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2020-536907ナノベクター、およびその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-536907(P2020-536907A)

(43)【公表日】2020年12月17日

(54)【発明の名称】ナノベクター、およびその使用

(51)【国際特許分類】

A61K 47/34 20170101AFI20201120BHJP

A61K 9/16 20060101ALI20201120BHJP

A61K 9/08 20060101ALI20201120BHJP

A61K 47/02 20060101ALI20201120BHJP

A61K 47/22 20060101ALI20201120BHJP

A61K 47/18 20060101ALI20201120BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20201120BHJP

A61K 33/243 20190101ALI20201120BHJP

A61K 31/704 20060101ALI20201120BHJP

【ＦＩ】

A61K47/34

A61K9/16

A61K9/08

A61K47/02

A61K47/22

A61K47/18

A61P35/00

A61K33/243

A61K31/704

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2020-520446(P2020-520446)

(86)(22)【出願日】2018年10月12日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月9日

(86)【国際出願番号】FR2018052538

(87)【国際公開番号】WO2019073182

(87)【国際公開日】20190418

(31)【優先権主張番号】1759607

(32)【優先日】2017年10月13日

(33)【優先権主張国】FR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】519433399

【氏名又は名称】エヌアッシュテラギ

(71)【出願人】

【識別番号】511196870

【氏名又は名称】ユニベルシテクロードベルナールリヨンプルミエ

(71)【出願人】

【識別番号】513015441

【氏名又は名称】サントゥルナシオナルドゥラルシェルシュシアンティフィック − セーエヌエールエス

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥＮＡＴＩＯＮＡＬＤＥＬＡＲＥＣＨＥＲＣＨＥＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ − ＣＮＲＳ

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯＷＯＲＬＤＰＡＴＥＮＴ＆ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ティユモン，オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】リュクス，フランソワ

(72)【発明者】

【氏名】ロセッティ，ファビアン

(72)【発明者】

【氏名】トラン，ヴュ−ロング

(72)【発明者】

【氏名】マチュ，クレリア

(72)【発明者】

【氏名】ダアン，ミルヴァ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA31

4C076AA32

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC27

4C076DD21

4C076DD49

4C076DD60

4C076EE27

4C076FF31

4C076GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA10

4C086HA12

4C086HA24

4C086HA26

4C086HA28

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA17

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA12

4C086NA13

4C086ZB26

(57)【要約】

本発明は、体内に活性物質を送達するためのナノベクターの分野に関し、特に、腫瘍を処置するためのナノベクターの分野に関する。特に、これらのナノベクターを使用することによって、より選択的に送達される活性物質の薬学動態の改善（例えば、腫瘍組織への薬物動態の改善）が可能になる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトまたは動物に活性物質を送達するためのナノベクターを調製する方法であって、
前記方法は、ヒトまたは動物に投与することができる以下の２つの溶液を混合する工程を含み、
ａ．ナノ粒子を含む第一の溶液であって、当該ナノ粒子は１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子から選択されるナノ粒子である、第一の溶液、
ｂ．有機化合物から選択される、一種類の活性物質、または複数種類の活性物質の混合物を含む第二の溶液であって、好ましくは、当該活性物質は前記ナノ粒子の重量の２％〜４０％の分子量、好ましくは前記ナノ粒子の重量の５％〜２５％の分子量を有する、第二の溶液、
前記混合する工程は、前記ナノ粒子の表面における前記活性物質の物理的吸着による相互作用を許容する、濃度比、ｐＨおよび温度の条件下で行われる、方法。

【請求項2】

［前記第二の溶液中の活性物質］：［前記第一の溶液中のナノ粒子］にて示される、重量に基づく濃度比は、０．５ｍｇ／ｇよりも大きく、好ましくは１ｍｇ／ｇよりも大きく、特に０．５ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記活性物質は、５０００ｇ．ｍｏｌ^−１未満のモル質量、好ましくは１００〜２０００ｇ．ｍｏｌ^−１のモル質量を有する有機低分子化合物から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記活性物質は、
アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン．レナリドミド、イブルチニブ、アビラテロン、エルロチニブ、エベロリムス、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ゴセレリン、ネダプラチン、ラボプラチンおよびヘプタプラチンである抗癌物質の１つ、または、これらの混合物から選択される、
好ましくは、ドキソルビシン、ＴＡＴＥペプチドおよびシスプラチンである抗癌物質の１つ、または、これらの混合物から選択される、ことを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。

【請求項5】

溶液中に遊離したまま残存している活性物質を除去するために、前記溶液を混合した後で得られた前記ナノベクターを精製する工程と、
前記活性物質が物理的吸着によって表面に結合しているナノ粒子を含む前記ナノベクターを回収する工程と、を含む、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。

【請求項6】

ヒトに活性物質を送達するためのナノベクターであって、
前記ナノベクターは、前記活性物質が物理的吸着によって表面に結合しているナノ粒子を含み、
前記ナノ粒子は、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子から選択されるナノ粒子であり、
前記活性物質は、前記ナノ粒子の全質量の２％〜４０％のモル質量、好ましくは前記ナノ粒子の全質量の５％〜２５％のモル質量を有する有機化合物から選択されることを特徴とする、ナノベクター。

【請求項7】

ナノベクター１グラム当たりの活性物質のミリグラム量にて表される積載量は、０．５ｍｇ／ｇよりも大きく、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇであることを特徴とする、請求項６に記載のナノベクター。

【請求項8】

前記ナノ粒子は、以下の構成を含むことを特徴とする、請求項６または７に記載のナノベクター：
ａ．前記ナノ粒子の全重量の少なくとも８％の重量比のケイ素、好ましくは前記ナノ粒子の全重量の８％〜５０％の重量比のケイ素を含む、ポリシロキサン、
ｂ．ナノ粒子当たり、好ましくは５〜１００の割合、好ましくは５〜２０の割合のキレート剤、
ｃ．必要に応じて、例えば、ナノ粒子当たり、５〜１００の割合、好ましくは５〜２０の割合の金属原子であって、前記キレート剤と錯体を形成する金属原子。

【請求項9】

前記ナノ粒子は、下記の化学式（Ｉ）で表されることを特徴とする、請求項６〜８の何れか１項に記載のナノベクター：
Ｓｉ_ｎ［Ｏ］_ｍ［ＯＨ］_ｏ［Ｃｈ_１］_ａ［Ｃｈ_２］_ｂ［Ｃｈ_３］_ｃ［Ｍ^ｙ＋］_ｄ［Ｄ^ｚ＋］_ｅ［Ｇｆ］_ｆ（Ｉ）
前記化学式（Ｉ）にて、
ｎは、２０〜５０００、好ましくは２０〜２００であり、
ｍは、ｎよりも大きく、４ｎ未満であり、
Ｏは、０〜２ｎであり、
Ｃｈ_１、Ｃｈ_２、Ｃｈ_３は、同じものであってもよく、異なるものであってもよいキレート剤であって、Ｓｉ−Ｃ共有結合にて前記ポリシロキサンのＳｉ原子に結合するキレート剤であり；ａ、ｂ、ｃは、０〜ｎの整数であり、且つ、ａ＋ｂ＋ｃは、ｎ以下、好ましくは５〜１００の、例えば５〜２０の整数であり、
Ｍ^ｙ＋およびＤ^ｚ＋は、お互いが同じものであってもよく、異なるものであってもよい金属カチオンであって、ｙおよびｚが１〜６である金属カチオンであり；ｄおよびｅは、０〜ａ＋ｂ＋ｃの整数であり、且つ、ｄ＋ｅは、ａ＋ｂ＋ｃ以下であり、
Ｇｆは、お互いが同じものであってもよく、異なるものであってもよい標的グラフトであって、各々がＳｉ−Ｃ結合にて前記Ｓｉ原子に結合し、目的の生物組織、例えば腫瘍組織への前記ナノ粒子の標的化を可能にする標的化分子を結合させる標的グラフトであり；ｆは、０〜ｎの整数である。

【請求項10】

前記キレート剤は、前記ナノ粒子上に、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡＧＡおよびＤＴＰＡＢＡである錯体分子の１つ、または、これらの混合物をグラフト化させることによって得られることを特徴とする、請求項８または９に記載のナノベクター。

【請求項11】

大きな原子番号Ｚを有する原子から選択される金属原子、例えばガドリニウム、ビスマス、または、これらの混合物から選択される金属原子を含むことを特徴とする、請求項８〜１０の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項12】

前記ナノ粒子は、１〜５ｎｍの平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子であり、
前記ナノ粒子は、当該ナノ粒子上にＤＯＴＡＧＡをグラフト化することによって得られた前記キレート剤と錯体化したガドリニウムを含むことを特徴とする、請求項８〜１１の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項13】

前記活性物質は、５０００ｇ．ｍｏｌ^−１未満のモル質量、好ましくは１００〜２０００ｇ．ｍｏｌ^−１のモル質量を有する有機低分子化合物から選択されることを特徴とする、請求項６〜１２の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項14】

前記ナノ粒子は、前記ポリシロキサンに共有結合にてグラフト化された標的化剤を含み、目的の生物領域のアクティブな標的化を可能にすることを特徴とする、請求項６〜１３の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項15】

請求項１〜５の何れか１項に記載の方法によって得られることを特徴とする、請求項６〜１４の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項16】

ヒトまたは動物の癌の処置に使用するための、請求項６〜１４の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項17】

前記活性物質は、抗癌物質、特に細胞毒性物質から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載のナノベクター。

【請求項18】

前記抗癌物質は、
アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン．レナリドミド、イブルチニブ、アビラテロン、エルロチニブ、エベロリムス、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ゴセレリン、ネダプラチン、ラボプラチンおよびヘプタプラチンである物質の１つ、または、これらの混合物から選択される、
好ましくは、ドキソルビシン、ＴＡＴＥペプチドおよびシスプラチンである物質の１つ、または、これらの混合物から選択される、ことを特徴とする、請求項１６または１７に記載のナノベクター。

【請求項19】

前記ナノ粒子は、放射線増感効果を有し、原子番号が４０を超える元素のキレートを含み、
前記ナノベクターの有効量の処置対象への投与は、化学療法および放射線療法の効果を組み合わせた癌の処置を可能にすることを特徴とする、請求項１６〜１８の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項20】

前記ナノ粒子は、金属原子のキレートを含み、
前記金属原子は、磁気共鳴画像法、スキャン、または、シンチグラフィーによるイメージングの用途のために選択されるものであり、
前記ナノベクターの有効量の処置対象への投与は、化学療法による癌の処置、および、当該処置の治癒作用のモニタリングを可能にすることを特徴とする、請求項１６〜１９の何れか１項に記載のナノベクター。

【請求項21】

請求項６〜１５の何れか１項に記載のナノベクターと、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤とを含む、注射用医薬溶液。

【請求項22】

前記ナノベクターは、４０よりも大きな原子番号Ｚを有する原子、好ましくはビスマスまたはガドリニウムを含み、
前記大きな原子番号Ｚを有する原子の前記溶液内での濃度は、１０〜２００ｍＭであることを特徴とする、請求項２１に記載の注射用医薬溶液。

【請求項23】

前記ナノベクターの前記活性物質が、ドキソルビシン、シスプラチンおよびＴＡＴＥペプチドから選択されることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の注射用医薬溶液。

【請求項24】

請求項１〜５の何れか１項に記載の方法によって直接的に得られることを特徴とする、請求項２１〜２３の何れか１項に記載の注射用医薬溶液。

【発明の詳細な説明】

【0001】

〔技術分野〕
本発明は、体内に活性物質を送達するためのナノベクター、特に腫瘍を治療するためのナノベクターに関する。特に、これらのナノベクターを使用することによって、より選択的に送達される活性物質の薬学動態の改善（例えば、腫瘍組織への薬物動態の改善）が可能になる。

【0002】

〔背景〕
最初のナノ粒子（Ａｄａｇｅｎ（登録商標）、Ｓｉｇｍａ−ＴａｕＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，ＭＤ，ＵＳＡ）が１９９０年に市販されて以来、生物医学的な目的でナノ粒子を使用するために、多数の研究が行われている（C. A. Schultz et al., Nanomedicine, 2013）。これらのナノシステムのうち、２０％を超えるナノシステムが、薬物送達の効能による癌の処置のためのものである。薬物送達におけるナノ粒子の使用には、実際に、フリーな化学療法における直接的な静脈注射を上回る、以下のような利点がある:（ｉ）薬物の溶解度の増加、（ｉｉ）薬物動態の改善、（ｉｉｉ）血流中での半減期の延長（フリーなドキソルビシンの１０時間に対して、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）は４５時間）（A. C. Anselmo et al., Journal of Controlled Release, 2015）、（ｉｖ）非標的器官への送達に関係する副作用の最小化（Q. Qu et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2016）。

【0003】

本発明者らの知る限り、現在、規制レベルにて認可されている抗癌剤をカプセル化するシステムの大部分は、ＰＥＧ化リポソーム、または、非ＰＥＧ化リポソームに基づいている（但し、アルブミンに基づくＡｂｒａｘａｎｅ（登録商標）を除く）（A. C. Anselmo, Bioengineering & Translational Medicine, 2016）（表１）。

【0004】

【表1】

これらの少数の成功にもかかわらず、臨床利用されるナノシステムの数は、前記ナノシステムに費やされてきた研究努力に比べて少ない。最近の研究は、リポソーム中にカプセル化されたドキソルビシンの製剤が動物において有効であることを示しているものの、ヒトに対する臨床的有用性を示すことが課題となっている（G. H. Petersen et al., Journal of Controled Release, 2016）。

【0005】

ヒトにおける有用性を示す際のこのような困難性に加えて、これらのシステムは、一般的に、化学的観点から複雑である。そのために、当該システムの合成には費用がかかり、当該システムの工業的スケールへの移行は困難である（J. Shi et al., Nature Reviews Cancer, 2017）。最新の研究から、多くのナノシステムは、大きすぎて、血管から腫瘍中へ効率的に移行できない、という考えに至っている。それ故に、約１００ｎｍの流体力学的な直径を有するリポソームであっても、腫瘍内への浸透は、血管から数えて数層の細胞層に限定される（A. A. Manzoor et al., Cancer Research, 2012）。このような制限は、ナノ粒子からの比較的遅い活性物質の放出と相まって、有効な濃度での活性物質の送達を困難にし得る。

【0006】

有機ナノ粒子に関する研究と並行して、無機ナノ粒子も開発されてきた。しかしながら、ＩＲＭ用の酸化鉄（Ｅｎｄｏｒｅｍ（登録商標）、ＧａｓｔｒｏＭＡＲＫ（商標）、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）など）を除いて、潜在的な毒性の理由から、２０１３年にはまだ市販されていない（C. A. Schultz et al., Nanomedicine, 2013）。生物医学的用途のために無機ナノ粒子を開発する理由の１つは、ナノスケールにおいて発揮され得る特性を利用することにある。当該特性とは、例えば、酸化鉄の磁気発熱Ｎａｎｏｔｈｅｒｍ（登録商標））（K. Maier-Hauff et al., Journal of Neurooncology, 2011）、金ナノ粒子の光学発熱（ＡｕｒｏＳｈｅｌｌ（登録商標））（J. M. Stern et al., International Journal of Toxicology, 2016）である。

【0007】

これらの利用と並行して、薬物送達のために、多孔質無機ナノシステムが開発されてきた。これらの多孔質システムの中で、メソポーラスシリカナノ粒子に関して多くの開発が行われてきた。メソポーラスシリカナノ粒子は、良好な生体適合性を有し、かつ、細胞毒性が低いが故に、２０００年代の始めに腫瘍学への利用が提案された（M. Vallet-Regi et al., Chem. Mater., 2001）。このようなナノ粒子の孔は、２００〜１０００ｍ^２・ｇ^−１という特定の表面積において、１０ｎｍ〜１ミクロンの範囲の大きさを有する対象に対して、２〜５０ｎｍの大きさで備えられ得る（Y. Yang, Nanomedicine: NBM, 2016）。しかしながら、５０ｎｍ未満のサイズを有するメソポーラスシリカナノ粒子は、合成が依然として困難であることに加え、凝集する傾向がある（F. Lu et al., Small, 2009）。

【0008】

血管外への移行と、腫瘍中への浸透とを増強させるために、研究者は、次第に、ナノシステムのサイズの減少を重視するようになった（Z. Popovic et al., Angew. Chem. Int. Ed.., 2010）。しかしながら、ナノ粒子のサイズを１０ｎｍより小さいサイズに減少させると、安定的な孔構造を合成することができない。

【0009】

したがって、現時点では、活性物質を送達するための新規なナノベクターを開発する必要性が依然として存在している。当該ナノベクターは、以下の利点の１つ以上を有している：
−活性物質の高い積載量にとって好ましい、非常に高い、表面／体積の比；
−毒性の問題を抑制する、腎臓内での迅速なナノベクターの除去；
−腫瘍の処置のために活性物質を投与した後の、血管外深くへの移行、および、腫瘍内への浸透；
−ｉｎｖｉｖｏにおける、活性物質の迅速かつ効率的な放出；
−ｉｎｖｉｖｏにおける投与後の、イメージング（ＭＩＲ、スキャン、または、シンチグラフィー）によるナノベクターのモニタリングの可能性；
−１つの同じナノ物質に結合した高Ｚ金属キレートの放射線増感作用を用いた放射線治療による、補完的な治癒の実行の可能性。化学療法と放射線療法との併用は、多剤耐性細胞の放射線抵抗性を克服できる可能性を有する。

【0010】

これらの利点、および、他の多くは、本明細書で説明されるナノベクターを使用することによって得られる。

【0011】

〔詳細な説明〕
これに関連して、本発明者らは、実際に薬物送達のための新しいナノベクターを開発する目的で、５ｎｍ未満の流体力学的な直径を有する安定なポリシロキサンナノ粒子の合成に関する最近の戦略を使用することが可能である（例えば、F. Lux et al., Angewandte Chemistry International Edition, 2010）。当該ナノベクターは、ポリシロキサン系の超微細なナノ粒子の表面にて、活性物質の単純な物理吸着によって、積載する。これらの超微細なナノ粒子の大きな表面積／体積の比は、前記ナノベクターが、高い活性表面積載量を得ることを可能にする。

【0012】

有利な一実施形態において、ナノ粒子は、その表面に金属キレートを有し、当該金属キレートは、ナノ粒子に対して、多様な機能、特に造影剤または放射線増感剤としての機能を与える。

【0013】

したがって、本発明は、ヒトまたは動物に活性物質を送達するためのナノベクターを調製する方法であって、前記方法は、ヒトまたは動物に投与することができる以下の２つの溶液を混合する工程を含み、
ナノ粒子を含む第一の溶液であって、当該ナノ粒子は１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子から選択されるナノ粒子である、第一の溶液、
有機化合物から選択される、一種類の活性物質、または複数種類の活性物質の混合物を含む第二の溶液であって、好ましくは、当該活性物質は前記ナノ粒子の重量の２％〜４０％の分子量、好ましくは前記ナノ粒子の重量の５％〜２５％の分子量を有する、第二の溶液、
前記混合する工程は、前記ナノ粒子の表面における前記活性物質の物理的吸着による相互作用を許容する、濃度比、ｐＨおよび温度の条件下で行われる方法、である。

【0014】

本発明の目的において、用語「ナノベクター」は、以下の特徴を有する粒子状の薬学的なシステムを意図する：
−（毒性反応を誘発しない）生体適合性を有する構造体；
−生体から容易に除去される；
−生物学的な標的に対して選択的に活性物質を輸送および放出するための、活性物質の積載量；
−１００ｎｍ未満のサイズ。

【0015】

本明細書において、用語「ナノベクター」は、活性物質が積載されたナノベクターを意図する。

【0016】

〔ナノベクターの調製に使用することができるナノ粒子〕
ナノベクターの調製に使用することができるナノ粒子は、以下の２つの不可欠な特徴を有する：
−ポリシロキサン系である；
−非常に小さい平均直径（例えば、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満である流体力学的な直径）を有する。

【0017】

本発明の目的において、用語「平均直径」は、粒子の直径の調和平均を意図する。ナノ粒子のサイズ分布は、例えば、市販の粒度測定器（例えば、平均流体力学的な直径にて特徴付けられるＰＣＳ（Photon Correlation Spectroscopy）に基づく、ＭａｌｖｅｒｎＺｅｔａＳｉｚｅｒＮａｎｏ-Ｓｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅｒ）を用いて測定される。このパラメータを測定する方法は、規格ＩＳＯ１３３２１：１９９６にも記載されている。

【0018】

用語「ポリシロキサン系ナノ粒子」は、ケイ素の重量比が少なくとも８％以上であることによって特徴付けられるナノ粒子を意図する。

【0019】

用語「ポリシロキサン」は、一連のシロキサンからなる、無機の架橋ポリマーを意図する。

【0020】

同一であってもよく、異なっていてもよいポリシロキサンの構造単位は、以下の化学式にて示される；
Ｓｉ（ＯＳｉ）_ｎＲ_４−ｎ
当該化学式にて、Ｒは、Ｓｉ−Ｃ共有結合によってケイ素に結合する有機分子であり、ｎは、１〜４の整数である。

【0021】

好ましい例として、用語「ポリシロキサン」は、ゾル−ゲル法によって、テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）とアミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）とを縮合させることによって生じる、特定のポリマーを包含する。

【0022】

特定の一実施形態において、ナノベクターの調製に利用できる前記ナノ粒子は、ポリシロキサン、および、任意で金属原子と錯体を形成したキレートに基づく。

【0023】

当該好ましい一実施形態において、前記ナノ粒子は、以下の分子を含む、または、以下の成分のみから構成される：
（ｉ）前記ナノ粒子の全重量の少なくとも８％の重量比のケイ素、好ましくは前記ナノ粒子の全重量の８％〜５０％の重量比のケイ素を含む、ポリシロキサン、
（ｉｉ）ナノ粒子当たり、好ましくは５〜１００の割合、好ましくは５〜２０の割合のキレート剤、
（ｉｉｉ）必要に応じて、例えば、ナノ粒子当たり、好ましくは５〜１００の割合、例えば５〜２０の割合の金属原子であって、前記キレート剤と錯体を形成する金属原子。

【0024】

本明細書の目的において、用語「キレート剤」は、金属カチオンを錯体化することができる有機基を意図する。例えば、特定の一実施形態において、キレート剤は、錯形成定数であるｌｏｇ（Ｋ_ｃ１）が標的である金属カチオンに対して１５よりも大きいキレート剤、好ましくは２０よりも大きいキレート剤から選択される。

【0025】

従って、前記キレート剤の機能は、ナノベクターの任意の無機元素（例えば、金属カチオン）を錯体化すること、および、ナノベクターをヒトまたは動物に投与した後で、当該無機元素が放出されることを減少させること、である。

【0026】

キレート剤は、ナノ粒子上に、以下の産物（ナノ粒子上にグラフト化する前）の１つをグラフト化（共有結合）することによって得られ得る：
（ｉ）ポリアミノポリカルボン酸およびその誘導体、さらに好ましくは、ＤＯＴＡ(１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、下記の化学式（Ｉ）にて示されるＤＯ３Ａ−ピリジン：

【0027】

【化1】

ＥＤＴＡ（２，２’，２’’，２’’’−（エタン−１，２−ジイルジニトリロ）四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＢＡＰＴＡ（１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＰＣＴＡ（３，６，９，１５−テトラアザビシクロ［９．３．１．］ペンタデカ−1（１５），１１，１３−トリエン−３，６，９−三酢酸）、ＤＯＴＡＧＡ（２−（４，７，１０−トリス（カルボキシメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−イル）ペンタン二酸）、下記の化学式（ＩＩ）にて示されるＴＭＰＡＣ：

【0028】

【化2】

および、これらの混合物、
（ｉｉ）ポルフィリン、クロリン、１，１０−フェナントロリン、ビピリジン、テルピリジン、サイクラム、トリアザシクロノナン、これらの誘導体、および、これらの混合物を含む化学基の産物：
および、これらの混合物。

【0029】

好ましくは、前記キレート剤は、共有結合によって、ナノ粒子のポリシロキサンのケイ素に対して、直接的または間接的に結合する。ここで、用語「間接的」な結合は、ナノ粒子とキレート剤との間に、「リンカー」または「スペーサー」として機能する分子が存在することを意図する。当該リンカーまたはスペーサーは、ナノ粒子の構成要素の１つに共有結合する。

【0030】

好ましい一実施形態において、前記キレート剤は、ナノ粒子上にＤＯＴＡＧＡをグラフト化することによって得られる。

【0031】

一実施形態において、前記ナノベクターの調製に使用される前記ナノ粒子は、金属原子を含まない。

【0032】

他の実施形態において、前記ナノ粒子は、イオン状態の金属原子（例えば、カチオン）、または、非イオン状態の金属原子を含んでもよい。

【0033】

前記金属カチオンの例としては、好ましくはキレート剤によって錯体化され得る金属カチオンを選択することができ、より詳しくは、所望の用途に従って、以下から選択することができる：
−アルカリ土類金属カチオン、
−アルカリ金属カチオン、および、その放射性同位体、
−遷移金属カチオン、および、その放射性同位体、
−ポスト遷移金属カチオン、および、その放射性同位体、
−希土類カチオン、および、その放射性同位体、
−上述したものの混合物。

【0034】

他の実施形態において、前記金属原子は、アルカリ土類金属カチオン、特にマグネシウムおよび／またはカルシウムから選択される。

【0035】

特に、所望の用途に応じて、前記金属原子は、大きな原子番号Ｚを有する金属カチオンから選択される。

【0036】

以下において、用語「高Ｚ原子」は、少なくとも、４０よりも大きい原子番号Ｚ、好ましくは５０よりも大きい原子番号を有する原子（イオン状態または非イオン状態の原子）を意図する。

【0037】

大きな原子番号Ｚを有する金属原子は、特に、抗癌物質を送達するためのナノベクターと組み合わせて使用することが有用であり、走査造影剤、または、放射線療法における放射線増感剤として有用である。

【0038】

抗癌物質を送達するためのナノベクターと組み合わせての使用、および、キュリー療法またはシンチグラフィーに利用する場合、前記金属原子はまた、適切な同位体から選択されてもよい。

【0039】

抗癌物質を送達するためのナノベクターと組み合わせての使用、および、磁気共鳴画像法に利用する場合、前記金属原子はまた、適切な磁気特性を有する原子から選択されてもよい。

【0040】

前記遷移金属としては、特に、Ｈｆ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ａｕ、Ｔｃ、Ｙ、Ｍｎ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｚｒ、および、これらの混合物が挙げられる。

【0041】

前記ポスト遷移金属としては、Ｂｉ、Ｇａ、Ｉｎ、および、これらの混合物が挙げられる。

【0042】

前記希土類金属としては、ランタニド（例えば、Ｇｄ、Ｄｙ、Ｅｕ、Ｔｂ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｅｒ、ＨｏおよびＬｕ）、および、ランタニドの混合物が挙げられ、好ましくはＧｄである。

【0043】

Ｇｄ、Ｄｙ、ＭｎおよびＦｅは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の造影剤として、特に有用である。

【0044】

Ｅｕ、Ｔｂ、Ｎｄ、ＹｂおよびＥｒは、イメージングにおける蛍光剤として、特に有用である。

【0045】

Ｈｏ、Ｂｉ、ＹおよびＬｕは、キュリー療法における薬剤として、特に有用である。

【0046】

Ｌｕ、Ｙｂ、Ｇｄ、Ｂｉ、ＨｆおよびＨｏは、放射線増感剤として、特に有用である。

【0047】

Ｃｕ、Ｇａ、Ｔｃ、Ｙ、ＩｎおよびＺｒは、シンチグラフィーにおけるプローブとして、特に有用である。

【0048】

特定の一実施形態において、ナノ粒子１個当たりの高Ｚ原子（例えば、ランタニド、Ｇｄ）の割合は、ナノ粒子１個当たり、５〜１００個の高Ｚ原子、好ましくは５〜２０個の高Ｚ原子である。

【0049】

さらに好ましい実施形態において、ナノ粒子は以下の構成を備える：
−ポリシロキサン、
−前記ポリシロキサンと共有結合した、キレート剤としてのＤＯＴＡＧＡ、
−前記キレート剤と錯体化した、Ｇｄ^３＋カチオン。

【0050】

ポリシロキサンおよび金属原子キレートに基づくナノ粒子は、当業者に周知である。好ましい実施形態は、特にＷＯ２０１１／１３５１０１、ＷＯ２０１３／１５３１９７に記載されている。

【0051】

＜超微細ナノ粒子＞
本明細書に開示されるナノベクターの調製のための特に好ましい実施形態は、「超微細」または「無機コアフリー」と呼ばれるナノ粒子である。当該ナノ粒子は、ポリシロキサンに基づくナノ粒子であって、１０ｎｍ未満、または、５ｎｍ未満の平均直径を有する。

【0052】

これらの超微細ナノ粒子は、特にＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果によって、マルチモダリティの利点、および、腫瘍（表面に標的分子が存在しない腫瘍）のパッシブターゲティングの利点を有する。
したがって、超微細ナノ粒子は、本明細書に開示されるナノベクターの調製に適しており、特に、抗癌治療に利用される抗癌物質と組み合わせられるナノベクター、化学療法に使用されるナノベクター、化学療法と、放射線療法またはキュリー療法から選択される少なくとも一つの別の療法とを組み合わせた療法に使用されるナノベクター、の調製に適している。

【0053】

超微細ナノ粒子は、その小さいサイズに加えて、コア−シェル型の多数のナノ粒子とは対照的に、金属原子をベースとする無機のコアが存在しないことに特徴がある。超微細ナノ粒子は、以下の化学式（Ｉ）によって特徴付けられる：
Ｓｉ_ｎ［Ｏ］_ｍ［ＯＨ］_ｏ［Ｃｈ_１］_ａ［Ｃｈ_２］_ｂ［Ｃｈ_３］_ｃ［Ｍ^ｙ＋］_ｄ［Ｄ^ｚ＋］_ｅ［Ｇｆ］_ｆ（Ｉ）
前記化学式（Ｉ）にて、
ｎは、２０〜５０００、好ましくは２０〜２００であり、
ｍは、ｎよりも大きく、４ｎ未満であり、
Ｏは、０〜２ｎであり、
Ｃｈ_１、Ｃｈ_２、Ｃｈ_３は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい、潜在的なキレート有機基であって、Ｓｉ−Ｃ共有結合にて前記ポリシロキサンのＳｉ原子に結合するキレート剤であり；ａ、ｂ、ｃは、０〜ｎの整数であり、且つ、ａ＋ｂ＋ｃは、ｎ以下、好ましくは５〜１００（例えば、５〜２０）の整数であり、
Ｍ^ｙ＋およびＤ^ｚ＋は、お互いが同じものであってもよく、異なるものであってもよい金属カチオンであって、ｙおよびｚが１〜６である金属カチオンであり；ｄおよびｅは、０〜ａ＋ｂ＋ｃの整数であり、且つ、ｄ＋ｅは、ａ＋ｂ＋ｃ以下であり、
Ｇｆは、お互いが同じものであってもよく、異なるものであってもよい標的グラフトであって、各々がＳｉ−Ｃ結合にて前記Ｓｉ原子に結合し、目的の生物組織、例えば腫瘍組織への前記ナノ粒子の標的化を可能にする標的化分子を結合させる標的グラフトであり；ｆは、０〜ｎの整数である。

【0054】

特定の一実施形態において、超微細ナノ粒子は、以下の化学式（ＩＩ）にて示される：
Ｇｄ_５−２０Ｓｉ_{２０−１００}Ｃ_{１５０−６００}Ｎ_{２５−１５０}Ｏ_{１００−５００}Ｈ_ｘ（ＩＩ）。

【0055】

他の原子の数に依存するＨは、原子分析などによって測定するのが困難である。そのため、数Ｘ（整数）は、化学式（ＩＩ）中に示さない。

【0056】

これらのナノ粒子は、５ｎｍ未満の平均直径を有することが好ましい。

【0057】

便宜上、化学式（Ｉ）または化学式（ＩＩ）で示されるナノ粒子を、以下では「超微細ナノ粒子」と呼ぶ。

【0058】

前記の一般式にて示されるナノ粒子は、以下に記載される方法の一つに従って、有利に調製される。

【0059】

＜超微細ナノ粒子を調製する方法＞
超微細ナノ粒子は、独自の「トップダウン」法によって調製することができ、その必須工程は、以下の通りである：
ａ．金属原子（Ｍ）の酸化物の無機コアを調製する工程であって、任意でドープ剤（Ｄ）をドープする工程：ここで、Ｍは、希土類金属および遷移金属原子から選択されることが好ましく、Ｄは、Ｍとは異なる金属原子であって、希土類金属および／または遷移原子から選択されるものである、
ｂ．ゾル−ゲル縮合によって、前記金属原子（Ｍ）の酸化物のコアの周囲に、ポリシロキサンのシェルを合成する工程、
ｃ．Ｓｉ−Ｃ共有結合によって、前記ポリシロキサン上にキレート剤をグラフト化することによって、コア−シェルナノ粒子前駆体を調製する工程、および、
ｄ．前記コア−シェルナノ粒子前駆体を水溶液に移す工程：ここで、前記キレート剤は、金属原子（Ｍ）の酸化物の無機コアの溶解を誘導し、かつ、金属原子（Ｍ）と錯体を形成し、必要に応じてドープ剤（Ｄ）とも錯体を形成するのに十分な量である。

【0060】

前記無機コアの溶解は、最終的なナノ粒子の直径を、ナノ粒子前駆体と比較して減少させ、その結果、超微細ナノ粒子の最終的な平均直径は、１〜５ｎｍとなる。

【0061】

実際には、前記プロセスは、以下の方法にて実施される。

【0062】

金属原子の酸化物（例えば、希土類酸化物）のコアを有するコア−シェル型のナノ粒子前駆体は、ゾル−ゲル合成によってポリシロキサンシェルで修飾されたポリオール経路を介して調製され、この生成物は、例えば５〜１０ｎｍのサイズを有する。

【0063】

より具体的に、非常に小さいサイズの金属原子の酸化物の無機コア（調整可能、１０ｎｍ未満に調整可能）は、刊行物（P. Perriat et al., J. Coll. Int. Sci, 2004, 273, 191; O. Tillement et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5076 and P. Perriat et al., J. Phys. Chem. C, 2009, 113, 4038）に記載される方法のうちの１つによって、アルコール中で製造され得る。無機コアを合成する工程の後、これらの無機コアは、例えば、刊行物（C. Louis et al., Chem. Mat., 2005, 17, 1673 and O. Tillement et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 5076）に記載される手順に従って、ポリシロキサンの層によってコーティングされ得る。

【0064】

次に、標的である金属原子に特異的なキレート剤を、前記ポリシロキサンの表面にグラフト化させる。当該キレート剤の一部は、当該層の内部に挿入され得るが、ポリシロキサンの構造の制御は複雑であって、非常に小さなサイズにおける、単純な外部のグラフト化は、十分なグラフト化率を提供する。

【0065】

次に、前記ナノ粒子は、適切な大きさの細孔を備える膜を用いた、透析法またはタンジェンシャルフィルトレーションによって、合成残留物から分離され得る。

【0066】

続く工程にて、前記無機コアは、水性溶媒中に移された後、溶解することによって（例えば、ｐＨを変更することによって、または、溶液中にキレート剤を導入することによって）、破壊される。次に、無機コアが破壊されることにより、（遅い浸食または崩壊のメカニズムに従って）、ポリシロキサン層の散乱が可能になる。これによって、最終的に、超微細ナノ粒子（換言すれば、複雑な形態のポリシロキサン物）が得られる。当該超微細ナノ粒子の特徴的な寸法は、最初のポリシロキサン層の厚さによって決まる。

【0067】

超微細ナノ粒子は、多量のキレート剤、および、金属原子を有している。その理由は、超微細ナノ粒子は、ポリシロキサンの表面にて、非常に小さなサイズにて、最初にグラフト化され、当該表面は、粒子の中の非常に多くの割合を占め、体積に対する表面の比率は、1／ｒ（半径）の関数として変化するからである。この構造が崩壊する間、新しく形成される「新鮮な」表面に対して、飽和状態以下の状態にまで、他の錯体が結合してもよい。このようにして得られる錯体化剤の含有量は、微細なケイ素粒子の表面を従来の方法によって機能化させることによって得られる錯体化剤の含有量よりも、このような粒子の利用可能性の条件の下で、はるかに高い。特に、ナノ粒子に対するキレート剤の割合は、５〜１００であり得、好ましくは５〜２０分子であり得る。

【0068】

このようにコアを除去することによって、略５ｎｍ以上である平均粒子径を、５ｎｍ未満に低下させることができる。更に、この操作によって、表面にのみ金属原子Ｍ（例えば、ガドリニウム）を含む、同じサイズの理論上のポリシロキサンナノ粒子と比較して、１ｎｍ^３あたりのＭ（例えば、ガドリニウム）の数を増やすことができる。

【0069】

ナノ粒子のサイズに対する金属原子Ｍの数は、ＥＤＸまたは元素分析によって測定される、Ｍ／Ｓｉ原子比によって評価され得る。ナノ粒子のサイズに対する金属原子Ｍの数は、一般的に、ナノ粒子当たりのキレート剤の数と実質的に同じであり、例えば５〜１００、好ましくは５〜２０である。

【0070】

これらの超微細ナノ粒子に関するさらなる詳細、それらを合成するための方法、および、それらの利用は、参照として組み込まれる、特許出願ＷＯ２０１１／１３５１０、および、「Mignot et al., 2013, Chem. Eur. J. 2013, 19, 6122-6136」に記載されている。

【0071】

＜“ワン・ポット”によるナノ粒子の合成＞
別の実施形態によれば、１０ｎｍ未満の直径の孔を有し、かつ、ポリシロキサンを含む、無機コアを含まない超微細ナノ粒子（適切な場合、金属原子キレート剤を含む）を、以下の方法によって調製することができる。

【0072】

“ワン・ポット”合成法では、（ｉ）生理的なｐＨにて負に帯電した少なくとも一つのシランと、（ｉｉ）生理的なｐＨにて中性である少なくとも一つのシラン、および／または、生理的なｐＨにて正に帯電した少なくとも一つのシランとが混合され、
ここで、
−負に帯電したシランの数に対する中性のシランの数のモル比Ａは、０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２であり；
−負に帯電したシランの数に対する正に帯電したシランの数のモル比Ｂは、０．２５≦Ｂ≦３、好ましくは０．５≦Ｂ≦２であり；
−負に帯電したシランの数に対する、正に帯電したシランの数、または、中性のシランの数のモル比Ｃは、０≦Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４である。

【0073】

前記ナノ粒子は、追加の分子（例えば、キレート剤、または、標的化グラフト）を含み得る。

【0074】

用語「生理的なｐＨ」は、ｐＨ７．４を意図する。

【0075】

用語「シラン」は、４つの置換基によって囲まれたケイ素原子を含む化合物を意図する。

【0076】

好ましい実施形態において、前記シランは、アルコキシシラン、ヒドロキシシラン、および、これらの混合物から選択される。以下の例は、この実施形態で使用することができるシランの例である：テトラエチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣ_２Ｈ_５）_４、ＴＥＯＳとしても知られる）、テトラメチルオルトシリケート（Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_４、ＴＭＯＳとしても知られる）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_３−Ｓｉ（ＯＣ_２Ｈ_５）_３、ＡＰＴＥＳとしても知られる）、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン酢酸三ナトリウム塩（（ＣＨ_３Ｏ）_３Ｓｉ−（ＣＨ_２）_３Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＮａ）（ＣＨ_２）_２Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＮａ）_２、ＴＡＮＥＤとしても知られる）、および、カルボキシエチルシラネトリオールナトリウム塩、（（ＨＯ）_３Ｓｉ−（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＮａ、ＣＥＳＴとしても知られる）。

【0077】

本明細書において、用語「シラン」は、キレートされた金属カチオンを含むシラン化合物をも包含する。また、本明細書において、用語「シラン」は、後述する任意の標的化剤をシラン前駆体に対して共有結合にてグラフト化した化合物をも包含する。

【0078】

本明細書において、用語「アルコキシシラン」は、化学式（ＩＩＩ）にて示される化合物を意図する：
Ｒ_ｎＳｉ（ＯＲ_ｉ）_４−ｎ（ＩＩＩ）
化学式（ＩＩＩ）中で、
−Ｒは、有機基であり、
−Ｒ_ｉは、１〜１２個の炭素、好ましくは１〜６個の炭素を含むアルキル基であり、
−ｎは、０、１、２または３に等しい。

【0079】

特定の一実施形態において、ｎは、０または１に等しい。

【0080】

本明細書において、用語「ヒドロキシシラン」は、化学式（ＩＶ）にて示される化合物を意図する：
Ｒ_ｎＳｉ（ＯＨ）_４−ｎ（ＩＶ）
化学式（ＩＶ）中で、
−Ｒは、有機基であり、
−ｎは、０、１、２または３に等しい。

【0081】

特定の一実施形態において、ｎは、０または１に等しい。

【0082】

本明細書において、用語「有機基」は、Ｓｉ−Ｃ結合によってケイ素原子に結合している官能基に限定されず、任意の有機基を意図する。有機基としては、例えばアルキルアミンが挙げられるが、これに限定されない。

【0083】

本明細書において、用語「アルキル基」は、直鎖アルキル基、または、架橋アルキル基を意図する。アルキル基としては、好ましくは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、t−ブチル、ペンチルおよびその異性体（すなわち、ｎ−ペンチルおよびイソペンチル）、および、ヘキシルおよびその異性体（すなわち、ｎ−ヘキシルおよびイソヘキシル）が挙げられる。

【0084】

好ましい一実施形態によれば、調製される前記ナノ粒子は、０．５〜１５ｎｍ、好ましくは０．５〜１０ｎｍの平均直径を有する。

【0085】

特定のいくつかの実施形態において、前記シラン（アルコキシシラン、ヒドロキシシラン、および、これらの混合物から選択される）は、試薬の合計重量の少なくとも８０％、少なくとも８５％、または、少なくとも９０％の割合で含まれてもよい。当該試薬とは、ナノ粒子の合成に使用される、初発の化合物を意図する。

【0086】

前記反応は、プロトン性の溶媒（例えば、アルコール、または、水性の溶液など）中で実施され得る。特定の一実施形態において、唯一の溶媒として、水を使用する。他の実施形態において、反応は、アルコール中、または、アルコールの混合物中で行われる。この実施形態に使用され得るアルコールとしては、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、エチレングリコール、および、ジエチレングリコールを挙げることができる。

【0087】

前記反応は、好ましくは、コロイド溶液中で実施される。当該コロイド溶液は、ナノ粒子のサイズのより良い制御を可能とする。したがって、前記反応は、架橋ゲルの形成を避けるための、従来のゾル−ゲル法によって行われることはない。

【0088】

この方法の利点の一つは、「ワン・ポット」反応によって実施され得ることであり、中間生成物を精製および単離する工程を回避できことである。

【0089】

利点の一つは、特定の比Ａ、ＢおよびＣを選択することによって、ケイ素粒子の表面電荷およびサイズの制御を可能にすることであり、特に０．５〜１５ｎｍの流体力学的な直径を有するナノ粒子の調製を可能にすることである。特に、ナノ粒子のサイズを１０ｎｍより小さく低減するためには、例えば２より小さい比、より好ましくは１．５より小さい比であることが好ましい。

【0090】

特定の一実施形態において、混合する工程は、少なくとも一つの正に帯電したシランを含む。当該正に帯電したシランは、少なくとも一つの正に帯電したアミン官能基を含む。ＡＰＴＥＳは、正に帯電したアミン官能基を含むシランの例である。

【0091】

一実施形態において、前記反応は、（ｉ）生理的なｐＨにて負に帯電し、かつ、少なくとも一つのキレート剤を含む、少なくとも一つのヒドロキシシランまたはアルコキシシランの混合物と、（ｉｉ）以下の構成と、を含み：
−生理的なｐＨにて中性である、少なくとも一つのヒドロキシシランまたはアルコキシシラン、および／または、
−生理的なｐＨにて正に帯電し、かつ、アミン官能基を含む、少なくとも一つのヒドロキシシランまたはアルコキシシラン、
ここで、
−負に帯電したシランの数に対する中性のシランの数のモル比Ａは、０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２であり；
−負に帯電したシランの数に対する正に帯電したシランの数のモル比Ｂは、０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦４であり；
−負に帯電したシランの数に対する、正に帯電したシランの数、または、中性のシランの数のモル比Ｃは、０≦Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４である。

【0092】

特定の一実施形態において、前記合成は、（ｉ）生理的なｐＨで負に帯電した少なくとも一つのアルコキシシランの混合物であって、当該アルコキシシランは、ＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡ、ＴＡＮＥＤ、ＣＥＳＴ、および、これらの混合物から選択される、混合物と、（ｉｉ）以下の構成と、を含み：
−生理的なｐＨにて中性である少なくとも一つのアルコキシシランであって、ＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、および、これらの混合物から選択されるアルコキシシラン、および／または、
−生理的なｐＨにて正に帯電するＡＰＴＥＳ、
ここで、
−負に帯電したシランの数に対する中性のシランの数のモル比Ａは、０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２であり；
−負に帯電したシランの数に対する正に帯電したシランの数のモル比Ｂは、０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦４であり；
−負に帯電したシランの数に対する、正に帯電したシランの数、または、中性のシランの数のモル比Ｃは、０≦Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４である。

【0093】

特定の一実施形態において、前記合成は、（ｉ）生理的なｐＨで負に帯電したＡＰＴＥＳ−ＤＯＴＡＧＡの混合物と、（ｉｉ）以下の構成と、を含み：
−生理的なｐＨにて中性である少なくとも一つのアルコキシシランであって、ＴＭＯＳ、ＴＥＯＳ、および、これらの混合物から選択されるアルコキシシラン、および／または、
−生理的なｐＨにて正に帯電するＡＰＴＥＳ、
ここで、
−負に帯電したシランの数に対する中性のシランの数のモル比Ａは、０≦Ａ≦６、好ましくは０．５≦Ａ≦２であり；
−負に帯電したシランの数に対する正に帯電したシランの数のモル比Ｂは、０≦Ｂ≦５、好ましくは０．２５≦Ｂ≦４であり；
−負に帯電したシランの数に対する、正に帯電したシランの数、または、中性のシランの数のモル比Ｃは、０≦Ｃ≦８、好ましくは１≦Ｃ≦４である。

【0094】

＜標的化分子＞
ナノ粒子は、また、ナノ粒子のケイ素に対して直接的または間接的に共有結合する標的化剤を含んでいてもよい。標的化剤の例については後述する。標的化剤は、ナノ粒子の表面上にグラフト化され、ナノ粒子当たり、１〜２０個の標的化剤、好ましくは１〜５個の標的化剤の割合で存在する。

【0095】

標的化分子を表面にグラフト化するために、存在する官能基との従来のカップリングを使用することができ、任意で、活性化工程が先に行われ得る。カップリング反応は当業者に公知であり、ナノ粒子の表層の構造、および、標的化分子の官能基にしたがって、カップリング反応が選択される。例えば、「“Bioconjugate Techniques”, G.T Hermanson, Academic Press, 1996, in “Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity”, Second Edition, W.T. Mason, ed. Academic Press, 1999」を参照。好ましいカップリング法については後述する。これらの標的化分子は、前節で説明した「コアフリー」超微細ナノ粒子バリアントによるナノ粒子のキレート剤に対してグラフト化されることが好ましい。

【0096】

前記標的化分子は、想定する用途に従って、選択される。

【0097】

特定の一実施形態において、腫瘍のアクティブな標的化に適した分子が選択される。ナノ粒子上にグラフト化され得る標的化分子の例として、αｖβ３インテグリンを認識することができるＲＧＤトリペプチドを含有する分子を挙げることができる。このようなペプチドおよびその誘導体（特に、環状ペンタペプチド）は、特に、ＷＯ２００４／０２６８９４に記載されている。

【0098】

腫瘍組織の標的化に適した標的化分子は、例えば国際公開ＷＯ０１／００６２１に記載されており、当該標的化分子として、４級アンモニウム誘導体、アプタマー、ポリペプチド、抗体などが挙げられる。

【0099】

〔ナノベクターの調製に使用できる活性物質〕
本発明の目的において、用語「活性物質」は、以下を意図する：
（ｉ）ヒトまたは動物の疾患に関して、治癒的特性または予防的特性を有する、あらゆる物質、
（ｉｉ）薬理学的作用、免疫学的作用または代謝作用によって、生理機能を回復、修正または変えることを目的として、ヒトまたは動物に使用し得る、または、ヒトまたは動物に投与し得る、あらゆる物質。

【0100】

本明細書に開示されたナノベクターの調製に使用され得る活性物質は、有機分子であることが好ましい。

【0101】

本明細書において、用語「有機分子」は、本質的に以下の元素：Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓから構成される分子を意図する。前記有機分子は、生物由来のものであっても、合成由来のものであってもよい。用語「有機分子」はまた、本発明の目的のために、金属（特に、Ｐｔ、Ｔｉ、Ｒｕ、ＡｕおよびＲｈから選択される金属）をキレートする有機化合物を包含する。

【0102】

特に、ナノベクターの調製に使用され得る活性物質は、ナノ粒子の重量の２％〜４０％の分子量を、好ましくはナノ粒子の重量の５％〜２５％の分子量を有する有機分子から選択される。

【0103】

特定の一実施形態において、ナノベクターの調製に使用され得る活性物質は、最大５０００ｇ・ｍｏｌ^−１の分子量、好ましくは、１００〜２０００ｇ・ｍｏｌ^−１の分子量（以下では小分子と呼ぶ）を有する有機分子である。

【0104】

他の実施形態において、前記活性物質は、核酸であり、特に、オリゴヌクレオチド、リボ核酸（ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、または、ｉＲＮＡ(ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ)である。

【0105】

他の実施形態において、前記活性物質は、最大で５０アミノ酸のペプチドであり、例えば５〜３０アミノ酸のペプチドである。

【0106】

特定の一実施形態において、前記活性物質は、抗癌物質から選択される。

【0107】

抗癌物質の例としては、アクチノマイシン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、ダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン．レナリドミド、イブルチニブ、アビラテロン、エルロチニブ、エベロリムス、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ゴセレリン、ネダプラチン、ラボプラチンおよびヘプタプラチン、または、これらの混合物が挙げられる。

【0108】

特定の一実施形態において、前記活性物質は、ドキソルビシン、ＴＡＴＥペプチドおよびシスプラチン、または、これらの混合物から選択される。

【0109】

〔本発明に係るナノベクターの調製〕
本発明に係るナノベクターを調製する方法は、ヒトまたは動物に投与することができる以下の２つの溶液を混合する工程を含み、
１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子を含む第一の溶液、および、
活性物質または活性物質の混合物を含む第二の溶液、
前記混合する工程は、前記ナノ粒子の表面における前記活性物質の物理的吸着による相互作用を許容する、濃度比、ｐＨおよび温度の条件下で行われる、方法である。

【0110】

本開示の目的において、用語「物理的吸着による相互作用」は、リガンド／レセプター型の特異的なタンパク質／タンパク質の相互作用、抗原／抗体の相互作用、および、他の分子に特異的な分子の相互作用などを除く、ファンデルワールス力による相互作用を意図する。

【0111】

ナノベクターの調製に使用され得るナノ粒子および活性物質、および、その好ましい実施形態は、前節に記載されている。

【0112】

本開示の目的おいて、積載量は、ナノ粒子１グラム当たりのｍｇ量で表される、ナノベクターに連結された活性物質の量に相当する。

【0113】

特定の一実施形態において、［前記第二の溶液中の活性物質］：［前記第一の溶液中のナノ粒子］にて示される、重量に基づく濃度比は、ナノ粒子における活性物質の積載量が、０．５ｍｇ／ｇよりも大きく、好ましくは１ｍｇ／ｇよりも大きくなるように決定される。前記積載量は、例えば、１ｍｇ／ｇ〜１００ｍｇ／ｇである。

【0114】

当業者は、ナノ粒子の構造および選択された活性物質に応じて、特に活性物質の積載量を最適化するために、最適な濃度比、ｐＨおよび温度を容易に決定することができる。

【0115】

特定の一実施形態において、第一の溶液は、ナノ粒子（例えば、超微細ナノ粒子）の濃度が５〜５００ｇ・Ｌ^−１であり、ｐＨが６〜８である、コロイド水溶液である。

【0116】

上述した実施形態と優先的に組み合わせられ得る特定の一実施形態において、第二の溶液は、活性物質の濃度が１ｍｇ・Ｌ^−１〜１０ｇ・Ｌ^−１であり、ｐＨが６〜８である、水溶液である。

【0117】

発明者らは、二つの溶液の単純な混合によって、活性物質が、物理的吸着によってポリシロキサン系ナノ粒子の表面に連結され得ることを実証した。

【0118】

したがって、対象へ投与する前に、混合する工程後に得られたナノベクターを精製する必要がない、という利点がある。

【0119】

しかしながら、必要であれば、溶液を混合する工程後に得られたナノベクターを精製する工程を行ってもよい。精製する工程を行えば、溶液中に遊離したまま残存している可能性がある活性物質を除去し、表面に物理的吸着によって活性物質が結合したナノ粒子を含むナノベクターを回収することができる。

【0120】

〔ヒトに活性物質を送達するためのナノベクター〕
したがって、本発明は、ヒトに活性物質を送達するためのナノベクターに関する。当該ナノベクターは、物理的吸着によって活性物質が表面に結合したナノ粒子を含み、当該ナノ粒子は、１０ｎｍ未満、好ましくは５ｎｍ未満の平均直径を有するポリシロキサン系ナノ粒子から選択され、前記活性物質は、前記ナノ粒子の重量の２％〜４０％の分子量、好ましくは前記ナノ粒子の重量の５％〜２５％の分子量を有する有機分子から選択される。

【0121】

このようなナノベクターは、上述した２つの溶液を混合する単純な手法によって、直接的または間接的に調製され得る。

【0122】

特定の一実施形態において、前記ナノベクターは、以下の構成を含む：
（ｉ）本質的に以下のａ〜ｃの要素からなるナノ粒子：および、
ａ．ケイ素の重量比が８％〜５０％であるポリシロキサン、
ｂ．ナノ粒子当たり、好ましくは５〜１００の割合、より好ましくは５〜２０の割合のキレート剤、
ｃ．必要に応じて、好ましくは５〜１００の割合、より好ましくは５〜２０の割合の金属原子（例えば、ＧｄまたはＢｉ）であって、前記キレート剤と錯体を形成する金属原子、
（ｉｉ）物理的吸着によって前記ナノ粒子の表面に結合した活性物質。

【0123】

上述した実施形態のより好ましい一実施形態において、ナノ粒子は、上述した超微細ナノ粒子である。超微細ナノ粒子を使用する更に具体的な一実施形態において、超微細ナノ粒子は、（ａ）当該超微細ナノ粒子の表面にグラフト化された、キレート剤としてのＤＯＴＡＧＡ、および、（ｂ）当該ＤＯＴＡＧＡと錯体を形成する金属原子である、ＧｄまたはＢｉ、を含む。

【0124】

〔ナノベクターを含む薬学的組成物〕
上述したナノベクターは、有利には、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共にヒトへ投与するために処方される。

【0125】

したがって、本発明は、本発明に係るナノベクター、および、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物に関する。

【0126】

特に、前記薬学的組成物は、前記ナノベクター、および、有効量の活性物質を含む少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、注射用医薬溶液である。

【0127】

薬学的に許容される賦形剤は、ヒトまたは動物に投与することができる任意の成分であって、生体内で活性物質の生物学的活性を実質的に改変しない任意の成分、を含んでいてもよい。そのような成分は、特に、参照する「Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company」に記載されている。

【0128】

特定の一実施形態において、注射用医薬溶液は、ナノベクターが金属原子（好ましくは、ビスマス、または、ガドリニウム）を含み、当該金属原子の濃度が５〜２００ｍＭであること、によって特徴付けられる。

【0129】

上述した実施形態と組み合わされ得る一実施形態において、注射用医薬溶液は、ナノベクターが抗癌活性物質を含むこと、によって特徴付けられる。

【0130】

上述した実施形態と組み合わされ得る特定の一実施形態において、ナノベクターの活性物質は、ドキソルビシン、シスプラチンおよびＴＡＴＥペプチドから選択される。

【0131】

有利なことに、注射用医薬溶液は、上述したように、後続する精製工程を行うこと無く、ナノベクターを調製するための２つの溶液を混合する工程によって直接調製される。注射用医薬溶液は、前もって調製されて、患者へ投与するまで保存しておくことが可能であり、または、投与の直前（例えば、患者へ投与する前の、４時間未満の時、３時間未満の時、１時間未満の時、３０分未満の時、または、１５分未満の時）に２つの溶液を混合して調製することもできる。

【0132】

したがって、本発明は、前記ナノベクターまたは前記注射用医薬溶液を調製するためのキットに関する。当該キットは、少なくとも二つの分離された容器を備えている。一方の容器は、ナノ粒子を含む第一の溶液を含み、当該第一の溶液は、すぐに混合可能な形態、または、濃縮された形態になっている。他方の容器は、活性物質（複数の活性物質）を含む第二の溶液を含んでいる。適切な場合には、前記溶液の一方または両方を、混合に適した水溶液を得るために希釈溶液中に希釈されるように準備された凍結乾燥物に置き換えてもよい。また、キットに任意に備えられる前記希釈溶液は、ヒトへの投与の観点から、緩衝剤、または、他の薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい。

【0133】

〔本発明のナノベクターおよび注射用医薬溶液の使用〕
前記ナノ粒子の、特に腫瘍に対する、パッシブターゲティングの特性によって、上述したナノベクターおよび注射用溶液は、ヒトまたは動物の癌の処置に特に有用である。前記活性物質は、抗癌物質、特に細胞毒性物質から選択される。

【0134】

ポリシロキサン系ナノ粒子（特に、超微細ナノ粒子）による腫瘍のパッシブターゲティングは、Detappe et al., Nano Letters 2017；C. Verry et al., Nanomedicine, 2016；Dufort et al., Small 2015 Bianchi et al., PNAS, 2014に記載されている。

【0135】

したがって、本開示は、患者の癌を治療するための方法についても、目的とする。当該方法は、患者へナノベクターを投与することを含み、当該ナノベクターは、癌を処置するための活性物質として、有効量の抗癌物質を含んでいる。

【0136】

抗癌物質の例は、前項に記載されている。

【0137】

本開示のナノベクターは、固形癌（特に、中枢神経系、肺、前立腺、子宮、結腸、膵臓、肝臓、腎臓、胸部、頭部、および頚部における癌、または、他の大腸癌）の化学療法による処置において、特に有用である。もちろん、標的は、このリストに限定されるものではない。

【0138】

ナノベクターは、大きな積載量の活性物質に加えて、金属カチオンのキレートの形態にて、大きな積載量の放射線増感剤も含むことができる。したがって、特定の一実施形態において、癌の処置に使用されるナノベクターは、放射線増感効果を有し、原子番号が４０を超える元素のキレートを含むナノ粒子（好ましくは、上述した超微細ナノ粒子）を含む。さらに、前記ナノベクターは、当該ナノベクターの有効量の処置対象への投与が、化学療法および放射線治療の効果を組み合わせた癌の処置を可能にする。

【0139】

多くの臨床前モデルのポリシロキサン系超微細ナノ粒子について言及され、かつ、文献（Detappe et al., Nano Letters 2017；C. Verry et al., Nanomedicine, 2016；Dufort et al., Small 2015; Bianchi et al., PNAS, 2014）に記載されるように、ナノ粒子上への活性物質の物理的吸着により、当該活性物質は、ＥＰＲ効果によって、薬物動態の改善、および、特に良好な腫瘍の標的化を有利に示す。

【0140】

本開示に係るナノベクター（または、注射用溶液）は、好ましくは、静脈内、腫瘍内、腹腔内、動脈内、または、気道（例えば、鼻腔内または気管内）を介して投与することができる。より詳しくは、国際公開第２０１３／１５３１９７号に記載されているように、投与することができる。

【0141】

ナノベクターはまた、金属原子のキレート（造影剤（特に、ＭＲＩ、スキャン又はシンチグラフィーにおける造影剤）として使用される）を含むナノ粒子を選択することによって、放射線治療による処置を可能にする。

【0142】

したがって、磁気共鳴画像法、スキャンまたはシンチグラフィーによるイメージングのための造影剤を含むナノ粒子を含むナノベクターを用いる特定の一実施形態であって、処置対象へ当該ナノベクターの有効量を投与する特定の一実施形態では、処置の治癒作用のモニタリングが可能になる。

【0143】

本発明はまた、ヒトまたは動物における治療的な処置の治療効果をモニターする方法に関し、当該方法は、下記の工程を含む：
（ｉ）処置の開始時に、前記に定義したナノベクターであって、有効量の造影剤、および、有効量の活性物質を含むナノベクターを患者に投与する工程、
（ｉｉ）前記造影剤によって病変を可視化するための適切なイメージング技術によって、イメージを取得する工程、
（ｉｉｉ）患者を処置する間に、必要に応じて必要な回数だけ、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）を繰り返す工程、
（ｉｖ）処置する間に、病変の進行を比較することによって、処置の治療効果を推定する工程。

【0144】

この方法の具体的な利用は、ヒトまたは動物における処置（例えば、腫瘍に対する処置、例えば、化学療法、放射線療法、キュリー療法、光線療法、または、温熱療法を用いた固形癌に対する処置）の治療効果のモニタリングに関する。

【0145】

好ましい一実施形態において、本発明は、ヒトまたは動物における腫瘍に対する処置（特に、固形癌に対する化学療法を用いた処置であって、適切な場合には、放射線療法、キュリー療法、光線療法、または、温熱療法と組み合わされる処置）の治療効果をモニタリングする方法を目的としており、当該方法は、以下の工程を含む：
（ｉ）処置の開始時に、前記に定義したナノベクター（好ましくは、超微細ナノ粒子に基づくナノベクター）であって、有効量の造影剤、および、有効量の抗癌物質を含むナノベクターを、固形癌を伴う癌を患う患者に投与する工程、
（ｉｉ）腫瘍を検出するための適切なイメージング技術によって、イメージを取得する工程、
（ｉｉｉ）患者を処置する間に、適切に、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）を繰り返す工程、
（ｉｖ）処置する間に得られた腫瘍のイメージを比較することによって、抗癌物質の治療効果をモニターする工程。

【0146】

従って、前記方法によれば、腫瘍の進展（特に、腫瘍の大きさの経時的変化、腫瘍の数、および、腫瘍の分布）を、患者の処置前、処置中および処置後にモニターすることが可能である。

【0147】

有利には、上述した方法において、ナノベクターは、（ｉ）有効量の腫瘍に対する活性物質、適切な場合には、（ｉｉ）腫瘍を処置するための、有効量の放射線増感剤、光増感剤または放射性薬剤、および／または、（ｉｉｉ）有効量の造影剤を、同時に含むことができる。

【0148】

したがって、上述した方法における特定の一実施形態において、造影剤として使用されるナノ粒子は、放射線増感剤として使用されるものと同様である。

【0149】

他の使用および実施形態もまた、後述する実施例にて説明される。

【0150】

〔図面の説明〕
図１：ナノベクター上での物理的吸着の一般的な原理を示す。ナノ粒子に対して、活性物質が添加される。ステップ１：活性物質は、ナノ粒子の表面にて物理的吸着によって相互作用する。ステップ２：活性物質は、ナノ粒子の相互作用領域を飽和させる。ステップ３：活性物質は、もはやナノ粒子の表面と相互作用することができず、溶液中に遊離したまま残る。

【0151】

図２：ポリシロキサン系ナノ粒子の存在下に配置された薬物の濃度の関数である、浮上分離液中の活性種の濃度の変化を表す曲線である。

【0152】

図３：実施例１および２の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0153】

図４：実施例３および４の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0154】

図５：１００ｍＭのＡＧｕＩＸ存在下におけるドキソルビシン溶液の浮上分離液に関する、導入されたドキソルビシンの量の関数としての、波長４９７ｎｍにおける吸光度を示す。

【0155】

図６：２０倍に希釈された実施例６および７の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0156】

図７：２０倍に希釈された実施例９および１０の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0157】

図８：２０倍に希釈された実施例８の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0158】

図９：２０倍に希釈された実施例６および７の浮上分離液の蛍光スペクトルである。

【0159】

図１０：２０倍に希釈された実施例９および１０の浮上分離液の蛍光スペクトルである。

【0160】

図１１：２０倍に希釈された実施例８の浮上分離液の蛍光スペクトルである。

【0161】

図１２：１００ｍＭのＡＧｕＩＸ存在下におけるＴＡＴＥペプチド溶液（２０倍希釈）の浮上分離液に関する、導入されたＴＡＴＥペプチドの量の関数としての、波長２８０ｎｍにおける吸光度を示す。

【0162】

図１３：実施例に記載した処理後における、実施例１２、１３および１４の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0163】

図１４：実施例に記載した処理後における、実施例１５および１６の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0164】

図１５：実施例に記載した処理後における、実施例１７および１８の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0165】

図１６：１００ｍＭのＡＧｕＩＸ（登録商標）存在下におけるシスプラチン溶液の浮上分離液に関する、導入されたシスプラチンの量の関数としての、波長７０６ｎｍにおける吸光度を示す。光吸収によるシスプラチンの検出を可能にするために、予め、実施例に記載した処理を浮上分離液に対して施した。

【0166】

図１７：前記の実施例に記載した処理後における、実施例１８および１９の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0167】

図１８：実施例に記載した処理後における、実施例１８および２０の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【0168】

〔実施例〕
以下の実施例は、本発明を説明することを可能にするが、本発明を限定するものではない。

【0169】

以下に示す種々の実施例は、化学療法に使用される分子の輸送体として機能するポリシロキサン系ナノ粒子の可能性を説明することを目的とする。図１に示されたメカニズムに従って、意図する分子が、ナノ粒子の表面に吸着する。後述する例では、ナノ粒子の表面にこれ以上分子が保持されなくなる薬物の限界濃度を決定することも可能である。

【0170】

様々な実施例にて、問題とするナノ粒子を臨床試験するときに採用される濃度に当該ナノ粒子の濃度を設定したときにおける、ポリシロキサン系ナノ粒子の薬物の最大積載量を決定した。活性物質の濃度を増加させながら、当該活性物質をナノ粒子と接触させた。溶液を、タンジェンシャルフィルトレーションによって精製した。ナノ粒子の表面に吸着することができなかった分子は、膜を通過し、浮上分離液中に見いだされた。ここで、ＵＶ／可視吸収または蛍光分光法などの分光技術によって、ナノ粒子の表面に吸着することができなかった分子を検出できる（図２）。

【0171】

〔ポリシロキサン系超微細ナノ粒子溶液の調製〕
刊行物「G. Le Duc et al., Cancer Nanotechnology, 2014」に記載の方法に従って、ポリシロキサン系超微細ナノ粒子（ＡＧｕＩＸ（登録商標））の溶液を調製した。

【0172】

１０ｍＭの濃度のガドリニウムを含むＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を、６３３ｎｍのレーザーを用いたＤＬＳによって分析した。数平均流体力学的直径は、３．２ｎｍであった。

【0173】

〔ドキソルビシンを送達するためのナノベクター〕
＜実施例１＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）ナノ粒子を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。２．８５ｍｇのドキソルビシンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．１ｍｌの超純水を加え、ドキソルビシンが完全に溶解するまで攪拌した。２．６ｇ／ｌにてドキソルビシンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該ドキソルビシンの溶液２１５μｌと、超純水１６０μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１１２ｍｇ／ｌのドキソルビシンを含む溶液を調製した。

【0174】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、２００μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析によって、浮上分離液を分析した。前記上清を５０倍に希釈して、紫外線−可視光分析による分析を行った。

【0175】

＜実施例２（比較）＞
１１２ｍｇ／ｌのドキソルビシンの溶液を実施例１に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0176】

＜実施例３＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）ナノ粒子を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。２．８５ｍｇのドキソルビシンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．１ｍｌの超純水を加え、ドキソルビシンが完全に溶解するまで攪拌した。２．６ｇ／ｌにてドキソルビシンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該ドキソルビシンの溶液３２７μｌと、超純水４８μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１７０ｍｇ／ｌのドキソルビシンを含む溶液を調製した。

【0177】

【0178】

＜実施例４（比較）＞
１７０ｍｇ／ｌのドキソルビシンの溶液を実施例３に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0179】

＜実施例１／２および実施例３／４の比較結果＞
図３および図４は、それぞれ、実施例１および２の溶液の浮上分離液の吸収スペクトル、および、実施例３および４の溶液の浮上分離液の吸収スペクトルである。これらのデータは、ドキソルビシンがＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子と相互作用していることを示している。実際に、１００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）のＡＧｕＩＸ（登録商標）および１１２ｍｇ／ｌのドキソルビシンを含む溶液では、ドキソルビシンは、ナノ粒子の表面に吸着されて、ドキソルビシンのみを含む溶液とは対照的に、タンジェンシャルフィルトレーション後の浮上分離液中に検出されない。１００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）のＡＧｕＩＸ（登録商標）および１７０ｍｇ／ｌのドキソルビシンを含む溶液では、紫外線−可視光分光分析によって、非常に弱いシグナルが検出された。このことは、ドキソルビシンの大部分がナノ粒子の表面に吸着されたこと、および、ドキソルビシンの少量が膜を通過したこと、を示している。

【0180】

実施例３で得られた溶液（１００ｍＭ［Ｇｄ^３＋］のＡＧｕＩＸ（登録商標）および１７０ｍｇ／ｌのドキソルビシン）を５０倍に希釈し、６３３ｎｍのレーザーを用いたＤＬＳによって分析した。数平均流体力学的直径は、３．７ｎｍであった。当該数平均流体力学的直径は、ＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子にて得られる３．２ｎｍの直径よりも大きく、このことは、ナノ粒子とドキソルビシンとの表面相互作用を示している。

【0181】

１００ｇ／ｌのナノ粒子に相当する１００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子の溶液に関して、ドキソルビシンの保持は、最低濃度１１２ｍｇ／ｌに至るまで観察される。このことは、重量に基づくナノ粒子の積載量が、１１２ｍｇ／ｇよりも大きいことに相当する（図５）。

【0182】

〔ＴＡＴＥペプチドを送達するためのナノベクター〕
＜実施例６＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。１４．９４ｍｇのｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＡＴＥ）ペプチドを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに４９８μｌの超純水を加え、ペプチドが完全に溶解するまで攪拌した。３０ｇ／ｌにてペプチドを含む溶液を得た。当該ペプチドの溶液４８μｌと、超純水３２８μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、２．９０ｇ／ｌのペプチドを含む溶液を調製した。

【0183】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、２００μｌの上清を得た。当該上清を２０倍に希釈した後、紫外線−可視光分析、および、蛍光分析によって、浮上分離液を分析した。

【0184】

＜実施例７（比較）＞
２．９０ｇ／ｌのＴＡＴＥペプチドの溶液を実施例６に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0185】

＜実施例８＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。６．１ｍｇのｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＡＴＥ）ペプチドを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに２０３．３μｌの超純水を加え、ペプチドが完全に溶解するまで攪拌した。３０ｇ／ｌにてペプチドを含む溶液を得た。当該ペプチドの溶液９７μｌと、超純水２７９μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、５．８０ｇ／ｌのペプチドを含む溶液を調製した。

【0186】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、３２０μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析（２０倍希釈）、および、蛍光分析（４０倍希釈）によって、浮上分離液を分析した。

【0187】

＜実施例９＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。１４．９４ｍｇのｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＡＴＥ）ペプチドを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに４９８μｌの超純水を加え、ペプチドが完全に溶解するまで攪拌した。３０ｇ／ｌにてペプチドを含む溶液を得た。当該ペプチドの溶液１９３μｌと、超純水１８２μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１１．６０ｇ／ｌのペプチドを含む溶液を調製した。

【0188】

【0189】

＜実施例１０（比較）＞
１１．６０ｇ／ｌのＴＡＴＥペプチドの溶液を実施例５に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0190】

＜実施例１１＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子を２５０μｌの超純水中に再分散して、２００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。０．６ｍｇのｔｙｒ３−オクトレオテート（ＴＡＴＥ）ペプチドを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに２０μｌの超純水を加え、ペプチドが完全に溶解するまで攪拌した。３０ｇ／ｌにてペプチドを含む溶液を得た。当該ペプチドの溶液２０μｌと、超純水２３０μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１．２０ｇ／ｌのペプチドを含む溶液を調製した。

【0191】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、３２０μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析（２０倍希釈）、または、蛍光分析（４０倍希釈）によって、浮上分離液を分析した。

【0192】

＜実施例６〜１０の結果＞
図６、７および８は、それぞれ、実施例６および７の溶液の２０倍に希釈された浮上分離液、実施例９および１０の溶液の２０倍に希釈された浮上分離液、ならびに、実施例８の溶液の２０倍に希釈された浮上分離液の、吸収スペクトルを示す。これらのデータは、ＴＡＴＥペプチドが、最大で約２ｇ・Ｌ^−１の濃度まで、ナノ粒子の表面に吸着することを示している（図１２）。実際、この限界濃度の前には、タンジェンシャルフィルトレーションによって精製された溶液の浮上分離液中、紫外線−可視光分光分析によって、ＴＡＴＥペプチドは検出されない。

【0193】

図９、１０および１１は、それぞれ、実施例６および７の２０倍に希釈された浮上分離液、実施例９および１０の２０倍に希釈された浮上分離液、ならびに、実施例８の２０倍に希釈された浮上分離液の、蛍光スペクトルを示す。紫外線−可視光分光分析による検出と同様に、これらのデータは、ＴＡＴＥペプチドがＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子と相互作用することを示している。

【0194】

実施例８によって得られた溶液（２．９０ｇ／ｌのＴＡＴＥ）を１０倍に希釈し、６３３ｎｍのレーザーを用いたＤＬＳによって分析した。

【0195】

数平均流体力学的直径は、３．４ｎｍであった。当該数平均流体力学的直径は、ＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子にて得られる３．２ｎｍの直径よりも大きく、このことは、ナノ粒子とＴＡＴＥペプチドとの表面相互作用を示している。

【0196】

１００ｇ／ｌのナノ粒子に相当する１００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子の溶液に関して、ＴＡＴＥペプチドの保持は、最低濃度２ｇ／ｌに至るまで観察される。このことは、重量に基づくナノ粒子の積載量が、２０ｍｇ／ｇよりも大きいことに相当する（図１２）。

【0197】

〔シスプラチンを送達するためのナノベクター〕
＜実施例１２＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。３．１ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．２ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液２４μｌと、超純水３５１μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１２０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0198】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、１６０μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析によって、浮上分離液を分析した。シスプラチンは、ＯＤＰＡと反応させた後、７０６ｎｍの波長での紫外線−可視光の吸収によって検出される。シスプラチンとの反応のために、１．４ｍｇ／ｍｌにてＯＤＰＡを含む溶液、および、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を準備した。浮上分離液を、５倍に希釈した。１４０μｌの当該溶液を、２００μｌの緩衝液および１００μｌのＯＤＰＡに加えた。得られた溶液を、１００℃にて１５分間加熱した。反応が終了し、温度が室温にまで戻ると直ぐに、５６０μｌのＤＭＦを加えた。最終的な溶液を濾過した後、当該溶液を、紫外線−可視光分析によって分析した。

【0199】

＜実施例１３＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。３．１ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．２ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液３６μｌと、超純水３３９μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１８０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0200】

【0201】

＜実施例１４＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。３．１ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．２ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液７２μｌと、超純水３０３μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、３６０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0202】

【0203】

＜実施例１５＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。２．８ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．１ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液１４２μｌと、超純水２３３μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、７２０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0204】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、１４０μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析によって、浮上分離液を分析した。シスプラチンは、ＯＤＰＡと反応させた後、７０６ｎｍの波長での紫外線−可視光の吸収によって検出される。シスプラチンとの反応のために、１．４ｍｇ／ｍｌにてＯＤＰＡを含む溶液、および、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を準備した。浮上分離液を、５倍に希釈した。１４０μｌの当該溶液を、２００μｌの緩衝液および１００μｌのＯＤＰＡに加えた。得られた溶液を、１００℃にて１５分間加熱した。反応が終了し、温度が室温にまで戻ると直ぐに、５６０μｌのＤＭＦを加えた。最終的な溶液を濾過した後、当該溶液を、紫外線−可視光分析によって分析した。

【0205】

＜実施例１６（比較）＞
７２０ｍｇ／ｌのシスプラチンの溶液を実施例１５に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0206】

＜実施例１７＞
５０μｍｏｌ（Ｇｄ^３＋）のＡＧｕＩＸ（登録商標）を１２５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）の溶液を調製した。２．８ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．１ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液２２９μｌと、超純水１４６μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのガドリニウム、および、１１６０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0207】

【0208】

＜結果（実施例１２、１３、１４、１５および１７）＞
実施例１２、１３、１４、１５および１７（１２０−１８０−３６０−７２０−１１６０ｍｇ／ｌのシスプラチン）を、６３３ｎｍのレーザーを用いたＤＬＳ（試料を１０倍に希釈）によって分析した。各々の数平均流体力学的直径は、３．８ｎｍ、３．７ｎｍ、３．８ｎｍ、３．４ｎｍ、３．７ｎｍであった。これらの数平均流体力学的直径は、ＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子にて得られる３．２ｎｍの直径よりも大きく、このことは、ナノ粒子とシスプラチンとの表面相互作用を示している。

【0209】

＜実施例１８（比較）＞
１１６０ｍｇ／ｌのシスプラチンの溶液を実施例１５に記載の工程に従って調製し、このとき、調製に用いるＡＧｕＩＸ（登録商標）の溶液を超純水に置き換えた。

【0210】

＜実施例１５／１６および実施例１７／１８の結果＞
図１３は、実施例に記載した処理後における、実施例１２、１３および１４の浮上分離液の吸光度を表す。

【0211】

図１４および１５は、それぞれ、実施例１５および１６の溶液の浮上分離液の吸収スペクトル、および、実施例１７および１８の溶液の浮上分離液の吸収スペクトルである。これらのデータは、シスプラチンが、最大で約２４０ｍｇ・Ｌ^−１の濃度まで、ナノ粒子の表面に吸着することを示している（図１６）。実際、この限界濃度の前には、ＯＤＰＡ処理された浮上分離液中、７０６ｎｍにおける紫外線−可視光分光分析によって、シグナルに変化はない。

【0212】

１００ｇ／ｌのナノ粒子に相当する１００ｍＭ（［Ｇｄ^３＋］）のＡＧｕＩＸ（登録商標）のナノ粒子の溶液に関して、シスプラチンの保持は、最低濃度２４０ｍｇ／ｌに至るまで観察される。このことは、重量に基づくナノ粒子の積載量が、２．４ｍｇ／ｇよりも大きいことに相当する（図１６）。

【0213】

＜実施例１９＞シスプラチンを送達するための、ポリシロキサンおよび遊離キレート（free chelates）に基づくナノ粒子
これらのナノ粒子を合成するために、６．１８７ｍｌ（２６．１７ｍｍｏｌ）のＡＰＴＥＳを、９０ｍｌのジエチレングリコールに加えた。当該溶液を、室温にて１時間攪拌した後、１０ｇ（１７．４５ｍｍｏｌ）のＤＯＴＡＧＡ無水物を加えた。水溶液を、５日間攪拌した。５日間の攪拌の後、当該溶液に７．９５２ｍｌ（３４．９０ｍｍｏｌ）のＴＥＯＳを添加し、１時間攪拌した。当該溶液に超純水９００ｍｌを加え、撹拌しながら、５０℃にて１８時間加熱した。当該溶液を、５ｋＤａのカットオフ閾値を有する膜を備えるＶｉｖａｆｌｏｗカセットを使用して、２００ｍｌに濃縮した。塩酸を加えることによって、ｐＨを２に調整した。当該溶液を、Ｖｉｖａｆｌｏｗを使用して係数５０にて精製し、１Ｍの水酸化ナトリウムを制御しながら加えることによって、ｐＨを７．４に中和した。当該溶液を、濾過し、その後、凍結乾燥した。当該凍結乾燥物を水中に再分散させると、ナノ粒子は、５．２ｎｍの流体力学的直径を有していた。

【0214】

５０μｍｏｌ（ＤＯＴＡＧＡ）のケイ素のナノ粒子（６２．５ｍｇ）を、１４１μｌの超純水に再分散させることによって、ＤＯＴＡＧＡの濃度が３５４ｍＭであり、かつ、４４３ｍｇ／ｌである溶液を調製した。３ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．２ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液２２９μｌと、超純水１３０μｌとを、前記のケイ素のナノ粒子の溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭの遊離キレート（１２５ｇ／ｌのナノ粒子）、および、１１６０ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0215】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、２００μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析によって、浮上分離液を分析した。シスプラチンは、ＯＤＰＡと反応させた後、７０６ｎｍの波長での紫外線−可視光の吸収によって検出される。シスプラチンとの反応のために、１．４ｍｇ／ｍｌにてＯＤＰＡを含む溶液、および、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を準備した。浮上分離液を、５倍に希釈した。１４０μｌの当該溶液を、２００μｌの緩衝液および１００μｌのＯＤＰＡに加えた。当該新たな溶液を、１００℃にて１５分間加熱した。反応が終了し、温度が室温にまで戻ると直ぐに、５６０μｌのＤＭＦを加えた。最終的な溶液を濾過した後、当該溶液を、紫外線−可視光分析によって分析した。

【0216】

図１７は、実施例１８および１９の溶液の浮上分離液の吸収スペクトルを示す。ケイ素のナノ粒子の溶液にシスプラチンを添加すると、不溶分離液において、より弱いシグナルが観察された。２つのＵＶスペクトルの波長７０６ｎｍにおけるシグナルから、１２５ｇ／ｌのナノ粒子の溶液に関して、２６０ｍｇ／ｌのシスプラチン濃度における保持が推定できる。このことは、重量に基づくナノ粒子の積載量が、２．１ｍｇ／ｇであることに相当する。

【0217】

＜実施例２０＞ビスマスイオンのキレート化によるナノ粒子の表面の改変が、積載量を変化させる可能性
実施例１９に記載のナノ粒子を水（２８３ｍｇ、２２７μｍｏｌのＤＯＴＡＧＡ）中に再分散させることによって、ＤＯＴＡＧＡの濃度を約２００ｍＭに調整した。当該溶液のｐＨを、ＮａＯＨを加えることによって、５．５に調整した。２５０ｍＭのＢｉＣｌ_３を含む６ＭのＨＣｌ溶液の８１７μｌを、７０℃の温度にて、攪拌しながら、３回に分けてゆっくりと添加することによって、錯体化を促進した。各添加の間、１０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液をゆっくりと加えることによって、ｐＨを５．５に再調整した。最後の添加の後、溶液を、８０℃にて１時間加熱した。加熱した後、超純水を加えることによって、ｐＨ５．５におけるキレート濃度が１００ｍＭに達した。当該溶液を、８０℃にて１８時間加熱した。過剰なＢｉ^３＋を、タンジェンシャルフィルトレーションによって除去した。当該溶液に水酸化ナトリウムを加えてｐＨが７になるように中和した後、当該溶液を、０．２μｍの膜にて濾過し、かつ、凍結乾燥した。当該凍結乾燥物を水中に再分散させると、ナノ粒子は、６．０ｎｍの流体力学的直径を有していた。

【0218】

３０μｍｏｌのＡＧｕＩＸ（単価記号・アットマーク）ＤＯＴＡ（単価記号・アットマーク）Ｂｉ（Ｂｉ^３＋）（６７．８ｍｇ）を７５μｌの超純水中に再分散して、４００ｍＭの溶液（９０４ｇ／Ｌのナノ粒子）を調製した。３ｍｇのシスプラチンを、２．５ｍｌのフラスコ内に入れた。当該フラスコに１．２ｍｌの超純水を加え、攪拌した。室温にてシスプラチンは全く溶解しないので、シスプラチンが完全に溶解するまで、４０℃に加熱する必要がある。２．５ｇ／ｌにてシスプラチンを含む溶液を得、アルミニウムを用いて、当該溶液を光から保護した。当該シスプラチンの溶液１１８μｌと、超純水１０７μｌとを、前記のＡＧｕＩＸ（単価記号・アットマーク）ＤＯＴＡ（単価記号・アットマーク）Ｂｉの溶液に加えた。フラスコを、暗所で３０分間攪拌した。これによって、１００ｍＭのビスマス（２２６ｇ／ｌのナノ粒子）、および、１０００ｍｇ／ｌのシスプラチンを含む溶液を調製した。

【0219】

当該溶液を３ｋＤａＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）に入れ、タンジェンシャルフィルトレーションサイクルを行うことによって、８０μｌの上清を得た。紫外線−可視光分析によって、浮上分離液を分析した。シスプラチンは、ＯＤＰＡと反応させた後、７０６ｎｍの波長での紫外線−可視光の吸収によって検出される。シスプラチンとの反応のために、１．４ｍｇ／ｍｌにてＯＤＰＡを含む溶液、および、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を準備した。浮上分離液を、５倍に希釈した。１４０μｌの当該溶液を、２００μｌの緩衝液および１００μｌのＯＤＰＡに加えた。当該新たな溶液を、１００℃にて１５分間加熱した。反応が終了し、温度が室温にまで戻ると直ぐに、５６０μｌのＤＭＦを加えた。最終的な溶液を濾過した後、当該溶液を、紫外線−可視光分析によって分析した。

【0220】

＜実施例１８および２０の結果＞
図１８は、実施例１８および２０の溶液の浮上分離液の吸収スペクトルを表す。

【0221】

図１８に示すように、ナノ粒子の表面でのビスマスのキレート化は、ナノ粒子の表面におけるシスプラチンの非保持を誘導する。これにより、ナノ粒子の表面にてキレート化された金属原子の数の変化が、ナノ粒子の積載量を変化させ得ることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

【0222】

【図1】ナノベクター上での物理的吸着の一般的な原理を示す。

【図2】ポリシロキサン系ナノ粒子の存在下に配置された薬物の濃度の関数である、浮上分離液中の活性種の濃度の変化を表す曲線である。

【図3】実施例１および２の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【図4】実施例３および４の浮上分離液の吸収スペクトルである。

【図5】１００ｍＭのＡＧｕＩＸ存在下におけるドキソルビシン溶液の浮上分離液に関する、導入されたドキソルビシンの量の関数としての、波長４９７ｎｍにおける吸光度を示す。

【図6】２０倍に希釈された実施例６および７の浮上分離液の吸収スペクトルである。