特表2020-536554 | 知財ポータル「IP Force」

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特表2020-536554細胞集団を増大させるための方法および組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-536554(P2020-536554A)

(43)【公表日】2020年12月17日

(54)【発明の名称】細胞集団を増大させるための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

C12N 5/0789 20100101AFI20201120BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20201120BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20201120BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20201120BHJP

A61P 35/02 20060101ALI20201120BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20201120BHJP

A61L 27/36 20060101ALI20201120BHJP

A61L 27/38 20060101ALI20201120BHJP

A61K 35/28 20150101ALI20201120BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20201120BHJP

C12N 5/0775 20100101ALI20201120BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20201120BHJP

C12N 15/113 20100101ALN20201120BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0789

A61K35/17 Z

A61P7/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 111

A61L27/36 300

A61L27/36 410

A61L27/36 430

A61L27/38 100

A61L27/38 300

A61K35/28

C12N5/0783

C12N5/0775

C12N5/10

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】210

(21)【出願番号】特願2020-520317(P2020-520317)

(86)(22)【出願日】2018年10月9日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月8日

(86)【国際出願番号】US2018055092

(87)【国際公開番号】WO2019074980

(87)【国際公開日】20190418

(31)【優先権主張番号】62/570,076

(32)【優先日】2017年10月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/695,820

(32)【優先日】2018年7月9日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】508297654

【氏名又は名称】ストワーズインスティテュートフォーメディカルリサーチ

(71)【出願人】

【識別番号】399019892

【氏名又は名称】ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＨＩＣＡＧＯ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジェンルイ

(72)【発明者】

【氏名】チアン，ペンシュウ

(72)【発明者】

【氏名】リー，リンヘン

(72)【発明者】

【氏名】ヘ，チュアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C081

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA44

4C081AB11

4C081BA12

4C081CD34

4C081EA02

4C081EA13

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZA51

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC41

(57)【要約】

本発明は、幹細胞集団ならびに他の細胞集団を増大させるための方法に関する。より詳細には、本発明は、とりわけ、幹細胞および／または他の細胞集団、特に、造血幹細胞集団を増大させるための方法および組成物に関する。本開示の一実施形態では、幹細胞の集団を増大させるための方法であって、幹細胞の集団を末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から得る方法が提供される。当該方法は、幹細胞の数が増大するように幹細胞の集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から得た幹細胞の集団を増大させるための方法であって、幹細胞の数が増大するように前記幹細胞の集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項2】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞に前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらす変異を導入すること、または、前記幹細胞を、小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せからなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーターと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項４に記載の方法。

【請求項11】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞を、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項13】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項14】

前記ｓｈＲＮＡが、前記幹細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することが、前記幹細胞を、以下：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、

ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２
からなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項19】

前記幹細胞の増大が、少なくとも２倍である、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記幹細胞の増大が、少なくとも４倍である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記幹細胞の増大が、少なくとも５倍である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記幹細胞の増大が、少なくとも８倍である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記幹細胞の増大が、少なくとも１０倍である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記幹細胞がＨＳＣである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

増大した前記細胞が、総コロニー形成単位（ＣＦＵ）の少なくとも５倍の増加を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

増大した前記細胞が、ＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）コロニーの少なくとも３．８倍の増加を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

実質的に未分化の幹細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、前記未分化の幹細胞集団において、前記幹細胞集団の著しい分化を伴わずに未分化の幹細胞の数が増大するようにＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項29】

末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得た造血幹細胞（ＨＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、前記ＨＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら前記ＨＳＣ集団が十分な数量まで増大するように前記ＨＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項30】

前記被験体が、ヒトである、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

【請求項32】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞を、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項42】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項43】

前記ｓｈＲＮＡが、前記幹細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項45】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

【請求項48】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項49】

前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織から得る、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記幹細胞の数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍および少なくとも１０倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項３１に記載の方法。

【請求項52】

請求項２８に記載のプロセスによって作製される増大した実質的に未分化の幹細胞集団。

【請求項53】

請求項２９に記載のプロセスによって作製される増大したＨＳＣ集団。

【請求項54】

造血幹細胞（ＨＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍に増大させるための方法であって、増大した前記ＨＳＣが、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにＨＳＣ系列を再構成する能力を有し、前記方法が、前記幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、前記ＨＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法。

【請求項55】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織から得る、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項５４に記載の方法。

【請求項58】

前記変異を、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に前記幹細胞を曝露させることによって導入する、請求項５４に記載の方法。

【請求項59】

前記変異が、前記幹細胞にｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるものである、請求項５４に記載の方法。

【請求項60】

前記ＨＳＣの数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍および少なくとも１０倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項５４に記載の方法。

【請求項61】

造血幹細胞集団（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、前記ＨＳＣ集団に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項62】

前記ＨＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＨＳＣ集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含む、請求項６１に記載のキット。

【請求項63】

前記ＨＳＣ集団に変異を導入するための系が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む、請求項６２に記載のキット。

【請求項64】

前記ＨＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＨＳＣ集団にｓｈＲＮＡを組み込むレンチウイルスを送達してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるための試薬を含む、請求項６２に記載のキット。

【請求項65】

造血幹細胞集団（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項66】

造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で前記試料中のＨＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＨＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項67】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらすものである、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡの前記ＨＳＣ集団への組込みをもたらすものである、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＨＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＨＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項71】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤が、Ｙｔｈｆｄ２を阻害するものである、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

前記被験体が、ヒトである、請求項７０に記載の方法。

【請求項74】

骨髄の再構成を必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、
（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で前記試料中のＨＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＨＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項75】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

骨髄の再構成を必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、
（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＨＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＨＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項77】

前記ＨＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

造血細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、前記ＨＳＣの集団を前記ＨＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大した前記ＨＳＣの集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法。

【請求項79】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項７９に記載の方法。

【請求項81】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記ヒトが、骨髄移植、末梢血移植、および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要としている、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

骨髄移植、末梢血移植および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項７８に記載の方法によって得たＨＳＣの集団を投与するステップを含む方法。

【請求項86】

造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料由来の前記ＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＨＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、
（ｉｉ）増大した前記ＨＳＣ集団が、総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップと
を含む方法。

【請求項87】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項８６に記載の方法。

【請求項92】

前記ヒトが、骨髄移植を必要としている、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

造血幹細胞系列の再構成を必要とする被験体において造血幹細胞系列を再構成するための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料由来の前記ＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＨＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、
（ｉｉ）増大した前記ＨＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップと、
（ｃ）増大した前記ＨＳＣ集団をそれを必要とする被験体に移植するステップと
を含む方法。

【請求項95】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項９４に記載の方法。

【請求項100】

前記ヒトが、骨髄移植を必要としている、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記試料が、自己供給源または同種異系供給源に由来するものである、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記試料が、自己供給源に由来するものである、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

造血幹細胞集団の増大を必要とする哺乳動物において造血幹細胞集団を増大させるための方法であって、前記哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、前記哺乳動物において造血系列を再構成する能力を有するＨＳＣを含む前記ＨＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法。

【請求項105】

前記モジュレーターが、前記ＨＳＣ集団にＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記モジュレーターが、前記ＨＳＣ集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記モジュレーターが、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を含む、請求項１０４に記載の方法。

【請求項108】

前記モジュレーターが、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤を含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項110】

実質的に未分化の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、ＭＳＣの著しい分化を伴わずに未分化のＭＳＣの数が増大するように前記未分化のＭＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項111】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣを含む、請求項１１１に記載の方法。

【請求項113】

末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得た間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、前記ＭＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら、前記ＭＳＣ集団が十分な数量まで増大するように前記ＭＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項114】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣを含む、請求項１１３に記載の方法。

【請求項116】

前記被験体が、ヒトである、請求項１１３に記載の方法。

【請求項117】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＭＳＣに前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらす変異を導入すること、または、前記幹細胞を、小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せからなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーターと接触させることを含む、請求項１１０または１１３に記載の方法。

【請求項118】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１１８に記載の方法。

【請求項120】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１２１に記載の方法。

【請求項123】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項124】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１１９に記載の方法。

【請求項126】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＭＳＣを、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項128】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＭＳＣにｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項129】

前記ｓｈＲＮＡが、前記幹細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項１１９に記載の方法。

【請求項131】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項１３１に記載の方法。

【請求項133】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することが、前記ＭＳＣを、以下：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、

ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２
からなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と接触させることを含む、請求項１３０に記載の方法。

【請求項134】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織から得る、請求項１１３に記載の方法。

【請求項135】

前記幹細胞の数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍および少なくとも８倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

請求項１１０に記載のプロセスによって作製される増大した実質的に未分化の間葉細胞集団。

【請求項137】

請求項１１３に記載のプロセスによって作製される増大したＭＳＣ集団。

【請求項138】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍増大させるための方法であって、増大した前記ＭＳＣが、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにＭＳＣ系列を再構成する能力を有し、前記方法が、前記幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、前記ＨＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法。

【請求項139】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１３８に記載の方法。

【請求項140】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織から得る、請求項１３８に記載の方法。

【請求項141】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１３８に記載の方法。

【請求項142】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項１３８に記載の方法。

【請求項143】

前記変異を、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に前記ＭＳＣを曝露させることによって導入する、請求項１３８に記載の方法。

【請求項144】

前記変異が、前記ＭＳＣにｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるものである、請求項１３８に記載の方法。

【請求項145】

前記ＭＳＣの数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍および少なくとも８倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項１３８に記載の方法。

【請求項146】

間葉系幹細胞集団（ＭＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、前記ＭＳＣ集団にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項147】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１４６に記載のキット。

【請求項148】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＭＳＣ集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含む、請求項１４６に記載のキット。

【請求項149】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む、請求項１４６に記載のキット。

【請求項150】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＨＳＣ集団にｓｈＲＮＡを組み込むレンチウイルスを送達してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるための試薬を含む、請求項１４６に記載のキット。

【請求項151】

間葉系幹細胞集団（ＭＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項152】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１５１に記載のキット。

【請求項153】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で、前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項154】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１５３に記載の方法。

【請求項155】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１５３に記載の方法。

【請求項156】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらすものである、請求項１５３に記載の方法。

【請求項157】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡの前記ＨＳＣ集団への組込みをもたらすものである、請求項１５３に記載の方法。

【請求項159】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項160】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１５９に記載の方法。

【請求項161】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１５９に記載の方法。

【請求項162】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤が、Ｙｔｈｆｄ２を阻害するものである、請求項１５９に記載の方法。

【請求項163】

前記被験体が、ヒトである、請求項１５９に記載の方法。

【請求項164】

骨髄の再構成を必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、
（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で、前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項165】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１６４に記載の方法。

【請求項167】

骨髄の再構成を必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、
（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項168】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１６７に記載の方法。

【請求項169】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１６７に記載の方法。

【請求項170】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、前記ＭＳＣの集団を、前記ＭＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大した前記ＭＳＣの集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法。

【請求項171】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも２．５倍である、請求項１７０に記載の方法。

【請求項173】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３倍である、請求項１７２に記載の方法。

【請求項174】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３．５倍である、請求項１７３に記載の方法。

【請求項175】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項１７４に記載の方法。

【請求項176】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項１７５に記載の方法。

【請求項177】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１７０に記載の方法。

【請求項178】

前記ヒトが、骨髄移植、末梢血移植、および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要としている、請求項１７７に記載の方法。

【請求項179】

骨髄移植、末梢血移植および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項１７０に記載の方法によって得たＭＳＣの集団を投与するステップを含む方法。

【請求項180】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料由来の前記ＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大する、ステップとを含む方法。

【請求項181】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１８０に記載の方法。

【請求項182】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも２．５倍である、請求項１８０に記載の方法。

【請求項183】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３倍である、請求項１８２に記載の方法。

【請求項184】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３．５倍である、請求項１８３に記載の方法。

【請求項185】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項１８５に記載の方法。

【請求項187】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１８０に記載の方法。

【請求項188】

前記ヒトが、骨髄移植を必要としている、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１８０に記載の方法。

【請求項190】

間葉系幹細胞系列の再構成を必要とする被験体において間葉系幹細胞系列を再構成するための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記試料由来の前記ＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大する、ステップと、
（ｃ）増大した前記ＭＳＣ集団をそれを必要とする被験体に移植するステップと
を含む方法。

【請求項191】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項１９０に記載の方法。

【請求項192】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも２．５倍である、請求項１９０に記載の方法。

【請求項193】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３倍である、請求項１９２に記載の方法。

【請求項194】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも３．５倍である、請求項１９３に記載の方法。

【請求項195】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項１９４に記載の方法。

【請求項196】

前記ＭＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項１９５に記載の方法。

【請求項197】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１９０に記載の方法。

【請求項198】

前記ヒトが、骨髄移植を必要としている、請求項１９７に記載の方法。

【請求項199】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項１９０に記載の方法。

【請求項200】

前記試料が、自己供給源または同種異系供給源に由来するものである、請求項１９９に記載の方法。

【請求項201】

前記試料が、自己供給源に由来するものである、請求項１９９に記載の方法。

【請求項202】

間葉系幹細胞集団の増大を必要とする哺乳動物において間葉系幹細胞集団を増大させるための方法であって、前記哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、前記哺乳動物において間葉系系列を再構成する能力を有するＨＳＣを含む、前記ＭＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法。

【請求項203】

前記ＭＳＣ集団が、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含む、請求項２０２に記載の方法。

【請求項204】

前記モジュレーターが、前記ＭＳＣ集団に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項２０２に記載の方法。

【請求項205】

前記モジュレーターが、前記ＭＳＣ集団に、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項２０２に記載の方法。

【請求項206】

前記モジュレーターが、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を含む、請求項２０２に記載の方法。

【請求項207】

前記モジュレーターが、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤を含む、請求項２０２に記載の方法。

【請求項208】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２０２に記載の方法。

【請求項209】

生体試料から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する方法であって、ＭＳＣの集団を有する前記生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるステップを含む方法。

【請求項210】

前記生体試料が、末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織を含む、請求項２０９に記載の方法。

【請求項211】

間葉系幹細胞の数が増大するように前記ＭＳＣの集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって前記生体試料由来の前記ＭＳＣの集団を増大させるステップをさらに含む、請求項２０９に記載の方法。

【請求項212】

前記ＭＳＣの集団を、前記生体試料から単離した後に増大させる、請求項２１１に記載の方法。

【請求項213】

前記生体試料中の前記ＭＳＣの集団を、前記生体試料から前記ＭＳＣを単離する前に増大させる、請求項２１１に記載の方法。

【請求項214】

前記ＭＳＣ集団を、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、前記ＭＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら十分な数量まで増大させる、請求項２１１に記載の方法。

【請求項215】

前記被験体が、ヒトである、請求項２１４に記載の方法。

【請求項216】

【請求項217】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項２１６に記載の方法。

【請求項218】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１７に記載の方法。

【請求項219】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１８に記載の方法。

【請求項220】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１９に記載の方法。

【請求項221】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２２０に記載の方法。

【請求項222】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１８に記載の方法。

【請求項223】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１８に記載の方法。

【請求項224】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２１８に記載の方法。

【請求項225】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２２４に記載の方法。

【請求項226】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞を、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項２１１に記載の方法。

【請求項227】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記幹細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項２１１に記載の方法。

【請求項228】

前記ｓｈＲＮＡが、前記幹細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項２２７に記載の方法。

【請求項229】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項２１１に記載の方法。

【請求項230】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項２２９に記載の方法。

【請求項231】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項２３０に記載の方法。

【請求項232】

【請求項233】

請求項２０９に記載のプロセスによって作製される単離された間葉系幹細胞の集団。

【請求項234】

請求項２１１に記載のプロセスによって作製される増大した単離された間葉系幹細胞の集団。

【請求項235】

後続のそれを必要とする被験体への移植のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を単離するためのキットであって、ＭＳＣを含む生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるための系と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項236】

前記ＭＳＣ集団に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することによって前記ＭＳＣの集団を増大させるための系と、その使用に関する指示とをさらに含む、請求項２３５に記載のキット。

【請求項237】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＭＳＣ集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含む、請求項２３６に記載のキット。

【請求項238】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む、請求項２３７に記載のキット。

【請求項239】

前記ＭＳＣ集団に変異を導入するための系が、前記ＭＳＣ集団にｓｈＲＮＡを組み込むレンチウイルスを送達してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるための試薬を含む、請求項２３７に記載のキット。

【請求項240】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＭＳＣの集団を含む生体試料からＭＳＣを、前記生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、
（ｂ）単離された前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項241】

前記ＭＳＣ集団を含有する前記生体試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、前記生体試料を適切な培養培地中で前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップとをさらに含む、請求項２４０に記載の方法。

【請求項242】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織を含む生体試料から得る、請求項２４０に記載の方法。

【請求項243】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらすものである、請求項２４１に記載の方法。

【請求項244】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡの前記ＨＳＣ集団への組込みをもたらすものである、請求項２４１に記載の方法。

【請求項245】

骨髄の再構成を必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、
（ａ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を含む生体試料からＭＳＣを、前記生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、
（ｂ）単離された前記ＭＳＣを前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項246】

前記ＭＳＣ集団を含有する前記生体試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、前記試料を適切な培養培地中で、前記試料中のＭＳＣの数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップとをさらに含む、請求項２４５に記載の方法。

【請求項247】

前記ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織を含む生体試料から得る、請求項２４５に記載の方法。

【請求項248】

骨髄移植、末梢血移植および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項２０９に記載の方法によって得た単離されたＭＳＣの集団を投与するステップを含む方法。

【請求項249】

前記試料が、自己供給源または同種異系供給源に由来するものである、請求項２４８に記載の方法。

【請求項250】

前記試料が、自己供給源に由来するものである、請求項２４９に記載の方法。

【請求項251】

末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって調製されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法であって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の数が増大するように前記ＣＡＲＴ細胞の集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項252】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞に前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらす変異を導入すること、または、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を、小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せからなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーターと接触させることを含む、請求項２５１に記載の方法。

【請求項253】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項２５２に記載の方法。

【請求項254】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５３に記載の方法。

【請求項255】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５４に記載の方法。

【請求項256】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５５に記載の方法。

【請求項257】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５６に記載の方法。

【請求項258】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５４に記載の方法。

【請求項259】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５８に記載の方法。

【請求項260】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２５４に記載の方法。

【請求項261】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２６０に記載の方法。

【請求項262】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項２５３に記載の方法。

【請求項263】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項２５３に記載の方法。

【請求項264】

前記ｓｈＲＮＡが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項２６３に記載の方法。

【請求項265】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項２５１に記載の方法。

【請求項266】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項２６５に記載の方法。

【請求項267】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項２６６に記載の方法。

【請求項268】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を、以下：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３

１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２
からなる群より選択される前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と接触させることを含む、請求項２６５に記載の方法。

【請求項269】

前記ＣＡＲＴ細胞の増大が、少なくとも２倍である、請求項２５１に記載の方法。

【請求項270】

前記ＣＡＲＴ細胞の増大が、少なくとも４倍である、請求項２６９に記載の方法。

【請求項271】

前記ＣＡＲＴ細胞の増大が、少なくとも５倍である、請求項２７０に記載の方法。

【請求項272】

前記ＣＡＲＴ細胞の増大が、少なくとも８倍である、請求項２７１に記載の方法。

【請求項273】

前記ＣＡＲＴ細胞の増大が、少なくとも１０倍である、請求項２７２に記載の方法。

【請求項274】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、ＣＡＲＴ細胞の数が増大するように前記ＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項275】

末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって調製されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、前記ＣＡＲＴ細胞集団が、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、十分な数量まで増大するように前記ＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法。

【請求項276】

前記被験体が、ヒトである、請求項２７５に記載の方法。

【請求項277】

前記被験体が、がんに罹患している、請求項２７５に記載の方法。

【請求項278】

前記被験体が、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される血液がんに罹患している、請求項２７５に記載の方法。

【請求項279】

【請求項280】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞に変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む、請求項２７９に記載の方法。

【請求項281】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８０に記載の方法。

【請求項282】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８１に記載の方法。

【請求項283】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８２に記載の方法。

【請求項284】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８３に記載の方法。

【請求項285】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８０に記載の方法。

【請求項286】

前記変異が、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８５に記載の方法。

【請求項287】

前記変異が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８０に記載の方法。

【請求項288】

前記変異が、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２８０に記載の方法。

【請求項289】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を、前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることを含む、請求項２７９に記載の方法。

【請求項290】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入して前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む、請求項２７９に記載の方法。

【請求項291】

前記ｓｈＲＮＡが、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞をレンチウイルスに曝露させて前記ｓｈＲＮＡを送達することによって導入される、請求項２９０に記載の方法。

【請求項292】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップが、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む、請求項２７５に記載の方法。

【請求項293】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される、請求項２９２に記載の方法。

【請求項294】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーが、Ｙｔｈｄｆ２を含む、請求項２９３に記載の方法。

【請求項295】

【請求項296】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織から得たＴ細胞を改変することによって調製する、請求項２７４に記載の方法。

【請求項297】

前記ＣＡＲＴ細胞の数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍および少なくとも１０倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項２７９に記載の方法。

【請求項298】

請求項２７４に記載のプロセスによって作製される増大したＣＡＲＴ細胞集団。

【請求項299】

請求項２７５に記載のプロセスによって作製される増大したＣＡＲＴ細胞集団。

【請求項291】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、増大した前記ＣＡＲＴ細胞が、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにがんおよび／または血液障害を処置する能力を有し、前記方法が、前記ＣＡＲＴ細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、前記ＣＡＲＴ細胞の集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法。

【請求項292】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される哺乳動物組織由来のＴ細胞を改変することによって得る、請求項２９１に記載の方法。

【請求項293】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２９１に記載の方法。

【請求項294】

前記哺乳動物が、がんに罹患している、請求項２９１に記載の方法。

【請求項295】

前記がんが、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される血液がんを含む、請求項２９４に記載の方法。

【請求項296】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させるものである、請求項２９１に記載の方法。

【請求項297】

前記変異を、前記ＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることによって導入する、請求項２９１に記載の方法。

【請求項298】

前記変異が、前記幹細胞にｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるものである、請求項２９６に記載の方法。

【請求項299】

前記ＣＡＲＴ細胞の数の増大が、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍および少なくとも１０倍からなる群より選択される倍数での増大である、請求項２９１に記載の方法。

【請求項300】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、前記ＣＡＲＴ細胞集団にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項301】

前記ＣＡＲ−Ｔ細胞集団に変異を導入するための系が、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含む、請求項３００に記載のキット。

【請求項302】

前記ＣＡＲ−Ｔ細胞集団に変異を導入するための系が、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む、請求項３０１に記載のキット。

【請求項303】

前記ＣＡＲ−Ｔ細胞集団に変異を導入するための系が、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞集団にｓｈＲＮＡを組み込むレンチウイルスを送達してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるための試薬を含む、請求項３０１に記載のキット。

【請求項304】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含むキット。

【請求項305】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で前記試料中のＣＡＲＴ細胞の数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＣＡＲＴ細胞を前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項306】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって得る、請求項３０５に記載の方法。

【請求項307】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらすものである、請求項３０５に記載の方法。

【請求項308】

前記変異が、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡの前記ＣＡＲＴ細胞集団への組込みをもたらすものである、請求項３０５に記載の方法。

【請求項309】

ＣＡＲＴ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、
（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＣＡＲＴ細胞の数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＣＡＲＴ細胞を前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項310】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項３０９に記載の方法。

【請求項311】

前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤が、Ｙｔｈｆｄ２を阻害するものである、請求項３０９に記載の方法。

【請求項312】

前記被験体が、ヒトである、請求項３０９に記載の方法。

【請求項313】

がんおよび／または血液障害の処置を必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための方法であって、
（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、
（ｂ）前記試料を適切な培養培地中で前記試料中のＣＡＲＴ細胞の数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｃ）前記ＣＡＲＴ細胞を前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項314】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって得る、請求項３１３に記載の方法。

【請求項315】

前記被験体が、がんに罹患している、請求項３１３に記載の方法。

【請求項316】

前記被験体が、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される血液がんに罹患している、請求項３１５に記載の方法。

【請求項371】

がんおよび／または血液障害の処置を必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための方法であって、
（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、前記試料中のＣＡＲＴ細胞の数を前記被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、
（ｂ）培養物から前記ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、
（ｃ）前記ＣＡＲＴ細胞を前記被験体に投与するステップと
を含む方法。

【請求項372】

前記ＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって得る、請求項３７１に記載の方法。

【請求項373】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法であって、前記ＣＡＲＴ細胞の集団を、前記ＣＡＲＴ細胞集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大した前記ＣＡＲＴ細胞の集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法。

【請求項374】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項３７３に記載の方法。

【請求項375】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項３７４に記載の方法。

【請求項376】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項３７５に記載の方法。

【請求項377】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項３７６に記載の方法。

【請求項378】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３７７に記載の方法。

【請求項379】

前記ヒトが、がんおよび／または血液障害に罹患している、請求項３７８に記載の方法。

【請求項380】

がんおよび／または血液障害に罹患している被験体を処置するための方法であって、前記被験体に、請求項３７３に記載の方法によって得たＣＡＲＴ細胞の集団を投与するステップを含む方法。

【請求項381】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団をもたらすステップと、
（ｃ）前記試料由来の前記ＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも２倍増大する、ステップと
を含む方法。

【請求項382】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項３８１に記載の方法。

【請求項383】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項３８２に記載の方法。

【請求項384】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項３８３に記載の方法。

【請求項385】

前記ＣＡＲＴ細胞集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項３８４に記載の方法。

【請求項386】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３８１に記載の方法。

【請求項387】

前記ヒトが、がんおよび／または血液障害に罹患している、請求項３８６に記載の方法。

【請求項388】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項３８７に記載の方法。

【請求項389】

がんおよび／または血液障害に罹患している被験体を処置するための方法であって、
（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団を形成するステップと、
（ｃ）前記試料由来の前記ＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、
（ｉ）前記ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも２倍増大する、ステップと、
（ｄ）増大した前記ＣＡＲＴ細胞集団を前記被験体に移植するステップと
を含む方法。

【請求項390】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも４倍である、請求項３８９に記載の方法。

【請求項391】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも５倍である、請求項３９０に記載の方法。

【請求項392】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも８倍である、請求項３９１に記載の方法。

【請求項393】

前記ＨＳＣ集団の増大が、少なくとも１０倍である、請求項３９２に記載の方法。

【請求項394】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３８９に記載の方法。

【請求項395】

前記ヒトが、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される少なくとも１種のがんに罹患している、請求項３９４に記載の方法。

【請求項396】

前記組織試料を、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得る、請求項３９４に記載の方法。

【請求項397】

前記試料が、自己供給源または同種異系供給源に由来するものである、請求項３９６に記載の方法。

【請求項398】

前記試料が、自己供給源に由来するものである、請求項３９７に記載の方法。

【請求項399】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団の増大を必要とする哺乳動物においてＣＡＲＴ細胞集団を増大させるための方法であって、前記哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、前記哺乳動物におけるがんおよび／または血液障害を処置する能力を有するＣＡＲＴ細胞を含む、前記ＣＡＲＴ細胞集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法。

【請求項400】

前記モジュレーターが、前記ＣＡＲＴ細胞集団にＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項３９９に記載の方法。

【請求項401】

前記モジュレーターが、前記ＣＡＲＴ細胞集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる変異を導入するための系を含む、請求項４００に記載の方法。

【請求項402】

前記モジュレーターが、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を含む、請求項３９９に記載の方法。

【請求項403】

前記モジュレーターが、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤を含む、請求項４０２に記載の方法。

【請求項404】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項４０３に記載の方法。

【請求項405】

血液障害に罹患している被験体を処置する方法であって、
（ａ）末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から、幹細胞およびＴ細胞からなる群より選択される細胞の集団を得るステップと、
（ｂ）必要に応じて、前記細胞の集団がＴ細胞を含む場合に前記Ｔ細胞をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて改変してＣＡＲＴ細胞をもたらすステップと、
（ｃ）前記細胞におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって前記細胞の集団を増大させて、細胞の数を増大させるステップと、
（ｄ）増大した前記細胞を前記被験体に移植して前記血液障害を処置するステップと
を含む方法。

【請求項406】

前記血液障害が、白血病を含む、請求項４０５に記載の方法。

【請求項407】

前記細胞の集団が、ＨＳＣおよびＭＳＣからなる群より選択される細胞を含む、請求項４０５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、ＰＣＴ出願として出願され、どちらもこれによってそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１０月９日出願の米国特許出願第６２／５７０，０７６号、ならびに２０１８年７月９日出願の米国特許出願第６２／６９５，８２０号に対する優先権の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、細胞集団、特に造血幹細胞集団などの幹細胞集団を増大させるための方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

造血幹細胞（ＨＳＣ）は、自己複製（増大）および全ての型の成熟血液細胞を生じさせる多系列潜在性の両方の性質を有するクローン原性細胞である。ＨＳＣは、造血に関与し、増殖および分化を受けて種々の系列の成熟血液細胞を生じさせる一方で、自己複製する能力を依然として維持する。自己複製する能力により、動物の生涯にわたってＨＳＣ集団を維持することが可能になり、また、致死的に照射を受けた類遺伝子性宿主の骨髄にＨＳＣを再配置させることも可能になる。

【0004】

初期のＨＳＣ発生は、広範囲にわたる自己複製能を有する長期（ＬＴ−）ＨＳＣから始まり、その後に、短期（ＳＴ−）ＨＳＣ（限定された自己複製能力を有する）および増殖性多分化能前駆細胞（ＭＰＰ）（多分化能潜在性を有するが自己複製能は有さない）に対応する増大状態が続く、階層的配列を示す。ＭＰＰはまた、分化のための刺激または準備の段階でもある。ＭＰＰは、分化して、リンパ系列の全てを生じさせる共通のリンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）、または骨髄系列の全てを生じさせる共通の骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）のいずれかになるよう拘束される。このプロセスの間、より原始的な集団からより原始的でない細胞の集団が生じ、より原始的でない細胞の集団からより原始的な細胞の集団を生じさせることはできない。ＨＳＣの多分化能、自己複製、および活性化（または一過性増幅）、ならびにＭＰＰからＣＬＰまたはＣＭＰへの系列拘束（ｌｉｎｅａｇｅｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）を含めたこれらのプロセスを調節する内因性遺伝プログラムは依然としてほとんど分かっていない。

【0005】

個体の生存期間にわたって血液細胞の一定の生成を持続させるために、骨髄ニッチに位置するＨＳＣは（Zhang, J. et al. Nature 425, 836-841, 2003； Calvi, L. M. et al.Nature 425, 841-846, 2003； Kiel, M. J., et al. Cell 121, 1109-1121, 2005； Arai,F. et al. Cell 118, 149-161, 2004）、造血の即時の要求が満たされる一方で、長期間にわたる幹細胞の維持も保証されるように、静止状態と活性化の平衡を達成しなければならない。成体において、幹細胞の静止した状態と活性化した状態の恒常性は、ＨＳＣが自己複製の潜在性を失うことから保護し、同時に、進行中の組織再生を支持するために重要である（Li,L. and Xie, T. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21, 605-631, 2005）。幹細胞の過剰活性化および増大には、幹細胞集団の最終的な枯渇および腫瘍形成の素因の両方のリスクがある。幹細胞活性化に重要ないくつかの因子が同定されているが（Heissig,B. et al. Cell 109, 625-637, 2002）、静止状態と活性化の間の移行を支配する分子事象は十分には理解されていない。

【0006】

ＨＳＣは、恒常性およびストレス条件下での生涯造血に関与し、これは、幹細胞の自己複製と分化の絶妙な平衡に依拠する（Li et al. Science, 327: 542-545, 2010； Weissman et al. Cell, 100:157-168, 2000）。したがって、ＨＳＣ移植は、血液疾患、免疫疾患、および遺伝子疾患、ならびにがんを含めた様々な障害に対する救命治療である（Walaseket al. Annals of the New York Academy of Sciences 1266: 138-150, 2012）。しかし、ＨＳＣに基づく処置は、主にＨＬＡ適合ドナー骨髄（ＢＭ）の欠如によって限定される可能性がある。同種異系移植により、代替の手法がもたらされるが、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が生涯の難題のままであり、これは、免疫抑制薬の服用には免疫学的回復の遅延、血栓性微小血管症などの多数の副作用があるからである（Sunget al. Stem Cells Translational Medicine, 2: 25-32 (2013)；Shlomchik et al.Nature Reviews. Immunology, 7: 340-352, 2007）。ｈＵＣＢ由来のＨＳＣの移植により、ＧｖＨＤのリスクが低下するが、ｈＵＣＢにおけるＨＳＣの数がＢＭまたは動員された末梢血よりも少ないことにより、その適用が限定される（Walaseket al. Annals of the New York Academy of Sciences, 1266: 138-150, 2012）。ｈＵＣＢＨＳＣ増大のために単一分子または経路の標的化が研究されてきた（Huanget al. Leukemia, 30: 144-153, 2016； Boitano et al. Science, 329: 1345-1348,2010； Fares et al. Science, 345; 1509-1512, 2014； Ansellem et al. NatureMedicine, 9: 1423-1427, 2003； Antonchuk et al. Cell, 109: 39-45, 2002； Rentaset al. Nature, 532: 508-511, 2016； Himburg et al. Nature Medicine, 16: 475-482,2010； North et al. Nature, 447: 1007-1011, 2007； Guo et al. Nature Medicine,2018）； Varnum-Finney et al. Nature Medicine, 6: 1278-1281, 2000；およびChou et al.Experimental Hematology, 41: 479-490 e474, 2013）。しかし、幹細胞の分化よりも自己複製を比較的有利にするために他の手法が探求されている（Zhaoet al. Molecular Cell Biology, 18: 31-42, 2017）。

【0007】

ｍ^６Ａは、マークの「ライター（ｗｒｉｔｅｒ）」、「イレイサー（ｅｒａｓｅｒ）」および「リーダー（ｒｅａｄｅｒ）」によってモジュレートされるＲＮＡプロセシング、局在化、翻訳、および最終的な減衰をモジュレートすることによって遺伝子発現の転帰を制御する、広く行きわたっているｍＲＮＡの内部修飾である（Roundtree et al. Cell, 169: 1187-1200, 2017； Li et al. Annual Reviewof Genomics and Human Genetics, 15: 127-150, 2014）。最近の研究により、胚形成の間の幹細胞の運命決定および内皮造血転換におけるｍ^６Ａ修飾の役割（Batistaet al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014； Geula et al. Science, 347: 1002-1006,2015； Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al. Nature, 549: 273-276, 2017； Zhao etal. Nature, 542: 475-478, 2017）ならびに白血病発症におけるｍ^６Ａ修飾の役割（Li et al.Cancer Cell, 31: 127-141, 2017； Vu et al. Nature Medicine, 2017; Barbieri etal. Nature, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199, 2018）が解明された。興味深いことに、ｍ^６Ａライター複合体であるＭｅｔｔｌ３およびＭｅｔｔｌ１４の欠損により、異なる型の幹細胞では別個の転帰が導かれる。例えば、Ｍｅｔｔｌ３またはＭｅｔｔｌ１４ＫＯにより、ＨＳＣでは分化が促進されるが（Vuet al. Nature Medicine, 2017; Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205 e199,2018； Barbieri et al. Nature, 2017）、一方、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）および胚神経幹細胞（ＮＳＣ）では幹細胞の自己複製および維持が増強される（Batistaet al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014； Yoon et al. Cell, 2017）。加えて、幹細胞および白血病におけるｍ^６Ａの生理機能は、異なる機構を通じて媒介される。幹細胞では、ｍ^６Ａ修飾により、幹細胞の運命決定因子をコードするｍＲＮＡのｍ^６Ａ媒介性減衰によって幹細胞の運命決定が制御されるが（Batistaet al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014； Yoon et al. Cell, 2017）、一方、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）では、ｍ^６Ａ修飾により癌遺伝子のｍＲＮＡが安定化され、かつ／またはそれらの翻訳が増大するので、Ｍｅｔｔｌ３およびＭｅｔｔｌ１４により白血病誘発が促進される（Vuet al. Nature Medicine, 2017; Barbieri et al. Nature, 2017; Weng et al. CellStem Cell, 22: 191-205 e199, 2018）。さらに、以前の研究により、ＦＴＯおよびＭｅｔｔｌ１４の白血病誘発機能がＹＴＨＤＦリーダータンパク質とは無関係であることが報告された（Liet al. Cancer Cell, 31: 127-141, 2017； Weng et al. Cell Stem Cell, 22: 191-205e199, 2018）。

【0008】

ｍ^６ＡＲＮＡ修飾は、マークの「ライター」、「イレイサー」および「リーダー」によってモジュレートされるので（Wang et al. Nature, 505 (7481): 117-120, 2014）、このマークおよび他のマークを組み入れる、認識する、および取り除くプロセスには、細胞、発生、および疾患の過程に関して種々の意味がありうる。例えば、研究により、ｍ^６Ａというマークが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）生合成の開始を促進するための重要な転写後修飾としての機能を果たし得ることが示されている（Alarconet al. Nature, 519 (7544): 482-485, 2015）。エビデンスから、ｍ^６ＡＲＮＡ修飾が幹細胞の特定の系列への分化（Batista,Cell stem Cell, 15 (6): 707-719, 2014; Zhang et al. Nature, 549 (7671):273-276, 2017）、および遺伝子発現の制御（Dominissini et al., Nature 485 (7397): 201-206,2012; Haussmann et al, Nature 540 (7632): 301-304, 2016）におそらく関与することも示される。ｍ^６ＡトランスフェラーゼであるＭＥＴＴＬ３がマウスナイーブ多能性を終結させるための制御因子として同定されている（Geulaet al. Science, 347 (6225): 1002-1006, 2015）。ｍ^６Ａ「ライター」タンパク質であるＭＥＴＴＬ３は、マウスＴ細胞において、Ｔ細胞の恒常性および分化を妨害することも示されており（Liet al. Nature, 548 (7667): 338-342, 2017）、また、ｍ^６ＡＲＮＡメチル化により、ＸＩＳＴ媒介性転写抑制が促進されることが見出されている（Patilet al. Nature, 537 (7620): 369-373, 2016）。ｍ^６ＡＲＮＡ修飾はまた、紫外線により誘導されるＤＮＡ損傷応答を制御することも示されている（Xianget al. Nature, 543 (7646): 573-576, 2017）。ゼブラフィッシュにおけるものなどの母体接合体移行（ＭＺＴ）の研究によっても、トランスクリプトーム切り換えおよび動物発生におけるｍ^６ＡｍＲＮＡメチル化の役割が示されている（Zhaoet al. Nature, 542 (7642): 475-478, 2017）。したがって、累積的なエビデンスによりｍ^６Ａの生物学的機能に関する洞察がもたらされているが（Lenceet al. Nature, 540 (7632); 242-247, 2016）、成体幹細胞におけるｍ^６Ａの機能はほとんどわかっていない。

【0009】

骨髄（ＢＭ）内の造血幹細胞（ＨＳＣ）は、生涯全体を通して造血恒常性を維持し、また、骨髄破壊後の再生を支持する（Weissman, 2000）。致死的に照射を受けたマウスにおいて、静止状態のＨＳＣは、増殖性ＨＳＣよりも優れた働きをし、これは、静止した状態ではＨＳＣがＤＮＡ損傷から保護されることに主に起因する（Araiet al., 2004; Fleming et al., 1993; Wilson et al., 2008）（Walter et al., 2015）。しかし、最近の研究から、ＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷蓄積が、ＨＳＣ静止状態に依存するＤＮＡ修復および応答経路の広範な減弱に関連付けられることが示された（Beermanet al., 2014）。実際、大多数のＨＳＣが、静止状態にあるにもかかわらず、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）などの化学療法薬によるＤＮＡ損傷に感受性である（Lernerand Harrison, 1990）。造血系がどのようにして骨髄破壊の結果を克服するかが未解決の問題である。発生中および成体におけるＨＳＣの注目すべき不均一性に関して（Benvenisteet al., 2010; Benz et al., 2012; Fleming et al., 1993; Morita et al., 2010;Zhou et al., 2016）、薬物抵抗性、およびバルクのＨＳＣを再生させてストレスによって引き起こされた骨髄破壊を克服する能力という特徴を有する予備ＨＳＣ（ｒＨＳＣ）亜集団の存在が提唱された（Hauget al., 2008; Li and Clevers, 2010; Wilson et al., 2008）。しかし、これまで、血液系におけるｒＨＳＣの存在を裏付ける機能的エビデンスはもたらされていない。

【0010】

ＨＳＣは、それらの維持および再生に関して複雑なＢＭニッチにおいて保存される（Liand Clevers, 2010; Mendelson and Frenette, 2014; Morrison and Scadden, 2014;Scadden, 2014; Schofield, 1978）。過去１０年間、多数の研究により、骨内膜（骨内部表面）細胞（Calvi et al.,2003; Zhang et al., 2003）、類洞内皮細胞（Hooper et al., 2009; Kiel et al., 2005）、Ｃｘｃｌ１２が豊富な細網（ＣＡＲ）細胞（Sugiyamaet al., 2006）、ネスチン^＋およびＮＧ２^＋血管周囲細胞（Kunisaki et al., 2013;Mendez-Ferrer et al., 2010）、ＬｅｐＲ^＋およびＰｒｘ−１^＋間葉系幹細胞および前駆細胞（Dingand Morrison, 2013; Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013）、非髄鞘形成シュワン細胞（Yamazakiet al., 2011）、ならびに巨核球（Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014）を含めた、ＨＳＣ骨髄ニッチ構成成分の複雑さが明らかにされた。しかし、ＢＭニッチの複雑さがＨＳＣ不均一性の制御に寄与するかどうか、およびどのように寄与するかは依然としてほとんど分かっていない（Itkinet al., 2016）。さらに、第１のＨＳＣニッチは、海綿骨領域の骨内膜内の紡錘形状Ｎ−カドヘリン^＋（Ｎ−ｃａｄ^＋）前骨芽細胞として最初に同定されたが（Calviet al., 2003; Xie et al., 2009; Zhang et al., 2003）、ＢＭ内のＮ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞の性質および機能は不明なままである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｌｉ，Ｌ．およびＣｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１０）３２７、５４２〜５４５

【非特許文献2】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ，Ａ．およびＦｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．ＮａｔＭｅｄ（２０１４）２０、８３３〜８４６

【非特許文献3】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｊ．およびＳｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５０５、３２７〜３３４

【非特許文献4】Ｓｃａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｔ．Ｃｅｌｌ（２０１４）１５７、４１〜５０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、幹細胞増殖および分化の分子制御に関する洞察をもたらすためにｍ^６Ａおよびｍ^６ＡｍＲＮＡ経路の役割を解明し、理解することが依然として必要とされている。ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏの両方で幹細胞の集団を増大させるための方法、ならびにそのような増大した幹細胞集団を用いた処置を、例えば、適切な被験体への移植などによってもたらす方法が依然としてさらに必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本開示の一実施形態では、幹細胞の集団を増大させるための方法であって、幹細胞の集団を末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から得る方法が提供される。当該方法は、幹細胞の数が増大するように幹細胞の集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0014】

さらに別の実施形態では、実質的に未分化の幹細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、幹細胞集団の著しい分化を伴わずに未分化の幹細胞の数が増大するように未分化の幹細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法が提供される。

【0015】

さらに別の実施形態によると、造血幹細胞（ＨＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、ＨＳＣ集団を末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得、前記方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＨＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながらＨＳＣ集団が十分な数量まで増大するように、ＨＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む、方法が提供される。

【0016】

さらに別の実施形態によると、造血幹細胞（ＨＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍に増大させるための方法であって、増大したＨＳＣが、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにＨＳＣ系列を再構成する能力を有し、前記方法が、幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＨＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法が提供される。

【0017】

さらなる実施形態によると、造血幹細胞集団（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ＨＳＣ集団に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含むキットが提供される。

【0018】

さらに別の実施形態によると、造血幹細胞集団（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含むキットが提供される。

【0019】

なおさらなる実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0020】

なおさらなる実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0021】

別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0022】

別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0023】

一実施形態では、造血細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、ＨＳＣの集団をＨＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大したＨＳＣの集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法が提供される。

【0024】

さらなる実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＨＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、（ｉｉ）増大したＨＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップとを含む方法が提供される。

【0025】

さらなる実施形態では、それを必要とする被験体において造血幹細胞系列を再構成するための方法であって、（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＨＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、（ｉｉ）増大したＨＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有するステップと、（ｃ）増大したＨＳＣ集団をそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む方法が提供される。

【0026】

さらに別の実施形態では、そのような増大を必要とする哺乳動物において造血幹細胞集団を増大させるための方法であって、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物において造血系列を再構成する能力を有するＨＳＣを含むＨＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法が提供される。

【0027】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、ＭＳＣ集団を末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得、前記方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＭＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら、ＭＳＣ集団が十分な数量まで増大するようにＭＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む方法が提供される。

【0028】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を少なくとも２倍、ｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、増大したＭＳＣが、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにＭＳＣ系列を再構成する能力を有し、前記方法が、幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＭＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法が提供される。

【0029】

さらなる実施形態によると、間葉系幹細胞集団（ＭＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ＭＳＣ集団にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含むキットが提供される。

【0030】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞集団（ＭＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含むキットが提供される。

【0031】

なおさらなる実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0032】

なおさらなる実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法であって、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0033】

別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0034】

別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法であって、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む方法が提供される。

【0035】

一実施形態では、間葉細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、ＭＳＣの集団を、ＭＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大したＭＳＣの集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法が提供される。

【0036】

さらなる実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、（ｉｉ）増大したＭＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップとを含む方法が提供される。

【0037】

さらなる実施形態では、それを必要とする被験体において間葉系幹細胞系列を再構成するための方法であって、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、（ｉｉ）増大したＭＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップと、（ｃ）増大したＭＳＣ集団をそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む方法が提供される。

【0038】

さらに別の実施形態では、そのような増大を必要とする哺乳動物において間葉系幹細胞集団を増大させるための方法であって、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物において間葉系系列を再構成する能力を有するＨＳＣを含む、ＭＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法が提供される。

【0039】

【0040】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍増大させるための方法であって、増大したＭＳＣが、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにＭＳＣ系列を再構成する能力を有し、前記方法が、幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＭＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む方法が提供される。

【0041】

【0042】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞集団（ＭＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットであって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤、およびその使用に関する指示とを含むキットが提供される。

【0043】

【0044】

【0045】

【0046】

【0047】

一実施形態では、間葉細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、ＭＳＣの集団を、ＨＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、増大したＭＳＣの集団が、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである、方法が提供される。

【0048】

さらなる実施形態では、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法であって、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大する、ステップとを含む方法が提供される。

【0049】

さらなる実施形態では、それを必要とする被験体において間葉系幹細胞系列を再構成するための方法であって、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大する、ステップと、（ｃ）増大したＭＳＣ集団をそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む方法が提供される。

【0050】

さらに別の実施形態では、そのような増大を必要とする哺乳動物において間葉系幹細胞集団を増大させるための方法であって、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物における間葉系系列を再構成する能力を有するＭＳＣを含むＭＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む方法が提供される。

【0051】

さらなる実施形態では、生体試料から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する方法であって、ＭＳＣの集団を有する生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるステップを含む方法が提供される。

【0052】

さらなる実施形態では、本明細書に記載のプロセスのいずれかによって作製される単離された間葉系幹細胞の集団が提供される。さらに別の実施形態によると、本明細書に記載のプロセスのいずれかによって作製される増大した単離された間葉系幹細胞の集団が提供される。

【0053】

さらに別の実施形態によると、後続のそれを必要とする被験体への移植のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を単離するためのキットが提供される。キットは、ＭＳＣを含む生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるための系と、その使用に関する指示とを含む。

【0054】

さらに別の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＭＳＣの集団を含む生体試料からＭＳＣを、生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、（ｂ）単離されたＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。

【0055】

さらに別の実施形態によると、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＭＳＣの集団を含む生体試料から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、（ｂ）単離されたＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。

【0056】

さらに別の実施形態によると、骨髄移植、末梢血移植および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要とする被験体を処置するための方法が提供される。当該方法は、被験体に、本明細書に記載の方法のいずれかによって得た単離されたＭＳＣの集団を投与するステップを含む。

【0057】

さらに別の実施形態では、末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって調製されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法が提供される。当該方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の数が増大するようにＣＡＲＴ細胞の集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0058】

さらなる実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法が提供される。当該方法は、ＣＡＲＴ細胞の数が増大するようにＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0059】

さらに別の実施形態によると、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって調製されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法が提供される。当該方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＣＡＲＴ細胞集団が十分な数量まで増大するように、ＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0060】

さらに別の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法であって、増大したＣＡＲＴ細胞が、それを必要とする哺乳動物に移植されたときにがんおよび／または血液障害を処置する能力を有する、方法が提供される。当該方法は、ＣＡＲＴ細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＣＡＲＴ細胞の集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む。

【0061】

さらなる実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞（ＨＳＣ）集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットが提供される。キットは、ＣＡＲＴ細胞集団にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含む。

【0062】

なおさらなる実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。

【0063】

別の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。

【0064】

さらなる実施形態では、それを必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。

【0065】

なおさらなる実施形態では、それを必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。

【0066】

一実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法が提供される。当該方法は、ＣＡＲＴ細胞の集団を、ＣＡＲＴ細胞集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、ここで、増大したＣＡＲＴ細胞の集団は、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである。

【0067】

さらに別の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法が提供される。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団をもたらすステップと、（ｃ）試料由来のＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも２倍増大する、ステップとを含む。

【0068】

さらなる実施形態では、がんおよび／または血液障害に罹患している被験体を処置するための方法が提供される。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団を形成するステップと、（ｃ）試料由来のＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも２倍増大する、ステップと、（ｄ）増大したＣＡＲＴ細胞集団を被験体に移植するステップとを含む。

【0069】

なおさらなる実施形態では、そのような増大を必要とする哺乳動物においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団を増大させるための方法が提供される。当該方法は、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物におけるがんおよび／または血液障害を処置する能力を有するＣＡＲＴ細胞を含む、ＣＡＲＴ細胞集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む。

【0070】

さらに別の実施形態では、血液障害に罹患している被験体を処置する方法が提供される。当該方法は、（ａ）末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織から、幹細胞およびＴ細胞からなる群より選択される細胞の集団を得るステップと、（ｂ）必要に応じて、細胞の集団がＴ細胞を含む場合にＴ細胞をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて改変してＣＡＲＴ細胞をもたらすステップと、（ｃ）細胞におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって細胞の集団を増大させて、細胞の数を増大させるステップと、（ｄ）増大した細胞を被験体に移植して血液障害を処置するステップとを含む。

【0071】

本発明のこれらおよび他の態様を以下の詳細な説明および実施例においてさらに開示する。

【0072】

以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。これらの図面の１つまたは複数を本明細書に提示されている具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1-1】図１Ａ〜１Ｈは、マウスにおいてＹｔｈｄｆ２ＫＯにより表現型ＨＳＣの増加が導かれることを示す図である。図１Ａは、Ｍｘ１−ｃｒｅ；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆコンディショナルＫＯ（ｃＫＯ）マウスのＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の欠失を示す概略図である。図１Ｂは、マウスＨＳＰＣにおけるノックアウトＹｔｈｄｆ２の細胞内フロー検証を示すウエスタンブロット（左）およびヒストグラム（右）を示す。図１Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの代表的なフローサイトメトリー分析プロットである。図１Ｄおよび１Ｅは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおける総有核細胞（ＴＮＣ）の頻度（１Ｄ）およびＨＳＰＣの絶対細胞数（１Ｅ）を示す棒グラフである。図１Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭＴＮＣの絶対数を示す棒グラフである。図１Ｇおよび１Ｈは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）のＢＭにおける拘束前駆細胞の絶対数（１Ｇ）および系列細胞の絶対数（１Ｈ）を示す棒グラフである。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図1-2】図１Ａ〜１Ｈは、マウスにおいてＹｔｈｄｆ２ＫＯにより表現型ＨＳＣの増加が導かれることを示す図である。図１Ａは、Ｍｘ１−ｃｒｅ；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆコンディショナルＫＯ（ｃＫＯ）マウスのＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の欠失を示す概略図である。図１Ｂは、マウスＨＳＰＣにおけるノックアウトＹｔｈｄｆ２の細胞内フロー検証を示すウエスタンブロット（左）およびヒストグラム（右）を示す。図１Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの代表的なフローサイトメトリー分析プロットである。図１Ｄおよび１Ｅは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおける総有核細胞（ＴＮＣ）の頻度（１Ｄ）およびＨＳＰＣの絶対細胞数（１Ｅ）を示す棒グラフである。図１Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭＴＮＣの絶対数を示す棒グラフである。図１Ｇおよび１Ｈは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）のＢＭにおける拘束前駆細胞の絶対数（１Ｇ）および系列細胞の絶対数（１Ｈ）を示す棒グラフである。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図1-3】図１Ａ〜１Ｈは、マウスにおいてＹｔｈｄｆ２ＫＯにより表現型ＨＳＣの増加が導かれることを示す図である。図１Ａは、Ｍｘ１−ｃｒｅ；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆコンディショナルＫＯ（ｃＫＯ）マウスのＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の欠失を示す概略図である。図１Ｂは、マウスＨＳＰＣにおけるノックアウトＹｔｈｄｆ２の細胞内フロー検証を示すウエスタンブロット（左）およびヒストグラム（右）を示す。図１Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの代表的なフローサイトメトリー分析プロットである。図１Ｄおよび１Ｅは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭにおける総有核細胞（ＴＮＣ）の頻度（１Ｄ）およびＨＳＰＣの絶対細胞数（１Ｅ）を示す棒グラフである。図１Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）由来のＢＭＴＮＣの絶対数を示す棒グラフである。図１Ｇおよび１Ｈは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）のＢＭにおける拘束前駆細胞の絶対数（１Ｇ）および系列細胞の絶対数（１Ｈ）を示す棒グラフである。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0074】

【図2-1】図２Ａ〜２Ｊは、マウスにおいて、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより機能的ＨＳＣの増大がもたらされることを示す図である。図２Ａは、機能的ＨＳＣの頻度を決定するための限界希釈移植アッセイ（ＬＤＡ）の実験スキームを示す。図２Ｂは、移植の１６週間後にＥＬＤＡ（極度限界希釈分析（ＥｘｔｒｅｍｅＬｉｍｉｔｉｎｇＤｉｌｕｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ））によってＣＲＵ頻度を決定するための一次ＬＤＡ（群当たりｎ＝１０）を示すグラフである。図２Ｃは、照射を受けたレシピエント（各群ｎ＝１０）に全骨髄（ＷＢＭ）細胞２００Ｋ個をレスキュー細胞２００Ｋ個と共に移植することによる競合的再構成アッセイを示すグラフである。図２Ｄおよび２Ｅは、（２Ｃ）と同様の移植レシピエントマウス（各群ｎ＝１０）由来のＢＭにおけるドナー由来のＨＳＰＣのＴＮＣの頻度（２Ｄ）および絶対細胞数（２Ｅ）を示す棒グラフである。図２Ｆおよび２Ｇは、ＢＭ２００Ｋ個の一次移植レシピエントマウス（各群ｎ＝９〜１０）由来のＢＭにおけるドナー由来の（ＣＤ４５．２^＋）拘束前駆細胞（２Ｆ）および系列細胞（２Ｇ）の絶対細胞数を示す棒グラフである。図２Ｈは、二次移植の１６週間後にＥＬＤＡによって長期間ＣＲＵ頻度を決定するための二次ＬＤＡのプロットを示す（ｎ＝１０）。図２Ｉおよび２Ｊは、それぞれ、移植の４週間後の総生着ドナー細胞についての末梢血分析を用いた移植アッセイによる機能的マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）の定量化を示す棒グラフ（２Ｉ）、および移植の４週間後にＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを用いた移植アッセイによる機能的マウスＨＳＣの定量化を示す棒グラフ（２Ｊ）である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図2-2】図２Ａ〜２Ｊは、マウスにおいて、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより機能的ＨＳＣの増大がもたらされることを示す図である。図２Ａは、機能的ＨＳＣの頻度を決定するための限界希釈移植アッセイ（ＬＤＡ）の実験スキームを示す。図２Ｂは、移植の１６週間後にＥＬＤＡ（極度限界希釈分析（ＥｘｔｒｅｍｅＬｉｍｉｔｉｎｇＤｉｌｕｔｉｏｎＡｎａｌｙｓｉｓ））によってＣＲＵ頻度を決定するための一次ＬＤＡ（群当たりｎ＝１０）を示すグラフである。図２Ｃは、照射を受けたレシピエント（各群ｎ＝１０）に全骨髄（ＷＢＭ）細胞２００Ｋ個をレスキュー細胞２００Ｋ個と共に移植することによる競合的再構成アッセイを示すグラフである。図２Ｄおよび２Ｅは、（２Ｃ）と同様の移植レシピエントマウス（各群ｎ＝１０）由来のＢＭにおけるドナー由来のＨＳＰＣのＴＮＣの頻度（２Ｄ）および絶対細胞数（２Ｅ）を示す棒グラフである。図２Ｆおよび２Ｇは、ＢＭ２００Ｋ個の一次移植レシピエントマウス（各群ｎ＝９〜１０）由来のＢＭにおけるドナー由来の（ＣＤ４５．２^＋）拘束前駆細胞（２Ｆ）および系列細胞（２Ｇ）の絶対細胞数を示す棒グラフである。図２Ｈは、二次移植の１６週間後にＥＬＤＡによって長期間ＣＲＵ頻度を決定するための二次ＬＤＡのプロットを示す（ｎ＝１０）。図２Ｉおよび２Ｊは、それぞれ、移植の４週間後の総生着ドナー細胞についての末梢血分析を用いた移植アッセイによる機能的マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）の定量化を示す棒グラフ（２Ｉ）、および移植の４週間後にＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを用いた移植アッセイによる機能的マウスＨＳＣの定量化を示す棒グラフ（２Ｊ）である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0075】

【図3-1】図３Ａ〜３Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２がｍ^６Ａリーダーとして機能し、ｍＲＮＡ分解を媒介することによってＨＳＣ遺伝子発現を制御することを示す図である。図３Ａは、ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑワークフローの概略図である。図３Ｂは、全てのｉｒＣＬＩＰピークが３回の反復実験全てで見いだされた、ＭＥＭＥによって同定されたＹｔｈｄｆ２結合モチーフを示す概略図である。図３Ｃは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるＹｔｈｄｆ２結合ピークの画分を示す円グラフである。図３Ｄは、３回のＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ反復実験の交差遺伝子（intersect gene）由来のＹｔｈｄｆ２標的からのＧＯ富化分析を示すチャートである。図３Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＴａｌ１の代表的なトラックを示し、ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。図３Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞の総ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析を示すチャートである。全てのＣｔ値をまずＡｃｔｂ対照（ｍ^６Ａタグを有さない）に対して正規化した。次いで、比（ｗｔに対するＹｔｈｄｆ２ＫＯ）を算出した（ｎ＝３）。図３Ｇは、ｗｔ（ｎ＝６５）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝５４）ＨＳＰＣのＴＡＬ１（緑色）についての染色強度の代表的な画像（左）および棒グラフによる定量化（右）を示す。図３Ｈは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＴａｌ１ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す画像を示し、矢マークは、共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図３Ｉは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＴａｌ１ｍＲＮＡおよびＤＣＰ１ａ共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｔａｌ１ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＴａｌ１ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝９〜１７）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。

【図3-2】図３Ａ〜３Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２がｍ^６Ａリーダーとして機能し、ｍＲＮＡ分解を媒介することによってＨＳＣ遺伝子発現を制御することを示す図である。図３Ａは、ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑワークフローの概略図である。図３Ｂは、全てのｉｒＣＬＩＰピークが３回の反復実験全てで見いだされた、ＭＥＭＥによって同定されたＹｔｈｄｆ２結合モチーフを示す概略図である。図３Ｃは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるＹｔｈｄｆ２結合ピークの画分を示す円グラフである。図３Ｄは、３回のＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ反復実験の交差遺伝子（intersect gene）由来のＹｔｈｄｆ２標的からのＧＯ富化分析を示すチャートである。図３Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＴａｌ１の代表的なトラックを示し、ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。図３Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞の総ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析を示すチャートである。全てのＣｔ値をまずＡｃｔｂ対照（ｍ^６Ａタグを有さない）に対して正規化した。次いで、比（ｗｔに対するＹｔｈｄｆ２ＫＯ）を算出した（ｎ＝３）。図３Ｇは、ｗｔ（ｎ＝６５）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝５４）ＨＳＰＣのＴＡＬ１（緑色）についての染色強度の代表的な画像（左）および棒グラフによる定量化（右）を示す。図３Ｈは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＴａｌ１ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す画像を示し、矢マークは、共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図３Ｉは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＴａｌ１ｍＲＮＡおよびＤＣＰ１ａ共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｔａｌ１ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＴａｌ１ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝９〜１７）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。

【図3-3】図３Ａ〜３Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２がｍ^６Ａリーダーとして機能し、ｍＲＮＡ分解を媒介することによってＨＳＣ遺伝子発現を制御することを示す図である。図３Ａは、ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑワークフローの概略図である。図３Ｂは、全てのｉｒＣＬＩＰピークが３回の反復実験全てで見いだされた、ＭＥＭＥによって同定されたＹｔｈｄｆ２結合モチーフを示す概略図である。図３Ｃは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるＹｔｈｄｆ２結合ピークの画分を示す円グラフである。図３Ｄは、３回のＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ反復実験の交差遺伝子（intersect gene）由来のＹｔｈｄｆ２標的からのＧＯ富化分析を示すチャートである。図３Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＴａｌ１の代表的なトラックを示し、ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。図３Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞の総ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析を示すチャートである。全てのＣｔ値をまずＡｃｔｂ対照（ｍ^６Ａタグを有さない）に対して正規化した。次いで、比（ｗｔに対するＹｔｈｄｆ２ＫＯ）を算出した（ｎ＝３）。図３Ｇは、ｗｔ（ｎ＝６５）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝５４）ＨＳＰＣのＴＡＬ１（緑色）についての染色強度の代表的な画像（左）および棒グラフによる定量化（右）を示す。図３Ｈは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＴａｌ１ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す画像を示し、矢マークは、共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図３Ｉは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＴａｌ１ｍＲＮＡおよびＤＣＰ１ａ共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｔａｌ１ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＴａｌ１ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝９〜１７）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。

【図3-4】図３Ａ〜３Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２がｍ^６Ａリーダーとして機能し、ｍＲＮＡ分解を媒介することによってＨＳＣ遺伝子発現を制御することを示す図である。図３Ａは、ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑワークフローの概略図である。図３Ｂは、全てのｉｒＣＬＩＰピークが３回の反復実験全てで見いだされた、ＭＥＭＥによって同定されたＹｔｈｄｆ２結合モチーフを示す概略図である。図３Ｃは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるＹｔｈｄｆ２結合ピークの画分を示す円グラフである。図３Ｄは、３回のＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ反復実験の交差遺伝子（intersect gene）由来のＹｔｈｄｆ２標的からのＧＯ富化分析を示すチャートである。図３Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＴａｌ１の代表的なトラックを示し、ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。図３Ｆは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞の総ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析を示すチャートである。全てのＣｔ値をまずＡｃｔｂ対照（ｍ^６Ａタグを有さない）に対して正規化した。次いで、比（ｗｔに対するＹｔｈｄｆ２ＫＯ）を算出した（ｎ＝３）。図３Ｇは、ｗｔ（ｎ＝６５）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝５４）ＨＳＰＣのＴＡＬ１（緑色）についての染色強度の代表的な画像（左）および棒グラフによる定量化（右）を示す。図３Ｈは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＴａｌ１ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す画像を示し、矢マークは、共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図３Ｉは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＴａｌ１ｍＲＮＡおよびＤＣＰ１ａ共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｔａｌ１ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＴａｌ１ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝９〜１７）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。

【0076】

【図4-1】図４Ａ〜４Ｉは、ｍ^６Ａ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑ分析によるヒト臍帯血ＨＳＣにおけるＹＴＨＤＦ２の役割を示す図である。図４Ａは、ＴＳＳ（左）および終止コドン（右）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルを示し、ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図４Ｂは、５つの重複していない転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図４Ｃは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣにおいて共有される、独特なｍ^６Ａタグを有する遺伝子を示すベン図を示す。図４Ｄは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣの両方で共有される、ｍ^６Ａタグを有する転写物のＧＯ富化分析のチャートを示す。図４Ｅは、ｍ^６Ａピークを有するＨＯＸＢ４の代表的なトラックを示し、カラーコードは図４Ａと同じである。図４Ｆは、ＲＮＡ−ｓｅｑのためのｈＵＣＢＣＤ３４^＋ＨＳＰＣにおけるレンチウイルス媒介性ＹＴＨＤＦ２ＫＤの概略図を示す。図４Ｇは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞を用いた、ｍ^６Ａでマークされた遺伝子（紫色の線）およびｍ^６Ａでマークされていない遺伝子（黒色の線）についてのｌｏｇ_２（倍率変化）での累積的分布のプロットである。図４Ｈは、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロットを示し、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにおいて、対照ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞と比較して、ｍ^６Ａタグを有する遺伝子ＨＯＸＢ４のリードは増加するがｍ^６Ａタグを有さない遺伝子ＡＣＴＢのリードは増加しないことが示されている。図４Ｉは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａで標識されていないＡＣＴＢ（対照として）および幹細胞の自己複製に関連するｍ^６Ａでマークされた転写因子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＲＰＫＭを対照に対して正規化した。調整したＰ値を示した。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図4-2】図４Ａ〜４Ｉは、ｍ^６Ａ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑ分析によるヒト臍帯血ＨＳＣにおけるＹＴＨＤＦ２の役割を示す図である。図４Ａは、ＴＳＳ（左）および終止コドン（右）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルを示し、ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図４Ｂは、５つの重複していない転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図４Ｃは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣにおいて共有される、独特なｍ^６Ａタグを有する遺伝子を示すベン図を示す。図４Ｄは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣの両方で共有される、ｍ^６Ａタグを有する転写物のＧＯ富化分析のチャートを示す。図４Ｅは、ｍ^６Ａピークを有するＨＯＸＢ４の代表的なトラックを示し、カラーコードは図４Ａと同じである。図４Ｆは、ＲＮＡ−ｓｅｑのためのｈＵＣＢＣＤ３４^＋ＨＳＰＣにおけるレンチウイルス媒介性ＹＴＨＤＦ２ＫＤの概略図を示す。図４Ｇは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞を用いた、ｍ^６Ａでマークされた遺伝子（紫色の線）およびｍ^６Ａでマークされていない遺伝子（黒色の線）についてのｌｏｇ_２（倍率変化）での累積的分布のプロットである。図４Ｈは、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロットを示し、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにおいて、対照ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞と比較して、ｍ^６Ａタグを有する遺伝子ＨＯＸＢ４のリードは増加するがｍ^６Ａタグを有さない遺伝子ＡＣＴＢのリードは増加しないことが示されている。図４Ｉは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａで標識されていないＡＣＴＢ（対照として）および幹細胞の自己複製に関連するｍ^６Ａでマークされた転写因子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＲＰＫＭを対照に対して正規化した。調整したＰ値を示した。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図4-3】図４Ａ〜４Ｉは、ｍ^６Ａ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑ分析によるヒト臍帯血ＨＳＣにおけるＹＴＨＤＦ２の役割を示す図である。図４Ａは、ＴＳＳ（左）および終止コドン（右）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルを示し、ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図４Ｂは、５つの重複していない転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図４Ｃは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣにおいて共有される、独特なｍ^６Ａタグを有する遺伝子を示すベン図を示す。図４Ｄは、マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣの両方で共有される、ｍ^６Ａタグを有する転写物のＧＯ富化分析のチャートを示す。図４Ｅは、ｍ^６Ａピークを有するＨＯＸＢ４の代表的なトラックを示し、カラーコードは図４Ａと同じである。図４Ｆは、ＲＮＡ−ｓｅｑのためのｈＵＣＢＣＤ３４^＋ＨＳＰＣにおけるレンチウイルス媒介性ＹＴＨＤＦ２ＫＤの概略図を示す。図４Ｇは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞を用いた、ｍ^６Ａでマークされた遺伝子（紫色の線）およびｍ^６Ａでマークされていない遺伝子（黒色の線）についてのｌｏｇ_２（倍率変化）での累積的分布のプロットである。図４Ｈは、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロットを示し、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにおいて、対照ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞と比較して、ｍ^６Ａタグを有する遺伝子ＨＯＸＢ４のリードは増加するがｍ^６Ａタグを有さない遺伝子ＡＣＴＢのリードは増加しないことが示されている。図４Ｉは、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａで標識されていないＡＣＴＢ（対照として）および幹細胞の自己複製に関連するｍ^６Ａでマークされた転写因子の相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＲＰＫＭを対照に対して正規化した。調整したＰ値を示した。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0077】

【図5-1】図５Ａ〜５Ｆは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤによりｅｘｖｉｖｏにおけるヒト臍帯血ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図５Ａ〜５Ｂは、７日間培養した後の、ＹＴＨＤＦ２ＫＤの示されている細胞の対照細胞に対する頻度（５Ａ）および絶対数（５Ｂ）の倍率変化を示す棒グラフである。図５Ｃは、形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ｈＵＣＢ細胞からのＣＦＵアウトプットを示す棒グラフおよびＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）の画像（スケールバー、２００μｍ）を示す。図５Ｄは、７日間培養した対照ｈＵＣＢ細胞またはＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞に由来する前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）（左）およびコロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）（右）の画像を含む（スケールバー、２００μｍ）。独立した臍帯血試料を使用し、パネルについて２回繰り返した。図５Ｅは、形質導入されたＣＤ３４^＋ｈＵＣＢ細胞中のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞の７日間培養物のアネキシンＶ染色によるアポトーシス分析を示す棒グラフである（ｎ＝３の独立したＣＢ試料）。図５Ｆは、示されているヒト臍帯血ＨＳＣ（ｎ＝３の独立したヒト試料）におけるＴｔｈｄｆ２ノックダウン（ＫＤ）の対照に対する倍率変化を示す棒グラフである。レンチウイルスを使用して対照ｓｈＲＮＡまたはヒトＹｔｈｄｆ２ｓｈＲＮＡを選別されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻臍帯血（ｂｌｏｏｄｃｏｒｄ）ＨＳＣに送達した。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図5-2】図５Ａ〜５Ｆは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤによりｅｘｖｉｖｏにおけるヒト臍帯血ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図５Ａ〜５Ｂは、７日間培養した後の、ＹＴＨＤＦ２ＫＤの示されている細胞の対照細胞に対する頻度（５Ａ）および絶対数（５Ｂ）の倍率変化を示す棒グラフである。図５Ｃは、形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ｈＵＣＢ細胞からのＣＦＵアウトプットを示す棒グラフおよびＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）の画像（スケールバー、２００μｍ）を示す。図５Ｄは、７日間培養した対照ｈＵＣＢ細胞またはＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞に由来する前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）（左）およびコロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）（右）の画像を含む（スケールバー、２００μｍ）。独立した臍帯血試料を使用し、パネルについて２回繰り返した。図５Ｅは、形質導入されたＣＤ３４^＋ｈＵＣＢ細胞中のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞の７日間培養物のアネキシンＶ染色によるアポトーシス分析を示す棒グラフである（ｎ＝３の独立したＣＢ試料）。図５Ｆは、示されているヒト臍帯血ＨＳＣ（ｎ＝３の独立したヒト試料）におけるＴｔｈｄｆ２ノックダウン（ＫＤ）の対照に対する倍率変化を示す棒グラフである。レンチウイルスを使用して対照ｓｈＲＮＡまたはヒトＹｔｈｄｆ２ｓｈＲＮＡを選別されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻臍帯血（ｂｌｏｏｄｃｏｒｄ）ＨＳＣに送達した。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図5-3】図５Ａ〜５Ｆは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤによりｅｘｖｉｖｏにおけるヒト臍帯血ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図５Ａ〜５Ｂは、７日間培養した後の、ＹＴＨＤＦ２ＫＤの示されている細胞の対照細胞に対する頻度（５Ａ）および絶対数（５Ｂ）の倍率変化を示す棒グラフである。図５Ｃは、形質導入されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ｈＵＣＢ細胞からのＣＦＵアウトプットを示す棒グラフおよびＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）の画像（スケールバー、２００μｍ）を示す。図５Ｄは、７日間培養した対照ｈＵＣＢ細胞またはＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞に由来する前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）（左）およびコロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）（右）の画像を含む（スケールバー、２００μｍ）。独立した臍帯血試料を使用し、パネルについて２回繰り返した。図５Ｅは、形質導入されたＣＤ３４^＋ｈＵＣＢ細胞中のＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞の７日間培養物のアネキシンＶ染色によるアポトーシス分析を示す棒グラフである（ｎ＝３の独立したＣＢ試料）。図５Ｆは、示されているヒト臍帯血ＨＳＣ（ｎ＝３の独立したヒト試料）におけるＴｔｈｄｆ２ノックダウン（ＫＤ）の対照に対する倍率変化を示す棒グラフである。レンチウイルスを使用して対照ｓｈＲＮＡまたはヒトＹｔｈｄｆ２ｓｈＲＮＡを選別されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻臍帯血（ｂｌｏｏｄｃｏｒｄ）ＨＳＣに送達した。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0078】

【図6-1】図６Ａ〜６Ｇは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにより、ヒト臍帯血機能的長期ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図６Ａは、ｉｎｖｉｖｏにおける増大後のＨＳＣの頻度を測定するための実験スキームを示す画像である。図６Ｂは、最も高い２つの細胞用量を受けた一次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。ｈＣＤ４５＝ヒトＣＤ４５。図６Ｃは、最も高い２つの用量を受けた一次レシピエントマウス（ｎ＝８）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、一次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すプロットである。破線は、９５％信頼区間を示す。図６Ｅは、最も高い２つの細胞用量を受けた二次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。図６Ｆは、最も高い２つの用量を受けた二次レシピエントマウス（ｎ＝６）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、二次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すグラフである。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図6-2】図６Ａ〜６Ｇは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにより、ヒト臍帯血機能的長期ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図６Ａは、ｉｎｖｉｖｏにおける増大後のＨＳＣの頻度を測定するための実験スキームを示す画像である。図６Ｂは、最も高い２つの細胞用量を受けた一次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。ｈＣＤ４５＝ヒトＣＤ４５。図６Ｃは、最も高い２つの用量を受けた一次レシピエントマウス（ｎ＝８）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、一次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すプロットである。破線は、９５％信頼区間を示す。図６Ｅは、最も高い２つの細胞用量を受けた二次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。図６Ｆは、最も高い２つの用量を受けた二次レシピエントマウス（ｎ＝６）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、二次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すグラフである。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図6-3】図６Ａ〜６Ｇは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにより、ヒト臍帯血機能的長期ＨＳＣの増大が容易になることを示す図である。図６Ａは、ｉｎｖｉｖｏにおける増大後のＨＳＣの頻度を測定するための実験スキームを示す画像である。図６Ｂは、最も高い２つの細胞用量を受けた一次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。ｈＣＤ４５＝ヒトＣＤ４５。図６Ｃは、最も高い２つの用量を受けた一次レシピエントマウス（ｎ＝８）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、一次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すプロットである。破線は、９５％信頼区間を示す。図６Ｅは、最も高い２つの細胞用量を受けた二次レシピエントマウスからのｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋再構成の代表的なフロープロットを含む。図６Ｆは、最も高い２つの用量を受けた二次レシピエントマウス（ｎ＝６）由来のＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋生着を示すプロットである。図６Ｄは、二次ＬＤＡによって決定されたＨＳＣ頻度を示すグラフである。破線は、９５％信頼区間を示す。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0079】

【図7-1】図７Ａ〜７Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＣが、系列の偏りの徴候または静止状態およびホーミング能力の差異を示さないが、低アポトーシス速度を示すことを示す図である。図７Ａは、ｐＩ：ｐＣ注射を伴わないＭｘ１−ｃｒｅ⁻；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウスおよびＭｘ１−ｃｒｅ^＋；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウス（群当たりｎ＝３）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの絶対細胞数を示す棒グラフである。図７Ｂは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスにおけるＨＳＰＣの細胞周期分析を示す棒グラフである。図７Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）におけるＢＭＨＳＰＣのアポトーシス分析を示す棒グラフである。図７Ｄは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の脾臓の画像および重量を示す。図７Ｅ〜７Ｈは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスの脾臓におけるＴＮＣ（７Ｅ）、ＬＳＫＣＤ４８⁻ＣＤ１５０^＋ＨＳＣ（７Ｆ）、拘束前駆細胞（７Ｇ）および系列細胞（７Ｈ）の絶対数を示す棒グラフである。図７Ｉは、ＣＦＤＡＳＥで標識したＢＭ細胞１×１０^６個を致死的に照射を受けたマウスに移植することによって決定されたｗｔ細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ細胞のホーミング能力を示す棒グラフである。１８時間後に、ＢＭをホーミング事象について分析した（群当たりｎ＝６のマウス）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図7-2】図７Ａ〜７Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＣが、系列の偏りの徴候または静止状態およびホーミング能力の差異を示さないが、低アポトーシス速度を示すことを示す図である。図７Ａは、ｐＩ：ｐＣ注射を伴わないＭｘ１−ｃｒｅ⁻；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウスおよびＭｘ１−ｃｒｅ^＋；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウス（群当たりｎ＝３）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの絶対細胞数を示す棒グラフである。図７Ｂは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスにおけるＨＳＰＣの細胞周期分析を示す棒グラフである。図７Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）におけるＢＭＨＳＰＣのアポトーシス分析を示す棒グラフである。図７Ｄは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の脾臓の画像および重量を示す。図７Ｅ〜７Ｈは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスの脾臓におけるＴＮＣ（７Ｅ）、ＬＳＫＣＤ４８⁻ＣＤ１５０^＋ＨＳＣ（７Ｆ）、拘束前駆細胞（７Ｇ）および系列細胞（７Ｈ）の絶対数を示す棒グラフである。図７Ｉは、ＣＦＤＡＳＥで標識したＢＭ細胞１×１０^６個を致死的に照射を受けたマウスに移植することによって決定されたｗｔ細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ細胞のホーミング能力を示す棒グラフである。１８時間後に、ＢＭをホーミング事象について分析した（群当たりｎ＝６のマウス）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図7-3】図７Ａ〜７Ｉは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＣが、系列の偏りの徴候または静止状態およびホーミング能力の差異を示さないが、低アポトーシス速度を示すことを示す図である。図７Ａは、ｐＩ：ｐＣ注射を伴わないＭｘ１−ｃｒｅ⁻；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウスおよびＭｘ１−ｃｒｅ^＋；Ｙｔｈｄｆ２^ｆ／ｆマウス（群当たりｎ＝３）由来のＢＭにおけるＨＳＰＣの絶対細胞数を示す棒グラフである。図７Ｂは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスにおけるＨＳＰＣの細胞周期分析を示す棒グラフである。図７Ｃは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（各群ｎ＝５）におけるＢＭＨＳＰＣのアポトーシス分析を示す棒グラフである。図７Ｄは、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の脾臓の画像および重量を示す。図７Ｅ〜７Ｈは、ｗｔマウス（ｎ＝３）およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ（ｎ＝４）マウスの脾臓におけるＴＮＣ（７Ｅ）、ＬＳＫＣＤ４８⁻ＣＤ１５０^＋ＨＳＣ（７Ｆ）、拘束前駆細胞（７Ｇ）および系列細胞（７Ｈ）の絶対数を示す棒グラフである。図７Ｉは、ＣＦＤＡＳＥで標識したＢＭ細胞１×１０^６個を致死的に照射を受けたマウスに移植することによって決定されたｗｔ細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯ細胞のホーミング能力を示す棒グラフである。１８時間後に、ＢＭをホーミング事象について分析した（群当たりｎ＝６のマウス）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0080】

【図8】図８Ａ〜８Ｆは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＢＭの移植レシピエントマウスが移植の１６週間後に系列の変化または欠陥を示さないことを示す図である。図８Ａ〜８Ｃは、二次移植の１６週間後の二次２００Ｋ移植レシピエントマウス由来のＢＭにおけるドナー由来の（ＣＤ４５．２^＋）ＴＮＣ（８Ａ）、拘束前駆細胞（８Ｂ）および系列細胞（８Ｃ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（各群についてｎ＝７〜１０）。図８Ｄ〜８Ｆは、二次移植の１６週間後の二次２００Ｋ移植レシピエントマウス由来の脾臓におけるドナー由来の（ＣＤ４５．２^＋）ＴＮＣ（８Ｄ）、拘束前駆細胞（８Ｅ）、および系列細胞（８Ｆ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（各群についてｎ＝７〜１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0081】

【図9-1】図９Ａ〜９Ｋは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯが、系列の偏りを誘導することなく、ｉｎｖｉｖｏにおけるマウスＨＳＣ増大に対する長期にわたる効果を有することを示す図である。図９Ａは、ｐＩ：ｐＣ誘導の５〜７カ月後にｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスから採取したＢＭおよび脾臓をフローサイトメトリーによって分析したことを示す概略図である。図９Ｂ〜９Ｅは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスのＢＭにおけるＴＮＣ（図９Ｂ）、ＨＳＰＣ（図９Ｃ）、拘束前駆細胞（図９Ｄ）および系列細胞（図９Ｅ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｆは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の脾臓の重量を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｇ〜９Ｊは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスの脾臓におけるＴＮＣ（図９Ｇ）、ＬＳＫＣＤ４８⁻ＣＤ１５０^＋ＨＳＣ（図９Ｈ）、拘束前駆細胞（図９Ｉ）および系列細胞（図９Ｊ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｋは、ｐＩ：ｐＣ注射の５カ月後に、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＷＢＭ７５ｋ個をレスキュー細胞２００Ｋ個と共に、致死的に照射を受けたレシピエントに移植したことを示す概略図およびグラフである。移植レシピエント由来の末梢血を移植後４週間ごとに分析して、ドナー由来の生着を決定した（各群ｎ＝１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図9-2】図９Ａ〜９Ｋは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯが、系列の偏りを誘導することなく、ｉｎｖｉｖｏにおけるマウスＨＳＣ増大に対する長期にわたる効果を有することを示す図である。図９Ａは、ｐＩ：ｐＣ誘導の５〜７カ月後にｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスから採取したＢＭおよび脾臓をフローサイトメトリーによって分析したことを示す概略図である。図９Ｂ〜９Ｅは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスのＢＭにおけるＴＮＣ（図９Ｂ）、ＨＳＰＣ（図９Ｃ）、拘束前駆細胞（図９Ｄ）および系列細胞（図９Ｅ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｆは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の脾臓の重量を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｇ〜９Ｊは、誘導の５〜７カ月後のｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスの脾臓におけるＴＮＣ（図９Ｇ）、ＬＳＫＣＤ４８⁻ＣＤ１５０^＋ＨＳＣ（図９Ｈ）、拘束前駆細胞（図９Ｉ）および系列細胞（図９Ｊ）の絶対細胞数を示す棒グラフである（群当たりｎ＝４〜７のマウス）。図９Ｋは、ｐＩ：ｐＣ注射の５カ月後に、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＷＢＭ７５ｋ個をレスキュー細胞２００Ｋ個と共に、致死的に照射を受けたレシピエントに移植したことを示す概略図およびグラフである。移植レシピエント由来の末梢血を移植後４週間ごとに分析して、ドナー由来の生着を決定した（各群ｎ＝１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0082】

【図10-1】図１０Ａ〜１０Ｄは、マウスＨＳＰＣにおけるｍ^６Ａ修飾の分子特徴付けを示す図である。図１０Ａは、ＴＳＳ（上）および終止コドン（下）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルのプロットを示す。ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図１０Ｂは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図１０Ｃは、発現レベルに応じたセグメントのそれぞれにおける、ｍ^６Ａピークを有するマウスＨＰＳＣにおける遺伝子の画分のプロットを示す。図１０Ｄは、ＨＳＰＣにおけるアクチノマイシンＤによる処置の０時間後および４時間後の発現レベルの分析によって決定されたｍ^６Ａタグを有するおよびｍ^６Ａタグを有さないｍＲＮＡの分解速度のグラフを示す。

【図10-2】図１０Ａ〜１０Ｄは、マウスＨＳＰＣにおけるｍ^６Ａ修飾の分子特徴付けを示す図である。図１０Ａは、ＴＳＳ（上）および終止コドン（下）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルのプロットを示す。ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図１０Ｂは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図１０Ｃは、発現レベルに応じたセグメントのそれぞれにおける、ｍ^６Ａピークを有するマウスＨＰＳＣにおける遺伝子の画分のプロットを示す。図１０Ｄは、ＨＳＰＣにおけるアクチノマイシンＤによる処置の０時間後および４時間後の発現レベルの分析によって決定されたｍ^６Ａタグを有するおよびｍ^６Ａタグを有さないｍＲＮＡの分解速度のグラフを示す。

【図10-3】図１０Ａ〜１０Ｄは、マウスＨＳＰＣにおけるｍ^６Ａ修飾の分子特徴付けを示す図である。図１０Ａは、ＴＳＳ（上）および終止コドン（下）周囲のウィンドウ内の配列カバレッジを示すメタ遺伝子プロファイルのプロットを示す。ｍ^６ＡＩＰおよび対照（インプット）断片のカバレッジがそれぞれ赤色および灰色で示されている。図１０Ｂは、５つの転写物セグメントのそれぞれにおけるｍ^６Ａピークの画分を示す円グラフを示す。図１０Ｃは、発現レベルに応じたセグメントのそれぞれにおける、ｍ^６Ａピークを有するマウスＨＰＳＣにおける遺伝子の画分のプロットを示す。図１０Ｄは、ＨＳＰＣにおけるアクチノマイシンＤによる処置の０時間後および４時間後の発現レベルの分析によって決定されたｍ^６Ａタグを有するおよびｍ^６Ａタグを有さないｍＲＮＡの分解速度のグラフを示す。

【0083】

【図11-1】図１１Ａ〜１１Ｅは、マウスＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の機能性をｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑによって定義する図である。図１１Ａは、対照ＨＰＣ７細胞またはＦｌａｇ−Ｙｔｈｄｆ２過剰発現ＨＰＣ７細胞におけるＹｔｈｄｆ２の免疫沈降を示す画像である。図１１Ｂは、ＩＲ８００標識されたＲＮＡ−Ｙｔｈｄｆ２複合体を示すｉｒＣＬＩＰメンブレン画像である。赤色の四角は、ライブラリー構築のために採取したＲＮＡ−Ｙｔｈｄｆ２複合体を示し、ＵＶ架橋結合を有さない試料が対照として働く。図１１Ｃは、３回の独立したＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１１Ｄは、Ｙｔｈｄｆ２結合性標的とｍ^６Ａ標識されたｍＲＮＡの重複を示すベン図である。図１１Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＧａｔａ２の代表的なトラックを示す。ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。

【図11-2】図１１Ａ〜１１Ｅは、マウスＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の機能性をｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑによって定義する図である。図１１Ａは、対照ＨＰＣ７細胞またはＦｌａｇ−Ｙｔｈｄｆ２過剰発現ＨＰＣ７細胞におけるＹｔｈｄｆ２の免疫沈降を示す画像である。図１１Ｂは、ＩＲ８００標識されたＲＮＡ−Ｙｔｈｄｆ２複合体を示すｉｒＣＬＩＰメンブレン画像である。赤色の四角は、ライブラリー構築のために採取したＲＮＡ−Ｙｔｈｄｆ２複合体を示し、ＵＶ架橋結合を有さない試料が対照として働く。図１１Ｃは、３回の独立したＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１１Ｄは、Ｙｔｈｄｆ２結合性標的とｍ^６Ａ標識されたｍＲＮＡの重複を示すベン図である。図１１Ｅは、ｍ^６ＡピークおよびＹｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰピークを有するＧａｔａ２の代表的なトラックを示す。ｍ^６Ａ免疫沈降のカバレッジおよびインプット断片がそれぞれ赤色および灰色で示されており、Ｙｔｈｄｆ２ｉｒＣＬＩＰリードが黄色で強調表示されている。

【0084】

【図12-1】図１２Ａ〜１２Ｆは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯが、ｍ^６Ａタグを有するｍＲＮＡの発現を増大させ、それにより、ＨＳＣ増大に寄与することを示す図である。図１２Ａは、選別されたＢＭＬＳＫＦｌｋ２⁻細胞１５，０００個から全ＲＮＡを抽出したことを示す棒グラフである。図１２Ｂは、ｗｔＬｉｎ⁻細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯＬｉｎ⁻細胞（ｎ＝６）におけるｍ^６ＡＲＮＡメチル化の定量化を示す。図１２Ｃは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＬＴ−ＨＳＣにおける、ｗｔＬＴ−ＨＳＣと比較したＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＳＴＡＴ５の発現の増大を示す細胞内フロー検証を示す定量化（右）およびヒストグラム（左）を示す（群当たりｎ＝３のマウス）。図１２Ｄは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＧａｔａ２ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す。矢マークは共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図１２Ｅは、ｗｔおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＧａｔａ２ｍＲＮＡとＤＣＰ１ａの共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｇａｔａ２ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＧａｔａ２ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝１２〜２０）。図１２Ｆは、移植の４週間後のＣＤ４５^＋集団におけるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図12-2】図１２Ａ〜１２Ｆは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯが、ｍ^６Ａタグを有するｍＲＮＡの発現を増大させ、それにより、ＨＳＣ増大に寄与することを示す図である。図１２Ａは、選別されたＢＭＬＳＫＦｌｋ２⁻細胞１５，０００個から全ＲＮＡを抽出したことを示す棒グラフである。図１２Ｂは、ｗｔＬｉｎ⁻細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯＬｉｎ⁻細胞（ｎ＝６）におけるｍ^６ＡＲＮＡメチル化の定量化を示す。図１２Ｃは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＬＴ−ＨＳＣにおける、ｗｔＬＴ−ＨＳＣと比較したＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＳＴＡＴ５の発現の増大を示す細胞内フロー検証を示す定量化（右）およびヒストグラム（左）を示す（群当たりｎ＝３のマウス）。図１２Ｄは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＧａｔａ２ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す。矢マークは共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図１２Ｅは、ｗｔおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＧａｔａ２ｍＲＮＡとＤＣＰ１ａの共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｇａｔａ２ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＧａｔａ２ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝１２〜２０）。図１２Ｆは、移植の４週間後のＣＤ４５^＋集団におけるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図12-3】図１２Ａ〜１２Ｆは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯが、ｍ^６Ａタグを有するｍＲＮＡの発現を増大させ、それにより、ＨＳＣ増大に寄与することを示す図である。図１２Ａは、選別されたＢＭＬＳＫＦｌｋ２⁻細胞１５，０００個から全ＲＮＡを抽出したことを示す棒グラフである。図１２Ｂは、ｗｔＬｉｎ⁻細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯＬｉｎ⁻細胞（ｎ＝６）におけるｍ^６ＡＲＮＡメチル化の定量化を示す。図１２Ｃは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＬＴ−ＨＳＣにおける、ｗｔＬＴ−ＨＳＣと比較したＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＳＴＡＴ５の発現の増大を示す細胞内フロー検証を示す定量化（右）およびヒストグラム（左）を示す（群当たりｎ＝３のマウス）。図１２Ｄは、ｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＧａｔａ２ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（赤色）およびＤｃｐ１ａ（Ｐ−ｂｏｄｙマーカー）（赤紫色）、Ｙｔｈｄｆ２（緑色）の蛍光免疫染色を示す。矢マークは共局在染色を示す。スケールバー、５μｍ。図１２Ｅは、ｗｔおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の選別されたＬＳＫ細胞におけるＧａｔａ２ｍＲＮＡとＤＣＰ１ａの共局在の定量化を示す。パーセンテージは、各ＬＳＫ細胞における総Ｇａｔａ２ｍＲＮＡレベルに対するＤＣＰ１ａと共局在したＧａｔａ２ｍＲＮＡの平均頻度を示す（ｎ＝１２〜２０）。図１２Ｆは、移植の４週間後のＣＤ４５^＋集団におけるＧＦＰ^＋細胞のパーセンテージを示す（ｎ＝１０）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0085】

【図13-1】図１３Ａ〜１３Ｇは、ＹＴＨＤＦ２により、ヒト臍帯血幹細胞における幹細胞の自己複製に関連する転写因子の発現が制御されることを示す図である。図１３Ａは、３つの独立した臍帯血試料を使用した３回の独立したｍ^６Ａ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１３Ｂは、ｍ^６Ａピークを含有するｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡのパーセンテージの円グラフを示す。図１３Ｃは、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａ修飾を有する転写因子のＧＯ富化分析を示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、選別されたＧＦＰ^＋対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２（上）およびβ−アクチン（下）のウエスタンブロッティングの画像を示す。図１３Ｅは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＹＴＨＤＦ２の発現レベル（左）および代表的なトラックプロット（右）の棒グラフを示す。図１３Ｆ〜１３Ｇは、示されているｍ^６Ａピークを有する転写因子の代表的なトラックプロット（上）およびそれらのＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロット（下）である。調整したＰ値が示されている。

【図13-2】図１３Ａ〜１３Ｇは、ＹＴＨＤＦ２により、ヒト臍帯血幹細胞における幹細胞の自己複製に関連する転写因子の発現が制御されることを示す図である。図１３Ａは、３つの独立した臍帯血試料を使用した３回の独立したｍ^６Ａ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１３Ｂは、ｍ^６Ａピークを含有するｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡのパーセンテージの円グラフを示す。図１３Ｃは、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａ修飾を有する転写因子のＧＯ富化分析を示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、選別されたＧＦＰ^＋対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２（上）およびβ−アクチン（下）のウエスタンブロッティングの画像を示す。図１３Ｅは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＹＴＨＤＦ２の発現レベル（左）および代表的なトラックプロット（右）の棒グラフを示す。図１３Ｆ〜１３Ｇは、示されているｍ^６Ａピークを有する転写因子の代表的なトラックプロット（上）およびそれらのＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロット（下）である。調整したＰ値が示されている。

【図13-3】図１３Ａ〜１３Ｇは、ＹＴＨＤＦ２により、ヒト臍帯血幹細胞における幹細胞の自己複製に関連する転写因子の発現が制御されることを示す図である。図１３Ａは、３つの独立した臍帯血試料を使用した３回の独立したｍ^６Ａ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１３Ｂは、ｍ^６Ａピークを含有するｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡのパーセンテージの円グラフを示す。図１３Ｃは、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａ修飾を有する転写因子のＧＯ富化分析を示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、選別されたＧＦＰ^＋対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２（上）およびβ−アクチン（下）のウエスタンブロッティングの画像を示す。図１３Ｅは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＹＴＨＤＦ２の発現レベル（左）および代表的なトラックプロット（右）の棒グラフを示す。図１３Ｆ〜１３Ｇは、示されているｍ^６Ａピークを有する転写因子の代表的なトラックプロット（上）およびそれらのＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロット（下）である。調整したＰ値が示されている。

【図13-4】図１３Ａ〜１３Ｇは、ＹＴＨＤＦ２により、ヒト臍帯血幹細胞における幹細胞の自己複製に関連する転写因子の発現が制御されることを示す図である。図１３Ａは、３つの独立した臍帯血試料を使用した３回の独立したｍ^６Ａ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１３Ｂは、ｍ^６Ａピークを含有するｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡのパーセンテージの円グラフを示す。図１３Ｃは、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａ修飾を有する転写因子のＧＯ富化分析を示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、選別されたＧＦＰ^＋対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２（上）およびβ−アクチン（下）のウエスタンブロッティングの画像を示す。図１３Ｅは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＹＴＨＤＦ２の発現レベル（左）および代表的なトラックプロット（右）の棒グラフを示す。図１３Ｆ〜１３Ｇは、示されているｍ^６Ａピークを有する転写因子の代表的なトラックプロット（上）およびそれらのＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロット（下）である。調整したＰ値が示されている。

【図13-5】図１３Ａ〜１３Ｇは、ＹＴＨＤＦ２により、ヒト臍帯血幹細胞における幹細胞の自己複製に関連する転写因子の発現が制御されることを示す図である。図１３Ａは、３つの独立した臍帯血試料を使用した３回の独立したｍ^６Ａ−ｓｅｑ実験において同定された交差遺伝子を示すベン図である。図１３Ｂは、ｍ^６Ａピークを含有するｍＲＮＡおよび非コードＲＮＡのパーセンテージの円グラフを示す。図１３Ｃは、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａ修飾を有する転写因子のＧＯ富化分析を示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、選別されたＧＦＰ^＋対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２（上）およびβ−アクチン（下）のウエスタンブロッティングの画像を示す。図１３Ｅは、ＹＴＨＤＦ２のノックダウン効率を示す、対照およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞のＲＮＡ−ｓｅｑ分析からのＹＴＨＤＦ２の発現レベル（左）および代表的なトラックプロット（右）の棒グラフを示す。図１３Ｆ〜１３Ｇは、示されているｍ^６Ａピークを有する転写因子の代表的なトラックプロット（上）およびそれらのＲＮＡ−ｓｅｑ分析からの代表的なカバレッジプロット（下）である。調整したＰ値が示されている。

【0086】

【図14-1】図１４Ａ〜１４Ｃは、ｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２ＫＤの結果、系列アウトプットを変化させることなくＨＳＣ増大がもたされることを示す図である。図１４Ａは、７日間培養した後の、対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＥＰＣＲ^＋ＨＳＣの代表的なフロープロットを示す。図１４Ｂは、形質導入されたＨｅｌａ細胞におけるＹＴＨＤＦ２タンパク質ノックダウンおよび過剰発現の確認を示す。図１４Ｃは、培養１０日目のＹＴＨＤＦ２ＯＥおよび対照形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＢによるＣＦＵ生成を示す（ｎ＝３回の独立したヒト試料）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図14-2】図１４Ａ〜１４Ｃは、ｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２ＫＤの結果、系列アウトプットを変化させることなくＨＳＣ増大がもたされることを示す図である。図１４Ａは、７日間培養した後の、対照ｈＵＣＢ細胞およびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞におけるＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＥＰＣＲ^＋ＨＳＣの代表的なフロープロットを示す。図１４Ｂは、形質導入されたＨｅｌａ細胞におけるＹＴＨＤＦ２タンパク質ノックダウンおよび過剰発現の確認を示す。図１４Ｃは、培養１０日目のＹＴＨＤＦ２ＯＥおよび対照形質導入ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＢによるＣＦＵ生成を示す（ｎ＝３回の独立したヒト試料）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0087】

【図15-1】図１５Ａ〜１５Ｄは、ｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２ＫＤの結果、系列アウトプットを変化させることなくＨＳＣ増大がもたらされることを示す図である。図１５Ａは、一次ＮＳＧレシピエントＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋単球、巨核球（ＭＫ細胞）、Ｂ細胞および赤血球の代表的なフロープロットを含む。図１５Ｂおよび１５Ｃは、移植の１０週間後の一次ＮＳＧレシピエント由来のｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋ＢＭ細胞（図１５Ｂ）および総ＣＤ４５^＋ＢＭ細胞（図１５Ｃ）における系列細胞のパーセンテージを示す棒グラフである（ｎ＝１３〜１５）。図１５Ｄは、移植の１２週間後の二次ＮＳＧレシピエント由来の総ＣＤ４５^＋ＢＭ細胞におけるヒトドナー由来の系列キメラ化の要約を示す棒グラフである（ｎ＝６）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【図15-2】図１５Ａ〜１５Ｄは、ｈＵＣＢ細胞におけるＹＴＨＤＦ２ＫＤの結果、系列アウトプットを変化させることなくＨＳＣ増大がもたらされることを示す図である。図１５Ａは、一次ＮＳＧレシピエントＢＭにおけるｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋単球、巨核球（ＭＫ細胞）、Ｂ細胞および赤血球の代表的なフロープロットを含む。図１５Ｂおよび１５Ｃは、移植の１０週間後の一次ＮＳＧレシピエント由来のｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋ＢＭ細胞（図１５Ｂ）および総ＣＤ４５^＋ＢＭ細胞（図１５Ｃ）における系列細胞のパーセンテージを示す棒グラフである（ｎ＝１３〜１５）。図１５Ｄは、移植の１２週間後の二次ＮＳＧレシピエント由来の総ＣＤ４５^＋ＢＭ細胞におけるヒトドナー由来の系列キメラ化の要約を示す棒グラフである（ｎ＝６）。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。対応のないｔ検定。ｎ．ｓ．、有意でない。

【0088】

【図16】図１６は、ｉｎｖｉｖｏにおける間葉系幹細胞の増大を示すグラフである。図１６は、ｗｔＹｔｈｄｆ２を有するＴＮＣとＹｔｈｄｆ２ノックアウト（ＫＯ）を有するＴＮＣにおけるＮ−Ｃａｄ＋ＣＤ１０５＋の頻度の両方を示す棒グラフである。

【0089】

【図17-1】図１７Ａ〜１７Ｊは、ｒＨＳＣ集団の機能的同定を示す図である。図１７Ａは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰについてのＦＡＣＳ選別の略図である。図１７Ｂは、移植アッセイによるｒＨＳＣおよびｐＨＳＣ機能の定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｃは、移植の４０週間後のｒＨＳＣまたはｐＨＳＣを移植したマウスのドナー由来細胞を示す。図１７Ｄは、追跡の１３０日後のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＨ２Ｂ−ＧＦＰ標識を有する細胞（群当たりｎ＝４のマウス）を示す。図１７Ｅは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおける細胞周期遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｆは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを移植されたレシピエントが示されている通り移植の４週間後に５ＦＵ注射を受けたことを示す。示されている移植後の週におけるドナー生着細胞についてのＰＢ分析。移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを示した（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｇは、５ＦＵ処置後３日目のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを示す（マウス１５匹からのプール）。図１７Ｈは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵ後３日目のマウス由来のｒＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子を示す（対照マウス群はｎ＝２０、Ｄ３５ＦＵマウス群はｎ＝４０）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１７Ｊは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣにおけるストレス応答遺伝子のヒートマップを示す。

【図17-2】図１７Ａ〜１７Ｊは、ｒＨＳＣ集団の機能的同定を示す図である。図１７Ａは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰについてのＦＡＣＳ選別の略図である。図１７Ｂは、移植アッセイによるｒＨＳＣおよびｐＨＳＣ機能の定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｃは、移植の４０週間後のｒＨＳＣまたはｐＨＳＣを移植したマウスのドナー由来細胞を示す。図１７Ｄは、追跡の１３０日後のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＨ２Ｂ−ＧＦＰ標識を有する細胞（群当たりｎ＝４のマウス）を示す。図１７Ｅは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおける細胞周期遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｆは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを移植されたレシピエントが示されている通り移植の４週間後に５ＦＵ注射を受けたことを示す。示されている移植後の週におけるドナー生着細胞についてのＰＢ分析。移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを示した（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｇは、５ＦＵ処置後３日目のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを示す（マウス１５匹からのプール）。図１７Ｈは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵ後３日目のマウス由来のｒＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子を示す（対照マウス群はｎ＝２０、Ｄ３５ＦＵマウス群はｎ＝４０）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１７Ｊは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣにおけるストレス応答遺伝子のヒートマップを示す。

【図17-3】図１７Ａ〜１７Ｊは、ｒＨＳＣ集団の機能的同定を示す図である。図１７Ａは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰについてのＦＡＣＳ選別の略図である。図１７Ｂは、移植アッセイによるｒＨＳＣおよびｐＨＳＣ機能の定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｃは、移植の４０週間後のｒＨＳＣまたはｐＨＳＣを移植したマウスのドナー由来細胞を示す。図１７Ｄは、追跡の１３０日後のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＨ２Ｂ−ＧＦＰ標識を有する細胞（群当たりｎ＝４のマウス）を示す。図１７Ｅは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおける細胞周期遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｆは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを移植されたレシピエントが示されている通り移植の４週間後に５ＦＵ注射を受けたことを示す。示されている移植後の週におけるドナー生着細胞についてのＰＢ分析。移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを示した（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｇは、５ＦＵ処置後３日目のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを示す（マウス１５匹からのプール）。図１７Ｈは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵ後３日目のマウス由来のｒＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子を示す（対照マウス群はｎ＝２０、Ｄ３５ＦＵマウス群はｎ＝４０）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１７Ｊは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣにおけるストレス応答遺伝子のヒートマップを示す。

【図17-4】図１７Ａ〜１７Ｊは、ｒＨＳＣ集団の機能的同定を示す図である。図１７Ａは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰについてのＦＡＣＳ選別の略図である。図１７Ｂは、移植アッセイによるｒＨＳＣおよびｐＨＳＣ機能の定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｃは、移植の４０週間後のｒＨＳＣまたはｐＨＳＣを移植したマウスのドナー由来細胞を示す。図１７Ｄは、追跡の１３０日後のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＨ２Ｂ−ＧＦＰ標識を有する細胞（群当たりｎ＝４のマウス）を示す。図１７Ｅは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおける細胞周期遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｆは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを移植されたレシピエントが示されている通り移植の４週間後に５ＦＵ注射を受けたことを示す。示されている移植後の週におけるドナー生着細胞についてのＰＢ分析。移植の２０週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージを示した（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１７Ｇは、５ＦＵ処置後３日目のｒＨＳＣおよびｐＨＳＣを示す（マウス１５匹からのプール）。図１７Ｈは、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子発現を示す（マウス２０匹からのｎ＝３の反復実験）。図１７Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵ後３日目のマウス由来のｒＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷遺伝子を示す（対照マウス群はｎ＝２０、Ｄ３５ＦＵマウス群はｎ＝４０）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１７Ｊは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣにおけるストレス応答遺伝子のヒートマップを示す。

【0090】

【図18-1】図１８Ａ〜１８Ｉは、ｒＨＳＣがＢＭニッチ内の骨内膜領域近くに位置することを示す図である。図１８Ａは、マウス胸骨骨髄（ＢＭ）の、骨（白色、第二次高調波発生、ＳＨＧによって作成）、ＭＫ（黄色、サイズ、形態およびＣＤ４１発現によって区別される）を伴う代表的なホールマウント画像を示す。緑色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣを示し、白色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣを示す。図１８Ｂは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの代表的な画像を示す。白色の矢マークは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣ、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣおよび表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻５ＦＵｒＨＳＣを示す。図１８Ｃ〜Ｅは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの血管、ＭＫまたは骨への相対的な距離を示す（ｎ＝１４４のｒＨＳＣ、ｎ＝６８５のｐＨＳＣ、ｎ＝７０７の５ＦＵｒＨＳＣ）。図１８Ｆは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウスにおける健康なＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞、アポトーシス性ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞および死滅ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞の絶対数を示す。図１８Ｆ〜Ｇは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウス由来の中心骨髄（ＣＭ）におけるアネキシンＶ^＋ＳｙｔｏｘＧ^─アポトーシス性Ｖｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋内皮細胞、またはＣＭおよび骨の両方におけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１８Ｈ〜Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵによる処置後３日目のマウスにおけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋およびＶｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管の代表的な画像を示す。

【図18-2】図１８Ａ〜１８Ｉは、ｒＨＳＣがＢＭニッチ内の骨内膜領域近くに位置することを示す図である。図１８Ａは、マウス胸骨骨髄（ＢＭ）の、骨（白色、第二次高調波発生、ＳＨＧによって作成）、ＭＫ（黄色、サイズ、形態およびＣＤ４１発現によって区別される）を伴う代表的なホールマウント画像を示す。緑色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣを示し、白色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣを示す。図１８Ｂは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの代表的な画像を示す。白色の矢マークは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣ、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣおよび表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻５ＦＵｒＨＳＣを示す。図１８Ｃ〜Ｅは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの血管、ＭＫまたは骨への相対的な距離を示す（ｎ＝１４４のｒＨＳＣ、ｎ＝６８５のｐＨＳＣ、ｎ＝７０７の５ＦＵｒＨＳＣ）。図１８Ｆは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウスにおける健康なＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞、アポトーシス性ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞および死滅ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞の絶対数を示す。図１８Ｆ〜Ｇは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウス由来の中心骨髄（ＣＭ）におけるアネキシンＶ^＋ＳｙｔｏｘＧ^─アポトーシス性Ｖｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋内皮細胞、またはＣＭおよび骨の両方におけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１８Ｈ〜Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵによる処置後３日目のマウスにおけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋およびＶｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管の代表的な画像を示す。

【図18-3】図１８Ａ〜１８Ｉは、ｒＨＳＣがＢＭニッチ内の骨内膜領域近くに位置することを示す図である。図１８Ａは、マウス胸骨骨髄（ＢＭ）の、骨（白色、第二次高調波発生、ＳＨＧによって作成）、ＭＫ（黄色、サイズ、形態およびＣＤ４１発現によって区別される）を伴う代表的なホールマウント画像を示す。緑色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣを示し、白色の矢じりは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣを示す。図１８Ｂは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの代表的な画像を示す。白色の矢マークは、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻ｒＨＳＣ、表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ^＋ｐＨＳＣおよび表現型Ｌｉｎ⁻ＣＤ４８⁻ＣＤ４１⁻ＣＤ１５０^＋ＣＤ４９ｂ⁻５ＦＵｒＨＳＣを示す。図１８Ｃ〜Ｅは、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵｒＨＳＣの血管、ＭＫまたは骨への相対的な距離を示す（ｎ＝１４４のｒＨＳＣ、ｎ＝６８５のｐＨＳＣ、ｎ＝７０７の５ＦＵｒＨＳＣ）。図１８Ｆは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウスにおける健康なＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞、アポトーシス性ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞および死滅ＶＥ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管細胞の絶対数を示す。図１８Ｆ〜Ｇは、対照マウスおよび５ＦＵ処置後１日目のマウス由来の中心骨髄（ＣＭ）におけるアネキシンＶ^＋ＳｙｔｏｘＧ^─アポトーシス性Ｖｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋内皮細胞、またはＣＭおよび骨の両方におけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図１８Ｈ〜Ｉは、対照マウスおよび５ＦＵによる処置後３日目のマウスにおけるＮ−ｃａｄ−ｔｏｍａｔｏ^＋およびＶｅ−Ｃａｄ^＋ＣＤ３１^＋血管の代表的な画像を示す。

【0091】

【図19-1】図１９Ａ〜１９Ｊは、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞により機能的ＨＳＣがＢＭニッチ内に維持されることを示す図である。図１９Ａは、Ｂ〜Ｇに示されている実験に使用したＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスへのＤＴ投与のスキームを示す。Ｄは日を示す（例えば、Ｄ０は０日目を示す）。図１９Ｂは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞によって示されるＮ−ｃａｄ^＋細胞除去効率を示す。図１９Ｃ〜Ｄは、ＴＭＸおよびＤＴ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウス由来の骨髄（ＢＭ）における総有核細胞（ＴＮＣ）およびＨＳＰＣの絶対数を決定するためのフローサイトメトリー分析を示す（群当たりｎ＝５のマウス）。図１９Ｅ〜Ｈは、一次１゜移植および二次２゜移植における移植アッセイによる機能的ＨＳＣの定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞からの総ＢＭ細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の１６週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１９Ｉ〜Ｊは、ＴＭＸおよびＤＴ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ＳＣＦｆ／ｆ（Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＿；ＳＣＦｆ／ｆ、ｎ＝４マウス、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；ＳＣＦｆ／ｆ、ｎ＝６マウス）およびＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆマウス（Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＿；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆ、ｎ＝３マウス、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆ、ｎ＝６マウス）由来の骨髄（ＢＭ）におけるＨＳＰＣの絶対数を決定するためのフローサイトメトリー分析を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図19-2】図１９Ａ〜１９Ｊは、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞により機能的ＨＳＣがＢＭニッチ内に維持されることを示す図である。図１９Ａは、Ｂ〜Ｇに示されている実験に使用したＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスへのＤＴ投与のスキームを示す。Ｄは日を示す（例えば、Ｄ０は０日目を示す）。図１９Ｂは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞によって示されるＮ−ｃａｄ^＋細胞除去効率を示す。図１９Ｃ〜Ｄは、ＴＭＸおよびＤＴ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウス由来の骨髄（ＢＭ）における総有核細胞（ＴＮＣ）およびＨＳＰＣの絶対数を決定するためのフローサイトメトリー分析を示す（群当たりｎ＝５のマウス）。図１９Ｅ〜Ｈは、一次１゜移植および二次２゜移植における移植アッセイによる機能的ＨＳＣの定量化を示す。移植後の示されている週数における総生着ドナー細胞からの総ＢＭ細胞についてのＰＢ分析ならびに移植の１６週間後のドナー由来のＢ系列細胞、Ｔ系列細胞および骨髄系列細胞のパーセンテージ（ｎ＝１群当たり１０匹のマウス）。図１９Ｉ〜Ｊは、ＴＭＸおよびＤＴ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ＳＣＦｆ／ｆ（Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＿；ＳＣＦｆ／ｆ、ｎ＝４マウス、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；ＳＣＦｆ／ｆ、ｎ＝６マウス）およびＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆマウス（Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＿；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆ、ｎ＝３マウス、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ＋；Ｃｘｃｌ１２ｆ／ｆ、ｎ＝６マウス）由来の骨髄（ＢＭ）におけるＨＳＰＣの絶対数を決定するためのフローサイトメトリー分析を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【0092】

【図20-1】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【図20-2】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【図20-3】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【図20-4】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【図20-5】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【図20-6】図２０Ａ〜２０Ｋは、造血細胞およびニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析を示す図である。図２０Ａ〜Ｂは、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｃ〜Ｄは、ＢＭニッチ細胞についてのピアソン距離木およびＰＣＡ分析を示す。図２０Ｅは、造血幹細胞・前駆細胞におけるＨＳＣシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｆは、ニッチ細胞におけるＢＭニッチシグネチャー遺伝子発現を示す。図２０Ｇは、ＢＭニッチ細胞についての用語分析（term analysis）を示す。図２０Ｈは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞における間質細胞発生遺伝子発現を示す。図２０Ｉは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；ネスチン−ＧＦＰマウス、および３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ＺｓＧ；Ｃｘｃｌ１２−ＤｓＲマウスについての系列追跡を示す。図２０Ｊは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の酵素により消化された骨髄細胞を示す。抗体により染色されたＬｅｐＲおよびＰｄｆｇｒαが赤色のピークとして示されている。アイソタイプ対照が灰色のピークとして示されている。図２０Ｋは、骨内膜および血管周囲の帯域由来のニッチ細胞におけるＣＦＵ−Ｆ活性を示す。

【0093】

【図21-1】図２１Ａ〜２１Ｇは、Ｎ−ｃａｄ^＋由来細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化潜在性および局在を示す図である。図２１Ａは、実験設計を示す。図２１Ｂは、酵素により消化された骨髄から培養し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）で染色した生ＣＦＵ−Ｆコロニーを示し、また、１つのコロニー内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞を高い倍率で示す。図２１Ｃ〜Ｅは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の間質細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化：骨分化の２１日後の培養物（２１Ｃ）の生ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞およびアルカリホスファターゼ染色；脂質分化(adipo-differentiation)の２１日後（２１Ｄ）の生Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞およびＯｉｌＲｅｄＯ脂質染色；軟骨分化(chondro-differentiation)の２１日後のＴｏｍａｔｏ^＋細胞（２１Ｅ）のアグリカン抗体染色およびトルイジンブルー染色された軟骨細胞を示す。図２１Ｆ〜Ｇは、（Ｆ〜Ｇ）実験設計を示す。図２１Ｈは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに由来する細胞の６時間、１４時間、２４時間、１週間および４週間の時点での局在を示す。図２１Ｉは、ＴＭＸ注射後１週間、２週間、４週間および６週間の時点での海綿骨、皮質骨および中心骨髄におけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞のパーセンテージを示す（１週間群および２週間群はｎ＝２のマウス、４週間群および６週間群はｎ＝３のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図21-2】図２１Ａ〜２１Ｇは、Ｎ−ｃａｄ^＋由来細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化潜在性および局在を示す図である。図２１Ａは、実験設計を示す。図２１Ｂは、酵素により消化された骨髄から培養し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）で染色した生ＣＦＵ−Ｆコロニーを示し、また、１つのコロニー内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞を高い倍率で示す。図２１Ｃ〜Ｅは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の間質細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化：骨分化の２１日後の培養物（２１Ｃ）の生ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞およびアルカリホスファターゼ染色；脂質分化(adipo-differentiation)の２１日後（２１Ｄ）の生Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞およびＯｉｌＲｅｄＯ脂質染色；軟骨分化(chondro-differentiation)の２１日後のＴｏｍａｔｏ^＋細胞（２１Ｅ）のアグリカン抗体染色およびトルイジンブルー染色された軟骨細胞を示す。図２１Ｆ〜Ｇは、（Ｆ〜Ｇ）実験設計を示す。図２１Ｈは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに由来する細胞の６時間、１４時間、２４時間、１週間および４週間の時点での局在を示す。図２１Ｉは、ＴＭＸ注射後１週間、２週間、４週間および６週間の時点での海綿骨、皮質骨および中心骨髄におけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞のパーセンテージを示す（１週間群および２週間群はｎ＝２のマウス、４週間群および６週間群はｎ＝３のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図21-3】図２１Ａ〜２１Ｇは、Ｎ−ｃａｄ^＋由来細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化潜在性および局在を示す図である。図２１Ａは、実験設計を示す。図２１Ｂは、酵素により消化された骨髄から培養し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）で染色した生ＣＦＵ−Ｆコロニーを示し、また、１つのコロニー内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞を高い倍率で示す。図２１Ｃ〜Ｅは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の間質細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化：骨分化の２１日後の培養物（２１Ｃ）の生ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞およびアルカリホスファターゼ染色；脂質分化(adipo-differentiation)の２１日後（２１Ｄ）の生Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞およびＯｉｌＲｅｄＯ脂質染色；軟骨分化(chondro-differentiation)の２１日後のＴｏｍａｔｏ^＋細胞（２１Ｅ）のアグリカン抗体染色およびトルイジンブルー染色された軟骨細胞を示す。図２１Ｆ〜Ｇは、（Ｆ〜Ｇ）実験設計を示す。図２１Ｈは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに由来する細胞の６時間、１４時間、２４時間、１週間および４週間の時点での局在を示す。図２１Ｉは、ＴＭＸ注射後１週間、２週間、４週間および６週間の時点での海綿骨、皮質骨および中心骨髄におけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞のパーセンテージを示す（１週間群および２週間群はｎ＝２のマウス、４週間群および６週間群はｎ＝３のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図21-4】図２１Ａ〜２１Ｇは、Ｎ−ｃａｄ^＋由来細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化潜在性および局在を示す図である。図２１Ａは、実験設計を示す。図２１Ｂは、酵素により消化された骨髄から培養し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）で染色した生ＣＦＵ−Ｆコロニーを示し、また、１つのコロニー内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞を高い倍率で示す。図２１Ｃ〜Ｅは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の間質細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化：骨分化の２１日後の培養物（２１Ｃ）の生ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞およびアルカリホスファターゼ染色；脂質分化(adipo-differentiation)の２１日後（２１Ｄ）の生Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞およびＯｉｌＲｅｄＯ脂質染色；軟骨分化(chondro-differentiation)の２１日後のＴｏｍａｔｏ^＋細胞（２１Ｅ）のアグリカン抗体染色およびトルイジンブルー染色された軟骨細胞を示す。図２１Ｆ〜Ｇは、（Ｆ〜Ｇ）実験設計を示す。図２１Ｈは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに由来する細胞の６時間、１４時間、２４時間、１週間および４週間の時点での局在を示す。図２１Ｉは、ＴＭＸ注射後１週間、２週間、４週間および６週間の時点での海綿骨、皮質骨および中心骨髄におけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞のパーセンテージを示す（１週間群および２週間群はｎ＝２のマウス、４週間群および６週間群はｎ＝３のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図21-5】図２１Ａ〜２１Ｇは、Ｎ−ｃａｄ^＋由来細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化潜在性および局在を示す図である。図２１Ａは、実験設計を示す。図２１Ｂは、酵素により消化された骨髄から培養し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）で染色した生ＣＦＵ−Ｆコロニーを示し、また、１つのコロニー内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞を高い倍率で示す。図２１Ｃ〜Ｅは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の間質細胞のｉｎｖｉｔｒｏにおける分化：骨分化の２１日後の培養物（２１Ｃ）の生ｔｄＴｏｍａｔｏ^＋細胞およびアルカリホスファターゼ染色；脂質分化(adipo-differentiation)の２１日後（２１Ｄ）の生Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞およびＯｉｌＲｅｄＯ脂質染色；軟骨分化(chondro-differentiation)の２１日後のＴｏｍａｔｏ^＋細胞（２１Ｅ）のアグリカン抗体染色およびトルイジンブルー染色された軟骨細胞を示す。図２１Ｆ〜Ｇは、（Ｆ〜Ｇ）実験設計を示す。図２１Ｈは、ＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに由来する細胞の６時間、１４時間、２４時間、１週間および４週間の時点での局在を示す。図２１Ｉは、ＴＭＸ注射後１週間、２週間、４週間および６週間の時点での海綿骨、皮質骨および中心骨髄におけるＴｏｍａｔｏ^＋細胞のパーセンテージを示す（１週間群および２週間群はｎ＝２のマウス、４週間群および６週間群はｎ＝３のマウス。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【0094】

【図22-1】図２２Ａ〜２２Ｋは、成体マウスにおいてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞および脂肪細胞が生じることを示す図である。図２２Ａは、解剖学的分布およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞の生成の増加を示す、ＴＭＸ注射後の異なる時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの代表的な大腿骨切片を示す。スケールバー、１００μｍ。図２２Ｂ〜Ｃは、６時間（２２Ｂ）および１４時間（２２Ｃ）で示された領域ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉにおける、ＴＭＸ後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの高倍率画像を示す。中空の矢じりは、ＴＭＸの６時間後および１４時間後のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３ＧＦＰ^＋骨芽細胞（黄色細胞）を示し、中実の矢じりは、海綿領域（ｉｉ、ｉｖ、ｖ）および皮質領域（ｉｉｉ、ｖｉ）において組み換えられたＮ−ｃａｄを示す（緑色）。これらの細胞は、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰが存在しないことによって示される通り、潜在的に未分化である。スケールバー、５０μｍ。図２２Ｄ〜Ｅは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｄ）および緻密骨（２２Ｅ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ⁻細胞のパーセンテージを示す、画像定量化を示す。図２２Ｆは、海綿骨と緻密骨の間で潜在的に未分化のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^─のパーセンテージを比較した画像定量化を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図２２Ｇは、ＴＭＸ注射の４週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｈは、ＴＭＸ注射の４週間後の、ペリリピン染色されたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の大腿骨切片の代表的な低倍率および高倍率画像を示す。骨膜領域（ｉ）、海綿領域付近の骨髄（ｉｉ）および中心骨髄（ｉｉｉ）において、中実の矢じりは、Ｎ−ｃａｄ^＋ＭＳＣに由来するＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋を示す。図２２Ｉは、ＢＯＤＩＰＹ染色を示し、Ｔｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞（矢じり）の内側の脂肪滴（緑色）が示された。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｊ〜Ｋは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｊ）および骨膜領域（２２Ｋ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞の画像定量化を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図22-2】図２２Ａ〜２２Ｋは、成体マウスにおいてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞および脂肪細胞が生じることを示す図である。図２２Ａは、解剖学的分布およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞の生成の増加を示す、ＴＭＸ注射後の異なる時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの代表的な大腿骨切片を示す。スケールバー、１００μｍ。図２２Ｂ〜Ｃは、６時間（２２Ｂ）および１４時間（２２Ｃ）で示された領域ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉにおける、ＴＭＸ後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの高倍率画像を示す。中空の矢じりは、ＴＭＸの６時間後および１４時間後のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３ＧＦＰ^＋骨芽細胞（黄色細胞）を示し、中実の矢じりは、海綿領域（ｉｉ、ｉｖ、ｖ）および皮質領域（ｉｉｉ、ｖｉ）において組み換えられたＮ−ｃａｄを示す（緑色）。これらの細胞は、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰが存在しないことによって示される通り、潜在的に未分化である。スケールバー、５０μｍ。図２２Ｄ〜Ｅは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｄ）および緻密骨（２２Ｅ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ⁻細胞のパーセンテージを示す、画像定量化を示す。図２２Ｆは、海綿骨と緻密骨の間で潜在的に未分化のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^─のパーセンテージを比較した画像定量化を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図２２Ｇは、ＴＭＸ注射の４週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｈは、ＴＭＸ注射の４週間後の、ペリリピン染色されたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の大腿骨切片の代表的な低倍率および高倍率画像を示す。骨膜領域（ｉ）、海綿領域付近の骨髄（ｉｉ）および中心骨髄（ｉｉｉ）において、中実の矢じりは、Ｎ−ｃａｄ^＋ＭＳＣに由来するＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋を示す。図２２Ｉは、ＢＯＤＩＰＹ染色を示し、Ｔｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞（矢じり）の内側の脂肪滴（緑色）が示された。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｊ〜Ｋは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｊ）および骨膜領域（２２Ｋ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞の画像定量化を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図22-3】図２２Ａ〜２２Ｋは、成体マウスにおいてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞および脂肪細胞が生じることを示す図である。図２２Ａは、解剖学的分布およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞の生成の増加を示す、ＴＭＸ注射後の異なる時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの代表的な大腿骨切片を示す。スケールバー、１００μｍ。図２２Ｂ〜Ｃは、６時間（２２Ｂ）および１４時間（２２Ｃ）で示された領域ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉにおける、ＴＭＸ後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの高倍率画像を示す。中空の矢じりは、ＴＭＸの６時間後および１４時間後のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３ＧＦＰ^＋骨芽細胞（黄色細胞）を示し、中実の矢じりは、海綿領域（ｉｉ、ｉｖ、ｖ）および皮質領域（ｉｉｉ、ｖｉ）において組み換えられたＮ−ｃａｄを示す（緑色）。これらの細胞は、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰが存在しないことによって示される通り、潜在的に未分化である。スケールバー、５０μｍ。図２２Ｄ〜Ｅは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｄ）および緻密骨（２２Ｅ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ⁻細胞のパーセンテージを示す、画像定量化を示す。図２２Ｆは、海綿骨と緻密骨の間で潜在的に未分化のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^─のパーセンテージを比較した画像定量化を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図２２Ｇは、ＴＭＸ注射の４週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｈは、ＴＭＸ注射の４週間後の、ペリリピン染色されたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の大腿骨切片の代表的な低倍率および高倍率画像を示す。骨膜領域（ｉ）、海綿領域付近の骨髄（ｉｉ）および中心骨髄（ｉｉｉ）において、中実の矢じりは、Ｎ−ｃａｄ^＋ＭＳＣに由来するＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋を示す。図２２Ｉは、ＢＯＤＩＰＹ染色を示し、Ｔｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞（矢じり）の内側の脂肪滴（緑色）が示された。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｊ〜Ｋは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｊ）および骨膜領域（２２Ｋ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞の画像定量化を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【図22-4】図２２Ａ〜２２Ｋは、成体マウスにおいてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞および脂肪細胞が生じることを示す図である。図２２Ａは、解剖学的分布およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞の生成の増加を示す、ＴＭＸ注射後の異なる時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの代表的な大腿骨切片を示す。スケールバー、１００μｍ。図２２Ｂ〜Ｃは、６時間（２２Ｂ）および１４時間（２２Ｃ）で示された領域ｉ、ｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉにおける、ＴＭＸ後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスの高倍率画像を示す。中空の矢じりは、ＴＭＸの６時間後および１４時間後のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３ＧＦＰ^＋骨芽細胞（黄色細胞）を示し、中実の矢じりは、海綿領域（ｉｉ、ｉｖ、ｖ）および皮質領域（ｉｉｉ、ｖｉ）において組み換えられたＮ−ｃａｄを示す（緑色）。これらの細胞は、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰが存在しないことによって示される通り、潜在的に未分化である。スケールバー、５０μｍ。図２２Ｄ〜Ｅは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｄ）および緻密骨（２２Ｅ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋およびＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ⁻細胞のパーセンテージを示す、画像定量化を示す。図２２Ｆは、海綿骨と緻密骨の間で潜在的に未分化のＴｏｍａｔｏ^＋Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^─のパーセンテージを比較した画像定量化を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．。図２２Ｇは、ＴＭＸ注射の４週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｈは、ＴＭＸ注射の４週間後の、ペリリピン染色されたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の大腿骨切片の代表的な低倍率および高倍率画像を示す。骨膜領域（ｉ）、海綿領域付近の骨髄（ｉｉ）および中心骨髄（ｉｉｉ）において、中実の矢じりは、Ｎ−ｃａｄ^＋ＭＳＣに由来するＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋を示す。図２２Ｉは、ＢＯＤＩＰＹ染色を示し、Ｔｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞（矢じり）の内側の脂肪滴（緑色）が示された。スケールバー、２０μｍ。図２２Ｊ〜Ｋは、ＴＭＸ注射の６時間後、１４時間後、２４時間後、２週間後および４週間後の海綿骨（２２Ｊ）および骨膜領域（２２Ｋ）におけるＴｏｍａｔｏ^＋ペリリピン^＋脂肪細胞の画像定量化を示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．）。

【0095】

【図23-1】図２３Ａ〜２３Ｊは、発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣから軟骨細胞が生じることを示す図である。図２３Ａは、実験設計を示す。図２３Ｂは、Ｅ１４．５（ＴＭＸによる誘導の２日後）時点で肋骨においてアグリカン^＋軟骨細胞と部分的に共局在したｔｏｍａｔｏ^＋を示す。図２３Ｃは、大腿骨における軟骨細胞発生の図を示す。図２３Ｄは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。関節面（ｉ）および発生中の二次骨化中心（ｉｉ）においてＴｏｍａｔｏ^＋細胞からアグリカン^＋軟骨細胞が生じたことに留意されたい。矢じりはＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞を示した。図２３Ｅは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた１０カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がペリリピン^＋脂肪細胞に分化した。図２３Ｆは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がオステオポンチン＋肥大性軟骨細胞（ｉおよびｉｉ）ならびに骨芽細胞（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉ）に分化した。図２３Ｇは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対する大腿溝傷害についての実験設計を示す。図２３Ｈは、対照マウスおよび膝軟骨傷害の３週間後のマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞の定量化を示す。（Ｉ）軟骨傷害を有さない、または軟骨傷害の３週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の遠位大腿骨の代表的な切片。対照マウスの膝表面にクラスター形成したＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞（ｉ）が膝軟骨傷害の３週間後のマウスの対応する領域で有意に増加した（ｉｉ）ことに留意されたい。図２３Ｊは対照（ｉ）および軟骨傷害の場所（ｉｉ）における、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を示す図６Ｈにおける切片のＡＨＯ染色を示す。

【図23-2】図２３Ａ〜２３Ｊは、発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣから軟骨細胞が生じることを示す図である。図２３Ａは、実験設計を示す。図２３Ｂは、Ｅ１４．５（ＴＭＸによる誘導の２日後）時点で肋骨においてアグリカン^＋軟骨細胞と部分的に共局在したｔｏｍａｔｏ^＋を示す。図２３Ｃは、大腿骨における軟骨細胞発生の図を示す。図２３Ｄは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。関節面（ｉ）および発生中の二次骨化中心（ｉｉ）においてＴｏｍａｔｏ^＋細胞からアグリカン^＋軟骨細胞が生じたことに留意されたい。矢じりはＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞を示した。図２３Ｅは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた１０カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がペリリピン^＋脂肪細胞に分化した。図２３Ｆは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がオステオポンチン＋肥大性軟骨細胞（ｉおよびｉｉ）ならびに骨芽細胞（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉ）に分化した。図２３Ｇは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対する大腿溝傷害についての実験設計を示す。図２３Ｈは、対照マウスおよび膝軟骨傷害の３週間後のマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞の定量化を示す。（Ｉ）軟骨傷害を有さない、または軟骨傷害の３週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の遠位大腿骨の代表的な切片。対照マウスの膝表面にクラスター形成したＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞（ｉ）が膝軟骨傷害の３週間後のマウスの対応する領域で有意に増加した（ｉｉ）ことに留意されたい。図２３Ｊは対照（ｉ）および軟骨傷害の場所（ｉｉ）における、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を示す図６Ｈにおける切片のＡＨＯ染色を示す。

【図23-3】図２３Ａ〜２３Ｊは、発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣから軟骨細胞が生じることを示す図である。図２３Ａは、実験設計を示す。図２３Ｂは、Ｅ１４．５（ＴＭＸによる誘導の２日後）時点で肋骨においてアグリカン^＋軟骨細胞と部分的に共局在したｔｏｍａｔｏ^＋を示す。図２３Ｃは、大腿骨における軟骨細胞発生の図を示す。図２３Ｄは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。関節面（ｉ）および発生中の二次骨化中心（ｉｉ）においてＴｏｍａｔｏ^＋細胞からアグリカン^＋軟骨細胞が生じたことに留意されたい。矢じりはＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞を示した。図２３Ｅは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた１０カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がペリリピン^＋脂肪細胞に分化した。図２３Ｆは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がオステオポンチン＋肥大性軟骨細胞（ｉおよびｉｉ）ならびに骨芽細胞（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉ）に分化した。図２３Ｇは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対する大腿溝傷害についての実験設計を示す。図２３Ｈは、対照マウスおよび膝軟骨傷害の３週間後のマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞の定量化を示す。（Ｉ）軟骨傷害を有さない、または軟骨傷害の３週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の遠位大腿骨の代表的な切片。対照マウスの膝表面にクラスター形成したＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞（ｉ）が膝軟骨傷害の３週間後のマウスの対応する領域で有意に増加した（ｉｉ）ことに留意されたい。図２３Ｊは対照（ｉ）および軟骨傷害の場所（ｉｉ）における、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を示す図６Ｈにおける切片のＡＨＯ染色を示す。

【図23-4】図２３Ａ〜２３Ｊは、発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣから軟骨細胞が生じることを示す図である。図２３Ａは、実験設計を示す。図２３Ｂは、Ｅ１４．５（ＴＭＸによる誘導の２日後）時点で肋骨においてアグリカン^＋軟骨細胞と部分的に共局在したｔｏｍａｔｏ^＋を示す。図２３Ｃは、大腿骨における軟骨細胞発生の図を示す。図２３Ｄは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。関節面（ｉ）および発生中の二次骨化中心（ｉｉ）においてＴｏｍａｔｏ^＋細胞からアグリカン^＋軟骨細胞が生じたことに留意されたい。矢じりはＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞を示した。図２３Ｅは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた１０カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がペリリピン^＋脂肪細胞に分化した。図２３Ｆは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がオステオポンチン＋肥大性軟骨細胞（ｉおよびｉｉ）ならびに骨芽細胞（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉ）に分化した。図２３Ｇは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対する大腿溝傷害についての実験設計を示す。図２３Ｈは、対照マウスおよび膝軟骨傷害の３週間後のマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞の定量化を示す。（Ｉ）軟骨傷害を有さない、または軟骨傷害の３週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の遠位大腿骨の代表的な切片。対照マウスの膝表面にクラスター形成したＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞（ｉ）が膝軟骨傷害の３週間後のマウスの対応する領域で有意に増加した（ｉｉ）ことに留意されたい。図２３Ｊは対照（ｉ）および軟骨傷害の場所（ｉｉ）における、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を示す図６Ｈにおける切片のＡＨＯ染色を示す。

【図23-5】図２３Ａ〜２３Ｊは、発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣから軟骨細胞が生じることを示す図である。図２３Ａは、実験設計を示す。図２３Ｂは、Ｅ１４．５（ＴＭＸによる誘導の２日後）時点で肋骨においてアグリカン^＋軟骨細胞と部分的に共局在したｔｏｍａｔｏ^＋を示す。図２３Ｃは、大腿骨における軟骨細胞発生の図を示す。図２３Ｄは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。関節面（ｉ）および発生中の二次骨化中心（ｉｉ）においてＴｏｍａｔｏ^＋細胞からアグリカン^＋軟骨細胞が生じたことに留意されたい。矢じりはＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞を示した。図２３Ｅは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた１０カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がペリリピン^＋脂肪細胞に分化した。図２３Ｆは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。初期胚形成期のＴｏｍａｔｏ^＋細胞がオステオポンチン＋肥大性軟骨細胞（ｉおよびｉｉ）ならびに骨芽細胞（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖおよびｖｉ）に分化した。図２３Ｇは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対する大腿溝傷害についての実験設計を示す。図２３Ｈは、対照マウスおよび膝軟骨傷害の３週間後のマウスにおけるＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞の定量化を示す。（Ｉ）軟骨傷害を有さない、または軟骨傷害の３週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の遠位大腿骨の代表的な切片。対照マウスの膝表面にクラスター形成したＴｏｍａｔｏ^＋アグリカン^＋細胞（ｉ）が膝軟骨傷害の３週間後のマウスの対応する領域で有意に増加した（ｉｉ）ことに留意されたい。図２３Ｊは対照（ｉ）および軟骨傷害の場所（ｉｉ）における、アルシアンブルー陽性軟骨細胞を示す図６Ｈにおける切片のＡＨＯ染色を示す。

【0096】

【図24-1】図２４Ａ〜２４Ｋは、５ＦＵ後のＢｒｄＵアッセイおよびＮ−ｃａｄレポーターマウス系を示す図である。図２４Ａ〜Ｆは、５ＦＵ処置後０日目、２日目、３日目、４日目および６日目のマウスの大腿骨におけるＢｒｄＵ^＋細胞を示す代表的な画像を示す。骨（赤色の点線）または血管／脂肪構造（緑色の点線）の付近でＢｒｄＵ^＋細胞が５ＦＵ後２日目に減少し、５ＦＵ後３日目から６日目まで再活性化したことに留意されたい。図２４Ｇは、ＢｒｄＵ^＋細胞の動的モデルを示す。図２４Ｈは、５ＦＵ処置３日目から６日目までの骨髄におけるＢｒｄＵ^＋細胞の骨表面におけるＢｒｄＵ^＋細胞に対する比を示す。図２４Ｉは、５ＦＵ処置後３日目から６日目までの骨表面付近および血管／脂肪構造付近のＢｒｄＵ^＋細胞のパーセンテージを示す。図２４Ｊは、骨表面および中心骨髄の両方におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞を示す、代表的な全骨切片を示す。図２４Ｋは、対照群および５ＦＵ処置の３日後のマウスのＮ−ｃａｄ−ＴｄＴマウスの中心骨髄（ＣＭ）および骨におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．

【図24-2】図２４Ａ〜２４Ｋは、５ＦＵ後のＢｒｄＵアッセイおよびＮ−ｃａｄレポーターマウス系を示す図である。図２４Ａ〜Ｆは、５ＦＵ処置後０日目、２日目、３日目、４日目および６日目のマウスの大腿骨におけるＢｒｄＵ^＋細胞を示す代表的な画像を示す。骨（赤色の点線）または血管／脂肪構造（緑色の点線）の付近でＢｒｄＵ^＋細胞が５ＦＵ後２日目に減少し、５ＦＵ後３日目から６日目まで再活性化したことに留意されたい。図２４Ｇは、ＢｒｄＵ^＋細胞の動的モデルを示す。図２４Ｈは、５ＦＵ処置３日目から６日目までの骨髄におけるＢｒｄＵ^＋細胞の骨表面におけるＢｒｄＵ^＋細胞に対する比を示す。図２４Ｉは、５ＦＵ処置後３日目から６日目までの骨表面付近および血管／脂肪構造付近のＢｒｄＵ^＋細胞のパーセンテージを示す。図２４Ｊは、骨表面および中心骨髄の両方におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞を示す、代表的な全骨切片を示す。図２４Ｋは、対照群および５ＦＵ処置の３日後のマウスのＮ−ｃａｄ−ＴｄＴマウスの中心骨髄（ＣＭ）および骨におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．

【図24-3】図２４Ａ〜２４Ｋは、５ＦＵ後のＢｒｄＵアッセイおよびＮ−ｃａｄレポーターマウス系を示す図である。図２４Ａ〜Ｆは、５ＦＵ処置後０日目、２日目、３日目、４日目および６日目のマウスの大腿骨におけるＢｒｄＵ^＋細胞を示す代表的な画像を示す。骨（赤色の点線）または血管／脂肪構造（緑色の点線）の付近でＢｒｄＵ^＋細胞が５ＦＵ後２日目に減少し、５ＦＵ後３日目から６日目まで再活性化したことに留意されたい。図２４Ｇは、ＢｒｄＵ^＋細胞の動的モデルを示す。図２４Ｈは、５ＦＵ処置３日目から６日目までの骨髄におけるＢｒｄＵ^＋細胞の骨表面におけるＢｒｄＵ^＋細胞に対する比を示す。図２４Ｉは、５ＦＵ処置後３日目から６日目までの骨表面付近および血管／脂肪構造付近のＢｒｄＵ^＋細胞のパーセンテージを示す。図２４Ｊは、骨表面および中心骨髄の両方におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞を示す、代表的な全骨切片を示す。図２４Ｋは、対照群および５ＦＵ処置の３日後のマウスのＮ−ｃａｄ−ＴｄＴマウスの中心骨髄（ＣＭ）および骨におけるＮ−ｃａｄ駆動性ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の絶対数を示す。各群Ｎ＝３。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバー、ｓ．ｅ．ｍ．

【0097】

【図25-1】図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔマウス系統の生成を示す図である。図２５Ａは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔマウス系統の生成を示す。図２５Ｂは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ、Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスについての系列追跡を示す。ＣＤ３１およびＶｅ−カドヘリン抗体によって染色された血管。

【図25-2】図２５Ａ〜２５Ｂは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔマウス系統の生成を示す図である。図２５Ａは、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔマウス系統の生成を示す。図２５Ｂは、３回のＴＭＸ注射後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ、Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスについての系列追跡を示す。ＣＤ３１およびＶｅ−カドヘリン抗体によって染色された血管。

【0098】

【図26-1】図２６Ａ〜２６Ｅは、ニッチ細胞の選別戦略およびシグネチャー遺伝子発現を示す図である。図２６Ａは、消化された骨細胞から採取された骨内膜帯域内のニッチ細胞を示す。図２６Ｂは、消化された骨髄細胞から採取された血管周囲および類洞帯域由来のニッチ細胞を示す。図２６Ｃは、骨内膜および動脈周囲領域へのＮＧ２−ＲＦＰ^＋細胞の局在を示す。図２６Ｄ〜Ｅは、ニッチ細胞における骨軟骨形成の前駆細胞遺伝子および脂肪生成の前駆細胞遺伝子発現のヒートマップを示す。

【図26-2】図２６Ａ〜２６Ｅは、ニッチ細胞の選別戦略およびシグネチャー遺伝子発現を示す図である。図２６Ａは、消化された骨細胞から採取された骨内膜帯域内のニッチ細胞を示す。図２６Ｂは、消化された骨髄細胞から採取された血管周囲および類洞帯域由来のニッチ細胞を示す。図２６Ｃは、骨内膜および動脈周囲領域へのＮＧ２−ＲＦＰ^＋細胞の局在を示す。図２６Ｄ〜Ｅは、ニッチ細胞における骨軟骨形成の前駆細胞遺伝子および脂肪生成の前駆細胞遺伝子発現のヒートマップを示す。

【図26-3】図２６Ａ〜２６Ｅは、ニッチ細胞の選別戦略およびシグネチャー遺伝子発現を示す図である。図２６Ａは、消化された骨細胞から採取された骨内膜帯域内のニッチ細胞を示す。図２６Ｂは、消化された骨髄細胞から採取された血管周囲および類洞帯域由来のニッチ細胞を示す。図２６Ｃは、骨内膜および動脈周囲領域へのＮＧ２−ＲＦＰ^＋細胞の局在を示す。図２６Ｄ〜Ｅは、ニッチ細胞における骨軟骨形成の前駆細胞遺伝子および脂肪生成の前駆細胞遺伝子発現のヒートマップを示す。

【図26-4】図２６Ａ〜２６Ｅは、ニッチ細胞の選別戦略およびシグネチャー遺伝子発現を示す図である。図２６Ａは、消化された骨細胞から採取された骨内膜帯域内のニッチ細胞を示す。図２６Ｂは、消化された骨髄細胞から採取された血管周囲および類洞帯域由来のニッチ細胞を示す。図２６Ｃは、骨内膜および動脈周囲領域へのＮＧ２−ＲＦＰ^＋細胞の局在を示す。図２６Ｄ〜Ｅは、ニッチ細胞における骨軟骨形成の前駆細胞遺伝子および脂肪生成の前駆細胞遺伝子発現のヒートマップを示す。

【図26-5】図２６Ａ〜２６Ｅは、ニッチ細胞の選別戦略およびシグネチャー遺伝子発現を示す図である。図２６Ａは、消化された骨細胞から採取された骨内膜帯域内のニッチ細胞を示す。図２６Ｂは、消化された骨髄細胞から採取された血管周囲および類洞帯域由来のニッチ細胞を示す。図２６Ｃは、骨内膜および動脈周囲領域へのＮＧ２−ＲＦＰ^＋細胞の局在を示す。図２６Ｄ〜Ｅは、ニッチ細胞における骨軟骨形成の前駆細胞遺伝子および脂肪生成の前駆細胞遺伝子発現のヒートマップを示す。

【0099】

【図27-1】図２７Ａ〜２７Ｅは、ＴＭＸによる誘導後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスにおける系列追跡を示す図である。図２７Ａ〜Ｂは、ＴＭＸによる誘導の２４時間後および２週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２７Ｃ〜Ｅは、ＴＭＸによる誘導の６時間後、１４時間後および２４時間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスの代表的な大腿骨切片を高倍率画像で示す。脂肪細胞がペリリピン抗体染色で示されている。

【図27-2】図２７Ａ〜２７Ｅは、ＴＭＸによる誘導後早期の時点のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスにおける系列追跡を示す図である。図２７Ａ〜Ｂは、ＴＭＸによる誘導の２４時間後および２週間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴ；Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰマウスにおける海綿骨（ＴＢ）および皮質骨（ＣＢ）の代表的な画像を示す。スケールバー、２０μｍ。図２７Ｃ〜Ｅは、ＴＭＸによる誘導の６時間後、１４時間後および２４時間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲＴ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスの代表的な大腿骨切片を高倍率画像で示す。脂肪細胞がペリリピン抗体染色で示されている。

【0100】

【図28】図２８Ａ〜２８Ｄは、初期発生からのおよび傷害修復におけるＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣの特徴付けを示す図である。図２８Ａは、出生後２日目のＴＭＸによる誘導の２４時間後のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴにおけるアグリカン染色を伴うＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣを示す大腿骨切片の代表的な画像を示す。図２８Ｂは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２カ月齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。脂肪細胞がペリリピン抗体染色で示されている。図２８Ｃは、Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けた２日齢のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウス由来の代表的な大腿骨切片を示す。発生中の骨細胞がオステオポンチン抗体染色で示されている。図２８Ｄは、対照群および膝軟骨傷害の２週間後の、Ｅ１２．５にＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスにおける代表的な矢状膝切片を示す。スケールバー、１ｍｍ。

【0101】

【図29】図２９は、５ＦＵ処置後３日目に生存しているｒＨＳＣ（緑色、ＣＤ１５０^＋Ｌｉｎ⁻ＣＤ４９ｂ⁻）が、多くの場合に骨表面に近接した単一細胞として検出されたこと（白色、ＳＨＧ）、および増殖しているＨＳＣが、多くの場合にＭＫ（ＣＤ１５０^＋Ｌｉｎ^＋）または血管付近に（赤色、ＣＤ３１＋）関連付けられたことを示す画像である。

【0102】

【図30】図３０は、ｉｎｖｉｖｏにおけるｎｃａｄ＋ｈＭＳＣ１０Ｋ個および総ｈＭＳＣ１０００ｋ個によるヒトＴｈｐｏの産生を示すプロットである。

【発明を実施するための形態】

【0103】

本発明の一実施形態は、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得た幹細胞の集団を増大させるための方法である。この方法は、幹細胞の数が増大するように幹細胞の集団におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0104】

本発明の別の実施形態は、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって得たキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法である。この方法は、幹細胞の数が増大するようにＣＡＲＴ細胞の集団におけるＮ６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0105】

本発明では、幹細胞および／またはＴ細胞の集団を、任意の哺乳動物、例えばヒトなどから、ならびに、幹細胞および／または前駆細胞および／またはＴ細胞を含有する任意の組織から得ることができる。上記の通り、好ましい実施形態では、組織は、末梢血、臍帯血または骨髄であり得る。

【0106】

本明細書で使用される場合、「増大させる（ｅｘｐａｎｄ）」、「増大させること（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）」および同様の用語は、集団内の幹細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の数を、ｉｎｖｉｖｏまたはｅｘｖｉｖｏのいずれかで、本明細書に開示される方法のいずれかを使用して元の集団内の幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の数と比べて増加させることを意味する。増大は、集団内の幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の元の数と比較して少なくとも４０倍であり得る。より好ましくは、増大は、幹細胞の元の数と比較して少なくとも２倍、４倍、５倍、８倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれよりも大きい。

【0107】

本発明では、「幹細胞の集団」とは、多くの異なる型の細胞を生じさせる能力を有し、自己複製する能力を有する実質的に未分化の細胞の群を意味する。本発明による幹細胞の代表的な非限定的な例としては、気管支肺胞上皮幹細胞（ＢＡＳＣ）、バルジ上皮幹細胞（ｂＥＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ＣＥＳＣ）、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、表皮神経堤幹細胞（ｅＮＣＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、肝臓卵形細胞（ＨＯＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ケラチノサイト幹細胞（ＫＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、膵幹細胞（ＰＳＣ）、網膜幹細胞（ＲＳＣ）、および皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）が挙げられる。

【0108】

造血幹細胞は、例えば、自己複製（すなわち、増大）する能力を有し、造血系における全ての型の前駆細胞（例えば、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰおよびＣＬＰなど）および最終的に全ての型の血液細胞（例えば、赤血球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、および血小板など）を生じさせることができる。別の例として、間葉系幹細胞は、種々の細胞型（例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞および脂肪細胞など）に分化することができる多分化能間質細胞である。

【0109】

本発明では、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団」とは、がん細胞の表面上の抗原などの特定の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体を用いて改変され、そのようながん細胞を標的とし、死滅させる能力を有し得るＴ細胞の群を意味する。ＣＡＲＴ細胞は、キメラ抗原受容体を用いてＴ細胞を改変することによって、例えば、キメラ抗原受容体をコードするＤＮＡをＴ細胞に導入して、Ｔ細胞の表面上にキメラ抗原受容体を発現させることによってなどで調製することができる（Davila et al. Sci Transl Med 6(224), 224ra25(2014)； Tasian et al.Ther Adv Hematol 6(5), 228-241(2015)）。

【0110】

本発明では、「モジュレートすること（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、「モジュレーション（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」および同様の用語は、これだけに限定されないが、タンパク質の発現レベルを低下もしくは上昇させること、そのようなタンパク質の配列を変更すること（変異、翻訳前もしくは翻訳後修飾または他のやり方によって）、またはそのようなタンパク質を阻害もしくは活性化すること（結合によるものか、リン酸化によるものか、グリコシル化によるものか、トランスロケーションによるものかまたは他のやり方によるものかにかかわらず）を含めた、シグナルトランスダクション経路、例えば、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内のタンパク質を変更することを意味する。そのようなモジュレーションは、遺伝学的にまたは薬理学的に達成することができる。

【0111】

本発明の一態様では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、幹細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞の集団に変異を導入することを含み、ここで、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらすものである。本発明の別の態様では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーションは、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡ経路内の分子のモジュレーターと接触させることも含む。そのようなモジュレーターの代表的な非限定的な例としては、小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せが挙げられる。

【0112】

本発明では、「ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーション」という句は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーの機能を変更することを意味し、ここで、機能の変更は、ｍＲＮＡのｍ^６Ａ修飾の上流および／または下流のプロセスに関与する分子の機能を阻害するまたは低下させることと同様の効果を有し得る。そのような「モジュレーション」の非限定的な例としては、ｍＲＮＡへのＮ^６−メチルアデノシン修飾の組込み、ｍＲＮＡへのＮ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾の除去、ならびに／またはＮ^６−メチルアデノシン修飾されたｍＲＮＡの認識およびプロセシングのいずれかに関与するタンパク質の発現または機能を増大または低減させることが挙げられる。例えば、モジュレーションは、ｍＲＮＡのＮ^６−メチルアデノシン修飾を増大もしくは低減させること、ならびに／または、例えば、ｍ^６Ａライター（例えば、メチルトランスフェラーゼ）およびｍ^６Ａイレイサー（例えば、デメチラーゼ）の１つもしくは複数の活性をモジュレートすることによってなどでｍＲＮＡにおけるそのような修飾の型および／もしくは分布に影響を及ぼすことを含み得る。別の例として、モジュレーションは、例えば、ｍ^６Ａリーダー（例えば、メチル化アデノシンを認識するＲＮＡ結合性タンパク質）の活性をモジュレートすることによってなどで、ｍＲＮＡに対するＮ^６−メチルアデノシン修飾を認識してｍ^６Ａ依存性機能を媒介するタンパク質の発現または機能を増大または低減させることであり得る。したがって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路モジュレーター内の分子のモジュレーションにより、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾プロセスの上流または下流の分子の活性および／または発現のモジュレーションをもたらすことができる。

【0113】

一態様では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーションは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーおよびこれらの組合せからなる群より選択される分子のモジュレーションを伴う。ｍ^６Ａ修飾ライターの非限定的な例としては、メッセンジャーＲＮＡにｍ^６Ａ修飾を転写後に組み入れることができるメチルトランスフェラーゼが挙げられ、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰ、ＫＩＡＡ１４２９およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。ｍ^６Ａ修飾イレイサーの非限定的な例としては、メチル化を逆転させることができるデメチラーゼが挙げられ、ＦＴＩ、ＡＬＫＢＨ５およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。ｍ^６Ａ修飾リーダーとしては、ｍ^６Ａメチル化ｍＲＮＡに選択的に結合して、メチル化ｍＲＮＡの選択的認識を通じて制御機能を発揮することができるタンパク質が挙げられる。適切なｍ^６Ａ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。一態様によると、ｍ^６Ａ修飾リーダーは、タンパク質のＹＴＨドメインファミリーのタンパク質を含み、それらとして、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２およびこれらの組合せが挙げられる。（例えば、Wang et al. Nature, 505 (7481): 117-120, 2014; Frayling et al.Science, 316: 889-894, 2007； Zheng et al. Mol. Cell., 49: 18-29, 2012； Cao etal. Open Biol., 6(4): 160003, 2016; Maity et al. The FEBS Journal, 283 (9):1607-1630, 2016を参照されたい）。

【0114】

本明細書で使用される場合、「変異を導入すること」とは、幹細胞集団および／またはＣＡＲＴ細胞集団の遺伝子構造に変更を生じさせるための任意の従来の方法を意味する。幹細胞集団および／またはＣＡＲＴ細胞集団に変異を導入することの非限定的な例としては、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の紫外線照射による変異誘発、化学的変異誘発、部位特異的変異誘発などの標的化変異誘発、ならびにトランスジェニックマウスの創出が挙げられる。一態様によると、変異を幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞に導入して、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーおよびこれらの組合せからなる群より選択される分子などのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させることができる。一態様では、変異を導入して、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる。好ましい態様では、変異を導入して、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる。さらに別の態様では、変異を導入して、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰ、ＫＩＡＡ１４２９およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる。さらに別の態様では、変異を導入して、ＦＴＩ、ＡＬＫＢＨ５およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる。

【0115】

一態様では、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系（例えば、Kuhn et al. Science, 269 (5229): 1427-1429, 1995を参照されたい）に曝露させることによって変異を導入することができる。さらに別の態様では、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞に低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が組み込まれる変異を導入して、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させる。例えば、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞を、ｓｈＲＮＡを送達するためのベクターに曝露させることによってｓｈＲＮＡを導入することができ、当該ベクターは、レンチウイルスなどのウイルスベクターであってよい（例えば、Chiraet al. Oncotarget, 6 (31): 30675-30703, 2015を参照されたい）。ｓｈＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを誘発して遺伝子発現を制御することができるものであってよい（例えば、Paddisonet al. Genes Dev., 16 (8): 948-958, 2002を参照されたい）。

【0116】

本明細書で使用される場合、「Ｎ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーター」（または「ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路モジュレーター」）は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路の任意のメンバーの活性を制御する任意の作用物質であり、例えば、ｍ^６Ａライター（例えば、メチルトランスフェラーゼ）およびｍ^６Ａイレイサー（例えば、デメチラーゼ）の１つまたは複数の活性をモジュレートすることによってなどで、例えば、ｍＲＮＡのＮ^６−メチルアデノシン修飾の増大もしくは低減、ならびに／またはｍＲＮＡにおけるそのような修飾の型および／もしくは分布の変化をもたらす。別の例として、作用物質は、例えば、ｍ^６Ａリーダー（例えば、メチル化アデノシンを認識するＲＮＡ結合性タンパク質）の活性をモジュレートすることによってなどで、ｍＲＮＡに対するＮ^６−メチルアデノシン修飾を認識してｍ^６Ａ依存性機能を媒介するタンパク質の活性を増大または低減させるものであり得る。したがって、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路モジュレーターは、ｍＲＮＡに対するｍ^６Ａ修飾に影響を及ぼす作用物質に作用する、またはその上流に作用する、またはその下流に作用するものであり得る。

【0117】

一実施形態では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路を、例えば、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御および／または阻害することなど、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーを下方制御および／または阻害することによってモジュレートすることができる。本明細書で使用される場合、「下方制御すること」とは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーの量を阻害するもしくは減少させること、またはその活性を阻害するもしくは低下させることを意味する。そのような下方制御は、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、抗体、または小分子を使用して達成することができる。別の例として、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡリーダーの阻害剤と接触させて、ｍ^６ＡｍＲＮＡリーダーによるｍ^６Ａ修飾されたｍＲＮＡへの結合および／またはその認識を阻害することによって下方制御することができる。一態様では、下方制御されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３およびこれらの組合せからなる群より選択される。好ましい態様では、下方制御されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ２である。ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤は、以下からなる群より選択されるもののいずれかであり得る：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ（例えば、Helwak et al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Whisnant et al., MBio 4(2), 2013: e000193を参照されたい）；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ（例えばHafneret al. Cell, 141 (1): 129-141, 2010; Helwak et al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013を参照されたい）；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63,2008; Yang et al. J Biol Chem., 292 (9): 3614-3623, 2017を参照されたい）；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈ

ｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-656, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63,2008; Baek et al, Nature, 455 (7209): 64-71, 2008; Leivonen et al. Mol CellProteomics, 10 (7), 2011： M110.005322を参照されたい）：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Hafner et al. Cell, 141 (1): 129-141,2010; Kishore et al, Nat Methods, 8 (7): 559-64, 2011; Memczak et al. Nature,495 (7441): 333-8, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63, 2008; Chi etal. Nature. 460 (7254): 479-86, 2009を参照されたい）。

【0118】

本発明では、「小分子」という用語は、生物学的プロセスに影響を及ぼすように、特に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーをモジュレートするように作用し得る、ポリペプチドおよび核酸以外のあらゆる化学物質または他の部分を含む。小分子は、現在公知であり使用されている、または生物学的機能をスクリーニングする目的でそのような分子のライブラリーにおいて合成することができる任意の数の治療剤を含み得る。小分子は、巨大分子とはサイズによって区別される。本発明の小分子は、通常、分子量が約５，０００ダルトン（Ｄａ）未満、好ましくは約２，５００Ｄａ未満、より好ましくは１，０００Ｄａ未満、最も好ましくは約５００Ｄａ未満である。

【0119】

小分子としては、これだけに限定することなく、有機化合物、ペプチド模倣体およびそのコンジュゲートが挙げられる。本明細書で使用される場合、「有機化合物」という用語は、核酸およびポリペプチドなどの巨大分子以外のあらゆる炭素に基づく化合物を指す。炭素に加えて、有機化合物は、カルシウム、塩素、フッ素、銅、水素、鉄、カリウム、窒素、酸素、硫黄および他の元素を含み得る。有機化合物は、芳香族または脂肪族の形態であり得る。有機化合物の非限定的な例としては、アセトン、アルコール、アニリン、炭水化物、単糖、オリゴ糖、多糖、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、脂質、レチノイド、ステロイド、プロテオグリカン、ケトン、アルデヒド、飽和、不飽和および多価不飽和脂肪、油およびワックス、アルケン、エステル、エーテル、チオール、硫化物、環式化合物、複素環化合物、イミダゾール、ならびにフェノールが挙げられる。本明細書で使用される場合、有機化合物は、ニトロ化有機化合物およびハロゲン化（例えば、塩素化）有機化合物も含む。

【0120】

好ましい小分子は、比較的容易かつ安価に製造される、製剤化されるまたは別の方法で調製される。好ましい小分子は、種々の保管条件下で安定である。好ましい小分子を巨大分子と密接に関連させて、生物活性があり、改善された薬学的性質を有する分子を形成することができる。改善された薬学的性質は、所望の生物活性に好都合である、循環時間、分布、代謝、修飾、排泄、分泌、排除、および安定性の変化を含む。改善された薬学的性質は、化学的実体の毒物学特性および有効性特性の変化を含む。

【0121】

一般に、ポリペプチド模倣体（「ペプチド模倣体」）は、ポリペプチドの生物活性を模倣するが、化学的性質においてペプチド性ではない分子である。一方、ある特定の実施形態では、ペプチド模倣体は、ペプチド結合（すなわち、アミノ酸間のアミド結合）を含有しない分子であり、ペプチド模倣体という用語は、偽ペプチド（pseudo-peptide）、半ペプチド、およびペプトイドなどの、特性において完全にはペプチド性ではない分子を含み得る。

【0122】

本明細書で使用される場合、「生物学的物質（biologic）」という用語は、化学的プロセスとは対照的に、生きている供給源に由来する産物を意味する。「生物学的物質」の非限定的な例として、タンパク質、馴化培地、および組織から部分的に精製された産物が挙げられる。

【0123】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本発明では、これらの用語は、連結したアミノ酸の配列を意味し、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組合せであり得る。この用語は、抗体、抗体模倣体、ドメイン抗体、リポカリン、および標的化プロテアーゼを包含する。この用語は、ペプチドまたはペプチド断片に対する抗体を生じさせることが意図された、当該ペプチドまたはペプチド断片を含有するワクチンも含む。

【0124】

「抗体」は、本明細書で使用される場合、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および単鎖抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、および二機能性抗体を含めた、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を含む。抗体は、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示す、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティ精製された抗体、またはそれらの混合物であってよい。抗体は、キメラ抗体であってもよい。抗体は、当技術分野で公知の１つまたは複数の化学的部分、ペプチド部分、またはポリペプチド部分の付着によって誘導体化されていてよい。抗体は、化学的部分とコンジュゲートしていてよい。抗体は、ヒト抗体であってもヒト化抗体であってもよい。これらおよび他の抗体は、米国特許出願公開第２００７００６５４４７号に開示されている。

【0125】

他の抗体様分子も本発明の範囲内に入る。そのような抗体様分子としては、例えば、受容体トラップ（例えば、エタネルセプト（entanercept）など）、抗体模倣体（例えば、例えばＣｏｍｐｏｕｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．からの、フィブロネクチンに基づく「アドレス可能な」治療用結合性分子であるアドネクチンなど）、ドメイン抗体（天然に存在する単一ドメイン抗体の最小機能性断片（例えば、ナノボディなど；例えば、Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7）を参照されたい）が挙げられる。

【0126】

適切な抗体模倣体は、一般に、本明細書に記載の抗体および抗体断片の代替物として使用することができる。そのような抗体模倣体には、有利な性質が付随し得る（例えば、抗体模倣体は、水溶性、タンパク質分解に対して抵抗性、および／または非免疫原性であり得る）。例えば、モノクローナル抗体の第２の相補性決定領域（ＣＤＲ）を模倣する合成ベータ−ループ構造を含むペプチドが提唱され、生成されている。例えば、Saragovi et al., Science. Aug. 16, 1991;253 (5021): 792-5を参照されたい。ペプチド抗体模倣体はまた、複数のＣＤＲ由来の抗原接触残基を含有するペプチド模倣体を設計するために、「活性な」抗原認識残基を決定するためのペプチドマッピング、分子モデリング、および分子動力学軌道分析(moleculardynamics trajectory analysis)を使用することによっても生成されている。例えば、Cassett et al., BiochemBiophys Res Commun. Jul. 18, 2003;307 (1): 198-205を参照されたい。本発明に関して適用可能であり得る関連する原理、方法などに関する追加的な考察は、例えば、Fassina,Immunomethods. October 1994; 5 (2): 121-9に提示されている。

【0127】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」は、例えば、米国特許出願公開第２００６０２７５８２３号に開示されている通り、例えば、翻訳後修飾の基質標的化阻害をなすことができる標的化プロテアーゼを含む。

【0128】

「アンチセンス」分子は、本明細書で使用される場合、標的ｍＲＮＡ（センス）またはＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを引き出す能力は、例えば、Stein and Cohen, Cancer Res. 48: 2659, (1988)およびvan der Krol et al.,BioTechniques 6: 958, (1988)に記載されている。

【0129】

アンチセンス分子は、修飾されたまたは修飾されていないＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーオリゴヌクレオチドであり得る。これらの分子は、対応する配列に特異的に結合し、それにより、立体的遮断またはＲＮａｓｅＨ酵素の活性化のいずれかによってペプチド合成を阻害することによって機能する（Wu-Pong, November 1994, BioPharm, 20-33）。アンチセンス分子はまた、ＲＮＡのプロセシングまたは核から細胞質への輸送に干渉することにより、タンパク質合成を変更させることができる（Mukhopadhyay& Roth, 1996, Crit. Rev. in Oncogenesis 7, 151-190）。さらに、一本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの結合により、ヘテロ二重鎖のヌクレアーゼ媒介性分解がもたらされ得る（Wu-Pong、上記）。ＲＮａｓｅＨの基質としての機能を果たすことがこれまで示されてきた骨格修飾ＤＮＡ化学は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボロントリフルオリデート（ｂｏｒｏｎｔｒｉｆｌｕｏｒｉｄａｔｅ）、および２’−アラビノおよび２’−フルオロアラビノ含有オリゴヌクレオチドである。

【0130】

アンチセンス分子は、例えば、ＷＯ９１／０４７５３に記載されている通り、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に、リガンド結合性分子とコンジュゲートを形成することによって導入することができる。適切なリガンド結合性分子としては、これだけに限定されないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、または細胞表面受容体に結合する他のリガンドが挙げられる。リガンド結合性分子のコンジュゲーションは、リガンド結合性分子のその対応する分子または受容体に結合する能力に実質的に干渉しない、または、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはそのコンジュゲートバージョンの細胞への進入を遮断しないものであることが好ましい。あるいは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＷＯ９０／１０４４８に記載されている通り、標的核酸配列を含有する細胞に、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって導入することができる。

【0131】

低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）という用語は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する低分子阻害性ＲＮＡ二重鎖を指す（Elbashir, S. M. et al. Nature 411: 494-498 (2001)； Caplen, N. J. etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 9742-9747 (2001)； Harborth, J. et al. J CellSci. 114: 4557-4565 (2001)）。これらの分子は、長さが変動し得（一般に１８〜３０塩基対）、アンチセンス鎖内のそれらの標的ｍＲＮＡに対して種々の程度の相補性を含有し得る。全てではないが一部、ｓｉＲＮＡは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端に対になっていない突出塩基を有する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、２つの別々の鎖の二重鎖、ならびに二重鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る一本鎖を含む。本明細書で使用される場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子に限定されず、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含する。ｓｉＲＮＡ遺伝子標的化は、細胞への一過性ｓｉＲＮＡ移入（リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または微量注射のような古典的方法によって達成される）によって行うことができる。

【0132】

本発明のさらなる態様では、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の数が少なくとも２倍増加する。幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の数が、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、またはそれよりも大きな増加を含め、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍など増加することが好ましい。驚いたことに、かつ予想外に、そのようなレベルの幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞増大が、本発明の方法を使用して達成される。

【0133】

上記の通り、本発明の方法を使用して、任意の幹細胞の集団を増大することができる。本発明の方法に従って増大させることができる幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、およびこれらの組合せから選択することができることが好ましい。一態様によると、幹細胞は、ＨＳＣである。さらに別の態様によると、幹細胞は、ＭＳＣである。

【0134】

本発明の方法により、幹細胞を、増大した細胞が総コロニー形成単位（ＣＦＵ）の少なくとも５倍の増加、例えば８倍、１０倍、およびさらには１５倍またはそれよりも大きな増大などを有するように増大させることもでき得る。さらに、当該方法により、ＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）コロニーの少なくとも３．８倍、例えば、少なくとも４倍、５倍、およびさらには少なくとも８倍またはそれよりも大きな増大をもたらすことができ得る。

【0135】

本発明の別の実施形態は、実質的に未分化の幹細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法である。この方法は、幹細胞集団の著しい分化を伴わずに未分化の幹細胞の数が増大するように、未分化の幹細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0136】

この実施形態では、幹細胞集団は、その集団内の十分な数の細胞が、レシピエントに移植されたときに自己複製する能力を保持し、種々の分化細胞型を生じさせること、例えば、ＨＳＣ集団の場合では、移植した際にＨＳＣ系列を再配置させること（またはＭＳＣ集団の場合では、移植した際にＭＳＣ系列を再配置させること）ができれば、「実質的に未分化」である。本明細書で使用される場合、「著しい分化を伴わない」とは、増大した幹細胞集団が、多系列分化潜在性を維持する細胞を十分な数だけ有し、したがって、増大した幹細胞集団をレシピエントに移植した際に標的幹系列の全範囲を再生させることができることを意味する。したがって、例えば、ＨＳＣ集団の場合では、増大したＨＳＣ集団は、レシピエントに移植されると、造血細胞系列全体を再生することができる。ＭＳＣ集団の場合では、増大したＭＳＣ集団は、レシピエントに移植されると、間葉細胞系列全体を再生させることができる。

【0137】

別の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法である。この方法は、ＣＡＲＴ細胞の数が増大するようにＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0138】

本発明のさらなる実施形態は、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得た造血幹細胞（ＨＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法である。この方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＨＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながらＨＳＣ集団が十分な数量まで増大するように、ＨＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0139】

本発明のさらなる実施形態は、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得た間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法である。この方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＭＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら、ＭＳＣ集団が十分な数量まで増大するように、ＭＳＣ集団におけるＮ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0140】

本発明のさらなる実施形態は、末梢血、臍帯血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＴ細胞を改変することによって調製されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法である。当該方法は、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＣＡＲＴ細胞集団が十分な数量まで増大するようにＣＡＲＴ細胞集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを含む。

【0141】

本明細書で使用される場合、組織から「得た」とは、ドナーから組織を採取または分割する任意の従来の方法を意味する。上記の通り、組織は、ＨＳＣおよび／もしくはＭＳＣなどの幹細胞、ならびに／またはキメラ抗原受容体を用いて改変することができるＴ細胞を含有する任意の組織であってよい。したがって、例えば、組織は、末梢血または臍帯血試料などの血液試料から得ること、または骨髄から採取することができる。そのような試料を得るための方法は、当業者には周知である。本発明では、試料は、新鮮なもの、すなわち、凍結を伴わずにドナーから得たものであってよい。さらに、試料を、増大前にさらに操作して、外来または望ましくない構成成分を除去することができる。試料は、保存されたストックから得ることもできる。例えば、末梢血または臍帯血の場合では、試料を低温でまたは他のやり方で保存されたそのような血液のバンクから引き出すことができる。そのような試料は、任意の適切なドナーから得ることができる。ドナーは、哺乳動物、例えば、ヒトなどの霊長類であることが好ましい。さらに、試料は、自己または同種異系ドナーまたは供給源から得ることができる。試料は、自己供給源から得ることが好ましい。

【0142】

この方法では、「多系列分化の潜在性を維持すること」とは、増大したＨＳＣおよび／またはＭＳＣ集団が、そのような移植を必要とする被験体に移植されたときに、造血系における全ての型の前駆細胞、例えば、ＣＭＰ、ＧＭＰ、ＭＥＰ、およびＣＬＰ、ならびに、最終的に、例えば、赤血球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、および血小板を含めた全ての型の血液細胞を再生させる能力を有することを意味する。

【0143】

本発明では、「後続の移植のために十分な」増大したＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞の数量は、一般に、移植後に約１％よりも大きな生着をもたらすＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞の数に対応する。これは、上首尾の移植の許容される尺度の１つである。本発明では、実施例に記載されているものを含めた任意の従来の方法を使用して、％生着を決定することができる。そのような測定は、競合細胞を用いてまたは用いずに、一般には、かつ好ましくは、競合細胞を用いずに行うことができる。（Zhang, C.C., et al., Nat Med, 12 (2): 240-5,2006. Zhang, C.C. andH.F. Lodish, Blood, 105 (11): 4314-20, 2005）。

【0144】

上記のｅｘｖｉｖｏ増大方法では、Ｎ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップを以前に記載されている通り達成することができる。Ｎ^６−メチルアデノシンｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、幹細胞および／もしくはＣＡＲＴ細胞にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらす変異を導入すること、または幹細胞および／もしくはＣＡＲＴ細胞を小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せからなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーターと接触させることを含み得る。

【0145】

ｅｘｖｉｖｏ増大方法の一態様では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーションは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサー、およびこれらの組合せからなる群より選択される分子のモジュレーションを伴う。ｍ^６Ａ修飾ライターの非限定的な例としては、メッセンジャーＲＮＡにｍ^６Ａ修飾を転写後に組み入れることができるメチルトランスフェラーゼが挙げられ、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰ、ＫＩＡＡ１４２９およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。ｍ^６Ａ修飾イレイサーの非限定的な例としては、メチル化を逆転させることができるデメチラーゼが挙げられ、ＦＴＩ、ＡＬＫＢＨ５およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。ｍ^６Ａ修飾リーダーとしては、ｍ^６Ａメチル化ｍＲＮＡに選択的に結合して、メチル化ｍＲＮＡの選択的認識を通じて制御機能を発揮することができるタンパク質が挙げられる。適切なｍ^６Ａ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３およびこれらの組合せからなる群より選択されるもののいずれかを含み得る。一態様によると、ｍ^６Ａ修飾リーダーは、タンパク質のＹＴＨドメインファミリーのタンパク質を含み、それらとして、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２およびこれらの組合せが挙げられる。（例えば、Wang et al. Nature, 505 (7481): 117-120, 2014; Frayling et al.Science, 316: 889-894, 2007； Zheng et al. Mol. Cell., 49: 18-29, 2012； Cao etal. Open Biol., 6(4): 160003, 2016; Maity et al. The FEBS Journal, 283 (9):1607-1630, 2016を参照されたい）。

【0146】

ｅｘｖｉｖｏ方法の一態様では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、幹細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞に変異を導入してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む。例えば、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、ｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサー、およびこれらの組合せからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。一態様では、変異は、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３、およびこれらの組合せからなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。好ましい態様では、変異は、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。さらに別の態様では、変異は、ＦＴＯ、ＡＬＫＢＨ５およびこれらの組合せからなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。さらに別の態様では、変異は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰ、ＫＩＡＡ１４２９およびこれらの組合せからなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターなどのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。

【0147】

ｅｘｖｉｖｏ増大方法の一態様では、本明細書において以前に開示されている方法のいずれかによって変異を導入することができる。例えば、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系（例えば、Kuhn et al. Science, 269 (5229): 1427-1429, 1995を参照されたい）に曝露させることにより、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させる変異を導入することができる。さらに別の態様では、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞に低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が組み込まれる変異を導入して、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させる。例えば、ｓｈＲＮＡは、幹細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞をｓｈＲＮＡを送達するためのベクターに曝露させることによって導入することができ、当該ベクターは、レンチウイルスなどのウイルスベクターであってよい（例えば、Chiraet al. Oncotarget, 6 (31): 30675-30703, 2015を参照されたい）。ｓｈＲＮＡは、遺伝子サイレンシングを誘発して遺伝子発現を制御することができるものであってよい（例えば、Paddisonet al. Genes Dev., 16 (8): 948-958, 2002を参照されたい）。

【0148】

これらのｅｘｖｉｖｏ増大方法では、一態様によると、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、例えば、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御および／または阻害することなど、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーを下方制御および／または阻害することを含む。本明細書で使用される場合、「下方制御すること」とは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路のメンバーの量を阻害するもしくは減少させること、またはその活性を阻害するもしくは低下させることを意味する。そのような下方制御を、例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、抗体、または小分子を使用して達成することができる。別の例として、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡリーダーの阻害剤と接触させて、ｍ^６ＡｍＲＮＡリーダーによるｍ^６Ａ修飾されたｍＲＮＡへの結合および／またはその認識を阻害することによって下方制御することができる。一態様では、下方制御されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ｅｌＦ３およびこれらの組合せからなる群より選択される。好ましい態様では、下方制御されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ２である。Ｙｔｈｄｆ２のＲＮＡを減衰させる役割は、以前に解明されている（例えば、Wang et al. Nature 505 (7481): 117-120, 2014を参照されたい）。ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤は、以下からなる群より選択されるもののいずれかであり得る：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Whisnant et al., MBio 4 (2), 2013: e000193を参照されたい）；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ（例えばHafneret al. Cell, 141 (1): 129-141, 2010; Helwak et al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013を参照されたい）；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63,2008; Yang et al. J Biol Chem., 292 (9): 3614-3623, 2017を参照されたい）；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ

−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-656, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63,2008; Baek et al, Nature, 455 (7209): 64-71, 2008; Leivonen et al. Mol CellProteomics, 10 (7), 2011： M110.005322を参照されたい）：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２（例えば、Helwaket al. Cell, 153 (3): 654-655, 2013; Hafner et al. Cell, 141 (1): 129-141,2010; Kishore et al, Nat Methods, 8 (7): 559-64, 2011; Memczak et al. Nature,495 (7441): 333-8, 2013; Selbach et al. Nature, 455 (7209): 58-63, 2008; Chi etal. Nature. 460 (7254): 479-86, 2009を参照されたい）。

【0149】

これらのｅｘｖｉｖｏ増大方法では、幹細胞は、ＨＳＣ、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、内皮前駆細胞、（ＥＰＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、心臓幹細胞（ＣＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、およびこれらの組合せから選択されることが好ましい。ある特定の態様によると、幹細胞は、ＨＳＣである。他の態様によると、幹細胞は、ＭＳＣである。ｅｘｖｉｖｏ増大方法では、ＣＡＲＴ細胞を含む細胞の集団を使用することもできる。これらの方法では、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣを、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトの臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得るが、任意のＨＳＣおよび／またはＭＳＣを含有する組織を使用することができる。

【0150】

造血幹細胞（ＨＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法の別の態様では、幹細胞の数の増大は、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍などであり、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含む。

【0151】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法の別の態様では、幹細胞の数の増大は、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍などであり、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含む。

【0152】

ＣＡＲＴ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法の別の態様では、ＣＡＲＴ細胞の数の増大は、少なくとも２倍、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍などであり、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、または少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含む。

【0153】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の方法、例えば、実質的に未分化の幹細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法または造血幹細胞（ＨＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法などによって作製された、増大した実質的に未分化の幹細胞集団である。

【0154】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の方法、例えば、実質的に未分化の幹細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法などによって作製された、増大した実質的に未分化の幹細胞集団である。

【0155】

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の方法、例えば、ＣＡＲＴ細胞集団をｅｘｖｉｖｏで増大させるための方法などによって作製された増大したＣＡＲＴ細胞集団である。

【0156】

本発明の追加的な実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍に増大させるための方法であって、増大したＨＳＣが、それを必要とする哺乳動物の被験体に移植されたときにＨＳＣ系列を再構成する能力を有する、方法である。この方法は、幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＨＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む。

【0157】

本発明の追加的な実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍増大させるための方法であって、増大したＭＳＣが、それを必要とする哺乳動物の被験体に移植されたときにＭＳＣ系列を再構成する能力を有する、方法である。この方法は、幹細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＨＳＣの集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む。

【0158】

本発明の追加的な実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍増大させるための方法であって、増大したＣＡＲＴ細胞が、それを必要とする哺乳動物の被験体に移植されたときにがんおよび／または血液障害を処置する能力を有する、方法である。この方法は、ＣＡＲＴ細胞に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、ＣＡＲＴ細胞の集団を適切な培養培地中で培養するステップとを含む。

【0159】

本発明のこの態様では、「ＨＳＣ系列を再構成する能力を有する」とは、増大したＨＳＣが、適切な哺乳動物の被験体に移植された時に、レシピエントにおいて１％を超える生着をもたらし、生着した細胞が、正常に機能する造血系を有するために必要な細胞系列に分化することができることを意味する。本発明のこの態様では、「ＭＳＣ系列を再構成する能力を有する」とは、増大したＭＳＣが、適切な哺乳動物の被験体に移植された時に、レシピエントにおいて１％を超える生着をもたらし、生着した細胞が、正常に機能する造血系を有するために必要な細胞系列に分化することができることを意味する。本発明のこの態様では、「がんおよび／または血液障害を処置する能力を有する」とは、増大したＣＡＲＴ細胞が、適切な哺乳動物の被験体に移植された時に、哺乳動物の被験体が罹患しているがんおよび／または血液障害、例えば、白血病およびリンパ腫の少なくとも１つなどの処置をもたらすことができることを意味する。この方法では、本明細書では互換的に使用される「適切な培養培地」、「液体培地」および「培地」は、幹細胞集団および／またはＣＡＲＴ細胞集団を必要な期間にわたって維持することができる生理的に平衡させた塩類溶液を意味し、当該溶液には、必要に応じて、適切な本発明のｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路モジュレーターを補充することができる。そのような基本的な培養培地は当技術分野で周知である。ＨＳＣのための適切な基本的な培養培地の非限定的な例は、１０μｇ／ｍｌのヘパリン、５×ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｎｇ／ｍｌの組換えマウス（ｒｍ）幹細胞因子、および２０ｎｇ／ｍｌのｒｍ−トロンボポエチンを補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．０９６００）である。

【0160】

本発明の一態様では、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞をｅｘｖｉｖｏで少なくとも２倍増大させることは、本明細書に記載されている方法のいずれかによって実施することができる。例えば、方法は、Ｙｔｈｄｆ２などのｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる変異を導入することを伴い得る。さらに、変異は、例えば、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞をｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることによってなど、本明細書に記載の方法のいずれかによって導入することができる。変異は、幹細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞にｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させることによって導入することもできる。変異を導入する他の方法、および本明細書に記載されている他のｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異も提供することができる。

【0161】

この実施形態の一態様では、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞を、臍帯血、末梢血、および骨髄から選択される哺乳動物組織、好ましくは霊長類またはヒト組織から得る。この実施形態では、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞の数を少なくとも２倍、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍など、および少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、増大させる。

【0162】

本発明のさらに別の実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）集団、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団、および／またはＣＡＲＴ細胞集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットである。キットは、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞集団にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するための系と、その使用に関する指示とを含む。キットにおいて、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲ−Ｔ細胞集団に変異を導入するための系は、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲ−Ｔ細胞集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含むことが好ましい。例えば、キットは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲ−Ｔ細胞集団に変異を導入するための系を含み得る。キットは、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞集団にｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるレンチウイルスを送達するための試薬を含む、ＨＳＣ、ＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞集団に変異を導入するための系も含み得る。キットは、変異を導入して、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を含めたｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることによってなど、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするための本明細書に記載の他の系／方法をさらに含み得る。キットおよびその中の構成成分は、分配および／または保管のための任意の適切な様式で包装することができる。

【0163】

さらに別の実施形態では、造血幹細胞集団（ＨＳＣ）集団および／または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞集団を後続のそれを必要とする被験体への移植のために増大させるためのキットが提供される。キットは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と、その使用に関する指示とを含み、ここで、阻害剤は、本明細書に開示される阻害剤のいずれか、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤などであってよい。

【0164】

この実施形態の一態様では、キットは、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞の数の、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大からなる群より選択される倍数での増大をもたらすことができるものであり得る。

【0165】

本発明のさらなる実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＨＳＣ集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＨＳＣは、任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0166】

本発明のさらなる実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＭＳＣ集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＭＳＣは、任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0167】

本発明のさらなる実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＣＡＲＴ細胞集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＣＡＲＴ細胞は、任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0168】

本発明のさらなる実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＨＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0169】

本発明のさらなる実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＭＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0170】

本発明のさらなる実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞をそれを必要とする被験体に投与するための方法である。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＣＡＲＴ細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0171】

本発明の追加的な実施形態は、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法である。当該方法は、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＨＳＣ集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＨＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0172】

本発明の追加的な実施形態は、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法である。当該方法は、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＭＳＣ集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＭＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0173】

本発明の追加的な実施形態は、それを必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための方法である。当該方法は、（ａ）ＣＡＲＴ細胞集団を含有する試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、（ｂ）試料を適切な培養培地中で試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。この実施形態では、変異を導入する方法、およびｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを標的とする変異は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらす変異、またはＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＣＡＲＴ細胞集団への組込みをもたらす変異など、以前に開示された通りである。さらに、ＣＡＲＴ細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0174】

さらに別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法が提供される。この方法は、（ａ）ＨＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＨＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＨＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＨＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0175】

さらに別の実施形態では、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための別の方法が提供される。この方法は、（ａ）ＭＳＣ集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＭＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0176】

これらの方法では、「骨髄を再構成する」とは、正常な骨髄機能が損なわれた、疾患に罹患している被験体における骨髄の全部または一部分の修復を意味する。そのような疾患の非限定的な例としては、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）などの血液障害、および白血病などの血液がんが挙げられる。したがって、本明細書で使用される場合、「再構成された」とは、移植されたＨＳＣおよび／またはＭＳＣが、宿主において首尾よく生着し、骨髄において一般に見いだされるまたは骨髄に由来する全ての細胞系列に分化することができることを意味する。本発明の方法の態様は、白血病およびリンパ腫などの血液障害を処置するために、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織から得たＨＳＣおよび／またはＭＳＣを被験体に移植することを伴い得る。

【0177】

さらに別の実施形態では、それを必要とする被験体においてがんおよび／または血液障害を処置するための別の方法が提供される。この方法は、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団を含有する試料を、適切な培養培地中、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤の存在下で、試料中のＣＡＲＴ細胞の数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップと、（ｂ）培養物からｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を除去するステップと、（ｃ）ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与するステップとを含む。この方法では、阻害剤は、例えば、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤など、以前に開示された通りである。さらに、ＣＡＲＴ細胞を調製するために改変されるＴ細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などの任意の適正な組織から得ることができ、被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0178】

これらの方法では、「被験体におけるがんおよび／または血液障害を処置する」とは、がんおよび／または血液障害に罹患している被験体におけるがん細胞を根絶すること、症候を緩和すること、または他のやり方で病態を軽減することを意味する。がんおよび／または血液障害の非限定的な例としては、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）などの血液障害、ならびに白血病およびリンパ腫などの血液がんが挙げられる。

【0179】

これらの方法では、「ＨＳＣの数を増大させるのに十分な期間」とは、培養下のＨＳＣを、１回または複数回の移植のために十分な数のＨＳＣが存在する点まで増大させるための最小の時間の量を意味し、「ＭＳＣの数を増大させるのに十分な期間」とは、培養下のＭＳＣを、１回または複数回の移植のために十分な数のＭＳＣが存在する点まで増大させるための最小の時間の量を意味する。同様に、「ＣＡＲＴ細胞の数が増大するのに十分な期間」とは、培養下のＣＡＲＴ細胞を、１回または複数回の移植のために十分な数のＣＡＲＴ細胞が存在する点まで増大させるための最小の時間の量を意味する。一般には、そのような期間は、培養下で少なくとも約１０日間であり得る。ある特定の状況下では、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞、例えば、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣ集団を単回の移植に必要なものを超えて増大させることが望ましい場合がある。例えば、幹細胞および／またはＣＡＲＴ細胞、例えば、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣ集団を、例えば、約２〜約１００回の移植などの複数回の移植のために十分な数まで増大させることが望ましい場合がある。これらの状況では、過剰な細胞を後で使用するために、例えば、凍結保存などの任意の従来の方法によって保存することができる。

【0180】

以前に示されている通り、「移植のために十分な数」とは、レシピエントにおける１％を超える生着を達成するために必要な幹細胞、例えば、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞の最小数を意味する。「ＨＳＣを被験体に投与する」とは、これだけに限定されないが、ＨＳＣを外科的におよび／または静脈内に送達することを含めた、被験体にＨＳＣを送達するための従来の方法を意味する。「ＭＳＣを被験体に投与する」とは、これだけに限定されないが、ＭＳＣを外科的におよび／または静脈内に送達することを含めた、被験体にＭＳＣを送達するための従来の方法を意味する。「ＣＡＲＴ細胞を被験体に投与する」とは、これだけに限定されないが、ＭＳＣを外科的におよび／または静脈内に送達することを含めた、被験体にＣＡＲＴ細胞を送達するための従来の方法を意味する。これらの実施形態では、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＴ細胞を得る組織、ならびにｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー阻害剤は、以前に開示されている通りである。

【0181】

本発明の追加的な実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法である。この方法は、ＨＳＣの集団をＨＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、ここで、増大したＨＳＣの集団は、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである。この実施形態では、「ＨＳＣ集団の増大をもたらすのに十分な条件」は、培養下のＨＳＣの、例えば、少なくとも２倍の増大、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大などの増大をもたらし得る条件である。「哺乳動物への移植に適した」とは、ＨＳＣの数および質が、それを必要とする哺乳動物レシピエント、例えば、ヒトレシピエントを含めた霊長類レシピエントなどにおける１％を超える生着を支持するために十分であることを意味する。

【0182】

本発明の追加的な実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法である。この方法は、ＭＳＣの集団を、ＭＳＣ集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、ここで、増大したＭＳＣの集団は、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである。この実施形態では、「ＭＳＣ集団の増大をもたらすのに十分な条件」は、培養下のＭＳＣの、例えば、少なくとも２倍の増大、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大などをもたらし得る条件である。「哺乳動物への移植に適した」とは、ＭＳＣの数および質が、それを必要とする哺乳動物レシピエント、例えば、ヒトレシピエントを含めた霊長類レシピエントなどにおける１％を超える生着を支持するために十分であることを意味する。

【0183】

本発明の追加的な実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法である。この方法は、ＣＡＲＴ細胞の集団を、ＣＡＲＴ細胞集団の少なくとも２倍の増大をもたらすのに十分な条件下で培養するステップを含み、ここで、増大したＣＡＲＴ細胞の集団は、それを必要とする哺乳動物への移植に適するものである。この実施形態では、「ＣＡＲＴ細胞集団の増大をもたらすのに十分な条件」は、培養下のＣＡＲＴ細胞の、例えば、少なくとも２倍の増大、例えば、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大などをもたらし得る条件である。「哺乳動物への移植に適した」とは、ＣＡＲＴ細胞の数および質が、それを必要とする哺乳動物レシピエント、例えば、ヒトレシピエントを含めた霊長類レシピエントなどにおける１％を超える生着を支持するために十分であることを意味する。

【0184】

本発明のさらに別の実施形態は、骨髄移植、末梢血移植、または臍帯血移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、本明細書に開示される方法、特に、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法によって得たＨＳＣの集団を投与するステップを含む方法である。被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0185】

本発明のさらに別の実施形態は、骨髄移植、末梢血移植、または臍帯血移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、本明細書に開示される方法、特に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法によって得たＭＳＣの集団を投与するステップを含む方法である。被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0186】

本発明のさらに別の実施形態は、がんおよび／または血液障害に罹患している被験体を処置するための方法であって、被験体に、本明細書に開示される方法、特に、ＣＡＲＴ細胞の集団を増大させるための方法によって得たＣＡＲＴ細胞の集団を投与するステップを含む方法である。被験体は、ヒトなどの哺乳動物とすることができる。

【0187】

本発明のさらなる実施形態は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団を増大させるための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＨＳＣ集団が少なくとも２倍増大し、（ｉｉ）増大したＨＳＣ集団が総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップとを含む。この実施形態の一態様では、ＨＳＣ集団は、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも４倍、例えば、少なくとも５倍増大する。この実施形態の別の態様では、哺乳動物は、ヒトを含めた霊長類である。ヒトは、末梢血移植、臍帯血移植、または骨髄移植を必要としていることが好ましい。別の態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。

【0188】

本発明のさらなる実施形態は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の集団を増大させるための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも２倍増大する、ステップとを含む。この実施形態の一態様では、ＭＳＣ集団は、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも２．５倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、例えば、少なくとも５倍増大する。この実施形態の別の態様では、哺乳動物は、ヒトを含めた霊長類である。ヒトは、末梢血移植、臍帯血移植、または骨髄移植を必要としていることが好ましい。さらなる態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。

【0189】

本発明のさらなる実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の集団を増大させるための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団をもたらすステップと、（ｃ）試料由来のＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも２倍増大する、ステップとを含む。この実施形態の一態様では、ＣＡＲＴ細胞集団は、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも２．５倍、例えば、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、例えば、少なくとも５倍増大する。この実施形態の別の態様では、哺乳動物は、ヒトを含めた霊長類である。ヒトは、がんおよび／または血液障害に罹患していることが好ましい。さらなる態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。

【0190】

本発明の追加的な実施形態は、それを必要とするレシピエントにおいて造血幹細胞系列を再構成するための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＨＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＨＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＨＳＣ集団が少なくとも２倍、例えば、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも４倍増大し、（ｉｉ）増大したＨＳＣ集団が、総コロニー形成単位の少なくとも５倍の増加を有する、ステップと、（ｃ）増大したＨＳＣ集団を霊長類またはヒトを含めた哺乳動物などのそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む。この実施形態では、ヒトレシピエントは、末梢血移植、臍帯血移植または骨髄移植を必要としている。したがって、さらなる態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。試料は、自己供給源または同種異系供給源から得ることができる。試料は、自己供給源から得ることが好ましい。

【0191】

本発明の追加的な実施形態は、それを必要とするレシピエントにおいて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）系列を再構成するための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＭＳＣ集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）試料由来のＭＳＣ集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＭＳＣ集団が少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも２倍、例えば、少なくとも４倍増大する、ステップと、（ｃ）増大したＭＳＣ集団を霊長類またはヒトを含めた哺乳動物などのそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む。この実施形態では、ヒトレシピエントは、末梢血移植、臍帯血移植または骨髄移植を必要としている。したがって、さらなる態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。試料は、自己供給源または同種異系供給源から得ることができる。試料は、自己供給源から得ることが好ましい。

【0192】

本発明の追加的な実施形態は、がんおよび／または血液障害に罹患している被験体を処置するための方法である。当該方法は、（ａ）哺乳動物からＴ細胞集団を含む組織試料を得るステップと、（ｂ）Ｔ細胞集団をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて改変してＣＡＲＴ細胞集団を形成するステップと、（ｃ）試料由来のＣＡＲＴ細胞集団をｉｎｖｉｔｒｏで増大させるステップであって、（ｉ）ＣＡＲＴ細胞集団が少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍またはそれよりも大きな増大を含め、少なくとも２倍、例えば、少なくとも４倍増大する、ステップと、（ｃ）増大したＣＡＲ−Ｔ細胞集団を霊長類またはヒトを含めた哺乳動物などのそれを必要とする被験体に移植するステップとを含む。この実施形態では、ヒトレシピエントは、例えば、白血病および／またはリンパ腫に罹患していてよい。したがって、さらなる態様では、組織試料を任意の適正な組織、例えば、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織などから得る。試料は、自己供給源または同種異系供給源から得ることができる。試料は、自己供給源から得ることが好ましい。

【0193】

本発明の複数の態様では、増大したＨＳＣ集団は、最も原始的かつ長期間未分化のヒトＨＳＣのマーカーであるＣＤ３４⁻またはＣＤ３４^＋／ＣＤ３８^{−／ｌｏｗ}／Ｔｈｙ−１^＋／ＣＤ９０^＋／Ｋｉｔ^−／ｌｏ／Ｌｉｎ⁻／ＣＤ１３３^＋ＶＥＧＦＲ２^＋；ヒトＨＳＣおよびそれらの前駆細胞のマーカーであるＣＤ１５０^＋／ＣＤ４８⁻／ＣＤ２４４⁻；ならびに／または非自己複製性多分化能造血前駆細胞のマーカーであるＣＤ１５０⁻／ＣＤ４８⁻／ＣＤ２４４^＋およびＣＤ１５０⁻／ＣＤ４８^＋／ＣＤ２４４^＋、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される表現型を有するＨＳＣを含むことが好ましい（例えば、Mimeault, M., et al., Stem Cells: A Revolution in Therapeutics -Recent Advances in Stem Cell Biology and Their Therapeutic Applications inRegenerative Medicine and Cancer Therapies. Clin Pharmacol Ther., 82 (3):252-64 (2007)を参照されたい）。本発明の複数の態様では、増大したＭＳＣ集団および／または増大に供されるＭＳＣ集団は、Ｎ−カドヘリン＋およびＣＤ１０５＋、ならびにこれらの組合せからなる群より選択される表現型を有するＭＳＣを含むことが好ましい。すなわち、本明細書に記載の実施形態のいずれかのＭＳＣ集団は、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣおよびＣＤ１０５＋ＭＳＣからなる群より選択される少なくとも１種のＭＳＣを含み得る。一実施形態では、ＭＳＣ集団は、Ｎ−カドヘリン＋ＭＳＣを含む。

【0194】

増大したＨＳＣおよび／またはＭＳＣ集団が全体としてレシピエントにおける少なくとも１％の生着をもたらすために十分である限りは、集団内のこれらのマーカーを有するＨＳＣおよび／またはＭＳＣの正確な割合は重要ではない。

【0195】

別の実施形態では、本発明は、そのような増大を必要とする哺乳動物において造血幹細胞集団を増大させるための方法である。この方法は、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物において造血系列を再構成する能力を有するＨＳＣを含む、ＨＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む。

【0196】

別の実施形態では、本発明は、そのような増大を必要とする哺乳動物において間葉系幹細胞集団を増大させるための方法である。この方法は、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物における間葉系系列を再構成する能力を有するＭＳＣを含む、ＭＳＣ集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む。

【0197】

別の実施形態では、本発明は、そのような増大を必要とする哺乳動物においてキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞集団を増大させるための方法である。この方法は、哺乳動物に、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路のモジュレーターを治療有効量で、哺乳動物におけるがんおよび／または血液障害を処置する能力を有するＣＡＲＴ細胞を含む、ＣＡＲＴ細胞集団を少なくとも２倍増大させるのに十分な期間にわたって投与するステップを含む。

【0198】

これらの方法では、モジュレーターは、本明細書で以前に開示されている通りであってよく、かつ／または、モジュレーションを本明細書に開示される任意の方法によって実施することができる。例えば、モジュレーターは、ＨＳＣおよび／またはＭＳＣおよび／またはＣＡＲＴ細胞集団に、Ｙｔｈｄｆ２などのＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させる変異を導入するための系を含み得る。さらに別の例として、モジュレーターは、Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤などのＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）ｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤を含み得る。増大を必要とする哺乳動物は、ヒトであってよい。

【0199】

別の実施形態では、本発明は、生体試料から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を単離する方法であって、ＭＳＣの集団を有する生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるステップを含む方法を含む。例えば、ある特定の態様によると、生体試料は、末梢血、臍帯血および骨髄からなる群より選択される組織を含む。さらに、ある特定の実施形態では、ＭＳＣを単離する方法は、例えば、本明細書に記載の方法のいずれかによってなどで、間葉系幹細胞の数が増大するようにＭＳＣの集団におけるＮ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）ｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって生体試料由来のＭＳＣの集団を増大させる１つまたは複数のステップをさらに含み得る。一実施形態では、ＭＳＣの集団を、生体試料から単離した後に増大させる。別の実施形態では、生体試料中のＭＳＣの集団を、生体試料からＭＳＣを単離する前に増大させる。一実施形態では、ＭＳＣ集団を、後続のそれを必要とする被験体への移植のために十分に、ＭＳＣ集団における多系列分化の潜在性を維持しながら十分な数量まで増大させ、したがって、当該方法によって単離されたＭＳＣをそのような移植のために使用することができる。例えば、単離されたＭＳＣをヒト被験体に移植することができる。さらに別の実施形態によると、Ｎ−カドヘリン抗体に加えてまたはその代替としてのいずれかで、ＣＤ１０５抗体と接触させることにより、生体試料からＭＳＣをさらに単離することができる。なおさらなる実施形態では、生体試料をＮ−カドヘリン抗体と接触させ、Ｎ−カドヘリン抗体に結合する細胞を検出することにより、Ｎ−カドヘリン抗体を使用して生体試料中のＭＳＣを同定することができる。

【0200】

一実施形態では、ＭＳＣを単離する方法は、例えば、本明細書に記載のモジュレーション方法のいずれかによってなどで、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって、幹細胞にｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーションをもたらす変異を導入することによって、または、幹細胞を、小分子、生物学的物質、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびこれらの組合せからなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子のモジュレーターと接触させることによってＭＳＣ集団を増大させることを含む。例えば、一実施形態では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、幹細胞に変異を導入してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換える、またはその発現を低減させることを含む。一実施形態では、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダー、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライター、およびｍ^６ＡｍＲＮＡイレイサーからなる群より選択される分子を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。さらに別の実施形態では、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。一実施形態では、変異は、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。別の実施形態では、変異は、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。一実施形態では、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。一実施形態では、変異は、ＦＴＯおよびＡＬＫＢＨ５からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾イレイサーを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。別の実施形態では、変異は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。一実施形態では、変異は、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ１４、ＷＴＡＰおよびＫＩＡＡ１４２９からなる群より選択されるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾ライターを発現する遺伝子を欠失させる、置き換えるまたはその発現を低減させるものである。

【0201】

別の実施形態では、ＭＳＣを単離する方法は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートすることによって、幹細胞を、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系に曝露させることによって、ＭＳＣＳの集団を増大させることを含む。一実施形態では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、幹細胞にｓｈＲＮＡが組み込まれる変異を導入してｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路内の分子を発現する遺伝子の発現を低減させることを含む。例えば、一実施形態では、ｓｈＲＮＡは、幹細胞をレンチウイルスに曝露させてｓｈＲＮＡを送達することによって導入される。さらに別の実施形態によると、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾経路をモジュレートするステップは、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することを含む。一実施形態では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ１、Ｙｔｈｄｆ２、Ｙｔｈｄｆ３、Ｙｔｈｄｃ１、Ｙｔｈｄｃ２、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、およびｅｌＦ３からなる群より選択される。例えば、一実施形態では、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーは、Ｙｔｈｄｆ２を含む。

【0202】

一実施形態では、ＭＳＣを単離する方法は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを下方制御することによって、幹細胞を、以下からなる群より選択されるもののいずれかなどの本明細書に記載のもののいずれかであるｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーの阻害剤と接触させることによって、ＭＳＣの集団を増大させることをさらに含む：（ＨＮＲＮＰＣの阻害剤）ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１５９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４７９０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８６−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５１５０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−７４４−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７４９４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０８５１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２１９６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０５−５ｐ（ＭＩＲＴ０３７９５９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９９９１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６９４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７３ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１３、ｈｓａ−ｍｉＲ−８７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ；（ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９７２１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８００９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５８０９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１４０４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６２１３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７１１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０２７８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６０ｂ（ＭＩＲＴ０５２６８０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０２７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１５０８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３６０７５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９７−３ｐ（ＭＩＲＴ０４８０９８）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｊ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２２ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５６−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｙ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｏ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−９４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６７４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｗ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６００、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｑ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４９、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｈ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８３−３ｐ；（Ｙｔｈｄｆ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｇ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７６７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５７；（Ｙｔｈｄｆ２の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００５４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４２５７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３８４２）、ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３ｂ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２；（Ｙｔｈｄｆ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４０９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９２０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８０、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｘ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２４−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｄ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５７０、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｌ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇｈｓａ−ｍｉＲ−３７２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３３、ｈｓａ−ｍｉＲ−９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ａｍ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５

１３ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５５０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９１２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１４ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６；（ｅｌＦ３の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０７３４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１７０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９７４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２０７７１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４８４（ＭＩＲＴ０４２３２４）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５１７７６）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１５９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉＲ−７−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６５５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５１ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４３６００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９０６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３９７７９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７７−３ｐ（ＭＩＲＴ０３６９６４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６７４６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２３−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２４６８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０４２８８７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２４−３ｐ（ＭＩＲＴ０２２９３２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１４０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９８、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３１１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３４２−５ｐ（ＭＩＲＴ０３８２１０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４３９８１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−６１５−３ｐ（ＭＩＲＴ０４００８６）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２２１１）、ｈｓａ−ｍｉｒ−４５５−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７８７９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６７、ｈｓａ−ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０４４３５５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２０ａ（ＭＩＲＴ０４４４６６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３２０１８）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５−５ｐ（ＭＩＲＴ０２１００９）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１−５ｐ（ＭＩＲＴ０４５７９３）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１３０３（ＭＩＲＴ０３５８９０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０１６３１６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２２−３ｐ（ＭＩＲＴ０４６６４０）、ｈｓａ−ｍｉｒ−５３２−３ｐ（ＭＩＲＴ０３７９２４）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４０９２９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０４９００１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５８２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４０、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６３、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１１７９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９^＊ｈｓａ−ｍｉＲ−３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２９６：（ＹＴＨＤＣ１の阻害剤）ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３８９６７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０３ａ−３ｐ（ＭＩＲＴ０２７０３７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１（ＭＩＲＴ０２３４９２）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９ｂ−３ｐ（ＭＩＲＴ０３１１０５）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００−５ｐ（ＭＩＲＴ０４８４００）、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３−５ｐ（ＭＩＲＴ０２７９８９）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１６−５ｐ（ＭＩＲＴ０３１３７９）、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ（ＭＩＲＴ０５２１５０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｔ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３１０、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６６８、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１６−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｃ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１３ａ−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６４７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６９、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１６４、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０３、ｈｓａ−ｍｉＲ−５００ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２４、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９０８、ｈｓａ−ｍｉＲ−８８９、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１１６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３３０−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３８１、ｈｓａ−ｍｉＲ−６１８、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−９６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｎ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３７、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８８、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３９４２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５４８ｖ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−８９１ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２７１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５４、ｈｓａ−ｍｉＲ−６４６、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５３、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅおよびｈｓａ−ｍｉＲ−４２６２。

【0203】

一実施形態によると、本発明は、本明細書に記載のプロセスのいずれかによって作製される単離された間葉系幹細胞の集団を含む。例えば、本発明は、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の増大および／または単離プロセスのいずれかによって作製される増大した単離された間葉系幹細胞の集団を含み得る。

【0204】

一実施形態では、後続のそれを必要とする被験体への移植のための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）集団を単離するためのキットが提供される。キットは、ＭＳＣを含む生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させるための系と、その使用に関する指示とを含む。一実施形態では、キットは、ＭＳＣ集団に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することによってＭＳＣの集団を増大させるための系と、その使用に関する指示とをさらに含む。さらに別の実施形態では、ＭＳＣ集団に変異を導入するための系は、ＭＳＣ集団にＹｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入することができる１種または複数種の試薬を含む。さらに別の実施形態では、ＭＳＣ集団に変異を導入するための系は、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の少なくとも一部分を不活化するまたは欠失させるＭｘ１−Ｃｒｅ標的化系を含む。一実施形態では、ＭＳＣ集団に変異を導入するための系は、ＭＳＣ集団にｓｈＲＮＡを組み込んでｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の発現を低減させるレンチウイルスを送達するための試薬を含む。

【0205】

本発明の別の実施形態によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をそれを必要とする被験体に投与するための方法が提供される。当該方法は、ＭＳＣの集団を含む生体試料からＭＳＣを、生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、単離されたＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。さらに、一実施形態では、方法は、ＭＳＣ集団を含有する生体試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、生体試料を適切な培養培地中で試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップとをさらに含む。一実施形態では、変異は、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の欠失をもたらすものである。一実施形態では、変異は、Ｙｔｈｄｆ２を発現する遺伝子の発現を低減させるｓｈＲＮＡのＨＳＣ集団への組込みをもたらすものである。さらに別の態様によると、ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織を含む生体試料から得る。

【0206】

さらに別の実施形態によると、それを必要とする被験体において骨髄を再構成するための方法が提供される。当該方法は、ＭＳＣの集団を含む生体試料から間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、生体試料を１種または複数種のＮ−カドヘリン抗体と接触させることによって単離するステップと、単離されたＭＳＣを被験体に投与するステップとを含む。さらに、一態様によると、方法は、ＭＳＣ集団を含有する生体試料に、ｍ^６ＡｍＲＮＡ修飾リーダーを発現する遺伝子の欠失、置換えまたはその発現の低減をもたらす変異を導入するステップと、試料を適切な培養培地中で、試料中のＭＳＣの数を被験体への移植に十分な数まで増大させるのに十分な期間にわたって培養するステップとをさらに含む。一実施形態では、ＭＳＣを、臍帯血、末梢血、および骨髄からなる群より選択される組織を含む生体試料から得る。

【0207】

さらに別の実施形態によると、骨髄移植、末梢血移植および臍帯血液移植からなる群より選択される移植を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、本明細書に記載の方法のいずれかによって得た単離されたＭＳＣの集団を投与するステップを含む方法。実施形態によると、試料は、自己供給源または同種異系供給源に由来する。さらに別の実施形態によると、試料は、自己供給源に由来する。

【0208】

本発明では、「治療有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすために十分な量である。哺乳動物の処置に関しては、モジュレーターおよび／または増大した細胞の「治療有効量」は、哺乳動物における骨髄疾患などの状態を処置する、管理する、和らげる、好転させる、または安定化させるために十分な量である。治療有効量は、１回または複数回用量で投与することができる。

【0209】

治療有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の技術の範囲内に入る。一般には、適正な投与量を決定する際にはいくつかの要因を考慮に入れる。これらの要因としては、被験体の年齢、性別および体重、処置される状態、状態の重症度および投与される薬物の形態が挙げられる。

【0210】

有効な剤形、投与形式、および投与量は、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当技術分野の技術の範囲内である。投与量は、投与経路、排出速度、処置の持続時間、投与される任意の他の薬物の正体、動物の年齢、サイズ、および種、ならびに医薬および獣医薬の技術分野で周知の同様の要因によって変動することが当業者には理解される。一般に、本発明によるモジュレーターの適切な用量は、所望の効果を生じさせるために有効な最低用量であるモジュレーターの量になる。モジュレーターの有効用量を、１日を通して適切な間隔で別々に投与される２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれよりも多くの副用量として投与することができる。

【0211】

モジュレーターは、任意の所望の有効な様式で：経口摂取用、または非経口もしくは他の投与用の医薬組成物として、腹腔内、皮下、局所、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、髄腔内、またはリンパ内などの任意の適正な様式で投与することができる。さらに、本発明のモジュレーターを他の処置と併せて投与することができる。所望であれば、本発明のモジュレーターをカプセル封入することまたは他のやり方で胃液分泌または他の分泌から保護することができる。

【0212】

本発明のモジュレーターを単独で投与することができるが、モジュレーターを医薬製剤（組成物）として投与することが好ましい。そのような医薬製剤は、一般には、１種または複数種のモジュレーターを１種または複数種の薬学的に許容される担体、ならびに、必要に応じて、１つまたは複数の他の化合物、薬物、成分および／または材料と混合した活性成分として含む。選択された投与経路にかかわらず、当業者に公知の従来の方法によって本発明のモジュレーターを薬学的に許容される剤形に製剤化することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton,Pa.）を参照されたい。

【0213】

薬学的に許容される担体は当技術分野で周知であり（例えば、Remington'sPharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.）およびThe NationalFormulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.)を参照されたい）、それらとして、糖（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えば、リン酸二カルシウム（ｄｉｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば、生理食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液）、アルコール（例えば、エチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生分解性ポリマー（例えば、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（酸無水物））、エラストマーマトリクス、リポソーム、マイクロスフェア、油（例えば、トウモロコシ、胚芽、オリーブ、ヒマシ、ゴマ、綿実、およびラッカセイ）、カカオバター、ワックス（例えば、坐薬ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、シリシレート（ｓｉｌｉｃｙｌａｔｅ）などが挙げられる。本発明のモジュレーターを含む医薬組成物に使用される薬学的に許容される担体はそれぞれ、製剤の他の成分と適合し、被験体にとって有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。選択された剤形および意図された投与経路に適する担体は当技術分野で周知であり、選択された剤形および投与の方法に許容される担体は、当技術分野における通常の技術を使用して決定することができる。

【0214】

本発明のモジュレーターを含む医薬組成物は、必要に応じて、医薬組成物に一般に使用される追加的な成分および／または材料を含有してもよい。これらの成分および材料は当技術分野で周知であり、それらとして、（１）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など；（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースおよびアラビアゴムなど；（３）保湿剤（humectant）、例えば、グリセロールなど；（４）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋したカルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウムなど；（５）溶解遅延剤、例えば、パラフィンなど；（６）吸収促進剤、例えば、四級アンモニウム化合物など；（７）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど；（８）吸収剤、カオリンおよびベントナイト粘土など；（９）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウムなど；（１０）懸濁化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガントなど；（１１）緩衝化剤；（１２）賦形剤、例えば、ラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、カカオバター、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチレート、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末など；（１３）不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒など；（１４）保存剤；（１５）表面活性剤（surface-activeagent）；（１６）分散剤；（１７）制御放出剤(control-release agent)または吸収遅延剤、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、生分解性ポリマー、リポソーム、マイクロスフェア、アルミニウムモノステアレート、ゼラチン、およびワックスなど；（１８）乳白剤；（１９）補助剤；（２０）湿潤剤；（２１）乳化および懸濁化剤；（２２）、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステルなど；（２３）噴霧体、例えば、クロロフルオロカーボンおよび揮発性の非置換型炭化水素、ブタンおよびプロパンなど；（２４）抗酸化剤；（２５）製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする作用物質、例えば、糖および塩化ナトリウムなど；（２６）増粘剤；（２７）コーティング材料、例えば、レシチンなど；ならびに（２８）甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤が挙げられる。そのような成分または材料はそれぞれ、製剤の他の成分と適合し、被験体にとって有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。選択された剤形および意図された投与経路に適した成分および材料は当技術分野で周知であり、選択された投与の剤形および方法のための許容される成分および材料は、当技術分野における通常の技術を使用して決定することができる。

【0215】

経口投与に適した医薬組成物は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、散剤、顆粒剤、水性液または非水性液中の液剤または懸濁剤、水中油または油中水エマルション、エリキシル剤またはシロップ剤、口内錠剤（pastille）、ボーラス、舐剤またはペースト剤の形態であり得る。これらの製剤は、当技術分野で公知の方法によって、例えば、従来のパンコーティング（pan-coating）、混合、顆粒化または凍結乾燥プロセスによって調製することができる。

【0216】

経口投与用の固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖剤、散剤、顆粒剤など）は、活性成分を、１種または複数種の薬学的に許容される担体、ならびに、必要に応じて、１つまたは複数の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤、および／または着色料と混合することによって調製することができる。同種の固体組成物を、適切な賦形剤を使用した軟充填ゼラチンカプセルおよび硬充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の副成分と共に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、保存剤、崩壊剤、表面活性剤または分散剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、適切な機械での成形によって作製することができる。錠剤、ならびに、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などの他の固体剤形は、必要に応じて、腸溶コーティングおよび医薬製剤化の技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて刻み目を入れるまたは調製することができる。これらは、その中に含まれる活性成分の緩徐放出または制御放出がもたらされるように製剤化することもできる。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって滅菌することができる。これらの組成物は、必要に応じて乳白剤を含有してもよく、また、活性成分を胃腸管のある特定の部分だけにまたは当該部分に優先的に、必要に応じて遅延様式で放出する組成物であってもよい。活性成分はマイクロカプセルに封入された形態であってもよい。

【0217】

経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。液体剤形は、当技術分野で一般に使用される適切な不活性な希釈剤を含み得る。不活性な希釈剤に加えて、経口用組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、芳香剤および保存剤などの補助剤も含み得る。懸濁剤は、懸濁化剤も含み得る。

【0218】

直腸投与または膣投与用の医薬組成物は、坐薬として提示され得、これは、１つまたは複数の活性成分を、室温では固体であるが体温では液体であり、したがって、直腸内または膣腔内で融解し、活性化合物を放出する１つまたは複数の適切な非刺激性担体と混合することによって調製することができる。膣投与に適した医薬組成物は、適正であることが当技術分野で公知の薬学的に許容される担体を含有する膣坐薬、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、泡沫またはスプレー製剤も含む。

【0219】

局所または経皮投与用の剤形としては、散剤、スプレー、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、液滴および吸入剤が挙げられる。活性化合物を適切な薬学的に許容される担体と滅菌条件下で混合することができる。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、賦形剤を含有し得る。散剤およびスプレーは、賦形剤および噴霧体を含有し得る。

【0220】

非経口投与に適した医薬組成物は、１種または複数種のモジュレーターを、適切な抗酸化剤、緩衝液、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤もしくは増粘剤を含有し得る、１つまたは複数の薬学的に許容される滅菌等張性水溶液または非水溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルション、または使用する直前に滅菌の注射可能な溶液もしくは分散物に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせて含む。妥当な流動性は、例えば、コーティング材料を使用することによって、分散物の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤および分散剤などの適切な補助剤も含み得る。等張化剤を含めることが望ましい場合もある。さらに、吸収を遅延させる作用物質を含めることにより、注射可能な医薬形態の延長した吸収をもたらすことができる。

【0221】

一部の場合では、本発明のモジュレーターを含有する薬物の効果を長引かせるために、皮下注射または筋肉内注射による吸収を減速することが望ましい。これは、難水溶性の結晶性材料または非晶質材料の液体懸濁物を使用することによって達成することができる。

【0222】

次に、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、溶解速度が今度は結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口投与された薬物の遅延吸収は、油性ビヒクルに薬物を溶解または懸濁させることによって達成することができる。生分解性ポリマー中活性成分のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって注射可能なデポー形態を作製することができる。活性成分のポリマーに対する比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、活性成分の放出速度を調節することができる。デポー注射製剤は、薬物を体組織と適合性のリポソームまたはマイクロエマルション中に閉じ込めることによっても調製される。注射可能な材料は、例えば、細菌保持フィルターを通して濾過することによって滅菌することができる。

【0223】

製剤は、単位用量または複数回用量の密閉容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示され得、使用する直前に滅菌液体担体、例えば、注射用蒸留水を添加することだけが必要になる凍結乾燥した状態で保管することができる。上記の型の滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から即時注射液剤および懸濁剤を調製することができる。

【0224】

以下の実施例は、本発明の方法および組成物をさらに例示するために提供される。これらの実施例は、単に例示的なものであり、本発明の範囲を多少なりとも限定するものではない。

【実施例】

【0225】

本明細書の実施例では、標的化ｍＲＮＡ分解を促進する、よく認識されたｍ^６ＡリーダーであるＹｔｈｄｆ２（Wang et al. Blood, 505: 17-120, 2014）を、少なくとも部分的に、ＨＳＣ維持に関連したその役割を調査する目的で試験する。いかなる特定の理論にも限定されずに、Ｙｔｈｄｆ２の操作は、ｍ^６Ａでマークされた多数のｍＲＮＡの寿命に潜在的に影響を及ぼす可能性があり、したがって、成体ＨＳＣ自己複製対分化に影響を及ぼし、ＨＳＣ増大を容易にするものと考えられる。下の実施例において示されているように、Ｙｔｈｄｆ２枯渇により、マウスおよびヒトＨＳＣが、系列運命が歪むことなく特異的に増大する。したがって、Ｙｔｈｄｆ２はＨＳＣ自己複製の制御において不可欠な役割を果たす可能性があり、臨床的適用におけるものを含め、ｈＵＣＢＨＳＣのｅｘｖｉｖｏでの増大を増強するための新規の手法をもたらすものであると考えられる。

【0226】

実施例では、薬物抵抗性ｒＨＳＣ集団の機能的な定義、ならびに、ｒＨＳＣが、恒常性の間および化学療法ストレス下で、大部分はＮ−ｃａｄ^＋細胞により骨内膜ニッチ内に維持されるという所見も示される。骨内膜帯域内のＮ−ｃａｄ^＋細胞が、間葉系幹細胞であり、ｒＨＳＣ維持に寄与することがさらに示される。

【0227】

（実施例Ａ）
以下の実施例「Ａ」では以下のプロトコールを使用した。

【0228】

マウス。Ｙｔｈｄｆ２コンディショナルＫＯマウスがChuan HeおよびBin Shenのグループにより生成された。マウスをＳｔｏｗｅｒｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（ＳＩＭＲ）の動物施設内に収容し、研究所およびＮＩＨのガイドラインに従って取り扱った。手順は全てＩＡＣＵＣｏｆＳＩＭＲによって認可されたものであった。

【0229】

フローサイトメトリーおよびＨＳＰＣ選別。マウスＨＳＰＣ、前駆細胞、および系列細胞をＢＭ（大腿骨および脛骨）ならびに脾臓から採取した。０．１６Ｍの塩化アンモニウム溶液を使用して赤血球を溶解させ、７０μｍストレーナーを用いて細胞を濾過して、単一細胞懸濁物を生成した。マウスＨＳＣ同定のために、細胞を、Ｓｃａ−１（Ｄ７）、ｃ−Ｋｉｔ（２Ｂ８）、ＣＤ３４（ＲＡＭ３４）、Ｆｌｋ２（Ａ２Ｆ１０）、ＣＤ４８（ＨＭ４８−１）、ＣＤ１５０に対する抗体（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２）を、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、Ｍａｃ−１（Ｍ１／７０）、Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０、ＲＡ３−６Ｂ２）、ＩｇＭ（Ｉｌ−４１）およびＴｅｒ１１９（ＴＥＲ−１１９）を含む系列カクテルと共に用いて染色した。前駆細胞および系列細胞に関しては、細胞を以前に記載されている抗体で染色した（Qian, P. et al. Cell Stem Cell, 18: 214-228, 2016, doi:10.1016/j.stem.2015.11.001）。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（Ａ１３１０、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して死細胞を排除した。ヒト臍帯血試料をＳｔ．ＬｏｕｉｓＣｏｒｄＢｌｏｏｄＢａｎｋから取得した。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単核細胞を単離し、その後、ヒトＣＤ３４^＋臍帯血細胞をヒトＣＤ３４ＭｉｃｒｏＢｅａｄＫｉｔＵｌｔｒａＰｕｒｅ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）によって単離した。ヒトＨＳＰＣを定量化するために、細胞を、ＣＤ３４（５８１）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、ＣＤ９０（５Ｅ１０）、ＣＤ４９ｆ（ＧｏＨ３）、ＥＰＣＲ／ＣＤ２０１（ＲＣＲ−４０１）に対する抗体で染色した。細胞選別および分析をＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ）、ＩｎＦｌｕｘＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および／またはＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ分析を実施した。

【0230】

ホーミングアッセイ。ｉｎｖｉｖｏホーミングアッセイを以前に記載されている通り実施した（He et al. Methods in Molecular Biology, 1185: 279-284, 2014）。基本的に、ＣＤ４５．２マウス由来の全骨髄（ＷＢＭ）細胞を５μＭの５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡＳＥ）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を用いて３７℃で１０分間標識し、３回洗浄し、ＷＢＭ１×１０^６個を、致死的に照射を受けたｐｔｐｒｃマウスに移植した。１８時間後に、大腿骨および脛骨を洗い出し、ＣＦＤＡＳＥ＋細胞を決定した。

【0231】

競合的再構成アッセイ。ｗｔマウスまたはＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）由来のドナー由来ＷＢＭ細胞２×１０^５個、７．５×１０^４個または２．５×１０^４個を、レスキュー細胞（ＣＤ４５．１）２×１０^５個と共に、致死的に照射を受けた（１０Ｇｙ）ｐｔｐｒｃレシピエントマウス１０匹の群に静脈内移植することにより、競合的再構成アッセイを実施した。二次移植のために、一次移植レシピエントを屠殺した。ＢＭ細胞を大腿骨および脛骨から切開し、次いで、照射を受けた二次レシピエントマウスに細胞１×１０^６個の投与量でマウス間移植した。バイトリル水をレシピエントマウスに照射の３日前に与え、照射後さらに２週間継続した。一次および二次ＣＲＵ頻度をＥＬＤＡソフトウェアを使用して測定し（Hu et al. Journal of Immunological Methods, 347: 70-78, 2009）、上首尾の生着を、それぞれ末梢血中の総造血細胞の≧５％および≧１％の別個のＣＤ４５．２^＋ＣＤ４５．１⁻集団が存在することと定義した（Purtonet al. Cell Stem Cell, 1: 263-270, 2007）。また、移植の１６週間後よりも前に死亡した二次移植レシピエントマウスを生着失敗としてカウントした。

【0232】

細胞周期およびアポトーシスアッセイ。細胞周期分析を、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＫｉ６７セット（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を製造者の指示に従って用いて実施した。簡単に述べると、ＢＭ細胞５×１０^６個を単離し、上記の通りＨＳＣ抗体で染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒドにより４℃で終夜または室温（ＲＴ）で１時間にわたって固定し、次いで、０．２％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて氷上で１５分にわたって透過処理した。細胞を、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｋｉ−６７抗体と一緒に暗闇中、ＲＴで１時間インキュベートし、ＳＹＴＯＸＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にＲＴでさらに５分間インキュベートし、その後、ＩｎＦｌｕｘＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。アポトーシス分析のために、ＢＭ細胞５×１０^６個のアネキシンＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＳＹＴＯＸＲｅｄ染色を製造者のプロトコールに従って実施した。

【0233】

ｍ^６ＡＲＮＡ−ＩＰ−ｓｅｑ。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ（ＬＳＫＣＤ３４^＋ＦＬＫ２⁻）およびＭＰＰ（ＬＳＫＣＤ３４^＋ＦＬＫ２^＋）１０^５個の２つの反復物をＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に選別し、全ＲＮＡを製造者の指示に従って単離した。Ａｍｂｉｏｎ断片化試薬を用いてＲＮＡを約１００ヌクレオチドの断片に断片化した（７０℃で２分のインキュベーション）。次いで、試料をＴｕｒｂｏＤＮａｓｅ処理（Ａｍｂｉｏｎ）に供し、その後、フェノール−クロロホルム抽出を行い、ヌクレアーゼを含まない水８５μｌ中に再浮遊させ、５μｌをインプットとして保存した。次いで、残りの８０μｌのＲＮＡ断片をＩＰＰ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に希釈した。ＲＮＡを、抗ｍ^６Ａポリクローナル抗体（ＳｙｎａｐｔｉｃＳｙｓｔｅｍｓ）３μｇを予め結合させたプロテインＧ磁気ビーズ２５μｌと一緒にＩＰＰ緩衝液中、４℃で３時間インキュベートした。ビーズをＩＰＰ緩衝液２００μｌで２回洗浄し、低塩緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）２００μｌで２回洗浄し、高塩緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）２００μｌで２回洗浄した。次いで、ビーズを溶出緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、０．０５％ＳＤＳ、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍｌ）４．２μｌ）３００μｌを用いて５０℃で１．５時間にわたって処理し、フェノール：クロロホルム抽出、その後、エタノール沈殿を用いてＲＮＡを回収した。３つのヒトＣＤ３４^＋臍帯血液細胞を上記の通り単離し、ＴＲＩｚｏｌを用いて全ＲＮＡを単離した。Ａｍｂｉｏｎ断片化試薬を用いてＲＮＡを約１００ヌクレオチドの断片に断片化した（７０℃で２分５０秒のインキュベーション）。次いで、試料をＴｕｒｂｏＤＮａｓｅ処理（Ａｍｂｉｏｎ）に供し、その後、フェノール：クロロホルム抽出を行い、ヌクレアーゼを含まない水１８μｌに再浮遊させ、１μｌをインプットとして保存した。ＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）Ｎ６−ＭｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＫｉｔを製造者の指示に従って用いてｍ^６ＡＲＮＡＩＰを実施した。

【0234】

ＲＮＡのｍ^６Ａ調製後、品質をＡｇｉｌｅｎｔ２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価し、ＳＭＡＲＴｅｒＳｔｒａｎｄｅｄＴｏｔａｌＲＮＡ−ＳｅｑＫｉｔ − ＰｉｃｏＩｎｐｕｔＭａｍｍａｌｉａｎ（ＴａｋａｒａＢｉｏＩｎｃ）について製造者の指示に従い、１６サイクル（マウス）または１３サイクル（ヒト）のＰＣＲ２増幅を使用してＲＮＡｓｅｑライブラリーを生成するためにＲＮＡ１ｎｇ（マウス）または１０ｎｇ（ヒト）を使用した。当該方法では、ランダムプライミングおよびテンプレートスイッチングオリゴ（template switching oligo）を使用して、相補ＤＮＡを生成し、その後、バーコードを付したアダプターのライゲーションを行う。次いで、リボソーム由来のｃＤＮＡをプローブ特異的酵素切断およびその後の切断されていない断片の富化によって除去した。

【0235】

ＰＣＲ１精製に１．２×ＳＰＲＩビーズ濃度を使用することにより、低分子量の試料断片が保持されるようにプロトコールを改変した。二量体を形成したアダプターを除去するために、ライブラリーを、ＰｉｐｐｉｎＰｒｅｐ（ＳａｇｅＳｃｉｅｎｃｅ）２％ゲルを用いた１６０〜６００ｂｐのサイズ選択に供した。得られたライブラリーを、ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒａｎｄＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して品質および数量について確認した。次いで、等モル濃度のライブラリーをプールし、再び定量化した。マウスｍ^６Ａ−ｓｅｑに関しては、ライブラリーを５０ｂｐの単一リードとしてＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００機器でＨｉＳｅｑＣｏｎｔｒｏｌＳｏｆｔｗａｒｅ２．２．５８を使用して配列決定した。配列決定後、ＩｌｌｕｍｉｎａＰｒｉｍａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎＲＴＡ１．１８．６４およびＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２ｖ２．１８を実行して全てのライブラリーについてリードを逆多重化し、ＦＡＳＴＱファイルを生成した。ヒトｍ^６Ａ−ｓｅｑに関しては、ライブラリーを７５ｂｐの単一リードとしてＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ機器でＮｅｘｔＳｅｑＣｏｎｔｒｏｌＳｏｆｔｗａｒｅ２．１．２を使用して配列決定した。配列決定後、ＩｌｌｕｍｉｎａＰｒｉｍａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎＮｅｘｔＳｅｑＲＴＡ２．４．１１およびＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２ｖ２．１８を実行して全てのライブラリーについてリードを逆多重化し、ＦＡＳＴＱファイルを生成した。

【0236】

プラスミド構築および安定細胞株の生成。マウスＹｔｈｄｆ２（ｍＹｔｈｄｆ２）を市販のｃＤＮＡクローン（ＯＲＩＧＥＮＥ＃ＭＣ２００７３０）からベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／Ｆｌａｇプラスミドに、以下に列挙するプライマーを使用してクローニングした：ｍＹｔｈｄｆ２ＯＲＦＣｌｏｎｅＢａｍｈＩＦ：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡ−３’およびｍＹｔｈｄｆ２ＯＲＦＣｌｏｎｅＮｏｔＩＲ：５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＴ−３’。次いで、Ｆｌａｇ−ｍＹｔｈｄｆ２をＥＦ１ａプロモーターの下でｐＳｉｃｏＲ−ＥＦ１ａ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰレンチウイルス構築物にサブクローニングした（ＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）、フォワードプライマー：５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧ−３’およびリバースプライマー：５’−ＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＡＣＧＴ−３’）。ヒトＹｔｈｄｆ２（ｈＹｔｈｄｆ２）をＣｈｕａｎＨｅｌａｂにより供給されたプラスミドから以下に示すプライマーを使用してクローニングした：フォワード５’−ＣＧＴＴＣＧＡＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴ−３’；リバース５’−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＧＡＣＣＴＴ−３’。次いで、ｈＹｔｈｄｆ２をｐＳｉｃｏＲ−ＥＦ１ａ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ構築物にＥＦ１ａプロモーターの下でＢｓｔＢＩおよびＸｍａＩ制限酵素消化およびライゲーションによってクローニングした。Ｆｌａｇ−ｍＹｔｈｄｆ２ＨＰＣ７安定細胞株を生成するために、ｐＳｉｃｏＲ−ＥＦ１ａ−Ｆｌａｇ−ｍＹｔｈｄｆ２−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ構築物をｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇプラスミドと共に１０：７．５：２．５の比でリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによってレンチウイルスを生成した。トランスフェクションの４８時間後、７２時間後、および９６時間後にウイルス粒子を採取し、０．４５マイクロメーターの濾過ユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濾過し、次いで、４℃、１８，０００ＲＰＭで２時間遠心分離した。ＨＰＣ７細胞に組換えレンチウイルス形質導入単位を４μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下で感染させた。感染の４８時間後、ＧＦＰ^＋細胞を実験のために選別し、培養した。

【0237】

ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑおよびデータ分析。ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑに関しては、手順を以前に報告された方法（Zarneger et al. Nature Methods, 13: 489-492, 2016）； Simsek et al.Cell, 169: 1051-1065 e1018, 2017）から改変した。簡単に述べると、Ｆｌａｇ−Ｙｔｈｄｆ２ＨＰＣ７細胞約３×１０^８個に対して、細胞を０．４Ｊ／ｃｍ^２で３回ＵＶ架橋結合させることによってｉｒＣＬＩＰを実施した。全細胞溶解物を溶解緩衝液（１５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、０．５ｍＭのＤＴＴ、１：１００のプロテアーゼ阻害剤カクテル、４００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤；細胞ペレット１ｍｌおよび溶解緩衝液２ｍｌ）中に生成させた。数回ピペットで吸引排出し、次いで、ｍＲＮＰ溶解物を氷上で５分間インキュベートし、液体窒素を用いて−８０℃でショック凍結した。ｍＲＮＰ溶解物を氷上で解凍し、１５，０００ｇで１５分間遠心分離して溶解物を清澄化した。Ｆｌａｇ−Ｙｔｈｄｆ２を、抗Ｆｌａｇモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）２μｇを回転させながら４℃で２時間にわたって予め結合させたプロテインＧ磁気ビーズを溶解物１ｍｌ当たり３０μｌで用いて単離した。ビーズを採取し、氷冷ＮＴ２緩衝液（２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＮＰ−４０、０．５ｍＭのＤＴＴ、２００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤）１ｍｌで８回洗浄し、ｉｒＣＬＩＰＮＴ２緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ_２；０．０００５％のＮＰ−４０）２００μｌで１回洗浄した。ｍＲＮＰ複合体をＲＮａｓｅ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃ＡＭ２２９４）をｉｒＣＬＩＰＮＴ２緩衝液（水性体積３０μｌおよびＰＥＧ４００６μｌを補充したもの（最終１６．７％））中０．４Ｕ／μｌで用いて消化した。ヌクレアーゼ反応物を３０℃で１５分間、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ、１，４００ｒ．ｐ．ｍ．で１５秒、９０秒静止でインキュベートした。氷冷高ストリンジェンシー緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５；１２０ｍＭのＮａＣｌ；２５ｍＭのＫＣｌ；５ｍＭのＥＤＴＡ；１％のＴｒｉｔｉｏｎ−Ｘ１００；１％のデオキシコール酸Ｎａ）０．５ｍＬを添加することによってヌクレアーゼ消化を停止させた。次いで、免疫沈降物を氷冷ｉｒＣＬＩＰＮＴ２緩衝液０．２５ｍＬ、次いで０．０５ｍＬですぐにすすいだ。ｉｒＣＬＩＰアダプターライゲーションおよびライブラリー構築は以前に報告されたプロトコールに従った（Zarnegeret al. Nature Methods, 13: 489-492, 2016）。

【0238】

データをＦＡＳＴ−ｉＣＬＩＰバージョン０．９．３を使用して逆多重化し、ＵＣＳＣからのマウスゲノムｍｍ１０に対して、パラメーター「−−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＳｃｏｒｅＭｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ０ −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎＯｖｅｒＬｒｅａｄ０ −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭａｔｃｈＮｍｉｎ０」を用いて、ＳＴＡＲ（２．４．２ａ）を使用してアラインメントした。ＲＰＭ正規化ゲノムブラウザトラックをＲ（３．４．１）で創出し、Ｇｖｉｚパッケージ（１．２０．０）を使用してプロットした。３つの反復物全てで見いだされた各結合性部位の中間点を取り、上流および下流に２０塩基を付加し、ＭＥＭＥ（４．１１．１）をパラメーター「−ｄｎａ −ｍｏｄｚｏｏｐｓ −ｒｅｖｃｏｍｐ −ｍｉｎｗ５ −ｍａｘｗ１０ −ｎｍｏｔｉｆｓ１０ −ｍａｘｓｉｚｅ１００００００」を用いて実行することにより、富化されたモチーフを同定した。モチーフの同定後、ｔｒａｎｓｆａｃ（１−２０１７）に対してｔｏｍｔｏｍ（４．１１．１）を実行して既知の結合性部位を同定した。Ｒで超幾何分布検定（hypergeometric test）を使用してＧＯ富化分析を実施した。ＧＯ用語のＢＨ調整されたｐ値が０．０５未満であれば、ＧＯ用語が富化されたとみなした。選択された目的の用語を棒プロットで示す。棒プロットの棒は、当該用語を有する試験された一覧中の遺伝子のパーセンテージを、当該用語を有するゲノム内の遺伝子のパーセンテージで割ったものを示す。３つの反復物全てにおいてＦＡＳＴ−ｉＣＬＩＰによって見いだされたピークをゲノム内の様々な特徴に割り当てた。プロモーターをＴＳＳの上流１５０塩基と定義した。「ｔｒａｎｓ＿ｓｔｏｐ」を転写開始部位の上流および下流２００塩基と定義した。

【0239】

臍帯血形質導入。臍帯血形質導入を以前に記載されている通り行った（Rentas, S.et al. Nature, 532: 508-511, 2016, doi: 10.1038/nature17665）。簡単に述べると、新鮮なＣＤ３４^＋臍帯血細胞またはフロー選別したＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞を、増殖因子インターロイキン６（ＩＬ−６；２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、幹細胞因子（ＳＣＦ；１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ；１００ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）およびトロンボポエチン（ＴＰＯ；２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１２〜１８時間にわたって前刺激した。次いで、同じ培地にレンチウイルスを感染効率（ＭＯＩ）５０〜２００で添加して２４時間置いた。次いで、細胞を形質導入後２日間置いた後、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏアッセイを行った。ヒトＹＴＨＤＦ２を、以前の報告（Wang,X. et al. Nature 505: 117-120, 2014, doi: 10.1038/nature12730）に使用されている通り、ＣＤＳのＮ末端付近の５’−ＡＡＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＡＡ−３’を標的とするｓｈＲＮＡによるノックダウンのために標的化された。スクランブルｓｈＲＮＡ（シード配列５’−ＧＣＧＣＧＡＴＡＧＣＧＣＴＡＡＴＡＡＴ−３’）を対照として使用した。

【0240】

クローン原性前駆細胞アッセイ。１０日目の培養した形質導入された細胞からフロー選別したＧＦＰ^＋臍帯血細胞（１ｍｌ当たり１２，０００個）を半固体メチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏｃｕｌｔＨ４０３４；ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再浮遊させた。１４日間インキュベートした後にコロニーカウントを行った。

【0241】

ヒト臍帯血液ＨＳＰＣ培養物。形質導入の２日後、ヒト臍帯血ＣＤ３４^＋またはＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞を採取し、フローサイトメトリーによってＧＦＰ^＋パーセンテージを決定した。増大前に等しい数のＧＦＰ^＋細胞が培養されることを確実にするために、対照およびｈＹｔｈｄｆ２ＫＤ間の％ＧＦＰ^＋が一致するように、等しく培養したＧＦＰ⁻細胞をＧＦＰ^＋パーセンテージがより高いものに添加した。次いで、細胞を増殖因子ＩＬ−６（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ３−Ｌ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＣＨＩＲ９９０２１（２５０ｎＭ）（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１ｍｌ当たり１０^５個の密度で播種した（Perry et al. Genes and Development, 25: 1928-1942, 2011）。

【0242】

ヒトＨＳＣ異種移植。ヒト臍帯血ＨＳＣのｅｘｖｉｖｏでの増大を分析するために、選別されたＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻細胞１０^５個にヒトＹＴＨＤＦ２ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを３日間にわたって形質導入し、次いで、形質導入効率（％ＧＦＰ^−／＋）および幹細胞マーカーについて分析した。１０日目に、培養細胞を幹細胞マーカー分析のために採取した。ｈＵＢＣＨＳＣ一次ＬＤＡアッセイのために、ＣＤ３４^＋細胞を上記の通り富化させ、ヒトＹＴＨＤＦ２ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡを５０ＭＯＩで形質導入した。感染の２４時間後に培地を交換した。感染の３日後に対照またはＹＴＨＤＦ２ＫＤ細胞から等しい数のＧＦＰ^＋細胞を選別し、終夜培養した。３つの用量、５０Ｋ個、２０Ｋ個および１０Ｋ個の選別されたＧＦＰ^＋細胞をそれぞれ、亜致死的に照射を受けた（３．２５Ｇｙ）ＮＳＧマウスに移植した。ＨＳＣ生着のカットオフは、一次移植レシピエントのＢＭにおける総ＣＤ４５^＋細胞のうちヒトＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋細胞が１％よりも多く示されることであった。ｈＵＣＢＨＳＣ二次ＬＤＡアッセイのために、移植の１０週間後に、最も高い２つの用量の一次レシピエントからＢＭ細胞を採取し、混合した。３つの用量、１．２×１０^７個、８×１０^６個、４×１０^６個のＢＭ細胞をそれぞれ、亜致死的に照射を受けた（３．２５Ｇｙ）ＮＳＧマウスに移植した。ＨＳＣ生着のカットオフは、二次移植レシピエントのＢＭにおける総ＣＤ４５^＋細胞のうちヒトＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋細胞が０．２％よりも多く示されることであった。ＥＬＤＡソフトウェア（Hu et al. Journal of Immunological methods, 347: 70-78, 2009）を使用してＨＳＣ頻度を評価した。全てのヒト臍帯血異種移植実験について、６〜８週齢の雌ＮＳＧマウスを使用した。

【0243】

ｍ^６Ａ−ｓｅｑデータ分析。ヒトおよびマウスｍ^６Ａ−ｓｅｑデータをｈｇ１９およびｍｍ１０のトランスクリプトームに対してアラインメントした。ｍ^６Ａピークを同定するために、ｈｇ１９およびｍｍ１０トランスクリプトームを２５ヌクレオチド幅のタイルに分けた。各タイルにおいてｍ^６ＡＩＰおよび非ＩＰ（対照）試料におけるリードの数をカウントし、フィッシャーの直接検定を用いてｐ値を算出し、複数の試験について調整した。有意なｍ^６Ａシグナル富化（調整Ｐ値≦０．０５）を有するタイルをより大きな領域に合体させた。１００ｂｐよりも小さな領域は破棄し、２００ｂｐを超える領域を１００〜２００ｂｐの小領域に分けた。各領域において対照を超えるｍ^６Ａシグナルを算出した。全ての反復物において少なくとも２倍の富化を有する領域をｍ^６Ａピークとして同定した。全てのｍ^６Ａピークをｈｇ１９およびｍｍ１０ＲｅｆＧｅｎｅアノテーションとオーバーラップすることにより、ｍ^６Ａピーク分布およびｍ^６Ａでマークされた遺伝子を決定した。ｍ^６Ａピークをｈｇ１９ＲｅｆＧｅｎｅとオーバーラップすることにより、ｍ^６Ａでマークされた遺伝子を同定した。転写因子をフィルタリングするために、３つの試料全てにおけるｍ^６Ａによりマークされた遺伝子をヒト転写因子データベースhttp://fantom.gsc.riken.jp/5/sstar/Browse_Transcription_Factors_hg19と比較した。次いで、Ｒパッケージ富化ＧＯを使用してＧＯ用語分析を実施した。ｍ^６Ａでマークされたヒト転写因子を検索一覧として使用し、全ての発現した遺伝子をバックグラウンドとして使用した。有意な富化を有する造血関連ＢＰ用語を使用して図３Ｃを作成した。

【0244】

ＲＮＡ−ｓｅｑ。ヒト臍帯血ＣＤ３４^＋細胞に対照またはヒトＹＴＨＤＦ２ＫＤレンチウイルスを形質導入し、１０日後にＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋について選別した。各群についてＧＦＰ^＋ＣＤ３４^＋細胞１２，０００個の３つの反復物を選別し、全ＲＮＡを抽出するために使用した。高品質の全ＲＮＡ４ナノグラムをｃＤＮＡ合成およびライブラリー調製のために製造者の指示に従ってＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑｖ４ＵｌｔｒａＬｏｗＩｎｐｕｔＲＮＡＫｉｔｆｏｒＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｔａｋａｒａ、６３４８９１）およびＮｅｘｔｅｒａＸＴ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＦＣ−１３１−１０９６）と共に使用した。得られた短い断片ライブラリーを品質および数量についてＡｇｉｌｅｎｔ２１００ＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＱｕｂｉｔＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを使用して確認した。等モル濃度ライブラリーをプールし、再び定量化し、ＩｌｌｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００機器の高倍率フローセルで７５塩基対の単一リードとして配列決定した。配列決定後、ＩｌｌｕｍｉｎａＰｒｉｍａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎＮｅｘｔＳｅｑＲＴＡ２．４．１１およびＳｅｃｏｎｄａｒｙＡｎａｌｙｓｉｓｖｅｒｓｉｏｎｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２２．１８を実行して全てのライブラリーについてリードを逆多重化し、ＦＡＳＴＱファイルを生成した。

【0245】

ＲＮＡ−ｓｅｑ分析のために、リードをＵＣＳＣゲノムｈｇ３８に対して、Ｅｎｓｅｍｂｌ８７遺伝子モデルを使用し、Ｔｏｐｈａｔバージョン２．０．１３をデフォルトパラメーターで用いてアラインメントした。−ｍｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−ｎｏｎｅｍｐｔｙを用いたＨＴＳｅｑ−カウントを使用してリードカウントを生成した。リードをＥＲＣＣ対照配列に対してもアラインメントし、カウントを表にした。スケーリング因子を各試料についてのＥＲＣＣカウントの中央値に基づいて算出し、正規化のために使用した。Ｒ（３．４．１）のｅｄｇｅＲパッケージ（３．１８．１）を使用して、異なって発現した遺伝子を見いだした。異なって発現した遺伝子はＢＨ調整されたｐ値＜．０５および発現の２倍の変化を有する必要があった。

【0246】

ＲＮＡの安定性アッセイ。選別されたＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰ１５，０００個を、１０μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、０．５×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｎｇ／ｍＬの組換えマウス（ｒｍ）ＳＣＦ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、および２０ｎｇ／ｍＬのＴｐｏ（ＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）（Perry et al. Genes and Development, 25: 1928-1942 (2011)）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２で培養した。選別された細胞を、ｍＲＮＡ転写の阻害のために５μＭのアクチノマイシンＤ（Ｓｉｇｍａ）で処理した。処理の０時間後または４時間後に細胞を採取し、全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ−ｓｅｑのために使用した。

【0247】

ｍ^６ＡＲＮＡメチル化の定量化。

【0248】

ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のマウスＢＭ系列陰性細胞を、マウスＬｉｎｅａｇｅＣｅｌｌＤｅｐｌｅｔｉｏｎＫｉｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）で富化し、その後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡ抽出を行った。Ｌｉｎ⁻細胞におけるｍ^６ＡＲＮＡメチル化の定量化をｍ^６ＡＲＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ａｂｃａｍａｂ１８５９１２）を製造者のプロトコールに従って使用して実施した。いずれの群についても反復物当たり２００ｎｇの全ＲＮＡを使用した。

【0249】

ｑＰＣＲ分析。

【0250】

ＬＳＫ細胞１０^５個をｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスから選別した。ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ−ＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ（商標）Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造者のプロトコールに従って用いてｃＤＮＡ合成を行った。使用したｑＰＣＲプライマーが表Ｓ５に列挙されており、ｑＰＣＲプライマーを使用してｗｔおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおける転写因子の発現レベルを検証した。

【0251】

ウエスタンブロットおよび細胞内染色。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスモデルまたはｈＵＣＢにおけるＫＯまたはＫＤ効率を検証するために、ｃＫｉｔ^＋細胞３３，０００個またはＧＦＰ^＋細胞１２０，０００個をそれぞれＢＭまたはトランスフェクトしたｈＵＣＢ試料から選別した。図１４Ｂに示されている通りヒトＹＴＨＤＦ２を過剰発現するように形質導入されたＨｅｌａ細胞を使用して過剰発現効率を検証した。抗ＹＴＨＤＦ２ウサギポリクローナル抗体（ＭＢＬ、ＲＮ１２３ＰＷ）およびβ−アクチンマウスモノクローナル抗体（ＮＯＶＵＳ、ＮＢ６００−５０１）を用いて免疫ブロッティングを実施した。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧおよびＩＲＤｙｅ８００ＣＷヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）であった。細胞内染色のために、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＢＭ細胞を上記の通りＨＳＣマーカーで染色し、次いで、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の指示に従って用いて固定した。固定し、透過処理した細胞を抗ＹＴＨＤＦ２抗体（ＭＢＬＲＮ１２３ＰＷ）、抗ＴＡＬ１抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚｓｃ−３９３２８７）、抗ＧＡＴＡ２抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚｓｃ−２６７）、抗ＲＵＮＸ１抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚｓｃ−３６５６４４）、抗ＳＴＡＴ５抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚｓｃ−７４４４２）で免疫染色し、Ａｌｅｘａ−４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって検出した。

【0252】

単一細胞免疫染色。ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＬＳＫ１０，０００個を選別してポリ−Ｌ−リシンコーティングスライド上に置き、それをモイスチャーチャンバーに入れ、４℃で３０分間インキュベートして細胞をスライド上に静置した。冷却したメタノールを用いてＲＴで１０分にわたって細胞を固定し、ユニバーサルブロッキング試薬（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を用いてＲＴで３０分にわたってブロッキングし、マウスＴＡＬ１抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＳＣ３９３２８７）またはマウスＩｇＧ対照（Ａｂｃａｍ）を用いて４℃で終夜染色した。次いで、細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて４℃で３０分にわたって染色した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＵｌｔｒａｖｉｅｗスピニングディスクシステムでＹｏｋａｇａｗａＣＳ−Ｘ１ディスクを用いて画像を取得した。全ての放出をＣ９１００−２３ＨａｍａｍａｔｓｕＥＭ−ＣＣＤにＶｅｌｏｃｉｔｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して収集した。Ｚ−スタックについて、ステップサイズを４００ｎｍに設定した。画像当たりの染色強度をＩｍａｇｅＪプログラムよって定量化した。

【0253】

蛍光免疫染色と併せたＦＩＳＨ。選別されたＬＳＫを顕微鏡ガラススライド（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣａｔ．Ｎｏ．１２−５４４−４）上でＣｙｔｏｓｐｉｎ（商標）４Ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ａ７８３００００３）を８００ｒｐｍで１分間、中程度の加速と共に使用してスピンさせ、その後、４％ＰＦＡ（１６％（ｗｔ／ｖｏｌ）水溶液から希釈したもの、ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．１５７１０）に即時に浸漬した。細胞をＲＴ（２５±２℃）で３０分にわたって固定した。ＲＮＡｓｃｏｐｅマルチプレックス蛍光検出キットを製造者の指示に従い使用して（ＡｄｖａｎｃｅｄＣｅｌｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、以下の２〜３の改変を伴ってＲＮＡｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した：抗原回復は不必要であった。また、消化を１：１５に希釈したプロテイナーゼＩＩＩ溶液を用いてＲＴで１０分にわたって実施した。マウスＴａｌ１およびＧａｔａ２を標的とするＲＮＡｓｃｏｐｅプローブはＡＣＤｂｉｏによって設計および作製された。ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの完了後、スライドをＰＢＳＴで２回すすぎ、バックグラウンドブロッキング（バックグラウンドバスター溶液、Ｉｎｎｏｖｅｘ、ｃａｔ．ｎｏ．ＮＢ３０６）および一次抗体インキュベーションを用いて直接処理した。抗ＹＴＨＤＦ２（ＭＢＬ、１：５００）および抗Ｄｃｐ１α（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＳＣ１００７０６、１：２００）抗体を抗体希釈試薬緩衝液（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．００３１１８）で希釈し、４℃で終夜インキュベートした。ロバ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）およびロバ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）をタンパク質標的多重化のために使用した。

【0254】

（実施例Ａ−１）
一次マウスにおいてＹｔｈｄｆ２ＫＯにより表現型ＨＳＣの増加が導かれる。

【0255】

Ｙｔｈｄｆ２の表現型ＨＳＣに対する影響を調査するために、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９技術を利用してＹｔｈｄｆ２^ｆ／ｆコンディショナルノックアウトマウスを生成し、次いで、Ｍｘ１−Ｃｒｅマウスと交雑させて、造血細胞におけるＹｔｈｄｆ２発現を特異的に低減させた（以降Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウス）（図１ＡおよびＢ）。ＢＭＨＳＰＣは、ｐＩ：ｐＣの不在時に識別可能な差異を示さなかった（図７Ａ）。ｐＩ：ｐＣ注射の４週間後、同腹仔野生型（ｗｔ）マウスと比較して、長期ＨＳＣ（Ｌｉｎ⁻Ｓｃａ１^＋ｃＫｉｔ^＋（ＬＳＫ）ＣＤ３４⁻Ｆｌｋ２⁻；ＬＴ−ＨＳＣ）および短期ＨＳＣ（ＬＳＫＣＤ３４^＋Ｆｌｋ２⁻；ＳＴ−ＨＳＣ）の頻度および絶対数の両方に有意な増加が観察されたが、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスにおける多分化能前駆細胞（ＬＳＫＣＤ３４^＋Ｆｌｋ２^＋；ＭＰＰ）では観察されなかった（図１Ｃ〜１Ｅ）。長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）およびＳＴ−ＨＳＣの頻度および絶対細胞数は２倍を超えて増加したが、ＭＰＰは穏やかな応答を示したことが見いだされた（図１Ｃおよび１Ｅ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯによりＢＭ細胞充実性の増大が導かれたが、共通の骨髄系前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）および共通のリンパ系前駆細胞（ＣＬＰ）を含めた拘束前駆細胞、ならびに成熟系列細胞、赤血球、骨髄性細胞、Ｂ細胞およびＴ細胞の絶対数には、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯとｗｔマウスの間で有意差は示されなかった（図１Ｆ〜Ｈ）。細胞周期分析から、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯ後のＨＳＣまたはＭＰＰの静止状態の識別可能な変化は明らかにならなかった（図７Ｂ）。とりわけ、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＬＴ−、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰにおけるアポトーシス細胞のパーセンテージがｗｔ対照と比較して有意に低下した（図７Ｃ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスにおけるあらゆる潜在的なＨＳＣ欠陥をさらに同定するために、脾臓におけるＨＳＣ、拘束前駆細胞、および成熟系列の数を調査し、ｗｔマウスとＹｔｈｄｆ２ＫＯマウスの間で有意差は見いだされなかった（図７Ｄ〜７Ｈ）。要約すると、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより、一次マウスにおいてＨＳＣ数が前駆細胞または系列細胞のいずれの偏りも欠陥も伴わずに特異的に増加する。

【0256】

（実施例Ａ−２）
マウスにおいてＹｔｈｄｆ２ＫＯにより機能的ＨＳＣが増大する。

【0257】

Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより機能的ＨＳＣが増大するかどうかを決定するために、ＫＯマウスまたはそれらの対照同腹仔由来のカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＤＡＳＥ）標識ＢＭ細胞１×１０^６個を、致死的に照射を受けたレシピエントマウスに移植することにより、短期ホーミングアッセイを最初に実施し、変異体とｗｔ対照の間でホーミング能力に有意差は見いだされなかった（図７Ｉ）。次いで、ｐｔｐｒｃ変異体系統（ＣＤ４５．１）に由来するレシピエントＢＭ細胞２×１０^５個と共に、ドナーＢＭ細胞（ＣＤ４５．２）２×１０^５個、７．５×１０^４個または２．５×１０^４個を致死的に照射を受けたレシピエントマウスに移植することにより、限界希釈、競合再配置単位アッセイ（ＬＤＡ）を実行した（図２Ａ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスにおける表現型ＨＳＣの数の増加と一致して、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＣでは対照と比較して競合再配置単位（ＣＲＵ）が２．２倍に増加したことが見いだされた（図２Ｂ）。２×１０^５個群では、移植の１６週間後に、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯドナー細胞からの全体的な再配置率に関して、対照と比較して、有意な増加が観察された（図２Ｃ）。さらに、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＢＭ細胞のレシピエントでは、対照のレシピエントと比較して、ドナー由来のＬＴ−ＨＳＣおよびＳＴ−ＨＳＣの著しく高い頻度および絶対数が示されたが、ＢＭにおけるＭＰＰに関してはそれが示されなかった（図２Ｄおよび２Ｅ）。さらに、変異体およびｗｔ細胞の移植レシピエント由来のＢＭにおけるドナー由来の拘束前駆細胞および成熟系列が有意な変化を示さなかったことが見いだされた（図２Ｆおよび２Ｇ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＨＳＣの長期再配置能力を決定するために、一次レシピエントに由来するＢＭ細胞を用いた二次移植を行った。とりわけ、対照と比較して、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯ細胞由来のＣＲＵでは３．５倍の増加が明らかになり（図２Ｈ）、二次移植の１６週間後にＢＭおよび脾臓のどちらにおいても白血病の徴候は示されなかった（図９Ａ〜９Ｆ）ことが見いだされた。さらに、図２Ｉおよび２Ｊでは、ＷＴマウスまたはＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来の総骨髄（ＢＭ）を３つの異なる投与量で移植することにより、限界希釈アッセイを行った。移植の４週間後、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＢＭ細胞２００，０００個を移植したマウスにおいて、ＷＴＢＭ細胞を移植したマウスと比較してドナー細胞の生着の増加が観察された。さらに、この増加により、移植レシピエントにおける系列の偏りは生じなかった。

【0258】

ｐＩ：ｐＣ注射後５カ月を超える時点でＢＭおよび脾臓の両方における幹細胞、前駆細胞、および系列を試験することにより、恒常性条件下での造血に対するＹｔｈｄｆ２ＫＯの長期にわたる影響も調査した（図９Ａ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＢＭにおいて対照由来のＢＭと比較してＬＴ−ＨＳＣの穏当な増加が観察されたが（図９Ｃ）、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスと対照マウスの間でＢＭまたは脾臓のいずれか由来の前駆細胞および系列細胞に識別可能な差異はなかった（図９Ｄ〜９Ｊ）。これらの知見から、ｉｎｖｉｖｏにおけるＹｔｈｄｆ２ＫＯの長期にわたる影響により、系列分化が歪むこともなく、異常な増殖が促進されることもないことが示され、これは、Ｙｔｈｄｆ２が白血病誘発には必要ないという以前の報告と一致する。ｐＩ：ｐＣ誘導の５カ月後のＢＭにおける機能的ＨＳＣの頻度を検証するために、ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＢＭ細胞７．５×１０^４個を、コンピテント細胞と共に、致死的に照射を受けたレシピエントに移植した。本発明者らは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより、レシピエントにおいてｗｔ対照と比較して有意に高い生着が導かれることを見いだし、これにより、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯがｉｎｖｉｖｏにおけるマウスＨＳＣ増大に対して長期にわたる能力を有することが示唆される（図９Ｋ）。総合すると、これらのデータから、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより、系列拘束に影響を及ぼすことなくｉｎｖｉｖｏにおける特異的かつ有意なマウスＨＳＣ増大がもたらされることが明らかになる。

【0259】

（実施例Ａ−３）
Ｙｔｈｄｆ２はｍ^６Ａ媒介性ｍＲＮＡ分解によってＨＳＣ自己複製遺伝子発現を制御する。

【0260】

Ｙｔｈｄｆ２ＫＯによりどのようにＨＳＣが増大するかの基礎をなす機構を探究するために、成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから選別されたＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、およびＭＰＰにおけるメチル化ＲＮＡ免疫沈降とハイスループット配列決定（ＭｅＲＩＰ−ｓｅｑまたはｍ^６Ａ−ｓｅｑ）を組み合わせてｍ^６Ａメチロームのマッピングを実施した（Meyer et al. Cell, 149: 1635-1646, 2012； Schwartz et al. Cell, 155:1409-1421, 2013； Dominissini et al. Nature, 485: 201-206, 2012）。２つの独立した反復物から有意に富化された重複するピークを同定することによってｍ^６Ａピークを選択した。以前の研究（Meyeret al. Cell, 149: 1635-1646, 2012）； Dominissini et al. Nature, 485: 201-206,2012）と一致して、３種のＨＳＰＣ集団全てにおいて、ｍ^６ＡピークがｍＲＮＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内、および終止コドン周辺で豊富であることが見いだされた。中等度に発現した遺伝子の転写物がメチル化されている可能性がより高かった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。興味深いことに、ｍ^６Ａ修飾がＧａｔａ２、Ｅｔｖ６、Ｓｔａｔ５およびＴａｌ１などの転写因子のｍＲＮＡにおいて富化されていることが見いだされ、これは、ＨＳＣ自己複製および幹細胞の状態維持に極めて重要であることが実証されており（Wanget al. Blood, 113: 4856-5865, 2009； Ebina et al. The EMBO Journal, 34: 694-709,2015； Orkin et al. Cell, 132: 631-644, 2008： de Pater et al. The Journal ofExperimental Medicine, 210: 2843-2850, 2013； Hock et al. Genes and Development,18: 2336-2341, 2004； Lim et al. The Journal of Clinical Investigation 122:3705-3717, 2012； Reynaud et al. Blood, 106: 2318-2328, 2005；およびKato et al. TheJournal of Experimental Medicine, 202: 169-179, 2005）、ｍ^６Ａ修飾がＨＳＣの制御において重大な役割を果たす可能性があることが示唆される（表Ｓ１、ＨＳＣ自己複製および維持に重大な重要な転写因子はＨＳＰＣにおいてｍ^６Ａにより標識されている）。ｍ^６ＡｍＲＮＡメチル化により、自己複製および分化に関与する重要なシグナル伝達経路内の転写因子および遺伝子をコードするｍＲＮＡの分解が容易になることによって幹細胞の運命決定が制御されるというエビデンスが蓄積されていることを考慮して（Batistaet al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014；（Geula et al. Science 347: 1001-1006,2015； Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al. Nature, 549: 273-276, 2017； Zhao etal. Nature, 542: 475-478, 2017； Li et al. Cancer Cell, 31: 127-141, 2017； Li etal. Nature, 548: 338-342, 2017）、次に、アクチノマイシンＤでの転写阻害後のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより、ＬＴ−ＨＳＣ、ＳＴ−ＨＳＣ、およびＭＰＰにおけるｍＲＮＡ分解速度を測定した。ＳＴ−ＨＳＣ、およびＭＰＰではメチル化ｍＲＮＡの分解速度が非メチル化ｍＲＮＡよりも有意に速いことが見いだされた（図１０Ｄ）。Ｙｔｈｄｆ２は、ｍＲＮＡ分解を媒介する、よく認識されたｍ^６Ａ「リーダー」であるので（Wanget al. Nature, 505: 117-120, 2014）、マウス多分化能造血の前駆体細胞株であるＨＰＣ−７において赤外ＵＶ架橋結合免疫沈降配列決定（ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ）を実施することによってＹｔｈｄｆ２の標的をさらに決定した（Pintodo et al. The EMBO Journal, 17: 5744-5756, 1998； Zarnegar et al. NatureMethods, 13: 489-492, 2016）（図３Ａ；図１１Ａ〜１１Ｃ）。結果から、Ｙｔｈｄｆ２標的ｍＲＮＡの５７．８％がｍ^６Ａピークを含有したことが示された（図１１Ｄ）。Ｙｔｈｄｆ２結合性部位では保存されたｍ^６Ａモチーフが富化されており、ｍ^６Ａ分布特徴の特性が示された（図３Ｂおよび３Ｃ）。Ｙｔｈｄｆ２標的転写物の遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、造血またはリンパ器官発生に関連する遺伝子の富化が明らかになり、これにより、造血の制御へのＹｔｈｄｆ２の関与が示唆される（図３Ｄ）。とりわけ、Ｙｔｈｄｆ２が、Ｔａｌ１およびＧａｔａ２のｍＲＮＡなどの転写因子ｍＲＮＡに、大部分がｍ^６Ａピークと重複する部位で結合することが見いだされた（図３Ｅ；図５Ｅおよび表Ｓ２、Ｙｔｈｄｆ２は３つのｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑ反復物からのｍＲＮＡを標的とした）。ｗｔマウスおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯマウス由来のＬＳＫＦｌｋ２⁻細胞における全ＲＮＡ質量に有意な変化は観察されなかった。哺乳動物細胞においてｍ^６Ａ修飾はアデノシンヌクレオチドの０．１〜０．４％しか構成しないが、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより、ＢＭＬｉｎ⁻細胞由来の全ＲＮＡにおけるｍ^６Ａ含有量のレベルの上昇が導かれることが見いだされ、これにより、Ｙｔｈｄｆ２がｍ^６ＡでマークされたｍＲＮＡの安定性を特異的に制御することが示唆される（図１２Ａおよび１２Ｂ）。一貫して、総ｍＲＮＡのｑＰＣＲ分析により、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＬＳＫ細胞において、ｗｔ対照と比較して、ｍＲＮＡがｍ^６Ａによって修飾されていることが示されているＴａｌ１、Ｇａｔａ２、Ｒｕｎｘ１およびＳｔａｔ５ａのレベルの上昇が明らかになった（図３Ｆ）。単一細胞免疫蛍光染色および細胞内フローサイトメトリーにより、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣでは、ＴＡＬ１、ＧＡＴＡ２、ＲＵＮＸ１およびＳＴＡＴ５などの、幹細胞の自己複製に関与する、ｍ_６Ａで標識された転写因子の強度の有意な増加が示されたことがさらに明らかになり、これにより、ＨＳＣ自己複製におけるＹｔｈｄｆ２の抑制性の役割が示される（図３Ｇ；図１２Ｃ）。以前の試験により、Ｙｔｈｄｆ２が、結合したｍＲＮＡをｍＲＮＡ分解部位に局在させることによってＲＮＡ代謝を制御することが示されている（Wanget al. Nature, 505: 117-120, 2014）。ＨＳＣ自己複製の制御におけるＹｔｈｄｆ２の機構をさらに探究するために、Ｔａｌ１ｍＲＮＡの蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）ならびにＹｔｈｄｆ２およびｍＲＮＡ分解部位のマーカーであるＤｃｐ１ａの蛍光免疫染色を実施し（Shethet al. Science, 30: 805-808, 2003; Kedersha et al. Methods in Enzymology, 431:61-81, 2007）、選別されたｗｔＨＳＰＣおよびＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるそれらの相対的な空間分布を分析した。ｗｔ細胞ではＴａｌ１ｍＲＮＡ、Ｄｃｐ１ａおよびＹｔｈｄｆ２の共局在が観察されたが、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯ対照では実質的に低減した（図３Ｈおよび３Ｉ）。さらに、ｗｔＨＳＰＣまたはＹｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣにおけるＧａｔａ２ｍＲＮＡＦＩＳＨとＹｔｈｄｆ２およびＤｃｐ１ａの共染色により、同様の観察が確認された（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスにおけるＴａｌ１などの転写因子の発現の増大が、ＨＳＣ増大の原因となるかどうかを決定するために、ｗｔＬＳＫ細胞およびＹｔｈｄｆ２ＫＯＬＳＫ細胞において低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡ媒介性Ｔａｌ１ノックダウン（ＫＤ）を使用したレスキュー実験を実施し、その後、致死的に照射を受けたレシピエントに移植した。ＨＳＰＣにおけるＴａｌ１の枯渇により、以前に報告された通りｗｔ細胞の再構成能力が有意に損なわれ、また、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯ細胞の生着の増大のレスキューもなされた（図１２Ｆ）。全体として、これらのデータから、Ｙｔｈｄｆ２が、幹細胞複製のために必須である転写因子をコードするｍＲＮＡの分解を可能することによってＨＳＣ自己複製を制御することが示される。

【0261】

（実施例Ａ−４）
ヒトＵＣＢＨＳＰＣにおけるＹｔｈｄｆ２の役割のｍ^６Ａ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑによる詳細な分析。

【0262】

単一のヒト臍帯血液単位におけるＨＳＣの数が限られていることが、ＨＳＣ移植などの臨床的適用の障害となっている（Walasek et al. Annals of the New York Academy of Sciences, 1266:138-150, 2012）。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯにより表現型および機能的マウスＨＳＣの増加がもたらされるという観察により、ＹＴＨＤＦ２ノックダウン（ＫＤ）によりヒトＵＣＢＨＳＣ増大を容易にすることができるかどうかの試験が促された。最初に、３つの個々のｈＵＣＢ試料から単離されたＣＤ３４^＋細胞を用いたｍ^６Ａ−ｓｅｑを実施した（図１３Ａ）。ｍ^６Ａ修飾は、主にｍＲＮＡに存在し（約９５％）、予測通りｍＲＮＡＯＲＦ領域、３’ＵＴＲ、および終止コドン付近に優先的に存在した（約９０％）（図４Ａおよび４Ｂ；図１３Ｂ）。マウスおよびｈＵＣＢＨＳＰＣにおけるｍ^６Ａランドスケープを比較し、２，２３９種の遺伝子が一般に、ｍ^６Ａタグを有することが見いだされた（図４Ｃ）。これらの一般にｍ^６Ａタグを有する転写物は、造血および幹細胞維持に関連する遺伝子に富化されていた（図４Ｄ）。マウスＨＳＣ自己複製に関与する転写因子のｍＲＮＡにｍ^６Ａ標識が富化されるので、次に、ＧＯ用語分析を実施することによってｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞におけるｍ^６Ａでマークされた転写因子転写物を特徴づけた。７２２種の同定されたｍ^６Ａ標識された転写因子ｍＲＮＡの中で、主要なＧＯ用語は、細胞の運命拘束および幹細胞維持に関連した（図１３Ｃ）。例えば、その過剰発現によりヒトおよびマウスＨＳＣがｅｘｖｉｖｏで増大することが報告されているＨＯＸＢ４（Amsellemet al. Nature Medicine, 9: 1423-1427, 2003； Antonchuck et al. Cell, 109: 39-45,2002）は、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞においてｍ^６Ａによりマークされた（図４Ｅ）。ＨＳＣ自己複製のために必要であり、ＨＳＣを他の細胞型から誘導するために重大である他の転写因子（Ebinaet al. The EMBO Journal, 34: 694-709, 2015； Galan-Caridad et al. Cell, 129:345-357, 2007）、例えば、Ｚｆｘ、ＲＵＮＸ１およびＦＯＳＢなども、ｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞においてｍ^６Ａタグを有した（図１３Ｆおよび１３Ｇ、ならびに、論文（その補足の表も含む）がその全体がこれによって参照により本明細書に組み込まれる、論文「Supressionof m6A reader Ythdf2 Prmotd Hematopoeitic Stem Cell Expansion」、Li et al, CellResearch 28, 904-917(2018)の補足の表Ｓ３、Genes marked by m⁶A in human UCBCD34⁺ HSPCs from individual samplesも参照されたい）。ｈＵＣＢＨＳＰＣにおけるＹＴＨＤＦ２の役割をさらに詳細に分析するために、対照またはＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞を用いてＲＮＡ−ｓｅｑを実施した（図４Ｆ；図１３Ｄおよび１３Ｅ）。驚くべきことに、ＨＯＸＢ４および他のＨＳＣ自己複製に関連する転写因子を含めた、ｍ^６Ａによりマークされた転写物では、ＹＴＨＤＦ２ＫＤ細胞において、対照と比較して、ｍ^６Ａ標識されていない遺伝子に関しては注目すべき変化を伴わずに、インプットｍＲＮＡリードの有意な増加が示された（図４Ｇ〜４Ｉ；図１３Ｆおよび１３Ｇ）。これらの結果により、ＲＮＡ分解によるｈＵＣＢＨＳＣ自己複製の制御におけるＹＴＨＤＦ２の役割が裏付けられる。

【0263】

（実施例Ａ−５）
ＹＴＨＤＦ２ＫＤによるｈＵＣＢＨＳＣの増大。

【0264】

ＹＴＨＤＦ２の抑制によりヒトＨＳＣを増大させることができるかどうかをさらに探究するために、ｈＵＣＢＨＳＰＣにおける低分子ヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡにより誘導されるＹＴＨＤＦ２ＫＤを上記の通り実施した（図４Ｆ）。７日間のｅｘｖｉｖｏにおける培養後、ＹＴＨＤＦ２のレンチウイルスによるノックダウンにより、対照細胞、特に、最も原始的なＣＦＵ−顆粒球赤血球単球巨核球（ＧＥＭＭ）コロニー型および前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）と比べて、ＣＤ３４^＋ＣＤ３８⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻ＥＰＣＲ^＋表現型ＨＳＣの頻度および絶対数のそれぞれ平均１４．３倍および１３．６倍の増加ならびにＣＦＵの５．１倍の増加がもたらされ、これは、ＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞においてＴＡＬ１などの造血のために重要な転写因子の発現レベルがより高いことを反映する（図５Ａ〜５Ｄ；図１４Ａ）。興味深いことに、ＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＨＳＰＣでは対照細胞と比較してアポトーシス率が有意に低下し、これは、Ｙｔｈｄｆ２ＫＯマウスにおけるＨＳＣの傾向と同様であった（図５Ｅ）。また、図５Ｆは、形質導入の１０日後にＹｔｈｄｆ２ノックダウン（ＫＤ）ＨＳＣが対照ＨＳＣと比較して１０倍に至るまでの増加を示したことを示す。次に、過剰発現（ＯＥ）ＹＴＨＤＦ２のＨＳＰＣ機能に対する影響を探求した。ＹＴＨＤＦ２の過剰発現により、ｈＵＣＢＨＳＰＣのクローン原性潜在性が２．２分の１に低下し、これにより、ＹＴＨＤＦ２により、ｅｘｖｉｖｏにおけるＨＳＣ維持が負に制御されることが示唆される（図１４Ｂおよび１４Ｃ）。

【0265】

ｉｎｖｉｖｏにおいてＹＴＨＤＦ２ＫＤによりヒトＨＳＣを増大させることができるかどうかを決定するために、対照およびＹＴＨＤＦ２ｓｈＲＮＡを感染させたｈＵＣＢＣＤ３４^＋細胞から選別されたＧＦＰ^＋細胞を感染の４日後に移植することによってＬＤＡを実施した（図６Ａ）。移植の１０週間後、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤＩｌ２ｒｇ^ｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス由来のＢＭ細胞をｉｎｖｉｖｏ増大後に分析し、機能的ＨＳＣ頻度を測定した。とりわけ、対照群と比較して、ＹＴＨＤＦ２ＫＤ細胞のレシピエントでは、各系列の割合の変化は伴わずに、ＢＭにおけるヒト造血細胞（ｈＣＤ４５^＋ＧＦＰ^＋）生着の９倍の増加が示された（図６Ｂおよび６ＣＨ；図１５Ａおよび１５Ｂ）。ＹＴＨＤＦ２ＫＤにより、一次レシピエントのＢＭにおける骨髄系、巨核球および赤血球のパーセンテージが有意に増加した（図１５Ｃ）。したがって、ＹＴＨＤＦ２ＫＤ細胞におけるＨＳＣ頻度が対照細胞におけるＨＳＣ頻度と比べて４．４倍増加したことが見いだされた（図６Ｄ）。ＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢ細胞の再構成され、自己複製を受ける長期にわたる能力が確認された。一次レシピエントから亜致死的に照射を受けた二次ＮＳＧレシピエントマウスへのＢＭの移植の１２週間後、ＢＭにおけるヒト造血細胞キメラ化は、ＹＴＨＤＦ２ＫＤ群において、対照群におけるものと比較して高かった（図６Ｅ、６Ｆ；図１５Ｄ）。ＹＴＨＤＦ２ＫＤ細胞のＣＲＵでは、対照細胞におけるものと比べて８倍の増加が明らかになった（図６Ｇ）。これらのデータから、ＹＴＨＤＦ２ＫＤにより、ｅｘｖｉｖｏにおける表現型および機能的ｈＵＣＢＨＳＣの両方の増大が著しく容易になることが実証される。

【0266】

（実施例Ａ−６）
本明細書の実施例では、ｍ６ＡリーダーであるＹｔｈｄｆ２のコンディショナル欠失により、系列の偏りを伴わずに表現型ＨＳＣおよび機能的ＨＳＣの増大が導かれることを実証する。ｉｎｖｉｖｏにおいて間葉系幹細胞が同時に増加するかどうかを調査するために、Ｙｔｄｈｆ２^ｆ／ｆマウスをＭｘ１−Ｃｒｅマウスと交雑させて、間葉細胞からのＹｔｈｄｆ２発現をコンディショナル欠失させた。ｐＩ：ｐｃ注射の９カ月後にＹｔｈｄｆ２^ＫＯおよびそれらの野生型同腹仔から骨髄細胞を単離した。総骨髄細胞の単一細胞懸濁物をフロー抗体で免疫染色した。造血細胞（ＣＤ４５、Ｔｅｒ１１９）および内皮細胞（ＣＤ３１）を特異的なマーカーを使用して除外した。総骨髄間質細胞内に存在する間葉系幹細胞を、Ｎ−カドヘリンおよびＣＤ１０５抗体を含めることによってさらに精製した。Ｎ−カドヘリン^＋およびＣＤ１０５^＋の両方の特色を有する間葉系幹細胞を定量化した。Ｙｔｈｄｆ２のコンディショナル欠失により、間葉系幹細胞の頻度の３．６倍の増大が導かれた（図１６）。本発明者らの試験は、Ｙｔｈｄｆ２の喪失により、ｉｎｖｉｖｏにおける骨髄間葉系幹細胞を増大させることができることを明白に実証するものである。

【0267】

考察

【0268】

最近の研究では、ｍＲＮＡｍ^６Ａ修飾の生物学的機能が探究されているが（Zheng et al. Molecular Cell, 49: 18-29, 2013； Zhou et al. Nature,526: 591-594, 2015； Alarcon et al. Cell, 162: 1299-1308, 2015； Zhang et al.Cancer Cell, 31: 591-606 e596, 2017； Lence et al. Nature, 540: 242-247, 2016；Haussmann et al. Nature, 540: 301-302, 2016； Chen et al. Cell Stem Cell, 16:289-301, 2015； Alarcon et al. Nature, 519: 482-485, 2015； Xiao et al. MolecularCell, 61: 507-519, 2016； Wojtas et al. Molecular Cell, 68: 374-387 e312, 2017；Ivanovna et al. Molecular Cell, 67: 1059-1067 e1054, 2017； Fustin et al. Cell,155: 793-806, 2013； Slobodin et al. Cell, 169: 326-337 e312, 2017； Schwartz etal. Cell, 159: 148-162, 2014； Pendleton et al. Cell, 169: 824-835 e814, 2017；Shi et al. Cell Research, 27: 315-328, 2017； Huang et al. Nature Cell Biology,20: 285-295, 2018； Bertero et al. Nature, 2018; Liu et al. Nature, 518:560-564, 2015）、本明細書の実施形態では、Ｙｔｈｄｆ２を、転写後ｍ^６Ａ修飾と自己複製のために重要な転写因子をコードするｍＲＮＡの分解をカップリングすることによるヒトおよびマウスＨＳＣ自己複製の重要な制御因子として同定する。マウスＨＳＰＣおよびｈＵＣＢＨＳＣにおけるＹｔｈｄｆ２の抑制により、自己複製のために重大な多数の重要なＴＦの発現の増大を導き、それにより、注目すべき系列の偏りおよび白血病の潜在性を伴わずに、表現型ＨＳＣおよび機能的ＨＳＣの両方のｅｘｖｉｖｏにおける増大を容易にすることができる。さらに、間葉系間質細胞においてＭｘ１−ｃｒｅが活性化され得るので、幹細胞ニッチがＹｔｈｄｆ２抑制媒介性マウスＨＳＣ増大にいくらかの程度まで寄与し得る。Ｙｔｈｄｆ２の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に対する機能、ならびに、ｉｎｖｉｖｏにおいてＨＳＣおよびＭＳＣの両方におけるＹｔｈｄｆ２の抑制によりどのようにＨＳＣを相乗的に増大させることができるかを試験することが興味深いものになる。

【0269】

ｍ^６Ａライター複合体Ｍｅｔｔｌ３およびＭｅｔｔｌ１４のｍＲＮＡスプライシング、翻訳、およびｐｒｉ−ｍｉＲＮＡプロセシングに対する広範かつ複雑な影響を考慮すると（Barbieri et al. Nature,, 2017; Alarcon et al. Nature, 519: 482-485,2015； Liu et al. Nature, 518: 560-564, 2015）、Ｍｅｔｔｌ３またはＭｅｔｔｌ１４枯渇の結果、正常な幹細胞および白血病において別個の転帰がもたらされる。最近の研究により、Ｍｅｔｔｌ３およびＭｅｔｔｌ１４が白血病発症および白血病幹細胞維持において重要な役割を果たすことが実証された（Vuet al. Nature Medicine, 2017; Barbieri et al. Nature, 2017; Weng et al. CellStem Cell, 22: 191-205 e199, 2018）。対照的に、Ｙｔｈｄｆ２はｍ^６Ａ媒介性ｍＲＮＡ分解に主に関与すると考えられている（Batistaet al. Cell Stem Cell, 15: 707-719, 2014； Yoon et al. Cell, 2017; Zhang et al.Nature, 549: 273-276, 2017； Wang et al. Nature, 505: 117-120, 2014）。本明細書のある特定の実施形態によると、Ｙｔｈｄｆ２を操作することにより、ｍＲＮＡプロセシングの他の側面に影響を及ぼすことなく、幹細胞の自己複製のために重大なＴＦをコードする特定のｍ^６ＡでマークされたｍＲＮＡの半減期を延長することができると考えられる。本明細書の実施例は、ＨＳＣのＹｔｈｄｆ２枯渇は系列拘束を歪めることも血液悪性疾患を誘導することもなく、それにより、ＨＳＣの増大に伴う白血病誘発のリスクが低減することを示すものである。さらに、幹細胞の自己複製は、細胞分裂、生存、分化の防止および幹細胞性の保持で構成される複雑なプロセスである。Ｙｔｈｄｆ２欠損ＨＳＣが低いアポトーシス率を示したという知見から、本明細書の方法の実施形態は、幹細胞の自己複製の別の特徴の利益にもなることが示される。

【0270】

ｈＵＣＢＨＳＣ移植の使用に関する主要な限定は、１つのｈＵＣＢ単位中のＨＳＣの数が不十分なことである。とはいえ、以前の研究により、Ｄｌｋ１、ＳＲ１、Ｍｕｓａｓｈｉ２およびＵＭ１７１により、ノッチ、ＡＨＲシグナル伝達または他の未知の経路を標的とすることによってｈＵＣＢＨＳＣを増大させることができることが明らかになっている（Boitano et al. Science, 329: 1345-1348, 2010； Fares et al. Science,345: 1509-1512, 2014； Rentas et al. Nature, 532: 508-511, 2016； Chou et al.Experimental HematologyI, 41: 479-490 e474, 2013）。したがって、本明細書の実施形態は、ＨＳＣ自己複製のために重大な多数の重要なＴＦを標的とするため、およびＨＳＣの増大を増強するための新規かつ強力なやり方を提供する。例えば、ｉｎｖｉｔｒｏでの培養中に低分子化学物質またはＡＡＶ媒介性ＫＤによってＹｔｈｄｆ２のレベルおよび機能を低下させることにより、ｉｎｖｉｖｏでの移植後にＹｔｈｄｆ２のレベルおよび機能を回復させることを可能にし、したがって、ヒト患者における正常なＨＳＣ維持および機能に影響を及ぼさないようにすることができる。さらに、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を他の方法と組み合わせて、ヒトＨＳＣだけでなく他の幹細胞の増大も容易にし、それにより、幹細胞に基づく治療のためのアプローチをもたらすことができる。

【0271】

（実施例Ｂ）
以下の実施例「Ｂ」では以下のプロトコールを使用した。

【0272】

動物。Ｃ５７ＢＬ／６−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ＨＢＥＧＦ）Ａｗａｉ／Ｊ（ｉＤＴＲ）、Ｂ６．Ｃｇ−Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ）Ｈｚｅ／Ｊ（Ｒ２６ＲｔｄＴ）、Ｔｇ（Ｃｓｐｇ４−ＤｓＲｅｄ．Ｔ１）１Ａｋｉｋ／Ｊ、Ｃｘｃｌ１２ｔｍ２．１Ｓｊｍ／Ｊ、Ｋｉｔｌｔｍ２．１Ｓｊｍ／Ｊ（ＳＣＦ^ｆ／ｆ）、Ｃｘｃｌ１２ｔｍ１．１Ｓｊｍ／Ｊ（ＣＸＣＬ１２^ｆ／ｆ）マウスをＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔマウス、およびＮ−ｃａｄ−ＴｄＴマウスはＡｐｐｌｉｅｄＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｉｎｃにより生成された。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスを誘導するために、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）を注射１回当たり２ｍｇで３日間、腹腔内に注射した。胚期のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴを誘導するために、１．５ｍｇの単回用量のＴＭＸをＥ１２．５の妊娠中の雌に腹腔内に注射した（ＩＰ）。Ｅ１９．５時点で帝王切開を実施し、新生仔マウスを里親マウスに渡した。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスにおいてＮ−Ｃａｄ^＋細胞除去を誘導するために、ＤＴ（Ｓｉｇｍａ）を２日に１回、示されている通り体重１ｇ当たり５０ｎｇの用量で腹腔内に注射した。５ＦＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を体重１ｇ当たり１５０μｇで尾静脈に１回注射した。５ＦＵ注射後、マウスをテキストに記載されている通り分析した。本試験に使用したマウス系統は全てＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景を有するものであった。動物を遺伝子型決定の結果に従って実験にランダムに含めた。動物実験は研究者に対して盲検式で行った。実験ごとに使用した動物の数は図の説明文に示されている。本試験に使用したマウスは全て、ＳｔｏｗｅｒｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ（ＳＩＭＲ）の動物施設内に収容し、ＳＩＭＲおよびＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ガイドラインに従って取り扱った。手順は全てＳＩＭＲのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたものであった。

【0273】

フローサイトメトリー。表現型分析のために、造血細胞を骨髄（大腿骨および脛骨）から採取した。０．１６Ｍの塩化アンモニウム溶液を使用して赤血球を溶解させた。細胞表面表現型決定のために、抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、抗ＣＤ８（５３−６．７）、抗Ｍａｃ−１（Ｍ１／７０）、抗Ｇｒ１（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、抗ＩｇＭ（ＩＩ／４１）および抗ＴＥＲ１１９（ＴＥＲ−１１９）を含む系列カクテル（Ｌｉｎ、フィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ５）を使用した（骨髄細胞１００万個当たり抗体カクテル１００ｎｇ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。示されている場合には、ＳＣＡ１に対するモノクローナル抗体（Ｄ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ｃ−ＫＩＴに対するモノクローナル抗体（２Ｂ８、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＬＫ２に対するモノクローナル抗体（Ａ２Ｆ１０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体（ＲＡＭ３４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４８に対するモノクローナル抗体（ＨＭ４８−１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１５０に対するモノクローナル抗体（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ４９ｂに対するモノクローナル抗体（ＨＭα２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（全て骨髄細胞１００万個当たり５０ｎｇで使用する）も使用した。末梢血の系列分析のために、ＣＤ４５．１に対するモノクローナル抗体（Ａ２０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５．２に対するモノクローナル抗体（１０４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３に対するモノクローナル抗体、Ｂ２２０に対するモノクローナル抗体、Ｍａｃ−１に対するモノクローナル抗体およびＧｒ１に対するモノクローナル抗体を使用した。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（Ａ１３１０、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して死細胞を排除した。間質ニッチ細胞分析のために、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（３９０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＤＧＦＲα−ビオチン（ＡＰＢ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＬｅｐＲ−Ｂｉｏ（Ｒ＆Ｄ）、ＣＤ５１（クローンＲＭ７−Ｖ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。ビオチンとコンジュゲートした抗体で染色した試料を染色用培地で洗浄し、次いで、ストレプトアビジンｂｒｉｌｌｉａｎｔｖｉｏｌｅｔ４２１（商標）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１：５００）と一緒にインキュベートした。ＭｏＦｌｏ（Ｄａｋｏ）、ＩｎＦｌｕｘＣｅｌｌＳｏｒｔｅｒ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）またはＣｙＡｎＡＤＰ（Ｄａｋｏ）機器を使用して細胞選別および分析を実施した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータ分析を実施した。

【0274】

ホールマウント胸骨ＨＳＣ免疫染色。胸骨を採取し、メスを用いて３〜４つの断片に切断した。断片を矢状に二分して骨髄腔を露出させ、４％ＰＦＡ中に固定した。２０％正常ヤギ血清および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有するＰＢＳ中でブロッキング／透過処理し、一次抗体を用いて３日にわたって染色した。組織を、二次抗体と一緒に２時間インキュベートした（Bruns et al., 2014; Kunisaki et al., 2013）。スピニング−ディスク共焦点システム（ＣＳＵ−Ｘ１；ＹｏｋｏｇａｗａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａ）およびＶｏｌｏｃｉｔｙ撮像ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を伴うＯｒｃａ−Ｒ２カメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）および２０×／０．８Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）が取り付けられた倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ；ＣａｒｌＺｅｉｓｓＭｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むスピニング−ディスク共焦点顕微鏡（ＵｌｔｒａＶＩＥＷ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で蛍光イメージングを実施した。画像をステップサイズが４μｍの一連の光学切片として収集した。画像を、試料全体を網羅するために十分なタイルパターン（重複１０％）で収集した。チャネルを逐次的に収集した。４０５ｎｍの光（５０ｍＷのダイオードレーザー、ＯＥＭ）を使用して（青色色素）を励起させ、５６１ｎｍの光（５０ｍＷの固体レーザー、ＯＥＭ）を使用して（赤色色素）を励起させ、それぞれを、４１５ｎｍ〜７７５ｎｍ、５８０ｎｍ〜６５０ｎｍのバンドを有するマルチバンドパスエミッションフィルターを使用して収集した。４８８ｎｍの光（５０ｍＷの固体レーザー、ＯＥＭ）を使用して（緑色色素）を励起させ、５００ｎｍ〜５５０ｎｍのマルチバンドパスエミッションフィルターを使用して収集し、６４０ｎｍの光（５０ｍＷの固体レーザー、ＯＥＭ）を使用して（遠赤色色素）を励起させ、４５５ｎｍ〜５１５ｎｍおよび６６０ｎｍ〜７５０ｎｍを有するマルチバンドパスエミッションフィルターを使用して収集した。曝露時間およびレーザーパワーを調整して、染色の変動を補正した。

【0275】

第二次高調波発生（ＳＨＧ）イメージングを蛍光イメージングの直後に実施した。ＱＵＡＳＡＲ検出ユニット、１０×０．４５Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ対物レンズ（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）、およびＺｅｎ２０１２撮像ソフトウェア（ｖ８．１．３、ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を備えたＬＳＭ−７８０レーザー走査共焦点顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）でＳＨＧ画像を収集した。画像を、ステップサイズが８μｍであり、画素サイズが蛍光画素サイズの４倍である整数の倍数（１．３２μｍ／画素）である一連の光学切片として収集した。ＳＨＧ画像をレーザー光波長９００ｎｍで取得し、３７１〜４２０ｎｍで収集した。画像アラインメントのための参照として、Ｃｄ１５０−ＰＥの画像を、５６１ｎｍラインのＤＰＳＳレーザー（ＭｅｌｌｅｓＧｒｉｏｔ）を使用して取得し、５６６〜７３５ｎｍでＳＨＧ画像と同時に収集した。画像を、試料全体を網羅するために十分なタイルパターン（重複なし）で収集した。Ｚｅｎソフトウェアを使用してタイルを完全な３Ｄ画像にまとめた。

【0276】

画像を、Ｆｉｊｉソフトウェア（１．５１ｇＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）を使用して分析した。ＳＨＧと蛍光画像をアラインメントするために、まず、蛍光画像のバックグラウンドを差し引き、Ｇｒｉｄ／Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓｔｉｔｃｈｉｎｇｐｌｕｇｉｎ（参照http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/25/11/1463.abstract）を使用して画像タイルを完全な３Ｄ画像にまとめた。蛍光顕微鏡からＳＨＧ顕微鏡への試料の移行には少量の試料の回転が伴うことを考慮して、ＳＨＧと蛍光画像を３次元で再アラインメントする必要があった。ＳＨＧと蛍光画像セットのアラインメントは、http://research.stowers.org/imagejpluginsにおいて入手可能な特注プラグインを使用して行った。まず、ＳＨＧおよび蛍光データセットの両方を目視検査することによって最低８つの共通のランドマークを同定した。次に、Ｋａｂｓｃｈアルゴリズムを使用して、蛍光座標をＳＨＧ画像座標に変換するために最もよくスケーリングされた回転を見いだした。最後に、蛍光画像の各３Ｄボクセルを対応するＳＨＧ位置に変換し、３つの線の内挿を使用してその位置のＳＨＧ強度を見いだして、再アラインメントされた複合画像を創出した。

【0277】

試験の仮説をよく知らない研究者によって画像分析を行った。ＨＳＣを眼で同定した。細胞の形状が眼で見分けられない場合、または細胞の形状が陽性シグナルの視野内で暗い領域を形成した場合、細胞を染色に関して陰性とみなした。ニッチ構成成分までの距離測定をＦｉｊｉソフトウェアおよびＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ（登録商標）ソフトウェアを使用して行った。ＨＳＣの場所および３つのニッチ構成成分のそれぞれの最も近い点にＦｉｊｉで点ＲＯＩを使用して印をつけ、場所をエクセルに移し、次いで、３ＤＰｙｔｈａｇｏｒｅａｎＴｈｅｏｒｅｍを使用して３Ｄでの距離を算出した。ランダムに分布したＨＳＣの距離を算出するために、観察されたＨＳＣについて分析したものと同じ画像に関してＦＩＪＩで特注プラグインを使用してランダムな点ＲＯＩを生成した。ランダムに生成した点が妥当なＨＳＣの場所に出現した場合（周囲領域内のＬｉｎ＋細胞の存在によって評価して）、それらをシミュレートされたＨＳＣとみなした。次いで、シミュレートされたＨＳＣについてのニッチ距離測定を観察されたＨＳＣについてと同じ様式で行った。

【0278】

距離の分布の差異の統計的有意性を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用してＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ分析によって評価した。５μｍでのＨＳＣのパーセンテージの変化の統計的有意性を、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ（登録商標）でスチューデントのＴ検定を使用して評価した。Ｐ＜０．０５の場合に変化を有意とみなした。

【0279】

図に示されている最終的な画像は、明確にするためにバックグラウンドを差し引き、コントラスト調整した最大の投影である。

【0280】

移植および再配置アッセイ。選別されたｐＨＳＣまたはｒＨＳＣ細胞１００個をＣＤ４５．１レスキュー骨髄細胞１．０×１０^５個と共に、致死的に照射を受けた（１０Ｇｙ）ＣＤ４５．１レシピエントに移植した。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲおよび対照マウス由来のＣＤ４５．２ＢＭ細胞２．０×１０^５個をＣＤ４５．１レスキュー骨髄細胞２．０×１０^５個と共に、致死的に照射を受けた（１０Ｇｙ）ＣＤ４５．１レシピエントに移植した。移植後４週間ごとに、末梢血を顎下静脈から採取した。ドナー由来の血液細胞（ＣＤ４５．２）からの造血再配置を測定した。

【0281】

ＲＮＡ配列決定および分析。ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒＵｌｔｒａＬｏｗＩｎｐｕｔＲＮＡｋｉｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を使用して精製された細胞１０００個から生成し、ライブラリーをＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって生成し、その後、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２５００で５０ｂｐの単一のリードについて配列決定を行った。未加工のリードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２ｖ２．１８を使用し、最大で１つのミスマッチを許容してＦａｓｔｑフォーマットに逆多重化した。リードを、ＴｏｐＨａｔｖ２．０．１３でデフォルトパラメーターを用いてＵＣＳＣゲノムｍｍ１０に対してアラインメントした。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓｖ２．２．１を「−ｕ −ｍａｘ−ｂｕｎｄｌｅ−ｆｒａｇｓ１００００００００」で使用してＦＰＫＭ値を生成した。ＨＴＳｅｑ−カウントを「−ｍｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ−ｎｏｎｅｍｐｔｙ」で使用してリードカウントを生成した。各集団について３つまたは４つの反復物で配列決定した。データはＮＣＢＩＧＥＯ：ＧＳＥ１０４８８７で入手可能である。

【0282】

ＣＦＵ−Ｆアッセイおよびｉｎｖｉｔｒｏにおける分化。細胞を９６ウェルプレートの培養物中に直接選別した。培養物を３７℃、加湿雰囲気中、５％Ｏ_２および１０％ＣＯ_２で７〜１０日間インキュベートした。コロニーをＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）ＧｒｅｅｎＣＭＦＤＡ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって染色し、ＣｅｌｉｇｏＩｍａｇｉｎｇＣｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）によって画像を取得した。ｉｎｖｉｔｒｏにおける分化のために、クローン的に増大したＮｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ駆動Ｔｏｍａｔｏ^＋ＢＭ／骨間質細胞をＣＦＵ−Ｆ培養物から０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いた消化によって単離し、３つのアリコートに分割し、分化が許容される別々の培養物に播種した：ＳｔｅｍＰｒｏＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔＧｉｂｃｏＡ１００７２−０１、ＡｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔＡ１００７０−０１およびＣｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｋｉｔＡ１００７１−０１。骨芽細胞分化をＶＥＣＴＯＲＲｅｄＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅによって評価し、脂肪生成分化をＯｉｌＲｅｄＯ（Ｓｉｇｍａ）によって検出し、軟骨形成分化をＴｏｌｕｉｄｉｎｅｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ、蒸留水１００ｍＬ当たり０．１ｇのＴＢｌｕｅ）によって検出した。

【0283】

骨切片作製、免疫染色およびイメージング。

【0284】

新鮮に単離した大腿骨を４％パラホルムアルデヒド中に終夜固定し、その後、１０％ＥＤＴＡ中で１〜３日間脱灰処理した。パラフィン切片のために、骨試料をＳａｋｕｒａＴｉｓｓｕｅＴｅｋＶＩＰ５ＴｉｓｓｕｅＰｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＳａｋｕｒａＡｍｅｒｉｃａ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で処理し、パラフィン切片を５μｍの厚さにカットした。切片をキシレンで脱パラフィンし、その後、アルシアンブルー／ヘマトキシリン／オレンジＧ染色を行った。凍結切片に対して、骨試料をＣｒｙｏＪａｎｅｔａｐｅ−ｔｒａｎｓｆｅｒｓｙｓｔｅｍを用いて処理した。切片をＰｏｗｅｒＢｌｏｃｋ（商標）ＵｎｉｖｅｒｓａｌＢｌｏｃｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔを用いて３０分〜１時間ブロッキングし、次いで、ウサギ−抗アグリカン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：３００）、ウサギ−抗ペリリピン（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、１：３００）およびヤギ−抗オステオポンチン（Ｒ＆Ｄ、１：３００）を用いて終夜染色した。ロバ抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびロバ抗ヤギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を二次抗体として使用した（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから、１：３００）。抗体をＡｎｔｉｂｏｄｙＤｉｌｕｅｎｔＳｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ００−３２１８）で希釈した。スライドにＦＬＵＯＲＯ−ＧＥＬ（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅ１７９８５１０）を用いて載置し、Ｏｌｙｍｐｕｓスライドスキャナーで画像を取得した。

【0285】

大腿溝外科手術。マウスを２．５％イソフルランで麻酔し、痛覚脱失のためにブプレノルフィンを投与した。右足の皮膚を剃毛し、アルコールおよびヨウ素でこすり洗いした。膝関節の側方に、皮膚に小さな切開を入れた。可視化のために皮膚を内側にスライドさせた後、膝蓋骨の内側に内部切開を入れ、四頭筋まで伸ばし、膝蓋腱に沿って、組織をはずした。膝蓋骨を外側に亜脱臼させ、遠位大腿骨を露出させた。マイクロソーを使用して肋軟骨下骨に穴をあけて膝関節で関節軟骨を貫通させた。伸筋機構（四頭筋、膝蓋腱および膝蓋骨）を元の解剖学的位置に戻した。内部切開を吸収性縫合糸で縫合し、皮膚を非吸収性縫合糸で縫合した。

【0286】

統計値。

【0287】

値は平均±ｓ．ｅ．ｍ．として示されている。統計分析は全て、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）を使用して行った。２群間の比較のためにスチューデントのｔ検定を使用した。統計的有意性をｐ＜０．０５と定義した。

【0288】

（実施例Ｂ−１）
マウス骨髄における機能的に区別される予備ＨＳＣおよび刺激されたＨＳＣ。予備ＨＳＣ（以降ｒＨＳＣ）亜集団を探究するために、恒久的に長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）と中期を区別することができる細胞表面マーカーであるＣＤ４９ｂ（インテグリンα２）を適合させた（Benveniste et al., 2010; Qian et al., 2015; Wagers and Weissman,2005; Yang et al., 2005）。興味深いことに、従来のＬＴ−ＨＳＣ（ＣＤ３４⁻Ｆｌｋ２⁻系列⁻Ｓｃａ−１^＋ｃ−Ｋｉｔ^＋（ＬＳＫ）細胞）にのみ存在し、短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ；ＣＤ３４^＋ＦＬＫ２⁻ＬＳＫ）または多分化能前駆細胞（ＭＰＰ；ＣＤ３４^＋ＦＬＫ２^＋ＬＳＫ）には存在しないＣＤ４８⁻ＣＤ４９ｂ⁻亜集団が見いだされた。ＣＤ４８⁻ＣＤ４９ｂ⁻ＬＴ−ＨＳＣ亜集団ではｒＨＳＣが富化されること、およびＣＤ４８⁻ＣＤ４９ｂ^＋ＬＴ−ＨＳＣ亜集団では刺激されたＨＳＣ（以降ｐＨＳＣ）が富化されること（図１７Ａ）が提唱され、再配置アッセイを用いて試験した。ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣのどちらも致死的に照射を受けたマウスにおいて最大で移植後４０週間にわたって造血を支持し、有意差はないことが見いだされ（図１７Ｂ）、これは以前の報告（Benvenisteet al., 2010）と一致した。しかし、移植されたｐＨＳＣは、レシピエントにおけるｒＨＳＣ（９５．４％の低下）ならびにＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰ（どちらの集団についても約７８％の低下）の生成に関して、移植されたｒＨＳＣと比較して非常に低い効率を有し、これにより、ｒＨＳＣがｐＨＳＣよりも階層的に前であることが示唆される（図１７Ｃ）。Ｓｃｌ−ｔＴＡにより誘導されるＨ２Ｂ−ＧＦＰ標識を保持するモデルを使用し、ｒＨＳＣでは、ｐＨＳＣと比較して有意により多くのＨ２Ｂ−ＧＦＰ^ｈｉｇｈ細胞が富化された（Ｐ＝０．００３９）ことが見いだされ、これにより、ｒＨＳＣがｐＨＳＣと比較して遅い細胞周期を有することが示される（図１７Ｄ）。分子的に、ｒＨＳＣでは、全てＨＳＣのＧ_０期の維持に関与するＧａｄｄ４５ｇ、Ｃｄｋｎ１ｃ（ｐ５７をコードする）、およびＦｏｘｏ１の発現が高く、Ｍｙｃ、Ｐｃｎａ、Ｃｃｎｇ２、およびＣｄｋ４などの細胞周期活性化因子の発現が低いことが見いだされた。Ｋｉ６７発現にはｒＨＳＣとｐＨＳＣの間で差異はなく、これにより、２つのＨＳＣ亜集団を区別するためにはＫｉ６７発現単独では不十分であることが示される（図１７Ｅ）。

【0289】

ｒＨＳＣの機能的な定義は薬物抵抗性であるので、ｒＨＳＣまたはｐＨＳＣをレシピエントマウスに移植し、移植の４週間後にマウスを５ＦＵで攻撃した。図１７Ｆに示されている通り、ｒＨＳＣは５ＦＵ処置に対して非感受性であったが、ｐＨＳＣはそれらの再構成能力が劇的に低下した（移植の２０週間後に４４％の低下）。総合すると、データから、ＣＤ４８⁻ＣＤ４９ｂ⁻ＬＴ−ＨＳＣでは化学療法処置に対して抵抗性のｒＨＳＣが実際に富化されるが、ＣＤ４８⁻ＣＤ４９ｂ^＋ＬＴ−ＨＳＣでは化学療法に対して感受性のｐＨＳＣが富化され、さらに、移植アッセイにおいて前者からは後者が生じるが、後者から前者は生じないことが示された。

【0290】

ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣに対する急性５ＦＵ攻撃の直接の結果をさらに分析した。図１７Ｇに示されている通り、５ＦＵの３日後に、ｐＨＳＣのおよそ９２％が排除され、ｒＨＳＣのみが残存し、これにより、ｒＨＳＣのＤＮＡ修復系が化学療法ストレスを克服するために特異的に作動したに違いないことが示唆される。この仮説を検定するために、ｒＨＳＣ、ｐＨＳＣおよび５ＦＵ処置後のｒＨＳＣにおけるＤＮＡ損傷応答遺伝子のトランスクリプトームプロファイリングを分析した。恒常性の間、ｒＨＳＣではｐＨＳＣと比較してＤＮＡ損傷修復系に関与する遺伝子の発現が低く維持されるが（図１７Ｈ）、５ＦＵ攻撃下では、ｒＨＳＣにおいてＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）、ヌクレオチド除去修復（ＮＥＲ）、塩基除去修復（ＢＥＲ）、および相同組換え（ＨＲ）などの大半のＤＮＡ修復経路が有意に活性化される（図１７Ｉ）ことが観察された。さらに、並行して、主にＨｓｐ９０ファミリーおよびＨｓｐ７０ファミリーに属する多数のストレス応答遺伝子（Rodina et al., 2016）も上方制御され（それぞれ１．８±０．１７倍および１．４±０．１倍）（図１７Ｊ）、これにより、化学療法ストレス下でｒＨＳＣがどのように残存し、造血系を再構成させるかが部分的に説明される。

【0291】

総合すると、ｐＨＳＣとｒＨＳＣの共存がＢＭにおいて機能的に実証された。それらの静止した状態および活性なＤＮＡ修復経路を用いた場合であっても、ｐＨＳＣはなお化学療法に対して感受性であったが、ｒＨＳＣではＤＮＡ損傷修復およびストレス応答遺伝子が活性化されて、化学療法ストレスを生き抜き、ｐＨＳＣを生じさせた。したがって、ｒＨＳＣは、重度のストレス下での造血再生の支持において重大な役割を果たす。

【0292】

（実施例Ｂ−２）
薬物抵抗性ｒＨＳＣは主に骨髄の骨内膜領域に局在する

【0293】

ＢＭニッチ由来の外因性機構が止血中および化学療法ストレス下のｒＨＳＣ維持に寄与するかどうかをさらに試験した。この目的のために、ホールマウントＨＳＣ染色を実施し、これにより、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣの骨（第二次高調波発生、ＳＨＧによって達成した）、巨核球（ＭＫ）または約７５μｍ以内の厚さの骨腔内の血管への相対的な分布も同時に検出した（図１８Ａ〜Ｂ）。本発明者らの定量化データから、４３．４％のｒＨＳＣおよび３１．０％のｐＨＳＣが血管から１０μｍ以内の距離に位置すること、ならびに２２．６％のｒＨＳＣおよび２４．６％のｐＨＳＣがＭＫから１０μｍ以内に位置することが示され（図１８Ｃ〜Ｄ）、これは、バルクのＨＳＣ集団が血管周囲および類洞帯域に存在するという以前の報告と一致する（Acar et al., 2015; Bruns et al., 2014; Chen et al., 2016; Zhao et al.,2014）。興味深いことに、１６．４％のｒＨＳＣが骨表面から１０μｍ以内に位置し、これと比較してｐＨＳＣは３．６９％しか骨表面から１０μｍ以内に位置しないことが認められた（図２Ｅ）。これらのデータから、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣは血管およびＭＫにはどちらも偏りなく分布するが、ｒＨＳＣはｐＨＳＣと比較して骨内膜骨表面に有意に近く位置することが示された（Ｐ＝０．００１８２）。

【0294】

化学療法ストレスの間にｒＨＳＣが骨内膜領域に保存されるかどうかを試験するために、ｐＨＳＣが排除された５ＦＵ処置後３日目にｒＨＳＣの分布を試験した（図１８Ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、急性５ＦＵストレスの際に、生存しているｒＨＳＣの約５５％が骨内膜ニッチに保存されることを見いだし、これは、恒常性と比較して約３．５倍の富化である（図１８Ｅ）。しかし、血管またはＭＫの付近で観察された生存しているｒＨＳＣの頻度に有意差はなかった（図１８Ｃ〜Ｄ）。一貫して、図１７Ｇに示されている通り、ｐＨＳＣは４．２４％しか急性５ＦＵストレスを生き残れなかったことが観察された。次に、５ＦＵストレス後のＢＭ損傷およびその後の回復の動的プロセスを、ＢｒｄＵ標識された生存している増殖細胞を調査することによって試験した。５ＦＵ処置後２日目に、ＢｒｄＵ標識された細胞の大きな減少が認められ、これにより、活性なアポトーシスが５ＦＵによって誘導されたことが示される。５ＦＵ処置後３日目に、生存しているＢｒｄＵ^＋細胞（大部分が単一細胞）が主に骨内膜領域内の骨内層細胞に近接して検出されることが観察された（図２４Ａ〜Ｄ）。３．５日目に、ＢｒｄＵ^＋細胞の対が骨内膜表面に出現したことが観察され、これにより、生存している細胞の活性化および分裂が示される。４日目および５日目に始まり、継続して、増殖している細胞の数が徐々に増加し、これらの細胞は、非常に多くの場合、血管または潜在的な脂肪細胞構造の付近のクラスターとして検出された（４日目に約５５％および６日目に約６５％）（図２４Ｅ〜Ｉ）。この観察により、骨表面が、細胞が５ＦＵ後に最初に残存するニッチであることが示唆された。次いで、これらの細胞が活性化され、娘細胞を生じ、後者が主に血管内または巨核球に近接して増大を受けた（Zhao et al., 2014）。生存している５ＦＵ−ｒＨＳＣが多くの場合に骨表面に近接する単一細胞として実際に検出され、増殖しているＨＳＣが多くの場合にＭＫまたは血管の近くに関連付けられることがさらに確認された。５ＦＵ処置後３日目に生存しているｒＨＳＣ（緑色、ＣＤ１５０＋Ｌｉｎ−ＣＤ４９ｂ−）は、多くの場合、骨表面に近接する単一細胞として検出され（白色、ＳＨＧ）、増殖しているＨＳＣは、多くの場合、ＭＫ（ＣＤ１５０＋Ｌｉｎ＋）または血管の近く（赤色、ＣＤ３１＋）に関連付けられた（図２９）。

【0295】

５ＦＵ処置に対して骨表面のＮ−ｃａｄ^＋前骨芽細胞は抵抗性であることが見いだされているが、Ｏｓｘ^＋骨芽細胞は、感受性であることが見いだされており、また、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞は、５ＦＵ処置後の回復中にＯｓｘ^＋骨芽細胞を生じさせることが見いだされている（Sugimura et al., 2012）。最近の研究により、照射１日後の細胞死に起因する、中心骨髄におけるＬｅｐＲ^＋間質細胞の劇的な枯渇が示された（Zhouet al., 2017）。血管および骨内膜ニッチにおける初期の変化を追跡するために、５ＦＵ処置後１日目にアポトーシスアッセイを実施した。アポトーシス性ＣＤ３１^＋ＶＥ−カドヘリン^＋細胞が５ＦＵの１日後に著しく増加することが見いだされ（図１８Ｆ）、これは５ＦＵ後に血管構造が妨害されるという以前の報告と一致する（Dominiciet al., 2009; Sugimura et al., 2012）。骨内膜ニッチを試験するために、Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞で中心骨髄および骨表面の両方におけるＮ−ｃａｄ発現が報告されるＮ−ｃａｄ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｎ−ｃａｄ−ＴｄＴ）マウス系を樹立した（図２４Ｊ）。中心骨髄ではアポトーシス性Ｎ−Ｃａｄ駆動性Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞の顕著な増加が認められたが、骨内膜帯域内のＴｏｍａｔｏ^＋細胞は５ＦＵの１日後に安定なままであった（図１８Ｇ）。造血再生が始まった５ＦＵ処置後３日目に、中心骨髄ならびに骨表面におけるＮ−Ｃａｄ駆動性Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞がそれぞれ２．２倍および１．７倍増加した（図１８Ｈ、図２４Ｋ）。ＣＤ３１^＋血管細胞の数も増加したが、膨張し、損傷を受けたアーキテクチャを示した（図１８Ｉ）。総合すると、以前の報告およびこのデータから、血管およびＬｅｐＲ^＋およびＮ−ｃａｄ^＋細胞を含めた血管周囲ニッチ内の関連する間質細胞は即時の損傷を受け、５ＦＵストレスに対して感受性であるが、Ｎ−ｃａｄ^＋骨内膜間質細胞は安定なままであることが示された。

【0296】

このデータにより、大多数のＨＳＣが主に血管周囲および類洞帯域に分布しているという以前の所見が部分的に説明される（Acar et al., 2015; Chen et al., 2016; Kunisaki et al., 2013）。静止状態のＨＳＣ集団の５１．３％を占めるｐＨＳＣが恒常性の中では血管周囲および類洞帯域の近くにある。しかし、ストレス下では、ｒＨＳＣは骨表面のより近くに存在し化学療法ストレスから残存する。集合的に、データから、骨内膜ニッチが化学療法からのｒＨＳＣの保護において重大な役割を果たすことが示される。

【0297】

（実施例Ｂ−３）
Ｎ−Ｃａｄ^＋ニッチ細胞により骨髄におけるｒＨＳＣを含めた機能的ＨＳＣが維持される

【0298】

Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞は最初に同定されたＨＳＣニッチ細胞であり、また、化学療法に対して骨内膜ニッチにおけるＮ−ｃａｄ^＋間質細胞は抵抗性であった一方Ｏｓｘ^＋骨芽細胞は感受性であったが、ＨＳＣを機能的に支持するＮ−ｃａｄ^＋に関する直接のエビデンスは妥当な遺伝学的マウス系の欠如に起因して依然として見つかっていない。本明細書の態様に従って、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ系を生成し（図２５Ａ）、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞からＣｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞および血管周囲細胞の両方が生じることが示された（図２５Ｂ）。以前の試験から、成熟Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞の枯渇がＢＭ細胞の全体的な生着には影響を及ぼさないが（Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013）、ＬＴ−ＨＳＣのサブセットの再生能の障害のみを引き起こす（Bowerset al., 2015）ことが示された。Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞はＯｓｘ^＋骨前駆細胞に発生的に進行し、これはさらに成熟Ｃｏｌ２．３^＋骨芽細胞を生じさせるが、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞によるＨＳＣ維持に対する機能的寄与は分かっていない。Ｎ−ｃａｄ^＋細胞のＨＳＣニッチ役割を調査するために、Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞がジフテリア毒素（ＤＴ）に対して感受性になっているＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ誘導性ＤＴＲ（ジフテリア毒素受容体をコードする）系（Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲ）を生成した。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲマウスに３回のタモキシフェン（ＴＭＸ）注射を投与し、その後、ＤＴを腹腔内注射し（１日おきに１回の注射）、最後の注射後１日目に分析した（図１９Ａ）。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；ｉＤＴＲ；Ｒ２６−ｔｄＴでは、同時にＤＴで処置されたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスと比較してＮ−ｃａｄ^＋間質細胞の効率的な除去が観察された（図１９Ｂ）。ｉｎｖｉｖｏにおいてＮ−ｃａｄ^＋細胞除去がＨＳＣに影響を及ぼすかどうかをさらに調査した。Ｎ−ｃａｄ^＋細胞の除去後、対照と比較してＢＭにおける細胞充実性の有意な変化は観察されなかった（図１９Ｃ）。しかし、ＨＳＣの数が劇的に減少した：ｒＨＳＣ（６５．０％の低下）、ｐＨＳＣ（６０．０％の低下）、ＳＴ−ＨＳＣ（５９．６％の低下）、およびＭＰＰ（２９．３％の低下）（図１９Ｄ）。これにより、Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞が、予備ＨＳＣを含めた最も原始的なＨＳＣ維持に寄与することが示された。

【0299】

Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞が除去されたマウスにおける機能的ＨＳＣ数を試験するために移植アッセイも実施した。Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞が除去されたマウス由来の骨髄細胞では有意に低いレベルのドナー細胞再構成がもたらされ（２０週間の時点で２８．３％の低下）（図１９Ｅ）、骨髄性細胞産生が低減する（２４．５％から１７．１％へ）（図１９Ｆ）ことが見いだされた。Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞がＨＳＣの長期自己複製の維持に寄与するかどうかをさらに調査するために、一次移植の２０週間後に二次移植を行った。Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞が除去されたマウス由来のＢＭ細胞は二次移植でドナー細胞再構成能力がより大きく低下したが（１６週間の時点で４０．５％の低下）（図１９Ｇ）、多系列再構成は可能である（図１９Ｈ）ことが観察された。

【0300】

さらに、本発明者らは、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞からのＣｘｃｌ１２のコンディショナルノックアウトにより、ｐＨＳＣ（４８％の減少）およびＳＴ−ＨＳＣ（２８．８％の減少）が有意に減少したが、ｒＨＳＣの有意な減少は観察されなかったことを見いだした。些細ではあるがわずかにＭＰＰが増加した（図１９Ｉ）。Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞からのＳＣＦのコンディショナル欠失により、ｒＨＳＣ（６０％の減少）、ｐＨＳＣ（３８．６％の減少）、およびＳＴ−ＨＳＣ（５３．７％の減少）が有意に減少したが、ＭＰＰはわずかに増加した（図１９Ｊ）。全体として、本発明者らは、Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞が、ｒＨＳＣを含めたＨＳＣ維持に維持因子の産生によって寄与したという最初の機能的エビデンスを提供した。

【0301】

（実施例Ｂ−４）
造血細胞およびそれらのＢＭニッチ細胞についてのトランスクリプトーム分析

【0302】

異なるニッチ細胞がどのようにＨＳＣ亜集団制御に寄与するかを支配する分子機構を理解するために、恒常性の間の４種の型の造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）に対して、および５ＦＵ後３日目のｒＨＳＣに対して、ならびに１０種の型のＢＭニッチ細胞に対して、トランスクリプトームプロファイリング分析を実施した。ＢＭニッチ細胞を骨内膜（Ｂ）および中心骨髄（Ｍ）の異なるニッチ帯域から採取した（図２６Ａ〜Ｂ）。ピアソン距離木および主成分分析（ＰＣＡ）データから、ｒＨＳＣおよびｐＨＳＣが、ＳＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰと比較して独特のトランスクリプトームプロファイリングを共有することが示された（図２０Ａ）。興味深いことに、５ＦＵ処置後のｒＨＳＣはｐＨＳＣに近いと思われ（図２０Ｂ）、これにより、生存しているｒＨＳＣが化学療法後のその後の造血再生を支持するための活性化のために刺激されたことが示唆される。

【0303】

ｒＨＳＣでは、Ｓｌａｍｆ１（ＣＤ１５０）、Ｈ１９、Ｃｔｎｎａｌ１（α−Ｃａｔｕｌｉｎ）、Ｆｇｄ５、ｖＷＦ、Ｔｅｋ（Ｔｉｅ２）、Ｐｒｏｃｒ（Ｅｐｃｒ）、Ｈｏｘｂ５およびＭｅｇ３（またはＧｔｌ２）などの公開されたＨＳＣ特異的マーカーの大部分が富化されることが見いだされた（Acar et al., 2015; Chen et al., 2016; Qian et al., 2015; Sanjuan-Plaet al., 2013; Venkatraman et al., 2013）。特に、ｒＨＳＣにおけるｖＷＦは、ｐＨＳＣにおけるｖＷＦの６．１倍であり、これにより、ｒＨＳＣではＨＳＣ階層の頂端に存在するｖＷＦ^＋ＨＳＣの大部分が富化されることが示唆される（Sanjuan-Plaet al., 2013）。一貫して、ＣＤ３４、ＣＤ４８、およびＦｌｔ３（Ｆｌｋ２）およびＩｔｇａ２（ＣＤ４９ｂ）などの前駆細胞シグネチャー遺伝子はｒＨＳＣにおいて低発現である（Acaret al., 2015; Chen et al., 2016; Gazit et al., 2014）。興味深いことに、５ＦＵ後のｒＨＳＣでは、ＣＸＣＲ４、Ｃｔｎｎａｌ１（α−Ｃａｔｕｌｉｎ）（Parket al., 2002）、Ｅｓａｍ（内皮細胞選択的接着分子）およびＣＤ１５０（Ｓｌａｍｆ１、シグナル伝達リンパ球性活性化分子をコードする）の発現レベルが高く、これは、変換された刺激された状態に関連するそれらの機能と一致する（図２０Ｅ）。

【0304】

ニッチ細胞分析では、ピアソン距離木（図２０Ｃ）およびＰＣＡ分析（図２０Ｄ）のどちらにおいても、Ｎ−ｃａｄ駆動性ｔｄＴｏｍａｔｏ（Ｎ−ｃａｄ−ＴｄＴ）（Ｍ）が、ＬｅｐＲ、Ｃｘｃｌ１２−ＲＦＰ、およびネスチン−ＧＦＰ細胞などの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）潜在性を有する他のニッチ細胞と比較して非常に類似したトランスクリプトームプロファイルを有することが見いだされ、これにより、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞がＭＳＣ潜在性およびＨＳＣの制御において同様の機能を有し得ることが示唆される。興味深いことに、ＮＧ２−ＲＦＰ細胞は、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞と非常に類似したトランスクリプトームプロファイルを有した（図２０Ｃ〜Ｄ）。ＮＧ２−ＲＦＰ細胞が骨端または骨幹において骨内膜に主に制限されるが、動脈周囲領域でも検出されることも見いだされた（図２６Ｃ）。

【0305】

Ｐｅｃａｍ−ＧＦＰ^＋内皮細胞においてＰｅｃａｍ（ＣＤ３１）、ＣＤＨ５（ＶＥ−カドヘリン）が富化されることが見いだされた。ＭＫおよびマクロファージ（Ｍａｃｓ）ではＰＦ４およびＡｄｇｒｅ１が富化された。ＮＧ２−ＲＦＰ細胞ではＣｓｐｇ４（ＮＧ２）が富化された。ネスチン−ＧＦＰ細胞は内在性ネスチン（Ｎｅｓ）発現を有さず、これは、以前の報告と一致する（Ding et al., 2012； Greenbaum et al., 2013）。興味深いことに、Ｋｉｔｌ（ＳＣＦ）、ＬｅｐＲ、Ｃｄｈ２（Ｎ−カドヘリン、Ｎ−ＣＡＤ）、Ｃｘｃｌ１２、Ｐｄｇｆｒαなどのいくつかのマーカー遺伝子が血管周囲ニッチ細胞において広範に発現されることが見いだされた（図２０Ｆ）。骨内膜帯域から単離されたＮ−ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｂ）細胞も、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ細胞およびＮＧ２−ＲＦＰ細胞などの骨内膜帯域由来の他の細胞と比較して高レベルのＳＣＦ、Ｃｘｃｌ１２、ＬｅｐＲおよびＰｄｇｆｒα発現を有した（図２０Ｆ）。本発明者らのＧＯ用語分析から、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ細胞、Ｐｅｃａｍ−ＧＦＰ細胞、ＭＫ細胞およびＭａｃ細胞では、ＲＮＡ代謝、タンパク質代謝、他の代謝経路および翻訳活性が高度に富化されたことが示され、これにより、これらの細胞が、比較的低い代謝状態であったＮ−ｃａｄ−ＴｄＴ細胞および他の血管周囲帯域細胞と比較して、比較的活性な機能的状態にあったことが示される。内皮細胞および血管周囲細胞は免疫系プロセスおよびストレス応答活性を有した（図２０Ｇ）。Ｎ−ｃａｄ^＋細胞はＬｅｐＲ^＋細胞、Ｃｘｃｌ１２−ＲＦＰ細胞、およびネスチン−ＧＦＰ細胞などの他のＭＳＣと同様のトランスクリプトームプロファイルを有したので、次に、異なるニッチ細胞に由来する間質発生関連遺伝子を分析し、比較した（図２０Ｈ）。Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ細胞では、骨芽細胞遺伝子Ｃｏｌ１ａおよび前駆細胞遺伝子Ｌｙ６ａ（ＳＣＡ１）が富化された（Yanget al., 2014）。骨内膜領域由来のＮ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｂ）細胞では、軟骨細胞遺伝子Ｓｐｏｃｋ１、Ｃｏｌ２ａ１およびＣｏｌ１ａ２ならびにＴｎｃなどの骨発生遺伝子が富化されたことが見いだされた。興味深いことに、Ｎ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｂ）およびＮ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｍ）の両方でＰｒｒｘ１、Ｐｄｇｆｒβ、Ｐｄｇｆｒα、Ｓｐ７、Ｓｏｘ９およびＧｒｅｍ１などの間葉系幹細胞および前駆細胞（ＭＳＰＣ）遺伝子の大部分が富化された。骨髄から採取されたＮＧ２−ＲＦＰ細胞もまた、Ａｌｃａｍ、Ｓｐ７、Ｍｃａｍ、Ｓｏｘ９およびＧｌｉ１などのＭＳＰＣ遺伝子発現が高レベルであったが、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ２ａ１、およびＣｏｌ１ａ２などの骨芽細胞および軟骨細胞関連遺伝子も高レベルであった。全ての血管周囲ニッチ細胞の中で、ＬｅｐＲ^＋細胞ではＧｌａならびにいくつかの骨芽細胞および軟骨細胞マーカー、例えば、Ａｔｆ４およびＴｎｃなどが排他的に富化されたことも見いだされた。Ｃｘｃｌ１２−ＲＦＰ細胞ではＭＳＰＣ遺伝子Ｉｔｇａｖが有意に富化された。さらに、Ｇｒｅｍ１がＮ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｂ）および全ての血管周囲ニッチ細胞において富化されたが、ＮＧ２−ＲＦＰ細胞では富化されなかった。

【0306】

以前のデータと一致して、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ細胞では、より成熟した骨系列遺伝子（Ｄｍｐ１、Ｃｏｌ１ａ１、Ｓｐｐ１、Ｂｇｌａｐ）が富化された。ネスチン−ＧＦＰ、Ｃｘｃｌ１２−ＲＦＰおよびＬｅｐＲは、ＭＳＣ遺伝子（Ｐｒｒｘ１、Ｐｄｇｆｒα、Ｉｔｇｂ１、Ｇｒｅｍ１）の富化におけるそれらの公知の役割と一致した（図２０Ｈ）。興味深いことに、ＭＳＣ遺伝子を発現することは別として、Ｎ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｍ）およびＮ−Ｃａｄ−ＴｄＴ（Ｂ）では、軟骨形成遺伝子（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１およびＴｎｃ）、脂肪生成遺伝子（Ｃｅｂｐα、Ｐｐａｒγ、Ａｄｉｐｏｑ）ならびに骨形成性遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｒｕｎｘ２）が富化され、これにより、Ｎ−Ｃａｄ^＋間質細胞の三分化能性が示唆される。驚いたことに、ＮＧ２−ＲＦＰでは骨発生遺伝子（Ｄｍｐ１、Ｂｇｌａｐ、Ｓｐ７、Ｒｕｎｘ２、Ｃｏｌ１ａ１）ならびに軟骨形成遺伝子（Ｓｏｘ９、Ｃｏｌ２ａ１およびＴｎｃ）の両方が富化され、これにより、骨軟骨形成の役割が示唆される（図２６Ｄ〜Ｅ）。これらのデータから、ＢＭにおけるＭＳＰＣの不均一性が強力に示される。

【0307】

（実施例Ｂ−５）
Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ誘導性レポーター細胞はＬｅｐＲ^＋およびＣｘｃｌ１２^＋幹／間質細胞と大きく重複する

【0308】

転写分析を確認するために、ＴｄＴまたはＺｓＧレポーターを使用してＮ−ｃａｄｉｎｖｉｖｏ系列追跡を実施し、誘導後３日目に、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ系列がＣｘｃｌ１２−ＲＦＰ細胞およびネスチン−ＧＦＰ細胞と部分的に重複する細胞を追跡したことが見いだされた（図２０Ｉ）。さらに、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ由来細胞の９８．３％および９７．９％がそれぞれＬｅｐＲ発現およびＰｄｇｆｒα発現について陽性であった（図２０Ｊ）。この結果により、トランスクリプトーム分析によって示唆される通りＮ−ｃａｄ^＋間質細胞がＭＳＣ潜在性を有することがさらに裏付けられる。Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞の系列潜在性を分析するために、コロニー形成単位−線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）アッセイを実施して、それらの増殖能を試験した。大多数の報告されたニッチ細胞が、骨内膜帯域由来であるか血管周囲帯域由来であるかにかかわらず、ＣＦＵ−Ｆ活性を有する細胞を１７．６個に１つしか有さないネスチン−ＧＦＰ^＋細胞は別として、ＣＦＵ−Ｆ活性を有する細胞を１０個未満に１つ有することが見いだされた。骨由来のＮ−ｃａｄ^＋細胞は、ＣＦＵ−Ｆ活性を有する細胞を細胞８．７９個に１つ有した。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ由来骨細胞は、ＣＦＵ−Ｆ活性を有する細胞を１０．７個に１つ有し、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ由来骨髄細胞は７．３７個に１つの細胞を有した（図２０Ｋ）。大多数のＣＦＵ−Ｆコロニーで、ｔｄＴｏｍａｔｏシグナルが維持され（図２１Ａ〜Ｂ）、これにより、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞がＣＦＵ−Ｆ活性を有するＭＳＰＣの主要な供給源であったことが示唆される。

【0309】

（実施例Ｂ−６）
ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏにおいてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞が生じる

【0310】

Ｎ−ｃａｄ^＋細胞のＭＳＣ潜在性を試験するために、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞によって形成された個々のＣＦＵ−Ｆコロニーから得た細胞を３つのアリコートに分割し、それらを骨細胞分化、脂肪細胞分化、または軟骨細胞分化が許容される培養物にサブクローニングすることにより、ｉｎｖｉｔｒｏにおける分化アッセイを実施した。Ｔｏｍａｔｏ^＋細胞は多系列分化を受け、アルカリホスフェート陽性骨芽細胞、ＯｉｌＲｅｄＯ陽性脂肪細胞、およびアグリカン染色およびトルイジンブルー陽性軟骨細胞が生じることが見いだされた（図２１Ｃ〜Ｅ）。

【0311】

Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞のｉｎｖｉｖｏにおける機能を特徴付けるために、１回用量のＴＭＸによる処置後にＮ−ｃａｄ由来細胞の動的な解剖学的分布を分析した（図２１Ｆ、Ｇ）。興味深いことに、検出されたＮ−ｃａｄ由来細胞は、早くもＴＭＸの６時間後に海綿骨幹端において検出されたが、中心骨髄では非常にわずかな細胞しかみられず、これにより、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞の大部分が骨内膜領域に由来することが示唆される（図２１Ｈ）。ＴＭＸによる処置後１週間から２週間まで海綿骨領域においてＮ−ｃａｄ由来細胞の数が２．２±０．２倍増加し、その後は安定なままであったことも観察された。皮質骨領域では、ＴＭＸ後２週間の時点で細胞数が２．９５±０．２倍増加したが、その後、ＴＭＸ後６週間の時点では減退し、これにより、海綿骨領域内のＮ−ｃａｄ^＋細胞が皮質骨領域と比較してより静止していたことが示唆される。さらに、Ｎ−ｃａｄ由来細胞は６週間に至るまで中心骨髄において増加し続け、これにより、Ｎ−ｃａｄ由来細胞がこの領域内で増殖および分化することができたことが示唆される（図２１Ｉ）。

【0312】

次に、ｉｎｖｉｖｏ系列追跡アッセイを実施し、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞が時間依存的にＣｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋骨芽細胞を生じさせる（Dacic et al., 2001）ことが観察された（図２２Ａ、図２７Ａ〜Ｂ）。Ｎ−ｃａｄ由来骨芽細胞が早くもＴＭＸによる誘導の６時間後に海綿周囲領域において検出され（図２２Ｂ）、ＴＭＸによる誘導の１４時間後に緻密骨領域において検出された（図２２Ｃ）。さらなる分析により、ＴＭＸ後６時間の時点で、未成熟Ｎ−ｃａｄ^＋Ｃｏｌ２．３⁻細胞（１．１％±０．２％）が海綿骨領域において皮質骨領域（０．１１％±０．０４％）と比較して１０倍多く富化されたことが示された（図２２Ｄ、Ｅ）。一貫して、ＴＭＸによる誘導後２４時間および２週間の時点で、海綿骨領域において緻密骨領域と比較してより多くの未成熟Ｎ−ｃａｄ^＋Ｃｏｌ２．３⁻細胞が富化された（図２２Ｆ）。ＴＭＸによる誘導後４週間の時点で、Ｃｏｌ２．３−ＧＦＰ細胞の大部分（７２％±６％）はＮ−ｃａｄ^＋細胞に由来するものであった（図２２Ｇ）。

【0313】

ＴＭＸ注射の４週間後に、海綿骨領域、特に、骨内膜の細胞においてＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から脂肪細胞が生じることがさらに観察され（図２２Ｈ）、これは、ＢＯＤＩＰＹ脂質プローブ染色によってさらに確認された（図２２Ｉ）。興味深いことに、Ｎ−ｃａｄ^＋由来脂肪細胞の頻度は、ＴＭＸによる誘導後６時間、１４時間および２４時間の時点でそれぞれＮ−ｃａｄ^＋由来細胞の３９．３％±４．５％、７７．１％±６．７％および１７．２％±３％が観察された定量化によって証明される通り、最初に急速に増大し、後で減退し、これにより、脂肪細胞が頻繁なターンオーバー速度を有し得ることが示唆される（図２２Ｊ〜Ｋ、図２７Ｃ〜Ｅ）。集合的に、データから、成体マウスにおいて恒常性の間にｉｎｖｉｖｏでＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から骨芽細胞および脂肪細胞系列の両方が生じることが実証された。

【0314】

さらに、Ｎｃａｄ＋ＭＳＣが他のマーカーと比較して＞１０倍富化されたことが見いだされた。例えば、図３０に示されている通り、ｉｎｖｉｖｏにおいて、ほんの１０Ｋ個のＮｃａｄ＋ｈＭＳＣから総ｈＭＳＣよりもはるかに多くのヒトトロンボポエチン（ＴＨＰＯまたはＴＰＯ）が生じた。同様に、Ｎｃａｄ−ｈＭＳＣは総ｈＭＳＣと同様の機能を示した。したがって、ＭＳＣをＮ−カドヘリン抗体で単離することにより、ＭＳＣ集団の富化をもたらすことができる。

【0315】

（実施例Ｂ−７）
発生の間および傷害後にＮ−ｃａｄ^＋間質細胞から軟骨細胞が生じる

【0316】

軟骨形成は、胎仔発生において活性であり、成体期ではまれに活性である（Raghunathet al., 2005; Sophia Fox et al., 2009）。出生後２日目（Ｐ２）にＴＭＸによる誘導を受けたマウスにおいて、Ｔｏｍａｔｏ^＋骨芽細胞および軟骨細胞周囲が成長板に近接しているにもかかわらず、Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスの大腿骨においてアグリカン^＋軟骨細胞の間でＴｏｍａｔｏ発現は検出されなかった（図２８Ａ）。Ｎ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに成長板が発生した１週間または２週間の時点でＴＭＸを用いて誘導した後、大腿骨または脛骨の軟骨においてＴｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞は検出不可能なままであった（データは示していない）。胚期Ｅ１２．５のＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスに対して、胎仔骨においてＭＳＣが圧縮（condensation）および軟骨細胞分化を受けた時にＴＭＸによる誘導を開始した（図２３Ａ）。大多数の未分化Ｎ−ｃａｄ由来ｔｄＴ^＋細胞は末梢に位置し、分化したＮ−ｃａｄ由来Ｔｏｍａｔｏ^＋軟骨細胞はＥ１４．５胚の肋骨の中心領域に位置したことが見いだされた（図２３Ｂ）。重要なことに、Ｐ２時点での大腿骨の海綿領域において、二次骨化中心が形成される円柱帯域、および、より深層を保護するために垂直の力（sheer force）に抵抗するために必須の表層の両方でＮ−ｃａｄ由来軟骨細胞が検出された（図２３Ｃ、Ｄ）。一貫して、Ｎ−ｃａｄ由来脂肪細胞は生後２カ月の時点で検出され、生後１０カ月の時点まで検出され（図２３Ｅ、図２８Ｂ）、これにより、Ｎ−ｃａｄ＋細胞が発生の間の初期および長期にわたる脂肪生成に寄与したことが示唆される。しかし、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞由来オステオポンチン^＋骨芽細胞および骨細胞は生後２カ月の時点では検出されたが、初期のＰ２では検出されなかった（図２３Ｆ、図２８Ｃ）。これらのデータから、胚Ｎ−ｃａｄ由来の細胞から３種の骨−脂肪生成−軟骨形成系列全てが生じ、胚期のＮ−ｃａｄ^＋のみが軟骨細胞を効率的に形成することができることが実証された。

【0317】

傷害後の成体マウスにおいてＮ−ｃａｄ^＋細胞が軟骨細胞を生じさせることができるかどうかを次に調査した。Ｅ１２．５時点でＴＭＸによる誘導を受けたＮ−ｃａｄ−ＣｒｅＥＲ^Ｔ；Ｒ２６−ｔｄＴマウスにおいて軟骨穿孔を実施した（図２３Ｇ）。軟骨損傷後２〜３週間の時点で、本発明者らは、Ｎ−ｃａｄ由来軟骨細胞が、損傷を受けていない対照マウスと比較して２倍に増加し、損傷部位の仮骨においてクラスター形成したことを見いだした（図２３Ｈ〜Ｉ）。外科手術後のマウスにおいて関節軟骨損傷に起因して大腿脛骨関節が腫脹した（図２８Ｄ）。傷害後領域では典型的な軟骨細胞の特徴を有するアルシアンブルー陽性細胞が劇的に増加し（図２３Ｊ）、これにより、傷害に応答してＮ−ｃａｄ^＋ＭＳＣにより軟骨細胞が急速に再生したことが示される。

【0318】

総合すると、データから、胎仔期（Ｅ１２．５）に誘導されたＮ−ｃａｄ由来の細胞が、成体における軟骨細胞前駆細胞を生じさせ、傷害に応答して軟骨細胞再生を支持することができることが証明された。

【0319】

考察

【0320】

ｒＨＳＣ対ｐＨＳＣ

【0321】

ＨＳＣの不均一性を広範に試験した。ＨＳＣは、活性な状態、静止した状態または深く静止した状態のいずれでも維持することができる。ＨＳＣの静止状態の特徴付けがそれらの長期自己複製潜在性に機能的に関連することが周知である（Foudi et al., 2008; Wilson et al., 2008）。しかし、静止状態のＨＳＣ集団がｉｎｖｉｖｏにおける骨髄破壊という結果をどのように克服するかは未解決の疑問である。静止状態にもかかわらず、大多数のＨＳＣは５ＦＵなどの化学療法ストレスを生き抜くことができない（Longleyet al., 2003）。本明細書の態様に従って、ＨＳＣ亜集団のごく一部が一次マウスにおける５ＦＵ処置を生き抜くことができ、移植モデルにおいて５ＦＵ処置に対して抵抗性であることが見いだされた。したがって、このＨＳＣ亜集団はｒＨＳＣと定義され、一方、静止しているが化学療法剤感受性である他のＨＳＣ亜集団はｐＨＳＣと定義される（Liand Clevers, 2010）。どちらのＨＳＣ亜集団も移植実験において長期造血を支持したが、ｐＨＳＣからｒＨＳＣが生じることはめったにないが、ｒＨＳＣはｐＨＳＣを生じさせることができた。機構的に、恒常性の間にｒＨＳＣではｐＨＳＣと比較してＤＮＡ修復系が減弱しているが、ｒＨＳＣは、それらのＤＮＡ修復経路およびストレス応答プログラムを急速に活性化して、化学療法ストレスを生き抜くことができ、その後の造血を支持して骨髄破壊という結果を克服することができることが見いだされた。

【0322】

化学療法に対する抵抗性の付与に関するニッチ物質

【0323】

ｒＨＳＣの化学療法抵抗性の基礎をなす外因性機構を探究するために、ｒＨＳＣがＢＭにおける特異的な微小環境に保存されるという考えを検定した。ホールマウントＨＳＣ染色（Kunisaki et al., 2013）を使用し、以前に報告された通り、バルクのＨＳＣが血管およびＭＫに関連することが最初に観察された。しかし、驚いたことに、恒常性の間および５ＦＵ処置後にｒＨＳＣがｐＨＳＣと比較して骨内膜ニッチに主に関連することが見いだされた。これにより、骨内膜ニッチが別個のＢＭ微小環境を形成してｒＨＳＣを化学療法ストレスから保護することができることが示された。一貫して、化学療法ストレスを受けると、大多数のｒＨＳＣが、化学療法抵抗性Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞が富化される骨内膜ニッチ内に保護されたが、血管および血管周囲細胞は５ＦＵ処置に対して感受性であり、これが化学療法によって誘導されるｐＨＳＣの大幅な喪失の原因である。豊富な骨分枝を有し、骨髄の内側に伸長する胸骨においてホールマウントＨＳＣ染色を行った。この特徴により、胸骨は大腿骨における海綿骨領域と非常に類似したものになる。Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞の枯渇がｒＨＳＣを含めたＨＳＣ維持に影響を及ぼしたことを示す移植アッセイによりこの概念が裏付けられる。ＨＳＣ静止状態はまた、それらの低代謝状態とも相関し、これは、「睡眠」と類似するとみなすことができ、ＨＳＣ休眠または冬眠と称された（Takuboet al., 2013; Wilson et al., 2008; Yamazaki et al., 2011）。しかし、本明細書の態様に従って、静止状態が薬物抵抗性の基礎をなす唯一の機構ではなく、その代わりに、内因性ストレス応答プログラムおよび外因性ニッチ保護の両方が薬物抵抗性に寄与することがさらに示された。

【0324】

ＢＭニッチにおけるＨＳＣ維持に関するＮ−ｃａｄ間質細胞の正体および機能

【0325】

Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞は、最初に同定されたＨＳＣニッチ細胞であり（Zhang et al., 2003）、その後の試験によって確認された（Arai et al., 2004; Sugiyama etal., 2006）。Ｎ−ｃａｄ^＋細胞は、それらが骨内膜に位置することに基づいて骨芽細胞の前駆細胞として最初に提唱された。本明細書の態様に従って、２つのレポーター株を使用することにより、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞が骨内膜領域および血管周囲部位のどちらにも分布していることが見いだされた。さらに興味深いことに、大多数のＮ−ｃａｄ^＋細胞がＬｅｐＲ^＋細胞およびＰｄｇｆｒα^＋細胞と重複することが見いだされた。転写分析から、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞、ＬｅｐＲ^＋細胞、Ｃｘｃｌ１２−ＲＦＰ（ＣＡＲ）細胞およびネスチン−ＧＦＰ細胞が非常に類似した遺伝子発現パターンを有することが示された。データから、ＨＳＣニッチ概念に関する長期にわたる議論が、それらの細胞の正体ではなく、使用される異なる細胞マーカーに起因する可能性が非常に高い可能性があることが強力に示される。

【0326】

Ｎ−Ｃａｄ^＋間質細胞の正体を決定するために、それらの局部的分布を、異なるニッチレポーターマウスを使用して、骨髄における他の公知のニッチ細胞と比べて可視化した。Ｎ−Ｃａｄ^＋間質細胞からは７２％±６％のＣｏｌ２．３−ＧＦＰ^＋細胞が生じたが、９．３％±４．７％のＮ−ｃａｄ^＋Ｃｏｌ２．３ＧＦＰ⁻細胞も骨内膜領域内で検出された。これらの未成熟の細胞は原始的なＭＳＣの原因となり、これにより、ＨＳＣニッチ機能試験におけるＣｏｌ２．３−Ｃｒｅ遺伝学的モデルの不十分な効率を説明することができる（Ding and Morrison, 2013; Ding et al., 2012; Greenbaum et al., 2013）。Ｎ−Ｃａｄ−ＴｄＴ^＋およびネスチン−ＧＦＰ^＋はどちらも海綿領域において富化されたが、Ｎ−Ｃａｄ−ＴｄＴ^＋は、以前に報告された通り、移植されたＨＳＣの生着が検出された海綿領域に濃縮され（Nilssonet al., 2001; Xie et al., 2009）、本発明で観察された通りストレス後に残存した。これらのデータ全てから、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞は他のＭＳＣと同様のトランスクリプトームプロファイルを共有するが、それらの解剖学的分布によりそれらの独特なＨＳＣニッチ機能が示される可能性があることが示される。実際に、ｒＨＳＣの保存においてＮ−ｃａｄ^＋骨内膜ニッチ細胞が重大な役割を果たすことが示された。

【0327】

誘導性ＤＴＲ系を使用することによって、Ｎ−ｃａｄ^＋細胞の除去により、ＢＭにおけるｐＨＳＣおよびｒＨＳＣがどちらも排除されることが見いだされた。これは、骨内膜および血管周囲の帯域の両方におけるＮ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞の解剖学的分布によって説明することができる。さらに、ＨＳＣのサブセットにおいてＮ−ｃａｄ発現を検出することができることが示された。しかし、Ｎ−ｃａｄ−ＴｄＴレポーターマウス系ではこの観察は裏付けられなかった（データは示していない）。これは、別のマウス系であるＮ−ｃａｄ−ｍＣｈｅｒｒｙ（タンパク質レベルでの融合）は実際に低レベルのＮ−ｃａｄ発現を示すＨＳＣの小さなサブセット（ＣＤ４９ｂ⁻ＣＤ３４⁻Ｆｌｔ２⁻ＬＳＫ）を有したので（一次観察）、それらのタンパク質レベルと転写レベルの不一致によって部分的に説明することができる。機能的移植データから、Ｎ−ｃａｄ^＋ニッチ細胞の除去の結果、ｒＨＳＣを含めたＨＳＣの減少がもたらされることが示された。Ｃｘｃｌ１２およびＳＣＦをＮ−ｃａｄ^＋細胞から欠失させることにより、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞がこれらの２つの因子を産生することによってＨＳＣの維持および制御に寄与することが見いだされた。全体として、本明細書の態様により、Ｎ−ｃａｄ^＋間質細胞がＭＳＣとして機能し、特に、ストレス下での原始的なＨＳＣ維持を支持することが実証される。

【0328】

ヒト臍帯血液（ｈＵＣＢ）由来の造血幹細胞（ＨＳＣ）を移植することには、がんを含めた様々な血液学的障害の処置に関して大きな見込みがあるが、単一のｈＵＣＢ単位中のＨＳＣの数が限られることにより、その広範にわたる使用が制限される恐れがある。広範囲にわたる試みにより、単一分子または経路を標的とすることによってヒトＨＳＣをｅｘｖｉｖｏで増大させるための多数の方法が開発されたが、幹細胞の自己複製のために必須である多数の標的を同時に操作することが達成可能であり得るかどうかは分かっていない。最近の研究により、Ｎ^６−メチルアデノシン（ｍ^６Ａ）により、幹細胞の運命決定のために重大であるｍＲＮＡの群の発現が、それらの安定性が影響を受けることによってモジュレートされることが明らかになった。いくつかのｍ^６Ａリーダーの中で、Ｙｔｈｄｆ２は、標的化ｍＲＮＡ分解を促進することがよく認識されている。しかし、成体幹細胞に対するＹｔｈｄｆ２の生理機能は依然としてわかりにくい。本明細書の実施形態では、コンディショナルノックアウト（ＫＯ）マウスＹｔｈｄｆ２により表現型ＨＳＣおよび機能的ＨＳＣ数が増加するが、系列分化が歪むことも造血悪性疾患が導かれることもないことが実証される。さらに、ヒトＹＴＨＤＦ２のノックダウン（ＫＤ）により、２ラウンドの限界希釈移植アッセイにおいて、ｅｘｖｉｖｏでのｈＵＣＢＨＳＣの増大の１０倍を超える増加、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の５倍の増加、および機能的ｈＵＣＢＨＳＣの８倍を超える増加が導かれた。機構的に、マウス造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）由来のＲＮＡならびにｈＵＣＢＨＳＣ由来のＲＮＡのｍ^６Ａマッピングにより、幹細胞の自己複製のために重大である転写因子をコードするｍＲＮＡへのｍ^６Ａ富化が明らかになった。これらのｍ^６ＡでマークされたｍＲＮＡは、Ｙｔｈｄｆ２によって認識され、ｍＲＮＡ分解を受けた。Ｙｔｈｄｆ２ＫＯＨＳＰＣおよびＹＴＨＤＦ２ＫＤｈＵＣＢＨＳＣでは、これらのｍＲＮＡが安定化され、それにより、タンパク質レベルの上昇が導かれ、Ｔａｌ１ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡのノックダウンによってレスキューすることができるＨＳＣの増大が容易になる。したがって、実施形態は、成体幹細胞維持におけるＹｔｈｄｆ２の機能を示し、また、ＨＳＣのｅｘｖｉｖｏでの増大を、ＨＳＣ自己複製のために重大である多数のｍＲＮＡの安定性を調節する機構によって制御することにおけるＹｔｈｄｆ２の重要な役割を同定するものであり、したがって、今後の臨床的適用の強力な潜在性がある。

【0329】

さらに、骨髄（ＢＭ）ニッチによる造血幹細胞（ＨＳＣ）の制御が実質的に試験されている。しかし、ＨＳＣ亜集団が異なるＢＭニッチによって異なって制御されるかどうか、およびどのように制御されるかは、依然としてほとんど分かっていない。本発明では、予備ＨＳＣ（ｒＨＳＣ）を刺激されたＨＳＣ（ｐＨＳＣ）と機能的に区別し、それらのそれぞれのＢＭニッチをさらに調査した。ｐＨＳＣおよびｒＨＳＣはどちらも恒常性の下で長期造血を支持することができることが見いだされている。しかし、ｐＨＳＣは化学療法に対して感受性であったが、ｒＨＳＣは化学療法を生き抜き、骨髄破壊後のその後の再生を支持した。ホールマウントＨＳＣ分布試験により、ｒＨＳＣが、恒常性の間および化学療法後に、Ｎ−カドヘリン^＋骨内層細胞が富化される骨内膜領域内に優先的に維持されることが明らかになった。ｐＨＳＣは、骨と比較して化学療法に対して脆弱な血管に主に関連付けられた。トランスクリプトームプロファイリングおよびｉｎｖｉｖｏ系列追跡結果から、Ｎ−カドヘリン^＋間質細胞が、発生および再生の間に骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞を生じさせる機能的な間葉系幹細胞であることが示された。最後に、Ｎ−カドヘリン^＋ニッチ細胞の除去またはＮ−カドヘリン^＋ニッチ細胞からのＳｃｆもしくはＣｘｃｌ１２のいずれかの欠失がＨＳＣの数および維持に影響を及ぼすことが実証された。

【0330】

（実施例Ｃ）
ｓｈＲＮＡを使用したＣＡＲ−Ｔ細胞の増大

【0331】

Ｙｔｈｄｆ２を操作することのＣＡＲ−Ｔ細胞の増大に対する効果を、レンチウイルス駆動性ヒトＹｔｈｄｆ２ｓｈＲＮＡを使用して評価する。ＣＡＲ−ＴレンチベクターへのＹＴＨＤＦ２ｓｈＲＮＡの上首尾のクローニングがなされた。レンチウイルスを使用してヒトＣＡＲ−Ｔ細胞に感染させ、ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を進行させる。増大は、結果に関して数日間〜数週間かかることが予想される。レンチウイルスに感染したＣＡＲ−Ｔ細胞集団ではＣＡＲ−Ｔ対照集団と比較して有意に増強された増大が実証されると考えられる。

【0332】

ｍ^６Ａ−ｓｅｑ、ｉｒＣＬＩＰ−ｓｅｑおよびＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを含めた全ての配列決定データがＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｂｉｂｕｓ（ＧＥＯ）を通じて受託ＧＳＥ１０７９５７の下で入手可能である。

【0333】

元のデータリポジトリ、http://www.stowers.org/research/publications/LIBPB-1248。

【0334】

参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載のものを補足する例示的な手続き上のまたは他の詳細を提供する範囲内で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【表1】