合物処理の前に、ＤＭＳＯ中０．１ｍＭのストック薬物を０．９ｍＬのＤＭＳＯと混合することによって、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック薬物を１０ｍＭに希釈して、最終量を１．０ｍＬにした。５μＬの希釈薬物を各ウェルに添加し、薬物のウェルあたり０．５ｍＬの培地を添加した。各薬物を三重に分析した。５μＬの薬物を４５μＬの培地に添加し、５０μＬを細胞上の４５０μＬの培地に添加することによって、１０００ｘまでの希釈を実施した。

【0414】

生物活性化合物もまた、肝細胞に投与した。１ｍＬのＤＭＳＯ中の生物活性化合物の１０００ｘストックを得るために、０．１ｍＬの１０，０００Ｘストックを０．９ｍＬのＤＭＳＯと複合した。

【0415】

Ｑ．ｓｉＲＮＡノックダウン
一次ヒト肝細胞を、２４ウェルフォーマット（ウェルあたり１μＬ）でＲＮＡｉＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号１３７７８０３０）を使用し、６ｐｍｏｌ ｓｉＲＮＡを有するｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした。翌朝、培地を取り除き、修飾された維持培地でさらに２４時間置き換えた。処理全体は４８時間続き、この時点で培地を取り除き、ＲＮＡ抽出のためにＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ９６ ＱＩＡｃｕｂｅ ＨＴキットカタログ番号７４１７１）と置き換えた。細胞をｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理し、次いで標的ｍＲＮＡのレベルを測定した。

【0416】

ｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎから取得し、全て関心対象の特定の遺伝子内で別個の部位を標的とするように設計された４つのｓｉＲＮＡ二重鎖のプールである（「ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ」として知られる）。以下のｓｉＲＮＡを使用した。Ｄ−００１２０６−１３−０５（非標的）、Ｍ−００３１４５−０２−０００５（ＪＡＫ１）、Ｍ−００３１４６−０２−０００５（ＪＡＫ２）、Ｍ−００３１７６−０３−０００５（ＳＹＫ）、Ｍ−００３００８−０３−０００５（ｍＴＯＲ）、Ｍ−００３１６２−０４−０００５（ＰＤＧＦＲＡ）、Ｍ−０１２７２３−０１−０００５（ＳＭＡＤ１）、Ｍ−００３５６１−０１−０００５（ＳＭＡＤ２）、Ｍ−０２００６７−００−０００５（ＳＭＡＤ３）、Ｍ−００３９０２−０１−０００５（ＳＭＡＤ４）、Ｍ−０１５７９１−００−０００５（ＳＭＡＤ５）、及びＭ−０１６１９２−０２−０００５（ＳＭＡＤ９）、Ｍ−００４９２４−０２−０００５（ＡＣＶＲ１）、及びＭ−００３５２０−０１−０００５（ＮＦ−κＢ）。

【0417】

Ｒ．マウス研究
６マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ株）の群（雄３及び雌３）に、候補化合物を１日１回４連続日にわたって経口強制栄養を介して投与した。４日目の最後の投与から４時間後にマウスを屠殺した。肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、血漿を含む臓器を収集した。マウス肝臓組織を液体窒素中で粉砕し、小さいマイクロチューブに分注した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５５９６０２６）をチューブに添加して、組織試料からの細胞溶解を促進した。次いで、崩壊した組織を含有するＴＲＩｚｏｌ溶液を遠心分離し、上澄み相を収集した。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１８２）を使用して、全ＲＮＡを上澄みから抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して標的ｍＲＮＡレベルを分析した。

【0418】

実施例２．刺激された肝細胞についてのＲＮＡ−ｓｅｑ研究
ＰＮＰＬＡ３を調整する小分子を特定するために、一次ヒト肝細胞を単一培養として調製し、少なくとも１つの小分子化合物を細胞に適用した。

【0419】

ＲＮＡ−ｓｅｑを実施して、肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現に対する化合物の効果を決定した。摂動されていた細胞系中の発現レベルを非摂動系中の発現レベルで除算することによって、変化倍率を計算した。ｐ値≦０．０５を有する発現の変化を有意であるとみなした。

【0420】

肝細胞のシグナル伝達中心を摂動するために使用される化合物は、表１に列挙される少なくとも１つの化合物を含む。表中で、化合物はそれらのＩＤ、標的、経路、及び薬学的作用とともに列挙される。摂動シグナルとして選択された大部分の化合物は、当該技術分野において少なくとも１つの正準細胞経路を調整することが知られている。いくつかの化合物を、有効性の欠失に起因して第ＩＩＩ相臨床評価において失格した化合物から選択した。

【0421】

（表１）ＲＮＡ−ｓｅｑ中で使用される化合物

【0422】

実施例３．ＰＮＰＬＡ３発現を調整する化合物の特定
ＲＮＡ−ｓｅｑデータの分析は、ＰＮＰＬＡ３の発現の有意な変化を引き起こした２３化合物を明らかにした（ｐ＜０．０１）。これらの化合物の中で、９化合物は、−０．５の最小ｌｏｇ２変化倍率を有するＰＮＰＬＡ３発現の低減をもたらすことが観察された。結果を表２に提示する。

【0423】

（表２）化合物によって調整されるＰＮＰＬＡ３発現

【0424】

２つの特定された化合物であるパクリチニブ及びモメロチニブは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の既知の阻害剤である。パクリチニブは、主にヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）及びＦｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）を阻害する。モメロチニブは、ヤヌスキナーゼＪＡＫ１及びＪＡＫ２を特異的に阻害するＡＴＰ競合剤である。この発見は、ＰＮＰＬＡ３発現が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路によって調節され得ることを示唆している。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路におけるシグナル伝達分子、特にＪＡＫ１及びＪＡＫ２を阻害することは、潜在的にＰＮＰＬＡ３を下方調節することができる。

【0425】

これらの結果もまた、ＰＮＰＬＡ３発現が他のシグナル伝達経路に関連し得ることを示唆している。Ｒ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）は、Ｓｙｋ依存的シグナル伝達を選択的に阻害する、脾臓チロシンキナーゼ（ＳＹｋ）の阻害剤である。ＢＭＳ−９８６０９４は、Ｃ型肝炎ウイルスからのヌクレオチドポリメラーゼ非構造的タンパク質５Ｂ（ＮＳ５Ｂ）を阻害するグアノシンヌクレオチド類似体である。ピフィスリン−μは、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ＸＬに対するその親和性を低減することによって、ミトコンドリアへのｐ５３結合を阻害し、それによってｐ５３依存的アポトーシスを阻害する。ＬＹ２９４００２は、多くのタンパク質の強力な阻害剤及び強力なホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤である。ＢＭＳ−７５４８０７は、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）／インスリン受容体ファミリーキナーゼ（ＩｎｓＲ）の強力かつ可逆的な阻害剤である。アムバチニブは、ｃ−Ｋｉｔ、血小板由来増殖因子受容体α（ＰＤＧＦＲα）及びＦＬＴ３の多標的阻害剤である。ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）は、高度に強力なＡＴＰ競合哺乳類ラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）阻害剤である。ＸＭＵ−ＭＰ−１は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路に関与するキナーゼである、哺乳類無菌２０様キナーゼ１及び２（ＭＳＴ１及びＭＳＴ２）の阻害剤である。これらの標的及び／または関連経路を標的とすることは、肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現を低減するために潜在的に有効であり得る。

【0426】

実施例４．シグナル伝達中心のゲノム位置及び組成物を決定する
多層アプローチは、シグナル伝達中心の位置または「フットプリント」を特定するために本明細書で使用された。遺伝子及びエンハンサーの直線上の近接は、常にシグナル伝達中心の３Ｄ立体配座を決定するために有益であるとは限らない。

【0427】

ＣｈＩＰ−ｓｅｑを使用して、シグナル伝達中心のゲノム位置及び組成物を決定した。実施例１に従い、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ実験及び分析を実施した。転写因子、シグナル伝達タンパク質、及びクロマチン修飾またはクロマチン関連タンパク質を含む６７標的に特異的な抗体を、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ研究に使用した。これらの抗体標的を表３に示す。シグナル伝達タンパク質カラムにおいて、関連正準経路は「−」の後に含まれる。

【0428】

（表３）一次ヒト肝細胞のＣｈＩＰ−ｓｅｑ標的

【0429】

一次ヒト肝細胞において、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含有する絶縁近傍は、位置４３，７８２，６７６〜４５，０２３，１３７における染色体２２上にあると特定され、およそ１，２４０ｋｂのサイズを有していた。１２シグナル伝達中心は、絶縁近傍内で見出された。絶縁近傍内で見出されたクロマチンマークまたはクロマチン関連タンパク質、転写因子及びシグナル伝達タンパク質を表４に提示する。

【0430】

（表４）ＰＮＰＬＡ３を含有する絶縁近傍

【0431】

ＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルは、ＰＮＰＬＡ３を含有する絶縁近傍が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤシグナル伝達、ＢＭＰシグナル伝達、核受容体シグナル伝達、ＶＤＲシグナル伝達、ＮＦ−κＢシグナル伝達、ＭＡＰＫシグナル伝達、及び／またはＨｉｐｐｏシグナル伝達経路によって調節され得ることを示唆している。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３は（両方がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路に関連する）、近傍内でシグナル伝達中心に結合することが観察され、これはＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を化合物で崩壊させることが、ＰＮＰＬＡ３発現を変更したという発見と一致する。さらに、絶縁近傍はまた、ｍＴＯＲ経路によって調節される転写因子であるＮＦ−κＢで富化される。これらの経路のうちの１つ以上を標的化することは、ＰＮＰＬＡ３発現を下方調節する際に有効であり得る。

【0432】

実施例５．肝細胞中のゲノムアーキテクチャを決定する
ＨＩ−ＣｈＩＰを実施例１に記載されるように実施して、ゲノムアーキテクチャを解読した。場合によっては、ＳＭＣ１構造タンパク質のＣｈＩＡ−ＰＥＴを同じ目的で使用した。これらの技法は、絶縁近傍及び遺伝子ループなどの３Ｄ構造を形成するために相互作用するクロマチンの部分を特定する。

【0433】

ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含む絶縁近傍は、位置４３，７８２，６７６〜４５，０２３，１３７における染色体２２上にあると特定され、およそ１，２４０ｋｂのサイズを有していた。絶縁近傍は、ＰＮＰＬＡ３及び７つの他の遺伝子を含有し、４つの遺伝子（すなわち、ＭＰＰＥＤ１、ＥＦＣＡＢ６、ＳＵＬＴ４Ａ１、及びＰＮＰＬＡ５）はＰＮＰＬＡ３の上流にあり、３つの遺伝子（すなわち、ＳＡＭＭ５０、ＰＡＲＶＢ、及びＰＡＲＶＧ）はＰＮＰＬＡ３の下流にある。

【0434】

実施例６．ヒト肝細胞中の化合物及び経路を検証する
初期ＲＮＡ−ｓｅｑスクリーニング及びＣｈＩＰ−ｓｅｑプロファイルは、ＰＮＰＬＡ３発現を下方調節するために利用され得る化合物及び経路を特定した。検証研究の目的は、重要な経路から特定された化合物を試験し、他の潜在的ヒットを特定するために化合物フランチャイズを拡大することであった。候補化合物を、ヒト肝細胞中でｑＲＴ−ＰＣＲを用いた検証に供した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、候補化合物で治療した第２のドナーからの一次ヒト肝細胞の試料上で実施した。化合物を、０．０１μＭ〜５０μＭの範囲の濃度で試験し、大部分は１０μＭで試験した。ｑＲＴ−ＰＣＲを介して観察されたＰＮＰＬＡ３発現の変化倍率は、実施例１に記載されるように分析した。ＰＮＰＬＡ３発現のロバストな低減を引き起こした化合物を、さらなる特性化のために選択した。

【0435】

初期ＲＮＡ−ｓｅｑスクリーニング及びＣｈＩＰ−ｓｅｑデータは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路がＰＮＰＬＡ３発現を制御することにおいて重要な役割を果たし得ることを示唆した。ＲＮＡ−ｓｅｑスクリーニングから特定された２つのＪＡＫ阻害剤であるモメロチニブ及びパクリチニブ、ならびにＪＡＫ阻害剤の追加のパネルをヒト肝細胞中で試験した。予想されるように、モメロチニブ及びパクリチニブの両方が、ヒト肝細胞においてＰＮＰＬＡ３発現の実質的な減少を誘導した。２つの他のＪＡＫ阻害剤であるオクラシチニブ及びＡＺＤ１４８０もまた、ＰＮＰＬＡ３の効率的な下方調節を示した。これは、ＪＡＫ阻害剤がＰＮＰＬＡ３発現を低減することを確認する。１０μＭの選択されたＪＡＫ阻害剤で治療されたヒト肝細胞からのｑＲＴ−ＰＣＲの結果を表５に示す。各値は、３つの複製±標準偏差の平均である。

【0436】

（表５）ヒト肝細胞中のＪＡＫ阻害剤

【0437】

ヒト肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現は、モメロチニブに対する用量依存的応答を呈し（図６を参照）、薬物特異的作用を示す。さらに、任意の試験した濃度（０．０１〜５０μＭ）のモメロチニブでは細胞毒性が観察されなかった。

【0438】

ｍＴＯＲ阻害剤であるＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）は、初期ＲＮＡ−ｓｅｑ実験において特定された。加えて、モメロチニブはまた、ｍＴＯＲ経路に連結されているＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）を含むキナーゼのスペクトルを阻害することが知られている。したがって、いくつかのｍＴＯＲ阻害剤をヒト肝細胞中で試験した。いくつかのｍＴＯＲ阻害剤は、ヒト肝細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現の阻害を示し、ＰＮＰＬＡ３遺伝子発現制御におけるｍＴＯＲシグナル伝達の役割を再確認した。１μＭのＷＹＥ−１２５１３２または１０μＭの選択されたｍＴＯＲ経路阻害剤で治療されたヒト肝細胞からのｑＲＴ−ＰＣＲの結果を表６に提示する。各値は、３つの複製±標準偏差の平均である。

【0439】

（表６）ヒト肝細胞中のｍＴＯＲ阻害剤

【0440】

初期ＲＮＡ−ｓｅｑスクリーニングはまた、Ｓｙｋ阻害剤であるＲ７８８（フォスタマチニブ、二ナトリウム六水和物）によるＰＮＰＬＡ３発現の下方調節を実証した。したがって、Ｒ７８８及びＳｙｋ経路阻害剤の追加のパネルをヒト肝細胞中で試験した。１０μＭで、Ｒ７８８及び６つの他のＳｙｋ経路阻害剤は、ヒト肝細胞中でＰＮＰＬＡ３発現を約２２％から５５％に低減した。これは、Ｓｙｋ経路を標的とすることもまた、ＰＮＰＬＡ３を効果的に下方調節し得ることを示す。１０μＭの選択されたＳｙｋ経路阻害剤で治療されたヒト肝細胞からのｑＲＴ−ＰＣＲの結果を表７に提示する。相対ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルをＢ２Ｍに対して正規化した。各値は、３つの複製±標準偏差の平均である。

【0441】

（表７）ヒト肝細胞中のＳｙｋ阻害剤

【0442】

実施例７．ｓｉＲＮＡを介して関心対象の経路を調べる
この実験の目的は、ＰＮＰＬＡ３発現を制御している特定されたシグナル伝達経路（例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｓｙｋ、ｍＴＯＲ及びＰＤＧＦＲ）の相対的な役割を確認することであった。各経路の末端構成成分を、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを介して標的化した。一次ヒト肝細胞を、以下のｍＲＮＡのうちの１つ以上を標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした：ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＳＹＫ、ｍＴＯＲ及び／またはＰＤＧＦＲＡ。４８時間の治療後、標的ｍＲＮＡのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲを介して測定し、非標的ｓｉＲＮＡ対照と比較して、ノウンダウン効率を評価した（減少パーセントとして報告した）。次いで、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲを介してアッセイし、２つの内部対照であるＧＡＰＤＨ及びＢ２Ｍの幾何平均に対して正規化した。

【0443】

ｓｉＲＮＡ実験のノックダウン効率は、５０％〜９５％の範囲であった。ノックダウンはまた、高度に特異的であった。ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＳＹＫ、ｍＴＯＲまたはＰＤＧＦＲＡを各々ノックダウンすることは、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルの減少につながり、以前の観察と一致していた。しかしながら、このデータはまた、単一キナーゼの阻害が、ＰＮＰＬＡ３を減少させるのに十分でないことを示唆する。これは、ＰＮＰＬＡ３発現が、少なくともＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｓｙｋ、ｍＴＯＲ及び／またはＰＤＧＦＲ経路からの機能を含むシグナル伝達ネットワークを通して良好に調節される。ｓｉＲＮＡ実験の結果を表８に提示する。

【0444】

（表８）ｓｉＲＮＡを介したシグナル伝達タンパク質のノックダウン

【0445】

実施例８．マウス肝細胞における化合物検証
選択された化合物をマウス肝細胞中で試験して、それらがＰＮＰＬＡ３を下方調節する能力を確認した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、候補化合物で治療したマウス肝細胞の試料上で実施した。化合物を、０．０１μＭ〜５０μＭの範囲の濃度で試験した。ｑＲＴ−ＰＣＲを介して観察されたＰＮＰＬＡ３発現の変化倍率は、実施例１に記載されるように分析した。ＰＮＰＬＡ３レベルを、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢのレベルに対して正規化した。ＰＮＰＬＡ３発現のロバストな低減を引き起こした化合物を、さらなる特性化のために選択した。

【0446】

ＰＮＰＬＡ３発現上のモメロチニブ及びパクリチニブの効果を、マウス肝細胞において検証した。モメロチニブ及びパクリチニブの両方は、マウス肝細胞においてＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルの著しい低減を誘導し、それぞれの変化倍率は対照に対して１０％及び１３％であった。わずかな細胞毒性が１０μＭでのパクリチニブで観察されたが、モメロチニブは、マウス肝細胞によって１０μＭで十分に耐容された。

【0447】

ｍＴＯＲ経路阻害剤によるＰＮＰＬＡ３発現の下方調節もまた、マウス肝細胞において観察され、ヒト一次肝細胞におけるデータと一致していた。選択されたｍＴＯＲ経路阻害剤で治療されたヒト肝細胞からのｑＲＴ−ＰＣＲの結果を表９に提示する。表中、１０μＭで試験したトリン１を除いて、全ての化合物を１μＭで試験した。

【0448】

（表９）マウス肝細胞中のｍＴＯＲ阻害剤

【0449】

実施例９．肝星細胞における化合物試験
肝星細胞（ＨＳＣ、類洞周囲細胞またはＩｔｏ細胞とも呼ばれる）は、内皮細胞に巻き付く収縮細胞である。正常な肝臓において、それらは静止状態で存在し、肝臓の約１０％を占める。肝臓が損傷されると、それらは活性化状態に変化し、関線維症において重要な役割を果たす。ＰＮＰＬＡ３は、星細胞ならびに肝細胞中で発現される。新興の証拠は、ＰＮＰＬＡ３が、ＨＳＣ活性化に関与し、その遺伝子変異体Ｉ１４８Ｍが、増加した炎症促進サイトカイン分泌などの線維化促進特徴を増強することを示唆している。したがって、候補化合物を、星細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現に対するそれらの効果について試験した。ＰＮＰＬＡ３の他に、Ｃｏｌ１ａ１は、線維症において重要な役割を果たし、Ｃｏｌ１ａ１レベルの減少が、線維症を改善することが予測されるため、コラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子によってエンコードされる）発現もまた、星細胞において評価した。ＣＯＬ１Ａ１遺伝子は、典型的に、肝細胞中で発現されないが、ＨＳＣ中ではるかに高いレベルで発現される。ＰＮＰＬＡ３の低減は、Ｃｏｌ１ａ１レベルを含むＨＳＣ中の線維性表現型に影響を及ぼすことが報告されている。したがって、ＰＮＰＬＡ３及びＣｏｌ１ａ１の両方のレベルを減少させることができる化合物は、ＮＡＳＨを治療するための追加の利益をもたらし得る。

【0450】

候補化合物を、それらがＰＮＰＬＡ３及びＣＯＬ１Ａ１を調整する能力について星細胞中で試験した。星細胞を、０．１μＭ〜１００μＭの範囲の化合物の連続希釈で処理した。星細胞中のＰＮＰＬＡ３（またはＣＯＬ１Ａ１）ｍＲＮＡレベルの変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＰＮＰＬＡ３及び／またはＣＯＬ１Ａ１を下方調節することができる化合物が特定されると、同じ経路で作用することが知られている追加の化合物もまた試験した。形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、インビトロでＣＯＬ１Ａ１を含む線維性遺伝子を誘導することが知られているため、正の対照として選択した（すなわち、ＣＯＬ１Ａ１発現を正に調節する）。

【0451】

モメロチニブは、星細胞中のＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを用量依存的に低減し（図７を参照）、ヒト及びマウス幹細胞における以前の観察と一致していた。しかしながら、試験した濃度（０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）において、モメロチニブは、ＣＯＬ１Ａ１発現を変更しなかった。

【0452】

奨励的に、ｍＴＯＲ阻害剤ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）は、ＨＳＣ中のＰＮＰＬＡ３及びＣＯＬ１Ａ１の両方を用量依存的に減少させた（表１０を参照）。次いで、エベロリムス、トリン１、ＰＰ２４２、ＣＺ４１５、ＩＮＫ−１２８、及びＡＺＤ−８０５５を含む追加のｍＴＯＲ化合物を試験した。ｍＴＯＲ化合物の連続希釈は、ＨＳＣにおいてＰＮＰＬＡ３及びＣＯＬ１Ａ１遺伝子発現に対してロバストな効果を有していた。全ての試験したｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＮＰＬＡ３レベルを減少させ、全ての試験したｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムスを除いてＣＯＬ１Ａ１レベルを減少させた。ＨＳＣ中のｍＴＯＲ化合物治療の結果を表１０に提示する。相対定量化（ＲＱ）、ＲＱ最小、及びＲＱ最大の値として表される変化倍率は、実施例１に記載されるように計算した。これらの結果は、４つの技術的複製から得られた。

【0453】

（表１０）肝星細胞中のｍＴＯＲ阻害剤

【0454】

驚くべきことに、ＨＳＣにおける化合物スクリーニングはまた、２つの追加の化合物であるＢＩＯ及びＡＺＤ２８５８を特定し、これらはＰＮＰＬＡ３及びＣＯＬ１Ａ１の両方を用量依存的に中度に減少させた。ＢＩＯ及びＡＺＤ２８５８は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害剤である。ＨＳＣ中のＧＳＫ３阻害剤の結果を表１１に提示する。相対定量化（ＲＱ）、ＲＱ最小、及びＲＱ最大の値として表される変化倍率は、実施例１に記載されるように計算した。これらの結果は、４つの技術的複製から得られた。

【0455】

（表１１）肝星細胞中のＧＳＫ３阻害剤

【0456】

実施例１０．ＰＮＰＬＡ３突然変異体細胞株ＨｅｐＧ２における化合物試験
候補化合物をＰＮＰＬＡ３突然変異体細胞株ＨｅｐＧ２において評価して、突然変異体ＰＮＰＬＡ３発現に対するそれらの効果を試験した。ＨｅｐＧ２細胞は、ＰＮＰＬＡ３中のＩ１４８Ｍ突然変異を有する。ＨｅｐＧ２細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現の変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析した。ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルを、２つの内部対照であるＧＵＳＢ及びＢ２Ｍの幾何平均に対して正規化した。

【0457】

モメロチニブは、ＨｅｐＧ２細胞中のＰＮＰＬＡ３と一致する下方調節を示した。１０μＭにおいて、モメロチニブ治療は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルのおよそ８５％低下を引き起こした。効果は、他の試験した細胞からの結果に対応している。さらに、ＨｅｐＧ２細胞中の突然変異体ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルは、用量依存的にモメロチニブに応答した（図８を参照）。これらの実験は、モメロチニブが、突然変異体ＰＮＰＬＡ３発現も同様に減少させ得ることを実証した。

【0458】

実施例１１．モメロチニブ作用機構研究
モメロチニブは一貫して、複数の実験においてＰＮＰＬＡ３の下方調節を呈したため、その作用機序をさらに調べた。ｓｉＲＮＡノックダウン実験（実施例７を参照）は、単独または共同にかかわらず、ＪＡＫ１またはＪＡＫ２をノックダウンすることが、ＰＮＰＬＡ３に対するモメロチニブの効果を完全に要約できなかったことを実証し、モメロチニブが追加の経路を通してその活性を引き出し得るという仮説を促した。実際に、モメロチニブは、ＪＡＫ１及びＪＡＫ２に加えて、マイクロモル以下の親和性を有する一連のキナーゼを阻害することが知られている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｙｎｅｒ ＪＷ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１５（２５），５２３２−５２４０）。モメロチニブ標的の一覧の中で、ＴＢＫ１及びＡＣＶＲ１（アクチビンＡ受容体、Ｉ型）が特に関心対象であった。ＮＦ−κＢ活性化キナーゼとしても知られるＴＢＫ１は、ある特定の増殖因子に応答してＮＦ−κＢ活性化を媒介し得る。ＡＣＶＲ１は、ＴＧＦ−βファミリー下位群の受容体のメンバーであり、リガンド結合時にＳＭＡＤ転写調節因子を活性化し得る。これは、ＰＮＰＬＡ３の絶縁近傍が、ＮＦ−κＢ、ＳＭＡＤ２／３及びＳＭＡＤ４を含むいくつかのシグナル伝達タンパク質によって結合されることを示したＣｈＩＰ−ｓｅｑデータ（実施例４に記載される）と一致する。これはさらに、アクチビンならびにＢＭＰ２及びＧＤＦ２などの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、ＲＮＡ−ｓｅｑ研究においてＰＮＰＬＡ３及びＰＮＰＬＡ５の最良の上方調節因子であったという観察を支持する。したがって、ＮＦ−κＢ経路及びＡＣＶＲ１／ＳＭＡＤ経路におけるシグナル伝達タンパク質を、ｓｉＲＮＡを介して標的化して、ＰＮＰＬＡ３に対するそれらの効果を試験した。追加として、ＰＮＰＬＡ５は、ＰＮＰＬＡ３と同じ絶縁近傍内に位置し、ＰＮＰＬＡ３として化合物治療に対して同様に応答することが観察されたため、ＰＮＰＬＡ５発現を第２の読み出し値として分析に含めた。

【0459】

一次ヒト肝細胞を、以下の６つのＳＭＡＤタンパク質の各々に特異的な１０ｎＭのｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした：ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９。ノックダウン治療を、ＢＭＰ２（２２０ｎＭ）またはＴＧＦ−β（１００ｎｇ／ｍＬ）のいずれかの存在下で実施して、ＳＭＡＤ活性化を刺激した。７２時間の治療後、標的ｍＲＮＡのレベルをノックダウン効率について評価し、ＰＮＰＬＡ３及びＰＮＰＬＡ５発現に対する各ノックダウンの効果を調べた。各標的ｍＲＮＡは、ｓｉＲＮＡによって効率的にノックダウンされた。ＳＭＡＤタンパク質ノックダウン実験の結果を表１２に提示する。データは、ＰＮＰＬＡ３及びＰＮＰＬＡ５発現が、ＳＭＡＤ３またはＳＭＡＤ４ノックダウンによって低減され得ることを示し、ＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと一致していた。

【0460】

（表１２）ｓｉＲＮＡを介したＳＭＡＤタンパク質のノックダウン

【0461】

ＢＭＰ２またはＴＧＦ−β刺激の非存在下、より長いｓｉＲＮＡ治療時間（３６時間）にわたって実験を繰り返した。追加の標的であるＡＣＶＲ１及びＮＦ−κＢを、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを介して標的化した。相対ＰＮＰＬＡ３またはＰＮＰＬＡ５ ｍＲＮＡレベルをＧＵＳＢに対して正規化した。結果を表１３に提示する。

【0462】

（表１３）ｓｉＲＮＡを介したＳＭＡＤタンパク質、ＡＣＶＲ１及びＮＦ−κＢのノックダウン

【0463】

上記の実験は、ＡＣＶＲ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、及びＮＦ−κＢが、ＰＮＰＬＡ３発現の調節に寄与することを確認した。モメロチニブは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害に加えて、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ及びＮＦ−κＢ経路を阻害することによって作用して、ＰＮＰＬＡ３を下方調節する可能性がある。

【0464】

実施例１２．マウスにおけるインビボ化合物試験
エクスビボで検証研究において有効な下方調節を示した化合物を、マウスにおけるインビボ試験のために選択した。候補化合物を適切な用量で１日１回、雄マウス３匹及び雌マウス３匹からなる野生型マウスの群に投与した。マウスを４日目に屠殺し、肝臓組織を収集して、ＰＮＰＬＡ３（またはＣＯＬ１Ａ１）発現についてｑＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＰＮＰＬＡ３発現は、雄よりも雌においてより高くより可変であることが観察されたため、データを各性別について別個に分析した。ＣＯＬ１Ａ１を分析した場合、星細胞特異的遺伝子ＧＦＡＰをハウスキーピング対照として使用した。

【0465】

モメロチニブを５０ｍｇ／ｋｇで投与し、モメロチニブの治療は、マウス肝臓において著しくＰＮＰＬＡ３を低減した。異なるベースラインＰＮＰＬＡ３レベルにかかわらず、雄マウス及び雌マウスの両方が、モメロチニブ治療に応答した（図９を参照）。動物の体重、臓器重量、またはアルブミン、ＡＳＧＲ１、及びＨＡＭＰ１などの多くの他の肝臓遺伝子において変化は観察されなかった。

【0466】

ＷＹＥ−１２５１３２（ＷＹＥ−１３２）を５０ｍｇ／ｋｇで投与し、ＷＹＥ−１２５１３２の治療は、雌マウスにおいてより優勢にマウス肝臓中のＣＯＬ１Ａ１発現（図１０を参照）を低減した。これは、ＷＹＥ−１２５１３２がＨＳＣ中のＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡを減少させたという観察と一致する。ＣＯＬ１Ａ１発現レベルの低減は、インビトロとインビボ動物との間の保存された機構を示す。

【0467】

実施例１３．患者細胞における化合物試験
患者由来の誘導多能性幹（ｉＰＳ）肝芽細胞において候補化合物を評価して、それらの有効性を確認する。選択された患者は、ＰＮＰＬＡ３遺伝子中にＩ１４８Ｍ突然変異を有する。肝芽細胞におけるＰＮＰＬＡ３発現の変化を、ｑＲＴ−ＰＣＲで分析する。結果を使用して、経路が患者細胞において同様に機能的であるか、また化合物が同じ影響を有するかを確認する。

【0468】

実施例１４．マウスモデルにおける化合物試験
候補化合物を、ＰＮＰＬＡ３媒介性肝疾患（例えば、ＮＡＳＨ）のマウスモデルにおいてインビボ活性及び安全性について評価する。

【0469】

等価物及び範囲
当業者であれば、慣用的な実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明による特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認し得るであろう。本発明の範囲は上記の説明に限定されるものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される。

【0470】

特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、１つ以上を意味し得る。群の１つ以上のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、特に逆が示されない限り、またはさもなければ文脈から明らかである場合を除き、群のメンバーのうちの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する場合に満たされると考えられる。本発明は、群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。本発明は、群のメンバーのうちの２つ以上、または全体が所与の製品またはプロセスに存在する、それに採用される、ないしは別の方法でそれに関連する実施形態を含む。

【0471】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、制約がないことが意図され、追加の要素またはステップの包含を可能にするが、その必要がないことにも留意する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合、したがって「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語もまた包含され、開示される。

【0472】

範囲が与えられている場合、エンドポイントは含まれる。さらに、特に記載されない限り、またはさもなければ文脈及び当業者の理解から明らかである場合を除き、範囲として表される値は、文脈が明確に示さない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで、本発明の異なる実施形態の指定された範囲内の任意の特定の値または下位範囲をとることができることを理解する。

【0473】

加えて、先行技術内に入る本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解する。そのような実施形態は、当業者に既知であるとみなされるため、それらは、除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも除外され得る。本発明の組成物のいずれの特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療成分または活性成分；任意の産生方法；任意の使用方法など）も、先行技術の存在に関連するかどうかに関わらず、あらゆる理由により、任意の１つ以上の特許請求の範囲から除外することができる。

【0474】

使用されている単語は、限定ではなく説明の単語であり、添付の特許請求の範囲の権限内で、そのより広い態様において本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく変更が行われてもよいことを理解されたい。

【0475】

本発明は、いくつかの記載される実施形態に関してある程度の長さ及びある程度の特定性で説明されてきたが、任意のそのような特定事項または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図しないが、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術を考慮してそのような特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供するもの、したがって、本発明の意図される範囲を有効に包含するものとして解釈される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2020530858000001.app

【手続補正書】

【提出日】2020年4月23日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0014】

いくつかの実施形態では、ＰＮＰＬＡ３関連障害を治療するために対象に投与される化合物は、ＧＳＫ３経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0029】

いくつかの実施形態では、細胞に投与される化合物は、ＧＳＫ３経路の阻害剤を含み得る。そのような化合物は、ＢＩＯ、ＡＺＤ２８５８、１−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ０１４４１８、ＡＺＤ１０８０、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−９８０１４、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＩＭ−１２、インジルビン、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ−８、チデグルシブ、ＴＷＳ１１９、またはそれらの誘導体もしくは類似体のうちの少なくとも１つを含み得る。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０４４２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0442】

実施例７．ｓｉＲＮＡを介して関心対象の経路を調べる
この実験の目的は、ＰＮＰＬＡ３発現を制御している特定されたシグナル伝達経路（例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｓｙｋ、ｍＴＯＲ及びＰＤＧＦＲ）の相対的な役割を確認することであった。各経路の末端構成成分を、ｓｉＲＮＡ媒介性ノックダウンを介して標的化した。一次ヒト肝細胞を、以下のｍＲＮＡのうちの１つ以上を標的とする１０ｎＭのｓｉＲＮＡで逆トランスフェクトした：ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＳＹＫ、ｍＴＯＲ及び／またはＰＤＧＦＲＡ。４８時間の治療後、標的ｍＲＮＡのレベルをｑＲＴ−ＰＣＲを介して測定し、非標的ｓｉＲＮＡ対照と比較して、ノックダウン効率を評価した（減少パーセントとして報告した）。次いで、ＰＮＰＬＡ３ ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲを介してアッセイし、２つの内部対照であるＧＡＰＤＨ及びＢ２Ｍの幾何平均に対して正規化した。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0039】

本明細書では、ＰＮＰＬＡ３遺伝子を含む絶縁近傍の上流もしくは下流近傍遺伝子またはそのＲＳＲのうちの１つ以上を変更する１種以上の化合物を細胞に導入することによって、細胞におけるＰＮＰＬＡ３遺伝子の発現を調整する方法がさらに提供される。絶縁近傍は、４３，７８２，６７６〜４５，０２３，１３７位における染色体２２上の領域を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の上流近傍遺伝子は、ＭＰＰＥＤ１、ＥＦＣＡＢ６、ＳＵＬＴ４Ａ１、及びＰＮＰＬＡ５のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の下流近傍遺伝子は、ＳＡＭＭ５０、ＰＡＲＶＢ、及びＰＡＲＶＧのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、肝星細胞である。
[本発明1001]
パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質3（ＰＮＰＬＡ3）関連障害を有する対象を治療する方法であって、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現を調整することができる有効量の化合物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
[本発明1002]
前記化合物が、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、ＢＭＬ−275、ＤＭＨ−1、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ02288、ＬＤＮ−193189、ＬＤＮ−212854、ＭＬ347、ＳＩＳ3、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記化合物が、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記化合物が、アピトリシブ（ＧＤＣ−0980、ＲＧ7422）、ＡＺＤ8055、ＢＧＴ226（ＮＶＰ−ＢＧＴ226）、ＣＣ−223、クリソファン酸、ＣＺ415、ダクトリシブ（ＢＥＺ235、ＮＶＰ−ＢＥＺ235）、エベロリムス（ＲＡＤ001）、ＧＤＣ−0349、ジェダトリシブ（ＰＦ−05212384、ＰＫＩ−587）、ＧＳＫ1059615、ＩＮＫ128（ＭＬＮ0128）、ＫＵ−0063794、ＬＹ3023414、ＭＨＹ1485、オミパリシブ（ＧＳＫ2126458、ＧＳＫ458）、ＯＳＩ−027、パロミド529（Ｐ529）、ＰＦ−04691502、ＰＩ−103、ＰＰ121、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−8669）、ＳＦ2523、タクロリムス（ＦＫ506）、テムシロリムス（ＣＣＩ−779、ＮＳＣ683864）、トリン1、トリン2、トリキニブ（ＰＰ242）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ2014）、ボクスタリシブ（Ｖｏｘｌａｌｉｓｉｂ）（ＳＡＲ245409、ＸＬ765）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ765、ＳＡＲ245409）、ＷＡＹ−600、ＷＹＥ−125132（ＷＹＥ−132）、ＷＹＥ−354、ＷＹＥ−687、ＸＬ388、ゾタロリムス（ＡＢＴ−578）、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記化合物が、ＷＹＥ−125132（ＷＹＥ−132）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記化合物が、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記化合物が、Ｒ788、タマチニブ（Ｒ406）、エントスプレチニブ（ｅｎｔｏｓｐｌｅｔｉｎｉｂ）（ＧＳ−9973）、ニルバジピン、ＴＡＫ−659、ＢＡＹ−61−3606、ＭＮＳ（3，4−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−060318、ＰＲＴ062607（Ｐ505−15、ＢＩＩＢ057）、ＰＲＴ2761、ＲＯ9021、セルデュラチニブ（ｃｅｒｄｕｌａｔｉｎｉｂ）、イブルチニブ、ＯＮＯ−4059、ＡＣＰ−196、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ（ｐｉｌａｒａｌｉｓｉｂ）、ＴＧＲ−1202、ＧＳ−9820、ＡＣＰ−319、ＳＦ2523、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記化合物が、Ｒ788、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記化合物が、ＧＳＫ3経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記化合物が、ＢＩＯ、ＡＺＤ2858、1−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ014418、ＡＺＤ1080、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−98014、ＣＨＩＲ−99021（ＣＴ99021）、ＩＭ−12、インジルビン、ＬＹ2090314、ＳＢ216763、ＳＢ415286、ＴＤＺＤ−8、チデグルシブ、ＴＷＳ119、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記化合物が、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記化合物が、ＡＣＨＰ、10Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ11−7085、Ｂａｙ11−7821、ベンガミドＢ、ＢＩ605906、ＢＭＳ345541、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ12、セラストロール、ＣＩＤ2858522、ＦＰＳ ＺＭ1、グリオトキシン、ＧＳＫ319347Ａ、ホノキオール、ＨＵ211、ＩＫＫ16、ＩＭＤ0354、ＩＰ7ｅ、ＩＴ901、ルテオリン、ＭＧ132、ＭＬ120Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ130、パルテノリド、ＰＦ184、ピセアタンノール、ＰＲ39（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ1145ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ106−9920、ＳＣ514、ＳＰ100030、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−1、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記化合物が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−04965842、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ868、フェドラチニブ、ＡＣ430、ＡＴ9283、ａｔｉ−50001及びａｔｉ−50002、ＡＺ960、ＡＺＤ1480、ＢＭＳ−911543、ＣＥＰ−33779、セルデュラチニブ（ｃｅｒｄｕｌａｔｉｎｉｂ）（ＰＲＴ062070、ＰＲＴ2070）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−509）、フェドラチニブ（ＳＡＲ302503、ＴＧ101348）、ＦＬＬＬ32、ＦＭ−381、ＧＬＰＧ0634類似体、Ｇｏ6976、ＪＡＮＥＸ−1（ＷＨＩ−Ｐ131）、ＮＶＰ−ＢＳＫ805、パクリチニブ（ＳＢ1518）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ015Ｋ、ＪＮＪ−54781532）、ＰＦ−06651600、ＰＦ−06700841、Ｒ256（ＡＺＤ0449）、ソルシチニブ（ＧＳＫ2586184もしくはＧＬＰＧ0778）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ018424）、ＴＧ101209、トファシチニブ（ＣＰ−690550）、ＷＨＩ−Ｐ154、ＷＰ1066、ＸＬ019、ＺＭ39923ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記化合物が、アムバチニブ、ＢＭＳ−754807、ＢＭＳ−986094、ＬＹ294002、ピフィスリン−μ、ＸＭＵ−ＭＰ−1、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記化合物が、ＪＡＫ1、ＪＡＫ2、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ3、ＡＣＶＲ1、ＳＭＡＤ3、ＳＭＡＤ4、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される1つ以上の遺伝子を標的とする1つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記化合物が、前記対象におけるＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現を低減する、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
ＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現が、少なくとも約30％低減される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
ＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記対象が、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子中に1つ以上の突然変異を有する、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記対象が、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子中にＩ148Ｍ突然変異を有する、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記化合物が、ＣＯＬ1Ａ1遺伝子の発現も低減する、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記ＣＯＬ1Ａ1遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記化合物が、ＰＮＰＬＡ5遺伝子の発現も低減する、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
ＰＮＰＬＡ5遺伝子の発現が、前記対象の肝臓において低減される、本発明1026の方法。
[本発明1028]
ＰＮＰＬＡ3関連障害が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
ＰＮＰＬＡ3関連障害が、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1030]
ＰＮＰＬＡ3関連障害が、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ）である、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1031]
ＰＮＰＬＡ3遺伝子のシグナル伝達中心に関連する1つ以上のシグナル伝達分子を変更することができる有効量の化合物を細胞に導入することを含む、前記細胞におけるＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現を調整する方法。
[本発明1032]
前記1つ以上のシグナル伝達分子が、ＨＮＦ3ｂ、ＨＮＦ4ａ、ＨＮＦ4、ＨＮＦ6、Ｍｙｃ、ＯＮＥＣＵＴ2及びＹＹ1、ＴＣＦ4、ＨＩＦ1ａ、ＨＮＦ1、ＥＲａ、ＧＲ、ＪＵＮ、ＲＸＲ、ＳＴＡＴ3、ＶＤＲ、ＮＦ−κＢ、ＳＭＡＤ2／3、ＳＴＡＴ1、ＴＥＡＤ1、ｐ53、ＳＭＡＤ4、ならびにＦＯＳからなる群から選択される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記化合物が、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1034]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、ＢＭＬ−275、ＤＭＨ−1、ドルソモルフィン、ドルソモルフィンジヒドロクロリド、Ｋ02288、ＬＤＮ−193189、ＬＤＮ−212854、ＭＬ347、ＳＩＳ3、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1031の方法。
[本発明1036]
前記化合物が、ｍＴＯＲ経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1037]
前記化合物が、アピトリシブ（ＧＤＣ−0980、ＲＧ7422）、ＡＺＤ8055、ＢＧＴ226（ＮＶＰ−ＢＧＴ226）、ＣＣ−223、クリソファン酸、ＣＺ415、ダクトリシブ（ＢＥＺ235、ＮＶＰ−ＢＥＺ235）、エベロリムス（ＲＡＤ001）、ＧＤＣ−0349、ジェダトリシブ（ＰＦ−05212384、ＰＫＩ−587）、ＧＳＫ1059615、ＩＮＫ128（ＭＬＮ0128）、ＫＵ−0063794、ＬＹ3023414、ＭＨＹ1485、オミパリシブ（ＧＳＫ2126458、ＧＳＫ458）、ＯＳＩ−027、パロミド529（Ｐ529）、ＰＦ−04691502、ＰＩ−103、ＰＰ121、ラパマイシン（シロリムス）、リダフォロリムス（デフォロリムス、ＭＫ−8669）、ＳＦ2523、タクロリムス（ＦＫ506）、テムシロリムス（ＣＣＩ−779、ＮＳＣ683864）、トリン1、トリン2、トリキニブ（ＰＰ242）、ビスツセルチブ（ＡＺＤ2014）、ボクスタリシブ（ＳＡＲ245409、ＸＬ765）類似体、ボクスタリシブ（ＸＬ765、ＳＡＲ245409）、ＷＡＹ−600、ＷＹＥ−125132（ＷＹＥ−132）、ＷＹＥ−354、ＷＹＥ−687、ＸＬ388、ゾタロリムス（ＡＢＴ−578）、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記化合物が、ＷＹＥ−125132、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1031の方法。
[本発明1039]
前記化合物が、Ｓｙｋ経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1040]
前記化合物が、Ｒ788、タマチニブ（Ｒ406）、エントスプレチニブ（ＧＳ−9973）、ニルバジピン、ＴＡＫ−659、ＢＡＹ−61−3606、ＭＮＳ（3，4−メチレンジオキシ−β−ニトロスチレン、ＭＤＢＮ）、ピセアタンノール、ＰＲＴ−060318、ＰＲＴ062607（Ｐ505−15、ＢＩＩＢ057）、ＰＲＴ2761、ＲＯ9021、セルデュラチニブ、イブルチニブ、ＯＮＯ−4059、ＡＣＰ−196、イデラリシブ、デュベリシブ、ピララリシブ、ＴＧＲ−1202、ＧＳ−9820、ＡＣＰ−319、ＳＦ2523、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記化合物が、Ｒ788、またはその誘導体もしくは類似体を含む、本発明1031の方法。
[本発明1042]
前記化合物が、ＧＳＫ3経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1043]
前記化合物が、ＢＩＯ、ＡＺＤ2858、1−アザケンパウロン、ＡＲ−Ａ014418、ＡＺＤ1080、ビキニン、ＢＩＯ−アセトキシム、ＣＨＩＲ−98014、ＣＨＩＲ−99021（ＣＴ99021）、ＩＭ−12、インジルビン、ＬＹ2090314、ＳＢ216763、ＳＢ415286、ＴＤＺＤ−8、チデグルシブ、ＴＷＳ119、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記化合物が、ＮＦ−κＢ経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1045]
前記化合物が、ＡＣＨＰ、10Ｚ−ヒメニアルジシン、アンレキサノクス、アンドログラホリド、アルクチゲニン、Ｂａｙ11−7085、Ｂａｙ11−7821、ベンガミドＢ、ＢＩ605906、ＢＭＳ345541、カフェイン酸フェネチルエステル、カルダモニン、Ｃ−ＤＩＭ12、セラストロール、ＣＩＤ2858522、ＦＰＳ ＺＭ1、グリオトキシン、ＧＳＫ319347Ａ、ホノキオール、ＨＵ211、ＩＫＫ16、ＩＭＤ0354、ＩＰ7ｅ、ＩＴ901、ルテオリン、ＭＧ132、ＭＬ120Ｂジヒドロクロリド、ＭＬ130、パルテノリド、ＰＦ184、ピセアタンノール、ＰＲ39（ブタ）、プリスチメリン、ＰＳ1145ジヒドロクロリド、ＰＳＩ、ピロリジンジチオカルバミン酸アンモニウム、ＲＡＧＥアンタゴニストペプチド、Ｒｏ106−9920、ＳＣ514、ＳＰ100030、スルファサラジン、タンシノンＩＩＡ、ＴＰＣＡ−1、ウィタフェリンＡ、ゾレドロン酸、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記化合物が、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の阻害剤を含む、本発明1031の方法。
[本発明1047]
前記化合物が、モメロチニブ（ＣＹＴ387）、ルキソリチニブ、オクラシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、ＰＦ−04965842、ウパダシチニブ、ククルビタシンＩ、ＣＨＺ868、フェドラチニブ、ＡＣ430、ＡＴ9283、ａｔｉ−50001及びａｔｉ−50002、ＡＺ960、ＡＺＤ1480、ＢＭＳ−911543、ＣＥＰ−33779、セルデュラチニブ（ＰＲＴ062070、ＰＲＴ2070）、クルクモール、デセルノチニブ（ＶＸ−509）、フェドラチニブ（ＳＡＲ302503、ＴＧ101348）、ＦＬＬＬ32、ＦＭ−381、ＧＬＰＧ0634類似体、Ｇｏ6976、ＪＡＮＥＸ−1（ＷＨＩ−Ｐ131）、ＮＶＰ−ＢＳＫ805、パクリチニブ（ＳＢ1518）、ペフィシチニブ（ＡＳＰ015Ｋ、ＪＮＪ−54781532）、ＰＦ−06651600、ＰＦ−06700841、Ｒ256（ＡＺＤ0449）、ソルシチニブ（ＧＳＫ2586184もしくはＧＬＰＧ0778）、Ｓ−ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ018424）、ＴＧ101209、トファシチニブ（ＣＰ−690550）、ＷＨＩ−Ｐ154、ＷＰ1066、ＸＬ019、ＺＭ39923ＨＣｌ、またはそれらの誘導体もしくは類似体からなる群から選択される少なくとも1つを含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記化合物が、アムバチニブ、ＢＭＳ−754807、ＢＭＳ−986094、ＬＹ294002、ピフィスリン−μ、ＸＭＵ−ＭＰ−1、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む、本発明1031の方法。
[本発明1049]
前記化合物が、ＪＡＫ1、ＪＡＫ2、ｍＴＯＲ、ＳＹＫ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＧＳＫ3、ＡＣＶＲ1、ＳＭＡＤ3、ＳＭＡＤ4、及びＮＦ−κＢからなる群から選択される1つ以上の遺伝子を標的とする1つ以上の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、本発明1031の方法。
[本発明1050]
前記化合物が、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現を低減する、本発明1031〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
ＰＮＰＬＡ3遺伝子の発現が、少なくとも約30％低減される、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記細胞が、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子中に1つ以上の突然変異を有する、本発明1031〜1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記細胞が、ＰＮＰＬＡ3遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子中にＩ148Ｍ突然変異を有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記化合物が、ＣＯＬ1Ａ1遺伝子の発現も低減する、本発明1031〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記化合物が、ＰＮＰＬＡ5遺伝子の発現も低減する、本発明1031〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記細胞が、哺乳類細胞である、本発明1031〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記細胞が、ヒト細胞である、本発明1056の方法。
[本発明1058]
前記細胞が、マウス細胞である、本発明1056の方法。
[本発明1059]
前記細胞が、肝細胞である、本発明1031〜1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記細胞が、肝星細胞である、本発明1031〜1058のいずれかの方法。

【国際調査報告】