特表 2021-500072 血友病Ａに対する遺伝子編集用組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-500072(P2021-500072A)

(43)【公表日】2021年1月7日

(54)【発明の名称】血友病Ａに対する遺伝子編集用組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20201204BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20201204BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20201204BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20201204BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20201204BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20201204BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20201204BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20201204BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20201204BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20201204BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20201204BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20201204BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20201204BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 110

   C12N15/55ZNA

   C12N15/31

   C12N15/113 Z

   C12N9/16 Z

   C12N15/12

   C12N15/864 100Z

   C12N5/10

   A61P7/04

   A61K31/7088

   A61K48/00

   A61K9/127

   A61K9/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】169

(21)【出願番号】特願2020-542542(P2020-542542)

(86)(22)【出願日】2018年10月17日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月12日

(86)【国際出願番号】US2018056390

(87)【国際公開番号】WO2019079527

(87)【国際公開日】20190425

(31)【優先権主張番号】62/573,633

(32)【優先日】2017年10月17日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】518370079

【氏名又は名称】クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(71)【出願人】

【識別番号】520135736

【氏名又は名称】バイエル ヘルスケア リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】アラン リチャード ブルックス

【テーマコード（参考）】

4B050

4B065

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B050CC03

4B050CC07

4B050DD02

4B050LL01

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BA02

4B065BA05

4B065CA24

4B065CA44

4C076AA19

4C076AA31

4C076AA95

4C076BB13

4C076CC14

4C076DD63

4C076FF31

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA53

(57)【要約】

提供されるものには、対象の血友病Ａをエキソビボ又はインビボで治療するための材料及び方法が含まれる。また提供されるものには、ゲノムに、詳細にはアルブミン遺伝子の遺伝子座にＦＶＩＩＩコード遺伝子をノックインするための材料及び方法も含まれる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を含むシステム。

【請求項2】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、請求項２に記載のシステム。

【請求項5】

前記ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、請求項２に記載のシステム。

【請求項6】

前記ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、請求項２に記載のシステム。

【請求項7】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項8】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項9】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、宿主細胞での発現にコドン最適化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項10】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、宿主細胞での発現にコドン最適化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項11】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項12】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項13】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１２に記載のシステム。

【請求項14】

前記ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項15】

前記ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項１４に記載のシステム。

【請求項16】

前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

前記ｇＲＮＡ標的部位が前記システム中のｇＲＮＡにとっての標的部位である、請求項１５又は１６に記載のシステム。

【請求項18】

前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、前記システム中のｇＲＮＡにとってのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項１７に記載のシステム。

【請求項19】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項20】

前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡもまた含む、請求項１９に記載のシステム。

【請求項21】

前記ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項22】

細胞のゲノムを編集する方法であって、
前記細胞に以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を提供することを含む方法。

【請求項23】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項27】

前記ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項28】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記細胞での発現にコドン最適化される、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、前記細胞での発現にコドン最適化される、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡにとっての標的部位である、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡにとっての前記細胞ゲノム内のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡもまた含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを前記細胞に提供することを含む、請求項２２〜４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された５日以上後に前記細胞に提供される、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）が前記細胞に提供された少なくとも１４日後に前記細胞に提供される、請求項２２〜４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に前記細胞に提供される、請求項４３又は４４に記載の方法。

【請求項46】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで前記細胞に提供される、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、請求項２２〜４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞がヘパトサイトである、請求項２２〜４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

請求項２２〜４８のいずれか一項に記載の方法によって前記細胞の前記ゲノムが編集されている遺伝子修飾細胞。

【請求項50】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、請求項４９に記載の遺伝子修飾細胞。

【請求項51】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、前記細胞での発現にコドン最適化される、請求項４９又は５０に記載の遺伝子修飾細胞。

【請求項52】

前記細胞がヘパトサイトである、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細胞。

【請求項53】

対象の血友病Ａを治療する方法であって、
前記対象の細胞に以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を提供することを含む方法。

【請求項54】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項58】

前記ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項59】

前記対象が、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記対象が、血友病Ａのリスクがあると診断される、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される、請求項５３〜６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸が、前記細胞での発現にコドン最適化される、請求項５３〜６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、前記細胞での発現にコドン最適化される、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、請求項５３〜６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ、（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び（ｃ）の前記ドナー鋳型のうちの１つ以上がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項５３〜６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、請求項５３〜６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

前記ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列を含むドナーカセットを含み、前記ドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項５３〜６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡにとっての標的部位である、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

前記ドナー鋳型の前記ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）の前記ｇＲＮＡにとっての前記細胞ゲノム内の前記ｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、前記ドナー鋳型を前記対象に投与することを含む、請求項５３〜７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記投与が静脈内経路による、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、請求項５３〜７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記リポソーム又は脂質ナノ粒子が前記ｇＲＮＡもまた含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ｇＲＮＡ及び前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記リポソーム又は脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記投与が静脈内経路による、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼを前記細胞に提供することを含む、請求項５３〜７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された５日以上後に前記細胞に提供される、請求項５３〜８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）の前記ドナー鋳型が前記細胞に提供された少なくとも１４日後に前記細胞に提供される、請求項５３〜８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に前記細胞に提供される、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで前記細胞に提供される、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

（ａ）の前記ｇＲＮＡ及び（ｂ）の前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を前記細胞に提供することが、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及び前記ｇＲＮＡを含む脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

（ｃ）の前記ドナー鋳型を前記細胞に提供することが、ＡＡＶベクターにコードされた前記ドナー鋳型を前記対象に投与することを含む、請求項８１〜８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列が、前記内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、請求項５３〜８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記細胞がヘパトサイトである、請求項５３〜８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項89】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする前記核酸配列が前記対象の肝臓で発現する、請求項５３〜８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

対象の血友病Ａを治療する方法であって、
請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の遺伝子修飾細胞を前記対象に投与すること
を含む方法。

【請求項91】

前記遺伝子修飾細胞が前記対象にとって自己性である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記対象から生体試料を採取することであって、前記生体試料がヘパトサイト細胞を含み、前記遺伝子修飾細胞が前記ヘパトサイトから調製されること
を更に含む、請求項９０又は９１に記載の方法。

【請求項93】

請求項１〜２１のいずれか一項に記載のシステムの１つ以上のエレメントを含み、且つ使用説明書を更に含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５７３，６３３号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、この仮特許出願の開示は全体として参照により本明細書に援用される。

【0002】

本明細書によって提供される開示は、エキソビボ及びインビボの両方での血友病Ａ患者の治療用材料及び方法に関する。加えて、本開示は、細胞における第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）などの血液凝固タンパク質の発現、機能又は活性をゲノム編集によって調節するための編集用材料及び方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

血友病Ａ（ＨｅｍＡ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の遺伝的欠陥が原因で血中のＦＶＩＩＩタンパク質レベルが低くなり又は検出不能となることによって引き起こされる。この結果、組織傷害部位での血栓形成が無効となり、治療しなければ致命的となり得る制御されない出血につながる。欠損しているＦＶＩＩＩタンパク質の補充はＨｅｍＡ患者に有効な治療であり、現行の標準治療である。しかしながら、タンパク質補充療法は高頻度のＦＶＩＩＩタンパク質静脈内注射が必要であり、これは成人には不便であり、小児には問題があり、法外な費用がかかり（＞＄２００，０００／年）、治療レジメンに厳密に従わなければ破綻出血イベントが起こり得る。

【0004】

ＦＶＩＩＩ遺伝子は、肝臓並びに体内の他の部位に存在する類洞内皮細胞に主に発現する。外因性ＦＶＩＩＩは肝臓のヘパトサイトに発現し、そこから分泌されて循環中にＦＶＩＩＩを生じさせ、そのようにして疾患の治癒に影響を及ぼし得る。肝臓のヘパトサイトを標的とする遺伝子送達方法が開発されており、従って動物モデル及び臨床試験の患者の両方でＨｅｍＡの治療としてそうした方法を用いてＦＶＩＩＩ遺伝子が送達されている。

【0005】

血友病Ａの根治は極めて望ましい。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いる従来のウイルスベースの遺伝子療法は、前臨床動物モデル及び患者において有望である可能性はあるが、不都合な点が幾つもある。ＡＡＶベースの遺伝子療法は、ＡＡＶウイルスカプシド（典型的には、とりわけ、血清型ＡＡＶ５、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０を使用する）の内部に封入された、肝臓特異的プロモーターによってドライブされるＦＶＩＩＩ遺伝子を使用する。遺伝子療法に使用されるＡＡＶウイルスはいずれも、パッケージングされた遺伝子カセットを形質導入細胞の核内に送達し、そこで遺伝子カセットはほぼ例外なくエピソームのまま留まり、治療用タンパク質を生じさせるのは、この治療用遺伝子のエピソームコピーである。ＡＡＶは、その封入されたＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込む機構を有さず、代わりにエピソームとして維持され、従って宿主細胞の分裂時に複製されない。エピソームＤＮＡはまた、時間とともに分解にも曝され得る。ＡＡＶエピソームを含有する肝細胞が誘導されて分裂すると、ＡＡＶゲノムは複製されず、代わりに希釈されることが実証されている。結果として、ＡＡＶベースの遺伝子療法は、肝臓がまだ成人サイズに達していない小児に行われる場合には有効でないものと思われる。加えて、現在、成人ヒトに行われるときＡＡＶベースの遺伝子療法がどのくらい持続するかは不明であり、しかし動物データでは、１０年もの期間にわたって治療効果の喪失がごく僅かであることが実証されている。従って、ＨｅｍＡに対する新規の有効な且つ浸透する（ｐｅｒｍｅａｎｔ）治療の開発が決定的に必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

一態様において、本明細書には、内因性アルブミン遺伝子座内又はその近傍にあるゲノム配列と相補的な配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列が提供される。

【0007】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも８５％の相同性を有するその変異体から選択されるスペーサー配列を含む。

【0008】

別の態様において、本明細書には、上述のｇＲＮＡのいずれかを有する組成物が提供される。

【0009】

一部の実施形態において、組成物のｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも８５％の相同性を有するその変異体から選択されるスペーサー配列を含む。

【0010】

一部の実施形態において、本組成物は、以下：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を有するドナー鋳型のうちの１つ以上を更に含む。

【0011】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。

【0012】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0013】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はコドン最適化される。

【0014】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列はコドン最適化される。

【0015】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

【0016】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。

【0017】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、共有結合でｇＲＮＡに連結される。

【0018】

一部の実施形態において、本組成物はリポソーム又は脂質ナノ粒子を更に含む。

【0019】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0020】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0021】

一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0022】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0023】

別の態様において、本明細書には、上記に記載される組成物のいずれかを有し、且つ使用説明書を更に有するキットが提供される。

【0024】

別の態様において、本明細書には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と；第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型とを含むシステムが提供される。

【0025】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0026】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0027】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、宿主細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。

【0028】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸は、宿主細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、宿主細胞はヒト細胞である。

【0029】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

【0030】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0031】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0032】

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位はシステム中のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、システム中のｇＲＮＡにとってのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。

【0033】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0034】

一部の実施形態において、本システムは、ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。

【0035】

別の態様において、本明細書には、細胞のゲノムを編集する方法が提供され、この方法は、細胞に以下：（ａ）上記に記載したｇＲＮＡのいずれか；（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を有するドナー鋳型を提供することを含む。

【0036】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0037】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも８５％の相同性を有するその変異体から選択されるスペーサー配列を有する。

【0038】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される。

【0039】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0040】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。

【0041】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、細胞での発現にコドン最適化される。

【0042】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

【0043】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。

【0044】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0045】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡは、共有結合でｇＲＮＡに連結される。

【0046】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0047】

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノム内のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。一部の実施形態において、

【0048】

一部の実施形態において、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つ以上はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0049】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0050】

一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0051】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは細胞への提供前にｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0052】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。

【0053】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された約１〜１４日後に細胞に提供される。

【0054】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される。

【0055】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。

【0056】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される。

【0057】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される。

【0058】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は細胞のゲノム配列に挿入される。

【0059】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子又はアルブミン遺伝子調節エレメントにあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0060】

一部の実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにある。

【0061】

一部の実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端から少なくとも３７ｂｐ下流且つゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端から少なくとも３３０ｂｐ上流である。

【0062】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0063】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0064】

別の態様において、本明細書には、上記に記載される方法のいずれかによって細胞のゲノムが編集されている遺伝子修飾細胞が提供される。

【0065】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は細胞のゲノム配列に挿入される。

【0066】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子又はアルブミン遺伝子調節エレメントにあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0067】

一部の実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにある。

【0068】

一部の実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端から少なくとも３７ｂｐ下流且つゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端から少なくとも３３０ｂｐ上流である。

【0069】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0070】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列はコドン最適化される。

【0071】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0072】

別の態様において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供され、この方法は、対象の細胞に以下：（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型を提供することを含む。

【0073】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0074】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である。

【0075】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。

【0076】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される。

【0077】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0078】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。

【0079】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、細胞での発現にコドン最適化される。

【0080】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。

【0081】

一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）である。一部の実施形態において、前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡはｍＲＮＡである。

【0082】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ、（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び（ｃ）のドナー鋳型のうちの１つ以上はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0083】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0084】

一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノム内のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。

【0085】

一部の実施形態において、ドナー鋳型を細胞に提供することは、ドナー鋳型を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、投与は静脈内経路による。

【0086】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0087】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することは、リポソーム又は脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、投与は静脈内経路による。

【0088】

一部の実施形態において、本方法は、ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞に提供することを含む。

【0089】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。

【0090】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される。

【0091】

一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む。

【0092】

一部の実施形態において、（ｃ）のドナー鋳型を細胞に提供することは、ＡＡＶベクターにコードされたドナー鋳型を対象に投与することを含む。

【0093】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0094】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0095】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は対象の肝臓で発現する。

【0096】

別の態様において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供される。本方法は、上述の遺伝子修飾細胞のいずれかを対象に投与することを含む。

【0097】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である。

【0098】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。

【0099】

一部の実施形態において、遺伝子修飾細胞は自己性である。

【0100】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0101】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は細胞のゲノム配列に挿入される。

【0102】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子又はアルブミン遺伝子調節エレメントにあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0103】

一部の実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにある。

【0104】

一部の実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端から少なくとも３７ｂｐ下流且つゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端から少なくとも３３０ｂｐ上流である。

【0105】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0106】

一部の実施形態において、本方法は、対象から生体試料を採取することであって、生体試料がヘパトサイト細胞を含むこと、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を細胞のゲノム配列に挿入することによりヘパトサイト細胞のゲノムを編集することであって、それにより遺伝子修飾細胞を作製することを更に含む。

【0107】

別の態様において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供される。本方法は、対象から生体試料を採取することであって、生体試料がヘパトサイト細胞を含むこと、ヘパトサイト細胞に以下：（ａ）上記に記載されるｇＲＮＡのいずれか；（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を有するドナー鋳型を提供することであって、それにより遺伝子修飾細胞を作製すること、及び遺伝子修飾細胞を対象に投与することを含む。

【0108】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である。

【0109】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。

【0110】

一部の実施形態において、遺伝子修飾細胞は自己性である。

【0111】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも８５％の相同性を有するその変異体から選択される配列を含む。

【0112】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。

【0113】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0114】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はコドン最適化される。

【0115】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列はコドン最適化される。

【0116】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。

【0117】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）配列である。

【0118】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合でｇＲＮＡに連結される。

【0119】

一部の実施形態において、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つ以上はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0120】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0121】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0122】

一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0123】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは細胞への提供前にｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0124】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。

【0125】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された約１〜１４日後に細胞に提供される。

【0126】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は細胞のゲノム配列に挿入される。

【0127】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子又はアルブミン遺伝子調節エレメントにあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0128】

一部の実施形態において、挿入は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにある。

【0129】

一部の実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端から少なくとも３７ｂｐ下流且つゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端から少なくとも３３０ｂｐ上流である。

【0130】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0131】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0132】

別の態様において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供される。本方法は、対象の細胞に以下：（ａ）上記に記載されるｇＲＮＡのいずれか；（ｂ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を有するドナー鋳型を提供することを含む。

【0133】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である。

【0134】

一部の実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。

【0135】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも８５％の相同性を有するその変異体から選択される配列を含む。

【0136】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される。

【0137】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0138】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はコドン最適化される。

【0139】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列はコドン最適化される。

【0140】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列である。

【0141】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）配列である。

【0142】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列は、共有結合でｇＲＮＡに連結される。

【0143】

一部の実施形態において、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のうちの１つ以上はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0144】

一部の実施形態において、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。

【0145】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。

【0146】

一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。

【0147】

一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは細胞への提供前にｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0148】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された後に細胞に提供される。

【0149】

一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、（ｃ）が細胞に提供された約１〜１４日後に細胞に提供される。

【0150】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は細胞のゲノム配列に挿入される。

【0151】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子又はアルブミン遺伝子調節エレメントにあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0152】

一部の実施形態において、挿入は、細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子の第１イントロンにある。

【0153】

一部の実施形態において、挿入は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端から少なくとも３７ｂｐ下流且つゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端から少なくとも３３０ｂｐ上流である。

【0154】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0155】

一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0156】

一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は対象の肝臓で発現する。

【0157】

別の態様において、本明細書には、上記に記載されるシステムの１つ以上の要素を含み、且つ使用説明書を更に含むキットが提供される。

【0158】

本開示の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより、本開示の特定の特徴及び利点の理解が得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0159】

【図1-1】様々にコドン最適化したＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列の多重アラインメントを示す。成熟コード配列のみを示す（シグナルペプチド領域は欠失している）。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用した。

【図1-2】同上。

【図1-3】同上。

【図1-4】同上。

【図1-5】同上。

【図1-6】同上。

【図1-7】同上。

【図2】ＤＮＡドナー鋳型の非限定的な例示的設計を示す。

【図3】Ｈｅｐａ１−６細胞におけるｍＡｌｂ ｇＲＮＡ−Ｔ１の切断効率のＴＩＤＥ分析の結果を示す。

【図4】様々な用量のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡｌｂ ｇＲＮＡ＿Ｔ１を封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）又はＰＢＳ対照の投与後３日におけるマウスの肝臓及び脾臓のインデル頻度の結果を示す。Ｎ＝５匹のマウス／群、平均値をプロットする。

【図5】実施例４に使用されるアルブミンイントロン１への標的組込み用のＤＮＡドナー鋳型の設計を示す。ＳＡ；スプライスアクセプター配列、ＬＨＡ；左相同性アーム；ＲＨＡ；右相同性アーム、ｐＡ；ポリアデニル化シグナル、ｇＲＮＡ部位；ｇＲＮＡによって標的化されるＣａｓ９ヌクレアーゼによる切断を媒介するｇＲＮＡにとっての標的部位、Δフューリン；ＦＶＩＩＩにおけるフューリン部位の欠失、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ；Ｂ−ドメインがＳＱ連結ペプチドに置き換わっているＢ−ドメイン欠失（ＢＤＤ）を有するヒトＦＶＩＩＩのコード配列。

【図6】４人のドナーからの初代ヒトヘパトサイトにおけるヒトアルブミンイントロン１を標的とする８つの候補ｇＲＮＡのインデル頻度を示す。ＡＡＶＳ１遺伝子座及び無関係のヒト遺伝子（Ｃ３）を標的とするｇＲＮＡを対照として含める。

【図7-1】様々なアルブミンガイドＲＮＡ及びｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡをトランスフェクトした非ヒト霊長類（サル）初代ヘパトサイトにおけるインデル頻度を示す。

【図7-2】同上。

【図7-3】同上。

【図8】例示的ＡＡＶ−ｍＳＥＡＰドナーカセットの概略図を示す。

【図9】ＡＡＶへのパッケージングに使用される例示的ＦＶＩＩＩドナーカセットの概略図を示す。

【図10】ＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６を注射し、続いてｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡとを封入するＬＮＰを注射した後の経時的な血友病Ａマウスの血中ＦＶＩＩＩレベルを示す。

【図11】ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとを封入するＬＮＰの注射後１０日目及び１７日目の血友病ＡマウスのＦＶＩＩＩレベルを示す。ＬＮＰはＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６の１７日後又は４日後のいずれかに投与した。

【図12】ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子及び様々なポリアデニル化シグナル配列を含有する例示的プラスミドドナーの概略図を示す。

【図13】３つの異なるポリＡシグナルを有するプラスミドドナー、続いてＣａｓ９ｍＲＮＡとｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡとを封入するＬＮＰをハイドロダイナミックインジェクションした後のマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性及びＦＶＩＩＩ活性／標的組込み比を示す。群２、３及び４には、それぞれｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６及びｐＣＢ０７７を投与した。表には、各個別のマウスの１０日目のＦＶＩＩＩ活性の値、標的組込み頻度及びＦＶＩＩＩ活性／ＴＩ比（比）を載せる。

【図14】初代ヒトヘパトサイトにおける標的組込みの判定に使用される例示的ＡＡＶドナーカセットの概略図を示す。

【図15】ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクション有り又は無しでＡＡＶ−ＤＪ−ＳＥＡＰウイルスによって形質導入した初代ヒトヘパトサイトの培地中におけるＳＥＡＰ活性を示す。黒色及び白色のバーで示す２人の細胞ドナーを試験した（ＨＪＫ、ＯＮＲ）。左側の３対のバーは、Ｃａｓ９及びｇＲＮＡのみ（１番目のバーの対）、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（２番目のバーの対）又は１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（３番目のバーの対）によってトランスフェクトした細胞の対照条件におけるＳＥＡＰ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）によって形質導入し、且つＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｈＡｌｂ Ｔ４ ｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞のウェル内でのＳＥＡＰ活性を表す。

【図16】ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｈＡＬｂ４ ｇＲＮＡのリポフェクション有り又は無しでＡＡＶ−ＤＪ−ＦＶＩＩＩウイルスによって形質導入した初代ヒトヘパトサイトの培地中におけるＦＶＩＩＩ活性を示す。黒色及び白色のバーで示す２つの細胞ドナーを試験した（ＨＪＫ、ＯＮＲ）。左側の２対のバーは、１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７（ＳＥＡＰウイルス）単独（１番目のバーの対）又は１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）単独（２番目のバーの対）によって形質導入した細胞の対照条件におけるＦＶＩＩＩ活性を表す。右側の４対のバーは、様々なＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６（ＦＶＩＩＩウイルス）によって形質導入し、且つＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｈＡｌｂ Ｔ４ ｇＲＮＡをトランスフェクトした細胞のウェルからの培地中におけるＦＶＩＩＩ活性を表す。

【発明を実施するための形態】

【0160】

本開示は、とりわけ、細胞における第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）などの血液凝固タンパク質の発現、機能又は活性をゲノム編集によって調節するための編集用組成物及び方法を提供する。本開示はまた、とりわけ、エキソビボ及びインビボの両方での血友病Ａ患者の治療用組成物及び方法も提供する。

【0161】

定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。詳細な説明は例示的且つ説明的なものに過ぎず、特許請求される任意の主題を限定するものではないことが理解されるべきである。本願において、特に具体的に明記されない限り、単数形の使用は複数形を含む。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。本願において、「又は」の使用は、特に明記しない限り「及び／又は」を意味する。更に、用語「〜を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」並びに「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形の使用は限定的でない。

【0162】

本開示の様々な特徴が単一の実施形態に関連して説明され得るが、それらの特徴はまた、個別に、又は任意の好適な組み合わせで提供されてもよい。逆に、本開示は、明確にするため本明細書において個別の実施形態に関連して説明され得るが、本開示はまた、単一の実施形態で実現されてもよい。本明細書に引用される任意の公開特許出願並びに任意の他の既発表の参考文献、文書、論稿、及び科学文献は、あらゆる目的から参照により本明細書に援用される。矛盾が生じた場合、定義を含め、本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、及び例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。

【0163】

本明細書で使用されるとき、範囲及び量は、「約」特定の値又は範囲と表され得る。約にはまた、正確な量も含まれる。従って「約５μＬ」は、「約５μＬ」を意味し、且つ「５μＬ」もまた意味する。概して、用語「約」には、±１０％など、実験誤差の範囲内であると予想され得る量が含まれる。

【0164】

本明細書において数値の範囲が提示されるとき、その範囲の下限と上限との間にある各中間値、その範囲の上限及び下限である値、及びその範囲に伴い明記されている全ての値が、本開示の範囲内に包含されることが企図される。範囲の下限及び上限の範囲内にある全ての可能な部分的範囲もまた本開示によって企図される。

【0165】

用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド配列」、「ペプチド」、「ペプチド配列」、「タンパク質」、「タンパク質配列」及び「アミノ酸配列」は、本明細書では、アミノ酸残基がペプチド結合によって順につながった線状の連なりを指して同義的に使用され、この連なりには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、及びその断片が含まれ得る。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸及び／又は合成の（例えば、修飾された又は天然に存在しない）アミノ酸で構成されていてもよい。従って「アミノ酸」、又は「ペプチド残基」は、本明細書で使用されるとき、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸の両方を意味する。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」には、限定はされないが、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種及び同種リーダー配列との融合体であって、Ｎ末端メチオニン残基を有する又は有しないもの；免疫学的タグが付加されたタンパク質；検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば、蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを融合パートナーとして含む融合タンパク質を含め、融合タンパク質が含まれる。更に、アミノ酸配列の始まり又は終わりにあるダッシュ記号は、１つ以上のアミノ酸残基の更なる配列とのペプチド結合又はカルボキシル若しくはヒドロキシル末端基との共有結合のいずれかを示すことに留意しなければならない。しかしながら、ダッシュ記号がなくても、アミノ酸配列の表記においてそのように省略することは慣習的であるため、それがかかるペプチド結合又はカルボキシル若しくはヒドロキシル末端基との共有結合が存在しないことを意味すると解釈されてはならない。

【0166】

本明細書で同義的に使用される用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド配列」、「オリゴマー」、「オリゴ」、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」は、ポリマー形態の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかを指す。従って、この用語には、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を有するポリマー又は他の天然の、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然の、又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれる。

【0167】

用語「誘導体」及び「変異体」は、限定なしに、本明細書に開示される化合物から誘導された構造又は配列を有する、且つその構造又は配列が本明細書に開示されるものと十分に類似していて、それが同じ又は類似の活性及び有用性を有するか、又はかかる類似性に基づけば、言及される化合物と同じ又は類似の活性及び有用性を呈することが当業者によって予想されるであろうような、従って同義的に「機能的に同等な」又は「機能的同等物」とも称される核酸又はタンパク質などの任意の化合物を指す。「誘導体」又は「変異体」を得るための修飾には、例えば、核酸又はアミノ酸残基の１つ以上の付加、欠失及び／又は置換が含まれ得る。

【0168】

機能的同等物又は機能的同等物の断片は、タンパク質の文脈では、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。用語「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸からその元のアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸への置換を指す。保存的アミノ酸のグループは以下のとおりである：

【0169】

【表1】

【0170】

保存的置換は、好ましい所定のペプチド又はその断片のいずれの位置に導入されてもよい。しかしながら、非保存的置換、特に、限定はされないが、任意の１つ以上の位置に非保存的置換を導入することがまた望ましいこともある。ペプチドの機能的に同等な断片の形成につながる非保存的置換は、誘導体又は変異体断片の機能は維持しながらも、例えば、極性、電荷、及び／又は立体容積が実質的に異なり得る。

【0171】

「配列同一性パーセンテージ」は、２つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され、ここで比較ウィンドウ内にあるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分には、参照配列（これは付加又は欠失を有しない）と比較して２つの配列を最適にアラインメントするための付加又は欠失（即ち、ギャップ）があり得る。場合によっては、パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が現れる位置の数を決定してマッチした位置の数を求め、そのマッチした位置の数を比較ウィンドウ内にある位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性パーセンテージを求めることにより計算してもよい。

【0172】

用語「同一」又はパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈では、比較ウィンドウ又は指定の領域にわたって最大限対応するように比較及びアラインメントしたとき、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて又は手動でのアラインメント及び目視検査によって測定すると同じである、又は特定の割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドが同じである（例えば、特定の領域、例えばポリペプチド配列全体又はポリペプチドの個々のドメインにわたって６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性）２つ以上の配列又は部分配列を指す。このとき、かかる配列は「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、供試配列の相補体も指す。

【0173】

本明細書で同義的に使用される用語「相補的」又は「実質的に相補的」は、核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）が、別の核酸と配列特異的に逆平行で非共有結合する、即ちワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する（即ち、核酸が相補核酸と特異的に結合する）ことを可能にするヌクレオチド配列を有することを意味する。当該技術分野において公知のとおり、標準的なワトソン・クリック型塩基対合には、アデニン（Ａ）のチミジン（Ｔ）との対合、アデニン（Ａ）のウラシル（Ｕ）との対合、及びグアニン（Ｇ）のシトシン（Ｃ）との対合が含まれる。

【0174】

特定のＲＮＡを「コードする」ＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードしてもよく、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はガイドＲＮＡ；別名「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」）をコードしてもよい。「タンパク質コード配列又は特定のタンパク質若しくはポリペプチドをコードする配列は、インビトロ又はインビボで適切な調節配列の制御下に置かれたときｍＲＮＡに転写される（ＤＮＡの場合）、及びポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸配列である。

【0175】

本明細書で使用されるとき、「コドン」は、一体となってＤＮＡ又はＲＮＡ分子中の遺伝子コード単位を形成する３つのヌクレオチドの配列を指す。本明細書で使用されるとき、用語「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変化を許容する遺伝子コードの性質を指す。

【0176】

用語「コドン最適化された」又は「コドン最適化」は、様々な宿主の形質転換用核酸分子の遺伝子又はコード領域を指し、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変更することのない、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子の遺伝子又はコード領域におけるコドンの変更を指す。かかる最適化には、少なくとも１つ、又は２つ以上、又は多数のコドンを、当該生物の遺伝子でより高頻度に使用される１つ以上のコドンに置き換えることが含まれる。コドン使用表が、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００８年３月２０日現在アクセス可能）で利用可能な「コドン使用データベース」において容易に利用可能である。各生物のコドン使用又はコドン選択に関する知識を利用することにより、当業者は、任意の所与のポリペプチド配列にその頻度を適用し、そのポリペプチドをコードするが、所与の種に最適なコドンを使用する、コドン最適化されたコード領域の核酸断片を作製することができる。コドン最適化コード領域は、当業者に公知の様々な方法によって設計することができる。

【0177】

用語「組換えの」又は「操作された」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使用されるとき、その細胞、核酸、タンパク質又はベクターが実験室的方法によって修飾されている又はその結果であることを示す。従って、例えば、組換えの又は操作されたタンパク質には、実験室的方法によって作製されたタンパク質が含まれる。組換えの又は操作されたタンパク質は、天然（非組換え又は野生型）形態のタンパク質の中には見られないアミノ酸残基を含んでもよく、又は修飾されている、例えば標識されているアミノ酸残基を含んでもよい。この用語には、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列に対する任意の修飾が含まれ得る。かかる修飾には、以下：１つ以上のアミノ酸、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドを含めた、ペプチド、タンパク質又は核酸配列の任意の化学修飾；ペプチド又はタンパク質中のアミノ酸のうちの１つ以上の付加、欠失、及び／又は置換；及び核酸配列中の核酸のうちの１つ以上の付加、欠失、及び／又は置換が含まれ得る。

【0178】

用語「ゲノムＤＮＡ」又は「ゲノム配列」は、限定はされないが、細菌、真菌、古細菌、植物又は動物のゲノムのＤＮＡを含め、生物のゲノムのＤＮＡを指す。

【0179】

本明細書で使用されるとき、「トランス遺伝子」、「外因性遺伝子」又は「外因性配列」は、核酸の文脈では、細胞のゲノムに存在しなかったが、例えばゲノム編集によってゲノムに人工的に導入された核酸配列又は遺伝子を指す。

【0180】

本明細書で使用されるとき、「内因性遺伝子」又は「内在性配列」は、核酸の文脈では、任意の人工的手段によって導入されていない、細胞のゲノムに天然に存在する核酸配列又は遺伝子を指す。

【0181】

用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、即ち「インサート」が取り付けられてもよい、細胞内でその取り付けられたセグメントの複製をもたらすようなプラスミド、ファージ、ウイルス、又はコスミドなどのレプリコンを意味する。

【0182】

用語「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を有するベクターを指す。「作動可能に連結された」は、そのように記載される構成要素が、それらのその意図された形での働きを可能にする関係にあるようにして並べて置かれていることを指す。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている。用語「組換え発現ベクター」、又は「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書では、ベクター及び少なくとも１つのインサートを有するＤＮＡ分子を指して同義的に使用される。組換え発現ベクターは、通常、インサートを発現及び／又は増殖させる目的のため、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築のために作成される。１つ又は複数の核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されても、又は連結されなくてもよく、及びＤＮＡ調節配列に作動可能に連結されても、又は連結されなくてもよい。

【0183】

用語「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で１つ又は複数の調節配列に連結されていることを意味する。用語「調節配列」には、例えば、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれることが意図される。かかる調節配列は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。当業者によれば、発現ベクターの設計が、標的細胞、所望の発現レベルなどの要因に依存し得ることが理解されるであろう。

【0184】

細胞は、外因性ＤＮＡ、例えば組換え発現ベクターが細胞内部に導入されているとき、かかるＤＮＡによって「遺伝子修飾されている」又は「形質転換されている」又は「トランスフェクトされている」。外因性ＤＮＡの存在は、永久的な又は一過性の遺伝子変化をもたらす。形質転換用ＤＮＡは、細胞のゲノムへの組込み（共有結合的連結）があっても、又はなくてもよい。治療活性、例えば血友病Ａを治療する治療活性を有する遺伝子修飾された（又は形質転換若しくはトランスフェクトされた）細胞を使用することができ、これは治療用細胞と称される。

【0185】

ペプチド断片などの分子の文脈で使用される用語「濃度」は、所与の容積の溶液中に存在する分子の量、例えば分子のモル数を指す。

【0186】

用語「個体」、「対象」及び「宿主」は、本明細書では同義的に使用され、診断、治療又は療法が望ましい任意の対象を指す。一部の態様において、対象は哺乳類である。一部の態様において、対象はヒトである。一部の態様において、対象はヒト患者である。一部の態様において、対象は血友病Ａを有するか、又はそれを有する疑いがあり、及び／又は血友病Ａの１つ以上の症状を有し得る。一部の態様において、対象は、診断時又は後に血友病Ａのリスクがあると診断されるヒトである。場合によっては、血友病Ａのリスクがあるとの診断は、ゲノム中の内因性第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子内又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の近傍にあるゲノム配列内の、ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現に影響を及ぼし得る１つ以上の突然変異の存在に基づき決定することができる。

【0187】

疾患又は病態を指して使用される用語「治療」は、少なくとも個体が罹患する病態に関連する症状の改善が実現することを意味し、ここで改善は、治療下の病態（例えば、血友病Ａ）に関連するパラメータ、例えば症状の重さの低減を少なくとも指して広義で使用される。このように、治療はまた、病的状態、又は少なくともそれに関連する症状が完全に抑制されている、例えば、起こらないように予防され、又は全て取り除かれているため、宿主がもはやその病態、又は少なくともその病態を特徴付ける症状を患っていない状況も含む。従って、治療には、（ｉ）予防、即ち、臨床症状を発症させないことを含め、臨床症状の発症リスクを低減すること、例えば疾患進行を予防すること；（ｉｉ）抑制、即ち、臨床症状の発症又は更なる発症を止めること、例えば、活動性疾患を緩和する又は完全に抑制することが含まれる。

【0188】

用語「有効量」、「薬学的に有効な量」、又は「治療有効量」は、本明細書で使用されるとき、特定の病態を有する対象への投与時に所望の有用性をもたらすのに十分な量の組成物を意味する。血友病Ａのエキソビボ治療の文脈では、用語「有効量」は、血友病Ａの少なくとも１つ又は複数の徴候又は症状を予防又は軽減するために必要な治療用細胞又はその子孫の集団の量を指し、及び治療用細胞又はその子孫を有する組成物が所望の効果をもたらす、例えば対象の血友病Ａの症状を治療するのに十分な量に関する。従って用語「治療有効量」は、血友病Ａを有する又はそのリスクがある者など、治療を必要としている対象への投与時に特定の効果を促進するのに十分な治療用細胞又は治療用細胞を有する組成物の量を指す。有効量にはまた、疾患の症状の発症を予防し又は遅延させ、疾患の症状の経過を変化させ（例えば限定はされないが、疾患の症状の進行を減速させ）、又は疾患の症状を好転させるのに十分な量も含まれ得る。対象（例えば患者）の血友病Ａのインビボ治療又はインビトロで培養される細胞で行われるゲノム編集の文脈では、有効量は、ｇＲＮＡ、ドナー鋳型及び／又は部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）など、ゲノム編集に使用される成分が対象の細胞又はインビトロで培養される細胞のゲノムを編集するのに必要な量を指す。いずれの場合にも、適切な「有効量」は当業者がルーチンの実験を用いて決定し得ることが理解される。

【0189】

用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、対象への１つ又は複数の目的の化合物の投与のために薬学的に許容可能な担体、添加剤又は希釈剤を提供する任意の好適な物質を指す。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、薬学的に許容可能な希釈剤、薬学的に許容可能な添加剤、及び薬学的に許容可能な担体と称される物質を包含し得る。

【0190】

核酸
ゲノムターゲティング核酸又はガイドＲＮＡ
本開示は、関連するポリペプチド（例えば、部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）の活性を標的核酸内の特定の標的配列に導くことのできるゲノムターゲティング核酸を提供する。一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸はＲＮＡである。ゲノムターゲティングＲＮＡは、本明細書では「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」と称される。ガイドＲＮＡは、少なくとも、目的の標的核酸配列にハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを有する。ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも有する。ＩＩ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列とが互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）では、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムとも、二重鎖が部位特異的ポリペプチドに結合して、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとが複合体を形成することになる。ゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドとのその会合のおかげでこの複合体に標的特異性を付与する。このようにしてゲノムターゲティング核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を導く。

【0191】

一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸は二分子ガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸は単一分子ガイドＲＮＡである。二分子ガイドＲＮＡは２本のＲＮＡ鎖を有する。第１の鎖は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列を有する。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。ＩＩ型システムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、任意選択のスペーサー伸長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列を有する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は、ガイドＲＮＡに追加的な機能性（例えば安定性）を与えるエレメントを有し得る。単一分子ガイドリンカーは最小ＣＲＩＳＰＲリピート及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結してヘアピン構造を形成する。任意選択のｔｒａｃｒＲＮＡ伸長部は１つ以上のヘアピンを有する。Ｖ型システムの単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、５’から３’方向に、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及びスペーサー配列を有する。

【0192】

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／Ｃｐｆ１システムで使用されるガイドＲＮＡ、又は他の小型ＲＮＡは、以下に例示され及び当該技術分野において記載されるとおりの化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが増して１００ヌクレオチドほどを大きく超えるようになると、一層難題となる傾向がある。長い大型ＲＮＡの作成に用いられる一つの手法は、一体にライゲートされている２つ以上の分子を作製することである。Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易には酵素的に作成される。ＲＮＡの化学合成及び／又は酵素的作成の最中又はその後に、各種のＲＮＡ修飾、例えば、安定性を亢進させ、自然免疫応答の可能性又は程度を低減し、及び／又は当該技術分野において記載されるとおりの他の属性を亢進させる修飾を導入することができる。

【0193】

スペーサー伸長配列
ゲノムターゲティング核酸の一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は、活性を修飾し、安定性を付与し、及び／又はゲノムターゲティング核酸の修飾のための場所を提供することができる。スペーサー伸長配列は、オンターゲット若しくはオフターゲット活性又は特異性を修飾することができる。一部の実施形態では、スペーサー伸長配列は提供される。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上を超える長さであり得る。スペーサー伸長配列は、約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上の長さであり得る。スペーサー伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００ヌクレオチド又はそれ以上に満たない長さであり得る。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は１０ヌクレオチド長未満である。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は３０〜７０ヌクレオチド長である。

【0194】

一部の実施形態において、スペーサー伸長配列は、別の部分（例えば、安定性制御配列、エンドリボヌクレアーゼ結合配列、リボザイム）を有する。一部の実施形態において、部分は核酸ターゲティング核酸の安定性を低下又は増加させる。一部の実施形態において、部分は転写ターミネーターセグメント（即ち転写終結配列）である。一部の実施形態において、部分は真核細胞で機能する。一部の実施形態において、部分は原核細胞で機能する。一部の実施形態において、部分は真核細胞及び原核細胞の両方で機能する。好適な部分の非限定的な例としては、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節及び／又はタンパク質及びタンパク質複合体による接近し易さの調節を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（即ちヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化させる配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／又はタンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに作用するタンパク質）が結合する部位を提供する修飾又は配列が挙げられる。

【0195】

スペーサー配列
スペーサー配列は目的の標的核酸中の配列にハイブリダイズする。ゲノムターゲティング核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（即ち、塩基対合）によって標的核酸と配列特異的に相互作用する。従ってスペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の配列に応じて変わる。

【0196】

本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、そのシステムに使用されるＣａｓ９酵素のＰＡＭの５’側に位置する標的核酸にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは標的配列と完全に一致してもよく、又はミスマッチを有してもよい。各Ｃａｓ９酵素が、標的ＤＮＡ内でそれが認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸内で、配列５’−ＮＲＧ−３’（式中、ＲはＡ又はＧのいずれかを有し、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、及びＮは、スペーサー配列が標的とする標的核酸配列のすぐ３’側にある）を有するＰＡＭを認識する。

【0197】

一部の実施形態において、標的核酸配列は２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、標的核酸は２０ヌクレオチド未満である。一部の実施形態において、標的核酸は２０ヌクレオチド超である。一部の実施形態において、標的核酸は少なくとも：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、標的核酸は多くても：５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、標的核酸配列はＰＡＭの１番目のヌクレオチドのすぐ５’側の２０塩基である。例えば、

【化1】

を有する配列において、標的核酸は、Ｎに対応する配列を有する［式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、及び下線のＮＲＧ配列（ＲはＧ又はＡである）は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ ＰＡＭである］。一部の実施形態では、本開示の組成物及び方法においてＳ．ｐ．Ｃａｓ９によって認識される配列として使用されるＰＡＭ配列は、ＮＧＧである。

【0198】

一部の実施形態において、標的核酸にハイブリダイズするスペーサー配列は、少なくとも約６ヌクレオチド（ｎｔ）の長さを有する。スペーサー配列は、少なくとも約６ｎｔ、約１０ｎｔ、約１５ｎｔ、約１８ｎｔ、約１９ｎｔ、約２０ｎｔ、約２５ｎｔ、約３０ｎｔ、約３５ｎｔ又は約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約８０ｎｔ、約６ｎｔ〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４５ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３５ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔであってもよい。一部の実施形態において、スペーサー配列は２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサーは１９ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサーは１８ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサーは１７ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサーは１６ヌクレオチドである。一部の実施形態において、スペーサーは１５ヌクレオチドである。

【0199】

一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、多くても約３０％、多くても約４０％、多くても約５０％、多くても約６０％、多くても約６５％、多くても約７０％、多くても約７５％、多くても約８０％、多くても約８５％、多くても約９０％、多くても約９５％、多くても約９７％、多くても約９８％、多くても約９９％、又は１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、標的核酸の相補鎖の標的配列の最も５’側の６連続ヌクレオチドにわたって１００％である。一部の実施形態において、スペーサー配列と標的核酸との間のパーセント相補性は、約２０連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％である。一部の実施形態において、スペーサー配列及び標的核酸の長さは１〜６ヌクレオチドだけ異なってもよく、これは１つ又は複数のバルジと考えることができる。

【0200】

一部の実施形態において、スペーサー配列はコンピュータプログラムを用いて設計又は選択される。コンピュータプログラムは、予測融解温度、二次構造形成、予測アニーリング温度、配列同一性、ゲノムコンテクスト、クロマチンへの接近し易さ、％ＧＣ、ゲノム発生頻度（例えば、同一の配列、又は同様であるが、ミスマッチ、挿入又は欠失の結果として１つ以上のスポットが異なる配列のゲノム発生頻度）、メチル化状態、ＳＮＰの存在などの変数を用いることができる。

【0201】

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列
一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、参照ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。

【0202】

一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、細胞において最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズすることのできるヌクレオチドを有する。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とは、二重鎖、即ち塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列及び最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部が最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の相補性を有する。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の少なくとも一部は最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と多くても約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の相補性を有する。

【0203】

最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列の長さは、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔである。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約９ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は約１２ヌクレオチド長である。

【0204】

一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｃｒＲＮＡ）と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一又は１００％同一である。

【0205】

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列である。

【0206】

一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、細胞において最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズするヌクレオチドを有する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列とは、二重鎖、即ち塩基対合した二本鎖構造を形成する。一体となって、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び最小ＣＲＩＳＰＲリピートは部位特異的ポリペプチドに結合する。最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の少なくとも一部が最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は最小ＣＲＩＳＰＲリピート配列と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％相補的である。

【0207】

最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約７ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することができる。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約７ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約７ｎｔ〜約４０ｎｔ、約７ｎｔ〜約３０ｎｔ、約７ｎｔ〜約２５ｎｔ、約７ｎｔ〜約２０ｎｔ、約７ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔ長であってもよい。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約９ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約１２ヌクレオチドである。一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）に記載されるｔｒａｃｒＲＮＡ ｎｔ２３〜４８からなる。

【0208】

一部の実施形態において、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列と少なくとも約６０％同一である。例えば、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一又は１００％同一である。

【0209】

一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は二重らせんを有する。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖は多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド又はそれ以上である。

【0210】

一部の実施形態において、二重鎖はミスマッチを有する（即ち、二重鎖の２本の鎖が１００％相補的でない）。一部の実施形態において、二重鎖は少なくとも約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを有する。一部の実施形態において、二重鎖は多くても約１、２、３、４、又は５又はミスマッチを有する。一部の実施形態において、二重鎖は２個以下のミスマッチしか有しない。

【0211】

バルジ
一部の実施形態において、最小ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡと最小ｔｒａｃｒＲＮＡとの間の二重鎖に「バルジ」がある。バルジは、二重鎖内で対合していないヌクレオチド領域である。一部の実施形態において、バルジは二重鎖による部位特異的ポリペプチドへの結合に寄与する。バルジは、二重鎖の片側に非対合５’−ＸＸＸＹ−３’を有し（式中、Ｘは任意のプリンであり、Ｙは、逆鎖上のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成し得るヌクレオチドを有する）、二重鎖の他方の側に非対合ヌクレオチド領域を含む。二重鎖の両側にある非対合ヌクレオチドの数は異なり得る。

【0212】

一例において、バルジは、バルジの最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上に非対合プリン（例えばアデニン）を有する。一部の実施形態において、バルジは、バルジの最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列鎖の非対合５’−ＡＡＧＹ−３’を有する（式中、Ｙは、最小ＣＲＩＳＰＲリピート鎖上のヌクレオチドとゆらぎ対合を形成し得るヌクレオチドを有する）。

【0213】

一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは、多くても１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、二重鎖の最小ＣＲＩＳＰＲリピート側のバルジは１個の非対合ヌクレオチドを有する。

【0214】

一部の実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側のバルジは、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個又はそれ以上の非対合ヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、二重鎖の第２の側（例えば、二重鎖の最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列側）のバルジは４個の非対合ヌクレオチドを有する。

【0215】

一部の実施形態において、バルジは少なくとも１つのゆらぎ対合を有する。一部の実施形態において、バルジは多くても１つのゆらぎ対合を有する。一部の実施形態において、バルジは少なくとも１個のプリンヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジは少なくとも３個のプリンヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも５個のプリンヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも１個のグアニンヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、バルジ配列は少なくとも１個のアデニンヌクレオチドを有する。

【0216】

ヘアピン
様々な実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列における最小ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側に１つ以上のヘアピンが位置する。

【0217】

一部の実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖における最後の対合ヌクレオチドから少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０ヌクレオチド又はそれ以上３’側から始まる。一部の実施形態において、ヘアピンは、最小ＣＲＩＳＰＲリピートと最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列との二重鎖における最後の対合ヌクレオチドの多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド又はそれ以上３’側から始まり得る。

【0218】

一部の実施形態において、ヘアピンは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、又は２０連続ヌクレオチド又はそれ以上を有する。一部の実施形態において、ヘアピンは、多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５連続ヌクレオチド、又はそれ以上を有する。

【0219】

一部の実施形態において、ヘアピンはＣＣジヌクレオチド（即ち２連続シトシンヌクレオチド）を有する。

【0220】

一部の実施形態において、ヘアピンは、二重鎖化したヌクレオチド（例えば、一体にハイブリダイズした、ヘアピン内のヌクレオチド）を有する。例えば、ヘアピンは、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列のヘアピン二重鎖内のＧＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＣＣジヌクレオチドを有する。

【0221】

ヘアピンのうちの１つ以上は、部位特異的ポリペプチドのガイドＲＮＡ相互作用領域と相互作用することができる。

【0222】

一部の実施形態では、２つ以上のヘアピンがあり、一部の実施形態では３つ以上のヘアピンがある。

【0223】

３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列
一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、参照ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のｔｒａｃｒＲＮＡ）と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の配列同一性を有する配列を有する。

【0224】

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約６ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、約６ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約６ｎｔ〜約４０ｎｔ、約６ｎｔ〜約３０ｎｔ、約６ｎｔ〜約２５ｎｔ、約６ｎｔ〜約２０ｎｔ、約６ｎｔ〜約１５ｎｔ、約８ｎｔ〜約４０ｎｔ、約８ｎｔ〜約３０ｎｔ、約８ｎｔ〜約２５ｎｔ、約８ｎｔ〜約２０ｎｔ、約８ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することができる。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は約１４ヌクレオチドの長さを有する。

【0225】

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一である。例えば、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、少なくとも６、７、又は８連続ヌクレオチドのストレッチにわたって参照３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列）と少なくとも約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９８％同一、約９９％同一、又は１００％同一である。

【0226】

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は２つ以上の二重鎖化した領域（例えば、ヘアピン、ハイブリダイズした領域）を有する。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は２つの二重鎖化した領域を有する。

【0227】

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列はステムループ構造を有する。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５又は２０ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡにおけるステムループ構造は、多くても１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、ステムループ構造は機能性部分を有する。例えば、ステムループ構造は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを有し得る。一部の実施形態において、ステムループ構造は、少なくとも約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を有する。一部の実施形態において、ステムループ構造は、多くても約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を有する。

【0228】

一部の実施形態において、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列におけるヘアピンはＰ−ドメインを有する。一部の実施形態において、Ｐ−ドメインはヘアピンにおける二本鎖領域を有する。

【0229】

ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡのコンテクストが単一分子ガイドか、それとも二分子ガイドかに関わらず、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列が提供されてもよい。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は約１ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、又は４００ヌクレオチド超の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は約２０〜約５０００ヌクレオチド又はそれ以上の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０００ヌクレオチド超の長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００ヌクレオチド又はそれ以上に満たない長さを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０００ヌクレオチド未満の長さを有することができる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０ヌクレオチド長未満を有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１０〜３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は３０〜７０ヌクレオチド長である。

【0230】

一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は機能性部分（例えば、安定性制御配列、リボザイム、エンドリボヌクレアーゼ結合配列）を有する。一部の実施形態において、機能性部分は転写ターミネーターセグメント（即ち転写終結配列）を有する。一部の実施形態において、機能性部分は、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１００ヌクレオチド、約１０ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ〜約１００ｎｔ、約１５ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、又は約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの全長を有する。一部の実施形態において、機能性部分は真核細胞で機能する。一部の実施形態において、機能性部分は原核細胞で機能する。一部の実施形態において、機能性部分は真核細胞及び原核細胞の両方で機能する。

【0231】

好適なｔｒａｃｒＲＮＡ伸長機能性部分の非限定的な例としては、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列（例えば、安定性の調節及び／又はタンパク質及びタンパク質複合体による接近し易さの調節を可能にするため）、ｄｓＲＮＡ二重鎖（即ちヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化させる配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接的なコンジュゲーション、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）、及び／又はタンパク質（例えば、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含めた、ＤＮＡに作用するタンパク質）が結合する部位を提供する修飾又は配列が挙げられる。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列はプライマー結合部位又は分子インデックス（例えばバーコード配列）を有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ伸長配列は１つ以上のアフィニティータグを有する。

【0232】

単一分子ガイドリンカー配列
一部の実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカー配列は約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有する。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、前掲では、例えば、単純な４ヌクレオチド「テトラループ」（−ＧＡＡＡ−）が使用された。Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）。例示的リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ｎｔ〜約８０ｎｔ、約３ｎｔ〜約７０ｎｔ、約３ｎｔ〜約６０ｎｔ、約３ｎｔ〜約５０ｎｔ、約３ｎｔ〜約４０ｎｔ、約３ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３ｎｔ〜約２０ｎｔ、約３ｎｔ〜約１０ｎｔの長さを有する。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することができる。一部の実施形態において、単一分子ガイド核酸のリンカーは４〜４０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、リンカーは、少なくとも約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上である。一部の実施形態において、リンカーは、多くても約１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、又は７０００ヌクレオチド又はそれ以上である。

【0233】

リンカーは種々の配列の任意のものを有し得るが、一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの他の部分との相同性領域を広範囲に有する配列は、分子内結合を引き起こしてガイドの他の機能性領域に干渉し得る可能性があり、リンカーが有することはないであろう。Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．、前掲では、単純な４ヌクレオチド配列−ＧＡＡＡ−が使用されたが、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）、より長い配列を含め、数多くの他の配列を同様に使用することができる。

【0234】

一部の実施形態において、リンカー配列は機能性部分を有する。例えば、リンカー配列は、アプタマー、リボザイム、タンパク質相互作用ヘアピン、タンパク質結合部位、ＣＲＩＳＰＲアレイ、イントロン、又はエクソンを含め、１つ以上の特徴を有し得る。一部の実施形態において、リンカー配列は少なくとも約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を有する。一部の実施形態において、リンカー配列は多くても約１、２、３、４、又は５個又はそれ以上の機能性部分を有する。

【0235】

一部の実施形態において、本開示においてｇＲＮＡが標的とするゲノム位置は、ゲノム、例えばヒトゲノムの内因性アルブミン遺伝子座にあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にあってもよい。かかる位置を標的とする例示的ガイドＲＮＡは、表３又は表４に掲載されるスペーサー配列（例えば、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列）及び関連するＣａｓ９又はＣｐｆ１切断部位を含む。例えば、配列番号１８からのスペーサー配列を含むｇＲＮＡは、スペーサー配列ＵＡＡＵＵＵＵＣＵＵＵＵＧＣＧＣＡＣＵＡ（配列番号１０５）を含み得る。当業者は理解するとおり、各ガイドＲＮＡが、そのゲノム標的配列と相補的なスペーサー配列を含むように設計される。例えば、表３又は表４に掲載されるスペーサー配列の各々が、単一のＲＮＡキメラ又は（対応するｔｒａｃｒＲＮＡと共に）ｃｒＲＮＡに置かれてもよい。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６−８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２−６０７（２０１１）を参照のこと。

【0236】

ドナーＤＮＡ又はドナー鋳型
ＤＮＡエンドヌクレアーゼなどの部位特異的ポリペプチドは、核酸、例えばゲノムＤＮＡに二本鎖切断又は一本鎖切断を導入することができる。二本鎖切断は細胞の内因性ＤＮＡ修復経路（例えば、相同性依存的修復又は非相同末端結合又は代替的非相同末端結合（Ａ−ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同性鋳型の必要性なく、切断された標的核酸を修復することができる。これは時に標的核酸の切断部位に小さい欠失又は挿入（インデル）を生じさせることがあり、遺伝子発現の破壊又は改変につながり得る。ＨＤＲ（相同組換え（ＨＲ）としても知られる）は、相同性修復鋳型、又はドナーが利用可能な場合に起こり得る。

【0237】

相同ドナー鋳型は、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同な配列を有する。概して姉妹染色分体が、細胞によって修復鋳型として使用される。しかしながら、ゲノム編集の目的上、修復鋳型は多くの場合に、プラスミド、二重鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、又はウイルス核酸など、外因性核酸として供給される。外因性ドナー鋳型では、隣接相同性領域間に追加的な核酸配列（トランス遺伝子など）又は修飾（単一又は複数の塩基変化又は欠失など）を導入して、標的遺伝子座に追加的な又は改変された核酸配列もまた取り込まれるようにすることが一般的である。ＭＭＥＪでは、切断部位に小さい欠失及び挿入が起こり得る点でＮＨＥＪと同様の遺伝的結果が生じる。ＭＭＥＪでは、切断部位に隣接する数塩基対の相同配列を用いて有利な末端結合ＤＮＡ修復結果がドライブされる。一部の例では、ヌクレアーゼ標的領域における潜在的なマイクロホモロジーの分析に基づき、起こり得る修復結果を予測することが可能であり得る。

【0238】

従って、一部の場合では、相同組換えを用いて標的核酸切断部位に外因性ポリヌクレオチド配列が挿入される。外因性ポリヌクレオチド配列は、本明細書ではドナーポリヌクレオチド（又はドナー又はドナー配列又はポリヌクレオチドドナー鋳型）と呼ばれる。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部分、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部分が標的核酸切断部位に挿入される。一部の実施形態において、ドナーポリヌクレオチドは外因性ポリヌクレオチド配列、即ち天然では標的核酸切断部位に存在しない配列である。

【0239】

二本鎖切断点が生じる細胞の核内に外因性ＤＮＡ分子が十分な濃度で供給されると、その外因性ＤＮＡがＮＨＥＪ修復過程で二本鎖切断点に挿入され、ひいてはゲノムに永久的に加わるようになり得る。これらの外因性ＤＮＡ分子は、一部の実施形態ではドナー鋳型と称される。ドナー鋳型が、ＦＶＩＩＩ遺伝子など、目的の遺伝子のコード配列を、任意選択でプロモーター、エンハンサー、ポリＡ配列及び／又はスプライスアクセプター配列などの関連性のある調節配列と共に含有する場合（本明細書では「ドナーカセット」とも称される）、その目的の遺伝子はゲノム中の組み込まれたコピーから発現することができ、細胞の寿命にわたって永久的に発現することになる。更に、ドナーＤＮＡ鋳型の組み込まれたコピーは細胞分裂時に娘細胞に遺伝し得る。

【0240】

二本鎖切断点の両側にあるＤＮＡ配列と相同性を有する隣接ＤＮＡ配列（相同性アームと称される）を含有するドナーＤＮＡ鋳型の十分な濃度の存在下では、ドナーＤＮＡ鋳型はＨＤＲ経路によって組み込まれ得る。相同性アームがドナー鋳型と二本鎖切断点の両側の配列との間の相同組換えの基質として働く。この結果、ドナー鋳型の誤りのない挿入が起こることができ、ここでは二本鎖切断点の両側の配列は非修飾ゲノムのものと変化していない。

【0241】

ＨＤＲによる編集に供給されるドナーは著しく異なるが、概して意図された配列を、ゲノムＤＮＡへのアニーリングを可能にする小さい又は大きい隣接相同性アームと共に含む。導入される遺伝子変化に隣接する相同性領域は、３０ｂｐ以下であるか、又はプロモーター、ｃＤＮＡ等を含有し得る数キロベースにも上る大きいカセットであり得る。一本鎖及び二本鎖の両方のオリゴヌクレオチドドナーを使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドはサイズが１００ｎｔ未満〜数ｋｂを上回るまでの範囲に及び、しかし更に長いｓｓＤＮＡもまた作成及び使用することができる。多くの場合に、ＰＣＲアンプリコン、プラスミド、及びミニサークルを含め、二本鎖ドナーが使用される。一般に、ＡＡＶベクターがドナー鋳型の極めて有効な送達手段であることが分かっているが、個々のドナーのパッケージング制限は＜５ｋｂである。ドナーの活性転写によりＨＤＲが３倍に増加したことから、プロモーターを含めると変換が増加し得ることが指摘される。逆に、ドナーのＣｐＧメチル化は遺伝子発現及びＨＤＲを減少させ得る。

【0242】

一部の実施形態では、ドナーＤＮＡは、ヌクレアーゼと共に、又は独立に、種々の異なる方法、例えばトランスフェクション、ナノ粒子、マイクロインジェクション、若しくはウイルス形質導入によって供給されてもよい。一部の実施形態ではＨＤＲへのドナーの利用可能性を高めるため、様々なテザー係留オプションを用いることができる。例としては、ドナーをヌクレアーゼに取り付けること、近くに結合するＤＮＡ結合タンパク質に取り付けること、又はＤＮＡ末端結合若しくは修復に関与するタンパク質に取り付けることが挙げられる

【0243】

ＮＨＥＪ又はＨＤＲによるゲノム編集に加えて、ＮＨＥＪ経路及びＨＲの両方を用いる部位特異的遺伝子挿入を行うことができる。恐らくはイントロン／エクソン境界を含むある種のセッティングにおいて、組み合わせ手法が適用可能であり得る。ＮＨＥＪはイントロンにおけるライゲーションに効力を発揮し得る一方、誤りのないＨＤＲはコード領域に一層適し得る。

【0244】

実施形態において、ゲノムへの挿入が意図される外因性配列は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子又はその機能性誘導体である。外因性遺伝子は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質又はその機能性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ＦＶＩＩＩ遺伝子の機能性誘導体は、野生型ヒトＦＶＩＩＩタンパク質などの野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の実質的な活性、例えば、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質が呈する活性の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約１００％を有するＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体をコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体は、ＦＶＩＩＩタンパク質、例えば野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％のアミノ酸配列同一性を有し得る。一部の実施形態において、当業者は、化合物、例えばペプチド又はタンパク質の機能又は活性を試験するために、当該技術分野で公知の幾つもの方法を用いることができる。ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体にはまた、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の任意の断片又は完全長の野生型ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基のうちの１つ以上に保存的修飾を有する修飾ＦＶＩＩＩタンパク質の断片も含まれ得る。従って、一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子の核酸配列の機能性誘導体は、ＦＶＩＩＩ遺伝子、例えば野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の核酸配列同一性を有し得る。

【0245】

第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子又はその機能性誘導体の挿入が関係する一部の実施形態において、欠陥ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその調節配列を有する患者のゲノムに第ＶＩＩＩ因子遺伝子又はその機能性誘導体のｃＤＮＡが挿入されてもよい。この場合、ドナーＤＮＡ又はドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子遺伝子又はその機能性誘導体をコードする配列、例えばｃＤＮＡ配列を有する発現カセット又はベクターコンストラクトであってもよい。一部の実施形態において、発現ベクターが、本開示の他の部分に記載されるＦＶＩＩＩ−ＢＤＤなどの修飾第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする配列を含有し、使用されてもよい。

【0246】

ドナーカセットを含む本明細書に記載されるドナー鋳型のいずれかに係る一部の実施形態において、ドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。例えば、かかるドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及び／又はドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含み得る。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含み、これらの２つのｇＲＮＡ標的部位は同じ配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれることになる標的遺伝子座のｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれることになる標的遺伝子座のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含み、ドナー鋳型中のこれらの２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれることになる標的遺伝子座のｇＲＮＡ標的部位と同じ配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位があるドナーカセットを含み、ドナー鋳型中のこれらの２つのｇＲＮＡ標的部位は、ドナー鋳型のドナーカセットが組み込まれることになる標的遺伝子座のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体を含む。

【0247】

部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸
一部の実施形態において、従って本ゲノム編集方法及び組成物は、部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列（又はオリゴヌクレオチド）を使用し得る。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列はＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。部位特異的ポリペプチドをコードする核酸配列がＲＮＡである場合、それはｇＲＮＡ配列に共有結合的に連結されてもよく、又は別個の配列として存在してもよい。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼのペプチド配列が、その核酸配列の代わりに使用されてもよい。

【0248】

ベクター
別の態様において、本開示は、本開示のゲノムターゲティング核酸、本開示の部位特異的ポリペプチド、及び／又は本開示の方法の実施形態を実行するのに必要な任意の核酸又はタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を提供する。一部の実施形態において、かかる核酸はベクター（例えば、組換え発現ベクター）である。

【0249】

企図される発現ベクターとしては、限定はされないが、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びレトロウイルスに由来するベクター、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳癌ウイルスなど）をベースとするウイルスベクター及び他の組換えベクターが挙げられる。真核標的細胞に企図される他のベクターとしては、限定はされないが、ベクターｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。真核標的細胞に企図される更なるベクターとしては、限定はされないが、ベクターｐＣＴｘ−１、ｐＣＴｘ−２、及びｐＣＴｘ−３が挙げられる。宿主細胞と適合性がある限り、他のベクターを使用することができる。

【0250】

一部の実施形態において、ベクターは１つ以上の転写及び／又は翻訳制御エレメントを有する。利用される宿主／ベクター系に応じて、幾つもの好適な転写及び翻訳制御エレメントの任意のものが、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含め、発現ベクターに用いられてもよい。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルス配列又はＣＲＩＳＰＲ機構の成分のいずれか又は他のエレメントを不活性化する自己不活性化ベクターである。

【0251】

好適な真核生物プロモーター（即ち、真核細胞で機能性のプロモーター）の非限定的な例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長末端反復（ＬＴＲ）、ヒト伸長因子−１プロモーター（ＥＦ１）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーがニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）に融合したものを有するハイブリッドコンストラクト、マウス幹細胞ウイルスプロモーター（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１遺伝子座プロモーター（ＰＧＫ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉからのものが挙げられる。

【0252】

Ｃａｓエンドヌクレアーゼに関連して使用されるガイドＲＮＡを含め、小さいＲＮＡを発現させるためには、例えばＵ６及びＨ１を含め、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの様々なプロモーターが有利であり得る。かかるプロモーターについての説明及びその使用を増強するためのパラメータは当該技術分野において公知であり、更なる情報及び手法が常時記載されている；例えば、Ｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３，ｅ１６１（２０１４）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１４．１２を参照のこと。

【0253】

発現ベクターはまた、翻訳開始用のリボソーム結合部位及び転写ターミネーターも含むことができる。発現ベクターはまた、発現の増幅に適切な配列も含むことができる。発現ベクターはまた、部位特異的ポリペプチドに融合した非天然タグ（例えば、ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列も含むことができ、ひいては融合タンパク質がもたらされ得る。

【0254】

一部の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、エストロゲン受容体調節性プロモーター等）である。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＵＢＣプロモーター）である。一部の実施形態において、プロモーターは空間的に制限された及び／又は時間的に制限されたプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）である。一部の実施形態において、ベクターは、宿主細胞で発現させようとする少なくとも１つの遺伝子について、その遺伝子がゲノムに組み込まれた後にゲノムに存在する内因性プロモーター下で発現することになる場合、そのためのプロモーターを有しない。

【0255】

部位特異的ポリペプチド又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ
ＮＨＥＪ及び／又はＨＤＲに起因する標的ＤＮＡの修飾は、例えば、突然変異、欠失、改変、組込み、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タグ付加、トランス遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子破壊、転座及び／又は遺伝子突然変異につながり得る。非天然核酸をゲノムＤＮＡに組み込むプロセスは、ゲノム編集の一例である。

【0256】

部位特異的ポリペプチドは、ゲノム編集においてＤＮＡの切断に使用されるヌクレアーゼである。部位特異的なもの（ｔｈｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）は、１つ以上のポリペプチド、又はポリペプチドをコードする１つ以上のｍＲＮＡのいずれかとして細胞又は患者に投与することができる。

【0257】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのコンテクストでは、部位特異的ポリペプチドはガイドＲＮＡに結合することができ、次にはガイドＲＮＡが、ポリペプチドの対象となる標的ＤＮＡ中の部位を特定する。本明細書におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムの実施形態において、部位特異的ポリペプチドはＤＮＡエンドヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼである。

【0258】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは複数の核酸切断（即ちヌクレアーゼ）ドメインを有する。２つ以上の核酸切断ドメインがリンカーによって一体に連結されてもよい。一部の実施形態において、リンカーは可動性リンカーを有する。リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０アミノ酸長又はそれ以上であってもよい。

【0259】

天然に存在する野生型Ｃａｓ９酵素は２つのヌクレアーゼドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣドメインを有する。本明細書では、「Ｃａｓ９」は、天然に存在するＣａｓ９及び組換えＣａｓ９の両方を指す。本明細書で企図されるＣａｓ９酵素は、ＨＮＨ又はＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン、及び／又はＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを有する。

【0260】

ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインはＭｃｒＡ様の折り畳みを有する。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは２つの逆平行βストランド及びαヘリックスを有する。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは金属結合部位（例えば二価カチオン結合部位）を有する。ＨＮＨ又はＨＮＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、ｃｒＲＮＡの標的となる鎖の相補鎖）を切断することができる。

【0261】

ＲｕｖＣ又はＲｕｖＣ様ドメインはＲＮアーゼＨ又はＲＮアーゼＨ様の折り畳みを有する。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨドメインは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方への作用を含め、多様な一組の核酸ベースの機能に関与する。ＲＮアーゼＨドメインは、複数のαヘリックスに囲まれた５つのβストランドを有する。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ又はＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは金属結合部位（例えば二価カチオン結合部位）を有する。ＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ又はＲｕｖＣ／ＲＮアーゼＨ様ドメインは、標的核酸の一方の鎖（例えば、二本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖）を切断することができる。

【0262】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド［例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書の配列番号８又はＳａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３９（２１）：９２７５−９２８２（２０１１）］、及び様々な他の部位特異的ポリペプチドと少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する）。

【0263】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）のヌクレアーゼドメインと少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0264】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と１０連続アミノ酸にわたって少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって少なくとも：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＨＮＨヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって少なくとも：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）と部位特異的ポリペプチドのＲｕｖＣヌクレアーゼドメインにおける１０連続アミノ酸にわたって多くても：７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９９、又は１００％の同一性を有する。

【0265】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドを有する。修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドは、部位特異的ポリペプチドの核酸切断活性を低下させる突然変異を有する。一部の実施形態において、修飾された形態の野生型例示的部位特異的ポリペプチドは、野生型例示的部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）の９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の核酸切断活性を有する。修飾された形態の部位特異的ポリペプチドは実質的な核酸切断活性を有しなくてもよい。部位特異的ポリペプチドが、実質的な核酸切断活性を有しない修飾された形態であるとき、それは本明細書では「酵素的に不活性」と称される。

【0266】

一部の実施形態において、修飾された形態の部位特異的ポリペプチドは、それが標的核酸上に一本鎖切断（ＳＳＢ）を（例えば、二本鎖標的核酸の糖−リン酸骨格の１つのみを切断することにより）誘導し得るような突然変異を有する。一部の実施形態において、突然変異により、野生型部位特異的ポリペプチド（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９、前掲）の複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上における核酸切断活性が９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満になる。一部の実施形態において、突然変異により、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上が、標的核酸の相補鎖を切断する能力は保持しているが、標的核酸の非相補鎖を切断するその能力は低下したものになる。一部の実施形態において、突然変異により、複数の核酸切断ドメインのうちの１つ以上が、標的核酸の非相補鎖を切断する能力は保持しているが、標的核酸の相補鎖を切断するその能力は低下したものになる。例えば、Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６など、野生型例示的化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドにおける残基が、複数の核酸切断ドメイン（例えばヌクレアーゼドメイン）のうちの１つ以上を不活性化するように突然変異される。一部の実施形態において、突然変異させる残基は、野生型例示的化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ポリペプチドの残基Ａｓｐ１０、Ｈｉｓ８４０、Ａｓｎ８５４及びＡｓｎ８５６に対応する（例えば、配列及び／又は構造アラインメントによって決定されるとおり）。突然変異の非限定的な例としては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ又はＮ８５６Ａが挙げられる。当業者は、アラニン置換以外の突然変異が好適であり得ることを認識するであろう。

【0267】

一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｄ１０Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｈ８４０Ａ突然変異が、Ｄ１０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｎ８５４Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、又はＮ８５６Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。一部の実施形態において、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く部位特異的ポリペプチドを生じさせるため、Ｎ８５６Ａ突然変異が、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＤ１０Ａ突然変異のうちの１つ以上と組み合わされる。１つの実質的に不活性なヌクレアーゼドメインを有する部位特異的ポリペプチドは、「ニッカーゼ」と称される。

【0268】

一部の実施形態において、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の変異体を使用して、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集の特異性を増加させることができる。野生型Ｃａｓ９は、典型的には、標的配列における特定の約２０ヌクレオチド配列（内因性ゲノム遺伝子座など）とハイブリダイズするように設計された単一のガイドＲＮＡによってガイドされる。しかしながら、ガイドＲＮＡと標的遺伝子座との間には幾つかのミスマッチが許容され得るため、標的部位における要求される相同性長さが例えば１３ｎｔほどの短い相同性に事実上低下し、それにより標的ゲノムにおける別の場所でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による結合及び二本鎖核酸切断−オフターゲット切断としても知られる−の可能性が高まり得る。Ｃａｓ９のニッカーゼ変異体は各々が１本の鎖のみを切断するため、二本鎖切断を作り出すには、一対のニッカーゼがごく近接して標的核酸の逆鎖上に結合し、それにより二本鎖切断と同等の一対のニックを作り出す必要がある。これには、２つの別個のガイドＲＮＡ−各ニッカーゼに１つずつ−がごく近接して標的核酸の逆鎖上に結合しなければならないという要件がある。この要件のため、二本鎖切断が起こるのに必要な最小相同性長さが本質的に二倍になり、ゲノムの別の場所で２つのガイドＲＮＡ部位が−それらが存在する場合に−二本鎖切断の形成を可能にするのに十分に互いに近接している可能性は低く、従ってそこで二本鎖切断イベントが起こるであろう可能性は低下する。当該技術分野で記載されるとおり、ニッカーゼはまた、ＮＨＥＪに対してＨＤＲを促進するためにも使用することができる。ＨＤＲを用いると、所望の変化を有効に媒介する特異的ドナー配列によってゲノムの標的部位に選択の変化を導入することができる。遺伝子編集に使用される様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの説明については、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット、及びＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，３４７−３５５（２０１４）、及びそこに引用される参考文献を参照することができる。

【0269】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性な部位特異的ポリペプチド）は核酸を標的とする。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）はＤＮＡを標的とする。一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチド（例えば、変異体の、突然変異した、酵素的に不活性な、及び／又は条件的に酵素的に不活性なエンドリボヌクレアーゼ）はＲＮＡを標的とする。

【0270】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは１つ以上の非天然配列を有する（例えば、部位特異的ポリペプチドは融合タンパク質である）。

【0271】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、核酸結合ドメイン、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有する。

【0272】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有する。

【0273】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメインを有し、ここで核酸切断ドメインの一方又は両方は、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９からのヌクレアーゼドメインと少なくとも５０％のアミノ酸同一性を有する。

【0274】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）、及び非天然配列（例えば核局在化シグナル）又は部位特異的ポリペプチドを非天然配列に連結するリンカーを有する。

【0275】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有し、ここで部位特異的ポリペプチドは、核酸切断ドメインの一方又は両方に、ヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる突然変異を有する。

【0276】

一部の実施形態において、部位特異的ポリペプチドは、細菌（例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））由来のＣａｓ９と少なくとも１５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、及び２つの核酸切断ドメイン（即ちＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有し、ここでヌクレアーゼドメインのうちの一方はアスパラギン酸１０の突然変異を有し、及び／又はヌクレアーゼドメインのうちの一方はヒスチジン８４０の突然変異を有し、及びこの突然変異は１つ又は複数のヌクレアーゼドメインの切断活性を少なくとも５０％低下させる。

【0277】

一部の実施形態において、１つ以上の部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼは、一緒になってゲノムの特異的遺伝子座に１つの二本鎖切断を生じさせる２つのニッカーゼ、又は一緒になってゲノムの特異的遺伝子座に２つの二本鎖切断を生じさせる４つのニッカーゼを含む。或いは、１つの部位特異的ポリペプチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼが、ゲノムの特異的遺伝子座における１つの二本鎖切断に影響を及ぼす。

【0278】

一部の実施形態において、ゲノムの編集に、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。かかる実施形態の一部において、部位特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、目的の標的ＤＮＡを含む細胞における発現のため、当該技術分野において標準的な方法によりコドン最適化される。例えば、意図される標的核酸がヒト細胞にある場合、Ｃａｓ９ポリペプチドの作製に、Ｃａｓ９をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを使用することが企図される。

【0279】

以下に、本開示の様々な実施形態で用いることのできる部位特異的ポリペプチドの一部の例を提供する。

【0280】

ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼシステム
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的間隔の短鎖パリンドロームリピート）ゲノム遺伝子座は、多くの原核生物（例えば、細菌及び古細菌）のゲノムに見出すことができる。原核生物では、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ある種の免疫系として働くことによりウイルス及びファージなどの外来性侵入者から原核生物を防御する助けとなる産物をコードする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座機能には３つの段階：ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への新規配列の組込み、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の発現、及び外来性侵入核酸のサイレンシングがある。５種類のＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｕ型、及びＶ型）が同定されている。

【0281】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、「リピート」と称される幾つもの短い反復配列を含む。発現時、リピートは二次ヘアピン構造（例えばヘアピン）を形成し、及び／又は構造化されていない一本鎖配列を有することができる。リピートは通常はクラスター化して存在し、種間で異なることが多い。リピートは、「スペーサー」と称されるユニークな介在配列を間に挟んで規則的な間隔を置き、そのためリピート−スペーサー−リピート遺伝子座構成となる。スペーサーは既知の外来性侵入配列と同一であるか、又は高い相同性を有する。スペーサー−リピート単位はｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードし、これがプロセシングされて成熟型のスペーサー−リピート単位になる。ｃｒＲＮＡは、標的核酸のターゲティングに関与する「シード」又はスペーサー配列を有する（原核生物における天然に存在する形態では、スペーサー配列が外来性侵入核酸を標的化する）。スペーサー配列は、ｃｒＲＮＡの５’又は３’末端に位置する。

【0282】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はまた、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列も有する。Ｃａｓ遺伝子は、原核生物においてバイオジェネシス及びｃｒＲＮＡ機能の干渉段階に関与するエンドヌクレアーゼをコードする。一部のＣａｓ遺伝子は相同性二次及び／又は三次構造を有する。

【0283】

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステム
天然でのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｃｒＲＮＡバイオジェネシスには、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）が必要である。ｔｒａｃｒＲＮＡは内因性ＲＮアーゼＩＩＩによって修飾され、次にｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ中のｃｒＲＮＡリピートにハイブリダイズする。内因性ＲＮアーゼＩＩＩが動員されてｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが切断される。切断されたｃｒＲＮＡはエキソリボヌクレアーゼのトリミングに供され、成熟ｃｒＲＮＡ形態（例えば、５’トリミング）を生じる。ｔｒａｃｒＲＮＡはｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたまま残り、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡが部位特異的ポリペプチド（例えばＣａｓ９）と会合する。ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体のｃｒＲＮＡがこの複合体を標的核酸にガイドし、この標的核酸は、それにｃｒＲＮＡがハイブリダイズすることができるものである。ｃｒＲＮＡが標的核酸にハイブリダイズすると、Ｃａｓ９が標的核酸切断のため活性化される。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおける標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される。天然では、ＰＡＭは、部位特異的ポリペプチド（例えばＣａｓ９）による標的核酸への結合を促進するのに不可欠である。ＩＩ型システム（Ｎｍｅｎｉ又はＣＡＳＳ４とも称される）はＩＩ−Ａ型（ＣＡＳＳ４）及びＩＩ−Ｂ型（ＣＡＳＳ４ａ）に更に細分される。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムがＲＮＡプログラム可能ゲノム編集に有用であることを示したとともに、国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレットは、部位特異的遺伝子編集に対するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムの数多くの例及び応用を提供する。

【0284】

Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステム
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型システムと比べて幾つかの重要な違いがある。例えば、Ｃｐｆ１は、ＩＩ型システムとは対照的に、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一のＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。実際に、Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは追加的なトランス活性化ｔｒａｃｒＲＮＡの必要なく成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲアレイは４２〜４４ヌクレオチド長の短い成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、各成熟ｃｒＲＮＡが１９ヌクレオチドのダイレクトリピートで始まり、その後に２３〜２５ヌクレオチドのスペーサー配列が続く。対照的に、ＩＩ型システムの成熟ｃｒＲＮＡは２０〜２４ヌクレオチドのスペーサー配列で始まり、その後に約２２ヌクレオチドのダイレクトリピートが続く。また、Ｃｐｆ１はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用し、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は短いＴリッチＰＡＭが前にある標的ＤＮＡを効率的に切断することになり、これはＩＩ型システムで標的ＤＮＡの後にＧリッチＰＡＭがあるのと対照的である。従って、Ｖ型システムはＰＡＭから離れた点で切断し、一方、ＩＩ型システムはＰＡＭに隣接する点で切断する。加えて、ＩＩ型システムと対照的に、Ｃｐｆ１は、４又は５ヌクレオチドの５’オーバーハングを伴い付着末端型のＤＮＡ二本鎖切断によってＤＮＡを切断する。ＩＩ型システムは平滑末端二本鎖切断によって切断する。ＩＩ型システムと同様に、Ｃｐｆ１は予測ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、第２のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインを欠いており、これはＩＩ型システムと対照的である。

【0285】

Ｃａｓ遺伝子／ポリペプチド及びプロトスペーサー隣接モチーフ
例示的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドは、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４２：２５７７−２５９０（２０１４）の図１にあるＣａｓ９ポリペプチドを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子の命名方式は、Ｃａｓ遺伝子が発見されて以来、大々的な書き換えを被っている。Ｆｏｎｆａｒａ、前掲の図５は、様々な種由来のＣａｓ９ポリペプチドについてのＰＡＭ配列を提供している。

【0286】

ゲノムターゲティング核酸と部位特異的ポリペプチドとの複合体
ゲノムターゲティング核酸は部位特異的ポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９などの核酸ガイド型ヌクレアーゼ）と相互作用し、それによって複合体を形成する。ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）は部位特異的ポリペプチドを標的核酸に誘導する。

【0287】

これまでに述べたとおり、一部の実施形態において部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸は、各々を細胞又は患者に個別に投与することができる。他方で、一部の他の実施形態において部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと一緒の１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化することができる。予め複合体化された材料は、次に細胞又は患者に投与することができる。かかる予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として公知である。

【0288】

ゲノム編集用システム
本明細書には、ゲノム編集用システム、詳細には、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子又はその機能性誘導体を細胞のゲノムに挿入するためのシステムが提供される。こうしたシステムは、本明細書に記載される方法において、細胞のゲノムの編集のため、及び対象、例えば血友病Ａ患者の治療のためなどに使用することができる。

【0289】

一部の実施形態において、本明細書には、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；（ｂ）細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と；（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型とを含むシステムが提供される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡはアルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。

【0290】

一部の実施形態において、本明細書には、（ａ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と；（ｂ）配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と；（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型とを含むシステムが提供される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0291】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0292】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、宿主細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、ヒト細胞での発現にコドン最適化される。

【0293】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、本システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、宿主細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ヒト細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。

【0294】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位はシステム中のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、システム中のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。

【0295】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。一部の実施形態において、本システムは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を含む。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

【0296】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるシステムのいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはｇＲＮＡと複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0297】

ゲノム編集方法
本明細書には、ゲノム編集方法、詳細には、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）遺伝子又はその機能性誘導体を細胞のゲノムに挿入する方法が提供される。この方法は、対象、例えば血友病Ａ患者の治療に用いることができ、その場合、患者又は別個のドナーから細胞が単離され得る。次に、本明細書に記載される材料及び方法を用いて細胞の染色体ＤＮＡが編集される。

【0298】

一部の実施形態において、ノックイン戦略は、ＦＶＩＩＩコード配列、例えば野生型ＦＶＩＩＩ遺伝子（例えば野生型ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子）、ＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡ、ミニ遺伝子（天然又は合成エンハンサー及びプロモーター、１つ以上のエクソン、及び天然又は合成イントロン、及び天然又は合成３’ＵＴＲ及びポリアデニル化シグナルを有する）又は修飾ＦＶＩＩＩ遺伝子をゲノム配列にノックインすることを伴う。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード配列が挿入されるゲノム配列は、アルブミン遺伝子座にあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。

【0299】

本明細書には、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体をゲノムにノックインする方法が提供される。一態様において、本開示は、細胞のゲノムへのＦＶＩＩＩ遺伝子の核酸配列、即ちＦＶＩＩＩタンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列の挿入を提供する。実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子は野生型ＦＶＩＩＩタンパク質をコードすることができる。ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体は、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の実質的な活性、例えば野生型ＦＶＩＩＩタンパク質が呈する活性の少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又は約１００％を有するペプチドを含み得る。一部の実施形態において、当業者は、化合物、例えばペプチド又はタンパク質の機能又は活性を試験するために、当該技術分野で公知の幾つもの方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体にはまた、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の任意の断片又は完全長の野生型ＦＶＩＩＩタンパク質のアミノ酸残基のうちの１つ以上に保存的修飾を有する修飾ＦＶＩＩＩタンパク質の断片も含まれ得る。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩタンパク質の機能性誘導体はまた、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質の機能に実質的に悪影響を及ぼさない１つ以上のアミノ酸の任意の１つ又は複数の修飾、例えば欠失、挿入及び／又は突然変異も含み得る。従って、一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子の核酸配列の機能性誘導体は、ＦＶＩＩＩ遺伝子と少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の核酸配列同一性を有し得る。

【0300】

一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体は細胞のゲノム配列に挿入される。一部の実施形態において、挿入部位は細胞のゲノム中のアルブミン遺伝子座にあるか、又はその範囲内にある。挿入方法は、アルブミン遺伝子の第１イントロン（又はイントロン１）を標的とする１つ以上のｇＲＮＡを使用する。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡは、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を有する一本鎖又は二本鎖ＤＮＡである。

【0301】

一部の実施形態において、ゲノム編集方法は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼを利用してＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を遺伝的に導入（ノックイン）する。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、その相同体、天然に存在する分子の組換え、コドン最適化された、又はその修飾されたバージョン、及び前述のいずれかの組み合わせである。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0302】

一部の実施形態において、ゲノム編集に供される細胞はゲノムに１つ以上の突然変異を有し、そのため、かかる突然変異を有しない正常なものでの発現と比較したとき内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現が低下する。正常細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子欠陥を有しない異なる対象に由来する（又はそれから単離された）健常又は対照細胞であり得る。一部の実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子に関連する病態又は障害、例えば血友病Ａの治療を必要としている対象に由来してもよい（又はそれから単離されてもよい）。従って、一部の実施形態においてかかる細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現は、正常細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子発現の発現と比較したとき約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％低下している。

【0303】

一部の実施形態において、ゲノム編集方法は、ゲノムの非コード領域に、機能性ＦＶＩＩＩ遺伝子、例えばインビボでＦＶＩＩＩタンパク質を安定に生成するように供給プロモーターに作動可能に連結されているＦＶＩＩＩコード配列の標的組込みを行う。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード配列の標的組込みは、目的の細胞型、例えばヘパトサイト又は類洞内皮細胞で高度に発現するアルブミン遺伝子のイントロンに起こる。一部の実施形態において、挿入されるＦＶＩＩＩコード配列は、野生型ＦＶＩＩＩコード配列、例えば野生型ヒトＦＶＩＩＩコード配列であってもよい。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード配列は、野生型ヒトＦＶＩＩＩコード配列などの野生型ＦＶＩＩＩコード配列の機能性誘導体であってもよい。

【0304】

一態様において、本開示は、細胞のゲノムへのＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体の核酸配列の挿入を提案する。実施形態において、挿入されるＦＶＩＩＩコード配列は、修飾ＦＶＩＩＩコード配列である。一部の実施形態において、修飾ＦＶＩＩＩコード配列では野生型ＦＶＩＩＩコード配列のＢ−ドメインが欠失し、「ＳＱリンク」と呼ばれるリンカーペプチド（アミノ酸配列ＳＦＳＱＮＰＰＶＬＫＲＨＱＲ−配列番号１）に置き換えられている。このＢ−ドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）は当該技術分野において周知であり、完全長ＦＶＩＩＩと同等の生物学的活性を有する。一部の実施形態において、Ｂ−ドメイン欠失型ＦＶＩＩＩはサイズが小さいため（４３７１ｂｐ対７０５３ｂｐ）、完全長ＦＶＩＩＩよりも好ましい。従って、一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドを欠き、且つその５’末端（ＦＶＩＩＩコード配列のＮ末端）にスプライスアクセプター配列を含有するＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列が、ヒトを含めた哺乳類のヘパトサイトにおけるアルブミン遺伝子のイントロン１に特異的に組み込まれる。この修飾ＦＶＩＩＩコード配列がアルブミンプロモーターから転写されると、アルブミンのエクソン１、イントロン１の一部及び組み込まれたＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ遺伝子配列を含有するプレｍＲＮＡとなり得る。このプレｍＲＮＡが天然のスプライシング過程を経てイントロンが除去されると、スプライシング機構により、アルブミンエクソン１の３’側にあるスプライスドナーが、挿入されたＤＮＡドナーのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列の５’末端にあるスプライスアクセプターであり得る次の利用可能なスプライスアクセプターにつなぎ合わされ得る。この結果、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの成熟コード配列に融合したアルブミンエクソン１を含む成熟ｍＲＮＡが生じ得る。アルブミンのエクソン１は、シグナルペプチド＋２個の追加的なアミノ酸及びヒトにおいて通常アルブミンのＮ末端のタンパク質配列ＤＡＨをコードするコドンの１／３をコードする。従って、一部の実施形態において、細胞からの分泌時における予想されるアルブミンシグナルペプチドの切断後、Ｎ末端に３個の追加的なアミノ酸残基が付加されたＦＶＩＩＩ−ＢＤＤタンパク質が生成されることができ、結果としてこのＦＶＩＩＩ−ＢＤＤタンパク質のＮ末端はアミノ酸配列

【化2】

となる。これらの３個のアミノ酸のうちの３番目（下線）は、一部はエクソン１の末端によってコードされ、一部はＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ ＤＮＡドナー鋳型によってコードされるため、３番目の追加的なアミノ酸残基のアイデンティティをＬｅｕ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ又はＡｒｇのいずれかとなるように選択することが可能である。一部の実施形態では、これらの選択肢の中でＬｅｕが好ましく、なぜならＬｅｕは分子的複雑性が最小限であり、ひいては新規Ｔ細胞エピトープを形成する可能性が最小限であるためであり、結果としてＦＶＩＩＩ−ＢＤＤタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列

【化3】

が生じる。或いは、ＤＮＡドナー鋳型は、３番目の残基が欠失してＦＶＩＩＩ−ＢＤＤタンパク質のＮ末端にアミノ酸配列

【化4】

が生じるように設計されてもよい。ある場合には、天然のタンパク質の配列に追加的なアミノ酸を加えると、免疫原性リスクが増加し得る。従って、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのＮ末端についてのこれらの２つの潜在的選択肢の潜在的免疫原性を予測するインシリコ分析により、１個の残基の欠失

【化5】

が免疫原性スコアを下げると実証される一部の実施形態では、それが少なくとも一部の実施形態において好ましい設計であり得る。

【0305】

一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤをコードするＤＮＡ配列は、哺乳類細胞での発現が向上するようにコドン使用が最適化されたものを使用することができる（いわゆるコドン最適化）。コドン最適化の実施には、当該技術分野において種々のコンピュータアルゴリズムも利用可能であり、それらが個別的なＤＮＡ配列を生成する。市販のコドン最適化アルゴリズムの例は、ＡＴＵＭ社及びＧｅｎｅＡｒｔ社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部）が採用しているものである。ＦＶＩＩＩコード配列のコドン最適化は、マウスへの遺伝子ベースの送達後にＦＶＩＩＩの発現を有意に改善することが実証された（Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣ，Ｇｒａｙ ＪＴ，Ｎｇ ＣＹ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（７）：２６５３−２６６１．；Ｗａｒｄ ＮＪ，Ｂｕｃｋｌｅｙ ＳＭ，Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎ ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７（３）：７９８−８０７．；Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ，Ｓｉｏｎ ＣＪ，Ｗｉｌｋｅｓ ＦＪ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８；１５（４）：２８９−２９７）。

【0306】

一部の実施形態において、種々のアルゴリズムによってコドン最適化されたＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列と天然ＦＶＩＩＩ配列（ヒトゲノムに存在するとおりの）との間の配列相同性又は同一性は、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は１００％の範囲であってもよい。一部の実施形態において、コドン最適化ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列は、天然ＦＶＩＩＩ配列と約７５％〜約７９％の配列相同性又は同一性を有する。一部の実施形態において、コドン最適化ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列は、天然ＦＶＩＩＩ配列と約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％又は約８０％の配列相同性又は同一性を有する。

【0307】

一部の実施形態において、ドナー鋳型又はドナーコンストラクトは、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤをコードするＤＮＡ配列を含有するように調製される。一部の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、コドン最適化されているヒトＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコード配列を含有するように設計される。一部の実施形態において、コドン最適化は、ＦＶＩＩＩのシグナルペプチドをコードする５’末端の配列が欠失し、スプライスアクセプター配列に置き換えられているように行われ、加えてＦＶＩＩＩ終止コドン後の３’末端にポリアデニル化シグナルが付加される（ＭＡＢ８Ａ−配列番号８７）。スプライスアクセプター配列は、公知の遺伝子からの公知のスプライスアクセプター配列の中から選択することができ、又は当該技術分野において公知の多くのスプライスアクセプター配列のアラインメントから導き出されるコンセンサススプライスアクセプター配列を使用することができる。一部の実施形態において、高発現遺伝子からのスプライスアクセプター配列は最適なスプライシング効率をもたらすと考えられるため、かかる配列が使用される。一部の実施形態において、コンセンサススプライシングアクセプター配列は、コンセンサス配列Ｔ／ＣＮＣ／ＴＴ／ＣＡ／ＧＡＣ／Ｔ（配列番号９９）を含む枝分かれ部位の後に２０ｂｐ以内に１０〜１２塩基のポリピリミジントラクト（Ｃ又はＴ）が続き、その後にＡＧ＞Ｇ／Ａ（ここでは＞がイントロン／エクソン境界の位置である）が続くように構成される。好ましい一実施形態では、合成スプライスアクセプター配列

【化6】

が使用される。別の好ましい実施形態において、ヒト

【化7】

又はマウス

【化8】

のアルブミン遺伝子イントロン１／エクソン２境界からの天然スプライスアクセプター配列が使用される。

【0308】

ポリアデニル化配列は、細胞内でのｍＲＮＡの安定性に必須のポリＡテールを付加するように細胞にシグナルを送る。ＤＮＡドナー鋳型がＡＡＶ粒子にパッケージングされることになる一部の実施形態では、パッケージングされるＤＮＡのサイズが、好ましくは約５Ｋｂ未満及び理想的には約４．７Ｋｂ以下であるＡＡＶのパッケージング限界の範囲内に収まることが好ましい。従って、一部の実施形態では、可能な限り短い、例えば約１０ｍｅｒ、約２０ｍｅｒ、約３０ｍｅｒ、約４０ｍｅｒ、約５０ｍｅｒ又は約６０ｍｅｒのポリＡ配列又は前述の任意の中間ヌクレオチド数を使用することが望ましい。コンセンサス合成ポリＡシグナル配列については、文献（Ｌｅｖｉｔｔ Ｎ，Ｂｒｉｇｇｓ Ｄ，Ｇｉｌ Ａ，Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ ＮＪ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１９８９；３（７）：１０１９−１０２５）に配列ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号５）で記載され、数多くの発現ベクターで一般的に用いられている。

【0309】

一部の実施形態において、組込み頻度を改善するためＤＮＡドナー鋳型に追加的な配列エレメントを加えることができる。１つのかかるエレメントは相同性アームであり、これは、ＨＤＲによる組込みを可能にするため組込みが標的化されるところであるゲノム中の二本鎖切断点の両側にあるＤＮＡ配列と同一の配列である。二本鎖切断点の左側からの配列（ＬＨＡ）が、ＤＮＡドナー鋳型の５’側の（ＦＶＩＩＩコード配列に対してＮ端側の）末端に付加され、及び二本鎖切断点の右側からの配列（ＲＨＡ）が、ＤＮＡドナー鋳型、例えばＭＡＢ８Ｂ（配列番号８８）の３’側の（ＦＶＩＩＩコード配列のＣ端側の）末端に付加される。

【0310】

一部の実施形態において提供される代替的なＤＮＡドナー鋳型設計は、ゲノム部位の切断に使用されることになるｓｇＲＮＡの認識配列と相補的な配列を有する。ＭＡＢ８Ｃ（配列番号８９）は、この種のＤＮＡドナー鋳型の一例に相当する。ｓｇＲＮＡ認識部位を含めることにより、ＤＮＡドナー鋳型は、ＤＮＡドナー鋳型及びｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９が送達された細胞の核内でｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって切断されることになる。ドナーＤＮＡ鋳型が線状断片に切断されると、二本鎖切断点における非相同末端結合機構又はＨＤＲ機構による組込み頻度が増加し得る。ＡＡＶゲノムは核への送達後にコンカテマー化して大型の環状二本鎖ＤＮＡ分子を形成することが公知であるため、これは、ＡＡＶにパッケージングされたドナーＤＮＡ鋳型を送達する場合に特に有益であり得る（Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ ２００１，ｖｏｌ７５ ｐ．６９６９−６９７６）。従って、場合によっては環状コンカテマーは、二本鎖切断点における、特にＮＨＥＪ機構による組込みに関して効率が低いドナーであり得る。以前、環状プラスミドＤＮＡドナー鋳型を使用した標的組込み効率が、プラスミドにジンクフィンガーヌクレアーゼ切断部位を含めることによって増加可能であったことが報告された（Ｃｒｉｓｔｅａ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３；１１０：８７１−８８０）。最近になって、この手法がまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用して適用された（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ ２０１７，Ｎａｔｕｒｅ ５４０，１４４−１４９）。ｓｇＲＮＡ認識配列は、二本鎖ＤＮＡドナー鋳型のいずれの鎖上に存在するときも活性であるが、ゲノムに存在するｓｇＲＮＡ認識配列の逆相補体の使用は、逆方向の組込みによってｓｇＲＮＡ認識配列が再び作り出され、それが再び切断され得ることにより挿入されたドナーＤＮＡ鋳型が放出されるため、安定組込みに有利に働くものと予想される。かかるドナーＤＮＡ鋳型がＮＨＥＪによってゲノムに順方向で組み込まれると、ｓｇＲＮＡ認識配列が再び作り出されることはなく、組み込まれたドナーＤＮＡ鋳型がゲノムから切り出されることはあり得ないと予想される。相同性アーム有り又は無しでドナーにｓｇＲＮＡ認識配列を含めることがＦＶＩＩＩドナーＤＮＡ鋳型の組込み効率に及ぼす利益は、例えばマウスにおいて、ドナーの送達にＡＡＶを使用し、且つＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９成分の送達にＬＮＰを使用して試験及び決定することができる。

【0311】

一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るドナーカセットにＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型はドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及び／又はドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は２つの隣接するｇＲＮＡ標的部位を含み、これらの２つのｇＲＮＡ標的部位は同じ配列を含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１イントロンを標的とする１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型は少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中の少なくとも１つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにおける１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つにとっての標的部位の逆相補体である。一部の実施形態において、ドナー鋳型はドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中のこれらの２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１イントロンを標的とする１つ以上のｇＲＮＡによって標的とされる。一部の実施形態において、ドナー鋳型はドナーカセットの５’側にｇＲＮＡ標的部位及びドナーカセットの３’側にｇＲＮＡ標的部位を含み、ドナー鋳型中のこれらの２つのｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子の第１イントロンにおける１つ以上のｇＲＮＡのうちの少なくとも１つにとっての標的部位の逆相補体である。

【0312】

標的部位、即ちＦＶＩＩＩコード遺伝子が挿入されるゲノム位置へのＦＶＩＩＩコード遺伝子の挿入は、内因性アルブミン遺伝子座又はその隣接配列にあってもよい。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子は、挿入された遺伝子の発現がアルブミン遺伝子の内因性プロモーターによって制御されるように挿入される。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子は、アルブミン遺伝子のイントロンのうちの１つに挿入される。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子は、アルブミン遺伝子のエクソンのうちの１つに挿入される。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子は、イントロン：エクソンの（又は逆の）接合部に挿入される。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子の挿入は、アルブミン遺伝子座の第１イントロン（又はイントロン１）にある。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子の挿入はアルブミン遺伝子の発現に大きい影響を及ぼさず、例えばそれを上方制御又は下方制御しない。

【0313】

実施形態において、ＦＶＩＩＩコード遺伝子の挿入の標的部位は、内因性アルブミン遺伝子にあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にある。一部の実施形態において、標的部位は、ゲノム中のアルブミン遺伝子座のプロモーターの上流にある遺伝子間領域にある。一部の実施形態において、標的部位はアルブミン遺伝子座の範囲内にある。一部の実施形態において、標的部位はアルブミン遺伝子座のイントロンのうちの１つにある。一部の実施形態において、標的部位はアルブミン遺伝子座のエクソンのうちの１つにある。一部の実施形態において、標的部位はアルブミン遺伝子座のイントロンとエクソンとの間の（又は逆の）接合部のうちの１つにある。一部の実施形態において、標的部位はアルブミン遺伝子座の第１イントロン（又はイントロン１）にある。特定の実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１エクソンの（即ち第１エクソンの最後の核酸から）少なくとも、約又は多くても０、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００又は５５０又は６００又は６５０ｂｐ下流にある。一部の実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第１イントロンの少なくとも、約又は多くても０．１ｋｂ、約０．２ｋｂ、約０．３ｋｂ、約０．４ｋｂ、約０．５ｋｂ、約１ｋｂ、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約３．５ｋｂ、約４ｋｂ、約４．５ｋｂ又は約５ｋｂ上流にある。一部の実施形態において、標的部位は、アルブミン遺伝子の第２エクソンの約０ｂｐ〜約１００ｂｐ上流、約１０１ｂｐ〜約２００ｂｐ上流、約２０１ｂｐ〜約３００ｂｐ上流、約３０１ｂｐ〜約４００ｂｐ上流、約４０１ｂｐ〜約５００ｂｐ上流、約５０１ｂｐ〜約６００ｂｐ上流、約６０１ｂｐ〜約７００ｂｐ上流、約７０１ｂｐ〜約８００ｂｐ上流、約８０１ｂｐ〜約９００ｂｐ上流、約９０１ｂｐ〜約１０００ｂｐ上流、約１００１ｂｐ〜約１５００ｂｐ上流、約１５０１ｂｐ〜約２０００ｂｐ上流、約２００１ｂｐ〜約２５００ｂｐ上流、約２５０１ｂｐ〜約３０００ｂｐ上流、約３００１ｂｐ〜約３５００ｂｐ上流、約３５０１ｂｐ〜約４０００ｂｐ上流、約４００１ｂｐ〜約４５００ｂｐ上流又は約４５０１ｂｐ〜約５０００ｂｐ上流の範囲内のいずれかにある。一部の実施形態において、標的部位はゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第１エクソンの終端（即ち３’側終端）の少なくとも３７ｂｐ下流にある。一部の実施形態において、標的部位は、ゲノム中のヒトアルブミン遺伝子の第２エクソンの始端（即ち５’側始端）の少なくとも３３０ｂｐ上流にある。

【0314】

一部の実施形態において、本明細書には、細胞のゲノムを編集する方法が提供され、この方法は、細胞に以下を提供することを含む：（ａ）細胞ゲノム中のアルブミン遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。一部の実施形態において、ｇＲＮＡはアルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。

【0315】

一部の実施形態において、本明細書には、細胞のゲノムを編集する方法が提供され、この方法は、細胞に以下を提供することを含む：（ａ）配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒトヘパトサイト細胞である。

【0316】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0317】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。

【0318】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を用いる。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒトヘパトサイト細胞である。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。

【0319】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。

【0320】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を用いる。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

【0321】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0322】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１７日後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子として細胞に提供される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態において、（ｃ）は、ドナー鋳型をコードするＡＡＶベクターとして細胞に提供される。

【0323】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される。

【0324】

一部の実施形態において、本明細書に記載される細胞のゲノム編集方法のいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0325】

一部の実施形態において、本明細書には、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法が提供され、本方法は、（ａ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸と、（ｂ）ｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸（ここでｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列を切断するようにＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導する能力を有する）と、（ｃ）ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を含む本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るドナー鋳型とを細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、本方法は、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、本方法は、ｉ）Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｉｉ）ｇＲＮＡとを含む本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るＬＮＰを細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型はＡＡＶドナー鋳型である。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡの標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。一部の実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞にドナー鋳型を導入した後に細胞に導入される。一部の実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞にドナー鋳型を導入した後に細胞核へのドナー鋳型の侵入を可能にするのに十分な時間が経ってから細胞に導入される。一部の実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＣａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸及びｇＲＮＡ又はｇＲＮＡをコードする核酸は、細胞にドナー鋳型を導入した後に細胞核内でのドナー鋳型の一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にするのに十分な時間が経ってから細胞に導入される。一部の実施形態において、Ｃａｓ ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。

【0326】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法のいずれかによれば、標的ポリヌクレオチド配列はアルブミン遺伝子のイントロン１にある。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表３又は表４に掲載されるスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0327】

一部の実施形態において、本明細書には、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を細胞ゲノムのアルブミン遺伝子座に挿入する方法が提供され、この方法は、（ａ）ｉ）Ｃａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとｉｉ）ｇＲＮＡ（ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子座の標的ポリヌクレオチド配列を切断するようにＣａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼを誘導する能力を有する）とを含む本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るＬＮＰ、及び（ｂ）ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を含む本明細書に記載される実施形態のいずれかに係るＡＡＶドナー鋳型を細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは片側又は両側にｇＲＮＡの標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットに隣接するｇＲＮＡ標的部位は、アルブミン遺伝子座におけるｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。一部の実施形態において、ＬＮＰは、細胞にＡＡＶドナー鋳型を導入した後に細胞に導入される。一部の実施形態において、ＬＮＰは、細胞にＡＡＶドナー鋳型を導入した後に細胞核へのドナー鋳型の侵入を可能にするのに十分な時間が経ってから細胞に導入される。一部の実施形態において、ＬＮＰは、細胞にＡＡＶドナー鋳型を導入した後に細胞核内でのドナー鋳型の一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にするのに十分な時間が経ってから細胞に導入される。一部の実施形態において、１回目の細胞へのＬＮＰの導入後に細胞へのＬＮＰの１回以上（２、３、４、５回、又はそれ以上など）の追加的な導入が実施される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。

【0328】

標的配列選択
一部の実施形態において、特定の参照遺伝子座に対する５’境界及び／又は３’境界の位置のシフトを用いると遺伝子編集の特定の適用が促進又は増強され、適用は、一部には、本明細書に更に記載及び例示されるとおりの、編集に選択されるエンドヌクレアーゼシステムに依存する。

【0329】

かかる標的配列選択の第１の非限定的な態様では、多くのエンドヌクレアーゼシステムが、ＣＲＩＳＰＲ ＩＩ型又はＶ型エンドヌクレアーゼの場合におけるＤＮＡ切断部位に隣接する特定の位置のＰＡＭ配列モチーフ要件など、潜在的な標的切断部位の初期選択の指針となる規則又は基準を有する。

【0330】

標的配列選択又は最適化の別の非限定的な態様では、標的配列と遺伝子編集エンドヌクレアーゼとの特定の組み合わせについての「オフターゲット」活性の頻度（即ち選択の標的配列以外の部位に起こるＤＳＢの頻度）がオンターゲット活性の頻度と比べて評価される。一部の場合において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、他の細胞と比べて選択的優位性を有し得る。選択的優位性の例示的な、しかし非限定的な例には、向上した複製率、持続性、ある種の条件に対する抵抗性、患者への導入後のインビボでの生着成功率又は持続性の向上、及びその他の、かかる細胞の数又は生存能力の維持又は増加に関連する属性など、属性の獲得が含まれる。他の場合において、所望の遺伝子座で正しく編集された細胞は、正しく編集された細胞の同定、選別又は他の選択に用いられる１つ以上のスクリーニング方法によってポジティブ選択されてもよい。選択的優位性及び定方向選択の両方の方法が、修正に関連する表現型を利用し得る。一部の実施形態において、意図した細胞集団の選択又は精製に用いられる新規表現型を作成する第２の修飾を作成するため、細胞が２回以上編集されてもよい。かかる第２の修飾は、選択可能又はスクリーニング可能マーカー用の第２のｇＲＮＡを加えることにより作成されてもよい。一部の場合では、ｃＤＮＡを含み、また選択可能なマーカーも含むＤＮＡ断片を使用して、細胞を所望の遺伝子座で正しく編集することができる。

【0331】

実施形態において、具体的な場合において任意の選択的優位性を適用可能であるか、それとも任意の定方向選択を適用すべきかに関わらず、適用の有効性を高めるため、及び／又は所望の標的以外の部位で望ましくない改変が起こる可能性を減らすため、標的配列選択はまた、オフターゲット頻度の検討が指針となる。本明細書及び当該技術分野において更に記載及び例示されるとおり、オフターゲット活性の発生は、標的部位と様々なオフターゲット部位との間の類似性及び相違性、並びに用いられる詳細なエンドヌクレアーゼを含め、幾つもの要因の影響を受ける。オフターゲット活性の予測を助けるバイオインフォマティクスツールが利用可能であり、高頻度でかかるツールはまた、最もオフターゲット活性の可能性が高い部位の同定にも用いることができ、次にはそれを実験的セッティングで評価して、オンターゲット活性に対するオフターゲットの相対頻度を判定することができ、それにより相対的にオンターゲット活性が高い配列の選択が可能になる。かかる技法の例示的な例は本明細書に提供され、及び当該技術分野では他の例も公知である。

【0332】

標的配列選択の別の態様は相同組換えイベントに関する。相同性領域を共有する配列は、介在配列の欠失を生じさせる相同組換えイベントの焦点となり得る。かかる組換えイベントは、染色体及び他のＤＮＡ配列の正常な複製経過中に起こり、またある時には、二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復の場合など、ＤＮＡ配列が合成されているときにも起こり、ＤＳＢは正常な細胞複製サイクルの中で常時起こるが、様々なイベント（紫外光及びその他のＤＮＡ切断誘導物質など）の発生又はある種の薬剤の存在（様々な化学的誘導物質など）によってもまた増強され得る。多くのかかる誘導物質がＤＳＢをゲノムに無差別に発生させ、正常細胞においてはＤＳＢは常時誘導され、修復されている。修復時、元の配列は完全な忠実度で再構成され得るが、しかしながら、一部の場合ではＤＳＢ部位に小さい挿入又は欠失（「インデル」と称される）が導入される。

【0333】

ＤＳＢはまた、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼシステムの場合のように、具体的な位置に特異的に誘導されてもよく、これを用いて選択の染色体位置に定方向の又は優先的な遺伝子修飾イベントを引き起こすことができる。ＤＮＡ修復（並びに複製）のコンテクストで相同配列が組換えを受け易い傾向は、幾つもの状況で利用することができ、所望の染色体位置に目的の配列を、但し「ドナー」ポリヌクレオチドの使用によって挿入するために相同組換え修復が用いられるＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集システムの一つの適用の基礎である。

【0334】

特定の配列間の相同性領域は、僅か１０塩基対以下を有し得る小さい「マイクロホモロジー」領域であってもよいもので、これもまた所望の欠失をもたらすために使用することができる。例えば、隣接配列とマイクロホモロジーを呈する部位に単一のＤＳＢが導入される。かかるＤＳＢの正常な修復経過の中で、高頻度で起こる結果は、ＤＳＢ及び同時の細胞修復過程によって組換えが促進される結果としての介在配列の欠失である。

【0335】

しかしながら、状況によっては、相同性領域内の標的配列を選択すると、遺伝子融合（欠失がコード領域にあるとき）を含め、はるかに大きい欠失が生じることもまたあり、具体的な状況を所与としてこれが所望されることも、又は所望されないこともある。

【0336】

本明細書に提供される例は、ＦＶＩＩＩコード遺伝子を挿入するように設計されたＤＳＢを作り出すための様々な標的領域の選択、並びにオンターゲットイベントと比べてオフターゲットイベントを最小限に抑えるように設計されるかかる領域内での特異的標的配列の選択を更に例示する。

【0337】

標的組込み
一部の実施形態において、本明細書に提供される方法は、「標的組込み」と称される、ヘパトサイトのゲノム中の特異的位置にＦＶＩＩＩコード遺伝子又は機能性ＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込むことである。一部の実施形態において、標的組込みは、配列特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生じさせることによって可能になる。

【0338】

一部の実施形態において使用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、多数のゲノム標的を迅速にスクリーニングして最適なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ設計を同定できるという利点がある。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、関連するＣａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ）をＤＮＡ中の特異的配列に標的化させるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれるＲＮＡ分子を使用する。このターゲティングは、ｓｇＲＮＡの約２０ｂｐターゲティング配列内においてｓｇＲＮＡとゲノムの配列との間でワトソン・クリック則に基づく対合によって起こる。標的部位に結合すると、ＣａｓヌクレアーゼはゲノムＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を作り出す。特異的ＤＮＡ配列を標的とするようにｓｇＲＮＡを設計するために必要なことは、標的配列が、ゲノム配列と相補的なｓｇＲＮＡ配列の３’末端にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含まなければならないことだけである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの場合、ＰＡＭ配列は、ＮＲＧ（式中、ＲはＡ又はＧであり、及びＮは任意の塩基である）、又はより制限が厳しいＰＡＭ配列ＮＧＧである。従って、インシリコで２０ｂｐ配列をあらゆるＰＡＭモチーフに隣接して置くことにより、ゲノムのいかなる領域を標的とするｓｇＲＮＡ分子も設計することができる。真核生物のゲノムでは、ＰＡＭモチーフは平均して１５ｂｐ毎に出現する。しかしながら、インシリコ方法によって設計されたｓｇＲＮＡは、細胞に二本鎖切断を異なる効率で生じさせることになり、インシリコ方法を用いて一連のｓｇＲＮＡ分子の切断効率を予測することは不可能である。ｓｇＲＮＡはインビトロで迅速に合成することができるため、これは所与のゲノム領域における全ての潜在的なｓｇＲＮＡ配列の高速スクリーニングによる、最も効率的な切断をもたらすｓｇＲＮＡの同定を可能にする。典型的には、所与のゲノム領域内の一連のｓｇＲＮＡを細胞で試験したとき、０〜９０％の様々な切断効率が観察される。インシリコアルゴリズム並びに研究室実験もまた、任意の所与のｓｇＲＮＡのオフターゲット可能性の決定に用いられてもよい。ほとんどの真核生物ゲノムでｓｇＲＮＡの２０ｂｐ認識配列との完全一致は主に１回限り起こることになるが、ゲノムには、ｓｇＲＮＡと１つ又は複数の塩基対ミスマッチを有する更なる部位が幾つもあり得る。これらの部位は様々な頻度で切断され得るが、多くの場合にその頻度をミスマッチの数又は位置に基づき予測することはできない。インシリコ分析によって同定されなかった更なるオフターゲット部位での切断もまた起こり得る。従って、関連性のある細胞型における幾つものｓｇＲＮＡをスクリーニングして、最も有利なオフターゲットプロファイルを有するｓｇＲＮＡを同定することが、治療適用に最適なｓｇＲＮＡの選択の重要な要素である。有利なオフターゲットプロファイルは、実際のオフターゲット部位の数及びそれらの部位での切断頻度のみならず、それらの部位のゲノム中における位置もまた考慮することになる。例えば、機能的に重要な遺伝子、特に癌遺伝子又は抗癌遺伝子に近い又はその範囲内にあるオフターゲット部位であれば、既知の機能を有しない遺伝子間領域の部位と比べて有利でないと見なされ得る。従って、最適なｓｇＲＮＡの同定は、単に生物のゲノム配列のインシリコ分析によっては予測できず、実験的試験が必要である。インシリコ分析は、試験するガイドの数を絞り込む助けになり得るが、オンターゲット切断が高率であるガイドを予測したり、又は望ましさの低いオフターゲット切断のガイドを予測したりすることはできない。実験データからは、各々が目的の領域（アルブミンイントロン１など）のゲノムと完全一致を有するｓｇＲＮＡの切断効率が、切断なしから＞９０％切断までばらつきがあり、いかなる公知のアルゴリズムによっても予測不可能であることが指摘される。所与のｓｇＲＮＡがＣａｓ酵素による切断を促進する能力は、ゲノムＤＮＡにおける当該の特異的部位への接近し易さに関係することができ、これは当該領域のクロマチン構造によって決まり得る。ヘパトサイトのような静止した分化細胞では大多数のゲノムＤＮＡが高度に凝縮したヘテロクロマチンとして存在する一方、能動的に転写される領域は、Ｃａｓタンパク質のようなタンパク質など、巨大分子が接近し易いことが知られる一層広がったクロマチン状態で存在する。能動的に転写される遺伝子内であっても、ＤＮＡの一部の特異的領域は、結合した転写因子又は他の調節タンパク質の有無に起因して他よりも接近し易い。ゲノム中、又はイントロンなど、及びアルブミンイントロン１などの特異的ゲノム遺伝子座若しくはゲノム遺伝子座の領域内の部位を予測することは不可能であり、従って関連性のある細胞型において実験的に決定する必要があり得る。一部の部位が潜在的な挿入部位として選択されると、実験的試験を伴い又は伴わず、例えば選択された部位から数個のヌクレオチドを上流又は下流に動かすことによってかかる部位に何らかの変更を加えることが可能となり得る。

【0339】

一部の実施形態において、本明細書に開示される方法において使用することのできるｇＲＮＡは、表３に挙げられる１つ以上又は表３のものと少なくとも約８５％のヌクレオチド配列同一性を有するその任意の誘導体である。

【0340】

核酸修飾
一部の実施形態において、細胞に導入されるポリヌクレオチドは、例えば活性、安定性又は特異性の増強、送達の改変、宿主細胞における自然免疫応答の低下、又は本明細書に更に記載するとおりの、及び当該技術分野において公知の他の増強のため、個々に、又は組み合わせて用いることのできる１つ以上の修飾を有する。

【0341】

特定の実施形態において、修飾されたポリヌクレオチドはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用され、その場合、ガイドＲＮＡ（単一分子ガイド又は二重分子ガイドのいずれか）及び／又は細胞に導入されるＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ又はＲＮＡが、以下に説明及び例示するとおり修飾されてもよい。かかる修飾されたポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて、任意の１つ以上ゲノム遺伝子座の編集に使用することができる。

【0342】

かかる使用の非限定的な例示を目的としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを用いると、ガイドＲＮＡの修飾は、単一分子ガイドであっても、又は二重分子であってもよいガイドＲＮＡとＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとを有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の形成又は安定性を増強するために用いることができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、又はそれに代えて、ゲノム編集複合体とゲノムにおける標的配列との間の相互作用の惹起、安定性又は動態を増強するために用いることもでき、それを用いて、例えばオンターゲット活性を増強することができる。ガイドＲＮＡの修飾はまた、又はそれに代えて、特異性、例えば他の（オフターゲット）部位における効果と比較したときのオンターゲット部位における相対ゲノム編集率を増強するために用いることもできる。

【0343】

修飾はまた、又はそれに代えて、例えば、細胞に存在するリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）による分解に対するその抵抗性を増加させて、それにより細胞におけるその半減期の増加を生じさせることによりガイドＲＮＡの安定性を増加させるために用いることができる。ガイドＲＮＡ半減期を増強する修飾は、編集しようとする細胞へのＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの導入が、エンドヌクレアーゼを生成するため翻訳される必要があるＲＮＡを介する実施形態において特に有用であることもあり、なぜなら、エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡと同時に導入されるガイドＲＮＡの半減期の増加を用いて、ガイドＲＮＡとコードされるＣａｓ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとが細胞に共存する時間を増加させることができるためである。

【0344】

修飾はまた、又はそれに代えて、細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を低下させるために用いることができる。かかる応答は、以下及び当該技術分野において記載されるとおりの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含め、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のコンテクストで十分に特徴付けられているものであり、ＲＮＡの半減期の低下及び／又はサイトカイン若しくは免疫応答に関連する他の因子の誘発と関連付けられる傾向がある。

【0345】

また、細胞に導入されるエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに、限定なしに、ＲＮＡの安定性を（細胞に存在するＲＮアーゼによるその分解の増加によるなど）増強する修飾、結果として生じる産物（即ちエンドヌクレアーゼ）の翻訳を増強する修飾、及び／又は細胞に導入されるＲＮＡが自然免疫応答を誘発する可能性又は程度を低下させる修飾を含め、１種以上の修飾が作られてもよい。

【0346】

前述のもの及びその他など、修飾の組み合わせも同様に用いることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１の場合、例えば、ガイドＲＮＡに１種以上の修飾（上記に例示されるものを含む）が作られてもよく、及び／又はＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡに１種以上の修飾（上記に例示されるものを含む）が作られてもよい。

【0347】

例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムにおいて使用されるガイドＲＮＡ、又は他の小型ＲＮＡは、以下に例示され、及び当該技術分野において記載されるとおりの、幾つもの修飾の容易な取込みを可能にする化学的手段によって容易に合成することができる。化学合成手順は絶えず拡大しているが、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、これはＰＡＧＥなどのゲルの使用を回避する）などの手順によるかかるＲＮＡの精製は、ポリヌクレオチド長さが増して１００ヌクレオチドほどを大きく超えるようになると、一層難題となる傾向がある。より大きい長さの化学的に修飾されたＲＮＡの生成に用いられる一つの手法は、一体にライゲートした２つ以上の分子を作製することである。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするものなど、はるかに長いＲＮＡは、より容易には酵素的に生成される。酵素的に作製されるＲＮＡで用いるのに利用可能な修飾の種類は概して少ないが、それでもなお、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性又は程度を低下させ、及び／又は以下及び当該技術分野で更に説明されるとおりの他の属性を増強するために用いることのできる修飾があり；及び新種の修飾が常時開発されている。

【0348】

各種の修飾、特により小型の化学的に合成されるＲＮＡで高頻度に用いられるものの例示として、修飾は、糖の２’位で修飾された１つ以上のヌクレオチド、一部の実施形態では、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、又は２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを有し得る。一部の実施形態において、ＲＮＡ修飾は、ピリミジンのリボース上の２’−フルオロ、２’−アミノ又は２’Ｏ−メチル修飾、脱塩基残基、又はＲＮＡの３’末端における逆位塩基を含む。かかる修飾はオリゴヌクレオチドにルーチンで取り込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシオリゴヌクレオチドと比べて所与の標的に対するＴｍがより高い（即ち、標的結合親和性がより高い）ことが示されている。

【0349】

幾つものヌクレオチド及びヌクレオシド修飾が、それを取り込むオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化耐性を天然オリゴヌクレオチドと比べて高めることが示されている；こうした修飾オリゴは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも長い間インタクトに生き残る。修飾オリゴヌクレオチドの具体的な例としては、修飾骨格、例えば、ホスホロチオエート、リン酸トリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル又はシクロアルキル糖間連結又は短鎖ヘテロ原子又は複素環式糖間連結を有するものが挙げられる。一部のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、並びにヘテロ原子骨格、特にＣＨ_２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ_２、ＣＨ，〜Ｎ（ＣＨ_３）〜Ｏ〜ＣＨ_２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ_２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２、ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２及びＯ−Ｎ（ＣＨ_３）−ＣＨ_２−ＣＨ_２骨格［ここで天然リン酸ジエステル骨格はＯ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨと表される］）；アミド骨格［Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，２８：３６６−３７４（１９９５）を参照］；モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ、米国特許第５，０３４，５０６号明細書を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（ここでオリゴヌクレオチドのリン酸ジエステル骨格はポリアミド骨格に置き換えられ、ヌクレオチドはポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９１，２５４，１４９７を参照）を有するものである。リン含有連結としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及びその他の、３’アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを有するアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート類を有するホスホルアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、及びボラノホスフェート類であって、通常の３’−５’連結を有するもの、これらの２’−５’連結類似体、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’に連結されている逆極性を有するものが挙げられる；米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９６号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３０６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；及び同第５，６２５，０５０号明細書を参照のこと。

【0350】

モルホリノベースのオリゴマー化合物について、Ｂｒａａｓｃｈ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（１４）：４５０３−４５１０（２００２）；Ｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ３０，Ｉｓｓｕｅ ３，（２００１）；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２４３：２０９−２１４（２００２）；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２６：２１６−２２０（２０００）；Ｌａｃｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９５９１−９５９６（２０００）；及び１９９１年６月２３日に取得された米国特許第５，０３４，５０６号明細書に記載されている。

【0351】

シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣体について、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８５９５−８６０２（２０００）に記載されている。

【0352】

そこにリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ連結（一部がヌクレオシドの糖部分で形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸塩骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩及びスルホンアミド骨格；アミド骨格を有するもの；並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ_２成分部分を有する他のものを有する；米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，２６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；及び同第５，６７７，４３９号明細書（これらの各々は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。

【0353】

１つ以上の置換糖部分、例えば２’位における以下のうちの１つもまた含まれ得る：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ_３ＯＣＨ_３、ＯＣＨ_３Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、又はＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３［式中、ｎは１〜約１０である］；Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリール又はアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ_３；ＯＣＦ_３；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ_３；ＳＯ_２ＣＨ_３；ＯＮＯ_２；ＮＯ_２；Ｎ_３；ＮＨ_２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ開裂基；レポーター群；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改良する基；又はオリゴヌクレオチド及び同様の特性を有する他の置換基の薬力学的特性を改良する基。一部の実施形態において、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）が挙げられる。他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ_３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ_２ ＣＨ_２ＣＨ_３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾がまた、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位に作られてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、シクロブチル類など、ペントフラノシル基の代わりに糖模倣体を有してもよい。

【0354】

一部の実施形態において、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、即ち骨格が、新規の基に置き換えられる。適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、塩基単位は維持される。一つのかかるオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格に置き換えられている。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製について教示する代表的な米国特許は、限定はされないが、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；及び同第５，７１９，２６２号明細書を有する。ＰＮＡ化合物の更なる教示については、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１４９７−１５００（１９９１）を参照することができる。

【0355】

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡはまた、それに加えて又は代えて、核酸塩基（多くの場合に当該技術分野では単に「塩基」と称される）修飾又は置換も含み得る。本明細書で使用されるとき、「非修飾」又は「天然」核酸塩基には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、天然核酸ではまれにしか又は一過性にしか見られない核酸塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン類、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’デオキシシトシンとも称され、及び多くの場合に当該技術分野では５−Ｍｅ−Ｃと称される）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びゲントビオシルＨＭＣ（ｇｅｎｔｏｂｉｏｓｙｌ ＨＭＣ）、並びに合成核酸塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ（ａｍｉｎｏａｌｋｌｙａｍｉｎｏ））アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ７５−７７（１９８０）；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：４５１３（１９９７）。当該技術分野において公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンもまた含まれ得る。５−Ｍｅ−Ｃ置換は核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の実施形態である。

【0356】

一部の実施形態において、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニルウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン（ｍｅｔｈｙｌｑｕａｎｉｎｅ）及び７−メチルアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなど、他の合成及び天然核酸塩基を含む。

【0357】

更に、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、‘Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ’，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｌｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ’，１９９１，３０，ｐａｇｅ ６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅａ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものを含む。これらの核酸塩基の特定のものは、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。それらとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びに２−アミノプロピルアデニンを有するＮ−２、Ｎ−６及び０−６置換プリン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ，‘Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ’，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、塩基置換の実施形態、更により詳細には、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせたときの態様である。修飾核酸塩基については、米国特許第３，６８７，８０８号明細書、並びに同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０２号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第５，７６３，５８８号明細書；同第５，８３０，６５３号明細書；同第６，００５，０９６号明細書；及び米国特許出願公開第２００３／０１５８４０３号明細書に記載されている。

【0358】

一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／又はエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ（又はＤＮＡ）は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取込みを増強する１つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に連結される。かかる部分は、限定はされないが、コレステロール部分などの脂質部分［Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６（１９８９）］；コール酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３−１０６０（１９９４）］；チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６−３０９（１９９２）及びＭａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５−２７７０（１９９３）］；チオコレステロール［Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３−５３８（１９９２）］；脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基［Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７−３３０（１９９０）及びＳｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９−５４（１９９３）］；リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）及びＳｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７−３７８３（１９９０）］；ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖［Ｍａｎｃｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９−９７３（１９９５）］；アダマンタン酢酸［Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１−３６５４（１９９５）］；パルミチル部分［（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９−２３７（１９９５）］；又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分［Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３−９３７（１９９６）］を含む。米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書もまた参照のこと。

【0359】

一部の実施形態において、糖及び他の部分を使用して、カチオン性ポリソーム及びリポソームなど、ヌクレオチドを有するタンパク質及び複合体を特定の部位に標的化することができる。例えば、肝細胞特異的トランスファーがアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）によって媒介されてもよい；例えば、Ｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｌｅｔｔ．２１（１０）：１０２５−３０（２０１４）を参照のこと。当該技術分野において公知の、及び常時開発される他のシステムを使用して、この場合に有用な生体分子及び／又はその複合体を目的の特定の標的細胞に標的化することができる。

【0360】

一部の実施形態において、これらのターゲティング部分又はコンジュゲートは、第一級又は第二級ヒドロキシル基など、官能基に共有結合的に結合するコンジュゲート基を含み得る。本開示のコンジュゲート基には、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を増強する基としては、本開示の文脈では、取込みを改良する基、分解に対する抵抗性を増強する基、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を増強する基としては、本開示の文脈では、本開示の化合物の取込み、分布、代謝又は排出を改良する基が挙げられる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号明細書、及び米国特許第６，２８７，８６０号明細書（これらは参照により本明細書に援用される）に開示されている。コンジュゲート部分としては、限定はされないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウムｌ，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又はアダマンタン酢酸、パルミチル部分、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；同第４，９４８，８８２号明細書；同第５，２１８，１０５号明細書；同第５，５２５，４６５号明細書；同第５，５４１，３１３号明細書；同第５，５４５，７３０号明細書；同第５，５５２，５３８号明細書；同第５，５７８，７１７号明細書、同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５８０，７３１号明細書；同第５，５９１，５８４号明細書；同第５，１０９，１２４号明細書；同第５，１１８，８０２号明細書；同第５，１３８，０４５号明細書；同第５，４１４，０７７号明細書；同第５，４８６，６０３号明細書；同第５，５１２，４３９号明細書；同第５，５７８，７１８号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第４，５８７，０４４号明細書；同第４，６０５，７３５号明細書；同第４，６６７，０２５号明細書；同第４，７６２，７７９号明細書；同第４，７８９，７３７号明細書；同第４，８２４，９４１号明細書；同第４，８３５，２６３号明細書；同第４，８７６，３３５号明細書；同第４，９０４，５８２号明細書；同第４，９５８，０１３号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，０８２，８３０号明細書；同第５，１１２，９６３号明細書；同第５，２１４，１３６号明細書；同第５，２４５，０２２号明細書；同第５，２５４，４６９号明細書；同第５，２５８，５０６号明細書；同第５，２６２，５３６号明細書；同第５，２７２，２５０号明細書；同第５，２９２，８７３号明細書；同第５，３１７，０９８号明細書；同第５，３７１，２４１号明細書、同第５，３９１，７２３号明細書；同第５，４１６，２０３号明細書、同第５，４５１，４６３号明細書；同第５，５１０，４７５号明細書；同第５，５１２，６６７号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５６５，５５２号明細書；同第５，５６７，８１０号明細書；同第５，５７４，１４２号明細書；同第５，５８５，４８１号明細書；同第５，５８７，３７１号明細書；同第５，５９５，７２６号明細書；同第５，５９７，６９６号明細書；同第５，５９９，９２３号明細書；同第５，５９９，９２８号明細書及び同第５，６８８，９４１号明細書を参照のこと。

【0361】

それほど化学合成に適していない、且つ典型的には酵素合成によって作製される、より長いポリヌクレオチドもまた、様々な手段によって修飾することができる。かかる修飾には、例えば、ある種のヌクレオチド類似体の導入、分子の５’又は３’末端における特定の配列又は他の部分の取込み、及び他の修飾が含まれ得る。例示として、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡは約４ｋｂ長であり、インビトロ転写によって合成することができる。このｍＲＮＡに修飾を適用することにより、例えば、その翻訳又は安定性を増加させることができ（細胞による分解に対するその抵抗性を増加させることによるなど）、又は外因性ＲＮＡ、特にＣａｓ９をコードするものなどのより長いＲＮＡの導入後に細胞で観察されることの多い自然免疫応答を誘発するＲＮＡの傾向を低下させることができる。

【0362】

数多くのかかる修飾が、ポリＡテール、５’キャップ類似体（例えば、アンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）又はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ））、修飾５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、修飾塩基の使用（プソイドＵＴＰ、２−チオ−ＵＴＰ、５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）又はＮ６−メチル−ＡＴＰなど）、又はホスファターゼ処理による５’末端リン酸の除去など、当該技術分野において記載されている。これら及び他の修飾は当該技術分野において公知であり、ＲＮＡの新規修飾が常時開発されている。

【0363】

修飾ＲＮＡの商業的供給業者は、例えば、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡｘｏＬａｂｓ、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ及び他多数を含め、数多くある。ＴｒｉＬｉｎｋによって記載されるとおり、例えば、５−メチル−ＣＴＰを使用して、ヌクレアーゼ安定性の増加、翻訳の増加又は自然免疫受容体とインビトロ転写ＲＮＡとの相互作用の低下など、望ましい特徴を付与することができる。５−メチルシチジン−５’−三リン酸（５−メチル−ＣＴＰ）、Ｎ６−メチル−ＡＴＰ、並びにプソイドＵＴＰ及び２−チオ−ＵＴＰもまた、以下で参照するＫｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．及びＷａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．による発表に示されるとおり、翻訳を増強しつつ、培養下及びインビボで自然免疫刺激を低下させることが示されている。

【0364】

インビボで送達される化学修飾ｍＲＮＡを使用して治療効果の向上を実現できることが示されている；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９，１５４−１５７（２０１１）を参照のこと。かかる修飾は、例えば、ＲＮＡ分子の安定性の増加及び／又はその免疫原性の低下のために使用することができる。プソイドＵ、Ｎ６−メチル−Ａ、２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃなどの化学修飾を使用すると、ウリジン及びシチジン残基の僅か４分の１をそれぞれ２−チオ−Ｕ及び５−メチル−Ｃに置換するだけで、マウスにおいてＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）媒介性のｍＲＮＡ認識の大幅な減少が生じたことが分かった。自然免疫系の活性化の低下により、こうした修飾を用いてインビボでのｍＲＮＡの安定性及び寿命を有効に増加させることができる；例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、前掲を参照のこと。

【0365】

また、自然抗ウイルス応答を回避するように設計された修飾を取り込んだ合成メッセンジャーＲＮＡを反復投与することにより、分化したヒト細胞を多能性に再プログラム化できることも示されている。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，７（５）：６１８−３０（２０１０）を参照のこと。一次再プログラム化タンパク質として働くかかる修飾ｍＲＮＡは、複数のヒト細胞型を再プログラム化するのに効率的な手段であり得る。かかる細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と称され、５−メチル−ＣＴＰ、プソイドＵＴＰ及びアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）を取り込んだ酵素的に合成されたＲＮＡを使用して細胞の抗ウイルス応答を有効に逃れ得ることが分かった；例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、前掲を参照のこと。

【0366】

当該技術分野において記載されるポリヌクレオチドの他の修飾としては、例えば、ポリＡテールの使用、５’キャップ類似体（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（ｍＣＡＰ）など）の付加、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の修飾、又はホスファターゼ処理による５’末端リン酸の除去が挙げられ−、新規手法が常時開発されている。

【0367】

本明細書で使用される修飾ＲＮＡの生成に適用可能な幾つもの組成物及び技法が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含め、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の修飾に関連して開発されている。ｓｉＲＮＡは、それがｍＲＮＡ干渉によって遺伝子サイレンシングに及ぼす効果が概して一過性であり、それにより反復投与が必要になり得るため、インビボで特定の課題を提示する。加えて、ｓｉＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、哺乳類細胞は、多くの場合にウイルス感染の副産物であるｄｓＲＮＡを検出して中和するように進化した免疫応答を有する。従って、ｄｓＲＮＡに対する細胞応答を媒介することのできる哺乳類酵素、例えば、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ応答性キナーゼ）、及び潜在的にレチノイン酸誘導性の遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、並びにかかる分子に応答してサイトカインの誘導を惹起することのできるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８など）がある；例えば、Ａｎｇａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ）６（４）：４４０−４６８（２０１３）；Ｋａｎａｓｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０（３）：５１３−５２４（２０１２）；Ｂｕｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ．６（９）：１１３０−４６（２０１１）；Ｊｕｄｇｅ ａｎｄ ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１１１−２４（２００８）によるレビュー；及びそこに引用される文献を参照のこと。

【0368】

多種多様な修飾が、ＲＮＡ安定性の増強、自然免疫応答の低下、及び／又は本明細書に記載されるとおりの、ヒト細胞へのポリヌクレオチドの導入に関連して有用であり得る他の利益の実現のため開発され、適用されている；例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ＫＡ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：７７−９６（２０１１）；Ｇａｇｌｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｒｅ，Ｍｉｎｉ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１０（７）：５７８−９５（２０１０）；Ｃｈｅｒｎｏｌｏｖｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１２（２）：１５８−６７（２０１０）；Ｄｅｌｅａｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ Ｃｈａｐｔｅｒ １６：Ｕｎｉｔ １６．３（２００９）；Ｂｅｈｌｋｅ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８（４）：３０５−１９（２００８）；Ｆｕｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒ ２２（３）：２０５−２１０（２０１２）；Ｂｒｅｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ ３：１５４（２０１２）によるレビューを参照のこと。

【0369】

上述のとおり、修飾ＲＮＡの商業的供給業者は幾つもあり、その多くはｓｉＲＮＡの有効性を改善するように設計された修飾に特化している。文献に報告される様々な知見に基づき種々の手法が提供される。例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎは、Ｋｏｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １１：１２５−１４０（２０１２）によって報告されるとおり、ｓｉＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を改善するため非架橋酸素から硫黄（ホスホロチオエート、ＰＳ）への置換が広範に用いられていることを注記している。リボースの２’位の修飾は、二重鎖安定性（Ｔｍ）を増加させつつインターヌクレオチドリン酸結合のヌクレアーゼ耐性を改善することが報告されており、これはまた免疫活性化からの保護を提供することも示されている。中程度のＰＳ骨格修飾と小さい十分に許容される２’置換（２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロ）との組み合わせは、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８（２００４）によって報告されるとおり、インビボでの適用に極めて安定性の高いｓｉＲＮＡと関連付けられており；及び２’−Ｏ−メチル修飾は、Ｖｏｌｋｏｖ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９：１９１−２０２（２００９）によって報告されるとおり、安定性の改善に有効であることが報告されている。自然免疫応答の誘導の減少に関連して、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−ヒドロによる特定の配列の修飾が、概してサイレンシング活性は維持しつつ、ＴＬＲ７／ＴＬＲ８相互作用を低下させることが報告されている；例えば、Ｊｕｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３：４９４−５０５（２００６）；及びＣｅｋａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６５：９０−１０８（２００７）．を参照のこと。２−チオウラシル、プソイドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びＮ６−メチルアデノシンなどの追加的な修飾もまた、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８によって媒介される免疫効果を最小限に抑えることが示されている；例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３：１６５−１７５（２００５）を参照のこと。

【0370】

同様に当該技術分野において公知であり、且つ市販されているとおり、本明細書で使用するＲＮＡなどのポリヌクレオチドに対し、例えば、コレステロール、トコフェロール及び葉酸、脂質、ペプチド、ポリマー、リンカー及びアプタマーを含め、その送達及び／又は細胞による取込みを増強することのできる幾つものコンジュゲートを適用することができる；例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４：７９１−８０９（２０１３）によるレビュー、及びそこに引用される文献を参照のこと。

【0371】

送達
一部の実施形態において、本明細書に提供される方法で使用される任意の核酸分子、例えば本開示のゲノムターゲティング核酸及び／又は部位特異的ポリペプチドをコードする核酸は、細胞への送達用の送達媒体の中又はその表面上にパッケージングされる。企図される送達媒体としては、限定はされないが、ナノスフェア、リポソーム、量子ドット、ナノ粒子、ポリエチレングリコール粒子、ヒドロゲル、及びミセルが挙げられる。当該技術分野で記載されるとおり、種々のターゲティング部分を用いてかかる媒体と所望の細胞型又は位置との優先的相互作用を増強することができる。

【0372】

細胞への本開示の複合体、ポリペプチド、及び核酸の導入は、ウイルス又はバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポソーム媒介性トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接のマイクロインジェクション、ナノ粒子媒介性核酸送達などによって行うことができる。

【0373】

実施形態において、ガイドＲＮＡポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）及び／又は１つ又は複数のエンドヌクレアーゼポリヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）は、当該技術分野において公知のウイルス又は非ウイルス送達媒体によって送達することができる。或いは、１つ又は複数のエンドヌクレアーゼポリペプチドは、電気穿孔又は脂質ナノ粒子など、当該技術分野において公知のウイルス又は非ウイルス送達媒体によって送達されてもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、単独か、又は１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されるかのいずれかで、１つ以上のポリペプチドとして送達されてもよい。

【0374】

実施形態において、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ナノ粒子、リポソーム、リボ核タンパク質、正電荷ペプチド、小分子ＲＮＡコンジュゲート、アプタマー−ＲＮＡキメラ、及びＲＮＡ融合タンパク質複合体を含めた非ウイルス送達媒体によって送達されてもよい。一部の例示的非ウイルス送達媒体について、Ｐｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８：１１２７−１１３３（２０１１）に記載されている（これはｓｉＲＮＡ用の非ウイルス送達媒体に焦点を置いているが、これは他のポリヌクレオチドの送達にもまた有用である）。

【0375】

実施形態において、ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、及びエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって細胞又は患者に送達されてもよい。

【0376】

動物モデル及びヒトの両方で核酸の非ウイルス送達方法が幾つか試験されているが、最も十分に開発されているシステムは、脂質ナノ粒子である。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、概して、イオン化可能なカチオン性脂質と、３つ以上の追加成分、典型的にはコレステロール、ＤＯＰＥ及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有脂質とで構成され、例えば実施例２を参照のこと。カチオン性脂質は、正電荷核酸に結合して、核酸の分解を防ぐ高密度複合体を形成することができる。マイクロ流体システムを通過する間に、それらの成分が自己組織化して５０〜１５０ｎＭのサイズ範囲の粒子を形成し、ここではカチオン性脂質と複合体化して脂質二重層様の構造に取り囲まれたコアに核酸が封入されている。対象の循環への注入後、この粒子はアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）に結合することができる。ＡｐｏＥはＬＤＬ受容体のリガンドであり、受容体媒介性エンドサイトーシスによる肝臓のヘパトサイトへの取込みを媒介する。この種のＬＮＰは、ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡをげっ歯類、霊長類及びヒトの肝臓のヘパトサイトに効率的に送達することが示されている。エンドサイトーシス後、ＬＮＰはエンドソームに存在する。封入された核酸は、カチオン性脂質のイオン化可能な性質によって媒介されるエンドソームエスケープの過程を経る。これにより核酸が細胞質に送達され、そこでｍＲＮＡがコードタンパク質へと翻訳されることができる。従って、一部の実施形態において、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡをＬＮＰに封入することを用いて、静脈注射後にヘパトサイトに両方の成分が効率的に送達される。エンドソームエスケープ後、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡはＣａｓ９タンパク質に翻訳され、ｇＲＮＡと複合体を形成することができる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質配列に核局在化シグナルが含まれると、Ｃａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の核移行が促進される。或いは、小さいｇＲＮＡは核膜孔複合体を横断し、核内でＣａｓ９タンパク質と複合体を形成する。核に入ると、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は相同標的部位に関してゲノムをスキャンし、ゲノム中の所望の標的部位に優先的に二本鎖切断を生じさせる。ＲＮＡ分子のインビボ半減期は数時間〜数日程度と短い。同様に、タンパク質の半減期も短い傾向があり、数時間〜数日程度である。従って、一部の実施形態においてＬＮＰを使用したｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達は、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の一過性の発現及び活性をもたらし得るに過ぎない。これによってオフターゲット切断頻度が低下するという利点が付与され、ひいては一部の実施形態では遺伝毒性のリスクが最小限となり得る。ＬＮＰは、概してウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトがＡＡＶに対する免疫を既に持っているが、ＬＮＰに対する既存免疫はない。ＬＮＰに対して追加及び適応免疫応答が起こる可能性は低く、これによりＬＮＰの反復投与が可能となる。

【0377】

ＬＮＰでの使用のため、幾つかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が開発されている。それらとしては、とりわけ、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０７，１８６４−１８６９）、ＭＣ３、ＬＮ１６、ＭＤ１が挙げられる。ある種のＬＮＰでは、ＬＮＰの外側にＧａｌＮａｃ部分が取り付けられ、これがアシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｙｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体を介した肝臓への取込みのリガンドとして働く。これらのカチオン性脂質の任意のものを使用して、肝臓へのｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達用ＬＮＰが製剤化される。

【0378】

一部の実施形態において、ＬＮＰは、１０００ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、又は２５ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。或いは、ナノ粒子は、１〜１０００ｎｍ、１〜５００ｎｍ、１〜２５０ｎｍ、２５〜２００ｎｍ、２５〜１００ｎｍ、３５〜７５ｎｍ、又は２５〜６０ｎｍのサイズの範囲であってもよい。

【0379】

ＬＮＰは、カチオン性、アニオン性、又は中性脂質でできていてもよい。融合性リン脂質ＤＯＰＥ又は膜成分コレステロールなどの中性脂質が、「ヘルパー脂質」としてトランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強するためＬＮＰに含まれてもよい。カチオン性脂質の制限としては、低い安定性及び急速なクリアランスに起因する低い有効性、並びに炎症反応又は抗炎症反応の発生が挙げられる。ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、又は疎水性脂質及び親水性脂質の両方を有してもよい。

【0380】

当該技術分野において公知の任意の脂質又は脂質の組み合わせを使用してＬＮＰを作製し得る。ＬＮＰの作製に使用される脂質の例は、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ−コレステロール、ＤＯＴＡＰ−コレステロール、ＧＡＰ−ＤＭＯＲＩＥ−ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ−ＤＯＰＥ−ＤＭＰＥ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。カチオン性脂質の例は、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１である。中性脂質の例は、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭである。ＰＥＧ修飾脂質の例は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０である。

【0381】

実施形態において、ＬＮＰを作製するために、脂質はいかなるモル比で組み合わされてもよい。加えて、ＬＮＰを作製するために、１つ又は複数のポリヌクレオチドが１つ又は複数の脂質と幅広いモル比で組み合わされてもよい。

【0382】

実施形態において、部位特異的ポリペプチド及びゲノムターゲティング核酸は、各々が別個に細胞又は患者に投与されてもよい。他方で、部位特異的ポリペプチドは、１つ以上のガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡと併せた１つ以上のｃｒＲＮＡと予め複合体化されてもよい。予め複合体化された材料が、次には細胞又は患者に投与されてもよい。かかる予め複合体化された材料は、リボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）として知られる。

【0383】

ＲＮＡはＲＮＡ又はＤＮＡと特異的相互作用を形成する能力を有する。この特性は多くの生物学的過程で利用されているが、これはまた、核酸リッチな細胞環境において無差別な相互作用となるリスクも伴う。この問題の一つの解決法はリボ核タンパク質粒子（ＲＮＰ）の形成であり、ここではＲＮＡがエンドヌクレアーゼと予め複合体化される。ＲＮＰの別の利益は分解からのＲＮＡの保護である。

【0384】

一部の実施形態において、ＲＮＰにおけるエンドヌクレアーゼは修飾されていても、又は非修飾であってもよい。同様に、ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡは修飾されていても、又は非修飾であってもよい。数多くの修飾が当該技術分野において公知であり、使用することができる。

【0385】

エンドヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとは、概して１：１のモル比で組み合わされてもよい。或いは、エンドヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、概して１：１：１のモル比で組み合わされてもよい。しかしながら、ＲＮＰの作製には幅広いモル比を用いることができる。

【0386】

一部の実施形態において、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが送達に用いられてもよい。送達しようとするポリヌクレオチドを含むパッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子の作製技法は、当該技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの作製には、単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と称される）の中に以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個の（即ちその中にない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにヘルパーウイルス機能が存在する必要がある。ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、限定はされないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０、ＡＡＶ−１１、ＡＡＶ−１２、ＡＡＶ−１３及びＡＡＶ ｒｈ．７４を含め、組換えウイルスが由来することのできる任意のＡＡＶ血清型からのものであってもよく、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲと異なるＡＡＶ血清型からのものであってもよい。シュードタイプｒＡＡＶの作製が、例えば、国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。表１を参照のこと。

【0387】

【表2】

【0388】

一部の実施形態において、パッケージング細胞の作成方法は、ＡＡＶ粒子作製に必要な全ての成分を安定に発現する細胞株を作成することを含む。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムと別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、並びにネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーを有するプラスミド（又は複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ，２３：６５−７３）などの手順によるか、又は直接的な平滑末端ライゲーション（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ＆ Ｃａｒｔｅｒ，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１−４６６６）によって細菌プラスミドに導入されている。パッケージング細胞株は次に、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、且つｒＡＡＶの大規模作製に好適であることである。好適な方法の他の例では、プラスミドよりむしろアデノウイルス又はバキュロウイルスを利用してｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子がパッケージング細胞に導入される。

【0389】

ｒＡＡＶ作製の一般的原理については、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３−５３９；及びＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７−１２９）にレビューされている。様々な手法が、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４−１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９−６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４−１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に記載されている。

【0390】

ＡＡＶベクター血清型は標的細胞型に合致させることができる。例えば、以下の例示的細胞型は、数ある中でも特に、指示されるＡＡＶ血清型によって形質導入されてもよい。例えば、肝組織／細胞型に好適なＡＡＶベクターの血清型としては、限定はされないが、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９が挙げられる。

【0391】

アデノ随伴ウイルスベクターに加えて、他のウイルスベクターを使用することができる。かかるウイルスベクターとしては、限定はされないが、レンチウイルス、アルファウイルス、エンテロウイルス、ペスチウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パポーバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓｒ）、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。

【0392】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、アルブミン遺伝子の１つ又は２つの遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡ、及びドナーＤＮＡは、各々が脂質ナノ粒子に別個に製剤化されるか、又は全てが１つの脂質ナノ粒子に共製剤化され、又は２つ以上の脂質ナノ粒子に共製剤化される。

【0393】

一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に製剤化され、一方でｓｇＲＮＡ及びドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとは脂質ナノ粒子に共製剤化され、一方でドナーＤＮＡはＡＡＶベクターで送達される。

【0394】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼをＤＮＡプラスミドとして、ｍＲＮＡとして又はタンパク質として送達する選択肢が利用可能である。ガイドＲＮＡは同じＤＮＡから発現させることができ、又はＲＮＡとして送達することもできる。ＲＮＡは、その半減期が改変され若しくは向上するように、又は免疫応答の可能性若しくは程度が低下するように化学的に修飾することができる。エンドヌクレアーゼタンパク質は送達前にｇＲＮＡと複合体化することができる。ウイルスベクターは効率的な送達を可能にし；分割バージョンのＣａｓ９及びＣａｓ９のより小さいオルソログを、ＨＤＲ用のドナーについてできるのと同じく、ＡＡＶにパッケージングすることができる。これらの成分の各々を送達することのできる様々な非ウイルス送達方法もまた存在し、又は非ウイルス方法及びウイルス方法をタンデムで利用することができる。例えば、ナノ粒子を使用してタンパク質及びガイドＲＮＡを送達することができ、一方でＡＡＶを使用してドナーＤＮＡを送達することができる。

【0395】

治療処置用のゲノム編集成分を送達することが関係する一部の実施形態では、形質転換しようとする細胞、例えばヘパトサイトの核に少なくとも２つの成分；配列特異的ヌクレアーゼ及びＤＮＡドナー鋳型が送達される。一部の実施形態において、ドナーＤＮＡ鋳型は、向肝性のあるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）にパッケージングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６又はＡＡＶ−ＤＪから選択される。一部の実施形態において、ＡＡＶにパッケージングされたＤＮＡドナー鋳型が初めに末梢静脈内注射によって対象、例えば患者に投与され、続いて配列特異的ヌクレアーゼが投与される。ＡＡＶにパッケージングされたドナーＤＮＡ鋳型を最初に送達する利点は、送達されたドナーＤＮＡ鋳型が、形質導入されたヘパトサイトの核に安定に維持されるであろうことであり、それにより続く配列特異的ヌクレアーゼの投与が可能となり、それがゲノムに二本鎖切断を作り出し、続いてＨＤＲ又はＮＨＥＪによってＤＮＡドナーが組み込まれる。一部の実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、トランス遺伝子の標的組込みを促進するために必要となったときにのみ所望の治療効果に十分なレベルで標的細胞に活性のまま残っていることが望ましい。配列特異的ヌクレアーゼが細胞に長期間活性のまま残る場合、それによってオフターゲット部位での二本鎖切断の頻度が増加することになる。具体的には、オフターゲット切断頻度は、オフターゲット切断効率にヌクレアーゼが活性である時間を乗じたものの関数である。ｍＲＮＡの形態の配列特異的ヌクレアーゼを送達すると、ｍＲＮＡ及び翻訳されたタンパク質が細胞において短命であるため、ヌクレアーゼ活性の持続時間は数時間〜数日の範囲の短いものとなる。従って、ドナー鋳型を既に含有する細胞に配列特異的ヌクレアーゼを送達すると、オフターゲット組込みに対する標的組込みの比率が最も高くなるものと予想される。加えて、末梢静脈内注射後のヘパトサイトの核へのＡＡＶの媒介によるドナーＤＮＡ鋳型送達は、ウイルスが細胞を感染させて、エンドソームから逃れ、次に核に移行して、宿主成分によって一本鎖ＡＡＶゲノムを二本鎖ＤＮＡ分子に変換する必要があるため、典型的には１〜１４日程度と時間がかかる。従って、少なくとも一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９成分は約１〜３日しか活性でないであろうため、これらのヌクレアーゼ成分の供給前にドナーＤＮＡ鋳型を核に送達する過程を完了させることが好ましい。

【0396】

一部の実施形態において、配列特異的ヌクレアーゼは、アルブミン遺伝子のイントロン１内のＤＮＡ配列をＣａｓ９ヌクレアーゼと一緒になって指向するｓｇＲＮＡで構成されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）に作動可能に融合した、Ｃａｓ９タンパク質をコードするｍＲＮＡとして送達される。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子にパッケージングすることによりヘパトサイトに送達される。一部の実施形態において、脂質ナノ粒子は脂質Ｃ１２−２００を含有する（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ ２０１０，ＰＮＡＳ ｖｏｌ １０７ １８６４−１８６９）。一部の実施形態において、ＬＮＰにパッケージングされるｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとの比は１：１（質量比）であり、その結果、マウスにおけるインビボＤＮＡ切断が最大となる。代替的実施形態において、ＬＮＰにパッケージングされるｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとの別の質量比、例えば、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１又は２：１又は逆の比が用いられてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡとは別個のＬＮＰ製剤にパッケージングされ、ｓｇＲＮＡを含有するＬＮＰの約１〜約８時間前にＣａｓ９ ｍＲＮＡ含有ＬＮＰを患者に送達することにより、ｓｇＲＮＡの送達前にＣａｓ９ ｍＲＮＡが翻訳されるのに最適な時間が与えられる。

【0397】

一部の実施形態において、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとを封入するＬＮＰ製剤（「ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤」）が、ＡＡＶにパッケージングされたＤＮＡドナー鋳型を予め投与された対象、例えば患者に投与される。一部の実施形態において、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤は、ＡＡＶ−ドナーＤＮＡ鋳型の投与後１日〜２８日以内又は７日〜２８日以内又は７日〜１４日以内に対象に投与される。ＡＡＶ−ドナーＤＮＡ鋳型に対してＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤を送達する最適なタイミングは、当該技術分野において公知の技法、例えばマウス及びサルを含めた動物モデルで行われる試験を用いて決定することができる。

【0398】

一部の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、非ウイルス送達方法を用いて対象、例えば患者のヘパトサイトに送達される。一部の患者（典型的には３０％）は、最も一般的に用いられるＡＡＶ血清型に対する既存の中和抗体を有し、それが前記ＡＡＶによる効果的な遺伝子送達を妨げるが、非ウイルス送達方法では全ての患者が治療可能となる。幾つかの非ウイルス送達方法論が当該技術分野において公知となっている。詳細には脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が、動物及びヒトにおいて静脈内注射後にその封入されたカーゴをヘパトサイトの細胞質に効率的に送達することが公知である。このようなＬＮＰは、受容体媒介性エンドサイトーシスの過程を通じて肝臓によって能動的に取り込まれ、肝臓への優先的な取込みをもたらす。

【0399】

一部の実施形態において、ドナー鋳型の核局在化を促進するため、プラスミドの核局在化を促進することのできるＤＮＡ配列、例えばシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）複製起点及び初期プロモーターの３６６ｂｐ領域をドナー鋳型に加えることができる。細胞タンパク質に結合する他のＤＮＡ配列もまた、ＤＮＡの核移行の向上に使用することができる。

【0400】

一部の実施形態において、導入されたＦＶＩＩＩ遺伝子の発現又は活性レベルが、例えばｇＲＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとを含有するＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤をＡＡＶ−ドナーＤＮＡ鋳型の後に初回投与した後、対象、例えば患者の血中で測定される。ＦＶＩＩＩレベルが、例えば正常レベルの少なくとも５〜５０％、詳細には５〜２０％のＦＶＩＩＩレベルと定義されるとおり、疾患の治癒に十分でない場合、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の２回目又は３回目の投与が与えられ、アルブミンイントロン１部位への更なる標的組込みが促進される。複数回用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤を用いてＦＶＩＩＩの所望の治療レベルを達成することの実現可能性は、当該技術分野において公知の技法、例えばマウス及びサルを含めた動物モデルを用いた試験を用いて試験し、最適化することができる。

【0401】

一部の実施形態において、対象へのｉ）ドナーカセットを含むＡＡＶ−ドナーＤＮＡ鋳型及びｉｉ）ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の投与を含む本明細書に記載される任意の方法によれば、対象へのＡＡＶ−ドナーＤＮＡ鋳型の投与後１日〜２８日以内に対象に初回用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤が投与される。一部の実施形態において、初回用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤は、標的細胞の核へのドナーＤＮＡ鋳型の送達を可能にするのに十分な時間が経った後に対象に投与される。一部の実施形態において、初回用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤は、標的細胞の核内での一本鎖ＡＡＶゲノムから二本鎖ＤＮＡ分子への変換を可能にするのに十分な時間が経った後に対象に投与される。一部の実施形態において、初回用量の投与に続き、１つ以上（２、３、４、５つ、又はそれ以上など）の追加用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤が対象に投与される。一部の実施形態において、ドナーカセットの目標の標的組込みレベル及び／又はドナーカセットの目標の発現レベルが実現するまで１つ以上の用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤が対象に投与される。一部の実施形態において、本方法は、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の各投与後にドナーカセットの標的組込みレベル及び／又はドナーカセットの発現レベルを測定すること、及びドナーカセットの目標の標的組込みレベル及び／又はドナーカセットの目標の発現レベルが実現されない場合に追加用量のＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤を投与することを更に含む。一部の実施形態において、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量と同じである。一部の実施形態において、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量未満である。一部の実施形態において、ＬＮＰ−ヌクレアーゼ製剤の１つ以上の追加用量のうちの少なくとも１つの量は、初回用量より多い。

【0402】

遺伝子修飾細胞及び細胞集団
一態様において、本開示は本明細書によって、細胞のゲノムを編集し、それにより遺伝子修飾細胞を作り出す方法を提供する。一部の態様において、遺伝子修飾細胞集団が提供される。従って遺伝子修飾細胞とは、ゲノム編集によって（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１システムを使用して）導入された少なくとも１つの遺伝子修飾を有する細胞を指す。一部の実施形態において、遺伝子修飾細胞は、遺伝子修飾されたヘパトサイト細胞である。本明細書では、外因性ゲノムターゲティング核酸及び／又はゲノムターゲティング核酸をコードする外因性核酸を有する遺伝子修飾細胞が企図される。

【0403】

一部の実施形態において、細胞のゲノムは、細胞のゲノム配列にＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体の核酸配列を挿入することによって編集し得る。一部の実施形態において、ゲノム編集に供される細胞はゲノムに１つ以上の突然変異を有し、そのため、かかる突然変異を有しない正常なものでの発現と比較したとき、内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現が低下する。正常細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子欠陥を有しない異なる対象に由来する（又はそれから単離された）健常又は対照細胞であり得る。一部の実施形態において、ゲノム編集に供される細胞は、ＦＶＩＩＩ遺伝子に関連する病態又は障害の治療を必要としている対象に由来してもよい（又はそれから単離されてもよい）。従って、一部の実施形態においてかかる細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現は、正常細胞における内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子発現の発現と比較したとき約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は約１００％低下している。

【0404】

トランス遺伝子、例えばＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能断片をコードする核酸の挿入の成功後、細胞における導入されたＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体の発現は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現と比較したとき少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％又はそれ以上であり得る。一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞におけるＦＶＩＩＩの機能性断片を含めた導入されたＦＶＩＩＩ遺伝子産物の活性は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現と比較したとき少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、約１，０００％、約２，０００％、約３，０００％、約５，０００％、約１０，０００％又はそれ以上であり得る。一部の実施形態において、細胞における導入されたＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体の発現は、細胞の内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子の発現の少なくとも約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約５０倍、約１００倍、約１０００倍又はそれ以上である。また、一部の実施形態において、ゲノム編集された細胞におけるＦＶＩＩＩの機能性断片を含めた導入されたＦＶＩＩＩ遺伝子産物の活性は、正常な健常細胞におけるＦＶＩＩＩ遺伝子産物の活性と比べて同等又はそれ以上であり得る。

【0405】

血友病Ａを治療又は改善することが関係する実施形態において、遺伝子編集の主要な標的はヒト細胞である。例えば、エキソビボ方法及びインビボ方法において、ヒト細胞はヘパトサイトである。一部の実施形態において、必要としている患者に由来する、従ってその患者と既に完全に一致している自己細胞で遺伝子編集を実施することにより、患者に安全に再導入することができる細胞を作成し、且つ患者の疾患に関連する１つ以上の臨床状態の改善に有効となるであろう細胞の集団を有効に生じさせることが可能である。かかる治療についての一部の実施形態において、ヘパトサイト細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法により単離し、遺伝子修飾された治療上有効な細胞を作り出すために使用することができる。一つの実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｍｅｎｔ）において、肝幹細胞がエキソビボで遺伝子修飾され、次に患者に再導入され、そこで挿入されたＦＶＩＩＩ遺伝子を発現する遺伝子修飾されたヘパトサイト又は類洞内皮細胞が生じることになる。

【0406】

治療手法
一態様において、本明細書には、患者のゲノムを編集することにより患者の血友病Ａを治療するための遺伝子療法手法が提供される。一部の実施形態において、この遺伝子療法手法は、患者の関連性のある細胞型のゲノムに機能性ＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込むもので、これが血友病Ａの根治を提供することができる。一部の実施形態において、ＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込むことになる遺伝子療法手法に供される細胞型はヘパトサイトであり、なぜならこうした細胞は多くのタンパク質を効率的に発現し、血中に分泌するためである。加えて、ヘパトサイトを使用したこの組込み手法は、組み込まれた遺伝子がヘパトサイトの分裂時に娘細胞に受け継がれ得るため、肝臓が十分には成長していない小児患者に対して検討することができる。

【0407】

別の態様において、本明細書には、ゲノムエンジニアリングツールを使用して、ＦＶＩＩＩコード遺伝子又はその機能性誘導体をゲノム中の遺伝子座にノックインしてＦＶＩＩＩタンパク質活性を回復させることによりゲノムに永久的変化を作り出す細胞性エキソビボ及びインビボ方法が提供される。かかる方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを使用して、ゲノムから任意の配列を永久的に欠失させ、挿入し、編集し、修正し、又は置き換え、又は外因性配列、例えばＦＶＩＩＩコード遺伝子をゲノム遺伝子座に挿入する。このようにして、本開示に示される例は、単回治療で（可能性のある療法を患者の生涯にわたって送達するのでなく）ＦＶＩＩＩ遺伝子の活性を回復させる。

【0408】

一部の実施形態において、エキソビボ細胞ベース療法は、患者から単離されるヘパトサイトを使用して行われる。次に、それらの細胞の染色体ＤＮＡが、本明細書に記載される材料及び方法を用いて編集される。最後に、編集された細胞が患者に移植される。

【0409】

エキソビボ細胞療法手法の一つの利点は、投与前にその治療法の総合的分析を行うことが可能なことである。いずれのヌクレアーゼベース治療法にも、ある程度のオフターゲット効果がある。エキソビボで遺伝子修正を実施すると、修正された細胞集団を移植前に十分に特徴付けることが可能になる。本開示の態様は、修正された細胞のゲノム全体をシーケンシングして、存在する場合にオフターゲット切断が、患者にとって最小限のリスクに関連するゲノム位置にあるよう確実にすることを含む。更に、クローン集団を含めた特定の細胞集団を移植前に単離することができる。

【0410】

かかる方法の別の実施形態は、インビボベース療法である。この方法では、本明細書に記載される材料及び方法を用いて患者の細胞の染色体ＤＮＡが修正される。一部の実施形態において、細胞はヘパトサイトである。

【0411】

インビボ遺伝子療法の利点は、治療薬の作製及び投与の容易さである。同じ治療手法及び療法を用いて２人以上の患者、例えば同じ又は類似した遺伝子型又は対立遺伝子を共有する複数人の患者を治療することができる。対照的に、エキソビボ細胞療法は、典型的には患者自身の細胞を使用し、それが単離され、操作され、同じ患者に戻される。

【0412】

一部の実施形態において、本開示に係る治療方法を必要としている対象は、血友病Ａの症状を有する患者である。一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する疑いがあるヒトであってもよい。或いは、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断されたヒトであってもよい。一部の実施形態において、治療を必要としている対象は、内因性ＦＶＩＩＩ遺伝子又はその調節配列に１つ以上の遺伝的欠陥（例えば欠失、挿入及び／又は突然変異）を有してもよく、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現レベル又は機能を含めた活性が、正常な健常対象と比較して実質的に低下している。

【0413】

一部の実施形態において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供され、この方法は、対象の細胞に以下を提供することを含む：（ａ）細胞ゲノム中のアルブミン遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。一部の実施形態において、ｇＲＮＡはアルブミン遺伝子のイントロン１を標的とする。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。

【0414】

一部の実施形態において、本明細書には、対象の血友病Ａを治療する方法が提供され、この方法は、対象の細胞に以下を提供することを含む：（ａ）配列番号１８〜４４及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１、２２、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２１からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２２からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号２８からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号３０からのスペーサー配列を含む。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒトヘパトサイト細胞である。一部の実施形態において、対象は、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である。一部の実施形態において、対象は、血友病Ａのリスクがあると診断される。

【0415】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来（ｓｐＣａｓ９）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９はスタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）由来（ＳｌｕＣａｓ９）である。

【0416】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞である。

【0417】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を使用する。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、細胞での発現にコドン最適化される。一部の実施形態において、細胞はヒト細胞、例えばヒトヘパトサイト細胞である。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡプラスミドなどのＤＮＡである。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。

【0418】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、ドナー鋳型はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる。一部の実施形態において、ドナー鋳型は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットは、片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ドナーカセットは両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である。一部の実施形態において、ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位は、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である。一部の実施形態において、ドナー鋳型を細胞に提供することは、ドナー鋳型を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、投与は静脈内経路による。

【0419】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子はｇＲＮＡもまた含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することは、リポソーム又は脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む。一部の実施形態において、投与は静脈内経路による。一部の実施形態において、リポソーム又は脂質ナノ粒子は脂質ナノ粒子である。一部の実施形態において、本方法は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を用いる。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

【0420】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはｇＲＮＡと予め複合体化され、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。

【0421】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１７日後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）を細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を対象に（静脈内経路によるなどして）投与することを含む。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態において、（ｃ）を細胞に提供することは、ＡＡＶベクターにコードされたドナー鋳型を対象に（静脈内経路によるなどして）投与することを含む。

【0422】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される。一部の実施形態において、（ａ）及び（ｂ）を細胞に提供することは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を対象に（静脈内経路によるなどして）投与することを含む。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。

【0423】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する。

【0424】

一部の実施形態において、本明細書に記載される血友病Ａの治療方法のいずれかによれば、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列は対象の肝臓で発現する。

【0425】

対象への細胞の移植
一部の実施形態において、本開示のエキソビボ方法は、かかる方法を必要としている対象にゲノム編集された細胞を移植することを含む。この移植ステップは、当該技術分野において公知の任意の移植方法を用いて達成されてもよい。例えば、遺伝子修飾細胞は対象の血中に直接注射されてもよく、又は他の方法で対象に投与されてもよい。

【0426】

一部の実施形態において、本明細書に開示される方法は、所望の１つ又は複数の効果が生じるように所望の部位への導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路により、遺伝子修飾された治療用細胞を対象に投与すること（これは「導入すること」及び「移植すること」と同義的に用いられ得る）を含む。治療用細胞又はその分化した子孫は、移植された細胞又は細胞の成分の少なくとも一部分が生き残るような対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間ほどの短さ、例えば２４時間から、数日、数年もの長さ、又は更には患者の生涯、即ち長期生着であってもよい。

【0427】

予防的に提供されるとき、本明細書に記載される治療用細胞は、血友病Ａの任意の症状に先立って対象に投与され得る。従って、一部の実施形態において、遺伝子修飾されたヘパトサイト細胞集団の予防的投与は、血友病Ａ症状の発生を防ぐ働きをする。

【0428】

一部の実施形態において治療的に提供されるとき、遺伝子修飾されたヘパトサイト細胞は血友病Ａの症状又は徴候の発生時に（又は発生後に）、例えば疾患の発生を受けて提供される。

【0429】

一部の実施形態において、本明細書に記載される方法により投与される治療用ヘパトサイト細胞集団は、１個体以上のドナーから採取された同種異系ヘパトサイト細胞を有する。「同種異系」は、同じ種の１個体以上の異なるドナーから採取されたヘパトサイト細胞又はヘパトサイト細胞を有する生体試料を指し、ここでは１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない。例えば、対象に投与されるヘパトサイト細胞集団は、もう１個体の無関係のドナー対象に由来するか、又は１個体以上の同一でない同胞に由来することができる。一部の実施形態において、遺伝学的に同一の動物、又は一卵性双生児から採取されたものなど、同系ヘパトサイト細胞集団が使用されてもよい。他の実施形態において、ヘパトサイト細胞は自己細胞である；つまり、ヘパトサイト細胞は対象から採取又は単離され、且つ同じ対象に投与され、即ち、ドナーとレシピエントとが同じである。

【0430】

一実施形態において、有効量とは、血友病Ａの少なくとも１つ又はそれ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するために必要な治療用細胞集団の量を指し、所望の効果の提供、例えば血友病Ａを有する対象の治療に十分な量の組成物に関係する。実施形態において、従って治療有効量とは、血友病Ａを有する又はそのリスクがある対象など、典型的な対象への投与時に特定の効果を促進するのに十分な治療用細胞又は治療用細胞を有する組成物の量を指す。有効量にはまた、疾患の症状の発症を予防し又は遅延させ、疾患の症状の経過を変化させ（例えば限定はされないが、疾患の症状の進行を減速させ）、又は疾患の症状を好転させるのに十分な量も含まれ得る。いずれの場合にも、適切な有効量は当業者によってルーチンの実験を用いて決定され得ることが理解される。

【0431】

本明細書に記載される様々な実施形態における使用について、治療用細胞、例えばゲノム編集されたヘパトサイト細胞の有効量は、少なくとも１０^２細胞、少なくとも５×１０^２細胞、少なくとも１０^３細胞、少なくとも５×１０^３細胞、少なくとも１０^４細胞、少なくとも５×１０^４細胞、少なくとも１０^５細胞、少なくとも２×１０^５細胞、少なくとも３×１０^５細胞、少なくとも４×１０^５細胞、少なくとも５×１０^５細胞、少なくとも６×１０^５細胞、少なくとも７×１０^５細胞、少なくとも８×１０^５細胞、少なくとも９×１０^５細胞、少なくとも１×１０^６細胞、少なくとも２×１０^６細胞、少なくとも３×１０^６細胞、少なくとも４×１０^６細胞、少なくとも５×１０^６細胞、少なくとも６×１０^６細胞、少なくとも７×１０^６細胞、少なくとも８×１０^６細胞、少なくとも９×１０^６細胞、又はその倍数であってもよい。治療用細胞は１個体以上のドナーに由来してもよく、又は自己供給源から採取される。本明細書に記載される一部の実施形態において、治療用細胞は、それを必要としている対象への投与前に拡大培養される。

【0432】

一部の実施形態において、血友病Ａを有する患者の細胞で機能性ＦＶＩＩＩの発現レベルが少しずつ漸進的に増加することが、この疾患の１つ以上の症状の改善、長期生存の増進、及び／又は他の治療に伴う副作用の低減に有益であり得る。かかる細胞をヒト患者に投与すると、機能性ＦＶＩＩＩレベルの増加を生じさせる治療用細胞の存在が有益となる。一部の実施形態において、対象の有効な治療は、治療下の対象の全ＦＶＩＩＩに対して少なくとも約１％、３％、５％又は７％の機能性ＦＶＩＩＩを生じさせる。一部の実施形態において、機能性ＦＶＩＩＩは全ＦＶＩＩＩの少なくとも約１０％である。一部の実施形態において、機能性ＦＶＩＩＩは全ＦＶＩＩＩの少なくとも、約又は多くても２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％である。同様に、機能性ＦＶＩＩＩレベルが大幅に上昇した細胞の部分集団が比較的限られていても、場合によっては正常化した細胞が罹患細胞と比べて選択的優位性を有することになるため、その導入は様々な患者で有益であり得る。しかしながら、機能性ＦＶＩＩＩレベルが上昇した治療用細胞は、僅かなレベルであっても、患者における血友病Ａの１つ以上の側面の改善に有益となり得る。一部の実施形態では、かかる細胞が投与される患者において治療薬の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又はそれ以上が、機能性ＦＶＩＩＩレベルの増加を生じさせるものである。

【0433】

実施形態において、ある方法又は経路によって治療用細胞組成物を対象に送達すると、細胞組成物が所望の部位に少なくとも部分的に局在化する。細胞組成物は、対象に有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、即ち投与によって対象の所望の位置への送達が生じ、ここでは送達される組成物の少なくとも一部分、即ち少なくとも１×１０^４細胞が、ある期間にわたって所望の部位に送達される。投与方法としては、注射、注入、点滴注入、又は経口摂取が挙げられる。「注射」としては、限定なしに、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳室内 脊髄、及び胸骨内注射及び注入が挙げられる。一部の実施形態において、経路は静脈内である。細胞の送達には、注射又は注入による投与が行われ得る。

【0434】

一実施形態において、細胞は全身投与され、換言すれば、治療用細胞集団は、標的部位、組織、又は器官への直接投与以外で、それよりむしろそれが対象の循環系に入り、従って代謝及び他の同様の過程に曝されるように投与される。

【0435】

血友病Ａの治療用組成物を有する治療の有効性は、当業者である臨床医が判断することができる。しかしながら、一例に過ぎないが、機能性ＦＶＩＩＩレベルの徴候又は症状のうちのいずれか１つ又は全てが有益な形で変化する（例えば、少なくとも１０％増加する）場合、又は疾患の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが向上し又は改善される場合、治療は有効な治療と見なされる。有効性はまた、入院期間又は医学的介入の必要性によって評価したときに個体が悪化しないこと（例えば、疾患の進行が止まるか、又は少なくとも減速する）によっても測定することができる。これらの指標の測定方法は当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載される。治療には、個体又は動物（一部の非限定的な例としては、ヒト、又は哺乳類が挙げられる）における疾患の任意の治療が含まれ、（１）疾患を抑制すること、例えば、症状の進行を抑止する、又は減速させること；又は（２）疾患を軽減すること、例えば、症状の退行を生じさせること；及び（３）症状の発症可能性を予防又は低減することが含まれる。

【0436】

組成物
一態様において、本開示は、本明細書に開示される方法を実行するための組成物を提供する。組成物は、以下：ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）；部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；及び本明細書に開示される方法の所望の遺伝子修飾を生じさせるため挿入されることになるポリヌクレオチド（例えばドナー鋳型）のうちの１つ以上を含み得る。

【0437】

一部の実施形態において、組成物は、ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列を有する。

【0438】

一部の実施形態において、組成物は、部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）を有する。一部の実施形態において、組成物は、部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。

【0439】

一部の実施形態において、組成物は、ゲノムに挿入されることになるポリヌクレオチド（例えばドナー鋳型）を有する。

【0440】

一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを有する。

【0441】

一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ゲノムに挿入されることになるポリヌクレオチド（例えばドナー鋳型）とを有する。

【0442】

一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ゲノムに挿入されることになるポリヌクレオチド（例えばドナー鋳型）とを有する。

【0443】

一部の実施形態において、組成物は、（ｉ）ゲノムターゲティング核酸（例えばｇＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）部位特異的ポリペプチド（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ）又は部位特異的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉｉ）ゲノムに挿入されることになるポリヌクレオチド（例えばドナー鋳型）とを有する。

【0444】

上記の組成物のいずれかの一部の実施形態において、組成物は単一分子ガイドゲノムターゲティング核酸を有する。上記の組成物のいずれかの一部の実施形態において、組成物は二分子ゲノムターゲティング核酸を有する。上記の組成物のいずれかの一部の実施形態において、組成物は２つ以上の二分子ガイド又は単一分子ガイドを有する。一部の実施形態において、組成物は、核酸ターゲティング核酸をコードするベクターを有する。一部の実施形態において、ゲノムターゲティング核酸はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、詳細にはＣａｓ９である。

【0445】

一部の実施形態において、組成物は、ゲノム編集、詳細には細胞のゲノムへのＦＶＩＩＩ遺伝子又はその誘導体の挿入に使用することのできる１つ以上のｇＲＮＡを含む組成物を含有し得る。この組成物のｇＲＮＡは、内因性アルブミン遺伝子にあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にあるゲノム部位を標的とすることができる。従って、一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、アルブミン遺伝子にあるか、その範囲内にあるか、又はその近傍にあるゲノム配列と相補的なスペーサー配列を有し得る。

【0446】

一部の実施形態において、組成物のｇＲＮＡは、表３に掲載されるもの及び表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の同一性又は相同性を有するその変異体から選択される配列である。一部の実施形態において、本キットのｇＲＮＡの変異体は、表３に掲載されるもののいずれかと少なくとも約８５％の相同性を有する。

【0447】

一部の実施形態において、組成物のｇＲＮＡは、ゲノム中の標的部位と相補的なスペーサー配列を有する。一部の実施形態において、スペーサー配列は１５塩基〜２０塩基長である。一部の実施形態において、スペーサー配列とゲノム配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも１００％である。

【0448】

一部の実施形態において、組成物は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び／又はＦＶＩＩＩ遺伝子又はその機能性誘導体の核酸配列を有するドナー鋳型を有することができる。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼはＣａｓ９である。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0449】

一部の実施形態において、本キットの任意のオリゴヌクレオチド又は核酸配列のうちの１つ以上が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされてもよい。従って、一部の実施形態において、ｇＲＮＡがＡＡＶベクターにコードされてもよい。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がＡＡＶベクターにコードされてもよい。一部の実施形態において、ドナー鋳型がＡＡＶベクターにコードされてもよい。一部の実施形態において、２つ以上のオリゴヌクレオチド又は核酸配列が単一のＡＡＶベクターにコードされてもよい。従って、一部の実施形態において、ｇＲＮＡ配列及びＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、単一のＡＡＶベクターにコードされてもよい。

【0450】

一部の実施形態において、組成物はリポソーム又は脂質ナノ粒子を有してもよい。従って、一部の実施形態において、組成物の任意の化合物（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型）がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。一部の実施形態では、１つ以上のかかる化合物が共有結合又は非共有結合によってリポソーム又は脂質ナノ粒子に会合される。一部の実施形態では、化合物の任意のものが個別に又は一緒にリポソーム又は脂質ナノ粒子に含められてもよい。従って、一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型の各々がリポソーム又は脂質ナノ粒子に個別に製剤化される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼがｇＲＮＡと共にリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される。一部の実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型がリポソーム又は脂質ナノ粒子に一緒に製剤化される。

【0451】

一部の実施形態において、上記に記載される組成物は１つ以上の追加的な試薬を更に有し、ここで追加的な試薬は、緩衝液、細胞へのポリペプチド又はポリヌクレオチドの導入用緩衝液、洗浄緩衝液、対照試薬、対照ベクター、対照ＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからのポリペプチドのインビトロ作製用試薬、シーケンシング用のアダプターなどから選択される。緩衝液は、安定化緩衝液、再構成緩衝液、希釈緩衝液などであり得る。一部の実施形態において、組成物はまた、オンターゲット結合若しくはエンドヌクレアーゼによるＤＮＡ切断の促進若しくは増強、又はターゲティングの特異性の向上に用いることのできる１つ以上の成分も含み得る。

【0452】

一部の実施形態において、組成物の任意の成分は、詳細な投与方法及び剤形に応じて、担体、溶媒、安定剤、補助剤、希釈剤など、薬学的に許容可能な賦形剤と共に製剤化される。実施形態において、ガイドＲＮＡ組成物は、概して、生理的に適合性のあるｐＨを実現するように製剤化され、製剤及び投与経路に応じてｐＨ約３〜ｐＨ約１１、約ｐＨ３〜約ｐＨ７の範囲である。一部の実施形態において、ｐＨは、約ｐＨ５．０〜約ｐＨ８の範囲となるように調整される。一部の実施形態において、本組成物は、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの化合物の治療有効量を１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤と共に有する。任意選択で、本組成物は、本明細書に記載される化合物の組み合わせを有してもよく、又は細菌増殖の処置又は予防に有用な第２の活性成分を含んでもよく（例として、及び限定なしに、抗細菌剤又は抗微生物剤）、又は本開示の試薬の組み合わせを含んでもよい。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、他の１つ以上のオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ及び／又はドナー鋳型をコードする核酸と共に製剤化される。或いは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ及びドナー鋳型をコードする核酸は、個別に、又は他のオリゴヌクレオチドとの組み合わせで、上記にｇＲＮＡ製剤に関して記載される方法で製剤化される。

【0453】

好適な賦形剤には、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体、及び不活性ウイルス粒子など、大型の緩徐に代謝される巨大分子を含む担体分子が含まれ得る。他の例示的賦形剤としては、抗酸化剤（例として、及び限定なしに、アスコルビン酸）、キレート剤（例として、及び限定なしに、ＥＤＴＡ）、炭水化物（例として、及び限定なしに、デキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルメチルセルロース）、ステアリン酸、液体（例として、及び限定なしに、油、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール）、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが挙げられる。

【0454】

一部の実施形態において、組成物の任意の化合物（例えばＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸、ｇＲＮＡ及びドナー鋳型）は、電気穿孔などのトランスフェクションによって送達されてもよい。一部の例示的実施形態では、細胞への提供前にＤＮＡエンドヌクレアーゼをｇＲＮＡと予め複合体化してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成してもよく、このＲＮＰ複合体が電気穿孔されてもよい。かかる実施形態において、ドナー鋳型は電気穿孔によって送達されてもよい。

【0455】

一部の実施形態において、組成物とは、エキソビボ治療方法に使用される治療用細胞を有する治療組成物を指す。

【0456】

実施形態において、治療組成物は、細胞組成物と共に生理学的に許容可能な担体、及び任意選択で、その中に活性成分として溶解又は分散させた、本明細書に記載されるとおりの少なくとも１つの追加的な生物活性剤を含有する。一部の実施形態において、治療組成物は、そのように所望されない限り、哺乳類又はヒト患者に治療目的で投与されたときに実質的に免疫原性でない。

【0457】

一般に、本明細書に記載される遺伝子修飾された治療細胞は、薬学的に許容可能な担体と共に懸濁液として投与される。当業者は、細胞組成物に使用されるべき薬学的に許容可能な担体が、対象に送達しようとする細胞の生存能を実質的に妨げる量の緩衝剤、化合物、凍結保存剤、保存剤、又は他の薬剤を含まないであろうことを認識するであろう。細胞を有する製剤は、例えば、細胞膜完全性の維持を可能にする浸透圧緩衝液、及び任意選択で、細胞生存能を維持し又は投与時の生着を増強するための栄養素を含み得る。かかる製剤及び懸濁液は当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載されるとおりの前駆細胞との使用向けにルーチンの実験を用いて適合させることができる。

【0458】

一部の実施形態において細胞組成物はまた、乳化させるか、又はリポソーム組成物として提供することもでき、但し乳化手順が細胞生存能に悪影響を与えないものとする。細胞及び任意の他の活性成分は、薬学的に許容可能で活性成分と適合性のある、且つ本明細書に記載される治療的方法における使用に好適な量の賦形剤と共に混合することができる。

【0459】

細胞組成物に含まれる追加的な薬剤には、その中の成分の薬学的に許容可能な塩が含まれ得る。薬学的に許容可能な塩としては、例えば塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸などと形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有機塩基などから誘導することができる。

【0460】

生理学的に許容可能な担体は当該技術分野において周知である。例示的液体担体は、活性成分及び水の他にいかなる材料も含有しないか、又は生理的ｐＨ値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水又はリン酸緩衝生理食塩水などの両方を含有する滅菌水溶液である。なおも更に、水性担体は、２つ以上の緩衝塩、並びに塩化ナトリウム及びカリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及び他の溶質などを含有することができる。液体組成物はまた、水に加えて、及び水の他に、液相も含有することができる。かかる追加的な液相の例はグリセリン、綿実油などの植物油、及び水−油エマルションである。特定の障害又は病態の治療において有効な細胞組成物中に使用される活性化合物の量は、障害又は病態の性質に依存することになり、標準的な臨床技法により決定することができる。

【0461】

キット
一部の実施形態は、上述の組成物のいずれか、例えばゲノム編集用組成物又は治療用細胞組成物と１つ以上の追加成分とを含有するキットを提供する。

【0462】

一部の実施形態において、キットは、所望の目的のための、例えばゲノム編集又は細胞療法用の組成物と同時投与又は順次投与することのできる１つ以上の追加的な治療剤を有してもよい。

【0463】

一部の実施形態において、キットは、本方法を実施するためのキットの成分の使用説明書を更に含んでもよい。方法の実施説明書は、概して好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷されてもよい。説明書は、キットにおいて添付文書として存在する、キットの、若しくはその成分の容器のラベル表示に存在する（即ち、包装又は部分的包装に関連付けられる）等であってもよい。説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等に存在する電子記憶データファイルとして存在することができる。一部の例では、実際の説明書はキットに存在するのではなく、説明書を遠隔配布源から（例えばインターネット経由で）入手する手段を提供することができる。この実施形態の一例は、そこで説明書を閲覧することのできる、及び／又はそこから説明書をダウンロードすることのできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、このような説明書を入手する手段も好適な基材に記録することができる。

【0464】

他の可能な治療手法
遺伝子編集は、特異的配列を標的とするように操作されたヌクレアーゼを使用して行うことができる。現在までのところ、４つの主要なタイプのヌクレアーゼ：メガヌクレアーゼ及びその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼシステムがある。これらのヌクレアーゼプラットフォームは、特にＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの特異性がタンパク質−ＤＮＡ相互作用を通じたものである一方、ＲＮＡ−ＤＮＡ相互作用が主としてＣａｓ９をガイドするとおり、設計の難しさ、ターゲティング密度及び作用様式が異なる。Ｃａｓ９切断はまた、隣接モチーフ、ＰＡＭも必要とし、ＰＡＭはＣＲＩＳＰＲシステム毎に異なる。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９はＮＲＧ ＰＡＭを用いて切断し、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣＲＩＳＰＲは、ＮＮＮＮＧＡＴＴ（配列番号１０１）、ＮＮＮＮＮＧＴＴＴ（配列番号１０２）及びＮＮＮＮＧＣＴＴ（配列番号１０３）を含むＰＡＭを有する部位で切断することができる。幾つもの他のＣａｓ９オルソログが、別のＰＡＭに隣接するプロトスペーサーを標的とする。

【0465】

本開示の方法の様々な実施形態においては、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを使用することができる。しかしながら、治療標的部位など、本明細書に記載される教示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＨＥ、又はＭｅｇａＴＡＬなど、他の形態のエンドヌクレアーゼに対して、又はヌクレアーゼの組み合わせを用いて適用することが可能である。しかしながら、本開示の教示をかかるエンドヌクレアーゼに適用するためには、とりわけ、特異的標的部位に向けられるタンパク質を操作することが必要となり得る。

【0466】

追加的な結合ドメインをＣａｓ９タンパク質に融合して特異性を高めてもよい。こうしたコンストラクトの標的部位は、同定されたｇＲＮＡによって指定される部位に位置付け得るが、ジンクフィンガードメインの場合のように、追加的な結合モチーフが必要であり得る。Ｍｅｇａ−ＴＡＬの場合、メガヌクレアーゼをＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインに融合することができる。メガヌクレアーゼドメインは特異性を増加させ、切断をもたらすことができる。同様に、不活性化又はデッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）を切断ドメインに融合することができ、融合したＤＮＡ結合ドメインにｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９標的部位及び隣接する結合部位が必要であり得る。これには恐らくは、触媒不活性化に加えて、追加的な結合部位のない結合を減少させるためのｄＣａｓ９の何らかのプロテインエンジニアリングが必要になり得る。

【0467】

一部の実施形態において、本開示に係るゲノムを編集する（例えばＦＶＩＩＩコード配列をアルブミン遺伝子座に挿入する）組成物及び方法は、以下の手法のいずれかを利用することができ、又はそれを用いて行うことができる。

【0468】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインがＩＩ型エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインに連結したものを有するモジュラータンパク質である。ＦｏｋＩは二量体としてのみ機能するため、一対のＺＦＮが対向するＤＮＡ鎖上のコグネイト標的「ハーフ部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）」配列に、それらの間に正確な間隔を置いて結合して触媒活性ＦｏｋＩ二量体の形成を可能にするように操作されなければならない。それ自体は本質的に配列特異性を有しないＦｏｋＩドメインが二量化すると、ゲノム編集における開始ステップとしてＺＦＮハーフ部位間にＤＮＡ二本鎖切断が生成される。

【0469】

各ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には豊富なＣｙｓ２−Ｈｉｓ２構成の３〜６個のジンクフィンガーを有する、各フィンガーが標的ＤＮＡ配列の一方の鎖上にあるヌクレオチドのトリプレットを主に認識するが、４番目のヌクレオチドとの交差鎖相互作用もまた重要であり得る。ＤＮＡとの主要な接触をなす位置にあるフィンガーのアミノ酸が変わると、所与のフィンガーの配列特異性が変わる。従って、４フィンガージンクフィンガータンパク質は１２ｂｐ標的配列を選択的に認識することになり、ここで標的配列は、各フィンガーが寄与するトリプレット優先性の混合体であるが、トリプレット優先性は隣接フィンガーによって様々な程度に影響を受け得る。ＺＦＮの重要な側面は、単に個々のフィンガーを修飾することによってＺＦＮをほぼいかなるゲノムアドレスにも容易に再標的化できる点であり、しかしながらこれを上手く行うには相当の熟練が要求される。ＺＦＮのほとんどの適用で４〜６個のフィンガーのタンパク質が使用され、これはそれぞれ１２〜１８ｂｐを認識する。従って、一対のＺＦＮが、ハーフ部位間の５〜７ｂｐスペーサーを含まずに、典型的には２４〜３６ｂｐの組み合わされた標的配列を認識することになる。結合部位は、１５〜１７ｂｐを含め、より大きいスペーサーで更に分離することができる。設計過程で反復配列又は遺伝子ホモログが除外されると仮定すれば、この長さの標的配列はヒトゲノムにおいてユニークである可能性が高い。それにも関わらず、ＺＦＮタンパク質−ＤＮＡ相互作用はその特異性に関して絶対ではないため、実にオフターゲット結合及び切断イベントが、２つのＺＦＮ間のヘテロ二量体、又はＺＦＮのいずれか一方のホモ二量体のいずれかとして起こる。後者の可能性は、ＦｏｋＩドメインの二量化界面を操作して、互いとのみ二量化することのできる、自己二量化はしない、絶対ヘテロ二量体変異体としても知られる「プラス」及び「マイナス」変異体を作成することにより有効に取り除かれている。絶対ヘテロ二量体を強制することにより、ホモ二量体の形成が妨げられる。これにより、ＺＦＮ並びにこうしたＦｏｋＩ変異体を採用する任意の他のヌクレアーゼの特異性は大いに高まった。

【0470】

種々のＺＦＮベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾は常時報告され、数多くの参考文献が、ＺＦＮの設計の指針とするため用いられる規則及びパラメータについて記載している；例えば、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６（６）：２７５８−６３（１９９９）；Ｄｒｅｉｅｒ Ｂ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．３０３（４）：４８９−５０２（２０００）；Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７７（６）：３８５０−６（２００２）；Ｄｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０（４２）：３５５８８−９７（２００５）；及びＤｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７６（３１）：２９４６６−７８（２００１）を参照のこと。

【0471】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）
ＴＡＬＥＮは、モジュラーヌクレアーゼのもう一つのフォーマットに相当し、これによれば、ＺＦＮと同様に、操作されたＤＮＡ結合ドメインがＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに連結され、且つ一対のＴＡＬＥＮがタンデムで働いて標的化したＤＮＡ切断を実現する。ＺＦＮとの主な違いは、ＤＮＡ結合ドメインの性質及び関連する標的ＤＮＡ配列認識特性である。ＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインは、当初植物細菌病原体キサントモナス属種（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＴＡＬＥにおいて記載されたものであるＴＡＬＥタンパク質に由来し、３３〜３５アミノ酸リピートのタンデムアレイを有し、各リピートが、典型的に最大２０ｂｐ長であって、最大４０ｂｐの合計標的配列長さとなる標的ＤＮＡ配列中の単一の塩基対を認識する。各リピートのヌクレオチド特異性は、１２位及び１３位に２アミノ酸だけを含む反復可変二残基（ＲＶＤ）によって決まる。塩基グアニン、アデニン、シトシン及びチミンは、主に４つのＲＶＤ：それぞれＡｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｉｌｅ、Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｓｎ−Ｇｌｙによって認識される。これはジンクフィンガーと比べてはるかに単純な認識コードを成し、従ってヌクレアーゼ設計上、後者に優る利点を呈する。それにも関わらず、ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮのタンパク質−ＤＮＡ相互作用はその特異性の点で絶対でなく、ＴＡＬＥＮもまた、オフターゲット活性を低下させるため、ＦｏｋＩドメインの絶対ヘテロ二量体変異体の使用から利益が得られている。

【0472】

その触媒機能が不活性化されるＦｏｋＩドメインの更なる変異体が作成されている。ＴＡＬＥＮ対又はＺＦＮ対のいずれかの片方が不活性ＦｏｋＩドメインを含む場合、標的部位においてはＤＳＢでなく、むしろ一本鎖ＤＮＡ切断（ニッキング）のみが起こることになる。この結果は、Ｃａｓ９切断ドメインの一方が不活性化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１「ニッカーゼ」突然変異体を使用するのと同等である。ＤＮＡニックを用いてＨＤＲによるゲノム編集をドライブすることができ、しかしＤＳＢと比べて効率が低い。主な利益は、ＮＨＥＪ媒介性の修復誤りを受け易いＤＳＢと異なり、オフターゲットニックが迅速且つ正確に修復される点である。

【0473】

種々のＴＡＬＥＮベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾が常時報告されている；例えば、Ｂｏｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０９−１２（２００９）；Ｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３５（６０６９）：７１６−９（２０１２）；及びＭｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６（５９５９）：１５０１（２００９）を参照のこと。「ゴールデンゲート」プラットフォームをベースとするＴＡＬＥＮの使用、又はクローニングスキームが複数のグループによって記載されている；例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１２）：ｅ８２（２０１１）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９（１４）：６３１５−２５（２０１１）；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（２）：ｅ１６７６５（２０１１）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４１（６）：３３９−４７，Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｃａｎ １７（２０１４）；及びＣｅｒｍａｋ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３９：１３３−５９（２０１５）を参照のこと。

【0474】

ホーミングエンドヌクレアーゼ
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）は、長い認識配列（１４〜４４塩基対）を有し、且つＤＮＡを高い特異性で−多くの場合にゲノム中のユニークな部位で−切断する配列特異的エンドヌクレアーゼである。ＨＥには、その構造によって分類されるとおりの、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号６）、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈｉｓ−Ｃｉｓボックス、Ｈ−Ｎ−Ｈ、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫ、及びＶｓｒ様を含む少なくとも６つの公知のファミリーがあり、これらは、真核生物、原生生物、細菌、古細菌、シアノバクテリア及びファージを含めた広範囲の宿主に由来する。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、ＨＥは、ゲノム編集の初めのステップとして標的遺伝子座にＤＳＢを作成するために用いることができる。加えて、一部の天然の及び操作されたＨＥはＤＮＡの単一の鎖のみを切断し、それにより部位特異的ニッカーゼとして機能する。ＨＥの大きい標的配列及びそれがもたらす特異性により、ＨＥは部位特異的ＤＳＢを作成するのに魅力的な候補となっている。

【0475】

種々のＨＥベースのシステムが当該技術分野において記載されており、その修飾が常時報告されている；例えば、Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２４（８）：６６３−８０（２０１４）；Ｂｅｌｆｏｒｔ ａｎｄ Ｂｏｎｏｃｏｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１１２３：１−２６（２０１４）；Ｈａｆｅｚ ａｎｄ Ｈａｕｓｎｅｒ，Ｇｅｎｏｍｅ ５５（８）：５５３−６９（２０１２）によるレビュー；及びそこに引用される文献を参照のこと。

【0476】

ＭｅｇａＴＡＬ／Ｔｅｖ−ｍＴＡＬＥＮ／ＭｅｇａＴｅｖ
ハイブリッドヌクレアーゼの更なる例として、ＭｅｇａＴＡＬプラットフォーム及びＴｅｖ−ｍＴＡＬＥＮプラットフォームは、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと触媒活性ＨＥとの融合体を用いるものであり、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＨＥの切断配列特異性の両方を利用する；例えば、Ｂｏｉｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２：２５９１−２６０１（２０１４）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇ３ ４：１１５５−６５（２０１４）；及びＢｏｉｓｓｅｌ ａｎｄ Ｓｃｈａｒｅｎｂｅｒｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２３９：１７１−９６（２０１５）を参照のこと。

【0477】

更なる変形例では、ＭｅｇａＴｅｖ構成は、メガヌクレアーゼ（Ｍｅｇａ）とＧＩＹ−ＹＩＧホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＴｅｖＩに由来するヌクレアーゼドメイン（Ｔｅｖ）との融合体である。２つの活性部位はＤＮＡ基質上で約３０ｂｐ離れて位置し、適合性のない付着末端を有する２つのＤＳＢを生成する；例えば、Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ４２，８８１６−２９（２０１４）を参照のこと。既存のヌクレアーゼベース手法の他の組み合わせが進化し、本明細書に記載される標的化したゲノム修飾の実現において有用となるであろうことが予想される。

【0478】

ｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ又はｄＣｐｆ１−Ｆｏｋ１及び他のヌクレアーゼ
上記に記載されるヌクレアーゼプラットフォームの構造的特性と機能的特性とを組み合わせると、固有の欠陥の一部を潜在的に解消し得る更なるゲノム編集手法がもたらされる。例として、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集システムは、典型的には単一のＣａｓ９エンドヌクレアーゼを使用してＤＳＢを作成する。ターゲティングの特異性は、標的ＤＮＡとワトソン・クリック型塩基対合を起こすガイドＲＮＡ中の２０又は２２ヌクレオチド配列（加えて、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合には隣接するＮＡＧ又はＮＧＧ ＰＡＭ配列中の追加的な２塩基）によって左右される。かかる配列は、ヒトゲノム中でユニークであるのに十分に長く、しかしながら、ＲＮＡ／ＤＮＡ相互作用の特異性は絶対でなく、時に著しい無差別さが、特に標的配列の５’側の半分において許容され、特異性を左右する塩基の数が事実上減少する。これに対する一つの解決法は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１触媒機能を完全に不活性化し−ＲＮＡガイド型ＤＮＡ結合機能のみを保持して−、代わりにＦｏｋＩドメインを不活性化Ｃａｓ９に融合することとされている；例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ３２：５６９−７６（２０１４）；及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５７７−８２（２０１４）を参照のこと。ＦｏｋＩは触媒活性になるためには二量化しなければならないため、２つのＦｏｋＩ融合体が二量体を形成してＤＮＡを切断するようにそれらを近接して係留するには、２つのガイドＲＮＡが必要である。本質的にこれによって組み合わされる標的部位の塩基の数が二倍になり、従ってＣＲＩＳＰＲベースのシステムによるターゲティングのストリンジェンシーは増加する。

【0479】

更なる例として、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインと、Ｉ−ＴｅｖＩなど、触媒活性ＨＥとの融合体は、オフターゲット切断が更に低減され得ることを見込んで、ＴＡＬＥの調節可能なＤＮＡ結合及び特異性、並びにＩ−ＴｅｖＩの切断配列特異性の両方を利用するものである。

【0480】

以下の付属の記載に本開示の１つ以上の実施形態の詳細が示される。本開示の実施又は試験においては、本明細書に記載されるものと同様の又は等価な任意の材料及び方法を用いてもよいが、ここでは好ましい材料及び方法を記載する。本開示の他の特徴、目的及び利点は、この記載から明らかになるであろう。この記載中、文脈上特に明確に指示されない限り単数形には複数形も含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、本記載が優先するものとする。

【0481】

本明細書に記載される例及び実施形態は例示目的に過ぎないこと、及びそれらを踏まえた様々な修正又は変更が当業者に提案されてもよく、それらは本願の趣旨及び範囲内並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。

【0482】

本明細書によって提供される開示の一部の実施形態は、以下の非限定的な例によって更に例示される。

【0483】

例示的実施形態
実施形態１．システムであって、
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）エンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；
配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；及び
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を含むシステム。

【0484】

実施形態２．ｇＲＮＡが配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、実施形態１のシステム。

【0485】

実施形態３．ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、実施形態２のシステム。

【0486】

実施形態４．ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、実施形態２のシステム。

【0487】

実施形態５．ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、実施形態２のシステム。

【0488】

実施形態６．ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、実施形態２のシステム。

【0489】

実施形態７．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ、又はその機能性誘導体からなる群から選択される、実施形態１〜６のいずれか１つのシステム。

【0490】

実施形態８．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態１〜７のいずれか１つのシステム。

【0491】

実施形態９．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、宿主細胞での発現にコドン最適化される、実施形態１〜８のいずれか１つのシステム。

【0492】

実施形態１０．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列が、宿主細胞での発現にコドン最適化される、実施形態１〜９のいずれか１つのシステム。

【0493】

実施形態１１．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態１〜１０のいずれか１つのシステム。

【0494】

実施形態１２．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態１〜１０のいずれか１つのシステム。

【0495】

実施形態１３．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態１２のシステム。

【0496】

実施形態１４．ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、実施形態１〜１３のいずれか１つのシステム。

【0497】

実施形態１５．ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態１４のシステム。

【0498】

実施形態１６．ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態１５のシステム。

【0499】

実施形態１７．ｇＲＮＡ標的部位がシステム中のｇＲＮＡにとっての標的部位である、実施形態１５又は１６のシステム。

【0500】

実施形態１８．ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、システム中のｇＲＮＡにとってのゲノムｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態１７のシステム。

【0501】

実施形態１９．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、実施形態１〜１８のいずれか１つのシステム。

【0502】

実施形態２０．前記リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡもまた含む、実施形態１９のシステム。

【0503】

実施形態２１．ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つのシステム。

【0504】

実施形態２２．細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞に以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を提供することを含む方法。

【0505】

実施形態２３．ｇＲＮＡが配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、実施形態２２の方法。

【0506】

実施形態２４．ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、実施形態２３の方法。

【0507】

実施形態２５．ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、実施形態２３の方法。

【0508】

実施形態２６．ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、実施形態２３の方法。

【0509】

実施形態２７．ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、実施形態２３の方法。

【0510】

実施形態２８．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される、実施形態２２〜２７のいずれか１つの方法。

【0511】

実施形態２９．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態２２〜２８のいずれか１つの方法。

【0512】

実施形態３０．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、細胞での発現にコドン最適化される、実施形態２２〜２９のいずれか１つの方法。

【0513】

実施形態３１．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列が、細胞での発現にコドン最適化される、実施形態２２〜３０のいずれか１つの方法。

【0514】

実施形態３２．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態２２〜３１のいずれか１つの方法。

【0515】

実施形態３３．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態２２〜３１のいずれか１つの方法。

【0516】

実施形態３４．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態３３の方法。

【0517】

実施形態３５．ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、実施形態２２〜３４のいずれか１つの方法。

【0518】

実施形態３６．ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態２２〜３５のいずれか１つの方法。

【0519】

実施形態３７．ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態３６の方法。

【0520】

実施形態３８．ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である、実施形態３６又は３７の方法。

【0521】

実施形態３９．ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノム内のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態３８の方法。

【0522】

実施形態４０．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、実施形態２２〜３９のいずれか１つの方法。

【0523】

実施形態４１．前記リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡもまた含む、実施形態４０の方法。

【0524】

実施形態４２．ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞に提供することを含む、実施形態２２〜４１のいずれか１つの方法。

【0525】

実施形態４３．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される、実施形態２２〜４２のいずれか１つの方法。

【0526】

実施形態４４．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される、実施形態２２〜４３のいずれか１つの方法。

【0527】

実施形態４５．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される、実施形態４３又は４４の方法。

【0528】

実施形態４６．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される、実施形態４５の方法。

【0529】

実施形態４７．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列が、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、実施形態２２〜４６のいずれか１つの方法。

【0530】

実施形態４８．前記細胞がヘパトサイトである、実施形態２２〜４７のいずれか１つの方法。

【0531】

実施形態４９．実施形態２２〜４８のいずれか１つの方法によって細胞のゲノムが編集されている遺伝子修飾細胞。

【0532】

実施形態５０．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列が、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、実施形態４９の遺伝子修飾細胞。

【0533】

実施形態５１．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列が、細胞での発現にコドン最適化される、実施形態４９又は５０の遺伝子修飾細胞。

【0534】

実施形態５２．前記細胞がヘパトサイトである、実施形態４９〜５１のいずれか１つの遺伝子修飾細胞。

【0535】

実施形態５３．対象の血友病Ａを治療する方法であって、対象の細胞に以下：
（ａ）配列番号２２、２１、２８、３０、１８〜２０、２３〜２７、２９、３１〜４４、及び１０４のいずれか１つからのスペーサー配列を含むｇＲＮＡ；
（ｂ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又は前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸；及び
（ｃ）第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナー鋳型
を提供することを含む方法。

【0536】

実施形態５４．ｇＲＮＡが、配列番号２２、２１、２８、及び３０のいずれか１つからのスペーサー配列を含む、実施形態５３の方法。

【0537】

実施形態５５．ｇＲＮＡが配列番号２２からのスペーサー配列を含む、実施形態５４の方法。

【0538】

実施形態５６．ｇＲＮＡが配列番号２１からのスペーサー配列を含む、実施形態５４の方法。

【0539】

実施形態５７．ｇＲＮＡが配列番号２８からのスペーサー配列を含む、実施形態５４の方法。

【0540】

実施形態５８．ｇＲＮＡが配列番号３０からのスペーサー配列を含む、実施形態５４の方法。

【0541】

実施形態５９．前記対象が、血友病Ａを有する又はそれを有する疑いがある患者である、実施形態５３〜５８のいずれか１つの方法。

【0542】

実施形態６０．前記対象が、血友病Ａのリスクがあると診断される、実施形態５３〜５８のいずれか１つの方法。

【0543】

実施形態６１．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（別名Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１００、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ；又はその機能性誘導体からなる群から選択される、実施形態５３〜６０のいずれか１つの方法。

【0544】

実施形態６２．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼがＣａｓ９である、実施形態５３〜６１のいずれか１つの方法。

【0545】

実施形態６３．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、細胞での発現にコドン最適化される、実施形態５３〜６２のいずれか１つの方法。

【0546】

実施形態６４．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又はその機能性誘導体をコードする核酸配列が、細胞での発現にコドン最適化される、実施形態５３〜６３のいずれか１つの方法。

【0547】

実施形態６５．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、実施形態５３〜６４のいずれか１つの方法。

【0548】

実施形態６６．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である、実施形態５３〜６４のいずれか１つの方法。

【0549】

実施形態６７．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態６６の方法。

【0550】

実施形態６８．（ａ）のｇＲＮＡ、（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸、及び（ｃ）のドナー鋳型のうちの１つ以上がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、実施形態５３〜６７のいずれか１つの方法。

【0551】

実施形態６９．ドナー鋳型がアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにコードされる、実施形態５３〜６８のいずれか１つの方法。

【0552】

実施形態７０．ドナー鋳型が、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列を含むドナーカセットを含み、このドナーカセットの片側又は両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態５３〜６９のいずれか１つの方法。

【0553】

実施形態７１．ドナーカセットの両側にｇＲＮＡ標的部位が隣接する、実施形態７０の方法。

【0554】

実施形態７２．ｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）のｇＲＮＡにとっての標的部位である、実施形態７０又は７１の方法。

【0555】

実施形態７３．ドナー鋳型のｇＲＮＡ標的部位が、（ａ）のｇＲＮＡにとっての細胞ゲノム内のｇＲＮＡ標的部位の逆相補体である、実施形態７２の方法。

【0556】

実施形態７４．ドナー鋳型を細胞に提供することが、ドナー鋳型を対象に投与することを含む、実施形態５３〜７３のいずれか１つの方法。

【0557】

実施形態７５．投与が静脈内経路による、実施形態７４の方法。

【0558】

実施形態７６．前記ＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸がリポソーム又は脂質ナノ粒子に製剤化される、実施形態５３〜７５のいずれか１つの方法。

【0559】

実施形態７７．前記リポソーム又は脂質ナノ粒子がｇＲＮＡもまた含む、実施形態７６の方法。

【0560】

実施形態７８．ｇＲＮＡ及びＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することが、リポソーム又は脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、実施形態７７の方法。

【0561】

実施形態７９．投与が静脈内経路による、実施形態７８の方法。

【0562】

実施形態８０．ｇＲＮＡと予め複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するＤＮＡエンドヌクレアーゼを細胞に提供することを含む、実施形態５３〜７９のいずれか１つの方法。

【0563】

実施形態８１．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された５日以上後に細胞に提供される、実施形態５３〜８０のいずれか１つの方法。

【0564】

実施形態８２．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸が、（ｃ）のドナー鋳型が細胞に提供された少なくとも１４日後に細胞に提供される、実施形態５３〜８１のいずれか１つの方法。

【0565】

実施形態８３．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に細胞に提供される、実施形態８１又は８２の方法。

【0566】

実施形態８４．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の１つ以上の追加用量が、（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸の初回用量の後に、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の標的組込みレベル及び／又は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列の目標の発現レベルが実現するまで細胞に提供される、実施形態８３の方法。

【0567】

実施形態８５．（ａ）のｇＲＮＡ及び（ｂ）のＤＮＡエンドヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸を細胞に提供することが、ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする核酸とｇＲＮＡとを含む脂質ナノ粒子を対象に投与することを含む、実施形態８１〜８４のいずれか１つの方法。

【0568】

実施形態８６．（ｃ）のドナー鋳型を細胞に提供することが、ＡＡＶベクターにコードされたドナー鋳型を対象に投与することを含む、実施形態８１〜８５のいずれか１つの方法。

【0569】

実施形態８７．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列が、内因性アルブミンプロモーターの制御下で発現する、実施形態５３〜８６のいずれか１つの方法。

【0570】

実施形態８８．前記細胞がヘパトサイトである、実施形態５３〜８７のいずれか１つの方法。

【0571】

実施形態８９．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質又は機能性誘導体をコードする核酸配列が対象の肝臓で発現する、実施形態５３〜８８のいずれか１つの方法。

【0572】

実施形態９０．対象の血友病Ａを治療する方法であって、
実施形態４９〜５２のいずれか１つの遺伝子修飾細胞を対象に投与すること
を含む方法。

【0573】

実施形態９１．前記遺伝子修飾細胞が対象にとって自己性である、実施形態９０の方法。

【0574】

実施形態９２．対象から生体試料を採取すること
を更に含む、実施形態９０又は９１の方法であって、生体試料がヘパトサイト細胞を含み、遺伝子修飾細胞がヘパトサイトから調製される、方法。

【0575】

実施形態９３．実施形態１〜２１のいずれか１つのシステムの１つ以上の要素を含み、且つ使用説明書を更に含むキット。

【実施例】

【0576】

実施例１：インビトロでＨｅｐａ１−６細胞においてマウスアルブミン遺伝子のイントロン１におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによる切断を導くｇＲＮＡの同定
関連性のある前臨床動物モデルで判定することを目的として、関連性のある前臨床動物種由来のアルブミンのイントロン１におけるＣａｓ９ヌクレアーゼによる効率的な切断を導くｇＲＮＡ分子を試験した。血友病Ａのマウスモデルは十分に確立されており（Ｂｉ Ｌ，Ｌａｗｌｅｒ ＡＭ，Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＳＥ，Ｈｉｇｈ ＫＡ，Ｇｅａｒｈａｒｔ ＪＤ，Ｋａｚａｚｉａｎ ＨＨ．，Ｊｒ「マウス第ＶＩＩＩ因子遺伝子の標的化した破壊により血友病Ａモデルが生じる（Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ）」．（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．１９９５；１０：１１９−２１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５９５−１１９）、この疾患に対する新規治療手法を試験するのに有用なモデルシステムに相当する。マウスアルブミンのイントロン１において切断する可能性のあるｇＲＮＡを同定するため、目的の配列中で化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）による切断の潜在的な標的となり得るＮＧＧ ＰＡＭ配列を利用する可能な全てのｇＲＮＡ標的配列、及びマウスゲノム中の全ての関連配列を同定するアルゴリズム（例えばＣＣＴＯＰ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）を用いてイントロンの配列を分析した。次にマウスゲノム中における正確にその配列又は関連配列の頻度に基づき各ｇＲＮＡを順位付けして、理論上のオフターゲット切断リスクが最小のｇＲＮＡを同定した。この種の分析に基づき、ｍＡＬｂｇＲＮＡ＿Ｔ１と呼ばれるｇＲＮＡが試験に選択された。

【0577】

ｍＡｌｂｇＲＮＡ＿Ｔ１がマウスゲノム中で相同性を呈した他の部位は、各々が以下の表２に示されるとおりの４ヌクレオチドのミスマッチを呈する４部位のみであった。

【0578】

【表3】

【0579】

ｍＡＬｂｇＲＮＡ＿Ｔ１がマウス細胞においてＣａｓ９による切断を促進する効率を判定するため、マウス肝細胞由来細胞株Ｈｅｐａ１−６を使用した。Ｈｅｐａ１−６細胞を５％ＣＯ_２インキュベーターにおいてＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養した。化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）タンパク質に結合したｇＲＮＡで構成されるリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を、２．４μｌのｓｐＣａｓ９（０．８μｇ／μｌ）及び３μｌの合成ｇＲＮＡ（２０μＭ）及び７μｌのＰＢＳ（１：５のｓｐＣａｓ９：ｇＲＮＡ比）を混合することによって予め形成し、室温で１０分間インキュベートした。ヌクレオフェクションのため、ＳＦ添加試薬（Ｌｏｎｚａ）のバイアル全部をＳＦ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ試薬（Ｌｏｎｚａ）に加えて完全ヌクレオフェクション試薬を調製した。各ヌクレオフェクションにつき、１×１０^５個のＨｅｐａ１−６細胞を２０μｌの完全ヌクレオフェクション試薬に再懸濁し、ＲＮＰに加え、次に４Ｄヌクレオフェクション装置（４Ｄ ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）（Ｌｏｎｚａ）に置いたヌクレオフェクションキュベット（１６ウェルストリップ）に移し、プログラムＥＨ−１００を用いてヌクレオフェクトした。細胞を１０分間静置させた後、新鮮完全培地が入った適切なサイズのプレートに移した。ヌクレオフェクションの４８時間後、細胞を回収し、ゲノムＤＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキット（カタログ番号６９５０６）を使用して精製した。

【0580】

アルブミンイントロン１の標的部位におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ媒介性切断頻度を判定するため、５２℃のアニーリング温度を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で標的部位に隣接する一対のプライマー（ＭＡＬＢＦ３；５’ＴＴＡＴＴＡＣＧＧＴＣＴＣＡＴＡＧＧＧＣ３’（配列番号１１）及びＭＡＬＢＲ５：ＡＧＴＣＴＴＴＣＴＧＴＣＡＡＴＧＣＡＣＡＣ３’（配列番号１２））を使用してゲノムＤＮＡから６０９ｂｐ領域を増幅した。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用してＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲ反応に使用した同じプライマーでサンガーシーケンシングを用いて直接シーケンシングした。分解によるインデルトラッキング（Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｄｅｌｓ ｂｙ Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ：ＴＩＤＥＳ）と呼ばれるアルゴリズムによって配列データを分析し、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体についての予測切断部位に存在する挿入及び欠失（インデル）の頻度を決定した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）。ｍＡｌｂｇＲＮＡ＿Ｔ１の総合的インデル発生頻度は、３つの独立した実験で試験したとき８５〜９５％であったことから、これらの細胞のゲノムにおけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９による効率的な切断が指摘される。ｍＡｌｂ ｇＲＮＡ−Ｔ１をヌクレオフェクトしたＨｅｐａ１−６細胞におけるＴＩＤＥＳ分析の例を図３に示す。ほとんどの挿入及び欠失が１ｂｐの挿入及び１ｂｐの欠失からなり、最大６ｂｐの欠失が少数ある。

【0581】

実施例２：マウスにおけるｍＡｌｂｇＲＮＡ−Ｔ１のインビボ切断効率の判定
Ｃａｓ９及びｍＡｌｂｇＲＮＡ−Ｔ１をマウスのヘパトサイトに送達するため、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達媒体を使用した。化学的に修飾されたヌクレオチドを取り入れることによりヌクレアーゼ耐性を向上させたｓｇＲＮＡを化学的に合成した。一例ではｇＲＮＡは、以下の構造でできている：

【化9】

式中、「Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ」は天然ＲＮＡヌクレオチドであり、「ａ、ｇ、ｕ、ｃ」は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドであり、及び「ｓ」はホスホロチオエート骨格を表す。ｇＲＮＡのマウスアルブミンターゲティング配列には下線を付し、残りのｇＲＮＡ配列は共通の足場配列である。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡは、ゲノムＤＮＡの切断が起こり得るところである核コンパートメント内にｓｐＣａｓ９タンパク質を輸送するために必要な核局在化ドメイン（ＮＬＳ）に融合したｓｐＣａｓ９タンパク質をコードするように設計した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの追加的な成分は、リボソーム結合を促進するための第１コドンの前の５’末端にあるコザック配列、及び一連のＡ残基で構成される３’末端にあるポリＡテールである。ＮＬＳ配列を有するｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡの配列の例を配列番号８１に示す。このｍＲＮＡは、当該技術分野において周知の種々の方法によって作製することができる。本明細書において用いられるかかる方法の一つは、Ｔ７ポリメラーゼを使用したインビトロ転写であり、ここではｍＲＮＡの配列が、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターを含有するプラスミドにコードされる。簡潔に言えば、Ｔ７ポリメラーゼ及びリボヌクレオチドを含有する適切な緩衝液中でこのプラスミドをインキュベートすると、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＲＮＡ分子が作製された。反応混合物中の天然リボヌクレオチド又は化学的に修飾されたリボヌクレオチドのいずれも使用されることにより、天然化学構造又は修飾化学構造のいずれも備えるｍＲＮＡ分子が生じ、これは発現、安定性又は免疫原性の点で有利であり得る。加えて、ｓｐＣａｓ９コード配列の配列は、各アミノ酸について最も高頻度で使用されるコドンを利用することにより、コドン使用を最適化した。加えて、コード配列は、ｍＲＮＡからｓｐＣａｓ９タンパク質への最も効率的な翻訳を促進するため、潜在リボソーム結合部位及び上流オープンリーディングフレームを取り除くように最適化した。

【0582】

本試験に使用されるＬＮＰの主成分は、脂質Ｃ１２−２００である（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０７，１８６４−１８６９）。Ｃ１２−２００脂質は高電荷ＲＮＡ分子と複合体を形成する。Ｃ１２−２００を１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ＤＭＰＥ−ｍＰＥＧ２０００及びコレステロールと組み合わせた。例えばＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ装置（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）における制御された条件下でｇＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの核酸と混合すると、ＬＮＰの自己組織化が起こり、核酸がＬＮＰの内部に封入された。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡをＬＮＰにアセンブルするため、エタノール及び脂質ストックをガラスバイアルに適宜ピペッティングした。Ｃ１２−２００とＤＯＰＥ、ＤＭＰＥ−ｍＰＥＧ２０００及びコレステロールとの比を調整して製剤化を最適化した。典型的な比は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比のＣ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール及びｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧで構成された。ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡをＲＮアーゼフリーチューブ内の１００ｍＭクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０及び３００ｍＭ ＮａＣｌに希釈した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒカートリッジ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）の脂質側をエタノールで洗浄し、ＲＮＡ側を水で洗浄した。この脂質ワーキングストックをシリンジに引き込み、シリンジから空気を除去し、カートリッジに挿入した。同じ手順を用いてシリンジにｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの混合物をロードした。次に標準条件下でＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒランを実施した。次にＬＮＰ懸濁液を２０Ｋｄカットオフ透析カートリッジを使用して４リットルのＰＢＳ中で４時間透析し、次に２０Ｋｄカットオフスピンカートリッジ（Ａｍｉｃｏｎ）による遠心を用いて（遠心中にＰＢＳでの３回の洗浄を含んだ）濃縮した。最後に、ＬＮＰ懸濁液を０．２μＭシリンジフィルタで滅菌ろ過した。市販のエンドトキシンキット（ＬＡＬアッセイ）を使用してエンドトキシンレベルを確認し、動的光散乱によって粒径分布を決定した。ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、封入されたＲＮＡの濃度を決定した。或いは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは個別にＬＮＰに製剤化し、次に培養下の細胞の処理前又は動物への注射前に併せて混合した。個別に製剤化したｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを使用することにより、特定の比率のｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを試験することが可能であった。

【0583】

ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達には、代替的なカチオン性脂質分子を利用した代替的なＬＮＰ製剤もまた使用した。ｍＡＬＢ ｇＲＮＡ Ｔ１及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを封入する新鮮に調製したＬＮＰを１：１のＲＮＡ質量比で混合し、血友病Ａマウスの尾静脈に注射（ＴＶ注射）した。或いは、ＬＮＰは後眼窩（ＲＯ）注射によって投与した。マウスに与えたＬＮＰの用量は、体重１ｋｇ当たり０．５〜２ｍｇのＲＮＡの範囲であった。ＬＮＰの注射の３日後、マウスを犠牲にし、左右肝葉の小片及び脾臓の小片を採取し、各々からゲノムＤＮＡを精製した。次にゲノムＤＮＡをＴＩＤＥＳ分析に供してアルブミンイントロン１の標的部位における切断頻度及び切断プロファイルを測定した。結果の一例を図４に示し、ここでは２ｍｇ／ｋｇの用量で平均して２５％の対立遺伝子が切断された。用量反応が見られ、０．５ｍｇ／ｋｇ用量では約５％の切断となり、１ｍｇ／ｋｇでは約１０％の切断となった。ＰＢＳ緩衝液のみを注射したマウスはＴＩＤＥＳアッセイにおいて、ＴＩＤＥＳアッセイそれ自体のバックグラウンドの尺度である約１〜２％の低いシグナルを示した。

【0584】

実施例３：ヒトアルブミンのイントロン１に標的化されるｓｇＲＮＡのインデル頻度の判定
ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１の範囲内で化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）による切断の標的となり得るＮＧＧ ＰＡＭ配列を利用する全ての潜在的ｇＲＮＡ配列を、「ＣＣＴｏｐ」（例えばｈｔｔｐｓ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｃｏｓ．ｕｎｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／を参照のこと）と呼ばれる公開されているアルゴリズムに基づく「Ｇｕｉｄｏ」と呼ばれる所有アルゴリズムを用いて同定した。このアルゴリズムは、ヒトゲノム中の潜在的なオフターゲット部位を同定し、予測されるオフターゲット切断可能性に基づき各ｇＲＮＡを順位付けする。同定されたｇＲＮＡ配列を以下の表に提供する。

【0585】

【表4】

【0586】

５μｇ／μｌのＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質（Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標））をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し（カタログ番号Ａ２７８６５、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、次に１：６希釈して０．８３μｇ／μｌ又は５．２μＭのワーキング濃度とした。化学的に修飾された合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）をＴＥ緩衝液により１００μＭで再懸濁してストック溶液とした。或いは、使用するｇＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）によって作製してもよい。この溶液をヌクレアーゼフリー水で希釈して２０μＭのワーキング濃度とした。

【0587】

リボ核タンパク質複合体を作るため、Ｃａｓ９タンパク質（１２．５ｐｍｏｌ）及びｓｇＲＮＡ（６０ｐｍｏｌ）を室温で１０〜２０分間インキュベートした。このインキュベーション中、ＨｅｐＧ２細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）又はＨｕＨ７細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して３７℃で５分間解離した。各トランスフェクション反応物には１×１０^５細胞が含まれ、１実験当たりの適切な数の細胞を３５０×Ｇで３分間遠心し、次にトランスフェクション反応毎に２０μｌのＬｏｎｚａ ＳＦヌクレオフェクションプラス添加溶液（カタログ番号Ｖ４ＸＣ−２０３２、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。２０μｌのヌクレオフェクション溶液中の再懸濁細胞を各ＲＮＰチューブに加え、全容積を１６ウェルヌクレオフェクションストリップの１つのウェルに移した。Ａｍａｘａ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ）のＥＨ−１００プログラムを用いてＨｅｐＧ２又はＨｕＨ７細胞をトランスフェクトした。ＨｅｐＧ２及びＨｕＨ７はヒトヘパトサイト細胞株であり、従って肝臓の遺伝子の切断に使用されるｇＲＮＡの判定に関連性がある。トランスフェクション後、細胞をヌクレオフェクションストリップにおいて１０分間インキュベートし、１０％ウシ胎仔血清（カタログ番号１０４３８０２６、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補足したイーグル最小必須培地（カタログ番号１０−００９−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）からなる温培地が入った４８ウェルプレートに移した。翌日、細胞に新鮮培地を再フィードした。

【0588】

トランスフェクション後４８時間で、ＨｅｐＧ２又はＨｕＨ７細胞を解離し、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙキット（カタログ番号６９５０６、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをＰｌａｔｉｎｕｍ ＳｕｐｅｒＦｉ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び０．２μＭの以下のプライマー：アルブミンフォワード：５’−ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１４）；アルブミンリバース：５’−ＴＣＴＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴ−３’（配列番号１５）；ＡＡＶＳ１フォワード：５’−ＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１６）；ＡＡＶＳ１リバース：５’−ＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＴＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号１７）と共に使用してＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、９８℃で２分（１回）、続いて９８℃で３０秒、６２．５℃で３０秒及び７２℃で１分（３５回）であった。１．２％Ｅ−ゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲ産物が正しいことを確認し、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キット（カタログ番号２８１０６）を使用して精製した。対応するＰＣＲ産物に対するフォワード又はリバースのいずれかのプライマーを使用して、精製したＰＣＲ産物をサンガーシーケンシングに供した。Ｂｒｉｎｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．，Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ，ａｎｄ ｖａｎ Ｓｔｅｅｎｓｅｌ，Ｂ．「配列トレース分解によるゲノム編集の容易な定量評価（Ｅａｓｙ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｒａｃｅ ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．２２ ｅ１６８）により記載されるとおりのＴＩＤＥ分析アルゴリズムを用いて、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９についての予測切断部位における挿入又は欠失頻度を決定した。簡潔に言えば、クロマトグラムシーケンシングファイルを未処理細胞から得られた対照クロマトグラムと比較して、異常なヌクレオチドの相対存在量を決定した。この結果は表４に要約する。また、非ヒト霊長類など、関連性のある前臨床種で相同のヒトのｇＲＮＡ配列を同定することも興味深い。ヒトアルブミンイントロン１に同定された潜在的ｇＲＮＡ配列を霊長類カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）のアルブミンイントロン１配列とアラインメントすると、表４に示されるとおり、完全一致又は１〜２ヌクレオチドのミスマッチを有する幾つかのｇＲＮＡ分子が同定された。ＨｕＨ７細胞では、ＩＶＴガイドを使用して生じるインデル頻度を測定し、ＨｅｐＧ２細胞では、合成ガイドで生じるインデル頻度を測定した。ＨｕＨ７細胞で異なるガイドによって生じるインデル頻度は０．３％〜６４％の範囲であり、アルブミンのイントロン１において効率的に切断するｇＲＮＡは、単に配列ベースのインシリコアルゴリズムに基づくだけでは選択できないことが実証された。ＨｕＨ７におけるＩＶＴ ｇＲＮＡ及びＨｅｐＧ２細胞における合成ｇＲＮＡのインデル頻度に基づき、切断頻度が４０％より高い幾つかのｇＲＮＡを同定した。合成ガイドとして４６％及び４３％の切断を呈し、且つヒト及び霊長類で１００％同一であるｇＲＮＡ Ｔ５及びＴ１２が特に興味深い。

【0589】

【表5】

【0590】

実施例４：マウスアルブミンイントロン１における目的の治療用遺伝子の標的組込み
疾患の治療に必要な治療用タンパク質を発現させるための手法は、当該のタンパク質をコードする遺伝子のｃＤＮＡ又はコード配列をインビボで肝臓のアルブミン遺伝子座に標的化して組み込むことである。標的組込みは、ドナーＤＮＡ鋳型が生物のゲノムに二本鎖切断部位で組み込まれる過程であり、かかる組込みはＨＤＲ又はＮＨＥＪのいずれかによって起こる。この手法は、生物の細胞への配列特異的ＤＮＡヌクレアーゼ及び治療用遺伝子をコードするドナーＤＮＡ鋳型の導入を用いる。本発明者らは、アルブミンイントロン１に標的化されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼがドナーＤＮＡ鋳型の標的組込みを促進する能力を有するかどうかを判定した。ドナーＤＮＡ鋳型は、静脈内注射後に肝臓のヘパトサイトを優先的に形質導入するＡＡＶウイルス、好ましくはマウスの場合にはＡＡＶ８ウイルスで送達される。配列特異的ｇＲＮＡ ｍＡｌｂ＿Ｔ１及びＣａｓ９ ｍＲＮＡは、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとを封入するＬＮＰ製剤の静脈内又はＲＯ注射によって同じマウスの肝臓のヘパトサイトに送達される。ＡＡＶによるヘパトサイトの形質導入は数時間〜数日かかり、送達されたドナーＤＮＡはヘパトサイトの核に数週間〜数ヵ月にわたって安定に維持されることが公知であるため、ある場合には、ＡＡＶ８−ドナー鋳型はＬＮＰよりも前にマウスに注射される。対照的に、ＬＮＰによって送達されるｇＲＮＡ及びｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子の固有の不安定性に起因して、ヘパトサイトで僅か１〜４日しか生き残らないであろう。別の場合には、ＬＮＰはＡＡＶ−ドナー鋳型の１日〜７日後にマウスに注射される。ドナーＤＮＡ鋳型は、（ｉ）組込みの最大化、及び（ｉｉ）コードされた治療用タンパク質の発現の最大化を目標として幾つかの設計特徴を取り入れる。

【0591】

ＨＤＲによる組込みが起こるためには、治療用遺伝子カセットの両側に相同性アームが含まれる必要がある。これらの相同性アームは、マウスアルブミンイントロン１におけるｇＲＮＡ切断部位の両側の配列で構成される。相同性アームが長いほど、概して効率の高いＨＤＲが促進されるが、相同性アームの長さは、ＡＡＶウイルスの約４．７〜５．０Ｋｂのパッケージング限界によって制限を受け得る。従って、相同性アームの最適な長さを同定するには、試験が必要である。組込みはまたＮＨＥＪ機構によっても起こり、ここでは二本鎖ＤＮＡドナーの遊離末端が二本鎖切断の末端につなぎ合わされる。この場合、相同性アームは必要ない。しかしながら、遺伝子カセットの両側にｇＲＮＡ切断部位を取り入れると、線状二本鎖断片が生じることにより組込み効率が向上し得る。ｇＲＮＡ切断部位を逆向きで使用することにより、所望の順方向での組込みに有利に働き得る。ＦＶＩＩＩのフューリン切断部位に突然変異を導入すると、タンパク質の発現中にフューリンによって切断されることができないＦＶＩＩＩタンパク質が生じ、完全な機能を維持しつつ血漿中での安定性が向上していることが示されている１本の鎖のＦＶＩＩＩポリペプチドとなり得る。

【0592】

アルブミンイントロン１にＦＶＩＩＩ遺伝子を組み込むように設計された例示的ＤＮＡドナーを図５に示す。特異的ドナー設計の配列は、順に配列番号８７〜９２である。

【0593】

ＦＶＩＩＩドナーＤＮＡがパッケージングされたＡＡＶ８又は他のＡＡＶ血清型ウイルスの作製は、十分に確立されたウイルスパッケージング方法を用いて達成される。一つのかかる方法では、ＨＥＫ２９３細胞に３つのプラスミドがトランスフェクトされ、１つはＡＡＶパッケージングタンパク質をコードし、２つ目はアデノウイルスヘルパータンパク質をコードし、３つ目はＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接したＦＶＩＩＩドナーＤＮＡ配列を含む。トランスフェクト細胞は、１つ目のプラスミドにコードされるＡＡＶカプシドタンパク質の組成によって指定される血清型のＡＡＶ粒子を生じる。これらのＡＡＶ粒子は、細胞上清又は上清及び溶解細胞から回収され、ＣｓＣｌ勾配若しくはイオジキサノール勾配で、又は必要に応じて他の方法により精製される。精製されたウイルス粒子は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によってドナーＤＮＡのゲノムコピー数を測定することにより定量化される。

【0594】

ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡのインビボ送達は、様々な方法によって達成される。第１の例では、ＡＡＶウイルスベクターからｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を発現させる。この場合、ｇＲＮＡの転写はＵ６プロモーターによってドライブされ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ転写はＥＦ１−αのような遍在性プロモーター又は好ましくはトランスサイレチンプロモーター／エンハンサーなどの肝臓特異的プロモーター及びエンハンサーのいずれかからドライブされる。ｓｐＣａｓ９遺伝子のサイズ（４．４Ｋｂ）が妨げとなって単一のＡＡＶにｓｐＣａｓ９及びｇＲＮＡカセットを含めることはできないため、ｇＲＮＡ及びｓｐＣａｓ９の送達に別個のＡＡＶが必要である。第２の例では、ウイルスゲノムの自己不活性化を促進する配列エレメントを有するＡＡＶベクターが使用される。この場合、ベクターＤＮＡにｇＲＮＡの切断部位を含めるため、インビボでベクターＤＮＡの切断が起こる。切断時にＣａｓ９の発現を遮断する位置に切断部位を含めることにより、Ｃａｓ９発現が短時間に限られる。インビボでｇＲＮＡ及びＣａｓ９を細胞に送達する第３の代替的な手法では、非ウイルス送達方法が用いられる。一例では、非ウイルス送達方法として脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が使用される。幾つかの異なるイオン化可能なカチオン性脂質が、ＬＮＰでの使用に利用可能である。それらとしては、とりわけ、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ（２０１０），ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０７，１８６４−１８６９）、ＭＣ３、ＬＮ１６、ＭＤ１が挙げられる。ある種のＬＮＰでは、ＬＮＰの外側にＧａｌＮａｃ部分が取り付けられ、これがアシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｙｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体を介した肝臓への取込みのリガンドとして働く。これらのカチオン性脂質の任意のものを使用して、肝臓へのｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの送達用ＬＮＰが製剤化される。

【0595】

ＦＶＩＩＩの標的組込み及び発現を判定するため、初めに、ＦＶＩＩＩドナーＤＮＡ鋳型を封入するＡＡＶウイルス、好ましくはＡＡＶ８ウイルスを血友病Ａマウスに静脈内注射する。ＡＡＶの用量は、各マウスにつき４×１０^１１〜４×１０^１３ＶＧ／ｋｇ当量の１０^１０〜１０^１２ベクターゲノム（ＶＧ）の範囲である。ＡＡＶ−ドナーの注射の１時間〜７日後、同じマウスに、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとを封入するＬＮＰの静脈内注射を与える。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは別個のＬＮＰに封入され、次に注射前に１：１のＲＮＡ質量比で混合される。与えられるＬＮＰの用量は、体重１ｋｇ当たり０．２５〜２ｍｇのＲＮＡの範囲である。ＬＮＰは尾静脈注射によるか、又は後眼窩注射によって投与される。ＡＡＶ注射に対するＬＮＰ注射のタイミングが標的組込み及びＦＶＩＩＩタンパク質発現の効率に及ぼす影響が、ＡＡＶ投与後１時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間及び１６８時間の時点を試験することによって判定される。

【0596】

別の例において、ドナーＤＮＡ鋳型は、ＬＮＰである非ウイルス送達システムを使用してインビボで送達される。ＤＮＡ分子が上記に記載されるものと同様のＬＮＰ粒子に封入され、静脈注射後に肝臓のヘパトサイトに送達される。エンドソームから細胞質へのＤＮＡのエスケープは比較的効率的に起こるが、大型の荷電ＤＮＡ分子の核内移行は効率的でない。ある場合には、核へのＤＮＡの送達を向上させる方法は、ドナーＤＮＡ鋳型にＡＡＶ ＩＴＲを取り込むことによるＡＡＶゲノムの模倣である。この場合、ＩＴＲ配列がＤＮＡを安定化させ、又は他の方法で核移行を向上させる。ドナーＤＮＡ鋳型配列からのＣＧジヌクレオチド（ＣｐＧ配列）の除去もまた、核送達を向上させる。ＣＧジヌクレオチドを含有するＤＮＡは、自然免疫系によって認識され、排除される。人工ＤＮＡ配列に存在するＣｐＧ配列を除去すると、非ウイルス及びウイルスベクターによって送達されるＤＮＡの持続性が向上する。コドン最適化過程では典型的にはＣＧジヌクレオチドの含有量が増加し、なぜなら最も高頻度のコドンが多くの場合に３番目の位置にＣ残基を有し、それにより次のコドンがＧで始まる場合にＣＧが作り出される可能性が高くなるためである。ドナーＤＮＡ鋳型のＬＮＰ送達と、続いて１時間〜５日後にｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを含有するＬＮＰとの組み合わせが、血友病Ａマウスで判定される。

【0597】

ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及びドナーＤＮＡ鋳型のインビボ送達の有効性を判定するため、注射した血友病マウスについて、２つ目の成分の投与後約７日から開始して種々の時点で血中のＦＶＩＩＩレベルを判定する。血液試料をＲＯ採血によって採取し、血漿を分離し、発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ）を用いてＦＶＩＩＩ活性に関してアッセイする。ＦＶＩＩＩタンパク質標準を使用してアッセイをキャリブレーションし、血中のＦＶＩＩＩ活性の単位／ｍｌを計算する。

【0598】

ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの発現もまた、試験終了時にマウスの肝臓で測定する。マウスの肝臓から抽出した全ＲＮＡについて、Ｑ−ＰＣＲを用いてアルブミンｍＲＮＡ及びＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡのレベルをアッセイする。未治療マウスと比較したときのアルブミンｍＲＮＡに対するＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの比が、ハイブリッドアルブミン−ＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡの作製に利用されたアルブミン転写物の％の指標である。

【0599】

治療したマウスの肝臓からのゲノムＤＮＡについて、特にアルブミンイントロン１でのｇＲＮＡにとっての標的部位における標的組込みイベントを判定する。ＰＣＲプライマー対は、予測標的組込みの両側の接合部断片を増幅するように設計する。これらのプライマーは、順方向及び逆方向の両方の組込みを検出するように設計される。ＰＣＲ産物をシーケンシングすることにより、予想された組込みイベントが起こったかどうかを確認する。標的組込みを受けたアルブミン対立遺伝子の割合を定量化するため、予想される接合部断片に対応する標準を合成する。未治療マウスからのゲノムＤＮＡに種々の濃度でスパイクし、次に同じＰＣＲ反応に供すると、検量線が作成され、これを使用して、治療したマウスからの試料における組込みイベントを有する対立遺伝子のコピー数を計算する。

【0600】

実施例５：霊長類アルブミンイントロン１への標的組込み
実施例４にマウスについて記載される同じ方法論を、霊長類のアルブミンイントロン１を標的とするｇＲＮＡを使用して霊長類種に適用する。ＡＡＶ８又はＬＮＰのいずれかを使用して、初めにドナーＤＮＡ鋳型を静脈注射によって送達する。使用する用量は、マウスで成功が認められたものに基づく。続いて同じ霊長類に、ｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとを封入するＬＮＰの静脈注射を与える。マウスで有効と認められた同じＬＮＰ製剤及び用量を使用する。霊長類の血友病モデルは存在しないため、ＦＶＩＩＩタンパク質はヒトＦＶＩＩＩ特異的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定する必要がある。実施例４に記載される同じ標的組込み及びＦＶＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの分子解析を霊長類で実施する。霊長類は、トランスレーショナルから臨床までの評価を可能にする良好な前臨床モデルである。

【0601】

実施例６：ヒト初代ヘパトサイトにおけるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９によるオンターゲット及びオフターゲット切断並びに標的組込みの判定
初代ヒトヘパトサイトは、患者の肝臓に送達されることになるｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の効力及びオフターゲット切断の判定に最も関連性の高い細胞型である。これらの細胞を限られた期間にわたって接着単層培養下で成長させる。ｍＲＮＡによる接着細胞のトランスフェクションについては、例えばＭｅｓｓａｇｅ Ｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）など、方法が確立されている。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｇＲＮＡとの混合物によるトランスフェクション後、ＴＩＤＥＳ分析を用いてオンターゲット切断効率を測定する。同じゲノムＤＮＡ試料をオフターゲット分析に供して、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体によって切断されたゲノム中の更なる部位を同定する。一つのかかる方法は、「ＧｕｉｄｅＳｅｑ」（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ Ｆｅｂ；３３（２）：１８７−１９７）である。他の方法としては、ディープシーケンシング、全ゲノムシーケンシング、ＣｈＩＰ−ｓｅｑ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２，６７７−６８３ ２０１４）、ＢＬＥＳＳ（２０１３ Ｃｒｏｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２４０８）、２０１５ Ｆｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１０１に記載されるとおりのハイスループットゲノムワイドトランスロケーションシーケンシング（ＨＴＧＴＳ）、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（２０１５ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．３２８４）、及びＩＤＬＶ（２０１４ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３１２７）が挙げられる。

【0602】

初代ヒトヘパトサイトはまた、ドナーＤＮＡ鋳型を含有するＡＡＶウイルスによって形質導入される。詳細には、ＡＡＶ６又はＡＡＶＤＪ血清型が、培養下の細胞の形質導入に特に効率的である。ＡＡＶ−ＤＮＡドナーによる形質導入の１〜４８時間後、次に細胞にｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡをトランスフェクトして標的組込みを誘導する。標的組込みイベントは、実施例４に記載される同じＰＣＲベースの手法を用いて測定する。

【0603】

実施例７：培養下の初代ヒトヘパトサイトにおいてヒトアルブミンイントロン１で効率的に切断するガイドＲＮＡの同定及び選択
初代ヒトヘパトサイトにおける切断効率を判定するため、非ヒト霊長類と完全な相同性を有すること、並びにＨｕＨ７及びＨｅｐＧ２細胞における切断効率に関するスクリーニング（表４）に基づき、４つのｇＲＮＡ（Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１３）を選択した。初代ヒトヘパトサイト（ＢｉｏＩＶＴから入手した）を解凍し、凍結保存ヘパトサイト回復培地（ＣＨＲＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に移し、低速でペレット化し、次にＩＶ型コラーゲンを予めコートした２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ（商標）ＣＰ培地（ＢｉｏＩＶＴ）＋Ｔｏｒｐｅｄｏ（商標）抗生物質ミックス（ＢｉｏＩＶＴ）中に０．７×１０^６細胞／ｍｌの密度でプレーティングした。プレートを５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞が接着した後（プレーティングの３〜４時間後）、プレートに接着しなかった死細胞を新鮮な温完全培地を加えて洗い流し、次に細胞を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞のトランスフェクションのため、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）及びガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を氷上で解凍し、次にウェル当たり０．６ｕｇ ｍＲＮＡ及び０．２ｕｇガイドで３０ｕｌ ＯｐｔｉＭｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）に加えた。ＯｐｔｉＭｅｍ中３０ｕｌに全核酸重量に対して２：１体積で希釈したＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ ＯｐｔｉＭｅｍ溶液と共に室温で２０分間インキュベートした。この混合物を２４ウェルプレート内の培養ヘパトサイトのウェル当たり５００ｕｌのヘパトサイトプレーティング用培地に滴下して加え、細胞を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。翌朝、細胞を洗浄して再フィードし、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、各ウェルに２００ｕｌの温０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を加えて３７℃で５〜１０分間インキュベートすることによりゲノムＤＮＡを抽出した。細胞を取り除けた後、２００ｕｌ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を加えてトリプシンを不活性化した。１ｍｌ ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に加えた後、細胞を１２００ｒｐｍで３分間ペレット化し、次に５０ｕｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。ＭａｇＭＡＸ ＤＮＡ Ｍｕｌｔｉ−Ｓａｍｐｌｅ Ｕｌｔｒａ ２．０キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）を使用して、キットの説明書に従いゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ品質及び濃度を分光光度計を用いて分析した。ＴＩＤＥ分析のため、予測されるオンターゲット切断部位に隣接するプライマー（ＡｌｂＦ：ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣ、配列番号１７８、及びＡｌｂＲ：ＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡ、配列番号１７９）及びＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３５サイクルのＰＣＲ及び５５℃のアニーリング温度を用いてゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。初めにＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、正しいサイズの産物（１０５３ｂｐ）が生成されたことを確認し、次に精製し、及びプライマー（フォワード：ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧ、配列番号１８０、リバース：ＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ、配列番号１８１）を使用してシーケンシングした。次にＴｓｕｎａｍｉと呼ばれる改良版のＴＩＤＥＳアルゴリズム（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）を用いて配列データを分析した。これにより、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体についての予測切断部位に存在する挿入及び欠失（インデル）の頻度が決定される。

【0604】

Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、及びＴ１３ガイドの標準的な２０ヌクレオチド標的配列又は１９ヌクレオチド標的配列（５’末端が１ｂｐ短い）のいずれかを含有するガイドＲＮＡ（ＡｘｏＬａｂｓ、Ｋｕｌｍｂａｃｈ Ｇｅｒｍａｎｙ、又はＳｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡにおいて化学的に合成された）を試験した。１９ヌクレオチドｇＲＮＡの方が配列特異性は高くなり得るが、短いガイドほど効力が低くなり得る。ドナー間での比較のため、ヒトＡＡＶＳ１遺伝子座及びヒト補体因子を標的とする対照ガイドを含めた。トランスフェクションから４８時間後にＴＩＤＥＳ法を用いてアルブミンイントロン１の標的部位におけるインデル頻度を測定した。図６は、４人の異なるヒトドナーからの初代ヘパトサイトのトランスフェクションの結果を要約する。これらの結果は、切断効率が種々のガイドについて２０％〜８０％の範囲であることを実証している。２０ヌクレオチドバージョンの各アルブミンｇＲＮＡは、一貫して１９ヌクレオチド変異体よりも効力が高かった。２０ヌクレオチドｇＲＮＡの優れた効力は、オフターゲット切断の点で１９ヌクレオチドｇＲＮＡが有し得る任意の潜在的な利益を相殺し得る。４つの細胞ドナー間ではガイドＲＮＡ Ｔ４が最も一貫性のある切断を呈し、約６０％のインデル頻度であった。ｇＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１及びＴ１３をオフターゲット分析に選択した。

【0605】

実施例８：ヒトアルブミンガイドＲＮＡのオフターゲット部位の同定
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のオフターゲット部位を同定する２つの手法は、アブイニシオ予測及び経験的検出である。ガイドＲＮＡによるＣａｓ９切断部位の特定は、Ｃａｓ９切断がガイドＲＮＡ配列とゲノムとの間のミスマッチを許容するため不完全な過程である。種々のガイドの安全性リスクを理解し、及び最も有利なオフターゲットプロファイルを有するガイドを選択するには、Ｃａｓ９切断部位のスペクトルが既知であることが重要である。予測的方法は、オフターゲット予測のＣＣＴｏｐアルゴリズムを改良したソフトウェアツールであるＧｕｉｄｏに基づく（Ｓｔｅｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。Ｇｕｉｄｏは、Ｂｏｗｔｉｅ １アルゴリズムを使用してガイドＲＮＡとヒトゲノムのＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ビルド全体との間の相同性を検索することにより潜在的なオフターゲット切断部位を同定する（Ｌａｎｇｍｅａｄ ｅｔ ａｌ．，２００９）。Ｇｕｉｄｏは、ＰＡＭ近位の相同性及び正しく位置するＮＧＧ ＰＡＭを優先して、ガイドＲＮＡとのミスマッチが最大５個の配列を検出する。部位がそのミスマッチの数及び位置によって順位付けされた。ラン毎にガイド配列並びにゲノムＰＡＭがコンカテネートされ、デフォルトパラメータでランされる。アルブミンガイドＴ４、Ｔ５、Ｔ１１及びＴ１３について、ミスマッチが３個以下の上位ヒットを以下の表５〜表８に示す。各表の第１行がヒトゲノムにおけるオンターゲット部位を示し、その下の行が予測されるオフターゲット部位を示す。

【0606】

【表6】

【0607】

【表7】

【0608】

【表8】

【0609】

【表9】

【0610】

加えて、ヒト肝細胞におけるヒトアルブミンｇＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１、Ｔ１３のオフターゲット部位を、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑと呼ばれる方法を用いて同定した。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）は、オフターゲット切断部位を見付け出す経験的方法である。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑは、染色体ＤＮＡの二本鎖切断部位におけるオリゴヌクレオチドの自然発生的捕捉に頼る。端的には、関連性のある細胞にｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体をトランスフェクトした後、細胞から二本鎖オリゴヌクレオチドゲノムＤＮＡが精製され、超音波処理され、一連のアダプターライゲーションが実施されてライブラリが作成される。このオリゴヌクレオチド含有ライブラリがハイスループットＤＮＡシーケンシングに供され、デフォルトのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑソフトウェアで出力が処理されると、オリゴヌクレオチド捕捉部位が同定される。

【0611】

詳細には、二本鎖ＧＵＩＤＥｓｅｑオリゴは、２つの相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを８９℃に加温し、次に室温にゆっくりと冷却することによってアニーリングすることにより作成した。４．８ｕＬの最終容積中、２４０ｐｍｏｌのガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及び４８ｐｍｏｌの２０ｕＭ Ｃａｓ９ ＴｒｕＣｕｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を混合することにより、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を調製した。別個のチューブに４ｕｌの１０ｕＭ ＧＵＩＤｅｓｅｑ二本鎖オリゴヌクレオチドを１．２ｕｌのＲＮＰミックスと混合し、次にヌクレオフェクションカセット（Ｌｏｎｚａ）に加えた。これに、１６．４ｕｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＳＦ溶液（Ｌｏｎｚａ）及び３．６ｕｌの添加剤（Ｌｏｎｚａ）を加えた。接着培養物として成長させたＨｅｐＧ２細胞をトリプシン処理によりプレートから遊離させて、次にトリプシンの失活後、ペレット化し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に１２．５ｅ６細胞／ｍｌで再懸濁し、各ヌクレオフェクションキュベットに２０ｕｌ（２．５ｅ５細胞）を加えた。４−Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒユニット（Ｌｏｎｚａ）においてＥＨ−１００細胞プログラムでヌクレオフェクションを実施した。室温で１０分間インキュベートした後、８０ｕｌの完全ＨｅｐＧ２培地を加え、２４ウェルプレートのウェルに細胞懸濁液を入れ、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。細胞をトリプシンで遊離させて、遠心（３００ｇ １０分間）によってペレット化し、次にＤＮＡｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。ヒトアルブミンイントロン１領域をプライマーＡｌｂＦ（ＣＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＣ、配列番号１７８）及びＡｌｂＲ（ＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡ、配列番号１７９）及びＰｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して３５サイクルのＰＣ及び５５℃のアニーリング温度を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、初めにアガロースゲル電気泳動によって分析して、正しいサイズの産物（１０５３ｂｐ）が生成されたことを確認し、次にプライマー（フォワード：ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡＧＴＧＧ、配列番号１８０、リバース：ＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧ、配列番号１８１）を使用して直接シーケンシングした。次にＴｓｕｎａｍｉと呼ばれる改良版のＴＩＤＥＳアルゴリズム（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（２１０４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，１）を用いて配列データを分析した。これにより、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体についての予測切断部位に存在する挿入及び欠失（インデル）の頻度が決定される。Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．によって記載されるプロトコルと比較して、本発明者らは、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを４０ｐｍｏｌ（約１．６７μＭ）の捕捉オリゴヌクレオチドで実施して、オフターゲット切断部位同定の感度を増加させた。約０．０１％の感度を実現するため、本発明者らは、最低５０％のオンターゲット切断でトランスフェクション１回につき最低１０，０００個のユニークなオンターゲット配列リードを定義した。並行してＲＮＰをトランスフェクトしない試料を処理した。ＲＮＰ含有試料及びＲＮＰナイーブ試料の両方で見出された部位（±１ｋｂ）は、更なる分析から除外する。

【0612】

ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２でＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを実施した。ＨｅｐＧ２では、オンターゲット部位におけるＧＵＩＤＥ−ｓｅｑオリゴヌクレオチドの捕捉はＮＨＥＪ頻度の７０％〜２００％の範囲であり、効率的なオリゴ捕捉が実証された。

【0613】

８ｍｅｒ分子インデックスを含有する試料バーコードアダプター（Ａ０１〜Ａ１６）の各々に共通アダプターをアニーリングすることにより、Ｙ−アダプターを調製した。ＲＮＰ及びＧＵＩＤＥＤｓｅｑオリゴをヌクレオフェクトしたＨｅｐＧ２細胞から抽出したゲノムＤＮＡをＱｕｂｉｔを使用して定量化し、全ての試料を１２０ｕＬ容積のＴＥ緩衝液中４００ｎｇに標準化した。Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２２０ソニケーターの標準的な操作手順によりゲノムＤＮＡを２００ｂｐの平均長さに剪断した。平均断片長を確認するため、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造者のプロトコルに従い１ｕＬの試料を分析した。剪断されたＤＮＡの試料をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを使用して製造者のプロトコルに従いクリーンアップし、１７ｕＬのＴＥ緩衝液に溶出させた。１．２ｕｌのｄＮＴＰミックス（各５ｍＭのｄＮＴＰ）、３ｕｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液、２．４ｕｌの末端修復ミックス、２．４ｕｌの１０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋不含）、及び０．６ｕｌのＴａｑポリメラーゼ（非ホットスタート）及び１４ｕＬの剪断ＤＮＡ試料（前のステップから）をチューブ１本につき２２．５ｕＬの容積として混合することによりゲノムＤＮＡに対して末端修復反応を実施し、サーモサイクラーでインキュベートした（１２℃１５分；３７℃１５分；７２℃１５分；４℃保持）。これに１ｕｌのアニールしたＹアダプター（１０ｕＭ）、２ｕｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼを加え、混合物をサーモサイクラーでインキュベートした（１６℃、３０分；２２℃、３０分；４℃保持）。試料をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを使用して製造者のプロトコルに従いクリーンアップし、２３ｕＬのＴＥ緩衝液に溶出させた。１ｕＬの試料を製造者のプロトコルに従いＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎにかけて、断片へのアダプターのライゲーションを確認した。ＧＵＩＤＥｓｅｑライブラリを調製するため、１４ｕｌヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏ、３．６ｕｌ １０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液、０．７ｕｌ ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、１．４ｕｌ ＭｇＣｌ_２、５０ｍＭ、０．３６ｕｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．２ｕｌセンス又はアンチセンス遺伝子特異的プライマー（１０ｕＭ）、１．８ｕｌ ＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６ｕｌ Ｐ５＿１（１０ｕＭ）及び前のステップからの１０ｕｌの試料を含有する反応物を調製した。この混合物をサーモサイクラーでインキュベートした（９５℃で５分、次に９５℃で３０秒、７０℃（サイクル毎に１℃降温）で２分、７２℃で３０秒を１５サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒を１０サイクル、続いて７２℃で５分）。このＰＣＲ反応物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを使用して製造者のプロトコルに従いクリーンアップし、１５ｕＬのＴＥ緩衝液に溶出させた。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで製造者のプロトコルに従い１ｕＬの試料を確認し、試料の経過を追った。６．５ｕｌヌクレアーゼフリーＨ_２Ｏ、３．６ｕｌ １０×Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ緩衝液（Ｍｇ２＋不含）、０．７ｕｌ ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭ）、１．４ｕｌ ＭｇＣｌ_２（５０ｍＭ）、０．４ｕｌ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ、１．２ｕｌの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）２（センス；＋又はアンチセンス；−）、１．８ｕｌ ＴＭＡＣ（０．５Ｍ）、０．６ｕｌ Ｐ５＿２（１０ｕＭ）及び前のステップからの１５ｕｌのＰＣＲ産物を混合することにより、２回目のＰＣＲを実施した。１回目のＰＣＲにＧＳＰ１＋が使用された場合、ＰＣＲ２ではＧＳＰ２＋を使用した。１回目のＰＣＲ反応にＧＳＰ１−プライマーが使用された場合、この２回目のＰＣＲ反応ではＧＳＰ２−プライマーを使用した。１．５ｕｌのＰ７（１０ｕＭ）を加えた後、反応物をサーモサイクラーで以下のプログラムによりインキュベートした：９５℃で５分、次に９５℃で３０秒、７０℃（サイクル毎に１℃降温）で２分、７２℃で３０秒を１５サイクル、続いて９５℃で３０秒、５５℃で１分、７２℃で３０秒を１０サイクル、続いて７２℃で５分。このＰＣＲ反応物をＡＭＰｕｒｅ ＸＰ ＳＰＲＩビーズを使用して製造者のプロトコルに従いクリーンアップし、３０ｕＬのＴＥ緩衝液に溶出させて、製造者のプロトコルに従いＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで１ｕＬを分析して増幅を確認した。Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリ定量化用のＫａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓキットを使用して、製造者が供給するプロトコルに従いＰＣＲ産物のライブラリを定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシステムで次世代シーケンシングに供してオリゴヌクレオチドが組み込まれた部位を決定した。

【0614】

ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの結果を表９〜表１２に掲載する。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって同定される予測標的配列を考慮に入れることが重要である。予測標的配列がＰＡＭを欠いている、又はｇＲＮＡとの有意な相同性を欠いている、例えば５個より多いミスマッチ（ｍｍ）の場合、それらのゲノム部位は真のオフターゲット部位ではなく、アッセイからのバックグラウンドシグナルと見なされる。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ手法はＨｅｐＧ２細胞において高いオリゴ捕捉頻度をもたらしたことから、この方法がこの細胞型に適切であることが指摘される。オンターゲットリードカウントは、４個中３個のガイドについて最低１０，０００個のオンターゲットリードという予め設定した基準を満たした。４個のリードｇＲＮＡ候補について少数のオフターゲット部位が同定された。真のオフターゲット部位の数（つまり、ＰＡＭを含有し、且つｇＲＮＡとの有意な相同性を有する）は、これらの４個のｇＲＮＡについて０〜６の範囲であった。Ｔ４ガイドは、本物のように見える２つのオフターゲット部位を呈した。シーケンシングリードカウントによって判断したときのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにおけるこれらのイベントの頻度は、オンターゲット切断頻度の２％及び０．６％であった。Ｔ１３及びＴ５ガイドは両方とも、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによっては、ｇＲＮＡとの相同性を有し、且つＰＡＭを含有するオフターゲット部位を呈しなかったため、従って試験した４個のガイドの中では最も望ましいオフターゲットプロファイルを有するように見える。ｇＲＮＡ Ｔ１１は、オンターゲットリードカウントの２３％である比較的高いリードカウントの１つのオフターゲット部位を呈したことから、このガイドが治療用途にはあまり魅力的でないことが示唆される。

【0615】

【表10】

【0616】

【表11】

【0617】

【表12】

【0618】

【表13】

【0619】

治療薬候補は、ヒトでの使用についてのその効力及び安全性を予測するため、非ヒト霊長類で判定されることが多い。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを使用した遺伝子編集の場合、ヒトで使用されることになる可能性のあるガイドを試験するためにヒト及び非ヒト霊長類の両方に同じ標的配列が存在すべきかは、ガイドＲＮＡの配列特異性に左右される。ヒトアルブミンイントロン１を標的とするガイドをインシリコでスクリーニングして、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）における対応するゲノム配列に一致するものを同定した（表４を参照のこと）。しかしながら、これらのガイドが非ヒト霊長類のゲノムを切断する能力及びそれらが予測されるオンターゲット部位で切断する相対効率が、関連性のある細胞システムで決定される必要がある。カニクイザル由来の初代ヘパトサイト（ＢｉｏＩＶＴ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹから入手した）に、上記に初代ヒトヘパトサイトに関して記載される同じ実験プロトコルを用いてアルブミンガイドＲＮＡ Ｔ４、Ｔ５、Ｔ１１又はＴ１３及びｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡをトランスフェクトした。次に上記に記載される同じＴＩＤＥＳプロトコルを用いて、但しカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）アルブミンイントロン１に特異的なＰＣＲプライマーを使用してインデル頻度を決定した。結果は図７に要約する。比較のため、ヒト初代ヘパトサイトにおけるガイドＲＮＡ Ｔ４の対応するデータを同じ図中に示す。４つのガイド全てが、２匹の異なる動物ドナー由来のカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）ヘパトサイトのアルブミンイントロン１における予想される部位での切断を１０％〜２５％の範囲の頻度で促進した。切断効率の順位はＴ５＞Ｔ４＞Ｔ１１＝Ｔ１３であった。これらの４個のガイド中ではＴ５ガイドＲＮＡが最も効力が高く、２匹のドナーにおける標的対立遺伝子の２０％及び２５％を切断した。切断効率はヒト細胞における対応するガイドよりも低かったが、これはトランスフェクション効率の差に起因し得る。或いは、これらのガイド及び／又はｓｐＣａｓ９酵素は霊長類細胞において固有に効力が低い可能性もある。それにも関わらず、これらの４個のガイドの中でＴ５が最も効力が高かったという知見は、ＧＵＩＤＥｓｅｑによるその有利なオフターゲットプロファイルと併せると、Ｔ５をＮＨＰ並びにヒトにおける試験に魅力的とするものである。

【0620】

実施例９：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるマウスアルブミンイントロン１へのＳＥＡＰレポーター遺伝子ドナーの標的組込みは、ＳＥＡＰの発現及び血中への分泌をもたらす
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９による配列特異的切断を用いて、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体によって作り出される二本鎖切断点への目的の遺伝子をコードするドナー鋳型配列の組込みを媒介する可能性を判定するため、本発明者らは、レポーター遺伝子マウス分泌型アルカリホスファターゼ（ｍＳＥＡＰ）をコードするドナー鋳型を設計し、構築した。ｍＳＥＡＰ遺伝子はマウスにおいて非免疫原性であり、タンパク質に対する免疫応答による妨げなしに、コードされるｍＳＥＡＰタンパク質の発現のモニタリングが可能である。加えて、ｍＳＥＡＰは、コード配列の５’末端に適切なシグナルペプチドが含まれるとき血中に容易に分泌され、そのタンパク質は、タンパク質の活性を測定するアッセイを用いて容易に検出可能である。ｓｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡ ｍＡＬｂＴ１（ｔｇｃｃａｇｔｔｃｃｃｇａｔｃｇｔｔａｃａｇｇ、配列番号８０）による切断を介したマウスアルブミンのイントロン１への標的組込みのため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）へのパッケージング用のｍＳＥＡＰコンストラクトを図８に示されるとおり設計した。シグナルペプチドが取り除かれたｍＳＥＡＰコード配列をマウスにコドン最適化し、その前に、内因性マウスアルブミンエクソン１までのスプライシング後に正しいリーディングフレームを維持するのに必要な２つの塩基対（ＴＧ）を置いた。コンセンサススプライスアクセプター配列及びポリピリミジントラクトからなるスプライスアクセプター（ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ、配列番号２）をコード配列の５’末端に付加し、ポリアデニル化シグナル（ｓＰＡ）をコード配列の３’末端に付加した（ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ、配列番号５）。ゲノム中に存在するｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡ（ＴＧＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＡＣＡＧＧ、配列番号８０）にとっての標的部位の逆相補体をこのカセットの両側に含めた。本発明者らは、ガイドＲＮＡの切断部位を加えることにより、ＡＡＶゲノムがインビボでその送達先の細胞の核内で切断され、それにより二本鎖切断点における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による組込みに最適な鋳型である線状ＤＮＡ断片が生じるはずであると仮定した。ＡＡＶカプシドへの効率的なパッケージングを可能にするため、ヒトマイクロサテライト配列に由来するスタッファー断片を加え、ＩＴＲを含めて４５９６ｂｐの総サイズを実現した。このドナーカセットが、Ｃａｓ９／ｍＡＬｂＴ１ガイドＲＮＡ複合体によって作り出されたアルブミンイントロン１の二本鎖切断点に順方向で組み込まれた場合、アルブミンプロモーターからの転写により、アルブミンエクソン１のスプライスドナーからコンセンサススプライスアクセプターまでのスプライシングを受け得る一次転写物が生じ、及びアルブミンエクソン１がインフレームでｍＳＥＡＰコード配列と融合している成熟ｍＲＮＡが生じるものと予測される。このｍＲＮＡの翻訳により、マウスアルブミンのシグナルペプチド（これはアルブミンエクソン１にコードされる）が前に付いたｍＳＥＡＰタンパク質が産生されることになる。シグナルペプチドは循環中へのｍＳＥＡＰの分泌を導き、分泌の過程で切断されて取り除かれ、成熟ｍＳＥＡＰタンパク質が残ることになる。マウスアルブミンエクソン１は、シグナルペプチド及びプロペプチドと、それに続く成熟アルブミンタンパク質のＮ末端をコードする７ｂｐ（Ｇｌｕ−Ａｌａ＋１ｂｐ（Ｃ）をコードする）をコードするため、プロペプチドの切断後、ＳＥＡＰタンパク質はＮ末端に３つの追加的なアミノ酸、即ちＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（Ｌｅｕは、組み込まれたＳＥＡＰ遺伝子カセットからのＴＧまでスプライシングされるアルブミンエクソン１の最後のＣ塩基によって生じる）を含むものと予測される。ロイシンは無電荷且つ非極性であり、従ってＳＥＡＰタンパク質の機能を妨げる可能性が低いため、本発明者らは、Ｎ末端に加えられる３つの追加的なアミノ酸の３番目としてロイシン（Ｌｅｕ）をコードするように選択した。ｐＣＢ００４７と称されるこのＳＥＡＰドナーカセットを、ＨＥＫ２９３ベースのトランスフェクションシステム及び標準的なウイルス精製方法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ）を用いてＡＡＶ８血清型カプシドにパッケージングした。ｍＳＥＡＰコード配列内に位置するプライマー及びプローブによる定量的ＰＣＲを用いてウイルスの力価を決定した。

【0621】

０日目、ｐＣＢ００４７ウイルスを２ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量でマウスの尾静脈に注射し、続いて４日後、ｍＡＬｂＴ１ガイドＲＮＡ（ガイドＲＮＡ配列

【化10】

、ＰＡＭに下線を付す、配列番号８０）とｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を注射した。シングルガイドＲＮＡは化学的に合成し、これは本質的に記載されるとおり（Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５ ３３（９）：９８５−９８９）化学修飾塩基を取り入れ、及び標準的なｔｒａｃｒＲＮＡ配列を使用した。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡは標準技法を用いて合成し、タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方に核局在化シグナルを付加するヌクレオチド配列を含めた。核局在化シグナルは、ｍＲＮＡがＬＮＰによって目的の細胞の細胞質に送達され、次にｓｐＣａｓ９タンパク質へと翻訳された後にｓｐＣａｓ９タンパク質を核へと導くために必要である。ＮＬＳ配列を使用した核へのＣａｓ９タンパク質の誘導は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ（ｅＬｉｆｅ ２０１３；２：ｅ００４７１．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１）を参照のこと。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡはまたポリＡテールも含み、これは安定性及び翻訳効率を向上させるため５’末端でキャッピングした。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡをＬＮＰにパッケージングするため、本発明者らは、本質的にＫａｕｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１５（１１）：７３００−６）により記載されるとおりのプロトコルを用いて、イオン化可能な脂質Ｃ１２−２００（ＡｘｏＬａｂｓから購入）をベースとしてＬＮＰをアセンブルした。ＬＮＰの他の成分は、ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、Ｓｉｇｍａから購入）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ、Ａｖａｎｔｉから購入）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＭＰＥ−ｍＰＥＧ２００、Ａｖａｎｔｉから購入）及びコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｒｏｌ）（Ａｖａｎｔｉから購入）である。ＬＮＰは、マイクロ流体チャンバ内で制御された条件下に脂質及び核酸成分が混合されるとＬＮＰが自己組織化するＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ機器（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して作製した。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとは別個のＬＮＰに封入した。ＬＮＰをリン酸緩衝生理食塩水への透析によって濃縮し、使用時まで最長で１週間、４℃で貯蔵した。ＬＮＰを動的光散乱を用いて特徴付け、典型的には５０〜６０ｎＭの範囲のサイズであった。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＬＮＰ中のＲＮＡ濃度を測定し、それを用いてマウスに与える用量を決定した。マウスへの投与のため、注射直前にｓｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡ ＬＮＰを１：１のＲＮＡ質量比で混合した。これらのＬＮＰがｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをマウスの肝臓に送達する能力は、ある範囲のＬＮＰ用量をマウスにＩＶ注射し、肝臓内のアルブミンイントロン１のオンターゲット部位におけるマウスゲノムの切断をＴＩＤＥＳ手順（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１４ Ｄｅｃ １６；４２（２２）：ｅ１６８）を用いて測定することにより実証された。典型的な結果に関しては実施例２（図４）を参照されたく、ここでは最大２５％の対立遺伝子がオンターゲット部位で切断された。

【0622】

５匹のマウスの２つのコホートに２ｅ１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ８−ＣＢ００４７ウイルスを尾静脈注射した。３日後、コホートのうちの一方に、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡとを封入するＬＮＰを２ｍｇ／ｋｇの全ＲＮＡ用量（１：１比のｓｐＣａｓ９及びｇＲＮＡ）で注射した。血液試料を毎週採取し、血漿を市販のキット（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を使用してＳＥＡＰ活性に関してアッセイした。結果（表１３を参照）は、ＡＡＶ８−ｐＣＢ００４７ウイルスのみの投与を受けたマウスではＳＥＡＰ活性は検出不能であったことを実証している。ＡＡＶ８−ｐＣＢ００４７ウイルスと、続いてＬＮＰの投与を受けたマウスは血漿中にＳＥＡＰ活性を有し、これは投与後４週間の最後の時点まで安定したままであった。マウスがＡＡＶ８ドナーＳＥＡＰ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集成分の両方の投与を受けたときに限りＳＥＡＰが発現したという知見は、ＳＥＡＰタンパク質が、アルブミンイントロン１の標的部位に組み込まれたＳＥＡＰ遺伝子のコピーから発現していたことを示唆している。ｐＣＢ０４７のＳＥＡＰ遺伝子はシグナルペプチド又はプロモーターを欠いているため、ＳＥＡＰコード配列とインフレームであるプロモーター及びシグナルペプチドに作動可能に連結されない限り、その発現及び分泌はあり得ない。ｐＣＢ０４７遺伝子カセットがゲノムのランダムな部位に組み込まれたならば、これが起こったであろう可能性は低い。

【0623】

ｐＣＢ００４７からのＳＥＡＰ遺伝子カセットがアルブミンのイントロン１に組み込まれたことを確認するため、本発明者らは試験終了時にマウスの肝臓から抽出したゲノムＤＮＡにおいてドロップレットデジタルＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）を用いて組込み頻度を測定した。ＤＤ−ＰＣＲは、複雑な混合物中の核酸配列のコピー数を正確に定量化する方法である。一方がマウスアルブミンゲノム配列中のｍＡｌｂＴ１ガイドにとっての標的部位（予測される標的組込み部位）の５’側に位置し、他方のプライマーがｐＣＢ００４７においてＳＥＡＰ遺伝子の５’末端に位置する一対のＰＣＲプライマーを設計した。この「インアウト」ＰＣＲは、ＳＥＡＰカセットが所望の順方向で組み込まれると、マウスアルブミンゲノム配列と組み込まれたＳＥＡＰカセットとの間の接合部を増幅することになる。これらの２つのプライマーによって増幅されたＤＮＡ配列にハイブリダイズする蛍光プローブを設計した。ＤＤ−ＰＣＲアッセイの内部対照として、マウスアルブミン遺伝子を検出するプライマープローブセットを使用した。このＤＤ−ＰＣＲアッセイを使用して本発明者らが標的組込み頻度を測定したところ０．２４±０．０７％（１００コピーのアルブミン遺伝子当たり０．２４コピー）となり、それによりＳＥＡＰカセットがアルブミンイントロン１に組み込まれたことが確認された。

【0624】

【表14】

【0625】

実施例１０：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるマウスアルブミンイントロン１へのヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ドナーの標的組込みは、血中でのＦＶＩＩＩの発現をもたらす
血友病Ａは、広く研究されている疾患であり（Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｌｏｏｄ Ｍｅｄ．２０１０；１：１８３−１９５）、患者が第ＶＩＩＩ因子遺伝子に突然変異を有するため、その血中の機能性第ＶＩＩＩ因子タンパク質レベルが低くなるものである。第ＶＩＩＩ因子は凝固カスケードの決定的に重要な成分であり、十分な量のＦＶＩＩＩがないと、血液は傷害部位で安定した凝血塊を形成することができず、過度の出血が生じることになる。有効に治療されていない血友病Ａ患者は関節に出血を起こし、関節が破壊されることになる。頭蓋内出血が起こることもあり、時に致命的であり得る。

【0626】

この遺伝子編集戦略を血友病Ａの治療に用いることができるかどうかを判定するため、本発明者らは、マウスＦＶＩＩＩ遺伝子が不活性化されているマウスモデルを使用した。こうした血友病Ａマウスはその血中のＦＶＩＩＩが検出不能であり、そのため外因的に供給されたＦＶＩＩＩをＦＶＩＩＩ活性アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＦＶＩＩＩ、カタログ番号Ｋ８２４０８６ｋｉｔ）を用いて測定することが可能である。このアッセイの標準として、本発明者らは、血友病患者の治療に用いられる組換えヒトＦＶＩＩＩであるコージネイト（Ｋｏｇｅｎａｔｅ）（Ｂａｙｅｒ）を使用した。アッセイの結果は、１ＩＵ／ｍｌとして定義される正常ヒトＦＶＩＩＩ活性に対する割合として報告する。強力な肝臓特異的プロモーターの制御下でＡＡＶベクターによってマウスに送達したとき機能することが示されているＢ−ドメイン欠失型ＦＶＩＩＩコード配列をベースとしてヒトＦＶＩＩＩドナー鋳型を構築した（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｂｌｏｏｄ；１２１（１７）：３３３５−３３４４）。天然シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列をこのＦＶＩＩＩコード配列から除去し、マウスアルブミンエクソン１までのスプライシング後に正しいリーディングフレームを維持するために必要な２塩基対（ＴＧ）に置き換えた。このＦＶＩＩＩコード配列の直ちに５’側に、マウスアルブミンイントロン１に由来するスプライスアクセプター配列を挿入した。ＦＶＩＩＩコード配列の３’側に、ヒトグロビン遺伝子からの３’非翻訳配列と、続く合成ポリアデニル化シグナル配列を挿入した。合成ポリアデニル化シグナルは、ポリアデニル化を有効に導くことが示されている短い４９ｂｐ配列である（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ，１９８９；ＧＥＮＥＳ ＆ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ３：１０１９−１０２５）。３’ＵＴＲ配列はＢ−グロビン遺伝子から取ったもので、これはポリアデニル化効率を更に向上させる働きをし得る。このＦＶＩＩＩ遺伝子カセットの両側（ｅｉｔｈｅｒ ｓｉｔｅ）にｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡにとっての標的部位の逆相補体を置いて、図９に示されるとおりのＡＡＶ２のＩＴＲ配列を含有するｐＣＢ０５６と呼ばれるベクターを作成した。このプラスミドをＡＡＶ８カプシドにパッケージングしてＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６ウイルスを作成した。

【0627】

５匹の血友病Ａマウスのコホート（群２；Ｇ２）にＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６ウイルスを１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で尾静脈注射し、１９日後、同じマウスに、各々１ｍｇ ＲＮＡ／ｋｇの用量の、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡｌｂＴ１ガイドＲＮＡとを封入する２つのＣ１２−２００ベースのＬＮＰの混合物を尾静脈注射した。ＬＮＰは、上記の実施例２に記載されるとおり製剤化した。５匹の血友病Ａマウスの別のコホート（群６；Ｇ６）にＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６ウイルスを１ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で尾静脈注射し、続く４週間にわたってＦＶＩＩＩ活性をモニタした。ＡＡＶのみを注射したとき、マウスの血中のＦＶＩＩＩ活性は測定不能であった（図９のＧ６）。ＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６ウイルスと、続いてＬＮＰ中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分の投与を受けたマウスは、その血中に正常ヒトＦＶＩＩＩ活性レベルの２５％〜６０％の範囲のＦＶＩＩＩ活性を有した。重症血友病患者はＦＶＩＩＩ活性レベルが正常値の１％未満であり、中等症血友病Ａ患者はＦＶＩＩＩレベルが正常値の１〜５％であり、軽症患者はレベルが正常値の６％〜３０％である。ＦＶＩＩＩ補充タンパク質療法を受けている血友病Ａ患者の分析では、３％、５％、１０％、１５％及び２０％の予想ＦＶＩＩＩトラフ濃度で、出血が起こらなかった頻度がそれぞれ７１％、７９％、９１％、９７％、及び１００％であったことが報告されており（Ｓｐｏｔｔｓ ｅｔ ａｌ Ｂｌｏｏｄ ２０１４ １２４：６８９）、１５〜２０％の最低レベルを上回るＦＶＩＩＩレベルが維持されると、出血イベント率がゼロ近くまで低下したことが示唆される。血友病Ａの治癒に必要な正確なＦＶＩＩＩレベルは定義されておらず、恐らく患者毎に異なるが、５％〜３０％のレベルが、出血イベントの有意な減少をもたらすものと見込まれる。従って、上記に記載される血友病Ａマウスモデルでは、実現したＦＶＩＩＩレベル（２５〜６０％）は、治癒的であると予想される治療上意味のある範囲である。

【0628】

図１０の５匹中４匹のマウスが、３６日目の試験終了時まで安定したＦＶＩＩＩレベル（アッセイの通常のばらつき及びマウス生理学の変動の範囲内）を呈した。マウスのうちの１匹（２−３）のＦＶＩＩＩ活性は、３６日目に検出不能レベルに下がったが、これは恐らくは、マウスにおいて外来性タンパク質と認識され得るヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対する免疫応答に起因した（Ｍｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ，２０１２ Ｂｌｏｏｄ １２０（１２）：２５１２−２５２０）。ＡＡＶ−ＦＶＩＩＩドナー鋳型のみが注射されたときにはマウスにおいてＦＶＩＩＩタンパク質が発現しなかったという観察は、ＦＶＩＩＩの発現にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分の提供が必要であったことを実証している。ＦＶＩＩＩドナーカセットはプロモーター又はシグナルペプチドを有しないため、ゲノムのランダムな部位へのカセットの組込み又は他の何らかの定義されていない機構によってＦＶＩＩＩが作られた可能性は低い。ＦＶＩＩＩドナーカセットがアルブミンのイントロン１に組み込まれたことを確認するため、本発明者らはＤＤ−ＰＣＲフォーマットでインアウトＰＣＲを用いた。群２のマウスの全肝をホモジナイズし、ゲノムＤＮＡを抽出し、マウスアルブミン遺伝子においてオンターゲット組込みが起こったと予測されるｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡにとっての切断部位の５’側の位置に置いた１つのプライマーを使用するＤＤ−ＰＣＲによりアッセイした。第２のＰＣＲプライマーは、ｐＣＢ０５６カセット内でＦＶＩＩＩコード配列の５’末端に置いた。検出に使用した蛍光プローブは、２つのＰＣＲプライマー間の配列にハイブリダイズするように設計した。これらの２つのプライマーを使用したＰＣＲは、ＦＶＩＩＩカセットがｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ切断部位に順方向で組み込まれてＦＶＩＩＩタンパク質の発現能を得るであろう組込みイベントの５’側接合部を増幅することになる。マウスアルブミン遺伝子内の領域に対するＤＤ−ＰＣＲアッセイを対照として用いて、アッセイにおけるマウスゲノムのコピー数を測定した。このアッセイは、１００個のハプロイドマウスゲノム当たり０．４６〜１．２８（平均１．０）の標的組込みイベントを検出した。標的組込み頻度とピークＦＶＩＩＩレベルとの間には相関があり、組み込まれたＦＶＩＩＩ遺伝子カセットからＦＶＩＩＩが産生されることと整合した。マウス肝の細胞の約７０％がヘパトサイトであり、ＡＡＶ８及びＬＮＰの両方が主にヘパトサイトによって取り込まれると仮定すると、１．４％（１．０×（１／０．７））のヘパトサイトアルブミン対立遺伝子が、順方向で組み込まれたＦＶＩＩＩカセットを含んだと推定することができる。これらの結果は、ＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、適切に設計されたＦＶＩＩＩ遺伝子カセットをマウスのアルブミンイントロン１に組み込み、治療レベルの機能性ＦＶＩＩＩタンパク質の発現及び分泌を血中にもたらし得ることを実証している。この試験に用いた送達モダリティ、即ち、ＦＶＩＩＩドナー鋳型を送達するＡＡＶウイルス及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を送達するＬＮＰは、潜在的に患者へのインビボ送達に適している。Ｃａｓ９は、インビボで短命（１〜３日の範囲）のｍＲＮＡとして送達されたため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体は短期間しか活性でないことになり、これによりオフターゲット切断イベントが起こる時間が制限され、従って予測される安全上の利益が付与される。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が活性であったのは短期間に過ぎなかったが、それがマウスにおいて治療的に意味のあるレベルのＦＶＩＩＩ活性を生じさせるのに十分な頻度で標的組込みを誘導するのに十分であったことを実証している。

【0629】

【表15】

【0630】

実施例１１：ＡＡＶドナーに対するＬＮＰでのガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの投与タイミングは遺伝子発現レベルに影響を与える
ＡＡＶドナー鋳型の注射とＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを封入するＬＮＰの投与との間の時間が、ドナー鋳型にコードされた遺伝子の発現レベルに影響を及ぼしたかどうかを判定するため、本発明者らは各５匹のマウスの２つのコホートに、ｍＳＥＡＰをコードするＡＡＶ８−ｐＣＢ００４７を注射した。ＡＡＶを注射した４日後、一方のマウスコホート（群３）に、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）を封入するＣ１２−２００ベースのＬＮＰを注射し、血漿中のＳＥＡＰ活性を次の４週間にわたって毎週測定した。第２のマウスコホートにおいてＳＥＡＰ活性を４週間モニタし、その間、ＳＥＡＰは検出されなかった。ＡＡＶを注射した後２８日の時点で群４のマウスに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）を封入するＣ１２−２００ベースのＬＮＰを投与し、血漿中のＳＥＡＰ活性を次の３週間にわたって毎週測定した。ＳＥＡＰデータを表１５に要約する。ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡをＡＡＶの４日後に投与された群３では、ＳＥＡＰ活性は平均して３３０６μＵ／ｍｌであった。ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡをＡＡＶの２８日後に投与された群４では、ＳＥＡＰ活性は平均して、群３の４倍の高さである１３３８９μＵ／ｍｌであった。これらのデータから、ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡをＬＮＰの２８日後に投与すると、ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９／ｇＲＮＡがＡＡＶ−ドナー鋳型の僅か４日後に投与される場合と比べてゲノムに組み込まれた遺伝子からの発現が４倍に高くなることが実証された。この発現の向上は、完全長ドナーがコードされる遺伝子カセットがアルブミンイントロン１に組み込まれる頻度がより高いことに起因する可能性が高い。

【0631】

【表16】

【0632】

また、治療的に意味のある遺伝子の例として第ＶＩＩＩ因子遺伝子を使用して、ＡＡＶ−ドナー及びＬＮＰに封入されたＣａｓ９／ｇＲＮＡの投与タイミングの影響を判定した。０日目、血友病Ａマウスの２つのコホートに、ヒトＦＶＩＩＩドナーカセットをコードするＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６を２ｅ１２ｖｇ／ｋｇの用量で注射した。４日後、一方のコホートに、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）を封入するＣ１２−２００ベースのＬＮＰを注射し、一方、第２のコホートには１７日後にｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡ（各１ｍｇ／ｋｇ）を封入するＣ１２−２００ベースのＬＮＰを注射した。ＡＡＶ８−ｐＣＢ０５６の投与の時間をずらすことにより、ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを封入するＬＮＰについて両群とも同じバッチが同じ日に用いられるようにした。ＬＮＰを投与した後１０日目及び１７日目にマウスの血中のＦＶＩＩＩ活性を測定した。結果は図１１に示す。ＡＡＶの４日後にＬＮＰの投与を受けたマウスは、その血中のＦＶＩＩＩが検出不能であった一方、ＡＡＶの１７日後にＬＮＰを注射した群では、４匹全てのマウスが検出可能なＦＶＩＩＩ活性を有し、１７日目に正常値の２％〜３０％の範囲であった。これらの結果は、ＦＶＩＩＩをコードするＡＡＶドナーについて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分をＡＡＶドナーの少なくとも１７日後に投与すると、治療的に意味のあるレベルのＦＶＩＩＩが生じる一方、ＡＡＶの４日後に投与してもＦＶＩＩＩ発現には至らなかったことを実証している。

【0633】

肝臓の細胞を含め、細胞にＡＡＶが感染する過程には、エンドソームからのエスケープ、ウイルスの脱外被及びＡＡＶゲノムの核内輸送が関わる。一本鎖ゲノムがウイルスにパッケージングされているこれらの試験で使用されるＡＡＶの場合、一本鎖ゲノムは第２鎖ＤＮＡ合成のプロセスを受けて二本鎖ＤＮＡゲノムを形成する。一本鎖ゲノムから二本鎖ゲノムへの完全な変換に必要な時間については十分に確立されていないが、それは律速段階であると考えられている（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ １９９６；Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７０：３２２７−３２３４）。二本鎖線状ゲノムは次にはコンカテマー化して、単量体が頭−尾結合及び尾−頭結合でつなぎ合わされて構成される多量体環状形態になる（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ ２０１０；Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１：７５０−７６２）。本発明者らの試験で使用されるＡＡＶドナー鋳型は相同性アームを含まないため、ＨＤＲの鋳型にはならず、従ってＮＥＨＪ経路による組込みのみが可能である。二本鎖切断点におけるＮＨＥＪ媒介性組込みの鋳型となるのは、二本鎖線状ＤＮＡ断片のみである。従って、本発明者らは、ＡＡＶドナー後すぐにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９成分を肝細胞に送達すると、大多数のＡＡＶゲノムが一本鎖形態であり、そうした状況下ではゲノム中の二本鎖切断点のほとんどが、ドナー鋳型の組込みのない、少数の挿入及び欠失で修復されることになるため、低い組込み頻度につながる可能性があると仮定する。ＡＡＶ−ドナー鋳型の後、時間が経ってからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分を送達することにより、ＮＨＥＪ媒介性標的組込みの鋳型である二本鎖ＡＡＶゲノムが形成できる時間が与えられる。しかしながら、ＡＡＶドナーが送達された後に長く待ち過ぎると、二本鎖線状形態から、ＮＨＥＪ媒介性標的組込みの鋳型とはならない環状（コンカテマー状）形態への変換が起こり得る。ドナー鋳型にガイドＲＮＡ／Ｃａｓ９の切断部位を含めると、環状形態が切断されて線状形態が生じることになる。任意の残りの線状形態もまた、切断されて、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む短い断片を放出することになる。ＡＡＶドナー鋳型に１又は２つのいずれかのガイドＲＮＡ切断部位を含めると、コンカテマー形態のＡＡＶゲノムから種々の線状断片が生じることになる。線状断片のタイプは、ＡＡＶゲノム中の切断部位の数及び各コンカテマー中の多量体の数並びにその相対的な向きに応じて異なることになり、従って予測することは困難である。ＡＡＶ中のカセットの５’末端に置かれた単一のｇＲＮＡ部位は、単量体環及び頭−尾結合型コンカテマー（頭−尾結合型とは、一つのＡＡＶゲノムの５’末端が次のＡＡＶゲノムの３’末端につなぎ合わされていることを意味する）の両方から単量体二本鎖鋳型を遊離させるであろう。しかしながら、５’末端の単一のｇＲＮＡ部位は、頭−頭結合型コンカテマー（頭−頭結合型コンカテマーは、一つのＡＡＶゲノムの５’末端が次のＡＡＶゲノムの５’末端につなぎ合わされたものからなる）からは単量体二本鎖線状鋳型を遊離させないであろう。５’末端に単一のｇＲＮＡ部位を使用することの可能な利点は、それが頭−尾結合型コンカテマーからではなく、頭−頭結合型コンカテマーからは短いＩＴＲ含有二本鎖断片を遊離させるのみであることである。ＡＡＶゲノムの５’末端に単一のｇＲＮＡ切断部位があるとき、ＩＴＲは線状単量体遺伝子カセットの３’末端に残ることになり、従ってゲノムに組み込まれることになる。ＡＡＶ中のドナーカセットが２つのｇＲＮＡ部位（カセットに隣接する）を含むとき、これによってあらゆる形態の二本鎖ＤＮＡから単量体二本鎖鋳型が遊離することになり、従って、特に頭−尾結合型及び尾−頭結合型コンカテマーの混合物が存在する場合、標的組込みのためにより多くの鋳型が放たれ得る。カセットに隣接する２つのｇＲＮＡ標的部位を含むことの可能性のある欠点は、それによりＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む小さい（約１５０塩基対）二本鎖線状断片が遊離するであろうことである。目的の治療用遺伝子を含む遺伝子カセットの各コピーにつき、これらの小さい（約１５０塩基対）断片の２つが生じることになる。この短いＩＴＲ含有断片もまた、ゲノム中の二本鎖切断点におけるＮＨＥＪ媒介性標的組込みの鋳型になると思われ、従ってゲノム中の二本鎖切断点における組込みに関して、遺伝子カセットを含有する断片と競合し、それにより宿主細胞のゲノムへの治療用遺伝子カセットの所望の組込みイベントが起こる頻度が低下することになる。コンカテマー形成の動態及びコンカテマーの分子組成（頭−尾結合型及び尾−頭結合型コンカテマーの含有量並びにコンカテマー中の単量体単位の数）などの多くのパラメータが不明であるこの生体システムの複雑さを所与とすれば、ドナーカセット中の０、１又は２個のうちいずれのガイド切断部位が、治療用遺伝子を含有する所望のドナーカセットの最も高率の標的組込みを実現するか、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分の送達タイミングによってこれがどのように達成されるかについて、何らかの確実性をもって予測することは不可能である。本発明者らのデータは、ＡＡＶ−ドナーカセットの４日後にＬＮＰが投与されたときではなく、ＡＡＶ−ドナーカセットが投与された少なくとも１７日後に投与されるｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとガイドＲＮＡとを封入するＬＮＰによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分が送達されるセッティングで、２個のガイドＲＮＡ切断部位を含めると測定可能な標的組込みにつながることを裏付けている。

【0634】

実施例１２：異なるポリアデニル化シグナルがＦＶＩＩＩ発現に及ぼす影響
異なるポリアデニル化シグナル配列がマウスアルブミンイントロン１への標的組込み後のＦＶＩＩＩ遺伝子の発現に及ぼす影響を判定するため、本発明者らは、図１２に示す一連のプラスミドを構築した。これらのプラスミドは、ｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡにとっての単一の標的部位を５’末端に有し、それがハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）を用いたマウスへの送達後にインビボで環状プラスミドＤＮＡの線状化をもたらすことになるものとして設計した。ＨＤＩは、マウスの肝臓にプラスミドＤＮＡを送達するための確立された技法であり（Ｂｕｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９６；Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３，５９３−５９８）、生理食塩水中のネイキッドプラスミドＤＮＡがマウスの尾静脈に急速注入される（２〜３ｍｌ容積を５〜７秒）。

【0635】

６匹の血友病Ａマウスのコホートにマウス１匹当たり２５μｇのｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６又はｐＣＢ０７７をハイドロダイナミックインジェクションした。２４時間後、マウスにｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡとを封入するＣ１２−２００ ＬＮＰを１ｍｇ／ｋｇの各ＲＮＡ用量で後眼窩注射によって投与した。ＬＮＰ投与後１０日目にマウスの血中のＦＶＩＩＩ活性を測定した。１０日目、マウスを犠牲にし、全肝をホモジナイズし、ホモジネートからゲノムＤＮＡを抽出した。アルブミンイントロン１への順方向でのＦＶＩＩＩドナーカセットの標的組込み頻度を定量的リアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。このリアルタイムＰＣＲアッセイでは、１つのプライマーが、マウスアルブミン遺伝子のゲノム配列中における予想組込み部位（ｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡにとっての切断部位）の５’側に置かれ、第２のＰＣＲプライマーが、ドナープラスミドのＦＶＩＩＩコード配列の５’末端に置かれた。これらの２つのプライマー間に蛍光プローブが置かれた。このアッセイは、組込みが順方向で起こったとき（ここではＦＶＩＩＩ遺伝子がゲノムマウスアルブミン遺伝子と同じ向きである）、マウスゲノムとドナーカセットとの間の接合部を特異的に検出することになる。ナイーブマウス肝臓ゲノムＤＮＡにスパイクされた接合部断片予想配列で構成される合成ＤＮＡ断片をコピー数標準として使用して、肝臓ゲノムＤＮＡにおける組込みイベントの絶対コピーを計算した。群２（ｐＣＢ０６５を注射）、群３（ｐＣＢ０７６を注射）及び群４（ｐＣＢ０７７を注射）のマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性は、それぞれ、５．５％、４．２％及び１１．４％であった。ｐＣＢ０７７を注射した群４が最も高いＦＶＩＩＩ活性を有した。ハイドロダイナミックインジェクションによる肝臓へのＤＮＡの送達はマウス間で高度にばらつきがあるため、本発明者らは、図１３に示されるとおり各個別のマウスについてＦＶＩＩＩ活性を標的組込み頻度で除したものを計算した。この比は、組み込まれたＦＶＩＩＩ遺伝子コピー当たりのＦＶＩＩＩ発現に相当し、ｐＣＢ０６５及びｐＣＢ０７６と比較してｐＣＢ０７７（群４）からの優れた発現が実証された。本発明者らが、いかなるＦＶＩＩＩも発現しなかったマウスを除外したとき、平均ＦＶＩＩＩ／ＴＩ比は、ｐＣＢ０６５、ｐＣＢ０７６及びｐＣＢ０７７についてそれぞれ４２、８及び５７であった。これらのデータは、ｐＣＢ０７７のａＰＡ＋ポリアデニル化シグナルが、ｐＣＢ０７６のｓＰＡポリアデニル化シグナルと比較したとき優れたＦＶＩＩＩ発現を可能にすることを示している。ｓＰＡ＋ポリアデニル化シグナルを使用したＦＶＩＩＩの発現は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナルを使用した発現と同様であった。ｓＰＡ（４９ｂｐ）又はｓＰＡ＋（５４ｂｐ）などの短いポリアデニル化シグナル配列の使用には、ｂＧＨポリＡ（２２５ｂｐ）と比較したとき、特に４．３ＫｂサイズでＡＡＶのパッケージング限界（ＩＴＲを除いて４．４Ｋｂ）に近いＦＶＩＩＩ遺伝子の場合、ＡＡＶウイルスを使用したドナーの送達時に利点がある。ｓＰＡ＋ポリアデニル化シグナルはｓＰＡポリアデニル化シグナルと比べて、ＦＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンと合成ポリアデニル化シグナル配列（ａａｔａａａａｇａｔｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｔａｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇ、配列番号５）との間に５ｂｐスペーサー（ｔｃｇｃｇ、配列番号２１２）が存在することだけが異なる。この合成ポリアデニル化シグナル配列については以前記載されており（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ，１９８９；Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（７）：１０１９−２５）、他の研究者らによってＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターに使用されているが（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｂｌｏｏｄ １２１：３３３５−３３４４）、スペーサー配列を含める利益が明示的に実証されたことはない。本発明者らのデータは、５ｂｐの短いスペーサーを含めることにより、アルブミンイントロン１に組み込まれたＦＶＩＩＩ遺伝子の発現が向上したことを実証しており、ここで転写はゲノム中の強力なアルブミンプロモーターからドライブされた。このスペーサーの利点は、ゲノム中の高発現遺伝子座への標的組込みセッティングにユニークである可能性がある。

【0636】

実施例１３：ＬＮＰを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を反復投与すると、マウスアルブミンイントロン１を標的とするＡＡＶ送達ドナーカセットの発現が漸進的に増加する
治療用遺伝子がアルブミンのイントロン１に組み込まれる遺伝子編集ベースの遺伝子療法を患者に投与するセッティングでは、患者に最適な治療利益をもたらす遺伝子発現レベルを実現することが有利であり得る。例えば、血友病Ａでは、血中の最も望ましいＦＶＩＩＩタンパク質レベルは２０％〜１００％又は３０％〜１００％又は４０％〜１００％又は最も好ましくは５０％〜１００％の範囲であり得る。１００％を超えるＦＶＩＩＩレベルは血栓イベントリスクが増加し（Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，２０１２；Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１５７：６５３−６３）、従って望ましくない。強力なプロモーターを使用してＡＡＶゲノムのエピソームコピーからの治療用遺伝子の発現をドライブする標準的なＡＡＶベースの遺伝子療法は、ＡＡＶウイルスを１回しか投与できず、実現する発現レベルが患者間で大きく異なるため（Ｒａｎｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ，２０１７；Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：２５１９−２５３０）、実現する発現レベルのいかなる制御も不可能である。患者にＡＡＶウイルスが投与された後、患者はウイルスカプシドタンパク質に対する高力価抗体を産生し、前臨床モデルに基づけば、これはウイルスの有効な再投与の妨げとなることが予想される（Ｐｅｔｒｙ ｅｔ ａｌ，２００８； Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：５４−６０）。ＡＡＶウイルスによって送達される治療用遺伝子が、アルブミンイントロン１など、セーフハーバー遺伝子座のゲノムに組み込まれ、及びこの標的組込みがゲノムにおける二本鎖切断の作成を介して起こる手法は、標的組込みレベル、ひいては治療用遺伝子産物レベルを制御する機会を提供する。目的の治療用遺伝子をコードするドナーＤＮＡカセットを含有するＡＡＶゲノムを封入するＡＡＶによって肝臓が形質導入された後、ＡＡＶゲノムは形質導入細胞の核内にエピソームとして維持されることになる。このようなエピソーム性ＡＡＶゲノムは、時間が経っても比較的安定しており、従ってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって作り出される二本鎖切断点における標的組込み用のドナー鋳型のプールを提供する。非免疫原性ＬＮＰで送達される反復用量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を用いて、ＡＡＶ送達ドナー鋳型にコードされたタンパク質の発現の段階的増加を誘導する可能性について、ＡＡＶ８−ｐＣＢ００４７並びにＣ１２−２００ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡを使用して判定した。５匹のマウスのコホートにＡＡＶ８−ｐＣＢ００４７を２ｅ１２ｖｇ／ｋｇで尾静脈注射し、４日後、１ｍｇ／ｋｇのｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡと１ｍｇ／ｋｇのｍＡｌｂＴ１ ｇＲＮＡとを封入するＣ１２−２００ベースのＬＮＰを静脈内注射した。血中のＳＥＡＰレベルを次の４週間にわたって毎週測定し、平均すると３３０６μＵ／ｍｌとなった（表１６）。４週目の最後のＳＥＡＰ測定後、同じマウスに、各１ｍｇ／ｋｇのｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡとを封入するＣ１２−２００ ＬＮＰを再投与した。血中のＳＥＡＰレベルを次の３週間にわたって毎週測定し、平均すると６９００μＵ／ｍｌとなり、これは初回ＬＮＰ用量後の週平均レベルの２倍の高さであった。次に同じ５匹のマウスに、各１ｍｇ／ｋｇのｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡとｍＡＬｂＴ１ ｇＲＮＡとを封入したＣ１２−２００ ＬＮＰの３回目の注射を与えた。血中のＳＥＡＰレベルを次の４週間にわたって毎週測定し、平均すると１３１１７μＵ／ｍｌとなり、これは２回目のＬＮＰ用量後の週平均レベルの２倍の高さであった。これらのデータは、ＬＮＰに封入されたｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分の反復投与により、ＡＡＶ送達ドナー鋳型からの遺伝子発現の段階的な増加が生じ得ることを実証している。ドナー鋳型にコードされるＳＥＡＰ遺伝子が発現に関してプロモーター及びシグナルペプチド配列との共有結合に依存するという事実は、発現の増加がアルブミンイントロン１への標的組込みの増加に起因することを強力に示唆している。１２週目、マウスを犠牲にし、全肝をホモジナイズし、ゲノムＤＮＡを抽出し、順方向の（この向きが機能性ＳＥＡＰタンパク質の産生に必要である）予測される５’接合部に隣接するプライマーによるＤＤ−ＰＣＲを用いてアルブミンイントロン１における標的組込みに関してアッセイした。組込み頻度は平均して０．３％（１００個のアルブミン対立遺伝子当たり０．３コピー）であった。

【0637】

【表17】

【0638】

実施例１４：ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される初代ヒトヘパトサイトのアルブミンイントロン１へのＦＶＩＩＩ又はＳＥＡＰドナーの標的組込みは、ＦＶＩＩＩ又はＳＥＡＰの発現をもたらす
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断によって媒介されるアルブミンイントロン１への遺伝子カセットの標的組込みという概念が、ヒトゲノムに特異的なガイドＲＮＡを使用してヒト細胞においてもまた機能することを実証するため、本発明者らは初代ヒトヘパトサイトで実験を実施した。初代ヒトヘパトサイトは、その正常表現型を維持するため最小限のインビトロ操作しか受けていないヒトドナーの肝臓から採取されたヒトヘパトサイトである。図１４に示されるとおり２つのドナー鋳型を構築し、インビトロでのヘパトサイトの形質導入に特に有効なＡＡＶ−ＤＪ血清型（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ，２００８；Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１）にパッケージングした。関連性のある遺伝子（ＦＶＩＩＩ又はｍＳＥＡＰ）のコード配列内に位置するプライマー及びプローブを使用した定量的ＰＣＲによってＡＡＶ−ＤＪウイルスを力価測定し、ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍｌとして表される力価が得られた。

【0639】

初代ヒトヘパトサイト（ＢｉｏＩＶＴ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹから入手した）を解凍し、ヘパトサイト回収培地（ＣＨＲＭ）（Ｇｉｂｃｏ）に移し、低速でペレット化し、次にＩＶ型コラーゲンを予めコートした２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内のＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ（商標）ＣＰ培地（ＢｉｏＩＶＴ）＋Ｔｏｒｐｅｄｏ（商標）抗生物質ミックス（ＢｉｏＩＶＴ）中に０．７×１０^６細胞／ｍｌの密度でプレーティングした。プレートを５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。細胞が接着した後（プレーティングの３〜４時間後）、プレートに接着しなかった死細胞を洗い流し、細胞に新鮮な温完全培地を加えた。ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋで作製された）とｈＡｌｂ Ｔ４ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ Ｃｏｒｐ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡで作製された）との脂質ベースのトランスフェクション混合物を、これらのＲＮＡをＯｐｔｉＭｅｍ培地（Ｇｉｂｃｏ）に０．０２ｕｇ／ｕｌ ｍＲＮＡ及び０．２ｕＭガイドの最終濃度で加えることにより調製した。これに、Ｏｐｔｉｍｅｍに３０倍希釈した等容積のリポフェクタミンを加え、室温で２０分間インキュベートした。ＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７又はＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６のいずれかを関連性のあるウェルに１細胞当たり１，０００ＧＣ〜１細胞当たり１００，０００ＧＣの範囲の様々な感染多重度で加え、続いて直ちに（５分以内に）ｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ脂質トランスフェクション混合物を加えた。次にプレートを５％ＣＯ_２、３７℃で７２時間インキュベートし、その後、培地を回収し、発色アッセイ（Ｄｉａｐｈａｒｍａ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ ＳＰ Ｆａｃｔｏｒ ＦＶＩＩＩ、カタログ番号Ｋ８２４０８６ｋｉｔ）を用いたＦＶＩＩＩ活性のアッセイ又は市販のキット（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いたＳＥＡＰ活性のアッセイのいずれかを行った。結果は図１５及び図１６に要約する。細胞にｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ単独又はＳＥＡＰウイルス単独又はＦＶＩＩＩウイルス単独をトランスフェクトした対照は、細胞におけるバックグラウンド活性に相当する低いレベルのＳＥＡＰ活性であった。ＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７ウイルス及びＣａｓ９ ｍＲＮＡ／ｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡの両方をトランスフェクトしたとき、より高い５０，０００及び１００，０００のＭＯＩでＳＥＡＰ活性はバックグラウンドレベルを有意に上回った。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分と、同じｇＲＮＡにとっての切断部位を含有するＡＡＶ送達ドナーとの組み合わせが、ドナーにコードされるトランス遺伝子の発現をもたらし得ることを示している。ＡＡＶドナーにコードされるＳＥＡＰ遺伝子はプロモーター又はシグナルペプチドを欠いているため、及びＳＥＡＰ発現には遺伝子編集成分が必要であったため、ＳＥＡＰは、ヒトアルブミンイントロン１に組み込まれたドナーのコピーから発現した可能性が高い。インアウトＰＣＲは、ヒトアルブミンのイントロン１へのＳＥＡＰドナーの組込みの確認に用いることのできる方法である。

【0640】

細胞に１００，０００ＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１０７又はＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６ウイルス単独のいずれか（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ又はｇＲＮＡなし）をトランスフェクトした対照は、７２時間の時点で培地中において低い又は検出不能なレベルのＦＶＩＩＩ活性を呈した（図１６）。様々なＭＯＩのＡＡＶ−ＤＪ−ｐＣＢ０１５６ウイルスをｓｐＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｈＡｌｂＴ４ ｇＲＮＡと共にトランスフェクトした細胞は、７２時間の時点で培地中において測定可能なレベルのＦＶＩＩＩ活性を有し、０．２〜０．６ｍＩＵ／ｍｌの範囲であった。これらのデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集成分と、同じｇＲＮＡにとっての切断部位を含有するＡＡＶ送達ドナーとの組み合わせが、ドナーにコードされたＦＶＩＩＩトランス遺伝子の発現をもたらし得ることを示している。ＡＡＶドナーにコードされるＦＶＩＩＩ遺伝子はプロモーター又はシグナルペプチドを欠いているため、及びＦＶＩＩＩ発現には遺伝子編集成分が必要であったため、ＦＶＩＩＩは、ヒトアルブミンイントロン１に組み込まれたドナーのコピーから発現した可能性が高い。インアウトＰＣＲは、ヒトアルブミンのイントロン１へのＦＶＩＩＩドナーの組込みの確認に用いることのできる方法である。

【0641】

本開示は、幾つかの記載される実施形態に関連してかなり長く且つかなり詳しく記載されているが、それが任意のかかる詳細又は実施形態又は任意の詳細な実施形態に限定されなければならないとの意図はなく、添付の特許請求の範囲を参照して、先行技術に鑑みてかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、従って、本開示の意図される範囲を有効に包含するものと受け取られるべきである。

【0642】

配列表
本開示の他の部分に開示される配列に加え、例示を目的として提供される本開示の様々な例示的実施形態においてそれらが言及又は使用されるとおり以下の配列が提供される。

【0643】

【表18】

【0644】

【表19】

【0645】

【表20】

【0646】

【表21】

【0647】

【表22】

【0648】

【表23】

【0649】

【表24】

【0650】

【表25】

【0651】

【表26】

【0652】

【表27】

【0653】

【表28】

【0654】

【表29】

【0655】

【表30】

【0656】

【表31】

【0657】

【表32】

【0658】

【表33】

【0659】

【表34】

【0660】

【表35】

【0661】

【表36】

【0662】

【表37】

【0663】

【表38】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】