特表 2020-533962 ＢＲＡＦ特異的ＴＣＲおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-533962(P2020-533962A)

(43)【公表日】2020年11月26日

(54)【発明の名称】ＢＲＡＦ特異的ＴＣＲおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20201030BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20201030BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20201030BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20201030BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201030BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20201030BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201030BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20201030BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20201030BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20201030BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201030BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201030BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C12N15/12ZNA

   C12N15/13

   C12N15/63 Z

   C12N15/867 Z

   C07K19/00

   C07K16/28

   C07K14/725

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61K38/17

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/04

   A61K35/17 Z

   A61K35/15 Z

   A61K38/19

   A61K38/20

   A61K39/395 U

   A61K31/7105

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】75

(21)【出願番号】特願2020-506978(P2020-506978)

(86)(22)【出願日】2018年8月10日

(85)【翻訳文提出日】2020年3月25日

(86)【国際出願番号】US2018046350

(87)【国際公開番号】WO2019033057

(87)【国際公開日】20190214

(31)【優先権主張番号】62/544,695

(32)【優先日】2017年8月11日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】506139369

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター

(71)【出願人】

【識別番号】517075883

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ワシントン

【氏名又は名称原語表記】Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ヴィーチ， ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】リデル， スタンリー アール．

(72)【発明者】

【氏名】リー， シルビア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AA99Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084AA22

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA12

4C084DA14

4C084MA02

4C084MA55

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZC752

4C085AA14

4C085CC23

4C085EE03

4C085GG04

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA55

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB27

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087MA55

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、様々な腫瘍関連抗原（ヒトＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}エピトープを含む）に特異的に結合する、ＴＣＲなどの、結合タンパク質；そのような抗原特異的結合タンパク質を発現する細胞；そのような抗原特異的結合タンパク質をコードする核酸；および細胞がＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を発現する疾患または障害、例えばがんの処置において、使用するための組成物を提供する。ある特定の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（例えば、ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）に会合するＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原などの、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原と特異的に結合することができる、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの、結合タンパク質を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）配列番号２９〜３２のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列、または最大で５つのアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を有する配列番号２９〜３２のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変（Ｖα）ドメインと、ＴＣＲβ鎖可変（Ｖβ）ドメインとを含む結合タンパク質；
（ｂ）Ｖαドメインと、配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列、または最大で５つのアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を有する配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、Ｖβドメインとを含む結合タンパク質；または
（ｃ）（ａ）のＶαドメインと（ｂ）のＶβドメインとを含む結合タンパク質
であって、
ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異を含有するＢＲＡＦペプチドを含む細胞表面のＨＬＡ複合体と特異的に結合することができ、前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異を含有しないＢＲＡＦペプチドを含む細胞表面のＨＬＡ複合体には結合しない、結合タンパク質。

【請求項2】

（ａ）前記Ｖαドメインが、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記Ｖαドメインが、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記Ｖαドメインが、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記Ｖαドメインが、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｅ）前記Ｖαドメインが、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｆ）前記Ｖαドメインが、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｇ）前記Ｖαドメインが、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｈ）前記Ｖαドメインが、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｉ）前記Ｖαドメインが、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｊ）前記Ｖαドメインが、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；
（ｋ）前記Ｖαドメインが、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む；または
（ｌ）前記Ｖαドメインが、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記Ｖβドメインが、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。

【請求項3】

配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるＶαドメインを含み、配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一であるＶβドメインを含み、ただし、（ａ）ＣＤＲの少なくとも３または４つが変異を有さず、（ｂ）変異を有するＣＤＲが、アミノ酸置換、挿入および／または欠失を最大で３つしか有さない、請求項１または２に記載の結合タンパク質。

【請求項4】

前記Ｖαドメインが、配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項5】

前記Ｖβドメインが、配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項6】

ＴＣＲ、ＴＣＲの抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項7】

前記ＴＣＲの前記抗原結合断片が、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む、請求項６に記載の結合タンパク質。

【請求項8】

キメラ抗原受容体である、請求項６または７に記載の結合タンパク質。

【請求項9】

前記ＴＣＲ、前記ＴＣＲの前記抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体が、キメラ、ヒト化、またはヒトである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項10】

ＴＣＲである、請求項６または９に記載の結合タンパク質。

【請求項11】

前記ＴＣＲが、配列番号２５のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するα鎖定常（Ｃα）ドメインを含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。

【請求項12】

前記Ｃαドメインが、配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の結合タンパク質。

【請求項13】

前記ＴＣＲが、配列番号２６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するβ鎖（Ｃβ）定常ドメインを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項14】

前記Ｃβドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の結合タンパク質。

【請求項15】

前記ＴＣＲα鎖が、配列番号５５〜５８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項16】

前記ＴＣＲβ鎖が、配列番号５９〜６１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項17】

前記ＢＲＡＦＶ６００Ｅペプチドが、約７〜約２７個のアミノ酸、約１０〜約２５個のアミノ酸、または約１２〜約２０個のアミノ酸、または約１５〜約１９個のアミノ酸を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項18】

前記ＢＲＡＦＶ６００Ｅペプチドが、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項19】

前記ＨＬＡ複合体が、ＨＬＡ−ＤＱを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項20】

前記ＨＬＡ複合体が、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、＊０３０２、または＊０３０３を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項21】

前記ＨＬＡ複合体が、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２を含む、請求項２０に記載の結合タンパク質。

【請求項22】

前記ＨＬＡ複合体が、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。

【請求項23】

請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物。

【請求項24】

請求項１〜２２のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項25】

結合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、目的の宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項26】

発現制御配列に作動可能に連結された請求項２４または２５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項27】

前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる、請求項２６に記載の発現ベクター。

【請求項28】

前記宿主細胞が、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である、請求項２７に記載の発現ベクター。

【請求項29】

前記免疫系細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項２８に記載の発現ベクター。

【請求項30】

前記免疫系細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２９に記載の発現ベクター。

【請求項31】

前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項２９または３０に記載の発現ベクター。

【請求項32】

ウイルスベクターである、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の発現ベクター。

【請求項33】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである、請求項３２に記載の発現ベクター。

【請求項34】

請求項２４もしくは２５に記載の異種ポリヌクレオチドまたは請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、その細胞表面で、前記異種ポリヌクレオチドによりコードされる結合タンパク質を発現する、宿主細胞。

【請求項35】

（ａ）前記Ｖαドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、および／または
（ｂ）前記Ｖβドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である、請求項３４に記載の宿主細胞。

【請求項36】

前記Ｖαドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４または３５に記載の宿主細胞。

【請求項37】

前記Ｖβドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項38】

前記Ｖαドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、ＴＣＲα鎖定常ドメインをコードする部分に連結されており、前記α鎖定常ドメインをコードする前記部分が、配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列を含むか、または配列番号２７のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列からなる、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項39】

前記Ｖβドメインをコードする前記異種ポリヌクレオチドの部分が、ＴＣＲβ鎖定常ドメインをコードする部分に連結されており、前記β鎖定常ドメインをコードする前記部分が、配列番号２８のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列を含むか、または配列番号２８のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列からなる、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項40】

前記Ｖαドメインをコードする前記部分が、配列番号１８のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１８のポリヌクレオチド配列からなり、前記Ｖβドメインをコードする前記部分が、配列番号２２のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２２のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項41】

前記Ｖαドメインをコードする前記部分が、配列番号１９のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１９のポリヌクレオチド配列からなり、前記Ｖβドメインをコードする前記部分が、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２３のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項42】

前記Ｖαドメインをコードする前記部分が、配列番号２０のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２０のポリヌクレオチド配列からなり、前記Ｖβドメインをコードする前記部分が、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２３のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項43】

前記Ｖαドメインをコードする前記部分が、配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２１のポリヌクレオチド配列からなり、前記Ｖβドメインをコードする前記部分が、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２４のポリヌクレオチド配列からなる、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項44】

前記ポリヌクレオチドの一部分が、自己切断ペプチドをコードし、ＴＣＲα鎖をコードする部分とＴＣＲβ鎖をコードする部分の間に配置されている、請求項３４〜４３のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項45】

前記自己切断ペプチドをコードする前記部分が、配列番号４４〜４８のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号４４〜４８のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる、請求項４４に記載の宿主細胞。

【請求項46】

前記コードされた自己切断ペプチドが、配列番号４９〜５２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４９〜５２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる、請求項４５に記載の宿主細胞。

【請求項47】

造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項48】

前記免疫系細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項49】

前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項50】

前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項４７に記載の宿主細胞。

【請求項51】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項52】

前記Ｔ細胞により発現される前記結合タンパク質またはＴＣＲが、内在性ＴＣＲと比較して、ＣＤ３タンパク質とより効率的に会合することができる、請求項５０または５１に記載の宿主細胞。

【請求項53】

ＰＤ−１遺伝子、ＬＡＧ３遺伝子、ＴＩＭ３遺伝子、ＣＴＬＡ４遺伝子、ＨＬＡ成分遺伝子、ＴＣＲ成分遺伝子またはそれらの任意の組合せの染色体遺伝子ノックアウトを含む、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項54】

前記染色体遺伝子ノックアウトが、α１マクログロブリン遺伝子、α２マクログロブリン遺伝子、α３マクログロブリン遺伝子、β１ミクログロブリン遺伝子またはβ２ミクログロブリン遺伝子から選択されるＨＬＡ成分遺伝子のノックアウトを含む、請求項５３に記載の宿主細胞。

【請求項55】

前記染色体遺伝子ノックアウトが、ＴＣＲα可変領域遺伝子、ＴＣＲβ可変領域遺伝子、ＴＣＲ定常領域遺伝子またはそれらの組合せから選択されるＴＣＲ成分遺伝子のノックアウトを含む、請求項５３または５４に記載の宿主細胞。

【請求項56】

内在性ＴＣＲと比較して、Ｔ細胞上での前記結合タンパク質またはＴＣＲのより高い表面発現、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項57】

請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物。

【請求項58】

（ｉ）請求項３４〜５２のいずれか一項に記載の宿主細胞または（ｉｉ）請求項５７に記載の組成物の有効量を含む単位用量であって、前記宿主細胞が、必要に応じて約１０^７細胞／ｍ^２〜約１０^１１細胞／ｍ^２の用量でのものである、単位用量。

【請求項59】

（ｉ）少なくとも約３０％の操作されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約３０％の操作されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、ナイーブＴ細胞を実質的に含有しない、請求項５８に記載の単位用量。

【請求項60】

過剰増殖性障害を処置するための方法であって、（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＢＲＡＦＶ^６００Ｅペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質を含む組成物；（ｉｉ）請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞；（ｉｉｉ）請求項５７に記載の組成物；または（ｉｖ）請求項５８もしくは５９に記載の単位用量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、方法。

【請求項61】

前記過剰増殖性障害が、がんである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記がんが、ヘアリー細胞白血病、黒色腫、甲状腺がん、例えば低分化甲状腺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳頭がん、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫、および毛様細胞性星細胞腫から選択される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記組成物が、請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞を含む、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

過剰増殖性障害を有する対象の細胞におけるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現を特徴とする状態を処置するための養子免疫治療方法であって、請求項３４〜５６のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項５７に記載の組成物または請求項５８もしくは５９に記載の単位用量の有効量を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項65】

前記宿主細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏで改変される、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記宿主細胞が、前記対象にとって同種異系細胞、同系細胞または自己細胞である、請求項６４または６５に記載の方法。

【請求項67】

前記宿主細胞が、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

前記免疫系細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞またはそれらの任意の組合せである、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記免疫系細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項70】

前記細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項６８または６９に記載の方法。

【請求項71】

前記過剰増殖性障害が、がんである、請求項６４〜７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記がんが、ヘアリー細胞白血病、黒色腫、甲状腺がん、例えば甲状腺乳頭がんおよび低分化甲状腺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳頭がん、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫、および毛様細胞性星細胞腫、乳がん、卵巣がん、ランゲルハンス細胞組織球症、または肉腫（例えば、線維肉腫（線維芽細胞肉腫）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫；血管肉腫（血管の肉腫）、カポジ肉腫、脂肪肉腫、多形性肉腫、もしくは滑膜肉腫）から選択される、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

前記宿主細胞が、非経口投与される、請求項６４〜７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記宿主細胞の多数の用量を前記対象に投与することを含む、請求項６４〜７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記多数の用量が、約２〜約４週間の投与間隔で投与される、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

組換え宿主細胞が、約１０^７細胞／ｍ^２〜約１０^１１細胞／ｍ^２の用量で前記対象に投与される、請求項６４〜７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

サイトカインを投与することをさらに含む、請求項６４〜７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記サイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはそれらの任意の組合せである、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記サイトカインが、ＩＬ−２であり、前記宿主細胞と併せてまたは逐次的に投与される、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記宿主細胞がサイトカイン投与前に少なくとも３または４回、前記対象に投与されたことを条件に、前記サイトカインが逐次的に投与される、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記サイトカインが、ＩＬ−２であり、皮下投与される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記対象が、免疫抑制治療をさらに受けている、請求項６４〜８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記免疫抑制治療が、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せから選択される、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記対象が、骨髄非破壊的または骨髄破壊的造血細胞移植を受けた、請求項６４〜８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記対象に、前記骨髄非破壊的造血細胞移植の少なくとも３ヶ月後に前記宿主細胞が投与される、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記対象に、前記骨髄破壊的造血細胞移植の少なくとも２ヶ月後に前記宿主細胞が投与される、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

免疫抑制剤の阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６４〜８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記免疫抑制剤の前記阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ２、ＫＩＲ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＣＤ１６０、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組合せを阻害する、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記免疫抑制剤の前記阻害剤が、抗体もしくはその抗原結合断片、融合タンパク質、小分子、ＲＮＡｉ分子、リボザイム、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８７または８８に記載の方法。

【請求項90】

前記免疫抑制剤の前記阻害剤が、ピディリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＥＤＩ０６８０、ＡＭＰ−２２４、ＢＭＳ−９３６５５８、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ−９８６０１６、イピリムマブ、トレメリムマブ、アバタセプト、ベラタセプト、エノブリツズマブ、３７６．９６、抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくは抗原結合断片、リリルマブ、レボ−１−メチルトリプトファン、エパカドスタット、エブセレン、インドキシモド、ＮＬＧ９１９、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）−チラパザミン、Ｎ（オメガ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−オメガ−ヒドロキシ−ノル−１−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−ＮＯＨＡ、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、ＣＡ−１７０、ＣＯＭ９０２、ＣＯＭ７０１、もしくはその抗原結合断片、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニストの治療有効量を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６４〜９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記アゴニストが、ウレルマブ、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、ＭＥＤＩ０５６２、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＤＸ−１１２７、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＰ−８７０，８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、ＳＧＮ−４０、ＩＬ−２、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ ８８．２、ＪＴＸ−２０１１、Ｉｃｏｓ １４５−１、Ｉｃｏｓ ３１４−８またはそれらの任意の組合せから選択される、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

治療用抗体、化学療法、放射線治療、外科手術のうちの１つもしくは複数またはそれらの任意の組合せを前記対象に投与することをさらに含む、請求項６４〜９２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

米国政府所有権の記述
本発明は、米国国立衛生研究所（the National Institutes of Health）により与えられたＣＡ０１５７０４に基づいて米国政府の支援を受けてなされたものである。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表に関する記述

【0002】

本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４５４ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは１２６ ＫＢであり、２０１８年８月９日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

腫瘍特異的Ｔ細胞の養子移入は、既存の腫瘍を排除する魅力的な戦略であり、既存の腫瘍を排除して再発を予防するためにｉｎ ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞の頑強な集団の確立を必要とする（Stromnes et al., Immunol.Rev. 257:145, 2014）。近年、がんにおいて変異によって生じる抗原に対する免疫応答は、Ｔ細胞により認識され得ること、ならびにこれらのＴ細胞は、養子細胞治療および免疫チェックポイント阻害剤での処置に対する臨床応答を媒介し得ることの証拠が、増加している。そのような変異から生じる抗原は、正常な組織と比べてがんに対して完全に特異的であるため、およびまた他の抗原型に対するＴ細胞機能を制限することができる中枢性寛容機構を欠いているという理由で、免疫治療の特に魅力的な標的である。
しかし、自己または操作された同種異系腫瘍特異的ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の投与は、特定の患者では直接的な抗腫瘍活性を媒介し得る（Chapuis et al., Cancer Res. 72:LB-136, 2012; Chapuis et al., Sci. Transl.Med. 5:174ra127, 2013; Chapuis et al., Proc. Nat'l. Acad.Sci. U.S.A. 109:4592, 2012）^２〜４が、所望の特性を有する腫瘍反応性Ｔ細胞の同定および単離は、骨の折れる複雑な試みである（Stone and Kranz, Frontiers Immunol. 4:244, 2013; Chapuis et al., 2013; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; Ho et al., J. Immunol. Methods 310:40, 2006を参照されたい）。さらに、各患者またはドナーから単離されたＣＴＬのアビディティが変動しやすいことが、臨床試験における抗腫瘍有効性を制限する（Chapuis et al., 2013）。さらに、免疫応答につながる大部分の抗原特異的変異は、１個体のがんにのみに見られ、複数の患者には見られない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Stromnes et al., Immunol.Rev. 257:145, 2014

【非特許文献2】Chapuis et al., Cancer Res. 72:LB-136, 2012

【非特許文献3】Chapuis et al., Sci. Transl.Med. 5:174ra127, 2013

【非特許文献4】Chapuis et al., Proc. Nat'l. Acad.Sci. U.S.A. 109:4592, 2012

【非特許文献5】Stone and Kranz, Frontiers Immunol. 4:244, 2013

【非特許文献6】Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009

【非特許文献7】Ho et al., J. Immunol. Methods 310:40, 2006

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

ヘアリー細胞白血病、悪性黒色腫、甲状腺がん、肺がんおよび結腸がんなどの、様々ながんに向けた代替の抗原特異的ＴＣＲ免疫治療が、明らかに必要である。特に、がん特異的でもあり、がんに広く高頻度に見られもする抗原を標的とするＴＣＲ免疫治療が、必要とされている。今般開示される実施形態は、これらの要求に対処し、他の関連する利点を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1-1】図１Ａ〜１Ｉは、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}に特異的な患者由来ＣＤ４^＋Ｔ細胞の同定および特徴付けを示す。（１Ａ）左腸骨領域（左）および左大腿部（右）における再発腫瘍を示すポジトロン放出断層撮影。（１Ｂ〜１Ｄ）ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｔ細胞の特異性およびＨＬＡ拘束性：（１Ｂ）野生型および変異型ＢＲＡＦペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞とともにインキュベートした患者由来Ｔ細胞株によるＩＦＮ−γ産生；（１Ｃ）変異型ＢＲＡＦペプチドでパルスされた、または変異型もしくは野生型ＢＲＡＦ配列をコードするｍＲＮＡがトランスフェクトされた、自己Ｂ細胞の認識；（１Ｄ）ＨＬＡ遮断抗体の存在または非存在下での変異型ＢＲＡＦペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞の認識。（１Ｅ）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０４（ＤＲ４）またはＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２／ＤＱＡ１＊０３（ＤＱ３）での形質導入前および後の、患者とＨＬＡ−ＤＱがマッチしているＢ−ＬＣＬ株１３３１、およびＨＬＡミスマッチＢ−ＬＣＬ株ＶＡＶＹの、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞による認識。（１Ｆ）ＨＬＡ ＤＱＢ１＊０３アレルを発現する同種異系Ｂ−ＬＣＬ細胞株とともにインキュベートされ、示されている量の２１ｍｅｒ ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドでパルスされた、患者由来ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ放出。３回の技術的反復実験が行われた。（１Ｇ）ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドでパルスされた自己Ｂ細胞とともに、またはヒトＩＦＮ−γ ５００Ｕ／ｍｌでの前処置を伴うおよび伴わないで示されている腫瘍細胞株とともに、３日間インキュベートされた、患者由来ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｔ細胞によるＩＦＮーγ放出。（１Ｈ、１Ｉ）フローサイトメトリーによりアイソタイプ対照と比較して定量された、ＩＦＮ−γでの前処置を伴うおよび伴わない腫瘍細胞株上のＨＬＡ−ＤＱ（１Ｈ）およびＨＬＡ−ＤＲ（１Ｉ）の発現（平均蛍光強度）。実験は、示されているように技術的二重反復または三重反復で行われたものであり、２回の独立した実験の代表である。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【0007】

【図2-1】図２Ａ〜２Ｏは、ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞の特異性、および養子移入後の血液中のＴ細胞クローン型のＴＣＲシークエンシングを示す。（２Ａ）エリスポットアッセイによる、患者の黒色腫に存在する２０の非同義変異を含有する４０の２０ｍｅｒペプチドを包含するペプチドの１３のプールでパルスされた自己ＣＤ４０Ｌ活性化Ｂ細胞とともにインキュベートしたＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生。アッセイにおける各ペプチドの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。３回の技術的反復実験が行われた。（２Ｂ〜２Ｆ）２９の非同義変異を包含するタンデムミニ遺伝子でもしくは自己抗原チロシナーゼ、Ｍａｇｅ Ａ３、Ｍａｒｔ１、ＳＳＸ２およびＧＰ１００からのコード配列で形質導入されたＢ細胞とともにブレフェルジンＡの存在下でインキュベートされた（２Ｂ〜２Ｅ）または腫瘍関連自己抗原でパルスされた（２Ｆ）ＴＩＬによるＩＦＮ−γ産生。アッセイにおける各ペプチドの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。３回の技術的反復実験が行われた。（２Ｇ）擬似刺激（mock stimulation）、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド刺激後の、またはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド再刺激後にＩＦＮ−γ分泌細胞をソートした後の、末梢血単核細胞におけるＴＣＲ Ｖβ配列の頻度。（２Ｈ）処置前血液、腫瘍単個細胞懸濁液および患者に注入されたＴＩＬ産物のＴＣＲβシークエンシングにより定量されたＢＲＡＦ特異的Ｔ細胞のＴＣＲ Ｖβクローン型。（２Ｉ）存在率によりランク付けされたＴＩＬ産物におけるＴＣＲＶβ配列（グラフの右側の部分）。（２Ｊ）１０および２４ヶ月の時点で得られた処置前血液および処置後血液における（２Ｉ）からの上位３４のＴＩＬ ＴＣＲ Ｖβクローン型の頻度。（２Ｋ）処置前および処置後血液における指定抗原に特異的なＣＤ４^＋ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のＴＣＲ Ｖβクローン型の頻度。（２Ｌ〜２Ｏ）自己Ｂ細胞とともにインキュベートされたＴＩＬおよびＴＩＬからのＴ細胞に関するＴＣＲβシークエンシング、ならびにペプチドのタイル表示。（２Ｌ）チロシナーゼ、（２Ｍ）Ｍａｒｔ１、（２Ｎ）Ｍａｇｅ Ａ３および（２Ｏ）ＴＲＰ２に範囲指定され、ＩＦＮ−γ捕捉によりソートされた、ペプチドのタイル表示。ソートされた細胞に多く含まれていた抗原特異的ＴＣＲβ配列に囲み枠を付ける。

【図2-2】同上。

【図2-3】同上。

【図2-4】同上。

【図2-5】同上。

【図2-6】同上。

【図2-7】同上。

【図2-8】同上。

【0008】

【図3-1】図３Ａ〜３Ｃは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）での処置後のＢＲＡＦ特異的Ｔ細胞についての表現型分析を示す。（３Ａ）ＴＩＬから単球（ＣＤ１４^＋）、Ｂ細胞（ＣＤ１９^＋）および死細胞（ＶｉａＰｒｏｂｅ）を除外するためのダンプチャネルゲーティングスキーム。生存ＣＤ４＋Ｔ細胞がテトラマーおよびＣＤ４５ＲＡに対してプロットされた。（３Ｂ）テトラマー陽性および陰性であったＣＤ４５ＲＡ−メモリー細胞（ＣＤ４^＋の８８．１％）が、示されている細胞表面マーカーに対してプロットされた。数は、ゲートした領域内の細胞の百分率または各マーカーについてのテトラマー陽性細胞の百分率を示す。（３Ｃ）活性化（ＣＤ１５４＋）ＢＲＡＦ特異的Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色。

【図3-2】同上。

【図3-3】同上。

【図3-4】同上。

【0009】

【図4】図４Ａ〜４Ｂは、黒色腫応答性患者ＴＩＬの優勢ＶαおよびＶβ配列から得られた合成ＴＣＲが、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を発現する細胞を認識することを示す。（４Ａ）擬似刺激、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}刺激後の、またはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド再刺激後にＩＦＮ−γ分泌細胞をソートした後の、末梢血単核細胞におけるＴＣＲＢＶａ配列の頻度。（４Ｂ）合成ＴＣＲ構築物で形質導入され、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドでパルスされた、または変異型もしくは野生型ＢＲＡＦ配列をコードするｍＲＮＡがトランスフェクトされた、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２ Ｂ細胞株１３３１とともにインキュベートされた、２名の正常ドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生。示されているとおりの技術的反復実験数Ｎ＝２または３。

【0010】

【図5】図５は、患者ＴＩＬにおいて同定されたＴＣＲβおよびＴＣＲα遺伝子を使用して作成された４つのＴＣＲ（ｐＪＶ８８〜ｐＪＶ９１）のうちの１つで形質導入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を示す。左、抗原ペプチドなし。右、抗原ペプチド。

【0011】

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、初代ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞における異種ＢＲＡＦ特異的ＴＣＲの発現に対する内在性ＴＣＲ配列のＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトの効果を示す。（６Ａ）刺激されたＴ細胞に、ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢを標的とするＣａｓ９−ＲＮＰがトランスフェクトされ、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲをコードするＤＮＡで形質導入された。ＢＲＡＦ特異的ＴＣＲ発現は、Ｖｂｅｔａ３．１により測定され、ＴＣＲ発現は、抗ＣＤ３を使用して測定された。上のパネル：ＣＲＩＳＰＲ媒介ＴＣＲノックアウトを有さない（左）または有する（右）非改変細胞。下のパネル：ＣＲＩＳＰＲ媒介ＴＣＲノックアウトを有さない（左）または有する（右）形質導入細胞。（６Ｂ）テトラマー染色：内在性ＴＣＲの欠失を有するまたは有さないＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲで改変されたＴ細胞が、テトラマーへの結合について、非形質導入細胞（最も左側のピーク）および患者由来の抗原に特異的なＴ細胞クローン（最も右側のピーク）と比較された。

【発明を実施するための形態】

【0012】

ある特定の態様では、本開示は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）（例えば、ヒト白血球抗原、ＨＬＡ）に会合するＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原などの、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原と特異的に結合することができる、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）などの、結合タンパク質を提供する。本開示の結合タンパク質は、例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現を特徴とする過剰増殖性疾患、例えばがんを処置するための治療に有用である。

【0013】

背景として、がん関連変異によって生じる抗原は、治療的介入の魅力的な標的であるが、一般に、個々の患者に特有のものである。したがって、がんの必須「駆動因子」変異によって生じる抗原は、がん細胞に特異的でもあり、患者集団において高頻度に出現もするので、興味深い。ＢＲＡＦタンパク質は、細胞成長シグナル伝達に関与し、その一方で、変異型ＢＲＡＦは、多数のがんに関係付けられる（例えば、Frasca et al., Endocrine-Related Cancer 15:191(2008)を参照されたい）。特に、ＢＲＡＦ遺伝子の第１５番エクソンにおいて生じる置換変異Ｖ６００Ｅ（ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}）は、ＢＲＡＦを活性化して成長シグナル伝達経路を駆動し、これは発癌の初期事象である。この変異は、ヘアリー細胞白血病の全ての事例、悪性黒色腫症例の約半分、および進行した甲状腺がん、肺がんおよび結腸がんを有する患者の有意な数に見られる。

【0014】

本明細書に記載される組成物および方法には、ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現に関連する疾患および状態の処置への治療的有用性がある。そのような疾患には、様々な形態の過剰増殖性障害、例えば、ヘアリー細胞白血病、黒色腫、甲状腺がん（低分化甲状腺がんを含む）、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳頭がん、非ホジキンリンパ腫、膠芽腫、および毛様細胞性星細胞腫、乳がん、卵巣がん、ランゲルハンス細胞組織球症、および肉腫（例えば、線維肉腫（線維芽細胞肉腫）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫；血管肉腫（血管の肉腫）、カポジ肉腫、脂肪肉腫、多形性肉腫、および滑膜肉腫）が含まれる。これらの非限定的な例および関連する使用は、本明細書に記載され、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原特異的Ｔ細胞応答の、例えばＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドに特異的ＴＣＲを発現する組換えＴ細胞の使用による、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの刺激を含む。

【0015】

本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することは、本開示の理解の助けになり得る。さらなる定義は、本開示を通して示される。

【0016】

本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数の値、および適宜、それらの分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むと理解するべきである。また、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関して本明細書で列挙される任意の数値範囲は、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。本明細書で使用される用語「約」は、別段の指示がない限り、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「１つの（a）」および「１つの（an）」は、本明細書で使用される場合、列挙されている構成要素のうちの「１または複数」を指すと理解すべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、それらの選択肢のうち１つ、両方、またはそれらの任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（include）」、「有する」および「含む（comprise）」は、同義で使用され、これらの用語およびそれらの異表記は、非限定的と解釈されることを意図したものである。

【0017】

さらに、本明細書に記載される構造および置換基の様々な組合せから得られる個々の化合物または化合物の群は、あたかも各化合物または化合物の群が個々に示されたのと同程度に、本願により開示されると理解すべきである。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。

【0018】

用語「から本質的になる」は、「含む」と同等ではなく、特許請求された発明の明記された材料もしくはステップ、または特許請求された発明の基本的特徴に実質的に影響を与えない材料もしくはステップを指す。例えば、タンパク質のドメイン、領域もしくはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）またはタンパク質（これは、１もしくは複数のドメイン、領域もしくはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、組み合わせて、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の長さの多くても２０％（例えば、多くても１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合性タンパク質の標的結合親和性）に実質的に影響を与えない（すなわち、活性の低減が、５０％を超えない、例えば、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下または１％以下である）、伸長、欠失、変異またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端にある、またはドメイン間にあるアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。

【0019】

本明細書で使用される場合、「免疫系細胞」は、２つの主要な系列、骨髄系前駆細胞（これは、骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球を生じさせる）およびリンパ系前駆細胞（これは、リンパ系細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞を含むナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を生じさせる）、を生じさせる、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、および樹状細胞が挙げられる。マクロファージおよび樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ばれることもあり、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、ペプチドと複合体化したＡＰＣの表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面のＴＣＲと相互作用したときＴ細胞を活性化することができる特殊化した細胞である。

【0020】

「主要組織適合遺伝子複合体」（ＭＨＣ）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜通過α鎖（３つのαドメインを有する）と非共有結合的に会合しているβ２ミクログロブリンとを有するヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβ、で構成されており、これらの両方が膜にまたがっている。各鎖は、２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識される。ヒトＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる。ＨＬＡ−ＩＩ型は、ＤＰ、ＤＭ、ＤＯＡ、ＤＯＢ、ＤＱおよびＤＲを含む。様々なＨＬＡ型のサブユニットをコードする非常に多くのアレルが公知であり、そのようなアレルには、例えば、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３が含まれる。ある特定の実施形態では、本開示による結合タンパク質は、ＨＬＡ−ＤＱと複合体化したＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドを認識することができる。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、＊０３０２または＊０３０３を含む。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２を含む。さらなる実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３を含む。

【0021】

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する、免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；Ｔ_ＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現減少）、メモリーＴ細胞（Ｔ_Ｍ）（抗原を経験した、長寿命）およびエフェクター細胞（抗原を経験した、細胞傷害性）であり得る。Ｔ_Ｍは、さらに、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ；ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現減少）およびエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ_ＥＭ；ナイーブＴ細胞またはＴ_ＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現減少、およびＣＤ１２７の発現増加）のサブセットに分けることができる。

【0022】

エフェクターＴ細胞（Ｔ_Ｅ）は、抗原を経験したＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球であって、Ｔ_ＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現減少を有し、グランザイムおよびパーフォリンに対して陽性である、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。ヘルパーＴ細胞（Ｔ_Ｈ）は、サイトカインを放出することにより他の免疫細胞の活性に影響を与えるＣＤ４^＋細胞である。ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化することおよび抑制することができ、これら２つの機能のどちらが誘導されるのかは、他の細胞およびシグナルの存在に依存する。公知の技法を使用してＴ細胞を収集することができ、公知の技法により、例えば、抗体への親和性結合、フローサイトメトリーまたは免疫磁気選択により、様々な部分集団またはそれらの組合せを富化することまたは枯渇させることができる。他の例示的なＴ細胞としては、調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋（Ｆｏｘｐ３^＋）調節性Ｔ細胞およびＴｒｅｇ１７細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８^＋ＣＤ２８⁻、およびＱａ−１拘束Ｔ細胞が挙げられる。

【0023】

「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドと特異的に結合することができる免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（可変結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域および短い細胞質側テールを有する；例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3^rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照されたい）を指す。ＴＣＲは、細胞の表面にまたは可溶性形態で見られることがあり、一般に、α鎖およびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）、またはγ鎖およびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）を有するヘテロダイマーから構成される。免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、α鎖、β鎖）の細胞外部分は、次の２つの免疫グロブリンドメインを含む：Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶ_α、β鎖可変ドメインまたはＶβ；通常は、Ｋａｂａｔ番号付け（Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5^th ed.）に基づいてアミノ酸１〜１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣ_α、通常はＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣ_β、通常はＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）。また、免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられた相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci.U.S.A.87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988を参照されたく、Lefranc et al., Dev.Comp.Immunol.27:55, 2003も参照されたい）。ＴＣＲ可変ドメイン配列を番号付けスキーム（例えば、Kabat, EU, International Immunogenetics Information System (IMGT) and Aho）に合わせてアラインメントすることができ、これにより、Ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ Ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウェアツール（2016, Bioinformatics 15:298-300）を使用する等価な残基位置へのアノテーションの付与および異なる分子の比較が可能になり得る。番号付けスキームにより、ＴＣＲ可変ドメイン内のフレームワーク領域およびＣＤＲの標準化された描写が得られる。

【0024】

ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見られ、ＣＤ３複合体と会合している。本開示で使用される場合のＴＣＲの供給源は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物からのものであり得る。

【0025】

「ＣＤ３」は、６つの鎖の多タンパク質複合体として当技術分野において公知である（Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p. 172 and 178, 1999を参照されたい）。哺乳動物では、この複合体は、１つのＣＤ３γ鎖と、１つのＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖の１つのホモダイマーとを含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖の正荷電Ｔ細胞受容体鎖との会合を可能にする特性である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の細胞内テールは、各々、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知の単一の保存モチーフを含むが、各ＣＤ３ζ鎖は、３つのＩＴＡＭを有する。理論により拘束されることを望まないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能にとって重要であると考えられる。本開示で使用される場合のＣＤ３は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種からのものであり得る。

【0026】

本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」は、ＣＤ３とＴＣＲとの会合により形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、１つのＣＤ３γ鎖と、１つのＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖の１つのホモダイマーと、１つのＴＣＲα鎖と、１つのＴＣＲβ鎖とで構成され得る。あるいは、ＴＣＲ複合体は、１つのＣＤ３γ鎖と、１つのＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖の１つのホモダイマーと、１つのＴＣＲγ鎖と、１つのＴＣＲδ鎖とで構成され得る。

【0027】

「ＴＣＲ複合体の成分」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγもしくはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εもしくはＣＤ３ζ）、または２つまたはそれより多くのＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖により形成される複合体（例えば、ＴＣＲαとＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγとＴＣＲδの複合体、ＣＤ３εとＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γとＣＤ３εの複合体、もしくはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δと２つのＣＤ３ε鎖とのサブ−ＴＣＲ複合体）を指す。

【0028】

「ＣＤ４」は、ＴＣＲの抗原提示細胞との通信を補助する免疫グロブリン共受容体糖タンパク質を指す（Campbell & Reece, Biology 909 (Benjamin Cummings, Sixth Ed., 2002)；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０１７３０を参照されたい）。ＣＤ４は、免疫細胞、例えば、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見られ、前記細胞表面で発現される４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を含む。抗原提示中に、ＣＤ４は、ＴＣＲ複合体とともに動員されて、ＭＨＣＩＩ分子の異なる領域と結合する（ＣＤ４はＭＨＣＩＩ β２に結合し、その一方でＴＣＲ複合体はＭＨＣＩＩ α１／β１に結合する）。理論により拘束されることを望まないが、ＴＣＲ複合体への近接は、ＣＤ４会合キナーゼ分子によるＣＤ３の細胞質ドメインに存在する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を可能にすると考えられる。この活性は、活性化されたＴＣＲにより生成されるシグナルを増幅して様々なタイプのＴヘルパー細胞を産生すると考えられる。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８共受容体」または「ＣＤ８」は、アルファ・アルファホモダイマーまたはアルファ・ベータヘテロダイマーのどちらかとしての、細胞表面糖タンパク質ＣＤ８を意味する。ＣＤ８共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８^＋）の機能を補助し、その細胞質チロシンリン酸化経路経由でのシグナル伝達によって機能する（Gao and Jakobsen, Immunol.Today 21:630-636, 2000; Cole and Gao, Cell. Mol.Immunol.1:81-88, 2004）。ヒトの場合、五（５）つの異なるＣＤ８ベータ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ１０９６６を参照されたい）および単一のＣＤ８アルファ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ０１７３２を参照されたい）がある。

【0030】

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原へのＴＣＲの結合に関与する、ＴＣＲα鎖またはβ鎖（またはγδＴＣＲについてはγ鎖およびδ鎖）のドメインを指す。ネイティブＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶαおよびＶβ）は、類似の構造を一般に有し、一般に、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。Ｖαドメインは、２つの別々のＤＮＡセグメント、可変遺伝子セグメントと連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｊ）、によりコードされ、Ｖβドメインは、３つ別々のＤＮＡセグメント、可変遺伝子セグメント、多様性遺伝子セグメントと連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｄ−Ｊ）、によりコードされる。抗原結合特異性を付与するには単一のＶαまたはＶβドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合するＴＣＲは、その抗原に結合するＴＣＲからのＶαまたはＶβドメインを使用して相補的ＶαまたはＶβドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることにより、単離することができる。

【0031】

用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与するＴＣＲ可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは当技術分野において公知である。一般に、各α鎖可変領域には３つのＣＤＲ（αＣＤＲ１、αＣＤＲ２、αＣＤＲ３）があり、各β鎖可変領域には３つのＣＤＲ（βＣＤＲ１、βＣＤＲ２、βＣＤＲ３）がある。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要ＣＤＲであると考えられる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、主としてＭＨＣと相互作用する。ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１〜４のうちのいずれか１つに示されるようなＶαドメインのαＣＤＲ１、αＣＤＲ２および／またはαＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号５〜７のうちのいずれか１つに示されるようなＶβドメインのβＣＤＲ１、βＣＤＲ２および／またはβＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0032】

本明細書で使用される場合の「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する免疫原性分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫適格細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化、または両方に関与し得る。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、糖ペプチド、ポリペプチド、糖ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質などであり得る。抗原を合成、組換えにより産生、または生体試料から得ることができることは、容易に分かる。１つまたは複数の抗原を含有することができる例示的な生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、生体液、またはそれらの組合せが挙げられる。抗原は、抗原を発現するように改変されたまたは遺伝子操作された細胞によって産生され得る。例示的な抗原としては、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}が挙げられる。

【0033】

用語「エピトープ」または「抗原エピトープ」は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体または他の結合分子、ドメインもしくはタンパク質などの、同族結合分子により認識され、特異的に結合される、任意の分子、構造、アミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面集団を含有し、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有することができる。

【0034】

「結合ドメイン」（「結合領域」または「結合部分」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的（例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}）と特異的かつ非共有結合的に会合、一体化または化合する能力を有する分子またはその一部分（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質）を指す。結合ドメインは、生体分子、分子複合体（すなわち、２つもしくはそれより多くの生体分子を含む複合体）または目的の他の標的に対する、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。例示的な結合ドメインとしては、単鎖免疫グロブリン可変領域（例えば、ｓｃＴＣＲ、ｓｃＦｖ）、受容体細胞外ドメイン、リガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）、または生体分子、分子複合体もしくは目的の他の標的と結合するそれらの特異的能力のために選択される合成ポリペプチドが挙げられる。

【0035】

本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「に特異的な」は、試料中のいずれの他の分子または成分と有意に会合も一体化もしない、１０^５Ｍ^−１に等しいかまたはそれより高い（これは、この会合反応についてのオンレート［Ｋ_ｏｎ］のオフレート［Ｋ_ｏｆｆ］に対する比に相当する）親和性またはＫ_ａ（すなわち、単位が１／Ｍである、特定の結合相互作用の平衡会合定数）での結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ受容体）または結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と標的分子の会合または一体化を指す。結合タンパク質または結合ドメイン（またはそれらの融合タンパク質）は、「高親和性」結合タンパク質もしくは結合ドメイン（もしくはそれらの融合タンパク質）として分類されることもあり、または「低親和性」結合タンパク質もしくは結合ドメイン（もしくはそれらの融合タンパク質）として分類されることもある。「高親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、少なくとも１０^７Ｍ^−１、少なくとも１０^８Ｍ^−１、少なくとも１０^９Ｍ^−１、少なくとも１０^１０Ｍ^−１、少なくとも１０^１１Ｍ^−１、少なくとも１０^１２Ｍ^−１、または少なくとも１０^１３Ｍ^−１のＫ_ａを有する、結合タンパク質または結合ドメインを指す。「低親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、最大で１０^７Ｍ^−１、最大で１０^６Ｍ^−１、最大で１０^５Ｍ^−１のＫ_ａを有する、結合タンパク質または結合ドメインを指す。あるいは、単位がＭである、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋ_ｄ）（例えば、１０^−５Ｍ〜１０^−１３Ｍ）として、親和性を定義することができる。

【0036】

ある特定の実施形態では、受容体または結合ドメインは、「増強された親和性」を有することができ、この「増強された親和性」は、野生型（または親）結合ドメインよりも標的抗原と強く結合する、選択もしくは操作された受容体または結合ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、野生型結合ドメインよりも高い標的抗原に対するＫ_ａ（平衡会合定数）に起因することもあり、野生型結合ドメインのものより低い標的抗原に対するＫ_ｄ（解離定数）に起因することもあり、野生型結合ドメインのものよりも低い標的抗原に対するオフレート（ｋ_ｏｆｆ）に起因することもあり、またはそれらの組合せであることもある。ある特定の実施形態では、増強された親和性ＴＣＲは、Ｔ細胞などの特定の宿主細胞における発現を増強するためにコドン最適化され得る（Scholten et al., Clin.Immunol.119:135, 2006）。

【0037】

特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための、および結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための、様々なアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心分離、分光法および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析が、公知である（例えば、Scatchard et al., Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res.53:2560, 1993；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号または対応特許を参照されたい）。親和性または見かけの親和性または相対親和性を評価するアッセイも公知である。ある特定の例では、ＴＣＲの見かけの親和性は、様々な濃度のテトラマーとの結合を評定することにより、例えば、標識されたテトラマーを使用してフローサイトメトリーにより測定される。一部の例では、ＴＣＲの見かけのＫ_Ｄは、ある濃度範囲の標識されたテトラマーの２倍希釈物を使用して測定され、続いて非線形回帰により結合曲線が決定され、半最大結合を生じさせたリガンドの濃度として見かけのＫ_Ｄが決定される。

【0038】

用語「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質」は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原またはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体、例えば、細胞表面のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原またはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原：ＨＬＡ複合体と特異的に結合するが、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異を含有しないＢＲＡＦペプチドを含む細胞表面のＨＬＡ複合体には結合しない、タンパク質またはポリペプチドを指す。

【0039】

ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有ペプチド：ＨＬＡ複合体（またはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有ペプチド：ＭＨＣ複合体）に、約１０^−８Ｍ未満、約１０^−９Ｍ未満、約１０^−１０Ｍ未満、約１０^−１１Ｍ未満、約１０^−１２Ｍ未満、もしくは約１０^−１３Ｍ未満のＫ_ｄで、または本明細書において提供される例示的なＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質、例えば、本明細書において提供されるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲのいずれかによって示される親和性と、例えば、同じアッセイによって測定して、ほぼ同じである、そのような親和性と少なくともほぼ同じである、もしくはそのような親和性より大きいかほぼそのような親和性である親和性で、結合する。ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的免疫グロブリンスーパーファミリー結合タンパク質またはその結合部分を含む。

【0040】

用語「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}結合ドメイン」または「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}結合断片」は、特異的ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}結合を担う、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質のドメインまたは一部分を指す。単独でのＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合ドメイン（すなわち、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質のいずれの他の部分も有さない）は、可溶性であり得、約１０^−８Ｍ未満、約１０^−９Ｍ未満、約１０^−１０Ｍ未満、約１０^−１１Ｍ未満、約１０^−１２Ｍ未満、または約１０^−１３Ｍ未満のＫ_ｄでＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}（例えば、ＭＨＣ受容体分子またはその機能的断片との複合体内の）と結合することができる。例示的なＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合ドメインとしては、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ｓｃＴＣＲ（例えば、単鎖αβＴＣＲタンパク質、例えば、Ｖα−Ｌ−Ｖβ、Ｖβ−Ｌ−Ｖα、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖα、またはＶα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ（ここで、ＶαおよびＶβは、それぞれ、ＴＣＲαおよびβ可変ドメインであり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、ＴＣＲαおよびβ定常ドメインであり、Ｌは、リンカーである））、および抗ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ＴＣＲまたは抗体に由来し得る本明細書に記載のｓｃＦｖ断片が挙げられる。

【0041】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、リンパ球または他の細胞型）による抗原プロセシングの原理、および免疫適合性（例えば、抗原提示に関連するＭＨＣ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の形態を共有する）ＡＰＣとＴ細胞との間の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束性の提示を含む、ＡＰＣによるＴ細胞への抗原提示の原理は、十分確立されている（例えば、Murphy, Janeway's Immunobiology (8^th Ed.)2011 Garland Science, NY; chapters 6, 9 and 16を参照されたい）。例えば、サイトゾルに由来するプロセシングされた抗原ペプチド（例えば、腫瘍抗原、細胞内病原体）は、一般に、約７アミノ酸長〜約１１アミノ酸長であり、クラスＩ ＭＨＣ分子と会合するが、小胞系においてプロセシングされたペプチド（例えば、細菌、ウイルス）は、一般に、長さに約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸の幅があり、クラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合する。

【0042】

「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原」または「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原」または「ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有ペプチド抗原」は、長さ約７アミノ酸〜約２０アミノ酸の範囲であり、Ｖ６００Ｅ置換変異を含む、ＢＲＡＦタンパク質の天然にまたは合成により産生される部分（例えば、完全長野生型ＢＲＡＦの６００位に対応する残基におけるバリンの代わりにグルタミン酸を含む、ＢＲＡＦ^{５９７〜６０３}またはＢＲＡＦ^{５９０〜６１０}からのペプチド；例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｐ１５０５６およびＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ識別子ＮＰ＿００４３２４．２を参照されたい）を指し、これは、ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）分子と複合体を形成することができ、そのような複合体は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＭＨＣ（例えば、ＨＬＡ）複合体に特異的な結合タンパク質と結合することができる。例示的なＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原としては、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。

【0043】

「リンカー」は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域またはモチーフを接続するアミノ酸配列であって、結果として生じるポリペプチドが、標的分子に対する特異的結合親和性を保持する（例えば、ｓｃＴＣＲ）ように、またはシグナル伝達活性を保持する（例えば、ＴＣＲ複合体）ように、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のスペーサー機能を提供することができる、アミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態では、リンカーは、約２〜約３５アミノ酸、例えば、または約４〜約２０アミノ酸または約８〜約１５アミノ酸または約１５〜約２５アミノ酸から構成される。

【0044】

「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」は、ポリペプチドの２つの隣接するモチーフ、領域またはドメイン間、例えば、結合ドメインと隣接定常ドメインとの間、またはＴＣＲ鎖と隣接自己切断ペプチドとの間の、１または複数（例えば、約２〜１０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物設計の結果として生じ得る（例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子の構築中の制限酵素部位の使用の結果として生じるアミノ酸残基）。

【0045】

「変更されたドメイン」または「変更されたタンパク質」は、少なくとも８５％（例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％）の、野生型のモチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、野生型のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲα定常ドメイン、ＴＣＲβ定常ドメイン）に対する同一でない配列同一性を有する、モチーフ、領域、ドメイン、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。

【0046】

本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳により生成された断片、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用またはエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成された断片のいずれかを指す。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲにより産生される。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）、または両方の組合せである、モノマーで構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分またはピリミジンもしくはプリン塩基部分における修飾あるいはそのような部分の置き換えを有することができる。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合により連結させることができ、またはそのような連結の類似体により連結させることができる。ホスホジエステル連結の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

【0047】

用語「単離された」は、材料がその元の環境（例えば、その材料が天然に存在する場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系内に共存する材料の一部または全てから分離された同じ核酸またはポリペプチドは、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部であることもあり、および／またはそのような核酸もしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であることもあるが、それでもやはり、そのようなベクターもしくは組成物が核酸もしくはポリペプチドの天然環境の一部でないという点で単離されていることであり得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、このセグメントには、コード領域の前および後の領域（「リーダーおよびトレーラー」）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。

【0048】

本明細書で使用する場合、用語「組換え」は、人間の介在により遺伝子操作された細胞、微生物、核酸分子もしくはベクター、すなわち、異種核酸分子の導入により、改変された細胞、改変された微生物、修飾された核酸分子、もしくは修飾されたベクターを指すか、または内在性核酸分子もしくは遺伝子の発現が制御されるように、調節解除されるように、欠失されるように、減弱されるように、もしくは構成的になるように変更された、細胞もしくは微生物を指す。人間が生じさせる遺伝子変更は、例えば、１もしくは複数のタンパク質もしくは酵素をコードする核酸分子（これは、発現制御エレメント、例えばプロモーターを含み得る）を導入する修飾、または他の核酸分子付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質に対する他の機能的破壊もしくは付加を含み得る。例示的な修飾としては、参照または親分子からの異種または同種ポリペプチドのコード領域またはその機能的断片における修飾が挙げられる。

【0049】

本明細書で使用される場合、「変異」は、参照または野生型核酸分子またはポリペプチド分子とそれぞれ比較したときの核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入または欠失を含む、配列のいくつかの異なるタイプの変化をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、変異は、１つもしくは３つのコドンもしくはアミノ酸の置換、１つ〜約５つのコドンもしくはアミノ酸の欠失、またはそれらの組合せである。

【0050】

「保存的置換」は、あるアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸に代えての置換として、当技術分野では認識されている。例示的な保存的置換は、当技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３、第１０頁；Lehninger, Biochemistry, 2^nd Edition; Worth Publishers, Inc. NY, NY, pp.71-77, 1975; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA, p. 8, 1990を参照されたい）。

【0051】

用語「構築物」は、組換え核酸分子を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在することもあり、またはゲノムに組み込まれていることもある。「ベクター」は、別の核酸分子を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクターであることもあり、または染色体の、非染色体の、半合成のもしくは合成の核酸分子を含み得る線状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であることもある。例示的なベクターは、自律複製することができるもの（エピソームベクター）、または自体が連結されている核酸分子を発現させることができるもの（発現ベクター）である。

【0052】

ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられ、二本鎖ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）が含まれる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。

【0053】

「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子送達のためのＨＩＶベースのレンチウイルスベクターであって、組込み型であることもあり、または非組込み型であることもあり、比較的大きいパッケージング容量を有し、様々な異なる細胞型に形質導入することができる、レンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、産生細胞内への３つ（パッケージング、エンベロープおよび移入）またはそれより多くのプラスミドの一過性トランスフェクション後に通常は生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面の受容体との相互作用によって標的細胞に侵入する。侵入すると、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖線状ウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡ中へのウイルス組込みの基質である。

【0054】

用語「作動可能に連結された」は、１つの核酸分子の機能が他の核酸分子による影響を受けるような、単一核酸断片上の２つまたはそれより多くの核酸分子の会合を指す。例えば、プロモーターとコード配列は、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、作動可能に連結されている。「連結されていない」は、会合している遺伝子エレメントが、互いに密接に会合しておらず、１つの遺伝子エレメントの機能が他の遺伝子エレメントに影響を与えないことを意味する。

【0055】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、好適な宿主において核酸分子の発現を生じさせることができる好適な制御配列に作動可能に連結されている核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、そのような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製および機能することができ、または一部の場合には、自体を宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」および「ベクター」は、同義で使用されることが多い。

【0056】

用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが、遺伝子などの核酸分子のコード配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組合せを含み得る。

【0057】

核酸分子を細胞に挿入する文脈での用語「導入される／された」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸分子を細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込むことができる、自律レプリコンに変換することができる、または（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡを）一過性に発現することができる、真核または原核細胞への核酸分子の組込みへの言及を含む。

【0058】

本明細書で使用される場合、「異種」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞にとってネイティブではないが、宿主細胞からの核酸分子または核酸分子の部分と相同であり得る、核酸分子または核酸分子の部分を指す。異種核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種からであり得る。ある特定の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに、例えば、コンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどにより付加され（すなわち、内在性でもネイティブでもない）、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれることもあり、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミド形態もしくは他の形態の自己複製ベクターとして）存在することもあり、複数のコピーで存在することもある。加えて、「異種」は、宿主細胞が相同のタンパク質または活性をコードする場合であっても、宿主細胞に導入された異種ポリヌクレオチドによりコードされている非ネイティブの酵素、タンパク質または他の活性を指す。

【0059】

本明細書に記載されるように、１つより多くの異種核酸分子を、別々の核酸分子として、複数の個々に制御された遺伝子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組合せとして、宿主細胞に導入することができる。例えば、本明細書において開示されるように、宿主細胞を、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原ペプチドに特異的な所望の結合タンパク質（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）をコードする２つまたはそれより多くの異種核酸分子を発現するように、改変することができる。２つまたはそれより多くの異種核酸分子が宿主細胞に導入される場合、これら２つまたはそれより多くの異種核酸分子が、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターで）導入されることもあり、別々のベクターで宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位に組み込まれることもあり、またはそれらの任意の組合せであることもあることは理解される。言及された異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指し、宿主細胞に導入される別々の核酸分子の数を指さない。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「内在性」または「ネイティブ」は、宿主細胞内に通常は存在する遺伝子、タンパク質または活性を指す。さらに、親遺伝子、タンパク質または活性と比較して変異、過剰発現、シャッフル、重複または別様に変更された遺伝子、タンパク質または活性は、それでもやはり、その特定の宿主細胞にとって内在性またはネイティブであると見なされる。例えば、第１の遺伝子からの内在性対照配列（例えば、プロモーター、翻訳減弱配列）を使用して、第２のネイティブ遺伝子または核酸分子の発現を変更または調節することができ、この第２のネイティブ遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における通常の発現または調節とは異なる。

【0061】

用語「相同（の）」または「相同体」は、宿主細胞、種もしくは株に見られる、または宿主細胞、種もしくは株から得られる、分子または活性を指す。例えば、異種ポリヌクレオチドは、ネイティブ宿主細胞遺伝子と相同であることがあり、変更された発現レベル、異なる配列、変更された活性、またはそれらの任意の組合せを必要に応じて有することがある。

【0062】

「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、配列のアラインメントを行い、必要な場合、最大の配列同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後の、別の参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である１配列中のアミノ酸残基の百分率であって、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と見なさない百分率を指す。配列同一性百分率値は、パラメーターをデフォルト値に設定して、Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402により定義されたようにＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウェアを使用して、生成することができる。

【0063】

本明細書で使用される場合、「造血前駆細胞」は、造血幹細胞または胎児組織に由来し得る細胞であって、成熟細胞型（例えば、免疫系細胞）へとさらに分化することができる細胞である。例示的な造血前駆細胞としては、ＣＤ２４^ＬｏＬｉｎ⁻ＣＤ１１７^＋表現型を有するもの、または胸腺に見られるもの（前駆胸腺細胞と呼ばれる）が挙げられる。

【0064】

本明細書で使用される場合、用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、抗ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ＴＣＲ）を産生するために異種核酸分子での遺伝子修飾の標的とされる細胞（例えば、Ｔ細胞）または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば異種タンパク質の生合成に関係するまたは関係しない所望の特性を付与する他の遺伝子修飾（例えば、検出可能なマーカーの組み入れ；内在性ＴＣＲの欠失、変更もしくは短縮化；または共刺激因子発現の増加）を、必要に応じて、既に有することもあり、または含むように修飾されることもある。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原ペプチドに特異的なＴＣＲα鎖をコードする異種核酸分子を形質導入したヒト造血前駆細胞である。

【0065】

本明細書で使用される場合、「過剰増殖性障害」は、正常または非罹患細胞と比較して過剰な成長または増殖を指す。例示的な過剰増殖性障害としては、腫瘍、がん、新生物組織、癌、肉腫、悪性細胞、前悪性細胞、および非新生物性または非悪性過剰増殖性障害（例えば、腺腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、血管腫、線維症、再狭窄、ならびに自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、炎症性腸疾患など）が挙げられる。
ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質

【0066】

ＢＲＡＦ（Ｂ−ＲＡＦ１、ＢＲＡＦ１、ＮＳ７、ＲＡＦＢ１、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ癌原遺伝子、およびセリン／トレオニンキナーゼとしても公知）は、ＢＲＡＦ遺伝子によりコードされる７６６アミノ酸タンパク質を指す。ヒト野生型ＢＲＡＦの転写物配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ識別子ＮＭ＿００４３３３．４（配列番号７８）に示されており、タンパク質配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ識別子ＮＰ＿００４３２４．２（配列番号３６）に示されている。ＢＲＡＦは、成長シグナル伝達タンパク質キナーゼのＲａｆキナーゼファミリーのメンバーであり、細胞分裂、分化および分泌に影響を与えるＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の調節に関与する。構造に関しては、ＢＲＡＦは、Ｒａｆキナーゼに特有の３つの保存ドメインで構成されている：Ｒａｓ−ＧＴＰ結合自己調節ドメイン；セリンリッチヒンジ領域；およびタンパク質基質上のコンセンサス配列をリン酸化する触媒性キナーゼドメイン（それぞれ、ＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３）。活性Ｂ−Ｒａｆは、ダイマーを形成する。

【0067】

Ｖ６００Ｅ変異を含む変異形態のＢＲＡＦキナーゼ（ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}）は、黒色腫症例の４０％、結腸直腸がん症例の１０％、および非小細胞肺がん症例の１％を含む、非常に多くの新生物性状態に存在する発癌性駆動因子であり、腫瘍細胞の成長および生存を促進する構成的シグナル伝達をもたらす。小分子ＢＲＡＦ阻害剤は、黒色腫にはある程度の有効性があるが、代替シグナル伝達経路の補充により、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}タンパク質の発現を損なうことなく耐性が発生する。Shi et al., Cancer Disc.4(1):80 (2014)を参照されたい。

【0068】

ある特定の態様では、本開示は、（ａ）配列番号２９〜３２のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列、または最大で５つのアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を有する配列番号２９〜３２のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変（Ｖα）ドメインと、ＴＣＲβ鎖可変（Ｖβ）ドメインとを含む結合タンパク質；（ｂ）Ｖαドメインと、配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列、または最大で５つのアミノ酸置換、挿入および／もしくは欠失を有する配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、Ｖβドメインとを含む結合タンパク質；または（ｃ）（ａ）のＶαドメインと（ｂ）のＶβドメインとを含む結合タンパク質であって、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異を含有するＢＲＡＦペプチドを含む細胞表面のＨＬＡ複合体と特異的に結合することができ、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異を含有しないＢＲＡＦペプチドを含む細胞表面のＨＬＡ複合体には結合しない、結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱを含む。

【0069】

ある特定の実施形態では、（ａ）Ｖαドメインは、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｂ）Ｖαドメインは、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｃ）Ｖαドメインは、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｄ）Ｖαドメインは、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｅ）Ｖαドメインは、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｆ）Ｖαドメインは、配列番号２９のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｇ）Ｖαドメインは、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｈ）Ｖαドメインは、配列番号３０のＣＤＲ３アミノ酸を含み、Ｖβドメインは、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｉ）Ｖαドメインは、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸を含み、Ｖβドメインは、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｊ）Ｖαドメインは、配列番号３１のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３５のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；（ｋ）Ｖαドメインは、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３３のＣＤＲ３アミノ酸配列を含むか；または（ｌ）Ｖαドメインは、配列番号３２のＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号３４のＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0070】

ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体などの、ペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＴＣＲにより認識され、ＴＣＲによりＶαおよびＶβドメインを介して結合される。リンパ球発生中に、Ｖαエクソンは、異なる可変および連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｊ）からアセンブリされ、Ｖβエクソンは、異なる可変、多様性および連結遺伝子セグメント（Ｖ−Ｄ−Ｊ）からアセンブリされる。ＴＣＲα染色体遺伝子座は、７０〜８０の可変遺伝子セグメントおよび６１の連結遺伝子セグメントを有する。ＴＣＲβ染色体遺伝子座は、５２の可変遺伝子セグメント、および単一の多様性遺伝子セグメントを各々が含有する２つの別々のクラスターを、６または７つの連結遺伝子セグメントとともに有する。機能性ＶαおよびＶβ遺伝子エクソンは、Ｖαについては可変遺伝子セグメントと連結遺伝子セグメントの組換えにより生成され、Ｖβについては可変遺伝子セグメントと多様性遺伝子セグメントおよび連結遺伝子セグメントの組換えにより生成される。

【0071】

ＶαおよびＶβドメイン各々は、ペプチド−ＭＨＣ複合体と接触する相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変ループを含む。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、可変遺伝子セグメント内にコードされるが、ＣＤＲ３は、Ｖαについては可変および連結セグメントにわたる領域、またはＶβについては可変、多様性および連結セグメントにわたる領域によりコードされる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２と比較して、ＣＤＲ３は、組換えプロセス中のヌクレオチドの付加および損失のため、多様性が有意に大きい。

【0072】

ＴＣＲ可変ドメイン配列を番号付けスキーム（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｏｔｈｉａ、およびＡｈｏ）に合わせてアラインメントすることができ、これにより、ＡＮＡＲＣＩソフトウェアツール（2016, Bioinformatics 15:298-300）を使用する等価な残基位置へのアノテーションの付与および異なる分子の比較が可能になる。番号付けスキームにより、ＴＣＲ可変ドメイン内のフレームワーク領域およびＣＤＲの標準化された描写が得られる。

【0073】

したがって、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を対応する可変遺伝子セグメント（例えば、ＴＣＲＢＶ２８−０１、ＴＣＲＡＶ２１−０１、ＴＣＲＡＶ２６−０１、ＴＣＲＡＶ１２−０２アレル）から推定することができる。ある特定の実施形態では、（ａ）Ｖα ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み、Ｖαドメインは、配列番号１１に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、ＣＤＲ１アミノ酸配列およびＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含むか、（ｂ）Ｖα ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含み、Ｖαドメインは、配列番号１２に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、ＣＤＲ１アミノ酸配列およびＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含むか、（ｃ）Ｖα ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、Ｖαドメインは、配列番号１３に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、ＣＤＲ１アミノ酸配列およびＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含むか、または（ｄ）Ｖα ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含み、Ｖαドメインは、配列番号１３に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、ＣＤＲ１アミノ酸配列およびＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｖβ ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含み、Ｖβドメインは、配列番号８に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる、ＣＤＲ１アミノ酸配列およびＣＤＲ２アミノ酸配列をさらに含む。

【0074】

ＴＣＲ ＶαおよびＶβドメインの結合対を同定する方法は、例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１６／１６１２７３；Redmond et al., 2016, Genome Med.8: 80; Munson et al., 2016, Proc. Natl.Acad.Sci.113:8272-7; Kim et al., 2012, PLoS ONE 7:e37338に記載されている方法を含む（これらの参考文献からの方法の各々は、その全体が参照により組み込まれる）。したがって、本明細書に記載されるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｖβドメイン（例えば、配列番号３３〜３５のいずれか１つに示されるようなＣＤＲ３を含むＶβドメイン）のためのＶαドメイン、または逆にＶαドメインのためのＶβドメインを、同定することができる。

【0075】

本明細書に記載されるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、天然に存在する結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）と比べて１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し得る。アミノ酸の保存的置換は公知であり、自然に起こることもあり、または結合タンパク質もしくはＴＣＲが組換えにより産生されるときに導入されることもある。アミノ酸置換、欠失および挿入は、変異誘発法を使用してタンパク質に導入することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 2001を参照されたい）。オリゴヌクレオチド指向性部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順を利用して、所望される置換、欠失または挿入に応じて変化した特定のコドンを有する変更されたポリヌクレオチドを得てもよい。あるいは、ランダムまたは飽和変異誘発技法、例えば、アラニンスキャニング変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、およびオリゴヌクレオチド指向性変異誘発を使用して、免疫原ポリペプチドバリアントを調製することができる（例えば、Sambrook et al.、上掲を参照されたい）。

【0076】

当技術分野において公知の様々な基準は、ペプチドまたはポリペプチド中の特定の位置において置換されているアミノ酸が保存的である（または類似している）かどうかを示す。例えば、類似のアミノ酸または保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられることである。類似のアミノ酸は、次のカテゴリーに含まれ得る：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）。分類することがより困難であると考えられるプロリンは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびアラニン）と特性を共有する。ある特定の状況では、グルタミンでのグルタミン酸の置換、またはアスパラギンでのアスパラギン酸の置換は、グルタミンおよびアスパラギンがそれぞれグルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で類似の置換と見なしてよい。当技術分野において理解されているように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸代用物を第２のポリペプチドの配列と（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、または本明細書に記載される、および当技術分野において実施されている、他のアルゴリズムを使用して）比較することにより、決定される。

【0077】

したがって、ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質は、配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも約９９．９％）同一であるＶαドメインを含み、配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも約９９．９％）同一であるＶβドメインを含み、ただし、（ａ）ＣＤＲの少なくとも３または４つが変異を有さず、（ｂ）変異を有するＣＤＲは、アミノ酸置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを最大で３つしか有さない。ある特定の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１〜４のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、Ｖβドメインは、配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５〜７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。

【0078】

特定の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。

【0079】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。

【0080】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。

【0081】

特定の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。

【0082】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。

【0083】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。

【0084】

特定の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。

【0085】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。

【0086】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。

【0087】

特定の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。

【0088】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる。

【0089】

他の実施形態では、Ｖαドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、Ｖβドメインは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。

【0090】

さらなる実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、ＴＣＲ、ＴＣＲの抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体である。「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲとも呼ばれる）は、膜貫通ドメインに連結されている抗原結合ドメイン（例えば、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様分子から得られるもしくは由来する抗原結合ドメイン、例えば、がん抗原に特異的な抗体もしくはＴＣＲに由来するｓｃＦｖ、またはＮＫ細胞からのキラー免疫受容体から得られるまたは由来する抗原結合ドメイン）と１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインとを含む（必要に応じて共刺激ドメイン（複数可）を含有する）融合タンパク質である（例えば、Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4): 388-398, 2013を参照されたく、Harris and Kranz, Trends Pharmacol.Sci., 37(3): 220-230, 2016; Stone et al., Cancer Immunol.Immunother., 63(11):1163-1176,2014もまた参照されたい）。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲ結合ドメインを含むＣＡＲを含む（例えば、Walseng et al., Scientific Reports 7:10713, 2017を参照されたい；この参考文献のＴＣＲ ＣＡＲ構築物および方法は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＡＲを作製する方法は、例えば、米国特許第６，４１０，３１９号、米国特許第７，４４６，１９１号、米国特許出願公開第２０１０／０６５８１８号、米国特許第８，８２２，６４７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０３１６８７、米国特許第７，５１４，５３７号、およびBrentjens et al., Clin.Cancer Res.13:5426, 2007に記載されている。

【0091】

ある特定の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合断片は、ＴＣＲ ＶαおよびＶβドメインのＴＣＲ両方を含むが単一のＴＣＲ定常ドメイン（ＣαまたはＣβ）しか含まない、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体は、キメラ（例えば、１つより多くのドナーもしくは複数の種からのアミノ酸残基もしくはモチーフを含む）、ヒト化（例えば、ヒトにおける免疫原性のリスクを低下させるように変更もしくは置換されている非ヒト生物からの残基を含む）、またはヒトである。

【0092】

本開示による結合タンパク質、例えばＴＣＲは、例えば、Ｖαドメイン、Ｖβドメインまたは両方のＣ末端に連結されている、ＴＣＲ定常ドメインをさらに含むこともある。ＴＣＲβ鎖定常ドメインは、ＴＲＢＣ１遺伝子またはＴＲＢＣ２遺伝子によりコードされ得、ＴＣＲα鎖は、ＴＲＡＣ遺伝子によりコードされ得る。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも約９９．９％）の配列同一性を有するα鎖定常（Ｃα）ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃαドメインは、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも約９９．９％）の配列同一性を有するβ鎖（Ｃβ）定常ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃβドメインは、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0093】

ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号５５〜５８のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むα鎖（ＶαドメインおよびＣαドメインから構成される）を含む。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号５９〜６１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むβ鎖（ＶβドメインおよびＣβドメインから構成される）を含む。

【0094】

組換えにより産生された可溶性結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を単離および精製するのに有用な方法は、例として、組換え可溶性ＴＣＲを培養培地に分泌する好適な宿主細胞／ベクター系から上清を得るステップ、および次いで市販のフィルターを使用して培地を濃縮するステップを含み得る。濃縮後、濃縮物を単一の好適な精製マトリックスに、または一連の好適なマトリックス、例えば、アフィニティーマトリックスもしくはイオン交換樹脂に、適用することができる。１つまたは複数の逆相ＨＰＬＣステップを利用して、組換えポリペプチドをさらに精製することができる。これらの精製方法は、免疫原をその天然環境から単離するときに利用することもできる。本明細書に記載される単離された／組換え可溶性ＴＣＲの１つまたは複数についての大規模産生方法は、好適な培養条件を維持するためにモニタリングおよび制御される、バッチ細胞培養を含む。本明細書に記載される、当技術分野で公知である、ならびに自国および外国の規制機関の法律およびガイドラインと適合する方法に従って、可溶性ＴＣＲの精製を行うことができる。

【0095】

ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）をコードする核酸分子は、養子移入治療において使用するための宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）へのトランスフェクション／形質導入に使用される。ＴＣＲシークエンシングの進歩が記載されており（例えば、Robins et al., Blood 114:4099, 2009; Robins et al., Sci.Translat.Med.2:47ra64, 2010; Robins et al., (Sept. 10) J. Imm.Meth.Epub ahead of print, 2011; Warren et al., Genome Res.21:790, 2011）、本開示による実施形態を実施する過程で利用され得る。同様に、Ｔ細胞に所望の核酸をトランスフェクト／形質導入する方法は、記載されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８７０２５号）、所望の抗原特異性のＴ細胞を使用する養子移入手順も記載されており（例えば、Schmitt et al., Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261, 2008; Wang et al., Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007；米国特許出願公開第２０１１／０２４３９７２号；米国特許出願公開第２０１１／０１８９１４１号；Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007）、したがって、今般開示される実施形態へのこれらの方法論の適用が、ＨＬＡ受容体と複合体化されたＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド抗原に特異的なＴＣＲに関するものを含む本明細書における教示に基づいて、企図される。

【0096】

本明細書に記載のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質またはドメインは、Ｔ細胞結合、活性化または誘導の決定を含み、抗原特異的であるＴ細胞応答の決定も含む、Ｔ細胞活性をアッセイするための当技術分野において一般に認められている多数の方法論のいずれかに従って機能的に特徴付けることができる。例は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞サイトカイン放出、抗原特異的Ｔ細胞刺激、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞刺激、ＣＴＬ活性（例えば、前もって負荷された標的細胞からの^５１Ｃｒ放出を検出することによる）、Ｔ細胞表現型マーカー発現の変化、およびＴ細胞機能の他の尺度の決定を含む。これらおよび類似のアッセイを行うための手順は、例えば、Lefkovits（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998）において見つけることができる。Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.)Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998)およびこれらに引用されている参考文献も参照されたい。

【0097】

「ＭＨＣ−ペプチドテトラマー染色」は、少なくとも１つの抗原（例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}）と同族である（例えば、同一であるまたは関連する）アミノ酸配列を有する同一のペプチドを各々が含むＭＨＣ分子のテトラマーであって、複合体が、同族抗原に特異的なＴ細胞受容体に結合することができる、テトラマーを特徴とする、抗原特異的Ｔ細胞を検出するために使用されるアッセイを指す。ＭＨＣ分子の各々にビオチン分子のタグを付けることができる。ビオチン化ＭＨＣ／ペプチドは、蛍光標識することができるストレプトアビジンの付加により、テトラマーにされる。蛍光標識を介してテトラマーをフローサイトメトリーにより検出することができる。ある特定の実施形態では、ＭＨＣ−ペプチドテトラマーアッセイは、本開示の増強された親和性のＴＣＲを検出または選択するために使用される。

【0098】

サイトカインレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー、ならびにそれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリー）を含む、本明細書に記載されるおよび当技術分野において実施されている方法に従って、決定することができる。免疫応答の抗原特異的惹起または刺激の結果として生じる免疫細胞増殖およびクローン拡大は、末梢血液細胞またはリンパ節からの細胞の試料中の循環リンパ球などのリンパ球を単離し、前記細胞を抗原で刺激し、サイトカイン産生、細胞増殖および／または細胞生存率を、例えば、トリチウム化チミジンの取り込みまたは非放射性アッセイ、例えばＭＴＴアッセイなどにより、測定することによって、決定することができる。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答の間のバランスに対する本明細書に記載される免疫原の効果は、例えば、Ｔｈ１サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＴＮＦ−β、ならびに２型サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３、のレベルを決定することによって、検査することができる。

【0099】

さらなる態様では、本開示は、本開示による結合タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、組成物を提供する。薬学的に許容される賦形剤は、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物対象への投与に好適である、本明細書中でより詳細に記載される生体適合性ビヒクル、例えば、生理食塩水である。

【0100】

免疫細胞（例えば、樹状細胞、食細胞およびＢ細胞）による抗原提示は、一部は、細胞上に存在するＨＬＡ複合体により決定される。理論により拘束されることを望まないが、異なるＨＬＡアレルによりコードされるＨＬＡタンパク質は、特定の抗原ペプチドを提示するそれらの能力および免疫細胞タンパク質（例えば、ＴＣＲ）と相互作用するそれらの能力が異なり得ると考えられる。例えば、所与の抗原ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＱ複合体により提示されることがあるが、ＨＬＡ−ＤＲ複合体により提示されないことがあり、または逆に、ＨＬＡ−ＤＱ複合体により提示されないことがあるが、ＨＬＡ−ＤＲ複合体により提示されることがある。ある特定の実施形態では、本開示による結合タンパク質は、ＨＬＡ−ＤＱと複合体化したＢＲＡＦＶ^６００Ｅペプチドを認識することができる。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、＊０３０２または＊０３０３を含む。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２を含む。さらなる実施形態では、ＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３を含む。

【0101】

本開示による結合タンパク質が標的とするペプチド抗原は、サイズに関しても、例えば、抗原を提示するＨＬＡ分子のタイプによって異なり得る。一般に、ＨＬＡクラスＩ複合体は、約８〜１０アミノ酸長であるペプチドを提示し、その一方でＨＬＡクラスＩＩ複合体は、約１５〜２４アミノ酸長であるペプチドを提示するが、これらのペプチドは、これらの一般的な長さより短いこともあり、または長いこともある。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質が特異的に結合するＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドは、約７〜約２７個のアミノ酸、約１０〜約２５個のアミノ酸、または約１２〜約２０個のアミノ酸、または約１５〜約１９個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドは、配列番号３８または３９に示されるアミノ酸配列を含む。
ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび関連ベクター

【0102】

なおさらなる態様では、本開示による結合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドおよび発現ベクターが、提供される。目的のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドに特異的な結合タンパク質またはＴＣＲの遺伝子操作および産生に使用される発現ベクターの構築は、当技術分野において公知の任意の好適な分子生物学操作技法を使用することにより遂行することができる。効率的な転写および翻訳を達成するために、各組換え発現構築物中のポリヌクレオチドは、免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に（すなわち、作用的に（operatively））連結された少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも呼ばれる）、例えば、リーダー配列および特にプロモーターを含む。

【0103】

ある特定の実施形態は、本明細書で提供される結合タンパク質、例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）をコードする、ポリヌクレオチドに関する。核酸は、任意の形態の一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり得、アンチセンスＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを含む、互いを補足する核酸のプラス鎖とマイナス鎖を含み得る。ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、リボザイム、および他の様々な天然に存在するまたは合成形態のＤＮＡまたはＲＮＡも含む。本開示のポリヌクレオチドが、本明細書において開示される参照ポリヌクレオチド配列と比較して異なり（すなわち、異なるヌクレオチド配列を含み）、同じアミノ酸またはポリペプチドを、例えば遺伝コードの縮重のため、なおコードすることができることは、理解される。ある特定の実施形態では、例えば、結合タンパク質もしくはその一部分、自己切断ペプチド、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド；または結合タンパク質をコードする構築物は、配列番号８〜２４、２７、２８、４４〜４８、６２〜６８、および７３〜７７のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または少なくとも約９９．９％）の同一性を有することができる。

【0104】

上述の実施形態のいずれにおいても、本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的宿主細胞における効率的発現のためにコドン最適化される。

【0105】

ある特定の実施形態は、ベクター内に含有される本開示のポリヌクレオチドを含む。例示的なベクターは、そのポリヌクレオチドが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド、または宿主生物において複製することができるポリヌクレオチドを含むことができる。ベクターの一部の例としては、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドなどが挙げられる。導入される宿主細胞において自律複製が可能であり得るベクター（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）もあるが、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る、または宿主細胞への導入の際にポリヌクレオチド挿入物の組込みを促進し、それによって宿主ゲノムとともに複製し得るベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター）もある。加えて、一部のベクターは、それらが作用的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる（これらのベクターは、「発現ベクター」と呼ばれることもある）。関連実施形態に従って、１つまたは複数の薬剤（例えば、本明細書に記載の、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}に特異的な結合タンパク質もしくは組換えＴＣＲをコードするポリヌクレオチド、またはそのバリアント）が対象に共投与される場合には、各薬剤が、別々のベクターまたは同じベクターの中に存在することができ、複数のベクター（各々が異なる薬剤または同じ薬剤を含有する）を細胞もしくは細胞集団に導入することができ、または対象に投与することができることは、さらに理解される。

【0106】

ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、ベクターのある特定のエレメントに作用的に連結させることができる。例えば、ポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチド配列がライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせる必要があるポリヌクレオチド配列を、作用的に連結させることができる。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびにことによると、タンパク質分泌を増進する配列を挙げることができる。発現制御配列は、発現制御配列が、目的の遺伝子と、および目的の遺伝子を制御するようにトランスでまたは少し離れて作用する発現制御配列と近接している場合、作用的に連結されていてよい。ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである発現ベクターに含まれている。

【0107】

ある特定の実施形態では、本開示の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドが発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されている、発現ベクターが提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、ポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である。さらなる実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。

【0108】

本明細書中の実施形態のいずれにおいても、ベクターは、ウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである。
宿主細胞

【0109】

なおさらなる態様では、本開示による異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドによりコードされた結合タンパク質をその細胞表面に発現する（すなわち、本開示による結合タンパク質を発現する）宿主細胞が、提供される。特定の実施形態では、発現ベクターは、適切な細胞、例えば、Ｔ細胞または抗原提示細胞、すなわち、その細胞表面にペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）に送達される。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞）は、ＣＤ８共受容体またはＣＤ４共受容体を欠いており、コードされた結合タンパク質は、ＣＤ４またはＣＤ８共受容体の非存在下でＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原：ＨＬＡ複合体に結合することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である。例えば、免疫系細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、コードされた結合タンパク質は、ＭＨＣＩＩ拘束ＴＣＲ結合ドメインを含み、宿主細胞（例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞）は、異種ＣＤ４^＋共受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0110】

Ｔ細胞が宿主である、ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブ、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せであり得る。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、または両方である。宿主細胞に導入される発現ベクターは、例えば、リンパ系組織特異的転写調節エレメント（ＴＲＥ）、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球または樹状細胞に特異的なＴＲＥも含み得る。リンパ組織に特異的なＴＲＥは、当技術分野において公知である（例えば、Thompson et al., Mol.Cell.Biol.12:1043, 1992); Todd et al., J. Exp.Med.177:1663, 1993); Penix et al., J. Exp.Med.178:1483, 1993を参照されたい）。

【0111】

宿主細胞は、ベクターをもしくは核酸の組み入れを受け入れることができる、またはタンパク質を発現することができる、任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことができる。この用語は、遺伝的にまたは表現型的に同じであるのか異なるのかを問わず、宿主細胞の子孫も包含する。好適な宿主細胞は、ベクターに依存し得、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞を含み得る。ウイルスベクターの使用、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによる形質転換、または他の方法によって、ベクターまたは他の材料を組み入れるように、これらの細胞を誘導することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)を参照されたい。

【0112】

したがって、一態様では、本開示による異種ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含む宿主細胞であって、前記異種ポリヌクレオチドによりコードされた結合タンパク質をその細胞表面に発現する宿主細胞が、提供される。ある特定の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である。ある特定の実施形態では、Ｖ_βドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である。

【0113】

ある特定の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、Ｖ_βドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる。

【0114】

ある特定の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１８〜２１のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなり、Ｖ_βドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号２２〜２４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる。

【0115】

ある特定の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、ＴＣＲα鎖定常ドメインをコードする部分に連結されており、前記α鎖定常ドメインをコードする部分は、配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列を含むか、または配列番号２７に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列からなる。

【0116】

ある特定の実施形態では、Ｖ_βドメインをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、ＴＣＲβ鎖定常ドメインをコードする部分に連結されており、前記β鎖定常ドメインをコードする部分は、配列番号２８に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列を含むか、または配列番号２８に示されるポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０％同一である配列からなる。

【0117】

特定の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードするポリヌクレオチドの部分は、配列番号１８を含むか、または配列番号１８からなり、Ｖ_βドメインをコードする部分は、配列番号２２を含むか、または配列番号２２からなる。

【0118】

他の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードするポリヌクレオチドの部分は、配列番号１９を含むか、または配列番号１９からなり、Ｖ_βドメインをコードする部分は、配列番号２３を含むか、または配列番号２３からなる。

【0119】

他の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードするポリヌクレオチドの部分は、配列番号２０を含むか、または配列番号２０からなり、Ｖ_βドメインをコードする部分は、配列番号２３を含むか、または配列番号２３からなる。

【0120】

さらに他の実施形態では、Ｖ_αドメインをコードするポリヌクレオチドの部分は、配列番号２１を含むか、または配列番号２１からなり、Ｖ_βドメインをコードする部分は、配列番号２４を含むか、または配列番号２４からなる。

【0121】

本明細書に記載される実施形態のいずれにおいも、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原を提示または発現する抗原提示細胞と共培養されたとき、インターフェロンを産生することができる。ある特定の実施形態では、産生されるインターフェロンは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を含む。一部の実施形態では、標的細胞は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原を含むかまたはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原からなるペプチドまたはポリペプチドでパルスされた。一部の実施形態では、標的細胞に、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原を含むかまたはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原からなるポリペプチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡ）がトランスフェクトされた。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、抗原約０．００５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの濃度のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原でパルスされた抗原提示細胞とともに培養されたとき、ＩＦＮ−γを産生する。さらなる実施形態では、宿主細胞は、少なくとも抗原約０．１μｇ／ｍＬの濃度のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原でパルスされた抗原提示細胞とともに培養されたとき、少なくとも約１，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生する。一部の実施形態では、宿主細胞は、少なくとも抗原約０．１、０．２、０．３、０．４または０．５μｇ／ｍＬの濃度のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原でパルスされた抗原提示細胞とともに培養されたとき、少なくとも約１，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生する。一部の実施形態では、宿主細胞は、抗原約０．５μｇ／ｍＬ〜抗原約１０μｇ／ｍＬの濃度のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原でパルスされた抗原提示細胞とともに培養したとき、約１，０００ｐｇ／ｍＬ〜約１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ−γを産生する。一部の実施形態では、標的細胞は、Ｂ細胞を含む。さらなる実施形態では、Ｂ細胞は、ＨＬＡ−ＤＱアレルを発現する。なおさらなる実施形態では、Ｂ細胞は、Ｂ−ＬＣＬ株１３３１のＢ細胞である。

【0122】

ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドの一部分は、自己切断ペプチドをコードし、ＴＣＲα鎖をコードする部分とＴＣＲβ鎖をコードする部分の間に配置されている。単一ベクターによる分離可能なポリペプチドの発現に有用な自己切断ペプチドは、当技術分野において公知であり、例えば、ブタテッショウイルス−１ ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチド、および口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチドを含む。したがって、ある特定の実施形態では、自己切断ペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドの部分は、配列番号４４〜４８のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列を含むか、または配列番号４４〜４８のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列からなる。さらなる実施形態では、コードされた自己切断ペプチドは、配列番号４９〜５２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４９〜５２のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる。

【0123】

ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。さらなる実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。

【0124】

ある特定の実施形態では、Ｔ細胞により発現される結合タンパク質またはＴＣＲは、内在性ＴＣＲと比較して、より効率的にＣＤ３タンパク質、ＣＤ４タンパク質または両方と会合することができる。ある特定の実施形態では、内在性ＴＣＲと比較してＴ細胞上での結合タンパク質またはＴＣＲのより高い表面発現。

【0125】

上述の実施形態のいずれにおいても、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ分子、ＴＣＲ分子またはそれらの任意の成分もしくは組合せから選択されるポリペプチド産物をコードする１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を低減または排除するように改変される免疫細胞である。理論により拘束されることを望まないが、ある特定の内因性発現された免疫細胞タンパク質は、改変された免疫宿主細胞（例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ）の免疫活性を下方調節することができる；または本開示の異種結合タンパク質と、宿主細胞による発現、ＴＣＲ複合体成分（例えば、ＣＤ３タンパク質）との会合について競合することができる；または本開示の異種発現された結合タンパク質（例えば、非ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原もしくは非ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原：ＨＬＡ複合体と結合し、今般開示される結合タンパク質のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原への結合に干渉し、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原を発現する標的細胞に結合する免疫宿主細胞に干渉する、内在性ＴＣＲ）の結合活性に干渉することができる；またはそれらの任意の組合せ。さらに、細胞移入治療に使用されることになるドナー免疫細胞上に発現される内在性タンパク質（例えば、免疫宿主細胞タンパク質、例えばＨＬＡ）は、同種異系レシピエントにより外来性として認識され得、その結果、同種異系レシピエントによりドナー免疫細胞が排除または抑制され得る。

【0126】

したがって、そのような内在性遺伝子またはタンパク質の発現または活性を減少または排除することで、自己または同種異系宿主環境での宿主細胞の活性、寛容および持続性を向上させることができ、細胞の（例えば、ＨＬＡ型に関係なく任意のレシピエントへの）普遍的投与が可能になる。ある特定の実施形態では、改変宿主免疫細胞は、ドナー細胞（例えば、同種異系）または自己細胞である。ある特定の実施形態では、本開示の改変免疫宿主細胞は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分（例えば、α１マクログロブリン、α２マクログロブリン、α３マクログロブリン、β１ミクログロブリンもしくはβ２ミクログロブリンをコードする遺伝子）、またはＴＣＲ成分（例えば、ＴＣＲ可変領域もしくはＴＣＲ定常領域をコードする遺伝子）をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数についての染色体遺伝子ノックアウトを含む（例えば、Torikai et al., Nature Sci.Rep.6:21757 (2016); Torikai et al., Blood 119(24):5697 (2012)；およびTorikai et al., Blood 122(8):1341 (2013)を参照されたく、これらの参考文献の遺伝子編集技法、組成物および養子細胞治療は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる；例えば、配列番号１４２〜１４９）。本明細書で使用される場合、用語「染色体遺伝子ノックアウト」は、機能的に活性な内在性ポリペプチド産物の宿主細胞による産生を妨げる、宿主細胞の遺伝子変化を指す。染色体遺伝子ノックアウトの結果として生じる変化は、例えば、導入ナンセンス変異（未成熟終止コドンの形成を含む）、ミスセンス変異、遺伝子欠失および鎖切断、ならびに宿主細胞における内在性遺伝子発現を阻害する阻害性核酸分子の異種発現を含み得る。

【0127】

ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックインは、宿主細胞の染色体編集によってなされる。染色体編集は、例えばエンドヌクレアーゼを使用して、行うことができる。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合の切断を触媒することができる酵素を指す。ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子を切断することによって標的遺伝子を不活性化または「ノックアウト」することができる。エンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼ、組換えエンドヌクレアーゼ、遺伝子修飾エンドヌクレアーゼまたは融合エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼにより引き起こされる核酸鎖切断は、一般に、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の明確に異なる機序によって修復される。相同組換え中に、ドナー核酸分子は、ドナー遺伝子「ノックイン」に、標的遺伝子「ノックアウト」に、および必要に応じて、ドナー遺伝子ノックインまたは標的遺伝子ノックアウト事象によって標的遺伝子を不活性化するために、使用され得る。ＮＨＥＪは、ＤＮＡ配列の切断部位での変化、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失または付加をもたらすことが多い、エラープローン修復プロセスである。ＮＨＥＪは、標的遺伝子を「ノックアウトする」ために使用されることもある。エンドヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびメガＴＡＬが挙げられる。

【0128】

本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼなどの、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を指す。約３０アミノ酸の各ジンクフィンガーモチーフがＤＮＡの約３塩基対と結合し、ある特定の残基におけるアミノ酸を変化させてトリプレット配列特異性を変更することができる（例えば、Desjarlais et al., Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260, 1993; Wolfe et al., J. Mol.Biol.285:1917-1934, 1999を参照されたい）。複数のジンクフィンガーモチーフをタンデムに連結させて、所望のＤＮＡ配列、例えば約９〜約１８塩基対の範囲の長さを有する領域、に対する結合特異性を生じさせることができる。背景として、ＺＦＮは、ゲノム内での部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の形成を触媒することによりゲノム編集を媒介し、ＤＳＢの部位にゲノムに相同な隣接配列を含む導入遺伝子の標的組込みが相同組換え修復により容易になる。あるいは、ＺＦＮにより生じたＤＳＢは、切断部位のヌクレオチドの挿入または欠失を生じさせる結果となるエラープローン細胞修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を介して、標的遺伝子のノックアウトをもたらし得る。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＺＦＮ分子を使用してなされる挿入、欠失、変異またはそれらの組合せを含む。

【0129】

本明細書で使用される場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを含む融合タンパク質を指す。「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１２番目および１３番目のアミノ酸が異なる高度に保存された３３〜３５アミノ酸配列を各々が一般に有する、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットで構成されている。ＴＡＬＥ反復ドメインは、ＴＡＬＥの標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる、異なるアミノ酸残基は、特異的ヌクレオチド認識と相関する。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識についての天然（標準）コードは、ＴＡＬＥの１２および１３位のＨＤ（ヒスチジン−アスパラギン酸）配列が、シトシン（Ｃ）へのＴＡＬＥ結合をもたらし、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドと、ＮＩ（アスパラギン−イソロイシン）がＡと結合し、ＮＮ（アスパラギン−アスパラギン）がＧまたはＡヌクレオチドと結合し、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドと結合するように、決定された。非標準（非定型）ＲＶＤもまた公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたく、この非定型ＲＶＤは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＡＬＥＮを使用して、Ｔ細胞のゲノム内での部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を指示することができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、アニーリングのための配列重複がほとんどまたは全くない、二本鎖切断の両側からのＤＮＡをライゲーションし、それによって、遺伝子発現をノックアウトする誤りを導入する。あるいは、相同組換え修復は、相同隣接配列が導入遺伝子に存在することを条件に、その導入遺伝子をＤＳＢの部位に導入することができる。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＴＡＬＥＮ分子を使用してなされる挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含む。

【0130】

本明細書で使用される場合、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／Ｃａｓ」（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステムは、塩基対合相補性によってゲノム内の標的部位（プロトスペーサーとして公知）を認識するために、そしてその後、短い保存プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）が相補標的配列の３’の直後に続く場合にはＤＮＡを切断するために、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）誘導型Ｃａｓヌクレアーゼを利用するシステムを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼの配列および構造に基づいて３つの型（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）に分類される。Ｉ型およびＩＩＩ型のｃｒＲＮＡ誘導型監視複合体は、複数のＣａｓサブユニットを必要とする。最もよく研究されているＩＩ型システムは、少なくとも次の３つの成分を含む：ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、二重鎖形成領域を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと相互作用することおよびｃｒＲＮＡ上のスペーサーとＰＡＭから上流の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合によって標的ＤＮＡ上の特定の部位にＣａｓ９／ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を誘導することができる、二重鎖を形成する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡスペーサーにより規定される領域内で二本鎖切断を行う。ＮＨＥＪによる修復は、標的遺伝子座の発現を破壊する挿入および／または欠失をもたらす。あるいは、相同隣接配列を伴う導入遺伝子を相同組換え修復によってＤＳＢの部位に導入することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを操作して一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）にすることができる（例えば、Jinek et al., Science 337:816-21, 2012を参照されたい）。さらに、標的部位に相補的なガイドＲＮＡの領域を、所望の配列を標的とするように変更またはプログラムすることができる（Xie et al., PLOS One 9:e100448, 2014；米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、米国特許出願公開第２０１４／０１８６８４３号：米国特許第８，６９７，３５９号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０７１４７４；これらの各々は、参照により組み込まれる）。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含み、それは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムを使用してなされる。

【0131】

例示的なｇＲＮＡ配列、およびそれらを使用して、免疫細胞タンパク質をコードする内在性遺伝子をノックアウトする方法は、Ren et al., Clin.Cancer Res.23(9):2255-2266 (2017)に記載されるものを含み、この文献のｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ＤＮＡ、ベクターおよび遺伝子ノックアウト技法は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0132】

一部の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＴＣＲα鎖定常領域遺伝子座（Ｃα）、ＴＣＲβ鎖定常領域遺伝子座（Ｃβ）または両方のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子ノックアウトを含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｃα遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ（配列番号１３６）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｃα遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＴＧＴＧＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＡ（配列番号１３７）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｃβ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧＡ（配列番号１３８）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲ Ｃβ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣ（配列番号１３９）を含む。一部の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ヒトβ２Ｍ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子ノックアウトを含む。ある特定の実施形態では、ヒトβ２Ｍを標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＣＧＣＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＡ（配列番号１４０）を含む。一部の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＰＤ−１遺伝子座のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子ノックアウトを含む。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１を標的とするｇＲＮＡ配列は、ヌクレオチド配列ＧＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＴＴＣＴＴＡＧＧＴ（配列番号１４１）を含む。

【0133】

本明細書で使用される場合、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とも呼ばれる「メガヌクレアーゼ」は、大きい認識部位（約１２〜約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて次の５つのファミリーに分類することができる：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスおよびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫ。例示的なメガヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられ、これらの認識配列は公知である（例えば、米国特許第５，４２０，０３２号および同第６，８３３，２５２号；Belfort et al., Nucleic Acids Res.25:3379-3388, 1997; Dujon et al., Gene 82:115-118, 1989; Perler et al., Nucleic Acids Res.22:1125-1127, 1994; Jasin, Trends Genet.12:224-228, 1996; Gimble et al., J. Mol.Biol.263:163-180, 1996; Argast et al., J. Mol.Biol.280:345-353, 1998を参照されたい）。

【0134】

ある特定の実施形態では、天然に存在するメガヌクレアーゼを使用して、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡをコードする遺伝子、またはＴＣＲ成分をコードする遺伝子から選択される標的の部位特異的ゲノム修飾を促進することができる。他の実施形態では、標的遺伝子に対する新規結合特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼが、部位特異的ゲノム修飾に使用される（例えば、Porteus et al., Nat. Biotechnol.23:967-73, 2005; Sussman et al., J. Mol.Biol.342:31-41, 2004; Epinat et al., Nucleic Acids Res.31:2952-62, 2003; Chevalier et al., Molec.Cell 10:895-905, 2002; Ashworth et al., Nature 441:656-659, 2006; Paques et al., Curr.Gene Ther.7:49-66, 2007；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号、同第２００６／０２０６９４９号、同第２００６／０１５３８２６号、同第２００６／００７８５５２号、および同第２００４／０００２０９２号を参照されたい）。さらなる実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、メガＴＡＬとして公知の融合タンパク質を作製するためにＴＡＬＥＮのモジュラーＤＮＡ結合ドメインで修飾されたホーミングエンドヌクレアーゼを使用して生成される。メガＴＡＬを利用して、１つまたは複数の標的遺伝子をノックアウトすることができるばかりでなく、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖または両方などの目的のポリペプチドをコードする外因性ドナーテンプレートと組み合わせて使用すると異種または外因性ポリヌクレオチドを導入（ノックイン）することもでき、細胞により産生されるノックインＴＣＲは、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原またはペプチドに特異的である。

【0135】

ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、腫瘍関連抗原と特異的に結合する抗原特異的受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞（例えば、免疫細胞）に導入される阻害性核酸分子を含み、前記阻害性核酸分子は、標的特異的インヒビターをコードし、コードされた標的特異的インヒビターは、宿主免疫細胞における内在性遺伝子発現（すなわち、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分もしくはＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せの発現）を阻害する。

【0136】

染色体遺伝子ノックアウトを、ノックアウト手順またはノックアウト剤の使用後の宿主免疫細胞のＤＮＡシークエンシングによって直接確認することができる。染色体遺伝子ノックアウトを、ノックアウト後の遺伝子発現の非存在（例えば、遺伝子によりコードされたｍＲＮＡまたはポリペプチド産物の非存在）から推測することもできる。
処置の方法

【0137】

一部の態様では、本開示の方法は、過剰増殖性障害を処置する方法であり、これらの方法は、本開示によるヒトＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}または宿主細胞に特異的な結合タンパク質を含む組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む。

【0138】

ある特定の態様では、本開示は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現を特徴とする過剰増殖性障害または状態を処置する方法であって、上述の結合タンパク質のいずれかによるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体に特異的な結合タンパク質を含む組成物または前記結合タンパク質を発現する宿主細胞を含む組成物を、それを必要とするヒト対象に投与することによる方法に関する。

【0139】

対象における過剰増殖性障害または悪性状態の存在は、当技術分野において公知であり、診断および分類の基準が確立されている、例えば、新生物性、腫瘍、非接触阻害されたまたは腫瘍形成的に形質転換された細胞など（例えば、固形がん；リンパ腫および白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病などを含む、血液がん；例えば、腎がん、胃がん、卵巣がんおよび結腸直腸がん）を含む、対象における異形成細胞、がん性細胞および／または形質転換細胞の存在を指す（例えば、Hanahan and Weinberg, Cell 144:646, 2011; Hanahan and Weinberg, Cell 100:57, 2000; Cavallo et al., Canc.Immunol.Immunother. 60:319, 2011; Kyrigideis et al., J. Carcinog. 9:3, 2010）。特に、例えば、ヘアリー細胞白血病、黒色腫、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳頭がん、および甲状腺がん、例えば低分化甲状腺がん。したがって、さらなる実施形態では、ヘアリー細胞白血病、黒色腫、甲状腺がん、例えば低分化甲状腺がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、乳頭がん、非ホジキンリンパ腫、肺腺癌、ならびに膠芽腫および毛様細胞性星細胞腫を含む脳腫瘍を含む、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現に関連する過剰増殖性障害または他の状態を処置する方法が、提供される。

【0140】

本明細書で使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、対象（すなわち、ヒトであることもあり、または非ヒト動物であることもある、患者、宿主）の疾患、障害または状態の医学的管理を指す（例えば、Stedman's Medical Dictionary参照）。一般に、適切な用量および処置レジメンは、結合タンパク質、もしくはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体、または結合タンパク質もしくはＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド：ＨＬＡ複合体を発現する宿主細胞の１つまたは複数、および必要に応じて補助的治療（例えば、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１またはそれらの任意の組合せ）を、治療的または予防的恩恵をもたらすのに十分な量で提供する。目的が、望ましくない生理学的変化もしくは障害を予防もしくは遅延もしくは別様に低減（例えば、未処置対照と比べて、統計的に有意な形で減少）させること、またはそのような疾患もしくは障害の拡大もしくは重症度を予防、遅延もしくは別様に低減させることである、治療的処置または予防的もしくは防止的方法の結果として生じる治療的または予防的恩恵は、例えば、臨床成績の向上を含む。対象に対する処置の結果として生じる有益なまたは望ましい臨床結果は、処置される疾患もしくは障害に起因もしくは関連する症状の緩解、緩和もしくは軽減；症状の発生頻度低下；生活の質向上；より長い無病状態（すなわち、対象が症状（この症状に基づいて疾患が診断される）を提示する尤度または傾向を減少させること）；疾患の程度の低下；安定した（すなわち、悪化していない）病状；疾患進行の遅延または緩徐化；病状の改善もしくは緩和；および検出可能か検出不能かを問わず寛解（部分的寛解か完全寛解かを問わず）；または全生存期間を含む。

【0141】

「処置」は、対象が処置を受けなかった場合の予想生存期間と比較したときの生存期間の延長も意味し得る。本明細書に記載される方法および組成物を必要とする対象は、疾患または障害に既に罹患している対象はもちろん、疾患もしくは障害に罹患しやすいまたは疾患もしくは障害を発症するリスクがある対象も含む。予防的処置を必要とする対象は、疾患、状態または障害を予防すべきである（すなわち、疾患または障害の発生または再発の尤度を低下させるべき）対象を含む。本明細書に記載される組成物（および組成物を含む調製物）および方法によってもたらされる臨床的恩恵は、実施例で説明されるように、組成物の投与が恩恵をもたらすことが意図される対象においてｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、前臨床研究および臨床研究を設計および実行することにより評価することができる。

【0142】

本明細書に記載の結合タンパク質を発現する細胞を、薬学的にまたは生理的に許容されるまたは好適な賦形剤または担体中にある状態で、対象に投与することができる。薬学的に許容される賦形剤は、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物対象への投与に好適である、本明細書中でより詳細に説明される生体適合性ビヒクル、例えば、生理食塩水である。

【0143】

養子細胞治療の文脈での治療有効用量は、処置されるヒトまたは非ヒト哺乳動物において臨床的に望ましい結果を生じさせることができる養子移入に使用される宿主細胞（本開示による結合タンパク質を発現する）の量（すなわち、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を発現する細胞に対する特異的Ｔ細胞免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を統計的に有意な形で誘導または増強するのに十分な量）である。医学技術分野で周知のように、いずれの１患者についての投薬量も、患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、投与される特定の治療、性別、投与の回数および経路、総体的な健康、および併せて投与されている他の薬物を含む、多くの因子に依存する。用量は、変動するが、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞の投与に好ましい用量は、約１０^７細胞／ｍ^２、約５×１０^７細胞／ｍ^２、約１０^８細胞／ｍ^２、約５×１０^８細胞／ｍ^２、約１０^９細胞／ｍ^２、約５×１０^９細胞／ｍ^２、約１０^１０細胞／ｍ^２、約５×１０^１０細胞／ｍ^２、または約１０^１１細胞／ｍ^２である。

【0144】

今般開示される実施形態のいずれにおいても、単位用量は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、または両方を含むことができ、前記Ｔ細胞は、バルクＴ細胞、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、またはエフェクターメモリーＴ細胞を含むことができる。ある特定の実施形態では、単位用量は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含み、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含まない。他の実施形態では、単位用量は、異種ＣＤ４^＋共受容体を発現するように操作されていてよい、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を含み、必要に応じて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含まない。ある特定の実施形態では、単位用量は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ宿主細胞を含み、１つまたは複数の他の抗原または抗原−ＨＬＡ複合体、例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}抗原、Ｖ６００Ｅ変異を含まないＢＲＡＦ抗原；単位用量中の今般開示される宿主細胞の結合タンパク質に関連する抗原とは異なるＨＬＡに関連するＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原；または過剰増殖性疾患もしくは障害に関連する異なる抗原；例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、チロシナーゼ、ＴＭＧ１−４、ＧＰ１００、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＲＯＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ Ａ、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５６、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＡ１２５、ｃ−ＭＥＴ、ＦｃＲＨ５、ＷＴ−１、葉酸受容体α、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＰＳＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、メソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＦＡＰ、炭酸脱水酵素９、ＥＲＢＢ２、もしくはＣＥＡ、またはそれらの任意の組合せなど、に対する結合特異性を有する、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞（例えば、同種異系または自己、修飾された（例えば、異種タンパク質、例えば、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＣＤ４共受容体、ＣＤ８共受容体、もしくはそれらの任意の組合せを発現するように）または未修飾）をさらに含む。

【0145】

ある特定の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない（すなわち、単位用量に存在するナイーブＴ細胞の集団を、匹敵する数のＰＢＭＣを有する患者試料と比較して約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満有する）。

【0146】

一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約５０％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約５０％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。さらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約６０％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約６０％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。なおさらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約７０％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約７０％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８０％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８０％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８５％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８５％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約９０％の操作されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約９０％の操作されたＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。

【0147】

本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、単位用量は、操作されたＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋および操作されたＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ_Ｍ細胞の等しいまたはほぼ等しい数を含む。

【0148】

医薬組成物は、医学技術分野の当業者により決定されるような、処置（または予防）される疾患または状態に適切な方法で、投与することができる。組成物の適切な用量ならびに好適な投与期間および頻度は、患者の健康状態、患者のサイズ（すなわち、体重、量（mass）または体面積）、患者の疾患のタイプおよび重症度、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法などの因子によって決定される。一般に、適切な用量および処置レジメンは、治療的および／または予防的恩恵（例えば、臨床成績向上、例えば、より高頻度の完全もしくは部分的寛解、またはより長い無病および／もしくは全生存期間、または症状重症度の低下を含む、本明細書に記載されるもの）をもたらすのに十分な量で、組成物（複数可）を提供する。予防的使用のための用量は、疾患もしくは障害を予防する、疾患もしくは障害の発症を遅延させる、または疾患もしくは障害に関連する疾患重症度を低下させるのに、十分なものであるべきである。本明細書に記載される方法に従って投与される免疫原性組成物の予防的恩恵は、前臨床研究（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの動物研究を含む）および臨床研究の実施、ならびにそこから得られるデータの適切な統計的、生物学的および臨床的方法および技法による分析によって決定することができ、前記方法および技法の全てが当業者によって容易に実施され得る。

【0149】

ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現に関連する状態は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}により駆動される細胞事象または分子事象が存在し、正常細胞と比べて罹患細胞の過剰成長として通常は現れる、任意の障害または状態を含む。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現に関連する一部の状態は、急性および慢性の障害および疾患、例えば、対象を特定の障害に罹りやすくする病的状態を含み得る。

【0150】

ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現に関連する状態の一部の例としては、腫瘍、新生物、がん、悪性疾患などを含む、対象における活性化および／または増殖性細胞（細胞が転写活性過剰である場合もある）の状態を指す、過剰増殖性障害が挙げられる。活性化または増殖性細胞に加えて、過剰増殖性障害は、壊死によるかアポトーシスによるかを問わず細胞死プロセスの異常または調節異常も含み得る。細胞死プロセスのそのような異常は、がん（原発性、二次性悪性疾患、および転移を含む）または他の状態を含む、様々な状態に関連し得る。

【0151】

ある特定の実施形態によれば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現を特徴とするがんを、本明細書において開示される組成物および方法の使用によって処置することができる。さらに、「がん」は、固形腫瘍、腹水腫瘍、血液もしくはリンパもしくは他の悪性疾患；結合組織悪性疾患；転移性疾患；器官または幹細胞の移植後の微小残存疾患；多剤耐性がん、原発性または二次性悪性疾患、悪性疾患に関係する血管新生、または他の形態のがんを含む、任意の加速された細胞増殖を指すことができる。上記タイプの疾患の１つだけが含まれる特定の実施形態、または特定の状態が、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}発現を特徴とするか否かを問わず、排除されることもある、特定の実施形態も、今般開示される実施形態内で企図される。

【0152】

本明細書において企図される処置または予防のある特定の方法は、本明細書に記載の所望のポリヌクレオチドを含む宿主細胞（これは、自己、同種異系または同系であり得る）であって、前記ポリヌクレオチドが細胞の染色体に安定的に組み込まれている宿主細胞を投与するステップを含む。例えば、そのような細胞組成物を、自己、同種異系または同系免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー細胞）を使用してｅｘ ｖｉｖｏで生成して、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を標的とする所望のＴ細胞組成物を養子免疫治療として対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫細胞である。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。

【0153】

本明細書で使用される場合、組成物または治療の投与は、送達経路または方法に関係なく、対象への組成物または治療の送達を指す。投与を持続的にまたは間欠的に、および非経口的に果たすことができる。投与は、認識された状態、疾患または病状を有すると既に確認された対象を処置するためであることもあり、あるいはそのような状態、疾患もしくは病状に罹りやすいまたはそのような状態、疾患もしくは病状を発症するリスクがある対象を処置するためであることもある。補助的治療との共投与は、任意の順序および任意の投薬スケジュールでの、複数の薬剤（例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的組換え（すなわち、操作された）宿主細胞と、１または複数のサイトカイン；免疫抑制治療、例えば、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せ）の同時のおよび／または逐次的な送達を含み得る。

【0154】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組換え宿主細胞の多数の用量が対象に投与され、前記用量は、約２週間〜約４週間の投与間隔で投与され得る。さらなる実施形態では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１）は、組換え宿主細胞がサイトカイン投与の前に少なくとも３または４回、対象に投与されたことを条件に、逐次的に投与される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、宿主細胞と併せて投与される。ある特定の実施形態では、サイトカインは、皮下投与される。

【0155】

なおさらなる実施形態では、処置されている対象は、免疫抑制治療、例えば、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せをさらに受けている。なおさらなる実施形態では、処置されている対象は、骨髄非破壊的または骨髄破壊的造血細胞移植を受けたことがあり、この処置は、骨髄非破壊的造血細胞移植の少なくとも２ヶ月〜少なくとも３ヶ月後に投与され得る。

【0156】

治療用組成物または医薬組成物の有効量は、本明細書に記載されるような所望の臨床結果または有益な処置を達成するために、必要な投薬量でかつ必要な期間にわたって、十分な量を指す。有効量を１または複数回の投与で送達することができる。投与が、疾患または病状を有することが既に分かっているまたは確認された対象への投与である場合、用語「治療量」を、処置に関して使用することができ、これに対して「予防有効量」を、疾患もしくは病状（例えば、再発）に罹りやすいまたは疾患もしくは病状を発症するリスクがある対象に有効量を予防的コースとして投与することを記述するために、使用することができる。

【0157】

ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載されるおよび当技術分野において日常的に実施されている非常に多くの免疫学的方法のいずれか１つによって決定することができる。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、例えばＴ細胞により発現される本明細書に記載されるＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質のいずれか１つの投与の前および後に、決定することができる。ＣＴＬ活性を決定するための細胞傷害性アッセイは、当技術分野において日常的に実施されているいくつかの技法および方法のいずれか１つを使用して行うことができる（例えば、Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), pages 1127-50およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。

【0158】

抗原特異的Ｔ細胞応答は、観察されるＴ細胞応答を本明細書に記載されるＴ細胞の機能的パラメーター（例えば、増殖、サイトカイン放出、ＣＴＬ活性、変更された細胞表面マーカー表現型など）のいずれかに従って比較することによって、通常は決定され、この比較は、適切な状況で同族抗原（例えば、免疫適合性抗原提示細胞により提示されたときにＴ細胞をプライミングまたは活性化するために使用される抗原）に曝露されるＴ細胞と、構造的に異なるまたは無関係の対照抗原の代わりに曝露される同じ供給源の集団からのＴ細胞との間で行われ得る。統計的有意性をもって、対照抗原に対する応答より大きい、同族抗原に対する応答は、抗原特異性を示す。

【0159】

本明細書に記載のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}含有抗原ペプチドに対する免疫応答の存在およびレベルを決定するために、生体試料を対象から得ることができる。「生体試料」は、本明細書で使用される場合、血液試料（ここから、血清または血漿を調製することができる）、生検材料、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または対象もしくは生物学的供給源からの任意の他の組織もしくは細胞調製物であり得る。生体試料をいずれの免疫原性組成物を受ける前の対象から得ることもでき、この生体試料は、ベースライン（すなわち、免疫処置前）データを確立するための対照として有用である。

【0160】

本明細書に記載される医薬組成物は、単位用量または複数用量用容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに入っている状態で提供することができる。そのような容器を凍結して、製剤の安定性を保つことができる。ある特定の実施形態では、単位用量は、本明細書に記載される組換え宿主細胞を約１０^７細胞／ｍ^２〜約１０^１１細胞／ｍ^２の用量で含む。例えば、非経口もしくは静脈内の投与または製剤を含む、様々の処置レジメンにおける、本明細書に記載される特定の組成物の使用に好適な投薬レジメンおよび処置レジメンの開発。

【0161】

対象組成物が非経口投与される場合、その組成物は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液も含み得る。好適な非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒としては、水、リンゲル液、等張塩類溶液、水との混合物での１，３−ブタンジオール、エタノール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール（polythethylene glycol）が挙げられる。水溶液または水性懸濁液は、１つまたは複数の緩衝剤、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたは酒石酸ナトリウムをさらに含むことができる。もちろん、いずれの投薬単位製剤の調製に使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋でなければならず、利用される量で実質的に非毒性でなければならない。加えて、活性化合物を、徐放性調製物および製剤中に組み込むことができる。投薬単位形態は、本明細書で使用される場合、処置される対象にとって単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な医薬担体と共同で所望の治療効果を生じさせるように計算された所定量の組換え細胞または活性化合物を含有し得る。

【0162】

一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的または予防的恩恵をもたらすのに十分な量で、活性分子または細胞を提供する。そのような応答は、処置されていない対象と比較して処置された対象において臨床成績向上（例えば、より高頻度の寛解、完全もしくは部分的、またはより長い無病生存期間）を確立することによって、モニタリングすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般に、臨床成績向上と相関する。そのような免疫応答は、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して、一般に評価することができ、前記アッセイは、当技術分野において日常的であり、処置前および後に対象から得た試料を使用して行うことができる。

【0163】

なおさらなる態様では、本開示による宿主細胞を含む単位用量形態が提供される。

【0164】

本開示による方法は、併用療法で疾患または障害を処置するために１つまたは複数の追加の薬剤を投与することをさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、併用療法は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を免疫チェックポイント阻害剤とともに（併せて、同時に、または逐次的に）投与することを含む。一部の実施形態では、併用療法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を刺激性免疫チェックポイント剤のアゴニストとともに投与することを含む。さらなる実施形態では、併用療法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を第２の治療、例えば、化学療法剤、放射線治療、外科手術、抗体またはそれらの任意の組合せとともに投与することを含む。

【0165】

本明細書で使用される場合、用語「免疫抑制（immune suppression）剤」または「免疫抑制（immunosuppression）剤」は、免疫応答の制御または抑制を補助するための阻害性シグナルをもたらす１つまたは複数の細胞、タンパク質、分子、化合物または複合体を指す。例えば、免疫抑制剤は、免疫刺激を部分的にもしくは完全に遮断する、免疫活性化を減少、予防もしくは遅延させる、または免疫抑制を増加、活性化もしくは上方調節する分子を含む。標的化する（例えば、免疫チェックポイント阻害剤で）ための例示的な免疫抑制剤としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、ＰＶＲ１Ｇ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＰＶＲＬ２、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５）、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。

【0166】

免疫抑制剤阻害剤（免疫チェックポイント阻害剤とも呼ばれる）は、化合物、抗体、抗体断片もしくは融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体、例えば、ＣＴＬＡ４−ＦｃもしくはＬＡＧ３−Ｆｃ）、アンチセンス分子、リボザイムもしくはＲＮＡｉ分子、または低分子量有機分子であり得る。本明細書において開示される実施形態のいずれにおいても、方法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、単独でのまたは任意の組合せでの下記の免疫抑制成分のいずれか１つに対する１つまたは複数の阻害剤とともに、投与することを含み得る。

【0167】

ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ＰＤ−１特異的抗体またはその結合断片、例えば、ピディリズマブ、ニボルマブ（キートルダ、旧名ＭＤＸ−１１０６）、ペムブロリズマブ（オプジーボ、旧名ＭＫ−３４７５）、ＭＥＤＩ０６８０（旧名ＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４、ＢＭＳ−９３６５５８、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。さらなる実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＰＤ−Ｌ１特異的抗体またはその結合断片、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アテゾリズマブ（ＲＧ７４４６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0168】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＬＡＧ３阻害剤、例えば、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ−９８６０１６、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0169】

ある特定の実施形態では、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質は、ＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合断片、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＧＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0170】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ｂ７−Ｈ３特異的抗体またはその結合断片、例えば、エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）、３７６．９６、または両方と組み合わせて使用される。Ｂ７−Ｈ４抗体結合断片は、例えば、Dangaj et al., Cancer Res.73:4820, 2013に記載されているｓｃＦｖまたはその融合タンパク質、ならびに米国特許第９，５７４，０００号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ／２０１６４０７２４Ａ１およびＷＯ２０１３／０２５７７９Ａ１に記載されているものであり得る。

【0171】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＤ２４４の阻害剤と組み合わせて使用される。

【0172】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＢＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０の阻害剤、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。抗ＣＤ１６０抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０８４１５８に記載されている。

【0173】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＴＩＭ３の阻害剤と組み合わせて使用される。

【0174】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ｇａｌ９の阻害剤と組み合わせて使用される。

【0175】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、アデノシンシグナル伝達の阻害剤、例えば、デコイアデノシン受容体と組み合わせて使用される。

【0176】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ａ２ａＲの阻害剤と組み合わせて使用される。

【0177】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＫＩＲの阻害剤、例えばリリルマブ（ＢＭＳ−９８６０１５）と組み合わせて使用される。

【0178】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、阻害性サイトカイン（通常は、ＴＧＦβ以外のサイトカイン）またはＴｒｅｇ発生もしくは活性の阻害剤と組み合わせて使用される。

【0179】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＩＤＯ阻害剤、例えば、レボ-１-メチルトリプトファン、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０；Liu et al., Blood 115:3520-30, 2010）、エブセレン（Terentis et al., Biochem.49:591-600, 2010）、インドキシモド、ＮＬＧ９１９（Mautino et al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013）、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）−チラ−パザミン、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0180】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、アルギナーゼ阻害剤、例えば、Ｎ（オメガ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−オメガ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−ＮＯＨＡ、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0181】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＶＩＳＴＡの阻害剤、例えばＣＡ−１７０（Ｃｕｒｉｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）と組み合わせて使用される。

【0182】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＴＩＧＩＴの阻害剤、例えばＣＯＭ９０２（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）など、ＣＤ１５５の阻害剤、例えばＣＯＭ７０１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）など、または両方と組み合わせて使用される。

【0183】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＰＶＲＩＧの阻害剤、ＰＶＲＬ２の阻害剤、または両方と組み合わせて使用される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１３４３３３に記載されている。抗ＰＶＲＬ２抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０２１５２６に記載されている。

【0184】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）はＬＡＩＲ１阻害剤と組み合わせて使用される。

【0185】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＥＡＣＡＭ−１の阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ−３の阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ−５の阻害剤、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。

【0186】

ある特定の実施形態では、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、刺激性免疫チェックポイント分子の活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）薬剤と組み合わせて使用される。例えば、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト（例えば、ウレルマブなど）、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）アゴニスト（例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、またはＭＥＤＩ０５６２など）、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＤ２７アゴニスト（例えば、ＣＤＸ−１１２７など）、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、またはＣＤ８６など）、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＰ−８７０，８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、またはＳＧＮ−４０など）、ＣＤ１２２アゴニスト（例えば、ＩＬ−２など）、ＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１６／０５４６３８に記載されているヒト化モノクローナル抗体など）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のアゴニスト（例えば、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ ８８．２、ＪＴＸ−２０１１、Ｉｃｏｓ １４５−１、Ｉｃｏｓ ３１４−８など、またはそれらの任意の組合せ）と組み合わせて使用することができる。本明細書において開示される実施形態のいずれにおいても、方法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、単独でのまたは任意の組合せでの上述のいずれかを含む、刺激性免疫チェックポイント分子についての１つまたは複数のアゴニストとともに投与することを含み得る。

【0187】

ある特定の実施形態では、併用療法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）と、非炎症型固形腫瘍により発現されるがん抗原に特異的である抗体もしくはその抗原結合断片、放射線処置、外科手術、化学療法剤、サイトカイン、ＲＮＡｉのうちの１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せを含む、第２の治療とを含む。

【0188】

ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を投与すること、および放射線処置または外科手術をさらに施すことを含む。放射線治療は、当技術分野において周知であり、Ｘ線治療、例えばガンマ線照射、および放射性医薬品治療を含む。対象における所与のがんまたは非炎症型固形腫瘍の処置に適切な外科手術および外科的技法は、当業者には周知である。

【0189】

ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、本開示のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質（または前記ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を投与すること、および化学療法剤をさらに投与することを含む。化学療法剤は、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗薬（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、および糖修飾類似体）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（例えば、挿入剤）、およびＤＮＡ修復阻害剤を含むが、これらに限定されない。実例となる化学療法剤は、これらに限定されないが、以下の群を含む：代謝拮抗薬／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖性／抗有糸分裂剤、これには、天然産物、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン（merchlorehtamine）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テモゾロミド（temozolamide）、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））が含まれる；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身代謝させ、独自のアスパラギンを合成する能力がない細胞を欠乏させる、Ｌ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トリアゼン（trazene）−ダカルバジン（dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；分泌抑制剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；キメラ抗原受容体；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（methylpednisolone）、プレドニゾン、およびプレニゾロン（prenisolone））；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤、毒素、例えば、コレラ毒素、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル酸シクラーゼ毒素、またはジフテリア毒素、およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊剤。

【0190】

サイトカインは、抗がん活性に対する宿主免疫応答を操作するために使用されることが増えている。例えば、Floros & Tarhini, Semin.Oncol.42(4):539-548, 2015を参照されたい。免疫抗がんまたは抗腫瘍応答の促進に有用なサイトカインとしては、例えば、単独での、または本開示の結合タンパク質もしくは結合タンパク質を発現する細胞との任意の組合せでの、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。

【0191】

別のがん治療アプローチは、癌遺伝子の、ならびにがん細胞による成長、維持、増殖および免疫回避に必要な他の遺伝子の、発現を低減させることを含む。ＲＮＡ干渉、特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用は、がん遺伝子の発現をノックダウンするアプローチを提供し（例えば、Larsson et al., Cancer Treat.Rev. 16(55):128-135, 2017を参照されたい）、そのアプローチを、本開示の結合タンパク質または結合タンパク質を発現する細胞と組み合わせて使用することができる。

【0192】

本明細書において開示される実施形態のいずれにおいても、治療剤（例えば、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的結合タンパク質または操作された宿主細胞、免疫抑制成分の阻害剤、刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニスト、抗腫瘍リンパ球、化学療法剤、放射線治療、外科手術、サイトカインまたは阻害性ＲＮＡ）のいずれかを、処置過程にわたって対象に１回または１回より多く投与することができ、組合せの場合は、任意の順序または任意の組合せで対象に投与することができる。治療剤の適切な用量、好適な投与期間および頻度は、患者の状態；腫瘍またはがんのサイズ、タイプ、拡散、成長および重症度；活性成分の特定の形態；ならびに投与方法などの因子によって、決定される。

【実施例】

【0193】

（実施例１）
黒色腫患者におけるＣＤ４^＋ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｔ細胞の同定
５２歳男性は、左脚に発生したステージＩＩＩＣ、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異黒色腫を呈し、彼に広範囲切除術、リンパ節郭清術およびアジュバントイピリムマブでの処置を施した。１年のイピリムマブ完了の少し前に、彼は、彼の左脚部における３つのｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移の切除を必要とし、そして３ヶ月後にさらなるｉｎ−ｔｒａｎｓｉｔ転移の切除を必要とした。その後、彼は、進行して３ｃｍの左腸骨リンパ節転移および左大腿部の軟部組織に結節性ＦＤＧ ａｖｉｄ病変を有した（図１Ａ）。全エクソームシークエンシングおよびＴＩＬの拡大のために腸骨リンパ節を切除し、その後、この患者に、リンパ球枯渇化学療法に従ってＴＩＬ注入を施した。左大腿部病変が解消され、患者は、治療の２７ヶ月後に無病のままである。

【0194】

精製腫瘍細胞および正常組織の全エクソームおよびＲＮＡシークエンシングで、表１に示す、２０のみの非同義ミスセンス変異を同定した：（左から２および３列目）；左から４〜６列目：コードされた非同義変異を包含する２７ｍｅｒペプチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡ−Ｓｅｑ中の変異の存在（左から４〜６列目）；（左から７および８列目）変異を含む操作された２０ｍｅｒペプチド；ならびに１００万あたりの転写物数（ＴＰＭ）の単位でのＲＮＡ−ｓｅｑ発現。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0195】

表１には示さなかったが、各変異についての染色体位置（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９参照アセンブリを使用して）およびバリアントアレル頻度（ＶＡＦ）も決定した。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}変異についてのＶＡＦは、３５．４％であった。

【0196】

可能性のあるこれらのネオ抗原に対するＴ細胞応答を、ＴＩＬ療法後の患者から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を２０の変異の各々に隣接しているペプチドのプールで刺激することにより評価した。候補ネオ抗原に対するＣＤ８^＋Ｔ細胞応答は検出されなかったが、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を包含する２０ｍｅｒペプチドに特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が同定された。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}反応性Ｔ細胞をＩＦＮ−γ捕捉により精製し、これらのＴ細胞は、変異型ＢＲＡＦペプチドでパルスした自己Ｂ細胞を認識するが、野生型ＢＲＡＦペプチドでパルスした自己Ｂ細胞を認識しないことを示した。これにより、変異型ペプチドに対する特異性が確証される（図１Ｂ）。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}がクラスＩＩ ＭＨＣ^＋ＡＰＣによりプロセシングされ、提示されるかどうかを決定するために、自己Ｂ細胞に、エンドソームに標的化された野生型または変異型ＢＲＡＦ配列をコードするｍＲＮＡを、トランスフェクトした。Ｔ細胞は、変異型ＢＲＡＦを発現するＢ細胞を認識したが、野生型ＢＲＡＦを発現するＢ細胞を認識しなかった（図１Ｃ）。

【0197】

認識は、抗ＨＬＡ−ＤＱによって遮断されたが、抗クラスＩ抗体によっても、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によっても遮断されず、このことからＨＬＡ−ＤＱを、可能性のある拘束アレルとして同定した（図１Ｄ）。遺伝子型が分かっている複数のＢ細胞株の分析は、ＤＱＢ１＊０３０１の弱い認識ならびにＤＱＢ１＊０３０２およびＤＱＢ１＊０３０３のより強い認識に伴う、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３と対合したＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３による拘束性を示唆した（図１Ｆおよび表２）。

【0198】

【表2-1】

【表2-2】

【0199】

完全患者ＨＬＡ型判定は、次のとおりであった：Ａ＊１１：０１：０１／Ａ＊２４：０２：０１；Ｂ＊１５：０１：０１／Ｂ＊４０：０１：０２；Ｃ＊０３：０３：０１／Ｃ＊０３：０４：０１；ＤＰＡ１＊０１：０３：０１／ＤＰＡ１＊０１：０３：０１；ＤＰＢ１＊０４：０１：０１／ＤＰＢ１＊０４：０１：０１；ＤＱＡ１＊０３：０１：０１／ＤＱＡ１＊０３：０２；ＤＱＢ１＊０３：０２：０１／ＤＱＢ１＊０３：０３：０２；ＤＲＢ１＊０４：０３：０１／ＤＲＢ１＊０９：０１：０２；ＤＲＢ４＊０１：０３：０１／ＤＲＢ４＊０１：０３：０２。

【0200】

ＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３またはＤＱＢ１＊０３０２をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬは、変異型ペプチドでパルスしたときＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞により認識されたが、密接に連鎖したＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４をトランスフェクトしたＢ−ＬＣＬは認識されなかった。これにより、ＨＬＡ拘束性が確証される（図１Ｅ）。

【0201】

ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０２およびＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}遺伝子型を有する３つの黒色腫細胞株の認識を試験した。最大量のＨＬＡ−ＤＱを発現した１つの腫瘍細胞株は、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞により認識された。これにより、エピトープが、腫瘍細胞によって直接提示され得ることが実証される（図１Ｇ〜１Ｉ）。腫瘍特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、直接細胞を殺滅することおよびサイトカインを放出することによって抗腫瘍活性を有することができる（例えば、Quezada et al., J. Exp.Med.207(3):637-650 (2010); Manici et al., J. Exp.Med.189(5):871-876 (1999)を参照されたい）が、主要な役割は、ＡＰＣのライセンス化およびサイトカインの産生によりＣＤ８^＋Ｔ細胞の発生および機能を支援することである（例えば、Sun and Bevan, Science 300(5617):339-342 (2003); Williams et al., Nature 441(7095):890-893 (2006)を参照されたい）。養子移入ＴＩＬは、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞を含有したが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＴＩＬ中に広く認められる集団であった（表３）。手短に述べると、患者に注入した最終ＴＩＬ産物をフローサイトメトリーにより表現型について分析し、ＰＭＡ／イオノマイシンでの刺激後、サイトカインについて細胞内染色した。表３に示す百分率は、ＣＤ４５＋細胞（上部）またはＣＤ４もしくはＣＤ８細胞（下部）の百分率である。

【表3】

【0202】

さらに、自己腫瘍での複数の独立したＴＩＬ培養物の刺激により産生されたＩＦＮ−γの大部分が、ＨＬＡクラスＩ遮断抗体により遮断された（表４）。

【表4】

【0203】

腫瘍エクソームシークエンシングにより同定した２０の非同義変異の全てを含むペプチドのプールでパルスした自己Ｂ細胞とともにＴＩＬを培養したとき、ＩＦＮ−γ産生は観察されなかった（図２Ａ）が、ＩＦＮ−γは、黒色腫におけるＴ細胞の公知標的である系列限定自己抗原（チロシナーゼ、Ｍａｒｔ−１、ＴＲＰ２）およびがん精巣抗原（Ｍａｇｅ Ａ３）（例えば、Gros et al.Nat. Med.2016を参照されたい）からのペプチドでパルスした（図２Ｆ）または２９の非同義変異を包含するタンデムミニ遺伝子をもしくはチロシナーゼ、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｒｔ１、ＳＳＸ２およびＧＰ１００のコード配列をトランスフェクトした（図２Ｂ〜２Ｅ）Ｂ細胞との共培養後に産生された。このように、患者ＴＩＬは、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞、および自己抗原に対する異なるＣＤ８^＋Ｔ細胞応答を含有した。
臨床プロトコール

【0204】

ＦＤＡ承認ＩＮＤ、およびフレッド・ハッチンソンがん研究センターの治験審査委員会（the Institutional Review Board of Fred Hutchinson Cancer Research Center）により承認された臨床プロトコール（ＦＨＣＲＣ ２６４３；ＮＣＴ０１８０７１８２）に従って、患者をＴＩＬ生成に登録した。ステージＩＶ黒色腫、または外科手術により治癒する見込みのないステージＩＩＩであり、＞１８歳であり、ＥＣＯＧ＜／＝１であり、転移性疾患部位を安全に切除または生検することができる患者が、適格であった。米国国立がん研究所の外科部門（the Surgery Branch of the National Cancer Institute）において開発された方法論（例えば、Dudley et al., J. Immunother. 24(4):363-373 (2002)）を使用して、６，０００ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ−２（プロロイキン；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）中で腫瘍断片からＴＩＬを拡大した。自己腫瘍細胞との共培養後にＩＦＮ−γ分泌により決定した細胞成長および自己腫瘍反応性に基づいて、ＴＩＬ培養を選択した。使用が必要となるまでＴＩＬを凍結保存し、次に解凍し、以前に記載されたような迅速拡大プロトコール（Riddell and Greenberg, J. Immunological Methods 128(2):189-201 (1990)）を使用してさらに拡大した。拡大されたＴＩＬを、シクロホスファミド ６０ｍｇ／ｋｇ／日×２日、次いでフルダラビン ２５ｍｇ／ｍ^２／日×５日のリンパ球枯渇化学療法レジメン後に、患者に投与した。ＴＩＬ注入から２４時間以内に、６００，０００ＩＵ／ｋｇ ＩＶでの高用量のＩＬ−２の合計９用量を８時間ごとに患者に施した。ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１を使用して、ＣＴおよびＭＲＩで、６、１２および２４週目に、その後、３〜６ヶ月ごとに、主要提供者の自由裁量で腫瘍応答を評定した。
エクソーム捕捉およびＲＮＡシークエンシングのための核酸調製

【0205】

処置後の血液を使用して、非腫瘍ＤＮＡを単離した。腸骨リンパ節腫瘍再発から得た単個細胞懸濁液をフローソート（ヨウ化プロピジウム陰性およびＣＤ４５陰性）して、存在量が多い浸潤リンパ球を枯渇させて新生物細胞を富化した。正常組織およびソートされた腫瘍細胞をＱｉａｇｅｎ ＤＮＡ／ＲＮＡ ＡｌｌＰｒｅｐ Ｍｉｃｒｏキットで処理して、エクソーム捕捉のためのＤＮＡを単離し、その後のＲＮＡ−ｓｅｑプロファイリングのためにＲＮＡを確保した。ゲノムＤＮＡ濃度を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＴｒｉｎｅａｎ ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６分光光度計（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ、ＭＡ）で定量した。
全エクソームシークエンシング

【0206】

Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを使用してエクソームシークエンシングライブラリーを調製し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｌｌ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ ｖ６（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してエクソン標的を単離した。Ｃｏｖａｒｉｓ ＬＥ２２０一点集中型超音波照射装置（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して２００ｎｇのゲノムＤＮＡを断片化し、Ｓｃｉｃｌｏｎｅ ＮＧＳｘ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）でライブラリーを調製し、捕捉した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎを使用して、ライブラリーサイズ分布を検証した。Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して、追加のライブラリーＱＣ、プールされたインデックス付きライブラリーのブレンディング、およびクラスター最適化を行った。

【0207】

結果として得たライブラリーを、ペアードエンド１００ｂｐ（ＰＥ１００）戦略を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００でシークエンシングした。ＩｌｌｕｍｉｎａのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｖ１．１８ソフトウェアを使用して画像解析および塩基コーリングを行い、その後、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｂｃｌ２ｆａｓｔｑ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．８．４（http://support.illumina.com/downloads/bcl2fastq_conversion_software_184.html）を使用して、インデックス付きリードの「逆多重化」およびＦＡＳＴＱファイルの生成を行った。標準Ｉｌｌｕｍｉｎａクオリティフィルターを通過したリードペアをさらなる分析のために保持し、腫瘍用の７７Ｍのリードペアおよび正常用の８９Ｍのリードペアを得た。ＢＷＡ−ＭＥＭショートリードアライナーでペアリードをヒトゲノムリファレンス（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にアラインメントした（例えば、Li, H., arXiv preprint arXiv:1303.3997 (2013); Li and Rudbin, Bioinfomatics 25(14):1754-1760を参照されたい）。標準ＢＡＭ形式の得られたアラインメントファイルを、推奨された最良の実施（Auwera et al., Current Protocols in Bioinformatics pp. 11.10.1-11.10.33 (2013)を参照されたい）に従って、クオリティスコア再較正、インデル再アラインメントおよび重複除去のためにＰｉｃａｒｄ ２．０．１およびＧＡＴＫ ３．５［３７］によって処理した。

【0208】

次の３つの独立したソフトウェアパッケージを使用して、分析の準備が整った腫瘍および正常ＢＡＭファイルから体細胞変異をコールした：ＭｕＴｅｃｔ １．１．７［３９］、Ｓｔｒｅｌｋａ １．０．１４［４０］、およびＶａｒＳｃａｎ．ｖ２．４．１（Koboldt et al., Genome Res.22(3):568-576 (2012)）。ＶＣＦ形式での全てのツールからのバリアントコールにＯｎｃｏｔａｔｏｒでアノテーションを付与した（Ramos et al., Human Mutation 36(4):E2423-E2429 (2015)）。ミスセンス体細胞バリアントを組み合わせ、野生型およびバリアントペプチド配列を含むアノテーションをさらに付与して、統合された要約を作り上げ、そこから候補ペプチドを合成のために選択した。
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータ処理

【0209】

観察発現レベルにより候補ペプチドをランク付けするために、同じ単個細胞懸濁液からのフローソートされた腫瘍細胞を用いてＲＮＡ−ｓｅｑを行った。ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ ｖ２ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＳｃｉｃｌｏｎｅ ＮＧＳｘ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡからＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ ２２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ライブラリーサイズ分布を検証した。Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、追加のライブラリーＱＣ、プールされたインデックス付きライブラリーのブレンディング、およびクラスター最適化を行った。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００でシークエンシングして、１３３Ｍの５０ｎｔペアリード（ＰＥ５０）を生成した。ＲＳＥＭ １．２．１９（Li and Dewer, BMC Bioinformatics 12(1):323 (2011)を参照されたい）を用いて、リードをＲｅｆＳｅｑ由来参照トランスクリプトームにアラインメントした。ＴＰＭ単位でのＲＳＥＭからの遺伝子レベル発現値を、ミスセンス体細胞バリアントのサマリに加えた。
Ｔ細胞培養

【0210】

各変異にまたがる２つのペプチドがあり、２０アミノ酸配列の＋７または＋１３位に変異残基がある、Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから入手した重複２０ｍｅｒ粗ペプチドを用いて、初回刺激を行った。後続の実験は、＋１１位にＶ６００（野生型）またはＥ６００（変異型）がある、純度＞８０％の２１ｍｅｒペプチドを用いて行った。凍結保存ＰＢＭＣを解凍し、一晩、ＣＴＬ（１０％ヒト血清（施設内で産生された）、５０μＭのベータ−メルカプトエタノール、ペニシリンおよびストレプトマイシン、４ｍＭのＬ−グルタミンおよび２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した、Ｌ−グルタミンおよびＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＲＰＭＩ培地）中で静置した。翌朝、ＰＢＭＣを洗浄し、６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｍｌ ＣＴＬ中１×１０^６細胞でのＰＢＭＣを、サイトカインを含まない各ペプチドの１μｇ／ｍｌのプールで刺激した。組換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を＋３日目に１０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、ＩＬ−２補充による半培地交換を＋３、＋６および＋９日目に行った。＋１３日目に、細胞をＥＬＩＳＡおよびサイトカイン染色アッセイに使用した。

【0211】

ＩＦＮ−γ分泌アッセイＡＰＣ（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ）を製造業者の指示に従って使用し、１０μｇ／ｍｌの２１ｍｅｒ ＢＲＡＦ変異型ペプチドでパルスした抗原提示細胞としての自己Ｂ細胞を使用して、生細胞を分泌ＩＦＮ−γについて染色することにより、抗原特異的Ｔ細胞富化を行った。ＣＤ４^＋ＩＦＮ−γ分泌細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ２でソートした。ソートされた細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１５を補充したＣＴＬ中で５日間静置し、その後、以前に記載された迅速拡大プロトコール（Riddell and Greenberg、上掲）を使用して拡大した。抗Ｖβ ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＴＣＲ２７４０）での染色によりＶβ３．１陽性のＣＤ４^＋細胞についてソートすることによって抗原特異的Ｔ細胞をさらに富化し、拡大し、拡大後１３または１４日目に凍結保存した。アッセイの前に、凍結保存細胞を解凍し、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を補充したＣＴＬ中で一晩静置した。
抗原提示細胞

【0212】

ＣＤ１９を認識する抗体で被覆された磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０５０−３０１）および磁気ポジティブセレクションを製造業者の指示（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従って使用して、新鮮または解凍ＰＢＭＣから自己Ｂ細胞を単離した。初代Ｂ細胞を、記載されたように（Tran et al., Science 344(3184):641-645 (2014)を参照されたい）、２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＢ細胞培地中で、７日間、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するＮＩＨ ３Ｔ３細胞とともに１：１の比でインキュベートした。その後、Ｂ細胞を回収し、３Ｔ３ ＣＤ４０Ｌおよび新鮮培地で３日ごとに再刺激した。２回目または３回目の刺激から＋３日目にＢ細胞をアッセイに使用した。
サイトカイン放出アッセイ

【0213】

ＥＬＩＳＡアッセイでは、５０，０００個のエフェクターＴ細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、５％熱不活性化ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中の１００，０００個のＢ細胞またはＢ−ＬＣＬ株および１０μｇ／ｍｌまたは特定の濃度のペプチドとともにインキュベートした。ｒｅａｄｙ ｓｅｔ ｇｏヒトＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡキット（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を技術的三重反復（technical triplicate）において使用して、上清中のＩＦＮ−γを定量した。ペプチドを添加する１時間前に、２０μｇ／ｍｌの抗体 抗クラスＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１１４１１）抗ＨＬＡ ＤＲ（クローンＬ２４３、カタログ番号３０７６１１）およびＨＬＡ−ＤＱ（Ａｂｃａｍ、クローンｓｐｖ−ｌ３、カタログ番号ａｂ２３６３２）を添加して、ＨＬＡ遮断実験を行った。エリスポットアッセイのために、ヒトＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ−Ｐｒｏキット（Ｍａｂｔｅｃｈ）を使用し、製造業者の指示を使用して生じさせた、ＣＴＬ培地中１０μｇ／ｍｌの最終濃度の各ペプチドのペプチドプールでパルスした２００，０００個の自己Ｂ細胞とともに、５０，０００個の腫瘍浸潤リンパ球をインキュベートした。
ＨＬＡ同定

【0214】

ＬＣＬ細胞株１３３１、ＤＵＣＡＦ、ＶＡＶＹ、ＢＭ１４、ＤＥＭおよびＤＥＵを利用した。共培養アッセイについては、ＬＣＬ細胞株を１０μｇ／ｍｌのＢＲＡＦ変異型ペプチドまたはＤＭＳＯ対照で４時間にわたってパルスし、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。特異的クラスＩＩアレルの同定のために、ＨＬＡ−ＤＱＡ１ ０３０１タンパク質にＴ２Ａスキップ配列によって連結させたＨＬＡ−ＤＲＢ１ ０４０４タンパク質またはＨＬＡ−ＤＱＢ１ ０３０２タンパク質をコードするコドン最適化線状ＤＮＡ断片を、Ｇｅｎｅｓｔｒｉｎｇｓ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して合成し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で線状化したベクターＭＰ７１（Engels et al., Hum. Gene Ther. 14(12):1155-1168 (2003)）にクローニングし、配列を検証した。Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒら（Leukemia, 2015)）により記載されたように、ＨＬＡ ＤＲＢ１ ０３０１、ＤＱＡ１ ０５０１およびＤＱＢ１ ０２０１についてホモ接合性のＶＡＶＹ細胞株（研究用セルバンク）へのレトロウイルス形質導入を行った。抗体ＤＲＢ１−ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６２３０３）を使用してＤＲＢ１ ０４０４に対して陽性の細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ２ソーターでソートし、抗ＤＱ抗体クローンＨＬＡＤＱ１−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８１０４）を使用してＤＱＢ１ ０３ ＤＱＡ１ ０３に対して陽性の細胞をソートした。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドでパルスして、またはせずに、アッセイを行った。ＥＬＩＳＡ実験は、示したように技術的二重反復または三重反復で行ったものであり、２回の独立した実験の代表である。
（実施例２）
ＴＩＬによるＴＣＲ遺伝子使用の同定

【0215】

ディープシークエンシングを行って、ＴＩＬ中のＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的Ｔ細胞および他のＴ細胞におけるＴＣＲ遺伝子使用を同定した。３つのＴＣＲ Ｖβクローン型は、処置後ＰＢＭＣのＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチドでの刺激後に顕著な拡大を示し、これらの配列は、ＩＦＮ−γ捕捉後にさらに富化された。これは、変異型ペプチドに対するそれらの特異性を示す（図２Ｇ）。腫瘍、ＴＩＬ、およびＴＩＬ注入前に得たＰＢＭＣについての、ＴＣＲ Ｖβシークエンシングにより、ＴＣＲ Ｖβクローンが腫瘍では３つ全ておよびＴＩＬでは３つのうち２つ同定された。３つ全てのＴＣＲ Ｖｂ配列が、処置前ＰＢＭＣでは検出レベル未満であった。これは、腫瘍部位での富化を示す（図２Ｈ）。合計３４の共通Ｖβ配列が、合わせてＴＩＬ産物の＞５０％を構成した（図２Ｉ）。これら３４クローンのうちの５つのみが処置前の血液で検出され、４つは非常に低頻度であった（図２Ｊ）。その４つの系列特異的またはＣ／Ｔ抗原の各々を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子使用を評定するために、ＩＦＮ−γ捕捉を使用して、ＴＩＬからこれらの細胞をソートし、ＴＣＲ Ｖβ使用を評定した。ソートされた細胞において７つの異なるＶβ配列が同定され、ＴＩＬ産物中のＴ細胞の４．７％に相当した（図２Ｌ〜２Ｏ）。これら７つのクローン型およびＢＲＡＦ特異的クローンの１つが、処置の１０および２４ヶ月後に得た血液中で検出された（図２Ｊおよび２Ｋ）。抗原のクラスＩ ＭＨＣソーティングシグナルへの融合により抗原がエンドソームに標的化される、Ｋｒｅｉｔｅｒら（J. Immunol. 180(1):309-318 (2008)）により記載された方法を使用して、エンドソームに標的化したＲＮＡ発現を行った。ヒトＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＮ末端２５アミノ酸に融合したＴ７プロモーター、続いて、ＢａｍＨＩ制限部位、増強ＧＦＰのコード配列、ＡｇｅＩ制限部位、ヒトＨＬＡ−Ｂ遺伝子のＣ末端５５アミノ酸、続いてヒトベータグロビン非翻訳領域、続いて３０ヌクレオチドポリＡテール、続いて、そのポリＡテール内での切断を方向付けるＳａｐＩ制限部位を含有する、ｍＲＮＡ発現構築物ｐＪＶ５７を、遺伝子合成により構築した（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。Ｅ６００置換を含有する５’ＡｇｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位が隣接しているＢＲＡＦアミノ酸５７５〜６２４をコードする、アニールされたオリゴヌクレオチド（Ｕｌｔｒａｍｅｒｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＪＶ５７にライゲーションすることにより、構築物ｐＪＶ８４をクローニングした。野生型Ｖ６００アミノ酸を含有する５’ＡｇｅＩおよび３’ＢａｍＨＩ部位が隣接しているＢＲＡＦアミノ酸５７５〜６２４をコードする、アニールされたオリゴヌクレオチド（Ｕｌｔｒａｍｅｒｓ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をライゲーションすることにより、構築物ｐＪＶ８５を作製した。次いで、ｐＪＶ８４およびｐＪＶ８５をＳａｐＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で線状化し、Ｈｉｇｈｓｃｒｉｂｅ Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｍＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、製造業者の指示に従ってリチウム沈殿法により精製した。ｍＲＮＡをＣＤ４０Ｌ刺激Ｂ細胞にエレクトロポレーションした１６時間後に、Ｔｒａｎら（上掲）により記載されたような共培養実験を行った。
（実施例３）
ＴＩＬ産物の表現型特徴付け

【0216】

ＢＲＡＦ特異的クローンの表現型分析をＴＩＬ処置後に行った（図３Ａ〜３Ｃ）。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、エフェクターメモリー表現型（ＣＤ４５ＲＡ⁻ＣＣＲ７⁻ＣＤ２７⁻ＫＬＲＧ１^＋）を示し、低レベルのＰＤ−１を発現した（図３Ａ、３Ｂ）。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的細胞の大部分が、ＣＸＣＲ３およびＣＣＲ４を発現した。細胞の小部分は、皮膚ホーミングマーカーである皮膚リンパ球関連抗原（ＣＬＡ）も発現した。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ペプチド活性化細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４およびＩＬ−２１を産生し（図３Ｃ）、これらを組み合わせて産生することもあった（データを示さない）。まとめると、これらのデータは、ＴＩＬ注入後の循環ＢＲＡＦ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、黒色腫における変異ＢＲＡＦに対する確立されたメモリー細胞免疫応答と一致した、混合Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型を有することを示唆する。
（実施例４）
ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}ＴＣＲの構築および試験

【0217】

単独での自己抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子移入後の黒色腫の永続的寛解は、極めて稀である（例えば、Johnson et al., Blood 114(3):535-546 (2009); Yee et al., PNAS 99(25):16168-16173 (2002); Dudley et al., J. Immunother. 24(4):363-373 (2001)を参照されたい）。理論により拘束されることを望まないが、ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞は、抗腫瘍効果を方向付け、ネオ抗原をほとんど含有しない腫瘍に対する自己抗原反応性ＣＤ８^＋Ｔ細胞の存続性および機能を補助すると考えられる。ＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＨＬＡ−ＤＱＡ１＊０３／ＤＱＢ１＊０３拘束アレルは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｗｏｒｋｇｒｏｕｐデータベース（Petersdorf, E., personal communication, International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation. 2017）における個体の２９％に存在し、この患者からのＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲ遺伝子の単離は、ＴＣＲを操作したＴ細胞でのＢＲＡＦ変異型腫瘍を有する患者に対する養子療法を容易にすることができる。様々なレベルのＢＲＡＦ反応性クローンを含有する試料に関するＴＣＲ Ｖαシークエンシングにより、三（３）つのＴＣＲ Ｖβ配列と頻度が相関する四（４）つのＴＣＲ Ｖα配列を同定した（図２Ｇ）。

【0218】

同定された三（３）つのＴＣＲＢアレルおよび四（４）つのＴＲＣＡアレルから四（４）つのＴＣＲを構築し、抗原特異的応答について試験した（図４Ａ、４Ｂおよび５）。患者からの優勢ＴＣＲ（ｐＪＶ８８）が、２名の健常ドナーからのＣＤ４^＋Ｔ細胞において発現され、野生型ＢＲＡＦ配列ではなくＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}を発現する細胞に対する特異性を付与した（図２Ｈ）。患者からの２番目に優勢なＶβクローンと可能性があるアルファ鎖のうちの１つとから作成したＴＣＲ ｐＪＶ９０は、ある程度の活性を示したが、非特異的ベースライン活性化を示す可能性もあった。
ＴＣＲ ＶｂおよびＶａシークエンシング

【0219】

Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙまたはＱｉａｍｐ ｍｉｃｒｏ ＤＮＡキットを製造業者の指示に従って使用して、臨床試料からＤＮＡを単離した。ＴＣＲＢシークエンシングは、ヒトＴＣＲＢシークエンシングキット（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を製造業者の指示に従って使用して行い、ＭｉＳｅｑ（フレッド・ハッチンソンがん研究センターのＧｅｎｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅ）を使用してシークエンシングし、Ａｄａｐｔｉｖｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙソフトウェアによりデータ解析を行った。ＴＣＲＡシークエンシングは、ヒトＴＣＲＡシークエンシングサービス（Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行った。
Ｔ細胞受容体構築

【0220】

ＴＣＲ構築は、ベクターＰＲＲＬ（Jones et al., Hum. Gene Ther. 20(6):630-640 (2009)）内であり、これを、Lim and Brown, RNA Biology 13(9):743-747 (2016))におけるようなウッドチャック肝炎ウイルスＸタンパク質の開始コドンおよび推定プロモーター領域と、ベータ鎖、続いてＰ２Ａ翻訳スキップ配列、続いて対合を容易にするためにシステインが導入されたアルファ鎖に、６つの点変異を導入することによって、さらに修飾した（Kuball et al., Blood 109(6):2331-2338 (2007)を参照されたい）。ＴＲＢＶ２８およびＣＤＲ３およびＴＲＢＪ１−３配列、続いて、残基５７がシステイン置換されているＴＣＲＢ１配列、続いて、Ｐ２Ａスキップ配列ならびにＴＲＡＶ２１およびＣＤＲ３配列、続いて、ＴＲＡＪ４３およびＴＲＡＣ配列を含有する、コドン最適化ＤＮＡ断片を、ｇｅｎｅｓｔｒｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）として合成し、ＰｓｔＩおよびＡｓｃＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で線状化したベクターＰＲＲＬ−ＳＩＮへ、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してクローニングし、配列を検証した。形質導入の１週間後、抗体クローン８Ｆ１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＴＣＲ２７４０）を使用してＶｂｅｔａ３．１発現に基づいて細胞をソートし、上で説明したように迅速拡大によって拡大した。迅速拡大から１４日目に、Ｔ細胞をアッセイに使用するかまたは凍結保存した。
（実施例５）
内在性ＴＣＲのＣＲＩＳＰＲ媒介欠失は導入遺伝子ＢＲＡＦ特異的ＴＣＲの発現増加をもたらす

【0221】

Ｔ細胞への合成Ｔ細胞受容体配列の遺伝子移入後、移入されたＴＣＲアルファおよびベータ鎖は、内在性ＴＣＲサブユニットと発現およびシグナル伝達機構について競合し得る。内在性ＴＣＲの欠失が、移入されたＴＣＲの発現を増加させるかどうかを調査するために、刺激されたＴ細胞に、内在性ＴＣＲアルファ（ガイドｒｎａ ＡＧＡＧＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＡ；配列番号１３６）およびＴＣＲベータ（ガイドｒｎａ：ＧＧＡＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣＣ；配列番号１３９）定常領域遺伝子（Ren et al., Clin. Cancer Res. 23(9):2255-2266 (2017)から）の切断を方向付けるガイドＲＮＡ配列を有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９リボヌクレオタンパク質を、先ず、トランスフェクトした。１２μＭ Ｃａｓ９タンパク質（ＩＤＴ）２０μＭ ガイドＲＮＡ（ＩＤＴ）とエレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）をアセンブリし、３μｌを、ヌクレオフェクション緩衝液Ｐ３（Ｌｏｎｚａ）中の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）での刺激の２日後に２×１０^６個の初代ヒトＴ細胞に添加し、ＡＭＡＸＡ ４Ｄヌクレオフェクションエレクトロポレーター（Ｌｏｎｚａ）を使用しプログラムＥＨ−１１５を使用してヌクレオフェクトした。この組合せは、ＴＣＲ受容体複合体のＣＤ３成分の染色により測定して、ＴＣＲ発現を有する細胞の＞９９％低減をもたらした（図６Ａ）。内在性ＴＣＲの遺伝子欠失をＢＲＡＦ^{Ｖ６００Ｅ}特異的ＴＣＲの遺伝子移入と組み合わせたとき、テトラマー染色により測定して、移入されたＴ細胞受容体の細胞表面における発現増加が観察された（図６Ｂ）。

【0222】

上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を得ることができる。本明細書において言及するおよび／または出願データシートに収載する、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献の全ては、２０１７年８月１１日に出願した米国特許仮出願第６２／５４４，６９５号を含めて、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および公表文献の概念を利用するために必要な場合、実施形態の態様を修飾して、なおさらなる実施形態を得ることができる。

【0223】

上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、下記の特許請求の範囲において使用する用語は、本明細書および本特許請求の範囲において開示する特定の実施形態に、本特許請求の範囲を限定すると解釈すべきでなく、そのような特許請求の範囲に権利がある均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示により限定されない。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図2-7】

【図2-8】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】