特表 2020-534826 真核細胞において遺伝子発現をサイレンシングするための非コードＲＮＡ分子の特異性の改変

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-534826(P2020-534826A)

(43)【公表日】2020年12月3日

(54)【発明の名称】真核細胞において遺伝子発現をサイレンシングするための非コードＲＮＡ分子の特異性の改変

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20201106BHJP

   A01K 67/027 20060101ALI20201106BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20201106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201106BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20201106BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201106BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20201106BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201106BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20201106BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20201106BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20201106BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20201106BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/113 Z

   A01K67/027ZNA

   C12N15/09 100

   C12N15/09 110

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N5/10

   A61P31/00

   A61K48/00

   A61P37/06

   A61P43/00 105

   A61P35/00

   A61K45/00

   A61P43/00 121

   A61K31/713

   A61K31/7105

   A61K38/47

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】121

(21)【出願番号】特願2020-515764(P2020-515764)

(86)(22)【出願日】2018年9月18日

(85)【翻訳文提出日】2020年5月14日

(86)【国際出願番号】IB2018057143

(87)【国際公開番号】WO2019058253

(87)【国際公開日】20190328

(31)【優先権主張番号】1715116.8

(32)【優先日】2017年9月19日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1715113.5

(32)【優先日】2017年9月19日

(33)【優先権主張国】GB

(31)【優先権主張番号】1719516.5

(32)【優先日】2017年11月23日

(33)【優先権主張国】GB

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】519428096

【氏名又は名称】トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】マオリ エヤル

(72)【発明者】

【氏名】ガランティ ヤーロン

(72)【発明者】

【氏名】ピグノッチ クリスティナ

(72)【発明者】

【氏名】チャパッロ ガルシア アンジェラ

(72)【発明者】

【氏名】メイア オフィール

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA17

4C084AA19

4C084DC22

4C084NA14

4C084ZB081

4C084ZB082

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB311

4C084ZB312

4C084ZC75

4C086AA01

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB08

4C086ZB21

4C086ZB26

4C086ZB31

(57)【要約】

真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし前記真核細胞は植物細胞ではない方法が開示される。当該方法は、目的の標的ＲＮＡに対する上記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を上記真核細胞に導入する工程を含む。真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法も開示される。疾患の予防及び処置の方法、細胞アポトーシスを誘導する方法並びに真核性非ヒト生物を生成する方法も開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし前記真核細胞は植物細胞ではなく、前記方法は、目的の標的ＲＮＡに対する前記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を前記真核細胞に導入し、それによって前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を改変する工程を含む方法。

【請求項2】

真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし前記真核細胞は植物細胞ではなく、前記方法は、前記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を前記真核細胞に導入し、それによって前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を改変する工程を含み、前記標的ＲＮＡ及び前記第２の標的ＲＮＡは異なる方法。

【請求項3】

前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子が、前記真核細胞に対して内在性である請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子が、前記真核細胞に対して内在性である請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を前記改変することが、前記非コードＲＮＡ分子に、前記目的の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項１又は請求項３に記載の方法。

【請求項6】

前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を前記改変することが、前記ＲＮＡサイレンシング分子に、前記第２の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項２又は請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記非コードＲＮＡ分子の前記サイレンシング特異性が、前記目的の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項１、請求項３又は請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が、前記第２の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項２、請求項４又は請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が表現型的に決定される請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記表現型的に決定されることは、細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の色素沈着、感染パラメータ及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型の決定によってもたらされる請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が遺伝子型的に決定される請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

表現型が遺伝子型の前に決定される請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

遺伝子型が表現型の前に決定される請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子前駆体からプロセシングされる請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＮＡｉ分子が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記非コードＲＮＡ分子が、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、及び転移因子ＲＮＡからなる群から選択される請求項１、請求項３、請求項５、請求項７及び請求項９から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ＲＮＡｉ分子が、構造のオリジナリティを保存し、細胞ＲＮＡｉ因子によって認識されるように改変される請求項１５又は請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、点突然変異及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変によって行われる請求項１から請求項１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記改変が、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域にある請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記改変が、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のループ領域にある請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記改変が、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域にある請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記改変が、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域にある請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

前記改変が、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域にある請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記改変が最大２００ヌクレオチドの改変を含む請求項１９から請求項２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む請求項１９から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＤＮＡ編集剤が、植物発現性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのｇＲＮＡを含む請求項１から請求項２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＤＮＡ編集剤が、エンドヌクレアーゼを含まない請求項１から請求項２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含む請求項１から請求項２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含む請求項１から請求項２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記エンドヌクレアーゼがＣａｓ９を含む請求項２９又は請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＤＮＡ編集剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして前記細胞に適用される請求項１から請求項３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＤＮＡ編集剤が、真核細胞における発現を監視するためのレポーターに連結される請求項１から請求項３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記レポーターが蛍光タンパク質である請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが、前記真核細胞に対して内在性である請求項１から請求項３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが癌に関連する請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが、前記真核細胞に対して外来性である請求項１から請求項３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが感染症に関連する請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記真核細胞が、哺乳動物、昆虫、線虫、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、真菌及び藻類からなる群から選択される真核生物から得られる請求項１から請求項３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記真核細胞が哺乳類細胞である請求項１から請求項３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記哺乳類細胞がヒト細胞を含む請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記真核細胞が全能性幹細胞である請求項１から請求項４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

必要とする対象において感染症を処置する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記感染症を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは、前記感染症の発症又は進行と関連する方法。

【請求項44】

必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記単一遺伝子劣性遺伝疾患と関連する方法。

【請求項45】

必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記自己免疫疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記自己免疫疾患と関連する方法。

【請求項46】

必要とする対象において癌性疾患を処置する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記癌性疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記癌性疾患と関連する方法。

【請求項47】

必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増強と関連する方法。

【請求項48】

必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導する方法であって、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において細胞アポトーシスを誘導する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記アポトーシスと関連する方法。

【請求項49】

真核性非ヒト生物を生成する方法であって、ただし前記生物は植物ではなく、前記生物の細胞の少なくともいくつかは、目的の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる改変遺伝子を含み、前記方法は、請求項１から請求項４２のいずれか一項に記載の方法に従って、遺伝子を改変し、それによって前記真核性非ヒト生物を生成する工程を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング分子を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変することに関し、より詳細には、植物細胞ではない真核細胞における目的の内在又は外来性の標的ＲＮＡ発現をサイレンシングするためのその使用に関するが、これに限定されない。

【背景技術】

【0002】

ヒトゲノムの中のおよそ２５，０００のアノテーションされた遺伝子のうちで、３，０００を超える遺伝子の中の変異は、すでに疾患表現型にリンクされており、より多くの疾患関連遺伝子変異が、驚くほど急速なペースで明らかにされつつある。疾患の影響を受ける細胞及び組織の中の核酸を改変することができる新たな治療戦略は、その明確なジェネティクスに起因して、そして多くの場合、安全で有効な代替の治療がないことに起因して、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血友病及び特定の酵素欠損症等の一遺伝子性の浸透性が高い疾患の処置のための有望性を有する。これまでに開発された最も強力な遺伝子的な治療技術のうちの２つは、ウイルス性導入遺伝子の発現により失われた遺伝子機能の修復を可能にする遺伝子治療、及び標的ｍＲＮＡのノックダウンにより欠損遺伝子の抑制を媒介するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。

【0003】

遺伝子治療は、機能的遺伝子を造血幹細胞／造血前駆細胞のゲノムに半無作為的に組み込むことにより、ＳＣＩＤ及びウィスコット・アルドリッチ症候群等の造血系に影響を及ぼす単一遺伝子劣性遺伝疾患を成功裏に治療するために使用されてきた［Ｇａｓｐａｒら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１） ３：９７ｒａ７９；Ｈｏｗｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８） １１８：３１４３−３１５０］。ＲＮＡｉは、とりわけ臨床試験において、癌、加齢黄斑変性及びトランスサイレチン（ＴＴＲ）関連アミロイドーシスに関与する遺伝子の機能を抑制するために使用されてきた。有望性及び最近の成功にもかかわらず、遺伝子治療及びＲＮＡｉは、非常に多くの疾患に対してそれらを利用することを妨げる制約を有する。例えば、ウイルスによる遺伝子治療は、組み込み部位で変異生成を引き起こして調節不全の導入遺伝子発現を生じる可能性がある［Ｈｏｗｅら（２００８）、前出］。一方、ＲＮＡｉの使用は、遺伝子ノックダウンが有益である標的に限られる。また、ＲＮＡｉは、送達されたｓｉＲＮＡの一過性に起因して、及び植物又は線虫におけるようなサイレンシング増幅機構がないことに起因して遺伝子発現を十分に抑制することができないことが多く、それゆえ、治療のために遺伝子機能の完全な抑制が必要な疾患に対して恩恵をもたらす可能性は低い。ＲＮＡに基づく治療学の現在の主要な障害は、細胞への効率的で有効なＲＮＡ送達である。いくつかの送達剤は治療的なＲＮＡエンドサイトーシスを増強することができるが、０．０１％未満のわずかに非常に小さい割合は、エンドソームから逃避し、生物活性を有する［Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ Ｄｏｗｄｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１７） ３５，２２２−２２９］。

【0004】

ゲノム編集技術における最近の進歩は、ヒト患者の細胞の中の数１０億個のヌクレオチドのうちのわずか数個を編集することにより、生細胞においてＤＮＡ配列を変化させることを可能にした。過去１０年間において、ヒトの体細胞及び多能性細胞においてゲノム編集を使用するための道具及び専門知識は、このアプローチが今ではヒト疾患を処置するための戦略として広く開発されているという程度まで増大している。この基本的なプロセスは、ゲノムにおいて部位特異的な二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を作り出し、次いで細胞の内在性のＤＳＢ修復機構に（例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え（ＨＲ）により）その切断を固定させることに依拠し、相同組換え（ＨＲ）は、正確なヌクレオチド変更がＤＮＡ配列に対して行われることを可能にすることができる［Ｐｏｒｔｅｕｓ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２０１６） ５６：１６３−９０］。

【0005】

３つの主要なアプローチが、細胞の変異原性ゲノム編集（ＮＨＥＪ）を有望な治療学として使用する：（ａ）空間的に正確な挿入又は欠失を作り出すことにより、機能的遺伝因子をノックアウトすること、（ｂ）根底にあるフレームシフト変異を相殺する挿入又は欠失を作り出すこと；従って、一部機能的又は非機能的な遺伝子を再活性化すること、及び（ｃ）明確な遺伝子欠失を作り出すこと。いくつかの異なる治療への応用がＮＨＥＪによる編集を使用するが、治療的編集の最も幅広い応用は、おそらく、相同組換え（ＨＲ）によるゲノム編集を利用することになろう。しかし、希な事象は、鋳型に依拠して修復プロセスの間に正しい配列をコピーするため、非常に正確である。

【0006】

現在、ＨＲ媒介ゲノム編集への４つの主要なタイプの治療への応用は、（ａ）遺伝子修復（すなわち、単独の遺伝子における点突然変異によって引き起こされる疾患の修正）、（ｂ）機能的遺伝子修復（すなわち、遺伝子全体にわたって散らばった変異により引き起こされる疾患の修正）、（ｃ）セーフ・ハーバー遺伝子付加（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ ｇｅｎｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ）（すなわち正確な制御が要求されない場合、又は超生理的なレベルの治療的導入遺伝子が望まれる場合）、及び（ｄ）標的導入遺伝子付加（すなわち、正確な制御が要求される場合）である［Ｐｏｒｔｅｕｓ（２０１６）、前出］。

【0007】

様々な真核生物（例えば、マウス、ヒト、エビ、植物）におけるＲＮＡ分子のゲノム編集に関する以前の研究では、例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子活性のノックアウトに焦点を当てたり、標的ＲＮＡにおけるその結合部位を変化させたりすることに焦点が当てられていた。

【0008】

ヒト細胞におけるゲノム編集に関して、Ｊｉａｎｇら［Ｊｉａｎｇら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）１１（１０）：１２４３−９］は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、ＨｅＬａ細胞におけるクラスターの５’領域を標的化することによって、そのクラスターからヒトｍｉＲ−９３を枯渇させた。ドローシャ（Ｄｒｏｓｈａ）プロセシング部位（すなわち、二本鎖ＲＮＡ特異的ＲＮアーゼＩＩＩ酵素であるドローシャが、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に結合してこれを切断し、それによって宿主細胞の核内でｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにプロセシングする位置）及びシード配列（すなわち、典型的にはｍｉＲＮＡ ５’末端から２〜７位に位置する、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に必須である保存された７塩基配列）を含む標的領域において、種々の小さいインデルが誘導された。Ｊｉａｎｇらによれば、ただ１つのヌクレオチドの欠失でさえ、高い特異性で標的ｍｉＲＮＡの完全なノックアウトをもたらした。

【0009】

マウス種におけるゲノム編集に関して、Ｚｈａｏら［Ｚｈａｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４：３９４３］は、マウス細胞においてＣＲＩＳＰＲシステムを用いるｍｉＲＮＡ阻害戦略を提供した。Ｚｈａｏは特別に設計されたｇＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９によって単一部位でｍｉＲＮＡ遺伝子を切断し、マウス細胞でｍｉＲＮＡのノックダウンをもたらした。

【0010】

植物ゲノム編集に関して、Ｂｏｒｔｅｓｉ及びＦｉｓｃｈｅｒ［Ｂｏｒｔｅｓｉ及びＦｉｓｃｈｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５） ３３：４１−５２］は、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと比較して植物におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術の使用を論じ、Ｂａｓａｋ及びＮｉｔｈｉｎ［Ｂａｓａｋ及びＮｉｔｈｉｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１５） ６：１００１］は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びタバコ、並びに小麦、トウモロコシ、及びイネのような作物等のモデル植物におけるタンパク質コード遺伝子のノックダウンのためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術の適用を教示する。

【0011】

ｍｉＲＮＡ活性又は標的結合部位の破壊に加えて、内在及び外来性の標的遺伝子の人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）媒介遺伝子サイレンシングを使用する遺伝子サイレンシングが使用された［Ｔｉｗａｒｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４） ８６：１］。マイクロＲＮＡと同様に、ａｍｉＲＮＡは、約２１ヌクレオチド（ｎｔ）長の一本鎖であり、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ内の二重鎖の成熟ｍｉＲＮＡ配列を置換することによって設計される［Ｔｉｗａｒｉら（２０１４）前出］。これらのａｍｉＲＮＡは、人工発現カセット（プロモーター、ターミネーター等を含む）内に導入遺伝子として導入され［Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０１４） １１３．２３４９８９頁］、小分子ＲＮＡ生合成及びサイレンシング機構を介してプロセシングされ、標的発現を下方制御する。Ｓｃｈｗａｂら［Ｓｃｈｗａｂら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００６） 第１８巻、１１２１−１１３３］によれば、ａｍｉＲＮＡは、組織特異的又は誘導性プロモーター下で発現された場合に活性であり、特に、関連するが同一ではないいくつかの標的遺伝子を下方制御する必要がある場合に、植物における特異的遺伝子サイレンシングに使用することができる。

【0012】

Ｓｅｎｉｓら［Ｓｅｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７） 第４５巻（１）：ｅ３］は、内在ｍｉＲＮＡ遺伝子座へのプロモーターを用いない抗ウイルスＲＮＡｉヘアピンの操作を開示している。具体的には、Ｓｅｎｉｓらは、Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮのような配列特異的ヌクレアーゼによって誘導される相同指向性ＤＮＡ組換えによって、天然に存在するｍｉＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲ１２２）に隣接するａｍｉＲＮＡ前駆体導入遺伝子（ヘアピンｐｒｉ−ａｍｉＲＮＡ）を挿入する。このアプローチは、天然ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ１２２）を発現する転写活性ＤＮＡを利用することによって、プロモーターとターミネーターのないａｍｉＲＮＡを使用する、すなわち内在プロモーターとターミネーターが、挿入されたａｍｉＲＮＡ導入遺伝子の転写を駆動し調節した。

【0013】

ＲＮＡ及び／又はタンパク質を細胞に導入する種々のＤＮＡを含まない方法は、以前に記載されている。例えば、エレクトロポレーション及びリポフェクションを使用するＲＮＡトランスフェクションは、米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号明細書に記載されている。Ｃａｓ９タンパク質及びｇＲＮＡ複合体のマイクロインジェクションによる細胞へのＣａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の直接送達は、Ｃｈｏ［Ｃｈｏら、「Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７−１１８０］によって記載された。Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体のエレクトロポレーションによる送達は、Ｋｉｍ［Ｋｉｍら、「Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２−１０１９］によって記載された。リポソームを介するＣａｓ９タンパク質結合ｇＲＮＡ複合体の送達は、Ｚｕｒｉｓ［Ｚｕｒｉｓら、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１］によって報告された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0014】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号明細書

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Ｇａｓｐａｒら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．（２０１１） ３：９７ｒａ７９

【非特許文献2】Ｈｏｗｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（２００８） １１８：３１４３−３１５０

【非特許文献3】Ｓｔｅｖｅｎ Ｆ Ｄｏｗｄｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１７） ３５，２２２−２２９

【非特許文献4】Ｐｏｒｔｅｕｓ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ．（２０１６） ５６：１６３−９０

【非特許文献5】Ｊｉａｎｇら、ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１４）１１（１０）：１２４３−９

【非特許文献6】Ｚｈａｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１４）４：３９４３

【非特許文献7】Ｂｏｒｔｅｓｉ及びＦｉｓｃｈｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ（２０１５） ３３：４１−５２

【非特許文献8】Ｂａｓａｋ及びＮｉｔｈｉｎ、Ｆｒｏｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．（２０１５） ６：１００１

【非特許文献9】Ｔｉｗａｒｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１４） ８６：１

【非特許文献10】Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（２０１４） １１３．２３４９８９頁

【非特許文献22】Ｓｃｈｗａｂら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００６） 第１８巻、１１２１−１１３３

【非特許文献12】Ｓｅｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１７） 第４５巻（１）：ｅ３

【非特許文献13】Ｃｈｏら、「Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７−１１８０

【非特許文献14】Ｋｉｍら、「Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２−１０１９

【非特許文献15】Ｚｕｒｉｓら、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし上記真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入し、それによって上記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる上記遺伝子を改変する工程を含む方法が提供される。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし上記真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、目的の標的ＲＮＡに対する上記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入する工程を含む方法が提供される。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし上記真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、上記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入し、それによって上記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする上記遺伝子を改変する工程を含み、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡが異なる方法が提供される。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし上記真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、上記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入する工程を含み、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡが異なる方法が提供される。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において感染症を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記感染症を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記感染症の発症又は進行と関連する方法が提供される。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記単一遺伝子劣性遺伝疾患と関連する方法が提供される。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記自己免疫疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記自己免疫疾患と関連する方法が提供される。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において癌性疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記癌性疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記癌性疾患と関連する方法が提供される。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増強と関連する方法が提供される。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において細胞アポトーシスを誘導する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記アポトーシスと関連する方法が提供される。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、真核性非ヒト生物を生成する方法であって、ただし上記生物は植物ではなく、上記生物の細胞の少なくともいくつかは、目的の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる改変遺伝子を含み、当該方法は、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って遺伝子を改変し、それによって上記真核性非ヒト生物を生成する工程を含む方法が提供される。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる上記遺伝子は、真核細胞に対して内在性である。

【0028】

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする上記遺伝子は、真核細胞に対して内在性である。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変することは、上記非コードＲＮＡ分子に、目的の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子をコードする遺伝子を改変することは、上記ＲＮＡサイレンシング分子に、上記第２の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、目的の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル（濃度）又はタンパク質レベル（濃度）を測定することによって決定される。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性は、上記第２の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル（濃度）又はタンパク質レベル（濃度）を測定することによって決定される。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性は、表現型的に決定される。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態によれば、表現型的に決定されることは、細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の色素沈着、感染パラメータ及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型の決定によってもたらされる。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性は、遺伝子型的に決定される。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態によれば、表現型は、遺伝子型の前に決定される。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態によれば、遺伝子型は、表現型の前に決定される。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、前駆体からプロセシングされる。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。

【0040】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡｉ分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される。

【0041】

本発明のいくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、及び転移因子ＲＮＡからなる群から選択される。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＲＮＡｉ分子は、構造のオリジナリティを保存し、細胞ＲＮＡｉ因子によって認識されるように改変される。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態によれば、遺伝子の改変は、欠失、挿入、点突然変異、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変によって行われる。

【0044】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域にある。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のループ領域にある。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域にある。

【0047】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域にある。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域にある。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は挿入である。

【0050】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は欠失である。

【0051】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は点突然変異である。

【0052】

本発明のいくつかの実施形態によれば、改変は、最大２００ヌクレオチドの改変を含む。

【0053】

本発明のいくつかの実施形態によれば、当該方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入する工程をさらに含む。

【0054】

本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、植物発現性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

【0055】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。

【0056】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。

【0057】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含む。

【0058】

本発明のいくつかの実施形態によれば、エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９を含む。

【0059】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして細胞に適用される。

【0060】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、真核細胞における発現を監視するためのレポーターに連結される。

【0061】

本発明のいくつかの実施形態によれば、レポーターは蛍光タンパク質である。

【0062】

本発明のいくつかの実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡ又は第２の標的ＲＮＡは、真核細胞に対して内在性である。

【0063】

本発明のいくつかの実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡ又は第２の標的ＲＮＡは癌と関連する。

【0064】

本発明のいくつかの実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡ又は第２の標的ＲＮＡは、真核細胞に対して外来性である。

【0065】

本発明のいくつかの実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡ又は第２の標的ＲＮＡは、感染症と関連する。

【0066】

本発明のいくつかの実施形態によれば、真核細胞は、哺乳動物、昆虫、線虫、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、真菌及び藻類からなる群から選択される真核生物から得られる。

【0067】

本発明のいくつかの実施形態によれば、真核細胞は哺乳類細胞である。

【0068】

本発明のいくつかの実施形態によれば、哺乳類細胞はヒト細胞を含む。

【0069】

本発明のいくつかの実施形態によれば、真核細胞は全能性幹細胞である。

【0070】

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の方法及び材料を、本発明の実施形態の実施又は試験において使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、必ずしも限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0071】

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、単に例として本明細書に記載される。ここで図面を詳細に特に参照すると、示される詳細は、例として、及び本発明の実施形態の例示的な議論の目的のためであることが強調される。この点に関して、図面を参照した説明により、本発明の実施形態がどのように実施され得るかが当業者に明らかになる。

【0072】

【図1】図１は、ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）鋳型を生成するための計算パイプラインの実施形態のフローチャートである。計算ＧＥｉＧＳパイプラインは、生物学的メタデータを適用し、そしてｍｉＲＮＡ遺伝子を最小限に編集するために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡ鋳型の自動生成を可能にし、新たな機能の獲得、すなわち、目的の配列を標的とするそれらのサイレンシング能力のリダイレクションを導く。

【図2】図２は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を標的とするｓｉＲＮＡによりｍｉＲＮＡをＧＥｉＧＳ置換し、ヒト細胞株において安定に発現されるＧＦＰ遺伝子のサイレンシングを生成する実施形態のフローチャートである。

【図3】図３Ａ〜Ｂは、ヒト細胞におけるＧＦＰ発現レベルのノックダウンを示す写真である。対照細胞（図３Ａ）は、ＧＦＰ発現がサイレンシングされている、ｓｉＧＦＰを安定に発現する細胞（図３Ｂ）と比べて高いレベルで安定にＧＦＰを発現する。

【図4】図４は、ｓｉＧＦＰを安定に発現するＧＥｉＧＳ細胞の実施形態のフローチャートである。すべての陽性トランスフェクション事象は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）＋ＧＦＰである。しかしながら、ＧＥｉＧＳ細胞はｓｉＧＦＰを安定に発現するため、陽性のトランスフェクション細胞は赤色蛍光発現だけを示す。

【図5】図５は、ｐ５３を標的とするｓｉＲＮＡを安定に発現するＧＥｉＧＳ細胞の実施形態のフローチャートである。すべての陽性トランスフェクション事象はＧＦＰであり、化学療法又はｈＤＭ２阻害剤Ｎｕｔｌｉｎ３誘導細胞死を逃れる。

【図6】図６は、ヒト癌細胞株Ｕ２ＯＳにおいてアポトーシス促進性遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを安定に発現するＧＥｉＧＳ細胞の実施形態のフローチャートである。すべての陽性トランスフェクション事象はＲＦＰであり、化学療法誘導細胞死を逃れる。

【図7】図７は、レンチウイルス感染に耐性があるように生成されたＧＥｉＧＳ細胞（ＧＦＰがウイルスマーカー遺伝子として又は外来遺伝子として使用されている）の実施形態のフローチャートである。

【図8】図８は、ウイルス感染に耐性がある（すなわち、外来ウイルス遺伝子に対する細胞の免疫化）ように生成されたＧＥｉＧＳ細胞の実施形態のフローチャートである。

【図9】図９は、最小限に編集されたｍｉＲＮＡ遺伝子塩基を用いてＲＮＡサイレンシング分子を設計するために必要とされる主な段階を示す実施形態の図である。

【図10】図１０は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に活発に関与する多様な非コードＲＮＡのタイプを示すグラフである。この一覧は、ダイサー基質（ダイサーによって結合されることが判明している）であり、小分子サイレンシングＲＮＡ（それらの小分子ＲＮＡはアルゴノートタンパク質によって結合されることが判明している）にプロセシングされる非コードＲＮＡタイプ（ｙ軸）を提供する。各タイプは、複数のわずかに異なる亜型を有する（ｘ軸）。

【図11】図１１Ａ〜Ｅは、非コードＲＮＡ前駆体及びその誘導されたＡｇｏ結合小分子ＲＮＡを示すヒト非コードＲＮＡの実施形態の例である。ＡＧＯ２結合小分子ＲＮＡ及びＡＧＯ３結合小分子ＲＮＡがダイサー結合非コードＲＮＡ前駆体にマッピングされて示されている。（図１１Ａ）ｌｅｔ７マイクロＲＮＡ及びその一次（青線でマークされている）及び二次の成熟ｍｉＲＮＡ部位（灰色の棒によって表される）を示す。（図１１Ｂ〜Ｅ）小分子ＲＮＡマッピングがマイクロＲＮＡで見出されるものに対する符号類似体を示す他の生物型の例を示す。

【図12A】図１２Ａ〜Ｅは、ＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例である。成熟小分子ＲＮＡ分子を生じる非コードＲＮＡ前駆体の選択物が緑色で強調されている。ＧＥｉＧＳオリゴと野生型配列との配列差は、赤色で強調されている。（図１２Ａ）ＧＥｉＧＳ前駆体が野生型（ｗｔ）非コードＲＮＡと同一の二次構造を保存するＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例。ヒトマイクロＲＮＡ−１００に基づく設計。左から右へ：野生型マイクロＲＮＡ、マッチング構造及び最小配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計、並びにマッチング構造及び最大配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計。なお、このＧＥｉＧＳ設計は、ヒトヘパリン結合性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする２１ｎｔ ｓｉＲＮＡに基づいていた。

【図12B】図１２Ａ〜Ｅは、ＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例である。成熟小分子ＲＮＡ分子を生じる非コードＲＮＡ前駆体の選択物が緑色で強調されている。ＧＥｉＧＳオリゴと野生型配列との配列差は、赤色で強調されている。（図１２Ｂ）ＧＥｉＧＳ前駆体がｗｔ非コードＲＮＡとしての二次構造を保存しないＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例。ヒトマイクロＲＮＡ−１００に基づく設計。左から右へ：野生型マイクロＲＮＡ、非マッチング構造及び最小配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計、並びに非マッチング構造及び最大配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計。なお、このＧＥｉＧＳ設計は、ヒトヘパリン結合性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的とする２１ｎｔ ｓｉＲＮＡに基づいていた。

【図12C】図１２Ａ〜Ｅは、ＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例である。成熟小分子ＲＮＡ分子を生じる非コードＲＮＡ前駆体の選択物が緑色で強調されている。ＧＥｉＧＳオリゴと野生型配列との配列差は、赤色で強調されている。（図１２Ｃ）ＧＥｉＧＳ前駆体がｗｔ非コードＲＮＡと同一の二次構造を保存するＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例。ＣＩＤ＿００１０３３ ｔＲＮＡに基づく設計。左から右へ：野生型ｔＲＮＡ、マッチング構造及び最小配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計、並びにマッチング構造及び最大配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計。なお、このＧＥｉＧＳ設計は、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質遺伝子を標的とする２１ｎｔ ｓｉＲＮＡに基づいていた。

【図12D】図１２Ａ〜Ｅは、ＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例である。成熟小分子ＲＮＡ分子を生じる非コードＲＮＡ前駆体の選択物が緑色で強調されている。ＧＥｉＧＳオリゴと野生型配列との配列差は、赤色で強調されている。（図１２Ｄ）ＧＥｉＧＳ前駆体がｗｔ非コードＲＮＡとしての二次構造を保存しないＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例。ＣＩＤ＿００１０３３ ｔＲＮＡに基づく設計。左から右へ、野生型ｔＲＮＡ、非マッチング構造及び最小配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計、並びに非マッチング構造及び最大配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計。このＧＥｉＧＳ設計は、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質遺伝子を標的とする２１ｎｔ ｓｉＲＮＡに基づいていた。

【図12E】図１２Ａ〜Ｅは、ＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例である。成熟小分子ＲＮＡ分子を生じる非コードＲＮＡ前駆体の選択物が緑色で強調されている。ＧＥｉＧＳオリゴと野生型配列との配列差は、赤色で強調されている。（図１２Ｅ）前駆体構造が生合成において役割を果たさず、従って前駆体構造が維持される必要がないＧＥｉＧＳオリゴ設計の実施形態の例。ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｒａｐａ）ｂｎＴＡＳ３Ｂ ｔａｓｉＲＮＡに基づく設計。左から右へ：野生型ｔａｓｉＲＮＡ、最小配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計、及び最大配列変更を有するＧＥｉＧＳ設計。なお、円形構造は、この分子に固有ではなく、便宜のため用いられた；ｔａｓｉＲＮＡ生合成は、（Ｂｏｒｇｅｓ及びＭａｒｔｉｅｎｓｓｅｎ（２０１５） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ｜ＡＯＰ、２０１５年１１月４日オンライン公開；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ４０８５で詳細に論じられているように）ｍｉＲＮＡ及びｔＲＮＡとは異なり、上記前駆体二次構造に依存しない。全体分子の下方に、改変を含むセクションの詳細がある。このＧＥｉＧＳ設計は、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質遺伝子を標的とする２１ｎｔ ｓｉＲＮＡＳに基づいていた。

【図13】図１３は、ＰＤＳ３表現型／遺伝子型を示す。ドナーの存在対野生型配列を検証するために、退色した表現型植物を選択し、内部アンプリコンＰＣＲ、続いてＢｔｓαＩ（ＮＥＢ）による制限消化分析によって遺伝子型を決定した。レーン１：ドナー（ＤＯＮＯＲ）なしで処理された植物、制限あり、レーン２〜４：ドナーを含むＰＤＳ３処理植物、制限あり、レーン５：陽性プラスミドドナー対照、非制限、レーン６：鋳型無し対照の水、レーン７：陽性プラスミドドナー、制限あり、レーン８：負のドナーで衝撃された植物、制限あり、レーン９：非処理対照植物、制限あり。その後のアンプリコンの外部ＰＣＲ増幅を処理し、挿入を確認するために配列決定した。

【図14】図１４は、ＡＤＨ１表現型／遺伝子型を示す。ドナーの存在を検証するために、植物をアリルアルコール耐性により選択し、内部アンプリコンＰＣＲ、続いてＢｃｃＩ（ＮＥＢ）制限消化により遺伝子型を決定した。レーン１：アリルアルコール感受性対照植物、制限あり、レーン２〜４：ドナー制限を含むアリルアルコール耐性植物、レーン５：陽性プラスミドドナー対照、制限なし、レーン６：鋳型なし対照、レーン７：陽性プラスミドドナー、制限あり、レーン８：非特異的ドナーを用いた衝撃された植物、制限あり、レーン９：非アリルアルコール処理対照、制限あり。

【図15】図１５は、ＡｔＰＤＳ３転写産物を標的とするｍｉＲ−１７３改変植物における遺伝子発現分析を示すグラフである。ＡｔＰＤＳ３発現の分析は、ＧＥｉＧＳ＃５及びＳＷＡＰ１及び２（ＧＦＰ）で衝撃された植物と比較して、ＧＥｉＧＳ＃４及びＳＷＡＰ３で衝撃された植物を再生する際に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。注目すべきは、対照植物と比較して、ｍｉＲ−１７３をＡｔＰＤＳ３を標的とするように改変した場合、遺伝子発現レベルの平均８２％の低下が観察された（エラーバーはＳＤを示す；Ｃｔ値で計算したｐ値＜０．０１）。

【図16】図１６は、ＡｔＰＤＳ３転写産物を標的とするｍｉＲ−３９０改変植物における遺伝子発現分析を示すグラフである。ＡｔＡＤＨ１発現の分析は、ＧＥｉＧＳ＃５及びＳＷＡＰ１及び２（ＧＦＰ）で衝撃された植物と比較して、ＧＥｉＧＳ＃１及びＳＷＡＰ１１で衝撃された植物を再生する際に、ｑＲＴ−ＰＣＲによって行った。注目すべきは、対照植物と比較して、ｍｉＲ−３９０をＡｔＡＤＨ１を標的とするように改変した場合、遺伝子発現レベルの平均８２％の低下が観察された（エラーバーはＳＤを表す；Ｃｔ値で計算したｐ値＜０．０１）。

【発明を実施するための形態】

【0073】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、ＲＮＡサイレンシング分子を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変することに関し、より詳細には、植物細胞ではない真核細胞における目的の内在又は外来性の標的ＲＮＡをサイレンシングするためのその使用に関するが、これに限定されない。

【0074】

本発明の原理及び動作は、図面及び添付の説明を参照することにより、より良く理解することができる。

【0075】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるか、又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は様々な方法で実施又は実行されることが可能である。また、本明細書で使用される語法及び用語は、説明の目的のためのものであり、限定とみなされるべきではないことを理解されたい。

【0076】

これまでに開発された最も強力な遺伝的な治療技術のうちの２つは、ウイルス性導入遺伝子の発現により失われた遺伝子機能の修復を可能にする遺伝子治療、及び標的ｍＲＮＡのノックダウンにより欠損遺伝子の抑制を媒介するＲＮＡｉである。ゲノム編集技術における最近の進歩は、例えばゲノム中の所望の場所における部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の誘導に続くゲノム編集（ＮＨＥＪ及びＨＲ）によりヒト患者の細胞の中の数個のヌクレオチドを編集することによって、ヒト患者の細胞の中の数個のヌクレオチドを編集することにより、生細胞においてＤＮＡ配列を変化させることを可能にした。

【0077】

本発明を実施に移す中で、本発明者らは、任意の目的の標的遺伝子（真核細胞に対して内在性又は外来性）を標的とし、それと干渉するように設計された非コードＲＮＡ分子を利用する遺伝子編集技術を考案した。本明細書に記載の遺伝子編集技術は、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーを有する発現カセットを含む古典的な分子遺伝学的遺伝子導入ツールを必要としない。さらに、本発明のいくつかの実施形態の遺伝子編集技術は、非コードＲＮＡ分子（例えば内在性）のゲノム編集を含むが、そのゲノム編集は安定であり遺伝性である。

【0078】

本明細書のこれ以降において、及びそれに続く実施例の節においてに示されるように、本発明者らは、例えばＲＮＡサイレンシング分子（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）を含む真核細胞の内在性非コードＲＮＡ分子を利用し、そしてそれらを改変して、目的の任意のＲＮＡ標的を標的化することができるゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）プラットフォームを設計した（図２の例示的なフローチャートを参照）。ＧＥｉＧＳを使用して、当該方法は、有望な非コードＲＮＡ分子のスクリーニング、これらの内在ＲＮＡ分子中の数個のヌクレオチドを編集し、それによって、それらの活性及び／又は特異性を、例えば、変異タンパク質をコードする内在性ＲＮＡ（例えば、癌における癌遺伝子）又は病原体によってコードされる外来性ＲＮＡを含む、目的の任意のＲＮＡを有効にかつ特異的に標的とするためにリダイレクトすることを可能にする（図１の例示的なフローチャートを参照）。総合すると、ＧＥｉＧＳは、内在性遺伝子の発現の調節のための新規な技術として、また、例えば癌、ウイルス、昆虫、真菌、線虫、熱、干ばつ（乾燥）、飢餓等の様々な生物的及び非生物的なストレスに対して生物を免疫するために利用することができる。

【0079】

従って、本発明の一態様によれば、真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただしこの真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、目的の標的ＲＮＡに対する上記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入し、それによって上記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する工程を含む方法が提供される。

【0080】

本発明の別の態様によれば、真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただしこの真核細胞は植物細胞ではなく、当該方法は、上記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入し、それによって上記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする遺伝子を改変する工程を含み、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なる方法が提供される。

【0081】

本明細書で使用する場合の用語「真核細胞」は、真核生物の任意の細胞を指す。真核生物は、単細胞生物及び多細胞生物を含む。単細胞真核生物としては、酵母、原性動物、粘菌及び藻類が挙げられるが、これらに限定されない。多細胞真核生物としては、動物（例えば、哺乳動物、昆虫、線虫、鳥類、魚類、爬虫類及び甲殻類）、真菌及び藻類（例えば、褐藻、紅藻、緑藻）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0082】

一実施形態によれば、真核細胞は植物の細胞ではない。

【0083】

一実施形態によれば、真核細胞は動物細胞である。

【0084】

一実施形態によれば、真核細胞は、脊椎動物の細胞である。

【0085】

一実施形態によれば、真核細胞は、無脊椎動物の細胞である。

【0086】

特定の実施形態によれば、無脊椎動物細胞は、昆虫、巻貝、ハマグリ、タコ、ヒトデ、ウニ、クラゲ及び寄生虫の細胞である。

【0087】

特定の実施形態によれば、無脊椎動物細胞は、甲殻類の細胞である。例示的な甲殻類としては、エビ、小エビ、カニ、ロブスター及びザリガニが挙げられるが、これらに限定されない。

【0088】

特定の実施形態によれば、無脊椎動物細胞は、魚類の細胞である。例示的な魚類としては、サケ、マグロ、スケトウダラ、ナマズ、タラ、コダラ（モンツキダラ）、小エビ、シーバス、ティラピア、ホッキョクイワナ及びコイが挙げられるが、これらに限定されない。

【0089】

一実施形態によれば、真核細胞は哺乳類細胞である。

【0090】

特定の実施形態によれば、哺乳類細胞は、非ヒト生物、例えば、齧歯動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、反芻動物（例えば、ウシ、ヒツジ、アンテロープ、シカ、及びキリン）、イヌ、ネコ、ウマ、及び非ヒト霊長類（これらに限定されない）の細胞である。

【0091】

特定の実施形態によれば、真核細胞はヒトの細胞である。

【0092】

一実施形態によれば、真核細胞は、初代培養細胞、細胞株、体細胞、胚細胞、幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、配偶子細胞、接合体細胞、胚盤胞細胞、胚、胎仔細胞及び／又はドナー細胞である。

【0093】

本明細書で使用する場合、語句「幹細胞」は、特定の、特殊化した機能を有する他の細胞型（例えば、十分に分化した細胞）へと分化するように誘導されるまで、培養下で長期間、未分化状態で留まることができる細胞（例えば、全能性幹細胞、多能性幹細胞又は複能性幹細胞）を指す。受精後の細胞分裂の最初の一対の中の胚細胞等の全能性細胞は、胚細胞及び胚体外細胞へ分化できる唯一の細胞であり、生存可能なヒトへと発達できる。好ましくは、語句「多能性幹細胞」は、すべての３つの胚性胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉及び中胚葉へと分化することができるか、又は未分化状態で留まる細胞を指す。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）が挙げられる。複能性幹細胞としては、成体幹細胞及び造血幹細胞が挙げられる。

【0094】

語句「胚性幹細胞」は、すべての３つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の細胞へと分化することができるか、又は未分化状態で留まることができる胚細胞を指す。語句「胚性幹細胞」は、胚の着床前の、妊娠後に形成される胚組織（例えば、胚盤胞）（すなわち、着床前胚盤胞）から得られた細胞、着床後／原腸形成前の段階の胚盤胞から得られた拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号パンフレットを参照）、妊娠中のいつでも、好ましくは、妊娠１０週の前に胎児の生殖組織から得られた胚性生殖（ＥＧ）細胞、及び単為生殖（単為生殖生物）によって刺激される未受精の卵子に由来する細胞を含んでもよい。

【0095】

本発明のいくつかの実施形態の胚性幹細胞は、周知の細胞培養方法を用いて得ることができる。例えば、ヒト胚性幹細胞はヒト胚盤胞から単離することができる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒトのインビボ着床前胚から得られるか、又は体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚を胚盤胞段階まで拡張することができる。

【0096】

市販の幹細胞も、本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができるということは分かるであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞登録機関［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｇｒａｎｔｓ（ｄｏｔ）ｎｉｈ（ｄｏｔ）ｇｏｖ／ｓｔｅｍ＿ｃｅｌｌｓ／ｒｅｇｉｓｔｒｙ／ｃｕｒｒｅｎｔ（ｄｏｔ）ｈｔｍ］から購入することができる。

【0097】

加えて、胚性幹細胞は、マウス（Ｍｉｌｌｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ、２００１）、ゴールデンハムスター［Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １２７：２２４−７］、ラット［Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、１９９４、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １６３：２８８−９２］、ウサギ［Ｇｉｌｅｓら １９９３、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ． ３６：１３０−８；Ｇｒａｖｅｓ及びＭｏｒｅａｄｉｔｈ、１９９３、Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ． １９９３、３６：４２４−３３］、いくつかの家畜種［Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｕｐｐｌ． ４３：２５５−６０；Ｗｈｅｅｌｅｒ １９９４、Ｒｅｐｒｏｄ Ｆｅｒｔｉｌ Ｄｅｖ． ６：５６３−８；Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａら、２００１、Ｃｌｏｎｉｎｇ． ３：５９−６７］及び非ヒト霊長類種（アカゲザル及びマーモセット）［Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９２：７８４４−８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９６、Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ． ５５：２５４−９］を含む種々の種から得ることができる。

【0098】

「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳ；胚様幹細胞）は、多能性（すなわち、３つの胚性胚葉、すなわち、内胚葉、外胚葉及び中胚葉に分化することができること）が賦与されている成体体細胞の脱分化により得られる細胞を指す。本発明のいくつかの実施形態によれば、このような細胞は、分化した組織（例えば、皮膚等の体細胞組織）から得られ、胚性幹細胞の特徴を獲得するように細胞を初期化する遺伝子操作による脱分化を受ける。本発明のいくつかの実施形態によれば、人工多能性幹細胞は、体性幹細胞においてＯｃｔ−４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４及びｃ−Ｍｙｃの発現を誘導することにより形成される。

【0099】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）（胚様幹細胞）は、例えば、線維芽細胞、肝細胞、胃上皮細胞等の体細胞をＯｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、及びＫＬＦ４等の転写因子でレトロウイルス形質導入することにより、体細胞の遺伝子操作により体細胞から生成することができる［例えば、Ｐａｒｋら Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｎａｔｕｒｅ（２００８） ４５１：１４１−１４６に記載されている］。

【0100】

語句「成体幹細胞」（「組織幹細胞」又は体細胞組織由来の幹細胞とも呼ばれる）は、［出生後又は出生前のいずれかの動物（とりわけ、ヒト）の］体細胞組織由来の任意の幹細胞を指す。成体幹細胞は、一般に、複数の細胞型へと分化することができる複能性幹細胞であると考えられている。成体幹細胞は、脂肪組織、皮膚、腎臓、肝臓、前立腺、膵臓、腸（腸管）、骨髄及び胎盤等の任意の成体組織、新生児（新生仔）組織又は胎児（胎仔）組織に由来することができる。

【0101】

一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態で利用される幹細胞は、造血幹細胞、間質幹細胞又は間葉系幹細胞を含む骨髄（ＢＭ）由来幹細胞である［Ｄｏｍｉｎｉｃｉ，Ｍら、（２００１） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ． １５：２８−３７］。ＢＭ由来幹細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄腔から得てもよい。

【0102】

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、成体組織幹細胞とも呼ばれてよいが、この造血幹細胞（ＨＳＣ）は、任意の年齢の個体の血液又は骨髄組織から、又は新生児（新生仔）個体の臍帯血から得られる幹細胞を含む。本発明のいくつかの実施形態のこの態様に係る好ましい幹細胞は、好ましくは、ヒト又は霊長類（例えば、サル）由来の胚性幹細胞である。

【0103】

胎盤幹細胞及び臍帯血幹細胞は、「若い幹細胞」と呼ばれてもよい。

【0104】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、形成性の多能性芽細胞、は、１以上の間葉系組織（例えば、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織及び線維性結合組織、筋芽細胞）並びにサイトカイン等の生理活性因子からの種々の影響に応じて、胚体中胚葉に由来する組織以外の組織（例えば、神経細胞）を生じる。このような細胞は胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児（胎仔）及び青年期の皮膚、血液及び他の組織から単離することができるが、ＢＭ中のそれらの存在量は、他の組織中のそれらの存在量をはるかに超え、従ってＢＭからの単離が今のところ好ましい。

【0105】

成体組織幹細胞は、Ａｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．［Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．（２００３）２００（５）：５４７−５０］によって開示されたもの等の当該技術分野で公知の種々の方法を使用して単離することができる。胎児（胎仔）幹細胞は、Ｅｖｅｎｔｏｖ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｓ，ら［ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．（２００６） ３：ｅ２１５］によって開示されたもの等の当該技術分野で公知の種々の方法を使用して単離することができる。

【0106】

造血幹細胞は、Ｒｏｂｅｒｔ Ｌａｎｚｅ編による「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００４、第５４巻、６０９−６１４頁、Ｇｅｒａｌｄ Ｊ Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ及びＷｉｌｌｉａｍ Ｂ Ｓｔａｙｔｏｎによるｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓにより開示されたもの等の当該技術分野で公知の種々の方法を使用して単離することができる。

【0107】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離、精製及び拡張する方法は、当該技術分野で公知であり、その例としては、例えば、Ｃａｐｌａｎ及びＨａｙｎｅｓｗｏｒｔｈによる米国特許第５，４８６，３５９号及びＪｏｎｅｓ Ｅ．Ａ．ら、２００２、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ． ４６（１２）：３３４９−６０により開示されたものが挙げられる。

【0108】

一実施形態によれば、真核細胞は、その自然環境（例えば、人体）から単離されたものである。

【0109】

一実施形態によれば、真核細胞は健常な細胞である。

【0110】

一実施形態によれば、真核細胞は、病的細胞又は疾患易発性細胞である。

【0111】

一実施形態によれば、真核細胞は癌細胞である。

【0112】

一実施形態によれば、真核細胞は、免疫細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞等）である。

【0113】

一実施形態によれば、真核細胞は、病原体に（例えば、細菌性、ウイルス性又は真菌性の病原体に）感染した細胞である。

【0114】

本明細書で使用する場合、用語「非コードＲＮＡ分子」は、アミノ酸配列に翻訳されず、そしてタンパク質をコードしないＲＮＡ配列をいう。

【0115】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、典型的には、ＲＮＡサイレンシングプロセシング機構又は活性を受ける。しかし、本明細書では、ＲＮＡ干渉又は翻訳阻害をもたらすプロセシング機構を誘発しうるヌクレオチドのわずかな変化（例えば、２４ヌクレオチドまで）も意図される。

【0116】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、細胞に対して内在性（天然、例えば未変性）である。

【0117】

非コードＲＮＡ分子はまた、細胞に対して外来性であり得る（すなわち、外部から付加され、そして細胞中に天然に存在しない）ことが理解される。

【0118】

いくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、固有の翻訳阻害活性を含む。

【0119】

いくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、固有のＲＮＡｉ活性を含む。

【0120】

いくつかの実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、固有の翻訳阻害活性又は固有のＲＮＡｉ活性を含まない（すなわち、非コードＲＮＡ分子は、ＲＮＡサイレンシング活性を有さない）。

【0121】

本発明の一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ（例えば、天然標的ＲＮＡ）に特異的であり、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、免疫組織化学及び／若しくはフローサイトメトリー、又は任意の他の検出方法によってＲＮＡ又はタンパク質レベルで決定される場合に、標的遺伝子に対して１００％未満の全体的相同性、例えば、標的遺伝子に対して９９％未満、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％未満の全体的相同性を示して、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡを交差阻害又はサイレンシングするように設計されない限り（以下に論じる）、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡを交差阻害又はサイレンシングしない。

【0122】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、ＲＮＡサイレンシング分子又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子である。

【0123】

用語「ＲＮＡサイレンシング」又はＲＮＡｉは、非コードＲＮＡ分子（「ＲＮＡサイレンシング分子」又は「ＲＮＡｉ分子」）が、配列特異的に、遺伝子発現又は翻訳の同時転写（転写時）阻害又は転写後阻害を媒介する細胞調節機構をいう。

【0124】

一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、転写中のＲＮＡ抑制（同時転写遺伝子サイレンシング）を媒介することができる。

【0125】

特定の実施形態によれば、同時転写遺伝子サイレンシングは、エピジェネティックサイレンシング（例えば、遺伝子発現を妨げるクロマチン状態（ｃｈｒｏｍａｔｉｃ ｓｔａｔｅ））を含む。

【0126】

一実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子は、転写後のＲＮＡ抑制（転写後遺伝子サイレンシング）を媒介することができる。

【0127】

転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）とは、典型的には、翻訳を妨げることによって活性を低下させるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の分解又は切断の過程をいう。例えば、そして以下に詳細に議論されるように、ＲＮＡサイレンシング分子のガイド鎖は、ｍＲＮＡ分子中の相補的配列と対合し、そして例えば、アルゴノート２（Ａｇｏ２）による切断を誘導する。

【0128】

同時転写遺伝子サイレンシングとは、典型的には遺伝子活性の不活性化（すなわち、転写抑制）を指し、典型的には細胞核内で起こる。このような遺伝子活性抑制は、標的ＤＮＡやヒストンをメチル化するメチルトランスフェラーゼなどのエピジェネティック関連因子によって媒介される。従って、同時転写遺伝子サイレンシングにおいて、小分子ＲＮＡと標的ＲＮＡとの結合（小分子ＲＮＡ−転写産物相互作用）は、標的新生転写産物を不安定化し、そして遺伝子活性及び転写を抑制する構造へのクロマチン再構築を誘導するＤＮＡ改変酵素及びヒストン改変酵素（すなわち、エピジェネティック因子）を動員する。また、同時転写遺伝子サイレンシングにおいて、クロマチン関連の長鎖非コードＲＮＡ骨格は、小分子ＲＮＡとは無関係にクロマチン修飾複合体を動員してもよい。これらの同時転写サイレンシング機構は、不適切な転写事象を検出しサイレンシングするＲＮＡサーベイランスシステムを形成し、自己強化エピジェネティックループを介してこれらの事象の記憶を提供する［Ｄ．Ｈｏｃｈ及びＤ．Ｍｏａｚｅｄ、ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２０１５） １６（２）：７１−８４に記載されている］。

【0129】

本発明の一実施形態によれば、ＲＮＡｉ生合成／プロセシング機構は、ＲＮＡサイレンシング分子を生成する。

【0130】

本発明の一実施形態によれば、ＲＮＡｉ生合成／プロセシング機構はＲＮＡサイレンシング分子を生成するが、特異的標的は特定されていない。

【0131】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導することができる。

【0132】

以下は、本発明の特定の実施形態に従って使用され得る固有のＲＮＡｉ活性を含む非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の詳細な説明である。

【0133】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、前駆体からプロセシングされる。

【0134】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）前駆体からプロセシングされる。

【0135】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、二重鎖構造の一本鎖ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。

【0136】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、（例えば、完全及び不完全な塩基対合を含む）ｄｓＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。

【0137】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、非構造化ＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。

【0138】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、タンパク質コードＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。

【0139】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子は、非コードＲＮＡ前駆体からプロセシングされる。

【0140】

一実施形態によれば、ｄｓＲＮＡは、２つの異なる相補的ＲＮＡから、又はそれ自体が折り畳まれてｄｓＲＮＡを形成する単一のＲＮＡから誘導することができる。

【0141】

完全及び不完全な塩基対合ＲＮＡ（すなわち、二本鎖ＲＮＡ；ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ − 細胞中の長いｄｓＲＮＡの存在は、ダイサー（ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサー（エンドリボヌクレアーゼダイサー又はＲＮａｓｅモチーフを有するヘリカーゼとしても知られる）は、ヒトにおいてＤＩＣＥＲ１遺伝子によってコードされる酵素である。ダイサーは、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い小片へのｄｓＲＮＡのプロセシングに関与する。ダイサー活性に由来するｓｉＲＮＡは、典型的には、約２１〜約２３ヌクレオチド長であり、２つの３’ヌクレオチドオーバーハングを有する約１９塩基対二重鎖を含む。

【0142】

従って、本発明のいくつかの実施形態は、ｄｓＲＮＡをコードする遺伝子を改変して、サイレンシング特異性（サイレンシング活性を含む）を第２の標的ＲＮＡ（すなわち、目的のＲＮＡ）に向け直すことを意図する。

【0143】

一実施形態によれば、２１ｂｐより長いｄｓＲＮＡ前駆体が使用される。種々の研究は、長いｄｓＲＮＡが、ストレス応答を誘導することなく、又は有意なオフターゲット効果を引き起こすことなく、遺伝子発現をサイレンシングするために使用され得ることを実証する。例えば、以下を参照［Ｓｔｒａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、第３４巻、第１３号、３８０３−３８１０；Ｂｈａｒｇａｖａ Ａら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｐｒｏｔｏｃ．２００４；１３：１１５−１２５；Ｄｉａｌｌｏ Ｍ．ら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３：３８１−３９２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２；９９：１４４３−１４４８；Ｔｒａｎ Ｎ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００４；５７３：１２７−１３４］。

【0144】

用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する小分子の阻害性ＲＮＡ二重鎖（一般に１８〜３０塩基対）を指す。典型的には、ｓｉＲＮＡは、中央の１９ｂｐ二重鎖領域及び末端上の対称的な２塩基３’−オーバーハングを有する２１マー（塩基長）として化学的に合成されるが、２５〜３０塩基長の化学的に合成されたＲＮＡ二重鎖は、同じ位置の２１マーと比較して、１００倍もの効力の増加を有し得ることが最近記載されている。ＲＮＡｉを誘発する際に、より長いＲＮＡを使用して得られた観察された増大した効力は、生成物（２１マー）の代わりに基質（２７マー）をダイサーに提供することから生じること、及びこれが、ＲＩＳＣへのｓｉＲＮＡ二重鎖の侵入の速度又は効率を改善することが示唆される。

【0145】

３’−オーバーハングの位置は、ｓｉＲＮＡの効力に影響を及ぼすが、組成は影響を及ぼさないこと、及びアンチセンス鎖上に３’−オーバーハングを有する非対称二重鎖は、一般に、センス鎖上に３’−オーバーハングを有するものよりも強力であることが見出されている（Ｒｏｓｅら、２００５）。

【0146】

二本鎖干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）の鎖は、ヘアピン又はステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ）を形成するために連結され得る。従って、言及したように、本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。

【0147】

短鎖ヘアピンＲＮＡ「ｓｈＲＮＡ」という用語は、本明細書中で使用される場合、相補的配列の第１及び第２の領域を含むステムループ構造を有するＲＮＡ分子をいい、これらの領域の相補性及び配向の程度は、領域間で塩基対形成が起こるように十分であり、第１及び第２の領域は、ループ領域によって連結され、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）間の塩基対形成の欠如から生じる。ループ中のヌクレオチドの数は、３〜２３、又は５〜１５、又は７〜１３、又は４〜９、又は９〜１１（両端の数値を含む）である。ループ中のヌクレオチドのいくつかは、ループ中の他のヌクレオチドとの塩基対相互作用に関与し得る。ループを形成するために使用され得るオリゴヌクレオチド配列の例としては、５’−ＣＡＡＧＡＧＡ−３’及び５’−ＵＵＡＣＡＡ−３’（国際公開第２０１３１２６９６３号パンフレット及び国際公開第２０１４１０７７６３号パンフレット）が挙げられる。得られる一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｉ機構と相互作用することができる二本鎖領域を含むステムループ又はヘアピン構造を形成することが、当業者によって認識される。

【0148】

本発明のいくつかの実施形態のＲＮＡサイレンシング分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドをさらに包含する。

【0149】

トランス作用性ｓｉＲＮＡ（Ｔａ−ｓｉＲＮＡ）、リピート関連ｓｉＲＮＡ（Ｒａ−ｓｉＲＮＡ）及び天然アンチセンス転写産物由来ｓｉＲＮＡ（Ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）を含む種々の型のｓｉＲＮＡが、本発明によって意図される。

【0150】

一実施形態によれば、サイレンシングＲＮＡは、約２６及び３１ヌクレオチド長のＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡのクラスである「ｐｉＲＮＡ」を含む。ｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質との相互作用を介してＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する、すなわち、アンチセンスｐｉＲＮＡは、典型的には、Ｐｉｗｉタンパク質（例えば、Ｐｉｗｉ、Ａｇｏ３及びＡｕｂｅｒｇｉｎｅ（Ａｕｂ））にロードされる（取り込まれる）。

【0151】

ｍｉＲＮＡ − 別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子はｍｉＲＮＡであってもよい。

【0152】

用語「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲＮＡ」及び「ｍｉＲ」は同義であり、遺伝子発現を調節する長さ約１９〜２８ヌクレオチドの非コード一本鎖ＲＮＡ分子の一群を指す。ｍｉＲＮＡは、広範囲の生物（例えば、ウイルス）に見出され、発生、恒常性、及び疾患の病因において役割を果たすことが示されている。

【0153】

最初に、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、長い非完全二本鎖ステムループＲＮＡとして存在し、これは、成熟ガイド鎖（ｍｉＲＮＡ）及びパッセンジャー鎖（ｍｉＲＮＡ^＊）として公知の類似のサイズのフラグメントを含むｓｉＲＮＡ様二重鎖へと、ダイサーによってさらにプロセシングされる。ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ^＊は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとｐｒｅ−ｍｉＲＮＡの対向アームに由来してもよい。ｍｉＲＮＡ^＊配列は、クローニングされたｍｉＲＮＡのライブラリー中に見出されることがあるが、典型的にはｍｉＲＮＡよりも低い頻度で見出される。

【0154】

当初はｍｉＲＮＡ^＊との二本鎖種として存在しているが、最終的にはｍｉＲＮＡは一本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボ核タンパク質複合体に取り込まれるようになる。さまざまなタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、それによってｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖に対する特異性、標的遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制又は活性化）、及びｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のどの鎖がＲＩＳＣにロードされるかにばらつきが生じる可能性がある。

【0155】

ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣにロードされると、ｍｉＲＮＡ^＊は除去され、分解される。ＲＩＳＣにロードされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二重鎖の鎖は、５’末端があまり緊密に対合していない鎖である。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊の両端がおよそ等価な５’対合をもつ場合には、ｍｉＲＮＡとｍｉＲＮＡ^＊の両方が遺伝子サイレンシング活性をもつ可能性がある。

【0156】

ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の高いレベルの相補性、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８（「シード配列」と呼ばれる）に基づいて標的核酸を特定する。

【0157】

翻訳の効率的な阻害を達成するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的との間の塩基対形成必要性については、多くの研究が注目している（Ｂａｒｔｅｌ ２００４、Ｃｅｌｌ １１６−２８１による総説）。全ゲノム上のｍｉＲＮＡ結合を解析する計算研究から、標的結合におけるｍｉＲＮＡの５’側の塩基２〜８（「シード配列」とも呼ばれる）の特異的な役割が示唆されているが、通常「Ａ」であることがわかっている最初のヌクレオチドの役割も認識されていた（Ｌｅｗｉｓら２００５ Ｃｅｌｌ １２０−１５）。同様に、ヌクレオチド１〜７又は２〜８を使用して、Ｋｒｅｋら（２００５、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３７−４９５）によって標的が特定及び確認された。ｍＲＮＡの標的部位は５’ ＵＴＲ、３’ ＵＴＲ、又はコード領域にあってもよい。興味深いことに、複数のｍｉＲＮＡが同一又は複数の部位を認識することによって同一のｍＲＮＡ標的を調節している可能性がある。遺伝的に特定されたほとんどの標的に複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、複数のＲＩＳＣの協同作用が最も効率的な翻訳阻害をもたらすことを示している可能性がある。

【0158】

ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ切断又は翻訳抑制という２つの機構のいずれかによって、ＲＩＳＣを遺伝子発現の下方制御に誘導する可能性がある。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡとある程度相補性をもつ場合には、ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡの切断を指定することもある。ｍｉＲＮＡが切断を誘導する場合、切断は、典型的には、ｍｉＲＮＡの残基１０及び１１に対合するヌクレオチド間である。あるいは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有さない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制し得る。動物ではｍｉＲＮＡと結合部位との間の相補性の程度が低い可能性があるため、翻訳抑制が動物でより多くみられる可能性がある。

【0159】

ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ^＊のいずれかの一対の５’末端及び３’末端に可変性（ばらつき）がある可能性があることに注意すべきである。この可変性は、切断部位に関するドローシャ及びダイサーの酵素プロセシング（処理）の可変性に起因し得る。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ^＊の５’末端及び３’末端における可変性は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチに起因する可能性もある。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらし得る。ステム構造の可変性はまた、ドローシャ及びダイサーによる切断産物の可変性をもたらし得る。

【0160】

ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は４５〜９０、６０〜８０又は６０〜７０ヌクレオチドを含み得、一方、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列は４５〜３０，０００、５０〜２５，０００、１００〜２０，０００、１，０００〜１，５００又は８０〜１００ヌクレオチドを含み得ることが理解される。

【0161】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５０（例えば、例えば配列番号１３に示されるヒトｍｉＲ−１５０）を含む。

【0162】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２１０（例えば、例えば配列番号１４に示されるヒトｍｉＲ−２１０）を含む。

【0163】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ−７（例えば、例えば配列番号１５に示されるヒトＬｅｔ−７）を含む。

【0164】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１８４（例えば、例えば配列番号１６に示されるヒトｍｉＲ−１８４）を含む。

【0165】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０４（例えば、例えば配列番号１７に示されるヒトｍｉＲ−２０４）を含む。

【0166】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２５（例えば、例えば配列番号１８に示されるヒトｍｉＲ−２５）を含む。

【0167】

一実施形態によれば、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３４（例えば、例えばそれぞれ配列番号１９〜配列番号２１に示されるヒトｍｉＲ−３４ａ／ｂ／ｃ）を含む。

【0168】

さらなるｍｉＲＮＡは、本明細書中下記の表１Ｂに提示されている。

【0169】

アンチセンス − アンチセンスは、遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることによって、その遺伝子の発現を阻止又は阻害するように設計された一本鎖ＲＮＡである。標的ＲＮＡの下方制御は、標的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡ転写産物と特異的にハイブリダイズし得るアンチセンスポリヌクレオチドを使用して達成され得る。

【0170】

言及したように、非コードＲＮＡ分子は、カノニカルな（内因性）ＲＮＡｉ活性を含まなくてもよい（例えば、カノニカルなＲＮＡサイレンシング分子ではないか、又はその標的は特定されていない）。このような非コードＲＮＡ分子には、以下のものが含まれる。

【0171】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）である。用語「ｔＲＮＡ」は、核酸のヌクレオチド配列とタンパク質のアミノ酸配列との間の物理的連結として働くＲＮＡ分子を指し、以前は可溶性ＲＮＡ又はｓＲＮＡと呼ばれていた。ｔＲＮＡは、典型的には、約７６〜９０ヌクレオチド長である。

【0172】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）である。用語「ｒＲＮＡ」は、リボソームのＲＮＡ成分、すなわちリボソーム小サブユニット又はリボソーム大サブユニットのいずれかを指す。

【0173】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵ−ＲＮＡ）である。用語「ｓＲＮＡ」又は「Ｕ−ＲＮＡ」は、真核細胞における細胞核のスプライシング斑点及びカハール体に見出される小分子ＲＮＡ分子を意味する。ｓｎＲＮＡは、典型的には約１５０ヌクレオチド長である。

【0174】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）である。用語「ｓｎｏＲＮＡ」は、主として他のＲＮＡ、例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｓｎＲＮＡの化学修飾を導く小分子ＲＮＡ分子のクラスを指す。ｓｎｏＲＮＡは、典型的には、２つのクラスのうちの１つに分類される：Ｃ／ＤボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には、約７０〜１２０ヌクレオチド長であり、メチル化に関連し、そしてＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡは、典型的には、約１００〜２００ヌクレオチド長であり、そしてシュードウリジル化に関連する。

【0175】

ｓｎｏＲＮＡと同様にｓｃａＲＮＡ（すなわち、Ｓｍａｌｌ Ｃａｊａｌ ｂｏｄｙ ＲＮＡ ｇｅｎｅ（小分子カハール体ＲＮＡ遺伝子））もｓｎｏＲＮＡと同様のＲＮＡ成熟の役割を果たすが、その標的はスプライセオソームｓｎＲＮＡであり、ｓｃａＲＮＡは（核のカハール体の）スプライセオソームｓｎＲＮＡ前駆体の部位特異的改変を行う。

【0176】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）である。用語「ｅｘＲＮＡ」は、転写された場所である細胞の外部に存在するＲＮＡ種（例えば、エキソソームＲＮＡ）を意味する。

【0177】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子は、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）である。用語「ｌｎｃＲＮＡ」又は「長鎖ｎｃＲＮＡ」は、典型的には２００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物を指す。

【0178】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ又はＵＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、小分子カハール体ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、細胞外ＲＮＡ（ｅｘＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、転移因子ＲＮＡ及び長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0179】

一実施形態によれば、ＲＮＡｉ分子の非限定的な例には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0180】

上記のように、本発明のいくつかの実施形態の方法は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに向けて、非コードＲＮＡ分子のサイレンシング活性及び／又は特異性をリダイレクトするために（又は非コードＲＮＡ分子がＲＮＡ分子をサイレンシングする固有の能力を有さない場合、サイレンシング活性及び／又は特異性を生成するために）利用される。

【0181】

一実施形態によれば、標的ＲＮＡ及び第２の標的ＲＮＡは異なる。

【0182】

一実施形態によれば、真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし上記真核細胞は植物細胞ではない方法は、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング活性及び／又は特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を真核細胞に導入し、それによってＲＮＡサイレンシング分子をコードする遺伝子を改変する工程を含み、標的ＲＮＡ及び第２の標的ＲＮＡは異なる。

【0183】

本明細書中で使用される場合、用語「サイレンシング特異性をリダイレクトする」、「サイレンシング特異性を向け直す」は、非コードＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の非天然標的に向かって非コードＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の元の特異性を再プログラミングすることをいう。従って、非コードＲＮＡの本来の特異性は破壊され（すなわち、機能の喪失）、新しい特異性は、天然標的とは異なるＲＮＡ標的（すなわち、目的のＲＮＡ）に対するものである（すなわち、機能の獲得）。非コードＲＮＡがサイレンシング活性を持たない場合には、機能の獲得のみが起こることが理解されるであろう。

【0184】

本明細書で使用する場合、用語「標的ＲＮＡ」は、非コードＲＮＡ分子によって天然に結合されるＲＮＡ配列をいう。従って、標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡの基質として当業者によって考慮される。

【0185】

本明細書で使用する場合、用語「第２の標的ＲＮＡ」は、非コードＲＮＡ分子によって天然には結合されないＲＮＡ配列（コード又は非コード）をいう。従って、第２の標的ＲＮＡは、非コードＲＮＡの天然の基質ではない。

【0186】

本明細書で使用する場合、用語「目的の標的ＲＮＡ」は、設計された非コードＲＮＡ分子によってサイレンシングされるべきＲＮＡ配列（コード又は非コード）をいう。

【0187】

本明細書で使用する場合、用語「標的遺伝子をサイレンシングすること」は、標的遺伝子からのタンパク質及び／又はｍＲＮＡ産物のレベルにおける（例えば、同時転写及び／又は転写後遺伝子サイレンシングによる）欠如又は観察可能な減少を意味する。従って、標的遺伝子のサイレンシングは、本発明の設計された非コードＲＮＡ分子によって標的化されない標的遺伝子と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％であり得る。

【0188】

サイレンシングの結果は、真核細胞又は真核生物の外向きの特性の試験によって、又は生化学的技術（以下に議論されるように）によって確認され得る。

【0189】

本発明のいくつかの実施形態の設計された非コードＲＮＡ分子は、真核細胞若しくは真核生物の成長、分化又は機能に影響を及ぼさないという条件で、いくつかのオフターゲット特異性効果を有することができることが理解されるであろう。

【0190】

一実施形態によれば、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡは、真核細胞に対して内在性である。例示的な内在性の第２標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡには、癌及び／又はアポトーシスに関連する遺伝子の産物が含まれるが、これらに限定されない。例示的な癌に関連する標的遺伝子としては、本明細書中でこのあと論じられるように、ｐ５３、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ及びＦＡＳ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0191】

一実施形態によれば、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡは、真核細胞に対して外来性である（本明細書では異種とも呼ばれる）。このような場合、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡは、真核細胞ゲノム（すなわち、非コードＲＮＡを発現する）の天然の一部ではない遺伝子の産物である。例示的な外来性標的ＲＮＡには、本明細書中以下にさらに議論されるように、病原体（例えば昆虫、ウイルス、細菌、真菌、線虫）の遺伝子等の感染症に関連する遺伝子の産物が挙げられるが、これらに限定されない。外来性標的ＲＮＡ（コード又は非コード）は、真核生物の内在ＲＮＡ配列（例えば、内在核酸配列と部分的に相同であり得る）と配列同一性を共有する核酸配列を含み得る。

【0192】

内在非コードＲＮＡ分子と標的ＲＮＡとの特異的結合は、コンピューターアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）によって決定することができ、そして例えば、ノーザンブロット、Ｉｎ Ｓｉｔｕ（インサイチュ）ハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘアッセイなどを含む方法によって検証され得る。

【0193】

用語「相補性」又は「相補的」の使用は、非コードＲＮＡ分子（又はプロセシングされる小分子ＲＮＡ形態で存在する非コードＲＮＡ分子の少なくとも一部、又は二本鎖ポリヌクレオチド若しくはその一部の少なくとも１本鎖、又は一本鎖ポリヌクレオチドの一部）が、生理的条件下で標的ＲＮＡ又はそのフラグメントにハイブリダイズして、標的遺伝子の制御又は機能又は抑制をもたらすことを意味する。例えば、いくつかの実施形態では、非コードＲＮＡ分子は、標的ＲＮＡ（又は所与の標的遺伝子のファミリーメンバー）中の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００又はこれより多い連続するヌクレオチドの配列と比べて、１００％配列同一性又は少なくとも約３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。

【0194】

本明細書で使用する場合、非コードＲＮＡ分子、又はそれらのプロセシングされる小分子ＲＮＡ形態は、５’から３’に読み取られた配列のうちの１つの配列のすべてのヌクレオチドが、３’から５’に読み取られた場合の他の配列のすべてのヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。基準ヌクレオチド配列と完全に相補的なヌクレオチド配列は、基準ヌクレオチド配列の逆相補配列と同一の配列を示すであろう。

【0195】

配列相補性を決定するための方法は、当技術分野で周知であり、当技術分野で周知のバイオインフォマティクスツール（例えば、ＢＬＡＳＴ、多重配列アラインメント）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0196】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡであるか、又はｓｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して９０〜１００％の範囲（例えば、１００％）である。

【0197】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡであるか、又はｍｉＲＮＡ若しくはｐｉＲＮＡにプロセシングされる場合、相補性は、その標的配列に対して３３〜１００％の範囲である。

【0198】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、シード配列相補性（すなわち、５’からのヌクレオチド２〜８）は、その標的配列に対して８５〜１００％の範囲（例えば、１００％）である。

【0199】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡは、小分子ＲＮＡ形態にさらにプロセシングされ得る（例えば、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる）。このような場合、相同性は、プロセシングされる小分子ＲＮＡ形態（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列）に基づいて測定される。

【0200】

本明細書で使用する場合、用語「小分子ＲＮＡ形態」は、標的ＲＮＡ（又はそのフラグメント）とハイブリダイズし得る成熟小分子ＲＮＡをいう。一実施形態によれば、小分子ＲＮＡ形態はサイレンシング活性を有する。

【0201】

一実施形態によれば、標的配列に対する相補性は、プロセシングされる小分子ＲＮＡ形態の少なくとも約３３％（例えば、２１〜２４ｎｔの３３％）である。従って、例えば、非コードＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列（例えば、２１ｎｔ）の３３％は、シード相補性を含む（例えば、２１ｎｔのうちの７ｎｔ）。

【0202】

一実施形態によれば、標的配列に対する相補性は、プロセシングされる小分子ＲＮＡ形態の少なくとも約４５％（例えば、２１〜２８ｎｔの４５％）である。従って、例えば、非コードＲＮＡ分子がｍｉＲＮＡである場合、成熟ｍｉＲＮＡ配列（例えば、２１ｎｔ）の４５％は、シード相補性を含む（例えば、２１ｎｔのうちの９〜１０ｎｔ）。

【0203】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して約１０％、２０％、３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％までの相補性を有するものとして選択される。

【0204】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９９％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0205】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９８％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0206】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９７％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0207】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９６％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0208】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９５％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0209】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して９０％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0210】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して８５％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0211】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して５０％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0212】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（すなわち、改変前）は、典型的には、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して３３％以下の相補性を有するものとして選択される。

【0213】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して、少なくとも約３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の相補性を含むように設計される。

【0214】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小３３％の相補性（例えば、８５〜１００％のシードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ））を含むように設計される。

【0215】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小４０％の相補性を含むように設計される。

【0216】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小４５％の相補性を含むように設計される。

【0217】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小５０％の相補性を含むように設計される。

【0218】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小６０％の相補性を含むように設計される。

【0219】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小７０％の相補性を含むように設計される。

【0220】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小８０％の相補性を含むように設計される。

【0221】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小８５％の相補性を含むように設計される。

【0222】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９０％の相補性を含むように設計される。

【0223】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９５％の相補性を含むように設計される。

【0224】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９６％の相補性を含むように設計される。

【0225】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９７％の相補性を含むように設計される。

【0226】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９８％の相補性を含むように設計される。

【0227】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して最小９９％の相補性を含むように設計される。

【0228】

特定の実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対して１００％の相補性を含むように設計される。

【0229】

非コードＲＮＡ分子のサイレンシング活性及び／若しくは特異性を生成するため、又は非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／若しくは特異性を、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードする遺伝子を、ＤＮＡ編集剤を用いて改変する。

【0230】

以下は、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードする遺伝子に核酸改変を導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤、並びに本開示の特定の実施形態に従って使用され得るそれを実施するための薬剤の種々の非限定的な例の説明である。

【0231】

改変エンドヌクレアーゼを用いたゲノム編集 − このアプローチは、典型的にはゲノム中の所望の位置（複数可）で特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を切断し作製するために人工的に改変されたヌクレアーゼを用いる逆遺伝学的方法を指し、その二本鎖切断はその後、相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞内在性プロセスによって修復される。ＮＨＥＪは最小限の末端トリミングの有無にかかわらず二本鎖切断（ＤＳＢ）でＤＮＡ末端を直接結合する一方、ＨＲは欠失したＤＮＡ配列を切断部位で再生／コピーするために鋳型（すなわち、Ｓ期に形成された姉妹染色分体）として相同ドナー（ｄｏｎｏｒ）配列を利用する。ゲノムＤＮＡに特定のヌクレオチド改変を導入するために、所望の配列を含むドナーＤＮＡ修復鋳型が、ＨＲの間に存在しなければならない（外因的に提供される一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ）。

【0232】

ほとんどの制限酵素は、ＤＮＡ上の数塩基対を標的として認識し、これらの配列は、しばしば、ゲノムにわたる多くの位置に見出され、所望の位置に限定されない複数の切断を生じるので、ゲノム編集は、従来の制限エンドヌクレアーゼを使用して実施され得ない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖切断又は二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出すために、現在までにいくつかの異なるクラスのヌクレアーゼが発見され、生物工学的に操作されている。これらには、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（及びすべてのそれらの変法）システムが含まれる。

【0233】

メガヌクレアーゼ − メガヌクレアーゼは、一般に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つ又は２つのコピーのいずれかを有することによって特徴付けられる。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造要素、従ってＤＮＡ認識配列特異性及び触媒活性に関して互いに大きく分離されている。メガヌクレアーゼは、微生物種において一般的に見出され、そして非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するという独特の特性を有し、従って、それらを、所望の位置での切断に対して天然に非常に特異的にする。

【0234】

これを利用して、ゲノム編集における部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を作ることができる。当業者は、これらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、突然変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を用いて、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体が作製された。例えば、種々のメガヌクレアーゼが融合されて、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作製されている。

【0235】

あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸は、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するために変更され得る（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照のこと）。メガヌクレアーゼは、例えばＣｅｒｔｏ、ＭＴら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５；米国特許第８，３０４，２２２号明細書；米国特許第８，０２１，８６７号明細書；米国特許第８，１１９，３８１号明細書；米国特許第８，１２４，３６９号明細書；米国特許第８，１２９，１３４号明細書；米国特許第８，１３３，６９７号明細書；米国特許第８，１４３，０１５号明細書；米国特許第８，１４３，０１６号明細書；米国特許第８，１４８，０９８号明細書；又は米国特許第８，１６３，５１４号明細書に記載されている方法を用いて設計することができる。これらの文献のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。あるいは、部位特異的切断特性を有するメガヌクレアーゼは、市販の技術（例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＤｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術）を使用して得られ得る。

【0236】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ − ２つの異なるクラスの操作されたヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の両方が、標的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するのに有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０；Ｋｉｍら、１９９６；Ｌｉら、２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０）。

【0237】

基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特異的ＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一連のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピートのいずれか）に連結された非特異的ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位及び切断部位が互いに分離している制限酵素が選択される。切断部分を分離し、次いでＤＮＡ結合ドメインに連結し、それによって所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼを生じる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋ１である。さらに、Ｆｏｋ１は、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが固有のＤＮＡ配列を認識するので、特異性が劇的に増加することを意味する。この効果を増強するために、ヘテロ二量体としてのみ機能し得、そして増加した触媒活性を有するＦｏｋ１ヌクレアーゼが操作された。ヘテロ二量体機能性ヌクレアーゼは、不要なホモ二量体活性の可能性を避け、従って二本鎖切断（ＤＳＢ）の特異性を増加させる。

【0238】

従って、例えば、特定の部位を標的とするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、この対の各メンバーは、標的とされた部位で隣接する配列に結合するように設計される。細胞における一過性発現の際に、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量化し、二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介したこれらの二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復は、しばしば小さな欠失又は小さな配列挿入（インデル）を生じる。ＮＨＥＪによってなされる各修復は独特であるので、単一のヌクレアーゼ対の使用は、標的部位での一連の異なる挿入又は欠失を有する対立遺伝子系列を生成し得る。

【0239】

一般に、ＮＨＥＪは比較的正確であり（ヒト細胞中のＤＳＢの約８５％が、検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）、遺伝子編集では、修復が正確である場合、ヌクレアーゼは、修復生成物が変異原性であり、認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが消失／変異するか、又は一過性に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しなくなるまで切断を続けるので、誤ったＮＨＥＪが依拠される。

【0240】

欠失は、典型的には、長さが数塩基対から数百塩基対の範囲であるが、２対のヌクレアーゼを同時に使用することによって、より大きな欠失が、細胞培養において首尾よく生成されている（Ｃａｒｌｓｏｎら、２０１２；Ｌｅｅら、２０１０）。さらに、標的領域に相同性を有するＤＮＡのフラグメントがヌクレアーゼ一対と一緒に導入される場合、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、相同組換え（ＨＲ）を介して修復されて、特異的な改変を生成し得る（Ｌｉら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０；Ｕｒｎｏｖら、２００５）。

【0241】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼ間の差異は、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮはＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインの両方は、それらがそれらのタンパク質中に組み合わせて天然に見出されるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れた反復で見出され、そして種々の核酸相互作用タンパク質において多様な組み合わせで見出される。他方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識比を有する反復において見出される。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥの両方が反復パターンで起こるので、多種多様な配列特異性を作製するために、異なる組み合わせを試みることができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、モジュラーアセンブリ（この場合、トリプレット配列と相関するジンクフィンガーは、必要とされる配列をカバーするために列で結合される）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、続いて、細菌系におけるペプチド組み合わせ対最終標的の高ストリンジェンシー選択）、及びとりわけ、ジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮはまた、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から設計され、そして商業的に入手され得る。

【0242】

ＴＡＬＥＮを設計し、取得する方法は、例えば、以下に記載されている。Ｒｅｙｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２年５月；３０（５）：４６０−５；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１） ２９：１４３−１４８；Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２及びＺｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１） ２９（２）：１４９−５３。Ｍｏｊｏ Ｈａｎｄという名前の最近開発されたウェブベースのプログラムが、ゲノム編集アプリケーションのためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮ構築物を設計するためにＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃによって導入された（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ（ｄｏｔ）ｏｒｇを通してアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮはまた、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から設計され、そして商業的に入手され得る。

【0243】

Ｔ−ＧＥＥシステム（ＴａｒｇｅｔＧｅｎｅ’ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅ） − ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含有するプログラマブル核タンパク質分子複合体であって、標的細胞においてインビボで集合し、所定の標的核酸配列と相互作用することができるものが提供される。プログラマブル核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集し、並びに／又は標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を改変することができる機能ドメイン、及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子、並びに（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含む。この組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対形成を介して、標的核酸に対する分子複合体の高い特異性及び結合能力で、所定の核酸配列標的を正確に、信頼性をもって、かつ費用効果的に改変することを可能にする。この組成物は、遺伝毒性が低く、それらの組立てにおいてモジュール式であり、カスタマイズすることなく単一のプラットフォームを利用し、特殊化された中核施設の外部での独立した使用のために実用的であり、開発時間枠がより短く、コストが低減されている。

【0244】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム及びそのすべての変法（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ」とも呼ばれる） − 多くの細菌及び古細菌は、侵入するファージ及びプラスミドの核酸分子を分解することができる内在ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を産生するｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ：クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）ヌクレオチド配列とタンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに対して相同性を有する短鎖を含み、対応する病原体の相補的核酸を分解するようにＣａｓヌクレアーゼに指示するためのガイドとして作用する。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究では、３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、一緒になって配列特異的ヌクレアーゼ活性に十分であることが示されている：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列と相同性を有する２０塩基対を含むｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１）。

【0245】

さらに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合で構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、インビトロでｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的を切断するようにＣａｓ９を誘導できることが実証された。合成ｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９の一過性発現を使用して、様々な異なる種において標的二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができることも実証された（Ｃｈｏら、２０１３；Ｃｏｎｇら、２０１３；ＤｉＣａｒｌｏら、２０１３；Ｈｗａｎｇら、２０１３ａ、ｂ；Ｊｉｎｅｋら、２０１３；Ｍａｌｉら、２０１３）。

【0246】

ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ｇＲＮＡとエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の２つの異なる成分を含んでいる。

【0247】

ｇＲＮＡ（本明細書では短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれる）は、典型的には、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、単一のキメラ転写産物においてｃｒＲＮＡをＣａｓ９ヌクレアーゼに連結する内在細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的ゲノムＤＮＡとの間の塩基対形成によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の首尾よい結合のために、ゲノム標的配列はまた、標的配列の直後に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）配列を含まなければならない。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合は、Ｃａｓ９が二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすＤＮＡの両方の鎖を切断できるように、ゲノム標的配列にＣａｓ９を局在化する。ＺＦＮやＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成される二本鎖切断（ＤＳＢ）は相同組換えやＮＨＥＪを受けることができ、ＤＮＡ修復の際に特異的な配列改変を受けやすい。

【0248】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣとＨＮＨという２つの機能ドメインを持ち、それぞれ異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性化されると、Ｃａｓ９はゲノムＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。

【0249】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの重要な利点は、このシステムの高い効率が、合成ｇＲＮＡを容易に作製する能力と結びついていることである。これは、異なるゲノム部位での改変を標的化するために、及び／又は同じ部位での異なる改変を標的化するために、容易に改変され得るシステムを作製する。さらに、複数の遺伝子の同時標的化を可能にするプロトコルが確立されている。突然変異をもつ細胞の大部分は、標的遺伝子に二対立遺伝子突然変異を提示する。

【0250】

しかしながら、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対形成相互作用における見かけ上の柔軟性は、標的配列との不完全な一致（マッチ）をＣａｓ９によって切断することを可能にする。

【0251】

単一の不活性触媒ドメイン（ＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメインのいずれか）を含むＣａｓ９酵素の改変型は、「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性のあるヌクレアーゼドメインが１つだけあれば、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの一方の鎖だけを切断し、一本鎖切断、すなわち「ニック」を作る。一本鎖切断、すなわちニックは、ほとんどがＰＡＲＰ（センサー）やＸＲＣＣ１／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（連結）のような（これらだけではない）タンパク質が関与する一本鎖切断修復機構によって修復される。もし一本鎖切断（ＳＳＢ）がトポイソメラーゼＩの毒物によって、あるいは天然に存在するＳＳＢ上にＰＡＲＰ１を捕捉する薬物によって生じると、これらは持続し、細胞がＳ期に入って複製フォークがこのようなＳＳＢに出会うと、それらはＨＲによってのみ修復可能な一端ＤＳＢとなる。しかし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入される２つの近位の反対鎖ニックは、しばしば「二重ニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれる二本鎖切断として扱われる。基本的に非平行ＤＳＢである二重ニックは、遺伝子標的に対する所望の効果及びドナー配列の存在及び細胞周期段階（ＨＲははるかに存在量が少なく、細胞周期のＳ期及びＧ２期にのみ起こりうる）に応じて、他のＤＳＢと同様にＨＲ又はＮＨＥＪによって修復することができる。従って、もし特異性とオフターゲット効果の減少がきわめて重要であれば、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いて、ゲノムＤＮＡのごく近傍及び反対の鎖に標的配列をもつ２つのｇＲＮＡを設計することによって二重ニックを作り出すと、どちらかのｇＲＮＡだけではゲノムＤＮＡを変化させないようなニックが生じるので、オフターゲット事象は不可能ではないにしてもオフターゲット効果は減少するであろう。

【0252】

２つの不活性触媒ドメイン（活性を持たないＣａｓ９又はｄＣａｓ９）を含むＣａｓ９酵素の改変型はヌクレアーゼ活性を有さないが、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合することができる。ｄＣａｓ９は、不活性酵素を既知の調節ドメインに融合させることにより、ＤＮＡ転写調節因子が遺伝子発現を活性化又は抑制するためのプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列へのｄＣａｓ９単独の結合は、遺伝子転写を妨害し得る。

【0253】

標的配列の選択及び／又は設計を助けるために利用可能な多数の公的に利用可能なツール、並びに、異なる種における異なる遺伝子についてのバイオインフォマティックに決定された固有のｇＲＮＡのリストがいくつかあり、例えばＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を特定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒがあるが、しかしこれらに限定されない。

【0254】

ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するために、ｇＲＮＡ及びＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の両方は、（例えば、リボ核タンパク質複合体として）標的細胞において発現されるか、又は存在するべきである。挿入ベクターは、単一のプラスミド上に両方のカセットを含み得るか、又はカセットは、２つの別個のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（７５ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔ、Ｓｕｉｔｅ ５５０Ａ・Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ ０２１３９）からのｐｘ３３０プラスミドのように市販されている。哺乳動物ゲノムを改変するためのｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）−ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用はまた、少なくとも、Ｂａｕｅｒら［Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（２０１５） （９５）：ｅ５２１１８．ｄｏｉ：１０．３７９１／５２１１８］（これは、その全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）によって開示される。ｇＲＮＡでＤＮＡ編集を行うために使用され得るＣａｓエンドヌクレアーゼには、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５、Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９−７１）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３（Ｓｈｍａｋｏｖら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５年１１月５日；６０（３）：３８５−９７）が含まれるが、これらに限定されない。

【0255】

特定の実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲは、配列番号５〜６又は配列番号１６５〜２３６に示される核酸配列を含む短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。

【0256】

「ヒットエンドラン（ｈｉｔ ａｎｄ ｒｕｎ）」又は「インアウト（ｉｎ−ｏｕｔ）」 − は、２ステップの再結合手順を含む。第１のステップにおいて、二重正／負選択マーカーカセットを含む挿入型ベクターを使用して、所望の配列変更を導入する。挿入ベクターは、標的遺伝子座に対して相同性を持つ単一の連続領域を含み、目的の突然変異を運ぶように改変される。この標的化構築物を、相同性領域内の１箇所で制限酵素を用いて線状化し、細胞内に導入し、正の選択を行い、相同組換え媒介事象を単離する。相同配列を有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖オリゴとして提供することができる。これらの相同組換え体は、選択カセットを含む介在ベクター配列によって分離される局所重複を含む。第２のステップでは、標的クローンを負の選択に供し、重複配列間の染色体内組換えを介して選択カセットを失った細胞を特定する。局所的組換え事象は重複を除去し、組換え部位に応じて、対立遺伝子は導入された変異を保持するか、野生型に復帰するかのいずれかである。最終的な結果は、外来配列を保持することなく、所望の改変を導入することである。

【0257】

「二重置換」又は「タグ及び交換」ストラテジー − は、ヒットエンドランアプローチと同様の２ステップ選択手順を含むが、２つの異なる標的化構築物の使用を必要とする。第１のステップにおいて、３’及び５’相同性アームを有する標準的な標的化ベクターを使用して、変異が導入されるべき場所の近くに二重の正／負選択可能なカセットを挿入する。系成分を細胞に導入し、正の選択を適用した後、ＨＲ媒介事象を特定することができよう。次に、所望の突然変異と相同性の領域を含む第２の標的化ベクターを標的化クローンに導入し、負の選択を適用して選択カセットを除去し、突然変異を導入する。最終対立遺伝子は、望ましくない外来配列を排除しながら、所望の変異を含む。

【0258】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ標的化モジュール（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。

【0259】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はエンドヌクレアーゼを含まない。

【0260】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ標的化モジュール（例えば、ｇＲＮＡ）を含む。

【0261】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えばｇＲＮＡ及びＣａｓ９である。

【0262】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はＴＡＬＥＮである。

【0263】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はＺＦＮである。

【0264】

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はメガヌクレアーゼである。

【0265】

一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、真核細胞における発現を監視するためのレポーターに連結される。

【0266】

一実施形態によれば、レポーターは蛍光レポータータンパク質である。

【0267】

用語「蛍光タンパク質」は、蛍光を発し、典型的にはフローサイトメトリー、顕微鏡法又は任意の蛍光イメージングシステムによって検出可能であり、従って、このようなタンパク質を発現する細胞の選択の基礎として使用することができるポリペプチドを指す。

【0268】

レポーターとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）であるが、これらに限定されない。蛍光又は他のレポーターの非限定的なリストは、ルミネセンス（例えば、ルシフェラーゼ）又は比色アッセイ（例えば、ＧＵＳ）によって検出可能なタンパク質を含む。特定の実施形態によれば、蛍光レポーターは、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）又はＧＦＰである。

【0269】

新しいクラスの蛍光タンパク質及び応用の総説は、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅｒｉｋ Ａ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚ．；Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ；Ｐａｌｍｅｒ，Ａｍｙ Ｅ．；Ｓｈｕ，Ｘｉａｏｋｕｎ；Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎ；Ｔｓｉｅｎ，Ｒｏｇｅｒ Ｙ．「Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｏｗｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１６．０９．０１０］に見出すことができる。

【0270】

別の実施形態によれば、レポーターは抗生物質選択マーカーである。レポーターとして使用され得る抗生物質選択マーカーの例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）及びハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）であるが、これらに限定されない。本教示に従って使用され付加さらなるマーカー遺伝子は、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ａｃｃＣ３）耐性遺伝子並びにブレオマイシン及びフレオマイシン耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。

【0271】

酵素ＮＰＴＩＩは、カナマイシン、ネオマイシン、ジェネティシン（又はＧ４１８）及びパロモマイシンのような多くのアミノグリコシド系抗生物質をリン酸化することによって不活性化することが認識されるであろう。これらのうち、Ｇ４１８は、形質転換された哺乳類細胞の選択のために常法として使用される。

【0272】

使用されるＤＮＡ編集剤にかかわらず、本発明の方法は、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードする遺伝子が、欠失、挿入又は点突然変異の少なくとも１つによって改変されるように使用される。

【0273】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子の構造化領域にある。

【0274】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域にある。

【0275】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のループ領域にある。

【0276】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域にある。

【0277】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域にある。

【0278】

一実施形態によれば、改変は、非コードＲＮＡ分子又はＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域にある。

【0279】

特定の実施形態によれば、改変は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの改変を含む。

【0280】

一実施形態によれば、改変は、（天然非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又は最大２５０ヌクレオチドの改変を含む。

【0281】

一実施形態によれば、改変は、連続した核酸配列（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００塩基）にあり得る。

【0282】

一実施形態によれば、改変は、非連続的な様式、例えば、２０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００核酸配列全体にわたる様式であり得る。

【0283】

特定の実施形態によれば、改変は、最大２００ヌクレオチドの改変を含む。

【0284】

特定の実施形態によれば、改変は、最大１５０ヌクレオチドの改変を含む。

【0285】

特定の実施形態によれば、改変は、最大１００ヌクレオチドの改変を含む。

【0286】

特定の実施形態によれば、改変は、最大５０ヌクレオチドの改変を含む。

【0287】

特定の実施形態によれば、改変は、最大２５ヌクレオチドの改変を含む。

【0288】

特定の実施形態によれば、改変は、最大２０ヌクレオチドの改変を含む。

【0289】

特定の実施形態によれば、改変は、最大１５ヌクレオチドの改変を含む。

【0290】

特定の実施形態によれば、改変は、最大１０ヌクレオチドの改変を含む。

【0291】

特定の実施形態によれば、改変は、最大５ヌクレオチドの改変を含む。

【0292】

一実施形態によれば、改変は、ＲＮＡサイレンシング分子の構造に依存する。

【0293】

従って、ＲＮＡサイレンシング分子が非必須構造（すなわち、その適切な生合成及び／又は機能において役割を果たさないＲＮＡサイレンシング分子の二次構造）を含むか、又は純粋にｄｓＲＮＡ（すなわち、完全又はほぼ完全なｄｓＲＮＡを有するＲＮＡサイレンシング分子）である場合、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするために、いくつかの改変（例えば、２０〜３０ヌクレオチド、例えば、１〜１０ヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチド）が導入される。

【0294】

別の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子が必須構造を有する（すなわち、ＲＮＡサイレンシング分子の適切な生合成及び／又は活性がその二次構造に依存する）場合、ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするために、より大きな改変（例えば、１０〜２００ヌクレオチド、例えば、５０〜１５０ヌクレオチド、例えば、３０超のヌクレオチドかつ２００以下のヌクレオチド、３０〜２００ヌクレオチド、３５〜２００ヌクレオチド、３５〜１５０ヌクレオチド、３５〜１００ヌクレオチド）が導入される。

【0295】

一実施形態によれば、改変は、ＲＮＡサイレンシング分子の認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが改変されて、元のＰＡＭ認識部位を無効にするようにされる。

【0296】

特定の実施形態によれば、改変は、ＰＡＭモチーフ中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の核酸にある。

【0297】

一実施形態によれば、改変は挿入を含む。

【0298】

特定の実施形態によれば、挿入は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0299】

特定の実施形態によれば、挿入は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0300】

一実施形態によれば、挿入は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又は最大２５０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0301】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大２００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0302】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大１５０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0303】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大１００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0304】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大５０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0305】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大２５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0306】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大２０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0307】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大１５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0308】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大１０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0309】

特定の実施形態によれば、挿入は、最大５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0310】

一実施形態によれば、改変は欠失を含む。

【0311】

特定の実施形態によれば、欠失は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの欠失を含む。

【0312】

一実施形態によれば、欠失は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又は最大２５０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0313】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大２００ヌクレオチドの欠失を含む。

【0314】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大１５０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0315】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大１００ヌクレオチドの欠失を含む。

【0316】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大５０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0317】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大２５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0318】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大２０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0319】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大１５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0320】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大１０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0321】

特定の実施形態によれば、欠失は、最大５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0322】

一実施形態によれば、改変は点突然変異を含む。

【0323】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0324】

一実施形態によれば、点突然変異は、（天然非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又は最大２５０ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0325】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大２００ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0326】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大１５０ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0327】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大１００ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0328】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大５０ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0329】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大２５ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0330】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大２０ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0331】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大１５ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0332】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大１０ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0333】

特定の実施形態によれば、点突然変異は、最大５ヌクレオチドの点突然変異を含む。

【0334】

一実施形態によれば、改変は、欠失、挿入及び／又は点突然変異のいずれかの組み合わせを含む。

【0335】

一実施形態によれば、改変は、ヌクレオチド置換（例えば、ヌクレオチド交換（スワッピング））を含む。

【0336】

特定の実施形態によれば、交換（スワッピング）は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチド又は約１００〜２００ヌクレオチドの交換を含む。

【0337】

一実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、（天然の非コードＲＮＡ分子、例えばＲＮＡサイレンシング分子と比較して）最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又は最大２５０ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0338】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大２００ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0339】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大１５０ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0340】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大１００ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0341】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大５０ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0342】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大２５ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0343】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大２０ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0344】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大１５ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0345】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大１０ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0346】

特定の実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、最大５ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む。

【0347】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードする遺伝子は、内在ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の配列を選択されたＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）と交換することによって改変される。

【0348】

特定の実施形態によれば、内在ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の遺伝子交換のために使用されるｓｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜配列番号４、配列番号９３〜配列番号１６４、又は配列番号２４３〜配列番号２５２からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0349】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のガイド鎖は、構造のオリジナリティを保存し、同じ塩基対形成プロファイルを維持するように改変される。

【0350】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のパッセンジャー鎖は、構造のオリジナリティを保存し、同じ塩基対形成プロファイルを維持するように改変される。

【0351】

本明細書で使用する場合、用語「構造のオリジナリティ」は、二次ＲＮＡ構造（すなわち、塩基対形成プロファイル）をいう。構造のオリジナリティを維持することは、構造依存性であり、純粋に配列依存性ではない非コードＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのようなＲＮＡサイレンシング分子）の正確かつ効率的な生合成／プロセシングのために重要である。

【0352】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、標的ＲＮＡに対して約５０〜１００％の相補性を含むようにガイド鎖（サイレンシング鎖）において改変され（上記のように）、一方、パッセンジャー鎖は、元の（未改変の）非コードＲＮＡ構造を保存するように改変される。

【0353】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、シード配列（例えば、５’末端からのｍｉＲＮＡヌクレオチド２〜８について）が標的配列に対して相補的であるように改変される。

【0354】

特定の実施形態によれば、ＲＮＡサイレンシング分子（すなわち、ＲＮＡｉ分子）は、ＲＮＡｉ分子の配列が、構造のオリジナリティを保存し、細胞ＲＮＡｉプロセシング及び実行因子によって認識されるように改変されるように設計される。

【0355】

本発明のＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ送達方法（例えば、発現ベクターによる）を使用して、又はＤＮＡを含まない方法を使用して、真核細胞に導入され得る。

【0356】

一実施形態によれば、ｇＲＮＡ（又は使用されるＤＮＡ編集システムに依存して、使用される任意の他のＤＮＡ認識モジュール）は、ＲＮＡとして細胞に提供され得る。

【0357】

従って、本技術は、ＲＮＡトランスフェクション（例えば、ｍＲＮＡ＋ｇＲＮＡトランスフェクション）、又はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）トランスフェクション（例えば、タンパク質−ＲＮＡ複合体トランスフェクション、例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＲＮＰ複合体トランスフェクション、又はＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質の任意の組み合わせ）のようなＤＮＡを含まない方法を用いてＤＮＡ編集剤を導入することに関することが理解される。

【0358】

例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ発現プラスミドとして、インビトロ転写産物（すなわち、ＲＮＡ）として、又はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）中のＲＮＡ部分に結合した組換えタンパク質として導入され得る。ｇＲＮＡは、例えば、ＤＮＡプラスミドとして、又はインビトロ転写産物（すなわち、ＲＮＡ）として送達され得る。

【0359】

ＲＮＡ又はＲＮＰトランスフェクションのための当該分野で公知の任意の方法が、本教示に従って使用され得る。例としては、例えば、マイクロインジェクション［Ｃｈｏら、「Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｅ ｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１３）１９５：１１７７−１１８０（参照により本明細書に援用される）に記載されている］、エレクトロポレーション［Ｋｉｍら、「Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．（２０１４）２４：１０１２−１０１９（参照により本明細書に援用される）に記載されている］、又は例えばリポソームを用いる脂質媒介性トランスフェクション［Ｚｕｒｉｓら、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０８１（参照により本明細書に援用される）に記載されている］が挙げられるがこれらに限定されない。ＲＮＡトランスフェクションのさらなる方法は、米国特許出願公開第２０１６０２８９６７５号に記載されており、この文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0360】

本発明のＲＮＡトランスフェクション方法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、ベクターを含まないことである。ＲＮＡ導入遺伝子は、任意のさらなる配列（例えば、ウイルス配列）を必要としない、最小発現カセットとして、細胞に送達され得、そしてそこで発現され得る。

【0361】

一実施形態によれば、哺乳類細胞における本発明の外来性ＤＮＡ編集剤の発現のために、ＤＮＡ編集剤をコードするポリヌクレオチド配列が、哺乳類細胞発現に好適な核酸構築物にライゲーションされる。このような核酸構築物は、細胞中でのポリヌクレオチド配列の転写を構成的又は誘導的に導くためのプロモーター配列を含む。

【0362】

本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物（本明細書中で「発現ベクター」とも呼ばれる）は、このベクターを真核生物における複製及び組み込みに好適なもの（例えば、シャトルベクター）にするさらなる配列を含む。加えて、典型的なクローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列、転写及び翻訳ターミネーター並びにポリアデニル化シグナルも含有してよい。例として、このような構築物は、通常、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部分を含むことになる。

【0363】

真核生物のプロモーターは、通常、２種類の認識配列、ＴＡＴＡボックス及び上流のプロモーター配列を含有する。ＴＡＴＡボックスは、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡ合成を開始するように導くことに関与すると考えられている。他の上流のプロモーター配列は、転写が開始される速度を決定する。

【0364】

好ましくは、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物によって利用されるプロモーターは、形質転換される特定の細胞集団で活性である。細胞型特異的及び／又は組織特異的プロモーターの例としては、肝臓特異的であるアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔら、（１９８７） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８−２７７］、リンパ様特異的プロモーター［Ｃａｌａｍｅら、（１９８８） Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５−２７５］；特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏら、（１９８９） ＥＭＢＯ Ｊ． ８：７２９−７３３］及び免疫グロブリン［Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３） Ｃｅｌｌ ３３７２９−７４０］、神経フィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅら（１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７］等の神経細胞特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈら（１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６］又は乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４，１６６号明細書）等の乳腺特異的プロモーター等のプロモーターが挙げられる。

【0365】

エンハンサー配列は、リンクされた相同的又は異種性のプロモーターから最大１，０００倍転写を刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流又は上流に置かれたときに活性である。ウイルス由来の多くのエンハンサー配列は幅広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型に好適である。本発明のいくつかの実施形態に好適な他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせとしては、ポリオーマウイルス、ヒト又はマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、マウス白血病ウイルス、マウス又はラウス肉腫ウイルス及びＨＩＶ等の種々のレトロウイルス由来の末端反復配列が挙げられる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ． １９８３を参照のこと。この文献は、参照により本明細書に援用したものとする。

【0366】

発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、天然の状況においてプロモーターが転写開始点から位置する距離とおよそ同じ距離だけ異種性の転写開始点から離れて位置する。しかしながら、当該技術分野で公知のように、この距離のいくらかのばらつきは、プロモーター機能の喪失なく許容されうる。

【0367】

ｍＲＮＡ翻訳の効率を高めるために、ポリアデニル化配列も、発現ベクターに加えられてよい。２つの別個の配列エレメントが正確で効率的なポリアデニル化のために必要とされる。それらは、ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵ又はＵリッチ配列、及び１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する６ヌクレオチドの高度保存配列、ＡＡＵＡＡＡ。本発明のいくつかの実施形態に好適な終結シグナル及びポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０に由来するものが挙げられる。

【0368】

すでに説明した配列、エレメントに加えて、本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、通常、クローニングされた核酸の発現のレベルを高めること、又は組換えＤＮＡを保有する細胞の特定を容易にすることを意図した他の特殊化したエレメントを含有してもよい。例えば、いくつかの動物ウイルスは、許容的な細胞型でのウイルスゲノムの染色体外の複製を促進するＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、プラスミドで運ばれているか又は宿主細胞のゲノムにある遺伝子によって適切な因子が提供されるかぎり、エピソームにより複製される。

【0369】

ベクターは、真核生物のレプリコンを含有してもよいししなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在する場合、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核細胞において増幅可能である。ベクターが真核生物のレプリコンを含まない場合、エピソーム増幅は不可能である。その代わり、組換えＤＮＡが操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターが所望の核酸の発現を導く。

【0370】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクターは、例えば、内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）等の単一のｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列及びプロモーター−キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含むことができる。

【0371】

発現ベクターに含まれる個々の配列、エレメントが様々な構成で並んでいてもよいということは理解されよう。例えば、エンハンサー配列、プロモーター等、さらにはＤＮＡ編集剤をコードするポリヌクレオチド配列（複数可）は、「頭−尾」構造で並んでもよいし、反転した相補体（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として、又は相補的な構成で、逆平行鎖として存在してもよい。構成のそのような多様性は発現ベクターの非コードエレメントに関してより起こりやすいが、発現ベクター内のコード配列の代替構成も想定される。

【0372】

哺乳類発現ベクターの例としては、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手できるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手できるｐＣＩ、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から入手できるｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ及びｐＢＫ−ＣＭＶ、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手できるｐＴＲＥＳ、並びにこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0373】

レトロウイルス等の真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターも使用することができる。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしてはｐＨＥＢＯ、及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ^＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ^＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞における発現に有効であると示されている他のプロモーターの誘導のもとでタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。

【0374】

ウイルスは、多くの場合、宿主生体防御機構を回避するように進化した非常に特殊化された感染病原体である。通常、ウイルスは、特定の細胞型に感染し増殖する。ウイルスベクターの標的特異性は、所定の細胞型を特異的に標的とし、それによって組換え遺伝子を感染細胞に導入するために、その天然の特異性を利用する。従って、本発明のいくつかの実施形態によって使用されるベクターの種類は、形質転換される細胞型に依存することになる。形質転換される細胞型に従って好適なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内にあり、従って、選択の考慮事項の一般的な説明は、本明細書に提示されない。例えば、骨髄細胞は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的とすることができ、腎臓細胞は、Ｌｉａｎｇ ＣＹら、２００４（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ． １４９：５１−６０）に記載されているとおり、バキュロウイルスである核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ：ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種性のプロモーターを使用して標的とされてもよい。

【0375】

組換えウイルスベクターは、ＤＮＡ編集剤のインビボ発現に対して有用である。というのも、組換えウイルスベクターは、水平感染及び標的特異性等の利点をもたらすからである。水平感染は、例えばレトロウイルスの生活環に固有であり、単独の感染細胞が、出芽して隣接する細胞を感染させる多くの子孫ウイルス粒子（ビリオン）を生成するプロセスである。その結果として、大きな領域が迅速に感染した状態になるが、そのほとんどがもとのウイルス粒子によって最初に感染されなかったものである。これは、感染病原体が娘子孫を通してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。水平に広がることができないウイルスベクターも、生成することができる。この特徴は、所望の目的が、特定の遺伝子を限局的な数の標的細胞へと導入することである場合に、有用でありうる。

【0376】

一実施形態によれば、機能的ＤＮＡ編集剤を発現させるために、切断モジュール（ヌクレアーゼ）がＤＮＡ認識ユニットの不可欠な部分でない場合、発現ベクターは、切断モジュール並びにＤＮＡ認識ユニット（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの場合、ｇＲＮＡ）をコードし得る。

【0377】

あるいは、切断モジュール（ヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ）は、別々の発現ベクターにクローニングされ得る。このような場合、少なくとも２つの異なる発現ベクターを同じ真核細胞に形質転換しなければならない。

【0378】

あるいは、ヌクレアーゼが利用されない場合（すなわち、外来性供給源から細胞に投与されない場合）、ＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一の発現ベクターを使用してクローニング及び発現され得る。

【0379】

一実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された少なくとも１つのＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ）をコードする核酸剤を含む。

【0380】

一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ）は、同じ発現ベクターからコードされる。このようなベクターは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットの両方の発現のために、植物細胞において活性な単一のシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）を含み得る。あるいは、ヌクレアーゼ及びＤＮＡ認識ユニットはそれぞれ、真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結され得る。

【0381】

一実施形態によれば、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡ認識ユニット（例えば、ｇＲＮＡ）は、異なる発現ベクターからコードされ、それによって各々は、真核細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。

【0382】

一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む。

【0383】

一実施形態によれば、改変が挿入である場合、当該方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む。

【0384】

一実施形態によれば、改変が欠失である場合、当該方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む。

【0385】

一実施形態によれば、改変が欠失及び挿入（例えば、交換）である場合、当該方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む。

【0386】

一実施形態によれば、改変が点突然変異である場合、当該方法は、真核細胞にドナーオリゴヌクレオチドを導入することをさらに含む。

【0387】

本明細書で使用する場合、用語「ドナーオリゴヌクレオチド」又は「ドナーオリゴ」は、外来性ヌクレオチド（すなわち、ゲノムにおける正確な変化を生成するために真核細胞に外部から導入されるもの）をいう。一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは合成されたものである。

【0388】

一実施形態によれば、ドナーオリゴはＲＮＡオリゴである。

【0389】

一実施形態によれば、ドナーオリゴはＤＮＡオリゴである。

【0390】

一実施形態によれば、ドナーオリゴは合成オリゴである。

【0391】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む。

【0392】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）を含む。

【0393】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を含む。

【0394】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖（ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖）を含む。

【0395】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。

【0396】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。

【0397】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。

【0398】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。

【0399】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を含む。

【0400】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、（上述のように）交換のためのＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。

【0401】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、非発現ベクターフォーマット又はオリゴで提供される。

【0402】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡドナープラスミドを含む。

【0403】

一実施形態によれば、ドナーオリゴヌクレオチドは、約５０〜５０００、約１００〜５０００、約２５０〜５０００、約５００〜５０００、約７５０〜５０００、約１０００〜５０００、約１５００〜５０００、約２０００〜５０００、約２５００〜５０００、約３０００〜５０００、約４０００〜５０００、約５０〜４０００、約１００〜４０００、約２５０〜４０００、約５００〜４０００、約７５０〜４０００、約１０００〜４０００、約１５００〜４０００、約２０００〜４０００、約２５００〜４０００、約３０００〜４０００、約５０〜３０００、約１００〜３０００、約２５０〜３０００、約５００〜３０００、約７５０〜３０００、約１０００〜３０００、約１５００〜３０００、約２０００〜３０００、約５０〜２０００、約１００〜２０００、約２５０〜２０００、約５００〜２０００、約７５０〜２０００、約１０００〜２０００、約１５００〜２０００、約５０〜１０００、約１００〜１０００、約２５０〜１０００、約５００〜１０００、約７５０〜１０００、約５０〜７５０、約１５０〜７５０、約２５０〜７５０、約５００〜７５０、約５０〜５００、約１５０〜５００、約２００〜５００、約２５０〜５００、約３５０〜５００、約５０〜２５０、約１５０〜２５０又は約２００〜２５０ヌクレオチドを含む。

【0404】

特定の実施形態によれば、ｓｓＯＤＮ（例えばｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２００〜５００ヌクレオチドを含む。

【0405】

特定の実施形態によれば、ｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）を含むドナーオリゴヌクレオチドは、約２５０〜５０００ヌクレオチドを含む。

【0406】

一実施形態によれば、内在ＲＮＡサイレンシング分子（例えば、ｍｉＲＮＡ）の、選択されたＲＮＡサイレンシング配列（例えば、ｓｉＲＮＡ）との遺伝子交換のために、発現ベクター、ｓｓＯＤＮ（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）又はｄｓＯＤＮ（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）は、真核細胞中で発現される必要はなく、非発現鋳型として働くだけである。特定の実施形態によれば、このような場合、ＤＮＡ編集剤（例えば、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡモジュール）のみが、ＤＮＡ形態で提供される場合、発現される必要がある。

【0407】

いくつかの実施形態によれば、ヌクレアーゼを使用せずに内在非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）を遺伝子編集するために、ＤＮＡ編集剤（例えば、ｇＲＮＡ）を、（本明細書中で議論されるように）ドナーオリゴヌクレオチドを用いて、又は用いずに、真核細胞に導入してもよい。

【0408】

一実施形態によれば、真核細胞へのドナーオリゴヌクレオチドの導入は、上記の方法のいずれかを使用して（例えば、発現ベクター又はＲＮＰトランスフェクションを使用して）行われる。

【0409】

一実施形態によれば、ｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドは、真核細胞に同時導入される。任意のさらなる因子（例えば、ヌクレアーゼ）が、それと一緒に導入され得ることが理解される。

【0410】

一実施形態によれば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に（例えば、数分又は数時間以内に）真核細胞に導入される。任意のさらなる因子（例えば、ヌクレアーゼ）が、ｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、それと同時に、又はそれに続いて導入され得ることが理解される。

【0411】

一実施形態によれば、ｇＲＮＡは、ＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドに続いて（例えば、数分又は数時間以内に）真核細胞に導入される。任意のさらなる因子（例えば、ヌクレアーゼ）が、ｇＲＮＡ又はＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドの前に、それと同時に、又はそれに続いて導入され得ることが理解される。

【0412】

一実施形態によれば、ゲノム編集のための少なくとも１つのｇＲＮＡ及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。

【0413】

一実施形態によれば、ゲノム編集のための少なくとも１つのｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ）及びＤＮＡドナーオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。

【0414】

本発明のいくつかの実施形態の発現ベクター又はドナーオリゴを真核細胞（例えば、幹細胞）へと導入するために種々の方法を使用することができる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州（１９８９）、Ｃｈａｎｇら、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）、ミシガン州（１９９５）、Ｖｅｇａら、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、アナーバー、ミシガン州（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）、マサチューセッツ州（１９８８）及びＧｉｌｂｏａら、［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４−５１２、１９８６］に一般に記載されており、例えば、安定なトランスフェクション又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション（電気穿孔）、及び組換えウイルスベクターを用いた感染が挙げられる。加えて、正−負の選択方法については米国特許第５，４６４，７６４号明細書及び同第５，４８７，９９２号明細書を参照。

【0415】

ウイルス感染による核酸の導入は、リポフェクション及びエレクトロポレーション等の他の方法に勝るいくつかの利点をもたらす。というのも、より高いトランスフェクション効率が、ウイルスの感染性に起因して得られうるからである。

【0416】

現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、アデノウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び脂質ベースの系等のウイルス性構築物又は非ウイルス性構築物を用いるトランスフェクションが挙げられる。遺伝子の脂質媒介移入用の有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ［Ｔｏｎｋｉｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１４（１）：５４−６５（１９９６）］である。遺伝子治療については、好ましい構築物は、ウイルス、最も好ましくはアデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、又はレトロウイルスである。レトロウイルス構築物等のウイルス性構築物は、少なくとも１つの転写プロモーター／エンハンサー又は遺伝子座規定エレメント（ｌｏｃｕｓ−ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）（複数可）、又は選択的スプライシング、ＲＮＡ核外輸送、若しくはメッセンジャーの翻訳後修飾等の他の手段による遺伝子発現を制御する他のエレメントを含む。このようなベクター構築物は、そのウイルス性構築物にパッケージングシグナル、末端反復配列（ＬＴＲ）又はその一部分、並びに使用されるウイルスに適切なプラス鎖及びマイナス鎖プライマー結合部位がすでに存在している場合を除き、これらも含む。加えて、このような構築物は、通常、宿主細胞からのペプチドの分泌のためのシグナル配列を含み、その宿主細胞にこのシグナル配列が置かれている。好ましくは、この目的のためのシグナル配列は、哺乳類シグナル配列又は本発明のいくつかの実施形態のポリペプチド変異体のシグナル配列である。任意に、構築物は、ポリアデニル化を導くシグナル、並びに１以上の制限酵素部位及び翻訳終結配列も含んでよい。例として、そのような構築物は、通常、５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第２鎖ＤＮＡ合成の起点、及び３’ＬＴＲ又はその一部分を含むことになる。カチオン性脂質、ポリリジン、及びデンドリマー等の非ウイルス性である他のベクターを使用することができる。

【0417】

挿入されたコード配列の転写及び翻訳のための必要なエレメントを含有することのほかに、本発明のいくつかの実施形態の発現構築物は、発現されたペプチドの安定性、産生、精製、収率又は毒性を増強するように操作された配列も含むことができる。

【0418】

特定の実施形態によれば、外来遺伝子を真核細胞に導入するために衝撃方法が使用される。一実施形態によれば、この方法は一過性である。本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができる例示的な衝撃方法は、後述の実施例の節で論じられる。真核細胞（例えば、哺乳類細胞）の衝撃は、Ｕｃｈｉｄａ Ｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．（２００９） １７９０（８）：７５４−６４にも教示されており、この文献を参照により本明細書に援用したものとする。

【0419】

使用される形質転換／感染方法にかかわらず、本教示はさらに、ゲノム編集事象を含む形質転換細胞を選択する。

【0420】

特定の実施形態によれば、選択は、特定の遺伝子座において首尾よく正確な改変（例えば、交換、挿入、欠失、点突然変異）を含む細胞のみが選択されるように実施される。従って、意図しない遺伝子座における改変（例えば、挿入、欠失、点突然変異）を含む任意の事象を含む細胞は、選択されない。

【0421】

一実施形態によれば、改変細胞の選択は、表現型レベルで、分子事象の検出によって、蛍光レポーターの検出によって、又は選択（例えば、抗生物質、又は薬物への耐性等の他の選択マーカー、すなわちＴＰ５３サイレンシングの場合のＮｕｔｌｉｎ３）の存在下での成長によって行うことができる。

【0422】

一実施形態によれば、改変細胞の選択は、新たに編集された非コードＲＮＡ分子の生合成及び発生（例えば、新規ｍｉＲＮＡバージョンの存在、新規編集ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｔａｓｉＲＮＡなどの存在）を分析することによって行われる。

【0423】

一実施形態によれば、改変された細胞の選択は、標的ＲＮＡをコードする生物の少なくとも１つの真核細胞又は真核生物の表現型、例えば細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の色素沈着、生物における感染パラメータ（ウイルス負荷若しくは細菌負荷等）又は生物における炎症パラメータ（発熱若しくは発赤等）を確認することによって、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／又は特異性を分析することによって行われる。

【0424】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、例えば、遺伝子の発現又は発現の欠如によって遺伝子型的に決定される。

【0425】

一実施形態によれば、非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性は、表現型的に決定される。

【0426】

一実施形態によれば、真核細胞又は真核生物の表現型は、遺伝子型の前に決定される。

【0427】

一実施形態によれば、真核細胞又は真核生物の遺伝子型は、表現型の前に決定される。

【0428】

一実施形態によれば、改変細胞の選択は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡのＲＮＡレベルを測定することによって、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／又は特異性を分析することによって行われる。これは、例えば、ノーザンブロッティング、ヌクレアーゼ保護アッセイ、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ又は免疫ブロット法によって、当該分野で公知の任意の方法を使用して実施され得る。

【0429】

一実施形態によれば、改変細胞の選択は、例えば、挿入、欠失、挿入−欠失（インデル（Ｉｎｄｅｌ））、反転、置換、及びそれらの組み合わせなど、求められる編集のタイプに応じて、本明細書で「突然変異」又は「編集」とも呼ばれるＤＮＡ編集事象を含む真核細胞又はクローンを分析することによって行われる。

【0430】

配列変更を検出するための方法は、当該分野で周知であり、そしてＤＮＡ及びＲＮＡ配列決定（例えば、次世代シークエンシング）、電気泳動、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイ及びハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロット分析）を含むが、これらに限定されない。一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために使用される種々の方法（例えば、ユニークな制限部位（複数可）の出現又は消失を検出するためのＰＣＲに基づくＴ７エンドヌクレアーゼ、Ｈｅｔｒｏｄｕｐｌｅｘ及びＳａｎｇｅｒ配列決定、又はＰＣＲ、続いて制限消化もまた、使用され得る。

【0431】

ＤＮＡ編集事象（例えば、インデル）の存在を確認する別の方法は、ミスマッチＤＮＡを認識し切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。

【0432】

一実施形態によれば、形質転換細胞の選択は、蛍光レポーターによって発せられる蛍光を示す形質転換細胞を選択するフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって行われる。ＦＡＣＳソーティングに続いて、蛍光マーカーを提示する、形質転換真核細胞の正に選択されたプールを収集し、そしてアリコートを、上記のようにＤＮＡ編集事象を試験するために使用し得る。

【0433】

抗生物質選択マーカーを使用した場合、形質転換後、真核細胞クローンを、例えば、細胞培養液において選択（例えば、抗生物質）の存在下で培養する。次いで、細胞培養液の細胞の一部を、上記のように、ＤＮＡ編集事象について分析（検証）する。

【0434】

本発明の一実施形態によれば、当該方法は、形質転換された細胞において、第２の標的ＲＮＡに対する内在非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の相補性を検証することをさらに含む。

【0435】

上記のように、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）をコードする遺伝子の改変後、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、第２の標的ＲＮＡ又は目的の標的ＲＮＡの配列に対して、少なくとも約３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はさらには１００％の相補性を含む。

【0436】

設計された非コードＲＮＡ分子と目的の標的ＲＮＡとの特異的結合は、計算アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ）などの当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができ、例えば、ノーザンブロット、Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｐｌｅｘアッセイ等を含む方法によって検証することができる。

【0437】

陽性真核細胞は、ＤＮＡ編集事象に関してホモ接合又はヘテロ接合であり得ることが理解されるであろう。ヘテロ接合体細胞の場合、細胞は、改変された遺伝子のコピー及び非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）の非改変遺伝子のコピーを含み得る。当業者は、意図される用途に従って、さらなる培養／再生のために細胞を選択する。

【0438】

一実施形態によれば、一過的な方法が所望される場合、所望されるようなＤＮＡ編集事象の存在を示す真核細胞が、ＤＮＡ編集剤の存在、すなわち、ＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の喪失についてさらに分析され、選択される。これは、例えば、ＤＮＡ編集剤の発現喪失（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質で）を、例えばＧＦＰの蛍光検出又はｑ−ＰＣＲ、ＨＰＬＣによって分析することによって行うことができる。

【0439】

一実施形態によれば、一過性方法が所望される場合、真核細胞は、本明細書中に記載される核酸構築物又はその部分（例えば、ＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列）の存在について分析され得る。これは、蛍光顕微鏡法、ｑ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、及び／又はサザンブロット、ＰＣＲ、配列決定、ＨＰＬＣなどの任意の他の方法によって確認することができる。

【0440】

陽性真核細胞クローンを保存（例えば、凍結保存）してもよい。

【0441】

あるいは、真核細胞は、長期間、さらに培養して、例えば、未分化状態で維持されてもよいし、必要に応じて、他の細胞型、組織、器官又は生物へと分化するように誘導されてもよい。

【0442】

本発明のいくつかの実施形態のＤＮＡ編集剤及び任意にドナーオリゴは、単一の細胞に、細胞の群（例えば、上で論じたように初代培養細胞又は細胞株）に、又は生物（例えば、上で論じたように哺乳動物、鳥類、魚類、及び昆虫）に投与することができる。

【0443】

従って、本発明のいくつかの実施形態のＤＮＡ編集剤及び任意にドナーオリゴ（又はそれらを含む発現ベクター又はＲＮＰ複合体）は、生物にそれ自体で投与することができるし、又はそれらが好適な担体又は賦形剤と混合されている医薬組成物として投与することもできる。

【0444】

本明細書で使用する場合、「医薬組成物」は、１以上の本明細書に記載される活性成分と、生理的に好適な担体及び賦形剤等の他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

【0445】

本明細書中で、用語「活性成分」は、生物学的効果に関与するＤＮＡ編集剤及び任意にドナーオリゴを指す。

【0446】

これ以降、語句「生理的に許容できる担体」及び「薬学的に許容できる担体」は、互換的に使用されてもよく、これらは、生物に対して重大な刺激作用を引き起こさず、投与された化合物の生物活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を指す。アジュバント（佐剤）は、これらの語句の範疇に含まれる。

【0447】

本明細書中で、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖類及びデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。

【0448】

薬物の配合及び投与のための技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルベニア州、最新版に見出すことができ、この文献を参照により本明細書に援用したものとする。

【0449】

好適な投与経路としては、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、とりわけ経鼻送達、腸内送達又は非経口送達、例えば筋肉内注射、皮下注射及び髄内注射、並びに髄腔内注射、直接室内注射、心臓内注射、例えば、右心室内腔又は左心室内腔への注射、一般冠状動脈への注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、又は眼内注射を挙げてもよい。

【0450】

中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達のための従来のアプローチとしては、神経外科的戦略（例えば、脳内注射又は脳室内注入）；ＢＢＢの内在性の輸送経路のうちの１つを利用しようとした、薬剤の分子操作（例えば、自身ではＢＢＢ（血液脳関門）を通過することができない薬剤と組み合わせて、内皮細胞表面分子に対する親和性を有する輸送ペプチドを含むキメラ融合タンパク質の製造）；薬剤の脂質溶解性を向上するように設計（例えば、水溶性薬剤を脂質又はコレステロール担体に結合すること）された薬理学的な戦略；並びに（頚動脈へのマンニトール溶液の注入又はアンギオテンシンペプチド等の生物活性剤の使用から生じる）高浸透圧性の分断（ｈｙｐｅｒｏｓｍｏｔｉｃ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）によるＢＢＢの完全性の一時的な分断、が挙げられる。しかしながら、これらの戦略の各々は、制約を抱える。例えば、侵襲的な外科手術に随伴する固有のリスク、内在性の輸送系に固有の制約によって課されるサイズの制約、ＣＮＳの外部で活性であることができる担体モチーフから構成されるキメラ分子の全身投与に随伴する潜在的に望ましくない生物的副作用、及びＢＢＢが分断される脳の領域内での脳損傷のリスクの可能性（これは、この経路を次善の送達方法にしてしまう）などである。

【0451】

あるいは、例えば、医薬組成物を患者の組織領域に直接注射することにより、医薬組成物を全身的ではなく局所的に投与してもよい。

【0452】

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセスにより、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、微粒子化、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥のプロセスによって製造されてもよい。

【0453】

本発明のいくつかの実施形態に係る使用のための医薬組成物は、このように、医薬品として使用することができる調剤への活性成分の加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１以上の生理的に許容できる担体を使用して従来の方法で処方されてよい。適正な処方は、選ばれた投与経路に依存する。

【0454】

注射用に、上記医薬組成物の活性成分は、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理的塩緩衝液等の生理的に適合性の緩衝液中で処方されてもよい。経粘膜投与用に、浸透するべき障壁に適切な浸透剤が処方物で使用される。このような浸透剤は、一般に当該技術分野で公知である。

【0455】

経口投与用に、医薬組成物は、活性化合物を当該技術分野で周知の薬学的に許容できる担体と組み合わせることにより容易に処方できる。このような担体によって、医薬組成物は、患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、薬糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等として処方されることが可能である。経口使用のための薬理学的な調剤は、固体賦形剤を使用し、任意に、得られた混合物を粉砕し、所望に応じて好適な補助剤を加えた後、顆粒の混合物を加工することで作製することができ、これにより錠剤又は薬糖衣錠コアが得られる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース（乳糖）、スクロース（ショ糖）、マンニトール、若しくはソルビトールを含めた糖類；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、ガムトラガント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム等のセルロース調製物；及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の生理的に許容できるポリマーなどの充填剤である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム等のその塩などの崩壊剤が加えられてもよい。

【0456】

薬糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、濃縮砂糖溶液が使用されてもよく、この濃縮糖溶液は、任意にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい。特定のため、又は活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料又は色素が錠剤又は薬糖衣錠コーティングに加えられてもよい。

【0457】

経口で使用することができる医薬組成物は、ゼラチンから作製される押し込み型（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤から作製される軟密封カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、及び任意に安定剤との混合物で活性成分を含有してもよい。軟カプセル剤では、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、又は液状ポリエチレングリコール等の好適な液体に溶解又は懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与用のすべての処方物は、選ばれた投与経路に好適な投薬量である必要がある。

【0458】

口腔内投与用に、組成物は、従来の様式で処方された錠剤又はトローチ剤の形態をとってもよい。

【0459】

鼻内吸入による投与のために、本発明のいくつかの実施形態に係る使用のための活性成分は、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフロロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使用して、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形態で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合には、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを備えることにより決定されてもよい。ディスペンサーにおいて使用するための、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジは、化合物及びラクトース又はデンプン等の好適な粉末基材の粉末混合物を含有して処方されてもよい。

【0460】

本明細書に記載される医薬組成物は、非経口投与、例えば、ボーラス注入又は持続点滴用に処方されてもよい。注射用の処方物は、単位剤形で、例えば、任意に防腐剤を添加したアンプル剤で、又は複数回用量容器で提示されてもよい。この組成物は、油性又は水性のビヒクル（媒質）中の懸濁剤、液剤又は乳剤であってよく、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散化剤等の製剤化剤を含有してもよい。

【0461】

非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性形態の活性調製物の水溶液が挙げられる。さらに、活性成分の懸濁液が、適切な油性又は水系の注射用懸濁液として調製されてもよい。好適な親油性の溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランを含有してもよい。任意に、この懸濁液は、好適な安定剤又は非常に濃厚な溶液の調製を可能にするための活性成分の溶解性を高める薬剤も含有してよい。

【0462】

あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌の、発熱性物質除去水ベースの溶液を用いて構成するための粉末形態にあってもよい。

【0463】

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物は、例えば、カカオバター又は他のグリセリド等の従来の座薬基材を使用して、座薬又は停留浣腸等の直腸組成物として処方されてもよい。

【0464】

本発明のいくつかの実施形態に関する使用に好適な医薬組成物としては、活性成分が意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が挙げられる。より具体的には、治療上有効量は、障害（例えば、癌若しくは感染症）の症候を予防、緩和若しくは寛解させるか、又は処置されている対象の生存を延長するために有効な活性成分（ＤＮＡ編集剤）の量を意味する。

【0465】

治療上有効量の決定は、とりわけ本明細書に提示される詳細な開示を踏まえると、十分に当業者の能力の範囲内にある。

【0466】

本発明の方法で使用される任意の調製物について、治療上有効量又は治療上有効用量は、インビトロ及び細胞培養液アッセイから最初に推定することができる。例えば、用量は、所望の濃度又は力価を達成するために、動物モデルにおいて処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。

【0467】

癌性疾患についての動物モデルは、例えばＹｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ． （２０１５） ８（Ｓｕｐｐｌ １）：１１５−１１８に記載されている。感染症についての動物モデルは、例えばＳｈｅｖａｃｈ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、オンライン公開：２０１１年４月１日、ＤＯＩ：１０．１００２／０４７１１４２７３５．ｉｍ１９００ｓ９３に記載されている。

【0468】

本明細書に記載される活性成分の毒性及び治療効果（治療有効性）は、標準的な医薬手順によって、インビトロにおいて、細胞培養液において、又は実験動物において決定することができる。これらのインビトロ及び細胞培養液アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおいて使用するための投薬量の範囲を処方する際に使用することができる。投薬量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変わりうる。正確な処方、投与経路及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ばれうる。（例えば、Ｆｉｎｇｌ，ら、１９７５、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」中、第１章、１頁を参照）。

【0469】

投薬量及び投薬間隔は、生物学的効果を誘導又は抑制するために十分な量（最小有効濃度、ｍｉｎｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＥＣ）の活性成分を提供するように個々に調整されてよい。ＭＥＣは、調製物ごとに変わることになろうが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特徴及び投与経路に依存することになる。血漿中濃度を決定するために検出アッセイを使用することができる。

【0470】

処置されるべき状態の重症度及び応答性に応じて、投薬は、単回又は複数回の投与であることができ、処置過程は、数日から数週間、又は治癒がもたらされるか若しくは病状の軽減が成し遂げられるまで続く。

【0471】

投与されるべき組成物の量は、当然、処置される対象、苦痛の重症度、投与様式、担当医の判断等に依存することになる。

【0472】

本発明のいくつかの実施形態の組成物は、所望に応じて、パック又はディスペンサー装置、例えばＦＤＡ認可のキット等で提示されてもよく、これらは、活性成分を含有する１以上の単位剤形を含有してよい。パックは、例えば、金属箔又はプラスチック箔を含んでもよく、例えばブリスターパックであってもよい。このパック又はディスペンサー装置は、投与についての説明書を伴ってもよい。パック又はディスペンサーは、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により指定された形式の容器に随伴する通知に入れられていてもよく、この通知は、当局による組成物の形態又はヒト投与若しくは獣医学投与の認可を反映したものである。このような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局に認可されたラベル又は認可された製品挿入物であってもよい。適合性の医薬担体中で処方された本発明の調製物を含む組成物は、さらに後述するように、調製され、適切な容器に入れられ、適応する状態の処置のためにラベル付けされてもよい。

【0473】

目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を含むように設計されたＤＮＡ編集剤は、後述する種々の疾患及び状態を処置するために使用することができる。

【0474】

用語「処置（する）」は、病態（疾患、障害又は状態）の発生を阻害、予防若しくは停止すること、及び／又は病態の低減、寛解、又は退縮を引き起こすことを指す。当業者は、種々の方法論及びアッセイが、病態の発症を評価するために使用することができ、同様に、種々の方法論及びアッセイが病態の低減、寛解又は退縮を評価するために使用されてもよいことを理解しているであろう。

【0475】

本明細書で使用する場合、用語「予防（する）」は、疾患、障害又は状態が、その疾患のリスクがある可能性があるがその疾患を有するとはまだ診断されていない対象において発生することを防ぐことを指す。

【0476】

本明細書で使用する場合、用語「対象」又は「必要とする対象」は、病態を患っている、哺乳動物、好ましくはヒトを含めた任意の年齢又は性別の動物を含む。好ましくは、この用語は、病態を発生するリスクがある個体を包含する。

【0477】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において感染症を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記感染症を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記感染症の発症又は進行と関連する方法が提供される。

【0478】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において感染症を処置することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡは、感染症の発症又は進行と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0479】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において感染症を処置することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡは感染症の発症又は進行と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0480】

用語「感染症」は、本明細書で使用する場合、慢性感染症、亜急性感染症、急性感染症、ウイルス性疾患、細菌性疾患、原虫性疾患、寄生虫疾患、真菌性疾患、マイコプラズマ疾患及びプリオン病のいずれかを指す。

【0481】

一実施形態によれば、対象において感染症を処置するために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、感染症の発症又は進行と関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0482】

一実施形態によれば、上記目的の標的ＲＮＡは、病原体（例えば、ウイルス、細菌、真菌等）に対する耐性を付与する真核細胞の遺伝子の産物を含む。例示的な遺伝子としては、ＣｙＰＡ−（サイクロフィリン（ＣｙＰ））、サイクロフィリンＡ（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染についての）、ＣＤ８１、スカベンジャー受容体クラスＢ Ｉ型（ＳＲ−ＢＩ）、ユビキチン特異的ペプチダーゼ１８（ＵＳＰ１８）、ホスファチジルイノシトール４−キナーゼＩＩＩアルファ（ＰＩ４Ｋ−ＩＩＩα）（例えば、ＨＳＶ感染について）及びＣＣＲ５−（例えば、ＨＩＶ感染について）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、上記病原体の遺伝子の産物を含む。

【0483】

一実施形態によれば、ウイルスは、アルボウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルスインディアナ株−ＶＳＶ）である。一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、ＶＳＶ遺伝子の産物、例えばＧタンパク質（Ｇ）、Ｌタンパク質（巨大タンパク質）（Ｌ）、リン酸化タンパク質、マトリクスタンパク質（Ｍ）又は核タンパク質を含む。

【0484】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡとしては、ｇａｇ及び／又はｖｉｆ遺伝子（すなわち、ＨＩＶ−１における保存配列）；Ｐタンパク質（すなわち、ＲＳＶにおけるウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの必須のサブユニット）；Ｐ ｍＲＮＡ（すなわちＰＩＶにおける）；コア（ｃｏｒｅ）、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５Ｂ（すなわちＨＣＶにおける）；ＶＡＭＰ関連タンパク質（ｈＶＡＰ−Ａ）、Ｌａ抗原及びポリピリミジントラクト結合タンパク質（ＰＴＢ）（すなわちＨＣＶについて）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0485】

特定の実施形態によれば、上記生物がヒトである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、マラリアを引き起こす病原体の遺伝子；ＨＩＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００１８０２．１に記載）；ＨＣＶウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００４１０２．１に記載）；及び寄生虫の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＸＭ＿００３３７１６０４．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0486】

特定の実施形態によれば、上記生物がヒトである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、癌性疾患に関連する遺伝子（例えば、ｂｃｒ／ａｂｌ ｅ８ａ２融合タンパク質についてのホモサピエンスｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＢ０６９６９３．１に記載）又は骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）及び血管疾患に関連する遺伝子（例えば、ヒトヘパリン結合性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｍ３２９７７．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0487】

特定の実施形態によれば、上記生物がウシである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、ウシ感染性鼻気管炎ウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＪ００４８０１．１に記載）、例えばＢＲＤ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ウシ呼吸器病症候群）を引き起こすウシヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ１）；ブルータング病（ＢＴＶウイルス）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＫＰ８２１１７０．１に記載）；ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００１４６１．１に記載）；例えば口蹄疫を引き起こすピコルナウイルスの遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００４００４．１に記載）；例えばＢＲＤを引き起こすパラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ３）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿０２８３６２．１に記載）；例えばウシ型結核（ｂＴＢ）を引き起こすマイコバクテリウム・ボビス（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿０３７３４３．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0488】

特定の実施形態によれば、上記生物がヒツジである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、条虫症を引き起こす病原体（単包条虫ライフサイクル、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、テニア・オウィス（Ｔａｅｎｉａ ｏｖｉｓ）、テニア・ヒダチゲナ（Ｔａｅｎｉａ ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、モニエジア属（Ｍｏｎｉｅｚｉａ）の種）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＪ０１２６６３．１に記載）；扁形動物病を引き起こす病原体（肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、ファスキオロイデス・マグナ（Ｆａｓｃｉｏｌｏｉｄｅｓ ｍａｇｎａ）、槍形吸虫（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、ボビス住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｂｏｖｉｓ））の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ６４４４５９．１に記載）；ブルータング病を引き起こす病原体の遺伝子（ＢＴＶウイルス、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＫＰ８２１１７０．１に記載）；及び回虫症を引き起こす病原体（「ｈｏｏｓｅ」としても知られる寄生性気管支炎、エレオフォラ・シュネイデリ（Ｅｌａｅｏｐｈｏｒａ ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）、捻転胃虫（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、毛様線虫（トリコストロンギルス属、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）の種、テラドルサギア・サーカムシンクタ（Ｔｅｌａｄｏｒｓａｇｉａ ｃｉｒｃｕｍｃｉｎｃｔａ）、クーペリア属（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）の種、ネマトジルス属（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）の種、ジクチオカウルス・フィラリア（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｆｉｌａｒｉａ）、プロトストロンギルス・ルフェセンス（Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｒｅｆｅｓｃｅｎｓ）、ムエルレリウス・カピラリス（Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）、腸結節虫（エソファゴストム属、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）の種、ネオストロンギルス・リネアリス（Ｎｅｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）、大口腸線虫（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ ｏｖｉｎａ）、ヒツジ鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｏｖｉｓ））の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００３２８３．１１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0489】

特定の実施形態によれば、上記生物がブタである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）の遺伝子（例えば、アフリカブタ熱を引き起こす）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００１６５９．２に記載）；ブタコレレラウイルス（例えば、ブタコレラを引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００２６５７．１に記載）；及びピコルナウイルス（例えば、口蹄疫を引き起こす）の遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿００４００４．１に記載）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0490】

特定の実施形態によれば、上記生物がニワトリである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、トリインフル（若しくはトリインフルエンザ）の遺伝子、トリパラミクソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）（例えば、ニューカッスル病を引き起こす）のバリアントの遺伝子、又はマレック病を引き起こす病原体の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0491】

特定の実施形態によれば、上記生物がカブトエビである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、ホワイトスポット病ウイルス（ＷＳＳＶ）の遺伝子、イエローヘッドウイルス（ＹＨＶ）の遺伝子、又はタウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0492】

特定の実施形態によれば、上記生物がサケである場合、目的の標的ＲＮＡとしては、伝染性サケ貧血（ＩＳＡ）の遺伝子、伝染性造血器壊死症（ＩＨＮ）の遺伝子、ウミジラミ（Ｓｅａ ｌｉｃｅ）（例えば、レペオフテイルス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属及びカリグス（Ｃａｌｉｇｕｓ）属の外寄生の橈脚類）の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0493】

目的のＲＮＡ（例えば、病原体の遺伝子）を標的とするように改変され得る例示的な内在非コードＲＮＡ分子、内在非コードＲＮＡ分子を改変するために使用され得る例示的なｇＲＮＡ（すなわち、ＤＮＡ編集剤）配列、及び目的の標的ＲＮＡに対する内在非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性をリダイレクトするための例示的なヌクレオチド配列は、以下の表１Ｂに提供される。

【0494】

【表1(1)】

【0495】

【表1(2)】

【0496】

【表1(3)】

【0497】

【表1(4)】

【0498】

【表1(5)】

【0499】

【表1(6)】

【0500】

【表1(7)】

【0501】

【表1(8)】

【0502】

【表1(9)】

【0503】

【表1(10)】

【0504】

処置の有効性を評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば対象の身体的健康状態を評価することにより、血液検査により、ウイルス負荷／細菌負荷を評価することにより、等で実施されてもよい。

【0505】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記単一遺伝子劣性遺伝疾患と関連する方法が提供される。

【0506】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡは単一遺伝子劣性遺伝疾患に関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0507】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡは単一遺伝子劣性遺伝疾患に関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0508】

本明細書で使用する場合、用語「単一遺伝子劣性遺伝疾患」は、常染色体上の単独の欠損遺伝子の結果として引き起こされる疾患又は状態を指す。

【0509】

一実施形態によれば、単一遺伝子劣性遺伝疾患は、自然突然変異又は遺伝性の突然変異の結果である。

【0510】

一実施形態によれば、単一遺伝子劣性遺伝疾患は、常染色体優性遺伝性、常染色体劣性遺伝性又は伴性劣性遺伝性である。

【0511】

例示的な単一遺伝子劣性遺伝疾患としては、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、血友病、酵素欠損症、パーキンソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ハンター病、アイカルディ症候群、クラインフェルター症候群、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0512】

一実施形態によれば、対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置するために、非コードＲＮＡ分子（例えばＲＮＡサイレンシング分子）は、単一遺伝子劣性遺伝疾患と関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0513】

一実施形態によれば、障害がパーキンソン病である場合、目的の標的ＲＮＡは、ＳＮＣＡ（ＰＡＲＫ１＝４）、ＬＲＲＫ２（ＰＡＲＫ８）、Ｐａｒｋｉｎ（ＰＡＲＫ２）、ＰＩＮＫ１（ＰＡＲＫ６）、ＤＪ−１（ＰＡＲＫ７）、又はＡＴＰ１３Ａ２（ＰＡＲＫ９）遺伝子の産物を含む。

【0514】

一実施形態によれば、障害が血友病又はフォン・ヴィレブランド病である場合、目的の標的ＲＮＡは、例えば、アンチトロンビン遺伝子、凝固因子ＶＩＩＩ遺伝子又は第ＩＸ因子遺伝子の産物を含む。

【0515】

処置の有効性を評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば血液検査によって、骨髄液によって対象の身体的健康状態を評価することによる等で実施されてもよい。

【0516】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記自己免疫疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記自己免疫疾患と関連する方法が提供される。

【0517】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において自己免疫疾患を処置することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡは自己免疫疾患と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0518】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において自己免疫疾患を処置することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡは自己免疫疾患と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0519】

自己免疫疾患の非限定的な例としては、心血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経疾患、筋疾患、腎疾患、生殖に関連する疾患、結合織疾患（膠原病）及び全身性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0520】

自己免疫性心血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化症（Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ． １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ Ｏ． Ｌｕｐｕｓ． １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）、ウェゲナー肉芽腫症、高安動脈炎、川崎病（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ Ｋｌｉｎ Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ ２０００年８月２５日；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、微量免疫型巣状壊死性半月体形成性糸球体腎炎（ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ ｆｏｃａｌ ｎｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｅｓｃｅｎｔｉｃ ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）（Ｎｏｅｌ ＬＨ． Ａｎｎ Ｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）． ２０００年５月；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質抗体症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ Ｒ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導性心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ Ｇ．ら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ． １９９９年６月１７日；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ Ｆ． Ａｎｎ Ｉｔａｌ Ｍｅｄ Ｉｎｔ． １９９９年４〜６月；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ １９９６年５月１５日；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ １９９８年１月；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ Ｓ．ら、Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９７年３月；７４（３）：１３９）、シャーガス病における心臓自己免疫（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ Ｅ．ら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９６年１０月１５日；９８（８）：１７０９）及び抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；１１（１）：９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0521】

自己免疫性リウマチ様疾患の例としては、関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ ２０００年７月；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＨＯ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ ＳＡ １９９４年１月１８日；９１（２）：４３７）及び強直性脊椎炎（Ｊａｎ Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0522】

自己免疫性腺疾患の例としては、膵疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーブス病、甲状腺炎、自然発症自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣自己免疫、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎及び多腺性自己免疫症候群Ｉ型が挙げられるが、これらに限定されない。疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、１型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ Ｌ．及びＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ Ｐ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ １９９６年１０月；３４ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ Ｊ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ ２０００年６月；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ Ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １９９３年３月；９２（１）：７７）、自然発症自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ Ｈ．及びＹｕ Ｓ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００年１２月１５日；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ １９９９年８月；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ Ｔ． Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ． １９９９年８月；５７（８）：１７５９）、卵巣自己免疫（Ｇａｒｚａ ＫＭ．ら、Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８年２月；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ ＡＢ．ら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｐｒｏｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０００年３月；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９７年１２月；５０（６）：８９３）及び多腺性自己免疫症候群Ｉ型（Ｈａｒａ Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ． １９９１年３月１日；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0523】

自己免疫性胃腸疾患の例としては、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ Ｈｅｒｏｌａ Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ． ２０００年１月；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ ＹＥ．及びＳｈｏｅｎｆｅｌｄ Ｙ． Ｈａｒｅｆｕａｈ ２０００年１月１６日；１３８（２）：１２２）、大腸炎（結腸炎）、回腸炎及びクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。

【0524】

自己免疫性皮膚疾患の例としては、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡及び落葉状天疱瘡等（これらに限定されない）の自己免疫性水疱性皮膚症が挙げられるが、これらに限定されない。

【0525】

自己免疫性肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ Ａ．ら、Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １９９０年３月；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ ＤＥ． Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ） １９９６年１１月；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ ＣＰ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ． １９９９年６月；１１（６）：５９５）及び自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ ＭＰ． Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ ２０００年８月；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0526】

自己免疫性神経疾患の例としては、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ ＡＨ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２００１年１月１日；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ Ｌ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ Ｓｕｐｐｌ． １９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ ＡＪ．及びＫｒａｉｇ Ｅ、Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９；１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ Ｍ．ら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９０年１２月；２０（１２）：２５６３）、ニューロパチー、運動性ニューロパチー（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ＡＪ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０００年５月；７（３）：１９１）；ギラン−バレー症候群及び自己免疫性ニューロパチー（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ Ｓ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ． ２０００年４月；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバート−イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ Ｍ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ． ２０００年４月；３１９（４）：２０４）；傍腫瘍性神経症候群、小脳萎縮症、傍腫瘍性小脳萎縮症及び全身硬直症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ｕｎｉｔｓ ＳＡ ２００１年３月２７日；９８（７）：３９８８）；非傍腫瘍性全身硬直症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側策硬化症、シデナム舞踏病（Ｓｙｄｅｈａｍ ｃｈｏｒｅａ）、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群及び自己免疫性多腺性内分泌不全症（Ａｎｔｏｉｎｅ ＪＣ．及びＨｏｎｎｏｒａｔ Ｊ． Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ） ２０００年１月；１５６（１）：２３）；免疫不全ニューロパシー（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｕｐｐｌ １９９９；５０：４１９）；後天性神経性筋強直症、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． １９９８年５月１３日；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ．ら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９９４年５月；５７（５）：５４４）及び神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。

【0527】

自己免疫性筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎及び原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ Ｅ．ら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０００年９月；１２３（１）：９２）及び平滑筋自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ １９９９年６月；５３（５−６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0528】

自己免疫性腎疾患の例としては、腎炎及び自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ ＣＪ． Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９９０年８月；１（２）：１４０）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0529】

生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、習慣性流産（Ｔｉｎｃａｎｉ Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ １９９８；７ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ１０７−９）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0530】

自己免疫性結合織疾患の例としては、耳疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９４年８月；１５７（１）：２４９）及び内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ Ｂ．ら、Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １９９７年１２月２９日；８３０：２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0531】

自己免疫性全身性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ １９９８；１７（１−２）：４９）及び全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９９年３月；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １９９９年６月；１６９：１０７）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0532】

一実施形態によれば、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む。

【0533】

一実施形態によれば、対象において自己免疫疾患を処置するために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、自己免疫疾患と関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0534】

一実施形態によれば、上記疾患が狼瘡である場合、目的の標的ＲＮＡは、Ｂ細胞によって病理学的に産生される抗核抗体（ＡＮＡ）等の抗核抗体（ＡＮＡ）を含む。

【0535】

処置の有効性を評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば血液検査によって、骨髄液によって対象の身体的健康状態を評価することによる等で実施されてもよい。

【0536】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において癌性疾患を処置する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において上記癌性疾患を処置する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記癌性疾患と関連する方法が提供される。

【0537】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において癌性疾患を処置することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡは癌性疾患に関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0538】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において癌性疾患を処置することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡは癌性疾患に関連するＤＮＡ編集剤が提供される。
本発明のいくつかの実施形態の方法に従って処置することができる癌の非限定的な例は、任意の固形癌若しくは非固形癌及び／若しくは癌転移又は前癌であってよく、その例としては、消化管の腫瘍（結腸細胞腫、直腸細胞腫、結腸直腸細胞腫、結腸直腸癌、結腸直腸腺腫、遺伝性非ポリポーシス１型、遺伝性非ポリポーシス２型、遺伝性非ポリポーシス３型、遺伝性非ポリポーシス６型；結腸直腸癌、遺伝性非ポリポーシス７型、小腸及び／又は大腸の細胞腫、食道細胞腫、食道癌を伴う胼胝、胃細胞腫、膵細胞腫、膵内分泌腫瘍）、子宮内膜細胞腫、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢細胞種、胆道腫瘍、前立腺癌、前立腺腺癌、腎癌（例えば、ウィルムス腫瘍２型又は１型）、肝癌（例えば、肝芽腫、肝細胞腫、肝細胞癌）、膀胱癌、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞性腫瘍、栄養膜腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣の未熟奇形腫、子宮腫瘍、卵巣上皮腫瘍、仙尾骨腫瘍、絨毛癌、胎盤部トロホブラスト腫瘍、成人上皮性腫瘍（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｄｕｌｔ ｔｕｍｏｒ）、卵巣細胞癌、漿液性卵巣癌、卵巣性索腫瘍、子宮頸癌、子宮頸部細胞腫、小細胞及び非小細胞肺癌、上咽頭細胞種、乳細胞癌（例えば、乳管癌、浸潤性乳管内癌、散発性；乳癌、乳癌への易罹患性、４型乳癌、乳癌−１、乳癌−３；乳癌卵巣癌）、扁平上皮癌（例えば、頭頸部における）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫）、神経膠腫、腺癌、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌、脳腫瘍、種々の他の細胞腫（例えば、気管支原性大細胞癌、腺管癌、エーリッヒ・レトレ（Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｒｅ）腹水癌、類表皮癌、大細胞癌、ルイス肺癌、髄様癌、粘表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘細胞癌、有棘細胞癌、移行上皮癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、上衣芽腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド白血病、リンパ芽球性白血病）、線維肉腫、巨細胞腫、グリア細胞腫瘍、神経膠芽腫（例えば、多形神経膠芽腫、星状細胞腫）、神経膠腫肝細胞腫、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞）、副腎腫（グラヴィッツ腫瘍）、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化腫、平滑筋芽腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性ｐｒｅ−Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球、単球性、急性骨髄性、急性骨髄性、好酸球増加症を伴う急性骨髄性、Ｂ細胞、好塩基球性、慢性骨髄性、慢性、Ｂ細胞、好酸球性、フレンド、顆粒球性又は骨髄球性、ヘアリー細胞、リンパ球性、巨核芽球性、単球性、単球性マクロファージ、骨髄芽球性、骨髄性、骨髄単球性、形質細胞性、ｐｒｅ−Ｂ細胞、前骨髄球性、亜急性、Ｔ細胞、リンパ系腫瘍、骨髄性悪性腫瘍素因、急性非リンパ球性白血病）、リンパ肉腫、黒色腫、乳房腫瘍、マスト細胞腫、髄芽腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽腫、神経組織グリア細胞腫瘍、神経組織神経細胞腫瘍、神経鞘腫、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、骨軟骨腫、オステオミエローマ（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨肉腫（例えば、ユーイング骨肉腫）、乳頭腫、移行細胞、褐色細胞腫、下垂体腫瘍（浸潤性）、形質細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞、イエンセン肉腫、骨原性肉腫、細網肉腫）、シュワン腫、皮下腫瘍、奇形癌腫（例えば、多能性）、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫及び毛包上皮腫、胃癌、線維肉腫、多形神経膠芽腫；多発性グロムス腫瘍、リー・フラウメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ癌（ｌｙｎｃｈ ｃａｎｃｅｒ）ファミリー症候群ＩＩ型、雄性生殖細胞腫瘍、マスト細胞白血病、延髄甲状腺、多発性髄膜腫、内分泌腫瘍粘液肉腫、傍神経節腫、家族性非クロム親和性、毛母腫、乳頭腫瘍、家族性及び散発性、ラブドイド腫瘍素因症候群、家族性、ラブドイド腫瘍、軟部肉腫、及び神経膠芽腫を伴うターコット症候群が挙げられるが、これらに限定されない。

【0539】

一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって処置することができる癌は、血液悪性腫瘍を含む。例示的な血液悪性腫瘍は、異なる他の染色体へのＡＢＬチロシンキナーゼの悪性の融合を伴うものを含み、この悪性の融合によってＢＣＲ−ＡＢＬと呼ばれるものが生成され、これが次に悪性の融合タンパク質を生じる。従って、ｍＲＮＡ中の融合点を標的とすることは、融合ｍＲＮＡのみを下方制御のためにサイレンシングする可能性があり、一方で、細胞にとって必須の正常なタンパク質はそのままにされることになる。

【0540】

一実施形態によれば、対象において癌性疾患を処置するために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、癌性疾患と関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0541】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、癌遺伝子（例えば、変異癌遺伝子）の産物を含む。

【0542】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、腫瘍抑制因子の機能を修復する。

【0543】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、ＲＡＳ、ＭＣＬ−１又はＭＹＣ遺伝子の産物を含む。

【0544】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、アポトーシス関連遺伝子のＢＣＬ−２ファミリーの産物を含む。

【0545】

例示的な標的遺伝子としては、ドミナントネガティブな変異体ＴＰ５３、Ｂｃｌ−ｘ、ＩＡＰｓ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３及びＳＭＳ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0546】

一実施形態によれば、癌が黒色腫である場合、目的の標的ＲＮＡはＢＲＡＦを含む。例えばＶ６００Ｅ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｇ、及びＶ６００Ｒを含むＢＲＡＦ変異のいくつかの形態が本明細書で企図される。

【0547】

一実施形態によれば、当該方法は、白血球等の健常な免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）が、悪性細胞（例えば、血液悪性腫瘍の細胞）を（直接的又は間接的に）死滅させることができるように、それらの免疫細胞の中の非コードＲＮＡ分子を、目的の標的ＲＮＡへ標的とすることにより行われる。

【0548】

一実施形態によれば、当該方法は、癌が未変性の免疫系によって認識され根絶されることができるように、癌因子によって操作されるタンパク質（すなわち目的の標的ＲＮＡ）をサイレンシングするように（すなわち、免疫応答が悪性腫瘍を認識するのを抑制するために）非コードＲＮＡ分子を標的化することにより行われる。

【0549】

処置の有効性を評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えばＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、血液検査、超音波、ｘ線によって腫瘍成長又は新生物若しくは転移の数を評価することによる等で実施されてもよい。

【0550】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する工程を含み、目的の標的ＲＮＡは上記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増強と関連する方法が提供される。

【0551】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増大することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡは、上記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増大と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0552】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増大することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡは、上記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増大と関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0553】

本明細書で使用する場合、用語「化学療法剤」は、新生物若しくは転移の成長を低下、予防、軽減、限定及び／若しくは遅延するか、若しくは新生物の壊死若しくはアポトーシス、若しくは任意の他の機構により新生物細胞を直接死滅させる薬剤、又は新生物疾患（例えば、癌）を有する対象において新生物又は転移の成長を低下、予防、軽減、限定及び／若しくは遅延するために、別の方法で医薬的有効量で使用することができる薬剤を指す。

【0554】

化学療法剤としては、フルオロピリミジン；ピリミジンヌクレオシド；プリンヌクレオシド；葉酸代謝拮抗薬、白金製剤；アントラサイクリン／アントラセンジオン；エピポドフィロトキシン；カンプトテシン（例えば、カレニテシン）；ホルモン；ホルモン複合体；抗ホルモン薬；酵素，タンパク質、ペプチド並びにポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体；免疫薬；ビンカアルカロイド；タキサン類；エポチロン；抗微小管薬（チューブリン重合阻害剤）；アルキル化剤；代謝拮抗物質；トポイソメラーゼ阻害剤；抗ウイルス薬；並びに種々の他の細胞毒性薬及び細胞分裂抑制剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0555】

特定の実施形態によれば、化学療法剤としては、アバレリックス、アルデスロイキン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダルベポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシンリポソーム、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトクス、デクスラゾキサン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロモスタノロンプロピオン酸エステル、エリオットのＢ溶液（Ｅｌｌｉｏｔｔ’ｓ Ｂ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル５−ＦＵ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン酢酸塩、ヒストレリン酢酸塩、ヒドロキシ尿素、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブメシル酸塩、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド酢酸塩、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、ナイトロジェンマスタード、メゲストロール酢酸塩、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン６−ＭＰ、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロンフェンプロピオン酸エステル、ネララビン、ノフェツモマブ（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オプレルベキン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロン酸、ペガデマーゼ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセドジナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシンミスラマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブマレイン酸塩、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシドＶＭ−２６、テストラクトン、チオグアニン６−ＴＧ、チオテパ、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノインＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾレドロン酸塩及びゾレドロン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0556】

一実施形態によれば、上記化学療法剤の効果は、目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／又は特異性を付与するように設計されているＤＮＡ編集剤によって処置されていない対象における化学療法剤の効果と比べて、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％増強される。

【0557】

化学療法剤の有効性及び／又は特異性を評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えばＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ−ＣＴ、血液検査、超音波、ｘ線等によって腫瘍成長又は新生物若しくは転移の数を評価することによる等で実施されてもよい。

【0558】

一実施形態によれば、当該方法は、白血球等の健常な免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）が、化学療法に対する癌の耐性を低下させることができるように、それらの免疫細胞の中の非コードＲＮＡ分子を、目的の標的ＲＮＡへ標的とすることにより行われる。

【0559】

一実施形態によれば、当該方法は、白血球等の健常な免疫細胞、例えばＴ細胞、Ｂ細胞又はＮＫ細胞（例えば、患者由来又は細胞ドナー由来の）が化学療法に耐性であるように、それらの免疫細胞の中の非コードＲＮＡ分子を、目的の標的ＲＮＡへ標的とすることより行われる。

【0560】

一実施形態によれば、対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強するために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、化学療法剤の有効性及び／又は特異性の抑制と関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0561】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、薬物代謝酵素遺伝子（例えば、チトクロムＰ４５０［ＣＹＰ］２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェラーゼ［ＵＧＴ］１Ａ１、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ［ＳＵＬＴ］１Ａ１、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ［ＮＡＴ］、チオプリンメチルトランスフェラーゼ［ＴＰＭＴ］）及び薬物輸送体（Ｐ−糖タンパク質［多剤耐性１］、多剤耐性タンパク質２［ＭＲＰ２］、乳癌耐性タンパク質［ＢＣＲＰ］）の産物を含む。

【0562】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、抗アポトーシス遺伝子を含む。例示的な標的遺伝子としては、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバー、例えばＢｃｌ−ｘ、ＩＡＰｓ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３及びＳＭＳ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0563】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導する方法であって、本発明のいくつかの実施形態の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって上記対象において細胞アポトーシスを誘導する工程を含み、目的の標的ＲＮＡはアポトーシスと関連する方法が提供される。

【0564】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導することにおいて使用するための、目的の標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤であって、上記目的の標的ＲＮＡはアポトーシスと関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0565】

本発明の一態様によれば、必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導することにおいて使用するための、標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、上記標的ＲＮＡ及び上記第２の標的ＲＮＡは異なり、上記第２の標的ＲＮＡはアポトーシスと関連するＤＮＡ編集剤が提供される。

【0566】

用語「細胞アポトーシス」は、本明細書で使用する場合、プログラム細胞死の細胞プロセスを指す。アポトーシスは、細胞質及び核の明確な構造的変化、規則的な間隔の部位でのクロマチン開裂、及びヌクレオソーム間の部位でのゲノムＤＮＡのヌクレオチド鎖切断を特徴とする。これらの変化は、小疱形成、細胞収縮、核の断片化、クロマチン凝縮、及び染色体ＤＮＡ断片化を含む。

【0567】

一実施形態によれば、細胞アポトーシスは、目的の標的ＲＮＡに対する非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング活性及び／又は特異性を付与するＤＮＡ編集剤によって処置されていない対象における細胞アポトーシスと比べて、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％増強される。

【0568】

細胞アポトーシスを評価することは、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば細胞増殖アッセイ、ＦＡＣＳ分析等を使用して実施されてもよい。

【0569】

一実施形態によれば、対象において細胞アポトーシスを誘導するために、非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）は、アポトーシスと関連する目的のＲＮＡを標的とするように設計される。

【0570】

一実施形態によれば、上記目的の標的ＲＮＡは、アポトーシス関連遺伝子のＢＣＬ−２ファミリーの産物を含む。

【0571】

一実施形態によれば、目的の標的ＲＮＡは、抗アポトーシス遺伝子を含む。例示的な遺伝子としては、ドミナントネガティブな変異体ＴＰ５３、Ｂｃｌ−ｘ、ＩＡＰｓ、Ｆｌｉｐ、Ｆａｉｍ３及びＳＭＳ１が挙げられるが、これらに限定されない。

【0572】

本発明の一態様によれば、真核性非ヒト生物を生成する方法であって、ただし上記生物は植物ではなく、上記真核性非ヒト生物の細胞の少なくともいくつかは、目的の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる改変遺伝子を含み、当該方法は、真核性非ヒト生物の少なくとも１つの細胞に、目的の標的ＲＮＡに対する上記非コードＲＮＡ分子（例えば、ＲＮＡサイレンシング分子）のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を導入する工程を含む方法が提供される。

【0573】

以下の情報が利用可能であるべきである：ａ）遺伝子編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）によってサイレンシングされる標的配列（「標的」）；ｂ）ＧＥｉＧＳ（すなわち、改変非コードＲＮＡ）が遍在的に（例えば、構成的に）又は特異的に発現される（例えば、特定の組織、発生段階、ストレス、加熱／冷ショックなどに特異的な発現）かどうかを選択すること。

【0574】

入力基準に適合する関連ｍｉＲＮＡのみをフィルタリング（すなわち、選択）するために、この情報を公的に利用可能なｍｉＲＮＡデータセット（例えば、小分子ＲＮＡ配列決定、ゲノム配列、マイクロアレイなど）に提出すること：上記の要件に従って発現されるｍｉＲＮＡ。

【0575】

公的に入手可能なツールを用いて、効力ある標的特異的ｓｉＲＮＡ配列の一覧を作製することができる。ｍｉＲＮＡは効力あるｓｉＲＮＡ配列に対してアラインメントされ、最も相同なｍｉＲＮＡが選択され得る。フィルタリングを受けたｍｉＲＮＡは、効力あるｓｉＲＮＡと同様に、同じ方向に類似の配列を有し得る。

【0576】

標的特異的な効力あるｓｉＲＮＡと高い相同性を有するとスコア付けされた自然成熟ｍｉＲＮＡ配列を、標的の配列と完全に一致させるように改変する。この改変は、標的相同性が最も高い１つの成熟ｍｉＲＮＡ鎖で起こる可能性がある（例えば、元のｍｉＲＮＡガイド又はパッセンジャー鎖のいずれかであり得る）。標的に対するこのような１００％相補性は、潜在的に、ｍｉＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡに変えることができる。

【0577】

最小のＧＥは、標的に対する天然の高い相同性（逆相補性）を有するｍｉＲＮＡ配列をフィルタリングすることによって達成され得る。

【0578】

一次改変ｍｉＲＮＡ遺伝子を用いて、改変ｍｉＲＮＡ前駆体配列（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）に隣接するゲノムＤＮＡ配列に基づいて、ｓｓＤＮＡオリゴ（例えば、２００〜５００ｎｔのｓｓＤＮＡ長さ）及びｄｓＤＮＡフラグメント（例えば、２５０〜５０００ｎｔのｄｓＤＮＡフラグメントのみ又はプラスミド内でクローニングされたｄｓＤＮＡフラグメント）を生成すること。改変されたｍｉＲＮＡのガイド鎖（サイレンシング鎖）配列は、標的に対して１００％相補的であるように設計され得る。

【0579】

同じ塩基対形成プロファイルを保つことにより、元の（改変されていない）ｍｉＲＮＡ前駆体及び成熟構造を保存するために、他のｍｉＲＮＡ遺伝子領域の配列を改変する。

【0580】

元の未改変ｍｉＲＮＡ遺伝子（ゲノムｍｉＲＮＡ遺伝子座に特異的）を特異的に標的とし、改変版（すなわちオリゴ／フラグメント配列）を標的としないようにｓｇＲＮＡを設計する。

【0581】

改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との比較制限酵素部位を解析し、異なる制限部位をまとめる。このような検出システムは、制限酵素消化及びゲル電気泳動に先行するＰＣＲに基づく。

【0582】

上記で詳細に論じたように検証する。

【0583】

内在非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）が、標的との天然の高い相同性（例えば、６０〜９０％）を含む場合に、インシリコ方法を用いて、他の標的に向けた非コードＲＮＡの標的化（例えば、「オフターゲット効果」）を調べることで、目的の標的の特異的なサイレンシングを得るようにする。

【0584】

内在非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を最小限に改変して、目的の標的をサイレンシングするその効力を高める。

【0585】

最小限に編集された一次ｍｉＲＮＡ遺伝子のＧＥｉＧＳ結果を検証し、候補の改良された最小限に編集されたｍｉＲＮＡを生成する。実験的に有効な一次ＧＥｉＧＳ結果（一次の最小編集ｍｉＲＮＡ遺伝子）は、標的に１００％適合するように改変されたガイド鎖又はパッセンジャー鎖を有するｍｉＲＮＡと考えられる。

【0586】

（図９に示すように）元の配列に徐々に戻るいくつかのガイド鎖配列又はパッセンジャー鎖配列を生成する。

【0587】

７つのシードヌクレオチド（５’末端からヌクレオチド２〜８）のうち少なくとも５つの一致があるようにシード配列を保持する。

【0588】

標的サイレンシング効率のための種々の候補「改良された最小限に編集されたｍｉＲＮＡ遺伝子」を試験する。最小限のｍｉＲＮＡ配列改変で最も高いサイレンシングをもたらす遺伝子ＧＥ媒介ノックインを選択する。

【0589】

改良された最小限に編集されたｍｉＲＮＡ候補の潜在的「オフターゲット効果」を試験する。「オフターゲット効果」の有意な予測は、改良された最小限に編集されたｍｉＲＮＡ遺伝子の最終評価に影響を及ぼす。

【0590】

実験的検証に基づいて、あまり改良されていない最小限に編集されたｍｉＲＮＡ遺伝子候補を試験する。

【0591】

本明細書で使用される「約」という用語は、±１０％を指す。

【0592】

用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、及びそれらの複合語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（含むが、これに限定されない）」を意味する。

【0593】

「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ（を含み、かつ、限定される）」を意味する。

【0594】

「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」という用語は、組成物、方法又は構造が、追加の成分、工程及び／又は部品を含んでもよいが、その追加の成分、工程及び／又は部品が、請求項に係る組成物、方法又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。

【0595】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の参照対照を含む。例えば、「化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物及びそれらの混合物を含むことができる。

【0596】

本出願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、その範囲内のすべての可能な部分範囲並びに個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６などを具体的に開示したと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0597】

本明細書中で数値範囲が示されている場合にはいつでも、その数値範囲は、示された範囲内のあらゆる引用された数値（分数又は整数）を含むことが意図されている。句、第１の示された数と第２の示された数との間「にわたる／の範囲」、及び第１の示された数から第２の示された数まで（第１の示された数〜第２の示された数）「にわたる／の範囲」は、本明細書中で互換的に使用され、その第１及び第２の示された数並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことが意図されている。

【0598】

本明細書で使用する場合、用語「方法」は、与えられた課題を成し遂げるためのやり方、手段、技法及び手順を指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に公知であるか、又は化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者によって公知のやり方、手段、技法及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技法及び手順が含まれるが、これらに限定されない。

【0599】

明確性のために、別個の実施形態に関して記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴が、別個に若しくはいずれかの好適なサブコンビネーションにおいて、又は適宜本発明のいずれかの他の記載された実施形態において提供されてもよい。種々の実施形態に関して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能である場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。

【0600】

本明細書中でこれまで記載された及び添付の特許請求の範囲でクレームされる本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的にサポートされる。

【0601】

本願に開示されるあらゆる配列番号は、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマット又はＲＮＡ配列フォーマットでのみ表されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができるということは理解される。例えば、配列番号１〜配列番号４はＤＮＡ配列フォーマットで表される（例えば、チミンについてＴと書かれている）が、それは、ｇＲＮＡ核酸配列に対応するＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の現実の種類に応じて、ＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルについてＵと書かれている）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、又は示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、いずれかの置換を有して開示された配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。

【実施例】

【0602】

ここで、以下の実施例を参照するが、これらは、上記の説明と共に、本発明を非限定的な様式で例示する。

【0603】

一般に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用する実験室手順は、分子技法、生化学的技法、微生物学的技法及び組換えＤＮＡ技法を含む。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば下記を参照。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州（Ｍａｒｙｌａｎｄ）（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書及び米国特許第５，２７２，０５７号明細書に示される方法論；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許文献及び科学文献に詳細に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特許第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書及び米国特許第５，２８１，５２１号明細書を参照；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらのすべては、参照により、本明細書中にすべて示されているが如く援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書全体にわたって提供されている。これらの文献の中にある手順は当該技術分野で周知であると考えられるが、読者の便宜のために提供されている。上記文献に含まれるすべての情報は、参照により本明細書に援用される。

【0604】

一般的な材料と実験手順
細胞培養
組織培養を、ヒト細胞株で、又はマウス胚性幹細胞において実施する。ヒト骨肉腫上皮細胞（Ｕ２ＯＳ）、ヒト網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ１）、ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞（Ａ５４９）、子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）又はヒト結腸直腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を、必要に応じて必須栄養素（アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル）、成長因子、ホルモンを添加した組織培養培地中で培養する。この細胞を、適切な生理化学的な条件（ｐＨ緩衝液、浸透圧）下で制御された温度（３７℃）のＣＯ_２加湿培養器中で培養する。

【0605】

生存率アッセイ
化学感受性は、これまでに記載された［Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｃｅｌｌ（２００２） １０９：４５９−７２］クリスタルバイオレットアッセイによって決定する。細胞を、２×１０^４／ウェルで１２穴プレートに播種し、シスプラチン、カンプトテシン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、パクリタキセル（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ＡＺＤ２２８１（アクソンメディケム（Ａｘｏｎ Ｍｅｄｃｈｅｍ））又はＮｕｔｌｉｎ３（セレックケム（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ））を用いて示された用量で処理する。３日間のインキュベーション後、単層を、１０％酢酸を含有する１０％メタノールで固定する。接着細胞を、メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットで染色する。吸収された染料を、０．１％ＳＤＳを含有するメタノールで再溶解し、これを９６穴プレートに移し、マイクロプレートリーダーにおいて測光法で（５９５ｎｍ）測定する。細胞生存率は、吸光度を未処理の対照の吸光度に対して規格化することにより算出される。

【0606】

上記と同じ方法を６穴プレート以上の形式までスケールアップし、次いで形成コロニーを、クリスタルバイオレットを再溶解することなく計測し、この形式をクローン原性アッセイと呼ぶ。この形式は、処理された細胞がコロニーへと成長する能力に基づく。使用する別のアッセイは、代謝活性に基づく細胞生存率アッセイＸＴＴ又は任意の他の代謝生存率アッセイである。ＸＴＴは、代謝活性に基づいて細胞数の関数として細胞生存率を評価するために使用される比色分析である。この迅速な、高感度の、非放射性のアッセイは、標準的なマイクロプレート吸光度読み取り装置を使用して検出される。細胞を、９６穴プレートにおいて、試験される化合物を含む培地１００μＬ中で、１０^４〜１０^５細胞／ウェルの密度で成長させ、ＣＯ_２培養器の中で２４〜４８時間培養する。アッセイの前に毎回新しい緩衝液を調製する：リン酸緩衝生理食塩水中の１０ｍＭ ＰＭＳ溶液及び４ｍｇのＸＴＴを４ｍＬの３７℃細胞培養培地に溶解させる。上記ＰＭＳ溶液１０μＬを、細胞を標識する直前に４ｍＬのＸＴＴ溶液に加える。２５μＬのＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を、１００μＬ細胞培養液を含む各ウェルに直接加え、ＣＯ_２培養器中で、３７℃で２時間インキュベーションし、４５０ｎｍで吸光度測定を行う。

【0607】

小分子ＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの単離
ｍｉＲＮＡを含む小分子ＲＮＡを、ｍｉＲｖａｎａ ＲＮＡ単離キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）、テキサス州、米国）を製造業者のプロトコルに従って使用して単離する。ＲＮＡを、Ｑｕｂｉｔ又はＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、デラウェア州、米国）を使用して定量し、品質をＡｇｉｌｅｎｔ ６０００ナノチップ（アジレントテクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）、カリフォルニア州、米国）によって決定する。

【0608】

ｍｉＲＮＡ測定
定量的リアルタイムＰＣＲ分析を以下のとおりに実施する：ＲＮＡを逆転写し、製造業者のプロトコルに従ってｍｉＳｃｒｉｐｔ逆転写キット及びｍｉＳｃｒｉｐｔ ＳＹＢＲ ＰＣＲキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州，米国）を用い、ＡＢＩ ７５００リアルタイムＰＣＲシステムを使用してＰＣＲ増幅する。二重の反応物からの値を平均し、Ｕ６ ＳｎｏＲＮＡのレベルに規格化する。相対的発現レベルを、これまでに記載された［Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ及びＬｉｖａｋ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ（２００８） ３：１１０１−１１０８］比較Ｃｔ定量法（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ ｍｅｔｈｏｄ）に従って算出する。あるいは、ｍｉＲＮＡを検出し、小分子ＲＮＡ配列解析［ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｉｌｌｕｍｉｎａ（ｄｏｔ）ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｒｎａ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｓｍａｌｌ−ｒｎａ−ｓｅｑ（ｄｏｔ）ｈｔｍｌ又はＷａｋｅら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（２０１６） １７（１）：１に記載されている］を使用して相対的に定量する。

【0609】

ＧＥｉＧＳ鋳型を生成するための計算パイプライン
計算ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）パイプラインは、生物学的メタデータを適用し、非コードＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ遺伝子）を最小限に編集するために使用されるＧＥｉＧＳ ＤＮＡ鋳型の自動生成を可能にし、新しい機能獲得、すなわち目的の標的配列へのサイレンシング能力のリダイレクションをもたらす。

【0610】

図１に示されるように、パイプラインは、ａ）ＧＥｉＧＳによってサイレンシングされるべき標的配列；ｂ）遺伝子編集されるべき及びＧＥｉＧＳを発現するための宿主生物；ｃ）ＧＥｉＧＳが遍在的に発現されるか否かを選択し得ることを記入し、そして入力を提出することから開始する。特定のＧＥｉＧＳ発現が必要とされる場合、いくつかの選択肢（特定の組織、発生段階、ストレス、熱／低温ショックなどに特異的な発現）から選択することができる。

【0611】

すべての必要な入力が提出されると、計算プロセスは、ｍｉＲＮＡデータセット（例えば、小分子ＲＮＡ配列決定、マイクロアレイなど）の間での検索、及び入力基準に適合する関係ｍｉＲＮＡのみのフィルタリング（すなわち、保持すること）から始まる。次に、選択された成熟ｍｉＲＮＡ配列を標的配列に対して整列させ、最も高い相補的レベルを有するｍｉＲＮＡをフィルタリングする。次いで、これらの天然の標的相補的な成熟ｍｉＲＮＡ配列は、標的の配列に完全に一致するように改変される。次いで、改変された成熟ｍｉＲＮＡ配列を、ｓｉＲＮＡ効力を予測するアルゴリズムに通し、そして最高のサイレンシングスコアを有するトップ２０をフィルタリングする。次いで、これらの最終改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子を用いて、２００〜５００ｎｔのｓｓＤＮＡ又は２５０〜５０００ｎｔのｄｓＤＮＡ配列を以下のように生成する。

【0612】

２００〜５００ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴ及び２５０〜５０００ｎｔのｄｓＤＮＡフラグメントは、改変されたｍｉＲＮＡに隣接するゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、オリゴの中心に位置する。改変されたｍｉＲＮＡのガイド鎖（サイレンシング）配列は標的に対して１００％相補的である。しかし、改変されたパッセンジャーｍｉＲＮＡ鎖の配列は、元の（改変されていない）ｍｉＲＮＡ構造を保存するためにさらに改変され、同じ塩基対形成プロファイルを維持する。

【0613】

次に、改変交換バージョンではなく、元の未改変ｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的化するように、異なるｓｇＲＮＡを設計する。最後に、改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子との間で比較制限酵素部位解析を行い、制限部位の差異についてまとめる。

【0614】

従って、パイプライン出力は以下を含む。
ａ）最小限に改変されたｍｉＲＮＡを有する２００〜５００ｎｔ ｓｓＤＮＡオリゴ又は２５０〜５０００ｎｔのｄｓＤＮＡフラグメント配列
ｂ）改変されたものではなく元のｍｉＲＮＡ遺伝子を特異的に標的とする２〜３個の異なるｓｇＲＮＡ
ｃ）改変されたｍｉＲＮＡ遺伝子と元のｍｉＲＮＡ遺伝子の間の異なる制限酵素部位の一覧

【0615】

ＧＥｉＧＳ前駆体の選択
ダイサー基質であり、小分子サイレンシングＲＮＡにプロセシングされる非コードＲＮＡタイプの一覧を、Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ Ａ．ら［Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２０１４） １５９、１１５３、Ａｉ１１６７］でこれまでに公開された結果から手作業で整理した。この際、ＰＡＲ−ＣＬＩＰ技術を使用して、ダイサー並びにアルゴノート２及び３によって結合されたＲＮＡ分子を特定した。ダイサー基質をさらにフィルタリング処理して、コード遺伝子と重なる領域を排除し、曖昧なアノーテーション（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）を除外するためにさらに整理した。配列決定アダプタマーを除外するために、ＡＧＯ２及びＡＧＯ３小分子ＲＮＡ配列をｃｕｔａｄａｐｔ ｖ１．７［Ｍａｒｔｉｎ Ｍ．、ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ（２０１１） １７（１）：１０−１２］で加工した。加工したリードを、次に、パラメータ「−−ａｌｉｇｎＩｎｔｒｏｎＭａｘ １ −−ａｌｉｇｎＥｎｄｓＴｙｐｅ ＥｎｄＴｏＥｎｄ −−ｓｃｏｒｅＤｅｌＯｐｅｎ −１００００ −−ｓｃｏｒｅＩｎｓＯｐｅｎ −１００００」を用いてＳＴＡＲ ｖ２．６．１ａ［Ｄｏｂｉｎ Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１３） ２９、１５、Ａｉ２１］を使用して、ヒトゲノムのＧＲＣｈ３７アセンブリに対してアラインメントした。グラフを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア［Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ Ｈ．ら、Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ（２０１３） １４（２）：１７８−９２］を使用して得た。

【0616】

標的遺伝子
遍在する発現プロファイルを有するｍｉＲＮＡが選択される（用途によっては、特定の組織、発生段階、温度、ストレスなどに特異的である発現プロファイルを有するｍｉＲＮＡを選択してもよい）。

【0617】

例えば、ｍｉＲＮＡは、ＧＦＰ、ｐ５３、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡに改変される（下記表１Ａを参照）。

【0618】

【表2】

【0619】

ｓｉＲＮＡ設計
標的特異的ｓｉＲＮＡは、サーモフィッシャー・サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の「ＢＬＯＣＫ−ｉＴ（商標）ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ」及びインビボジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）の「Ｆｉｎｄ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」などの公的に入手可能なｓｉＲＮＡ設計ツールによって設計される。

【0620】

ｓｇＲＮＡｓ設計
ｓｇＲＮＡは、Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１５） ３１（２４）：４０１４−４０１６に以前に記載されているように、公的に入手可能なｓｇＲＮＡ設計ツールを用いて内在ｍｉＲＮＡ遺伝子を標的とするように設計される。２つのｓｇＲＮＡはそれぞれのカセットに対して設計されているが、１細胞あたり１つのｓｇＲＮＡが発現し、遺伝子交換が開始される。ｓｇＲＮＡは、交換後に改変されるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列に対応する。

【0621】

効率的なｓｇＲＮＡ選択の機会を最大にするために、２つの異なる公的に利用可能なアルゴリズム（ＣＲＩＳＰＥＲ Ｄｅｓｉｇｎ：ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｒｉｓｐｒ（ｄｏｔ）ｍｉｔ（ｄｏｔ）ｅｄｕ：８０７９／及びＣＨＯＰＣＨＯＰ：ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｃｈｏｐｃｈｏｐ（ｄｏｔ）ｃｂｕ（ｄｏｔ）ｕｉｂ（ｄｏｔ）ｎｏ／）を使用し、各アルゴリズムからのトップスコアを示すｓｇＲＮＡを選択する。

【0622】

交換ｓｓＤＮＡオリゴ設計
４００ｂのｓｓＤＮＡオリゴはｍｉＲＮＡ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計されている。このｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は、オリゴの中心に位置する。次に、ガイド（サイレンシング）ｓｉＲＮＡ鎖が標的に対して１００％相補的に保たれるように、二本鎖ｓｉＲＮＡ配列を成熟ｍｉＲＮＡ配列と交換する。パッセンジャーｓｉＲＮＡ鎖の配列を改変して、元のｍｉＲＮＡ構造を保存し、同じ塩基対形成プロファイルを維持する。

【0623】

交換プラスミドＤＮＡ設計
４０００ｂｐのｄｓＤＮＡフラグメントはｍｉＲＮＡ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列に基づいて設計される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列はｄｓＤＮＡフラグメントの中心に位置している。このフラグメントを標準的なベクター（例えば、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）にクローニングし、Ｃａｓ９システム成分を有する細胞にトランスフェクトする。次に、ガイド（サイレンシング）ｓｉＲＮＡ鎖が標的に対して１００％相補的に保たれるように、二本鎖ｓｉＲＮＡ配列を成熟ｍｉＲＮＡ配列と交換する。パッセンジャーｓｉＲＮＡ鎖の配列を改変して、元のｍｉＲＮＡ構造を保存し、同じ塩基対形成プロファイルを維持する。

【0624】

ｓｇＲＮＡ配列
ヒトｍｉＲ−１５０
１． ＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＧＧＴＴＧＧＧ（配列番号５）
２． ＣＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧ（配列番号６）

【0625】

交換される内在ｍｉＲＮＡの一覧
１． ヒトｍｉＲ−１５０（配列番号１３）
２． ヒトｍｉＲ−２１０（配列番号１４）
３． ヒトｍｉＲ−３４（配列番号１９−２１）
５． ヒトＬｅｔ７ｂ（配列番号１５）
６． ヒトｍｉＲ−１８４（配列番号１６）
７． ヒトｍｉＲ−２０４（配列番号１７）
８． ヒトｍｉＲ−２５（配列番号１８）

【0626】

遺伝子交換に用いられるｓｓＤＮＡオリゴ
オリゴ−１：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ１＿＿ｈｓａ−ｍｉｒ１５０（５’→３’）（配列番号１）
オリゴ−２：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ６＿＿ｈｓａ−ｍｉｒ１５０（５’→３’）（配列番号２）
オリゴ−３：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ１＿＿ｈｓａ−ｍｉｒ１５０（５’→３’）（配列番号３）
オリゴ−４：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ２＿＿ｈｓａ−ｍｉｒ１５０（５’→３’）（配列番号４）
オリゴ−５：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ１７（５’→３’）（配列番号２４３）
オリゴ−６：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ２−ｍＭＩＲ１７（５’→３’）（配列番号２４４）
オリゴ−７：ＨＰＲＴ−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ１７（５’→３’）（配列番号２４５）
オリゴ−８：ＨＰＲＴ−ｓｉＲＮＡ２−ｍＭＩＲ１７（５’→３’）（配列番号２４６）
オリゴ−９：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ２１ａ（５’→３’）（配列番号２４７）
オリゴ−１０：ＴＰ５３−ｓｉＲＮＡ２−ｍＭＩＲ２１ａ（５’→３’）（配列番号２４８）
オリゴ１１：ＨＰＲＴ−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ２１ａ（５’→３’）（配列番号２４９）
オリゴ１２：ＨＰＲＴ−ｓｉＲＮＡ２−ｍＭＩＲ２１ａ（５’→３’）（配列番号２５０）
オリゴ１３：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ１７（５’→３’）（配列番号２５１）
オリゴ１４：ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ１−ｍＭＩＲ２１ａ（５’→３’）（配列番号２５２）

【0627】

ｓｇＲＮＡクローニング
利用したトランスフェクションプラスミドは、以下のものを含む４つのモジュールから構成される。
１）ＢＧＨポリ（Ａ）シグナル終結配列によって終結したＣＭＶプロモーターによって駆動されるｍＣｈｅｒｒｙ；
２）ＢＧＨポリ（Ａ）シグナル終結配列によって終結されたＥＦ１ａコアプロモーターによって駆動されるＣａｓ９（ヒトコドン最適化）；
３）ガイド１に対するｐｏｌ ＩＩＩ（Ｕ６）プロモーターｓｇＲＮＡ；

【0628】

プラスミド設計
一過性発現には、３つの転写単位を含むプラスミドを用いる。最初の転写単位は、Ｃａｓ９の発現を駆動するＥＦ１ａコアプロモーター及びＢＧＨポリ（Ａ）シグナル３５Ｓターミネーターを含む。次の転写単位は、ｍＣｈｅｒｒｙの発現を駆動するＣＭＶプロモーター及びＢＧＨポリ（Ａ）シグナルターミネーターからなる。３番目は、ｍｉＲＮＡ遺伝子を標的とするためのｓｇＲＮＡを発現するｐｏｌ ＩＩＩ（Ｕ６）プロモーターを含む（各ベクターは単一のｓｇＲＮＡを含む）。

【0629】

ｍｉＲ−１７３及びｍｉＲ−３９０を標的とし、ＧＦＰ、ＡｔＰＤＳ３及びＡｔＡＤＨ１を標的とするＳＷＡＰを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９の設計及びクローニング
概念実証のために、本発明者らは、標的遺伝子に逆に相補する小分子ＲＮＡを生成することによって、ゲノム的状況において、成熟したｍｉＲ−１７３及びｍｉＲ−３９０の配列を、（植物細胞における）ＧＦＰ、ＡｔＰＤＳ３又はＡｔＡＤＨ１を標的とするように、変更するように設計した。さらに、ｍｉＲＮＡ前駆体転写産物の二次構造を維持するために、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡのさらなる変更を行った（下記表２）。これらのフラグメントをＰＵＣプラスミドにクローン化し、ドナー（ＤＯＮＯＲ）と命名し、ＤＮＡフラグメントをＳＷＡＰと称した。ｍｉＲ−１７３を改変するための配列について、 − ＳＷＡＰ１及びＳＷＡＰ２はＧＦＰを標的とし、ＳＷＡＰ３及びＳＷＡＰ４はＡｔＰＤＳ３を標的とし、ＳＷＡＰ９及びＳＷＡＰ１０はＡｔＡＤＨ１を標的とする（下記表２参照）。ｍｉＲ−３９０を改変するための配列について、 − ＳＷＡＰ５及びＳＷＡＰ６はＧＦＰを標的し、ＳＷＡＰ７及びＳＷＡＰ８はＡｔＰＤＳ３を標的とし、ＳＷＡＰ１１及びＳＷＡＰ１２はＡｔＡＤＨ１を標的とする（下記表２参照）。

【0630】

ｍｉＲ−１７３及びｍｉＲ−３９０を標的とするガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ベクター系に導入して、所望のｍｉＲＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ切断を生じさせた。これらを遺伝子衝撃プロトコルによりドナーベクターと共に植物に同時導入し、相同ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）により所望の改変を導入した。これらのガイドＲＮＡは、以下の表２に特定される。

【0631】

【表3(1)】

【0632】

【表3(2)】

【0633】

【表3(3)】

【0634】

【表3(4)】

【0635】

プラスミドトランスフェクション
トランスフェクションのために、リポフェクタミン（登録商標） ２０００トランスフェクション試薬（又は任意の他のもの）を、製造業者のプロトコルに従って使用する。要約すれば以下のとおりである。
接着細胞について：トランスフェクション時に細胞が９０〜９５％コンフルエントになるように、トランスフェクションの１日前に、０．５〜２×１０^５細胞を５００μｌの、抗生物質を含まない増殖培地にプレーティングする。

【0636】

浮遊細胞について：複合体を調製する直前に、５００μｌの増殖培地中の４〜８×１０^５細胞を抗生物質を用いずにプレーティングする。

【0637】

各トランスフェクション試料に対して、複合体を以下のとおりに調製する：ａ）血清を含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（又は血清を含まない他の培地）５０μｌの中でＤＮＡを希釈し、ゆっくり混合する。ｂ）リポフェクタミン（商標）２０００を、使用前にゆっくりと混合し、次いで適切な量を５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｉ Ｍｅｄｉｕｍに希釈し、室温で５分間インキュベーションする。工程ｃに進むことは２５分間以内に行われる必要があることに留意されたい。ｃ）５分間のインキュベーション後、希釈したＤＮＡを希釈したリポフェクタミン（商標） ２０００と合わせ（全量＝１００μｌ）、これをゆっくり混合し、室温で２０分間インキュベーションする（溶液は、濁って見える可能性がある）。この複合体は室温で６時間安定であることに留意されたい。ｄ）この複合体１００μｌを、細胞及び培地を含有する各ウェルに加え、プレートを前後に揺り動かすことによりゆっくり混合する。ｅ）導入遺伝子発現について試験する前に、細胞をＣＯ_２培養器の中で、３７℃で１８〜４８時間インキュベーションする。培地は、４〜６時間後に変えてもよい。

【0638】

蛍光タンパク質発現細胞のＦＡＣＳソーティング
プラスミド／ＲＮＡ送達の４８時間後、細胞を収集し、フローサイトメーターを用いて蛍光タンパク質発現（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）について選別し、以前に記載されたように［Ｃｈｉａｎｇら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１６）６：２４３５６］、蛍光タンパク質／編集剤発現細胞を濃縮した。この濃縮工程は、抗生物質選択をバイパスし、蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを一過性に発現する細胞のみを収集することを可能にする。これらの細胞は、ＨＲ事象による標的遺伝子の編集、及びそれに続く標的遺伝子、すなわちＧＦＰの効率的なサイレンシングについてさらに試験することができる。

【0639】

衝撃及び植物再生
シロイヌナズナ根調製物
塩素ガス滅菌シロイヌナズナ（ｃｖ．Ｃｏｌ−０）種子をＭＳマイナススクロースプレート上に播種し、暗所で４℃で３日間春化処理し、続いて２５℃で恒光下で垂直に発芽させた。２週間後、根を１ｃｍ根切片に切り出し、Ｃａｌｌｕｓ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（ＣＩＭ：Ｂ５ビタミン、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、２ｍｇ／ｌ ＩＡＡ、０．５ｍｇ／ｌ ２，４−Ｄ、０．０５ｍｇ／ｌキネチンを含む１／２ＭＳ）プレート上に置いた。暗所、２５℃で６日間インキュベートした後、根切片を濾紙ディスク上に移し、衝撃に備えて、４〜６時間、ＣＩＭＭプレート（ビタミン、２％グルコース、０．４Ｍマンニトール、ｐＨ５．７及び０．８％寒天を含まない１／２ＭＳ）上に置いた。

【0640】

衝撃
プラスミド構築物を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ粒子送達（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；ＰＤＳ−１０００／Ｈｅシステム＃１６５２２５７）を介して根組織に導入し、以下に概説するいくつかの調製工程が、この手順を実施するために必要であった。

【0641】

金ストック材料の調製
４０ｍｇの０．６μｍ金（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；カタログ：１６５２２６２）を１ｍｌの１００％エタノールと混合し、パルス遠心分離してペレットにし、エタノールを除去した。この洗浄手順をさらに２回繰り返した。

【0642】

洗浄後、ペレットを１ｍｌの滅菌蒸留水に再懸濁し、１．５ｍｌチューブに５０μｌアリコート作業容量として分配した。

【0643】

ビーズ調製
要するに、以下のことを行った。
単一のチューブは、シロイヌナズナ根の２つのプレートに衝撃を与えるのに十分な金であり（プレート当たり２ショット）、従って、各チューブを４つの（１，１００ｐｓｉ（約７．６ＭＰａ））のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ破裂板（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；カタログ：１６５２３２９）の間に分配した。

【0644】

衝撃は同じ試料の複数のプレートを必要とするので、チューブを合わせ、それに応じてＤＮＡ及びＣａＣｌ２／スペルミジン混合物の体積を調整して、試料の一貫性を維持し、調製物全体を最小限にした。

【0645】

以下のプロトコルは、金の１つのチューブを調製するプロセスを要約し、これらは、使用される金のチューブの数に従って調整されるべきである。

【0646】

この後の全てのプロセスは、エッペンドルフサーモミキサー中で４℃で行った。

【0647】

プラスミドＤＮＡ試料を調製し、各チューブは、１０００ｎｇ／μｌの濃度で添加された１１μｇのＤＮＡを含む。
１）４９３μｌのｄｄＨ２Ｏを１アリコート（７μｌ）のスペルミジン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｓ０２６６）に添加し、０．１Ｍスペルミジンの最終濃度を得た。１２５０μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ２をスペルミジン混合物に添加し、ボルテックスし、氷上に置いた。
２）予め調製した金のチューブをサーモミキサーに入れ、１４００ｒｐｍの速度で回転させた。
３）チューブに１１μｌのＤＮＡを加え、ボルテックスし、回転するサーモミキサーに戻した。
４）ＤＮＡ／金粒子を結合させるために、７０μｌのスペルミジンＣａＣｌ_２混合物を各チューブ（サーモミキサー中）に添加した。
５）チューブを１５〜３０秒間激しくボルテックスし、氷上に約７０〜８０秒間置いた。
６）混合物を７０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去し、氷上に置いた。
７）５００μｌの１００％エタノールを各チューブに添加し、ペレットをピペッティングにより再懸濁し、ボルテックスした。
８）チューブを７０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。
９）上清を除去し、ペレットを５０μｌの１００％エタノールに再懸濁し、氷上で保存した。

【0648】

マクロ担体調製
層流キャビネット内で以下のことを行った。
１）マクロ担体（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；１６５２３３５）、停止スクリーン（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）；１６５２３３６）、及びマクロ担体ディスクホルダーを滅菌乾燥した。
２）マクロ担体のディスクホルダーにマクロ担体を平らに配置した。
３）ＤＮＡ被覆金混合物をボルテックスし、各Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ破裂板の中心に広げた（５μｌ）。
エタノールを蒸発させた。

【0649】

ＰＤＳ−１０００（ヘリウム粒子送達系）
要するに、以下のことを行った。
ヘリウムボトルの調整弁を少なくとも１３００ｐｓｉ（約９．０ＭＰａ）の流入圧力に調整した。真空は、真空／ベント／ホールド・スイッチを押し、稼動スイッチを３秒間押し続けることによって作り出した。これは、ヘリウムが配管に流れ込むことを確実にした。

【0650】

１１００ｐｓｉ（約７．６ＭＰａ）の破裂ディスクをイソプロパノールに入れ、混合して静電気を除去した。
１）１つの破裂ディスクをディスク保持キャップ内に配置した。
２）マイクロ担体発射アセンブリを構築した（停止スクリーンと金含有マイクロ担体を備えた）。
３）シャーレ上でシロイヌナズナ根カルスを発射アセンブリの６ｃｍ下に置いた。
４）真空圧を２７インチＨｇ（水銀）（約９１ｋＰａ）に設定し、ヘリウム弁を開いた（約１１００ｐｓｉ（約７．６ＭＰａ）で）。
５）真空を解放した。マイクロ担体発射アセンブリ及び破裂板保持キャップを取り外した。
６）同じ組織への衝撃（すなわち、各プレートを２回衝撃した）。
７）次に、衝撃を与えた根を、暗所で、２５℃で、さらに２４時間、ＣＩＭプレート上に置いた。

【0651】

同時衝撃
ＧＥｉＧＳプラスミドの組み合わせに衝撃を与える場合、５μｇ（１０００ｎｇ／μｌ）のｓｇＲＮＡプラスミドを８．５μｇ（１０００ｎｇ／μｌ）のｓｗａｐ（スワップ）プラスミドと混合し、この混合物１１μｌを試料に添加した。同時により多くのＧＥｉＧＳプラスミドを衝撃する場合、使用したｓｇＲＮＡプラスミド対ｓｗａｐプラスミドの濃度比は１：１．７であり、この混合物１１μｇ（１０００ｎｇ／μｌ）を試料に添加した。ＧＥｉＧＳ交換に関連しないプラスミドを同時衝撃する場合、等しい比率を混合し、１１μｇ（１０００ｎｇ／μｌ）の混合物を各試料に添加した。

【0652】

植物再生
シュート再生のために、Ｖａｌｖｅｋｅｎｓら［Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ，Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８８） ８５（１５）：５５３６−５５４０］からの改変プロトコルを実施した。Ｂ５ビタミン、２％グルコース、ｐＨ５．７、０．８％寒天、５ｍｇ／ｌ ２ ｉＰ、０．１５ｍｇ／ｌ ＩＡＡを有する１／２ＭＳを含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）プレート上に、衝撃を与えた根を置いた。プレートを、２５℃で１６時間明、２３℃で８時間暗のサイクルに放置した。１０日後、プレートを、３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレートに１週間移し、次いで、新鮮な同様のプレートに移した。植物が再生したら、それらを根から切り出し、分析するまで、３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレート上に置いた。

【0653】

表現型解析
上記のとおり、蛍光、及び細胞形態、又は標的遺伝子に依存する成長速度／阻害及び／若しくはアポトーシス等の他の表現型、ＴＰ５３サイレンシングの場合にはＮｕｔｌｉｎ３耐性を見ることによる。

【0654】

抗ウイルスアッセイ
アッセイは、精製されたインターフェロン原液の効力を決定するために一般に使用される細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づく。ＣＰＥアッセイでは、クリスタルバイオレット生細胞染色［Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ． （１９８１） １０：７５５−７５８によりこれまでに記載されている］により測定される、ウイルス誘導細胞病理を阻害する能力に基づいて抗ウイルス活性を測定する。

【0655】

ＶＳＶは、ＷＩＳＨ羊膜細胞株の静置培養において分散した、微視的な溶菌斑を形成する。微小溶菌斑の形成は迅速であり、再現性があり、容易に定量され、３３〜４０℃の範囲の温度で起こり、半固体のオーバーレイを必要としない。

【0656】

アリルアルコール選択
アリルアルコールで植物を選択するために、衝撃後１０日目に、根をＳＩＭ培地上に置いた。根を３０ｍＭアリルアルコール（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）に２時間浸漬した。次に、根をＭＳ培地で３回洗浄し、３％スクロース、０．８％寒天を含むＭＳプレート上に置いた。再生プロセスは、先に記載したように実施した。

【0657】

遺伝子型決定
植物組織試料を処理し、アンプリコンを製造業者の推奨に従って増幅した。ＭｙＴａｑ Ｐｌａｎｔ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｉｎｅ ＢＩＯ ２５０５６）を短い内部増幅に用い、Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ Ｋｉｔ（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｆ−１３０ＷＨ）を長い外部増幅に用いる。これらの増幅のために使用されるオリゴは、上記の表２に特定される。ｍｉＲＮＡ遺伝子座における異なる改変は、以下のようにアンプリコンの異なる消化パターンを介して特定された。

【0658】

ｍｉＲ−３９０の改変については、 − 内部アンプリコンは９７８塩基対の長さであり、外部増幅については２６２９塩基対であった。ｓｗａｐ７の特定については、ＮｌａＩＩＩによる消化は、６３６塩基対のフラグメントサイズをもたらしたが、ｗｔバージョンでは、それは、４２０及び２１６の長さのフラグメントに切断された。ｓｗａｐ８の特定については、Ｈｐｙ１８８Ｉによる消化は、２９３及び３３９塩基対のフラグメントサイズをもたらしたが、ｗｔバージョンでは、この部位は存在せず、６３２長のフラグメントをもたらした。ｓｗａｐ１１及び１２の特定については、ＢｃｃＩによる消化は、６６２塩基対のフラグメントサイズをもたらしたが、ｗｔバージョンでは、それは、１４７及び４１７長のフラグメントに切断された。

【0659】

ｍｉＲ−１７３の改変については、 − 内部アンプリコンは５７４塩基対の長さであり、ネステッド外部増幅については４６６塩基対であった。ｓｗａｐ３の特定については、ＢｓｌＩによる消化は、外部アンプリコンにおいて２１７及び２４９塩基対のフラグメントサイズ、並びに内部アンプリコンにおいて３１７及び１４９塩基対のフラグメントサイズをもたらした。ｗｔバージョンでは、この部位は存在せず、外部アンプリコンでは４６６長のフラグメントを、内部反応では５７４長のフラグメントをもたらした。ｓｗａｐ４の特定については、ＢｔｓαＩによる消化は、外部アンプリコンにおいて２１２及び２５４塩基対のフラグメントサイズ、並びに内部アンプリコンにおいて２１２及び３６２のフラグメントサイズをもたらした。ｗｔバージョンでは、この部位は存在せず、外部アンプリコンでは４６６長のフラグメントを、内部反応では５７４長のフラグメントをもたらした。ｓｗａｐ９の特定については、ＮｌａＩＩＩによる消化は、外部アンプリコンにおいて３１７及び１４９塩基対のフラグメントサイズ、並びに内部アンプリコンにおいて３１７及び２４４のフラグメントサイズを生じた。ｗｔバージョンでは、この部位は存在せず、外部アンプリコンでは４６６長のフラグメントを、内部反応では５６１長のフラグメントをもたらした。ｓｗａｐ１０の特定については、ＮｌａＩＩＩによる消化は、外部アンプリコンにおいて３７５及び９１塩基対のフラグメントサイズ、並びに内部アンプリコンにおいて３７５及び１８６のフラグメントサイズを生じた。ｗｔバージョンでは、この部位は存在せず、外部アンプリコンでは４６６長のフラグメントを、内部反応では５６１長のフラグメントをもたらした。

【0660】

ＤＮＡ及びＲＮＡの単離
植物試料を液体窒素中に回収し、処理するまで−８０℃で保存した。組織の粉砕は、ドライアイス中に置かれたチューブ中で、プラスチック組織粉砕ペスル（Ａｘｙｇｅｎ、米国）を用いて行った。ＲＮＡ／ＤＮＡ精製キット（カタログ番号４８７００；Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．、カナダ）を用いて、製造業者の説明書に従って、粉砕組織からのＤＮＡ及び全ＲＮＡの単離を行った。ＲＮＡ画分の低い２６０／２３０比（＜１．６）の場合、単離ＲＮＡは、１μｌグリコーゲン（カタログ１０８１４０１０；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）１０％Ｖ／Ｖ酢酸ナトリウム、３Ｍ ｐＨ５．５（カタログＡＭ９７４０、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）及び３倍の体積のエタノールを用いて−２０℃で一晩沈殿した。溶液を４℃で最高速度で３０分間遠心分離した。これに続いて、７０％エタノールで２回洗浄し、１５分間風乾し、ヌクレアーゼを含まない水（カタログ番号１０９７７０３５；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）に再懸濁した。

【0661】

逆転写（ＲＴ）及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
１μｇの単離された全ＲＮＡを、製造業者のマニュアルに従ってＤＮａｓｅ Ｉで処理した（ＡＭＰＤ１；シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）。この試料を、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ４３６８８１４；アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、米国）の使用マニュアルに従って逆転写した。

【0662】

遺伝子発現のために、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）解析を、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）、米国）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（Ｓ４４３８、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、米国）で、製造業者のプロトコルに従って実施し、Ｂｉｏ−ＲａｄＣＦＸマネージャープログラム（バージョン３．１）で解析した。ＡｔＡＤＨ１（ＡＴ１Ｇ７７１２０）の分析のために、以下のプライマーセットを使用した：順方向ＧＴＴＧＡＧＡＧＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ 配列番号２３７及び逆方向ＣＴＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧ 配列番号２３８。ＡｔＰＤＳ３（ＡＴ４Ｇ１４２１０）の分析のために、以下のプライマーセットを使用した：順方向ＧＴＡＣＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＧ 配列番号２３９及び逆方向ＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＧＡＴＧ 配列番号２４０。内在較正遺伝子のために、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ＮＣ＿０３７３０４）を使用した − 順方向ＡＣＡＣＣＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＴ 配列番号２４１及び逆方向ＧＴＡＴＧＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＡＣＣＡＣ 配列番号２４２。

【0663】

実施例１Ａ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）プラットフォーム
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ） マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、長い自己相補的な前駆体に由来する２０〜２４ヌクレオチド長の小分子の内在性非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）である。成熟ｍｉＲＮＡは、２つのやり方、（ｉ）翻訳阻害することにより、又は（ｉｉ）標的ｍＲＮＡとの完全又はほぼ完全な相補体によってコードｍＲＮＡを劣化させることにより、遺伝子発現を制御する。動物では、ｍｉＲＮＡに関する重要な研究が、シード領域（５’末端の２〜８位にまたがる配列）だけが標的認識にとって非常に重要であることを示している。このシード配列は、標的ｍＲＮＡの主に３０−非翻訳領域（ＵＴＲ）でその応答配列に十分に対合する。ｍｉＲＮＡｓ生合成機構、ｍｉＲＮＡ発現レベル及びｍｉＲＮＡ制御ネットワークの変化は、細胞分化及びアポトーシス等の重要な生物学的経路に影響を及ぼし、この変化は、種々のヒト疾患及び症候群、とりわけ癌において検出される。

【0664】

すべての腫瘍は、ｍｉＲＮＡ発現の変化の特異的な痕跡を提示する。この理由のために、腫瘍のｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、診断、予後診断、患者の層別化、リスク群の定義及び療法への応答の監視のための妥当で有用なバイオマーカーを表す可能性がある。等しく関係があるのは、ウイルス感染におけるｍｉＲＮＡの新興的な役割である。文献からのデータは、ウイルスと宿主細胞のｍｉＲＮＡ機構との相互干渉を示す。例えば、ウイルスは、特定のタンパク質と相互作用することにより宿主細胞のｍｉＲＮＡ経路を障害し、自身のｍｉＲＮＡを合成して細胞環境を改変するか若しくは自身のｍＲＮＡを制御し、又は細胞ｍｉＲＮＡを自身に有利なように利用する可能性がある。しかしながら、宿主細胞のｍｉＲＮＡがウイルスｍＲＮＡを標的とする可能性があることも言える。多くの場合、この双方向性の干渉がウイルスに有利に解消され、その結果、ウイルスは、免疫応答を逃れ、複製サイクルを完了する可能性がある。

【0665】

従って、本発明者らは、任意の目的のＲＮＡを特異的にサイレンシングするために、サイレンシング機能性を獲得するためのＧＥｉＧＳを使用して、相同組換え（ＨＲ）により再設計される内在性のｎｃＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡの）を使用している。選んだ配列を置換するために、ＨＲは、ＤＮＡ損傷を修復するために、ＤＳＢ部位に隣接しているより長い広がりの配列相同性を利用し、それゆえ、ＨＲは、ＤＮＡの損傷した鎖と無傷のドナー鎖（すなわち挿入されるｓｉＲＮＡ配列）との間のより高い配列相同性が必要であるため、ＤＳＢ修復のための正確な機構であると考えられる。このプロセスは、修復のために使用されるＤＮＡ鋳型がＤＳＢのところのもとのＤＮＡ配列と同一である場合には、エラーがないと考えられ、又はこのプロセスは、非常に特異的な変異を損傷したＤＮＡに導入することができる、例えば交換（スワッピング）遺伝子。

【0666】

実施例１Ｂ
ゲノム編集誘導遺伝子サイレンシング（ＧＥｉＧＳ）
ＧＥｉＧＳオリゴを設計するためには、プロセシングされ、誘導体である小分子サイレンシングＲＮＡ分子（成熟）を生じる鋳型非コードＲＮＡ分子（前駆体）が必要とされる。本発明者らは、Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ［Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ、Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２０１４） １５９：１１５３、Ａｉ１１６７］においてこれまでに論じられたように、ヒト及びエレガンス線虫においてサイレンシングに関与する小分子ＲＮＡ（すなわち、アルゴノート２及びアルゴノート３によって結合される小分子ＲＮＡ）を生成するダイサー基質ＲＮＡ（すなわち、ダイサーによって結合される細胞ＲＮＡ）を特徴づけている。両方のデータセット（ダイサー結合ＲＮＡ並びにＡｇｏ２及びＡｇｏ３結合小分子ＲＮＡ）を横断することで、小分子サイレンシングＲＮＡの前駆体である非コードＲＮＡの一覧を生成することが可能になった（図１０及び図１１Ａ〜Ｅ）。前駆体の２つの供給源及びその対応する成熟配列を、ＧＥｉＧＳオリゴを生成するために使用した。ｍｉＲＮＡについては、配列は、ｍｉＲＢａｓｅデータベース［Ｋｏｚｏｍａｒａ、Ａ．及びＧｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２０１４） ４２：Ｄ６８、ＡｉＤ７３］から得た。他の種類の前駆体（ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡｓ、及び種々の種類のリピートを含む）は、ダイサー結合及びＡＧＯ結合ＲＮＡを記載する最近の刊行物［Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ（２０１４） １５９：１１５３、Ａｉ１１６７］から得た。

【0667】

サイレンシング標的を、種々の宿主生物において選択した。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡｒｕｌｅｓソフトウェア［Ｈｏｌｅｎ，Ｔ．、ＲＮＡ（２００６） １２：１６２０、Ａｉ１６２５］を用いてこれらの標的に対して設計した。これらのｓｉＲＮＡ分子の各々を使用して、各前駆体中に存在する成熟配列を置換し、「ナイーブ」ＧＥｉＧＳオリゴを生成した。これらのナイーブ配列の構造は、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ｖ２．６［Ｌｏｒｅｎｚ，Ｒ．ら、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０．Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１） ６：２６］を使用して、野生型前駆体の構造に可能な限り近づくように調整した。成功裏の構造維持対不成功の構造維持の例は、図１２Ａ〜Ｄで見ることができる。構造調整後、配列数及び野生型と改変オリゴとの間の二次構造変化を計算した。これらの計算は、野生型に対して最小の配列変更しか必要としない潜在的に機能的なＧＥｉＧＳオリゴを特定するために必須である（図１２Ａ〜Ｅ）。

【0668】

野生型前駆体に対するＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９小分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、ＣａｓＯＴソフトウェア［Ｘｉａｏ，Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４） ３０：１１８０、Ａｉ１１８２］を用いて作製した。ＧＥｉＧＳオリゴを生成するために適用される改変がｓｇＲＮＡのＰＡＭ領域に影響を及ぼし、それを改変オリゴに対して無効にするｓｇＲＮＡを選択した。

【0669】

実施例２
「内在」導入遺伝子のＧＥｉＧＳ
ＧＥｉＧＳの効率を確認するための迅速で堅牢なアプローチは、内在性遺伝子として働くことになり、加えてＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）のようなマーカー遺伝子でもある導入遺伝子をサイレンシングすることである。細胞におけるＧＦＰサイレンシングの有効性を評価するための選択肢はいくつかあり、本発明者らは、細胞におけるＧＦＰサイレンシングの有効性を評価するために、ＦＡＣＳ分析、ＲＴ−ｑＰＣＲ及び顕微鏡法を使用している。

【0670】

ＧＦＰのサイレンシングは、十分に特徴づけられており、ＧＦＰサイレンシングを誘発することに効率的な利用可能な低分子干渉ＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ）は多く存在する。それゆえ、遺伝子交換（スワッピング）のために、本発明者らは、ＧＦＰをサイレンシングするように設計した２１マーｓｉＲＮＡ分子を使用している。加えて、又はあるいは、本発明者らは、与えられた遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に対して遺伝子サイレンシングを開始するのにどのｓｉＲＮＡが有効であるかを予測する公開されているアルゴリズムを使用する。これらのアルゴリズムの予測は１００％ではないので、本発明者らは、少なくとも２つの異なるアルゴリズムの結果である配列のみを使用している。

【0671】

ＧＦＰ遺伝子をサイレンシングするｓｉＲＮＡ配列を使用するために、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、それらを公知の内在ｍｉＲＮＡ遺伝子配列と交換する。特徴付けられたｍｉＲＮＡの多くのデータベースがある。本発明者らは、異なる発現プロフィール（例えば、低い構成的発現、高度に発現、ストレスで誘導されるなど）を有するいくつかの公知のヒトｍｉＲＮＡを選択している。内在ｍｉＲＮＡ配列をｓｉＲＮＡと交換するために、本発明者らは、ＨＲアプローチを使用している。

【0672】

図２に示すように、ＨＲを用いて、本発明者らは、次の２つの選択肢を企図している：１）中央に交換ｓｉＲＮＡ配列を含む約２００〜５００ｎｔのドナーｓｓＤＮＡオリゴ配列を使用すること、又は、２）２×２１ｂｐのｍｉＲＮＡ及びＧＦＰのｓｉＲＮＡに変更する^＊ｍｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡの５００〜２０００ｂｐ上流及び下流側）を除き、ゲノム中の取り囲むｍｉＲＮＡとほぼ１００％同一の１Ｋｂ〜４Ｋｂ挿入物を発現するプラスミドを使用すること。トランスフェクションは、いくつかの構築物を含む：ＣＲＩＳＰＲ：Ｃａｓ９／ＧＦＰセンサー（これは、陽性の形質転換細胞を追跡し、そして濃縮する）、ｇＲＮＡ（これは、Ｃａｓ９を、挿入ベクター／オリゴに依存して、ＨＲによって修復されるＤＳＢを生成するように誘導する）。

【0673】

挿入ベクターは、置換され（例えば、ｍｉＲＮＡ）、目的の突然変異（すなわち、ｓｉＲＮＡ）を運ぶように改変された標的遺伝子座を囲む相同性の２つの連続した領域を含む。プラスミドを使用する場合、標的化構築物は、選択されたｓｉＲＮＡでのｍｉＲＮＡの交換で終わる相同組換えのための鋳型として使用される。組織培養細胞へのトランスフェクション後、ＦＡＣＳを用いて、陽性Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡトランスフェクト事象を濃縮し、細胞を、（図２に示すように）顕微鏡下でＧＦＰサイレンシングについてスコア化する。陽性編集細胞は、ＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ配列を産生すると予想され、従って、導入遺伝子のＧＦＰ発現は、対照細胞と比較してサイレンシングされると予想される。

【0674】

ＧＥｉＧＳを使用するＧＦＰサイレンシングの概念実証（ＰＯＣ）を示すために、ＧＦＰを発現する遺伝子導入ヒト細胞株（Ｕ２ＯＳ、ＲＰＥ１、Ａ５４９又はＨｅｌａ細胞を含む）を利用している。細胞を、ＧＥｉＧＳ方法論を用い、内在性非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を交換してそれをＧＦＰに対してＲＮＡサイレンシング機構を開始するための、ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡへとプロセシングされる非コードＲＮＡに変えるためのカセットを用いてトランスフェクトする。図３Ａ〜Ｂに示すように、ヒト細胞におけるＧＦＰ遺伝子発現レベルのノックダウンは、対照細胞（図３Ａ）と比べて、ｓｉＧＦＰを発現する細胞（すなわち、ＧＦＰがサイレンシングされている）において低下したＧＦＰの発現を生じる。

【0675】

実施例３
組織培養細胞における外来性導入遺伝子（ＧＦＰ）のＧＥｉＧＳ
ＧＦＰサイレンシングの前述の例（上記の実施例２）に加えて、ＧＥｉＧＳの効率を実証するための別の方法は、一過性ＧＦＰトランスフェクションアッセイにおいてＧＦＰのようなマーカー遺伝子をサイレンシングすることである。図４に示すように、（上記の実施例２で論じたように）ＧＦＰ遺伝子を標的とする小分子ｓｉＲＮＡの分子の発現を介して内在性ｍｉＲＮＡのサイレンシング特異性をリダイレクトするために、ヒト細胞を、ＧＥｉＧＳを使用して処理する。次に、対照の未処置の細胞及びＧＥｉＧＳ−ＧＦＰ細胞（すなわち、ｓｉＧＦＰを発現する）を、別々に２つのマーカー（センサー）ＧＦＰ＋ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）を発現するプラスミドでトランスフェクトする。ＧＥｉＧＳ処理においてＲＦＰのみを発現するがＧＦＰを発現しない細胞は、ｓｉＧＦＰ発現に起因するＧＦＰ遺伝子サイレンシングの結果である。これらの細胞（赤色だが、ＧＦＰ発現を欠く）由来のＤＮＡを抽出し、正確なゲノム編集事象について調べる。さらには、この細胞を、例えば、ＧＦＰの蛍光検出、又はｑ−ＰＣＲ、ＨＰＬＣによりＧＦＰの発現の喪失について分析することができる。

【0676】

実施例４
ＴＰ５３又はＨＰＲＴの発現のＧＥｉＧＳは、Ｕ２ＯＳ及びＲＰＥ１又はマウス胚性幹（ｍＥＳ）細胞においてＮｕｔｌｉｎ３誘導又は６ＴＧ（チオグアニン、６−ＴＧ、６−チオグアニン）細胞死／増殖阻害を阻害する
ヒト細胞におけるＧＥｉＧＳのＰＯＣを示すために、本発明者らは、Ｕ２ＯＳ、ＲＰＥ１又はマウス胚性幹細胞を用いて検討している。Ｕ２ＯＳは、早く成長して高効率でトランスフェクトし易い細胞である。これらの細胞は、骨癌 − 骨肉腫に由来する。ＲＰＥ１は、正常な網膜に由来する（すなわち、疾患又は病気の培養物由来ではない）上皮細胞であり、ｍＥＳと同様に正常で活性なＴＰ５３を有する。

【0677】

ＴＰ５３は、癌化ストレスに応答して直接的又は間接的にアポトーシス細胞死を誘導する腫瘍サプレッサータンパク質である。ＤＮＡ損傷の結果は、細胞型及び損傷の重症度に依存する。軽度のＤＮＡ損傷は、細胞周期停止を伴い又は伴わずに修復されうる。より重度で回復不能なＤＮＡ損傷は、変異を保有する細胞の外観につながるか、又は老化若しくは細胞死プログラムの誘導に向かうシフトを引き起こす。長年、ＤＮＡ損傷がアポトーシス又は壊死を介して細胞を死滅させると主張されたが、過去数年の間の技術的及び方法論的な進歩は、この損傷が、アポトーシス又は壊死につながりうるオートファジー又は分裂死によっても死を活性化しうるということを明らかにすることに役立った。この意思決定プロセスの根底にある分子的基礎は、現在、集中的な検討の主題である。

【0678】

今日、癌研究に関心がある者は誰でも、ＴＰ５３の存在及び腫瘍生物学の事実上あらゆる局面へのその関連性をすでに十分に認識している。ＴＰ５３は、疑いなく、最も広範囲に研究されている遺伝子及びタンパク質のうちの１つである。初期の研究は、ｐ５３のトランス活性化欠損変異体がアポトーシスを誘導することができることを示し、これは、アポトーシスにおけるｐ５３の非転写依存的な役割を含意する。ＤＮＡ損傷は、ＴＰ５３のミトコンドリア転位につながる。ＴＰ５３は、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬに結合し、チトクロムｃ放出に影響を及ぼす。ＴＰ５３は、他のタンパク質の不存在下で、アポトーシス促進性のＢｃｌ−２タンパク質Ｂａｘを直接活性化して、ミトコンドリアを透過させアポトーシスプログラムに関与させる。ＴＰ５３は、アポトーシス促進性の多ドメインタンパク質及びＢｃｌ−Ｘｌによって隔離されているＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の両方を放出することができる。加えて、ＴＰ５３は、Ｂａｘオリゴマー化を容易にし、ＢａｘではなくＢｃｌ−ｘＬに結合することにより、アポトーシスのミトコンドリア機構を媒介することができる。ＴＰ５３−Ｂｃｌ−ｘＬ相互作用はＢａｘを放出し、放出されたＢａｘはミトコンドリア膜でオリゴマーを形成し、チトクロムｃ放出及びアポトーシスにつながる（この効果のために、ＴＰ５３のプロリンリッチドメイン、マウスにおけるａａ６２−９１、が必要とされる）［Ｊｅｒｒｙら Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４） ３０３（５６６０）：１０１０−４］。ＴＰ５３も、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ及びＮＯＸＡ等のアポトーシス促進性遺伝子の発現を促進する転写因子として作用する。

【0679】

図５に示すように、本発明者らは、ＲＰＥ１細胞を、ＴＰ５３に向けたｓｉＲＮＡを発現するように改変しており、これらの細胞は、Ｎｕｔｌｉｎ３又は化学療法（例えば、カンプトテシン（ＣＰＴ）、エトポシド、オラパリブ等）に曝露したときに、細胞死の阻害を示す。本発明者らが利用しているアッセイのうちの１つは、細胞の染色により健常な細胞と瀕死の細胞とで異なる細胞数（密度）及び形態を比較することが可能になるクリスタルバイオレットアッセイである。細胞死に抵抗性がある細胞クローンは、正しいゲノム編集事象及び関連するＴＰ５３ ｓｉＲＮＡの発現について検証される。さらには、この細胞を、例えばＧＦＰの蛍光検出又はｑ−ＰＣＲ、ＨＰＬＣによって、ＴＰ５３の発現の喪失について分析することができる。

【0680】

チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）又は６−チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）（６−ＴＧ）としても知られるチオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ）は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置するために一般に使用される薬物（薬物療法）である。代謝拮抗物質であるチオグアニンは、グアニンのプリン類似体であり、ＤＮＡ及びＲＮＡを壊すことにより働く。６−チオグアニンは、天然に存在するプリン塩基グアニンのチオ類似体である。６−チオグアニンは、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴａｓｅ／ＨＰＲＴ）を利用して、６−チオグアノシン一リン酸（ＴＧＭＰ）へと変換される。高濃度のＴＧＭＰが、細胞内部で蓄積して、酵素イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰデヒドロゲナーゼ）を介してグアニンヌクレオチドの合成を妨害する可能性がある。ＴＧＭＰは、リン酸化によってチオグアノシン二リン酸（ＴＧＤＰ）及びチオグアノシン三リン酸（ＴＧＴＰ）に変換される。同時に、酵素リボヌクレオチドレダクターゼを介してデオキシリボシル類似体が形成される。ＴＧＭＰ、ＴＧＤＰ及びＴＧＴＰは、まとめて６−チオグアニンヌクレオチド（６−ＴＧＮ）と名付けられている。６−ＴＧＮは、（１）細胞の合成期（Ｓ期）の間のＤＮＡへの組み込みにより、及び（２）Ｒａｃ／Ｖａｖ経路を制御するＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）Ｒａｃ１の阻害を通して、細胞にとって細胞毒性である。ＲＮＡへの６−チオグアニンの組み込みから追加的な効果が誘導されうる。これは、リボソームによっては読み取ることができない改変ＲＮＡ鎖をもたらす。

【0681】

手短に言えば、ＨＰＲＴ遺伝子発現の喪失又は低下は、細胞を６ＴＧ耐性にする。従って、本発明者らは、ＨＰＲＴに向けたｓｉＲＮＡを発現することにより、ＨＰＲＴ遺伝子発現を改変し、６ＴＧへの耐性によりＨＰＲＴの下方制御を分析している。

【0682】

実施例５
アポトーシス促進性遺伝子（ＢＡＸ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ）のＧＥｉＧＳは、ヒト癌細胞において化学療法誘導細胞死を阻害する
この実験では、本発明者らはＵ２ＯＳ細胞を使用している。ＣＰＴ、エトポシド、オラパリブ等のような化学療法剤に耐性がある細胞を作り出すために、本発明者らは、最初に、アポトーシス促進性遺伝子として公知のＢＡＸ、ＰＵＭＡ及びＮＯＸＡのようなアポトーシス遺伝子を標的とすることができるｓｉＲＮＡを使用している。

【0683】

図６に示すように、本発明者らは、アポトーシス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを発現するためのＧＥｉＧＳを使用してＵ２ＯＳ細胞を処置している。ｓｉＲＮＡを発現する改変細胞は、化学療法（例えば、ＣＰＴ、エトポシド、オラパリブ等）誘導細胞死に抵抗性であると期待される。ＧＥｉＧＳカセット＋ＲＦＰセンサーを用いたトランスフェクション後、トランスフェクションした細胞を、ＦＡＣＳを用いて濃縮し、細胞を化学療法剤に曝露する。対照では、すべての細胞は、感受性であり、死滅するか又は老化に入る（Ｄａｐｉ染色を使用して顕微鏡下で容易に検出でき、大きい核を有する細胞はほとんどない）。細胞死及び／又は老化に抵抗性であるクローンは、編集したｓｉＲＮＡを積極的に発現すると期待され、正確なゲノム編集改変及び関連するｓｉＲＮＡの発現を有することが検証される。さらには、この細胞を、例えばＧＦＰの蛍光検出又はｑ−ＰＣＲ、ＨＰＬＣによって、ＢＡＸ、ＰＵＭＡ及びＮＯＸＡのようなアポトーシス遺伝子の発現の喪失について分析することができる。

【0684】

実施例６
ＧＥｉＧＳを使用して、ウイルス感染に対してヒト細胞を免疫する
ＧＥｉＧＳが、外来の病原性遺伝子をノックダウンする能力を有してヒト免疫化について堅牢な方法であることを証明するために、本発明者らは、ウイルス遺伝子のサイレンシングの例を提供する。レンチウイルス系は、モデル生物全体及びほとんどすべての哺乳類細胞（非分裂の非増殖細胞を含む）、並びに難トランスフェクト細胞（神経細胞、初代培養細胞及び幹細胞を含む）に遺伝子材料を送達する上で非常に効果的である。レンチウイルストランスフェクションの効率は、感染多重度（ＭＯＩ）によっては１００％に近く、これは、レンチウイルスを発現ベクター系として理想的なものにする。

【0685】

ＧＦＰを発現するレンチウイルスに感染した対照細胞は、（図７に示すように）顕微鏡下でＧＦＰの発現を示す。ＧＦＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを発現するように操作したＧＥｉＧＳ−ＧＦＰ細胞（上記の実施例２に示すとおり）は、ＧＦＰのレベルの低下を示すと期待される（図７に示すとおり）。ウイルス−ＧＦＰ（例えば、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ）に感染した後にＧＦＰ遺伝子発現がないか又は低いＧＦＰ遺伝子発現を有するＧＥｉＧＳ細胞を生成することは、外来遺伝子のサイレンシングが成し遂げられたこと、及びＧＥｉＧＳが、ウイルスのような侵襲的な感染性ＲＮＡに対してヒト細胞を免疫するための有効な方法であることを証明することになる。

【0686】

細胞においてＧＦＰ遺伝子サイレンシングの有効性を評価するための簡単な選択肢はいくつかあり、本発明者らは、ＦＡＣＳ分析、ＲＴ−ｑＰＣＲ、顕微鏡法及び／又は免疫ブロット法を使用している。それゆえ、遺伝子交換のために、本発明者らは、２１マーｓｉＲＮＡ分子を設計した（上記の実施例２に記載したとおり）。本発明者らは、与えられた遺伝子に対して遺伝子サイレンシングを開始するのにどのｓｉＲＮＡが有効であるかを予測する公開のアルゴリズムを使用している（上記の実施例２に記載したとおり）。

【0687】

実施例７
外来ウイルス遺伝子のサイレンシングによりウイルス感染に対してヒト細胞を免疫すること（細胞生存率アッセイ）
ＧＥｉＧＳが、外来遺伝子をノックダウンする能力を有してヒト免疫化について堅牢な方法であることを証明するために、ＧＦＰを発現するレンチウイルスを使用する例（上記の実施例６）に加えて、本発明者らは、野生型ＲＮＡウイルス感染を使用しており、細胞生存についてスコア付けしている。本発明者らは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）遺伝子のサイレンシングの例を提供する。

【0688】

ラブドウイルス科ＲＮＡウイルスであるＶＳＶは、多くの細胞型に感染することができ、それゆえラブドウイルス科のウイルスの特性を研究するため、及びウイルスの進化を研究するに使用される一般的な実験用ウイルスである。ＶＳＶはアルボウイルスであり、その複製は細胞質で起こる。ＶＳＶのゲノムは、５つの主要タンパク質であるＧタンパク質（Ｇ）、Ｌタンパク質（Ｌ）、リン酸化タンパク質、マトリクスタンパク質（Ｍ）及び核タンパク質をコードする１１，１６１ヌクレオチドの長さのマイナス鎖ＲＮＡの単一分子である。健常なヒト細胞では、このウイルスは繁殖することはできない（おそらく、インターフェロン応答のため）が、（インターフェロン応答が低下している）多くの癌細胞では、ＶＳＶは成長することができ、従って癌化細胞を溶解することができる。上記の「一般的な材料と実験手順」の節で詳細に記載したように、細胞生存率を決定するために、細胞変性効果（ＣＰＥ）に基づく機能的な抗ウイルスアッセイを利用する。この方法により、細胞生存及び生存率を評価し比較することが可能になる。細胞を染色することにより、健常な細胞と瀕死の細胞とで異なる細胞数、密度及び形態を比較することが可能である。

【0689】

ＶＳＶ遺伝子を標的とする効率的なｓｉＲＮＡを見出すために、ウイルス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの異なるトランスフェクションを用いた予備的な実験を実施する。ＶＳＶ誘導細胞死を阻害するｓｉＲＮＡをＧＥｉＧＳと共に使用して、ヒトＷＩＳＨ細胞をこれらのｓｉＲＮＡを発現するように編集する。ＶＳＶに感染した対照細胞は、ウイルス感染に抵抗性であると期待されるＧＥｉＧＳ細胞と比べて、クリスタルバイオレットにより測定される細胞病理効果を示すことになる。

【0690】

実施例８
アポトーシス促進性のＦＡＳ遺伝子発現のＧＥｉＧＳは、ＨＣＴ１１６細胞において５−フルオロウラシル誘導アポトーシスを低下させる
Ｐｅｄｒｏら［Ｐｅｄｒｏら Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（２００７） １７７２：４０−４７］によって、野生型ｐ５３を発現するＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸癌細胞において、ＲＮＡ干渉によるＦＡＳ発現のサイレンシングが５−ＦＵ誘導アポトーシスを緩和することが以前に示された。

【0691】

ＨＣＴ１１６細胞を、ＦＡＳ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを発現するためのＧＥｉＧＳを使用して処理する。ＨＣＴ１１６対照及びＧＥｉＧＳ陽性細胞（ＦＡＳ ｓｉＲＮＡを発現する）を、５−ＦＵ（例えば１〜８μＭ）で例えば８〜４８時間処理する。細胞生存率を、ＸＴＴ及びトリパンブルー染料排除により評価する。アポトーシスを、核の形態及びカスパーゼ３活性の変化によって評価する。５−ＦＵは、ＨＣＴ１１６細胞において細胞毒性であるが、ｓｉＲＮＡを使用してＦａｓを阻害するとき、５−ＦＵ媒介性の核断片化及びカスパーゼ３活性は著しく低下すると期待される。

【0692】

実施例９
異なる遺伝子を標的とする内在性ｍｉＲＮＡを改変した植物の生成
ｍｉＲＮＡのゲノム遺伝子座におけるその認識配列（ｍｉＲＮＡに成熟するであろう）のごくわずかな改変は、非トランスジェニック様式で、新しい遺伝子を調節する新しいシステムに導くことができる。従って、シロイヌナズナ根の衝撃によるこれらの改変を導入するために、及びさらなる解析のためのそれらの再生のために、アグロバクテリウムフリー一過性発現方法を使用した。本発明者らは、シロイヌナズナ植物において２つの遺伝子、ＰＤＳ３及びＡＤＨ１を標的とすることを選択した。

【0693】

カロチノイドは植物の多くの生理学的過程において重要な役割を果たし、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（ＰＤＳ３）はカロチノイド生合成経路における重要な酵素の１つをコードし、そのサイレンシングはアルビノ／退色表現型を生じる。従って、ＰＤＳ３の発現が減少した植物は、完全なアルビノ及び矮化症まで、減少したクロロフィルレベルを示す。

【0694】

アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１）は、アルコールとアルデヒド又はケトンとの間の相互変換を触媒し、同時にＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を還元するデヒドロゲナーゼ酵素の群を含む。この酵素の主な代謝目的は、組織内のアルコール性毒性物質の分解である。ＡＤＨ１発現の減少を有する植物は、アリルアルコールに対する耐容性の増加を示す。従って、減少したＡＤＨ１を有する植物はアリルアルコールの毒性効果に対して抵抗性であり、従って、それらの再生をアリルアルコール選択を用いて行った。

【0695】

２つの十分に確立されたｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１７３及びｍｉＲ−３９０が改変されるように選択され、これらは、以前に、植物の発育全体を通して発現されることが示された［Ｚｉｅｌｅｚｉｎｓｋｉ Ａら、ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１５）１５：１４４］。改変を導入するために、２成分系を使用した。まず、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９システムを用いて、ｍｉＲ−１７３及びｍｉＲ−３９０遺伝子座において、設計された特定のガイドＲＮＡ（上述の表２）を介して切断を生成し、その部位における相同的ＤＮＡ修復（ＨＤＲ）を促進した。第二に、新たに割り当てられた遺伝子を標的とするためのｍｉＲＮＡ配列の所望の改変を伴うＡドナー（ＤＯＮＯＲ）配列を、ＨＤＲの鋳型として導入した（上記表２）。さらに、ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）の一次転写産物の二次構造は、成熟ｍｉＲＮＡの正確な生合成及び活性に重要であるので、さらなる改変をｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの相補鎖に導入し、構造保存のためにｍＦＯＬＤ（ｗｗｗ（ｄｏｔ）ｕｎａｆｏｌｄ（ｄｏｔ）ｒｎａ（ｄｏｔ）Ａｌｂａｎｙ（ｄｏｔ）ｅｄｕ）において分析した（データは示さず）。全体として、ｍｉＲＮＡ遺伝子座ごとに２つのガイドを設計し、各遺伝子ごとに２つの異なるドナー配列（改変ｍｉＲＮＡ配列）を設計した（上述の表２）。

【0696】

実施例１０
衝撃及び植物再生
ＧＥｉＧＳ構築物を、（上記の材料と実験手順の節で詳細に議論したように）予め調製された根に衝撃し、そして再生した。ＰＤＳ３形質転換体については退色表現型を介して、ＡＤＨ１形質転換体についてはアリルアルコール処理での生存を介して植物を選択した。ＳｗａｐをＳｗａｐなし、すなわち保持された野生型と比較して検証するために、これらの植物を、改変領域にわたる特異的プライマーを介した挿入について続いてスクリーニングし、続いて制限消化した（図１３）。

【0697】

実施例１１
表現型選択の遺伝子型検証
前述したように、よく知られた表現型形質であるフィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ３）とアルコールデサチュラーゼ（ＡＤＨ１）を標的として、遺伝子編集システムの概念実証（ＰＯＣ）が確立された。

【0698】

上記のように、減少したＡＤＨ１発現を有する植物は、アリルアルコールに対する耐容性の増加を示す。従って、ＡＤＨ１を標的とする改変ｍｉＲＮＡのための衝撃植物を、３０ｍＭアリルアルコールを含有する培地中で再生し、対照植物の再生速度と比較した。１１８のＧＥｉＧＳ＃３＋ＳＷＡＰ１１アリルアルコール選択植物は、アリルアルコール培地上で５１の対照植物と比較して生存した（データは示さず）。選択されたＧＥｉＧＳ＃３＋ＳＷＡＰ１１のうち、５つがドナーを保有することが示された（データは示さず）。ドナー処理植物において再生する大量の植物は、衝撃プロセスの間の一過性発現にも起因し得る。

【0699】

従って、退色表現型（図１６）及びアリルアルコール選択（図１７）によるＰＤＳ３及びＡＤＨ１の選択は、それぞれ、遺伝子型決定のための形質転換小植物選択のための理想的な手段を与える。

【0700】

４ｋｂのスワップ領域を、主に、内部プライマー及び制限酵素消化のバリエーションを介する挿入に対する元の野生型の特異的アンプリコン分化を通して評価した。

【0701】

ＡＤＨ１（図１４）は、ドナープラスミド 制限及びドナープラスミド 非制限と比較した場合、予想されるドナー存在制限パターンを有するアリルアルコール選択植物の比較遺伝子型を示した。ＰＤＳ３（図１３）は、ドナープラスミド 制限及びドナープラスミド 非制限のものと比較した、ドナーを伴う及び伴わない衝撃試料表現型と、それらのそれぞれの異なる制限酵素消化パターンとの比較を示した。これらの結果は、ＰＤＳ３アルビノ／退色表現型と予想される制限パターンとの明確な関連を提供した。そのあとで、特定の内部、すなわちＳｗａｐ（スワップ）領域内のプライマーと、交換（スワッピング）で導入するべきゲノム領域の外部にあってそれに特異的な外部プライマーとを組み合わせて、外部ＰＣＲを実施した（データは示さず）。ヘテロ接合性、ホモ接合性、又はドナーＳｗａｐの存在を評価するために、ＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒ配列決定によって、Ｓｗａｐのさらなる検証を得た（データは示さず）。

【0702】

実施例１２
改変されたｍｉＲＮＡはその新しい標的遺伝子の発現を低下させる
ＧＥｉＧＳ系における改変ｍｉＲＮＡが新たに指定された標的の発現を下方制御する可能性を検証するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的リアルタイムＰＣＲ）を用いて遺伝子発現解析を行った。陽性に特定された再生植物からＲＮＡを抽出し、逆転写し、再生植物と比較し、並行して処理したが、関連する改変構築物は導入されなかった。ｍｉＲ−１７３をＰＤＳ３を標的とするように改変した場合（ＧＥｉＧＳ＃４＋ＳＷＡＰ４）では、遺伝子発現量の平均８３％の低下が認められた（図１５）。ＡＤＨ１を標的とするように改変されたｍｉＲ−３９０（ＧＥｉＧＳ＃３＋ＳＷＡＰ１１）を有する植物では、同様の遺伝子発現の変化が観察され、対照植物のレベルの８２％であった（図１６）。まとめると、これらの結果は、内在遺伝子座におけるｍｉＲＮＡ転写産物中の標的認識配列を置換することにより、内在ｍｉＲＮＡを改変して新たな遺伝子をうまく標的とし、その発現を低下させる遺伝子編集法を実証する。

【0703】

本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、多くの代替、修正、及び変形が当業者には明らかであろうことは明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び広い範囲内にある、そのような代替、修正、及びバリエーションのすべてを包含することが意図される。

【0704】

本明細書において言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照により本明細書に援用されるように具体的かつ個別に示されたかのように、その全体が本明細書に援用される。さらに、本出願における任意の参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを容認するものとして解釈されるべきではない。節の見出しが使用される限り、それらは必ずしも限定するものと解釈されるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図12E】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2020534826000001.app

【国際調査報告】