特表 2021-501744 多重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-501744(P2021-501744A)

(43)【公表日】2021年1月21日

(54)【発明の名称】多重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20201218BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20201218BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20201218BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20201218BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20201218BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20201218BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20201218BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20201218BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46

   C07K16/28

   C07K16/30

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61P35/00

   C12N15/13ZNA

   C12N15/63 Z

   C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】169

(21)【出願番号】特願2020-519761(P2020-519761)

(86)(22)【出願日】2018年10月9日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月8日

(86)【国際出願番号】EP2018077509

(87)【国際公開番号】WO2019072868

(87)【国際公開日】20190418

(31)【優先権主張番号】17195779.8

(32)【優先日】2017年10月10日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】18150465.5

(32)【優先日】2018年1月5日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】18167093.6

(32)【優先日】2018年4月12日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】18180814.8

(32)【優先日】2018年6月29日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515310984

【氏名又は名称】ヌマブ セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】ダービド ウレッヒ

(72)【発明者】

【氏名】テア グンデ

(72)【発明者】

【氏名】ゼバスチャン マイアー

(72)【発明者】

【氏名】マティーアス ブロック

(72)【発明者】

【氏名】クリスティアン ヘス

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドル シモナン

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン バルムート

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC01

4C085CC08

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン及び少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメインを含む多重特異性抗体、ならびに医薬組成物及びその使用方法に関する。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記多重特異性抗体を産生する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）；及び
ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）
を含む多重特異性抗体であって、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、前記ＰＤＬ１−ＢＤのヒトＰＤＬ１への結合の解離定数（ＫＤ）と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、４００、より好ましくは少なくとも５００倍、例えば少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１，０００倍高い解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する、上記多重特異性抗体。

【請求項2】

前記抗体が、ＣＤ１３７特異性について一価、二価又は多価であり、好ましくは一価であり、
場合により、ここで、前記抗体は、ＰＤＬ１特異性について一価、二価又は多価、好ましくは一価である、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項3】

前記抗体が、少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメイン、好ましくは１つのヒト血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体。

【請求項4】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、ＣＤ１３７のアゴニストである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項5】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、
ａ）５０ｎＭ未満、具体的には１０ｎＭ未満、具体的には５ｎＭ未満、具体的には１ｎＭ未満、具体的には５００ｐＭ未満、より具体的には１００ｐＭ未満、より具体的には５０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合し、ここで、前記抗体はｓｃＦｖ（一価の親和性）であり；
ｂ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｆｆ速度が１０^−３ｓ^−１以下、又は１０^−４ｓ^−１以下、又は１０^−５ｓ^−１以下でヒトＣＤ１３７に結合し、ここで、前記抗体はｓｃＦｖであり；
ｃ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｎ速度が少なくとも１０^４Ｍ^−１ｓ^−１以上、少なくとも１０^５Ｍ^−１ｓ^−１以上、少なくとも１０^６Ｍ^−１ｓ^−１以上でヒトＣＤ１３７に結合し、前記抗体はｓｃＦｖであり；
ｄ）場合により、ウレルマブと交差競合せず；
ｅ）場合により、ウトミルマブと交差競合しない；及び／又は
ｆ）Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＣＤ１３７と交差反応する、請求項４に記載の多重特異性抗体。

【請求項6】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列：
ａ）それぞれ配列番号５９、６０、及び６１、ならびにそれぞれ配列番号７４、７５、及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
ｂ）それぞれ配列番号１、２、及び３、ならびにそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；ならびに
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくは、ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４、具体的には配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４（より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９のアミノ酸配列を含む）から選択されるフレームワークＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む、請求項４又は５に記載の多重特異性抗体

【請求項7】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列を含み、好ましくは、前記ＶＨは、Ｇ５１Ｃ突然変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬは、Ｔ１４１Ｃ突然変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、請求項４又は５に記載の多重特異性抗体。

【請求項8】

前記ＰＤＬ１−ＢＤがＰＤＬ１の遮断薬である、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項9】

前記ＰＤＬ１−ＢＤが、
ａ）５０ｎＭ未満、具体的には１０ｎＭ未満、具体的には５ｎＭ未満、具体的には１ｎＭ未満、具体的には５００ｐＭ未満、より具体的には１００ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満、より好ましくは５ｐＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＰＤＬ１に結合し、ここで、前記抗体はｓｃＦｖ（一価の親和性）であり；
ｂ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋ_off速度が１０^-3ｓ^-1以下、又は１０^-4ｓ^-1以下、又は１０^-5ｓ^-1以下でヒトＰＤＬ１に結合し、前記抗体がｓｃＦｖであり；
ｃ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋ_on速度が少なくとも１０³Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０６Ｍ^-1ｓ^-1以上でヒトＰＤＬ１に結合し、前記抗体がｓｃＦｖであり；
ｄ）Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＰＤＬ１と交差反応性であり；及び／又は
ｅ）Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＰＤＬ１に交差反応性ではない、請求項８に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

前記ＰＤＬ１−ＢＤが
ａ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
ｂ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくは、ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；ならびに
ｃ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４、具体的には配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４（より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９に記載される）から選択されるフレームワークＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む、請求項８又は９に記載の多重特異性抗体。

【請求項11】

前記ＰＤＬ１−ＢＤが、それぞれ配列番号９２、９３及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列を含み、好ましくは前記ＶＨは、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ突然変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、及び前記ＶＬは、Ｓ９Ａ及びＡ５１Ｐ突然変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、請求項８又は９に記載の多重特異性抗体。

【請求項12】

前記ＨＳＡ−ＢＤが、（ａ）配列番号１６１のＶＨ配列及び配列番号１７１のＶＬ配列；又は（ｂ）配列番号１８５のＶＨ配列及び配列番号１９５のＶＬ配列を含む、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体及び医薬として許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項14】

医薬品として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体又は請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体又はその結合ドメイン若しくはその断片をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多重特異性抗体を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン及び少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメインを含む多重特異性抗体、ならびに医薬組成物及びその使用方法に関する。本発明はさらに、前記多重特異性抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞、及び前記多重特異性抗体を産生する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、細胞外ドメインのシステインに富む偽反復を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とする受容体のタンパク質スーパーファミリーである（Locksley et al., 2001, Cell. 104: 487-501）。現在、２７のＴＮＦファミリーが同定されている。ＴＮＦＲＳＦメンバーとそのリガンドは、主に免疫細胞に発現しており、Ｔ細胞を介した免疫応答において免疫調節因子の役割を果たす。ＴＮＦＲＳＦメンバーは、Ｔ細胞の樹状細胞の生存とプライミング能力の強化、エフェクターＴ細胞の最適な生成、最適な抗体応答、及び炎症反応の増幅に役割を果たす。

【0003】

ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー９、ＴＮＦＲＳＦ９）は、ＴＮＦＲスーパーファミリーの表面糖タンパク質である。それは誘導可能な共刺激Ｔ細胞受容体である。ＣＤ１３７の発現は活性化依存性であり、活性化ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞、調節性Ｔ細胞、濾胞性ＤＣを含む樹状細胞（ＤＣ）、刺激されたマスト細胞、骨髄細胞の分化、単球、好中球、好酸球（Wang et al, Immunol Rev. 229(1): 192-215 (2009)）、及び活性化されたＢ細胞（Zhang et al, J Immunol. 184(2):787-795 (2010)）を含む、広範囲のサブユニットの免疫細胞を包含する。さらに、ＣＤ１３７の発現は腫瘍血管系でも実証されている（Broil K et al., Am J Clin Pathol. 115(4):543-549 (2001); Seaman et al, Cancer Cell 11(6):539-554 (2007)) and atherosclerotic endothelium (Olofsson et al, Circulation 117(10): 1292 1301 (2008)）。

【0004】

ＴＮＦファミリーの分子であるＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４−１ＢＢＬ又はｔｎｆｓｆ９）は、ＣＤ１３７で知られている細胞間天然リガンドである（Alderson, M. R., et al., Eur. J. Immunol. 24:2219-2227 (1994); Pollok K., et al., Eur. J. Immunol. 24:367-374 (1994); Goodwin, R. G., et al., Eur. J. Immunol. 23: 2631-2641 (1993)）。ＣＤ１３７のリガンドはホモ三量体を形成し、ＣＤ１３７を介したシグナル伝達は細胞表面のライゲーションされた分子から始まり、三量体化されたリガンドによって架橋される（Won, E. Y., et al., J. Biol. Chem. 285: 9202-9210 (2010)）。したがって、ＣＤ１３７の高次クラスタリングは、シグナル伝達の媒介に必要であることが示唆された。ＣＤ１３７は、細胞質尾部でアダプターＴＲＡＦ−２及びＴＲＡＦ−１と結合し、Ｔ細胞でのＣＤ１３７の活性化により増強される共免疫沈降を引き起こす（Saoulli, K., et al., J. Exp. Med. 187: 1849-1862 (1998); Sabbagh, L., et al., J. Immunol. 180: 8093-8101 (2008)）。ＣＤ１３７によるＴＲＡＦ−１及びＴＲＡＦ−２の採用により、ＮＦＫＢの下流の活性化と、ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８ ＭＡＰキナーゼを含むマイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼカスケードが生じる。ＮＦｋＢの活性化は、Ｂｃｌ−２ファミリーの生存促進メンバーであるＢｆｌ−１及びＢｃｌ−ＸＬのアップレギュレーションにつながる。プロアポトーシスタンパク質Ｂｉｍは、ＴＲＡＦ−１及びＥＲＫ依存的にダウンレギュレートされる（Sabbagh et al., J Immunol. 180(12):8093-8101 (2008)）。ＣＤ１３７の主な作用は、２つ以上のＴＲＡＦ−２分子を互いに分子的に近接させることである（Sanchez-Paulete, A. R., et al., Eur. J. Immunology 46(3): 513-522 (2016)）。これに基づいて、ＣＤ１３７シグナル伝達を促進する主な要因は、原形質膜のマイクロパッチにおけるＴＲＡＦ−２で組み立てられたＣＤ１３７部分の相対密度であると仮定された（(Sanchez-Paulete, A. R., et al., Eur. J. Immunology 46(3): 513-522 (2016)）。全体として、ＣＤ１３７シグナル伝達は多量体化によって促進され、ＣＤ１３７分子のクロスリンクがＣＤ１３７共刺激活性の重要な要素であることが提案された。

【0005】

ＣＤ１３７は、Ｔ細胞を共刺激して、確立された腫瘍の根絶、一次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の拡大、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリプールの強化、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）合成の誘導などのエフェクター機能を実行する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の機能と生存におけるＣＤ１３７刺激の重要な役割は、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ機能の操作を通じて腫瘍の治療に利用できる可能性がある。実際、マウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏの有効性研究により、抗ＣＤ１３７抗体による治療が複数の腫瘍モデルで腫瘍の退縮を引き起こすことが実証されている。例えば、アゴニスト性抗マウスＣＤ１３７抗体は、Ｐ８１５肥満細胞腫腫瘍及び低免疫原性腫瘍モデルＡｇ１０４に対する免疫応答を誘導することが実証された（I. Melero et al., Nat. Med., 3(6):682-5 (1997)）。単剤療法と併用療法の両方の予防的及び治療的設定におけるＣＤ１３７アゴニストｍＡｂの有効性と、抗腫瘍保護Ｔ細胞メモリー応答がいくつかの研究で報告されている（Lynch et al., Immunol Rev. 222:277-286 (2008)）。ＣＤ１３７アゴニストは、様々な自己免疫モデルにおける自己免疫反応も阻害する（Vinay et al, J Mol Med 84(9):726-736 (2006)）。

【0006】

現在臨床で使用されている２つの抗ＣＤ１３７抗体は、完全にヒト化されたＩｇＧ４ ｍＡｂであるウレルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）と、完全にヒト化されたＩｇＧ２ ｍＡｂであるオトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６、ファイザー）である（Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。ＣＤ１３７を刺激する治療用抗体の利用は非常に有望な治療戦略であるが、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の有効性の低さ、高い毒性、有害事象などの問題と結びついている。

【0007】

ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、免疫系及び臓器機能の変化を引き起こし、毒性のリスクを高めることが示されている。ナイーブ及び腫瘍を有するマウスにおける高用量のＣＤ１３７アゴニスト抗体は、肝臓へのＴ細胞浸潤と、肝臓の炎症と一致するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼの上昇を誘発すると報告されている（Niu L, et al. J Immunol 178(7):4194-4213 (2007); Dubrot J, et al., Int J Cancer 128(1):105-118 (2011)）。 ＣＤ１３７アゴニスト抗体のヒトの治療的使用に関する最初の臨床研究では、肝酵素の上昇と肝炎の発生率の増加も実証されている（Sznol M., et al., J Clin Oncol 26(115S):3007 (2008); Ascierto PA, et al., Semin Oncol 37(5):508-516 (2010); Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。以前に治療されたステージＩＩＩ／ＩＶ黒色腫のＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ）フェーズＩＩ抗ＣＤ１３７研究で、致命的な可能性のある肝炎が観察された（全国臨床試験（ＮＣＴ）００６１２６６４）。この研究及び他のいくつかの研究（ＮＣＴ００８０３３７４、ＮＣＴ００３０９０２３、ＮＣＴ００４６１１１０、ＮＣＴ００３５１３２５）は、有害事象のために終了した（Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。このような有害事象は、おそらくＴ細胞の全身的な過剰刺激が原因である。

【0008】

上記に加えて、二価ＣＤ１３７抗体は、外因性のクラスター形成がない場合、シグナル伝達を誘導する能力が一般に弱いことがｉｎ ｖｉｔｒｏで示された。例えば、抗ＣＤ１３７抗体であるウトミルマブは、抗ヒトＦ（ａｂ’）２二次抗体に架橋されているか、組織培養プラスチックに固定化されている場合にのみＣＤ１３７シグナル伝達を活性化できる（Fisher at al., Cancer Immunol Immunother 61:1721-1733 (2012)）。ＴＮＦＲＳＦの別のメンバーであるＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５）に対するげっ歯類のアゴニスト抗体に関する研究は、外因性クラスター形成がＦｃγ受容体との相互作用を介して部分的に達成され得ることを示唆している（Li F, Ravetch JV, Science 333(6045):1030-10 (2011); White AL, et al., J Immunol 187(4):1754-1763 (2011)）。しかしながら、Ｆｃγ受容体との相互作用により、エフェクターメカニズムを介してＣＤ１３７発現細胞を枯渇させることができる。ＣＤ１３７を標的とする現在の二価抗体には、ａ）Ｆｃγ受容体の相互作用がない場合にＣＤ１３７刺激能力が制限されている、ｂ）Ｆｃγ受容体とのそのような相互作用がＣＤ１３７発現細胞の枯渇を引き起こす可能性があり、活動に影響する可能性が高い、及びｃ）それらの活動は標的組織に限定されず、それにより全身的な悪影響を引き起こすという制限を有する。

【0009】

追加の架橋機能を得て、特定のレベルのＴＮＲＳＦ、特にＣＤ１３７の活性化を達成するために、ＰＤＬ１及びＴＮＲＳＦメンバー、又は葉酸受容体アルファ（ＦＲα）及びＴＮＲＳＦメンバーに結合する多価及び多特異性融合ポリペプチドを使用することが最近提案された。ここで、ＰＤＬ１又はＦＲαへの結合は、追加の架橋機能を提供することができる（ＷＯ２０１７／１２３６５０）。エッケルマン他ＩＮＢＲＸ−１０５の場合のように、ＣＤ１３７の２価の関与は、２つのＰＤＬ１結合ドメイン、２つのＣＤ１３７結合ドメイン、及びＦｃ領域を有する多特異的かつ多価のポリペプチドであり、外因性のクラスター化イベント、レポーターＴ細胞株に対する分子の影響を分離するアッセイを使用する。対照的に、ＰＤＬ１陽性細胞の存在下での２番目の細胞表面抗原ＰＤＬ１の関与により、ＣＤ１３７のさらなるクラスタリングと生産的シグナル伝達が可能になる（ＷＯ２０１７／１２３６５０）。

【0010】

ＰＤＬ１（ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１）は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。ＰＤＬ１はＰＤ−１の表面糖タンパク質リガンドであり、活性化Ｔ及びＢ細胞によって発現される主要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫抑制を媒介する。ＰＤＬ１は、慢性感染症、妊娠、組織同種グラフト、自己免疫疾患、及び癌の際の免疫系反応の抑制に関与する。ＰＤＬ１は、頭頸部の扁平上皮癌、黒色腫、脳腫瘍、甲状腺、胸腺、食道、肺、乳房、消化管、結腸直腸、肝臓、膵臓、腎臓、副腎皮質、膀胱、尿路上皮、卵巣、及び皮膚などの抗原提示細胞とヒト癌細胞の両方に見られる（(Katsuya Y, et al., Lung Cancer.88(2):154-159 (2015); Nakanishi J, et al., Cancer Immunol Immunother. 56(8):1173-1182 (2007); Nomi T, et al., Clin Cancer Res. 13(7):2151-2157 (2007); Fay AP, et al., J Immunother Cancer. 3:3 (2015); Strome SE, et al., Cancer Res. 63(19):6501-6505 (2003); Jacobs JF, et al. Neuro Oncol.11(4):394-402 (2009); Wilmotte R, et al. Neuroreport. 16(10):1081-1085 (2005)）。ＰＤＬ１は正常組織ではほとんど発現されないが、腫瘍部位で誘導的に発現される（Dong H, et al., Nat Med. 8(8):793-800 (2002); Wang et al., Onco Targets Ther. 9: 5023-5039 (2016)）。ＰＤＬ１はＰＤ−１に結合することによりＴ細胞の活性化とサイトカイン分泌をダウンレギュレートする（(Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001）。ＰＤＬ１によって活性化されるＰＤ−１は、腫瘍の発生と成長に免疫寛容環境を提供する可能性がある。ＰＤＬ１はまた、別の受容体Ｂ７．１（Ｂ７−１、ＣＤ８０）との相互作用を介してＴ細胞機能を負に調節する。

【0011】

ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の阻害は、強力な抗腫瘍活性を可能にする。ＰＤ−１シグナル伝達を妨害する多くの抗体が臨床開発に入っている。これらの抗体は、主に次の２つのカテゴリに属する：ＰＤ−１を標的とする抗体（ニボルマブ, Bristol-Myers Squibb; ペンブロリズマブ, Merck, Whitehouse Station, NJ; ピジリズマブ, CureTech, Yavne, Israel）、及びＰＤＬ１を標的とする抗体（MPDL3280A, Genentech, South San Francisco, CA; MEDI4736, MedImmune/AstraZeneca; BMS-936559, Bristol-Myers Squibb; MSB0010718C, EMD Serono, Rockland, MA）（概説についてはPostow MA et al., J Clin Oncol. Jun 10;33(17):1974-82 (2015)参照）。ＰＤＬ１をターゲットにすることとＰＤ−１をターゲットにすることは、異なる生物学的影響をもたらす可能性がある。ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１とそのリガンドであるＰＤＬ１及びＰＤＬ２の相互作用を防止する。この相互作用の影響は不明なままであるが、ＰＤＬ１抗体はＰＤ−１とＰＤＬ２の相互作用を妨げない。しかしながら、ＰＤＬ１抗体は、ＰＤＬ１とＰＤ−１だけでなく、Ｔ細胞に負のシグナルを及ぼすと考えられているＢ７−１（Butte MJ, et al., Immunity 27:111-122, (2007)）との相互作用も妨げる。ＰＤＬ１の遮断は有望な初期データを示しており、現在、４つの臨床抗ＰＤＬ１ ｍＡｂが試験中である：アテゾリズマブとＭＥＤＩ４７３６（どちらもヒトＩｇＧ１のＦｃ ｎｕｌｌ変異体）、ＭＳＢ００１０７８Ｃ（ＩｇＧ１）、及びＢＭＳ−９３６５５９（ＩｇＧ４）（Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。

【0012】

抗ＰＤＬ１抗体と抗ＣＤ１３７抗体の組み合わせにより、ＩＤ−８卵巣腺癌モデルの全生存期間が延長し、Ｔ細胞エフェクター機能が強化された（Duraiswamy J, et al., Cancer Res 73:6900-6912 (2013))）。固形腫瘍とＢ細胞非ホジキンリンパ腫の両方におけるウレルマブ（抗ＣＤ１３７）とニボルマブ（抗ＰＤ−１）の併用は、第Ｉ／ＩＩ相試験（ＮＣＴ０２２５３９９２）で試験されているが、ＰＦ−０５０８２５６６（抗ＣＤ１３７）は、固形腫瘍（ＮＣＴ０２１７９９１８）の患者を対象に、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）を用いた第Ｉｂ相試験で試験されている（Chester C., et al., Cancer Immunol Immunother Oct;65(10):1243-8 (2016)）。

【0013】

最近、ＰＤＬ１とＣＤ１３７に結合する多価及び多特異性融合ポリペプチドの効果が、Ｔ細胞の活性化と増殖に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価された。未成熟なＤＣとドナーが一致するＴ細胞を実装する自己ｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養システムを使用すると、２つのＰＤＬ１結合ドメイン、２つのＣＤ１３７結合ドメイン、及びＦｃ領域を持つ多特異的多価ポリペプチドであるＩＮＢＲＸ−１０５が、インターフェロン−γ産生の刺激において、単一特異性ＰＤＬ１ ｓｄ−Ａｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＣＤ１３７ ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、２つの組み合わせ、抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ、抗ＣＤ１３７抗体ウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）、又はＩＮＦγの誘導又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化の媒介における、抗ＰＤＬ１抗体プレムブロリズマブ、及びそれらの組み合わせ（ＷＯ２０１７／１２３６５０）と比較した場合、優れていることが実証されている。さらに、ＷＯ２０１６／１４９２０１は、ＰＤＬ１に対する特定の抗体を開示し、Ｔ細胞関与抗体をさらに含む二重特異性抗体構築物の作成を提案しており、ＣＤ１３７は２０を超える潜在的なＴ細胞標的の非排他的リストに含まれている。

【0014】

癌に苦しむ患者のための多くの治療選択肢にもかかわらず、効果的で安全な治療薬の必要性、及びより標的を定めた方法でのそれらの優先的使用の必要性が残っている。免疫調節生物製剤は、その作用機序により、癌の治療に有望なアプローチを提供するが、病理学的に関連する細胞及び部位に対する全体的な免疫刺激及びこの免疫調節の制限の欠如により、多数の副作用及び重大な毒性が引き起こされ、患者の罹患率及び死亡率の増加につながる可能性がある。したがって、本発明の目的は、増殖性疾患、特に癌の治療を改善するための薬剤を提供することである。

【発明の概要】

【0015】

以下の項目にそれぞれ要約される本発明の態様、有利な特徴及び好ましい実施形態は、それぞれ単独で又は組み合わせて、本発明の目的を解決することにさらに貢献する。

【0016】

一態様では、本発明は、少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン及び少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメインを含む多重特異性抗体に関する。本発明はさらに、少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン、少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン、及び少なくとも１つのヒト血清アルブミンドメインを含む多重特異性抗体に関する。

【0017】

一態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

【0018】

さらなる態様では、本発明は、医薬品として使用するための、本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物を提供する。

【0019】

さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象における癌の治療に使用するための、本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物を提供する。

【0020】

一態様では、本発明は、それを必要とする対象の癌を治療するための、本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。

【0021】

一態様では、本発明は、それを必要とする対象における、癌の治療のための医薬の製造における、本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。

【0022】

さらに別の態様では、本発明は、治療的有効量の本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の癌を治療する方法を提供する。

【0023】

さらなる態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。さらなる態様では、本発明は、前記核酸を含むベクターを提供する。さらなる態様では、本発明は、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0024】

さらに別の態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体又はその結合ドメイン又はその断片を産生する方法を提供し、この方法は、本発明の多重特異性抗体又はその結合ドメイン又はその断片をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む。

【0025】

以下の項目にそれぞれ要約される本発明の態様、有利な特徴及び好ましい実施形態は、それぞれ単独で又は組み合わせて、本発明の目的の解決にさらに貢献する。

【0026】

１．以下を含む多重特異性抗体：
ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）；及び
ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）。

【0027】

２．前記抗体がＣＤ１３７特異性について一価、二価又は多価であり、好ましくは一価である、項目１に記載の多重特異性抗体。

【0028】

３．前記抗体が、ＰＤＬ１特異性について一価、二価又は多価、好ましくは一価である、項目１又は２の多重特異性抗体。

【0029】

４．前記抗体が１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び１つのＰＤＬ１−ＢＤを含む、項目１に記載の多重特異性抗体。

【0030】

５．前記抗体が１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び１つのＰＤＬ１−ＢＤからなる、項目１の多重特異性抗体。

【0031】

６．前記抗体が三重特異性である、項目１〜４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

【0032】

７．前記抗体が少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメイン、好ましくは１つのヒト血清アルブミン結合ドメインをさらに含む、項目１〜４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。

【0033】

８．前記抗体が、１つのＣＤ１３７−ＢＤ、１つのＰＤＬ１−ＢＤ及び１つのＨＳＡ−ＢＤを含む、項目７に記載の多重特異性抗体。

【0034】

９．前記抗体が免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まない、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0035】

１０．前記結合ドメインが、それぞれの抗原又は受容体に同時に結合することができる、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0036】

１１．前記結合ドメイン、例えば、ＰＤＬ１−ＢＤ、ＣＤ１３７−ＢＤ、又はＨＳＡ−ＢＤのそれぞれが、独立して、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ又はｄＡｂ）、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、サメのＶＮＡＲ構造に基づく単一ドメイン抗体、アンキリンベースのドメイン、ファイノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えば、ｆ−ｓｔａｒテクノロジー（Ｆ−ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ）を含むがこれらに限定されない代替の足場に基づく結合ドメインからなる群から選択される、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0037】

１２．ＰＤＬ１−ＢＤ及び／又はＣＤ１３７−ＢＤ及び／又はＨＳＡ−ＢＤが、Ｆｖ及びｓｃＦｖから独立して選択される、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0038】

１３．前記ＣＤ１３７−ＢＤがクラスター形成時にＣＤ１３７に作用することができる、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0039】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、
ａ）５０ｎＭ未満、特に１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ ｐＭ未満、さらに特に１００ｐＭ未満、さらに特に５０ｐＭ未満（特にＳＲＰで測定した場合）の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖ（一価親和性）である；
ｂ）特にＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｆｆ速度が１０^-3ｓ^-1以下、又は１０^-4ｓ^-1以下、又は１０^-5ｓ^-1以下のヒトＣＤ１３７に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖである；
ｃ）特にＳＰＲで測定した場合、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖである；
ｄ）必要に応じて、ウレルマブと競合しない；
ｅ）必要に応じて、ウトミルマブと競合しない；及び／又は
ｆ）Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＣＤ１３７と交差反応する；及び／又は
ｇ）ｓｃＦｖ形式の場合、示差走査蛍光分析により測定された場合、少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも５５℃、より好ましくは少なくとも６０℃の融解温度を有し、特に抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌのリン酸−クエン酸緩衝液で処方され、特に、前記抗体は、ｐＨ６．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で処方される；
ｈ）ｓｃＦｖ形式の場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保管した後、７％未満、例えば本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満、及び特に、本発明の抗体は、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に製剤化される；及び／又は
ｉ）ｓｃＦｖ形式の場合、４０℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保管した後、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含有量が失われ、特に本発明の抗体がｐＨ６．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で処方される
である、項目１３に記載の多重特異性抗体。

【0040】

１５．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、ＨＣＤＲ１の配列番号１、ＨＣＤＲ２の配列番号２、及びＨＣＤＲ３の配列番号３の配列を有するＣＤＲを含む重鎖可変領域、ならびにＬＣＤＲ１の配列番号１８、ＬＣＤＲ２の配列番号１９、及びＬＣＤＲ３の配列番号２０の配列を有するＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目１３又は項目１４の多重特異性抗体。

【0041】

１６．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、配列番号１４、１５、１６、及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号２７、２８、２９及び３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１５に記載の多重特異性抗体。

【0042】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、配列番号１４、１５、１６及び１７のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２７、２８、２９及び３０のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１６に記載の多重特異性抗体。

【0043】

前記ＣＤ１３７−ＢＤが、（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２９のＶＬ配列；又は（ｄ）配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号３０のＶＬ配列を含む、項目１６に記載の多重特異性抗体。

【0044】

１９．前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記軽鎖可変領域はＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、項目１５に記載の多重特異性抗体。

【0045】

２０．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、ＨＣＤＲ１の配列番号５９、ＨＣＤＲ２の配列番号６０、及びＨＣＤＲ３の配列番号６１の配列を有するＣＤＲを含む重鎖可変領域；及びＬＣＤＲ１の配列番号７４、ＬＣＤＲ２の配列番号７５、ＬＣＤＲ３の配列番号７６の配列を有するＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、項目１３又は項目１４の多重特異性抗体。

【0046】

２１．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、配列番号７１、７２及び７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号８３、８４及び８５からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目２０に記載の多重特異性抗体。

【0047】

２２．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、配列番号７１、７２及び７３のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号８３、８４及び８５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目２１に記載の多重特異性抗体。

【0048】

２３．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、（ａ）配列番号７１のＶＨ配列及び配列番号８３のＶＬ配列；（ｂ）配列番号７２のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列；又は（ｃ）配列番号７３のＶＨ配列及び配列番号８５のＶＬ配列を含む、項目２１に記載の多重特異性抗体。

【0049】

項目２４．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域はＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記軽鎖可変領域はＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、項目２１に記載の多重特異性抗体。

【0050】

項目２５．前記ＰＤＬ１−ＢＤがＰＤＬ１のブロッカーである、先行する項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0051】

項目２６．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、
ａ）５０ｎＭ未満、特に１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ ｐＭ未満、さらに特に１００ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満、より好ましくは５ｐＭ（特にＳＲＰで測定した場合）の解離定数（ＫＤ）でヒトＰＤＬ１に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖ（一価親和性）である；
ｂ）特にＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｆｆ速度が１０^-3ｓ^-1以下、又は１０^-4ｓ^-1以下、又は１０^-5ｓ^-1以下のヒトＰＤＬ１に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖである；
ｃ）特にＳＰＲで測定した場合、少なくとも１０³Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＰＤＬ１に結合する；特に前記抗体はｓｃＦｖである；
ｄ）Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＰＤＬ１と交差反応する；及び／又は；
ｅ）Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＰＤＬ１と交差反応しない；及び／又は
ｆ）ｓｃＦｖ形式の場合、示差走査蛍光分析により測定された場合、少なくとも５５℃、例えば、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、より好ましくは少なくとも７０℃の融解温度を有し、特に抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌのリン酸−クエン酸緩衝液で処方され、特に、前記抗体は、ｐＨ６．４の１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液で処方される；
ｇ）ｓｃＦｖ形式の場合、５回の連続した凍結融解サイクル後に、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度であり、特に前記抗体が、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液中に処方される場合、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失がある；及び／又は
ｈ）ｓｃＦｖ形式の場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、特に本発明の抗体が、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される場合、１５％未満、例えば１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含有量が失われる
である、項目２５に記載の多重特異性抗体。

【0052】

２７．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、項目２５又は項目２６に記載の多重特異性抗体。

【0053】

２８．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む、項目２５又は項目２６に記載の多重特異性抗体。

【0054】

２９．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【0055】

３０．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【0056】

前記ＰＤＬ１−ＢＤが、（ａ）配列番号１０２のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列；（ｂ）配列番号１０３のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列；（ｃ）配列番号１０４のＶＨ配列及び配列番号１１５のＶＬ配列；（ｄ）配列番号１３２のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列；（ｅ）配列番号１３３のＶＨ配列及び配列番号１４５のＶＬ配列；又は（ｆ）配列番号１３４のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列を含む、項目２５〜２８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【0057】

３２．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、（ａ）配列番号１０２のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列、又は（ｂ）配列番号１０４のＶＨ配列及び配列番号１１５のＶＬ配列を含む、項目２７に記載の多重特異性抗体。

【0058】

３３．前記ＰＤＬ１−ＢＤが、（ａ）配列番号１３３のＶＨ配列及び配列番号１４５のＶＬ配列、又は（ｂ）配列番号１３４のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列を含む、請求項２８に記載の多重特異性抗体。

【0059】

３４．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、前記ＰＤＬ１−ＢＤのヒトＰＤＬ１への結合の解離定数（ＫＤ）と比較して、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００倍、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍高い解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する、前述の項目のいずれかの多重特異性抗体。

【0060】

３５．前記ＣＤ１３７−ＢＤが、１０ｎＭと１０ｐＭの間、例えば、１０ｎＭと０．１ｎＭの間、好ましくは５ｎＭと０．１ｎＭの間、より好ましくは５ｎＭと１ｎＭの間の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する、項目３４に記載の多重特異性抗体。

【0061】

３６．前記ＨＳＡ−ＢＤが、（ａ）配列番号１４９及び１７３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１５０及び１７４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１５１及び１７５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１６２及び１８６のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６３及び１８７のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１６４及び１８８のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む、項目７〜３５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【0062】

３７．前記ＨＳＡ−ＢＤが、配列番号１６１及び１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１７１及び１９５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３６に記載の多重特異性抗体。

【0063】

前記ＨＳＡ−ＢＤが、配列番号１６１及び１８５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１７１及び１９５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３６に記載の多重特異性抗体。

【0064】

前記ＨＳＡ−ＢＤが、（ａ）配列番号１６１のＶＨ配列及び配列番号１７１のＶＬ配列；又は（ｂ）配列番号１８５のＶＨ配列及び配列番号１９５のＶＬ配列を含む、項目３６に記載の多重特異性抗体。

【0065】

４０．前記ＨＳＡ−ＢＤが、（ａ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、アミノ酸配列（配列番号１６１）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及びアミノ酸配列（配列番号１７１）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域酸配列；又は（ｂ）それぞれ配列番号１７３、１７４、１７５のそれぞれのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１８６、１８７、及び１８８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、アミノ酸配列（配列番号１８５）と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む鎖可変領域；アミノ酸配列（配列番号１９５）と少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３６に記載の多重特異性抗体。

【0066】

４１．前記抗体が、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（Ｔａｎｄａｂ）、線形二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）又はバイボディ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、モリソン（ＩｇＧ ＣＨ３−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＬ）又はＩｇＧ ＣＬ−ｓｃＦｖ融合体（モリソンＨ））、トリアボディ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合体、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ融合体、ジダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、例えばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（重鎖と軽鎖の両方のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたｄｓｓｃＦｖ）、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、例えば、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ抗体（ＫｉＨ）；Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、ヘテロ二量体Ｆｃドメインのいずれかの鎖のＮ−及び／又はＣ−に融合したＣＯＶＤ、又は任意の他のヘテロ二量体ドメイン、ＭＡＴＣＨ及びＤｕｏＢｏｄｙからなる群から選択される形式である、項目１の多重特異性抗体。

【0067】

４２．前記抗体が、配列番号２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂである、項目１に記載の多重特異性抗体。

【0068】

４３．前記抗体が、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０及び２３１のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、好ましくは、前記抗体は、配列番号２２９又は配列番号２３１のアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、より好ましくは、前記抗体は、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである、項目１に記載の多重特異性抗体。

【0069】

４４．先行する項目のいずれか１つの多重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【0070】

４５．医薬品として使用するための、項目１〜４３のいずれか１つの多重特異性抗体又は項目４４の医薬組成物。

【0071】

４６．それを必要とする対象における癌の治療に使用するための、項目１〜４３のいずれか１つの多重特異性抗体又は項目４４の医薬組成物。

【0072】

４７．それを必要とする対象における癌を治療するための、項目１〜４３のいずれか１つの多重特異性抗体又は項目４４の医薬組成物の使用。

【0073】

４８．癌の治療を必要とする対象における、癌の治療のための医薬品の製造における、項目１〜４３のいずれか１つの多重特異性抗体又は項目４４の医薬組成物の使用。

【0074】

４９．項目１〜４３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体又は項目４４の医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における癌の治療方法。

【0075】

５０．前記癌がＰＤＬ１陽性癌であり、好ましくは前記癌が、健康な組織と比較して高レベルのＰＤＬ１を発現する、項目４５〜４６のいずれか１つの多重特異性抗体、項目４７〜４８のいずれか１つの使用又は項目４９の方法。

【0076】

５１．項目１〜４３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする核酸又はその結合ドメイン又はその断片。

【0077】

５２．項目５１の核酸を含むベクター。

【0078】

５３．項目５１の核酸又は項目５２のベクターを含む宿主細胞。

【0079】

５４．項目５１項に記載の核酸又は５２項に記載のベクターを含む宿主細胞を培養する工程を含む、項目１〜４３のいずれかに記載の多重特異性抗体の製造方法。

【0080】

５５．項目１〜４３のいずれか１つに記載の多重特異性抗体、又は項目４４の組成物を含むキット。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1A-B】例えば、完全長の二価ＩｇＧによるＴ細胞共刺激受容体の架橋は、Ｔ細胞の全体的な刺激をサポートし、その結果、用量制限毒性が生じる（Ａ）。本発明の安定な二重／三重特異性一価分子は、枯渇の標的となる細胞型が存在しない場合、Ｂ細胞のＴ細胞上の共刺激受容体を架橋結合（又は拡張により作動）させることができない（Ｂ）。

【図1C】本発明の安定な二重／三重特異性一価分子は、枯渇の標的とされる細胞型の存在下で、Ｔ細胞上の共刺激受容体を架橋する（又は拡張により、作動させる）（Ｃ）。

【図2】ＰＤＬ１とＣＤ１３７への同時結合は、腫瘍反応性Ｔ細胞の選択的活性化を引き起こし、同時にＰＤ−１シグナル伝達を遮断する。

【図3】ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和に対するＣＤＲセットとフレームワーク選択の影響。アッセイで得られた発光シグナルに比例する阻害％は、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表される。アベルマブは参照として使用された。

【図4】ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和効力に対するドメイン最適化の影響。アッセイで得られた発光シグナルに比例する阻害％は、ｓｃＦｖｓ濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表される。アベルマブは参照として使用された。

【図5】組換えヒト血清アルブミンの存在下、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓ ＰＲＯ９６３及びＰＲＯ１０５７（Ａ）、ＰＲＯ１１８６及びＰＲＯ１４３０（Ｂ）、ＰＲＯ１４３１及びＰＲＯ１４３２（Ｃ）、ＰＲＯ１４７３（Ｄ）、ＰＲＯ１４７６（Ｅ）、ＰＲＯ１４７９（Ｆ）、ＰＲＯ１４８２（Ｇ）、ＰＲＯ１４８０及びＰＲＯ１４８１（Ｈ）によるレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和効力。アッセイで得られた発光シグナルに比例する阻害％は、ｓｃＦｖｓ濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表される。アベルマブは参照として使用された。

【図6】二価分子の効力と、ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の中和効力に対するモリソン形式のＬＣ又はＨＣ ｓｃＦｖ融合の影響。アッセイで得られた発光シグナルに比例する阻害％は、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表される。アベルマブは参照として使用された。

【図7】ＰＤ−１／ＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ。すべての分子はＰＤ−１とＰＤＬ１間の相互作用を強力にブロックし、参照ＩｇＧアベルマブよりもＩＣ５０値が類似又は小さい。

【図8】Ｂ７．１／ＰＤＬ１競合ＥＬＩＳＡ。アベルマブと同様に、すべての分子はＢ７．１とＰＤＬ１間の相互作用を強力にブロックした。

【図9】競合ＥＬＩＳＡにおいて、ＣＤ１３７ＬへのＣＤ１３７結合の阻害なし。ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を評価する競合ＥＬＩＳＡで測定された吸光度は、ＰＲＯ８８５（Ａ）、ＰＲＯ９５１（Ｂ）、ＰＲＯ１３５９及びＰＲＯ１３６０（Ｃ）の濃度の増加の関数として表される。阻害性抗体のヤギ抗ヒトＣＤ１３７は参照として役立った。

【図10】クローン３８−２７−Ａ１１由来のＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、ウサギＩｇＧ、及びウレルマブとウトミルマブのエピトープビニング結果のヒートマップ。固定化分子（行）に対する検体分子（列）のパーセント（％）での理論的Ｒｍａｘに正規化された結合レベル。結合がない（濃い灰色）は同じエピトープを意味し、明るい灰色は二次分子（分析物）が結合でき、固定化された分子とは別のエピトープを持つことを意味する。

【図11】ＰＲＯ８８５のエピトープビニングセンサーグラム。ＰＲＯ８８５はセンサーチップに固定化され、ＣＤ１３７は最初のステップ（左側）でＰＲＯ８８５によって捕捉され、続いて４つの異なる抗体（右側）が注入された。ＰＲＯ９５１と競合他社は、捕獲されたＣＤ１３７に結合することができたが、ＰＲＯ８８５の注入は結合を示さなかった。

【図12】ＰＲＯ９５１のエピトープビニングセンサーグラム。ＰＲＯ９５１はセンサーチップに固定化され、ＣＤ１３７は最初のステップ（左側）でＰＲＯ９５１によって捕捉され、続いて４つの異なる抗体（右側）が注入された。ウロミルマブとＰＲＯ９５１の注射ではそれ以上の結合は見られなかったのに対し、ＰＲＯ８８５とウレルマブは捕捉されたＣＤ１３７に結合できた。

【図13】ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイで評価した、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ９５１によるＣＤ１３７の活性化。ＰＤＬ１発現細胞の存在下で、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ９５１は、ジャーカット細胞でＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したが、ＣＨＯ ＷＴ細胞を試験した場合、活性化は観察されなかった。ウレルマブは、ＰＤＬ１の発現とは無関係にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を添加してから６時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットさせた。

【図14】ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＣＤ１３７の活性化は、ＰＤＬ１及びＣＤ１３７と異なる親和性を持つｓｃＤｂによる。ＰＤＬ１を発現するＣＨＯ細胞の存在下では、すべてのｓｃＤｂがＪｕｒｋａｔ細胞のＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したが、ＣＨＯ ＷＴ細胞を試験した場合、活性化は観察されなった。ウレルマブは、ＰＤＬ１の発現とは無関係にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。ジャーカットレポーター細胞を添加してから６時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を用いてフィットさせた。

【図15】ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＣＤ１３７の活性化は、ＰＤＬ１及びＣＤ１３７と異なる親和性を持つｓｃＤｂによる。ＰＤＬ１を発現するＨＣＣ８２７細胞の存在下では、すべてのｓｃＤｂがＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。ウレルマブは、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対的な活性化を評価するための参照分子として機能した。ＣＤ１３７及びＰＤＬ１への親和性の増加に伴い、効力はわずかに増加した。ＰＤＬ１への親和性の増加はこの効果に寄与しなかったが、高濃度（ベル形の曲線）でのシグナルの減少は、ＣＤ１３７への親和性の増加とともにより顕著になった。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を添加してから６時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットさせた。

【図16】ＰＤＬ１とＣＤ１３７に異なる親和性を持つｓｃＤｂによるＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおけるＣＤ１３７の活性化。１０ｎｇ／ｍｌで２４時間ＩＦＮγで刺激されたＰＤＬ１発現ＨＣＣ８２７細胞の存在下で、ＳＴＲグラフトｓｃＤｂは、ジャーカット細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。ウレルマブは、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対的な活性化を評価するための参照分子として機能した。ＣＤ１３７及びＰＤＬ１への親和性の増加に伴い、効力はわずかに増加した。ＰＤＬ１への親和性の増加はこの効果に寄与しなかったが、高濃度（ベル形の曲線）でのシグナルの減少は、ＣＤ１３７への親和性の増加とともにより顕著になった。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を添加してから６時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットさせた。

【図17】ＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける血清半減期が延長された分子による６時間後のＣＤ１３７の活性化。ＰＤＬ１を発現するＣＨＯ細胞の存在下では、長い半減期の分子がＪｕｒｋａｔ細胞のＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したが、ＣＨＯ ＷＴ細胞を試験した場合、活性化は観察されなかった。ウレルマブは、ＰＤＬ１の発現とは無関係にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。興味深いことに、両方のターゲットに類似した親和性があるにもかかわらず、ＰＲＯ１０５７はＰＲＯ１０５８よりもはるかに高い最大シグナルを示した。さらに、一価のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１０５７は、それぞれの二価のモリソン形式ＰＲＯ１０６０よりも強い活性化を示した。Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を添加してから６時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットさせた。

【図18】２４時間後のＮＦｋＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおける血清半減期が延長した分子によるＣＤ１３７の活性化。ＰＤＬ１を発現するＣＨＯ細胞の存在下では、長い半減期の分子がＪｕｒｋａｔ細胞のＣＤ１３７シグナル伝達を活性化したが、ＣＨＯ ＷＴ細胞を試験した場合、活性化は観察されなかった。ウレルマブは、ＰＤＬ１の発現とは無関係にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。興味深いことに、両方のターゲットに類似の親和性があるにもかかわらず、ＰＲＯ１０５７は、ＰＲＯ１０５８よりもはるかに高い最大シグナルを示した。これは、２４時間後にｓｃＤｂ Ｐｒｏ８８５の活性さえも超えた。さらに、一価のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１０５７は、それぞれの二価のモリソン形式ＰＲＯ１０６０よりもはるかに強い活性化を示した。ジャーカットレポーター細胞を添加してから２４時間後に輝度を読み取り、データをシグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットさせた。

【図19A】（Ａ）２４時間後の半減期が延長された分子によるＣＤ１３７の活性化。刺激されていないか、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで２４時間刺激されたＨＣＣ８２７細胞の存在下で、長い半減期の分子がＪｕｒｋａｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。ウレルマブは、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対的な活性化を評価するための参照分子として機能した。一価のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１０５７は、それぞれの二価のモリソン形式ＰＲＯ１０６０よりも高い最大活性化を示した。ジャーカットレポーター細胞を添加してから２４時間後に発光を読み取り、Ｓ字型４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットさせた。

【図19B】（Ｂ）三重特異性ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４３１、ＰＲＯ１４３２、ＰＲＯ１４７３、ＰＲＯ１４７６、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８０、ＰＲＯ１４８１及びＰＲＯ１４８２を、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激ＨＣＣ８２７の存在下、ＣＤ１３７活性アッセイで６時間及び２４時間この実験では、ＰＲＯ８８５が参照分子として機能し、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対的な活性化を評価した。三重特異性ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６を各プレートで採取し、その活性を他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子と比較した。ジャーカットレポーター細胞を添加してから６時間後又は２４時間後に発光を読み取り、ＲＬＵ値のみが増加する試験分子の濃度をシグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットした。

【図20】エクスビボＴ細胞活性化。ＰＲＯ８８５によるＰＤＬ１とＣＤ１３７の共刺激的関与が示され、バックグラウンドのＩＬ−２レベルを明らかに上回るＩＬ−２産生をもたらす。ＣＨＯ−Ａ２細胞は、ＰＤＬ１を発現するトランスジェニックＣＨＯ細胞である。

【図21】エクスビボＴ細胞活性化アッセイ。ＰＢＭＣは１０ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡで刺激され、参照分子アベルマブの連続希釈液、参照分子アベルマブとウレルマブのカクテル、又はｓｃＦｖ ＰＲＯ９９７、ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５、又はｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓ ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８０で９６時間処理された。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡによって収穫された上清中のＩＬ−２の定量化によって評価された。ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９９７、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９及びＰＲＯ１４８０による治療は、顕著なＩＬ−２分泌をもたらした。ＰＲＯ９９７はＡａｖｅｌｕｍａｂより高い効力を示した。ＰＲＯ８８５は、アベルマブと比較して、効果サイズが大幅に増加した。参照分子のカクテルと比較した場合、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓでの処理は顕著なＩＬ−２分泌をもたらした。ＰＲＯ１４８０は、他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖと比較して、エフェクトサイズが大幅に増加した。シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットした。

【図22】本開示の多重特異性抗体の例示的な形式の略図：一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）（Ａ）、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓ（Ｂ）、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子（Ｃ及びＤ）。

【図23A-E】エクスビボＴ細胞活性化アッセイ。（Ａ）−（Ｄ）ＰＢＭＣは１０ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡ（ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）で刺激され、アベルマブ、ウレルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせ、ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５、及びｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１１７５又はＰＲＯ１１８６の連続希釈で９６時間処理された。Ｔ細胞の活性化は、ＥＬＩＳＡによって収穫された上清中のＩＬ−２の定量化によって評価された。ＰＲＯ１１７５とＰＲＯ１１８６は、アベルマブとウレルマブの組み合わせと比較して、ＰＭＢＣのＩＬ−２産生を刺激する優れた効力を示した。シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してデータをフィットした。（Ｅ）１０ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡで刺激されたＰＢＭＣは、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４３１、ＰＲＯ１４７６、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８２の連続希釈で９６時間処理された。三重特異性ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６は、各プレート上のＰＢＭＣにおける相対的なＩＬ−２産生を評価するための参照分子として機能した。ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９、及びＰＲＯ１４８２は、他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子と比較して、ＰＭＢＣにおけるＩＬ−２産生を刺激する優れた効力を示した。ＩＬ−２値が増加するだけの試験済み分子の濃度は、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットされた。

【図23F-K】（Ｆ）−（Ｉ）１０ｎｇ／ｍｌ ＳＥＡで刺激されたＰＢＭＣは、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４３１、ＰＲＯ１４７６、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８２の連続希釈で９６時間処理された。三重特異性ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６は、各プレート上のＰＢＭＣにおける相対的なＩＬ−２産生を評価するための参照分子として機能した。ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９、及びＰＲＯ１４８２は、他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子と比較して、ＰＭＢＣにおけるＩＬ−２産生を刺激する優れた効力を示した。ＩＬ−２値が増加するだけの試験済み分子の濃度は、シグモイド４ＰＬフィット（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）を使用してフィットされた。（Ｊ）−（Ｋ）健康なドナーからのＰＢＭＣを、抗ＣＤ３抗体の存在下で３日間インキュベートした。ヒトＰＤＬ１発現ＣＨＯ細胞及びアベルマブ、ウレルマブ、アベルマブ／ウレルマブの組み合わせ又は抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ２）の段階希釈液を培養液に加えた。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって評価した。ＰＲＯ１１８６は、ＩＬ−２（Ｊ）及びＩＦＮγ（Ｋ）の産生を誘発するのに、アベルマブ又はウレルマブ、あるいはその２つの組み合わせよりも強力であった。抗ＣＤ３抗体がない場合、ＩＬ−２とＩＦＮγのレベルは、試験したすべての濃度で基礎サイトカイン分泌に匹敵し、生産的なＣＤ１３７シグナル伝達にはＴＣＲシグナル伝達又はＣＤ３関与が必要であることを示す。

【図23L-M】（Ｌ）ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６及び抗ヒトＣＤ１３７と抗ヒトＰＤＬ１ ＩｇＧの組み合わせによるＳＥＡ ＰＢＭＣアッセイにおけるエクスビボでのＴ細胞の刺激。ウレルマブに正規化された測定されたＲＬＵは、分子濃度の関数としてｎｇ／ｍｌで表される。（Ｍ）ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１１８６及び抗ヒトＣＤ１３７と抗ヒトＰＤＬ１ ＩｇＧの組み合わせによるＳＥＡ ＰＢＭＣアッセイでのエクスビボでのＴ細胞の最大ＩＬ−２分泌。試験した分子の高濃度（８０００、１６００、３２０ｎｇ／ｍｌ）でのＩＬ−２レベルの平均を計算して比較した。ＰＲＯ１１８６は、ＩｇＧの組み合わせよりも統計的に有意に高いＩＬ−２レベルを示した（ｐ＜０．０００１）。１ｗａｙ ＡＮＯＶＡとＴｕｋｅｙの多重比較検定による統計分析。

【図24】免疫不全ＮＯＧマウス株と同種異系ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を使用した、ヒトＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ異種グラフトにおける抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）及び抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）療法と比較した、多重特異性抗体ＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）及びＰＲＯ１０６０（モリソン形式抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７）の抗腫瘍活性。。マウスは、多重特異性抗体（ＰＲＯ１０５７及びＰＲＯ１０６０）、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１０３７）、抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１０３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）又はベヒクルｉ．ｐ． で０、３、７、及び１０日目処置された。アベルマブの０．１ｍｇ用量と比較した相対活性は、相対単位（ｒ．Ｕ）として括弧内に示される。腫瘍体積は、マウスが１７日目及び１８日目に屠殺されるまで週２回測定された。腫瘍体積は、治療開始時の腫瘍体積（相対腫瘍体積）に対して正規化されている。（Ａ）２人のドナーからのＰＢＭＣで再構成されたマウスの平均相対腫瘍体積（ｎ＝８匹マウス／グループ）。点線は治療の時間を示す。（Ｂ）ドナーＢのＰＢＭＣで再構成されたマウスの平均相対腫瘍体積（ｎ＝４匹マウス／グループ）。（Ｃ）２人のドナーからのＰＢＭＣで再構成されたマウスの個々の相対腫瘍体積。各記号は、同じ治療グループ内の個々の動物を表す。（Ｄ）ドナーＢのＰＢＭＣで再構成されたマウスの個々の相対腫瘍体積。各記号は、同じ治療グループ内の個々の動物を表す。

【図25】ｈＰＢＭＣ置換ＮＯＧマウスにおける２５ ＨＣＣ８２７異種グラフト。多重特異性抗体ＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）とＰＲＯ１０６０（モリソン形式抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７）での治療時に、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）及び抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）療法と比較したＨＣＣ８２７チャレンジＮＯＧマウスの体重。マウスを１７日目と１８日目に屠殺するまで、体重を週２回測定した。

【図26】ｈＰＢＭＣ置換ＮＯＧマウスにおけるＨＣＣ８２７異種グラフト。多重特異性抗体ＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）及びＰＲＯ１０６０（モリソン形式抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７）及び抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）又は抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）抗体でそれぞれ処理されたＨＣＣ８２７チャレンジＮＯＧマウスの腫瘍浸潤リンパ球フローサイトメトリーで検討した。（Ａ）ヒト調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋）の頻度は、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表示される。（Ｂ）腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度とヒト調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の比率が示されている。各記号は、同じ治療グループ内の個々の動物を表す。

【図27】ｈＰＢＭＣ置換ＮＯＧマウスにおけるＨＣＣ８２７異種グラフト。多重特異性抗体ＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）及びＰＲＯ１０６０（モリソン形式抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７）及び抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）又は抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）抗体でそれぞれ処理されたＨＣＣ８２７チャレンジＮＯＧマウスの腫瘍浸潤リンパ球フローサイトメトリーで検討した。（Ａ）ヒト活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＰＤ−１＋）の頻度は、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表示される。（Ｂ）ヒト活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＰＤ−１＋）の頻度は、ＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして表示される。各記号は、同じ治療グループ内の個々の動物を表す。

【図28】ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトされたＮＯＧマウスにおける、ＰＤＬ１遮断及び付随するＣＤ１３７の局所刺激の抗腫瘍効果の評価。多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）の抗腫瘍活性は、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６又はａｖｅｌｕｍａｂ）及び抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ウレルマブ）療法又は抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）の組みあわせと比較された。マウスは、パリビズマブ（０．１ｍｇ）、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（０．１ｍｇ ＰＲＯ１１９６、又は０．１ｍｇアベルマブ）、抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（０．１ｍｇウレルマブ）、３つの異なる用量レベル（０．０２ｍｇ、０．１ｍｇ及び０．５ｍｇ）のＰＲＯ１１８６、又は抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）の組み合わせ（各０．１ｍｇ）で０、５、１０、１５、２０日目に処置された（点線の縦線）。腫瘍の成長と体重を週に２回記録した。

【図29】ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトされたＮＯＧマウスにおけるＰＤＬ１遮断及び付随するＣＤ１３７の局所刺激の抗腫瘍効果の評価。多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ；すべての用量レベルを組み合わせた）の抗腫瘍活性は、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６とアベルマブを組み合わせた）及び抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ウレルマブ）療法、又は抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）の組みあわせによる処置と比較された。すべての統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６を使用して計算された。統計的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を適用する一元配置分散分析検定を使用して決定された。グラフは９５％ＣＩ（信頼区間）の平均を示す。腫瘍の成長と体重を週に２回記録した。

【図30】ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトしたＮＯＧマウスにおける抗腫瘍効果の評価。多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）による治療時の体重と相対的腫瘍体積は、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６又はａｖｅｌｕｍａｂ）、及び抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ウレルマブ）、又は抗−ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）の組み合わせによる処置と比較された。

【図31】ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトしたＨＣＣ８２７チャレンジＮＯＧマウスの腫瘍浸潤リンパ球は、多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）又は抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６又はアベルマブ）又は抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ウレルマブ）単独、又は抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）の組み合わせによるで処理した後に分析された。抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７療法により、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＧｒＢ＋）の頻度が高くなり、腫瘍のＣＤ８＋／ＣＤ４＋及びＣＤ８＋、ＧｒＢ＋／Ｔｒｅｇ比が増加した。

【図32】ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトし、多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）で処理したＨＣＣ８２７チャレンジＮＯＧマウスの腫瘍浸潤リンパ球を分析した。多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ；すべての用量レベルを組み合わせた）による治療は、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ１単独（ＰＲＯ１１９６とａｖｅｌｕｍａｂを組み合わせた治療、抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４単独（ｕｒｅｌｕｍａｂ）、又は抗−ＰＤＬ１ ＩｇＧ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ４（ＰＲＯ１１３８）を用いた処置と比較された。すべての統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６を使用して計算された。統計的有意性は、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を適用する一元配置分散分析試験を使用して決定された。グラフは、９５％ＣＩ（信頼区間）の平均を示す）抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７療法により、腫瘍内の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ＋）の頻度が高くなった。

【図33】ヒトＣＤ３４＋幹細胞置換ＮＯＧマウスを使用したＨＣＣ８２７異種グラフト研究における動物の血清サンプル中の多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）を定量化するための薬物動態分析。希釈された血清サンプル中のＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）濃度は、検量線から内挿された。薬物動態パラメーターは、非コンパートメントアプローチを使用したＰＫソルバーソフトウェアアドインによって推定された。

【発明を実施するための形態】

【0082】

ＣＤ１３７を刺激する治療用抗体の利用は非常に有望な治療戦略であるが、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体の有効性の低さや、高い毒性と有害事象などの問題と結びついている。例えば、フルレングスの２価ＩｇＧによるＴ細胞共刺激受容体の架橋は、ウレルマブの場合のように、Ｔ細胞の全体的な刺激をサポートし、結果として用量制限毒性をもたらす（図１Ａ）。したがって、Ｔ細胞の全身的な過剰刺激なしにＣＤ１３７シグナル伝達を強力に誘導することができ、したがって現在利用可能な抗体よりも低い用量制限毒性及び有害事象の速度を有する新規抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体が医療分野で必要とされている。

【0083】

本発明は、（ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）、及び（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）を含む多重特異性抗体を提供する。本開示の多重特異性抗体は、標的化された様式で、例えば、関心のある部位、つまりＰＤＬ１陽性腫瘍の微小環境で、ＣＤ１３７シグナル伝達を刺激することができる。本発明の多重特異性抗体は、例えば、ＰＦ−０５０８２５６６（Fisher at al., Cancer Immunol Immunother 61:1721-1733 (2012)）又はＦｃγ−受容体相互作用の場合のように、抗ヒトＦ（ａｂ’）２二次抗体による架橋や組織培養プラスチックへの固定化を必要とせず、強力なＣＤ１３７シグナル伝達を媒介、例えば、刺激することができるしたがって、本発明の多重特異性抗体は、Ｆｃγ受容体と相互作用することなく、強力なＣＤ１３７シグナル伝達を媒介、例えば、刺激するその能力のため、ＣＤ１３７を発現する細胞の枯渇を引き起こさない。さらに、驚くべきことに、本開示の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７が一価である場合でさえ、特に本開示の新規ＣＤ１３７結合ドメインを含む場合、クラスター化し、ＣＤ１３７を刺激することができるが、ＰＤＬ１陽性細胞、したがってＣＤ１３７の全身活性化を回避する。多重特異性抗体の一価ＣＤ１３７結合とＦｃレス構造により、エフェクター細胞に対するＣＤ１３７のアゴニズムは、抗体が同時に標的細胞の表面上のＰＤＬ１に結合する場合にのみ発生することが保証される。

【0084】

さらに、驚くべきことに、本開示の多重特異性抗体は、（ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）、（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）、及び（ｃ）少なくとも１つのヒト血清アルブミン結合ドメイン（ＨＳＡ−ＢＤ）を含み、（ｉ）非架橋二価抗体と比較してＣＤ１３７のクラスター化が強化されている、（ｉｉ）ＰＤＬ１を遮断し、ＣＤ１３７を刺激する能力を保持しながら抗体の半減期が増加する、及び（ｉｉｉ）有益な動態（例えば、ＣＤ１３７の活性化レベルが高い）などのさらに有益な特性を示した。さらに、半減期を延長する抗ＨＳＡドメインの追加は、便利な投与を可能にするだけでなく、分子の腫瘍微小環境への送達を促進するべきである。

【0085】

したがって、本発明の多重特異性抗体は、従来の組成物及び治療を超える明確な治療上の利点を提供する。

【0086】

明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。

【0087】

本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、特に明記しない限り、制限のない非限定的な意味で使用される。したがって、そのような後者の実施形態に関して、「含む」という用語は、「からなる」というより狭い用語を含む。

【0088】

本明細書で特に明記しない限り、本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の参照は、単数及び複数の両方をカバーすると解釈されるべきである。又は文脈によって明らかに矛盾している。例えば、用語「細胞」は、それらの混合物を含む複数の細胞を含む。化合物、塩などに複数形が使用されている場合、これは単一の化合物、塩なども意味すると解釈される。

【0089】

第１の態様では、本発明は、（ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）、及び（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）を含む多重特異性抗体に関する。

【0090】

本明細書で使用される「抗体」などの用語は、全抗体又はその単鎖；任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はその単鎖、及び抗体ＣＤＲ、ＶＨ領域又はＶＬ領域を含む分子（多特異的抗体を含むがこれに限定されない）を含む。天然に存在する「全抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインで構成されている。ＶＨ領域とＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＶＨとＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0091】

本明細書で使用される、抗体の「結合ドメイン」、「その抗原結合断片」、「抗原結合部分」などの用語は、与えられた抗原（例えば、ＣＤ１３７、ＰＤＬ１、ＨＳＡ）に特異的に結合する能力を保持する無傷の抗体の１つ又は複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、無傷の抗体の断片によって実行できる。いくつかの実施形態では、本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨドメインとＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ又はｄＡｂ）、単一ドメイン重鎖抗体、及び単一ドメイン軽鎖抗体、ＶＨＨ、ＶＮＡＲ、サメのＶＮＡＲ構造に基づく単一ドメイン抗体、及び限定されないが、アンキリンベースのドメイン、ファイノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチンを含む代替の足場に基づく結合ドメイン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えば、ｆ−ｓｔａｒテクノロジー（Ｆ−ｓｔａｒ’ｓ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標））からなる群から選択される。適切には、本発明の結合ドメインは、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又は単一抗体可変ドメインである。好ましい実施形態では、本発明の結合ドメインは、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。

【0092】

「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語は、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して決定された境界を有するアミノ酸配列であって、例えば、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (“Kabat” numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (“Chothia” numbering scheme), ImMunoGenTics (IMGT) numbering (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (“IMGT” numbering scheme) and numbering scheme described in Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670（AHo」 番号付け）に記載されるものが含まれる。例えば、古典的な形式では、Ｋａｂａｔの下で、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＣＤＲアミノ酸残基は、３１−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）に番号が付けられ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＣＤＲアミノ酸残基は、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）に番号付けられる。Ｃｈｏｔｈｉａでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸は、２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５２−５６（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）、及びＶＬのアミノ酸残基は、２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）の番号が付けられる。ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＲＲ定義を合わせると、ＣＤＲは、ヒトＶＨのアミノ酸残基２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）、ヒトＶＬのアミノ酸残基２４−３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、８９〜９７（ＬＣＤＲ３）で構成される。ＩＭＧＴでは、ＶＨのＣＤＲアミノ酸残基は、約２６−３５（ＨＣＤＲ１）、５１−５７（ＨＣＤＲ２）及び９３−１０２（ＨＣＤＲ３）に番号が付けられ、ＶＬのＣＤＲアミノ酸残基は約２７−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）、８９−９７（ＬＣＤＲ３）に番号付けられる（「Ｋａｂａｔ」による番号付け）。ＩＭＧＴでは、抗体のＣＤＲはプログラムＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐ Ａｌｉｇｎを使用して決定できる。

【0093】

本発明の文脈では、特に別段の言及がない限り、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（「ＡＨｏ」）によって提案された番号付けシステムが使用される（Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670）。さらに、次の残基はＡＨｏ番号付けスキームに従ってＣＤＲとして定義される：ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１とも呼ばれる）：Ｌ２４−Ｌ４２；ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｌ２とも呼ばれる）：Ｌ５８−Ｌ７２；ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｌ３とも呼ばれる）：Ｌ１０７−Ｌ１３８；ＨＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｈ１とも呼ばれる）：Ｈ２７−Ｈ４２；ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ−Ｈ２とも呼ばれる）：Ｈ５７−Ｈ７６；ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ−Ｈ３とも呼ばれる）：Ｈ１０８−Ｈ１３８。明確にするために、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌuｃｋｔｈｕｎによる番号付けシステムでは、様々なＶＨ及びＶＬサブファミリー、特にＣＤＲの両方に自然に存在する抗体に見られる長さの多様性を考慮に入れており、配列におけるギャップを提供する。したがって、所与の抗体可変ドメインでは、通常、１〜１４９位のすべてがアミノ酸残基によって占有されるわけではない。

【0094】

本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、個々の抗体が、異なる抗原決定基とではなく、１つの抗原決定基と反応する能力を指す。本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」又は「に特異的である」という用語は、標的と抗体との間の結合などの測定可能であり再現可能な相互作用を指し、これは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下での標的の存在を決定する。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗体は、他の標的に結合するよりも、より容易に、及び／又はより長い持続時間で、この標的に結合する抗体である。その最も一般的な形（及び定義された参考文献が言及されていない場合）では、「特異的結合」は、当該分野で公知のアッセイ方法にしたがって、例えば特異性に従って決定される、対象の標的と無関係の分子を区別する抗体の能力を指す。そのような方法は、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）試験及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。スコアリングは、標準的な発色（例えば、西洋ワサビペルオキシドを含む二次抗体及び過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン）によって実施することができる。特定のウェルでの反応は、例えば４５０ｎｍでの光学密度によって記録される。典型的なバックグラウンド（＝ネガティブ反応）は約０．１ＯＤである。典型的な陽性反応は約１ＯＤである。これは、正のスコアと負のスコアの比率が１０倍以上になる可能性があることを意味する。さらなる例では、バックグラウンドとシグナルとの間の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の差が特異的結合を示すＳＰＲアッセイを実施することができる。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照分子ではなく、粉乳、トランスフェリンなどの約３〜５個の無関係な分子のセットを使用して行われる。

【0095】

適切には、本発明の抗体は単離された抗体である。本明細書で使用される「単離された抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＣＤ１３７及びＰＤＬ１を特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ１３７及びＰＤＬ１以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない。例えば、ＣＤ１３７、ＰＤＬ１及びヒト血清アルブミンに特異的に結合する単離された抗体は、ＣＤ１３７、ＰＤＬ１及びヒト血清アルブミン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まない可能性がある。

【0096】

適切には、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、アミノ酸配列と実質的に同一であるか、又は同じ遺伝的起源に由来する抗体を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する結合特異性と親和性、又は特定のエピトープに対する結合特異性と親和性を示す。

【0097】

本発明の抗体には、キメラ、ヒト及びヒト化が含まれるが、これらに限定されない。

【0098】

「キメラ抗体」（又はその抗原結合断片）という用語は、（ａ）定常領域又はその一部が改変され、置換され、又は交換されて、抗原結合部位（可変領域）が、異なる又は変更されたクラス、エフェクター機能及び／又は種の定常領域、又はキメラ抗体に新しい特性を与える完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬剤に連結され；又は（ｂ）可変領域又はその一部は、異なる又は変更された抗原特異性を有する可変領域と変更、置換又は交換される、抗体分子（又はその抗原結合断片である。
例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンからの定常領域で置き換えることにより改変することができる。ヒト定常領域での置換により、キメラ抗体は、元のマウス抗体と比較してヒトにおける抗原性を低下させながら、抗原を認識する際のその特異性を保持することができる。

【0099】

本明細書で使用される「ヒト抗体」（又はその抗原結合断片）という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体（及びその抗原結合断片）を含むことが意図されている。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、そのようなヒト配列、例えば、ヒト生殖系列配列、又はヒト生殖系列配列の変異バージョンに由来する。本発明のヒト抗体及びその抗原結合断片は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーなどの、当該技術分野において工程である様々な技術を用いて生成することができる（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581 (1991)）。ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるのは、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al, J. Immunol, 147(l):86-95 (1991)に記載される方法である。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が無効にされているトランスジェニック動物、例えば免疫化異種生物に抗原を投与することにより調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）テクノロジーに関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関して、例えば、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．ＵＳＡ、１０３：３５５７〜３５６２（２００６）を参照されたい。

【0100】

本明細書で使用される「ヒト化」抗体（又はその抗原結合断片）は、非ヒト抗体の反応性を保持しながら、ヒトにおいて免疫原性が低い抗体（又はその抗原結合断片）である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分をそれらのヒト対応物（すなわち、定常領域ならびに可変領域のフレームワーク部分）で置き換えることによって達成することができる。追加のフレームワーク領域の変更は、ヒトのフレームワーク配列内だけでなく、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列内でも行うことができる。本発明のヒト化抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発によって、又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異、又は安定性又は製造を促進するための保存的置換）を含み得る。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; and Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994を参照されたい。ヒト工学技術の他の例としては、米国特許第５，７６６，８８６号に開示されているＸｏｍａ技術が挙げられるが、これらに限定されない。

【0101】

本明細書で使用される「組換えヒト化抗体」という用語は、例えばトランスフェクトーマなどのヒト化抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のすべて又は一部の配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体。などの組換え手段によって調製、発現、作製又は単離されるすべてのヒト抗体を含む。

【0102】

適切には、本発明の抗体又はその抗原結合断片はヒト化されている。適切には、本発明の抗体又はその抗原結合断片はヒト化されており、ウサギ由来のＣＤＲを含む。

【0103】

本明細書で使用される「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つ以上の異なる標的（例えば、ＣＤ１３７及びＰＤＬ１）上の２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。「多重特異性抗体」という用語は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性及び六重特異性を含む。本明細書で使用される「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる標的（例えば、ＣＤ１３７及びＰＤＬ１）上の２つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。本明細書で使用される「三重特異性抗体」という用語は、少なくとも３つの異なる標的（例えば、ＣＤ１３７、ＰＤＬ１及びＨＳＡ）上の３つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。

【0104】

「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖などの化学的に活性な分子の表面グループで構成され、通常、特定の３次元構造特性と特定の電荷特性を有する。「コンフォメーション」及び「線形」エピトープは、前者への結合は変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別される。

【0105】

本明細書で使用される「立体構造エピトープ」という用語は、ポリペプチド鎖が折りたたまれてネイティブタンパク質を形成するときに表面に集まり、Ｆａｂ結合のためにＨＤ交換の有意に低下した速度を示す抗原のアミノ酸残基を指す。立体配座エピトープは、機能的エピトープを含むがこれに限定されない。

【0106】

「線形エピトープ」という用語は、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用点のすべてが、タンパク質の一次アミノ酸配列（連続）に沿って直線的に発生するエピトープを指す。

【0107】

本明細書で使用される「認識する」という用語は、その立体構造エピトープを見出し、それと相互作用する（例えば、結合する）その抗体抗原結合断片を指す。

【0108】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７特異性について一価、二価又は多価である。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７特異性について二価である。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７特異性について一価である。

【0109】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、ＰＤＬ１特異性について一価、二価又は多価である。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＰＤＬ１特異性について二価である。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＰＤＬ１特異性について一価である。

【0110】

「多価抗体」という用語は、複数の原子価を有する単一の結合分子を指し、「原子価」は、同一の標的分子上のエピトープに結合する抗原結合部分の数として説明される。したがって、単一の結合分子は、標的分子上の複数の結合部位に結合することができる。多価抗体の例には、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体などが含まれるが、これらに限定されない。

【0111】

本明細書で使用する「一価抗体」という用語は、ＣＤ１３７などの標的分子上の単一のエピトープに結合する抗体を指す。また、本明細書で使用する「結合ドメイン」又は「一価結合ドメイン」という用語は、ＣＤ１３７などの標的分子上の単一のエピトープに結合する結合ドメインを指す。

【0112】

本明細書で使用される「二価抗体」という用語は、ＣＤ１３７標的分子などの少なくとも２つの同一の標的分子上の２つのエピトープに結合する抗体を指す。

【0113】

最近、追加のクロスリンク機能を得て、特定のレベルのＣＤ１３７活性化を達成するために、ＰＤＬ１及びＣＤ１３７に結合する多価及び多特異性融合ポリペプチドの使用が提案された。Eckelmanらは、ＩＮＢＲＸ−１０５（２つのＰＤＬ１結合ドメイン、２つのＣＤ１３７結合ドメイン及びＦｃ領域を持つ多特異性及び多価ポリペプチド）の場合のＣＤ１３７の二価の関与は、生産的なＣＤ１３７シグナル伝達を効果的にクラスター化及び仲介するには不十分である一方で、ＰＤＬ１陽性細胞の存在下での２番目の細胞表面抗原ＰＤＬ１の動作は、ＣＤ１３７のさらなるクラスター化と生産的シグナル伝達を可能にする（ＷＯ２０１７／１２３６５０）。

【0114】

本発明の発明者らは、驚くべきことに、ここで、（ａ）ただ１つのＣＤ１３７結合ドメイン（ＣＤ１３７−ＢＤ）を含む多重特異性抗体を発見し、（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）は、ＣＤ１３７シグナル伝達を標的化する方法で効果的に活性化することができることを見出した。本発明のＣＤ１３７分子に対して安定な多特異的（例えば、二重特異性／三重特異性）一価は、ＰＤＬ１結合ドメインによって認識される別の細胞型の非存在下では、Ｔ細胞上のＣＤ１３７を刺激することができないことが示されている（図１Ｂ）。本発明の多重特異性抗体の抗ＰＤＬ１ドメインがＰＤＬ１陽性細胞の表面に露出したＰＤＬ１分子に結合するため、ＣＤ１３７の効果的な活性化はＰＤＬ１陽性細胞の存在下でのみ起こる（図１Ｃ及び図２）。これは、特定の位置における本発明の多重特異性抗体の密度の増加をもたらし、したがって、ＣＤ１３７結合ドメインの密度の増加をもたらす。したがって、ＣＤ１３７−ＢＤは効果的にクラスター化し、ＣＤ１３７を刺激することができる。ＰＤＬ１及びＣＤ１３７へのこの付随的な結合は、腫瘍反応性Ｔ細胞の選択的活性化を引き起こし、同時にＰＤ−１シグナル伝達をブロックする（図２）。腫瘍細胞でのＰＤＬ１の高い過剰発現により、ＣＤ１３７シグナル伝達は腫瘍細胞の存在下で局所的にのみ活性化され、全身毒性の低下につながる。したがって、本発明の抗体は、現在の治療選択肢と比較していくつかの有益な効果を有することが期待される。本発明の抗体は、（ｉ）免疫関連の有害事象のより低い率、及び（ｉｉ）用量制限毒性のより低い率を有すると予測される。

【0115】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７特異性について一価である。重要なことに、本発明のＣＤ１３７特異性多重特異性抗体の一価は、ＰＤＬ１−ＢＤのその抗原への結合によって引き起こされるクラスター化の不在下でのＣＤ１３７活性化の欠如により、全身的にＣＤ１３７シグナル伝達を誘導することができない。一実施形態では、本発明は、（ａ）１つのＣＤ１３７−ＢＤ；及び（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、好ましくは１つ又は２つのＰＤＬ１−ＢＤ、より好ましくは１つのＰＤＬ１−ＢＤを含む多重特異性抗体に関する。したがって、本発明の多重特異性抗体は、ＰＤＬ１特異性について一価、二価又は多価、好ましくはＰＤＬ１特異性について一価である。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び１つのＰＤＬ１−ＢＤを含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び１つのＰＤＬ１−ＢＤからなる。

【0116】

「ＣＤ１３７」という用語は、特に、本明細書において配列番号１９７として複製される、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ０７０１１を有するヒトＣＤ１３７を指す。適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＣＤ１３７、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ０７０１１に示されるヒトＣＤ１３７を標的とする。好適には、ＣＤ１３７−ＢＤを含む本発明の多重特異性抗体は、ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ１３７を標的とする。好ましくは、ＣＤ１３７−ＢＤを含む本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用を遮断しない。

【0117】

本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＣＤ１３７に特異的に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体はＣＤ１３７−ＢＤを含み、前記ＣＤ１３７−ＢＤはＣＤ１３７に特異的に結合する。特定の実施形態では、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって決定されるように、ヒトＣＤ１３７に対する結合特異性を有し、ヒトＣＤ４０に結合せず、及び／又はヒトＯＸ４０に結合しない。

【0118】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤはＣＤ１３７アゴニストである。「アクチベーター」又は「活性化抗体」又は「アゴニスト」又は「アゴニスト抗体」又は「アゴニスト結合ドメイン」又は「活性化結合ドメイン」は、それが結合する抗原によるシグナル伝達を増強又は開始するものである。本発明の文脈において、用語「ＣＤ１３７アゴニスト」は、それらのクラスター形成時にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる本発明のＣＤ１３７結合ドメインを包含し、例えば、前記ＣＤ１３７−ＢＤの少なくとも２つの結合により、結合したＣＤ１３７分子の多量体化とそれらの活性化を可能にする。いくつかの実施形態では、アゴニスト抗体は、天然のリガンドの存在なしにシグナル伝達を活性化する。

【0119】

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、モノクローナル抗体又は抗体断片に由来する。

【0120】

本発明の多重特異性抗体での使用に適したＣＤ１３７−ＢＤは、本開示で提供される新規結合ドメインである。本発明の新規のＣＤ１３７−ＢＤは、実施例を含む、本明細書に記載されるように単離されたヒト化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。そのようなＣＤ１３７−ＢＤの例は、その配列が表１に列挙されている抗体又はその結合ドメインである。本明細書に記載の抗体及び結合ドメインの生成及び特徴付けに関するさらなる詳細は、実施例に提供されている。本発明の新規ＣＤ１３７−ＢＤは、本発明の目的に特に適している。少なくとも１つの前記ＣＤ１３７−ＢＤを含む本発明の多重特異性抗体、例えば、ＣＤ１３７結合特異性が一価で、ＰＤＬ１陽性細胞の存在下でＣＤ１３７を活性化できる。

【0121】

適切には、ＣＤ１３７−ＢＤはＣＤ１３７に特異的に結合し、以下のパラメーターの１つ以上によって特徴付けられる：
（ｉ）５０ｎＭ未満、特に１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、特に１００ｐＭ未満、より具体的には５０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合し、特に前記抗体はｓｃＦｖ（一価の親和性）である；
（ｉｉ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｆｆ率速度が１０^-3ｓ^-1以下、又は１０^-4ｓ^-1以下、又は１０^-5ｓ^-1以下でヒトＣＤ１３７に結合し、前記抗体はｓｃＦｖである；
（ｉｉｉ）ＳＰＲで測定した場合、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合し、特に、前記抗体はｓｃＦｖである；
（ｉｖ）必要に応じて、ウレルマブと競合しない；
（ｖ）必要に応じて、ウトミルマブと競合しない；
（ｖｉ）必要に応じて、Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＣＤ１３７と交差反応する；及び
（ｖｉｉ）必要に応じて、特に競合ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＣＤ１３７とそのリガンドＣＤ１３７Ｌの相互作用を阻害しない。

【0122】

「アビディティ」という用語は、抗体−抗原複合体の全体的な安定性又は強度の有益な尺度を指す。それは３つの主要な要因によって制御される：抗原と抗体の両方の価数；相互作用するパーツの構造配置。最終的にこれらの要因は、抗体の特異性、つまり特定の抗体が正確な抗原エピトープに結合する可能性を定義する。

【0123】

本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原の間の相互作用の強さを指す。各抗原部位内で、抗体の「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して、多数の部位で抗原と相互作用する。相互作用が多いほど、親和性が強くなる。

【0124】

「結合親和性」は、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用する「結合親和性」、「結合する」、「結合する」又は「結合している」は、結合対のメンバー（例えば、抗体断片及び抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。一般に、低親和性抗体は抗原との結合が遅く、解離しやすい傾向があるが、高親和性抗体は一般に抗原との結合が速く、結合が長く維持される傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、それらのいずれも本発明の目的に使用することができる。結合親和性、すなわち結合強度を測定するための特定の例示的かつ例示的な実施形態を以下に説明する。

【0125】

本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」、「Ｋａ」又は「Ｋｏｎ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すことが意図され、一方、用語「Ｋｄｉｓ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｏｆｆ」は、本明細書で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すことが意図されている。一実施形態では、本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すものとする。「ＫＤ」若しくは「ＫＤ値」又は本発明による「ＫＤ」若しくは「ＫＤ値」は、一実施形態では、ＭＡＳＳ−１ ＳＰＲ機器（Sierra Sensors）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定される。アフィニティを測定するには、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ａ１２０−１１１Ａ）を標準アミン−カップリング手順を使用してセンサーチップ（ＳＰＲ−２アフィニティセンサー、高容量アミン、Ｓｉｅｒｒａセンサー）に固定化する。Ｂ細胞上清中のウサギモノクローナル抗体は、固定化された抗ウサギＩｇＧ抗体によって捕捉される。十分な捕捉を可能にするために、Ｂ細胞上清中の最小限のＩｇＧ濃度が必要である。モノクローナル抗体の捕捉後、ヒトＣＤ１３７ ＥＣＤ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ３１０−１５−１ＭＧ）、又はＰＤＬ１−ＢＤの場合と同様に、ヒトＰＤＬ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を９０ｎＭの濃度で３分間、フローセルに注入し、センサーチップに捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を５分間進行させた。各注入サイクル後、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌを２回注入して表面を再生する。見かけの解離（ｋｄ）と会合（ｋａ）の速度定数と見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）で１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを用いて計算され、適合の品質は、曲線適合の品質の尺度である相対的Ｃｈｉ２（分析物の外挿された最大結合レベルに対して正規化されたＣｈｉ２）に基づいて監視される。Ｃｈｉ２の値が小さいほど、１対１のラングミュア結合モデルへの適合がより正確になる。リガンド結合の応答単位（ＲＵ）が抗体捕捉のＲＵの少なくとも２％である場合、結果は有効であると見なされる。リガンド結合用のＲＵが抗体捕捉用のＲＵの２％未満の試料は、捕捉された抗体へのＣＤ１３７又はＰＤＬ１の特異的結合を示さないと見なされる。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率として計算される。例えば、Chen et al, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照されたい。

【0126】

適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７に対する親和性は、ＣＤ１３７Ｌに対するＣＤ１３７Ｌの親和性に匹敵するか、又はそれより高い場合がある。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７に対する親和性は、ＣＤ１３７に対するウレルマブの親和性に匹敵するか、それよりも高い可能性がある。ＣＤ１３７結合ドメインのより高い親和性は、本発明の多重特異性抗体における使用に特に適切であり得、前記抗体は、ＣＤ１３７に対して一価であることが理解される。抗体又はその結合断片の結合親和性は、例えば、解離定数（ＫＤ）によって決定され得る。強い親和性は低いＫＤで表され、弱い親和性は高いＫＤで表される。

【0127】

したがって、適切な実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲにより測定される場合、５〜５０，０００ｐＭ、５〜４０，０００ｐＭ、５〜３０，０００ｐＭ、５〜２０，０００ｐＭ、５〜１０，０００ｐＭ、５〜９，０００ｐＭ、５〜８，０００ｐＭ、５〜７，０００ｐＭ、５〜６，０００ｐＭ、５〜５，０００ｐＭ、５〜２，５００ｐＭ、５〜１，０００ｐＭ、５〜７５０ｐＭ、５〜５００ｐＭ、５〜２５０ｐＭ、５〜１００ｐＭ、５〜７５ｐＭ、５〜５０ｐＭ、５〜３０ｐＭのＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定した場合、１０ｎＭ〜１０ｐＭ、好ましくは１０ｎＭ〜０．１ｎＭ、例えば５ｎＭ〜０．１ｎＭ、より好ましくは５ｎＭ〜１ｎＭのＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。

【0128】

適切な実施形態では、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定した場合、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、未満約６ｎＭ、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、又は０．１ｎＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定した場合、１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。好ましくは、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定される場合、５ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定した場合、１ｎＭ未満のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲによって測定される場合、５０ｐＭ未満のＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する。

【0129】

適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、少なくとも１０３Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＳＰＲで測定した場合、少なくとも１０⁴Ｍ^-1ｓ^-1以上、特に少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。特に、前記抗体がｓｃＦｖ（一価親和性）である。

【0130】

適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、１０^-3ｓ^-1以下、３×１０^-3ｓ^-1以下、５×１０^-3ｓ^-1以下、５×１０^-3ｓ^-1以下、１０^-4ｓ^-1以下、５×１０^-4ｓ^-1以下、１０^-5ｓ^-1以下、５×１０^-5ｓ^-1以下、１０^-6ｓ^-1以下、又は１０^-7ｓ^-1以下のＫｏｆｆ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＳＰＲによって測定した場合、１０^-4ｓ^-1以下、特に１０^-5ｓ^-1以下のＫｏｆｆ速度でヒトＣＤ１３７に結合する。

【0131】

適切には、本発明の多重特異性抗体又は本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＳＲＰで測定した場合、少なくとも６０％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上のヒトＣＤ１３７への結合を有し、ウレルマブで得られた結合レベルに正規化された。

【0132】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウレルマブとの結合に関して交差競合しない。したがって、本発明は、ウレルマブとは異なるエピトープに結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供する。ウレルマブはＢＭＳ−６６３５１３とも呼ばれ、ブリストル・マイヤーズスクイブの完全ヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂであり、ＷＯ２００４／０１０９４７、ＵＳ６，８８７，６７３及びＵＳ７，２１４，４９３に記載され、これらは参照に全体が本明細書に援用される。別の実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウレルマブとの結合について交差競合する。

【0133】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウトミルマブとの結合について交差競合しない。したがって、本発明は、ウトミルマブとは異なるエピトープに結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供する。ウトミルマブは、ＰＦ−０５０８２５６６とも呼ばれ、ファイザー社の完全ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂであり、参照により全体が本出願に組み込まれている、ＷＯ２０１２／０３２４３３及びＵＳ８，８２１，８６７に記載されている。別の実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウトミルマブとの結合について交差競合する。

【0134】

さらなる実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウレルマブ又はウトミルマブのいずれとも結合することについて交差競合しない。したがって、本発明は、ウレルマブ及びウトミルマブとは異なるエピトープに結合する本発明のＣＤ１３７−ＢＤを提供する。

【0135】

「競合する」又は「交差競合する」という用語及び関連する用語は、本明細書では互換的に使用され、標準的な競合結合アッセイにおいて、抗体又は他の結合剤が他の抗体又は結合剤のＣＤ１３７への結合を妨害する能力を意味する

【0136】

抗体又は他の結合剤が、ＣＤ１３７、ＰＤＬ１などの目的のターゲットへの別の抗体又は結合分子の結合を妨害できる能力又は程度、したがって、本発明に従って交差競合すると言えるかどうかは、標準的な競合結合アッセイを使用して決定することができる。適切な定量的交差競合アッセイは、ＦＡＣＳベース又はＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースのアプローチを使用して、標的への結合に照らして、ラベル付き（Ｈｉｓタグ付き、ビオチン化又は放射性ラベル付き）の抗体又はその断片と他の抗体又はその断片との結合の競合を測定する。一般に、交差競合抗体又はその断片は、例えば、交差競合アッセイにおいて標的に結合し、その結果、アッセイ中及び二次抗体又はその断片の存在下で、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン又はポリペプチドの記録された置換は、所定の量で存在する試験される可能性があるクロスブロッキング抗体又はその断片であるものによって、試験される可能性のある交差ブロッキングによる最大理論的置換（例えば、（ブロッキングされていない）冷たい（例えば、非標識）抗体又はその断片による置換）の最大１００％である。好ましくは、交差競合抗体又はその断片は、１０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％の記録された置換を有する。本発明の目的のために、競合ＥＬＩＳＡが利用され、対応するプロトコルは、本開示の「実施例」セクションに詳細に記載されている。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウレルマブ及び／又はウトミルマブのＣＤ１３７タンパク質への結合を阻害せず、これは、本発明のＣＤ１３７−ＢＤが、ＣＤ１３７への結合について、それぞれウレルマブ及び／又はウトミルマブと競合できないことを示す；そのようなＣＤ１３７−ＢＤ又は前記ドメインを含む抗体は、非限定的な理論によれば、それぞれウレルマブ又はウトミルマブとしてＣＤ１３７上の異なる（例えば、構造的に異なる又は空間的に離れた）エピトープに結合することができる。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ウレルマブ又はウトミルマブのＣＤ１３７タンパク質への結合を阻害し、これは、本発明のＣＤ１３７−ＢＤが、ＣＤ１３７への結合について、それぞれウレルマブ又はウトミルマブと競合できることを示す；そのようなＣＤ１３７−ＢＤ又は前記ドメインを含む抗体は、非限定的な理論によれば、それぞれウレルマブ又はウトミルマブとして、ＣＤ１３７上の同じ又は重複する（例えば、構造的に類似又は空間的に近位の）エピトープに結合し得る。

【0137】

本発明はまた、表１に列挙されたＣＤ１３７−ＢＤと同じエピトープに結合する結合ドメインを提供する。したがって、追加の結合ドメインは、それらがＣＤ１３７結合アッセイにおける本発明の他の抗体及びその抗原結合断片と交差競合する（例えば、統計的に有意な方法で、その結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。

【0138】

本発明のＣＤ１３７−ＢＤのＣＤ１３７タンパク質への結合を阻害する試験結合ドメインの能力は、試験結合ドメインがＣＤ１３７への結合についてそのＣＤ１３７−ＢＤと競合できることを実証している；そのような結合ドメインは、非限定的な理論によれば、それが競合するＣＤ１３７−ＢＤと同じ又は関連する（例えば、構造的に類似又は空間的に近位の）ＣＤ１３７上のエピトープに結合することができる。特定の実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤと同じＣＤ１３７上のエピトープに結合する結合ドメインは、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。そのようなヒト又はヒト化モノクローナル抗体は、本明細書に記載されるように調製及び単離され得る。

【0139】

抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本発明に記載される技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。あるいは、発見プロセス中に、抗体の生成及び特徴付けにより、望ましいエピトープに関する情報が明らかになる場合がある。この情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、相互競合研究を実施して、互いに競合的に結合する抗体を見つけることであり、例えば、抗体は抗原への結合について競合する。それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング」するためのハイスループットプロセスは、ＷＯ２００３／４８７３１に記載されている。当業者によって理解されるように、実際には、抗体が特異的に結合することができるあらゆるものがエピトープであり得る。エピトープは、抗体が結合するそれらの残基を含み得る。

【0140】

エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して特定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、線形エピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（タンパク質分子の部分に対応するペプチド）を同時に合成し、ペプチドが依然として支持体に付着している間にペプチドを抗体と反応させることにより決定され得る。そのような技術は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715に記載されている。同様に、立体配座エピトープは、例えば、水素／重水素交換、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴などによって、アミノ酸ＣＤ１３７の空間的立体配座を決定することによって容易に識別される。
例えば、上記のエピトープマッピングプロトコルを参照されたい。タンパク質の抗原性領域は、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたものなど、標準的な抗原性及びハイドロパシープロットを使用して特定することもできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのホップ／ウッズ法（Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828）；ハイドロパシープロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Kyte et al., (1982) J.MoI. Biol. 157: 105-132）を採用する。

【0141】

適切には、ＣＤ１３７−ＢＤはＣＤ１３７に特異的に結合し、以下のパラメーターの１つ以上によって特徴付けられる：
ａ）ｓｃＦｖ形式の場合、示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）によって測定された場合、少なくとも５０℃、好ましくは少なくとも５５℃、より好ましくは少なくとも６０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、特に前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌのリン酸−クエン酸緩衝液、特にｐＨ６．４の５０ｍＭのリン酸−クエン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中で処方される。
ｂ）ｓｃＦｖ形式の場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、モノマー含有量が７％未満、例えば、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満の喪失であり、特に、本発明の抗体、例えば、前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される；及び／又は
ｃ）ｓｃＦｖ形式の場合、４０℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、モノマー含有量が５％未満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満の喪失であり、特に、本発明の抗体、例えば、前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４で１５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に処方される。

【0142】

ＤＳＦは以前に説明されている（Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221）。ｓｃＦｖ構築物の熱変性の遷移の中点は、蛍光色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅを使用した示差走査蛍光分析によって決定される（Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840参照）。ｐＨ６．４のリン酸−クエン酸緩衝液のサンプルは、５０μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度で調製され、総容量１００μｌに５ｘＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅの最終濃度を含む。調製したサンプルの２５マイクロリットルを、３重に白い壁のＡＢ遺伝子ＰＣＲプレートに加える。アッセイはサーマルサイクラーとして使用されるｑＰＣＲマシンで実行され、ソフトウェアのカスタム色素キャリブレーションルーチンを使用して蛍光発光が検出される。試験サンプルを含むＰＣＲプレートは、２５℃から９６℃まで１℃ずつ上昇し、各温度上昇後に３０秒間休止する。総分析時間は約２時間である。Ｔｍは、ソフトウェアのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、数学的な２次導関数法を使用して曲線の変曲点を計算する。報告されたＴｍは、３つの測定値の平均である。

【0143】

モノマー含有量の損失は、ＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムの曲線下の面積によって決定される。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＵＳＰの第６２１章で概説されているように、固体固定相と液体移動相に基づく分離技術である。この方法は、疎水性固定相と水性移動相を利用して、サイズと形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムのボイドボリューム（Ｖ０）と総透過ボリューム（ＶＴ）の間で発生する。ＳＥ−ＨＰＬＣによる測定は、自動サンプル注入と２８０ｎｍの検出波長に設定されたＵＶ検出器を備えたＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行われる。装置は、結果のクロマトグラムの分析もサポートするソフトウェアＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージョン３．３．２ ＳＰ２）によって制御される。タンパク質サンプルは遠心分離により清澄化され、注入前にオートサンプラーで４〜６℃の温度に保たれる。ｓｃＦｖサンプルの分析には、Ｓｈｏｄｅｘ ＫＷ４０３−４Ｆ（Ｓｈｏｗａ Ｄｅｎｋｏ Ｉｎｃ、＃Ｆ６９８９２０２）のカラムを、標準化された緩衝生理食塩水移動相（５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．５、３００ｍＭ塩化ナトリウム）とともに、推奨される流速０．３５ｍＬ／分で使用する。注入あたりの目標サンプル負荷は５μｇであった。サンプルは、２８０ｎｍの波長でＵＶ検出器によって検出され、データは適切なソフトウェアスイートによって記録される。結果のクロマトグラムは、Ｖ０からＶＴの範囲で分析され、それにより、１０分を超える溶出時間のマトリックス関連ピークが除外される。

【0144】

本発明は、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供し、前記結合ドメインは、表１に列挙されたＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供する。前記ＣＤ１３７−ＢＤは、表１にリストされたＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、又はそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（又はそれからなる）。

【0145】

本発明はまた、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供し、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合するＣＤ１３７−ＢＤを提供する。前記ＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３つ、又はそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（又はそれからなる）。

【0146】

本発明の他のＣＤ１３７−ＢＤは、変異しているが、表１に記載されている配列で示されているＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。一態様では、本発明の他のＣＤ１３７−ＢＤは、１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以下のアミノ酸が、表１に記載されている配列で示されているＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲ領域で変異している変異アミノ酸配列を含む。

【0147】

「同一」又は「同一性」という用語は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連で、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。核酸、ペプチド、ポリペプチド又は抗体配列に関する「パーセント（％）配列同一性」及び「相同性」は、必要に応じて、配列を整列させ、ギャップを導入した後、最大の配列同一性を達成するために、保存的置換を配列同一性の一部として考慮しないで、特定の核酸、ペプチド、又はポリペプチド配列の酸残基において、ヌクレオチド又はアミノ残基と同一である候補配列中のヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、又はＡＬＩＧＮソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0148】

配列比較では、通常、１つの配列が参照配列として機能し、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じてサブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することも、別のパラメーターを指定することもできる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

【0149】

配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれin Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; 及びAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990に記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公開されている。

【0150】

２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付け残差テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl.
さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ギャップウェイトの１６、１４、１２、１０、８、６、又は４、長さの重みの１、２、３、４、５、又は６を用いて、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970）アルゴリズムを使用して決定できる。

【0151】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコード化されたアミノ酸、ならびにヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリンなど、後で修飾されるアミノ酸である。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。特に明記しない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に改変された変異体を暗黙のうちに包含する。

【0152】

適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号１、４、５、８、１１、３５、３８、４１及び４４のいずれか１つ、好ましくは配列番号１から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号２、６、９、１２、３６、３９、４２及び４５のいずれか、好ましくは配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号３、７、１０、１３、３７、４０、４３及び４６のいずれか、好ましくは配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号１８、２１、２４、４８、５１及び５４のいずれか、好ましくは配列番号１８から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１９、２２、２５、４９、５２、及び５５、好ましくは配列番号１９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号２０、２３、２６、５０、５３及び５６のいずれか、好ましくは配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。好適には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号１、４、５、８、１１、３５、３８、４１、及び４４のいずれか１つ、好ましくは配列番号１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；（ｂ）配列番号２、６、９、１２、３６、３９、４２及び４５のいずれか、好ましくは配列番号２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；（ｃ）配列番号３、７、１０、１３、３７、４０、４３及び４６のいずれか、好ましくは配列番号３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；（ｄ）配列番号１８、２１、２４、４８、５１、及び５４のいずれか、好ましくは配列番号１８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）；（ｅ）配列番号１９、２２、２５、４９、５２、及び５５のいずれか、好ましくは配列番号１９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；及び（ｆ）配列番号２０、２３、２６、５０、５３、及び５６のいずれか、好ましくは配列番号２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。

【0153】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｃ）それぞれ配列番号５、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｄ）それぞれ配列番号８、９、及び１０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｅ）それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２４、２５、及び２６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｆ）それぞれ配列番号３５、３６、及び３７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｇ）それぞれ配列番号３８、３９、及び４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｈ）それぞれ配列番号４１、４２、及び４３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｉ）それぞれ配列番号４４、４５、及び４６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５４、５５、及び５６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0154】

好適には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号１、２、及び３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号４、６、及び７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｃ）それぞれ配列番号５、６、及び７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｄ）それぞれ配列番号８、９、及び１０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ及び配列番号１８、１９、及び２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｅ）それぞれ配列番号１１、１２、及び１３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２４、２５、及び２６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｆ）それぞれ配列番号３５、３６、及び３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｇ）それぞれ配列番号３８、３９、及び４０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｈ）配列番号４１、４２、及び４３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｉ）配列番号４４、４５、及び４６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５４、５５、及び５６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を有する。好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号１、２、及び３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。

【0155】

さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号４又は配列番号５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号４又は配列番号５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号２２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号２３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0156】

なおさらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号４９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号３５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号４９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号５０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0157】

さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号３８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５２のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号５３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ａ）配列番号３８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号３９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号５１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号５２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号５３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0158】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＣＤ１３７−ＢＤを含み、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号５９、６２、６５及び６８のいずれか１つ、好ましくは配列番号５９から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６０、６３、６６及び６９のいずれか、好ましくは配列番号６０から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６１、６４、６７及び７０のいずれか、好ましくは配列番号６１から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号７４、７７及び８０のいずれか、好ましくは配列番号７４から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７５、７８及び８１のいずれか、好ましくは配列番号７５から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号７６、７９及び８２のいずれか、好ましくは配列番号７６から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。適切には、本発明の多重特異性のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号５９、６２、６５及び６８のいずれか１つ、好ましくは配列番号５９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６０、６３、６６及び６９のいずれか１つ、好ましくは配列番号６０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６１、６４、６７及び７０のいずれか１つ、好ましくは配列番号６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号７４、７７及び８０のいずれか１つ、好ましくは配列番号７４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７５、７８及び８１のいずれか１つ、好ましくは配列番号７５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに（ｆ）配列番号７６、７９及び８２のいずれか１つ、好ましくは配列番号７６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

【0159】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号６２、６３及び６４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７７、７８及び７９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列；（ｃ）それぞれ配列番号６５、６６及び６７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列；（ｄ）それぞれ配列番号６８、６９及び７０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号８０、８１、及び８２のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５、７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0160】

好適には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号５９、６０及び６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号６２、６３及び６４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７７、７８及び７９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｃ）それぞれ配列番号６５、６６、及び６７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｄ）それぞれ配列番号６８、６９及び７０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号８０、８１及び８２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号５９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号６０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号７４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号７５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号７６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。

【0161】

さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。本発明の文脈において、用語「ＶＨ」（可変重鎖）、「ＶＬ」（可変軽鎖）、「Ｖκ」及び「Ｖλ」は、配列の同一性及び相同性に従ってグループ化された抗体重鎖及び軽鎖配列のファミリーを指す。例えば、BLOSUM（Henikoff, S. & Henikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919）などの相同性検索マトリックスを使用することによる配列相同性の決定方法、及び相同性による配列のグループ化のための方法は、当業者に周知である。ＶＨに関して、例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86に示されるように、Ｖκ及びＶλを同定することができ、ＶＨはＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ２〜ＶＨ６、ＶκはＶκ１〜Ｖκ４、ＶλはＶλ１〜Ｖλ３にグループ化される。インビボでは、抗体Ｖκ鎖、Ｖλ鎖、及びＶＨ鎖は、生殖細胞系列κ鎖Ｖ及びＪセグメント、生殖細胞系λ鎖Ｖ及びＪセグメント、ならびに重鎖Ｖ、Ｄ及びＪセグメントのランダムな再配置の結果である。所与の抗体可変鎖がどのサブファミリーに属するかは、対応するＶセグメントによって、特にフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３によって決定される。したがって、本出願において特定のセットのフレームワーク領域ＨＦＲ１〜ＨＦＲ３のみによって特徴付けられる任意のＶＨ配列は、任意のＨＦＲ４配列、例えば、重鎖生殖系列Ｊセグメントの１つから取られたＨＦＲ４配列、又は再配置されたＶＨ配列から取得されたＨＦＲ４配列と組み合わせることができる。

【0162】

適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、ＶＨ４又はＶＨ３ドメインフレームワーク配列、好ましくはＶＨ４ドメインフレームワーク配列、より好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列を含む。

【0163】

ＶＨ３ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号７１に示されている。特に、配列番号７１から取られたフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は、ＶＨ３ファミリーに属する（表１、太字で示されていない領域）。適切には、本明細書で使用される場合、ＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号７１のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。

【0164】

ＶＨ４ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号１４に示されている。特に、配列番号１４から取られたフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４は、ＶＨ４ファミリーに属する（表１、太字ではない領域）。適切には、本明細書で使用される場合、ＶＨ４ファミリーに属するＶＨは、配列番号１４のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。

【0165】

適切には、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、好ましくはＶκ１フレームワークＦＲ１〜３、及びＶκＦＲ４、特にＶκ１ＦＲ４、Ｖκ３ＦＲ４、及びＶλＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、配列番号２７又は配列番号８３に示されている（表１、ＦＲ領域は太字では記されていない）。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、ＦＲ１〜３に対応し、配列番号２７又は配列番号８３から取られたアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む（表１、ＦＲ領域は太字では記されていない）。適切なＶλ ＦＲ４は、配列番号１９９〜配列番号２０５に示されるとおりである。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。

【0166】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列：
ａ．それぞれ配列番号１、２、及び３、ならびにそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
ｂ．それぞれ配列番号３５、３６、及び３７、ならびにそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
ｃ．それぞれ配列番号５９、６０、及び６１、ならびにそれぞれ配列番号７４、７５、及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくはＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４、より好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及び特に、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より具体的には配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む。

【0167】

好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体の前記ＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0168】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列：
ａ．それぞれ配列番号４、６、及び７、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列：
ｂ．それぞれ配列番号５、６、及び７、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
ｃ．それぞれ配列番号３８、３９、及び４０、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくはＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４、より好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及び特に、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より具体的には配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む。

【0169】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、以下を含むＶＬを含む：
（ｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；
（ｉｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３、特にヒトＶκ１フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３；
（ｉｉｉ）（ａ）ＦＲ４のヒトＶλ生殖系列配列、特に配列番号１９９〜２０５の列挙から選択されるＶλ生殖系列配列、好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶλＦＲ４；及び（ｂ）配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ４の最も近いヒトＶλ生殖系列配列と比較して、１つ又は２つの変異、特に１つの変異を有するＶλベースの配列、好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶλＦＲ４から選択されるＦＲ４
を含むＶｌを含む。

【0170】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列：
ａ．それぞれ配列番号４、６、及び７、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
ｂ．それぞれ配列番号５、６、及び７、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
ｃ．それぞれ配列番号３８、３９、４０、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）Ｖκ１フレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３を含むＶＬフレームワーク、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、特に配列番号１９９〜配列番号２０５、好ましくは配列番号１９９で示されるＶλＦＲ４を含むＶＬドメイン
を含む。

【0171】

別の好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ｉ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）Ｖκ１フレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３を含むＶＬフレームワーク、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、特に配列番号１９９〜配列番号２０５、好ましくは配列番号１９９で示されるＶλＦＲ４を含むＶＬドメイン
を含む。

【0172】

より好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ｉ）それぞれ配列番号５９、６０、及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５、及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）Ｖκ１フレームワークＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３を含むＶＬフレームワーク、配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、特に配列番号１９９〜配列番号２０５、好ましくは配列番号１９９で示されるＶλＦＲ４を含むＶＬドメイン
を含む。

【0173】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＨドメインを含む。適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、１に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中に約１０以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に記載されているＶＨアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＣＤ１３７−ＢＤは、変異しているが、表１に記載されている配列に示されているＶＨ領域とＶＨ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0174】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＬドメインを含む。適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中に約１０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に列挙されたＶＬアミノ酸配列を含み、ここで、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＣＤ１３７−ＢＤは、変異しているが、ＶＬ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含み、ＶＬ領域は表１に記載されている。

【0175】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１４、１５、１６、１７及び４７、好ましくは配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２７、２８、２９、３０及び５７、好ましくは配列番号３０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0176】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１４、１５、１６、１７及び４７のいずれか、好ましくは配列番号１７から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２７、２８、２９、３０及び５７のいずれか、好ましくは配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0177】

さらなる実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２９のＶＬ配列；（ｄ）配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号３０のＶＬ配列；又は（ｅ）配列番号４７のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列を含む。好ましい態様において、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１７のＶＨ配列及びＶＬ配列番号３０の配列を含む。

【0178】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；（ｂ）それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるＶＬ配列；（ｃ）それぞれ配列番号５、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；（ｄ）それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；又は（ｅ）それぞれ配列番号３８、３９、及び４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列を含む。

【0179】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ａ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｂ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるＶＬ配列；
（ｃ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｄ）それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；又は
（ｅ）それぞれ配列番号３５、３６、及び３７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号４８、４９、及び５０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列
を含む。

【0180】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、列配列番号１７のアミノ酸配と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、ＶＨは、Ｇ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）及び前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、を含む。適切には、本発明の前記ＣＤ１３７−ＢＤは、フレームワーク領域内で人工ドメイン間ジスルフィド架橋を形成するように変異され、特に、システインの対は、前記ＶＨ上のＧｌｙ５１（ＡＨｏ番号付け）及び前記ＶＬ上のＴｈｒ１４１（ＡＨｏ番号付け）を置き換える。驚くべきことに、ドメイン間ジスルフィド架橋を含むこのようなＣＤ１３７−ＢＤは、熱安定性が大幅に向上していることがわかった。

【0181】

ジスルフィド架橋（「ＳＳ架橋」又は「ｄｉＳ」）に関する「人工」という用語は、Ｓ−Ｓ架橋が、野生型抗体によって自然に形成されるのではなく、親分子の操作された変異体によって形成されることを意味する。ここで、少なくとも１つの外来アミノ酸がジスルフィド結合に関与する。人工ジスルフィド架橋の部位特異的操作は、天然免疫グロブリン、又はＷＯ２００９／０００００６に記載されているようなモジュラー抗体で自然に利用可能なものとは明らかに異なる。これは、人工ジスルフィド架橋の橋脚の部位の少なくとも１つが通常、野生型抗体のＣｙｓ残基の位置とは別に配置され、フレームワーク領域内に代替又は追加のジスルフィド架橋を提供するためである。本発明の人工ジスルフィド架橋は、ベータドメイン構造を安定化するか、ドメイン（「ドメイン間架橋」）又はドメインの鎖（「鎖間架橋」）を架橋する抗体ドメイン（「ドメイン内架橋」）内で操作して、本発明による多重特異性抗体の構造を制約し、潜在的な結合パートナーとの相互作用をサポートすることができる。

【0182】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２９のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号１７のＶＨ配列、及び配列番号３０のＶＬ配列；又は
（ｅ）配列番号４７のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列
を含む。

【0183】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、
（ａ）配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２７のＶＬ配列；
（ｂ）配列番号１５のＶＨ配列及び配列番号２８のＶＬ配列；
（ｃ）配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２９のＶＬ配列；
（ｄ）配列番号１７のＶＨ配列、及び配列番号３０のＶＬ配列；又は
（ｅ）配列番号４７のＶＨ配列及び配列番号５７のＶＬ配列
を含む。

【0184】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号３０のＶＬを含む。

【0185】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、表１に記載されている。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一である。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４又は配列番号５８に示されるとおりである。実施形態において、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１又は配列番号３３又は配列番号３４に示されるとおりである。好ましい実施形態において、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、示されるとおりである。より好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３４に示されるとおりである。

【0186】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７１、７２及び７３、好ましくは配列番号７１、より好ましくは配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号８３、８４及び８５、好ましくは配列番号８３、より好ましくは配列番号８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７１、７２及び７３のいずれか、好ましくは配列番号７１、より好ましくは配列番号７３から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号８３、８４及び８５のいずれか、好ましくは配列番号８３、より好ましくは配列番号８５から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0187】

さらなる実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）配列番号７１のＶＨ配列及び配列番号８３のＶＬ配列；（ｂ）配列番号７２のＶＨ配列及び配列番号８４のＶＬ配列；又は（ｃ）配列番号７３のＶＨ配列及び配列番号８５のＶＬ配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７１のＶＨ配列及びＶＬ配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７３のＶＨ配列及び配列番号８５のＶＬ配列を含む。

【0188】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５、及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるＶＨ配列、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；（ｂ）それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるＶＨ配列、及び配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；又は（ｃ）それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５、及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるＶＨ配列、及び配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、を含む。

【0189】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一のＶＨ配列、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一のＶＬ配列を含み、好ましくは前記ＶＨはＧ５１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、及び前記ＶＬはＴ１４１Ｃ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む。適切には、本発明の前記ＣＤ１３７−ＢＤは、フレームワーク領域内で人工ドメイン間ジスルフィド架橋を形成するように変異され、特に、システインの対は、前記ＶＨ上のＧｌｙ５１（ＡＨｏ番号付け）及び前記ＶＬ上のＴｈｒ１４１（ＡＨｏ番号付け）を置き換える。驚くべきことに、ドメイン間ジスルフィド架橋を含むこのようなＣＤ１３７−ＢＤは、熱安定性が大幅に向上していることがわかった。

【0190】

好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７１のＶＨ配列、及び配列番号８３のＶＬを含む。より好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号７３のＶＨ配列、及び配列番号８５のＶＬを含む。

【0191】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは表１に記載されている。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６、８７及び８８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一である。一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６、配列番号８７、又は配列番号８８に記載される。好ましい態様において、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６に記載される。より好ましい態様において、ＣＤ１３７−ＢＤ本発明のＢＤは、配列番号８８に記載される。

【0192】

本発明の他のＣＤ１３７−ＢＤは、アミノ酸又はアミノ酸をコードする核酸が変異されているが、表１に記載されている配列と少なくとも６０、７０、８０、９０又は９５パーセントの同一性を有するものを含む。実施形態では、それは、表１に記載された配列に示される可変領域と比較した場合、実質的に同じ治療活性を保持しながら、１、２、３、４又は５以下のアミノ酸が可変領域で変異している変異アミノ酸配列を含む。本明細書で使用される「実質的に同じ活性」という用語は、親ＣＤ１３７−ＢＤ、特に表１に記載されている本発明のＣＤ１３７−ＢＤについて決定した場合、実質的に同じ活性が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも１００％、又は少なくとも１１０％、又は少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％、又は少なくとも１４０％、又は少なくとも１５０％、又は少なくとも１６０％、又は少なくとも１７０％、又は少なくとも１８０％、又は少なくとも１９０％、例えば、最大２００％の活性であることによって指示される活性を指す。

【0193】

これらの各結合ドメイン又は抗体はＣＤ１３７に結合でき、抗原結合特異性は主にＣＤＲ１、２及び３領域によって提供されるため、ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３配列とＶＬ ＣＤＲ１、２及び３配列は、「混合して適合させる」ことができる（すなわち、各結合ドメイン又は各抗体は、本発明の他のＣＤ１３７結合を作成するためにＶＨ ＣＤＲ１、２及び３とＶＬ ＣＤＲ１、２及び３を含んでいる必要があるが、異なる結合ドメイン又は抗体のＣＤＲを混合して適合させることができる）。そのような「混合及び適合される」ＣＤ１３７−ＢＤは、当技術分野で公知の結合アッセイ及び実施例に記載されているもの（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列が混合及び適合されると、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換える必要がある。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合して適合させる場合、特定のＶＬ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は構造的に類似したＣＤＲ配列で置換される必要がある。新規のＶＨ及びＶＬ配列は、本発明のモノクローナル抗体又はの結合ドメインについて本明細書に示されるＣＤＲ配列からの構造的に類似した配列で１つ又は複数のＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ領域配列を変異させることによって作され得ることは、当業者には容易に明らかである。

【0194】

さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載の配列と相同であるアミノ酸配列を含むＣＤ１３７−ＢＤを提供し、前記結合ドメインはＣＤ１３７に結合し、表１に記載のこれらの結合ドメインの所望の機能特性を保持する。

【0195】

例えば、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＣＤ１３７−ＢＤを提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５、１６、１７、４７、７１、７２及び７３、好ましくは配列番号１７、より好ましくは配列番号７１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２７、２８、２９、３０、５７、８３、８４及び８５、好ましくは配列番号３０、より好ましくは配列番号８５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；ここで、結合ドメインは、ヒトＣＤ１３７タンパク質に特異的に結合する。

【0196】

一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、表１に記載される配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であり得る。一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて同一であり得る。

【0197】

一実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、ここで、これらのＣＤＲ配列の１つ又は複数が、本明細書に記載のＣＤ１３７−ＢＤに基づく特定のアミノ酸配列又はその保存的改変を有し、ＣＤ１３７−ＢＤは本発明のＣＤ１３７−ＢＤの所望の機能特性を保持する。

【0198】

「保存的に改変された変異体」又は「保存的変異体」という用語は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一の多数の核酸が任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定されるすべての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異を記述する。当業者は、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が機能的に同一の分子を生じるように改変され得ることを認識する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントバリエーションは、記載された各配列に内在している。

【0199】

ポリペプチド配列について、「保存的に改変された変異体」又は「保存的変異体」は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす、ポリペプチド配列への個々の置換、欠失又は付加を含む。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野でよく知られている。そのような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に加えられ、それらを除外しない。次の８つのグループには、互いに保守的な置換であるアミノ酸が含まれる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照）。一実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意な影響を与えたり変更したりしないアミノ酸修飾を指すために使用される。

【0200】

したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及びＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域からなるＣＤ１３７−ＢＤを提供し、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、好ましくは、配列番号１、４、５、８、１１、３５、３８、４１、４４、５９、６２、６５、及び６８のいずれか、好ましくは配列番号１、より好ましくは配列番号５９、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなり；重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号２、６、９、１２、３６、３９、４２、４５、６０、６３、６６、及び６９のいずれか、好ましくは配列番号２、より好ましくは配列番号６０、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなり；重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号３、７、１０、１３、３７、４０、４３、４６、６１、６４、６７及び７０のいずれか、好ましくは配列番号３、より好ましくは配列番号６１、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなり；軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号１８、２１、２４、４８、５１、５４、７４、７７及び８０のいずれか、好ましくは配列番号１８、より好ましくは配列番号７４、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなり；軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号１９、２２、２５、４９、５２、５５、７５、７８及び８１のいずれか、好ましくは配列番号１９、より好ましくは配列番号７５、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなり；及び軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号２０、２３、２６、５０、５３、５６、７６、７９及び８２のいずれか、好ましくは配列番号２０、より好ましくは配列番号７６、又はその保存的変異体から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる、を含み、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、追加の架橋の有無にかかわらずＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる。

【0201】

一実施形態では、哺乳動物細胞での発現に最適化された本発明のＣＤ１３７−ＢＤ又はＣＤ１３７−ＢＤを含む多重特異性抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、ここで、これらの配列の１つ又は複数は、本明細書に記載のＣＤ１３７−ＢＤに基づく特定のアミノ酸配列を有する又はその保存的改変を有し、及びＣＤ１３７−ＢＤ又は該ＣＤ１３７−ＢＤを含む多重特異性抗体は、本発明のＣＤ１３７−ＢＤの所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、哺乳動物細胞での発現に最適化された本発明のＣＤ１３７−ＢＤ又は該ＣＤ１３７−ＢＤを含む多重特異性抗体を提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１４、１５、１６、１７、４７、７１、７２及び７３のいずれか、好ましくは配列番号１７、より好ましくは配列番号７１から選択される酸配列、及びそれらの保存的改変を含み；軽鎖可変領域は、配列番号２７、２８、２９、３０、５７、８３、８４及び８５のいずれか、好ましくは配列番号３０、より好ましくは配列番号８３から選択されるアミノ酸配列、及びその保守的改変を含み；ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、追加の架橋の有無にかかわらずＣＤ１３７シグナル伝達を活性化することができる。

【0202】

本明細書で使用される場合、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞又は生物、一般に真核細胞、例えばピキアの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としても知られている開始ヌクレオチド配列によって元々コードされていたアミノ酸配列を完全に又は可能な限り保持するように操作される。本明細書で最適化された配列は、哺乳動物細胞で好ましいコドンを有するように操作されている。しかしながら、他の真核細胞又は原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において想定される。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、最適化されたとも呼ばれる。

【0203】

別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより「親和性成熟」として知られる、目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を向上させることである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を行って突然変異を導入し、抗体結合又は他の目的の機能的特性への影響を、本明細書に記載され、実施例で提供されるｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。（前述のように）保守的な変更を導入できる。突然変異は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であり得る。さらに、典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ又は５つ以下の残基が変更される。

【0204】

「親和性成熟した」抗体又は結合ドメインは、変更がないその親ドメインの抗体又は結合ドメインと比較して、抗原に対する抗体又は結合ドメインの親和性の改善をもたらす、その１つ又は複数の可変ドメインに１つ又は複数の変更があるものである。一実施形態では、親和性成熟した抗体又は結合ドメインは、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性さえ有する。親和性成熟した抗体又はドメインは、当技術分野で知られている手順によって生成される。例えば、Marks et al, Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインのシャッフリングによる親和性成熟について記述する。超可変領域（ＨＶＲ）及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310- 9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)に記載される。

【0205】

一実施形態では、本発明の「親和性成熟した」ＣＤ１３７−ＢＤは、Ｉ４４Ｖ；Ｆ８９Ｖ；Ｙ１０５Ｆ変異を含むＶＨ４４（特に配列番号１５によるアミノ酸配列を含む）；及びＡ５１Ｐ変異を含むＶＬ（特に配列番号２８によるアミノ酸配列を含む）を含む。

【0206】

別の実施形態では、本発明の「親和性成熟した」ＣＤ１３７−ＢＤは、Ｉ４４Ｖ；Ｖ８２Ｋ；Ｆ８９Ｖ；Ｙ１０５Ｆ変異を含むＶＨ４（特に配列番号１６によるアミノ酸配列を含む）；及びＩ２Ｌ；Ａ５１Ｐ変異を含むＶＬ（特に配列番号２９によるアミノ酸配列を含む）を含む。

【0207】

本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、開始の結合ドメインから変更された特性を有し得る、改変された結合ドメインを操作するために、本明細書に示されるＶＨ及び／又はＶＬ配列の１つ以上を出発物質として有する抗体又はその結合ドメインを使用して調製することができる。結合ドメインは、可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）の一方又は両方の１つ以上の残基を、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内で修飾することによって操作することができる。

【0208】

実施することができる可変領域操作の１つのタイプは、ＣＤＲグラフティングである。抗体又はその結合ドメインは、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）にあるアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列よりも、個々の抗体又はその結合ドメイン間で多様である。
ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトさせた、特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣した組換え抗体又は結合ドメインを発現させることができる（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522- 525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86: 10029-10033; U.S. Pat. No. 5,225,539 to Winter, and U.S. Pat. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 and 6,180,370 to Queen et al.を参照されたい）。

【0209】

このようなフレームワーク配列は、生殖ＤＮＡ抗体遺伝子配列又は再構成された抗体配列を含み、公開ＤＮＡデータベース又は公開された参考文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）、ならびに、それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれるKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836に見出すことができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列と再構成された抗体配列は、「ＩＭＧＴ」データベース（インターネットのwww.imgt.orgで入手可能；それぞれの内容は参照により本明細書に明示的に組み込まれるLefranc, M.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212を参照されたい）に見出すことができる。

【0210】

本発明のＣＤ１３７−ＢＤで使用するためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択されたＣＤ１３７−ＢＤによって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３配列、及びＶＬ ＣＤＲ１、２及び３配列は、フレームワーク配列の派生元である生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見られる配列と同じ配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得るか、又はＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して、１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、特定の例では、フレームワーク領域内の残基を変異させて、抗体又はその結合ドメインの抗原結合能力を維持又は増強することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号を参照されたい）。

【0211】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、及び限定されないが、アンキリンベースのドメイン、フィノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えば、ｆ−ｓｔａｒテクノロジー（Ｆ−ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ））などの代替の足場に基づく結合ドメインからなる群から選択される。

【0212】

適切には、本発明のＣＤ１３７−ＢＤはｓｃＦｖ抗体断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが標的結合に望ましい構造を形成することが可能になる。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＦドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能である（例えば、Pluckthun, The pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315を参照されたい）。

【0213】

特定の実施形態では、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号２０６によるリンカーを含むｓｃＦｖである。

【0214】

さらなる実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４及び配列番号５８、好ましくは配列番号３４に示されるような一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。１つの実施形態において、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３２に示されるような一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。別の実施形態において、ＣＤ１３７−ＢＤは、本発明のＣＤ１３７は、配列番号３３に示されるような一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３４に示されるような一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。さらに好ましい実施形態では、本発明のＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６、８７又は８８、好ましくは配列番号８６、より好ましくは配列番号８８に示される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。

【0215】

本発明の多重特異性抗体で使用するための他の適切なＣＤ１３７結合ドメインは、以下からなる群から選択される抗体を含むか又はそれに由来する：（ｉ）ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３；完全ヒト化ＩｇＧ４ ｍＡｂ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；ＷＯ２００４／０１０９４７、ＵＳ６，８８７，６７３及びＵＳ７，２１４，４９３に記載され、これらは、参照によりそれらの全体が本出願に組み込まれる）；及び（ｉｉ）オトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６；完全ヒトＩｇＧ２ ｍＡｂ；Ｐｈｉｚｅｒ；ＷＯ２０１２／０３２４３３及びＵＳ８，８２１，８６７に記載され、これは参照によりその全体が本出願に組み込まれる）。

【0216】

本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＰＤＬ１結合ドメイン（ＰＤＬ１−ＢＤ）を含む。

【0217】

「ＰＤＬ１」という用語は、特に、本明細書で配列番号１９８として再現された、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９ＮＺＱ７を有するヒトＰＤＬ１を指す。好適には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、本明細書に配列番号１９８として複製されているＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｑ９ＮＺＱ７に示されているＰＤＬ１、特にヒトＰＤＬ１を標的とする。適切には、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤＬ１−ＢＤ標的ヒト及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＤＬ１を含み、好ましくはＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＰＤＬ１と交差反応しない。本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ヒトＰＤＬ１タンパク質に特異的に結合する。

【0218】

本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１阻害剤である。「ブロッカー」又は「ブロッキング抗体」又は「阻害剤」又は「阻害抗体」又は「アンタゴニスト」又は「アンタゴニスト抗体」又は「ブロッキング結合ドメイン」又は「阻害結合ドメイン」という用語は、それが結合する抗原の生物活性を阻害又は低下させる抗体又はその結合ドメインを指す。いくつかの実施形態では、遮断抗体又は遮断結合ドメイン又は拮抗薬抗体又は拮抗薬結合ドメインは、抗原の生物活性を実質的又は完全に阻害する。本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１のその結合パートナーへの結合能力を標的とし、低下させ、阻害し、それによりＰＤＬ１機能を妨害する。特に、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１とその受容体、特にＰＤ−１との相互作用を遮断する。いくつかの実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１とその１つ又は複数の受容体、特にＰＤ−１及び／又はＢ７−１との相互作用を遮断する。

【0219】

一部の実施形態では、ＰＤＬ１−ＢＤは、モノクローナル抗体又は抗体断片に由来する。

【0220】

本発明の多重特異性抗体での使用に適したＰＤＬ１−ＢＤは、本開示で提供される新規結合ドメインである。本発明の新規ＰＤＬ１結合ドメインは、限定されないが、実施例を含む、本明細書に記載されるように単離されたヒト化モノクローナル抗体を含む。そのようなＰＤＬ１−ＢＤの例は、その配列が表２に列挙されている抗体又はその結合ドメインである。

【0221】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはＰＤＬ１に特異的に結合し、以下のパラメーターの１つ又は複数によって特徴付けられる：
（ｉ）特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、１０ｎＭ未満、特に５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、さらに特に１００ｐＭ未満、好ましくは５０ｐＭ未満、より好ましくは１０ｐＭ未満、より好ましくは５ｐＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＰＤＬ１に結合し、ここで、前記抗体はｓｃＦｖ（一価親和性）である；
（ｉｉ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｆｆ速度が１０^-3ｓ^-1以下、又は１０^-4ｓ^-1以下、又は１０^-5ｓ^-1以下でヒトＰＤＬ１に結合し、ここで、前記抗体はｓｃＦｖである；
（ｉｉｉ）ＳＰＲで測定した場合、Ｋｏｎ速度が少なくとも１０３Ｍ−１ｓ−１以上、少なくとも１０４Ｍ−１ｓ−１以上、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１以上、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１以上でヒトＰＤＬ１に結合し、特に、前記抗体がｓｃＦｖである；
（ｉｖ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、特に５００ｐＭ未満、さらに特に１００ｐＭ未満、好ましくは１０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＰＤＬ１に結合する；
（ｖ）特にＳＰＲで測定した場合、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＰＤＬ１に対して非交差反応性である；及び／又は
（ｖｉ）特にＳＰＲで測定した場合、ヒトＰＤＬ２に結合しない。

【0222】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１、例えばヒトＰＤＬ１に対して高い親和性を有する。適切な実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、１〜５０，０００ｐＭ、１〜４０，０００ｐＭ、１〜３０，０００ｐＭ、１〜２０，０００ｐＭ、１〜１０，０００ｐＭ、１〜５，０００ｐＭ、１〜２５００ｐＭ、１〜１０００ｐＭ、１〜７５０ｐＭ、１〜５００ｐＭ、１〜２５０ｐＭ、１〜１００ｐＭのＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。適切な実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、約５０ｎＭ未満、約４５ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３５ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約未満５ｎＭ、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．２５ｎＭ未満、１００ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、又は５ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、１ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、０．５ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。好ましくは、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲにより測定されるように、１０ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。より好ましくは、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、５ｐＭ未満のＫＤでヒトＰＤＬ１に結合する。

【0223】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、少なくとも１０³Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０４Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０４Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０６Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1以上、少なくとも５×１０⁷Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＰＤＬ１に結合する。好ましくは、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＳＰＲにより測定した場合、少なくとも１０⁵Ｍ^-1ｓ^-1以上、特に少なくとも１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1以上のＫｏｎ速度でヒトＰＤＬ１に結合する。特に、抗体はｓｃＦｖ（一価親和性）である。

【0224】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合、１０^-3ｓ^-1以下、３×１０^-3ｓ^-1以下、５×１０^-3ｓ^-1以下、１０^-4ｓ^-1以下、５×１０^-4ｓ^-1以下、１０^-5ｓ^-1以下、５×１０^-5ｓ^-1以下、１０^-6ｓ^-1以下、又は１０^-7ｓ^-1以下のＫｏｆｆ速度でヒトＰＤＬ１に結合する。好ましくは、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＳＰＲによって測定した場合、１０^-3ｓ^-1以下、１０^-4ｓ^-1以下、特に１０^-5ｓ^-1以下のＫｏｆｆ速度でヒトＰＤＬ１に結合する。

【0225】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１に特異的に結合し、以下のパラメーターの１つ又は複数によって特徴付けられる：（ｉ）ｓｃＦｖ形式の場合、示差走査蛍光分析により決定すると、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、好ましくは少なくとも６５℃、より好ましくは少なくとも７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有する（特に、ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４のリン酸−クエン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌで製剤化され、特に、前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液に製剤化される）；（ｉｉ）ｓｃＦｖ形式の場合、５回の連続した凍結融解サイクル後に、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、５％未満、好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失がある（特に、ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液中に製剤化される）；及び／又は（ｉｉｉ）ｓｃＦｖ形式の場合、４℃で少なくとも２週間、特に少なくとも４週間保存した後、本発明の抗体が１０ｍｇ／ｍｌの開始濃度である場合、１５％未満、例えば１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、好ましくは１％未満のモノマー含有量の損失がある（特に本発明の抗体、例えば前記抗体又はその抗原結合断片は、ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に製剤化される）。

【0226】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されたＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されているＶＨ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３、又はそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含む。

【0227】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されたＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む。特に、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、。表２に列挙されているＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３又はそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含む。

【0228】

本発明の他のＰＤＬ１−ＢＤは、変異しているが、表２に記載の配列に記述されるＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。本発明の他のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に記載されている配列で示されるＣＤＲ領域と比較した場合、ＣＤＲ領域において、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以下のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列を含む。

【0229】

本発明は、（ａ）配列番号８９、９２、９３、９６、９９、１１９、１２２、１２３、１２６及び１２９のいずれか１つ、好ましくは配列番号８９又は１１９、より好ましくは配列番号８９から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０、９４、９７、１００、１２０、１２４、１２７及び１３０のいずれか、好ましくは配列番号９０又は１２０、より好ましくは配列番号９０から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９１、９５、９８、１０１、１２１、１２５、１２８及び１３１のいずれか、好ましくは配列番号９１又は１２１、より好ましくは配列番号９１から選択されたアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０５、１０８、１１１、１３５、１３８及び１４１のいずれか、好ましくは配列番号１０５又は１３５、より好ましくは配列番号１０５から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０６、１０９、１１２、１３６、１３９及び１４２のいずれか、好ましくは配列番号１０６又は１３６、より好ましくは配列番号１０６から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１０７、１１０、１１３、１３７、１４０及び１４３、好ましくは配列番号１０７又は１３７、より好ましくは、配列番号１０７から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれらからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３、を含むＰＤＬ１−ＢＤを提供する。

【0230】

適切には、本発明の単離された抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）配列番号８９、９２、９３、９６、９９、１１９、１２２、１２３、１２６、及び１２９のいずれか、好ましくは配列番号８９又は１１９、より好ましくは配列番号８９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０、９４、９７、１００、１２０、１２４、１２７及び１３０のいずれか、好ましくは配列番号９０又は１２０、より好ましくは配列番号９０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９１、９５、９８、１０１、１２１、１２５、１２８及び１３１のいずれか、好ましくは配列番号９１又は１２１、より好ましくは配列番号９１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０５、１０８、１１１、１３５、１３８及び１４１のいずれか、好ましくは配列番号１０５又は１３５、より好ましくは配列番号１０５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０６、１０９、１１２、１３６、１３９及び１４２のいずれか、好ましくは配列番号１０６又は１３６、より好ましくは配列番号１０６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに（ｆ）配列番号１０７、１１０、１１３、１３７、１４０及び１４３のいずれかに、好ましくは配列番号１０７又は１３７、より好ましくは配列番号１０７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

【0231】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、以下を含む：（ａ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号９２、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｃ）それぞれ配列番号９３、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｄ）それぞれ配列番号９６、９７、及び９８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｅ）それぞれ配列番号９９、１００、及び１０１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１１１、１１２、及び１１３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｆ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｇ）それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｈ）それぞれ配列番号１２３、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｉ）それぞれ配列番号１２６、１２７、及び１２８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｊ）それぞれ配列番号１２９、１３０、及び１３１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１４１、１４２、及び１４３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0232】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０５、１０６、及び１０７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｂ）それぞれ配列番号９２、９４、及び９５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０８、１０９、及び１１０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｃ）それぞれ配列番号９３、９４、及び９５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０８、１０９、及び１１０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｄ）それぞれ配列番号９６、９７、及び９８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０５、１０６、及び１０７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｅ）それぞれ配列番号９９、１００、及び１０１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１１１、１１２、及び１１３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｆ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１３５、１３６、及び１３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｇ）それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１３８、１３９、及び１４０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｈ）それぞれ配列番号１２３、１２４、及び１２５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１３８、１３９、及び１４０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｉ）それぞれ配列番号１２６、１２７、及び１２８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１３５、１３６、及び１３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列；（ｊ）それぞれ配列番号１２９、１３０、及び１３１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１４１、１４２、及び１４３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列配列を含む。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号８９、９０、及び９１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列；及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列；及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0233】

好適には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号８９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１０７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0234】

さらなる実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；（ｆ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号９２又は配列番号９３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号９４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号９５に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１０８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１０９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１１０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0235】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号１１９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１２１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１３５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３６と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１３７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0236】

さらなる実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む：適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号１２３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１２４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１２５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＨＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１４０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなるＬＣＤＲ３を含む。

【0237】

さらなる実施形態において、本発明は、ＰＤＬ１（例えば、ヒトＰＤＬ１タンパク質）に特異的に結合するＰＤＬ１−ＢＤを提供し、ここで、前記結合ドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。

【0238】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４を含む。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはＶＨ３ドメインを含む。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはＶＨ４ドメインを含む。別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＶＨ１Ａ又はＶＨ１Ｂドメインを含む。

【0239】

ＶＨ１ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号１０３に示されている。特に、配列番号１０３から取られたフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は、ＶＨ１ファミリーに属している（表１、太字で示されていない領域）。適切には、本明細書で使用される、ＶＨ１ファミリーに属するＶＨは、配列番号１０３のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。

【0240】

ＶＨ３ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号１０４に示されている。特に、配列番号１０４から取られたフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は、ＶＨ３ファミリーに属している（表２、太字で示されていない領域）。適切には、本明細書で使用される、ＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号１０４のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。

【0241】

ＶＨ４ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号１０２に示されている。特に、配列番号１０２から取られたフレームワーク領域ＦＲ１からＦＲ４は、ＶＨ４ファミリーに属している（表２、太字で示されていない領域）。好適には、本明細書で使用される、ＶＨ４ファミリーに属するＶＨは、配列番号１０２のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。

【0242】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、好ましくはＶκ１フレームワークＦＲ１〜３、及びＶκＦＲ４、特にＶκ１ＦＲ４、Ｖκ３ＦＲ４、及びＶλＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４を含む。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、配列番号１１４に示されている（表２、ＦＲ領域は非太字で示されている）。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、ＦＲ１〜３に対応するアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有し、配列番号１１４から取られたアミノ酸配列を含む（表２、ＦＲ領域は非−大胆な）。適切なＶλ ＦＲ４は、配列番号１９９〜配列番号２０５に示されるとおりである。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１９９から配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。

【0243】

したがって、一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列：
ａ．それぞれ配列番号９２、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
ｂ．それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列：又は
ｃ．それぞれ配列番号１２３、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメイン、好ましくはＶＨ４ドメイン；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９に記載される、を含むＶＬドメイン。

【0244】

別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ｉ）それぞれ配列番号９３、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３又はＶＨ４ドメイン、好ましくはＶＨ１Ａ又はＶＨ１Ｂドメイン；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９〜配列番号２０５に記載され、より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９に記載される、を含むＶＬドメイン。

【0245】

特定の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ｉ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメイン、好ましくはＶＨ４ドメイン；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９〜配列番号２０５に記載され、より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９に記載される、を含むＶＬドメイン。

【0246】

好ましい実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ｉ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくは、ＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；ならびに
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９〜配列番号２０５に記載され、より好ましくはＶλ ＦＲ４は配列番号１９９に記載される、を含むＶＬドメイン。

【0247】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、以下を含むＶＬを含む：
（ｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；
（ｉｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３、特にヒトＶκ１フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３；
（ｉｉｉ）（ａ）ＦＲ４のヒトＶλ生殖系列配列、特に配列番号１９９〜２０５の列挙から選択されたＶλ生殖系列配列から選択されるＦＲ４、好ましくはＶλＦＲ４は配列番号１９９に示されるとおりである；及び（ｂ）配列番号１９９〜配列番号２０５、好ましくは配列番号１９９のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＦＲ４の最も近いヒトＶλ生殖系列配列と比較して、１つ又は２つの変異、特に１つの変異を有するＶλベースの配列。

【0248】

本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されたＶＨドメインを含む。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１０以下のアミノ酸が変異している（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＰＤＬ１−ＢＤは、変異されているが、ＶＨ領域において、表２で説明されている配列に示されているＶＨ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0249】

本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に記載されているＶＬドメインを含む。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に記載されているＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１０以下のアミノ酸が変異している（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に列挙されているＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＰＤＬ１−ＢＤは、変異しているが、ＶＬ領域において、表２に記載されている配列に描かれているＶＬ領域と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0250】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４、好ましくは配列番号１０２又は１０４、より好ましくは配列番号１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５、好ましくは配列番号１１４又は１１５、より好ましくは配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0251】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４、好ましくは配列番号１０２又は１０４、より好ましくは配列番号１０４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５、好ましくは配列番号１１４又は１１５、より好ましくは配列番号１１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0252】

さらなる実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、（ａ）配列番号１０２のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列；（ｂ）配列番号１０３のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列；（ｃ）配列番号１０４のＶＨ配列及び配列番号１１５のＶＬ配列；（ｄ）配列番号１３２のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列；（ｅ）配列番号１３３のＶＨ配列及び配列番号１４５のＶＬ配列；又は（ｆ）配列番号１３４のＶＨ配列及び配列番号１４４のＶＬ配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１０２のＶＨ配列及び配列番号１１４のＶＬ配列を含む。より好ましい実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１０４のＶＨ配列及び配列番号１１５のＶＬ配列を含む。

【0253】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、以下の含む：
（ａ）それぞれ配列番号９２、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ；
（ｂ）それぞれ配列番号９３、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｃ）それぞれ配列番号９２、９３及び９４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１０８、１０９及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＧ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＳ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；
（ｄ）それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１４４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｅ）それぞれ配列番号１２３、１２４、１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１４５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨはＶ２Ｓ、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬは、Ｉ２Ｆ、Ｍ４Ｌ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；又は
（ｆ）それぞれ配列番号１２２、１２４及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１４４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨは、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ及びＦ８９Ｖ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む、を含む。

【0254】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ａ）それぞれ配列番号８９、９０、９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｂ）それぞれ配列番号８９、９０、９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｃ）それぞれ配列番号８９、９０、９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１０５、１０６、１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、ＶＨはＧ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、ＶＬはＳ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ番号付け）；
（ｄ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１４４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列；
（ｅ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、配列番号１４５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、ここで、前記ＶＨは、Ｖ２Ｓ、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ、Ｆ８９Ｖ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬは、Ｉ２Ｆ、Ｍ４Ｌ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む；又は
（ｆ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、配列番号１４４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは、前記ＶＨは、Ｖ２５Ａ、Ｉ４４Ｖ、Ｇ５６Ａ、Ｖ８２Ｋ及びＦ８９Ｖ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む。

【0255】

好ましい態様において、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、及び配列番号１１５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列を含み、好ましくは、前記ＶＨはＧ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異（ＡＨｏ番号付け）を含み、前記ＶＬはＳ９Ａ及びＡ５１Ｐ変異（ＡＨｏ番号付け）を含む。

【0256】

一実施形態では、ＰＤＬ１に特異的に結合するＰＤＬ１−ＢＤは、表２に記載される結合ドメインである。一実施形態では、ＰＤＬ１に特異的に結合する本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４６、配列番号１４７、又は配列番号１４８に示されるとおりである。一実施形態において、ＰＤＬ１に特異的に結合する本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６又は配列番号１１７、又は配列番号１１８、好ましくは配列番号１１６、より好ましくは配列番号１１８に記載されている。一実施形態では、ＰＤＬ１に特異的に結合する本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１４６又は配列番号１４７又は配列番号１４８、好ましくは配列番号１４６、より好ましくは配列番号１４８に示されるとおりである。

【0257】

本発明の他のＰＤＬ１−ＢＤには、アミノ酸又はアミノ酸をコードする核酸が変異しているが、表２に記載されている配列と少なくとも６０、７０、８０、９０又は９５パーセントの同一性を有するものが含まれる。一実施形態では、実質的に同じ活性を保持しながら、表２に記載された配列に示されている可変領域と比較した場合、１、２、３、４又は５以下のアミノ酸が可変領域で変異している変異アミノ酸配列を含む。本明細書で使用される「実質的に同じ活性」という用語は、実質的に同じ活性が、親ＰＤＬ１−ＢＤ、特に表２に記載されている本発明のＰＤＬ１−ＢＤについて決定された場合の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又はさらには少なくとも１００％、又は少なくとも１１０％、又は少なくとも１２０％、又は少なくとも１３０％、又は少なくとも１４０％、又は少なくとも１５０％、又は少なくとも１６０％、又は少なくとも１７０％、又は少なくとも１８０％、又は少なくとも１９０％、例えば、最大２００％であることによって示される活性を指す。

【0258】

これらの各結合ドメインはＰＤＬ１に結合することができ、抗原結合特異性は主にＣＤＲ１、２及び３領域によって提供されるため、ＶＨ ＣＤＲ１、２及び３配列とＶＬ ＣＤＲ１、２及び３配列は「混合及び適合」され得る。そのような「混合及び適合される」ＰＤＬ１−ＢＤは、当技術分野で公知の結合アッセイ及び実施例に記載されているもの（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して試験することができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合して適合させる場合、特定のＶＨ配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換える必要がある。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合して適合させる場合、特定のＶＬ配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似したＣＤＲ配列で置き換える必要がある。

【0259】

さらに別の実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、表２に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含み、前記ＢＤはＰＤＬ１に結合し、表２に記載されている抗体の所望の機能特性を保持する。

【0260】

例えば、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＰＤＬ１−ＢＤを提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４、好ましくは配列番号１０２又は１０４、より好ましくは配列番号１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；
軽鎖可変領域は、配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５、好ましくは配列番号１１４又は１１５、より好ましくは配列番号１１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。

【0261】

一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、表２に記載される配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。一実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４又は５個以下のアミノ酸位置でのアミノ酸置換を除いて同一であり得る。

【0262】

一実施形態では、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含むＰＤＬ１−ＢＤを提供し、これらのＣＤＲ配列の１つ又は複数が特定されている本明細書に記載されるＰＤＬ１−ＢＤ又はその保存的改変に基づくアミノ酸配列、及びＰＤＬ１−ＢＤは本発明のＰＤＬ１−ＢＤの所望の機能特性を保持する。

【0263】

したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含むＰＤＬ１−ＢＤを提供し、ここで、重鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号８９、９２、９３、９６、９９、１１９、１２２、１２３、１２６及び１２９、好ましくは配列番号８９又は１１９、より好ましくは配列番号８９のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保存的変異体を含み；重鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号９０、９４、９７、１００、１２０、１２４、１２７及び１３０、好ましくは配列番号９０又は１２０、より好ましくは配列番号９０のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保守的変異体を含み；重鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号９１、９５、９８、１０１、１２１、１２５、１２８及び１３１、好ましくは配列番号９１又は１２１、より好ましくは配列番号９１のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保守的変異体を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ１は、配列番号１０５、１０８、１１１、１３５、１３８、及び１４１、好ましくは配列番号１０５又は１３５、より好ましくは配列番号１０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保守的変異体を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ２は、配列番号１０６、１０９、１１２、１３６、１３９及び１４２、好ましくは配列番号１０６又は１３６、より好ましくは配列番号１０６のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保存的変異体を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ３は、配列番号１０７、１１０、１１３、１３７、１４０、及び１４３、好ましくは配列番号１０７又は１３７、より好ましくは配列番号１０７のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はその保守的変異体を含み；ここで、ＰＤＬ１−ＢＤは、ＰＤＬ１に特異的に結合し、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックすることができる。

【0264】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、哺乳動物細胞における発現に最適化されており、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を有し、これらの配列の１つ又は複数は、本明細書に記載される結合ドメインに基づいて特定のアミノ酸配列又はその保存的変異体を有し、結合ドメインは、本発明のＰＤＬ１−ＢＤの所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む哺乳動物細胞での発現に最適化されたＰＤＬ１−ＢＤを提供し、ここで、重鎖可変領域は、配列番号１０２、１０３、１０４、１３２、１３３及び１３４、好ましくは配列番号１０２又は１０４、より好ましくは配列番号１０４のいずれかから選択されるアミノ酸配列、及びその保存的変異体を含み；軽鎖可変領域は、配列番号１１４、１１５、１４４及び１４５、好ましくは配列番号１１４又は１１５、より好ましくは配列番号１１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列、及びその保存的変異体を含み；ここで、ＰＤＬ１−ＢＤはＰＤＬ１に特異的に結合し、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックすることができる。

【0265】

一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、Ｇ５６Ａ及びＹ１０５Ｆ変異を含むＶＨ３、特に配列番号１０４に記載のアミノ酸配列を含むＶＨ３を含む；好ましくはＳ９Ａを含むＶＬ；Ａ５１Ｐ変異、特に配列番号１１５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0266】

１つの実施形態において、本発明の「親和性成熟した」ＰＤＬ１−ＢＤは、Ｖ２５Ａ；Ｉ４４Ｖ；Ｇ５６Ａ；Ｖ８２Ｋ；Ｆ８９Ｖ変異を含むＶＨ４を含み、特に配列番号１３４のアミノ酸配列を含む；好ましくは配列番号１４４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。さらなる実施形態では、本発明の「親和性成熟した」ＰＤＬ１−ＢＤは、Ｖ２Ｓ；Ｖ２５Ａ；Ｉ４４Ｖ；Ｇ５６Ａ；Ｖ８２Ｋ；Ｆ８９Ｖ；Ｙ１０５Ｆ変異を含むＶＨ４、特に配列番号１３３のアミノ酸配列を含み；及びＩ２Ｆ；Ｍ４Ｌ；Ａ５１Ｐ変異を含むＶＬ、特に配列番号１４５のアミノ酸配列を含む。

【0267】

本発明のＰＤＬ１−ＢＤはさらに、本明細書に示されるＶＨ及び／又はＶＬ配列の１つ又は複数を有する抗体又は結合ドメインを出発材料として使用して調製することができ、修飾結合ドメインは、開始抗体又は結合ドメインから変更された特徴を有し得る。結合ドメインは、可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）の一方又は両方の１つ以上の残基を、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内で修飾することによって操作することができる。

【0268】

好適には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、ならびに、限定されないが、アンキリンベースのドメイン、ファイノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位からなる群から選択される（例えば、ｆ−スター技術（Ｆ−ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ））。

【0269】

適切には、本発明のＰＤＬ１−ＢＤはｓｃＦｖ抗体断片である。特定の実施形態では、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号２０６によるリンカーを含むｓｃＦｖである。

【0270】

さらなる実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１４６、配列番号１４７及び配列番号１４８に示される単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。１つの実施形態において、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６又は配列番号１１７又は配列番号１１８に示されるようなｓｃＦｖであり、好ましくは配列番号１１６又は１１８、より好ましくは配列番号１１８である。一実施形態では、本発明のＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１４６又は配列番号１４７又は配列番号１４８、好ましくは配列番号１４７又は１４８、より好ましくは配列番号１４８に示されるようなｓｃＦｖである。

【0271】

他の適切なＰＤＬ１−ＢＤは、（ｉ）アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ヒトＩｇＧ１抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；Ｍｅｒｃｋ−Ｓｅｒｏｎｏ；全体として本願に組み込まれるＷＯ２０１３／０７９１７４に記載）；（ｉｉ）アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６；ヒトＩｇＧ抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ）；（ｉｉｉ）ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９；ヒトＩｇＧ４抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ；全体として本願に組み込まれるＷＯ２００７／００５８７４に記載）；（ｉｖ）デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６；ヒト化ＩｇＧ１抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ；全体として本願に組み込まれるＷＯ２０１１／０６６３８９及びＵＳ２０１３／０３４５５９に記載）；（ｖ）ＫＮ０３５（抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；３Ｄ医薬品）；（ｖｉ）ＬＹ３３０００５４（抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体；Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）；及び（ｖｉｉ）ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（全体として本願に組み込まれるＷＯ２０１０／０７７６３４及び米国特許第８，２１７，１４９号に記載）からなる群から選択される抗体を含むか、又はそれに由来する。

【0272】

本発明者らはさらに驚くべきことに、ＣＤ１３７−ＢＤとＰＤＬ１−ＢＤの親和性又は結合力の間の特定の比率で、最大活性の濃度ウィンドウが拡張され、これが治療用途に有益であると予測され、本発明の多重特異性抗体又はそれを含む医薬組成物の投与におけるより高い柔軟性を可能にすることを見出した。したがって、一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、前記ＰＤＬ１−ＢＤの親和性に対する前記ＣＤ１３７−ＢＤの親和性は、特にＳＰＲで測定した場合、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍弱い。言い換えれば、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、前記ＰＤＬ１−ＢＤのヒトＰＤＬ１への結合の解離定数（ＫＤ）と比較して、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍高い解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する。したがって、適切には、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、前記ＰＤＬ１−ＢＤのヒトＰＤＬ１への結合の解離定数（ＫＤ）に対して、５〜１，０００倍、例えば、１０〜１，０００倍、好ましくは５０〜１，０００倍、より好ましくは１００〜１，０００倍、２００〜１，０００倍、３００〜１，０００倍、４００〜１，０００倍、５００〜１，０００倍、６００〜１，０００倍、７００〜１，０００倍、８００〜１，０００倍、９００〜１，０００倍の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合する。さらなる実施形態では、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、１０ｎＭ〜１０ｐＭ、好ましくは１０ｎＭ〜０．１ｎＭ、例えば、５ｎＭ〜０．１ｎＭ、より好ましくは５ｎＭ〜１ｎＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３７に結合し、特にここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、１ｎＭ〜１ｐＭ、好ましくは０．５ｎＭ〜１ｐＭ、より好ましくは１００ｐＭ〜１ｐＭの解離定数（ＫＤ）でヒトＰＤＬ１に結合する。別の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、前記ＰＤＬ１−ＢＤの結合力と比較して、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍弱い（低い）の結合力を有する。

【0273】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤの親和性に対する前記ＰＤＬ１−ＢＤの親和性は、特にＳＰＲで測定した場合、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍強い。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、前記ＣＤ１３７−ＢＤのヒトＣＤ１３７への結合の解離定数（ＫＤ）と比較して少なくとも５．０、好ましくは少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍低い解離定数（ＫＤ）でヒトＰＤＬ１に結合する。別の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ及び少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、特にＳＰＲで測定した場合、ＣＤ１３７−ＢＤの結合力と比較して、少なくとも５．０、好ましくは少なくとも１０、例えば、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、より好ましくは少なくとも５００、例えば少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１，０００倍強い（高い）結合力を有する。

【0274】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１又は３４、好ましくは配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１６又は１１８、より好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む、を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１又は３４、好ましくは配列番号３４のアミノ酸配列を含み；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１６からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含む、を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１又は３４、好ましくは配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１６又は１１８、より好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３１又は３４、好ましくは配列番号３４のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり；（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１６又は１１８、より好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、を含む。

【0275】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む、を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列を含む；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含む、を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＦｖであり；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＦｖである、を含む。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＦｖであり；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含むＦｖである、を含む。

【0276】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含み；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３３のアミノ酸配列を含み；（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むＦｖであり、及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８からなる列挙、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含むＦｖである。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＦｖであり；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含むＦｖである。

【0277】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６又は配列番号８７又は配列番号８８、好ましくは配列番号８６、より好ましくは配列番号８８のアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む；及び（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、又は少なくとも９５パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、ＣＤ１３７−ＢＤは、配列番号８６又は配列番号８７又は配列番号８８、好ましくは配列番号８６、より好ましくは配列番号８８のアミノ酸配列を含む；（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは、配列番号１１６、１１７、１１８、１４６、１４７、及び１４８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号１１８からなる列挙から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0278】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、以下を含む：
（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１７のＶＨ配列、及び配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号３０のＶＬ配列；及び
（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：（ａ）それぞれ配列番号８９、９０、９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１０２のＶＨ配列、及び配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１１４のＶＬ配列；又は
（ｂ）それぞれ配列番号８９、９０、９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１０４のＶＨ配列、及び配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１１５のＶＬ配列；又は
（ｃ）それぞれ配列番号１１９、１２０、１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１３３のＶＨ配列、及び配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１４５のＶＬ配列；又は
（ｄ）それぞれ配列番号１１９、１２０、１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１３４のＶＨ配列、及び配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１４４のＶＬ配列。

【0279】

より好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は以下を含む：
（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、ここで、前記ＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列、配列番号７１のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは、配列番号７１のＶＨ配列、及び配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号８３のＶＬ配列を含む；及び
（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、ここで、前記ＰＤＬ１−ＢＤは以下を含む：
（ａ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１０２のＶＨ配列、及び配列番号１１４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１１４のＶＬのＶＬ配列；又は
（ｂ）それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１０４のＶＨ配列、及び配列番号１１５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１１５のＶＨ配列；又は
（ｃ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３３のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１３３のＶＨ配列、及び配列番号１４５のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１４５のＶＨ配列；又は
（ｄ）それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１３４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＨ配列、好ましくは配列番号１３４のＶＨ配列、及び配列番号１４４のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント同一であるＶＬ配列、好ましくは配列番号１４４のＶＨ配列。

【0280】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、２つの異なる特異性（ＰＤＬ１及びＣＤ１３７）を有する。適切には、本発明の多重特異性抗体は二重特異性抗体である。本発明の多重特異性抗体は、さらなる特異性（三重特異性）又は特異性（四重特異性、五重特異性又は六重特異性抗体）を含み得る。一実施形態では、多重特異性抗体は三重特異性である。

【0281】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含む。本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。適切な天然配列Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＪＧＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれる。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃｙＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子変異体及びこれらの受容体の選択的スプライス形態を含み、ＦｃγＲＩＩ受容体は、主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 5:203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capet et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)に概説される。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語に含まれる。「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、母体のＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児受容体、ＦｃＲｎを含む。Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は知られている（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al)を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清の半減期は、例えば、トランスジェニックマウス又はヒトＦｃＲｎを発現するトランスフェクトヒト細胞株において、又は変異Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイすることができる。ＷＯ２００４／４２０７２（Presta）は、ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた抗体変異体を記載する。また、例えば、Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照されたい。

【0282】

別の実施形態では、本発明の抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域ポリペプチドを含まない。

【0283】

同じ又はより低い分子量で特異性／機能性の数を増やすために、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片及び他の抗体断片を含む抗体を使用することが有利である。これらのより小さい分子は、抗体全体の抗原結合活性を保持し、免疫グロブリン分子全体と比較して、改善された組織浸透及び薬物動態特性も示すことができる。そのような断片は、免疫グロブリン全体よりも多くの利点を示すようであるが、ｉｎ ｖｉｖｏで長い半減期を与えるＦｃドメインがないため、血清からのクリアランス率が高くなる（Medasan et al., 1997, J. Immunol. 158:2211-2217）。低分子量の分子は、標的組織（固形癌など）により効率的に浸透するため、同じ又はより低い用量で効果が向上する可能性がある。

【0284】

本発明者らは、驚くべきことに、（ａ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、及び（ｂ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含む本発明の多重特異性抗体へのヒト血清アルブミン結合ドメイン（ＨＳＡ−ＢＤ）の追加が以下の有益な効果を有することを見出した：
（ｉ）少なくとも１つのヒト血清アルブミンドメインを含む本発明の多重特異性抗体の血清半減期は、ＩｇＧのそれと同等である；
（ｉｉ）本発明の多重特異性抗体へのヒト血清アルブミン結合ドメインの追加は、他の結合ドメインの機能と互換性がある、例えば、ＰＤＬ１−ＢＤはそのブロッキング活性を保持し、ＣＤ１３７−ＢＤは、クラスタリング時にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化するその能力を保持する；
（ｉｉｉ）ヒト血清アルブミン結合ドメインは、ＣＤ１３７を活性化するために本発明の多重特異性抗体のＥＣ５０を増加させるとしても、予期せぬことに最大効果サイズを改善する、例えば、ＣＤ１３７シグナル伝達の最大活性化は著しく高くなる。

【0285】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、ヒト血清アルブミンに対して特異性を有するさらなる結合ドメインを含み得る。一実施形態では、多重特異性抗体は、（ｉ）少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ；（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ；及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＳＡ−ＢＤを含む。適切には、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）１つのＣＤ１３７−ＢＤ；（ｉｉ）少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、好ましくは１つのＰＤＬ１−ＢＤ又は２つのＰＤＬ１−ＢＤ、より好ましくは１つのＰＤＬ１−ＢＤ；及び（ｉｉｉ）少なくとも１つのＨＳＡ−ＢＤ、好ましくは１つのＨＳＡ−ＢＤを含む。

【0286】

「ＨＳＡ」という用語は、特にＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ番号Ｐ０２７６８のヒト血清アルブミンを指す。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、５８５アミノ酸からなるヒト血清中の６６．４ｋＤａの豊富なタンパク質（総タンパク質の５０％）である（Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446）。多機能ＨＳＡタンパク質は、脂肪酸、金属イオン、ビリルビン、及び一部の薬物などの多くの代謝産物と結合して輸送することを可能にする構造に関連付けられている（Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290）。血清中のＨＳＡ濃度は約３．５〜５ｇ／ｄＬである。アルブミン結合抗体及びその断片は、例えば、それに結合した薬物又はタンパク質のインビボ血清半減期を延長するために使用され得る。

【0287】

いくつかの実施形態では、ＨＳＡ−ＢＤは、モノクローナル抗体又は抗体断片に由来する。

【0288】

本発明の多重特異性抗体での使用に適したＨＳＡ−ＢＤは、本開示で提供される結合ドメインである。本発明のＨＳＡ−ＢＤは、その配列が表３に列挙されているヒト化モノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。

【0289】

本発明のＨＳＡ−ＢＤは、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する。本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されたＶＨ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、表３に列挙されるＶＨ ＣＤＲのいずれかの配列を有する１、２、３、又はそれ以上のＶＨ ＣＤＲを含むＨＳＡ−ＢＤを提供する。

【0290】

本発明はまた、表３に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含むＨＳＡ−ＢＤを提供する。特に、本発明は、表３に列挙されるＶＬ ＣＤＲのいずれかのアミノ酸配列を有する１、２、３又はそれ以上のＶＬ ＣＤＲを含むＨＳＡ−ＢＤを提供する。

【0291】

本発明の他のＨＳＡ−ＢＤは、変異されているが、なおも表３に記載されるＣＤＲ領域と、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。本発明の他のＨＳＡ−ＢＤは、表３に記載されている配列で示されるＣＤＲ領域と比較した場合、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以下のアミノ酸がＣＤＲ領域で変異している変異アミノ酸配列を含む。

【0292】

本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７３、１７６、１７９及び１８２のいずれか１つ、好ましくは配列番号１４９又は１７３、より好ましくは配列番号１４９から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１５０、１５３、１５６、１５９、１７４、１７７、１８０及び１８３のいずれか、好ましくは配列番号１５０又は１７４、より好ましくは配列番号１５０から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１５１、１５４、１５７、１６０、１７５、１７８、１８１及び１８４のいずれか、好ましくは配列番号１５１又は１７５、より好ましくは配列番号１５１から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１６２、１６５、１６８、１８６、１８９、及び１９２のいずれか、好ましくは配列番号１６２又は１８６、より好ましくは配列番号１６２から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６３、１６６、１６９、１８７、１９０、及び１９３のいずれか、好ましくは配列番号１６３又は１８７、より好ましくは配列番号１６３から選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１６４、１６７、１７０、１８８、１９１及び１９４のいずれか、好ましくは配列番号１６４又は１８８、より好ましくは配列番号１６４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）配列番号１４９、１５２、１５５、１５８、１７３、１７６、１７９及び１８２のいずれか、好ましくは配列番号１４９又は１７３、より好ましくは配列番号１４９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）配列番号１５０、１５３、１５６、１５９、１７４、１７７、１８０及び１８３のいずれか、好ましくは配列番号１５０又は１７４、より好ましくは配列番号１５０と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１５１、１５４、１５７、１６０、１７５、１７８、１８１及び１８４のいずれか、好ましくは配列番号１５１又は１７５、より好ましくは配列番号１５１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１６２、１６５、１６８、１８６、１８９、及び１９２のいずれか、好ましくは配列番号１６２又は１８６、より好ましくは配列番号１６２と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する選択されたアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）配列番号１６３、１６６、１６９、１８７、１９０、及び１９３のいずれか、好ましくは配列番号１６３又は１８７、より好ましくは配列番号１６３と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）配列番号１６４、１６７、１７０、１８８、１９１及び１９４のいずれか、好ましくは配列番号１６４又は１８８、より好ましくは配列番号１６４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含む、好ましくはそれからなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。

【0293】

一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；（ｂ）それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は（ｃ）それぞれ配列番号１７３、１７４、及び１７５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８６、１８７、及び１８８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は（ｄ）それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は（ｂ）それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、又は（ｃ）それぞれ配列番号１７３、１７４、及び１７５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８６、１８７、及び１８８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、又は（ｃ）それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0294】

さらなる実施形態において、本発明は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合するＨＳＡ−ＢＤを提供し、ここで、前記結合ドメインは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。

【0295】

適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、ＶＨ３又はＶＨ４を含む。一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、ＶＨ３ドメインフレームワーク配列を含む。ＶＨ３ファミリーに属するＶＨの特定の例は、配列番号１６１の下に表される。特に、配列番号１６１から取られたフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は、ＶＨ３ファミリーに属する（表３、太字で示されていない領域）。適切には、本明細書で使用される、ＶＨ３ファミリーに属するＶＨは、配列番号１６１のＦＲ１〜ＦＲ４と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するＦＲ１〜ＦＲ４を含むＶＨである。ＶＨ３配列の別の例、及びＶＨ４配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86に見出すことができる。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、特にＶκ１又はＶκ３フレームワーク、好ましくはＶκ１フレームワークＦＲ１〜３、及びフレームワークＦＲ４を含み、これは、ＶκＦＲ４、特にＶκ１ＦＲ４、Ｖκ３ＦＲ４、及びＶλＦＲ４から選択される。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、配列番号１７１に示される（表３、ＦＲ領域は非太字でマークされる）。Ｖκ１配列の別の例、及びＶκ２、Ｖκ３、又はＶκ４配列の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86に見出すことができる。適切なＶκ１フレームワークＦＲ１〜３は、ＦＲ１〜３に対応するアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有し、配列番号１７１から取られたアミノ酸配列を含む（表３、ＦＲ領域は太字でなく示される）。適切なＶλ ＦＲ４は、配列番号１９９〜配列番号２０５に示されるとおりである。一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、配列番号１９９から配列番号２０５のいずれかから、好ましくは配列番号１９９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセンの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含む。

【0296】

したがって、一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、
（ｉ）以下のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列：
（ａ）それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；又は
（ｂ）それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列に記載されるＶλ ＦＲ４、より好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列に記載されるＶλ ＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む。

【0297】

したがって、好ましい実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、
（ｉ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列；
（ｉｉ）ＶＨ３又はＶＨ４ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；好ましくはＶＨ３ドメインフレームワーク配列ＦＲ１〜ＦＲ４；及び
（ｉｉｉ）ＶκフレームワークＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３、具体的にはＶκ１又はＶκ３ ＦＲ１〜ＦＲ３、好ましくはＶκ１ ＦＲ１〜ＦＲ３、及びＶκＦＲ４、具体的にはＶκ１ ＦＲ４、Ｖκ３ ＦＲ４、及びＶλ ＦＲ４から選択されるフレームワークＦＲ４、好ましくは配列番号１９９〜配列番号２０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４、より好ましくは配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＶλ ＦＲ４を含むＶＬフレームワークを含むＶＬドメイン
を含む。

【0298】

一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、
（ｉ）ＣＤＲドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；
（ｉｉ）ヒトＶκフレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３、具体的にはヒトＶκ１フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ３；
ＦＲ４であって、（ａ）ＦＲ４のヒトＶλ生殖系列配列、特に配列番号１９９〜２０５、好ましくは配列番号１９９の列挙から選択されるＶλ生殖系列配列；及び（ｂ）配列番号１９９〜配列番号１９９のいずれか、好ましくは配列番号１９９から選択される挙げられる配列を含むＦＲ４の最も近いヒトＶλ生殖系列配列と比較して、１つ又は２つの変異、特に１つの変異を有するＶλベースの配列から選択されるＦＲ４
を含むＶＬを含む。

【0299】

本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されたＶＨドメインを含む。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されたＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１０以下のアミノ酸が変異している（変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されているＶＨアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＨＳＡ−ＢＤは、変異しているが、表３で説明されている配列に示されているＶＨ領域と、ＶＨ領域において、少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0300】

本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されたＶＬドメインを含む。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されたＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約１０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、表３に列挙されているＶＬアミノ酸配列を含み、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）中の約２０以下のアミノ酸が変異している（ここで、突然変異は、様々な非限定的な例として、付加、置換又は欠失である）。本発明の他のＨＳＡ−ＢＤは、変異しているが、表３に記載されている配列に記載されるＶＬ領域と、ＶＬ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。

【0301】

適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、配列番号１６１及び１８５、好ましくは配列番号１６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；配列番号１７１及び１９５、好ましくは配列番号７６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセント、好ましくは少なくとも９０パーセント同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0302】

一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、配列番号１６１及び１８５のいずれか、好ましくは配列番号１６１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１７１及び１９５のいずれか、好ましくは配列番号１６１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0303】

さらなる実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、（ａ）配列番号１６１のＶＨ配列及び配列番号１７１のＶＬ配列；又は（ｂ）配列番号１８５のＶＨ配列及び配列番号１９５のＶＬ配列を含む。好ましい実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、配列番号１６１のＶＨ配列及び配列番号１７１のＶＬ配列を含む。

【0304】

実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、
（ａ）それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＨ配列は、及び配列番号１７１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％のとの同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｂ）それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列と、それぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１８５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号１９５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＬ配列
を含む。

【0305】

一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、
（ａ）それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１６１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号１７１と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９％の同一性を有するＶＬ配列；又は
（ｂ）それぞれ配列番号１７３、１７４、及び１７５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１８６、１８７、及び１８８のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列、配列番号１８５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＨ配列、及び配列番号１９５と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するＶＬ配列
を含む。

【0306】

適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＡｂ、ＳＴＡＢ、及び限定されないが、アンキリンベースのドメイン、フィノマー、アビマー、アンチカリン、フィブロネクチン、及び抗体の定常領域に組み込まれている結合部位（例えば、ｆ−ｓｔａｒテクノロジー（Ｆ−ｓｔａｒのＭｏｄｕｌａｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＴＭ））などの代替の足場に基づく結合ドメインからなる群から選択される。

【0307】

適切には、本発明のＨＳＡ−ＢＤはｓｃＦｖ抗体断片である。一実施形態では、本発明のＨＳＡ−ＢＤは、配列番号１７２又は配列番号１９６、好ましくは配列番号１７２に示されるとおりである。

【0308】

本発明の多重特異性抗体での使用に適した他のＨＳＡ−ＢＤは、（ｉ）血清アルブミンに結合するポリペプチド（例えば、Smith et al., 2001, Bioconjugate Chem. 12:750-756; EP0486525; US6267964; WO 2004/001064; WO 2002/076489; 及びWO 2001/45746）；（ｉｉ）Holt et al., Protein Engineering, Design & Selection, vol 21, 5, pp283-288, WO 2004/003019, WO 2008/096158, WO 2005/118642, WO 2006/0591056及びWO 2011/006915に記載されている抗血清アルブミン結合単一可変ドメイン；（ｉｉｉ）WO 2009/040562, WO 2010/035012及びWO 2011/086091に記載されている抗血清アルブミン抗体からなる群から選択される抗体を含むか又はそれに由来する。

【0309】

本発明の多重特異性抗体は、任意の適切な形式であり得る。

【0310】

適切には、多重特異性抗体の結合ドメインは作動可能に連結されている。本発明の多重特異性抗体の結合ドメインは、それらのそれぞれの抗原又は受容体に同時に結合することができる。

【0311】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤを含み、ここで：（ｉ）前記ＣＤ１３７−ＢＤ及び前記ＰＤＬ１−ＢＤは、両方とも互いに作動可能に連結される。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、少なくとも１つのＨＳＡ−ＢＤを含み、（ｉ）前記ＣＤ１３７−ＢＤ及び前記ＰＤＬ１−ＢＤは両方とも作動可能に上記のＨＳＡ−ＢＤに連結されている；又は（ｉｉ）前記ＣＤ１３７−ＢＤ及び前記ＨＳＡ−ＢＤの両方は、前記ＰＤＬ１−ＢＤに作動可能に連結されている；又は（ｉｉｉ）前記ＰＤＬ１−ＢＤ及び前記ＨＳＡ−ＢＤは両方とも、前記ＣＤ１３７−ＢＤに作動可能に連結されている。好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、少なくとも１つのＣＤ１３７−ＢＤ、少なくとも１つのＰＤＬ１−ＢＤ、少なくとも１つのＨＳＡ−ＢＤを含み、前記ＣＤ１３７−ＢＤ及び前記ＨＳＡ−ＢＤは両方とも前記ＰＤＬ１−ＢＤに作動可能に連結される。

【0312】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、２つの分子（例えば、ポリペプチド、ドメイン、結合ドメイン）が、それぞれが機能的活性を保持するように付着していることを示す。２つの分子は、それらが直接又は間接的に（例えば、リンカーを介して、部分を介して、リンカーを介して部分に）付着するかどうかにかかわらず、「作動可能に連結」され得る。「リンカー」という用語は、本発明の結合ドメイン又は抗体断片の間に任意に配置されるペプチド又は他の部分を指す。分子を共有結合させるために、いくつかの戦略を使用できる。これらには、限定されないが、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端の間のポリペプチド結合、ジスルフィド結合を介した結合、及び化学架橋試薬を介した結合が含まれる。この実施形態の一態様では、リンカーは、組換え技術又はペプチド合成によって生成されるペプチド結合である。２つのポリペプチド鎖が接続される特定のケースに適したリンカーの選択は、２つのポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが自然にオリゴマー化するかどうか）、Ｎ−と既知の場合は接続されるＣ末端、及び／又はタンパク質分解と酸化に対するリンカーの安定性に依存する。さらに、リンカーは、柔軟性を提供するアミノ酸残基を含み得る。

【0313】

本発明との関連で、「ポリペプチドリンカー」という用語は、それぞれがリンカーの一端に付着している２つのドメインを接続しているペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖からなるリンカーを指す。ポリペプチドリンカーは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しいコンフォメーションをとるように、２つの分子を連結するのに十分な長さを有するべきである。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、２〜３０アミノ酸残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０アミノ酸残基）の連続鎖を有する。さらに、ポリペプチドリンカーに含めるために選択されたアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を著しく妨害しない特性を示すべきである。したがって、全体としてのリンカーペプチドは、ポリペプチドの活性と一致しない、内部フォールディングを妨げる、又は１つ以上のモノマーのアミノ酸残基との結合又は他の相互作用を形成する電荷を示すべきではない。受容体単量体ドメインの結合を妨げる。特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは非構造化ポリペプチドである。有用なリンカーには、グリシン−セリン又はＧＳリンカーが含まれる。「Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」又は「ＧＳ」リンカーとは、グリシンとセリンが連続したポリマー（例えば、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（ＧＧＧＧＳ）ｎ及び（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは、少なくとも１つの整数である））、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、シェーカーカリウムチャネルのテザーなどのその他の柔軟なリンカー、及びその他の様々な柔軟なリンカーを意味し、これらは当業者に承認される。これらのアミノ酸はどちらも比較的構造化されておらず、したがって成分間の中性テザーとして機能できるため、グリシン−セリンポリマーが好ましい。第二に、セリンは親水性であるため、球状グリシン鎖である可能性があるものを可溶化することができる。第三に、同様の鎖が、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットを結合するのに効果的であることが示されている。

【0314】

適切には、多重特異性抗体は、任意の適切な多重特異性から選択される形式であり、例えば、当該技術分野で公知である二重特異性の形式、例えば、非限定的な例として、以下に基づく形式が挙げられ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデムｓｃＤｂ（タンダブ）、線形二量体ｓｃＤｂ（ＬＤ−ｓｃＤｂ）、環状二量体ｓｃＤｂ（ＣＤ−ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、トリボディ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２）又はバイボディ（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１）、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、モリソン（ＩｇＧ ＣＨ３−ｓｃＦｖ融合（モリソンＬ）又はＩｇＧ ＣＬ−ｓｃＦｖ融合（モリソンＨ））、トリアボディ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、ジミニ抗体、テトラボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ融合、ｓｃＦｖ−ＨＳＡ−ｓｃＦｖ融合、ジダイアボディ、ＤＶＤ−Ｉｇ、ＣＯＶＤ、ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、ｓｃＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆｖ２−Ｆｃ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合、例えばｂｓＡｂ（軽鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ１Ａｂ（軽鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ２Ａｂ（重鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｂｓ３Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｔｓ１Ａｂ（両方の重鎖及び軽鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖ）、Ｔｓ２Ａｂ（重鎖のＣ末端に連結されたされたｄｓｓｃＦｖ）、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに基づく二重特異性抗体、例えば、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ抗体（ＫｉＨ）（ＫｉＨテクノロジーによって調製された二重特異性ＩｇＧ）；Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＤｂ、タンデムｄｉ−ｓｃＦｖ、タンデムｔｒｉ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）１、Ｆａｂ、Ｆａｂ−Ｆｖ２、Ｎ−及び／又はＣ−に融合したＣＯＶＤヘテロ二量体Ｆｃドメイン又はその他のヘテロ二量体化ドメインのいずれかの鎖の末端、ＭＡＴＣＨ（WO 2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84に記載される）及びＤｕｏＢｏｄｉｅｓ（Ｄｕｏｂｏｄｙテクノロジーによって徴された二重特異性ＩｇＧ）（MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307）が含まれる。本明細書での使用に特に適しているのは、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）又はｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。

【0315】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ｓｃＤｂ（ダイアボディ）、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、トリアボディ、及びトリボディからなる列挙から選択される形式である。本明細書での使用に特に適しているのは、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂである。また、本明細書での使用に特に適するのは、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、特に前記ＣＤ１３７−ＢＤ及び前記ＰＤＬ１−ＢＤがｓｃＤｂの形態であり、前記ＨＳＡ−ＢＤが前記ｓｃＤｂに作動可能に連結されたｓｃＦｖである。

【0316】

「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、その断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）においてＶＬに接続されたＶＨを含む。同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを許可するには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインとペアになり、２つの抗原結合部位が作成される。ダイアボディは二価又は二重特異性である可能性がある。ダイアボディは、例えば、EP404097, WO 93/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。トリアボディとテトラボディはまた、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載されている。

【0317】

二重特異性ｓｃＤｂ、特に二重特異性単量体ｓｃＤｂは、特に、リンカーＬ１、Ｌ２及びＬ３の順に連結された２つの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）又はその断片及び２つの可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）又はその断片を含み、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＨＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＬＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＬＢ−Ｌ２−ＶＨＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＨＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＬＢ、ＶＬＢ−Ｌ１−ＶＬＡ−Ｌ２−ＶＨＡ−Ｌ３−ＶＨＢ又はＶＬＢ−Ｌ１−ＶＨＡ−Ｌ２−ＶＬＡ−Ｌ３−ＶＨＢであり、ここで、ＶＬＡ及びＶＨＡドメインは共同で第１抗原の抗原結合部位を形成し、ＶＬＢ及びＶＨＢは共同で第２抗原の抗原結合部位を形成する。

【0318】

リンカーＬ１は、特に２〜１０アミノ酸、より具体的には３〜７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドであり、リンカーＬ３は特に１〜１０アミノ酸、より具体的には２〜７アミノ酸、最も具体的には５アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、リンカーＬ１及び／又はＬ３は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎの１つ又は２つのユニットを含み、ｎ＝１又は２、好ましくはｎ＝１である。より特定の実施形態では、リンカーＬ１及び／又はＬ３は、配列番号２０７又は配列番号２０１８、好ましくは配列番号２０７に示されるとおりである。

【0319】

中間リンカーＬ２は、特に１０〜４０アミノ酸、より具体的には１５〜３０アミノ酸、最も具体的には２０〜２５アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、前記リンカーＬ２は、４つのグリシンアミノ酸残基及び１つのセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎの１つ以上のユニットを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７又は８、好ましくはｎ＝４である。より特定の実施形態では、リンカーＬ２は、配列番号２０６に示されるとおりである。

【0320】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はｓｃＤｂである。特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１５のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂである。１つの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂである。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、及び２１５のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるｓｃＤｂである。

【0321】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。「ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ」という用語は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片が柔軟なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーによって一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）に融合される抗体形式を指す。一実施形態では、前記柔軟なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーは、２〜４０アミノ酸、例えば、２〜３５、２〜３０、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０アミノ酸、特に１０アミノ酸のペプチドである。特定の実施形態では、前記リンカーは、４つ（４）のグリシンアミノ酸残基及び１つ（１）のセリンアミノ酸残基（ＧＧＧＧＳ）ｎの１つ又は複数のユニットを含み、ここで、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、又は８、好ましくはｎ＝２である。より特定の実施形態では、前記リンカーは、配列番号２０８に示されるとおりである。

【0322】

特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０及び２３１のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２２のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２３又は２２４と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。

【0323】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びのＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0324】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１７と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0325】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１８と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0326】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１９と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８の同一性パーセントを有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号３８、３９、及び４０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号５１、５２、及び５３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１２２、１２４、及び１２５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３８、１３９、及び１４０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0327】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２０と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号４、６及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号９２、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１５２、１５３、及び１５４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、ならびにそれぞれ配列番号１６５、１６６、及び１６７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0328】

適切には、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２１と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号４、６、及び７のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号２１、２２、及び２３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号９２、９４、及び９５のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０８、１０９、及び１１０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１７６、１７７、及び１７８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８９、１９０、及び１９１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0329】

好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２２又は配列番号２２３又は配列番号２２４、好ましくは配列番号２２２、より好ましくは配列番号２２３と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、（ａ）ＢＤ前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−は、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号８９、９０、及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0330】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２５又は配列番号２２６又は配列番号２２７又は配列番号２２８、好ましくは配列番号２２５又は配列番号２２８、より好ましくは配列番号２２５と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号１、２、及び３のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１８、１９、及び２０のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0331】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、及び２２８、好ましくは配列番号２２２又は２２３、より好ましくは配列番号２２３のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、及び２２８、好ましくは配列番号２２２又は２２３、より好ましくは配列番号２２３のいずれかから選択されるアミノ酸配列からなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。

【0332】

さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２９又は配列番号２３０又は配列番号２３１、好ましくは配列番号２２９又は配列番号２３１、より好ましくは配列番号２２９と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで、（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０及び６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５及び７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号１１９、１２０、及び１２１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１３５、１３６、及び１３７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0333】

好ましい態様において、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２９又は配列番号２３０又は配列番号２３１、好ましくは配列番号２２９又は配列番号２３１、より好ましくは配列番号２２９と少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。特定の実施形態であｈ、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２９又は配列番号２３０又は配列番号２３１、好ましくは配列番号２２９又は配列番号２３１、より好ましくは配列番号２２９と少なくとも６０、７０、８０、好ましくは少なくとも９０、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖであり、ここで（ａ）前記多重特異性抗体のＣＤ１３７−ＢＤは、それぞれ配列番号５９、６０、６１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号７４、７５、７６のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｂ）前記多重特異性抗体のＰＤＬ１−ＢＤは、それぞれ配列番号８９、９０及び９１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及びそれぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含み、及び（ｃ）前記多重特異性抗体のＨＳＡ−ＢＤは、それぞれ配列番号１４９、１５０、及び１５１のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３配列、及び配列番号１６２、１６３、及び１６４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３配列を含む。

【0334】

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０及び２３１のいずれか、好ましくは配列番号２２２又は２２３、より好ましくは配列番号２２３から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。さらなる態様において、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０及び２３１のいずれか、好ましくは配列番号２２２又は２２３、より好ましくは配列番号２２３から選択されるアミノ酸配列からなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。より好ましくは好ましい実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２９、２３０及び２３１のいずれか、好ましくは配列番号２２９又は２３１、より好ましくは配列番号２２９から選択されるアミノ酸配列を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。より特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、配列番号２２９、２３０及び２３１のいずれか、好ましくは配列番号２２９又は２３１、より好ましくは配列番号２２９から選択されるアミノ酸配列からなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖである。

【0335】

本発明の一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はモリソン−Ｌ形式である。

【0336】

特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３２のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３３のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３２のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３３のアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３２のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３３のアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖からなる。

【0337】

別の実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３６のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソン−Ｌ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３７のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３６のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３７のアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３６のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３７のアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖からなる。

【0338】

本発明の一実施形態では、本発明の多重特異性抗体はモリソンＨ形式である。

【0339】

特定の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３４のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＨ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３５のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＨ重鎖を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３４のアミノ酸を含むモリソンＨ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３５のアミノ酸配列を含むモリソンＨ重鎖を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３４のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３５のアミノ酸配列を含むモリソンＬ重鎖からなる。

【0340】

別の実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３８のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＨ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３９のいずれかと少なくとも６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有するアミノ酸配列を含むモリソンＨ重鎖を含む。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３８のアミノ酸を含むモリソンＨ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３９のアミノ酸配列を含むモリソンＨ重鎖を含む。さらなる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２３８のアミノ酸を含むモリソンＬ軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＭｏｒｒｉｓｏｎ−Ｌ重鎖からなる。

【0341】

本発明の一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、WO 2016/0202457；Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84に記載されているＭＡＴＣＨ形式である。

【0342】

本発明の多重特異性抗体は、当技術分野で公知の任意の好都合な抗体製造方法を使用して作製することができる（例えば、二重特異性構築物の作製に関して、Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14；二重特異性ダイアボディ及びタンデムｓｃＦｖに関してHornig, N. & Farber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727及び99/57150を参照されたい）。本発明の二重特異性構築物の調製のための適切な方法の特定の例は、とりわけ、
Genmab技術（Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150参照）及びMerus（de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750）技術を含む。機能的抗体Ｆｃ部分を含む二重特異性抗体の製造方法も当技術分野で知られている（例えば、Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134、及びSuresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228参照）。

【0343】

これらの方法は、典型的には、例えば、骨髄腫細胞を、ハイブリドーマ技術を使用して所望の抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞と融合する手段（例えば、Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 2, Unit 2.5, 2006）によって、又は組換え抗体工学（レパートリークローニング又はファージディスプレイ／酵母ディスプレイ）（例えば、Chames & Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8）によってモノクローナル抗体の生成を伴い、２つ以上の異なるモノクローナル抗体の抗原結合ドメイン又はその断片又は部分の組み合わせにより、既知の分子クローニング技術を使用して二重特異性又は多重特異性構築物を与える。

【0344】

本発明の多重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素結合特異性を結合させることによって調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成され、次いで互いに結合され得る。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、共有結合のために様々なカップリング剤又は架橋剤を使用することができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロハキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M A et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法には、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83)、及びGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375に記載されるものがふくまれる。結合剤は、ＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１）から入手可能である。

【0345】

結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によって結合することができる。特定の実施形態において、ヒンジ領域は、結合の前に、奇数の、例えば１つのスルフヒドリル残基を含むように改変される。

【0346】

あるいは、２つ以上の結合特異性を同じベクターにコード化し、同じ宿主細胞で発現させて組み立てることができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ Ｘ ｍＡｂ、ｍＡｂ Ｘ Ｆａｂ、Ｆａｂ Ｘ Ｆ（ａｂ’）２又はリガンドＸ Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の多重特異性抗体は、１つの単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖分子、又は２つの結合決定基を含む単鎖多重特異性抗体であり得る。多重特異性抗体は、少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。多重特異性抗体及び分子を調製するための方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；及び米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。

【0347】

多重特異性抗体のそれらの特異的標的への結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば、増殖阻害）、又はウエスタンブロットアッセイによって確認することができる。これらのアッセイのそれぞれは、一般的に、対象の複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を使用することにより、特定の対象のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。

【0348】

さらなる態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインをコードする核酸を提供する。そのような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のために最適化され得る。

【0349】

「核酸」という用語は、本明細書では「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖形態の１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。この用語には、既知のヌクレオチド類似体又は修飾されたバックボーン残基又は結合を含む核酸が含まれ、これらは、合成、自然発生、及び非自然発生であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様に代謝される。そのような類似体の例には、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホレート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明示的に示された配列も暗黙的に包含する。具体的には、以下に詳述するように、１つ以上の選択された（又はすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994）で置換された配列を生成することにより、縮退コドン置換を達成することができる。

【0350】

本発明は、上記の多重特異性抗体のセグメント又はドメインを含むポリペプチドをコードする実質的に精製された核酸分子を提供する。適切な発現ベクターから発現される場合、これらの核酸分子によってコードされるポリペプチドは、本発明の多重特異性抗体の抗原結合能力又は能力を示すことができる。

【0351】

また、本発明において提供されるのは、表１〜３に示される本発明の多重特異性抗体の結合ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域及び通常は３つすべてのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドである。コードの縮重のため、様々な核酸配列が免疫グロブリンのアミノ酸配列のそれぞれをコードする。

【0352】

ポリヌクレオチド配列は、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインをコードする既存の配列（例えば、以下の実施例に記載の配列）の新規の固相ＤＮＡ合成又はＰＣＲ突然変異誘発によって生成することができる。核酸の直接化学合成は、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90のホスホトリエステル法；Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109, 1979のホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859, 1981のジエチルホスホロアミダイト法；及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの当技術分野で公知の方法によって達成することができる。ＰＣＲによるポリヌクレオチド配列への変異の導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, Calif, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991に記載されるように行うことができる。

【0353】

本発明ではまた、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインを産生するための発現ベクター及び宿主細胞も提供される。

【0354】

「ベクター」という用語は、それが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド分子を指すことが意図される。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントが連結され得る環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。

【0355】

さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形である。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。この特定の文脈において、「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。典型的には、それは転写調節配列と転写配列との機能的関係を指す。例えば、プロモーター又はエンハンサー配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、コード配列に機能的に連結されている。一般に、転写された配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写された配列に物理的に隣接している、すなわち、それらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節配列は、物理的に隣接している必要はなく、転写が増強するコード配列に近接している必要もない。

【0356】

様々な発現ベクターを使用して、多重特異性抗体鎖又は結合断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベース及び非ウイルス発現ベクターの両方を使用して、哺乳動物宿主細胞において抗体を産生することができる。非ウイルスベクター及びシステムには、プラスミド、エピソームベクター、典型的にはタンパク質又はＲＮＡを発現するための発現カセット、及びヒト人工染色体が含まれる（例えば、Harrington et al., Nat Genet. 15:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞におけるＣＤ１３７結合ポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターには、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ及びＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳ Ｖベクター、及び他のタンパク質を発現するための当該技術分野で既知の多数の他のベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター及びセムリキフォレストウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターが含まれる。Brent et al.（前掲）; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; and Rosenfeld et al., Cell 68: 143, 1992を参照されたい。

【0357】

発現ベクターの選択は、ベクターが発現される予定の宿主細胞に依存する。典型的には、発現ベクターは、多重特異性抗体鎖又は断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター及び他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含む。一実施形態では、誘導性プロモーターを使用して、誘導条件下を除いて、挿入された配列の発現を防止する。誘導性プロモーターには、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター又は熱ショックプロモーターが含まれる。形質転換された生物の培養は、その発現産物が宿主細胞によりよく許容されるその配列をコードするための集団を偏らせることなく非誘導条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、多重特異性抗体鎖又は断片の効率的な発現のために、他の調節要素も必要又は望ましい場合がある。これらの要素には、通常、ＡＴＧ開始コドンと隣接するリボソーム結合部位又は他の配列が含まれる。さらに、使用中の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現効率を高めることができる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサー又はＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させることができる。

【0358】

発現ベクターはまた、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメイン配列を挿入することによってコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するための分泌シグナル配列位置を提供し得る。より頻繁には、挿入された本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメイン配列は、ベクターに含まれる前にシグナル配列に連結される。多重特異性抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインの結合ドメインをコードする配列を受け取るために使用されるベクターは、時々、定常領域又はその一部をコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能にし、それにより、無傷の抗体及びその抗原結合断片の産生をもたらす。通常、このような定常領域はヒトのものである。

【0359】

「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解されたい。突然変異又は環境の影響により後継世代で特定の変更が発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。

【0360】

本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインを保持及び発現するための宿主細胞は、原核生物又は真核生物のいずれかであり得る。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び発現に有用な１つの原核生物宿主である。使用に適した他の微生物宿主には、枯草菌などの桿菌、及びサルモネラ、セラチア、及び様々なシュードモナス種などの他の腸内細菌科が含まれる。これらの原核生物宿主では、典型的には宿主細胞と適合性のある発現制御配列（例えば複製起点）を含む発現ベクターを作製することもできる。さらに、ラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、ベータ−ラクタマーゼプロモーターシステム、又はファージラムダのプロモーターシステムなど、様々なよく知られたプロモーターがいくつも存在する。プロモーターは、典型的には、任意でオペレーター配列を用いて発現を制御し、転写及び翻訳を開始及び完了するためのリボソーム結合部位配列などを有する。酵母などの他の微生物もまた、本発明のＣＤ１３７結合ポリペプチドを発現させるために使用することができる。バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用できる。

【0361】

１つの実施形態において、哺乳動物宿主細胞は、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインを発現及び産生するために使用される。例えば、それらは、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現するハイブリドーマ細胞株、又は外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞株のいずれかであり得る。これらには、正常な致死的又は正常な又は異常な不死の動物又はヒト細胞が含まれる。例えば、ＣＨＯ細胞株、様々なＣｏｓ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、形質転換Ｂ細胞及びハイブリドーマを含む、無傷の免疫グロブリンを分泌できる多くの適切な宿主細胞株が開発されている。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養の使用は、例えば、Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987で一般的に検討されている。哺乳動物宿主細胞用の発現ベクターは、複製起源、プロモーター、及びエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queen, et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照）、及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位などの必要な処理情報部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳類の遺伝子又は哺乳類のウイルスに由来するプロモーターを含んでいる。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、及び／又は調節可能又は調節可能であり得る。有用なプロモーターには、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（例えば、ヒト前初期ＣＭＶプロモーター）、構成的ＣＭＶプロモーター、及び当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせが含まれる。

【0362】

目的のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主のタイプに応じて異なる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に一般的に利用されているが、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションは他の細胞宿主に使用することができる（一般的には上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照されたい）。他の方法には、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介形質転換、注射及びマイクロインジェクション、弾道法、ウイロソーム、免疫リポソーム、ポリ核酸核酸複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２への融合（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤強化取り込み、及びｅｘ ｖｉｖｏ形質導入が含まれる。組換えタンパク質を長期間、高収量で生産するには、安定した発現がしばしば望まれる。例えば、本発明の多重特異性抗体又はその断片又はその結合ドメインを安定に発現する細胞株は、ウイルス複製起点又は内因性発現エレメント及び選択可能なマーカー遺伝子を含む本発明の発現ベクターを使用して調製できる。ベクターの導入後、細胞を選択培地に切り替える前に、細胞を濃縮培地で１〜２日間成長させることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、その存在は、選択培地で導入された配列を首尾よく発現する細胞の増殖を可能にする。耐性があり、安定してトランスフェクトされた細胞は、細胞タイプに適した組織培養技術を使用して増殖させることができる。したがって、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合断片を産生する方法を提供し、前記方法は、本発明の抗体又は抗原結合断片をコードする核酸又はベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む。それにより、本開示の前記抗体又はその断片が発現される。

【0363】

一態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体又はその結合ドメイン又はその断片を産生する方法に関し、この方法は、本発明の多重特異性抗体又はその結合ドメイン又はその断片をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップを含む。

【0364】

さらなる態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。薬学的に許容される担体は、組成物を増強又は安定化するか、又は組成物の調製を容易にする。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合性のある溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。

【0365】

本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に応じて変化する。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下であるか、又は標的部位の近位に投与することができる。薬学的に許容される担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち本発明の多重特異性抗体は、化合物を不活性化し得る酸の作用及び他の自然条件から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。

【0366】

本発明の医薬組成物は、当技術分野でよく知られており、日常的に実施されている方法に従って調製することができる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20th ed., 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Pharmaceutical compositions are preferably manufactured under GMP conditionsを参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造されることが好ましい。典型的には、本発明の多重特異性抗体の治療的に有効な用量又は有効な用量が、本発明の医薬組成物において使用される。本発明の多重特異性抗体は、当業者に知られている従来の方法により、薬学的に許容される剤形に処方される。投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少又は増加してもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象の単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。各ユニットは、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。

【0367】

本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒ではなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療反応を達成するのに有効である有効成分の量を得るために変化させることができる。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態因子、例えば、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩若しくはアミドの活性、使用される特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、治療期間、使用される特定の組成物と併用される他の薬物、化合物及び／又は税量、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態及び以前の病歴に依存する。

【0368】

本発明の多重特異性抗体は通常、複数の機会に投与される。単回投与の間隔は、毎週、毎月、又は毎年とすることができる。間隔はまた、患者における本発明の多重特異性抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、不規則であり得る。あるいは、本発明の多重特異性抗体は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。投与量と頻度は、患者の抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト化抗体はキメラ抗体及び非ヒト抗体よりも長い半減期を示す。投与量及び投与頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なり得る。予防的適用では、比較的低い投薬量が長期間にわたって比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、一生涯治療を受け続ける。治療用途では、疾患の進行が軽減又は終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い投与量が必要になる場合がある。その後、患者に予防計画を施すことができる。

【0369】

一態様では、本発明は、医薬品として使用するための本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物に関する。適切な実施形態では、本発明は、増殖性疾患、特にそれを必要とする対象における癌の治療に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。

【0370】

別の態様では、本発明は、増殖性疾患、特に癌の治療用の医薬品の製造に使用するための多重特異性抗体又は医薬組成物を提供する。

【0371】

別の態様では、本発明は、増殖性疾患、特にそれを必要とする対象における癌を治療するための多重特異性抗体又は医薬組成物の使用に関する。

【0372】

さらなる態様において、本発明は、それを必要とする対象における増殖性疾患、特に癌の治療のための医薬の製造における多重特異性抗体又は医薬組成物の使用に関する。

【0373】

別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の多重特異性抗体を対象に投与することを含む、対象を治療する方法に関する。適切な実施形態では、本発明は、本発明の多重特異性抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、対象における増殖性疾患、特に癌を治療する方法に関する。

【0374】

「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類などの哺乳動物及び非哺乳動物が含まれる。特に明記しない限り、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0375】

本明細書で使用される「治療」、「治療すること」、「治療する」、「治療された」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的又は完全な治癒に関して、及び／又は疾患に起因するか、又は疾患の進行を遅らせるという悪影響に関して治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、以下：（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を阻止すること；（ｂ）疾患を緩和する、すなわち、疾患を後退させることを含む。

【0376】

「治療有効量」又は「有効量」という用語は、疾患を治療するために哺乳動物又は他の対象に投与された場合に、そのような疾患の治療をもたらすのに十分である薬剤の量を指す。「治療上有効な量」は、治療される対象の薬剤、疾患及びその重症度、ならびに年齢、体重などに応じて変化する。

【0377】

一実施形態では、増殖性疾患は癌である。「癌」という用語は、異常な細胞の急速で制御されない成長を特徴とする疾患を指す。癌細胞は局所的に、又は血流とリンパ系を介して体の他の部分に広がる可能性がある。「腫瘍」及び「癌」という用語は、本明細書では互換的に使用され、例えば、両方の用語は、固形及び液体、例えば、びまん性又は循環性の腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「癌」又は「腫瘍」という用語は、前癌性ならびに悪性の癌及び腫瘍を含む。「癌」という用語は、本明細書では、すべての固形及び血液悪性腫瘍を含む、広範囲の腫瘍を意味するために使用される。そのような腫瘍の例には、限定されないが、良性又は特に悪性腫瘍、固形腫瘍、脳腫瘍、腎臓癌、肝臓癌、副腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌（例えば、胃腫瘍）、食道癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、膣癌、甲状腺癌、黒色腫（例えば、切除不能又は転移性黒色腫）、腎細胞癌、肉腫、神経膠芽腫、多発性骨髄腫又は胃腸癌、特に結腸癌又は結腸直腸腺腫、首及び頭の腫瘍、子宮内膜癌、カウデン症候群、レルミット・デュクロス病、バナヤン・ゾナナ症候群、前立腺過形成、特に上皮性の腫瘍、好ましくは乳癌又は扁平上皮癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病（例えば、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病）、急性リンパ芽球性白血病（例えば、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病）、非ホジキンリンパ腫、形質細胞骨髄腫、ホジキンリンパ腫、白血病、及びそれらの組み合わせが含まれる。好ましい実施形態では、癌は肺癌、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、前記癌は結腸直腸癌である。

【0378】

本発明の多重特異性抗体又は本発明の組成物は、固形腫瘍だけでなく液体腫瘍の増殖も阻害する。さらなる実施形態では、増殖性疾患は固形腫瘍である。「固形腫瘍」という用語は、特に、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、胃癌（特に胃癌）、子宮頸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌及び小細胞肺癌）、及び頭頸部の腫瘍を意味する。さらに、腫瘍の種類及び使用される特定の組み合わせに応じて、腫瘍体積の減少を得ることができる。本発明の多重特異性抗体、又は本発明の組成物はまた、癌を有する対象における腫瘍の転移の広がり及び微小転移の成長又は発達を防止するのに適している。

【0379】

一実施形態では、前記癌は、ＰＤＬ１陽性であり、好ましくは、前記癌は、健康な組織と比較して高レベルのＰＤＬ１を発現し、特に、前記癌は、健康な組織でのＰＤＬ１発現（それぞれｍＲＮＡ又はタンパク質）と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍高いレベルでＰＤＬ１（ｍＲＮＡ又はタンパク質）を発現する。いくつかの実施形態では、前記癌は悪性である。一部の実施形態では、前記癌は良性である。一部の実施形態では、前記癌は原発性である。一部の実施形態では、前記癌は二次性である。一実施形態では、前記癌は肺癌、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、前記癌は結腸直腸癌である。

【0380】

一態様では、本発明は、本発明の多重特異性抗体又は本発明の医薬組成物を含むキットに関する。キットには、以下を含む１つ又は複数の他の要素を含めることができる：他の試薬、例えば、標識、治療剤、又は抗体を標識又は治療剤にキレート化するか、そうでなければ結合するのに有用な薬剤、又は放射線防護組成物；投与のための抗体分子を調製するためのデバイス又は他の材料；薬学的に許容される担体；及び対象への投与のためのデバイス又は他の材料。特定の実施形態では、キットは、本発明の多重特異性抗体を薬学的有効量で含む。さらなる実施形態において、キットは、凍結乾燥された形態の本発明の多重特異性抗体の薬学的有効量及び希釈剤、ならびに必要に応じて、使用説明書を含む。前記キットは、再構成のためのフィルター針及び注射用の針をさらに含み得る。

【0381】

【表1-1】

【0382】

【表1-2】

【0383】

【表1-3】

【0384】

【表1-4】

【0385】

【表1-5】

【0386】

【表1-6】

【0387】

【表2-1】

【0388】

【表2-2】

【0389】

【表2-3】

【0390】

【表2-4】

【0391】

【表3-1】

【0392】

【表3-2】

【0393】

【表3-3】

【0394】

【表4】

【0395】

【表5-1】

【0396】

【表5-2】

【0397】

【表5-3】

【0398】

【表5-4】

【0399】

【表5-5】

【0400】

【表5-6】

【0401】

【表5-7】

【0402】

【表5-8】

【0403】

【表5-9】

【0404】

【表5-10】

【0405】

本出願の本文全体を通して、明細書の本文（例えば、表１から５）と配列列挙の間に不一致がある場合、仕様の本文が優先される。

【0406】

明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは理解されるであろう。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別個に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供することもできる。本発明に関連する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかもありとあらゆる組み合わせが個別にかつ明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態及びその要素のすべてのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもすべてのそのようなサブコンビネーションが本明細書で個別かつ明確に開示されたかのように本明細書で開示される。

【0407】

本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明から当業者には明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。

【0408】

それぞれの特許法の下で可能な範囲で、ここに引用されているすべての特許、出願、出版物、試験方法、文献、及びその他の資料は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0409】

以下の実施例は、上記の本発明を例示するが、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。関連技術の当業者にそのように知られている他の試験モデルも、請求された発明の有益な効果を決定することができる。

【実施例】

【0410】

実施例１：ＰＤＬ１、ＣＤ１３７、ＨＳＡ及びＭＳＡとの親和性
方法：
異なる種のＰＤＬ１への親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００デバイス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲ測定によって決定された。ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体をアミンカップリングによってセンサーチップ（ＣＭ５センサーチップ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。Ｆｃを含むＭｏｒｒｉｓｏｎ形式を除いて、すべての形式で、異なる種のＰＤＬ１−Ｆｃキメラタンパク質が固定化抗体によって捕捉された。この実験では、Ｆｃタグ付きヒトＣＤ１３７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ８３８−４Ｂ−１００）及びＦｃタグ付きヒトＰＤＬ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ１００８４−Ｈ０２Ｈ）は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅキット（カタログＢＲ−１００８−３９）を用いて捕捉された。

【0411】

ＰＤＬ１に特異的な分子の３倍連続希釈液（０．１２〜９０ｎＭ）をフローセルに３分間注入し、解離を１０分間監視した。各注入サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ₂溶液を１回注入して表面を再生した。見かけの解離（ｋｄ）及び関連付け（ｋａ）速度定数と見かけの解離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルを使用して計算された。異なる種のＣＤ１３７−Ｆｃキメラタンパク質が固定化抗体によって捕捉されたことを除いて、ＰＤＬ１と同じ設定を使用して、異なる種のＣＤ１３７への親和性を決定した。

【0412】

Ｆｃを含む形式は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体によって直接捕捉された。ＰＤＬ１細胞外ドメイン又はＣＤ１３７細胞外ドメインの９０〜０．３５ｎＭの範囲の２倍連続希釈液を、バイオセンサーチップで捕捉されたＩｇＧへの結合について試験した。各注入サイクルの後、３Ｍ ＭｇＣｌ₂溶液を１回注入して表面を再生した。

【0413】

異なる種の血清アルブミン（ＳＡ）に対する分子の親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００デバイス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したＳＰＲ測定によって決定された。ＳＡは、アミンカップリング化学を使用して、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接結合された。再生スカウティングと表面性能試験を行って最適なアッセイ条件を見つけた後、用量反応を測定し、得られた結合曲線を二重参照（空の参照チャネルとゼロの検体注入）し、１：１ラングミュアモデルを使用して速度論パラメーターを取得してフィッティングした。このアッセイは、ｐＨ５．５の１×ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で行った。

【0414】

結果：
ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖのヒトＰＤＬ１への親和性を表６に示す。ヒトＰＤＬ１への結合は、すべてのｓｃＤｂ−ｓｃＦｖについて確認された。ヒト化構築物の結合速度の測定値は、クローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲと構造（ＳＴＲ）グラフトを比較すると、ＰＤＬ１の結合親和性に違いがあることを示し、ＳＴＲグラフトは、同じクローンのＣＤＲグラフトと比較すると、親和性が２０倍向上する（表６のＰＲＯ８８５対ＰＲＯ１１２６）。クローン３７−２０−Ｂ０３に由来するＣＤＲグラフト（ＰＲＯ９９７）は、クローン３３−０３−Ｇ０２のＳＴＲグラフトと比較して、約２倍高い親和性を示す。３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲグラフトの結合親和性は、異なる多重特異性形式に結合されたときに親のｓｃＦｖの結合親和性と類似する（表６のＰＲＯ８３０をＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、ＰＲＯ１１２３、ＰＲＯ１１２４、ＰＲＯ９６３、ＰＲＯ９６６、ＰＲＯ１０５７、ＰＲＯ１０５８、ＰＲＯ１０５９及びＰＲＯ１０６０と比較されたい）。両方のクローンに由来するｓｃＦｖは、ヒト及びカニクイザルＰＤＬ１とほぼ同じ親和性を示す（表６のＰＲＯ９７７及びＰＲＯ８３０を参照されたい）。対応するｓｃＦｖと比較すると、抗ＰＤＬ１部分３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ１８、３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０１、及び３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１を含む多重特異性の親和性は類似していることが判明した（ＰＲＯ１３９２、３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ１８のｓｃＦｖ：ＫＤ＝９．９４Ｅ−１２Ｍ；ＰＲＯ９０８、３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０１のｓｃＦｖ：ＫＤ＝５．９４Ｅ−１２Ｍ；及びＰＲＯ１３４７、３７−２０−ｓｃ０９．１のｓｃＦｖ：ＫＤ＝９．００Ｅ−１２Ｍ）。対照的に、対応するｓｃＦｖ ＰＲＯ１１８３と比較すると、抗ＰＤＬ１部分３３ ０３−Ｇ０２ ｓｃ０３を運搬するすべてのｓｃＤｂ−ｓｃＦｖでヒトＰＤＬ１への親和性の低下が観察された（３３ ０３−Ｇ０２ ｓｃ０３のｓｃＦｖ：ＫＤ＜２．０９Ｅ−１２Ｍ）。これらの構築物の親和性の損失は、主に解離速度が増加するオフレートの加速によるものである。ＰＤＬ１に対する最高の親和性は、抗ＰＤＬ１結合部分３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１を含むＰＲＯ１４３０で見出された。

【0415】

表６に示すように、すべてのｓｃＤｂ−ｓｃＦｖでヒトＣＤ１３７への結合が確認された。クローン３８−０２−Ａ０４及び３８−２７−Ｃ０５に由来する２つのＣＤ１３７特異的ヒト化構築物のＣＤＲグラフトの結合速度の測定は、ほぼ同じ親和性を示す（表６のＰＲＯ８８５とＰＲＯ９５１を比較されたい）。クローン３８−０２−０４の場合、フレームワーク領域にグラフトした記載された構造残基は、２００倍を超える親和性の改善をもたらした（表６のＰＲＯ８８５とＰＲＯ１１２４を比較されたい）。さらに、クローン３８−０２−０４に由来する構築物については、マウスＣＤ１３７への結合が観察されたが、親和性は非常に低下した。興味深いことに、ヒトＣＤ１３７への親和性は、対応するｓｃＦｖの親和性と比較すると、抗ＣＤ１３７結合部分３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３及び３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０３を含む多重特異性分子で類似していたが（それぞれ、ＰＲＯ１３５２、３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３のｓｃＦｖ、ＫＤ＝１．４７Ｅ−０９Ｍ、及びＰＲＯ１３６０、３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０３のｓｃＦｖ、ＫＤ＝２．３４Ｅ−１０Ｍ）、ｓｃＤｂヘアピンの内側部分における抗ＣＤ１３７部分３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０２を運搬するｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子（ｓｃＤｂ−ｉドメイン、つまりＰＲＯ１４８０）の親和性は、対応するｓｃＦｖの親和性よりも実質的に優れていた（ＰＲＯ１３５９、ＫＤ＝３．２４Ｅ−０９Ｍ；ＰＲＯ１３５９、ＫＤ＝３．０７Ｅ−０９Ｍ）。対照的に、抗ＣＤ１３７部分３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０２がｓｃＤｂヘアピンの外側の部分に配置された場合、親和性はｓｃＦｖ ＰＲＯ１３５９の１つに匹敵する。この親和性の向上は、ｓｃＤｂヘアピンの内部にある場合、ドメインの安定性が高まることによって引き起こされるのではないかと推測することができる。結果として、ｓｃＤｂヘアピンの内部にある抗ＣＤ１３７部分３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０２を含む多重特異的ヒトＣＤ１３７に対する親和性は、抗ＣＤ１３７部分３８−２７−Ａ１１ ｓｃ０３を有するｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓの親和性とほぼ同じであり（ＰＲＯ１４８０とＰＲＯ１４８１を比較）、これは予期しない結果を表す。

【0416】

ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓの血清アルブミン（ＳＡ）への結合は、ＳＰＲによって確認された。クローン１９−０１−Ｈ０４に由来するＳＡ結合ドメインを含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖは、ヒト血清アルブミンへの高親和性結合を示すが、げっ歯類ＳＡへの結合は観察されなかった。クローン２３−１３−Ａ０１を含むｓｃＤｂ−ｓｃＦｖの場合、結合はヒトＳＡで観察され、さらに分子はげっ歯類ＳＡとの親和性が低下して結合する（表６を参照）。ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４３７９及びＰＲＯ１４８０のｐＨ５．５でのＨＳＡへの結合は、高親和性（低ナノモル濃度のＫＤ値）であり、試験された分子間で同等であることが判明した（ＩｇＧクローン１９−０１−Ｈ０４）。さらに、ｐＨ値を７．４に上げても、分子のＨＳＡへの親和性に実質的な影響はなかった（データは示していない）。

【0417】

実施例２：ＰＤＬ１とＴＣＲ活性化分子を発現するＣＨＯ細胞、及びＰＤ−１を発現し、ＮＦＡＴ応答要素の下にルシフェラーゼ遺伝子を含むＪｕｒｋａｔ細胞を使用する細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用の遮断
方法：
生物発光レポーター遺伝子アッセイでは、ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）−ルシフェラーゼレポーターとヒトＰＤ−１を安定して発現する人工Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞として機能する。ヒトＰＤＬ１及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化因子を安定的に発現する細胞は、抗原提示細胞として機能する。２つの細胞株を共培養すると、ＴＣＲ活性化分子／ＴＣＲ複合体の架橋を介してＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ経路の活性化が誘導される。ＰＤＬ１発現細胞が関与すると、ＰＤ−１エフェクターＴ細胞におけるＰＤ−１シグナル伝達がＴ細胞機能を阻害し、ＮＦＡＴ経路の阻害をもたらす。ＰＤ−１とＰＤＬ１受容体の相互作用の遮断は、ＮＦＡＴ経路の再活性化につながる。１００μｌの細胞培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＣＳ）中の３５，０００個のＣＨＯ／ＰＤＬ１／ＴＣＲ活性化分子（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）細胞を、白色細胞培養プレートの内側のウェルに加え、３７℃で１６〜２０時間、５％ＣＯ₂でインキュベートした。翌日、各ウェルから９５μｌの細胞培養液を除去し、参照アベルマブを含む、試験対象の各分子（３，０００から０．４６ｎｇ／ｍｌ）の２倍濃縮段階希釈液を５０μｌ加えた。次に、アッセイ緩衝液（１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０）で４００，０００細胞／ｍｌに希釈したＰＤ−１（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を発現するエフェクターＪｕｒｋａｔ細胞５０μｌを各ウェルに加え、プレートを３７℃で５時間、５％ＣＯ₂でインキュベートした。最後に、製造元のプロトコルに従って調製された５０μＬのルシフェラーゼ基質（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をウェルごとに加え、プレートを暗闇で３０分間インキュベートし、Ｔｏｐｃｏｕｎｔを使用して発光を測定した。

【0418】

【表6】

【0419】

結果：
各プレートの個々のＩＣ５０値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションされた（相対ＩＣ５０：ＩＣ５０、アベルマブ／ＩＣ５０、試験ｓｃＦｖ）。効力を表７にまとめる。これは、試験したすべての分子のＩＣ５０がアベルマブのＩＣ５０の０．１倍から３．７３倍であることを示す。

【0420】

【表7】

【0421】

ＰＤ−１へのＰＤＬ１結合を中和する効力に対するＣＤＲセットとフレームワーク選択の影響を評価するために、３つの抗ＰＤＬ１ ｓｃＦｖがＮＦＡＴレポーター遺伝子細胞ベースのアッセイで試験された。ＰＲＯ８３０は、ＶＨ４フレームワークにグラフトされたクローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲセットを含み、ＰＲＯ９９７及びＰＲＯ１０１３は、それぞれＶＨ４又はＶＨ１フレームワークにグラフトされたクローン３７−２０−Ｂ０３のＣＤＲセットを含む。ＰＲＯ８３０は、４２．８８ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値で試験された３つのｓｃＦｖの最も低い効力を有し、３４．０９ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０値でアベルマブと同様の効力を有する。ＰＲＯ９９７は最も強力な分子である。同じＣＤＲセットの効力は、ＶＨ１フレームワークよりもＶＨ４フレームワークにグラフトした場合の方が約２倍高かった。ＩＣ５０値は、それぞれ１１．１２ｎｇ／ｍｌ対２１．２９ｎｇ／ｍｌであった（図３及び表７）。

【0422】

ＰＤ−１へのＰＤＬ１結合の中和効力は、３３−０３−Ｇ０２ ＰＤＬ１ドメイン（ＣＤＲグラフト）の前と後（構造グラフト）のドメイン最適化を所有する二重特異性分子について決定された。ＣＤＲグラフト（ＰＲＯ８８５）は、構造グラフト（ＰＲＯ１１２６）と比較された。ドメインの最適化により中和効力が３倍に向上し、ＩＣ５０値はＰＲＯ８８５では１３７．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＲＯ１１２６では４８．１５ｎｇ／ｍｌであった（図４及び表７）。

【0423】

ＰＤＬ１／ＰＤ−１相互作用を中和する効力は、半減期延長について、クローン３８−０２−Ａ０４又は３８−２７−Ａ１１に由来する抗ＣＤ１３７ドメイン、クローン３３−０３−Ｇ０２又はクローン３７−２０−Ｂ０３に由来する抗ＰＤＬ１ドメイン、及び２つの異なるヒト血清アルブミン結合ドメインを所有するいくつかの三重特異性分子についても評価された（図５及び表７）。クローン２３−１２−Ａ０１−ｓｃ０３に由来するＨＳＡドメインもまたマウス血清アルブミンに結合する。実験は、２５ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡの存在下で行われた。ＰＲＯ１０５７の中和効力（ＩＣ５０＝６６５．１ｎｇ／ｍｌ）は、アベルマブよりも低かった（図５及び表７）。

【0424】

血清中の半減期を延長する別の形式、いわゆるモリソン形式を、細胞ベースの効力レポーター遺伝子アッセイで試験した。この形式では、１つの特異性がＩｇＧ部分（二価）によって運ばれ、２番目のターゲットに対する特異性を持つ２つのｓｃＦｖが、柔軟性ペプチドリンカーによってＩｇＧの重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）に連結される。試験したすべてのモリソン分子は、両方のＩｇＧアームにクローン３３−０３−Ｇ０２のＣＤＲグラフトの抗ＰＤＬ１ドメインを保持した。２つの構築物ＰＲＯ１０５９及びＰＲＯ１０６０は、２つの抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖの重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）への融合によって異なる。ＰＲＯ１０６２は、ＰＲＯ１０６０と同じアーキテクチャであり、ＣＤ１３７ドメインが異なる。すべての分子の中和効力は類似していた（図６及び表７）。

【0425】

実施例３：競合ＥＬＩＳＡを用いたＰＤＬ１とＰＤ−１及びＢ７．１との相互作用のブロック
これらのアッセイは、ＰＤＬ１とＰＤ−１又はＰＤＬ１とＢ．７１の間の相互作用をブロックするＰＤＬ１阻害剤の能力を評価するために実行された。ｓｃＦｖｓ、ｓｃＤｂｓ、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ、及びモリソンを含む様々な形式を競合ＥＬＩＳＡで分析し、参照ＩｇＧアベルマブと比較した。

【0426】

ＰＤＬ１／ＰＤ−１競合ＥＬＩＳＡ
方法
４μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−１を４℃で一晩コーティングしたＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに１％ＢＳＡと０．２％ｔｗｅｅｎ（希釈緩衝液）を含む３００μｌのＰＢＳを加えることにより、プレートを室温で１時間ブロックした。阻害剤は、１ｎｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＰＤＬ１を含む希釈緩衝液で、３００倍から０．００５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度に３倍のステップで段階的に希釈した。混合物を、回転ミキサー（２１ｒｐｍ）で穏やかに攪拌しながら室温で１時間プレインキュベートし、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、マイクロプレートに加えた。プレートを穏やかに攪拌しながら室温で１．５時間インキュベートし、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０を各マイクロプレートウェルに添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を加えた。６分後に１Ｍ ＨＣｌを加えることにより酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値の計算では、４つのパラメーターのロジスティック（４ＰＬ）カーブフィットが、参照減算値を使用してＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで実行された。

【0427】

結果
各プレートの個々のＩＣ５０値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションされた（相対ＩＣ５０：ＩＣ５０、アベルマブ／ＩＣ５０、試験ｓｃＦｖ）。効力を表８にまとめる。図７及び表８に示すように、競合ＥＬＩＳＡで試験すると、すべてのＰＤＬ１阻害剤がＰＤ−１とＰＤＬ１の相互作用をブロックした。 ｓｃＦｖ ＰＲＯ８３０は類似の効力との相互作用をブロックしたが、ＰＲＯ９９７及びＰＲＯ１０１３はアベルマブよりも有意に低いＩＣ５０値を示し、より強力な阻害剤である。複数の特定の形式、つまりｓｃＤｂｓやＭｏｒｒｉｓｏｎｓに組み合わせると、すべての分子がその阻害特性を保持した。ＰＲＯ８８５はアベルマブよりも効力が低かったのに対し、改善された抗ＰＤＬ１ドメインを含むＰＲＯ１１２６については、より低いＩＣ５０値が決定された。モリソン形式は、アベルマブと比較した場合、効力がわずかに劣っていた。ＰＲＯ１０５７の中和効果は、ヒト血清アルブミンの存在下でも示され、ＩＣ５０値は約２倍高かった。

【0428】

【表8】

【0429】

ＰＤＬ１／Ｂ７．１競合ＥＬＩＳＡ
方法
４μｇ／ｍｌのヒトＢ７．１で４℃で一晩コーティングしたＥＬＩＳＡマイクロプレートを、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに１％ＢＳＡと０．２％ｔｗｅｅｎ（希釈緩衝液）を含む３００μｌのＰＢＳを加えることにより、プレートを室温で１時間ブロックした。阻害剤を３倍の段階で段階的に希釈し、４０ｎｇ／ｍｌのビオチン化ＰＤＬ１を含む希釈緩衝液で９００〜０．０１５ｎｇ／ｍｌの範囲の最終濃度にした。混合物を、回転ミキサー（２１ｒｐｍ）で穏やかに攪拌しながら室温で１時間プレインキュベートし、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、マイクロプレートに加えた。プレートを穏やかに攪拌しながら室温で１．５時間インキュベートし、ウェルあたり４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ポリＨＲＰ４０を各マイクロプレートウェルに添加した。ＲＴで１時間インキュベートした後、プレートを４５０μｌの洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を加えた。６分後に１Ｍ ＨＣｌを加えることにより酵素反応を停止させ、参照波長として６９０ｎｍを使用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ５０値の計算では、４つのパラメーターのロジスティック（４ＰＬ）カーブフィットが、参照減算値を使用してＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍで実行された。

【0430】

結果
各プレートの個々のＩＣ５０値は、各プレートで測定された参照分子アベルマブのＩＣ５０に対してキャリブレーションされた（相対ＩＣ５０：ＩＣ５０、アベルマブ／ＩＣ５０、試験ｓｃＦｖ）。効力を表８にまとめる。ＰＲＯ１１２６を除いて、すべてのＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤ−１とＢ７．１の相互作用をブロックする能力についても試験された。ＰＲＯ８３０はアベルマブと同様の効力を示したのに対し、ＰＲＯ９９７とＰＲＯ１０１３のＩＣ５０値は低くなった。すべてのｓｃＤｂｓとＭｏｒｒｉｓｏｎｓもＰＤＬ１とＢ．７−１の間の相互作用を抑制した。ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５はアベルマブと同様の効力を示したが、モリソンのＩＣ５０値は約２〜３．４倍低かった。図８と表８にデータを示す。

【0431】

実施例４：ヒト化抗ＣＤ１３７ドメインによるＣＤ１３７及びＣＤ１３７中和の阻害なし
方法：
ＰＲＯ８８５がＣＤ１３７へのＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）の結合を妨害しないことを示すために、競合ＥＬＩＳＡを採用した。市販の阻害性ポリクローナル抗ＣＤ１３７ヤギ抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎｌｉｎｅ、Ｃａｔ＃ＡＢＩＮ６３６６０９）が参照として使用された。手短に言えば、ＣＤ１３７をＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングし、ＰＲＯ８８５の段階希釈をＥＬＩＳＡプレートに加えた。その後、ビオチン化ＣＤ１３７Ｌを添加し、結合したリガンドをストレプトアビジン−ＨＲＰの添加により検出した。最後に、ＨＲＰ基質ＴＭＢが追加された。５分間の現像後、反応を１Ｍ ＨＣｌ溶液で停止した。参照として、４５０ｎｍと６９０ｎｍで吸光度を測定した。

【0432】

結果：
クローン３８−０２−Ａ０４に由来するＣＤ１３７ドメインを含むＰＲＯ８８５で得られた滴定曲線を図９Ａに示し、クローン３８−２７−Ｃ０５に由来するＣＤ１３７ドメインを含むＰＲＯ９５１で得られた結合曲線を図９Ｂに示す。クローン３８−２７−Ａ１１に由来するＣＤ１３７ドメインを含むＰＲＯ１３５９及びＰＲＯ１３６０で得られた滴定曲線を図９Ｃに示す。参照抗体はＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を完全に防止したが、ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、ＰＲＯ１３５９及びＰＲＯ１３６０は、ＣＤ１３７ＬのＣＤ１３７への結合を有意に阻害しなかったため、中和なしと定義された。

【0433】

実施例５：ウレルマブとウトミルマブに対する３８−０２−Ａ０４及び３８−２７−Ｃ０５のエピトープビニング
方法：
タンパク質ＰＲＯ８８５（３８−０２−Ａ０４ ＣＤＲグラフトを含むｓｃＤｂ）、ＰＲＯ９５１（３８−２７−Ｃ０５ ＣＤＲグラフトを含むｓｃＤｂ）、クローン３８−２７−Ａ１１に由来するウサギＩｇＧ、及び競合分子ウレルマブのＣＤ１３７の結合エピトープ（ＢＭＳ）及びオトミルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）は、ＭＡＳＳ−１デバイス（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ）を使用したＳＰＲエピトープビニングアッセイで比較された。分子が互いにＣＤ１３７への結合をブロックするかどうかを調べるために、サンドイッチ構成が選択された。したがって、ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、クローン３８−２７−Ａ１１由来のウサギＩｇＧ、ウレルマブ、及びウトミルマブは、高容量アミンセンサーチップ（ＨＣＡ、Ｓｉｅｒｒａセンサー）に固定化された。次に、９０ｎＭの抗原ＣＤ１３７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、カタログ３１０−１５）をｓｃＤｂｓ、ウサギＩｇＧ ３８−２７−Ａ１１、ウレルマブ、又はウトミルマブに注入して捕捉し、すぐに２２．５ｎＭの二次抗体を注入した（ＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９５１、ウサギＩｇＧ ３８−２７−Ａ１１、ウレルマブ又はオトミルマブ）。各タンパク質のＣＤ１３７の捕捉レベルと２番目の結合応答レベルを決定した（応答単位、ＲＵ）。関与するタンパク質の分子量と捕捉レベルに依存する理論的な最大応答（Ｒｍａｘ）を計算することにより、捕捉された抗原上のタンパク質の相対結合レベル（％）が決定された。分子が、ＣＤ１３７上の同じ、重複している（例えば、構造的に類似又は空間的に近位）又は類似のエピトープに結合する場合、捕捉されたＣＤ１３７の上に注入された抗体の結合は観察されない。その結果、抗体の結合が観察されると、２つの抗体ペアは重複しないエピトープに結合する。相対結合レベル（％）を各抗体ペアについて決定した。定義により、１０％未満の結合レベルは、ＣＤ１３７と同じ又は重複している（例えば、構造的に類似又は空間的に近位）ことを示し、３０％を超えると、重複していないエピトープを指す。

【0434】

結果：
ＰＲＯ８８５がセンサーチップに固定化されると、３つの抗体ＰＲＯ９５１、ウレルマブ、オトミルマブのすべてが、ＰＲＯ８８５によって捕捉されたＣＤ１３７への結合を示した。予想通り、コントロールを使用したＰＲＯ８８５では結合は観察されなかった（図１０及び図１１）。ＰＲＯ９５１がセンサーチップに固定化されると、ウレルマブとＰＲＯ８８５は結合を示したが、対照として使用されたウトミルマブとＰＲＯ９５１は有意な結合を示さなかった（図１０及び図１２）。これらの結果は、クローン３８−０２−Ａ０４に由来するＰＲＯ８８５が、ＣＤ１３７のウレルマブ、ウトミルマブ、及び３８−２７−Ｃ０５に由来するＰＲＯ９５１とは異なるエピトープに結合することを示す。対照的に、ＲＯ９５１は、ウトミルマブと重なっているが、ウレルマブとＰＲＯ８８５とは重なっていないエピトープに結合する。

【0435】

ＩｇＧ ３８−２７−Ａ１１は、重複しないエピトープを示唆するＣＤ１３７への結合についてオトミルマブと競合しなかったが、同じ又は重複するエピトープを示唆するＣＤ１３７への結合についてウレルマブと競合した（図１０）。

【0436】

実施例６：ＣＤ１３７を発現するトランスジェニックＮＦｋＢ Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株の細胞ベースのアッセイを使用することによる、抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子のＣＤ１３７アゴニスト効果の評価
導入
このアッセイでは、Ｊｕｋａｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化を評価した。ＣＤ１３７シグナル伝達の活性は、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株におけるＣＤ１３７誘導ＮＦ−ｋＢ活性化によって駆動されるルシフェラーゼ発現の測定によって報告される。ルシフェラーゼの発現は、ＣＤ１３７の活性と直接相関する。さらに、シグナル経路の活性化に必要なＣＤ１３７のクラスター化は、Ｊｕｒｋａｔ細胞とＰＤＬ１発現細胞株の間の免疫シナプスの形成を介して促進される。したがって、レポーター細胞株におけるＣＤ１３７のクラスター化と活性化にはＰＤＬ１発現が必要である。

【0437】

方法
ＰＤＬ１発現ＣＨＯ（クローンＡ２）細胞及びＨＣＣ８２７細胞を未刺激又は２４時間、１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで刺激してＰＤＬ１発現を増加させ、９６ウェル培養プレートに２５，０００細胞／ウェルで播種した。陰性対照として、ＰＤＬ１発現のないＣＨＯ ＷＴ細胞を同じ細胞密度で播種した。次に、抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子と競合ウレルマブの段階希釈液を調製し、細胞に加えた。次に、Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞を、ＨＳＡを２５ｍｇ／ｍｌで含むか含まないアッセイ培地で調製し、ウェルあたり４０，０００細胞の細胞密度で添加した。ルシフェラーゼ発現をルシフェラーゼ試薬の添加により検出し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の添加の６又は２４時間後に発光リーダーにより読み取った。ウレルマブ（図１３〜１８、図１９Ａ）又はＰＲＯ８８５（図１９Ｂ）で測定されたＲＬＵに対する試験サンプルの相対発光単位（ＲＬＵ）を正規化してデータを分析し、ＣＤ１３７シグナル伝達の相対活性化の値を得た。

【0438】

ＰＤＬ１発現を高めるために１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮγで２４時間刺激されたＰＤＬ１発現ＨＣＣ８２７細胞を、９６ウェル培養プレート上のウェルあたり５０μｌの細胞培養液（ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ）に２５，０００細胞で播種した。陰性対照として、ＰＤＬ１発現のないＣＨＯ−Ｋ１ ＷＴ細胞を同じ細胞密度で播種した。次に、２５μｌの４倍濃縮された、試験対象の各分子の５倍連続希釈液と、４０，０００から０．０２ｎｇ／ｍｌの参照ＰＲＯ１１８６及びＰＲＯ８８５を加えた。次に、アッセイ緩衝液（１０％ＦＣＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡを含むＲＰＭＩ１６４０）で１．６Ｅ＋０６細胞／ｍｌに希釈した２５μｌのＣＤ１３７発現エフェクターＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、ＨＳＡの最終濃度を２５ｍｇ／ｍｌにした。次に、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で６時間、２４時間インキュベートした。最後に、製造元のプロトコルに従って調製されたルシフェラーゼ基質（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）５０μＬをウェルごとに加え、プレートを暗所で１５分間インキュベートし、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ＩＩＩを使用して発光を測定した。各プレートの個々のＥＣ５０、ＩＣ１０／ＥＣ９０、及びＡＵＣ値は、各プレートで測定された参照分子ＰＲＯ１１８６のそれぞれの値に対して較正された（表１６Ｃ）。用量応答曲線のＥＣ５０及びＥＣ９０値は、相対発光単位（ＲＬＵ）が増加するポイントの４つのパラメーターロジスティックフィットを使用して取得された。一方、ＲＬＵが減少するポイントは、４つのパラメーターロジスティックを使用してフィットされた。ＩＣ１０値を計算するために、拘束された底に適合する。曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＰＲＯ８８５正規化データを使用してすべてのサンプルについて計算された。すべてのパラメーターは、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して取得された。

【0439】

結果
Ｉ．ＣＨＯ−ＰＤＬ１細胞を使用したＰＲＯ８８５及びＰＲＯ９５１の試験：
図１３に示すように、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ９５１は、ＰＤＬ１発現ＣＨＯ細胞の存在下で、ウレルマブよりも効率的にＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。ＰＲＯ８８５は最高の効力と最高の活性化シグナルを示した（ＰＲＯ８８５、ＥＣ５０＝１１．７２ｎｇ／ｍｌ、ＰＲＯ９５１：ＥＣ５０＝３３．６８ｎｇ／ｍｌ；ウレルマブ：ＥＣ５０＝７９．１１ｎｇ／ｍｌ、表９）。ＰＤＬ１が存在しない場合、ＰＲＯ８８５もＰＲＯ９５１もレポーター細胞でＣＤ１３７を活性化できなかったが、ウレルマブはＰＤＬ１とは無関係にＣＤ１３７シグナル伝達の活性化を示した。

【0440】

【表9】

【0441】

ＩＩ．ＣＨＯ−ＰＤＬ１細胞を使用したＳＴＲグラフトｓｃＤｂの試験：
図１４と表１０に示すように、抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ分子は、ＣＤ１３７シグナル伝達を、ウレルマブよりも効率的に刺激した。ウレルマブとは対照的に、ＰＤＬ１を発現する標的細胞が存在する場合、ｓｃＤｂに対してのみ刺激効果が見られなかった。すべてのｓｃＤｂは、ＰＤＬ１を高レベルで発現するＣＨＯ細胞の存在下でＮｆ−ｋＢレポーター遺伝子の活性化を刺激する同一の効力を示した。次に、同じ分子を、より少量のＰＤＬ１を発現する細胞の存在下で試験した。

【0442】

ＩＩＩ．ＩＦＮγなしのＨＣＣ８２７細胞を使用したＳＴＲグラフトｓｃＤｂの試験：
図１５と表１１に示すように、抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ分子は、ＣＤ１３７シグナル伝達をウレルマブよりも効率的に刺激した。親和性が改善されたＣＤ１３７ドメインを有するｓｃＤｂ（３８−０２−Ａ０４、ＰＲＯ１１２０、及びＰＲＯ１１２４のＳＴＲグラフト）は、ＣＤＲグラフトされたＣＤ１３７ドメインと比較した場合、ＣＤ１３７活性化において改善された効力を示した（例えば、ＰＲＯ８８５、ＥＣ５０＝１３．０２ｎｇ／ｍｌ、ＰＲＯ１１２４：ＥＣ５０＝５．６２ｎｇ／ｍｌ、表１１）。注目すべきことに、ＰＤＬ１ドメイン（Ｐｒｏ１１２６）のＳＴＲグラフトで見つかったため、ＰＤＬ１への親和性の増加はまた、親分子ＰＲＯ８８５と比較し場合、増加した効力に至った（ＰＲＯ８８５、ＥＣ５０＝１３．０２ｎｇ／ｍｌ、ＰＲＯ１１２６：ＥＣ５０＝６．９７ｎｇ／ｍｌ、表１１）。高濃度では、ＳＴＲグラフトｓｃＤｂは、活性化のシグナルを減少させる傾向を示した。これは、ＳＴＲグラフトＣＤ１３７ドメイン（ＰＲＯ１１２０及びＰＲＯ１１２６）を有する分子でより顕著であった。興味深いことに、ＰＤＬ１ドメインのＳＴＲグラフトをＣＤ１３７のＣＤＲグラフトと組み合わせた場合、高濃度でのシグナルの減少は観察されなかった（図１５のＰＲＯ８８５とＰＲＯ１１２４を比較されたい）。したがって、ＣＤ１３７とＰＤＬ１への親和性の増加に伴い、効力はわずかに増加した。ＰＤＬ１への親和性の増加はこの効果に寄与しなかったが、高濃度（ベル形の曲線）でのシグナルの減少は、ＣＤ１３７への親和性の増加とともにより顕著になった。したがって、各ドメインの絶対的な親和性よりもむしろ、ＣＤ１３７とＰＤＬ１に対する親和性の比率が、最大活性の濃度ウィンドウを拡張するために重要であると考えられる。

【0443】

【表10】

【0444】

ＩＶ．ＩＦＮγを含むＨＣＣ８２７細胞を使用したＳＴＲグラフトｓｃＤｂの試験：
ＩＦＮγによるＨＣＣ８２７の刺激は、ｓｃＤｂ分子の効力を変更せずに活性化のシグナルを増加させた。注目すべきことに、この設定では、試験されたｓｃＤｂの高濃度でのシグナルの低下はそれほど明白ではなく、ＰＤＬ１発現との相関を示唆する（図１６及び表１２）。

【0445】

Ｖ．ＣＨＯ−ＰＤＬ１細胞を使用した長い半減期の分子の試験：
図１７及び１８、表１３及び１４に示すように、試験された長い半減期の抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子は、ＣＤ１３７シグナル伝達をウレルマブと同じ程度に刺激した。Ｍｏｒｒｉｓｉｏｎ形式（ＰＲＯ１０６０、ＰＲＯ１０６２）をｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ形式（ＰＲＯ１０５７、ＰＲＯ１０５８）と比較すると、違いがあった。モリソン形式はより高い効力を示したが、活性化の最大シグナルは、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖが試験されたときに大幅に増加した。注目すべきことに、２４時間のインキュベーション後、ＰＲＯ１０５７は活性化の驚くべき高いシグナルを示した。試験されたすべての長い半減期の分子は、ＰＤＬ１発現細胞の存在下でのみＣＤ１３７シグナル伝達を活性化した。興味深いことに、両方のターゲットに類似した親和性があるにもかかわらず、ＰＲＯ１０５７はＰＲＯ１０５８よりもはるかに高い最大シグナルを示した。さらに、一価のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１０５７は、それぞれの二価のモリソン形式ＰＲＯ１０６０よりも強い活性化を示した。

【0446】

ＶＩ．ＩＦＮγを使用した場合と使用しない場合のＨＣＣ８２７細胞を使用した長い半減期の分子の試験：
図１９Ａ及び表１５に示すように、試験された長い半減期の抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子は、より少量のＰＤＬ１を発現する細胞の存在下で、ウレルマブと同じ程度にＣＤ１３７シグナル伝達を刺激した。試験された分子の最大活性化は、標的細胞がＩＦＮγによって刺激されたときにさらに増加し、ＣＤ１３７の活性化と標的細胞上のＰＤＬ１発現のレベルとの直接的な相関が示唆された。前述のように、ＰＲＯ１０５７はモリソン形式（ＰＲＯ１０６０）と比較して、より高いレベルのレポーター遺伝子活性化を示した。

【0447】

図１９Ｂは、６時間と２４時間、ＩＦＮγ（１０ｎｇ／ｍｌ）刺激ＨＣＣ８２７の存在下でのＣＤ１３７活性アッセイにおける三重特異性ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４３１、ＰＲＯ１４３２、ＰＲＯ１４７３、ＰＲＯ１４７６、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８０、ＰＲＯ１４８１及びＰＲＯ１４８２の試験結果を表す。

【0448】

ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７多重特異性構築物によるＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子活性化のデータを表１６Ａ、１６Ｂ及び１６Ｃにまとめる。

【0449】

候補分子の活性曲線の形状を比較するために、曲線の下の面積（ＡＵＣ、ベルの形をした曲線のシグナル振幅と幅の複合測定、効果サイズ）、及びプラトーの幅（ＥＣ９０／ＩＣ１０比（治療ウィンドウの指標を提供する）を計算した（表１６Ｃを参照）。最高のｒｅｌ．ＡＵＣ値（ＰＲＯ１１８６に正規化した場合、ある時点で少なくとも１を超える）がＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８０、及びＰＲＯ１４８１について見出された。注目すべきことに、試験サンプルのＥＣ９０／ＩＣ１０比が高いことは、広いベル型の用量反応曲線を示し、結果として、完全な活性のより大きな濃度範囲を提案する。したがって、上位の候補は、数百倍の濃度範囲で完全な活性を示す。

【0450】

これらのパラメーターに基づくと、ＮＦ−ｋＢレポーター遺伝子アッセイで最もパフォーマンスの高いｓｃＤｂ−ｓｃＦｖは、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９及びＰＲＯ１４８０であった。

【0451】

【表11】

【0452】

【表12】

【0453】

【表13】

【0454】

【表14】

【0455】

【表15】

【0456】

【表16】

【0457】

【表17】

【0458】

【表18】

【0459】

【表19】

【0460】

【表20】

【0461】

実施例７：ヒトＰＢＭＣ及びＰＤＬ１を発現するトランスジェニックＣＨＯ細胞を使用する細胞ベースのアッセイにおける付随するＰＤＬ１遮断及びＣＤ１３７刺激のＴ細胞刺激効果の評価
方法
ＰＤＬ１を発現するＣＨＯ−Ａ２細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体でプレコートした９６ウェル培養プレートに、ウェルあたり５０，０００〜２００，０００細胞の範囲の３つの異なる密度で播種した。プレートを３７℃、５％ＣＯ₂で一晩インキュベートした。翌日、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。ウェルあたり１００，０００個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートに添加し、続いて抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５を５００、５０及び５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。インキュベーションの７６時間後、細胞上清を回収した。培養上清中のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レベルは、キットの指示に従って、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄのＩＬ−２ヒトＥＬＩＳＡ ＭＡＸアッセイを使用して定量した。ＩＬ−２濃度はＩＬ−２標準曲線から内挿され、逆算され、ＥＣ５０値の計算のためにＰＲＯ８８５濃度に対してプロットされた。

【0462】

結果
図２０に示すように、ＩＬ−２は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用の同時遮断と二重特異性分子ＰＲＯ８８５の追加によるＣＤ１３７の刺激に続いてＴ細胞から分泌された。分泌されるＩＬ−２レベルは、抗ＣＤ３抗体とＣＨＯ−Ａ２細胞密度の増加、及びＰＲＯ８８５濃度の増加とともに増加した。抗ＣＤ３抗体がない場合、ＩＬ−２レベルは基礎ＩＬ−２分泌と同等であった。ＰＲＯ８８５は、抗ＣＤ３抗体によって共刺激されたＴ細胞のみを活性化した。抗ＣＤ３による刺激がない場合、ＩＬ−２の用量依存的産生はなく、抗原特異的Ｔ細胞の選択的活性化を確認する。この発見は、ＰＲＯ８８５が活性化Ｔ細胞のみを刺激することを示し、インビボＰＲＯ８８５が腫瘍特異的Ｔ細胞を特異的に刺激することを示唆する。

【0463】

実施例８：スーパー抗原ＳＥＡで刺激されたヒトＰＢＭＣを使用する細胞ベースのアッセイにおける、付随するＰＤＬ１遮断及びＣＤ１３７刺激の刺激効果の評価
この実験では、ＰＤ−１／ＰＤＬ１阻害とＣＤ１３７アゴニズムの相乗効果を評価した。このアッセイでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞でＰＤＬ１を、Ｔ細胞でＣＤ１３７をそれぞれ発現させるために、スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）で刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用した。抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子を適用することにより、２つのＴ細胞調節シグナル伝達経路が同時に標的にされた：抑制性ＰＤ−１／ＰＤＬ１経路の阻害と、二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子ＰＲＯ８８５によって、又は三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ分子ＰＲＯ１１７５、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９若しくはＰＲＯ１４８０によって媒介される免疫シナプスの形成によるＣＤ１３７経路の活性化。二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子ＰＲＯ８８５（配列番号２０９）による、又は三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ分子ＰＲＯ１１７５（配列番号２２０）、ＰＲＯ１４３０（配列番号２２２）、ＰＲＯ１４７９（配列番号２２３）若しくはＰＲＯ１４８０（配列番号２２９）によるＴ細胞の活性化が評価された。Ｔ細胞の活性化は、インターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌によって評価され、ベンチマーク基準抗体アベルマブによって媒介されるＰＤＬ１阻害によって媒介される効果と比較された。さらに、抗ＰＤＬ１ ｓｃＦｖ、ＰＲＯ９９７が試験され、同じ実験設定でアベルマブと比較された。さらに、二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子ＰＲＯ８８５（配列番号２０９）による、又は三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ分子ＰＲＯ１１７５（配列番号２２０）、ＰＲＯ１４３０（配列番号２２２）、ＰＲＯ１４７９（配列番号２２３）若しくはＰＲＯ１４８０（配列番号２２９）によるＴ細胞の活性化を参照抗体アベルマブ又はウレルマブ、又はそれらの組み合わせの効果と比較した。

【0464】

方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。次に、抗ＣＤ５６抗体とＭＡＣＳ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＮＫ細胞のＰＢＭＣを枯渇させた。次に、ウェルあたり１００，０００個のＰＢＭＣを９６ウェルプレートに追加し、続いてＳＥＡを含むアッセイ緩衝液に１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＲＯ８８５、ＰＲＯ９９７、ＰＲＯ１１７５、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９又はＰＲＯ１４８０、アベルマブ、ウレルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせを段階希釈したものを追加した。３７℃、５％ＣＯ₂で９６時間インキュベーションした後、細胞上清を回収し、培養液のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レベルをキットの指示に従ってＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＩＬ−２ヒトＥＬＩＳＡ ＭＡＸアッセイを使用して定量した。ＩＬ−２濃度は、ＩＬ−２標準曲線から内挿され、逆計算されて、ＥＣ５０値の計算のためのためにアベルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせ、及びＰＲＯ８８５濃度に対してプロットされ（図２１及び表１８）、又はＥＣ５０値の計算のためにアベルマブ、ウレルマブ、アベルマブとウレルマブの組み合わせ、ＰＲＯ８８５及びＰＲＯ１１７５、又はＰＲＯ１１８６濃度に対してプロットされた（図２３及び表１９）。

【0465】

結果

【0466】

【表21】

【0467】

図２１に示すように、ＩＬ−２は、ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用の同時遮断と二重特異性分子ＰＲＯ８８５の追加によるＣＤ１３７の刺激に続いてＴ細胞から分泌された。アベルマブと比較すると、ＰＲＯ８８５はより高いＴ細胞活性化とより優れた効力を示した（ＰＲＯ８８５、ＥＣ５０＝３９．９２ｎｇ／ｍｌ；アベルマブ、ＥＣ５０＝６９．８９ｎｇ／ｍｌ、表１８）。この発見は、二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５が、アベルマブによる単なるＰＤＬ１遮断よりも強いＴ細胞刺激を誘発できることを示している。さらに、高親和性の抗ＰＤＬ１ ｓｃＦｖ ＰＲＯ９９７は、アベルマブよりもＴ細胞の刺激において強力であることが判明した（ＰＲＯ９９７、ＥＣ５０＝４０．８６ｎｇ／ｍｌ；アベルマブ、ＥＣ５０＝９０．１８ｎｇ／ｍｌ、表１８）。

【0468】

さらに、二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ ＰＲＯ８８５は、（ｉ）ウレルマブよりも強いＴ細胞刺激を誘導でき（図２３）、（ｉｉ）ウレルマブよりもＴ細胞の刺激いより強力であった（ＰＲＯ８８５、ＥＣ５０＝５５．２１ｎｇ／ｍｌ、ウレルマブ、ＥＣ５０＝２７８．３ｎｇ／ｍｌ、表１９）。

【0469】

【表22】

【0470】

さらに、アベルマブとウレルマブの組み合わせは、アベルマブ単独よりも強力なＴ細胞刺激を誘導することができたが（図２３）、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖｓ ＰＲＯ１１７５、ＰＲＯ１１８６、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９及びＰＲＯ１４８０は、ＩＬ−２のさらに強力な産生を引き起こした（図２１及び２３）。おそらくＣＤ１３７をハイパークラスター化するその機能が原因である。ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１１７５は、（ｉ）アベルマブとウレルマブの組み合わせよりも有意に強いＴ細胞刺激を誘導でき（図２３）、（ｉｉ）アベルマブとウレルマブの組み合わせよりもＴ細胞の刺激により強力であった（ＰＲＯ１１７５、ＥＣ５０＝３１．１１ｎｇ／ｍｌ、アベルマブ＋ウレルマブ、ＥＣ５０＝３１８．６ｎｇ／ｍｌ、表１９）。さらに、ＰＲＯ１４３０、ＰＲＯ１４７９、ＰＲＯ１４８２及びＰＲＯ１４８０は、他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子と比較して、ＰＭＢＣでのＩＬ−２産生を刺激する優れた効力を示した（図２１及び２３）。試験した他のｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子と比較した場合、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１４８０は、ＰＭＢＣでのＩＬ−２産生を刺激する最高の効力を示した（図２１）。

【0471】

実施例９：コスティムシグナリングはＴＣＲ刺激との組み合わせでのみ発生し、ＰＤＬ１ ＩｇＧ１とＣＤ１３７ ＩｇＧ４の組み合わせよりもＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖで顕著になる
この実験では、ＰＤ−１／ＰＤＬ１阻害とＣＤ１３７アゴニズムの相乗効果を評価した。このアッセイでは、Ｔ細胞でのＣＤ１３７の発現を誘導するために、ＰＤＬ１発現ＣＨＯ細胞と抗ＣＤ３抗体の存在下で末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を使用した。抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子を適用することにより、２つのＴ細胞調節シグナル伝達経路が同時に標的にされた：阻害性ＰＤ−１／ＰＤＬ１経路の阻害と、三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ分子によって媒介される免疫シナプスの形成によるＣＤ１３７経路の活性化（ＰＲＯ１１８６）。三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ分子ＰＲＯ１１８６によるＴ細胞の活性化は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はＩＦＮγの分泌によって評価され、ベンチマーク参照抗体アベルマブ、ウレルマブによって媒介される交差連結、又はそれらの組み合わせによって媒介されるＰＤＬ１阻害媒介される効果と比較された。

【0472】

方法
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、密度勾配遠心分離により新鮮なヒト全血から単離された。次に、ウェルあたり１００，０００個のＰＢＭＣを、２ｍｃｇ／ｍｌの濃度の抗ＣＤ３抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５１９１６）を含む９６ウェルプレートに添加し、ウェルあたり１０，０００個のＣＨＯ細胞がヒトＰＤＬ１を発現した後、アッセイ緩衝液にＰＲＯ１１８６、アベルマブ、ウレルマブ、及びアベルマブとウレルマブの組み合わせを段階希釈したものを添加した。３７℃、５％ＣＯ₂での７２時間のインキュベーション後、細胞上清を回収し、培養上清中のヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）及びＩＦＮγレベルを定量した。キットの指示に従い、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄのＩＬ−２ヒトＥＬＩＳＡ ＭＡＸアッセイを使用して、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）レベルを定量した。ＩＬ−２濃度は、ＩＬ−２標準曲線から内挿された（図２３Ｅ）。ＥＬＩＳＡによるキットの指示に従い、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＨｕｍａｎＩＦＮ−γＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＩＦＮγレベルを定量化した（図２３Ｆ）。

【0473】

結果
図２３（Ｅ）及び（Ｆ）に示すように、ＩＬ−２及びＩＦＮγは、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用の同時遮断と、三重特異性分子ＰＲＯ１１８６の追加によるＣＤ１３７の刺激に続いてＴ細胞から分泌された。この発見は、三重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ ＰＲＯ１１８６が、アベルマブによる単なるＰＤＬ１遮断、又はウレルマブによるＣＤ１３７遮断、又はそれらの組み合わせよりも強いＴ細胞刺激を誘導できることを示しす。ＰＲＯ１１８６は、ＩＬ−２（図２３Ｅ）及びＩＦＮγ（図２３Ｆ）の産生を誘発するのに、アベルマブ又はウレルマブ、あるいはその２つの組み合わせよりも強力であった。抗ＣＤ３抗体がない場合、ＩＬ−２及びＩＦＮγのレベルは、試験したすべての濃度で基礎サイトカイン分泌に匹敵し、生産的なＣＤ１３７シグナル伝達にはＴＣＲシグナル伝達又はＣＤ３関与が必要であることを示す。

【0474】

実施例１０：ヒト細胞株由来肺癌異種グラフトモデルＨＣＣ８２７におけるＣＤ１３７のＰＤＬ１遮断及び付随する局所刺激の抗腫瘍効果の評価
本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性を、タコニック及び同種異系ヒト末梢血単核細胞由来の免疫不全ＮＯＧマウス株を用いたヒトＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ異種グラフト片における抗ＰＤＬ１及び抗ＣＤ１３７療法と比較した。グラフトしたヒトＴリンパ球は、外来主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩとマウス細胞からの他の抗原に対して異種反応性を示す。結果として、Ｔリンパ球は異なる臓器に炎症性浸潤を引き起こし、数週間後に動物の死に至る。これは異種グラフト片対宿主病（ｘＧＶＨＤ）として公知であるプロセスである。抗ＰＤＬ１や抗ＣＤ１３７などの免疫調節抗体による治療は、ｘＧＶＨＤを悪化させることが示された（Sanmamed MF et al. Nivolumab and urelumab enhance antitumor activity of human T lymphocytes engrafted in Rag2-/-IL2Rgnull immunodeficient mice. Cancer Res 2015;75(17):3466-3478）。腫瘍体積に対するＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ；配列番号２１８）とＰＲＯ１０６０（ＩｇＧの重鎖のＣ末端にＣＤ１３７ ｓｃＦｖが融合したＩｇＧ−ｓｃＦｖ；配列番号２３４及び２３５）の効果は、本発明の多重特異性抗体（例えば、ＰＲＯ１１３７）と同じＰＤＬ１特異的可変ドメインを含むＩｇＧ１、及び同じＣＤ１３７特異的可変ドメイン（ＰＲＯ１１３８）を有するＩｇＧ４による処置と比較された。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、制御性Ｔ細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度をフローサイトメトリーで分析した。抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１治療後の免疫系の変調を全身的に調査するために、肝臓及び脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。さらに、定量的ＥＬＩＳＡ法を使用して全身のＩＦＮｇレベルを分析した。

【0475】

研究設定と治療スケジュール
雌ＮＯＧマウスは、５×１０⁶個のＨＣＣ８２７細胞の片側注射を受けた。細胞を、ＰＢＳ中の５０％細胞懸濁液と５０％マトリゲルの混合液に１００μｌの総注入量で注入した。ＮＯＧマウスへの腫瘍細胞の注入及び腫瘍グラフトの成功（中央群腫瘍体積８０−１００ｍｍ３）後、静脈内注射によってマウスを５×１０⁶個のヒトＰＢＭＣに置き換えた。無作為化の日に、各グループの４匹のマウスをドナーＡのＰＢＭＣで再構成し、別の４匹のマウスをドナーＢのＰＢＭＣで再構成した。ＰＢＭＣの注射の１〜２時間後に治療を開始し、以下のように適用した。

【0476】

【表23】

【0477】

ＰＲＯ１０５７の高用量（ＨＤ）と、ＰＲＯ１０６０及びＰＲＯ１１３７の０．２ｍｇ用量は、ＮＦ−ＡＴレポーター遺伝子アッセイにおけるＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用をブロックする抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に基づいて、０．１ｍｇ用量のＡａｖｅｌｕｍａｂ（マウスあたり）に対してモデル化された同じ相対活性を達成するように設定された。したがって、２ｍｇのＰＲＯ１０５７、又は０．２ｍｇのＰＲＯ１０６０、又は０．２ｍｇのＰＲＯ１１３７は、０．１ｍｇの用量のアベルマブに対する１つの相対単位（１ｒ．Ｕ）として表すことができる。

【0478】

キャリパーによる体重測定及び腫瘍体積測定は、週に２回行われた。研究結果に応じて、定められた時点で動物を犠牲にした。３匹を除くすべての動物が「同じ」時点（１７日目と１８日目）で犠牲にされた。異種グラフト片対宿主病（ｘＧＶＨＤ）の発症により、３匹の動物はすでに１４日目に安楽死された。容量の都合上、各グループ前半のサンプル採取・処理は初日に行い、各グループ後半のサンプル採取・処理は翌日に行った。２匹の異なるドナーからのＰＢＭＣで再構成された動物は、２つのサンプリングコホートで等しく発現された。すべての動物の腫瘍、脾臓、肝臓を研究の最後に収集し、フローサイトメトリー用に処理して、次のヒトマーカーを分析した：生／死、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＴＩＭ３、ＰＤ−１、及びグランザイムＢ。製造元の指示に従い、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムを使用したＥＬＩＳＡにより、血清サンプルのＩＦＮｇレベルを分析した。

【0479】

結果
免疫不全症を使用したヒトＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ異種グラフト片における多重特異性抗体ＰＲＯ１０５７（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）及びＰＲＯ１０６０（モリソン形式抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７）、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）及び抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）の抗腫瘍活性ＮＯＧマウス系統及び同種異系ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）は、腫瘍体積を測定することにより評価された（図２４）。腫瘍体積は、１７日目又は１８日目にマウスが犠牲になるまで週２回測定された。腫瘍体積は、治療開始時の腫瘍体積（相対腫瘍体積）に対して正規化された。図２４に示すように、抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８又はｕｒｅｌｕｍａｂ）又は抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）モノクローナル抗体で処理されたＨＣＣ８２７腫瘍保有マウスは、ベヒクルコントロールグループと同様の腫瘍増殖を示した。対照的に、ｓｃＰｂ−ｓｃＦｖ（ＰＲＯ１０５７）やＩｇＧ−ｓｃＦｖ（ＰＲＯ１０６０）などの抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７二重特異性抗体による治療は、腫瘍増殖の明確な安定化をもたらした。さらに、ドナーＢからのＰＢＭＣで再構成されたマウスにおける二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７分子による処置は、腫瘍の退縮をもたらした（図２４Ｂ及び２４Ｄ）。特に、二重特異性分子による処置では、体重の中央値が低下することはなく、分子が試験した用量レベルで十分に許容されることを示唆しているが、ウレルマブによる処置では、治療開始から１７日後に体重の中央値が減少した（図２５）。

【0480】

さらに、Ｔリンパ球、すなわちヒト制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＦｏｘＰ３＋；図２６Ａ）及びヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、治療の１７日目又は１８日目の腫瘍で分析された（図２６）。腫瘍浸潤リンパ球をフローサイトメトリーで調べ、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度とヒト調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度の比率を測定した（図２６Ｂ）。

【0481】

ウレルマブ処理のみで、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞の頻度が減少し、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１３７）処理で、制御性Ｔ細胞が増加した（図２６Ａ）。興味深いことに、ＰＲＯ１０５７及びＰＲＯ１０６０治療グループにおけるＰＤ１／ＰＤＬ１の遮断とＣＤ１３７の同時トリガー（おそらく同じ細胞上）により、抗ＰＤＬ１治療グループで観察された制御性Ｔ細胞の増加が妨げられた（図２６Ａ）。

【0482】

さらに、二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７抗体（ＰＲＯ１０５７及びＰＲＯ１０６０）による治療では、単剤療法による治療グループ又はベヒクルコントロールグループと比較して、腫瘍内ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞／ヒトＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）比が２倍以上改善された（図２６Ｂ）。ＰＲＯ１０５７及びＰＲＯ１０６０で処理されたグループで観察されたＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比の増加は、腫瘍微小環境で二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７抗体によって効果的な抗腫瘍応答が誘発されたことを示す。二重特異性抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７抗体で処理した後、制御性Ｔ細胞の頻度が減少し、腫瘍内ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞／ヒトＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋）比が増加したことは、抗腫瘍エフェクター／メモリーＴ細胞応答が首尾よく誘発されたことを示す。

【0483】

さらに、ＰＤ１陽性のＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の頻度を測定して、腫瘍の微小環境における活性化Ｔ細胞の割合を評価した（図２７）。ＰＤ１０陽性のＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の用量依存的な増加がＰＲＯ１０５７で観察され、高用量では、ＰＲＯ１０６０及びＰＲＯ１０３７での処理と同様のレベルのＰＤ１陽性Ｔ細胞に達し、ＰＤＬ１ブロッキング活性に関して、３つの化合物の同等の投与が確認された（図２７Ａ及びＢ）。２つの抗ＣＤ１３７抗体ＰＲＯ１０３８及びウレルマブは、ＰＤ１陽性ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージに影響を与えなかったようであった。

【0484】

実施例１１：ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトされたＮＯＧマウスにおける、ＤＬ１遮断及び付随するＣＤ１３７の局所刺激の抗腫瘍効果の評価
本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性を、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣｓ）をグラフトしたＮＯＧマウス株を用いたヒトＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ異種グラフト片における抗ＰＤＬ１及び抗ＣＤ１３７単剤及び併用療法と比較した。腫瘍体積に対するＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ；配列番号２２１）の効果を、本発明の多重特異性抗体と同じＰＤＬ１特異的可変ドメイン（例えば、ＰＲＯ１１９６、配列番号２４２及び２４３）、アベルマブ（Ａａｖｅｌｕｍａｂ）、ウレルマブと比較した。さらに、腫瘍体積に対するＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ；配列番号２２１）の効果を、本発明の多重特異性抗体（ＰＲＯ１１９６、配列番号２４２及び２４３）と同じＰＤＬ１特異的可変ドメインを含むＩｇＧ１の併用治療と、同じＣＤ１３７特異的可変ドメイン（ＰＲＯ１１３８、配列番号２４４及び２４５）を有するＩｇＧ４を比較した。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、制御性Ｔ細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度をフローサイトメトリーで分析した。抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１治療後の免疫系の変調を全身的に調査するために、肝臓及び脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーで分析した。さらに、定量的ＥＬＩＳＡ法を使用して、全身のＩＦＮγレベルを分析した。

【0485】

研究設定と治療スケジュール
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）をグラフトしたメスのＮＯＧマウスに、ＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ細胞を皮下注射した。マウスは、５×１０⁶個のＨＣＣ８２７細胞の片側注射を受けた。細胞を、ＰＢＳ中の５０％細胞懸濁液と５０％マトリゲルの混合液に１００μｌの総注入量で注入した。ＮＯＧマウスへの腫瘍細胞の注入及び腫瘍グラフトの成功（中央群腫瘍体積８０〜１００ｍｍ³）後、マウス（ｎ＝１０）を無作為に治療群に分けた。

【0486】

【表24】

【0487】

キャリパーによる体重測定及び腫瘍体積測定は、週に２回行われた。研究の終わりに腫瘍を採取し、フローサイトメトリーによってヒトＴ細胞の浸潤を評価した。すべての動物の腫瘍、脾臓、肝臓を研究の最後に収集し、フローサイトメトリー用に処理して、以下のヒトマーカーを分析した：生／死、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＦＯＸＰ３、ＴＩＭ３、ＰＤ−１、及びグランザイムＢ。製造元の指示に従い、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムを使用したＥＬＩＳＡにより、血清サンプルのＩＦＮγレベルを分析した。

【0488】

結果
ヒト臍帯血をグラフトした免疫不全ＮＯＧマウス系統を使用したヒトＨＣＣ８２７ ＮＳＣＬＣ異種グラフト片における多重特異性抗体ＰＲＯ１１８６（ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ）、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１９６又はａｖｅｌｕｍａｂ）及び抗ＣＤ１３７（ウレルマブ）の抗腫瘍活性由来のＣＤ３４＋造血幹細胞（ＵＣＢ ＨＳＣ）は、腫瘍体積を測定することで評価された（図２８及び２９）。腫瘍体積は、マウスが２５、２９、又は３０日目に犠牲になるまで週２回測定された。腫瘍体積は、治療開始時の腫瘍体積（相対腫瘍体積）に対して正規化された。図２８及び２９に示すように、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ（ＰＲＯ１１８６）などの抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ三重特異性抗体、及び抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８）の組み合わせによる治療は、腫瘍増殖の明確な安定化をもたらした。特に、三重特異性分子（ＰＲＯ１１８６）による治療は、分子が中央値の減少につながらず、抗ＰＤＬ１（ＰＲＯ１１９６）と抗ＣＤ１３７（ＰＲＯ１１３８）は、治療開始の２４日後に、体重減少がそれぞれ１０％又は１５％を超える動物の数の増加をもたす（図３０）。抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ（ＰＲＯ１１８６）療法は、抗ＰＤＬ１ ＩｇＧ（ＰＲＯ１１９６）又は抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ（ウレルマブ）による療法よりも腫瘍増殖の強い減少をもたらした。抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ（ＰＲＯ１１８６）療法は、より高い奏効率（３０％ｖｓ ２０％）をもたらし、一般に抗ＰＤＬ１と抗ＣＤ１３７の併用療法よりも忍容性が高かった。これは、より高い頻度の細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋及びＣＤ８＋、ＧｒＢ＋）と相関し、腫瘍のＣＤ８＋／ＣＤ４＋及びＣＤ８＋、ＧｒＢ＋／Ｔｒｅｇ比が増加する（図３１及び３２）。Ｔリンパ球、すなわち細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋、ＧｒＢ＋）、ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞（図３１及び３２）の頻度を腫瘍の治療の２４日目、２９日目、及び３０日目に分析した。

【0489】

さらに、ヒトＣＤ３４＋幹細胞置換ＮＯＧマウスを使用したＨＣＣ８２７異種グラフト研究で、動物の血清サンプルの抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ（ＰＲＯ１１８６）を定量化する薬物動態分析を実施した（図３３、表２０）。ＥＬＩＳＡプレートをＣＤ１３７で一晩コーティングし、抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ（ＰＲＯ１１８６）の連続希釈液を加えて、検量線を作成した。結合した抗ＰＤＬ１ｘＣＤ１３７ｘＨＳＡ（ＰＲＯ１１８６）は、ビオチン化ヒトＰＤＬ１、続い試験レプトアビジンポリＨＲＰで検出された。希釈された血清サンプル中のＰＲＯ１１８６濃度は、検量線から内挿された。薬物動態パラメーターは、非コンパートメントアプローチを使用したＰＫソルバーソフトウェアアドインによって推定された。４１．７時間、３６．８時間、３８．４時間の半減期は、それぞれグループＰＲＯ１１８６−ＨＤ（０．５ｍｇ）、ＰＲＯ１１８６−ＭＤ（０．１ｍｇ）、ＰＲＯ１１８６−ＬＤ（０．０２ｍｇ）の投与後の最初の排出相を分析することにより決定された。

【0490】

【表25】

【0491】

実施例１２：同系ＭＣ３８結腸癌モデルにおけるＰＤＬ１遮断及び付随するＣＤ１３７の局所刺激の抗腫瘍効果の評価
さらに、本発明の多重特異性抗体の抗腫瘍活性は、無傷の免疫系を有する同系Ｃ５７ＢＬ ／ ６マウスのＭＣ３８結腸癌モデルで試験される。このモデルは、ＣＤ１３７アゴニストとＰＤ−１／ＰＤＬ１アンタゴニストの併用治療により抗腫瘍活性の増強を示すために他の人によって使用されている（Chen S et al. Combination of 4-1BB agonist and PD-1 antagonist promotes antitumor effector/memory CD8 T cells in a poorly immunogenic tumor model. Cancer Immunol Res 2014;3(2):149-160、及びRodriguez-Ruiz ME et al. Abscopal effects of radiotherapy are enhanced by combined immunostimulatory mAbs and are dependent on CD8 T cells and crosspriming. Cancer Res 2016;76(20):5994-6005）。

【0492】

本発明の多重特異性抗体の抗ＣＤ１３７ドメイン及び抗ＰＤＬ１ドメインはどちらもマウスＰＤＬ１に対して交差反応性がないため、ＣｒｏｗｎＢｉｏによって確立された操作されたヒトＣＤ１３７ノックインモデルが使用される。このモデルでは、マウスＣＤ１３７の細胞外及び膜貫通ドメインが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのバックグラウンドでヒトＣＤ１３７のそれぞれの配列に置き換えられた。さらに、マウスＰＤＬ１の代わりにＣＭＶプロモーターの制御下でヒトＰＤＬ１を発現する改変ＭＣ３８腫瘍細胞株が使用される。
腫瘍容積に対する本発明の多重特異性抗体の効果は、ＮＤ０２１と同じＰＤＬ１特異的可変ドメインを含むヒト化ＩｇＧ１と同じＣＤ１３７特異的可変ドメインを有するヒト化ＩｇＧ４との併用治療と比較される。ローカライズされた抗腫瘍免疫応答のさらなる証拠を提供するために、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋及び制御性Ｔ細胞などの腫瘍浸潤リンパ球の頻度がフローサイトメトリーによって分析される。抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１治療に続く免疫系の変調を探索するために、肝臓及び脾臓におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度がフローサイトメトリー及びおそらく免疫組織化学によって分析される。さらに、定量的ＥＬＩＳＡ法を使用して、全身のＩＦＮｇレベルを分析できる。抗ＣＤ１３７／抗ＰＤＬ１併用療法の安全性プロファイルをさらに特徴付けるために、アラニンアミノトランスフェラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼのレベルの増加など、主に肝毒性（臨床で抗ＣＤ１３７療法で観察）に関連する臨床化学病理学パラメーターアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを評価することができる。

【0493】

実施例１３：本発明の例示的な多重特異性抗体
一般的な説明ｓｃＤ
単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つの異なる抗体からの２つのＶＨ及び２つのＶＬドメインを含む、１つの鎖で構成される小さな二価抗体断片である（Holliger et al. PNAS, 1993 Jul 15;90(14):6444-8）。Ｎｕｍａｂ ｓｃＤｂ形式では、可変ドメインはＧＳリンカーによってＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ−ＶＨＡドメイン方向に接続される。これらの単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂｓ）のリンカーは、ドメインの正しいアセンブリを強制し、抗原結合活性を変更せずに安定性を向上させる。ＶＬＡをＶＨＢに、ＶＬＢをＶＨＡに接続する短いＧ４Ｓリンカーは、隣接するドメインのアセンブリを可能にし、ドメインを開いたコンフォメーションに保ち、対応するドメインの正しいペアリングを可能にするために必要なものよりもかなり短い。ＶＬＡ−ＶＨＢ及びＶＬＢ−ＶＨＡダイアボディアームは、ＶＨＢドメインとＶＬＢドメイン間の長い（Ｇ４Ｓ）４リンカーによって接続され、頭から尾への配向で二量体化して、分子量が約５０ｋＤａのコンパクトな二重特異性分子を生成する。ｓｃＤｂは、Ｅ．ｃｏｌｉ又はＣＨＯ−Ｓ宿主細胞のいずれかで組換え発現させることができる。図２２Ａを参照されたい。

【0494】

ＰＲＯ８８５
ＰＲＯ８８５は、２つの短い隣接するＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーによって接続された外側（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１）と内側（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。

【0495】

ＰＲＯ９５１
ＰＲＯ９５１は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外側（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１）と内側（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−２７−Ｃ０５ ｓｃ０２）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ヒトのアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。ＰＤＬ１特異的ＣＤＲは、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトし、ＣＤ１３７特異的ＣＤＲは、ＶＨ３のコンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトした。

【0496】

ＰＲＯ１１２３
ＰＲＯ１１２３は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外部（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１）と内部（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０５）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。さらに、ＣＤ１３７ドメインには、ＶＬ−ＶＨ界面の形成に関与するウサギの残基がほとんど含まれていない。

【0497】

ＰＲＯ１１２４
ＰＲＯ１１２４は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外部（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１）と内部（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０６）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。さらに、ＣＤ１３７ドメインは、ＶＬ−ＶＨ界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるいくつかのウサギ残基を含む。

【0498】

ＰＲＯ１１２５
ＰＲＯ１１２５は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外側（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０２）と内側（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。さらに、ＰＤＬ１ドメインは、ＶＬ−ＶＨ界面の形成に関与するウサギの残基をほとんど含まない。

【0499】

ＰＲＯ１１２６
ＰＲＯ１１２６は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外側（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０３）と内側（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。さらに、ＰＤＬ１ドメインは、ＶＬ−ＶＨ界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるバック変異ウサギ残基を含む。

【0500】

ＰＲＯ１１３４
ＰＲＯ１１３４は、２つの短い隣接したＧ４Ｓリンカーと長い中央（Ｇ４Ｓ）４リンカーで接続された外部（ＶＬＡ／ＶＨＡ）ＰＤＬ１結合ドメイン（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０７）と内部（ＶＨＢ／ＶＬＢ）ＣＤ１３７特異的ドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）を含むｓｃＤｂ分子である。どちらのドメインも、ＶＨ４コンセンサス様ヒトアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。さらに、ＰＤＬ１ドメインは、ＶＬ−ＶＨ界面の形成に関与し、抗原と相互作用する可能性のあるウサギの生殖系列残基を含む。

【0501】

一般的な説明ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ
ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ）はＮｕｍａｂで開発された形式であり、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して接続された３番目の単鎖可変ドメインペア（ＶＬＣ／ＶＨＣ）を上記のように非常に安定した単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）形式に追加する（ＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ−ＶＨＡドメイン方向（短いＧ４Ｓコアリンカーと長い（Ｇ４Ｓ）４中央リンカーを有する）。したがって、ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ形式は、単一タンパク質鎖上のｓｃＦｖエンティティと約８０ｋＤａの分子量を有するｓｃＤｂのタンデム配置からなる。ｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ抗体断片は、哺乳動物細胞で組換え発現させることができる。図２２Ｂを参照されたい。

【0502】

ＰＲＯ９６３
ＰＲＯ９６３は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４−ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１及びＣＤ１３７特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＨＳＡドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのＣＤＲからなる。

【0503】

ＰＲＯ９６６（ＰＲＯ１０５２）
ＰＲＯ９６６は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖエンティティ（１９−０１−Ｈ０４−ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）及び抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ｃ０５ ｓｃ０１、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１及びＣＤ１３７特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＨＳＡドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのＣＤＲからなる。

【0504】

ＰＲＯ１０５７
ＰＲＯ１０５７は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖエンティティ（２３−１３−Ａ０１−ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアで融合したｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１及びＣＤ１３７特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＨＳＡドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのＣＤＲからなる。

【0505】

ＰＲＯ１０５８
ＰＲＯ１０５８は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（２３−１３−Ａ０１−ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ｃ０５ ｓｃ０１、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１及びＣＤ１３７特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＨＳＡドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのＣＤＲからなる。

【0506】

ＰＲＯ１１８６
ＰＲＯ１０８６は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（２３−１３−Ａ０１−ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。 ＰＤＬ１及びＣＤ１３７特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＨＳＡドメインは、マウス血清アルブミンに対する交差反応性を含む親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギ残基を含む、ヒトのＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギのＣＤＲからなる。

【0507】

ＰＲＯ１４３０
ＰＲＯ１４３０は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトされたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡドメインは、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトされたウサギのＣＤＲからなる。ＨＳＡドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７特異的ドメインは、安定化するＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0508】

ＰＲＯ１４７９
ＰＲＯ１４７９は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖエンティティのあるターミナル（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ３コンセンサス様アクセプターフレームワークである。ＰＤＬ１及びＨＳＡ特異的ドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７特異的ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0509】

ＰＲＯ１４８２
ＰＲＯ１４８２は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４−ｓｃ１３、ＶＬＡ／ＶＨＡ）及び抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡ特異的ドメインは、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギＣＤＲからなる。すべてのドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。

【0510】

ＰＲＯ１４３１
ＰＲＯ１４３１は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ１８、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡ特異的ドメインは、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギＣＤＲからなる。ＨＳＡドメインは、親ウサギＩｇＧ結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７特異的ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0511】

ＰＲＯ１４７３
ＰＲＯ１４７３は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０３、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡ特異的ドメインは、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギＣＤＲからなる。ＨＳＡ及びＰＤＬ１特異的ドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基含み、ＣＤ１３７ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0512】

ＰＲＯ１４７６
ＰＲＯ１４７６は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ０３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡ特異的ドメインは、ヒトＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギＣＤＲからなる。ＨＳＡ及びＰＤＬ１特異的ドメインは、親ウサギＩｇＧ結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７固有ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0513】

ＰＲＯ１４３２
ＰＲＯ１４３２は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ１３、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２ ｓｃ１８、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。ＰＤＬ１特異的ドメインは、グラフトしたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ４コンセンサス様アクセプターフレームワークであるが、ＣＤ１３７及びＨＳＡ特異的ドメインは、ヒトのＶＨ３ベースのアクセプターフレームワークにグラフトしたウサギＣＤＲからなる。ＨＳＡ及びＰＤＬ１特異的ドメインは、親ウサギＩｇＧ結合特性の保持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７特異的ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0514】

ＰＲＯ１４８０
ＰＲＯ１４８０は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）及び抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ａ１１ｓｃ０２、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ３コンセンサス様アクセプターフレームワークである。ＰＤＬ１及びＨＳＡ特異的ドメインは、親ウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。

【0515】

ＰＲＯ１４８１
ＰＲＯ１４８１は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ）とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）と抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ａ１１ｓｃ０３、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのＣＤＲを有するヒトＶＨ３コンセンサス様アクセプターフレームワークである。ＰＤＬ１、ＣＤ１３７、及びＨＳＡ特異的ドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含む。

【0516】

ＤｉＳを有するＰＲＯ１４８０
ＤｉＳを有するＰＲＯ１４８０は、抗ＨＳＡ ｓｃＦｖ実体（１９−０１−Ｈ０４ ｓｃ０３、ＶＬＣ／ＶＨＣ））とＣ末端で融合した抗ＰＤＬ１（３７−２０−Ｂ０３ ｓｃ０９．１、ＶＬＡ／ＶＨＡ）及び抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ａ１１ｓｃ０７、ＶＨＢ／ＶＬＢ）ｓｃＤｂコアからなるｓｃＤｂ−ｓｃＦｖ分子である。すべてのドメインは、グラフトされたウサギのＣＤＲを有するヒトのＶＨ３コンセンサス様アクセプターフレームワークである。ＰＤＬ１及びＨＳＡ特異的ドメインは、親のウサギＩｇＧ結合特性の維持をサポートする追加のウサギフレームワーク残基を含み、ＣＤ１３７特異的ドメインは、安定化ＶＬ／ＶＨドメイン間ジスルフィド結合を含む。

【0517】

一般的な説明ＩｇＧ−ｓｃＦｖ
ＩｇＧ−ｓｃＦｖ分子は、単一特異性ＩｇＧに融合したｓｃＦｖ部分からなる二重特異性抗体である（Coloma M.J., Morrison S.L. Nat. Biotechnol. 1997;15:159-163）。各軽鎖又は重鎖のアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに、異なる特異性のｓｃＦｖドメインを付加することができ、これにより、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ二重特異性抗体タイプの多様なレパートリーがもたらされる。Ｎｕｍａｂで生成された分子は、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ又はＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖタイプのもであり、２つのｓｃＦｖは、完全長のＩｇＧ重鎖（ＨＣ）又は軽鎖（ＬＣ）のＣ末端に同じ特異性を有し、サイレンシングされたＦｃ部分と、ＩｇＧ部分とｓｃＦｖ部分を接続する（Ｇ４Ｓ）２リンカーを含む。両方のタイプの合計分子量は約２００ｋＤａであり、分子は哺乳類細胞で組換え発現させることができる。図２２Ｃ及び２２Ｄを参照されたい。

【0518】

ＰＲＯ１０５９（ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ）
ＬＣのＣ末端に融合した抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖドメイン（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）を有するサイレント抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２−ｓｃ０１）ｈＩｇＧ１。（Ｇ４Ｓ）２リンカーはＩｇＧ部分とｓｃＦｖ部分を接続する。これは、それ自体が（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して対応するＶＨドメインに接続されたＶＬドメインからなる。

【0519】

ＰＲＯ１０６０（ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ）
ＨＣのＣ末端に融合した抗ＣＤ１３７（３８−０２−Ａ０４ ｓｃ０１）ｓｃＦｖドメインを有するサイレント抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２−ｓｃ０１）ｈＩｇＧ１。（Ｇ４Ｓ）２リンカーはＩｇＧ部分とｓｃＦｖ部分を接続する。これは、それ自体が（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して対応するＶＨドメインに接続されたＶＬドメインからなる。

【0520】

ＰＲＯ１０６１（ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ）
ＬＣのＣ末端に融合した抗ＣＤ１３７ ｓｃＦｖドメイン（３８−２７−Ｃ０５ ｓｃ０１）を備えたサイレンシングされた抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２−ｓｃ０１）ｈＩｇＧ１。（Ｇ４Ｓ）２リンカーはＩｇＧ部分とｓｃＦｖ部分を接続する。これは、それ自体が（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して対応するＶＨドメインに接続されたＶＬドメインからなる。

【0521】

ＰＲＯ１０６２（ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ）
ＨＣのＣ末端に融合した抗ＣＤ１３７（３８−２７−Ｃ０５ ｓｃ０１）ｓｃＦｖドメインを有するサイレント抗ＰＤＬ１（３３−０３−Ｇ０２−ｓｃ０１）ｈＩｇＧ１。（Ｇ４Ｓ）２リンカーはＩｇＧ部分とｓｃＦｖ部分を接続する。これは、それ自体が（Ｇ４Ｓ）４リンカーを介して対応するＶＨドメインに接続されたＶＬドメインからなる。

【0522】

選択されたドメインの生物物理学的特性
選択されたドメインはより大きなスケールで生成され（０．２Ｌ〜１．２Ｌの発現量）、精製後に遠心濃縮チューブを使用して１０ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮された（表２１）。

【0523】

ＳｃＦｖは、４週間の安定性研究などの安定性研究に供された。ｓｃＦｖは、水性緩衝液（ｐＨ６．４で１５０ｍＭ ＮａＣＬを含む５０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液）に１０ｍｇ／ｍｌで処方され、＜−８０℃、４℃、４０℃で４週間保存された。少なくとも、１週間後、２週間後、及び各研究の終了時に、製剤中のモノマー及びオリゴマーの割合をＳＥ−ＨＰＬＣピーク面積の積分によって評価した。一部の分子について、追加の時点が記録された。表２２は、研究のｄ２８で得られたｄ７とエンドポイントの測定値を比較する。

【0524】

さらに、ｓｃＦｖ分子の互換性は、凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクル（コロイド安定性）に関して評価された。Ｆ／Ｔ安定性評価では、保存安定性研究（ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と同じ分析方法とパラメーター（％モノマー含有量と％モノマー損失）を適用して、５つのＦ／Ｔサイクルにわたって分室の質をモニターした。表２３は、５回の繰り返しＦ／Ｔサイクルにおけるモノマー含有量の推移を％で示す。Ｆ／Ｔサイクルを繰り返しても、どの分子も４％以上のモノマー含有量を喪失しなかった。

【0525】

分子の熱変性は、蛍光色素ＳＹＰＲＯオレンジを使用して評価した。関連する賦形剤条件のサンプルを調製し、ｑＰＣＲ装置でアッセイを実施した。蛍光発光は、ソフトウェアのカスタム色素キャリブレーションルーチンを使用して検出された。試験サンプルを含むＰＣＲプレートは、２５℃から９６℃まで１℃ずつ温度を上げていった。展開遷移の中間点（Ｔｍ）は、ソフトウェアのＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって、数学的な２次導関数法を使用して計算され、曲線の変曲点が計算された。報告されたＴｍは、３つの測定値の平均である。表２４は、一般的な緩衝液（ｐＨ６．４のリン酸−クエン酸緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で調合された分子の融解温度を示す。

【0526】

選択された上位の分子は、短期のｐＨストレス安定性試験にかけられ、ｓｃＦｖ分子は、ｐＨ値が３．５から７．５の一連の水性（リン酸−クエン酸塩）緩衝液システムで１ｍｇ／ｍｌで配合された。モノマー含有量（％）及びモノマー損失（％）は、それぞれの緩衝液システムで４０℃で２週間保存した後に分析した（データは示されない）。研究の過程でのモノマー含有量、モノマー損失、濃度、及び濃度損失の表形式の要約を表２５に示す。

【0527】

多重特異性抗体の生物物理学的特性
選択された多重特異性分子を４週間の安定性研究などの安定性研究に供し、多重特異性分子を次の緩衝液：１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍショ糖、ｐＨ５．５、１０ｍｇ／ｍｌを含む２５ｍＭリン酸クエン酸塩緩衝液に配合し、＜−２０℃、４℃、２０℃及び４０℃で４週間保存した。少なくとも、製剤中のモノマーとオリゴマーの割合は、ＳＥ−ＨＰＬＣを利用して、１日、４日、１週間後、及び１２週間まで毎週評価された。表は、調査結果をまとめた表２６である。

【0528】

【表26】

【0529】

【表27】

【0530】

【表28】

【0531】

【表29】

【0532】

【表30】

【0533】

【表31】

【0534】

【表32】

【図1A-B】

【図1C】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図22D】

【図23A-E】

【図23F-K】

【図23L-M】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【配列表】

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【国際調査報告】