特表 2020-537492 ＦＣγＲＩＩ結合フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、それらのコンジュゲート、及びそれらを含む多重特異性分子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2020-537492(P2020-537492A)

(43)【公表日】2020年12月24日

(54)【発明の名称】ＦＣγＲＩＩ結合フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、それらのコンジュゲート、及びそれらを含む多重特異性分子

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20201127BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20201127BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20201127BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201127BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20201127BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20201127BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201127BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20201127BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20201127BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20201127BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201127BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/12ZNA

   C12N15/13

   C12N15/62 Z

   C12N15/63 Z

   C12P21/02 C

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C07K16/42

   C07K14/705

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61K47/68

   A61K38/02

   A61P43/00 111

   A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】71

(21)【出願番号】特願2020-510561(P2020-510561)

(86)(22)【出願日】2018年8月24日

(85)【翻訳文提出日】2020年3月11日

(86)【国際出願番号】US2018047843

(87)【国際公開番号】WO2019040808

(87)【国際公開日】20190228

(31)【優先権主張番号】62/550,152

(32)【優先日】2017年8月25日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】チウ，マーク

(72)【発明者】

【氏名】ウィタカー，ブリアン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ディー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG26

4B064AG27

4B064BJ12

4B064CA01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF32

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA41

4C084BA42

4C084BA44

4C084CA53

4C084DA39

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZC41

4C085AA13

4C085AA14

4C085DD62

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

ＦｃγＲＩＩに特異的に結合するＦＮ３ドメイン、それらのコンジュゲート及び抗体融合体、その分子をコードする単離されたヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれらの作製及び使用方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたＦｃγＲＩＩ結合フィブロネクチンＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン。

【請求項2】

場合により残基位置１１、１４、１７、４６、７３、及び／又は８６に置換を有する、Ｔｅｎｃｏｎ２７（配列番号５）又はＴｅｎｃｏｎ（配列番号４）に基づく、請求項１に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項3】

配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項4】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のポリヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項5】

異種分子にコンジュゲートされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項6】

前記異種分子が、ポリペプチド、抗体、半減期延長部分、検出可能な標識、又は細胞毒性剤である、請求項５に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項7】

前記検出可能な標識が、アウリスタチン、モノメチルアウリスタチンフェニルアラニン、ドラスタチン（dolostatin）、化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素、又は放射性同位体である、請求項６に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項8】

前記半減期延長部分が、アルブミン結合分子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン、アルブミン変異体、又は免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項６に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項9】

前記抗体が、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体である、請求項６に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項10】

前記ＦＮ３ドメインのＮ末端にメチオニンを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離されたＦＮ３ドメイン。

【請求項11】

ａ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、若しくは２９のポリヌクレオチド配列を含むか、又は
ｂ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、若しくは２２のポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド。

【請求項12】

請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項13】

発現ベクターである、請求項１２に記載のベクター。

【請求項14】

請求項１２又は１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１に記載の単離されたＦＮ３ドメインを生成する方法であって、前記ＦＮ３ドメインが発現される条件下で、請求項１４に記載の宿主細胞を培養することと、前記ＦＮ３ドメインを精製することとを含む、前記方法。

【請求項16】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＦＮ３ドメインと、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項17】

請求項３に記載のＦＮ３ドメインに特異的に結合する、抗イディオタイプ抗体。

【請求項18】

請求項３に記載のＦＮ３ドメインを含むキット。

【請求項19】

ポリペプチドの抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）活性を増強する方法であって、前記ポリペプチドにＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコンジュゲートすることと、前記ポリペプチドの増強されたＡＤＣＰ活性を測定することとを含む、前記方法。

【請求項20】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のポリペプチド配列を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む、抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む、多重特異性分子。

【請求項22】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体、及び前記ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインが、ペプチド結合を介して共有結合している、請求項２１に記載の多重特異性分子。

【請求項23】

前記ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインが、前記重鎖若しくはその断片のＣ末端、前記重鎖若しくはその断片のＮ末端、前記軽鎖若しくはその断片のＣ末端、又は前記軽鎖若しくはその断片のＮ末端に結合されている、請求項２１又は２２に記載の多重特異性分子。

【請求項24】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項25】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、エフェクタサイレントＦｃを含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項26】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、又はＧＩＴＲに結合する、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項27】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のアミノ酸配列を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項28】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９のポリヌクレオチドによってコードされている、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項29】

ａ）配列番号３０及び３１、
ｂ）配列番号３２及び３１、
ｃ）配列番号３３及び３１、
ｄ）配列番号３４及び３１、
ｅ）配列番号３５及び３１、
ｆ）配列番号３６及び３１、
ｇ）配列番号３７及び３１、
ｈ）配列番号３８及び３１、
ｉ）配列番号３９及び３１、
ｊ）配列番号４０及び３１、
ｋ）配列番号３０及び４１、
ｌ）配列番号３０及び４２、
ｍ）配列番号４３及び３１又は
ｎ）配列番号３９及び４２
のポリペプチド含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項30】

ａ）配列番号４６及び４７、
ｂ）配列番号４８及び４７、
ｃ）配列番号４９及び４７、
ｄ）配列番号５０及び４７、
ｅ）配列番号５１及び４７、
ｆ）配列番号５２及び４７、
ｇ）配列番号５３及び４７、
ｈ）配列番号５４及び４７、
ｉ）配列番号５５及び４７、
ｊ）配列番号５６及び４７、
ｋ）配列番号４６及び５７、
ｌ）配列番号４６及び５８、
ｍ）配列番号５９及び４７又は
ｎ）配列番号５５及び５８
のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項31】

ａ）配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、若しくは５９のポリヌクレオチド配列を含むか、又は
ｂ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、若しくは４３のポリペプチドをコードする、
ポリヌクレオチド。

【請求項32】

請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項33】

発現ベクターである、請求項３２に記載のベクター。

【請求項34】

請求項３２又は３３に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項35】

抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強させる方法であって、
ａ）前記抗体を、ＦｃγＲＩＩＢ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートして、操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を生成することと、
ｂ）前記操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の前記増強したアゴニスト活性を測定することとを含む、
前記方法。

【請求項36】

対象において癌を治療する方法であって、治療的有効量の、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む、単離された多重特異性分子を、前記対象に投与して、前記癌を治療することを含む、前記方法。

【請求項37】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体、及び前記ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインが、ペプチド結合を介して共有結合している、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインが、前記重鎖若しくはその前記断片の前記Ｃ末端、前記重鎖若しくはその前記断片の前記Ｎ末端、前記軽鎖若しくはその前記断片の前記Ｃ末端、又は前記軽鎖若しくはその前記断片の前記Ｎ末端に結合されている、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプであり、場合によりエフェクタサイレントＦｃを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体が、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、又はＧＩＴＲに結合する、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＦＮ３ドメインが、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のアミノ酸配列を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記多重特異性分子が、
ａ）配列番号３０及び３１、
ｂ）配列番号３２及び３１、
ｃ）配列番号３３及び３１、
ｄ）配列番号３４及び３１、
ｅ）配列番号３５及び３１、
ｆ）配列番号３６及び３１、
ｇ）配列番号３７及び３１、
ｈ）配列番号３８及び３１、
ｉ）配列番号３９及び３１、
ｊ）配列番号４０及び３１、
ｋ）配列番号３０及び４１、
ｌ）配列番号３０及び４２、
ｍ）配列番号４３及び３１、又は
ｎ）配列番号３９及び４２
のポリペプチドを含む、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

癌が、固形腫瘍である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記固形腫瘍が、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は癌の転移性病変である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

癌の治療において使用するための、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む、単離された多重特異性分子。

【請求項46】

前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移性病変である、癌の治療において使用するための、請求項４５に記載の多重特異性分子。

【請求項47】

癌の治療のための薬剤の製造における、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む、単離された多重特異性分子の使用。

【請求項48】

前記癌が、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌（stomach cancer）、卵巣癌、胃癌（gastric cancer）、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は前記癌の転移性病変である、請求項４７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表）
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、その内容全体は参照により本明細書に援用される。２０１８年７月２５日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルは、ファイル名がＪＢＩ５１３６ＷＯＰＣ１１ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔであり、サイズは１１９キロバイトである。

【0002】

（発明の分野）
本発明は、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン、それらのコンジュゲート及びそれらを含む多重特異性分子、その分子をコードする単離されたヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、並びにそれらの作製及び使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒトにおいて、ＩｇＧクラス抗体のＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）の２つの一般的なクラス、すなわち、受容体と関連付けられた細胞質免疫受容体チロシンリン系活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡＭ）配列の存在によって特徴付けられる活性化受容体、及び免疫受容体チロシンチロシン系阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif、ＩＴＩＭ）配列の存在を特徴とする阻害性受容体が存在する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＢを含む活性化ＦｃγＲは、活性化又は炎症誘発性反応を誘発する一方で、阻害性ＦｃγＲＩＩＢは、抗炎症又は阻害反応を誘発する。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）系の主要な特徴は、同じ細胞上の活性化及び阻害性ＦｃγＲの共発現であり、それによって、活性化についての閾値を設定する（Ａｍｉｇｏｒｅｎａ、Ｂｏｎｎｅｒｏｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１８０８−１８１２、Ｍｕｔａ、Ｋｕｒｏｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：７０−７３、Ｗｈｉｔｅ、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６２：９４１−９４８、Ｐｉｎｃｅｔｉｃ、Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：７０７−７１６）。

【0004】

ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢは、それらの細胞外ドメインにおいて９６％同一である。これらは、様々な造血細胞上で発現され、ヒト血小板及び巨核細胞上の唯一のＦｃ受容体である（Ｃａｓｓｅｌ、ＭｃＫｅｎｚｉｅ、１９９３）。ＦｃγＲＩＩＢは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を除く全ての白血球上で広く発現され、ヒトＢ細胞上で発現される唯一の阻害性Ｆｃ受容体である。ＦｃγＲＩＩＢライゲーションは、脱顆粒、食作用、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出及び炎症誘発性活性化、並びにＢ細胞増殖などのカルシウム依存性プロセスの阻害を媒介する。ＦｃγＲＩＩＡは、単球、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、及びマスト細胞上で発現され、ライゲーション時にこれらの細胞の活性化を媒介する。したがって、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢへのＩｇ結合を遮断することは、それぞれ免疫応答を抑制又は増強するために使用され得、相互作用を遮断する分子は、疾患のスペクトルの治療に使用され得る。

【0005】

ＦｃγＲＩＩＢは、その一般的な阻害機能に加えて、抗体の架橋及び後続の受容体のクラスター化を媒介してシグナル伝達を開始することによって、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに向けられる抗体のアゴニスト活性に必要とされるということが後に特定された［３、８］。抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を更に増強する取り組みは、ＦｃにＳ２６７Ｅ又はＶ１２変異を導入するなど、ＦｃγＲＩＩＢ結合を増強するＦｃ操作を含んでいる（Ｃｈｕ、Ｖｏｓｔｉａｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３９２６−３９３３、Ｈｏｒｔｏｎ、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８６：４２２３−４２３３、Ｍｉｍｏｔｏ、Ｋａｔａｄａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ ２６：５８９−５９８、Ｚｈａｎｇ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９１：２７１３４−２７１４６）。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、単離されたＦｃγＲＩＩ結合フィブロネクチンＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを提供する。

【0007】

本発明は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。

【0008】

本発明は、異種分子への単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。

【0009】

本発明は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８又は２９のポリヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。

【0010】

本発明は、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、若しくは５９のポリヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、若しくは４３のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。

【0011】

本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

【0012】

本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞も提供する。

【0013】

本発明は、単離された本発明の宿主細胞を、本発明のＦＮ３ドメインが発現される条件下で培養することと、ＦＮ３ドメインを精製することとを含む、本発明のＦＮ３ドメインを産生する方法も提供する。

【0014】

本発明は、本発明のＦＮ３ドメインと、医薬的に許容できる担体とを含む、医薬組成物も提供する。

【0015】

本発明は、本発明のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。

【0016】

本発明は、本発明のＦＮ３ドメインを含むキットも提供する。

【0017】

本発明は、ポリペプチドにＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコンジュゲートすることと、ポリペプチドの増強されたＡＤＣＰ活性を測定することを含む、ポリペプチドの抗体依存性細胞貪食作用（antibody dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ）活性を増強する方法も提供する。

【0018】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供する。

【0019】

本発明はまた、抗体をＦｃγＲＩＩＢ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートして、操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を生成することと、操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の増強したアゴニスト活性を測定することとを含む、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強する方法も提供する。

【0020】

本発明は、治療的有効量の、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む単離された多重特異性分子を、対象に投与して、癌を治療することを含む、対象の癌の治療方法も提供する。

【0021】

本発明は、癌の治療において使用するための、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む単離された多重特異性分子も提供する。

【0022】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を含む単離された多重特異性分子の癌の治療のための薬剤の製造における使用も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインのアラインメントを示す。残基の番号付けは、Ｒ２ＢＳ９（配列番号１７）に従う。Ｒ２ＢＳ６（配列番号１６）、Ｒ２ＢＳ９（配列番号１７）、Ｒ２ＢＳ１２（配列番号１８）、Ｒ２ＢＳ２６（配列番号１９）、Ｒ２ＢＳ２９（配列番号２０）、Ｒ２ＢＳ３９（配列番号２１）、Ｒ２ＢＳ５６（配列番号２２）。箱に入れられた残基は、多様化領域Ｃストランド及びＣＤループ（残基２９〜４３）及びＦ鎖及びＦＧループ（残基６５〜８１）を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。

【0025】

「フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン」（ＦＮ３ドメイン）は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体及び原核生物酵素を含むタンパク質に頻繁に生じるドメインを指す（Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９−１５６６５、Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８９：８９９０−８９９４、Ｍｅｉｎｋｅ、Ｇｉｌｋｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０−１９１８）。例示的なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（human fibronectin、ＦＮ）に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び例えば米国特許第８，２７８，４１９号に記述される非天然の合成ＦＮ３ドメインがある。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって称される（例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０））。

【0026】

「ＯＸ−４０」は、ヒトＯＸ４０（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＤ１３４）を指す。

【0027】

「ＦｃγＲＩＩＡ」は、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＦｃγＲＩＩＡを指す。

【0028】

「ＦｃγＲＩＩＢ」は、配列番号３のアミノ酸配列を有するヒトＦｃγＲＩＩＢを指す。

【0029】

「ＦｃγＲＩＩ」は、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢの両方を指す。

【0030】

「Ｔｅｎｃｏｎ」は、配列番号４を有し、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号に記載される合成フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインを指す。

【0031】

「Ｔｅｎｃｏｎ２７」は、配列番号５の配列を有し、ＵＳ９２００２７３に記載される合成ＦＮ３ドメインを指す。

【0032】

配列番号１（ＯＸ４０）
ＭＣＶＧＡＲＲＬＧＲＧＰＣＡＡＬＬＬＬＧＬＧＬＳＴＶＴＧＬＨＣＶＧＤＴＹＰＳＮＤＲＣＣＨＥＣＲＰＧＮＧＭＶＳＲＣＳＲＳＱＮＴＶＣＲＰＣＧＰＧＦＹＮＤＶＶＳＳＫＰＣＫＰＣＴＷＣＮＬＲＳＧＳＥＲＫＱＬＣＴＡＴＱＤＴＶＣＲＣＲＡＧＴＱＰＬＤＳＹＫＰＧＶＤＣＡＰＣＰＰＧＨＦＳＰＧＤＮＱＡＣＫＰＷＴＮＣＴＬＡＧＫＨＴＬＱＰＡＳＮＳＳＤＡＩＣＥＤＲＤＰＰＡＴＱＰＱＥＴＱＧＰＰＡＲＰＩＴＶＱＰＴＥＡＷＰＲＴＳＱＧＰＳＴＲＰＶＥＶＰＧＧＲＡＶＡＡＩＬＧＬＧＬＶＬＧＬＬＧＰＬＡＩＬＬＡＬＹＬＬＲＲＤＱＲＬＰＰＤＡＨＫＰＰＧＧＧＳＦＲＴＰＩＱＥＥＱＡＤＡＨＳＴＬＡＫＩ

【0033】

配列番号２（ＦｃγＲＩＩＡ）
ＭＴＭＥＴＱＭＳＱＮＶＣＰＲＮＬＷＬＬＱＰＬＴＶＬＬＬＬＡＳＡＤＳＱＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＰＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＱＧＡＲＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＭＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＱＫＦＳＨＬＤＰＴＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＦＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＶＰＳＭＧＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＩＡＴＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＮＳＴＤＰＶＫＡＡＱＦＥＰＰＧＲＱＭＩＡＩＲＫＲＱＬＥＥＴＮＮＤＹＥＴＡＤＧＧＹＭＴＬＮＰＲＡＰＴＤＤＤＫＮＩＹＬＴＬＰＰＮＤＨＶＮＳＮＮ

【0034】

配列番号３（ＦｃγＲＩＩＢ）
ＭＧＩＬＳＦＬＰＶＬＡＴＥＳＤＷＡＤＣＫＳＰＱＰＷＧＨＭＬＬＷＴＡＶＬＦＬＡＰＶＡＧＴＰＡＡＰＰＫＡＶＬＫＬＥＰＱＷＩＮＶＬＱＥＤＳＶＴＬＴＣＲＧＴＨＳＰＥＳＤＳＩＱＷＦＨＮＧＮＬＩＰＴＨＴＱＰＳＹＲＦＫＡＮＮＮＤＳＧＥＹＴＣＱＴＧＱＴＳＬＳＤＰＶＨＬＴＶＬＳＥＷＬＶＬＱＴＰＨＬＥＦＱＥＧＥＴＩＶＬＲＣＨＳＷＫＤＫＰＬＶＫＶＴＦＦＱＮＧＫＳＫＫＦＳＲＳＤＰＮＦＳＩＰＱＡＮＨＳＨＳＧＤＹＨＣＴＧＮＩＧＹＴＬＹＳＳＫＰＶＴＩＴＶＱＡＰＳＳＳＰＭＧＩＩＶＡＶＶＴＧＩＡＶＡＡＩＶＡＡＶＶＡＬＩＹＣＲＫＫＲＩＳＡＬＰＧＹＰＥＣＲＥＭＧＥＴＬＰＥＫＰＡＮＰＴＮＰＤＥＡＤＫＶＧＡＥＮＴＩＴＹＳＬＬＭＨＰＤＡＬＥＥＰＤＤＱＮＲＩ

【0035】

配列番号４（Ｔｅｎｃｏｎ）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ

【0036】

配列番号５（Ｔｅｎｃｏｎ２７）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0037】

「センチリン」とは、ヒトテネイシンＣに存在する１５個の異なるＦＮ３ドメインのコンセンサス配列に基づいたＦＮ３ドメインのことを指す。

【0038】

「抗体」は、広い意味を持ち、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、二重特異性又は多重特異性抗体、二量体、四量体、又は多量体抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、並びに、必要とされる特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の、任意の他の改変された構成を含む、免疫グロブリン分子を含む。「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互に接続されている２本の重鎖（heavy chain、ＨＣ）及び２本の軽鎖（light chain、ＬＣ）、並びにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）から構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（heavy chain variable region、ＶＨ）、並びに重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（light chain variable region、ＶＬ）及び軽鎖定常領域（constant region、ＣＬ）から構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（freamework region、ＦＲ）が散在しており相補性決定領域（complementarity determinig region、ＣＤＲ）と呼称される超可変領域に更に分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲセグメントで構成される。

【0039】

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」は、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、様々な用語を用いて定義され得る：（ｉ）ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づく（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１−５０）（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在する、「高頻度可変領域（hypervariable region）」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」は、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋにより定義されるとおり、構造が高頻度可変性である抗体可変ドメインの領域を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−１７）。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位についての標準的番号及び定義を提供する。ＣＤＲ、ＨＶ及びＩＭＧＴの標記の対応関係については、（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５−７７）に記載されている。本明細書で使用されている「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」、及び「ＬＣＤＲ３」という用語は、本明細書において別途記載のない限り、上掲のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＩＭＧＴにより記載されている方法のいずれかにより定義されるＣＤＲを含む。

【0040】

免疫グロブリンは、重鎖定常領域アミノ酸配列に応じて、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに割り当てることができる。ＩｇＡ及びＩｇＧは、アイソタイプのＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として更に細分類される。任意の脊椎動物種の抗体軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つのはっきりと異なるタイプ、即ちカッパ（κ）及びラムダ（λ）のうち１つに割り当てることができる。

【0041】

「抗体断片」とは、重鎖及び／又は軽鎖抗原結合部位、例えば、重鎖相補性決定領域（heavy chain complementarity determining region、ＨＣＤＲ）１、２、及び３、軽鎖相補性決定領域（light chain complementarity determining region、ＬＣＤＲ）１、２、及び３、重鎖可変領域（ＶＨ）、又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を保持する免疫グロブリン分子の一部を指す。抗体断片は、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、及びＦｖ断片、並びに、１個のＶＨドメイン又は１個のＶＬドメインからなるドメイン抗体（domain antibody、ｄＡｂ）を含む。ＶＨ及びＶＬドメインは互いに、合成リンカーを介して結合し、様々なタイプの一本鎖抗体設計を形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインが、個別の一本鎖抗体構築物により発現される場合では、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内、又は分子間で対形成し、一価の抗原結合部位、例えば一本鎖Ｆｖ（single chain Fv、ｓｃＦｖ）又は二重特異性抗体を形成することができ、これらは、例えば国際公開第１９９８／４４００１号、同第１９８８／０１６４９号、同第１９９４／１３８０４号、及び同第１９９２／０１０４７号に記載されている。

【0042】

「モノクローナル抗体」とは、抗体重鎖からのＣ末端リジンの除去などの、可能な周知の変更、又は、アミノ酸の翻訳後修飾、例えば、メチオニン酸化、若しくはアスパラギン若しくはグルタミンアミド分解による変更を除いて、各重鎖及び各軽鎖に、１個のアミノ酸組成を有する抗体集団を指す。モノクローナル抗体は通常、１個の抗原性エピトープに特異的に結合するが、二重特異性又は多重特異性モノクローナル抗体は、２つ以上の異なる抗原性エピトープに特異的に結合する。モノクローナル抗体は、抗体集団内で不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は、単一特異性若しくは多重特異性、又は一価、二価、若しくは多価であり得る。二重特異性抗体は、モノクローナル抗体という用語に含まれる。

【0043】

「ヒト化抗体」とは、抗原結合部位が非ヒト種に由来し、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列に由来する、抗体を指す。ヒト化抗体は、フレームワーク内に置換を含む可能性があることから、フレームワークは、発現したヒト免疫グロブリン又はヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子の配列の正確なコピーでなくてもよい。

【0044】

「ヒト抗体」とは、フレームワーク及び抗原結合部位の両方がヒト起源の配列に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有する抗体を指し、ヒト対象に投与されたときに免疫応答が最小限に抑えられるように最適化される。抗体が定常領域又は定常領域の一部を含む場合、定常領域もヒト起源の配列に由来する。

【0045】

ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られた場合のヒト起源の配列に「由来する」重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。そのような系の例示的なものには、ファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリ、及び本明細書に記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するマウス又はラットなどといった、ヒト以外の遺伝子導入動物を含む。「ヒト抗体」は、抗体及びヒト免疫グロブリン座を得るために用いられる系間の違い、体細胞変異の導入、又はフレームワーク若しくは抗原結合部位、又はこれらの両方への意図的な置換の導入により、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子と比較したときにアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン又は再編成された免疫グロブリン遺伝子によってコードされているアミノ酸配列に対して、アミノ酸配列が少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。場合によっては、「ヒト抗体」は、例えば、（Ｋｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：５７−８６）に記載されている、ヒトフレームワーク配列分析により誘導される、コンセンサスフレームワーク配列、又は、例えば、（Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９７：３８５−９６）、及び国際公開第２００９／０８５４６２号に記載されている、ファージに表示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリに組み込まれた、合成ＨＣＤＲ３を含有してもよい。

【0046】

ヒト免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ファージディスプレイ組み込み合成ＣＤＲ及び／又は合成フレームワークなどの系を用いて生成することもでき、インビトロでの突然変異導入に供して抗体特性を改善した結果、インビボにおけるヒト抗体生殖系列レパートリーでは発現されない抗体を得ることもできる。

【0047】

抗原結合部位が非ヒト種に由来する抗体は、「ヒト抗体」の定義には含まれない。

【0048】

「抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体」、又は抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーに特異的に結合する抗体を指す。例示的なＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、腫瘍壊死因子受容体１（ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（ＣＤ１２０ｂ）、リンパ球β受容体（ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、Ｆａｓ受容体（ＣＤ９５）、Ｄｅｃｏｙ受容体３（ＴＲ６）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、細胞死受容体４（ＴＲＡＩＬＲ１）、細胞死受容体５（ＴＲＡＩＬＲ２）、Ｄｅｃｏｙ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３）、Ｄｅｃｏｙ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５）、オステオプロテゲリン、ＴＷＥＡＫ受容体、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＣＤ２７０）、神経成長因子受容体（ＣＤ２７１）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＣＤ３５７）、ＴＲＯＹ（ＴＲＡＤＥ）、細胞死受容体６（ＣＤ３５８）、細胞死受容体３（Ａｐｏ−３）及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ）である。

【0049】

「結合する」、「結合」、「特異的に結合する」又は「特異的な結合」とは、特異的な抗原（ＦｃγＲＩＩなど）と、約１×１０^−６Ｍ以下、例えば約１×１０^−７Ｍ以下、約１×１０^−８Ｍ以下、約１×１０^−９Ｍ以下、約１×１０^−１０Ｍ以下、約１×１０^−１１Ｍ以下、約１×１０^−１２Ｍ以下、又は約１×１０^−１３Ｍ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合する本発明の分子（ＦＮ３ドメインなど）の能力のことを指す。代替的に、「結合する」とは、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて陰性対照よりも少なくとも５倍高い特異的抗原に結合する本発明の分子の能力を指す。しかしながら、ＦｃγＲＩＩに結合する本発明の単離された分子は、他の関連する抗原、例えば、マカカ・ファシキュラリス（Macaca Fascicularis）（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、又はパン・トログロダイテス（Pan troglodytes）（チンパンジー）などの他種由来の同じ所定の抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。

【0050】

「多重特異性」とは、２つ以上の異なる抗原、又は同じ抗原内の２つ以上の異なるエピトープに結合する分子を指す。

【0051】

「二重特異性」は、２つの異なる抗原、又は同じ抗原中の２つの異なるエピトープと特異的に結合する抗体を指す。二重特異性分子は、他の関連抗原、例えば、ヒト又はサル、例えば、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）、又はＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、ｍａｒｍｏｓｅｔ）などの、他の種（ホモログ）からの同じ抗原に対し交差反応性を有し得る、あるいは、２つ以上の異なる抗原間で共有されるエピトープに結合し得る。

【0052】

「組み換え体」とは、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離された抗体及び他のタンパク質を指す。

【0053】

「単離された」とは、組み換え細胞などの分子が産生されるシステムに関係する他の成分から実質的に分離及び／又は精製されている、分子の均質な集団（例えば、合成ポリヌクレオチド又はＦＮ３ドメインなどのポリペプチド）に加えて、少なくとも１つの精製又は単離工程に供されたタンパク質を指す。「単離されたＦＮ３ドメイン」とは、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないＦＮ３ドメインを指し、より高い純度、例えば８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の純度まで単離されたＦＮ３ドメインを包含する。

【0054】

「ベクター」は、生物系内で複製可能な、又はそのような系間を移動することができる、ポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、生物系においてこれらのポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含んでいる。このような生物系の例としては、細胞、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用する再構成生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッド分子であり得る。

【0055】

「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を指令するために、生物系又は再構成された生物系において利用できるベクターを指す。

【0056】

「ポリヌクレオチド」は、糖−リン酸骨格鎖又は他の同等の共有結合化学によって共有結合されたヌクレオチド鎖を含む合成分子を指す。

【0057】

「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペプチド結合によって連結されてポリペプチドを形成する少なくとも２つのアミノ酸残基を含む分子を指す。約５０個未満のアミノ酸からなる小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。

【0058】

「試料」は、対象から単離された類似の流体、細胞、又は組織に加えて、対象の体内に存在する流体、細胞、又は組織の収集物を指す。例示的な試料は、組織生検、穿刺吸引、外科的に切除された組織、器官培養物、細胞培養物、及び生物学的流体、例えば、細胞培養物及び血液、血清及び漿膜液、血漿、リンパ液、尿、唾液、嚢胞液、涙液、糞便、喀痰などの体液、分泌組織及び器官の粘膜からの分泌液、膣分泌液、腹水、胸膜腔、心膜腔、腹膜腔、腹腔、及び他の体腔の流体、気管支洗浄によって回収された流体、滑液、対象又は生物源、例えば、細胞及び器官の培養培地（細胞又は器官の馴化培地を含む）、洗浄液などと接触した液体溶液である。

【0059】

「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」は、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物などの全ての脊椎動物を包含する。記載されている場合を除き、「患者」及び「対象」という用語は、互換的に使用される。

【0060】

「アゴニスト」とは、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの少なくとも１つの生物活性を誘導する分子を指し、分子は、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの天然リガンドにより誘導されるアゴニストに結合する。例示的なアゴニスト活性としては、インビトロアッセイにて、ＮＦκＢ誘導性プロモータの制御下で発現した、分泌胚アルカリホスファターゼ（secreted embryonic alkaline phosphatase、ＳＥＡＰ）の産生の誘導、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）でのＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲ表面発現の増加により評価される、ＤＣ分化の誘導、Ｂ細胞の細胞増殖の増加又はＢ細胞でのＣＤ２３、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲ表面発現の増加により評価されるＢ細胞の活性化、以前に抗原に曝露した患者から単離したＰＢＭＣによるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生により評価される、抗原特異的Ｔ細胞のリコール応答の誘導、並びに活性化Ｔ細胞若しくはＩＦＮ−γの増殖の誘導又は活性化Ｔ細胞によるＴＮＦ−α産生が挙げられる。アゴニスト活性（例えば、アゴニズム）は、架橋依存性であり得る、又は抗体架橋とは無関係であり得る。

【0061】

「増強したアゴニスト活性」又は「増強したアゴニズム」は、参照分子又は陰性対照と比較したときの試験分子のアゴニズムの改善を指す。「増強した」とは、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくはそれ以上の増強であり得るか、又は陰性対照と比較したときの試験分子によって媒介される統計学的に有意な増強であり得る。

【0062】

「架橋」とは、ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＢ ｃｉｓ又はｔｒａｎｓへの抗体結合、及び、その後のＴＮＦＲアゴニスト活性の誘導により誘導される、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを発現する細胞上での、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のハイオーダーでの多量体化を指す。架橋は、架橋剤として抗ヒトＦ（ａｂ’）２を使用すること、又はＲａｊｉ細胞などのＦｃγＲＩＩＢを発現する細胞を使用することによりインビトロで評価することができる。

【0063】

「抗体架橋とは独立したアゴニスト活性」とは、抗体が、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＢを発現しているＲａｊｉ細胞などの、架橋剤の非存在下で溶液中にアゴニスト活性を示すことを意味する。

【0064】

本明細書全体をとおして、抗体の定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、特に明示的に指定しない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されるＥＵインデックスに従っている。

【0065】

従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを、表１に示すとおりに本明細書で使用する。

【0066】

【表1】

【0067】

物質の組成
本発明は、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン及びそれらの融合タンパク質を提供する。ＦＮ３ドメインは、例えば、造影剤及び／又は治療薬として有用である。

【0068】

Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいたライブラリからのＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインの単離
Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号４）は、ヒトテネイシン−Ｃからの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された天然に存在しないフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインである（米国特許公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である７個のβ鎖をつなぐ６回表面露出ループを示し、β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれる（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９４）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基を、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのライブラリを構築するためにランダム化することができ、これらを用いてＦｃγＲＩＩに結合する新規分子を選択することができる。表２は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号４）の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。これにより、Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリは、無作為化ＦＧループ、又は無作為化ＢＣ及びＦＧループを有し得る。Ｔｅｎｃｏｎ ＢＣループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＢＣループで多様化させてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎ ＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、このため、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸を、ＦＧループで多様化させてＴｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計したライブラリにおいて無作為化してもよい。Ｔｅｎｃｏｎライブラリにおけるループでの更なる多様性は、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって達成され得る。例えば、ＦＧ及び／又はＢＣループを、アミノ酸１〜２２個伸長させてもよく、又はアミノ酸１〜３個減少させてもよい。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を提供するために、ＦＧループを、残基４〜２８個の抗体ＣＤＲ３の長さの範囲に対応するように、配列並びに長さを多様化させてもよい。例えば、追加の１、２、３、４、又は５個のアミノ酸によってループを伸長させることにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることができる。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成するランダム化された代替表面を有してもよく、それらは２本以上のβ鎖と少なくとも１つのループを含んでもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。Ｔｅｎｃｏｎの代替的なＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計については、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリはまた、１１、１４、１７、３７、４６、７３、又は８６番目の位置（残基の番号付けは配列番号４に対応する）の残基で置換を有し、改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変種に基づいて設計されたライブラリを含む。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体が米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、配列番号４のＴｅｎｃｏｎと比較したとき、Ｅ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、Ｅ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号５）が含まれる。

【0069】

【表2】

【0070】

Ｔｅｎｃｏｎに基づくライブラリは、ランダムな、又は定義されたアミノ酸の組を用いて、選択された残基位置でランダム化することができる。例えば、ランダムな置換を有するライブラリ内の変異体を、天然に存在する２０種全てのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。代替的に、２０種全てのアミノ酸残基を生じさせ、同時に停止コドンの頻度を低減するために、ＮＮＳコドンを使用することもできる。多様化させる位置で偏りのあるアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な普遍的構成単位として機能する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを用いたものである。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するために必要な、全ての考えられる配列組み合わせを示す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。

【0071】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、ＲｅｐＡをコードするＤＮＡ断片に、足場タンパク質をコードするＤＮＡ断片をライゲートして、インビトロ翻訳後に形成される、それぞれのタンパク質がそれがコードするＤＮＡに安定に会合する（米国特許第７，８４２，４７６号；Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０１，２８０６−２８１０）タンパク質−ＤＮＡ複合体のプールを作製するために、ｃｉｓディスプレイを用いてＴｅｎｃｏｎライブラリなどのＦＮ３ライブラリを産生すること、並びに当該技術分野において既知の及び実施例で記述される任意の方法によってＦｃγＲＩＩに対する結合に関してライブラリをアッセイすることによって単離することができる。使用することができる例示的な周知の方法は、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチイムノアッセイ、並びに競合及び非競合アッセイである。同定されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、それらの所望の特性について更に評価することができる。

【0072】

ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン
本発明は、単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、単離されたＦＮ３ドメインは、配列番号４のＴｅｎｃｏｎアミノ酸配列又は配列番号５のＴｅｎｃｏｎ２７配列に基づき、配列番号４又は配列番号５は、残基位置１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／又は８６において置換を場合により有する。

【0073】

本発明は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２３のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0074】

本発明は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0075】

本発明は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２５のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0076】

本発明は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２６のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0077】

本発明は、配列番号２０のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0078】

本発明は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２８のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0079】

本発明は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む単離されたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号２９のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

【0080】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、熱安定性を改善するため、並びに熱によるフォールディング及びアンフォールディングの可逆性を改善するためなどのそれらの特性を改善するために改変することができる。タンパク質及び酵素の見かけの熱安定性を高めるために、高度に類似した熱安定性配列との比較に基づく合理的設計、ジスルフィド架橋を安定化する設計、α−へリックス性向を高める突然変異、塩架橋の操作、タンパク質の表面電荷の変化、定方向進化、及びコンセンサス配列の組成を含むいくつかの方法が応用されている（Ｌｅｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｙｓｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２，３７１−３７５，２００１）。高熱安定性は、発現したタンパク質の収率を増加させ、溶解度又は活性を改善し、免疫原性を減少させ、製造におけるコールドチェーンの必要性を最小化することができる。Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号４）の熱安定性を改善するために置換することができる残基は、１１、１４、１７、３７、４６、７３、及び／又は８６番目の残基位置であり、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されている。これらの残基に対応する置換を、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに組み込むことができる。

【0081】

タンパク質安定性及びタンパク質不安定性の測定は、タンパク質完全性の同じ又は異なる態様として見ることができる。タンパク質は、熱、紫外線又は電離放射線、溶液中の場合には周囲の浸透圧モル濃度及びｐＨの変化、小さな孔寸法での濾過によって課される力学的剪断力、紫外線放射、γ線照射によるなどの電離放射線、化学的若しくは熱脱水、又はタンパク質構造の破壊を引き起こし得る他の任意の作用若しくは力によって引き起こされる変性に対して感受性がある、又は「不安定」である。分子の安定性は、標準方法を用いて決定することができる。例えば、分子の安定性は、標準方法を用いて、分子の半分がアンフォールドされるセ氏での温度（℃）である、熱融解（「Ｔ_Ｍ」）温度を測定することによって決定することができる。一般的には、Ｔ_ｍが高いほど、分子はより安定している。熱に加えて、化学環境もまた、タンパク質が特定の三次元構造を維持する能力を変化させる。

【0082】

化学変性も同様に、様々な方法によって測定することができる。化学変性剤には、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、アセトン、有機溶媒（ＤＭＦ、ベンゼン、アセトニトリル）、塩（硫酸アンモニウム、臭化リチウム、塩化リチウム、臭化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム）、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、β−メルカプトエタノール、ジニトロベンゼン、及び水素化ホウ素ナトリウムなどの水素化物）、非イオン性及びイオン性洗浄剤、酸（例えば、塩酸（hydrochloric acid、ＨＣｌ）、酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ）、ハロゲン化酢酸）、疎水性分子（例えば、リン脂質）、及び標的化変性剤が挙げられる。変性の程度の定量化は、標的分子の結合能などの機能的特性の喪失、又は凝集傾向、これまで溶媒が到達できなかった残基の露出、若しくはジスルフィド結合の破壊若しくは形成などの物理化学的特性に依存し得る。

【0083】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、価数を増加させ、このため標的分子結合の結合力を増加させるために、又は２つ以上の異なる標的分子に同時に結合する二重特異性又は多重特異性の足場を作製するために、単量体、二量体、又は多量体として作製され得る。二量体及び多量体は、例えばアミノ酸リンカー、例えばポリグリシン、グリシン及びセリン、又はアラニン及びプロリンを含むリンカーを含めることによって単特異性、二重特異性、又は多重特異性タンパク質足場を連結させることによって作製され得る。例示的なリンカーとしては、ＧＳＧＳ、（配列番号６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８）、ＡＰＡＰ（配列番号９）、ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号１０）、ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号１１）、ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号１２）、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＡＡ（配列番号１３）ａｎｄＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）が挙げられる。二量体及び多量体を、ＮからＣ−方向に互いに連結させてもよい。ポリペプチドを新規な連結された融合ポリペプチドに連結するための天然に存在するペプチドリンカー及び人工ペプチドリンカーの使用は、文献において周知である（Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ，Ｌａｒｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５２６０−５２６８、Ａｌｆｔｈａｎ，Ｔａｋｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５−７３１、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１０９−１１６、米国特許第５，８５６，４５６号）。

【0084】

ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインコンジュゲート
本発明は、異種分子にコンジュゲートしたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインも提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、ポリペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、抗体にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、半減期延長部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、検出可能な標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、細胞毒性薬物にコンジュゲートされる。コンジュゲートは、ＦＮ３ドメインとのペプチド結合を介してもよく、標準的なクローニング及び発現技術によって生成され得る。代替的に、周知の化学カップリング方法を用いて、組み換え技術によって産生された本発明のＦＮ３ドメインにその部分を結合させることができる。異種分子にコンジュゲートした本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、いくつかの周知のアッセイによって機能性に関して比較され得る。例えば、Ｆｃドメイン及び／又はＦｃドメイン変異体を組み込むことにより変化した特性を、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、又はＦｃＲｎ受容体などの可溶性型受容体を用いるＦｃ受容体結合アッセイにおいてアッセイしてもよく、又は例えばＡＤＣＣ若しくはＣＤＣを測定する周知の細胞系アッセイを用いて、又はインビボモデルにおける本発明の分子の薬物動態特性を評価してアッセイしてもよい。

【0085】

半減期延長部分
例示的な半減期延長部分としては、アルブミン、アルブミン変異体、アルブミン結合タンパク質及び／又はドメイン、トランスフェリン、並びにそのフラグメント及び類似体、並びにＦｃ領域がある。例示的なアルブミン変異体の１つに、配列番号１５に示されるものがある。ヒトＦｃ領域のアミノ酸配列は周知のものであり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥ Ｆｃ領域を含んでいる。

【0086】

配列番号１５
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ

【0087】

抗体定常領域の全て又は一部を、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに結合させて、半減期を延長してもよく、また抗体様特性、特にＣ１ｑ結合などのＦｃエフェクタ機能、補体依存性細胞障害性（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどの、Ｆｃ領域に関連する特性を付与してもよく、これらの活性に関与するＦｃにおける残基を修飾することによって更に修飾されてもよい（論評に関しては、（Ｓｔｒｏｈｌ（２００９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６８５−６９１）を参照されたい）。

【0088】

ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２０，０００などのポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリジン、オクタン、炭水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖又は多糖）などの他の半減期延長部分を、所望の特性を得るために本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに組み込むことができる。

【0089】

例えば、システイン残基を分子のＣ末端に組み込むか、又は、分子のＦｃγＲＩＩ結合面から離れる方向に面した残基位置にシステインを組み込み、周知の方法によってＰＥＧ化基をシステインに結合させることによって、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインにＰＥＧ化部分を付加することができる。

【0090】

検出可能な標識
検出可能な標識にコンジュゲートされた本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、対象からの試料などの組織又は細胞試料上のＦｃγＲＩＩの発現を評価するために、又は対象のリンパ球などのＦｃγＲＩＩ発現細胞を検出するためのインビボ撮像に使用されてもよい。

【0091】

検出可能な標識は、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインと結合させた場合に、ＦＮ３ドメインを、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的手段によって検出可能なものとすることができる組成物を含む。

【0092】

例示的な検出可能な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、電子密度試薬、酵素（例えば、一般的にＥＬＩＳＡにおいて使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、フルオロフォア、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位体、シンチラント（cintillants）、アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体又はその断片、ポリヒスチジン、Ｎｉ^２＋、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子供与体／受容体、アクリジニウムエステル、及び比色基質が挙げられる。

【0093】

検出可能な標識は、例えば、検出可能な標識が放射性同位体であるときなど、自発的にシグナルを発し得る。検出可能な標識はまた、外部フィールドによって刺激されるので、信号を放出してもよい。

【0094】

例示的な放射性同位体は、γ放出、オージェ放出、β放出、アルファ放出、又はポジトロン放出性の放射性同位体であり得る。例示的な放射性同位体としては、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｃ、^１５Ｎ、^１８Ｆ、^１９Ｆ、^５５Ｃｏ、^５７Ｃｏ、^６０Ｃｏ、^６１Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^７２Ａｓ、^７５Ｂｒ、^８６Ｙ、^８９Ｚｒ、^９０Ｓｒ、^９４ｍＴｃ、^９９ｍＴｃ、^１１５Ｉｎ、^１２３１、^１２４１、^１２５Ｉ、^１３１１、^２１１Ａｔ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２２３Ｒａ、^２２６Ｒａ、^２２５Ａｃ、及び^２２７Ａｃが挙げられる。

【0095】

例示的な金属原子は、２０超の原子番号を有する金属、例えば、カルシウム原子、スカンジウム原子、チタン原子、バナジウム原子、クロム原子、マンガン原子、鉄原子、コバルト原子、ニッケル原子、銅原子、亜鉛原子、ガリウム原子、ゲルマニウム原子、ヒ素原子、セレン原子、臭素原子、クリプトン原子、ルビジウム原子、ストロンチウム原子、イットリウム原子、ジルコニウム原子、ニオブ原子、モリブデン原子、テクネチウム原子、ルテニウム原子、ロジウム原子、パラジウム原子、銀原子、カドミウム原子、インジウム原子、スズ原子、アンチモン原子、テルル原子、ヨウ素原子、キセノン原子、セシウム原子、バリウム原子、ランタン原子、ハフニウム原子、タンタル原子、タングステン原子、レニウム原子、オスミウム原子、イリジウム原子、白金原子、金原子、水銀原子、タリウム原子、鉛原子、ビスマス原子、フランシウム原子、ラジウム原子、アクチニウム原子、セリウム原子、プラセオジム原子、ネオジム原子、プロメチウム原子、サマリウム原子、ユウロピウム原子、ガドリニウム原子、テルビウム原子、ジスプロシウム原子、ホルミウム原子、エルビウム原子、ツリウム原子、イッテルビウム原子、ルテチウム原子、トリウム原子、プロトアクチニウム原子、ウラン原子、ネプツニウム原子、プルトニウム原子、アメリシウム原子、キュリウム原子、バーケリウム原子、カリホルニウム原子、アインスタイニウム原子、フェルミウム原子、メンデレビウム原子、ノーベリウム原子、又はローレンシウム原子である。

【0096】

いくつかの実施形態では、金属原子は、２０超の原子番号を有するアルカリ土類金属であり得る。

【0097】

いくつかの実施形態では、金属原子は、ランタニドであり得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、金属原子は、アクチニドであり得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、金属原子は、遷移金属であり得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、金属原子は、卑金属であり得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、金属原子は、金原子、ビスマス原子、タンタル原子、及びガドリニウム原子であり得る。

【0102】

いくつかの実施形態では、金属原子は、５３（即ち、ヨウ素）〜８３（即ち、ビスマス）の原子番号を有する金属であり得る。

【0103】

いくつかの実施形態では、金属原子は、磁気共鳴映像法に好適な原子であり得る。

【0104】

金属原子は、＋１、＋２、又は＋３の酸化状態の形態の金属イオン、例えば、Ｂａ^２＋、Ｂｉ^３＋、Ｃｓ^＋、Ｃａ^２＋、Ｃｒ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｃｒ^６＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｏ^３＋、Ｃｕ^＋、Ｃｕ^２＋、Ｃｕ^３＋、Ｇａ^３＋、Ｇｄ^３＋、Ａｕ^＋、Ａｕ^３＋、Ｆｅ^２＋、Ｆｅ^３＋、Ｆ^３＋、Ｐｂ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｍｎ^３＋、Ｍｎ^４＋、Ｍｎ^７＋、Ｈｇ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｎｉ^３＋、Ａｇ^＋、Ｓｒ^２＋、Ｓｎ^２＋、Ｓｎ^４＋、及びＺｎ^２＋であり得る。金属原子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄、酸化マンガン、又は酸化ガドリニウムを含み得る。

【0105】

好適な色素としては、例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン、ＩＲＤｙｅ ６８０ＲＤマレイミド、又はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、ルテニウムポリピリジル色素などの任意の市販の色素が挙げられる。

【0106】

好適なフルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyante、ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオセミカルバジン、ローダミン、テキサスレッド、ＣｙＤｙｅｓ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ５９４、Ａｌｅｘａ６４７）、近赤外（near infrared、ＮＩＲ）（７００〜９００ｎｍ）蛍光染料、並びにカルボシアニン及びアミノスチリル染料である。

【0107】

本発明はまた、対象におけるＦｃγＲＩＩ発現細胞を検出する方法も提供し、方法は、
配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを検出可能な標識にコンジュゲートしてコンジュゲートを形成することと、
このコンジュゲートを対象に投与することと、
コンジュゲートが結合しているＦｃγＲＩＩ発現細胞を可視化することとを含む。

【0108】

本発明はまた、試料中のＦｃγＲＩＩ発現細胞を検出する方法も提供し、方法は、
試料を得ることと、
試料を、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を含むＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイ接触させることと、
ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインの結合を検出することとを含む。

【0109】

細胞毒性剤
細胞毒性剤にコンジュゲートされたＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、例えば、これらの細胞毒性剤の全身投与が正常細胞に許容されないレベルの毒性を生じうる場合に、細胞毒性剤のＦｃγＲＩＩ発現細胞、及びその細胞内蓄積部への標的化送達に使用することができる。

【0110】

いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ビンデシン、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシン、ゲルダナマイシン、マイタンシノイド、又はカリケアマイシンである。細胞毒性物質は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害を含む機構によりその細胞毒性又は細胞増殖抑制作用をもたらすことができる。

【0111】

いくつかの実施形態では、細胞毒性物質としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、アレウリテス・フォルディ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラカ・アメリカナ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテセンなどの酵素活性を有する毒素がある。

【0112】

いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、^２１２Ｂｉ、^１３１Ｉ、^１３１Ｉｎ、^９０Ｙ、及び^１８６Ｒｅなどの放射性核種である。

【0113】

いくつかの実施形態では、細胞毒性剤は、ドラスタチン又はドラスタチンのペプチド類似体及び誘導体、アウリスタチン又はモノメチルアウリスタチンフェニルアラニンである。例示的な分子は、米国特許第５，６３５，４８３号及び同第５，７８０，５８８号に開示されている。ドラスタチン及びオーリスタチンは、微小管の動力学、ＧＴＰの加水分解、並びに核及び細胞分裂と干渉することが示されており（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４５：３５８０−３５８４）、抗癌及び抗カビ活性を有することが示されている。ドラスタチン及びアウリスタチン薬物部分は、ペプチド薬物部分のＮ（アミノ）末端若しくはＣ（カルボキシル）末端を介して（国際公開第０２／０８８１７２号）、又はＦＮ３ドメインに組み込まれた任意のシステインを介して、本発明のＦＮ３ドメインに結合することができる。

【0114】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、既知の方法を用いて検出可能な標識又は細胞毒性剤にコンジュゲートされ得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、検出可能な標識又は細胞毒性剤は、キレート剤と錯体を形成している。

【0116】

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、リンカーを介して本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートされる。

【0117】

検出可能な標識又は細胞毒性剤は、既知の方法を用いて、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに直接、又は間接的に連結され得る。好適なリンカーは、当該技術分野において既知であり、例えば、補欠分子族、非フェノールリンカー（Ｎ−スクシミジル−ベンゾアートの誘導体；ドデカボラート）、大環状及び非環式の両キレート剤のキレート部分、例えば、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０，四酢酸（ＤＯＴＡ）の誘導体、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）の誘導体、及び１，４，８，１１−テトラアザシクロドデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）の誘導体、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）、並びに他のキレート部分が挙げられる。好適なペプチドリンカーは周知である。

【0118】

いくつかの実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、腎クリアランスを介して血液から除去される。

【0119】

ポリペプチド及び抗体コンジュゲート
ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを任意のポリペプチドにコンジュゲートさせて、ＦｃγＲＩＩ結合特性をポリペプチドに提供してもよい。例えば、改変されたエフェクタサイレントＦｃを有する抗体は、ＡＤＣＰ活性を選択的にレスキューするために、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートさせることができる。腫瘍抗原に結合するポリペプチドは、ＡＤＣＰを介して腫瘍細胞を排除するために、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートさせることができる。

【0120】

本発明は、ポリペプチドにＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコンジュゲートすることと、ポリペプチドの増強されたＡＤＣＰ活性を測定することを含む、ポリペプチドの抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）活性を増強する方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のポリペプチド配列を含む。「増強したＡＤＣＰ」は、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、若しくはそれ以上の増強であり得るか、又は陰性対照と比較したときの試験分子によって媒介される統計学的に有意な増強であり得る。ＡＤＣＰ活性は、既知のプロトコル及び本明細書に記載のものを使用して測定することができる。

【0121】

多重特異性分子
本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供する。抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体へのＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインのコンジュゲーションは、抗体のアゴニスト活性を増強し、エフェクタＦｃ抗体においてＡＤＣＰ活性を提供する。

【0122】

いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとが、ペプチド結合を介して共有結合している。

【0123】

いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、重鎖若しくはその断片のＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、重鎖若しくはその断片のＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、軽鎖若しくはその断片のＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、軽鎖若しくはその断片のＮ末端に結合される。

【0124】

いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＩｇＧ３アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体は、エフェクタサイレントＦｃを含む。「エフェクタサイレント」は、バックグラウンドにわたって測定可能なＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣを有さない抗体を指す。ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣは、既知の方法及び本明細書に記載される方法を使用して測定することができる。抗体の、活性化ＦｃγＲへの結合を低下させた後、エフェクタ機能を低下させるために変異可能なｆｃ位置としては、位置２１４、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２６５、２６７、２６８、２７０、２９５、２９７、３０９、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、及び３６５が挙げられる。単独で、又は組み合わせで加えることができる例示的な変異は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４における、変異Ｋ２１４Ｔ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ｖ２３４Ａ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ａ、Ｈ２６８Ｑ、Ｑ２６８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３２７Ｓ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、及びＰ３３１Ｓである。ＡＤＣＣが低下した抗体をもたらす例示的な変異の組み合わせは、ＩｇＧ１における変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、全てのＩｇアイソタイプにおけるＮ２９７Ａ、ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ、ＩｇＧ１におけるＫ２１４Ｔ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ａ３２７Ｇ／Ｐ３３１Ａ／Ｄ３６５Ｅ／Ｌ３５８Ｍ、ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ１におけるＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１におけるＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ、及び、ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６欠失／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓである。ＩｇＧ２由来の残基１１７〜２６０及びＩｇＧ４由来の残基２６１〜４４７を有するＦｃなどのハイブリッドＩｇＧ２／４ Ｆｃドメインを使用してもよい。ＣＤＣが低下した抗体をもたらす例示的な変異は、Ｋ３２２Ａ変異である。

【0125】

いくつかの実施形態では、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子は、ＯＸ４０に結合する。いくつかの実施形態では、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子は、ＣＤ２７に結合する。いくつかの実施形態では、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子は、ＣＤ４０に結合する。いくつかの実施形態では、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子は、ＣＤ１３７に結合する。いくつかの実施形態では、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子は、ＧＩＴＲに結合する。

【0126】

本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２３のポリヌクレオチドによってコードされている。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２４のポリヌクレオチドによってコードされる。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２５のポリヌクレオチドによってコードされている。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２６のポリヌクレオチドによってコードされる。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２７のポリヌクレオチドによってコードされる。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２８のポリヌクレオチドによってコードされる。本発明は、重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、このＦＮ３ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメインは、配列番号２９のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0127】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３０及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0128】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３２及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４８及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0129】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３３及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４９及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0130】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３４及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５０及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0131】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３５及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５１及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0132】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３６及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５２及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0133】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３７及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５３及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0134】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３８及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５４及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0135】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３９及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５５及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0136】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号４０及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５６及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0137】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３０及び４１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６及び５７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0138】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３０及び４２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４６及び５８のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0139】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号４３及び３１のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５９及び４７のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0140】

本発明は、重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子も提供し、この多重特異性分子は、配列番号３９及び４２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５５及び５８のポリヌクレオチドによってコードされる。

【0141】

本発明は、抗体をＦｃγＲＩＩＢ結合ＦＮ３ドメインにコンジュゲートして、操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体を生成することと、操作された抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体の増強したアゴニスト活性を測定することとを含む、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー抗体のアゴニスト活性を増強する方法も提供する。

【0142】

ポリヌクレオチド、ベクター及び宿主細胞
本発明は、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子をコードする核酸を、インビトロ転写／翻訳のために使用される直鎖ＤＮＡ配列、その組成物の真核生物、原核生物、又はフィラメントファージでの発現、分泌、及び／又は提示と適合するベクター、又はその標的化突然変異源を含む、単離されたポリヌクレオチドとして、又は発現ベクターの一部として、又は直鎖ＤＮＡ配列の一部として、提供する。ある特定の例示的なポリヌクレオチドが本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は所与の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明のＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子をコードする他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。

【0143】

本発明は配列番号１６のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２３のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0144】

本発明は配列番号１７のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0145】

本発明は配列番号１８のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0146】

本発明は配列番号１９のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２６のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0147】

本発明は配列番号２０のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２７のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0148】

本発明は配列番号２１のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２８のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0149】

本発明は配列番号２２のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、配列番号２９のポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0150】

本発明はまた、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２又は４３のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0151】

本発明は、配列番号４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８又は５９のポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドも提供する。

【0152】

本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成装置での固相ポリヌクレオチド合成などの化学合成により産生され、完全な一本鎖又は二本鎖分子に構築され得る。代替的に、本発明のポリヌクレオチドは、ＰＣＲに続いて通常のクローニングを行うなどの他の技術により産生され得る。所与の既知の配列のポリヌクレオチドを産生又は取得するための技術は、当該技術分野で周知である。

【0153】

本発明のポリヌクレオチドは、プロモータ又はエンハンサ配列、イントロン、ポリアデニル化シグナル、ＲｅｐＡ結合を促進するｃｉｓ配列等などの、少なくとも１つの非コード配列を含み得る。ポリヌクレオチド配列はまた、例えば、タンパク質の精製又は検出を容易にするためのヒスチジンタグ又はＨＡタグなどのマーカー又はタグ配列、シグナル配列、ＲｅｐＡ、Ｆｃなどの融合タンパク質パートナー、又はｐＩＸ若しくはｐＩＩＩなどのバクテリオファージコートタンパク質をコードした更なるアミノ酸をコードする更なる配列を含んでもよい。

【0154】

本発明はまた、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。そのようなベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、バキュロウイルス発現ベクター、トランスポゾンに基づいたベクター、又は任意の手段によって所与の生物若しくは遺伝子的バックグラウンドに本発明のポリヌクレオチドを導入するために好適な他の任意のベクターであり得る。そのようなベクターは、そのようなベクターによってコードされるポリペプチドの発現を制御、調節、誘発、又は許容することができる核酸配列エレメントを含む発現ベクターであり得る。このようなエレメントは、転写エンハンサ結合部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び所与の発現系においてコードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含み得る。このような発現系は、当該技術分野において公知の細胞に基づく系、又は無細胞系であり得る。

【0155】

また、本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明のポリペプチドは、場合により、当該技術分野において周知の細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン性集団によって産生させることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ（１９８７−２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１）を参照されたい。

【0156】

発現用に選択される宿主細胞は、哺乳動物起源であり得るか、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅ Ｇ２、ＳＰ２／０、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はその任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択され得る。代替的に、宿主細胞は、ポリペプチドをグリコシル化することができない種又は生物、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１−ＧＯＬＤ（ＤＥ３）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、ＪＭ１０９、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、及び天然若しくは改変大腸菌種（E.coli spp）、クレブシエラ種（Klebsiella spp）、又はシュードモナス種（Pseudomonas spp）の菌株のいずれかなどの原核細胞又は生物から選択され得る。

【0157】

本発明は、本発明の単離された宿主細胞を、本発明の単離されたＦＮ３ドメインが発現されるような条件下で培養することと、ＦＮ３ドメインを精製することとを含む、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを産生する方法も提供する。

【0158】

このＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、周知の方法、例えばプロテインＡ精製、硫酸アンモニウム、又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィ（high performance liquid chromatography、ＨＰＬＣ）によって、組み換え細胞培養物から精製することができる。

【0159】

抗イディオタイプ抗体
本発明は、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。

【0160】

本発明は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗イディオタイプ抗体も提供する。

【0161】

キット
本発明は、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを含むキットも提供する。

【0162】

このキットは、治療的使用のために、及び診断キットとして使用することができる。

【0163】

いくつかの実施形態では、キットは、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインと、ＦＮ３ドメインを検出するための試薬とを含む。キットは、使用説明書；他の試薬、例えば、標識、キレート化、ないしは別の方法のカップリングに有用な試薬、放射線防護組成物、撮像、診断、又は治療目的のための投与のための、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを調製するためのデバイス又は他の材料、医薬的に許容される担体、及び対象に投与するためのデバイス又は他の材料を含む、１つ以上の他の構成要素を含み得る。

【0164】

いくつかの実施形態では、キットは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを含む。

【0165】

ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン及び重鎖及び軽鎖と、ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子の使用
ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、ＮＫ細胞及びＴ細胞を除いて、エンドサイトーシス及び貪食作用に関与する活性化された免疫細胞、並びに白血球をモニタするために有用である。

【0166】

本発明のＦＮ３ドメインを使用して細胞内ドメイン内に免疫受容体チロシンリン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するヒトＦｃγＲＩＩＡをブロッキングすることは、小胞体（endoplasmic reticulum、ＥＲ）からカルシウムを放出させる下流シグナル伝達事象を遮断し得る。本発明のＦＮ３ドメインを使用してＦｃγＲＩＩＡをブロッキングすることは、ＲＡ、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、又は糖尿病を有する過剰活性化患者の免疫応答を低下させることができる。

【0167】

細胞ＦγＲに結合する抗体は、ウイルス感染又は悪性細胞の除去につながる炎症誘発性反応を効率的に誘導するが、これは自己免疫応答中の健康な組織の破壊にもつながり得る。したがって、抗体特異性、並びに細胞ＦｃγＲとの相互作用を通じて炎症誘発性反応を効率的に引き起こす抗体アイソタイプへのクラスの切り替えは、厳密に制御されなければならない。いくつかの中枢性及び末梢性チェックポイントは、Ｂ細胞発生全体にわたって存在し、自己反応性抗体の生成を防止する。本発明のＦＮ３ドメインを使用してＦｃγＲＩＩＢをブロッキングすることは、ＬＹＮによるＦｃγＲＩＩＢの細胞質尾部におけるＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ）のリン酸につながる受容体の潜在的架橋を遮断することができる。このシグナルカスケードは、ＳＲＣ−相同−２−ドメイン含有イノシトール−５−リン酸（ＳＨＩＰ）の動員及びＰｔｄＩｎｓ（３，４，５）Ｐ３のホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２）への加水分化をもたらし、最終的に、ＢＴＫ及びＰＬＣγなどのタンパク質を含有するプレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン含有タンパク質の動員を阻害する。したがって、本発明のＦＮ３ドメインを使用してＦｃγＲＩＩＢをブロッキングすることは、ヒト免疫応答を回避するために使用する免疫応答の癌細胞又は慢性ウイルス感染阻害の能力を低下させ得る。

【0168】

本発明は、自己免疫疾患を治療するために、治療的有効量の本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを、それを必要する対象に投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＢである。

【0169】

いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ（rheumatoid arthritis、ＲＡ）である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、乾癬である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、クローン病である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、潰瘍性大腸炎である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、糖尿病である。

【0170】

本発明は、ウイルス感染を治療するために、治療的有効量の本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを、それを必要する対象に投与することを含む、ウイルス感染の治療方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＢである。

【0171】

本発明は、癌を治療するために、治療的有効量の本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを、それを必要する対象に投与することを含む、癌の治療方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインは、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＢである。

【0172】

本発明は、治療的有効量の重鎖若しくはその断片及び軽鎖若しくはその断片と、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子を、それを必要する対象に投与することを含む、癌の治療方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＢである。

【0173】

本発明は、治療的有効量の重鎖及び軽鎖と、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインとを含む抗腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー抗体を含む多重特異性分子を、それを必要する対象に投与することを含む、癌の治療方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＦｃγＲＩＩは、ＦｃγＲＩＩＢである。

【0174】

いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーは、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１３７、又はＧＩＴＲである。

【0175】

いくつかの実施形態では、癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、黒色腫、肺癌、扁平非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、非扁平ＮＳＣＬＣ、結腸直腸癌、前立腺癌、去勢抵抗性前立腺癌、胃癌、卵巣癌、胃癌、肝癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、食道又は胃腸管の癌、乳癌、卵管癌、脳腫瘍、尿道癌、泌尿生殖器癌、子宮内膜症、子宮頸癌、又は癌の転移性病変である。

【0176】

ＴＮＦＲ１／２／ＴＮＦ−α、ＣＤ７０／ＣＤ２７、ＣＤ１３７／４−１ＢＢ、ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＧＩＴＲ／ＧＩＴＲＬを含む、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバー及びこれらのリガンドの多くは、癌治療の標的として示唆されており、ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを標的化するいくつかのアゴニスト抗体、例えば、抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７抗体が、様々な充実性腫瘍、並びに、ヘム悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫及びＢ細胞悪性腫瘍など）に対して臨床開発されている。場合によりエフェクタ機能と一体となった、アゴニスト活性の増強という点で改善された性質を有する、本発明の抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ１３７、及び他の抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーの抗体は、充実性腫瘍を含む様々な癌の治療において、治療的に有効であると予測することができる。

【0177】

医薬組成物／投与
本発明は、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。治療用途では、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、医薬的に許容される担体中に活性成分として、有効量の抗体又はＦｃドメイン含有分子を含有する医薬組成物として調製することができる。例示的な医薬的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶剤、分散媒体、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などであり、例えば、塩、緩衝液、抗酸化剤、糖類、植物油又はピーナッツオイルなどの水性若しくは非水性担体、防腐剤、湿潤剤、界面活性剤若しくは乳化剤、又はそれらの組み合わせである。

【0178】

使用され得る例示的な緩衝液は、酢酸、クエン酸、ギ酸、コハク酸、リン酸、炭酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、ホウ酸、トリス緩衝剤、ＨＥＰＰＳＯ及びＨＥＰＥＳである。いくつかの実施形態では、医薬組成物中の緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ又は約５０ｍＭであってもよい。

【0179】

使用され得る例示的なアミノ酸は、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニン、グリシン、アルギニン、リシン、Ｌ−ロイシン、トリロイシン、アラニン、グルタミン酸、Ｌ−スレオニン及び２−フェニルアミンである。医薬組成物中のアミノ酸の濃度は、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、約４０ｍＭ、約４１ｍＭ、約４２ｍＭ、約４３ｍＭ、約４４ｍＭ、約４５ｍＭ、約４６ｍＭ、約４７ｍＭ、約４８ｍＭ、約４９ｍＭ又は約５０ｍＭであってもよい。

【0180】

使用され得る例示的な界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート−２０又はポリソルベート−８０）；ポリオキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）；トリトン；オクチル配糖体ナトリウム（sodium octyl glycoside）；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−又はステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−又はセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノレアミドプロピル−、ミリストアミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリストアミドプロピル−、パルミドプロピル−又はイソステアラミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウム＝メチルココイル−又はジナトリウム＝メチルオレイル−タウレート；並びにＭＯＮＡＱＵＡ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｎ．Ｊ．））、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、及びエチレンとプロピレングリコールとのコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ＰＦ６８など）である。医薬組成物中の界面活性剤の濃度は、約０．０１％ｗ／ｖ、０．０２％ｗ／ｖ、０．０３％ｗ／ｖ、０．０４％ｗ／ｖ、０．０５％ｗ／ｖ、０．０６％ｗ／ｖ、０．０７％ｗ／ｖ、０．０８％ｗ／ｖ、０．０９％ｗ／ｖ又は０．１％ｗ／ｖであってもよい。

【0181】

使用され得る例示的な糖類は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、シリトール（sylitol）、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、グルシトール、マルチトール、ラクチトール又はイソマルツロースなどの、単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、還元糖、非還元糖である。医薬組成物中の糖類の濃度は、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２６０ｍＭ、約２７０ｍＭ、約２８０ｍＭ、約２９０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３９０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４１０ｍＭ、約４２０ｍＭ、約４３０ｍＭ、約４４０ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４６０ｍＭ、約４７０ｍＭ、約４８０ｍＭ、約４９０ｍＭ又は約５００ｍＭであってもよい。

【0182】

使用され得る例示的な塩は、酸付加塩及び塩基付加塩である。酸付加塩としては、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性無機酸由来、並びに、例えば脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸類などの無毒性有機酸由来のものが挙げられる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属由来、並びに、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミン類由来のものが挙げられる。医薬組成物中の塩の濃度は、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ又は約１００ｍＭであってもよい。

【0183】

使用され得る例示的な抗酸化剤は、アスコルビン酸、メチオニン、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、レシチン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediamine tetraacetic acid、ＥＤＴＡ）、ソルビトール及び酒石酸である。

【0184】

使用され得る例示的な防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール又はそれらの混合物である。

【0185】

医薬組成物中の医薬的に許容される担体（単数又は複数）の量は、担体（単数又は複数）の活性及び製剤の所望の特性、例えば安定性及び／又は最小酸化に基づいて実験的に決定され得る。したがって、このような医薬製剤中の本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子の濃度は、約０．５重量％未満から、通常は少なくとも約１重量％まで、最大で１５又は２０重量％まで変動し得、また、選択される具体的な投与方法に従って、必要とされる用量、流体体積、粘度などに主に基づいて選択され得る。

【0186】

例示的な医薬組成物は、２０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１００ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＬ−メチオニン及び０．０２％のポリソルベート８０を含む。これらの医薬組成物は滅菌され、一般には粒子状物質を含まない。これらは、通常の周知の滅菌技術（例えば、濾過）によって滅菌することができる。

【0187】

治療用途のための、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子の投与のモードは、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、ゲル、粒子としての製剤を使用し、注射器、埋め込み式デバイス、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプに入れられた又は当該技術分野において周知の、当業者によって認識される他の手段に含まれ得る製剤を用いた、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、又は皮下、肺、経粘膜投与（経口、鼻腔内、膣内、直腸）などの、抗体を宿主に送達する任意の好適な経路であり得る。部位特異的投与は、例えば、腫瘍内、関節内、気管支内、腹内、関節包内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸郭内、子宮内、血管内、膀胱内、病巣内、腟内、直腸内、口腔内、舌下、鼻腔内、又は経皮送達によって達成され得る。

【0188】

本発明の本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入又はボーラス注射により非経口的に、筋肉内又は皮下又は腹腔内になど任意の好適な経路によって対象に投与することができる。静脈内注入は、例えば、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、若しくは２４０分間にわたって、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２時間にわたって行ってもよい。

【0189】

対象に投与される用量は、治療されている疾患を緩和する又は少なくとも部分的に停止させるために十分（「治療的有効量」）なものであり、時に、０．００５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０５ｍｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ若しくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、又は約４ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ、若しくは約２４ｍｇ／ｋｇ、又は例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ｍｇ／ｋｇであり得るが、更に多量、例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００ｍｇ／ｋｇであってもよい。

【0190】

例えば、５０、１００、２００、５００、若しくは１０００ｍｇの一定の単位用量を与えてもよく、又は患者の表面積に基づいて、例えば、５００、４００、３００、２５０、２００、若しくは１００ｍｇ／ｍ^２の用量を与えてもよい。通常、１〜８用量（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）が患者を治療するために投与されるが、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれよりも多い用量を与えてもよい。

【0191】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子の投与は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、５週間、６週間、７週間、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月以上後に繰り返すことができる。治療コースを繰り返してもよく、長期にわたる投与も同様に可能である。繰り返し投与は、同一用量であっても異なる用量であってもよい。例えば、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、静脈内注入により８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで１週間間隔で８週間にわたり投与され、８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで２週間毎に更に１６週間の投与が続き、その後、８ｍｇ／ｋｇ又は１６ｍｇ／ｋｇで４週間毎の投与を続けて行うことができる。

【0192】

例えば、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇの量の１日投薬量として、治療の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０日目のうちの少なくとも１日に、又は代替として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週目のうちの少なくとも１週に、又はこれらの任意の組み合わせで、２４、１２、８、６、４、又は２時間毎の単一用量又は分割用量を使用して、又はこれらの任意の組み合わせで、提供され得る。

【0193】

また、本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、癌の発現リスクを低下させる、癌の進行における事象の発生の開始を遅延させる、及び／又は癌が寛解期にあるときの再発リスクを低下させるために予防的に投与されてもよい。

【0194】

本発明のＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメイン又は多重特異性分子は、保存のために凍結乾燥し、使用に先立って好適な担体中で再構成することができる。この技術は、従来のタンパク質調製物に関して有効であることが示されており、周知の凍結乾燥及び再構成技術を用いることができる。

【0195】

本発明は一般論として記述されてきたが、本発明の実施形態は、特許請求の範囲の範囲を限定するように解釈されるべきではない以下の実施例で更に開示される。

【0196】

実施例１．ＦｃγＲＩＩに結合するフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの選択
ＦｃγＲＩＩ結合ＦＮ３ドメインを、安定化されたＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号５）に基づいてライブラリから選択した。

【0197】

抗原を、１×ＰＢＳ中の抗原に対して１０倍モル過剰のビオチンを用いて、ＳｕｒｅＬＩＮＫビオチンキット（ＫＰＬ＃８６−００−０１）で標識した。パンニングを、特異的結合クローンを富化する５回の連続ラウンドの開始をとおして行った。ビーズに結合したビオチン化（biotinylated、ｂｔ）ＦｃγＲＩＩＢ、ライブラリブロッキングにおいて過剰の非標識化ＦｃγＲＩＩＡを有するビーズに結合したｂｔ−ＦｃγＲＩＩＢ、陽性選択ビーズに結合したｂｔ−ＦｃγＲＩＩＢの前に陰性選択ビーズに結合したｂｔ−ＦｃγＲＩＩＡ、及びエピトープブロッキングパンニングを含む複数のパンニングアプローチを実行した。

【0198】

ＦＮ３ドメインパニング出力を、３回及び５回のラウンドでＥＬＩＳＡによって、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢへの結合についてスクリーニングした。具体的には、出力物質をＰＣＲにより増幅し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ＃６３９６４９）を使用して、ｐＥＴ１５Ｅ大腸菌発現ベクター［ＢＬ２１コンピテント細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ＃２３０１３２）］にサブクローニングした。次いで、サブクローニングされたＦＮ３ドメイン発現プラスミドをカルベニシリン寒天プレート上で一晩選択した。各パニング及びライブラリから約１００個のコロニーをパンニングされた各ライブラリから採取し（４回のパンニング法から合計で約４０００個）、増殖のためにスケーリングし、発現を誘発させ、単離して、一次ＥＬＩＳＡスクリーニングのために溶解させた。

【0199】

一次ＥＬＩＳＡについては、Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレートに、ウェル当たり１００μＬのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ；ＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）を充填し、次いで４℃で一晩保持した。翌日、ストレプトアビジンでコーティングしたプレートを、３×ＴＢＳＴで洗浄し、次いで、２５０μＬのＳｔａｒｔｉｎｇ ＢｌｏｃｋＴ２０（Ｐｉｅｒｃｅ−ｃａｔ＃３７５４３）で遮断した。１時間のインキュベーション後、全てのプレートを、１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、ｂｔ−ＦｃγＲＩＩＡ、ｂｔ−ＦｃγＲＩＩＢ、又はｂｔ−ＨＳＡ（陰性スクリーニング）（全て１μｇ／ｍＬで）のいずれかのウェル当たり１００μＬで充填し、室温で１時間保持した。前に溶解したＦＮ３ドメインを３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｂｌｏｃｋ Ｔ２０中で１：１０に希釈し、１００μＬずつプレートに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、ウェルに、Ｔｅｎｃｏｎ２７に対するＨＲＰコンジュゲートウサギポリクローナル抗体１００μＬを充填した。室温での最終的な１時間のインキュベーション後、プレートを１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、ウェル当たり１００μＬの化学発光基質ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）で充填し、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。陽性結合コロニー（ＨＳＡと比較すると、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢへの５倍高い結合を示すクローン）をＳａｎｇｅｒシーケンシングにかけ、同定されたコード配列をアミノ酸配列にインシリコ翻訳した。配列固有のＦＮ３ドメインをＢＬ２１細胞で発現させ、ニッケルセファロースプレートを使用して精製した。希釈系列における精製されたＦＮ３ドメインの抗原結合を実施した。具体的には、ＥＬＩＳＡフォーマットでは、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｚ７０４１）を使用して、１μｇ／ｍＬのｂｔ−ＦｃγＲＩＩＢ、ｂｔ−ＦｃγＲＩＩＡ、又は粘着性ＦＮ３ドメインｂｔ−ＨＳＡに対する陰性対照としてのいずれかの５０μＬを捕捉した。このＦＮ３ドメインに１０μＭで添加した後、１２８ｐＭまで１：５で希釈し、Ｔｅｎｃｏｎ２７及びＰＯＤ基質に対するＨＲＰコンジュゲートウサギポリクローナル（Ｒｏｃｈｅ＃１１５８２９５０００１）を使用して結合について検出した。結合曲線及びＥＣ５０値を、Ｘ＝ｌｏｇ（ｘ）変換及びＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄの非線形回帰（曲線勾配）計算を使用して計算した。

【0200】

精製されたＦＮ３ドメインを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０ＧＬカラム（ＳＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２８−９２０５−０４）を使用して、１×ＰＢＳ中のサイズ排除クロマトグラフィＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００）によって評価した。光散乱のために補正されたモニタされた吸光度（２８０ｎｍ）によってモノマー含有量を定量化した。モノマーＴｅｎｃｏｎ２７を参照対照として使用して、溶出時間に基づいて、同様の見かけサイズを有するＦＮ３ドメインを同定した。適切な時間におけるモノマー物質の割合は、ＯｐｅｎＬａｂ ＥＣＭ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した積分分析によって計算された。一般に５０％面積を超えるＴｅｎｃｏｎ２７から約＋／−１分の予想時間範囲のピークを有するクローンを、モノマーとしてまとめた。時間範囲の可視ピークを有さないクローンを、モノマーではないとみなした。

【0201】

初期結合及びサイズ排除クロマトグラフィ、並びにその後のＮＦκＢレポータアッセイに基づいて、ＦｃγＲＩＩに結合する７つのＦＮ３を更に特性化した。これらのＦＮ３ドメインは、多様化Ｃストランド、ＣＤループ、Ｆストランド及びＦＧループを有する米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０２２６８３４号に記載されるＴｅｎｃｏｎ代替Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面ライブラリに由来するものである。選択されたＦＮ３ドメインのアミノ酸及びｃＤＮＡ配列を、それぞれ表３及び表４に示す。図１は、ＦＮ３ドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＦｃγＲＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂへの結合についてのＥＣ５０を、表５に示す。表５に示されるクローンから、Ｒ２ＢＳ６、Ｒ２Ｂ１２、Ｒ２Ｂ２９及びＲ２Ｂ５６は、モノマーであった。

【0202】

【表3】

【0203】

【表4】

【0204】

【表5】

【0205】

実施例２：ＯＸ４０−ＦｃγＲＩＩ ｍＡｂｔｙｒｉｎの生成
ｍＡｂｔｙｒｉｎを生成するために、選択ＦｃγＲＩＩ ＦＮ３ドメインを、ＩｇＧ２σアイソタイプ（野生型ＩｇＧ２と比較したとき、置換Ｖ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを有するエフェクタＦｃ）としてクローン化した抗ＯＸ４０抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ（ＨＣ配列番号３０、ＬＣ配列番号３１）の重鎖のＣ末端で操作した。ＦｃγＲＩＩへの結合、ＮＦ−κＢレポータアッセイにおけるアゴニズム、及び候補ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ／ＡＤＣＰエフェクタ活性を評価した。親抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａを、実験における対照として使用した。表６は、生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎを示す。

【0206】

【表6】

【0207】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ（配列番号３０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0208】

ＯＸ４０ＳＦ２＿ＬＣ（配列番号３１）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0209】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ６＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ６ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＱＹＡＡＷＹＬＰＲＨＨＥＡＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0210】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ９＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ９ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＷＩＹＹＬＥＹＷＲＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＱＩＨＧＶＫＧＧＱＹＳＹＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0211】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ１２＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ１２ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３４）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＡＹＡＥＹＷＥＧＧＥＡＶＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＱＩＮＧＶＫＧＧＦＷＳＩＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0212】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２６＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ２６ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３５）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＡＹＩＥＹＷＴＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＷＩＨＧＶＫＧＧＡＷＳＳＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0213】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３６）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＹＹＷＥＹＲＶＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＹＩＮＧＶＫＧＧＥＥＳＲＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0214】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ３９＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ３９ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３７）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＳＨＧＰＷＹＮＹＧＥＷＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0215】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ５６＿ＨＣ−Ｃアミノ酸（ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ５６ ＦＮ３ドメイン）（配列番号３８）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＳＩＡＹＷＥＹＲＫＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＬＩＹＧＶＫＧＧＷＱＳＫＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0216】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿ＨＣ ｃＤＮＡ（配列番号４６）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

【0217】

ＯＸ４０ＳＦ２＿Ｌｃ ｃＤＮＡ（配列番号４７）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ

【0218】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ６＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号４８）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＣＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＧＡＧＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ

【0219】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ９＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号４９）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＴＧＧＣＧＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＴＴＡＡＧＧＧＣＧＧＴＣＡＡＴＡＴＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ

【0220】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ１２＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５０）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣＴＧＡＴＣＧＣＧＴＡＴＧＣＧＧＡＡＴＡＴＴＧＧＧＡＧＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ

【0221】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２６＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＴＡＴＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧＡＴＴＣＡＣＧＧＣＧＴＴＡＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ

【0222】

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【0223】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ３９＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５３）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＧＣＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＧＴＴＣＴＧＡＡＣＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＴＡＣＡＣＣＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＧＧＣＣＣＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＴＧＧＣＧＴＴＣＴＡＡＣＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣ

【0224】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ５６＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５４）
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【0225】

ｍＡｂｔｙｒｉｎを発現するために、重鎖及び軽鎖を発現する構築物を、製造業者の指示に従ってＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で一過性にトランスフェクトした。簡潔に言えば、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、各ＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を１：３の比でコードする発現構築物でコトランスフェクトした。３７℃で５日間発現した後、遠心分離及び０．２μｍの濾過により上清を清澄化し、ｍＡｂｔｙｒｉｎをプロテインＡ親和性クロマトグラフィにより精製した。精製されたｍＡｂｔｙｒｉｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元（non-reducing、ＮＲ）条件における予想された１７０ｋＤａのタンパク質バンド及び還元（reducing、Ｒ）条件における６０ｋＤの重鎖並びに２５ｋＤａの軽鎖タンパク質バンドが明らかになった。

【0226】

溶液中におけるｍＡｂｔｙｒｉｎの凝集状態を、サイズ排除クロマトグラフィにより評価した。簡潔に言えば、抗体をＴＳＫｇｅｌ Ｇ３ＳＷカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＬＣ）に注入し、それらのサイズをクロマトグラフィにより解明した。全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、約１６分で溶出したタンパク質ピークを有する類似のクロマトグラフィプロファイルを示し、一方、抗体は、約１７分で溶出したタンパク質ピークを示した。

【0227】

実施例３：ＯＸ４０−ＦｃγＲＩＩ ｍＡｂｔｙｒｉｎの特性化
生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎを、それらのＦｃγＲへの結合及びアゴニスト活性について特性化した。親ＯＸ４０抗体ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａを、アッセイをとおしてコンパレータとして使用した。

【0228】

ＨＥＫ２９３ｆ細胞上で発現されたＦｃγＲ上のｍＡｂｔｙｒｉｎの結合
フローサイトメトリ染色
ヒトＦｃγＲＩ（ＮＭ＿０００５６６）（配列番号：４４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＮＭ＿０２１６４２）（配列番号：２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＮＭ＿００４００１）（配列番号：３）、及びＦｃγＲＩＩＩＡ（ＮＭ＿０００５６９）（配列番号：４５）をコードするｃＤＮＡを発現するプラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリアッセイを実施した。トランスフェクションしたＦｃ受容体の発現を確認するために、特異的抗体：ＦｃγＲＩについては１０．１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＦｃγＲＩＩＡについてはＩＶ．３（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＦｃγＲＩＩＢについては（社内で調製）２Ｂ６（Ｖｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２１：３９２−４０４）、及びＦｃγＲＩＩＩＡについては３Ｇ８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、陽性対照としてフローサイトメトリ染色に用いた。

【0229】

１ウェル当たり２×１０^５個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、４℃にて３０分間、ＢＳＡ染色緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＵＳＡ）にてブロッキングした。細胞を、氷上で４℃で１．５時間、試験ｍＡｂｔｙｒｉｎと共にインキュベーションした。ＢＳＡ染色緩衝液で２回洗浄した後、細胞を、Ｒ−ＰＥ標識抗ヒト又は抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に４℃で４５分間、インキュベートした。細胞を、染色緩衝液で２回洗浄し、その後、１：２００希釈したＤＲＡＱ７生／死細胞染色試薬（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）を含有する１５０μＬのＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁した。染色された細胞のＰＥ及びＤＲＡＱ７シグナルを、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）によってそれぞれＢ２及びＢ４チャンネルを使用して検出した。生細胞をＤＲＡＱ７除外でゲートし、収集された少なくとも１０，０００の生細胞イベントについて、幾何平均蛍光シグナルを測定した。解析にはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用した。データを、平均蛍光シグナルに対する抗体濃度の対数としてプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって非線形回帰分析を行い、ＥＣ_５０値を算出した。

【0230】

約９０〜７００ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有するＦｃγＲＩＩＡを発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に結合したｍＡｂｔｙｒｉｎ（表７）及び約５００〜１９００ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有するＦｃγＲＩＩＢを発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に結合したｍＡｂｔｙｒｉｎ（表７）。予想されるように、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａは、ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＢのいずれかに対する結合活性を示さなかった。ＦｃγＲＩ及びＦｃγＩＩＩＡに対する結合は、これらの構築物について試験しなかった。

【0231】

配列番号４４のＦｃγＲＩ
ＭＷＦＬＴＴＬＬＬＷＶＰＶＤＧＱＶＤＴＴＫＡＶＩＴＬＱＰＰＷＶＳＶＦＱＥＥＴＶＴＬＨＣＥＶＬＨＬＰＧＳＳＳＴＱＷＦＬＮＧＴＡＴＱＴＳＴＰＳＹＲＩＴＳＡＳＶＮＤＳＧＥＹＲＣＱＲＧＬＳＧＲＳＤＰＩＱＬＥＩＨＲＧＷＬＬＬＱＶＳＳＲＶＦＴＥＧＥＰＬＡＬＲＣＨＡＷＫＤＫＬＶＹＮＶＬＹＹＲＮＧＫＡＦＫＦＦＨＷＮＳＮＬＴＩＬＫＴＮＩＳＨＮＧＴＹＨＣＳＧＭＧＫＨＲＹＴＳＡＧＩＳＶＴＶＫＥＬＦＰＡＰＶＬＮＡＳＶＴＳＰＬＬＥＧＮＬＶＴＬＳＣＥＴＫＬＬＬＱＲＰＧＬＱＬＹＦＳＦＹＭＧＳＫＴＬＲＧＲＮＴＳＳＥＹＱＩＬＴＡＲＲＥＤＳＧＬＹＷＣＥＡＡＴＥＤＧＮＶＬＫＲＳＰＥＬＥＬＱＶＬＧＬＱＬＰＴＰＶＷＦＨＶＬＦＹＬＡＶＧＩＭＦＬＶＮＴＶＬＷＶＴＩＲＫＥＬＫＲＫＫＫＷＤＬＥＩＳＬＤＳＧＨＥＫＫＶＩＳＳＬＱＥＤＲＨＬＥＥＥＬＫＣＱＥＱＫＥＥＱＬＱＥＧＶＨＲＫＥＰＱＧＡＴ

【0232】

配列番号４５のＦｃγＲＩＩＩＡ
ＭＡＥＧＴＬＷＱＩＬＣＶＳＳＤＡＱＰＱＴＦＥＧＶＫＧＡＤＰＰＴＬＰＰＧＳＦＬＰＧＰＶＬＷＷＧＳＬＡＲＬＱＴＥＫＳＤＥＶＳＲＫＧＮＷＷＶＴＥＭＧＧＧＡＧＥＲＬＦＴＳＳＣＬＶＧＬＶＰＬＧＬＲＩＳＬＶＴＣＰＬＱＣＧＩＭＷＱＬＬＬＰＴＡＬＬＬＬＶＳＡＧＭＲＴＥＤＬＰＫＡＶＶＦＬＥＰＱＷＹＲＶＬＥＫＤＳＶＴＬＫＣＱＧＡＹＳＰＥＤＮＳＴＱＷＦＨＮＥＳＬＩＳＳＱＡＳＳＹＦＩＤＡＡＴＶＤＤＳＧＥＹＲＣＱＴＮＬＳＴＬＳＤＰＶＱＬＥＶＨＩＧＷＬＬＬＱＡＰＲＷＶＦＫＥＥＤＰＩＨＬＲＣＨＳＷＫＮＴＡＬＨＫＶＴＹＬＱＮＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮＩＴＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶＳＦＣＬＶＭＶＬＬＦＡＶＤＴＧＬＹＦＳＶＫＴＮＩＲＳＳＴＲＤＷＫＤＨＫＦＫＷＲＫＤＰＱＤＫ

【0233】

【表7】

【0234】

Ｒａｊｉ細胞上のｍＡｂｔｙｒｉｎの結合
Ｒａｊｉ細胞は、優勢にＦｃγＲＩＩＢを発現するＢ細胞に由来する細胞株である。Ｒａｊｉ細胞上のｍＡｂｔｙｒｉｎの結合を、ＦｃγＲに結合するｍＡｂｔｙｒｉｎの試験について記載したフローサイトメトリアッセイによって検討した。ヒトＩｇＧ（γ）に対するＰＥ標識ヤギＦ（ａｂ’）_２を使用して、ｍＡｂｔｙｒｉｎの結合をフローサイトメトリによって検出した。

【0235】

表８は、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度における結合及び平均シグナルのＥＣ_５０値を示す。研究された全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、Ｒａｊｉ細胞に対する用量依存的に増加した結合を示したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａは結合を示さなかった。１０μｇ／ｍＬの濃度で、全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａと比較して少なくとも６倍高い結合シグナルを示した。ｍＡｂｔｙｒｉｎの中で、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９は、Ｒａｊｉ細胞に対する最も強力な結合を示した。

【0236】

【表8】

【0237】

ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞上のｍＡｂｔｙｒｉｎの結合
細胞上に発現されたＯＸ４０に対するｍＡｂｔｙｒｉｎの結合を、ＦｃγＲに結合するｍＡｂｔｙｒｉｎの試験について記載したフローサイトメトリアッセイによって検討した。ＮＦ−κＢ誘導性プロモータ（ＩＦＮ−β最小プロモータ）の制御下で分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ遺伝子を発現するように改変されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）Ｎｕｌｌ１細胞に、ＯＸ４０発現プラスミド（ｐＵＮＯ１−ｈＯＸ４０）をトランスフェクションし、ヒトＯＸ４０を発現する安定なＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポータ細胞株（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０）を樹立した。ｍＡｂｔｙｒｉｎをＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞と共にインキュベートし、ヒトＩｇＧ（γ）に対してＰＥ標識ヤギＦ（ａｂ’）_２を使用して、フローサイトメトリによって結合を検出した。

【0238】

研究した全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、１μｇ／ｍでＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａと比較した場合に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０と同等の結合を示した（表９）。

【0239】

【表9】

【0240】

ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性
ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を、ＨＥＫ−ＢｌｕｅＮＦ−κＢレポータアッセイを用いて評価した。簡潔に言えば、２００μＬ培地に再懸濁した、１×１０^５個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに分け、ＯＸ４０リガンド又はｍＡｂｔｙｒｉｎを添加した。架橋効果を試験するために、１μＬのプロテインＧ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）又は１×１０^５個のＲａｊｉ細胞のいずれかを、同じアッセイウェルに添加した。３７℃で一晩インキュベーションした後、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ検出キット（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して、誘導により分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータ遺伝子発現を定量化することにより、ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を評価した。簡潔に言えば、４０μＬの細胞培養上清を１６０μＬのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ試薬と混合し、適切な青色が生じるまで、３７℃でインキュベーションした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、６５０ｎｍにおけるＯＤを測定した。ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を、１μｇ／ｍＬのＯＸ４０リガンドにより誘導される活性に対する活性（％）として、正規化した。

【0241】

ＯＸ４０リガンドの確立されたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞株からの用量依存的に刺激されたレポータ遺伝子発現は、トランスフェクトされたＯＸ４０の機能的発現を示す。

【0242】

試験された全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａについて観察されたものと同様の、ＨＥＬ−Ｂｌｕｅにおける弱い架橋非依存的アゴニスト活性を示した。Ｒａｊｉ細胞との架橋は、試験されたｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を増強したが、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａに影響を及ぼさなかった。ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＡ結合抗体（それぞれ、２Ｂ６及びＩＶ．３）のいずれか、又は対応するＦＮ３ドメイン（それぞれ、Ｒ２ｂ２９及びＲ２ＢＳ２６）を用いて、ｍＡｂｔｙｒｉｎのＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ９＿ＨＣ−Ｃ及びＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２６＿ＨＣ−ＣとＦｃγＲとの相互作用をブロッキングすることにより、ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を低下させた。これは、Ｒａｊｉ細胞上のＦｃγＲＩＩ ＦＮ３ドメインとＦｃγＲとの相互作用が、ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を増強するために必要であることが示された。表１０は、１μｇ／ｍｌのＯＸ４０リガンドに対する活性パーセントとして表されたＲａｊｉ細胞との架橋を伴うか、又は伴わない１μｇ／ｍｌのｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性並びに架橋時のアゴニズムの増強の倍率を示す。表１１は、抗ＦｃγＲＩＩ ｍＡｂ又は対応するＦＮ３ドメインでプレブロッキングした後の、選択ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を示す。

【0243】

【表10】

【0244】

【表11】

【0245】

Ｒａｊｉ細胞と同様に、Ｄａｕｄｉ細胞も、Ｂ細胞に由来し、かつ優勢にＦｃγＲＩＩＢを発現する。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｃは、Ｄａｕｄｉ細胞への結合を実証した。Ｄａｕｄｉ細胞との架橋は、Ｄａｕｄｉ細胞上のＦｃγＲＩＩ受容体がｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニズムを促進するために架橋活性を提供したことを示すＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｃのアゴニスト活性を促進した。表１２は、Ｄａｕｄｉ細胞を使用して、架橋を伴うか又は架橋を伴わないｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性及びＯＸ４０リガンドと比較したときの活性パーセントとして表される架橋時のアゴニズム増強の倍率を示す。

【0246】

【表12】

【0247】

ｍＡｂｔｙｒｉｎのエフェクタ機能
生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を評価した。
ＡＤＣＣアッセイ
製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）により指示されるとおりに、ＡＤＣＣレポータバイオアッセイにより、ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ活性を評価した。簡潔に言えば、９６ウェルプレートにプレートしたウェル当たり２５，０００個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体の活性化がルシフェラーゼレポータの発現につながる操作されたエフェクタ細胞と一晩混合した。ｍＡｂｔｙｒｉｎをこの細胞に添加し、３７℃で６時間インキュベートした。次いで、Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬を添加し、ルシフェラーゼシグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎにより定量化した。ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ活性を、試験抗体を添加しない活性化に対して、ルシフェラーゼシグナルの活性化が何倍であるかとして表した。

【0248】

ＡＤＣＰアッセイ
ＧＦＰを発現するＯＸ４０標的細胞株を、Ｔｕｒｂｏ ＧＦＰ形質導入粒子（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を感染させることにより樹立した。安定なＧＦＰ発現細胞を、ピューロマイシンを用いて選択した。ＣＤ１６が枯渇（depletion）していない、陰性ヒト単球濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ヒトＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋単球をＰＢＭＣ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ）から単離した。１０％ＦＢＳを含有するＸ−ＶＩＶＯ−１０培地（Ｌｏｎｚａ）に、単離した単球を蒔き、２５ｎｇ／ｍＬのマクロファージコロニー刺激因子（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を７日間添加することで、単球をマクロファージに分化させた。ＩＦＮγ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、分化の最後の２４時間の間添加した。ＡＤＣＰアッセイのため、１×１０^５個／ウェルの分化したマクロファージを、９６ウェルＵ底プレートで、２００μＬ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）中、０．２５×１０^５個／ウェルのＧＦＰ発現ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞（４：１比）と混合した。試験ｍＡｂｔｙｒｉｎを添加し、３７℃のインキュベータ内で２４時間プレートをインキュベートした。次いで、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を剥離し、ＢＳＡ染色バッファに再懸濁させた。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を連結した抗ＣＤ１１ｂ及び抗ＣＤ１４抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、マクロファージを染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＵＳＡ）を使用するフローサイトメトリにより、ＧＦＰ陽性ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０標的細胞及びＡｌｅｘａ６４７陽性マクロファージを識別した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを分析し、以下の式：殺傷された標的細胞の割合＝（（抗体濃度が最小の場合のＧＦＰ^＋、ＣＤ１１ｂ⁻、ＣＤ１４⁻細胞の割合）−（抗体濃度が試験濃度の場合のＧＦＰ^＋、ＣＤ１１ｂ⁻、ＣＤ１４⁻細胞の割合））／（抗体濃度が最小の場合のＧＦＰ^＋、ＣＤ１１ｂ⁻、ＣＤ１４⁻細胞の割合）×１００を使用して、ＧＦＰ蛍光の減少を測定することにより、ＡＤＣＰが介在する細胞殺傷を測定した。

【0249】

結果
ｍＡｂｔｙｒｉｎもＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａも、エフェクタサイレントＦｃのために、ＡＤＣＣ活性を有しなかった。このデータは、同定されたＦＮ３ドメインが、ＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を有しなかったこと、及び親抗体のＣ末端へのＦＮ３の添加が、ＡＤＣＣに影響を及ぼさなかったことを示した（データは示さず）。全ての試験されたｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＯＸ４０発現細胞の有意なＡＤＣＰを媒介したが、一方ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａはＡＤＣＰを媒介しなかった。表１３は、ＡＤＣＰアッセイにおいて、１μｇ／ｍｌの試験ｍＡｂｔｙｒｉｎによって殺傷されたＯＸ４０細胞の割合を示す。ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＰ活性は、おそらくは、ｍＡｂｔｙｒｉｎのマクロファージ上のＦｃγＲＩＩＡとの相互作用によって媒介された。

【0250】

【表13】

【0251】

実施例４：様々な構成を有するｍＡｂｔｙｒｉｎの生成及び特性化
ＦｃγＲＩＩ ＦＮ３ドメインの配置がｍＡｂｔｙｒｉｎ特性に影響を及ぼすかどうかを評価するために、Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメインを、抗ＯＸ４０抗体への異なる位置で操作した。抗体重鎖のＣ末端にＦＮ３ドメインを結合させる以外に、ＯＸ４０抗体の軽鎖のＣ末端にＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎ（ＬＣ−Ｃ構築物）、軽鎖のＮ末端にＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎ（ＬＣ−Ｎ）構築物、又は重鎖のＮ末端にＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎ（ＨＣ−Ｎ構築物）を生成した。ｍＡｂｔｙｒｉｎを、野生型ＩｇＧ１又はエフェクタサイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａとしてクローン化した。ｍＡｂｔｙｒｉｎを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞中に重鎖及び軽鎖構築物をトランスフェクトし、続いてプロテインＡ親和性クロマトグラフィによってｍＡｂｔｙｒｉｎ精製を行うことによって生成した。精製されたｍＡｂｔｙｒｉｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、非還元（ＮＲ）条件下で、予想される１７０ｋＤａのタンパク質バンドが明らかになった。

【0252】

表１４は、生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎを示す。ｍＡｂｔｙｒｉｎを、本明細書に記載のアッセイを使用して、ＦｃγＲへのそれらの結合、アゴニズム、エフェクタ機能、及びＴ細胞活性化について特性化した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１（ＨＣ配列番号３９；ＬＣ配列番号３１）又はＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ（ＨＣ配列番号３０；ＬＣ配列番号３１）をアッセイにおける対照として使用した。

【0253】

【表14】

【0254】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１＿ＨＣ（ＯＸ４０ＳＦ２ Ｆｖ＋ＩｇＧ１定常ドメイン）（配列番号３９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0255】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｎ（Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメイン＋リンカー＋ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ）（配列番号４０）：
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＹＹＷＥＹＲＶＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＹＩＮＧＶＫＧＧＥＥＳＲＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＡＡＡＳＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＡＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0256】

ｌｃＯＸ４０ＳＦ２＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＬＣ−Ｎ（Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメイン＋リンカー＋ＯＸ４０ＳＦ２軽鎖）（配列番号４１）
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＹＹＷＥＹＲＶＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＹＩＮＧＶＫＧＧＥＥＳＲＰＬＳＡＩＦＴＴＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ

【0257】

ｌｃＯＸ４０ＳＦ２＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＬＣ−Ｃ（ＯＸ４０ＳＦ２軽鎖＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメイン（配列番号４２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＤＶＧＡＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＩＮＹＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＹＹＷＥＹＲＶＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＹＩＮＧＶＫＧＧＥＥＳＲＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0258】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｃ（ＳＦ２ＩｇＧ１重鎖＋リンカー＋Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメイン（配列番号４３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＫＤＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＧＩＹＰＮＮＧＧＳＴＹＮＱＮＦＫＤＲＶＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＭＧＹＨＧＰＨＬＤＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＲＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＰＩＹＹＷＥＹＲＶＧＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＦＶＹＩＮＧＶＫＧＧＥＥＳＲＰＬＳＡＩＦＴＴ

【0259】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１ ｃＤＮＡ（配列番号５５）
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【0260】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｎ ｃＤＮＡ（配列番号５６）
ＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＡＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＧＧＴＣＣＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＴＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＡＴＡＡＣＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＴＡＴＣＡＣＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＴＡＣＴＣＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＣＣＴＧＡＧＧＴＣＡＣＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＣＧＴＴＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＣＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＣＧＧＧＴＡＡＡ

【0261】

ｌｃＯＸ４０ＳＦ２＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＬＣ−Ｎ ｃＤＮＡ（配列番号５７）
ＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＴＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＣＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＡＣＡＡＧＧＣＡＣＡＣＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ

【0262】

ｌｃＯＸ４０ＳＦ２＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＬＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５８）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＴＣＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＡＧＴＡＣＡＧＡＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＧＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＧＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＡ

【0263】

ｈｃＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１＿Ｒ２ＢＳ２９＿ＨＣ−Ｃ ｃＤＮＡ（配列番号５９）
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【0264】

Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞上で発現されたＦｃγ受容体上のｍＡｂｔｙｒｉｎの結合
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞上で一過的に発現されたＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡに対するＯＸ４０ｍＡｂ×Ｒ２ＢＳ２９センチリンの結合を、上記のフローサイトメトリによって検討した。Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＦＮ３ドメインの位置付けに無関係にＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに結合し、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＩＡへの結合は示さなかった。表１５は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で発現された様々なＦｃγＲに対するｍＡｂｔｙｒｉｎの結合のＥＣ５０値を示す。

【0265】

【表15】

【0266】

Ｒａｊｉ細胞及びＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞へのｍＡｂｔｙｒｉｎの結合
生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＦＮ３ドメインの位置付けに無関係にＲａｊｉ細胞への結合を示したが、一方親エフェクタサイレントｍＡｂ ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａは結合を示さなかった。全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＦＮ３ドメインの位置に無関係に、ＨＥＫＢｌｕｅ：ＯＸ４０細胞上に発現されたＯＸ４０への結合を実証した。表１６は、結合のＥＣ５０値を示す。ｍＡｂｔｙｒｉｎについての結合の効力は、対応する天然抗体と同等であり、Ｒ２ＢＳ２９ ＦＮ３ドメインの様々な位置での抗体上への結合が、それらの標的を認識する抗体に影響を及ぼさなかったことを示唆している。

【0267】

【表16】

【0268】

ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニズム
全ての生成されたｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞に対する弱い架橋非依存性アゴニスト活性を実証した。プロテインＧとの架橋は、ｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を押し上げた。Ｒａｊｉ細胞との架橋は、重鎖又は軽鎖のいずれかにおいてＣ末端結合ＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を押し上げた。しかしながら、Ｒａｊｉ細胞は、ＦＮ３ドメインが重鎖又は軽鎖のいずれかのＮ末端に位置付けられたｍＡｂｔｙｒｉｎのアゴニスト活性を有意に押し上げなかった。アゴニズムは、野生型ＩｇＧ１又はエフェクタサイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａとしてクローン化されたｍＡｂｔｙｒｉｎで観察され、アイソタイプが、ｍＡｂｔｙｒｉｎを含有するＦｃγＲＩＩ ＦＮ３ドメインのアゴニズムに影響を及ぼさないことを示した。表１７は、アッセイで得られたＥＣ５０値を示す。

【0269】

【表17】

【0270】

ｍＡｂｔｙｒｉｎのエフェクタ機能
ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣ活性を評価した。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰを、上記のプロトコルを用いて評価した。

【0271】

ＣＤＣアッセイ
抗ＯＸ４０抗体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を、補体が介在する細胞殺傷アッセイにより評価した。簡潔に言えば、ウサギ補体（Ｃｅｄａｒ Ｌａｎｅ Ｌａｂｓ）及び試験ｍＡｂｔｙｒｉｎと共に、１００，０００個のＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞を９６ウェルプレートで１時間、インキュベーションした。溶解させたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ：ＯＸ４０細胞の細胞質基質から上清中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（lactate dehydrogenase、ＬＤＨ）の活性を、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）により定量化した。補体が介在する細胞傷害を、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００により溶解されたものに対する細胞傷害性（％）として表した。

【0272】

ＦＮ３ドメインは、ｍＡｂｔｙｒｉｎのＡＤＣＣ活性に更には影響を与えなかった。全てのエフェクタサイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａ ｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＡＤＣＣを示さず、ＩｇＧ１ ｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１に対する同等のＡＤＣＣを示した。ｍＡｂｔｙｒｉｎ上のＦＮ３ドメインは、ｍＡｂｔｙｒｉｎ上のそれらの位置に無関係にＯＸ４０発現細胞の効率的なＡＤＣＰを促進した。エフェクタサイレントＩｇＧ２ｓｉｇｍａとしてクローンされたｍＡｂｔｙｒｉｎは、ロバストなＡＤＣＰを示したが、一方ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａは、ＡＤＣＰを示さなかった。ＩｇＧ１ ｍＡｂｔｙｒｉｎは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と同等のＡＤＣＰ活性を示し、一方ＦＮ３ドメインが軽鎖のＣ末端に位置し、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較したとき、若干改善された効力を有した。ｍＡｂｔｙｒｉｎ上のＦＮ３ドメインは、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１と比較したとき、ＣＤＣに影響を及ぼさなかった。表１８は、各々試験されたｍＡｂｔｙｒｉｎについてのＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰの程度を示す。

【0273】

【表18】

【0274】

Ｔ細胞活性化に対するｍＡｂｔｙｒｉｎの効果
Ｔ細胞活性化に対するｍＡｂｔｙｒｉｎの効果を評価した。簡潔に言えば、組み換えＦｃＲＩＩＢ又はＦｃＲＩＩＡタンパク質をプレート上にコーティングして、架橋活性を提供した。γγＴ細胞活性化アッセイについては、ＤＰＢＳ中、３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び１μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃμＲＩＩＡタンパク質の１００γＬを、Ｕ底９６ウェル組織培養プレートで一晩コーティングした。ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、陰性選択によってＰＢＭＣから単離した。ＯＸ４０発現を、単離されたＴ細胞を、１μｇ／ｍＬのＰＨＡの存在下で一晩培養することによって誘導した。アッセイ当日に、プレート中のコーティング溶液を吸引し、プレートをブロックするために、１５０μＬのＲＰＭＩ培地を添加した。培養したＴ細胞を、ＲＰＭＩ培養培地で３回洗浄し、２５，０００〜５０，０００個のＣＤ４陽性Ｔ細胞をアッセイプレート内の各ウェルに播種した。試験ｍＡｂｔｙｒｉｎをこの細胞に添加し、プレートを３日間インキュベートした。Ｔ細胞活性化を、ヒトＩＦＮγ又はＴＮＦαＥＬＩＳＡ検出キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）によって定量化されるＩＦＮγ又はＴＮＦα産生の誘導によって評価した。Ｔ細胞活性化アッセイの前に、ｍＡｂｔｙｒｉｎの固定化ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＡタンパク質に対する結合親和性を、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。このアッセイでは、１日前に、１γｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＡタンパク質の１００γＬをＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート上にコーティングした。ｍＡｂｔｙｒｉｎをアッセイウェルに添加し、２時間インキュベートした。ｍＡｂｔｙｒｉｎの固定化ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃμＲＩＩＡへの結合を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（γ）二次抗体によって検出し、ＴＭＢ基質を使用するＥＬＩＳＡアッセイで定量化した。

【0275】

試験した全てのｍＡｂｔｙｒｉｎは、ｍＡｂｔｙｒｉｎ内のＦＮ３ドメインの位置付けに無関係に、用量依存的な様式で固定化されたＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＡタンパク質への結合を示した。エフェクタサイレントＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａは、いずれの受容体にも結合しないことを実証した。ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１は、固定化されたＦｃγＲＩＩＢへ派結合しないこと、及び固定化されたＦｃγＲＩＩＡへの若干の結合を示した（データを示さず）。

【0276】

この試験条件下では、ＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ１もＯＸ４０ＳＦ２ＩｇＧ２ｓｉｇｍａ ｍＡｂのいずれも、固定化ＦｃγＲＩＩへの結合の欠如又は低減を示す、このＴ細胞活性化アッセイにおいて有意なアゴニスト活性を示さなかった。重鎖のＣ末端に位置付けられたＦＮ３ドメインを有するｍＡｂｔｙｒｉｎは、アイソタイプに無関係に、ＩＦＮγ又はＴＮＦα産生を用量依存的に媒介した。ｍＡｂｔｙｒｉｎ中のＮ末端へＦＮ３ドメインを位置付けることは、Ｔ細胞を活性化する能力を抗体に付与しなかった。表１９は、ｍＡｂｔｙｒｉｎが、ＦｃγＲＩＩＢ又はＦｃγＲＩＩＡのいずれかによって架橋された活性化Ｔ細胞によるＩＦＮγ又はＴＮＦαの産生を誘導したことを示す。

【0277】

【表19】

【図1】

【配列表】

2020537492000001.app

【国際調査報告】