特表 2020-531554 腫瘍微小環境のモジュレーションのためのＴＬＲ−９アゴニスト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-531554(P2020-531554A)

(43)【公表日】2020年11月5日

(54)【発明の名称】腫瘍微小環境のモジュレーションのためのＴＬＲ−９アゴニスト

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/711 20060101AFI20201009BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201009BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20201009BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20201009BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201009BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201009BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201009BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20201009BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20201009BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALI20201009BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20201009BHJP

   C12N 15/117 20100101ALN20201009BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/711

   A61P35/00

   A61P1/00

   A61K31/713

   A61P37/04

   A61K45/00

   A61P43/00 121

   A61K9/08

   A61K47/02

   C12N5/0786

   C12N5/0783

   C12N15/117 ZZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2020-512354(P2020-512354)

(86)(22)【出願日】2018年8月31日

(85)【翻訳文提出日】2020年4月27日

(86)【国際出願番号】EP2018073536

(87)【国際公開番号】WO2019043194

(87)【国際公開日】20190307

(31)【優先権主張番号】17001465.8

(32)【優先日】2017年8月31日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】18151734.3

(32)【優先日】2018年1月15日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】505106324

【氏名又は名称】モロゲン・アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100091502

【弁理士】

【氏名又は名称】井出 正威

(72)【発明者】

【氏名】カップ，カースチン

(72)【発明者】

【氏名】シュミット，マヌエル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AC20

4B065BD35

4B065CA44

4C076AA12

4C076BB11

4C076BB16

4C076CC16

4C076CC27

4C076DD23

4C076DD26

4C076FF34

4C084AA19

4C084MA17

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

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4C084ZA66

4C084ZB26

4C084ZC75

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA17

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA66

4C086ZB26

4C086ZC75

(57)【要約】

腫瘍疾患、特に結腸がんの治療における使用のため、および腫瘍微小環境のモジュレーションのためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療を必要とする対象の当該治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストであって、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチと
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率を増加させる、ＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項2】

ＣＤ３＋ Ｔ細胞、および／もしくはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージによる腫瘍の浸潤が、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしの浸潤と比較して刺激され、ならびに／または腫瘍内のＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率が、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしのＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率と比較して増加される、請求項１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項3】

ＣＤ３＋ Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項１または２に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項4】

前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させ、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の制御性Ｔ細胞に対する比率を増加させる、請求項３に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項5】

腫瘍がその周辺および／またはその中心、好ましくはその中心に浸潤している、請求項１から４のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項6】

腫瘍が固形腫瘍、好ましくは結腸がんであり、治療される対象がヒトである、請求項１から５のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項7】

ＴＬＲ−９アゴニストが腫瘍内または皮下に投与される、請求項１から６のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項8】

少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが配列Ｎ^１Ｎ^２ＣＧＮ^３Ｎ^４の一部であり、Ｎ^１Ｎ^２がＡＡ、ＴＴ、ＧＧ、ＧＴ、ＧＡまたはＡＴであり、Ｎ^３Ｎ^４がＣＴ、ＴＴ、ＴＧまたはＧＧであり、Ｃがデオキシシチジンであり、Ｇがデオキシグアノシンであり、Ａがデオキシアデノシンであり、Ｔがデオキシチミジンである、請求項１から７のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項9】

オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一端の末端５ヌクレオチド以内に含まれており、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端の末端５ヌクレオチド以内に含まれている、請求項１から８のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項10】

オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも３つのＣＧジヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項11】

オリゴデオキシリボヌクレオチドが一本鎖および／または部分的もしくは完全二本鎖である、請求項１から１０のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項12】

オリゴデオキシリボヌクレオチドが２つの一本鎖ループを含み、ダンベルの形状を形成する、請求項１から１１のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項13】

すべてのヌクレオチドがＤ−体である、請求項１２に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項14】

配列番号３の配列を有する、請求項１２または１３に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項15】

配列番号５〜配列番号１４のうちのいずれかの配列、好ましくは配列番号５の配列を有する、請求項９に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項16】

治療される対象が別のがん治療、好ましくは化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤を既に受けている、および／またはその後に受ける、請求項１から１５のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項17】

前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が低免疫原性腫瘍を高免疫原性腫瘍に変換させる、請求項１から１６のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項18】

低免疫原性腫瘍を高免疫原性腫瘍に変換するためのＴＬＲ−９アゴニストであって、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、腫瘍が好ましくは結腸がんである、ＴＬＲ−９アゴニスト。

【請求項19】

ＴＬＲ−９アゴニストをその投与を必要とする患者に投与することを含む、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させるため、および／または腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させるため、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の制御性Ｔ細胞に対する比率を増加させるため、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を増加させるため、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率を増加させるための方法であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、方法。

【請求項20】

ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させるため、および／または腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させるため、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の制御性Ｔ細胞に対する比率を増加させるため、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を増加させるため、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率を増加させるためのＴＬＲ−９アゴニストの使用であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、使用。

【請求項21】

腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療を必要とする対象の当該治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストならびに化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤を含む組成物であって、前記ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージのＭ２マクロファージに対する比率を増加させる、組成物。

【請求項22】

腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のための、ＰＢＳ中に、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌのＴＬＲ−９アゴニスト、好ましくは、すべてのヌクレオチドがＤ−体であるＴＬＲ−９アゴニストを含む医薬組成物であって、ＰＢＳがｐＨ６〜８、特に７．２〜７．６のｐＨを有し、
・６ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８．０ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、
・０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌの塩化カリウム、
・０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素カリウム、および
・１．０ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．１５ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二ナトリウム
を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍治療の分野、特に固形腫瘍の治療の分野に、特にヒトにおける結腸がんの治療に関する。本発明はさらに、ＴＬＲ−９アゴニストおよび前記腫瘍疾患の治療におけるそれらの使用の分野に関する。さらに本発明のさらなる態様では、本発明は、腫瘍、特に固形腫瘍の腫瘍微小環境をモジュレートし、それにより腫瘍治療をサポートする分野に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックスを含む、腫瘍が存在する細胞環境である。腫瘍と周囲微小環境は密接に関連しており、常に相互作用している。腫瘍は細胞外シグナルを放出し、腫瘍の血管新生を促進し、末梢免疫寛容を誘導することにより微小環境に影響を及ぼし得るが、一方、微小環境の免疫細胞はがん性細胞の増殖および進化に影響を及ぼし得る。

【0003】

歴史的に、患者における黒色腫特異的Ｔ細胞の発見は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を養子移入する方策につながり、免疫系にがんを調節する可能性があることを証明した。しかし、ＴＩＬを用いた養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）では、ウイルス特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を用いたＡＣＴの成功には至っていない。固形がんのＴＭＥは、白血病のＴＭＥとは基本的に異なるようであり、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を用いた臨床ＡＣＴ試験において有効性が実証されている。

【0004】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、腫瘍に浸透する（すなわち、腫瘍に浸潤する）リンパ球である。前臨床マウス研究では、がん細胞の近くのＴ細胞蓄積が制限されることが示唆された。この制限の克服により、抗腫瘍効果が増強されることが明らかになった。Ｔ細胞は、循環系を介して腫瘍部位に到達する。ＴＭＥは、その系からのＴ細胞よりも他の免疫細胞を優先的に動員するように思われる。そのような機序の１つは、細胞型特異的ケモカインの放出である。別の機序は、翻訳後のケモカインを変化させるＴＭＥの能力である。したがって、当業者には、ＴＩＬが腫瘍細胞の死滅に関係していることと、腫瘍中のリンパ球の存在がより良好な臨床転帰と関連していることが多いことが知られている。

【0005】

腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、主として、腫瘍周囲組織または骨髄を起源とし、２つの主要なタイプ：Ｍ１およびＭ２に分類することができる。特に、Ｍ１マクロファージは抗腫瘍特性を有する。したがって、Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変換、またはＭ１マクロファージの優先的な浸潤のいずれも、抗腫瘍免疫応答において有益である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、腫瘍治療を改善するためにＴＭＥをモジュレートする手段および方法を特定することがさらに必要とされている。特に、ＴＩＬ、特にＴ細胞、例えばＣＤ３＋ Ｔ細胞、およびマクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、それにより腫瘍治療をサポートするためのさらに改善された方法および手段が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一実施形態では、この目的は、腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療を必要とする対象の当該治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストであって、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激する、ＴＬＲ−９アゴニストを提供することによって解決される。

【0008】

好ましい実施形態では、浸潤性ＣＤ３＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞であり、より好ましい実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。別の好ましい実施形態では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイム（Ｇｒｚ）Ｂ＋）の頻度を増加させる。また細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の集団は、細胞溶解能を有する活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞とも呼ぶことができ、すなわち、この細胞集団は、好ましくは抗腫瘍形成能を有する。

【0009】

別の好ましい実施形態では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の制御性Ｔ細胞に対する比率を増加させる。制御性Ｔ細胞は、腫瘍形成促進能を有する。制御性Ｔ細胞は、例えば、抑制性サイトカインの分泌、ＩＬ−２の欠乏により、またはそれらの表面で発現される抑制性分子（例えばＣＴＬＡ−４）により、Ｔ細胞の抗腫瘍効果を抑制することができる。

【0010】

それに加えて、１つの目的は、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激するためのものであるということである。好ましい実施形態では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイム（Ｇｒｚ）Ｂ＋）の頻度を増加させるため、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ＋）対制御性Ｔ細胞の比率を増加させるためである。

【0011】

一実施形態では、腫瘍は、その周辺および／またはその中心、好ましくはその中心に浸潤している。

【0012】

それに加えて、１つの目的は、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、腫瘍にその周辺および／またはその中心、好ましくはその中心で浸潤させるためのものであるということである。

【0013】

一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍、好ましくは結腸がんであり、治療される対象はヒトである。

【0014】

さらに、本発明の目的は、それを必要とする患者にＴＬＲ−９アゴニストを投与することを含む、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させる方法であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、方法を適用することによって解決される。

【0015】

別の実施形態では、前記方法は、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させるのに有用である。

【0016】

別の実施形態では、前記方法は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）対制御性Ｔ細胞の比率を増加させるのに有用である。

【0017】

本発明者らは、そのようなＴＬＲ−９アゴニストがＴ細胞の腫瘍への輸送の増加をもたらすことができることを見出した。それに加えて、ＴＭＥおよび／または腫瘍におけるＴ細胞の局所濃度が上昇し、すなわち、Ｔ細胞は腫瘍に近接して蓄積し、そこで腫瘍に浸潤する。したがって、ＴＭＥによるＴ細胞の制限は克服されたように見える。したがって、Ｔ細胞は、それらの抗腫瘍効果を示すことができる。したがって、本発明の特定の一態様では、ＴＬＲ−９アゴニストを使用して、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の効力を増加させる。

【0018】

別の実施形態では、本発明の目的は、それを必要とする対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストであって、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチと
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる、ＴＬＲ−９アゴニストを提供することによって解決される。

【0019】

それに加えて、１つの目的は、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激することであり、および／または前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させることである。

【0020】

好ましくは、ＣＤ３＋ Ｔ細胞および／もしくはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージによる腫瘍の浸潤は、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしの浸潤と比較して刺激され、ならびに／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率は、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしのＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率と比較して増加される。

【0021】

別の実施形態において、本発明の目的は、それを必要とする対象にＴＬＲ−９アゴニストを投与することを含む、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させる方法、および／または腫瘍、好ましくは結腸がん内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる方法であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、方法を適用することによって解決される。

【0022】

本発明のさらに別の特に好ましい実施形態では、上記で定義されたＴＬＲ−９アゴニストを使用して、いわゆる「低免疫原性腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒｓ）」−すなわち、免疫細胞浸潤が低度の腫瘍−を免疫原性腫瘍である「高免疫原性腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒｓ）」、すなわち、免疫細胞浸潤が中度または高度の腫瘍に変換する。「低免疫原性」および「高免疫原性」腫瘍の概念は、当業者には周知である。低免疫原性腫瘍は、通常、免疫抑制性サイトカインに富んでおり、多数のＴｒｅｇ細胞および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を有する。低免疫原性腫瘍は、通常、Ｔ_Ｈ１細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は少数であり、機能性抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞／ＤＣ）はほとんど存在しない。対照的に、高免疫原性腫瘍はＴ_Ｈ１型のケモカインに富んでおり、多数のエフェクター免疫細胞（Ｔ_Ｈ１細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞）と多数のＤＣを有する。

【0023】

免疫細胞浸潤度は、例えば、いわゆる「Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅ」によって測定することができ、これはがん患者における臨床転帰を予測するために使用されている。コンセンサスＩｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、腫瘍内およびその浸潤周縁部のＣＤ３＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の密度をまとめたスコアリングシステムである。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅは、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞密度に応じて、低度、中度、高度に分類することができるが、引用文献の研究において、０〜２５％密度は、好ましくは低度としてスコアリングされ、２５〜７０％密度は、中度としてスコアリングされ、７０〜１００％密度は、好ましくは高度としてスコアリングされている（Ｐａｇｅｓ Ｆ．ら （２０１８） Ｌａｎｃｅｔ ３９１（１０１３５）：２１２８〜２１３９を参照）。低免疫原性腫瘍は、低度の免疫細胞浸潤を有すると定義され、すなわち好ましくは、低度Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有すると定義される。高免疫原性腫瘍は、中度または高度の免疫細胞浸潤を有すると定義され、すなわち好ましくは、中度または高度Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｒｅを有すると定義される。

【0024】

いくつかの腫瘍タイプは、治療前であっても高免疫原性腫瘍のタイプに属し、例えば黒色腫である。これらの腫瘍は、通常、薬物、例えばチェックポイント阻害薬に良好に応答する。本発明は、これらの腫瘍におけるＴＬＲ−９アゴニストの投与によりＴ細胞の活性化および免疫細胞の腫瘍への浸潤がさらに増強されることを示唆している。またＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、他の薬物、例えばチェックポイント阻害剤に対する腫瘍の応答性を増強し得る。

【0025】

低免疫原性腫瘍は、通常、チェックポイント阻害薬などの薬剤には良好に応答しない。本発明は、ＴＬＲ−９アゴニストが免疫細胞の腫瘍への浸潤を増加させ、それによりＴＭＥにプラスに影響を及ぼすことによって、そのような応答性を改善することができることを示唆している。したがって、低免疫原性腫瘍に罹患している患者は、ＴＬＲ−９アゴニストによる治療からとりわけ恩恵を受ける。腫瘍は、結果として、チェックポイント阻害薬などの薬物に対してより良好な応答性を示すことができる。低免疫原性腫瘍は、それにより高免疫原性腫瘍に変わり得る。

【0026】

この特定の使用に対して特に好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄである。

【0027】

一実施形態では、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させるため、および／または腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させるため、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）対制御性Ｔ細胞の比率を増加させるため、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を増加させるため、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させるためのＴＬＲ−９アゴニストの使用であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、使用が提供される。

【0028】

したがって、本発明の場合のＴＬＲ−９アゴニストの投与は、腫瘍増殖速度を低下させる。これは、以下の実施例の項目でより詳細に説明されているように、マウス結腸がんモデル（ＣＴ２６）において本発明者らにより実証され得る。

【0029】

本発明の好ましい実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストは、直接腫瘍に、すなわち、腫瘍内に、または皮下に投与することができる。皮下注射は、好ましくは、総称して皮膚と呼ばれる、真皮および表皮の真下の皮膚層である皮下に投与される。下記の実施例の項目で示しているように、ヒトにおける皮下適用を模倣するために、マウスを、接種した腫瘍の流入リンパ領域から遠位の離れた部位で皮下処置した。腫瘍内注射は、腫瘍に、好ましくは腫瘍の中心に直接投与される。

【0030】

皮下注射は多くの腫瘍タイプで可能であり、転移性腫瘍を標的とするために使用することもできる。腫瘍内注射については、腫瘍は、好ましくは非転移性であり、例えば、黒色腫または頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）に容易に利用可能である。しかし、肝転移は、腫瘍内注射により、好ましくは画像支援注射により標的とすることもできる。皮下注射は、長期間にわたり繰り返し使用することができる。腫瘍内注射は、ＴＬＲ−９アゴニストが腫瘍に直接適用されるので、皮下注射と比較して低用量とすることができる。本発明のＴＬＲ−９アゴニスト、好ましくは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄは、ホスホロチオエートの欠如の結果、毒性が低いことから高用量で適用することができる。

【0031】

トール様受容体（ＴＬＲ）は、当業者には公知である。それらは免疫系の多くの細胞に存在し、自然免疫応答に関与していることが明らかになっている。脊椎動物において、このファミリーは、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスからの病原体関連分子パターンを認識することが知られているＴＬＲ−１からＴＬＲ−１１と呼ばれる１１個のタンパク質で構成されている。

【0032】

ＴＬＲは、脊椎動物が外来分子を認識し、それに対する免疫応答を始める重要な手段であり、自然免疫応答と適応免疫応答が関連付けされる手段も提供する（（Ａｋｉｒａ， Ｓ．ら （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：６７５〜６８０； Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ， Ｒ． （２００１） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １ ： １３５〜１４５））。いくつかのＴＬＲは細胞表面に配置され、細胞外病原体に対する応答を検出および開始し、他のＴＬＲは細胞の内部に配置されて、細胞内病原体に対する応答を検出および開始する。

【0033】

ＴＬＲ−９は、細菌ＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドの非メチル化ＣｐＧモチーフを認識することが知られている（Ｈｅｍｍｉ， Ｈ．ら （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０８：７４０〜７４５）。ＴＬＲ−９の天然に存在するアゴニストは、抗腫瘍活性（例えば、腫瘍増殖および血管新生）を生じ、有効な抗がん応答（例えば抗白血病）をもたらすことが明らかになっている（Ｓｍｉｔｈ， Ｊ．Ｂ．およびＷｉｃｋｓｔｒｏｍ， Ｅ． （１９９８） Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９０： １１４６〜１１５４）。

【0034】

本発明のＴＬＲ−９アゴニストは、少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分はホスホジエステル結合によって連結されている。

【0035】

好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、少なくとも３つの、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチとを含み、オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分は、ホスホジエステル結合によって連結されており、ここで、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドは配列Ｎ^１Ｎ^２ＣＧＮ^３Ｎ^４の一部であり、Ｎ^１Ｎ^２はＡＡ、ＴＴ、ＧＧ、ＧＴ、ＧＡまたはＡＴであり、Ｎ^３Ｎ^４はＣＴ、ＴＴ、ＴＧまたはＧＧであり、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンであり、Ａはデオキシアデノシンであり、Ｔはデオキシチミジンである。

【0036】

一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一端の末端５ヌクレオチド以内に含まれており、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端の末端５ヌクレオチド以内に含まれている。

【0037】

一実施形態では、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストは、１つまたは複数の以下の特徴を有する：
− 少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に位置しており、
− 少なくとも３つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチが２つのＣＧジヌクレオチド間に位置しており、
− 少なくとも３つ、特に５つの連続したデオキシチミジンの１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端に位置しており、
− ３つの３’末端および／または５’末端デオキシヌクレオチドの少なくとも１つがＬ−体であり、
− ３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−体であり、
− 第１および第２の５’末端デオキシヌクレオチドがＬ−体である。

【0038】

特に好ましい実施形態では、Ｌ−体に少なくとも１つのヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストにおいて、
− 少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に位置しており、
− ３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−体であり、
− 少なくとも３つ、特に５つの連続したデオキシチミジンの１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端に位置している。

【0039】

一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、少なくとも３つのＣＧジヌクレオチドを含む。

【0040】

一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、一本鎖および／または部分的もしくは完全二本鎖である。

【0041】

一実施形態では、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、２つの一本鎖ループを含み、ダンベルの形状を形成する。

【0042】

一実施形態では、すべてのヌクレオチドはＤ−体である。

【0043】

本発明による好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、特にＥＰ１１９６１７８に開示されているオリゴデオキシリボヌクレオチドであり、最も好ましくは、ＩＮＮ Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ下で当業者に公知の免疫調節剤オリゴデオキシリボヌクレオチドである（ＣＡＳ登録番号１５４８４３９−５１−５；「ＭＧＮ１７０３」としても知られている；図１；配列番号３を参照）。Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（ＭＧＮ１７０３）は、自然免疫系および適応免疫系に対して広範な免疫調節作用を有する、共有結合で閉じたダンベル様の免疫監視再活性化因子である。Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄは、現在、ｍＣＲＣ患者におけるフェーズ３試験（ＩＭＰＡＬＡ試験）、ＳＣＬＣ患者におけるフェーズ２試験（ＩＭＰＵＬＳＥ試験）、ならびに（ｉ）チェックポイント阻害剤イピリムマブと組み合わせにおける固形腫瘍、および（ｉｉ）ＨＩＶ患者（ＴＥＡＣＨ試験）での２つのフェーズ１／２試験で評価されている。

【0044】

本発明のＴＬＲ−９アゴニストにおいて、オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分は、ホスホジエステル結合により連結されている。これは、オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホロチオエート結合により連結されていないことを意味する。

【0045】

本発明による使用に適し得るさらに好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、ＥＰ２６５５６２３Ｂ１およびＥＰ２９９９７８７Ｂ１に開示されている。本発明による他のさらに好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、図２に示したような配列番号４および５および６〜１４として開示されているＴＬＲ−９アゴニストである。しかし、本発明での使用において最も好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（配列番号３）である。少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストのうち、配列番号５、８、９および１０の配列が好ましい。配列番号５が最も好ましい。

【0046】

本発明による腫瘍疾患とは新生物を指し、これは言い換えれば、組織の異常および過度の増殖のタイプを意味する。新生物は、良性新生物および悪性新生物を含む。悪性新生物または腫瘍は、がんと呼ばれる場合もある。固形腫瘍は、通常、嚢胞または液体の領域を含まない組織の異常な塊と呼ぶことができる。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。固形腫瘍の例は、肉腫、癌種、およびリンパ腫、例えば、乳癌、黒色腫、皮膚新生物、結腸癌を含む胃腸腫瘍、胃癌、膵臓癌、結腸がん、小腸がん、卵巣癌、子宮頸癌、肺がん、前立腺がん、腎細胞癌および／または肝転移である。白血病は、一般に固形腫瘍を形成しない。結腸がんまたは結腸直腸がんは、結腸または直腸の内壁から発生する悪性腫瘍である。結腸がんは固形腫瘍である。

【0047】

好ましくは、本発明の腫瘍疾患は固形腫瘍であり、好ましくは結腸がんである。他の好ましい腫瘍は、結腸直腸がんおよび黒色腫である。

【0048】

細胞、例えばＴ細胞またはマクロファージは、腫瘍に浸潤することができる。腫瘍浸潤は、例えばケモカインに応じた、腫瘍の外側から腫瘍組織への細胞の遊走を意味するものと理解されたい。

【0049】

細胞が腫瘍に浸潤した場合、細胞は続いて腫瘍内に存在する。本発明の一実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニストは、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる。本発明の意味における「腫瘍内」とは、腫瘍における細胞を意味する。腫瘍内の比率の増加は、それぞれの細胞の腫瘍への浸潤の増加、または、例えばＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの変換、またはＭ１マクロファージへのマクロファージ前駆体の分化のＭ２マクロファージを超える増加によって生じ得る。

【0050】

腫瘍の「浸潤周縁部」または「周辺」は、悪性細胞巣を宿主組織から分ける境界を中心とする領域を意味するものとする。腫瘍の「中心」は、残りの腫瘍領域を表す。

【0051】

本発明の意味において、細胞浸潤の「刺激」とは、腫瘍内のそれぞれの細胞型の量の増加を意味する。

【0052】

頻度という用語は、親細胞集団内の特定の細胞集団の頻度を意味し、例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイム（Ｇｒｚ）Ｂ＋）の頻度を意味する。

【0053】

比率という用語は、重複しない２つの定義した細胞集団間の関係または比率を意味し、例えばＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を意味する。

【0054】

腫瘍へのＣＤ３＋ Ｔ細胞の浸潤は、ＣＤ３の検出により同定することができる。ＣＤ３は、腫瘍サンプル中のリンパ球を検出に使用されてきた（ＧＩ Ｃａｎｃｅｒｓの「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｏｕｂｔｓ Ｆａｄｉｎｇ」、２０１６年４月）。マクロファージの浸潤は、マーカーＣＤ１１ｂおよびＦ４／８０により検出することができる。次いで、Ｍ１マクロファージ（ＭＨＣ−ＩＩ／ＣＤ８６高）とＭ２マクロファージ（ＭＨＣ−ＩＩ／ＣＤ８６低）を区別することができる。

【0055】

また腫瘍免疫浸潤は、マイクロアレイまたはＲＮＡシーケンシングなどの遺伝子発現方法を使用して決定することができる。次いで、様々な種類の免疫細胞集団に特異的な遺伝子発現の検出を使用して、乳がんでリンパ球浸潤について明らかにされているように、リンパ球またはマクロファージ浸潤の程度を決定することができる（Ｂｅｄｏｇｎｅｔｔｉ， Ｄａｖｉｄｅ； Ｈｅｎｄｒｉｃｋｘ， Ｗｏｕｔｅｒ； Ｍａｒｉｎｃｏｌａ， Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．； Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌａｎｃｅ Ｄ． 「Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｇｅｎｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２７ （６）： ４３３〜４４４）。腫瘍内の活性免疫環境は、拒絶反応の免疫学的定数によって決定され得る場合、より良好な予後を示すことが多い。

【0056】

上記のように、Ｔ細胞はマーカーＣＤ３によって同定することができる。Ｔ細胞は、２つの主要な集団：ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に分けられる。ＣＤ４＋ ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞を活性化して抗体分泌プラズマ細胞またはメモリーＢ細胞に分化させるために必須である。またＣＤ４＋陽性Ｔ細胞は、免疫応答を形成するために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分化とサイトカイン（Ｔｈ１サイトカイン−例えばＩＦＮ−γまたはＴｈ２サイトカイン−例えばＩＬ−４）の分泌を促進する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、腫瘍細胞（または感染細胞）によってＭＨＣ Ｉのコンテキストで提示される特定のペプチドを認識し、可溶性分子（パーフォリン、グランザイム、グラニュロシン）または膜結合分子（Ｆａｓ−リガンド）によるそれらの破壊を誘導する。細胞傷害性エフェクターＴ細胞、すなわち、活性化され細胞溶解能を有するＴ細胞は、マーカーＣＤ８、ＣＤ６９およびグランザイムＢによって検出することができる。制御性Ｔ細胞は、マーカーＣＤ３、ＣＤ４およびＦＯＸＰ３によって検出することができる。

【0057】

ＣＤ３の代替マーカーとして、Ｔｈｙ１を使用することができるが、その理由は、ＣＤ３が細胞の活性化する際にダウンレギュレートされ得るからである。

【0058】

ＣＤ３＋ Ｔ細胞を同定する各種方法は当業者には公知であり、それらは、例えば、フローサイトメトリーまたは免疫組織学（ＩＨＣ）によって同定することができる。フローサイトメトリーは複数のマーカーを並行して使用し細胞を詳細に分析することができるが、免疫組織学的分析は、細胞の局在に関する情報（腫瘍中心／腫瘍周辺／周囲の健康組織）を提供する。したがって、ＩＨＣを使用すると、当業者は腫瘍の周辺または中心におけるＴ細胞の局在を同定することができる。周辺または浸潤周縁部は、健康な組織に隣接する腫瘍の境界を意味する。Ｔ細胞が腫瘍の中心に浸潤することが好ましい。

【0059】

本発明により使用されるオリゴデオキシリボヌクレオチドは、好ましくは、二本鎖ステムおよび２つの一本鎖ループを含み、ダンベルの形状を形成する。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、好ましくは、共有結合で閉じられている。少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが一本鎖ループの１つまたはそれぞれに位置する場合に有利である。

【0060】

本開示による「ステム」とは、同じＤＮＡ分子内（次いで部分的に自己相補的）または異なるＤＮＡ分子内（部分的にもしくは完全に相補的）のいずれかで塩基対合によって形成されるＤＮＡ二本鎖として理解されたい。分子内塩基対合は同一分子内の塩基対合を示し、異なるＤＮＡ分子間の塩基対合は分子間塩基対合と呼ばれる。

【0061】

本開示の意味内の「ループ」とは、ステム構造の内部または末端のいずれかの対になっていない一本鎖領域として理解されたい。

【0062】

「ダンベル形状」は、二本鎖ステム（同一オリゴヌクレオチド内の塩基対合）および二本鎖ステムの両末端の２つの一本鎖ループを含むオリゴヌクレオチドを意味する。

【0063】

これらのダンベル形状のオリゴヌクレオチドでは、好ましくは、すべてのヌクレオチドがＤ−体である。さらに、オリゴデオキシリボヌクレオチドは、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８０ヌクレオチド、最も好ましくは１１６ヌクレオチドを含むことが好ましい。このタイプのＴＬＲ−９アゴニストの２つの好ましい典型のヌクレオチド配列を図２に示す（配列番号３および配列番号４）。

【0064】

本発明による最も好ましいＴＬＲアゴニストは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（配列番号３）である。

【0065】

Ｌ−ＤＮＡまたはＬ−体のヌクレオチドは、天然に存在するＤ−デオキシリボースの代わりに糖残基としてＬ−デオキシリボースを含むヌクレオチドを意味する。Ｌ−デオキシリボースは、Ｄ−デオキシリボースのエナンチオマー（鏡像）である。Ｌ−体のヌクレオチドから部分的または完全に構成されるＤＮＡ構築物は、部分的または完全に一本鎖または二本鎖であり得る。Ｌ−ＤＮＡは、Ｄ−ＤＮＡと同等の溶解性および選択性がある。しかし、Ｌ−ＤＮＡは、天然に存在する酵素、特にエキソヌクレアーゼによる分解に対して耐性があり、そのため、Ｌ−ＤＮＡは生物学的分解から保護されている。したがって、Ｌ−ＤＮＡは非常に広範囲で適用することができる。

【0066】

少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む好ましいＴＬＲ−９アゴニストのヌクレオチド配列は、図２に示している（配列番号５〜１４）。配列番号５、８、９および１０のヌクレオチド配列がより好ましい。

【0067】

少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む最も好ましいＴＬＲ９−アゴニストは、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＴＬＲ９−アゴニストである。

【0068】

本発明のさらなる実施形態では、ＴＬＲ−９アゴニスト、好ましくはすべてのヌクレオチドがＤ−体であるＴＬＲ−９アゴニストを含む医薬組成物が提供され、これは腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療に適し得る。この医薬組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌのＴＬＲ−９アゴニストを含み、ＰＢＳはｐＨ６〜８、特に７．０〜７．５のｐＨを有し、
− ６ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８．８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、
− ０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２２ｍｇ／ｍｌの塩化カリウム、
− ０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２２ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素カリウム、および
− １．０ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．２６５ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二ナトリウム
を含む。

【0069】

特に好ましい実施形態では、ＰＢＳは、７．２〜７．６のｐＨを有し、
− ８．０ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、
− ０．２ｍｇ／ｍｌの塩化カリウム、
− ０．２ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素カリウム、および
− １．１５ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二ナトリウム
を含む。

【0070】

腫瘍内注射については、ヒト患者における好ましい週用量は、約１０〜約３０ｍｇ／週、好ましくは約１５ｍｇ／週である。皮下注射については、ヒト患者における好ましい週用量は、約１００〜約１５０ｍｇ／週、好ましくは約１２０ｍｇ／週であり、これは数回投与で、例えば約６０ｍｇを週２回、または約１２０ｍｇを週に１回で適用することができる。

【0071】

上記の好ましい医薬組成物では、ＴＬＲ−９アゴニストはＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（配列番号３）である。

【0072】

さらなる実施形態では、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを含む医薬組成物が提供され、これは腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療に適し得る。この医薬組成物は、グルコースを含む塩溶液中に少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。グルコースは、好ましくは、３％〜７％の濃度、よりさらに好ましくは５％の濃度である。塩溶液は、好ましくは、０．１〜１０ｍＭのＫＣｌ、より好ましくは０．５〜３ｍＭのＫＣｌ、よりさらに好ましくは１ｍＭのＫＣｌである。

【0073】

したがって、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを含む好ましい医薬組成物は、５％グルコースおよび１ｍＭのＫＣｌ中に少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。

【0074】

少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、配列番号５の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

【0075】

本発明の好ましい一実施形態によれば、ＴＬＲ−９アゴニスト、好ましくは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄは、単剤療法として使用される。用語「単剤療法」とは、特定の障害または疾患を治療するための単一の活性医薬成分（ＡＰＩ）としての薬物の使用を意味する。したがって、単剤療法では、薬物は別の薬物と組み合わせることなく投与される。

【0076】

別の好ましい実施形態では、それを必要とする対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストならびに化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤を含む組合せであって、前記ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる、組合せが提供される。

【0077】

組合せの成分、すなわち、ＴＬＲ−９アゴニストならびに化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤は、したがって、同時におよび／または連続して一緒に適用することができる。したがって、一実施形態では、治療される対象は、別のがん治療を既に受けている、および／またはその後に別のがん治療を受ける。「別のがん治療」とは、例えば、放射線療法ならびに／または化学療法剤および／もしくはチェックポイント阻害剤の適用、好ましくは化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤の適用を意味し得る。

【0078】

当業者には、適切な化学療法剤は公知である。前臨床データおよび臨床データは、特定の従来の化学療法が免疫刺激機序を介して部分的に作用し得ることを示唆している。そのような化学療法剤が好ましい。例えば、アントラサイクリンは、制御された免疫原性細胞死（ＩＣＤ）表現型を駆動し、ＴＭＥにおける免疫抑制経路を直接的に遮断する。免疫原性細胞死を誘発するか免疫抑制経路を遮断する化学療法薬は、例えば、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、パクリタキセル、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｕｃｉｎ）、イダルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、ボルテゾミブである。

【0079】

化学療法の代わりに、または化学療法に加えて、「標的抗がん剤」、例えばチロシンキナーゼ阻害剤を使用することができる。

【0080】

放射線療法は免疫原性細胞死を誘発することが可能であり、瀕死の細胞から腫瘍抗原を放出させ、次にエフェクターＴ細胞の活性化を促進し、非照射の局在に対しても抗腫瘍免疫応答を追加免疫する（アブスコパル効果）。

【0081】

チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞などのいくつかの免疫細胞およびいくつかのがん細胞によって発現される特定のタンパク質を阻害する。これらのいわゆるチェックポイントタンパク質は、免疫応答を抑制するために役立ち、Ｔ細胞ががん細胞を死滅させるのを防ぐことができる。これらのタンパク質が阻害された場合、免疫系に対する「ブレーキ」が解除され、Ｔ細胞はがん細胞を死滅させ得る。チェックポイント阻害剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、またはＬＡＧ３の阻害剤である。さらに、ＯＸ−４０、ＣＤ１３７（４−１ ＢＢ）またはＧＩＴＲなどのいわゆる同時刺激分子を活性化させて免疫応答を増強し、Ｔ細胞活性化を最適化することができる。当業者には、有用なチェックポイント阻害剤が公知である。好ましいチェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１の阻害剤、例えばペンブロリズマブおよびニボルマブ、ならびにＰＤ−Ｌ１の阻害剤、例えばアテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブである。ＣＴＬＡ−４の好ましい阻害剤は、イピリムマブである。また他の抗体も使用できる。

【0082】

したがって、ＴＬＲ−９アゴニストを適用する前の化学療法または放射線療法は、化学療法または放射線療法が腫瘍サイズの低減および腫瘍関連抗原の放出をもたらすので、有利であり得る。次いで、ＴＬＲ−９アゴニストは、抗原提示細胞を活性化し、次に、放出された腫瘍関連抗原をＴ細胞に提示し、Ｔ細胞を刺激することができる。

【0083】

チェックポイント阻害剤の前にＴＬＲ−９アゴニストを適用した場合、ＴＬＲ−９アゴニストの適用によりＴ細胞が活性化され、次に腫瘍に浸潤することができるので、有利であり得る。次いで、チェックポイント阻害剤は、腫瘍内の既に活性化されたＴ細胞上の阻害分子を阻害することができる。Ｔ細胞はそれにより完全に活性化され、それらの抗腫瘍効果を及ぼすことができる。

【0084】

ＴＬＲ−９アゴニストの適用の前にチェックポイント阻害剤を適用した場合、ＴＬＲ−９アゴニストがチェックポイント阻害剤に対する潜在的な非応答性を抑止する可能性があるので、有利であり得る。言い換えれば、腫瘍がチェックポイント阻害剤に良好に反応しない場合には、それが低免疫原性腫瘍である可能性があるので、ＴＬＲ−９アゴニストは、チェックポイント阻害剤に対する応答性が回復するように腫瘍の微小環境をモジュレートすることができる。例えば、腫瘍は、Ｔ細胞上でアップレギュレートされた阻害分子によりチェックポイント阻害剤による治療に耐性を有し得る。ＴＬＲ−９アゴニストによって活性化されたｄｅ ｎｏｖｏ活性化Ｔ細胞は、これらの阻害分子を発現しない可能性があり、したがって、チェックポイント阻害剤による治療に感受性があり得る。

【0085】

一実施形態では、それを必要とする対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストならびに化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤を含む組成物であって、前記ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療が、ＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる、組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0086】

【図1】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（ＭＧＮ１７０３）の配列および構造を示す図である。

【図2】ダンベル状のＴＬＲ−９アゴニストであるＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（ＭＧＮ１７０３）、ｄＳＬＩＭ ２００６（部分配列は完全配列の合成に使用される）、およびＬヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストの配列の部分配列および完全配列を示す図である。太字で下線部分のヌクレオチドはＬ−体である。

【図3】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療の影響を示す図である。図４および図５は、図３で示した値の単一の値を示している。

【図4】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療の影響を示す図である。図４および図５は、図３で示した値の単一の値を示している。

【図5】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療の影響を示す図である。図４および図５は、図３で示した値の単一の値を示している。

【図6】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後の腫瘍中心内のＣＤ３＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図7】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後の腫瘍中心内のＣＤ８＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図8】浸潤したＣＤ８＋ Ｔ細胞と腫瘍増殖の減少との相関を示す図である。

【図9】浸潤したＣＤ８＋ Ｔ細胞と腫瘍増殖の減少との相関を示す図である。

【図10】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後の腫瘍増殖に対するＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）治療の影響を示す図である。図１１および図１２は、図１０に示した値の単一の値を示している。

【図11】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後の腫瘍増殖に対するＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）治療の影響を示す図である。図１１および図１２は、図１０に示した値の単一の値を示している。

【図12】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後の腫瘍増殖に対するＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）治療の影響を示す図である。図１１および図１２は、図１０に示した値の単一の値を示している。

【図13】Ｌ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）により治療した後の腫瘍中心内のＣＤ３＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図14】Ｌ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）により治療した後の腫瘍中心内のＣＤ８＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図15】Ｌ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）により治療した後の浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞と腫瘍増殖の減少との相関を示す図である。

【図16】Ｌ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）により治療した後の浸潤ＣＤ８＋ Ｔ細胞と腫瘍増殖の減少との相関を示す図である。

【図17】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後のフローサイトメトリーによる腫瘍内のＴ細胞集団の分析を示す図である。

【図18】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後のフローサイトメトリーによるＣＤ８＋ Ｔ細胞、細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ ＧｒｚＢ＋）および制御性Ｔ細胞の分析を示す図である。

【図19】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後のＩＨＣによる腫瘍内のマクロファージの分析を示す図である。

【図20】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより治療した後のフローサイトメトリーによる腫瘍内のマクロファージの分析を示す図である。

【図21】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ皮下治療の影響を示す図である；図２２および図２３は、図２１で示した値の単一の値を示している。

【図22】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ皮下治療の影響を示す図である；図２２および図２３は、図２１で示した値の単一の値を示している。

【図23】腫瘍増殖に対するＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ皮下治療の影響を示す図である；図２２および図２３は、図２１で示した値の単一の値を示している。

【図24】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより皮下治療した後の腫瘍中心内のＣＤ８＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図25】Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄにより皮下治療した後の腫瘍周縁部のＣＤ８＋ Ｔ細胞の定量化を示す図である。

【図26】Ｌ−ヌクレオチドを含む異なるＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５〜１１）により治療した後のｐＤＣに対するヒトＰＢＭＣ由来のＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０の分泌ならびにＨＬＡ−ＤＲ発現の比較を示す図である。

【図27】Ｌ−ヌクレオチドを含む異なるＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号７〜９および１２〜１４）により治療した後のヒトＰＢＭＣ由来のＩＦＮ−アルファおよびＩＰ−１０の分泌の比較を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0087】

特定の実施形態
１．それを必要とする対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストであって、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激する、ＴＬＲ−９アゴニスト。

【0088】

別の実施形態１では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる。

【0089】

２．ＣＤ３＋ Ｔ細胞、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージによる腫瘍の浸潤が、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしの浸潤と比較して刺激される、実施形態１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0090】

別の実施形態２では、腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率は、ＴＬＲ−９アゴニスト治療なしのＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率と比較して増加している。

【0091】

３．ＣＤ３＋ Ｔ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、実施形態１または２に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0092】

別の実施形態３では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させる。

【0093】

別の実施形態３では、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）対制御性Ｔ細胞の比率を増加させる。

【0094】

４．腫瘍がその周辺および／またはその中心、好ましくはその中心に浸潤している、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0095】

５．腫瘍が固形腫瘍、好ましくは結腸がんであり、治療される対象はヒトである、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0096】

６．ＴＬＲ−９アゴニストが腫瘍内または皮下に投与される、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0097】

７．少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが配列Ｎ^１Ｎ^２ＣＧＮ^３Ｎ^４の一部であり、Ｎ^１Ｎ^２がＡＡ、ＴＴ、ＧＧ、ＧＴ、ＧＡまたはＡＴであり、Ｎ^３Ｎ^４がＣＴ、ＴＴ、ＴＧまたはＧＧであり、Ｃがデオキシシチジンであり、Ｇがデオキシグアノシンであり、Ａがデオキシアデノシンであり、Ｔがデオキシチミジンである、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0098】

８．オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含み、好ましくは、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一端の末端５ヌクレオチド以内に含まれており、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端の末端５ヌクレオチド以内に含まれている、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0099】

一実施形態８では、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストは、１つまたは複数の以下の特徴を有する：
− 少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に位置しており、
− 少なくとも３つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチが２つのＣＧジヌクレオチド間に位置しており、
− 少なくとも３つ、特に５つの連続したデオキシチミジンの１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端に位置しており、
− ３つの３’末端および／または５’末端デオキシヌクレオチドの少なくとも１つがＬ−体であり、
− ３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−体であり、
− 第１および第２の５’末端デオキシヌクレオチドがＬ−体である。

【0100】

特に好ましい実施形態８では、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストにおいて、
− 少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端に位置しており、
− ３つの３’末端デオキシヌクレオチドのうち２つがＬ−体であり、
− 少なくとも３つ、特に５つの連続したデオキシチミジンの１つのストレッチがオリゴデオキシリボヌクレオチドの３’末端に位置している。

【0101】

９．オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも３つのＣＧジヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0102】

１０．オリゴデオキシリボヌクレオチドが一本鎖および／または部分的もしくは完全二本鎖である、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0103】

１１．オリゴデオキシリボヌクレオチドが２つの一本鎖ループを含み、ダンベルの形状を形成する、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0104】

１２．すべてのヌクレオチドがＤ−体である、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0105】

１３．配列番号３の配列を有する実施形態１１または１２に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0106】

１４．配列番号５の配列を有する実施形態８に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0107】

１５．それを必要とする患者にＴＬＲ−９アゴニストを投与することを含む、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍、好ましくは結腸がんへの浸潤を増加させる方法であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されている、方法。

【0108】

別の実施形態１５では、前記方法は、腫瘍中のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団内の細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）の頻度を増加させるのに有用である。

【0109】

別の実施形態１５では、前記方法は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ グランザイムＢ＋）対制御性Ｔ細胞の比率を増加させるのに有用である。

【0110】

別の実施形態１５では、前記方法は、マクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍内への浸潤を増加させる、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させるのに有用である。

【0111】

１６．オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは３０〜３５ヌクレオチドを含む、実施形態８に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0112】

１７．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチがＤ−体であり、オリゴデオキシリボヌクレオチドの少なくとも１つの末端の末端６ヌクレオチド以内に、好ましくはオリゴデオキシリボヌクレオチドの５’末端の末端６ヌクレオチド以内に位置している、実施形態８または１６に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0113】

１８．少なくとも３つ、特に４つの連続するデオキシグアノシンが２つのＣＧジヌクレオチドの間に位置している、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0114】

１９．デオキシグアノシンを除いて、少なくとも５つのヌクレオチドが２つのＣＧジヌクレオチドの間に位置している、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0115】

２０．少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドの一本鎖および／または二本鎖領域に位置している、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0116】

２１．オリゴデオキシリボヌクレオチドが二本鎖ステムおよび少なくとも１つの一本鎖ループを含む、実施形態１から１０のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0117】

２２．オリゴデオキシリボヌクレオチドが少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも８０ヌクレオチド、最も好ましくは１１６ヌクレオチドを含む、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0118】

２３．オリゴデオキシリボヌクレオチドが多くとも２００ヌクレオチド、好ましくは多くとも１５０ヌクレオチド、最も好ましくは１１６ヌクレオチドを含む、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0119】

２４．少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが、
ｉ．一本鎖ループの１つまたはそれぞれに、好ましくは一本鎖ループのそれぞれに、または、
ｉｉ．二本鎖ステムに、または、
ｉｉｉ．一本鎖ループの１つまたはそれぞれに、および二本鎖ステムに、
位置している、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0120】

２５．オリゴデオキシリボヌクレオチドが二本鎖ステムおよび少なくとも１つの一本鎖ループを含み、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドが一本鎖ループに位置している、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0121】

２６．３つのＣＧジヌクレオチドが一本鎖ループのそれぞれに位置している、実施形態２５に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0122】

２７．一本鎖ループの１つまたはそれぞれが少なくとも２０ヌクレオチドを含み、好ましくは３０ヌクレオチドから構成される、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0123】

２８．一本鎖ループのそれぞれが３０ヌクレオチドから構成され、同一の配列である、実施形態２７に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0124】

２９．二本鎖ステムが少なくとも１５塩基対、好ましくは少なくとも２０塩基対を含み、最も好ましくは２８塩基対から構成される、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0125】

３０．二本鎖ステムが最大９０塩基対、好ましくは最大６０塩基対を含み、最も好ましくは２８塩基対から構成される、実施形態１１または２１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0126】

３１．一本鎖ループのそれぞれが３０ヌクレオチドから構成され、二本鎖ステムが２８塩基対から構成され、３つのＣＧジヌクレオチドが一本鎖ループのそれぞれに位置している、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0127】

３２．ＴＬＲ−９アゴニストが、二度の配列番号１の部分的にハイブリダイズした配列から構成される、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0128】

３３．ＴＬＲ−９アゴニストが、二度の配列番号２の部分的にハイブリダイズした配列から構成される、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0129】

３４．ＴＬＲ−９アゴニストが、配列番号４の配列から構成される、実施形態１１に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0130】

３５．少なくとも１つのヌクレオチドが、カルボキシル、アミン、アミド、アルジミン、ケタール、アセタール、エステル、エーテル、ジスルフィド、チオールおよびアルデヒド基を含む群から選択される官能基で修飾されている、前記実施形態のいずれかに記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0131】

３６．修飾ヌクレオチドが、ペプチド、タンパク質、炭水化物、抗体、脂質、ミセル、小胞、合成分子、ポリマー、マイクロ発射体、金属粒子、ナノ粒子、および固相を含む群から選択される化合物に連結されている、実施形態３５に記載の使用のためのＴＬＲ−９アゴニスト。

【0132】

３７．ＴＬＲ−９アゴニストが先行する実施形態のいずれかにおいて定義されている通りである、実施形態１５に記載の方法。

【0133】

３８．腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のための、ＰＢＳ中に、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１５ｍｇ／ｍｌのＴＬＲ−９アゴニストを含み、好ましくは、すべてのヌクレオチドがＤ−体であるＴＬＲ−９アゴニストを含む医薬組成物であって、ＰＢＳがｐＨ６〜８、特に７．２〜７．６のｐＨを有し、
・６ｍｇ／ｍｌ〜１２ｍｇ／ｍｌ、好ましくは８．０ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム、
・０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌの塩化カリウム、
・０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．２ｍｇ／ｍｌのリン酸二水素カリウム、
・１．０ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１．１５ｍｇ／ｍｌのリン酸水素二ナトリウム
を含む、医薬組成物。

【0134】

好ましい実施形態３８では、ＴＬＲ−９アゴニストはＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（配列番号３）である。

【0135】

別の実施形態３８では、医薬組成物は、グルコースを含む塩溶液に少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを１ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。グルコースは、好ましくは、３％〜７％の濃度、よりさらに好ましくは５％の濃度である。塩溶液は、好ましくは、０．１〜１０ｍＭのＫＣｌ、より好ましくは０．５〜３ｍＭのＫＣｌ、よりさらに好ましくは１ｍＭのＫＣｌである。

【0136】

したがって、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを含む好ましい医薬組成物は、５％グルコースおよび１ｍＭのＫＣｌ中に少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストを１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ含む。

【0137】

少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む好ましいＴＬＲ−９アゴニストは、配列番号５の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。

【0138】

３９．ＴＬＲ−９アゴニストを投与することを含む、対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんを治療する方法であって、ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる、方法。

【0139】

好ましくは、ＴＬＲ−９アゴニストは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄである。

【0140】

４０．それを必要とする対象の腫瘍疾患、好ましくは結腸がんの治療における使用のためのＴＬＲ−９アゴニストならびに化学療法剤および／またはチェックポイント阻害剤を含む組合せであって、前記ＴＬＲ−９アゴニストが、
ｉ．少なくとも１つの非メチル化ＣＧジヌクレオチド（ここで、Ｃはデオキシシチジンであり、Ｇはデオキシグアノシンである）を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドと、
ｉｉ．少なくとも３つ、特に４つの連続したデオキシグアノシンの少なくとも１つのストレッチ
と
を含み、
オリゴデオキシリボヌクレオチドのデオキシリボース部分がホスホジエステル結合によって連結されており、前記ＴＬＲ−９アゴニストによる治療がＣＤ３＋ Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を刺激し、および／またはマクロファージ、好ましくはＭ１マクロファージの腫瘍への浸潤を刺激し、および／または腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率を増加させる、組合せ。

【0141】

好ましくは、ＴＬＲ−９アゴニストは、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄである。

【実施例1】

【0142】

ＴＬＲ−９アゴニストは腫瘍微小環境をモジュレートする
本発明のようなＴＬＲ９アゴニストの使用の利点は、２つのＴＬＲ９アゴニスト、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（配列番号３）およびＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）により例示される。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）をモジュレートするＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄおよびＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）の可能性を抗腫瘍免疫応答に必要な免疫細胞の浸潤に関して評価した。ＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄおよびＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）は両方とも本発明の特に好ましい実施形態である。

【0143】

同系マウス結腸がんモデル（ＣＴ２６）を使用して、これらの効果を実証した。ＴＭＥの生物学的モジュレーションは、免疫組織化学（ＩＨＣ）およびフローサイトメトリーを使用して評価した。

【0144】

材料／方法
１．）腫瘍内投与後の免疫組織化学（ＩＨＣ）
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０日目に０．０５×１０^６個のＣＴ２６腫瘍細胞をマトリゲルと共に側腹部に皮下接種した。マウスは、腫瘍の体積によってケージイコライザーソフトウェアを用いて治療群に無作為化した。化合物（ＰＢＳに溶解したもの）またはビヒクル（ＰＢＳ）は、腫瘍が約１４０ｍｍ^３の体積に達した１０日目に腫瘍内経路により投与した。２００μｇのＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄまたは２００μｇのＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）を週に３回適用した。２１日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をＩＨＣ用に回収した。ＣＤ３染色およびマクロファージマーカーＦ４／８０の染色については、組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。ＣＤ８染色については、凍結切片を実施した。ＩＨＣ染色は、標準的な方法により実施した。免疫細胞の染色は、腫瘍の中心および浸潤周縁部について分析した。ＣＤ３染色はＤｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェア（Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ＡＧ、 Ｍｕｎｉｃｈ、 Ｇｅｒｍａｎｙ）によって定量化し、ＣＤ８染色はスコアリング方法によって手動で定量化した：
１から４までのＣＤ８に関するスコアリング方法：
１＝ラベリングなし
２＝ラベリングわずか
３＝ラベリング中程度
４＝ラベリング強い

【0145】

スコアリングは１名のＩＨＣオペレーターによって実施され、この試験に参加しなかった別のＩＨＣオペレーターによってチェックされた。

【0146】

２．）腫瘍内投与後のフローサイトメトリー
生存部分（ＣＴ ２６マウス）は、２５０μｇのＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄを使用したことを除き、上記のとおりであった。２１日目にマウスを安楽死させ、フローサイトメトリーによる腫瘍浸潤白血球を分析するため腫瘍を回収した。Ｔ細胞およびマクロファージの評価については、フルオロフォア結合抗体の２つのパネルを使用した。

【0147】

【表1】

【0148】

以下のマーカーを使用して以下の細胞タイプを検出した：

【0149】

【表2】

【0150】

３．）皮下投与後のＩＨＣ
Ｂａｌｂ／ｃマウスに対し、０日目に、右下腹部に０．５×１０^６個のＣＴ２６腫瘍細胞を皮下接種した。マウスは、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（商標）ソフトウェア（Ｓｔｕｄｙｌｏｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、体重に基づき無作為化され、治療群に入れられた。Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（ＰＢＳに溶解したもの）またはビヒクル（ＰＢＳ）を２日目に離れた皮下経路（腋窩リンパ節の近位の左前腹部）により投与した。２５０μｇのＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄを１６日目まで週に３回適用した。１７日目にマウスを安楽死させ、腫瘍をＩＨＣ用に回収した。組織をホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。ＣＤ８に対するＩＨＣ染色は、当業者に公知の標準的な方法により実施された。すべての染色された切片は、ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ−ＨＴ ２．０画像システム（浜松ホトニクス株式会社）でスキャンした。各サンプルの５つの代表的なフィールドを分析用に選択した。スキャンした領域の定量化は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／）を使用して実施した。ＩＨＣスコアは、フィールド内の細胞総数に対する５つのフィールド内の陽性細胞数の平均の比率として示されている。腫瘍周縁部および腫瘍中心のＩＨＣスコアリングは別々に行った。

【0151】

結果
腫瘍内投与されたＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄによる治療は、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖の低下をもたらした（図３、図４および図５）。これには、腫瘍中心へのＣＤ３＋ Ｔ細胞の浸潤の増強が伴った（図６）。またＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療は、細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍中心への浸潤をもたらした（図７）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤と腫瘍増殖の低下との間に相関があった（ｐ＝０．０２２；図８および図９）。

【0152】

Ｌ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）による治療（腫瘍内投与）は、ビヒクル対照と比較して腫瘍増殖の低下をもたらした（図１０、図１１および図１２）。腫瘍へのＣＤ３＋ Ｔ細胞の中程度の浸潤が観察された（図１３）。またＬ−ヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニスト（配列番号５）による治療は、腫瘍中心への細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤ももたらした（図１４）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞浸潤と腫瘍増殖の低下との間に相関の傾向があった（図１５および図１６）。

【0153】

Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（腫瘍内投与）によるＣＤ３＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤をフローサイトメトリーにより確認した。全腫瘍細胞内の両細胞集団の増加が観察された。（図１７）。

【0154】

さらに、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（腫瘍内投与）により抗腫瘍形成性細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ ＧｒｚＢ＋）対腫瘍形成促進性制御性Ｔ細胞の比率が有意に増加した。細胞傷害性エフェクターＴ細胞は、細胞溶解性分子、例えばグランザイムＢ（Ｇｒｚ Ｂ）を発現し、したがって腫瘍細胞を破壊することが可能である。同様のことがＣＤ８＋ Ｔ細胞集団全体においても観察された。制御性Ｔ細胞の頻度は変化しないままであった（図１８）。

【0155】

Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療（腫瘍内投与）は、マクロファージの腫瘍への誘引をもたらした（図１９）。

【0156】

フローサイトメトリー分析からの結果は、Ｍ１マクロファージの増加（ＣＤ８６およびＭＨＣ ＩＩ高）、Ｍ２マクロファージの減少（ＣＤ８６およびＭＨＣ ＩＩ低）、ならびにＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ（腫瘍内投与）による腫瘍内のＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージの比率の増加を示した（図２０）。

【0157】

図１７、図１８、および図２０のデータの統計分析は、コルモゴロフ・スミルノフ検定を使用して行った。

【0158】

腫瘍体積は、腫瘍内投与後だけでなく、Ｌｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄの遠位皮下投与後にも減少した（図２１〜２３）。またＬｅｆｉｔｏｌｉｍｏｄ治療（皮下投与）は、腫瘍中心および周縁部への細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の浸潤をもたらした（図２４〜２５）。

【0159】

したがって、本発明によるＴＬＲ−９アゴニストは、ＴＭＥをモジュレートするため、また、Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変換が促進され、ならびに／またはＭ１マクロファージおよび／もしくはＣＤ８＋ Ｔ、例えば細胞傷害性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ６９＋ ＧｒｚＢ＋）の腫瘍への浸潤が刺激される抗腫瘍応答を促進するために有益である。

【実施例2】

【0160】

少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストは、免疫系を活性化する
少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む異なるＴＬＲ−９アゴニストを、免疫系を活性化する、特に腫瘍微小環境をモジュレートする可能性について試験した。

【0161】

方法
匿名の健康なドナー由来のバフィーコートは、「ＤＲＫ−Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ−Ｏｓｔ」から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）を使用して、密度勾配遠心分離により単離した。細胞を、平底プレート（ＰＢＭＣ、６００万個細胞／ｍｌ）中の完全培地（１０％［ｖ／ｖ］ウシ胎仔血清［Ｌｉｎａｒｉｓ］、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン［Ｌｏｎｚａ］を補充し２ｍＭのＵｌｔｒａＧｌｕｔａｍｉｎｅ［Ｌｏｎｚａ］を入れたＲＰＭＩ１６４０［Ｌｏｎｚａ］）で培養した。

【0162】

細胞を氷上で１０％（ｖ／ｖ）のヒト血清、２．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳおよび０．１％（ｗ／ｖ）のアジドを含むＰＢＳ中のモノクローナル抗体により表面染色した。以下の抗体をｐＤＣ活性化の分析に使用した：抗系列カクテル１、抗ＣＤ１２３（７Ｇ３）、抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製。細胞のすべてのフローサイトメトリーパラメーターは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ｐＤＣフラクション内のＨＬＡ−ＤＲの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を推定した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。

【0163】

分泌されたサイトカインは、２日間、細胞増殖培地に蓄積された。ＩＦＮ−アルファ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＩＰ−１０（インターフェロン誘導タンパク質１０、ＣＸＣＬ１０（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ））のＥＬＩＳＡは、メーカーの指示に従って２連で実施した。光学密度を４５０ｎｍで測定した；データは、ＭｉｃｒｏＷｉｎソフトウェア（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。

【0164】

結果
図２６：ＰＢＭＣを、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む異なるＴＬＲ−９アゴニストで、４８時間、最終濃度３μＭ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、または０．０４〜３μΜの濃度範囲（Ｄ）で刺激した。細胞培養培地を対照として使用した。Ａ：配列番号５、７、８、１０、および１１を有する分子を標準のＴＬＲ９アゴニストと比較した。Ｂ：示した分子により刺激した後のｐＤＣのＨＬＤ−ＤＲ発現の比較。Ｃ：配列番号６を有する分子と配列番号５を有する分子との比較。配列番号５は既にＡにおける比較で使用した。Ｄ：配列番号９を有する分子と配列番号５を有する分子との比較。配列番号５は既にＡにおける比較で使用した。調査した濃度範囲内の各分子についての最大効果を示している。

【0165】

図２７：ＰＢＭＣを、少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含む異なるＴＬＲ−９アゴニストで、４８時間、示した濃度範囲で刺激した。Ａ：配列番号１３を有する分子と配列番号７を有する分子との比較。配列番号７は既に図２６Ａにおける比較で使用した；Ｂ：配列番号１２を有する分子と配列番号８を有する分子との比較。配列番号８は既に図２６Ａにおける比較で使用した；Ｃ：配列番号１４を有する分子と配列番号９を有する分子との比較。配列番号９は既に図２６Ｄにおける比較で使用した。

【0166】

すべての試験した少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストは、ＴＬＲ９を有する形質細胞様細胞（ｐＤＣ）およびＢ細胞を活性化することを示している。ＩＦＮ−アルファはｐＤＣにより分泌され、自然免疫系および適応免疫系の広範な活性化をもたらす。活性化プロファイルは、試験した分子間で異なる：異なる分子によりＰＢＭＣを刺激した後に得られるＩＦＮ−アルファの個々のレベルは多様であり（図２６Ａ、Ｃ、Ｄおよび図２７）、またｐＤＣに対する活性化分子のアップレギュレーションも多様であった（図２６Ｂ）。しかし、調査したすべての分子は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍微小環境への誘引に関与するケモカインである、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０、図２６Ａ、Ｃ、Ｄおよび図２７）の強力な分泌を誘発した。

【0167】

また、ＩＦＮ−ガンマ遊離により測定される抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化も増強された（データは示さず）。

【0168】

すべての試験した少なくとも１つのＬ−体のヌクレオチドを含むＴＬＲ−９アゴニストは、腫瘍微小環境をモジュレートする可能性を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【国際調査報告】