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特表2021-502416ヒトがんの治療のためのモノクローナル抗体ＮＥＯ−２０１
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2021-502416(P2021-502416A)
(43)【公表日】2021年1月28日
(54)【発明の名称】ヒトがんの治療のためのモノクローナル抗体ＮＥＯ−２０１
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20201225BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20201225BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20201225BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20201225BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20201225BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20201225BHJP
C07K 16/46 20060101ALN20201225BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20201225BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 T
A61K38/20
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 121
C07K16/28ZNA
C07K16/46
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】52
(21)【出願番号】特願2020-544565(P2020-544565)
(86)(22)【出願日】2018年11月2日
(85)【翻訳文提出日】2020年6月18日
(86)【国際出願番号】US2018059039
(87)【国際公開番号】WO2019090134
(87)【国際公開日】20190509
(31)【優先権主張番号】62/581,380
(32)【優先日】2017年11月3日
(33)【優先権主張国】US
(31)【優先権主張番号】62/592,778
(32)【優先日】2017年11月30日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
(71)【出願人】
【識別番号】520155136
【氏名又は名称】プレシジョン バイオロジックス、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アーレン、フィリップ、エム．
(72)【発明者】
【氏名】ツァン、クウォン、ワイ．
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA41
4C084BA44
4C084CA18
4C084DA12
4C084NA05
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZC751
4C085AA14
4C085BB01
4C085CC02
4C085CC05
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA71
(57)【要約】
ＮＥＯ−２０１は、ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、結腸癌、膵癌、胃癌、肺癌、乳癌、子宮癌など、多くの様々ながんの大部分の腫瘍組織に対して高い反応を示すが、正常組織の圧倒的多数がこの抗体では認識されない。機能アッセイにより、ＮＥＯ−２０１は腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の両方を媒介できることが明らかになった。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト膵臓異種移植腫瘍の成長は、ＮＥＣ−２０１を単独で、及びＡＤＣＣのエフェクター細胞源としてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と組み合わせて処理することで大幅に減衰した。ヒト腫瘍異種移植片担持マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ分布研究では、ＮＥＯ−２０１が腫瘍内に優先的に蓄積するが、臓器組織には蓄積しないことが明らかになった。非ヒト霊長類における単回用量毒性研究では、循環好中球の一時的な減少が観察された唯一の関連する悪影響であったため、ＮＥＯ−２０１の安全性及び忍容性が実証された。【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫細胞を死滅させる方法。
【請求項2】
有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を治療する方法。
【請求項3】
有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫の再発を予防する方法。
【請求項4】
有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を有する患者の腫瘍量を減少させる方法。
【請求項5】
前記抗体は、補体媒介性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介し、それにより前記患者のがん腫細胞を死滅させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記患者は、前記投与前または前記投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記患者は、前記投与前または前記投与時に重度のＮＫ枯渇である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記投与前または前記投与時に、前記患者がＮＫ枯渇しているかを決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記投与前または前記投与時に、前記患者が重度にＮＫ枯渇しているかを決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記患者は、任意によりＣＮＫＤ（例えば、ＣＮＫＤ１、ＣＮＫＤ２）、またはＦＮＫＤ（例えば、ＦＮＫＤ１）を含むＮＫ細胞欠損症（ＮＫＤ）を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記患者は、別の治療法の結果としてＮＫが枯渇しているか、または重度にＮＫが枯渇している、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記患者はがん治療を受けている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記患者は化学療法または放射線療法を受けている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記化学療法は、１つ以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリド−ヒドロキサム酸（ＳＡＨ）、酪酸ナトリウム）、遺伝毒性剤（例えば、ドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、アフィジコリン、マイトマイシン、メトトレキサート、エトポシド）、ＧＳＫ阻害剤（例えば、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ、ＳＢ２１）、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＪＱ１）、ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ラディシコラ（ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ））、１７−ＡＡＧ）、微小管集合阻害剤（例えば、ビンクリスチン、サイトカラシンＤ、ノコダゾール、ドセタキセル）、及び／または免疫調節薬（例えば、レナリドマイド）を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記投与前または前記投与時に、ＮＫ細胞は、前記個体における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の５％未満を構成する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記投与前または前記投与時に、ＮＫ細胞は、前記個体における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の３％未満を構成する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記投与前または前記投与時に、前記患者の７０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記投与前または前記投与時に、前記患者の５０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれるＣＤＲ配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つすべてを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８の可変重鎖配列及び配列番号３９の可変軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０〜４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０〜２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれる６つすべての前記ＣＤＲ配列を含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８の前記重鎖可変領域配列及び配列番号２９の前記軽鎖可変領域配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０〜４７０を含む重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０〜２３３を含む軽鎖配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、ヒトＩｇＧ１の定常ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記ＮＥＯ−２０１抗体はヒト化されている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、別の部分にコンジュゲートされている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記ＮＥＯ−２０１抗体は、別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、または親和性タグにコンジュゲートされている、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記がん腫の細胞の死滅を増強するかまたは刺激するための有効量のサイトカインアゴニストを前記患者に投与することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記サイトカインアゴニストは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５阻害剤、チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗−４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗Ｔｉｍ−３、またはそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記がん腫の細胞の死滅を増強するかまたは刺激するための有効量の補体調節タンパク質（ＣＲＰ）アンタゴニストを前記患者に投与することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
前記ＣＲＰアンタゴニストは、ＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９のうちの１つ以上に拮抗する、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記ＣＲＰアンタゴニストは、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項36】
前記サイトカインアゴニストは、ＩＬ−１５アゴニストまたはＩＬ−１５スーパーアゴニストを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項37】
前記サイトカインアゴニストが、ＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質に結合したＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）からなる複合体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項38】
前記サイトカインアゴニストがＡＬＴ−８０３を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＮＥＯ−２０１抗体の前記有効投与量が、前記サイトカインアゴニストを含まない前記ＮＥＯ−２０１抗体単独での治療と比較して低減される、請求項３1〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記がんは、結腸癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記がんは、膵癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記がんは、卵巣癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記がんは、胃癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記がんは、肺癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記がんは、乳癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記がんは、子宮癌である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願本明細書は、２０１７年１１月３０日に提出された米国仮出願第６２／５９２，７７８号、及び２０１７年１１月３日に提出された米国仮出願第６２／５８１，３８０号の利益を主張し、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表情報この出願は、本開示の一部として、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、３２５６３バイトのサイズを有し、２０１８年１１月２日に作成された「４３２８２ｏ４４０２．ｔｘｔ」という名前のファイルに列挙されている生物学的配列を含む。
【背景技術】
【0003】
がんは、世界中で最も頻度の高い死亡原因のうちの１つであり、２０２５年には早くも毎年推定二千万件の新規症例が予測されている（Ｆｅｒｌａｙら、２０１５年）。手術、放射線、化学療法などの従来のがん治療法は、多くの場合重篤な副作用を誘発するが、進行した疾患の大多数の患者を治癒できず、再発となる（Ｂｏｄｅｙら、１９９６年）。より近年の治療法が、主に正常な健康な組織を温存しながらがん性細胞を選択的に標的とするために開発されている。この中でも、免疫療法は、がん医療の分野に革命をもたらしており、がん患者のための重要な治療選択肢となっている。
【0004】
がん免疫療法の根本的な原理は、免疫編集として公知であり（Ｍｉｔｔａｌら、２０１４年）、これは、細胞の形質転換が起こり、がん抑制の固有のメカニズムが奏功しなかった後にのみ開始するがん抑制の外因性のメカニズムである。免疫編集プロセスは、排除、均衡、及び逃避の３つの相で行われる。排除相及び平衡相のそれぞれの間、がん細胞の免疫拒絶反応は、がん細胞の増殖を支配するか、またはそれと均衡して、悪性成長を制御する。しかし、逃避相では、一旦抑制されたがん細胞は、免疫エフェクターメカニズムへの非感受性及び／または腫瘍微小環境における免疫抑制の誘導により、免疫認識を免れる可能性がある。免疫認識を免れたがん細胞は、より自由に増殖し、成長して、臨床的に明らかな疾患となり得る（Ｄｕｎｎら、２００４年）。がん免疫療法の目的は、抗腫瘍免疫応答を生成すること、及び／または増幅させることにより、腫瘍の成長を抑制し、腫瘍の再発を遅延させ、生存を延長することにより、がん細胞を排除相及び／または平衡相に保つことである（Ｃａｒｔｅｒ，２００１；Ｈｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｖｅｒｇａｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇａｂｉｔｚｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。治療アプローチには、チェックポイント阻害抗体、抗腫瘍ワクチン、及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞により患者を治療することが含まれ、これらはすべてＴ細胞による適応免疫を利用する。しかし、自然免疫は、抗腫瘍応答を生成し、増強することもでき、腫瘍を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して、自然抗腫瘍免疫を刺激することができる（Ｔｏｐａｌｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。
【0005】
ＮＥＯ−２０１は、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ同種大腸癌ワクチンプラットフォームに対して生成された新規のヒト化ＩｇＧ１ ｍＡｂである（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９７０；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９７２）。このワクチンの免疫原性成分は、大腸癌患者７９名の外科的切除片からプールされた腫瘍膜画分に由来する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であった（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。これらの膜画分は、半精製され、結腸癌患者対健常ボランティアにおける遅延型過敏症（ＤＴＨ）についてスクリーニングされ、難治性大腸癌患者の臨床試験において評価された（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，ＵＳ４８１０７８１，１９８９；Ｂｒｉｓｔｏｌ＆Ｋａｎｔｏｒ，米国特許第７８２９６７８号，２０１０）。これらの治験では、ワクチンに対する細胞媒介応答に加えて持続的なＩｇＧ応答が生じた患者での抗腫瘍応答及び全生存期間の有意な延長の両方によって定義される臨床的利益が報告され、それによりワクチンは抗腫瘍抗体を生成できる免疫原性成分を含んでいることが示唆された（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ，１９９１）。この最初の大腸癌ワクチンは、マウスにおいてモノクローナル抗体を生成するために使用されており、以前に記載したエンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ／ＮＥＯ−１０２）（Ｌｕｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｂｅｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０１７）及びＮＥＯ−２０１を生成した。予備調査では、ＮＥＯ−２０１がＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーの腫瘍関連バリアントに結合し得ることが示唆され（Ｚｅｌｉｇｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＮＥＯ−２０１によって認識される抗原（複数可）及び特定のエピトープ（複数可）の特徴をさらに明らかにするための取り組みが進行している。
【0006】
ヒトがん胎児性抗原（ＣＥＡ）ファミリーは、染色体１９ｑ１３．２にタンデム配置された２９個の遺伝子で構成されている。これらの遺伝子は、ヌクレオチド相同性に基づいて、２つの主要なサブファミリー、ＣＥＡＣＡＭ及び妊娠固有の糖タンパク質サブグループに分類される。ＣＥＡＣＡＭコードタンパク質としては、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡ関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、及びＣＥＡＣＡＭ８）が挙げられる。ＣＥＡＣＡＭファミリーは、Ｉｇスーパーファミリーに属している。構造的には、ヒトＣＥＡＣＡＭの各々には、１０８〜１１０個のアミノ酸が含まれ、かつＩｇ可変ドメインと相同である１つのＮ末端ドメインが含まれ、その後に異なる数（０〜６）のＩｇＣ２型の定常様ドメインが続く。ＣＥＡＣＡＭタンパク質は、互いに同種親和性及び異種親和性により相互作用し得る。ＣＥＡＣＡＭ１は、その細胞質ドメイン内にＰＤ１様ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ）を含むため、このファミリー内の固有のタンパク質である。この阻害効果は、ＩＴＩＭによるチロシン残基のリン酸化によって引き起こされ、その結果として、Ｓｒｃホモロジー２ドメインを含むチロシンホスファターゼ−１及び−２が動員される。ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質は、単球、顆粒球、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＮＫ細胞など様々な免疫細胞に発現する。ＣＥＡＣＡＭ１はいくつかのアイソフォームとして生じ、２つの主要なアイソフォームは、ＣＥＡＣＡＭ１−Ｌ及びＣＥＡＣＡＭ１−Ｓであり、それぞれ長い（Ｌ）または短い（Ｓ）細胞質ドメインを有する。ＣＥＡＣＡＭ１−Ｓの発現は、ヒト白血球では完全に欠如している。ＣＥＡＣＡＭ１−Ｌは、ＣＤ１６については陰性であるがＣＤ５６については陽性である活性化ヒトＮＫ細胞の亜集団上に発現する。
【0007】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、所与のｍＡｂに特異的である固有の抗原結合領域（断片抗原結合、Ｆａｂ）、及び同じアイソタイプのすべてのｍＡｂに共通である定常領域（結晶化可能断片、Ｆｃ）で構成されている。Ｆｃ領域は、特定の免疫細胞型の表面に発現するＦｃ受容体（ＦｃＲ）ファミリーのメンバーと係合することにより、免疫細胞の活性を調節できる。特に、ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂは、マクロファージ及びＮＫ細胞上で発現するＦｃガンマ受容体ＩＩＩａ（ＦｃγＲＩＩＩａ、ＣＤ１６）と相互作用し得る。この相互作用により、マクロファージが刺激され、ｍＡｂオプソニン化されたがん細胞が貪食され、ＮＫ細胞が活性化されて、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）として公知であるメカニズムを介してがん細胞が脱顆粒化され、溶解し得る。ＡＤＣＣは、多くの前臨床試験においてｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果の主要な媒介物であることが示されており、がん治療に使用されるいくつかのｍＡｂの作用機序において重要な役割を果たしている（Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＡＤＣＣを媒介できる臨床的に承認されたｍＡｂの例としては、乳癌のＨＥＲ２受容体を標的とするトラスツズマブ（Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｅｔｒｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１３）；リンパ腫の汎Ｂ細胞マーカーＣＤ２０を標的とするリツキシマブ（Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００４）；大腸癌及び頭頸部癌の上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするセツキシマブ（Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｏｐｅｚ−Ａｌｂａｉｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）；ならびにメルケル細胞癌及び膀胱癌の免疫抑制リガンドＰＤ−Ｌ１を標的とするアベルマブ（Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が挙げられる。さらに、Ｆｃ領域は、Ｃ１複合体と相互作用して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化する可能性がある。ここでは、タンパク質分解カスケードにより、抗体の標的となる細胞の溶解を引き起こす原形質膜の孔が形成される。抗腫瘍ＣＤＣがｉｎ ｖｉｔｒｏで実証された場合であっても、それががんにおけるｍＡｂ治療の臨床効果に重要であるか否かについては、議論されている（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【0008】
本出願人のこれまでの米国特許第５，６８８，６５７号、同第７，３１４，６２２号、同第７，４９１，８０１号、同第７，７６３，７２０号、同第７，８２９，６７８号、同第８，４７０，３２６号、同第８，５２４，４５６号、同第８，５３５，６６７号、同第８，８０２，０９０号、同第９，０３４，５８８号、同第９，０６８，０１４号、同第９，３７１，３７５号、同第９，５９２，２９０号、同第９，７１８，８６６号、及びＲＥ３９，７６０（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、様々な抗がん抗体、がん抗原、及び関連技術が開示されている。
【発明の概要】
【0009】
本明細書の実施例に記載されている研究では、前臨床モデルにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ結合特性及びｉｎ ｖｉｖｏ活性及びＮＥＯ−２０１の局在を評価する。ＮＥＯ−２０１は、一連のヒトがん腫細胞株及び腫瘍組織に対して幅広い反応性を呈したが、健康な組織の大部分を結合することは観察されなかった。さらに、ＮＥＯ−２０１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒトがん腫細胞に対してＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方の活性を呈し、かつＮＥＯ−２０１は、ＡＤＣＣのエフェクター細胞源として単独、及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との組み合わせの両方において、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト膵臓異種移植腫瘍の成長を大幅に減衰させた。最後に、非ヒト霊長類における単回投与毒性研究では、観察された唯一の悪影響が、循環している好中球の一時的な減少であったため、ＮＥＯ−２０１の安全性及び忍容性が示された。これらの研究は、様々な固形腫瘍の治療用の新規治療剤としてのＮＥＯ−２０１の潜在的な臨床的有用性の根拠を提供する。さらに、対象の抗体の観察されたＣＤＣ活性により、ＡＤＣＣが有効であることが期待されない免疫不全患者、例えば、疾患が原因で、または放射線、化学療法、及び他の疾患の治療の影響として、免疫不全である患者を治療する機会が開かれる。
【0010】
本出願人らは、以前、Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ同種大腸癌ワクチンプラットフォームに対して生成されたｍＡｂ（エンシツキシマブ（ＮＰＣ−１Ｃ／ＮＥＯ−１０２）と呼ばれる）の前臨床抗腫瘍活性（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）ならびに臨床安全性及び有効性（Ｂｅｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，２０１７）を報告した。本報告では、ＮＥＯ−２０１と呼ばれる同じワクチンプラットフォームに由来する２番目の腫瘍抗原標的化ｍＡｂの特性について記載する。ＮＥＯ−２０１は、様々な腫瘍タイプ、組織学的サブタイプ、及び変異プロファイルに由来する細胞など、様々なヒトがん腫細胞株をｉｎ ｖｉｔｒｏで陽性染色することが示されている。ＮＥＯ−２０１陽性は、肺腺癌対扁平上皮癌に由来する腫瘍細胞株、及びＨＥＲ２陽性乳癌細胞株対トリプルネガティブ株においてより高い頻度で観察された。ヒト腫瘍試料の染色では、結腸、膵臓、胃、肺、乳房、及び子宮の腫瘍など、多様ながん組織がＮＥＯ−２０１に対して陽性染色されたことが示された。より大きい試料サイズを用いた拡大調査では、ＮＥＯ−２０１により、様々ながん腫の組織学的及び／または分子サブタイプを区別できることが明らかになり得る。興味深いことに、培養がん細胞株とは対照的に、より高い割合の腫瘍組織がＮＥＯ−２０１に反応した。この観察から、ＮＥＯ−２０１によって認識された標的がｉｎ ｖｉｔｒｏよりもｉｎ ｖｉｖｏにおいてより容易に発現することが示され得る。これは、標的発現が、局所的微小環境内からの因子との腫瘍細胞の相互作用に少なくとも部分的に依存していることを示唆している。ＮＥＯ−２０１によって認識される抗原（複数可）及びエピトープ（複数可）の特徴をさらに明らかにするため、及び正常組織ではなく腫瘍組織におけるその発現を支配する調節制御メカニズム（複数可）を決定するための実験が現在進行中である。
【0011】
この調査により、健康な正常組織及び腫瘍組織に隣接している正常組織の圧倒的多数がＮＥＯ−２０１に対して陰性であることが判明したため、染色プロファイルにおいて、ＮＥＯ−２０１が著しく腫瘍特異的であることが明らかになった。ＮＥＯ−２０１陽性は、正常な舌組織及び子宮頸部組織において観察されたが、染色強度は弱く、マイクロアレイでは、最小の試料サイズ（ｎ＝２）のみを表した。これらの観察結果を確認するために、正常組織試料におけるＮＥＯ−２０１染色のさらに拡大した分析が行われる。さらに、ＮＥＯ−２０１投与では、マウスにおいて肉眼で観察できる毒性はいずれも誘発されることはなく、非ヒト霊長類に投与した場合の忍容性は良好であった。非ヒト霊長類において好中球の枯渇が観察されたことにより、ＮＥＯ−２０１と反応する抗原（複数可）が、これらの免疫細胞上に発現することが示唆され、造血細胞型とのＮＥＯ−２０１の反応性の評価が進行中である。これらの有望な結果からは、１）ＮＥＯ−２０１は、患者の生検から良性組織とがん性組織とを区別する際に診断的有用性を有し得ること、及び２）ＮＥＯ−２０１は、好中球減少症以外の重大な毒性またはオフターゲット効果を引き起こすことなく、腫瘍を効果的に標的にし得ることが示唆される。現在、ＮＥＯ−２０１の安全性及び忍容性をさらに評価する取り組みが進行中であり、ＮＥＯ−２０１を使用したがん治療のための臨床試験が計画されている。
【0012】
自然免疫エフェクター機構は、宿主の抗腫瘍免疫を促進し、増強する上で主要な役割を果たすことが示されている。ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂのＦｃ部分は、オプソニン化された標的に対する自然免疫を活性化し、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを媒介する可能性があることは周知である（Ｓｔｒｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｈａｙｅｓ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，２０１７）。特に、ＡＤＣＣを媒介する能力は、がんの治療が承認された様々なヒトＩｇＧ１ ｍＡｂの治療効果の重要な要素と見なされている（Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｅｉｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｐｅｔｒｉｃｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｄａｌｌ’Ｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｌｏｐｅｚ−Ａｌｂａｉｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。重要なことに、ＦＣＧＲ３Ａ遺伝子（ＦｃγＲＩＩＩａをコードする）内のＶ１５８Ｆ多型は、ヒトＩｇＧ１ ｍＡｂの親和性の違いに関連しており（Ｋｏｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、高親和性Ｖ／Ｖ遺伝子型のドナー由来の免疫細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより高いトラスツズマブ媒介ＡＤＣＣ活性を呈する（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）。Ｖ／Ｖ遺伝子型は、トラスツズマブで治療された乳癌患者において客観的奏効率及び無増悪生存期間と有意に相関することも示され（Ｍｕｓｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８）、これにより、ｍＡｂベースの治療におけるＡＤＣＣの役割に関する間接的な臨床的エビデンスがもたらされる。腫瘍細胞をＮＥＯ−２０１で処理することにより、ＮＫ細胞の細胞傷害活性が２〜５倍増強され、ＡＤＣＣ活性が、低濃度の抗体（０．１μｇ／ｍＬ）でも維持されたため、ｉｎ ｖｉｔｒｏではＮＥＯ−２０１は、ＡＤＣＣを媒介できる。これらのデータは、Ｖ／Ｖ遺伝子型を有する患者がＮＥＯ−２０１治療から追加の利益を得る可能性を提起している。追加の見通しは、サイトカイン刺激によるＮＫ細胞機能の増強により、ＡＤＣＣ活性及びおそらくＮＥＯ−２０１の潜在的な臨床的利点が向上する可能性があることである。ＩＬ−２は、ＮＫ細胞の強力な活性化因子であることが周知であり（Ｈａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、ＩＬ−２１により、トラスツズマブ及びセツキシマブによって媒介されるＡＤＣＣ活性が増強されることが示された（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＡＬＴ−８０３と称される、ＩＬ−１５シグナル伝達の新規融合タンパク質スーパーアゴニストを用いた近年の前臨床研究では、ＮＫ細胞（及びＣＤ８＋Ｔ細胞）の増殖、活性化、及び溶解能力が大幅に向上し、これにより、がんの様々な動物モデルにおいて有意な抗腫瘍活性がもたらされることが実証されている（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｇｏｍｅｓ−Ｇｉａｃｏｉａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｍａｔｈｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｒｈｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｆｅｌｉｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。興味深いことに、ＡＬＴ−８０３は、Ｂ細胞リンパ腫細胞株及び原発性濾胞性リンパ腫細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞脱顆粒、ＩＦＮ−γの産生、及びリツキシマブ媒介ＡＤＣＣを実質的に増強し、ｉｎ ｖｉｖｏでの２つのＢ細胞リンパ腫モデルにおけるＡＬＴ−８０３及びリツキシマブによる併用治療により、腫瘍細胞量が大幅に減少し、生存率が向上することが見出された（Ｒｏｓａｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。
【0013】
ＭＡｂが係合し得る別の自然免疫エフェクター機構は、ＣＤＣを促す補体系の活性化であり、ＮＥＯ−２０１は、ＣＤＣを媒介して腫瘍細胞を死滅させる能力を有することが判明した。ＭＡｂの治療有効性に対してＣＤＣが寄与しているかについては、議論の余地があるが、少なくとも一部の特定の例では、がん治療に有益であることが示唆されている（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。さらに、いくつかの異なる補体調節タンパク質（ＣＲＰ）は、補体活性化を阻害するように機能し、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９などの特定の膜結合ＣＲＰが、ＣＤＣへの耐性を付与する可能性が高い様々ながんにおいて異常に発現することが報告されている（Ｓｅｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｎｉｅｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｄｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。今後の調査では、ＣＲＰをブロックする戦略が耐性腫瘍細胞のＮＥＯ−２０１媒介ＣＤＣを増強できるか否かを確認する予定である。
【0014】
Ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＥＯ−２０１の評価では、活性化されたヒト免疫エフェクター細胞と組み合わせて投与した場合に、顕著な抗腫瘍効果が明らかになった。この組み合わせにより、２つの組み合わせ群の一部のマウス（５／２０、２５％）において完全な退行さえもたらされた。さらに、ＮＥＯ−２０１は、異種移植腫瘍組織に優先的に局在するが、様々な健康な組織には局在しないことが判明した。これらのデータから、腫瘍に対するＮＥＯ−２０１の作用機序が、自然免疫細胞による腫瘍細胞のＡＤＣＣ依存性溶解であることが確認される。しかし、抗腫瘍活性は、ヒト免疫細胞を免疫不全マウスに追加することなく、ＮＥＯ−２０１のみでも観察されたことに留意する必要がある。ＡＤＣＣアッセイにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ＮＥＯ−２０１によるＣＦＰＡＣ−１腫瘍細胞の処理により、実質的な毒性が誘発されることはなかったため、この現象は、ｉｎ ｖｉｖｏで発生する条件に固有のものであり得る。免疫エフェクター細胞の不在下でのＮＥＯ−２０１活性に関する１つの仮説は、ＣＤＣの誘発であり得る。ＮＥＯ−２０１のＣＤＣ活性は、実施例３に記載されているさらなる実験で直接実証した。
【0015】
要約すると、この調査により、ＮＥＯ−２０１が、ＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方などの自然免疫エフェクター機構と係合して、腫瘍細胞を死滅させることができる、非常に腫瘍特異的な抗体であることが実証されている。さらに、ＮＥＯ−２０１では、膵癌のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植モデルでの安全性及び抗腫瘍有効性、ならびに非ヒト霊長類での忍容性が実証された。これらの知見が、様々な種類のがんを有する患者の診断剤及び治療剤としてのＮＥＯ−２０１の臨床開発の根拠となる。強力なＡＤＣＣ活性がない場合であっても、ＣＤＣから抗腫瘍効果が生じ得るため、これらの結果から、免疫不全（ＮＫ細胞レベルが低い）患者におけるＮＥＯ−２０１の使用も裏付けられる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１Ａ〜１Ｄは、ヒトがん腫細胞株へのＮＥＯ−２０１結合のフローサイトメトリーの結果を示す図である。様々なレベルのＮＥＯ−２０１抗原発現を有する代表的なヒトがん腫細胞株、（図１Ａ）膵臓ＣＦＰＡＣ−１（高）、（図１Ｂ）ＮＳＣＬＣ Ｈ４４１（中）、（図１Ｃ）乳房ＨＣＣ１９３７（低）、及び（図１Ｄ）結腸ＳＷ１１１６（陰性）である。結果は、各細胞株のＮＥＯ−２０１陽性率％及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表す。赤、ＮＥＯ−２０１染色細胞；黒、非染色細胞。ＮＥＯ−２０１陽性は、陽性率％≧１０％と定義された。
【図2】図２Ａ〜２Ｃは、ＮＥＯ−２０１によるヒト腫瘍試料のＩＨＣ染色を示す図である。図２Ａは、結腸、膵臓、胃、及び肺の試料からの隣接する正常組織及び悪性組織からの代表的なＮＥＯ−２０１染色を示す図である。いずれの画像も１００Ｘで得た。図２Ｂは、様々ながん性組織からのヒト腫瘍マイクロアレイ試料からのＮＥＯ−２０１陽性染色の定量化した図である。図２Ｃは、腫瘍組織に隣接する正常組織のヒト腫瘍マイクロアレイ試料からのＮＥＯ−２０１陽性染色を定量化した図である。ｎ＝試料の数。
【図3】図３Ａ〜３Ｃは、ＮＥＯ−２０１が、ヒト腫瘍細胞株に対してＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介することを示す図である。図３Ａは、標的細胞としてＣＦＰＡＣ−１細胞またはＡＳＰＣ−１細胞を使用したＡＤＣＣ活性を示す図である。細胞を１０μｇ／ｍＬのＮＥＯ−２０１またはヒトＩｇＧ１（陰性対照）で処理した。２名の健康なドナー由来の精製されたＮＫ細胞を、指定されたＥ：Ｔ比でエフェクター細胞として使用した。＊Ｔ検定により、統計上有意である（ｐ＜０．０５）。図３Ｂは、用量を増加したＮＥＯ−２０１で処理されたＣＦＰＡＣ−１細胞を使用したＡＤＣＣアッセイを示す図である。健康なドナーから単離されたＮＫ細胞をＥ：Ｔ比１２．５：１のエフェクター細胞として使用した。グラフは、１０μｇ／ｍＬヒトＩｇＧ１で処理された対照細胞に対するＮＥＯ−２０１処理された腫瘍細胞の特異的溶解率％の倍率変化を示している。＊Ｔ検定により、統計上有意である（ｐ＜０．０５）。図３Ｃは、指定された期間、指定された用量のＮＥＯ−２０１で処理されたＡＳＰＣ−１細胞を使用したＣＤＣアッセイを示す図である。＊Ｔ検定により、統計上有意である（ｐ＜０．０５）。
【図4】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＦＰＡＣ−１腫瘍異種移植片におけるＮＥＯ−２０１の抗腫瘍効果を示す図である。図４Ａは、様々な時点での各処理群のＣＦＰＡＣ−１異種移植片の腫瘍容積測定結果を示す図である。マウス（ｎ＝１０動物／群）に、腫瘍細胞移植後１３日目、１７日目、及び２０日目に生理食塩水、ヒトＩｇＧ１（２５０μｇ）、またはＮＥＯ−２０１（１００μｇ及び２５０μｇ）を腹腔内投与した。マウスに、免疫エフェクター細胞源として、１４日目、１８日目、及び２１日目に、約１．０ｘ１０７個のＩＬ−２活性化ヒトＰＢＭＣも腹腔内投与した。図４Ｂは、３６日目に依然として触知可能な腫瘍を担持しているマウスの数を定量化した図である。図４Ｃは、ＮＥＯ−２０１処理対生理食塩水処理腫瘍担持マウスの代表的な画像を示す図である。図４Ｄは、研究中の様々な時点での腫瘍担持マウスの体重測定結果を示す図である。
【図5】図５Ａ〜５Ｂは、ＣＦＰＡＣ−１異種移植片担持マウスにおけるＮＥＯ−２０１生体内分布を示す図である。放射能標識されたＮＥＯ−２０１を静脈内投与したＣＦＰＡＣ−１腫瘍を担持している雌（図５Ａ）及び雄（図５Ｂ）マウスの指定された組織からの正規化放射能の測定結果を示す図である。ｎ＝４動物／時点。１日目、２日目、４日目、及び７日目は、放射性標識抗体の注入から剖検までの時間量を表す。
【図6】図６Ａ〜図６Ｃは、ＣＮＥＯ−２０１で処理したカニクイザルの体重及び好中球数を示す図である。図６Ａは、指示された用量レベルでＮＥＯ−２０１の単回用量を受けた７日後及び１４日後に、サルについて測定された、ベースライン（−１日目）に対する体重の変化率（％）を示す図である。ｎ＝４匹の動物／群（雌２匹、雄２匹）。図６Ｂは、指定された用量レベルでのＮＥＯ−２０１の単回用量で処理されたサルの血液からのベースライン（−７日目）に対する好中球レベルの変化率を示す図である。ｎ＝４匹の動物／群（雌２匹、雄２匹）。図６Ｃは、好中球レベル対各用量及び時点での０ｍｇ／ｋｇ対照のｐ値を示す図である。＊Ｔ検定により、統計上有意である（ｐ＜０．０５）。
【図7】図７Ａ〜７Ｃは、ＮＥＯ−２０１を使用したｈａＮＫ ＡＤＣＣアッセイ（４時間）を示す図である。標的細胞＝３０００細胞／ウェル。図６Ａ〜６Ｂは、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比に対応させた４時間でのＮＥＯ−２０１（上線、四角記号）またはＩｇＧ１陰性対照（下線、丸記号）で処理したＨ５２０肺癌（図６Ａ）またはＯＶ９０卵巣癌（図６Ｂ）細胞の特異的溶解率を示す図である。Ｅ：Ｔ比は、６．２５：１、１２．５：１、または２５：１であった。ｍＡｂ濃度は１０μｇ／ｍＬであった。示されている値は３回の繰り返しの平均＋／−ＳＤである。アスタリスク（＊）は、ＩｇＧ陰性対照に対する統計的有意性を示す（ｐ＜０．０１、両側ｔ検定）。図６Ｃは、４時間、Ｅ：Ｔ比２５：１での肺（Ｈ５２０、ＨＣＣ８２７）、乳房（ＺＲ−７５−１）、及び卵巣（ＯＶ９０）のがん細胞をＮＥＯ−２０１（右、薄い灰色の棒線）または陰性対照ＩｇＧ（左、黒の棒線）で処理した細胞の特異的溶解率を示す図である。ｍＡｂ濃度は１０μｇ／ｍＬであった。示されている値は３回の繰り返しの平均＋／−ＳＤである。アスタリスク（＊）は、ＩｇＧ陰性対照に対する統計的有意性を示す（ｐ＜０．０１、両側ｔ検定）。
【図8】ＡＬＴ−８０３による処理により、ＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が増強されることを示す図である。２名の正常なドナーから単離されたＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３（２５ｎｇ／ｍｌ）または培地対照で４８時間処理し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇサイトメーターを使用して４時間の非放射性ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＣＦ−ＰＡＣ１（ヒト膵癌細胞株）細胞をカルセインＡＭで染色し、３，０００細胞／ウェルで標的として使用した。結果は、特異的溶解率％（ＳＥ）で表す。
【図9】ＡＬＴ−８０３による処理により、ヒトＮＫ細胞でのＴＩＭ−３及びＮＫＧ２Ｄの発現が増強されたことを示す図である。正常なドナー由来の精製されたヒトＮＫ細胞を、ＡＬＴ−８０３（２５ｎｇ／ｍｌ）を含むか、または含まずに４８時間培養した。結果は、陽性細胞率％（ＭＦＩ）で表す。
【図10】ＡＬＴ−８０３による処理により、ヒトＮＫ細胞でのＴＩＭ−３及びＮＫＧ２Ｄの発現が増強されたことを示す図である。別の正常なドナー由来の精製されたヒトＮＫ細胞を、ＡＬＴ−８０３（２５ｎｇ／ｍｌ）を含むか、または含まずに４８時間培養した。結果は、陽性細胞率％（ＭＦＩ）で表す。
【図11】ＡＬＴ−８０３による処理により、低濃度ＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が増強されたことを示す図である。正常なドナーから単離されたＮＫ細胞（ＮＤ＃６）をＡＬＴ−８０３（２５ｎｇ／ｍｌ）または培地対照で４８時間処理し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇサイトメーターを使用して４時間の非放射性ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。ＮＥＯ−２０１は、３つの異なる濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ）で使用した。ＣＦ−ＰＡＣ１（ヒト膵癌細胞株）細胞をカルセインＡＭで染色し、３，０００細胞／ウェルで標的として使用した。Ｅ：Ｔ＝２５：１。結果は特異的溶解（ＳＥ）％で表す。＊統計的に有意である（ｐ＜０．０１）。
【図12】ＡＬＴ−８０３による処理により、正常のドナー（ＮＤ＃８）のＡＤＣＣ活性を増強し、ＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が最小となることを示す図である。この活性は、抗ＣＤ１６及び抗ＴＩＭ−３抗体によってブロックされ得る。ＡＤＣＣ活性が最小の正常なドナーから単離されたＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３（２５ｎｇ／ｍｌ）または培地対照で４８時間処理し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇサイトメーターを使用して４時間の非放射性ＡＤＣＣアッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。抗ＣＤ１６及び抗ＴＩＭ−３は、３０μｇ／ｍｌ及び１５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。ＮＥＯ−２０１及びエフェクター細胞を添加する前に、ＮＫ細胞を抗ＣＤ１６または抗ＴＩＭ−３で２時間前処理した。ＣＦ−ＰＡＣ１（ヒト膵癌細胞株）細胞をカルセインＡＭで染色し、３，０００細胞／ウェルで標的として使用した。ＮＥＯ−２０１は、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｅ：Ｔ＝２５：１。結果は、特異的溶解率％（ＳＥ）で表す。＊ＡＬＴ−８０３処理のない場合と比較して統計的に有意である（ｐ＜０．０１）。＃抗ＣＤ１６及び抗ＴＩＭ−３処理のない場合と比較して統計的に有意である（ｐ＜０．０１）。
【図13】ＮＥＯ−２０１を使用したＮＫ−９２死滅アッセイ（１６時間）を示す図である。標的腫瘍細胞（ＡＳＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＣＦＰＡＣ−１、またはＬＳ１７４Ｔ）を３０００細胞／ウェルで播種した。その後、腫瘍細胞を１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体またはＮＥＯ−２０１で処理し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫ−９２をエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１．５６２５：１、３．１２５：１、６．２５：１、及び１２．５：１で添加した。３７℃で１６時間のインキュベーション後、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７ソフトウェアを使用して、細胞生存率を定量化した。生きた標的細胞（カルセインＡＭ＋／ＰＩ−）を各ウェルで数え、特異的溶解を計算した。結果をグラフで示し、各腫瘍細胞型について以下に表に示す。＊統計的に有意である（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
一態様では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫細胞を死滅させる方法を提供する。
【0018】
一態様では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を治療する方法を提供する。
【0019】
一態様では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫の再発を予防する方法を提供する。
【0020】
一態様では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を有する患者の腫瘍量を減少させる方法を提供する。
【0021】
この抗体は、補体媒介性細胞毒性（ＣＤＣ）を媒介し、それにより患者のがん腫細胞を死滅させることができる。
【0022】
患者は、投与前または投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している場合がある。患者は、投与前または投与時に重度のＮＫ枯渇であり得る。患者は、ＣＮＫＤ（例えば、ＣＮＫＤ１、ＣＮＫＤ２）、またはＦＮＫＤ（例えば、ＦＮＫＤ１）などのＮＫ細胞欠損症（ＮＫＤ）を有し得る。患者は、別の治療法、例えば、化学療法または放射線療法などのがん療法の結果として、ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇であり得る。患者は、１つ以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリド−ヒドロキサム酸（ＳＡＨ）、酪酸ナトリウム）、遺伝毒性剤（例えば、ドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、アフィジコリン、マイトマイシン、メトトレキサート、エトポシド）、ＧＳＫ阻害剤（例えば、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ、ＳＢ２１）、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＪＱ１）、ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ラディシコラ（ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ））、１７−ＡＡＧ）、微小管集合阻害剤（例えば、ビンクリスチン、サイトカラシンＤ、ノコダゾール、ドセタキセル）、及び／または免疫調節薬（例えば、レナリドマイド）で治療されてもよい。
【0023】
この方法は、投与前または投与時に、患者がＮＫ枯渇しているかを決定することを含み得る。
【0024】
この方法は、投与前または投与時に、患者が重度のＮＫ枯渇であるかを決定することを含み得る。
【0025】
この方法では、投与前または投与時に、ＮＫ細胞は、個体における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の５％未満を構成し得る。
【0026】
この方法では、投与前または投与時に、ＮＫ細胞は、個体における末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の３％未満を構成し得る。
【0027】
この方法では、投与前または投与時に、患者の７０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞であり得る。
【0028】
この方法では、投与前または投与時に、患者の５０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞であり得る。
【0029】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれるＣＤＲ配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つすべてを含み得る。
【0030】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列を含み得る。
【0031】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得る。
【0032】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得る。
【0033】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０〜４７０に対して少なくとも９０％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０〜２３３に対して少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖配列を含み得る。
【0034】
ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれる６つすべてのＣＤＲ配列を含み得る。
【0035】
ＮＥＯ−２０１抗体は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含み得る。
【0036】
ＮＥＯ−２０１ 抗体は、ヒト化され得る。
【0037】
ＮＥＯ−２０１抗体は、別の部分にコンジュゲートされてもよい。
【0038】
ＮＥＯ−２０１抗体は、別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、または親和性タグにコンジュゲートされてもよい。
【0039】
この方法は、がん腫の細胞の死滅を増強するか、または刺激するために有効量のサイトカインアゴニストを患者に投与することをさらに含み得る。サイトカインアゴニストは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５阻害剤、チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗−４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗Ｔｉｍ−３、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0040】
この方法は、がん腫の細胞の死滅を増強するかまたは刺激するために有効量の補体調節タンパク質（ＣＲＰ）アンタゴニストを患者に投与することをさらに含み得る。ＣＲＰアンタゴニストは、ＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９のうちの１つ以上に拮抗し得る。ＣＲＰアンタゴニストは、抗体またはその抗原結合断片を含み得る。
【0041】
サイトカインアゴニストは、ＩＬ−１５アゴニストまたはＩＬ−１５スーパーアゴニストを含み得る。
【0042】
サイトカインアゴニストは、ＡＬＴ−８０３などのＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質に結合したＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）からなる複合体を含み得る。
【0043】
ＮＥＯ−２０１抗体の有効投与量は、サイトカインアゴニストを含まないＮＥＯ−２０１抗体単独での治療と比較して低減され得る。
【0044】
がん腫は、結腸癌であり得る。がん腫は、膵癌であり得る。がん腫は、卵巣癌であり得る。がん腫は、胃癌であり得る。がん腫は、肺癌であり得る。がん腫は、乳癌であり得る。がん腫は、子宮癌であり得る。
【0045】
別の実施形態では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫細胞を死滅させる方法を提供し、本方法では、患者は、投与前または投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している。ＮＫ枯渇は、患者由来の試料、例えば血液試料中において、５％未満または３％未満のＮＫ細胞である末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を有する患者であり得る。代替的にまたは追加的に、この方法では、投与前または投与時に、患者の７０％未満（任意により５０％未満）のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞であり得る。
【0046】
別の実施形態では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を治療する方法を提供し、本方法では、患者は、投与前または投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している。
【0047】
別の実施形態では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫の再発を予防する方法を提供し、本方法では、患者は、投与前または投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している。
【0048】
別の実施形態では、本開示は、有効量のＮＥＯ−２０１抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む、がん腫を有する患者の腫瘍量を減少させる方法を提供し、本方法では、患者は、投与前または投与時にナチュラルキラー（「ＮＫ」）が枯渇している。
【0049】
前述の方法では、抗体はＣＤＣを媒介し、それにより、例えば、患者がＮＫ枯渇しているために有効なＡＤＣＣが存在しないにもかかわらず、それによって患者においてがん腫細胞を死滅させることができる。患者は、投与時に重度のＮＫ枯渇であり得る。任意により、方法は、例えば、投与時または投与前の期間内、例えば、１週間または２週間前など、患者がＮＫ枯渇であるか、または重度のＮＫ枯渇であるかを決定することをさらに含む。ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇状態は、ＮＫ細胞を枯渇させる別の治療法の事前使用または同時使用など、患者の病歴から推測されてもよい。例えば、患者は、放射線療法または化学療法などのがん療法を受けているか、または同時に受けている。がん療法は、１つ以上のプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２）、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、スベロイルアニリド−ヒドロキサム酸（ＳＡＨ）、酪酸ナトリウム）、遺伝毒性剤（例えば、ドキソルビシン、メルファラン、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、アフィジコリン、マイトマイシン、メトトレキサート、エトポシド）、ＧＳＫ阻害剤（例えば、ＬｉＣｌ、ＢＩＯ、ＳＢ２１）、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＪＱ１）、ＨＳＰ９０阻害剤（例えば、ラディシコラ（ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ））、１７−ＡＡＧ）、微小管集合阻害剤（例えば、ビンクリスチン、サイトカラシンＤ、ノコダゾール、ドセタキセル）、及び／または免疫調節薬（例えば、レナリドマイド）を投与することを含み得る。
【0050】
患者は、ＣＮＫＤ（例えば、ＣＮＫＤ１、ＣＮＫＤ２）、またはＦＮＫＤ（例えば、ＦＮＫＤ１）などのＮＫ細胞欠損症（ＮＫＤ）を有し得る。
【0051】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれるＣＤＲ配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つすべてを含み得る。
【0052】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列を含み得る。上記パーセント配列同一性を有する可変重鎖は、配列番号３８に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得る。
【0053】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得る。可変軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得る。
【0054】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変重鎖配列、及び配列番号３９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得る。可変軽鎖は、配列番号３９に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得、パーセント配列同一性を有する可変重鎖は、配列番号３８に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得る。
【0055】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０〜４７０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する重鎖配列、及び配列番号２９のアミノ酸２０〜２３３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖配列を含み得る。軽鎖は、配列番号２９に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得、パーセント配列同一性を有する可変重鎖は、配列番号２８に含まれる３つすべてのＣＤＲ配列を含み得る。
【0056】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８に含まれる重鎖可変領域配列及び配列番号２９に含まれる軽鎖可変領域配列を含み得る。
【0057】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、配列番号２８のアミノ酸２０〜４７０を含む重鎖配列及び配列番号２９のアミノ酸２０〜２３３を含む軽鎖配列を含み得る。
【0058】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、ヒトＩｇＧ１定常ドメインを含む。
【0059】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、ヒト化され得る。
【0060】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体は、別の細胞毒性部分、標識、放射性部分、または親和性タグなどの別の部分にコンジュゲートさせ得る。
【0061】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、この方法は、がん腫の細胞の死滅を増強するか、または刺激するために有効量のサイトカインアゴニストを患者に投与することをさらに含み得る。サイトカインアゴニストは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５阻害剤、チェックポイント阻害剤、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗−４１ＢＢ、抗ＯＸ４０、抗Ｔｉｍ−３、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0062】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、この方法は、がん腫の細胞の死滅を増強するかまたは刺激するために有効量の補体調節タンパク質（ＣＲＰ）アンタゴニストを患者に投与することをさらに含み得る。ＣＲＰアンタゴニストは、ＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９のうちの１つ以上に拮抗し得る。ＣＲＰアンタゴニストは、抗体またはその抗原結合断片を含み得る。サイトカインアゴニストは、ＩＬ−１５アゴニストまたはＩＬ−１５スーパーアゴニストを含み得る。サイトカインアゴニストは、ＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質に結合したＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）からなる複合体を含み得る。サイトカインアゴニストは、ＡＬＴ−８０３を含み得る。
【0063】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、ＮＥＯ−２０１抗体の有効投与量は、サイトカインアゴニストを含まないＮＥＯ−２０１抗体単独での治療と比較して低減される。
【0064】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんはＮＥＯ−２０１抗原を発現し得る。ＮＥＯ−２０１抗原の発現は、がんの試料中においてＮＥＯ−２０１抗原を検出することにより決定され得る。検出は、組織学的染色、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、ドットブロット、ウエスタンブロット、ノーザンブロット及び周知の技術を含む技術により行われ得る。再発がんまたは転移性がんの場合、ＮＥＯ−２０１抗原の発現は、原発がん中のＮＥＯ−２０１の発現またはＮＥＯ−２０１抗体治療法に対する原発がんの反応から予測してもよい。
【0065】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、結腸癌であり得る。
【0066】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、膵癌であり得る。
【0067】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、卵巣癌であり得る。
【0068】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、胃癌であり得る。
【0069】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、肺癌であり得る。
【0070】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、乳癌であり得る。
【0071】
前述のまたは以下の実施形態のいずれかと共に使用され得る本発明の好ましい実施形態では、がんは、子宮癌であり得る。
【0072】
定義
【0073】
別途定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法及び材料は、本発明または本発明の試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が本明細書に記載される。材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
【0074】
本明細書の説明において、及び下記特許請求の範囲にわたって用いられる場合、文脈が別途明確に指示しない限り、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味は、複数の指示対象を含む。
【0075】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を広く指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリンなど、後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合している炭素、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたＲ基を有するか（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
【0076】
本明細書で使用される用語「ＮＫ枯渇」または「ナチュラルキラー枯渇」は、正常範囲と比較して低いナチュラルキラー（ＮＫ）細胞レベルを有する患者を指す。ＮＫ細胞は、細胞傷害性自然免疫リンパ球である。典型的には、ＮＫ細胞は、健康な個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の５〜２０％を構成する。ＰＭＢＣの５％未満を構成するＮＫ細胞を有する患者は、ＮＫ枯渇と呼ばれる。さらに、ＮＫ細胞がＰＭＢＣの３％未満を構成する場合、患者は、重度のＮＫ細胞の枯渇と称される。さらに、正常な個体では、最大９０％のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞であり、これらは最も細胞毒性のあるサブセットと考えられている。７０％未満のＰＢＭＣ ＮＫ細胞がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である場合、その患者はＮＫ枯渇と称される。さらに、ＰＢＭＣ ＮＫ細胞の５０％未満がＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞である場合、その患者は重度のＮＫ枯渇と称される。所定の患者は、これらの個々の基準の一方または両方を満たすことに基づいて、ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇と称される場合がある。一般的に言えば、ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇としての患者の状態は、患者から採取された試料、例えば、血液試料、例えば、１週間または２週間前以内に得られ、検査された試料を検査することによって決定される。ＮＫ枯渇または重度のＮＫ枯渇としての患者の状態は、ＮＫ細胞のこうした枯渇に関連する疾患の診断及び／または一連の治療からも推測され得る。
【0077】
ＮＫ枯渇には、ＮＫ細胞欠損症（ＮＫＤ）を有する対象も含まれる。例示的なＮＫＤ状態としては、ＮＫ細胞の欠如及び末梢血リンパ球間のそれらの機能を特徴とする古典的なＮＫＤ（ＣＮＫＤ）、末梢血リンパ球内にＮＫ細胞が存在し、ＮＫ細胞活性に欠陥を有することを特徴とする機能的ＮＫＤ（ＦＮＫＤ）が挙げられる。ＣＮＫＤ及びＦＮＫＤの両方において、ＮＫ細胞の異常は主要な免疫学的欠損であり、これにより、ＡＤＣＣ応答が不十分になる。ＣＮＫＤ及びＦＮＫＤは、原因遺伝子（複数可）の同一性または他の患者の特徴などの患者の特徴に基づいてさらに細かく分類できる。ＣＮＫＤとしては、常染色体優性であり、ＧＡＴＡ２遺伝子での欠陥に関連するＣＮＫＤサブタイプ１（ＣＮＫＤ１）と、常染色体劣性であり、ＭＣＭ４遺伝子での欠陥に関連するＣＮＫＤサブタイプ２（ＣＮＫＤ２）が挙げられる。ＦＮＫＤとしては、常染色体劣性であり、ＦＣＣＲ３Ａ遺伝子での欠陥に関連するＦＮＫＤ１が挙げられる。
【0078】
「抗体」は、本明細書で用いられる場合、エピトープに適合し、それを認識する特定形状を有する任意のポリペプチド鎖含有分子構造を広く指し、１つ以上の非共有結合相互作用により、分子構造とエピトープとの間の複合体が安定化する。原型的な抗体分子は、免疫グロブリンであり、全ての源、例えば、ヒト、齧歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ニワトリからのあらゆる種類の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤが「抗体」であると考えられる。抗体としては、これらに限定されないが、キメラ抗体、ヒト抗体及び他の非ヒト哺乳動物抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダボディ、ナノボディ、ＩｇＮＡＲ（サメに由来する一本鎖抗体）、小モジュラー免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２）が挙げられる。多数の抗体コード配列が記載されている。また他のものは、当技術分野で周知の方法によって出現させ得る。Ｓｔｒｅｌｔｓｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４（１１）：２９０１−９；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７４（６５１８）：１６８−１７３；Ｎｕｔｔａｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（４）：３１３−２６；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）：４４６−８；Ｇｉｌｌ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：６５３−８を参照されたい。
【0079】
「ＮＥＯ−２０１抗体」は、配列番号２８及び２９の重鎖及び軽鎖、または任意によりその中に含まれる定常領域と共に可変領域、ならびにそれらの断片及び変異体を含む抗体を指す。そのような変異体としては、配列番号２８及び配列番号２９に含まれるＣＤＲ配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは好ましくは６つすべてを含む配列、すなわち配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３が挙げられる。この抗体は、ヒト化され得る。この抗体は、抗体の発現及び／またはプロセシング及び分泌中に除去され得る１つ以上のリーダー配列を含有して発現され得る。この抗体は、これらに限定されないが、ＮＥＯ−２０１抗体配列及び異なる抗体の結合断片を含む二特異性抗体または多特異性抗体など、一価、二価、またはより多価の形態で提示されてもよい。典型的には、この抗体は、がん腫細胞に特異的に結合し、配列番号３８の可変重鎖及び配列番号３９の可変軽鎖を含むか、または配列番号２８の重鎖及び配列番号２９の軽鎖を含む抗体とがん腫細胞への結合について競合する。配列番号２８及び／または配列番号２９に含まれるそれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は、配列番号１または４の軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２または５の軽鎖ＣＤＲ２；配列番号３または６の軽鎖ＣＤＲ３；配列番号７の重鎖ＣＤＲ１；配列番号８、１０、３０、または３１の重鎖ＣＤＲ２；配列番号９もしくは１１または配列番号３０〜３１の重鎖ＣＤＲ３；などのバリアント配列と置換されてもよい。軽鎖は、配列番号１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２９の軽鎖配列に含まれるＣＤＲを含み得る。重鎖は、配列番号１５、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２９の重鎖配列に含まれるＣＤＲを含み得る。抗体は、配列番号３８に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する可変重鎖配列、及び／または配列番号３９に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する可変軽鎖配列を含み得、任意により、重鎖及び／または軽鎖配列は、配列番号２８及び配列番号２９に含まれるＣＤＲ配列の１、２、３、４、５、または好ましくは６つすべて、すなわち、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。抗体は、細胞毒性部分、放射性部分、標識、または精製タグなどの別の部分にコンジュゲートされてもよい。
【0080】
本明細書で使用される「抗原」は、動物がその抗原のエピトープに結合できる抗体を産生するようにさらに誘導できる抗体によって結合され得る分子または分子の一部分を広く指す。抗原は、１つのエピトープを有していても、１つ以上のエピトープを有していてもよい。本明細書で言及される特定の反応は、抗原が、非常に選択的な様式で、対応する抗体と反応し、他の抗原によって誘起され得る他の多数の抗体とは反応しないことを示す。抗原は、腫瘍特異的であり得る（例えば、膵臓及び結腸癌の腫瘍性細胞によって発現される）。
【0081】
本明細書で使用される「がん」は、悪性の成長または腫瘍を引き起こす、制御されていない異常な細胞分裂を特徴とする任意の新生物疾患（侵襲性または転移性）を広く指す。
【0082】
本明細書で使用される「キメラ抗体」は、抗原結合部位（可変領域）が、異なるまたは変更されたクラス、エフェクター機能及び／もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物に連結されるように、定常領域もしくはその一部分が変更されるか、置換されるか、もしくは交換されるか；または、可変領域もしくはその一部が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域により変更され、置換され、または交換される抗体分子を広く指す。
【0083】
本明細書で使用される「保存的に改変されたバリアント」は、アミノ酸配列及び核酸配列の両方に適用され、特定の核酸配列に関しては、保存的に改変されたバリアントを広く指し、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、機能的に同一である多数の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。そのような核酸多様性は「サイレント変動」であり、保存的に改変された変動の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のいずれの核酸配列にも、核酸のあらゆる可能なサイレント変動について記載されている。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が機能的に同一の分子を生成するように改変され得ることを認識している。
【0084】
本明細書で使用する「相補性決定領域」、「超可変領域」、または「ＣＤＲ」は、抗体の軽鎖または重鎖の可変領域に見られる１つ以上の超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を広く指す。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．を参照されたい。これらの発現としては、Ｋａｂａｔらによって定義された（（１９８３）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）超可変領域、または抗体の三次元構造における超可変ループが挙げられる。Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７。各鎖内のＣＤＲは、フレームワーク領域によって密接に近接して保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲ内には、選択性決定領域（ＳＤＲ）として記載されている選択されたアミノ酸があり、抗体と抗原との相互作用においてＣＤＲが使用する重要な接触残基を表している。Ｋａｓｈｍｉｒｉ（２００５）Ｍｅｔｈｏｄｓ３６：２５−３４。
【0085】
本明細書で使用される「対照量」は、広くマーカーを指し、マーカーの試験量と比較される任意の量または量の範囲であり得る。例えば、マーカーの対照量は、特定の疾患または状態を有する患者またはそのような疾患または状態を有さないヒトにおけるマーカーの量であり得る。対照量は、絶対量（例えば、マイクログラム／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。
【0086】
本明細書で使用される「差次的に存在する」は、疾患または状態を有する患者から採取した試料に存在するマーカーの量または質における、疾患または状態のうちの１つを有さない患者から採取した同等の試料と比較した差異を広く指す。例えばハイブリダイゼーション／またはＮＡＴベースのアッセイによって測定された場合、例えば、一方の試料中の核酸断片の量が、他方の試料中の核酸断片の量と著しく異なる場合、核酸断片は任意により２つの試料間で異なるように存在してもよい。一方の試料中のポリペプチドの量が他方の試料中のポリペプチドの量と大幅に異なる場合、ポリペプチドは２つの試料間で異なるように存在する。マーカーが一方の試料中で検出可能であり、他方の試料では検出可能でない場合、こうしたマーカーは異なるように存在すると見なされ得ることに留意すべきである。任意により、比較的少量の上方調節がマーカーとして役立ち得る。
【0087】
「診断的」は、本明細書で用いられる場合、病態の存在または性質を特定することを広く指す。診断的方法は、それらの感受性及び特異性において異なる。診断的アッセイの「感受性」は、検査で陽性を示す、罹患した個体のパーセンテージである（「真の陽性」のパーセント）。アッセイによって検出されない罹患した個体は、「偽陰性」である。罹患していない、かつアッセイにおいて検査で陰性を示す対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断的アッセイの「特異性」は、１−偽陽性率であり、「偽陽性」率は、検査で陽性を示す疾患のない者の割合として定義される。特定の診断的方法は、状態の確定診断を提供しないことがあるが、この方法により、診断を補助する陽性表示がもたらされる場合は、この方法で十分である。
【0088】
「診断する」は、本明細書で用いられる場合、疾患または症状を分類することと、疾患の重症度を決定することと、疾患の進行を監視することと、疾患の転帰及び／または回復の見通しを予測することと、を広く指す。「検出する」という用語も、前述のいずれかを任意に包含し得る。本発明による疾患の診断は、いくつかの実施形態において、対象から得られた生物試料中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを決定することによって影響されることがあり、決定されるレベルは、疾患に対する素因、または疾患の存在もしくは非存在と相関し得る。「対象から得られた生物試料」は、対象から物理的に除去されていない試料も任意により含み得ることに留意すべきである。
【0089】
本明細書で使用するとき、「有効量」は、疾患を治療するために患者に投与される場合、疾患のこうした治療をもたらすのに十分な化合物、抗体、抗原、または細胞の量を広く指す。有効量は、予防に有効な量、及び／または防止に有効な量であり得る。有効量は、兆候／症状の発生を低減するために有効な量、防止するために有効な量、兆候／症状の発生の重症度を低減するため、兆候／症状の発生を排除するため、兆候／症状の発生の発達を遅延させるため、兆候／症状の発生の発達を防止するため、及び／または兆候／症状の発生の予防をもたらすために有効な量であり得る。「有効量」は、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、感受性、及び既存状態に応じて異なり得る。「有効量」という用語は、本発明の目的で「治療上有効な量」と同義である。
【0090】
本明細書で使用される「発現ベクター」は、原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫または哺乳動物の細胞などあらゆる細胞において、構成的または誘導的にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで本発明の核酸配列を発現する目的のあらゆる組換え発現系を広く指す。この用語には、線形または環式発現系を含む。この用語には、エピソームのままであるか、宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現系を含む。発現系は、自己複製する、または自己複製しない、すなわち、細胞における一過性発現のみを駆動する能力を有し得る。この用語としては、組換え核酸の転写に必要な最小限のエレメントのみを含む組換え発現カセットが挙げられる。
【0091】
本明細書で使用される「フレームワーク領域」または「ＦＲ」は、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のフレームワーク領域の１つ以上を広く指す。Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。これらの発現には、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域内のＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列領域を含む。
【0092】
本明細書で使用するとき「異種」とは、核酸の一部分を広く指す場合、その核酸が、自然界では互いに同じ関係で見られることのない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え生産され、新しい機能的核酸、例えばある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域を作製するように配置された無関係な遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然界では互いに同じ関係で見られない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【0093】
本明細書で使用される「高親和性」は、標的抗原に対して少なくとも１０−８Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−９Ｍ、さらにより好ましくは少なくとも１０−１０ＭのＫＤを有する抗体を広く指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて異なる場合がある。例えば、ＩｇＭアイソタイプの「高親和性」結合とは、少なくとも１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８ＭのＫＤを有する抗体を指す。
【0094】
本明細書で使用される「相同性」は、核酸配列と参照核酸配列との間、またはポリペプチド配列と参照ポリペプチド配列との間の類似性の程度を広く指す。相同性は、一部または全体であり得る。完全な相同性は、核酸またはアミノ酸配列が同一であることを示す。部分的に相同な核酸またはアミノ酸配列は、参照核酸またはアミノ酸配列と同一ではないものである。相同性の程度は、配列比較により決定できる。用語「配列同一性」は、「相同性」と同義的に使用され得る。
【0095】
本明細書で使用される「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、発現ベクターの複製または発現を支持する細胞を広く指す。宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞、または酵母、昆虫（例えば、ＳＦ９）、両生類などの真核細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ−２９３などの哺乳動物細胞、例えば、培養細胞、外植片、及びｉｎ ｖｉｖｏでの細胞であってよい。
【0096】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」は、鎖が互いに逆平行に配置されたときの相補的ヌクレオチド間に水素結合が形成されることによる相補的（部分的相補など）ポリヌクレオチド鎖の物理的相互作用を広く指す。
【0097】
本明細書で使用される「Ｋ−ａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を広く指すが、本明細書で使用される用語「Ｋｄｉｓｓ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。本明細書で使用される用語「ＫＤ」は、Ｋｄ対Ｋａの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指すことが意図されている。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定できる。
【0098】
「イムノアッセイ」は、本明細書で用いられる場合、抗体を使用して特異的に抗原に結合させるアッセイを広く指す。イムノアッセイは、抗原を単離、標的化、及び／または定量する特定の抗体の特異的結合特性を使用することを特徴とし得る。
【0099】
「単離された」は、本明細書で用いられる場合、それが天然に存在するその元の環境から除去され、したがってその天然環境からヒトの手によって改変された物質を広く指す。単離された物質は、例えば、ベクター系に含まれる外因性核酸、宿主細胞内に含有される外因性核酸、またはその元の環境から除去され、したがってヒトの手によって改変された任意の物質（例えば、「単離された抗体」）であり得る。
【0100】
「標識」または「検出可能な部分」は、本明細書で用いられる場合、顕微鏡的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物を広く指す。
【0101】
本明細書で使用される「低ストリンジェンシー」、「中ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」、または「非常に高いストリンジェンシーの条件」は、核酸ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を広く指す。ハイブリダイゼーション反応を行うためのガイダンスは、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第５版）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載されている。例示的な特定のハイブリダイゼーション条件には、これらに限定されないが、以下が挙げられる：（１）約４５℃、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）での低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、少なくとも５０℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄（低ストリンジェンシー条件の場合、洗浄温度を５５℃まで上げることができる）する；（２）約４５℃、６ＸＳＳＣで中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の後、６０℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄する；（３）約４５℃、６ＸＳＳＣでの高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の後、６５℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄する；及び（４）６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでの非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の後、６５℃、０．２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上洗浄する。
【0102】
「哺乳動物」は、本明細書で用いられる場合、皮膚の体毛被覆、及び雌において、子を育てるための乳汁産生乳腺を特徴とする、ヒトなどの哺乳動物クラスの任意かつ全ての温血脊椎動物を広く指す。哺乳動物の例としては、これらに限定されないが、アルパカ、アルマジロ、カピバラ、ネコ、ラクダ、チンパンジー、チンチラ、ウシ、イヌ、ヤギ、ゴリラ、ハムスター、ウマ、ヒト、キツネザル、ラマ、マウス、非ヒト霊長類、ブタ、ラット、ヒツジ、トガリネズミ、リス、及びバクが挙げられる。哺乳動物としては、これらに限定されないが、ウシ科、イヌ科、ウマ科、ネコ科、ネズミ科、ヒツジ科、ブタ科、霊長類、及び齧歯類が挙げられる。哺乳動物には、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｕｓｅｕｍ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ， Ｓｍｉｔｈｓｏｎｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ）によって維持される世界の哺乳類に列挙される任意かつ全てのものも含まれる。
【0103】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドオリゴヌクレオチドを広く指す。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを包含する。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造体を包含する。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明示的に示される配列も暗黙的に包含する。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと同義的に使用される。
【0104】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように２つのＤＮＡ断片が結合されているときを広く指す。
【0105】
本明細書で使用される「パラトープ」は、抗原を認識する抗体の部分（例えば、抗体の抗原結合部位）を広く指す。パラトープは、抗体のＦｖ領域の小さい領域（例えば、１５〜２２のアミノ酸）であり、抗体の重鎖及び軽鎖の一部分を含む場合がある。Ｇｏｌｄｓｂｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎｓ（Ｃｈａｐｔｅｒ ３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ Ｅｄ．）Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ５７−７５ページを参照されたい。
【0106】
「患者」は、本明細書で用いられる場合、疾患状態を軽減するか、または疾患状態の発生もしくは再発を防止するかのいずれかのために治療を必要とする任意の動物を広く指す。また「患者」は、本明細書で用いられる場合、危険因子、病歴、感受性、症状、兆候を有し、疾患が以前に診断されたか、疾患の危険性があるか、または疾患の患者集団の一員である、任意の動物を広く指す。患者は、ヒト等の臨床患者、または随伴動物、家畜動物、畜産動物、エキゾチック動物、または動物園動物であり得る。用語「対象」は、用語「患者」と同義的に用いられ得る。
【0107】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを広く指す。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の類似体または模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーに適用される。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用される。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加によって改変され得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語として、糖タンパク質、ならびに非糖タンパク質が挙げられる。
【0108】
本明細書で使用される「プロモーター」は、核酸の転写を指示する核酸配列のアレイを広く指す。本明細書で使用されるとき、プロモーターとしては、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなど、転写の開始部位の近くにおける、必要な核酸配列が挙げられる。また、プロモーターとしては、任意により、転写の開始部位から数千塩基対と同程度の距離に配置され得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントが挙げられる。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境及び発生条件下において活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生の調節下において活性であるプロモーターである。
【0109】
本明細書で使用される「予防的有効量」は、疾患の予防または疾患の再発の防止のために患者に投与された場合、疾患または再発のそのような予防をもたらすのに十分である化合物の量を広く指す。予防的有効量は、兆候及び／または症状の発生を防止するのに有効な量であり得る。「予防的有効量」は、疾患及びその重症度、ならびに治療される患者の年齢、体重、病歴、状態への素因、既存状態に応じて異なり得る。
【0110】
本明細書で使用される「予防」は、兆候及び／または症状が患者に存在しない、寛解にある、または以前に患者に存在していた治療過程を広く指す。予防は、患者の疾患の治療後に生じる疾患を予防することを含む。さらに、予防は、疾患を潜在的に発症する可能性のある患者、特に疾患に罹患しやすい患者（例えば、患者集団（ｐａｔｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）のメンバー、危険因子を有する患者、または疾患を発症するリスクのある患者）を治療することを含む。
【0111】
本明細書で使用される「組換え」は、生成物、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して広く言及し、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって改変されたか、または細胞がそのように改変された細胞に由来することを指す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内に見出されない遺伝子を発現するか、さもなければ発現が少ないか、または全く発現しない異常発現する天然遺伝子を発現する。
【0112】
本明細書で使用される場合、抗体に「特異的に（もしくは選択的に）結合する」または「特異的に（もしくは選択的に）免疫反応する」または「特異的に相互作用または結合する」とは、タンパク質またはペプチド（または他のエピトープ）を広く指し、いくつかの実施形態では、タンパク質及び他の生物製剤の不均一な集団におけるタンパク質の存在の決定因子である結合反応を指す。例えば、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、バックグラウンド（非特異的シグナル）よりも少なくとも２倍大きい特定のタンパク質に結合し、有意な量では、試料中に存在する他のタンパク質に実質的に結合しない。典型的に、特異的または選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナルまたはノイズであり、より典型的には約１０〜１００倍超のバックグラウンドである。
【0113】
本明細書で使用される「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」とは、核酸が伝統的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋまたは他の非伝統的なタイプのいずれかによって別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成できることを広く指す。その相補的配列を有する核酸分子の結合自由エネルギーは、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの決定は、当技術分野において周知である。例えば、Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ：１２３−３３；Ｆｒｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）ＰＮＡＳ８３：９３７３−７７；Ｔｕｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−８５を参照されたい。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合）を形成できる、核酸分子内の隣接する残基のパーセントを示す（例えば、１０のうち少なくとも約５、６、７、８、９、１０は約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的であり、包括的である）。「完全に相補的」または１００％相補性とは、第２の核酸配列中の同数の隣接する残基と水素結合する核酸配列の隣接する残基のすべてを広く指す。「実質的に相補性である」とは、非相補的であるように選択されたオーバーハングなどのポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、少なくとも約９０％の相補性を呈するポリヌクレオチド鎖を指す。特異的結合では、特異的結合が所望される条件下、すなわちｉｎ ｖｉｖｏアッセイもしくは治療処置の場合生理学的条件下で、またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要する。非標的配列は、典型的には、少なくとも５つのヌクレオチドのみ異なり得る。
【0114】
本明細書で使用される疾患の「兆候」は、患者の検査で発見可能な、疾患、疾患の主観的な兆候である症状とは対照的である、疾患の客観的な兆候を示す任意の異常を広く指す。
【0115】
本明細書で使用される「固体支持体」、「支持体」、及び「基質」は、これに限定されないが、平滑支持体（例えば、金属、ガラス、プラスチック、シリコン、及びセラミックの表面）、ならびにテクスチャ及び多孔質物質などの別の物質を接着することができる固体または半固体構造を提供する任意の物質を広く指す。
【0116】
本明細書で使用される「対象」は、本発明に従って治療されるのに好適である任意のヒトを広く指し、これらに限定されないが、鳥類及び哺乳動物の対象が挙げられ、好ましくは哺乳動物である。本発明の哺乳動物には、これらに限定されないが、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、げっ歯類（例えば、ラット及びマウス）、ウサギ、霊長類、ヒトが挙げられる。本発明による治療を必要とするあらゆる哺乳動物対象が好適である。両方の性別及び任意の発達段階（すなわち、新生児、幼児、若年者、青年期、成人）のヒト対象は、本発明により治療され得る。本発明はまた、動物対象、特にマウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、及びウマなどの哺乳動物対象に対して、獣医学的目的、ならびに薬物スクリーニング及び薬物開発目的で実施できる。「対象」は、「患者」と同義的に使用される。
【0117】
本明細書で使用される疾患の「症状」は、患者が経験し、疾患を示す、任意の病的現象、または正常な構造、機能、もしくは感覚からの逸脱を広く指す。
【0118】
「治療法」、「治療的」、「治療する」、または「治療」は、本明細書で用いられる場合、疾患を治療すること、疾患もしくはその臨床症状の発達を停止もしくは低減すること、及び／または疾患を緩和し、疾患もしくはその臨床症状の退行を引き起こすことを広く指す。治療法は、疾患、疾患の兆候、及び／または症状の予防、治療、修復、低減、軽減、及び／または緩和をもたらすことを包含する。治療法は、進行中の疾患兆候及び／または症状（例えば、腫瘍の成長、転移）を有する患者における兆候及び／または症状の軽減を包含する。治療法は、「予防」も包含する。「低減された」という用語は、治療法の目的で、兆候及び／または症状の臨床的に有意な低減を広く指す。治療法としては、再燃または再発の兆候及び／または症状（例えば、腫瘍の成長、転移）の治療が挙げられる。治療法は、これらに限定されないが、兆候及び／または症状の出現をいつでも除外すること、ならびに既存の兆候及び／または症状を低減すること、ならびに既存の兆候及び／または症状を排除することを包含する。治療法は、慢性疾患（「維持」）及び急性疾患を治療することを含む。例えば、治療としては、兆候及び／または症状（例えば、腫瘍の成長、転移）の再燃または再発を治療することまたは防止することが挙げられる。
【0119】
本明細書で使用される「可変領域」または「ＶＲ」は、抗体の抗原への結合に直接関与する抗体の軽鎖及び重鎖の各ペア内のドメインを広く指す。各重鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。
【0120】
本明細書で使用される「ベクター」は、宿主細胞内で自律的に複製でき、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を特徴とするプラスミド、コスミド、ファージミド、ファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ分子を広く指す。こうした認識部位では、そのようなＤＮＡ配列が、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく決定可能な方法で切断され得、その部位には、その複製及びクローニングをもたらすためにＤＮＡが挿入され得る。ベクターはさらに、ベクターで形質転換された細胞の同定に使用するのに好適であるマーカーを含んでもよい。
【0121】
技術及び手順は一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察されている、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されているように実行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ［３ｒｄ Ｅｄ］Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）には、標準技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実行され得る。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関連して利用される学名、ならびにこれらの実験室の手順及び技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、配合、及び送達、ならびに患者の治療に使用され得る。
【0122】
実施例
【0123】
ここで一般に記載される本発明は、次の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。これらは、単に本発明のある特定の態様及び実施形態を例示する目的で含まれ、本発明を限定することを意図するものではない。
【0124】
実施例１
【0125】
ＮＥＯ−２０１は、様々なヒトがん腫細胞株に結合する。
【0126】
フローサイトメトリー分析を使用して、ＮＥＯ−２０１結合についてヒトがん腫細胞株のパネルのプロファイルを作成した。染色プロファイルを表１にまとめ、高、中、低、及び陰性の染色を有する細胞株からの代表的なヒストグラムを図１Ａ〜Ｃに示す。ＮＥＯ−２０１の結合活性の評価では、３／６（５０％）の結腸癌細胞株及び４／５（８０％）の膵癌細胞株において陽性率が高いことが明らかになった。様々な組織学的サブタイプの非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株のプロファイルを作成したところ、腺癌細胞株の３／５（６０％）がＮＥＯ−２０１と反応したが、扁平上皮癌細胞株では１／４（２５％）のみが陽性であることが判明した。乳癌細胞株のスクリーニングも行った。エストロゲン受容体（ＥＲ）またはプロゲステロン受容体（ＰＲ）のいずれかを発現した細胞株のうち、単独か、またはＨＥＲ２との組み合わせかにかかわらず、ＮＥＯ−２０１に対して２／４（５０％）が陽性染色された。ＨＥＲ２＋細胞株のうち、単独またはＥＲまたはＰＲとの組み合わせにかかわらず、３／４（７５％）がＮＥＯ−２０１によって認識された。しかし、ＮＥＯ−２０１染色は、トリプルネガティブ乳癌細胞株のわずか１／４（２５％）において低レベルで発見された。全体で、検査された腫瘍細胞株の１５／３０（５０％）がＮＥＯ−２０１によって認識された。これらのデータは、ＮＥＯ−２０１が広範囲のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養腫瘍細胞株に対して反応性があることを示しており、腫瘍サブタイプに基づいて抗体反応性に明確な差異が生じ得ることを示している。
【0127】
実施例２
【0128】
ＮＥＯ−２０１組織染色は腫瘍特異性が高い
【0129】
免疫組織化学を使用して、各がん型について数十の試料を表す組織マイクロアレイを使用して、ヒト腫瘍試料からのＮＥＯ−２０１反応性を調査した。図２Ａに示すように、ＮＥＯ−２０１との免疫反応性（７，８２９，６７８）は、正常な結腸、膵臓、及び肺組織にはまったく存在しなかったが、これらの臓器由来の腫瘍組織では陽性率が高かった。驚くべきことに、周囲の間質細胞は染色されなかったため、染色は腫瘍細胞上でのみ見られた（図２Ａ）。ＩＨＣ染色及びマイクロアレイ試料では、ＮＥＯ−２０１は、結腸癌（７２％）、膵癌（８０％）、胃癌（７１％）、肺癌（６１％）、乳癌（５５％）、及び子宮癌（５４％）に対して非常に反応性が高いと判断された。さらに、かなり少数の卵巣癌（２６％）の試料も陽性染色を呈したが、前立腺癌組織ではいかなる染色も観察されなかった（図２Ｂ）。全体として、サンプリングされた腫瘍組織の２５８／３４５（７４．７％）がＮＥＯ−２０１に対して陽性染色した。重要なことに、ＮＥＯ−２０１の反応性は、正常な健康組織（表２）、ならびに一部の子宮及び卵巣の試料（図２Ｃ）を除く正常な腫瘍隣接組織ではほぼ完全にない。しかし、この一連の子宮及び卵巣組織では、組織の数が制限されていた（それぞれ、試料５個及び９個）。まとめると、これらのデータは、ＮＥＯ−２０１が様々ながん腫からの腫瘍組織を認識し、かつ腫瘍特異性が高いことを示している。
【0130】
実験例３
【0131】
ＮＥＯ−２０１は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを媒介して腫瘍細胞を死滅させる
【0132】
ＮＥＯ−２０１は、ヒト化ＩｇＧ１抗体として、ＮＥＯ−２０１抗原を発現する腫瘍細胞を死滅させるために、ＡＤＣＣを媒介できることが理論化されている。この潜在的な作用機序を調査するために、２名の異なる健康なドナー由来ＰＢＭＣから単離したヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を利用するＡＤＣＣアッセイは、ＮＥＯ−２０１染色に対して陽性率の高い細胞株（ＣＦＰＡＣ−１及びＡＳＰＣ−１）で行った。ＮＥＯ−２０１による治療では、ＣＦＰＡＣ−１及びＡＳＰＣ−１の両方の細胞の死滅が、対照のＩｇＧ１治療腫瘍細胞の死滅よりも２〜６倍高いレベルまで高まることが観察された（図３Ａ）。滴定アッセイも実施し、ＮＥＯ−２０１が０．１μｇ／ｍＬほどの低用量でＡＤＣＣを有意に誘導する能力を保持していることが明らかになった（図３Ｂ）。
【0133】
ＣＤＣは、抗体結合標的細胞を溶解する膜攻撃複合体の活性化に至る、タンパク質分解性切断の複合体カスケードである。特定のヒトＩｇＧ１抗体は、ＣＤＣを媒介できるが、ＣＤＣは抗体の抗原特異性に依存する。ＣＤＣアッセイでは、ＮＥＯ−２０１が、ｍＡｂ用量及びインキュベーション時間の両方に依存する様態でＡＳＰＣ−１細胞の補体媒介性溶解を誘導することが明らかになった（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＮＥＯ−２０１が自然免疫エフェクターメカニズムに効果的に係合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗体結合腫瘍細胞を特異的に溶解させることを示している。
【0134】
実施例４
【0135】
ＮＥＯ−２０１は、単独で、及びヒトＰＢＭＣエフェクター細胞と組み合わせて、腫瘍異種移植片の成長を抑制する。
【0136】
ＮＥＯ−２０１の潜在的な抗腫瘍効果を決定するために、免疫不全のＮＵ／ＮＵヌードマウスで腫瘍異種移植片としてＣＦＰＡＣ−１細胞を成長させた。これらの細胞は、ＮＥＯ−２０１抗原の発現レベルが高く、ＮＥＯ−２０１媒介ＡＤＣＣに対する感受性が高いことに基づいて選択した。ＣＦＰＡＣ−１腫瘍のサイズが約１００ｍｍ３まで成長したら、腫瘍担持マウスに生理食塩水、２５０μｇヒトＩｇＧ１、１００μｇ ＮＥＯ−２０１、または２５０μｇ ＮＥＯ−２０１を３回注入し、その後１．０ｘ１０７７ＩＬ−２活性化（２００Ｕ／ｍＬ）ヒトＰＢＭＣを３回注入して、ＡＤＣＣ媒介エフェクター細胞として機能させた。図４Ａに示すように、ＮＥＯ−２０１＋ＰＢＭＣにより、生理食塩水＋ＰＢＭＣまたはヒトＩｇＧ＋ＰＢＭＣ対照群のいずれかと比較して、両方の用量レベルで腫瘍成長の実質的な低減が誘導された。３６日目では対照群のいずれのマウスにも腫瘍がなかったのに対し、１０匹中１匹（１０％）及び１０匹中４匹（４０％）のマウスについては、それぞれ、ＮＥＯ−２０１ １００μｇ＋ＰＢＭＣ及びＮＥＯ−２０１＋２５０μｇ ＰＢＭＣでは触知可能な腫瘍が残存していなかった（図４Ｂ）。さらに、マウスの別の群にヒトＰＢＭＣを追加せずにＮＥＯ−２０１を投与したところ、対照群と比較して腫瘍の成長の有意な減少が観察された（図４Ａ、Ｃ）。重要なことは、腫瘍担持マウスの体重を監視したところ、いずれの治療群においても体重の減少がないことが明らかになった（図４Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＮＥＯ−２０１が、ＡＤＣＣメカニズム及び非ＡＤＣＣメカニズム（ＣＤＣなど）の両方を介して、マウスにおいて重大な毒性を誘発することなく、腫瘍の成長を大幅に低減できることを示している。
【0137】
実施例５
【0138】
ＮＥＯ−２０１は、異種移植腫瘍部位に局在する
【0139】
体内分布研究は、確立されたＣＦＰＡＣ−１異種移植腫瘍を有する雌及び雄のＮＵ／ＮＵヌードマウスで放射性標識ＮＥＯ−２０１を利用して行った。これらのマウスに放射性標識抗体を静脈注射し、注射後の様々な時点で分析するために血液、臓器、腫瘍を採取した。すべての時点で、雄及び雌の両方のマウスの膵臓、脾臓、腎臓、肝臓、胃、腸、及び肺において、低レベルの放射能が発見された（図５Ａ、Ｂ）。しかし、正規化された放射能の取り込みは、すべての時点で他のすべての組織と比較して腫瘍で大幅に高く、腫瘍の放射能は７日目までの血液の放射能よりも２０〜３０倍高いレベルまで徐々に上昇した（図５Ａ、Ｂ）。雌及び雄の両方のマウスで、定量的に同様の結果が得られた。これらの結果は、ＮＥＯ−２０１が優先的に標的抗原を発現する悪性組織に局在し、正常組織には蓄積しないことを示している。
【0140】
実施例６
【0141】
非ヒト霊長類におけるＮＥＯ−２０１の薬物動態及び毒性評価
【0142】
ＮＥＯ−２０１の薬物動態及び関連する毒性を決定するために、飼育目的カニクイザルにおいて単回投与試験を実施した。カニクイザルは、系統発生学的及び生理学的の両方においてヒトと密接に関連しており、非臨床毒性評価に一般的に使用されている種であるため、選択した。雄及び雌の動物に、生理食塩水で希釈したＮＥＯ−２０１を５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、及び４９ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内注入した。これは、注入量あたりの達成可能な最高用量であった。注射前及び注射後の最大１４日間の様々な時点で、すべての動物において血液試料を採取し、ＮＥＯ−２０１レベルについて、ＥＬＩＳＡにより血清調製物を評価した。表３に示すとおり、ＮＥＯ−２０１の定量可能な、用量依存的な血清濃度が最後の収集時点（投与後１４日）で観察された。静脈内投与について予測されたように、Ｔｍａｘ値は、５ｍｇ／ｋｇ群の雄１匹及び雌１匹を除いて、すべての群の大半の動物（１０／１２、８３％）は１０分でピークに達した。評価された用量範囲にわたって、ピーク（Ｃｍａｘ）曝露は用量比例であった。総（ＡＵＣ）曝露は、最低用量での用量比例より大きく、約２０ｍｇ／ｋｇ〜４９ｍｇ／ｋｇでほぼ比例した。最低用量での曝露の違いは、平均クリアランス（ＣＬ）より約２倍大きく、分布量（Ｖｚ）が少ないことに起因していた。平均半減期（ＨＬ）は、高用量で１６７（２０ｍｇ／ｋｇ）時間または１７０（４９ｍｇ／ｋｇ）時間であり、５ｍｇ／ｋｇ用量（４６．２時間）よりも約３．７倍長かった。性差は観察されなかった。
【0143】
１４日間の研究の過程で毒性を決定するための以下の観察及び検査を含む。１）定期的な臨床評価；２）摂食量及び体重の測定；ならびに３）尿検査及び血液検査（尿検査、血液学、凝固検査、血清化学、及び毒物動態学など）。図６Ａに示すとおり、いずれの投与量群も、注射前の体重から３％超える体重の変化を経験しておらず、個々のサルはいずれも７％を超える変化を経験しなかった。１１日目のみ摂食量が少ない５ｍｇ／ｋｇ用量群での２匹を除くすべての動物について摂食量は変化しなかった。血清化学、尿検査、または凝固検査のいずれにおいても、ベースライン（ＮＥＯ−２０１注射前）から１５日目までに有意な変化はなかった（詳細については、材料及び方法を参照されたい）。実験室での血球数の主な変化は、ベースラインと比較した好中球数の減少であった（図６Ｂ）。減少は、軽度から顕著なものまで様々な程度であり、明確な用量反応は明らかにならなかった。大部分の動物にとって、改善が通常８日目までに認められたため、これは一時的な所見であった（図６Ｂ）。１５日目までに、好中球数は５ｍｇ／ｋｇ群または２０ｍｇ／ｋｇ群と４９ｍｇ／ｋｇ群のそれぞれで、ほぼ全体または部分的に回復することが観察された（図６Ｂ）。１５日目までの好中球数の回復は、０ｍｇ／ｋｇ動物との統計的比較に反映されている。０ｍｇ／ｋｇ動物は、３つのすべての投与量レベルで２日目に有意差があった（ｐ＜０．０５）が、３つの投与群のうち２つについては８日目及び１５日目において有意差はなかった（ｐ＞０．０５）（図６Ｃ）。
【0144】
実施例７
【0145】
材料及び方法
【0146】
細胞株及び培養
【0147】
以下のヒトがん腫細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した：結腸（ＣＯＬＯ ２０５、ＨＴ−２９、ＬＳ１７４Ｔ、ＳＷ１１１６、ＳＷ１４６３、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０）、膵臓（ＡＳＰＣ−１、ＣＦＰＡＣ−１、ＰＡＮＣ−１）、乳房（ＡＵ−５６５、ＢＴ−４７４、ＢＴ−５４９、ＨＣＣ１５００、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ３８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ−４７Ｄ、ＺＲ−７５−１）、及び肺（ＣＡＬＵ−１、Ｈ１７０３、Ｈ２２６、Ｈ４４１、Ｈ５２０、Ｈ５２２、Ｈ５９６、ＨＣＣ４００６、ＨＣＣ８２７、ＳＫ−ＬＵ−１）。すべての細胞培養は、伝播及び維持のために供給業者によって指定されているＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、またはＩＭＤＭ培養培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で維持された。培養培地には、規定の１０％の米国産熱不活化ＨｙＣｌｏｎｅウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ，ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）を補充した。健康なボランティアドナー由来のＰＢＭＣは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ（ＮＣＴ００００１８４６）から、適切な治験審査委員会の承認及びインフォームドコンセントの下で得た。
【0148】
ヒト化ＮＥＯ−２０１モノクローナル抗体の作製
【0149】
Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ結腸癌特異的ワクチンは、マウスでモノクローナル抗体を生成するための免疫原性物質として使用した。腫瘍関連タンパク質及びペプチドを調製するための方法は、以前に記載されている（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ、ＵＳ４８１０７８１，１９８９）。簡潔に言えば、がん組織を細かく切り刻み、単一の細胞懸濁液を生成するために使用し、その後、低張食塩水膜の抽出、一連の遠心分離ステップ、その後の低周波超音波処理を行った。得られた膜抽出タンパク質をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２００樹脂または電気泳動法で分画し、次いで、濃縮し、定量した（Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ，１９７０；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９７２；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ＴＡＡ調製物を完全フロイントアジュバントと混合し、ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射した。これに続いて、２〜３週間の間隔をあけて、不完全フロイントアジュバントでの３回のブースター注射を行った。免疫化抗原に対する抗体応答についてマウス血清をＥＬＩＳＡでテストし、強力な応答のあるマウスを使用して、脾臓からのマウスＢ細胞をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株と融合させ、成長させ、マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）を生成した細胞を選択することにより、不死化ハイブリドーマ細胞を生成した。これらのマウスＩｇＧから、マウスの１６Ｃ３クローン（ｍ１６Ｃ３）を、ＥＬＩＳＡにより決定されたＬＳ１７４ＴまたはＨＴ−２９細胞由来の結腸腫瘍細胞膜抽出物との反応性に基づいて選択した。重鎖及び軽鎖ＩｇＧ１をコードするｃＤＮＡは、ハイブリドーマクローン１６Ｃ３ Ｅ１２から単離されたＲＮＡから決定され、ユニークであることが示された（Ｂｒｉｓｔｏｌ＆Ｋａｎｔｏｒ，ＵＳ７８２９６７８，２０１０）。ｍ１６Ｃ３タンパク質配列は、ｈ１６Ｃ３としてヒト化され、ＮＥＯ−２０１と命名された。ヒト化は、重鎖及び軽鎖タンパク質の両方のＦａｂ領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のマウス配列をヒトＦａｂ配列で置き換え、各鎖から３つのマウスＣＤＲ配列を保持することによりインシリコで行った。重鎖及び軽鎖のＦｃ領域は、他のヒト化承認済みｍＡｂ産生物で使用されているヒトＩｇＧ１アイソタイプから選択した。アミノ酸配列は、ＣＨＯ細胞でのタンパク質発現用に最適化されたＤＮＡに逆翻訳させた。次に、重鎖及び軽鎖ｈ１６Ｃ３のＤＮＡを化学合成し、哺乳動物発現プラスミドにクローニングし、哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ及びＣＨＯ）にトランスフェクトした。組換えｈ１６Ｃ３を発現するいくつかの安定したＣＨＯ細胞株を誘導させ、保存した。精製された組換えｈ１６Ｃ３は、ヒト化１６Ｃ３抗体が元のｍ１６Ｃ３抗体と同様の特性を有していることを確認する研究において再検査した（Ｂｒｉｓｔｏｌ＆Ｋａｎｔｏｒ，ＵＳ７８２９６７８，２０１０）。
【0150】
これらの実施例で使用されているＮＥＯ−２０１抗体配列は、次の図に含まれている。【数1】
【0151】
発現リーダー配列、可変領域、及び定常領域の間の境界は、各配列においてスラッシュ（「／」）で区切られ、ＣＤＲ配列は、太字の下線付き文字列で示される。使用された抗体配列は、示されている可変及び定常領域を含んでいた。これらの領域としては、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号３４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７の軽鎖ＣＤＲ３が挙げられる。
【0152】
フローサイトメトリー
【0153】
ＮＥＯ−２０１のヒトがん腫細胞株への結合をフローサイトメトリーで分析した。細胞（１．０ｘ１０６）を検査ごとに１μＬ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、４℃で、３０分間インキュベートして、生細胞対死細胞の区別を得た。次に細胞を遠心分離し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｌｕｅコンジュゲートＮＥＯ−２０１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含む１ＸＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｔｅｋｎｏｖａ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、４℃で３０分間染色した。染色後、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して検査した。ＢＤ ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェアを使用して細胞蛍光の分析を実施した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。染色値＞１０％陽性は、ＮＥＯ−２０１発現に対して陽性と見なした。陽性細胞株は、定量化させた発現レベル（陽性率％ｘＭＦＩ）に従ってランク付けし、低（＜２００）、中（２００〜１０００）、及び高（＜１０００）発現の群に分類した。
【0154】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
【0155】
結腸試料（ＣＯ８０８、ＣＯ９５１）の組織マイクロアレイは、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ（ロックビル、ＭＤ）から入手し、結腸（Ａ３０３（Ｉ））、膵臓（Ａ２０７（ＩＩ）、Ａ３０７）、胃（Ａ２０９）、肺（Ａ２０６（Ｖ）、Ａ３０６）、乳房（Ａ２０２（ＶＩ）、Ａ７１２）、子宮（Ａ２１２）、卵巣（Ａ２１２、Ａ２１３（ＩＩ））、前立腺（Ａ３０２（ＩＶ））、及び様々な正常（Ａ１０３（ＶＩＩ））試料のＡｃｃｕＭａｘ組織マイクロアレイは、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から入手した。ＮＥＯ−２０１は、製造業者の指示に従って、ビオチンタンパク質標識キット（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してビオチン化させた。スライドを６０℃で２０分間焼成し、キシレンにより脱パラフィンし、段階的エタノール系列で再水和した。スライドは、ペルオキシダーゼＩ溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）を使用して２分間過酸化ブロッキングに供し、アビジン溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）を使用して１０分間アビジンブロッキングに供し、ビオチン溶液（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａ，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）を使用して１０分間ビオチンブロッキングに供し、ＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋ組織化学試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して１０分間タンパク質ブロッキングに供した。次に、スライドを室温で、陰性対照のビオチン化ヒトＩｇＧ１カッパ（Ａｎｃｅｌｌ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ）または１ＸＰＢＳで希釈した１０μｇ／ｍＬのビオチン化ＮＥＯ−２０１と２時間インキュベートした。検出は、Ｄａｋｏストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を１：３００で３０分間、ＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で１〜３分間インキュベートし、ヘマトキシリンで対比染色して有効にした。各マイクロアレイ組織スポットは、以下のスケールを使用して、細胞染色強度について光学顕微鏡により評価した：０（陰性）、±（境界域）、１＋（弱い）、２＋（中程度）、３＋（強い）。＋１以上の強度で染色された細胞を含む組織スポットは、陽性として記録した。
【0156】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
【0157】
ＡＤＣＣアッセイは、前述の手順の変更を使用して実行した（Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。製造業者のプロトコルに従って、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、正常なヒトドナーＰＢＭＣからのＮＫ細胞の陰性選択を行った。精製したＮＫ細胞を、Ｌ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、及び抗生物質を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地で一晩インキュベートした。アッセイの日に、標的細胞（ＣＦＰＡＣ−１、ＡＳＰＣ−１）を１０μＭカルセインＡＭ細胞浸透性色素（Ｔｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で３０分間標識した後、３．０ｘ１０３細胞／ウェルで３回、黒壁の平底９６ウェル培養プレート（＃６５５０９０ Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種した。その後、腫瘍細胞を１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＮＥＯ−２０１で治療し、特に指定がない限り、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１２．５：１及び２５：１でＮＫ細胞を加えた。３７℃で４時間のインキュベーション後、１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を各ウェルに加え、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用してプレートをイメージングし、分析した（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ ＬＬＣ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）。生きた標的細胞（カルセインＡＭ／ＰＩ−）を各ウェルで数え、特定のＡＤＣＣ溶解を次のように計算した：特異的溶解率％＝１００−［（平均の生きた標的数ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ／平均の生きた標的数ｃｏｎｔｒｏｌ）ｘ１００］。
【0158】
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイ
【0159】
ＣＤＣアッセイは、前述の手順の変更を使用して実行した（Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００８）。ＡＳＰＣ−１標的細胞を上記のようにＣａｌｃｅｉｎ ＡＭで標識し、５．０ｘ１０３細胞／ウェルで黒壁の９６ウェルプレートに播種した。次に、細胞を０．５または５．０μｇ／ｍＬ ＮＥＯ−２０１で、３７℃で１５分間処理して細胞をオプソニン化し、精製したウサギ補体（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）を各ウェルに１：８の希釈で加えた。３７℃で３０分間、６０分間、または１２０分間インキュベートした後、ヨウ化プロピジウムを加え、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを使用してプレートをイメージングし、分析し、ＡＤＣＣ活性について上記のように比溶解を計算した。
【0160】
異種移植抗腫瘍アッセイ
【0161】
腫瘍は、６週齢の雌の無胸腺ＮＵ／ＮＵヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で、培養腫瘍細胞含有１ＸＰＢＳ懸濁液を、マウスの右側腹部に皮下移植することによって確立された。腫瘍のサイズが約１００ｍｍ３に到達すると、マウスを腫瘍体積で選別し、ランダムに５つの群に分けた（動物ｎ＝１０）。次に、マウスにビヒクルのみ（生理食塩水）、ヒトＩｇＧ１（２５０μｇ）、またはＮＥＯ−２０１（１００μｇ及び２５０μｇ）を移植後１３日目、１７日目、及び２０日目に腹腔内注射した。マウスはまた、免疫エフェクター細胞の供給源として、１４日、１８日、及び２１日に、ＩＬ−２で活性化された約１．０ｘ１０７のヒトＰＢＭＣの腹腔内注射（２００Ｕ／ｍＬ、培養で一晩処理）を受けた。マウスの１つの群は、ＮＥＯ−２０１で同様に処理したが、ヒトＰＢＭＣの投与は受けなかった。腫瘍はデジタルキャリパーで２〜３日ごとに測定し、腫瘍体積は式（幅２ｘ長さ）／２＝ｍｍ３によって計算した。ここで、幅は２つの測定値のうち短い値とした。マウスはまた一般的な健康の総計として毎週体重を量った。ＩＡＣＵＣガイドラインに従って、腫瘍体積が２０００ｍｍ３を超えるマウスは屠殺した。
【0162】
生体分布分析
【0163】
以前に記載された手順（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３）を用いて、放射性標識ＮＥＯ−２０１（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、腫瘍担持マウスで生体内分布研究を評価した。簡潔に述べると、雄及び雌の無胸腺ＮＵ／ＮＵヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の脇腹に、４．０ｘ１０６ＣＦＰＡＣ−１細胞を含む２００μＬ １ＸＰＢＳ懸濁液を皮下注射した。生着後１４日目に、マウスに２０μＣｉの１２５Ｉ標識ＮＥＯ−２０１を静脈内注射し、１日後、２日後、４日後、または７日後に剖検した。血液、腫瘍組織、及び内臓（肺、腎臓、肝臓、脾臓、膵臓、腸、及び胃）を各時点（動物ｎ＝４）で採取し、すべての組織の重量を量り、ガンマカウンターを用いて、組織内の放射能を測定した。各マウスのデータは最初にｃｐｍ／ｍｇ組織として計算し、次に組織ｃｐｍ値を血中ｃｐｍ値に対して正規化した。
【0164】
カニクイザルにおける単回投与毒性試験
【0165】
ＮＥＯ−２０１の単回投与後の薬物動態及び毒性についてＮＥＯ−２０１を試験するために、単回投与毒性試験を飼育目的カニクイザルで実施した。研究期間は、用量投与から１５日であり、サルを研究室に順応させるために用量投与前にさらに１４日間隔離した。注入ポンプ及びカテーテル延長チューブ付きのプラスチック製使い捨てシリンジを使用して、０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、及び４９ｍｇ／ｋｇの用量レベルで（これは、抗体の達成可能な最高濃度であった）、生理食塩水で希釈したＮＥＯ−２０１をゆっくりと静脈内注入（約３０分±５分の注入）して、８匹の雄及び雌の動物（２匹／性別／群）に投与した。以下の時点でＮＥＯ−２０１を受けたすべての動物から血液試料を採取した：投与前、１０分、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間。血清は、薬物動態学分析及び毒物学分析のために血液試料から調製した。全血を細胞分析に使用した。血清中のＮＥＯ−２０１レベルは、製造業者の指示に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてＥＬＩＳＡで測定した。
【0166】
臨床検査には、血液学及び凝固（ベースライン（ＢＬ）、２、８、１５日目）；ＣＢＣ及び差分、活性化部分トロンボプラスチン時間、フィブリノーゲン及びプロトロンビン時間；血清化学（ＢＬ、２、８、１５日目）：アルブミン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、カルシウム、総コレステロール、クレアチンキナーゼ、クレアチニン、グルコース、無機リン、総タンパク質、トリグリセリド、ナトリウム、カリウム、塩化物、グロブリン、アルブミン／グロブリン比、ＢＵＮ；尿検査（ＢＬ、１５日目）：色、透明度、グルコース、ケトン、潜血、タンパク質、ビリルビン、亜硝酸塩、ｐＨ、ウロビリノーゲン、白血球、体積、比重；生物分析（ＥＬＩＳＡを使用）−（ＢＬ、１０分、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１６８時間、及び３３６時間）、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン６．１ソフトウェア（Ｃｅｒｔａｒａ ＵＳＡ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）を用いて、２群〜４群を含めた。動物の体重測定値を記録し（ＢＬ、７、及び１４）、好中球数を評価した（ＢＬ、２、８、１５日目）。
【0167】
統計分析
【0168】
データはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して分析した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。２つの群間の比較はＴ検定によって行い、ｐ＜０．０５は統計的に有意であると見なした。グラフは、三連で行った１つの代表的な実験からの平均±ＳＤを示している。
【0169】
実施例８
【0170】
ＡＬＴ−８０３は、ＮＥＯ−２０１媒介ＡＤＣＣを強化する
【0171】
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−１５受容体α／ＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質に結合したＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）からなる新規のＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体である。本実施例では、ＡＬＴ−８０３がＮＥＯ−２０１によってＡＤＣＣを調節する能力について試験を行う。
【0172】
方法
【0173】
ＮＫ細胞は、正常なドナーから単離され、エフェクター細胞として使用される前に４８時間様々な濃度のＡＬＴ−８０３で処理され、ＮＥＯ−２０１抗原を発現するヒトがん腫細胞株を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ非放射性ＡＤＣＣアッセイにおいて標的として利用した。ＡＬＴ−８０３がＮＫ細胞の表現型に影響を及ぼし、ＮＫ細胞の遺伝子発現を調節する能力を、フローサイトメトリーとＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析をそれぞれ使用して評価した。
【0174】
結果
【0175】
ＡＬＴ−８０３での処理により、ＮＥＯ−２０１陽性のがん腫細胞に対して、ＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が有意に増強された（図８、図１１）。ＡＬＴ−８０３の効果は用量依存的であり、ビヒクル対照処理と比較して、試験を行ったすべての用量で統計的有意性を達成した。ＡＬＴ−８０３によりＮＫ細胞を処理することで、ＡＤＣＣ活性が最小限であるドナーからのＡＤＣＣ活性も増強され、未処理のＮＫ細胞と比較して、ＡＤＣＣ応答を開始するために必要とされるＮＥＯ−２０１の有効量が減少した（図１２）。さらに、抗ＣＤ１６ブロッキング抗体及び抗ＴＩＭ３ブロッキング抗体を使用することにより、ＡＤＣＣ活性のブロックが可能になる（図１２）。
【0176】
２５ｎｇ／ｍｌのＡＬＴ−８０３で４８時間処理したＮＫ細胞の表現型分析は、ＡＬＴ−８０３がＴＩＭ３及びＮＫＧ２Ｄの発現ならびにＣＤ１６／ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞におけるグランザイムＢ及びＣＤ１０７ａの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を増強することを示した（図９）。
【0177】
ＡＬＴ−８０３を様々な濃度で４８時間処理したヒトＮＫ細胞のＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析は、ＡＬＴ−８０３が６２遺伝子のｍＲＮＡ発現を調節できることを示した（ビヒクル対照と比較して１．６ ｌｏｇ２の倍率変化が有意であると見なした）。
【0178】
ＡＬＴ−８０３処理により、ＮＫ活性化受容体、ＮＫ細胞毒性に関与する因子、サイトカイン及びその受容体など４３の遺伝子のｍＲＮＡ発現が上方制御され、ＮＫ阻害受容体、及びアポトーシスの活性化に関与する因子など１９の遺伝子のｍＲＮＡ発現が下方制御された。
【0179】
したがって、ＡＬＴ−８０３により、ＮＥＯ−２０１によって媒介されるヒトがん腫細胞に対するＡＤＣＣ活性が増強される。ＡＤＣＣ活性の増強は、一部は、ＴＩＭ３、ＮＫＧ２Ｄ、グランザイムＢ、及びＣＤ１０７ａ陽性ＮＫ細胞の発現の増加、ならびにＮＫの活性化及び細胞毒性に関与する転写産物の調節が要因であり得る。
【0180】
要約すると、正常なドナーから単離されたＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３により処理することで、ＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が増強され得る。正常なドナーから単離されたＡＬＴ−８０３処理ＮＫ細胞の表現型分析により、ＡＬＴ−８０３がＣＤ１６／ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞でのＴＩＭ−３及びＮＫＧ２Ｄの発現が増強され得ることが示された。正常なＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３で処理することにより、ＣＤ１６／ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞におけるグランザイムＢのＭＦＩも増加する。正常なＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３で処理することにより、試験を行った２名のドナーのうちの１名で、ＣＤ１６／ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａのＭＦＩも増加する。ＴＩＭ−３は、インターフェロンガンマ産生を増強する誘導性ヒトＮＫ細胞受容体である。また、成熟マーカーでもある。ＡＬＴ−８０３による処理後のＮＥＯ−２０１によって媒介されたＡＤＣＣ活性の増強は、ＴＩＭ−３陽性、ＮＫＧ２Ｄ陽性のグランザイムＢ陽性、及びＣＤ１０７ａ陽性のＮＫ細胞の発現の増加が要因の一部であり得るが、この理論は、制限することを意図するものではない。ＮＫ細胞をＡＬＴ−８０３で処理することにより、低濃度のＮＥＯ−２０１によって媒介されるＡＤＣＣ活性が増強され得る。低濃度のＭａｂは、ＮＫ細胞がＡＬＴ−８０３で処理されたときにＡＤＣＣ活性を媒介するために使用することができ、また高濃度のＮＥＯ−２０１を使用したＡＬＴ−８０３処理を行わない場合のＮＫ細胞と比較して、同等レベルの細胞毒性となり得る。この結果は、がん治療のための臨床試験において、より少ない用量のＭａｂをＡＬＴ−８０３と組み合わせて使用できることを示唆している。
【0181】
実施例９
【0182】
ＮＥＯ−２０１は、阻害性ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ１免疫チェックポイント経路のブロックを介して、腫瘍細胞のＮＫ細胞依存性死滅を増強する。
【0183】
ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４などのエフェクター細胞阻害性受容体を標的とするチェックポイントブロッキング抗体を使用した免疫療法では、いくつかの腫瘍型において、いくつかの劇的で耐久性のある応答が引き出される。がん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）は、免疫細胞及び腫瘍細胞によって発現される細胞表面タンパク質であり、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４と同様にＴ細胞機能を阻害できる。ＣＥＡＣＡＭ１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞機能の強力な阻害剤でもある。ＮＫ細胞上のＣＥＡＣＡＭ１と腫瘍細胞上のＣＥＡＣＡＭ１またはＣＥＡＣＡＭ５との間での結合は、ＮＫＧ２Ｄによる活性化シグナル伝達を阻害し、これにより、ＮＫ細胞の細胞溶解を防ぎ、腫瘍細胞がＮＫ死滅を回避できるようになる。
【0184】
ＮＥＯ−２０１は、ＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバーに結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの自然免疫機構を活性化して、腫瘍細胞を死滅させることができる。この調査は、ＮＥＯ−２０１がＣＥＡＣＡＭ１阻害経路をブロックして、ＮＫ細胞に抗腫瘍機能を回復させるか否かを判断するために設計した。
【0185】
方法
【0186】
ヒト腫瘍細胞株を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、ＮＥＯ−２０１が結合したＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバーを特定した。機能アッセイを実施して、ＣＥＡＣＡＭ１を発現し、ＣＤ１６がなく、かつＡＤＣＣを媒介する能力のない、ＮＫ細胞株ＮＫ−９２による腫瘍細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ死滅を強化するＮＥＯ−２０１の能力を評価した。
【0187】
死滅アッセイは、前述の手順の変更を使用して、実施した（Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。簡潔に述べると、膵癌（ＡＳＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、ＣＦＰＡＣ−１）及び結腸癌（ＬＳ１７４Ｔ）由来の標的細胞を、１０μＭのカルセインＡＭ細胞浸透性色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で３０分間標識し、その後、三連で３．０ｘ１０３細胞／ウェルで、黒壁の平底９６ウェル培養プレートに播種した。その後、腫瘍細胞を１０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）またはＮＥＯ−２０１で処理し、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１．５６２５：１、３．１２５：１、６．２５：１、及び１２．５：１でナチュラルキラー（ＮＫ）細胞株ＮＫ−９２を加えた。３７℃で１６時間のインキュベーション後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を最終濃度１．６７μｇ／ｍＬで各ウェルに加え、プレートを遠心し、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ ＬＬＣ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用してイメージングし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて分析した。生きた標的細胞（カルセインＡＭ／ＰＩ−）を各ウェルで数え、特異的溶解を次のように計算した：特異的溶解率％＝１００−［（平均の生きた標的数ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ／平均の生きた標的数ｃｏｎｔｒｏｌ）ｘ１００］。
【0188】
結果
【0189】
ＮＥＯ−２０１は、ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＥＡＣＡＭ６の異なるバリアントには反応するが、ＣＥＡＣＡＭ１またはＣＥＡＣＡＭ８には反応しないことが判明した。発現プロファイリングでは、様々なＮＥＯ−２０１＋細胞株細胞により、異なるレベルのＣＥＡＣＡＭ５／６の陰性形態及びこれらの分子のＮＥＯ−２０１反応性バリアント形態が発現することが明らかになった。機能的に、ＮＥＯ−２０１処理により、ＣＥＡＣＡＭ５を発現したＮＥＯ−２０１＋腫瘍細胞に対してＮＫ−９２細胞の細胞溶解活性が増強されたが、ＣＥＡＣＡＭ６のみを発現したＮＥＯ−２０１＋細胞に対しては増強されなかった（図１３）。
【0190】
結論
【0191】
ＮＥＯ−２０１は、ＣＥＡＣＡＭ５／６の腫瘍関連バリアントと反応し、腫瘍細胞ＣＥＡＣＡＭ５とＮＫ細胞ＣＥＡＣＡＭ１との間の相互作用をブロックして、ＮＫ細胞毒性のＣＥＡＣＡＭ１依存性阻害を逆行させ得る。
【0192】
略語抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、時間０から無限大までの血漿中濃度時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、時間０から無限大までの血漿中濃度−時間曲線下の線量正規化面積（ＡＵＣｉｎｆ／Ｄ）、ベースライン（ＢＬ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、クリアランス（ＣＬ）、観察された最大血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、用量正規化測定最大血漿濃度（Ｃｍａｘ／Ｄ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、半減期（ＨＬ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、観察された最大血漿濃度時間（Ｔｍａｘ）、分布容積（Ｖｚ）。
【0193】
参考文献以下のリストの各文書を含む、本明細書で引用される各文書は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
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26. Ｌｏｐｅｚ−Ａｌｂａｉｔｅｒｏ Ａ，Ｌｅｅ ＳＣ，Ｍｏｒｇａｎ Ｓ，Ｇｒａｎｄｉｓ ＪＲ，Ｇｏｏｄｉｎｇ ＷＥ，Ｆｅｒｒｏｎｅ Ｓ，Ｆｅｒｒｉｓ ＲＬ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩＩａ ａｎｄ ＥＧＦＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｍｅｄｉａｔｅｄ，ＮＫ ｃｅｌｌ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９ Ｎｏｖ；５８（１１）：１８５３−６４．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２６２−００９−０６９７−４．
27. Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ Ｂ，Ｊｏｃｈｅｍｓ Ｃ，Ｆａｎｔｉｎｉ Ｍ，Ｈｅｅｒｙ ＣＲ，Ｇｕｌｌｅｙ ＪＬ，Ｔｓａｎｇ ＫＹ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｖｅｌｕｍａｂ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１５ Ｏｃｔ；３（１０）：１１４８−５７．
28. Ｍｅｙｅｒ Ｓ，Ｌｅｕｓｅｎ ＪＨ，Ｂｏｒｏｓｓ Ｐ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．ＭＡｂｓ．２０１４；６（５）：１１３３−４４．
29. Ｓｔｒｏｍｅ ＳＥ，Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ ＥＡ，Ｍａｎｎ Ｄ．Ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｂｅｙｏｎｄ ｔａｒｇｅｔ−ｒｅｌａｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００７ Ｓｅｐ；１２（９）：１０８４−９５．
30. Ｈａｙｅｓ Ｊ，Ｆｒｏｓｔｅｌｌ Ａ，Ｋａｒｌｓｓｏｎ Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｓ，Ｍｉｌｌａｎ−Ｍａｒｔｉｎ Ｓ，Ｐａｕｅｒｓ Ｍ，Ｒｅｕｓｓ Ｆ，Ｃｏｓｇｒａｖｅ Ｅ，Ａｎｎｅｒｅｎ Ｃ，Ｄａｖｅｙ ＧＰ，Ｒｕｄｄ ＰＭ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｆｏｒ ｒｉｔｕｘｉｍａｂ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１７ Ｊｕｎ ２．ｐｉｉ：ｍｃｐ．Ｍ１１７．０６６９４４．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１７．０６６９４４．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
31. Ｋｏｅｎｅ ＨＲ，Ｋｌｅｉｊｅｒ Ｍ，Ａｌｇｒａ Ｊ，Ｒｏｏｓ Ｄ，ｖｏｎ ｄｅｍ Ｂｏｒｎｅ ＡＥ，ｄｅ Ｈａａｓ Ｍ．Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−１５８Ｖ／Ｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＩｇＧ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ，ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｃ ｇａｍｍａＲＩＩＩａ−４８Ｌ／Ｒ／Ｈ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７ Ａｕｇ １；９０（３）：１１０９−１４．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９２４２５４２．
32. Ｗｕ Ｊ，Ｅｄｂｅｒｇ ＪＣ，Ｒｅｄｅｃｈａ ＰＢ，Ｂａｎｓａｌ Ｖ，Ｇｕｙｒｅ ＰＭ，Ｃｏｌｅｍａｎ Ｋ，Ｓａｌｍｏｎ ＪＥ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ ＲＰ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）ａｌｔｅｒｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｓ ｔｏ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７ Ｓｅｐ １；１００（５）：１０５９−７０．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ：９２７６７２２
33. Ｍｕｓｏｌｉｎｏ Ａ，Ｎａｌｄｉ Ｎ，Ｂｏｒｔｅｓｉ Ｂ，Ｐｅｚｚｕｏｌｏ Ｄ，Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ Ｍ，Ｍｉｓｓａｌｅ Ｇ，Ｌａｃｃａｂｕｅ Ｄ，Ｚｅｒｂｉｎｉ Ａ，Ｃａｍｉｓａ Ｒ，Ｂｉｓａｇｎｉ Ｇ，Ｎｅｒｉ ＴＭ，Ａｒｄｉｚｚｏｎｉ Ａ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ−ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００８ Ａｐｒ １０；２６（１１）：１７８９−９６．
34. Ｈａｎｋ ＪＡ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＲＲ，Ｓｕｒｆｕｓ Ｊ，Ｍｕｅｌｌｅｒ ＢＭ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ＲＡ，Ｃｈｅｕｎｇ ＮＫ，Ｓｏｎｄｅｌ ＰＭ．Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９０ Ｓｅｐ １；５０（１７）：５２３４−９．
35. Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ，Ｋｏｎｏ Ｋ，Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｙ，Ｍｉｚｕｋａｍｉ Ｙ，Ｍｉｍｕｒａ Ｋ，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｔ，Ｆｕｊｉｉ Ｈ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２１ ｃａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｓｔｏｒｅ ｉｍｐａｉｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｆｅｂ ２；１０２（３）：５２０−９．
36. Ｈａｎ ＫＰ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｊｅｎｇ Ｅ，Ｋｏｎｇ Ｌ，Ｙｏｖａｎｄｉｃｈ ＪＬ，Ｖｙａｓ ＶＶ，Ｍａｒｃｕｓ ＷＤ，Ｃｈａｖａｉｌｌａｚ ＰＡ，Ｒｏｍｅｒｏ ＣＡ，Ｒｈｏｄｅ ＰＲ，Ｗｏｎｇ ＨＣ．ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０１１ Ｄｅｃ；５６（３）：８０４−１０．
37. Ｇｏｍｅｓ−Ｇｉａｃｏｉａ Ｅ，Ｍｉｙａｋｅ Ｍ，Ｇｏｏｄｉｓｏｎ Ｓ，Ｓｒｉｈａｒａｎ Ａ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｙｏｕ Ｌ，Ｅｇａｎ ＪＯ，Ｒｈｏｄｅ ＰＲ，Ｐａｒｋｅｒ ＡＳ，Ｃｈａｉ ＫＸ，Ｗｏｎｇ ＨＣ，Ｒｏｓｓｅｒ ＣＪ．Ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃａｌ ＡＬＴ−８０３ ａｎｄ ＢＣＧ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ ａ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ；ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１４ Ｊｕｎ ４；９（６）：ｅ９６７０５．
38. Ｍａｔｈｉｏｓ Ｄ，Ｐａｒｋ ＣＫ，Ｍａｒｃｕｓ ＷＤ，Ａｌｔｅｒ Ｓ，Ｒｈｏｄｅ ＰＲ，Ｊｅｎｇ ＥＫ，Ｗｏｎｇ ＨＣ，Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ，Ｌｉｍ Ｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ＡＬＴ−８０３ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｄｕｒａｂｌｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｏｄｅｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１６ Ｊａｎ １；１３８（１）：１８７−９４．
39. Ｒｈｏｄｅ ＰＲ，Ｅｇａｎ ＪＯ，Ｘｕ Ｗ，Ｈｏｎｇ Ｈ，Ｗｅｂｂ ＧＭ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｚｈｕ Ｘ，Ｗｅｎ Ｊ，Ｙｏｕ Ｌ，Ｋｏｎｇ Ｌ，Ｅｄｗａｒｄｓ ＡＣ，Ｈａｎ Ｋ，Ｓｈｉ Ｓ，Ａｌｔｅｒ Ｓ，Ｓａｃｈａ ＪＢ，Ｊｅｎｇ ＥＫ，Ｃａｉ Ｗ，Ｗｏｎｇ ＨＣ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ Ｃｏｍｐｌｅｘ，ＡＬＴ−８０３，ｔｏ ＩＬ１５ ａｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１６ Ｊａｎ；４（１）：４９−６０．
40. Ｋｉｍ ＰＳ，Ｋｗｉｌａｓ ＡＲ，Ｘｕ Ｗ，Ａｌｔｅｒ Ｓ，Ｊｅｎｇ ＥＫ，Ｗｏｎｇ ＨＣ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｈｏｄｇｅ ＪＷ．ＩＬ−１５ ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ／ＩＬ−１５ＲαＳｕｓｈｉ−Ｆｃ ｆｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＩＬ−１５ＳＡ／ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｆｃ；ＡＬＴ−８０３）ｍａｒｋｅｄｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＮＫ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｒｉｎｅ ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｍａｒ ２９；７（１３）：１６１３０−４５．
41. Ｆｅｌｉｃｅｓ Ｍ，Ｃｈｕ Ｓ，Ｋｏｄａｌ Ｂ，Ｂｅｎｄｚｉｃｋ Ｌ，Ｒｙａｎ Ｃ，Ｌｅｎｖｉｋ ＡＪ，Ｂｏｙｌａｎ ＫＬＭ，Ｗｏｎｇ ＨＣ，Ｓｋｕｂｉｔｚ ＡＰＮ，Ｍｉｌｌｅｒ ＪＳ，Ｇｅｌｌｅｒ ＭＡ．ＩＬ−１５ ｓｕｐｅｒ−ａｇｏｎｉｓｔ（ＡＬＴ−８０３）ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１７ Ｊｕｎ；１４５（３）：４５３−４６１．
42. Ｒｏｓａｒｉｏ Ｍ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｋｏｎｇ Ｌ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＬＩ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ＳＥ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｈａｎ Ｋ，Ｊｅｎｇ ＥＫ，Ｒｈｏｄｅ ＰＲ，Ｌｅｏｎｇ ＪＷ，Ｓｃｈａｐｐｅ Ｔ，Ｊｅｗｅｌｌ ＢＡ，Ｋｅｐｐｅｌ ＣＲ，Ｓｈａｈ Ｋ，Ｈｅｓｓ Ｂ，Ｒｏｍｅｅ Ｒ，Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ ＤＲ，Ｃａｓｈｅｎ ＡＦ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ ＮＬ，Ｗｏｎｇ ＨＣ，Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ＴＡ．Ｔｈｅ ＩＬ−１５−Ｂａｓｅｄ ＡＬＴ−８０３ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６ Ｆｅｂ １；２２（３）：５９６−６０８．
43. Ｓｅｙａ Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ，Ｈａｒａ Ｔ，Ｈａｔａｎａｋａ Ｍ，Ｍａｓａｏｋａ Ｔ，Ａｋｅｄｏ Ｈ．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ３−ｓｔｅｐ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ，ＣＤ３５（ＣＲ１），ＣＤ４６（ＭＣＰ），ａｎｄ ＣＤ５５（ＤＡＦ），ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｌｅｕｋ Ｌｙｍｐｈｏｍａ．１９９４ Ｆｅｂ；１２（５−６）：３９５−４００．
44. Ｎｉｅｈａｎｓ ＧＡ，Ｃｈｅｒｗｉｔｚ ＤＬ，Ｓｔａｌｅｙ ＮＡ，Ｋｎａｐｐ ＤＪ，Ｄａｌｍａｓｓｏ ＡＰ．Ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｖａｒｉａｂｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＣＤ４６（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ），ＣＤ５５（ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ），ａｎｄ ＣＤ５９（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎ）．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１９９６ Ｊｕｌ；１４９（１）：１２９−４２．
45. Ｄｏｎｉｎ Ｎ，Ｊｕｒｉａｎｚ Ｋ，Ｚｉｐｏｒｅｎ Ｌ，Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｓ，Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ Ｍ，Ｆｉｓｈｅｌｓｏｎ Ｚ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ．Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｆｅｂ；１３１（２）：２５４−６３．
46. Ｈｓｕ ＹＦ，Ａｊｏｎａ Ｄ，Ｃｏｒｒａｌｅｓ Ｌ，Ｌｏｐｅｚ−Ｐｉｃａｚｏ ＪＭ，Ｇｕｒｐｉｄｅ Ａ，Ｍｏｎｔｕｅｎｇａ ＬＭ，Ｐｉｏ Ｒ．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０ Ｊｕｎ ７；９：１３９．
47. Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｅ，Ｋｉｔａｉ Ｙ，Ｋｏｎｄｏ Ｔ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ．Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｊａｎ；１５（１）：８８−９４．
48. Ｄａｖｉｄ ＪＭ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｃ，ＭｃＣａｍｐｂｅｌｌ ＫＫ，Ｇｕｌｌｅｙ ＪＬ，Ｓｃｈｌｏｍ Ｊ，Ｐａｌｅｎａ Ｃ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦ−β Ｔｒａｐ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｍ７８２４）ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｖｅｒｔｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７ Ｊｕｌ １３；６（１０）：ｅ１３４９５８９．
【表1】
【表2】
【表3】
【配列表】
【国際調査報告】