特表 2021-504492 癌治療のための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-504492(P2021-504492A)

(43)【公表日】2021年2月15日

(54)【発明の名称】癌治療のための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20210118BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210118BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210118BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20210118BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20210118BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20210118BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20210118BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210118BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210118BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210118BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210118BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20210118BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   C07K16/28ZNA

   C07K19/00

   C12Q1/02

   A61K38/17

   A61P7/00

   A61P37/04

   A61P43/00 111

   A61P35/00

   A61K47/68

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 Y

   C07K14/705

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】64

(21)【出願番号】特願2020-548872(P2020-548872)

(86)(22)【出願日】2018年11月29日

(85)【翻訳文提出日】2020年7月27日

(86)【国際出願番号】US2018063082

(87)【国際公開番号】WO2019108806

(87)【国際公開日】20190606

(31)【優先権主張番号】62/591,874

(32)【優先日】2017年11月29日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】504384000

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム

(71)【出願人】

【識別番号】520187414

【氏名又は名称】エクスフェノム，リミテッド ライアビリティ カンパニー

【氏名又は名称原語表記】Ｅｘｐｈｅｎｏｍ，ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】ボイトラー，ブルース

(72)【発明者】

【氏名】ナイール‐ギル，エヴァン

(72)【発明者】

【氏名】チョン，シュエ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，ジンレイ

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ピンピン

【テーマコード（参考）】

4B063

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR77

4C076AA95

4C076BB11

4C076CC07

4C076CC14

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA23

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZA511

4C084ZA512

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC411

4C084ZC412

4C084ZC421

4C084ZC422

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA33

4C085BB42

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本開示は、一般に、癌免疫治療のための組成物および方法、ならびに化学療法または照射等の癌処置後の造血回復に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

癌免疫治療用の医薬の製造のための、ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターの使用。

【請求項2】

前記ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターが、リンパ球、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞および細胞毒性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤を増強することによって、癌免疫治療を実現する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

造血回復用の医薬の製造のための、ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターの使用。

【請求項4】

前記ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターが、化学療法および／または放射線療法を受けてきた患者において、全ての造血系列、好ましくはリンパ系列の回復を増強する、請求項３に記載の使用。

【請求項5】

前記ＬＲＰ１０インヒビターが、好ましくはＬＲＰ１０エクトドメインに結合する、抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項6】

前記ＬＲＰ１０コンペティターが、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する操作された可溶性の受容体であり、前記受容体が、内因性ＬＲＰ１０との結合について、競合する（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。

【請求項7】

場合によっては癌免疫治療および／または造血回復に用いられる、
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号６２）：Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（Ｘ１＝Ｎ、Ａ、Ｒ、Ｄ；Ｘ２＝Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｔ）
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号６３）：ＱＱＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（Ｘ３＝Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｔ、Ｎ；Ｘ４＝Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ；Ｘ５＝Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｙ；Ｘ６＝Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｒ、Ｇ；Ｘ７＝Ｔ、Ｎ、Ｌ、Ｇ）
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号６４）：ＳＸ８ＡＭＳ（Ｘ８＝Ｑ、Ｙ）
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号６５）：Ｘ９ＩＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＸ１３Ｘ１４ＴＸ１５ＹＡＤＳＶＫＧ（Ｘ９＝Ｓ、Ｑ、Ｖ；Ｘ１０＝Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｙ；Ｘ１１＝Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１２＝Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｑ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１３＝Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ａ；Ｘ１４＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｘ１５＝Ｋ、Ｔ、Ｙ、Ｅ）
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６６）：Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＦＤＹ（Ｘ１６＝Ｓ、Ｄ、Ｎ；Ｘ１７＝Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｔ；Ｘ１８＝Ｐ、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ａ；Ｘ１９＝Ｓ、Ｋ、Ｔ）
のＣＤＲの１つまたは複数を含む抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３４）：ＮＡＳＤＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３５）：ＡＡＳＰＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３６）：ＲＡＳＲＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３７）：ＡＡＳＡＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３８）：ＤＡＳＬＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３９）：ＡＡＳＴＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４０）：ＱＱＳＳＲＴＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４１）：ＱＱＶＡＲＴＰＮＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４２）：ＱＱＰＴＳＬＰＬＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４３）：ＱＱＡＤＳＹＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４４）：ＱＱＩＫＴＲＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４５）：ＱＱＴＳＡＧＰＧＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４６）：ＱＱＮＤＹＹＰＴＴ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４７）：ＳＱＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４８）：ＳＹＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号４９）：ＱＩＧＴＭＧＲＰＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５０）：ＳＩＳＴＴＧＮＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５１）：ＶＩＱＲＱＧＴＧＴＥＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５２）：ＳＩＰＳＲＧＱＡＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５３）：ＳＩＡＴＴＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５４）：ＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５５）：ＳＩＹＴＳＧＡＡＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５６）：ＳＹＰＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５７）：ＳＧＫＫＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５８）：ＤＡＴＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５９）：ＮＳＲＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６０）：ＳＲＨＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６１）：ＮＴＡＴＦＤＹ
のＣＤＲの１つまたは複数を含む、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項9】

配列番号１、５、７、１１、１５、１９、および２３からなる群から選択されるＶＬ配列、ならびに配列番号２、８、１２、１６、２０、２４、２７、および２９からなる群から選択されるＶＨ配列を含む、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項10】

遊走アッセイで、前記抗体またはそのフラグメントと接触した細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）が、前記抗体またはそのフラグメントと接触していない対照細胞よりも迅速に、走化性刺激に向けて移動し、好ましくは、前記走化性刺激が、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、スフィンゴシン−１−ホスファート（Ｓ１Ｐ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド２（ＣＣＬ２）、および／またはＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）から選択される、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項11】

前記抗体またはそのフラグメントと接触した細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）が、前記抗体またはそのフラグメントと接触していない対照細胞と比較して、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび／またはＰ２１の発現の増大を示す、請求項７に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項12】

競合結合アッセイで、請求項７から１１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントと交差競合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項13】

場合によっては癌免疫治療および／または造血回復に用いられる、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体であって、前記１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドとの結合について内因性ＬＲＰ１０と競合し、好ましくはＬＲＰ１０−Ｆｃキメラである可溶性の受容体。

【請求項14】

請求項７から１１のいずれか１項に記載の抗体もしくはそのフラグメント、または請求項１３に記載の可溶性の受容体、ならびに薬学的に許容されるキャリアを含む、癌免疫治療および／または造血回復のための医薬組成物。

【請求項15】

ＬＲＰ１０インヒビターを同定する方法であって、細胞を試験剤と接触させることを含み、前記試験剤と接触していない対照細胞と比較した、走化性刺激に向かう移動の増大が、前記試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示し、好ましくは、前記走化性刺激が、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、スフィンゴシン−１−ホスファート（Ｓ１Ｐ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド２（ＣＣＬ２）、および／またはＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）から選択される、方法。

【請求項16】

ＬＲＰ１０インヒビターを同定する方法であって、細胞を試験剤と接触させることを含み、前記試験剤と接触していない対照細胞と比較したＦｒｉｚｚｌｅｄおよび／またはｐ２１の発現の増大が、前記試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示す、方法。

【請求項17】

前記試験剤が、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する抗ＬＲＰ１０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）である、請求項１５または１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２９日出願の米国仮特許出願第６２／５９１，８７４号明細書の優先権の利益を主張する。この出願の開示は、その全体が、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【0002】

分野
本開示は、一般に、癌免疫治療のための組成物および方法、ならびに化学療法または照射等の癌処置後の造血回復に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
複数の予防的かつ治療的なアプローチにも拘らず、癌は、世界中で主要な死因の１つである。２０１０〜２０２０年の間で、米国における新しい癌の症例数は、男性で約２４％増大して年間１００万症例を超え、そして女性で約２１％増大して年間９００，０００症例を超えると予想される。最も上昇すると予想される癌の種類は、男性および女性の双方において黒色腫；男性において前立腺癌、腎臓癌、肝臓癌、および膀胱癌；そして女性において肺癌、乳癌、子宮癌、および甲状腺癌である。癌は、米国において２番目に一般的な死因のままであり、死亡の４例にほぼ１例は癌である。多くの癌は、現行のアプローチで処置するのが困難である、または不可能である。多くの癌は、現行の処置レジメンを逃れるか、処置に耐性を示すようになるか、処置の後に再発生する。例えば、癌について最も一般的な全身的処置選択肢の１つである細胞毒性化学療法は、とりわけ固形腫瘍の処置において、効力が限られている。

【0004】

造血回復は、化学療法の転帰に影響を与える重要な因子の１つである。骨髄回復が速いほど、結果が有害となり難く、患者は、化学療法の更なるコースに滞りなく進むことが可能となる。骨髄回復が遅れると、感染が制御できず、処置が失敗する虞がある。化学療法の造血毒性は、処置レジメンについて用量を決定する際の重要な因子である。ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）およびＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ）等の薬物が現在、化学療法後の造血回復を補助するのに用いられている。しかしながら、これらの薬物は、好中球ブースターである。現在、リンパ回復を促進する薬物はない。したがって、化学療法の後に、好ましくはリンパ系細胞を含む全ての造血系列の、造血回復を促進するのに効果的な方法および組成物が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

癌免疫治療のための組成物および方法、ならびに化学療法等の癌処置後の造血回復が本明細書中で提供される。

【0006】

一態様において、癌免疫治療を実現する方法であって、それを必要とする対象において、ＬＲＰ１０を阻害することを含む方法が提供される。一部の実施形態において、前記阻害は、リンパ球、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞および細胞毒性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤を増強することによって、癌免疫治療を実現する。

【0007】

別の態様は、造血回復を増強する方法であって、それを必要とする対象において、ＬＲＰ１０を阻害することを含む方法に関する。種々の実施形態において、前記阻害は、全ての造血系列、好ましくはリンパ系列の回復を増強する。一部の実施形態において、対象は、化学療法および／または放射線療法を受けてきた。

【0008】

種々の実施形態において、本明細書中で開示される方法および使用は、対象に、有効量の抗ＬＲＰ１０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または１つもしくは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）を投与することを含んでもよい。

【0009】

別の態様は、癌免疫治療用の医薬の製造のための、ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターの使用に関する。一部の実施形態において、前記ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターは、リンパ球、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞および細胞毒性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤を増強することによって、癌免疫治療を実現する。

【0010】

更なる態様は、造血回復用の医薬の製造のための、ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターの使用に関する。一部の実施形態において、前記ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターは、化学療法および／または放射線療法を受けてきた患者において、全ての造血系列、好ましくはリンパ系列の回復を増強する。

【0011】

特定の実施形態において、前記ＬＲＰ１０インヒビターは、好ましくはＬＲＰ１０エクトドメインに結合する、抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態において、前記ＬＲＰ１０コンペティターは、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する操作された可溶性の受容体であり、前記受容体は、内因性ＬＲＰ１０との結合について、競合する（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）。

【0012】

場合によっては癌免疫治療および／または造血回復に用いられる、
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号６２）：Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（Ｘ１＝Ｎ、Ａ、Ｒ、Ｄ；Ｘ２＝Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｔ）
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号６３）：ＱＱＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（Ｘ３＝Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｔ、Ｎ；Ｘ４＝Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ；Ｘ５＝Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｙ；Ｘ６＝Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｒ、Ｇ；Ｘ７＝Ｔ、Ｎ、Ｌ、Ｇ）
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号６４）：ＳＸ８ＡＭＳ（Ｘ８＝Ｑ、Ｙ）
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号６５）：Ｘ９ＩＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＸ１３Ｘ１４ＴＸ１５ＹＡＤＳＶＫＧ（Ｘ９＝Ｓ、Ｑ、Ｖ；Ｘ１０＝Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｙ；Ｘ１１＝Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１２＝Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｑ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１３＝Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ａ；Ｘ１４＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｘ１５＝Ｋ、Ｔ、Ｙ、Ｅ）
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６６）：Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＦＤＹ（Ｘ１６＝Ｓ、Ｄ、Ｎ；Ｘ１７＝Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｔ；Ｘ１８＝Ｐ、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ａ；Ｘ１９＝Ｓ、Ｋ、Ｔ）
のＣＤＲの１つまたは複数を含む抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントも本明細書中で開示される。

【0013】

一部の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３４）：ＮＡＳＤＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３５）：ＡＡＳＰＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３６）：ＲＡＳＲＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３７）：ＡＡＳＡＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３８）：ＤＡＳＬＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３９）：ＡＡＳＴＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４０）：ＱＱＳＳＲＴＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４１）：ＱＱＶＡＲＴＰＮＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４２）：ＱＱＰＴＳＬＰＬＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４３）：ＱＱＡＤＳＹＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４４）：ＱＱＩＫＴＲＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４５）：ＱＱＴＳＡＧＰＧＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４６）：ＱＱＮＤＹＹＰＴＴ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４７）：ＳＱＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４８）：ＳＹＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号４９）：ＱＩＧＴＭＧＲＰＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５０）：ＳＩＳＴＴＧＮＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５１）：ＶＩＱＲＱＧＴＧＴＥＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５２）：ＳＩＰＳＲＧＱＡＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５３）：ＳＩＡＴＴＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５４）：ＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５５）：ＳＩＹＴＳＧＡＡＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５６）：ＳＹＰＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５７）：ＳＧＫＫＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５８）：ＤＡＴＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５９）：ＮＳＲＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６０）：ＳＲＨＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６１）：ＮＴＡＴＦＤＹ
のＣＤＲの１つまたは複数を含んでよい。

【0014】

一部の実施形態において、抗体またはそのフラグメントは、配列番号１、５、７、１１、１５、１９、および２３からなる群から選択されるＶＬ配列、ならびに配列番号２、８、１２、１６、２０、２４、２７、および２９からなる群から選択されるＶＨ配列を有してよい。

【0015】

更なる態様は、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体に関し、前記可溶性の受容体は、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドとの結合について、内因性ＬＲＰ１０と競合する。一部の実施形態において、可溶性の受容体は、ＬＲＰ１０−Ｆｃキメラである。

【0016】

一部の実施形態において、遊走アッセイで、抗体もしくはそのフラグメント、または１つもしく複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）と接触した細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）は、抗体もしくはそのフラグメント、または可溶性の受容体と接触していない対照細胞よりも迅速に、走化性刺激に向けて移動し、好ましくは、走化性刺激は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、スフィンゴシン−１−ホスファート（Ｓ１Ｐ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド２（ＣＣＬ２）、および／またはＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）から選択される。

【0017】

特定の実施形態において、抗体もしくはそのフラグメント、または１つもしくは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）と接触した細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）は、抗体もしくはそのフラグメント、または可溶性の受容体と接触していない対照細胞と比較して、Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび／またはＰ２１の発現の増大を示す。

【0018】

本明細書中で開示される抗体もしくはそのフラグメント、および／または１つもしくは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）、ならびに薬学的に許容されるキャリアを含む、癌免疫治療および／または造血回復のための医薬組成物も本明細書中で提供される。また、癌免疫治療および／または造血回復用の医薬の製造のための、本明細書中で開示される抗体もしくはそのフラグメント、および／または１つもしくは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）の使用が提供される。

【0019】

また、ＬＲＰ１０インヒビターを同定する方法であって、細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）を試験剤と接触させることを含み、試験剤と接触していない対照細胞と比較した、走化性刺激に向かう移動の増大が、試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示し、好ましくは、走化性刺激は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、スフィンゴシン−１−ホスファート（Ｓ１Ｐ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド２（ＣＣＬ２）、および／またはＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）から選択される、方法が提供される。一部の実施形態において、試験剤は、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）である。

【0020】

また、ＬＲＰ１０インヒビターを同定する別の方法であって、細胞（例えば、造血幹細胞またはＴ細胞）を試験剤と接触させることを含み、試験剤と接触していない対照細胞と比較したｐ２１の発現の増大が、試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示す、方法が提供される。一部の実施形態において、試験剤は、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに対する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または可溶性の受容体（例えばＬＲＰ１０−Ｆｃキメラ）である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．１）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）由来の骨髄細胞、または１：１の混合物の、照射されたＲａｇ２^−／−レシピエントマウス中への移植を示す概略図である。

【図2】照射された移植後Ｒａｇ２^−／−マウスにおけるドナーキメラ（ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の１：１の混合物）由来の末梢血中のＴ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞のフローサイトメトリの結果を示す図である。

【図3】照射された移植後Ｒａｇ２^−／−マウスにおけるドナーキメラ（ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の１：１の混合物）由来の末梢血中の様々なリンパ球集団（Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞）のパーセンテージを示す図であり、ｃｈｏｗｍｅｉｎホモ接合体が、造血幹細胞の競合能の増大を提示することを示唆している。

【図4】照射された移植後Ｒａｇ２^−／−マウスにおけるドナーキメラ（ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２の１：１の混合物）由来の末梢血中の様々な骨髄集団（マクロファージおよび好中球細胞）のパーセンテージを示す図であり、ｃｈｏｗｍｅｉｎホモ接合体が、造血幹細胞の競合能の増大を提示することを示唆している。

【図5】走化性アッセイにおいて、Ｌｒｐ１０^−／−末梢Ｔリンパ球（クリアな円）が、Ｌｒｐ１０^＋／＋（黒い円）よりも高速で移動することを示す図である。

【図6】Ｌｒｐ１０^−／−Ｔ細胞および造血前駆体における、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＰ２１の、Ｌｒｐ１０^＋／＋細胞よりも有意に増大した発現を示す図である。

【図7】Ｌｒｐ１０^−／−ホモ接合体が、ＣＤ４ Ｔ細胞およびＣＤ８ Ｔ細胞のより高い割合を示したことを示す図である。

【図8】黒色腫増殖が、Ｌｒｐ１０を欠くマウスにおいて遅延または抑制されていることを示す図である。

【図9】黒色腫Ｂ１６細胞でチャレンジされたＬｒｐ１０^−／−ホモ接合体が、血中でより高い活性のＣＤ８＋ Ｔ細胞を示したことを示す図である。

【図10】９つの抗体の発現および精製を示す図である。

【図11】ＬＲＰ１０に結合する抗体のＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の結果を示す図である。

【図12】ヒト抗Ｌｒｐ１０モノクローナル抗体が、マウスＴ細胞中でｐ２１を活性化することができることを示す図である。

【図13】ＡＢ２およびＡＢ７の双方が、ＳＤＦ１２に応答してＴ細胞移動を増強することを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

詳細な説明
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は双方とも、例示的かつ説明的なものであるにすぎず、本開示の組成物および方法の制限ではないことが理解されるべきである。

【0023】

ＬＲＰ１０の阻害、化学療法もしくは照射後の対象における造血回復の増強、および／または癌免疫治療の向上に関連する組成物および方法、ならびにそのような方法に用いることができるキットが本明細書中で開示される。本開示の一態様は、Ｌｒｐ１０内の突然変異またはＬｒｐ１０のノックアウトが、造血回復の速度の上昇によって特徴付けられる表現型を、そして、混合キメラの場合には、突然変異細胞が野生型（ＷＴ）細胞に、競合において勝るという驚くべき発見に関する。したがって、例えば化学療法または照射の後に、ＬＲＰ１０のインヒビター、例えば抗体を用いて、対象において造血回復を促進することができる。また、理論によって拘束されることを望むものではないが、ＬＲＰ１０阻害は、チェックポイント阻害と同等であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、普通よりも効果的に腫瘍に浸潤することを可能し得ると考えられる。したがって、ＬＲＰ１０阻害はまた、癌の免疫治療処置を（例えば、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の数を増大させることによって）増大させるのに用いることもできる。

【0024】

ＬＲＰ１０は、以前に機能が知られていない単一の血漿膜貫通受容体である。予想外にも、Ｌｒｐ１０ ＫＯ Ｔ細胞は、ＷＴ細胞よりも迅速に、走化性刺激に向かって移動する。さらに、Ｌｒｐ１０ ＫＯ Ｔ細胞は、Ｆｉｚｚｌｅｄおよびｐ２１（ｐ２１は、非標準的な（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔシグナリング経路の最終生成物である）の高い発現を示す。一部の実施形態において、走化性遊走アッセイで、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ発現および／またはｐ２１発現は、ＬＲＰ１０のインヒビターのスクリーニングにおいて、マーカーとして用いることができる。

【0025】

したがって、ＬＲＰ１０インヒビター、例えば本明細書中で開示される抗体および可溶性の受容体は、化学療法または照射の後に造血回復を向上させること、かつ／または癌免疫治療を向上させることによって、対象を処置するのに用いることができる。

【0026】

定義
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語を、ここに集める。別段の定めがない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、一般的に、本開示が属する技術の当業者が理解するのと同じ意味を有する。

【0027】

本明細書中で用いられる以下の用語およびフレーズは、以下の意味を有することが意図される。

【0028】

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の目的のうちの１つに、または複数（すなわち、少なくとも１つ）に言及するために、本明細書中で用いられる。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

【0029】

本明細書中で用いられる用語「約」は、明示される値の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内の許容可能な変動を意味する。

【0030】

「Ｌｒｐ１０」および「ＬＲＰ１０」（ＬＲＰ９、ＬＲＰ−１０、ＭＳＴ０８７、またはＭＳＴＰ０８７としても知られている）は、互換的に用いられ、そしてＬＤＬ受容体関連タンパク質１０を指し、「Ｌｒｐ１０」は、通常、特に明記しない限り、遺伝子またはｍＲＮＡ、およびタンパク質生成物「ＬＲＰ１０」を指す。当該用語は、完全な遺伝子、ｃＤＮＡ配列、完全なアミノ酸配列、またはそれらのあらゆるフラグメントもしくは変異体を含むことを理解すべきである。一部の実施形態において、ＬＲＰ１０は、ヒトＬＲＰ１０である。

【0031】

本明細書中で用いられる用語「ＬＲＰ１０インヒビター」は、ＬＲＰ１０活性を阻害し、下方調節し、抑制し、または下方制御する治療剤を含むことが意図される。当該用語は、化合物、例えば小分子インヒビターおよび生物剤（例えば抗体）、干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、可溶性アンタゴニスト、遺伝子編集／サイレンシングツール（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ）等を含むことが意図される。

【0032】

「抗ＬＲＰ１０抗体」は、ＬＲＰ１０（例えば、その細胞外ドメイン）に免疫特異的に結合する抗体である。抗体は、単離された抗体であってもよい。ＬＲＰ１０へのそのような結合は、値が、例えば、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、または５０ｎＭ以下であるＫｄを示す。Ｋｄは、当業者に知られているあらゆる方法によって測定することができ、例えば表面プラスモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイがある。抗ＬＲＰ１０抗体は、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントであってもよい。例示的な抗ＬＲＰ１０抗体は、ＬＲＰ１０の、そのリガンド（例えば内因性リガンド）との結合を阻害してもよい。

【0033】

本明細書中で用いられる「抗体」は、標的エピトープに結合する結合ドメインを含む１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質である。用語抗体は、免疫グロブリン重鎖分子および軽鎖分子を含むモノクローナル抗体、単重鎖可変ドメイン抗体、ならびにそれらの変異体および誘導体（モノクローナル抗体および単重鎖可変ドメイン抗体のキメラ変異体が挙げられる）を含む。結合ドメインは、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされ、タンパク質は、抗原に免疫特異的に結合する。認識されている免疫グロブリン遺伝子として、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは順番に、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ定義する。種としてヒトおよびマウスが挙げられるほとんどの脊椎動物について、典型的な免疫グロブリン構造ユニットは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成されるテトラマーを含み、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。「ＶＬ」および「ＶＨ」は、これらの軽鎖および重鎖の可変ドメインをそれぞれ指す。「ＣＬ」および「Ｃ_Ｈ」は、軽鎖および重鎖の定常ドメインを指す。β鎖のループ（ＶＬおよびＶＨ上にそれぞれ３つ）が、抗原への結合を担っており、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。「Ｆａｂ」（フラグメント、抗原結合）領域は、抗体の各重鎖および軽鎖由来の１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン、すなわちＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１を含む。

【0034】

抗体として、無傷の免疫グロブリンおよびその抗原結合フラグメントが挙げられる。用語「抗原結合フラグメント」は、抗原に結合し、または抗原結合（すなわち、特異的結合）について無傷の抗体と（すなわち、フラグメントが由来する無傷の抗体と）競合する抗体のポリペプチドフラグメントを指す。抗原結合フラグメントは、当該技術において周知である組換え方法または生化学的方法によって生成することができる。例示的な抗原結合フラグメントとして、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ＣＤＲ、パラトープ、およびＶｎ鎖およびＶＬ鎖が、連続ポリペプチドを形成するように互いに（直接的に、またはペプチドリンカーを介して）結合されている単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。

【0035】

重鎖抗体として知られている別のクラスの抗体（ＨＣＡ、２本鎖抗体または２本鎖重鎖抗体とも呼ばれる）が、ラクダ科の動物、例えば、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、野生フタコブラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、およびグアナコにおいて報告されている（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６３，４４６−４４８（１９９３）；Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）１９８：１５７−１７４；また、米国特許第５，７５９，８０８号明細書；米国特許第５，８００，９８８号明細書；米国特許第５，８４０，５２６号明細書；および米国特許第５，８７４，５４１号明細書を参照）。ＩｇＧ型の従来の４本鎖免疫グロブリン（ラクダ科の動物によっても生成される）と比較して、これらの抗体は、従来の免疫グロブリンの軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠いており、そしてそれらの可変ドメインは、時折、「ＶＨＨ」と称される。ＶＨＨは、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含んでよい。フレームワーク領域は、３つのＣＤＲ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３によって中断される。これらの天然に存在する重鎖抗体の顕著な特徴の１つは、ＶＨＨのＶＬ界面位置４４、４５、および４７（Ｒａｂａｔナンバリング）のそれぞれＧｌｕ、Ａｒｇ、およびＧｌｙの支配的な存在である。従来の４本鎖抗体のＶＨ内の同位置は、ほぼ排他的に、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、およびＴｒｐによって占められる。これらの差異は、従来の４本鎖抗体のＶＨドメインの関連する不溶性と比較して、ラクダ科の動物のＨＣＡ可変ドメイン（ＶＨＨ）の高い可溶性および安定性を担うと考えられる。ラクダ科の動物のＶＨＨドメインの２つのより顕著な特徴は、その比較的長いＣＤＲ３、およびＣＤＲ内でのシステイン対の高い出現率である。システイン対は、ジスルフィド架橋の形成を媒介するので、抗体結合部位の表面トポロジーの調節に関与するようである。ラクダのｓｄＡｂ−リゾチーム複合体の結晶構造において、ｓｄＡｂから突出し、かつＣＤＲジスルフィド結合によって部分的に安定化された堅いループが、結合部位から延びて、リゾチーム活性部位中に深く侵入する（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３，８０３−８１１（１９９６））。

【0036】

また、抗体として、変異体、キメラ抗体、およびヒト化抗体が挙げられる。本明細書中で用いられる用語「抗体変異体」は、重鎖および／または軽鎖内の単一または複数の突然変異を有する抗体を指す。一部の実施形態において、突然変異は、可変領域内に存在する。一部の実施形態において、突然変異は、定常領域内に存在する。「キメラ抗体」は、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部分が、特定の種に由来する、または特定のクラスに属する抗体内の対応する配列に相同である一方、鎖の残りのセグメントが、別のものにおける対応する配列に相同である抗体を指す。典型的には、当該キメラ抗体において、軽鎖および重鎖の双方の可変領域は、哺乳動物の１種に由来する抗体の可変領域を模倣する一方、定常部分は、別のものに由来する抗体内の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と併用で、好都合にも可変領域を、例えば非ヒト宿主生物由来の容易に利用可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を使用して現在知られている源から由来させ得ることである。可変領域は、調製の容易さの利点を有し、そして特異性は、その源によって影響されない一方、ヒトの定常領域は、非ヒト源由来の定常領域よりも、抗体が導入された場合に、ヒト対象由来の免疫応答を誘発する可能性が低い。しかしながら、定義は、この特定の例に限られない。「ヒト化」抗体は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位、ならびに、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく、分子の残りの免疫グロブリン構造を有する分子に言及する。抗原結合部位は、定常ドメイン上に融合した完全な可変ドメイン、または可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上にグラフトされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型であってもよいし、１つまたは複数のアミノ酸置換によって修飾されていてもよく、例えば、ヒト免疫グロブリンにより密接に似るように修飾されてもよい。ヒト化抗体の一部の形態は、全てのＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体由来の６つ全てのＣＤＲを含有するヒト化マウス抗体）を保存する。ヒト化抗体の他の形態は、１つまたは複数（１、２、３、４、５、または６つ）のＣＤＲを有し、これらは、元の抗体に対して変更されており、１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも呼ばれる。

【0037】

本明細書中に記載される、ＶＨＨが挙げられる抗体のアミノ酸残基は、Ｒａｂａｔの一般的なナンバリングに従って番号を付けられてよい（Ｒａｂａｔ， ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。

【0038】

ＶＨＨ等の抗体と、標的としてのＬＲＰ１０のエピトープとの間の結合の文脈において本明細書中で用いられる用語「結合」は、分子間での非共有結合性の相互作用のプロセスに言及する。好ましくは、前記結合は、特異的である。抗体の特異性は、親和性に基づいて判定することができる。特異的な抗体は、そのエピトープに対する結合親和性または解離定数Ｋｄが、１０^−７Ｍ未満、好ましくは１０^−８Ｍ未満であり得る。

【0039】

用語「親和性」は、抗体の結合ドメインとエピトープとの間の結合反応の強度に言及する。これは、結合ドメインとエピトープとの間で作用する引力および斥力の合計である。本明細書中で用いられる用語親和性は、解離定数Ｋｄを指す。

【0040】

用語「抗原」は、抗体等の選択的結合剤が結合することができ、そして加えて、動物において用いられて、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生成することができる分子または分子の一部を指す。抗原は、１つまたは複数のエピトープを有してもよい。

【0041】

用語「癌」は、宿主自身の細胞の無制御の、異常な増殖に広く言及し、これが、宿主において、周囲組織の、そして異常な細胞増殖の最初の部位に遠位の潜在的な組織の侵入の原因となる。主要なクラスとして、上皮組織（例えば、皮膚、扁平上皮細胞）の癌である癌腫；結合組織（例えば、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管その他）の癌である肉腫；血液形成組織（例えば骨髄組織）の癌である白血病；免疫細胞の癌であるリンパ腫および骨髄腫；ならびに脳および脊髄組織由来の癌が挙げられる中枢神経系の癌が挙げられる。「癌」、「新生物」、および「腫瘍」は、本明細書中で互換的に用いられる。本明細書中で用いられる「癌」は、白血病、癌腫、および肉腫が挙げられる全ての種類の癌、新生物、または悪性腫瘍を指し、新しいか再発かに拘らない。癌の具体例として、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合型の腫瘍がある。癌の限定されない例として、脳、黒色腫、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞性肺、中皮腫、卵巣、前立腺、肉腫、胃、子宮、および髄芽腫の新しい癌または再発した癌がある。

【0042】

用語「細胞の増強」または「免疫治療の増強」は、環境内での細胞の流入または細胞の増殖に広く言及し、当該細胞は、組成物の投与前の環境において実質的に存在せず、かつ組成物それ自体の中に存在しない。環境を増強する細胞として、免疫細胞、間質細胞、細菌細胞、および真菌細胞が挙げられる。特に注目する環境は、癌細胞が属する、または位置する微環境である。一部の例において、微環境は、腫瘍微環境または腫瘍排出リンパ節である。他の例において、微環境は、前癌性組織部位、組成物の局所投与の部位、または組成物が、遠く離れた投与の後に蓄積することとなる部位である。

【0043】

用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる、あらゆる決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子を含む。特定の実施形態において、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル等の分子の化学的に活性な表面基（ｓｕｒｆａｃｅ ｇｒｏｕｐｉｎｇ）が挙げられ、そして特定の実施形態において、特異的な三次元構造特性および／または特異的な電荷特性を有してもよい。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。特定の実施形態において、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合混合物内の標的抗原を選択的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。エピトープマッピング方法が、当該技術において周知であり、例えば、Ｘ線共結晶解析、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング、部位特異的突然変異誘発、高スループット突然変異誘発マッピング、および水素−重水素交換がある。

【0044】

エピトープに結合する抗体上の部位は、「パラトープ」と呼ばれ、これは典型的に、一旦結合すると、エピトープに近接するアミノ酸残基を含む。Ｓｅｌａ−Ｃｕｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；４：３０２を参照。

【0045】

「免疫組織化学」または「ＩＨＣ」は、組織切片の細胞内で抗原を検出して、生物組織内で、対象とする抗原を免疫特異的に認識する抗体の結合および以降の検出を可能にするプロセスを指す。ＩＨＣ技術のレビューについて、例えば、Ｒａｍｏｓ−Ｖａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｊａｎｕａｒｙ ２０１４ ｖｏｌ．５１ ｎｏ．１，４２−８７（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。ＩＨＣの結果を評価するために、様々な質的スコアリングシステムおよび半定量的スコアリングシステムが開発されてきた。例えば、Ｆｅｄｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１４；９：２２１（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。一例が、Ｈ−スコアであり、細胞のパーセンテージの、染色強度の序数値との乗算の結果を加えることによって求められ（「シグナルなし」について０から、「強いシグナル」について３にまでスコア化される）、３００の値が考えられる。

【0046】

「免疫特異的」または「免疫特異的に」（時折「特異的に」と互換的に用いられる）は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされるドメインを介して、対象とするタンパク質の１つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原分子の混合集団を含有するサンプル内で他の分子を実質的に認識せず、かつこれに結合しない抗体に言及する。典型的には、抗体は、同種抗原に免疫特異的に結合し、Ｋ_ｄが、表面プラスモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイによって測定されて５０ｎＭ以下の値である。そのようなアッセイの使用は、当該技術において周知である。

【0047】

用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介免疫応答および／またはＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答として、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞毒性が挙げられる。また、用語免疫応答は、例えば、サイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの抗体産生（液性応答）および活性化といった、Ｔ細胞活性化によって間接的にもたらされる免疫応答が挙げられる。

【0048】

「免疫治療」は、癌を処置するために対象の免疫系を用いる処置であり、例えば、固有の免疫治療、腫瘍浸潤リンパ球（「ＴＩＬ」）の養子移入、活性特異的免疫治療（「ＡＳＴ」）、養子細胞免疫治療（「ＡＣＴ」）、養子免疫治療、癌抗原免疫治療（「ＣＡＴ」）、サイトカイン発現癌免疫治療、モノクローナル抗体、治療癌ワクチン、腫瘍溶解性ウイルス免疫治療、養子Ｔ細胞移入、サイトカイン免疫治療、アジュバント免疫治療が挙げられる。

【0049】

用語「免疫療法剤」は、対象において腫瘍または癌に対して免疫応答を生じさせるように宿主免疫系を刺激することができるあらゆる分子、ペプチド、抗体、または他の剤を含むことができる。種々の免疫療法剤が、本明細書中に記載される組成物および方法に有用である。

【0050】

用語「交差競合する」、「交差競合」、「交差ブロックする」、「交差ブロックされた」、および「交差ブロッキング」は、本明細書中で互換的に用いられて、抗体またはそのフラグメントの、標的ＬＲＰ１０への直接的な、または本開示の抗ＬＲＰ１０抗体のアロステリック調節を介した間接的な結合に干渉する能力を意味する。抗体またはそのフラグメントが、標的への別のものの結合に干渉することができる程度、そして従って、本開示に従って交差ブロックまたは交差競合すると言えるかは、競合結合アッセイを用いて判定することができる。特に適切な一定量的交差競合アッセイは、標識された（例えば、Ｈｉｓタグ付けされた、ビオチン化された、または放射性標識された）抗体またはそのフラグメントと、標的への結合に関する他の抗体またはそのフラグメントとの競合を測定するためのＦＡＣＳ−またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベースのアプローチを用いる。一般に、交差競合抗体またはそのフラグメントは、例えば、交差競合アッセイにおいて、アッセイ中に、そして第２の抗体またはそのフラグメントの存在下で、本開示に従う免疫グロブリン単可変ドメインまたはポリペプチドの記録される置換が、所定の量で存在する、試験される潜在的交差ブロッキング抗体またはそのフラグメントによる理論上の最大置換（例えば、交差ブロックされるのに必要なコールド（例えば、非標識）抗体またはそのフラグメントによる置換）の（例えば、ＦＡＣＳベースの競合アッセイにおいて）最大１００％であるように、標的と結合することができるものである。好ましくは、交差競合抗体またはそのフラグメントは、記録される置換が、１０％〜１００％、より好ましくは５０％〜１００％である。

【0051】

本明細書中で互換的に用いられる用語「抑制する」、「抑制」、「阻害する」、「阻害」、「中和する」、および「中和している」は、活性の完全なブロッキングが挙げられる、生物活性（例えば、ＬＲＰ１０活性または腫瘍細胞増殖）の統計学的に有意なあらゆる低下を指す。例えば、「阻害」は、生物活性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低下を指し得る。

【0052】

用語「対象」または「患者」は、予防的または治療的な処置を受けるヒトまたは他の哺乳動物を含む。

【0053】

本明細書中で用いられる用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、治療的または予防的な措置を指し、例えば本明細書中に記載されるものがある。「処置」の方法は、本明細書中で提供されるＬＲＰ１０インヒビターの、患者、例えば癌を抱える患者への、癌または再発した癌を予防し、治療し、遅延させ、重症度を引き下げ、または１つもしくは複数の病徴を改善するための、あるいはそのような処置がない場合に予想されるよりも患者の生存期間を長引かせるための投与を使用する。また、「処置」の方法は、本明細書中で提供されるＬＲＰ１０インヒビター（例えば抗体）の、患者への、化学療法もしくは照射の後に造血回復を増強するための、かつ／またはそのような処置がない場合に予想されるよりも患者において癌免疫治療を向上させるための投与を使用する。

【0054】

本明細書中で用いられる用語「有効量」は、化学療法もしくは照射の後に対象において造血回復を促進するのに、かつ／または、患者に投与された場合に、癌の処置（例えば免疫治療）、予後、もしくは診断を達成するのに十分である剤、例えばＬＲＰ１０インヒビター、例えば抗ＬＲＰ１０抗体の量を指す。治療的に有効な量は、当業者によって容易に判定され得る、処置されることとなる患者および疾患症状、患者の体重および年齢、疾患症状の重症度、投与の様式等に応じて変わることとなる。投与用の投薬量は、例えば、本明細書中で提供される抗体またはその抗原結合部分の約１ｎｇ〜約１０，０００ｍｇ、約５ｎｇ〜約９，５００ｍｇ、約１０ｎｇ〜約９，０００ｍｇ、約２０ｎｇ〜約８，５００ｍｇ、約３０ｎｇ〜約７，５００ｍｇ、約４０ｎｇ〜約７，０００ｍｇ、約５０ｎｇ〜約６，５００ｍｇ、約１００ｎｇ〜約６，０００ｍｇ、約２００ｎｇ〜約５，５００ｍｇ、約３００ｎｇ〜約５，０００ｍｇ、約４００ｎｇ〜約４，５００ｍｇ、約５００ｎｇ〜約４，０００ｍｇ、約１μｇ〜約３，５００ｍｇ、約５μｇ〜約３，０００ｍｇ、約１０μｇ〜約２，６００ｍｇ、約２０μｇ〜約２，５７５ｍｇ、約３０μｇ〜約２，５５０ｍｇ、約４０μｇ〜約２，５００ｍｇ、約５０μｇ〜約２，４７５ｍｇ、約１００μｇ〜約２，４５０ｍｇ、約２００μｇ〜約２，４２５ｍｇ、約３００μｇ〜約２，０００、約４００μｇ〜約１，１７５ｍｇ、約５００μｇ〜約１，１５０ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１，１２５ｍｇ、約１ｍｇ〜約１，１００ｍｇ、約１．２５ｍｇ〜約１，０７５ｍｇ、約１．５ｍｇ〜約１，０５０ｍｇ、約２．０ｍｇ〜約１，０２５ｍｇ、約２．５ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、約３．０ｍｇ〜約９７５ｍｇ、約３．５ｍｇ〜約９５０ｍｇ、約４．０ｍｇ〜約９２５ｍｇ、約４．５ｍｇ〜約９００ｍｇ、約５ｍｇ〜約８７５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約８５０ｍｇ、約２０ｍｇ〜約８２５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約８００ｍｇ、約４０ｍｇ〜約７７５ｍｇ、約５０ｍｇ〜約７５０ｍｇ、約１００ｍｇ〜約７２５ｍｇ、約２００ｍｇ〜約７００ｍｇ、約３００ｍｇ〜約６７５ｍｇ、約４００ｍｇ〜約６５０ｍｇ、約５００ｍｇ、または約５２５ｍｇ〜約６２５ｍｇに及び得る。投薬は、例えば、毎週、２週毎、３週毎、４週毎、５週毎、または６週毎であってもよい。投薬レジメンは、最適な治療応答を実現するように調整されてよい。また、有効量は、剤のあらゆる有毒作用または有害作用（副作用）が最小にされ、かつ／または有益な作用を上回るものである。投与は静脈内に、正確に、あるいはおおよそ、毎週６ｍｇ／ｋｇもしくは１２ｍｇ／ｋｇ、または隔週で１２ｍｇ／ｋｇもしくは２４ｍｇ／ｋｇであってもよい。更なる投薬レジメンが、以下に記載される。

【0055】

本明細書中で用いられる組換え核酸技術、細菌学、免疫学、抗体工学、ならびに分子生物学および細胞生物学の分野で用いられる他の用語は、通常、該当する技術の当業者によって理解されるであろう。例えば、組換えＤＮＡを調製し、オリゴヌクレオチド合成を実行し、かつ組織培養およびトランスフォーメーション（例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクション、またはリポフェクション）を実行する従来の技術が用いられてもよい。酵素反応および精製技術は、メーカーの仕様書に従って、または当該技術において一般的に達成されるように、もしくは本明細書中に記載されるように、実行されてもよい。前述の技術および手順は、通常、当該技術において周知の、そして本明細書の全体を通して引用され、かつ考察される種々の一般的な、そしてより具体的な参考文献に記載される従来の方法に従って、実行されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる）を参照。具体的な定義が示されない限り、本明細書中に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および薬化学と関連して利用される命名法、ならびにそれらのラボの手順および技術は、当該技術において周知であり、かつ一般的に使用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置に用いられてもよい。

【0056】

本明細書中で用いられる用語「含んでいる」または「含む」は、所定の実施形態において存在するが、指定されていない要素の包含に対してオープンである組成物、方法、およびそれらの各構成要素に関して用いられる。

【0057】

本明細書中で用いられる用語「から本質的になる」は、所定の実施形態に必要とされる要素を指す。当該用語は、本開示の実施形態の基本的かつ新規な、または機能的な特性に物質的に影響を与えない付加的な要素の存在を容認する。

【0058】

用語「からなる」は、本明細書中に記載される組成物、方法、およびそれらの各構成要素に言及し、これらは、実施形態の説明において列挙されていないいかなる要素も除く。

【0059】

本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照を含む。ゆえに、例えば、「方法」への言及は、本明細書中に記載されるタイプの１つまたは複数の方法および／もしくは工程、ならびに／または本開示その他を読めば直ぐに当業者に明らかとなろうものを含む。

【0060】

種々の態様および実施形態が、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。

【0061】

ＬＲＰ１０
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、体内でのリポタンパク質代謝を媒介する細胞表面受容体である。ヒトにおいて、ＬＤＬＲ遺伝子は、第１９染色体上にバンド１９ｐ１３．２にて存在し、１８個のエキソンに分けられる。ＬＤＬＲ遺伝子の遺伝的欠乏は、家族性高コレステロール血症（ヒトにおいて最も一般的な遺伝的疾患の１つ）を生じさせる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，ｓｉｘｔｈ ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ．１２１５−１２５０）。ＬＤＬＲ遺伝子は、５つの官能ドメイン、複数のシステインリッチリピートで構成されるリガンド結合ドメイン、β−プロペラ構造を形成する配列Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（ＹＷＴＤ）を有する上皮成長因子（ＥＧＦ）前駆体相同性ドメイン、Ｏ結合型糖ドメイン、膜貫通ドメイン、およびコーティングされたｐｉｔ標的化シグナル（ｃｏａｔｅｄ ｐｉｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）を有する細胞質ドメインからなる単一の膜貫通タンパク質をコードする（Ｈ．Ｔｏｌｌｅｓｈａｕｇ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３０（１９８２），ｐｐ．７１５−７２４）。ＬＤＬＲに加えて、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬＲ）、アポリポタンパク質Ｅ受容体２（ＡｐｏＥＲ２、ＬＲＰ８としても知られている）、ＬＤＬＲ関連タンパク質−１（ＬＲＰ１、ＣＤ９１、またはα２マクログロブリン受容体、α２ｍＲとしても知られている）、ＬＲＰ２（メガリンまたは糖タンパク質３３０、ＧＰ３３０としても知られている）、ＬＲＰ３（ＳＴ７およびＬＲＰ９にかなり似ている）、ＬＲＰ４（コリンとしても知られている）、ＬＲＰ５（ＬＲＰ７としても知られている）、ＬＲＰ６（ＡＤＣＡＤ２またはＳＴＨＡＧ７としても知られている）、ＬＲＰ１０（ＬＲＰ９、ＬＲＰ−１０、ＭＳＴ０８７、またはＭＳＴＰ０８７としても知られている）、およびＬＲ１１（ｓｏｒＬＡとしても知られている）の受容体は、哺乳動物において、ＬＤＬＲ遺伝子ファミリーの一部であると考えられる（Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ Ｊａｎ １；３９１（１）：１１１０−５）。ほとんどのＬＤＬＲ遺伝子ファミリーは、ＬＤＬＲに構造的に類似するので、このファミリーのほとんどのメンバーが、リポタンパク質代謝において主要な役割を果たすと考えられてきた。ＬＤＬＲ遺伝子ファミリーについての他の役割は、（１）ＶＬＤＬＲおよびＡｐｏＥＲ２が、細胞外リーリンシグナルを移動ニューロン（ｍｉｇｒａｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎ）に送信し、これは、胚脳発達中の脳のニューロンレイヤリングを支配する（Ｔｒｏｍｍｓｄｏｒｆｆ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９７（１９９９），ｐｐ．６８９−７０１）、（２）ＬＲＰ１は、ウイルスおよび毒素の細胞エントリを調節し、そして、血小板由来の成長因子受容体−βシグナリングを血管壁内で調節することによって、アテローム性動脈硬化症から保護する（Ｈｅｒｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，１５（２００４），ｐｐ．１７５−１８１）、（３）ＬＲＰ２は、いくつかの細胞外シグナリング分子、例えば、ビタミンＤ、ビタミンＡ、および性ステロイドの可用性を媒介するエンドサイトーシス受容体として作用する（Ｈａｍｍｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２２（２００５），ｐｐ．７５１−７６２）、（４）ＬＲＰ３は、β−ＶＬＤＬの細胞吸収を調節する、（５）ＬＲＰ４は、タイプＩＩ膜貫通セリンプロテアーゼとして、そして血圧を調節する前心房性ナトリウム利尿ペプチド変換酵素として役立つ（Ｙａｎ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７（２０００），ｐｐ．８５２５−８５２９）、（６）ＬＲＰ５およびＬＲＰ６は、ＷｎｔおよびＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質に結合して、細胞増殖、細胞極性、および細胞結末の決定に関係するＷｎｔシグナリング経路を活性化する（Ｔａｍｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０７（２０００），ｐｐ．５３０−５３５）、そして（７）ＬＲ１１は、アミロイドβペプチドを生成するアミロイド前駆体タンパク質のエンドサイトーシスを調節することによって、アルツハイマー病の進行に関与し得る（Ｈｅｒｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．，１５（２００４），ｐｐ．１７５−１８１）ことである。

【0062】

ＬＲＰ１０は、単一の血漿膜貫通受容体であり、ＬＤＬＲ遺伝子ファミリーの５つの官能ドメイン特性からなる。ＬＲＰ１０の構造的組織化は、ＬＲＰ１０が、ＬＤＬＲ遺伝子ファミリーと同様に、リガンドに結合し得ること、そしてＬＲＰ１０が、エンドサイトーシス受容体またはシグナルトランスデューサーとしておそらく作用することを予測する（Ｊｅｏｎｇ，Ｙ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ Ｊａｎ １；３９１（１）：１１１０−５）。本開示に先立って、ＬＲＰ１０の機能は解明されていない。

【0063】

ヒトＬｒｐ１０の完全な遺伝子配列は、９，９６８ｂｐの長さである（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ＮＣ＿００００１４．９）。成熟Ｉ型膜タンパク質は、６９６個のアミノ酸を含有し、算出分子量は７４．８ｋｄである（Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９：１５８１７−１５８２５，２０００）。低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１０アイソフォーム２前駆体のヒトｃＤＮＡ配列は、４，７８５ｂｐの長さであり（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ＮＭ＿００１３２９２２６）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１０アイソフォーム１前駆体のヒトｃＤＮＡ配列は、６，９３０ｂｐの長さである（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ＮＭ＿０１４０４５）。マウスＬｒｐ１０遺伝子の完全な遺伝子配列は、７，３３４ｂｐの長さである（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．ＮＣ＿００００８０．６）。

【0064】

また、ＬＲＰ１０を阻害する、そして故に化学療法もしくは照射の後に対象において造血回復を増強する、かつ／または対象において癌免疫治療を向上させる組成物が提供される。組成物は、本明細書中に開示される１つまたは複数の抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントを含んでよい。一部の実施形態において、本明細書中で開示される抗ＬＲＰ１０抗体は、ＬＲＰ１０リガンドを、（例えば循環系内で）ＬＲＰ１０との結合から阻害することができる。一部の実施形態において、小分子化合物等の他のＬＲＰ１０インヒビターもまた、ＬＲＰ１０とそのリガンドとの結合が挙げられる、ＬＲＰ１０の１つまたは複数の活性を阻害するのに用いることができる。特定の実施形態において、ＬＲＰ１０の可溶性バージョンが操作されてよく、これは、内因性の膜タンパク質ＬＲＰ１０と競合して、ＬＲＰ１０リガンドに結合することによって、間接的に、内因性ＬＲＰ１０とそのリガンドとの結合を阻害するように作用し得る。

【0065】

ＬＲＰ１０インヒビター
ＬＲＰ１０の阻害は、例えば化学療法または照射の後に、対象において造血回復を増強することができ、かつ／または対象において癌免疫治療を実現することができる。したがって、ＬＲＰ１０インヒビターを、癌治療薬における効果的な剤として用いることができる。

【0066】

種々のＬＲＰ１０インヒビターが、本開示内に含まれる。例として、例えば、走化性遊走アッセイまたはＦｒｉｚｚｌｅｄおよび／もしくはｐ２１発現アッセイにおいて、ＬＲＰ１０に結合してその活性を阻害し、または低下させることができる化合物、例えば小分子インヒビターおよび生物剤（例えば抗体）が挙げられる。別の例示的なＬＲＰ１０インヒビターが、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに結合する可溶性のデコイ受容体である。また、Ｌｒｐ１０遺伝子発現レベルを調節する剤も挙げられ、例えば、Ｌｒｐ１０遺伝子またはそれに対する調節配列を特異的に標的化するように設計されている干渉ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）および遺伝子編集／サイレンシングツール（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）がある。

【0067】

一部の実施形態において、ＬＲＰ１０インヒビターを同定する方法が提供され、これは、細胞を試験剤と接触させることを含んでよく、抗体またはそのフラグメントと接触していない対照細胞と比較した、走化性刺激に向かう移動の増大が、試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示し、好ましくは、走化性刺激は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）、スフィンゴシン−１−ホスファート（Ｓ１Ｐ）、Ｃ−Ｃモチーフリガンド２（ＣＣＬ２）、および／またはＣ−Ｃモチーフリガンド２１（ＣＣＬ２１）から選択される。

【0068】

ＬＲＰ１０インヒビターを同定する別の方法は、細胞を試験剤と接触させることを含んでよく、抗体またはそのフラグメントと接触していない対照細胞と比較したＦｒｉｚｚｌｅｄおよび／またはＰ２１の発現の増大が、試験剤がＬＲＰ１０インヒビターであることを示す。

【0069】

ＬＲＰ１０インヒビターは、癌細胞の増殖の少なくとも部分的な阻害（例えば、対照に対して少なくとも１０％）によって、または患者におけるインビボでの腫瘍増殖（例えば、容積および／または転移）の少なくとも部分的な阻害によって、特徴付けられ得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、癌において、主要な問題の１つは、ＣＤ８ Ｔ細胞およびその子孫、細胞毒性Ｔリンパ球が、腫瘍塊に浸潤して腫瘍細胞を死滅させるのに失敗することであると考えられる。当該失敗は、ＬＲＰ１０を介したシグナリングに依存し得る。ゆえに、例えばＬＲＰ１０に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた、ＬＲＰ１０の機能的阻害により、そのような浸潤が起こり得る。

【0070】

特定の実施形態において、ＬＲＰ１０インヒビターは、抗ＬＲＰ１０抗体、例えばモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体は、マウス抗ＬＲＰ１０抗体に由来する修飾された、例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体であってよい。修飾抗体を製造する方法が、当該技術において知られている。一部の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体は、ヒトＬＲＰ１０タンパク質上に存在するエピトープ、例えば、細胞外エクトドメインまたはその一部に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0071】

一部の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下のＶＬ配列（配列番号１、５、７、１１、１５、１９、２３）およびＶＨ配列（配列番号２、８、１２、１６、２０、２４、２７、２９）の１つまたは複数を含んでよい。なお、完全な抗体配列について、各ＶＬは、Ｃｋ（配列番号３１）等の軽鎖定常領域に連結されて、完全な軽鎖を形成することができ、そして各ＶＨは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１２３（配列番号３２）等の重鎖定常領域に連結されて、完全な重鎖を形成することができる。

【0072】

ＶＬ（配列番号１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＡＳＤＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＳＲＴＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号５）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＰＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＶＡＲＴＰＮＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号７）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＰＴＳＬＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号１１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＡＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＤＳＹＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号１５）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＫＴＲＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号１９）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＬＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＳＡＧＰＧＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＬ（配列番号２３）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＤＹＹＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号２）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＱＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号８）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＱＩＧＴＭＧＲＰＴＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＧＫＫＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号１２）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＬＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＴＴＧＮＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＤＡＴＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号１６）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＱＲＱＧＴＧＴＥＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＳＲＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号２０）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＰＳＲＧＱＡＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＲＨＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号２４）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＡＴＴＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＴＡＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号２７）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＬＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＱＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＶＨ（配列番号２９）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＴＳＧＡＡＴＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｃｋアミノ酸配列（配列番号３１）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＩｇＧ１ ＣＨ１２３アミノ酸配列（配列番号３２）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0073】

一部の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３４）：ＮＡＳＤＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３５）：ＡＡＳＰＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３６）：ＲＡＳＲＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３７）：ＡＡＳＡＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３８）：ＤＡＳＬＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号３９）：ＡＡＳＴＬＱＳ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４０）：ＱＱＳＳＲＴＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４１）：ＱＱＶＡＲＴＰＮＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４２）：ＱＱＰＴＳＬＰＬＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４３）：ＱＱＡＤＳＹＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４４）：ＱＱＩＫＴＲＰＴＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４５）：ＱＱＴＳＡＧＰＧＴ
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号４６）：ＱＱＮＤＹＹＰＴＴ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４７）：ＳＱＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号４８）：ＳＹＡＭＳ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号４９）：ＱＩＧＴＭＧＲＰＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５０）：ＳＩＳＴＴＧＮＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５１）：ＶＩＱＲＱＧＴＧＴＥＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５２）：ＳＩＰＳＲＧＱＡＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５３）：ＳＩＡＴＴＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５４）：ＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号５５）：ＳＩＹＴＳＧＡＡＴＴＹＡＤＳＶＫＧ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５６）：ＳＹＰＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５７）：ＳＧＫＫＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５８）：ＤＡＴＳＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号５９）：ＮＳＲＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６０）：ＳＲＨＴＦＤＹ
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６１）：ＮＴＡＴＦＤＹ
のＣＤＲの１つまたは複数を含んでよい。

【0074】

ＣＤＲ配列のアラインメントを、表１〜６に示す。

【0075】

【表1】

【0076】

【表2】

【0077】

【表3】

【0078】

【表4】

【0079】

【表5】

【0080】

【表6】

【0081】

一部の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントは、
ＶＬ ＣＤＲ１（配列番号３３）：ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ
ＶＬ ＣＤＲ２（配列番号６２）：Ｘ１ＡＳＸ２ＬＱＳ（Ｘ１＝Ｎ、Ａ、Ｒ、Ｄ；Ｘ２＝Ｄ、Ｐ、Ｒ、Ａ、Ｌ、Ｔ）
ＶＬ ＣＤＲ３（配列番号６３）：ＱＱＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（Ｘ３＝Ｓ、Ｖ、Ｐ、Ａ、Ｉ、Ｔ、Ｎ；Ｘ４＝Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｄ、Ｋ；Ｘ５＝Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｙ；Ｘ６＝Ｔ、Ｌ、Ｙ、Ｒ、Ｇ；Ｘ７＝Ｔ、Ｎ、Ｌ、Ｇ）
ＶＨ ＣＤＲ１（配列番号６４）：ＳＸ８ＡＭＳ（Ｘ８＝Ｑ、Ｙ）
ＶＨ ＣＤＲ２（配列番号６５）：Ｘ９ＩＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＧＸ１３Ｘ１４ＴＸ１５ＹＡＤＳＶＫＧ（Ｘ９＝Ｓ、Ｑ、Ｖ；Ｘ１０＝Ｐ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ａ、Ｙ；Ｘ１１＝Ｐ、Ｔ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１２＝Ｇ、Ｍ、Ｔ、Ｑ、Ｒ、Ｓ；Ｘ１３＝Ｐ、Ｒ、Ｎ、Ｔ、Ｑ、Ａ；Ｘ１４＝Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｔ；Ｘ１５＝Ｋ、Ｔ、Ｙ、Ｅ）
ＶＨ ＣＤＲ３（配列番号６６）：Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＦＤＹ（Ｘ１６＝Ｓ、Ｄ、Ｎ；Ｘ１７＝Ｙ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｒ、Ｔ；Ｘ１８＝Ｐ、Ｋ、Ｔ、Ｒ、Ｈ、Ａ；Ｘ１９＝Ｓ、Ｋ、Ｔ）
のＣＤＲの１つまたは複数を含んでよい。

【0082】

また、競合結合アッセイにおいて、本明細書中で開示される抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原−結合フラグメントのいずれかと交差競合する抗体またはそのフラグメントが、本開示内に含まれる。一部の実施形態において、そのような交差競合抗体は、本明細書中で開示される抗ＬＲＰ１０抗体またはその抗原結合フラグメントと同じエピトープに結合することができる。

【0083】

特定の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体は、それぞれがＬＲＰ１０上の同じ、または異なるエピトープに結合する２つ以上の抗ＬＲＰ１０抗体の混合物またはカクテルを含んでもよい。一実施形態において、混合物またはカクテルは、それぞれがＬＲＰ１０上の同じ、または異なるエピトープに結合する３つの抗ＬＲＰ１０抗体を含む。

【0084】

別の実施形態において、ＬＲＰ１０インヒビターとして、ＬＲＰ１０の発現または活性を阻害する核酸分子、例えばＲＮＡ分子が挙げられ得る。Ｌｒｐ１０の発現および／または活性を特異的に阻害する、Ｌｒｐ１０に特異的な干渉ＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを、当該技術において知られている方法に従って設計することができる。

【0085】

ＬＲＰ１０コンペティター
一部の実施形態において、ＬＲＰ１０コンペティターは、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドに結合することによって、内因性ＬＲＰ１０へのリガンドの結合と競合し、かつこれを阻害し、または低下させることができる可溶性のデコイ受容体であってよい。例えば、デコイ受容体は、ＬＲＰ１０のエクトドメインの全てまたは一部に相当し、かつ膜貫通領域を欠いたアミノ酸配列を含有してもよい。アミノ酸配列は、野生型配列と比較して、１つまたは複数の置換、欠失、および／または付加を含有する一方、その、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドとの結合活性を保持または増強し得る。アミノ酸配列は、抗体（例えばＩｇＧ１）の定常末端に融合またはグラフトされることで、循環系内で可溶性となり得る。一部の実施形態において、デコイ受容体は、ヒトＬＲＰ１０−抗体Ｆｃフラグメント（ＬＲＰ１０−Ｆｃ）キメラであってよい。

【0086】

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、二量体化活性を有する。

【0087】

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号６７のＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＷＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６７）

【0088】

実施形態において、Ｆｃドメインは、エフェクタ減弱化Ｆｃドメインである。実施形態において、エフェクタ減弱化Ｆｃドメインは、例えば野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、例えば配列番号６７の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、エフェクタ活性が低下している。一部の実施形態において、エフェクタ活性は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含む。実施形態において、エフェクタ活性は、例えば配列番号６７の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、ＡＤＣＣアッセイにおいて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低下している。一部の実施形態において、エフェクタ活性は、相補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を含む。実施形態において、エフェクタ活性は、例えば配列番号６７の野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．」Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）２９：２６１３−２４に記載されるＣＤＣアッセイ等のＣＤＣアッセイにおいて、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％低下している。

【0089】

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号６８のＩｇＧ２定常領域もしくはそのフラグメント、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＷＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＷＳＶＬＴＷＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６８）

【0090】

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメイン、例えば配列番号６９のヒトＩｇＧ２ドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＷＳＶＬＴＷＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号６９）

【0091】

一部の実施形態において、Ｆｃドメインは、配列番号８０のＩｇＧ２Ｄａ Ｆｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、Ｒａｂａｔナンバリングシステムを用いたＡ３３０Ｓ突然変異およびＰ３３１Ｓ突然変異の一方または双方を含む。実施形態において、Ｆｃドメインは、Ａｒｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｌａｃｋｉｎｇ Ｆｃ ｇａｍｍａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．」Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９９）２９：２６１３−２４に記載されるものである。
ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＷＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＷＳＶＬＴＷＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰｓｓＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７０）

【0092】

種々の実施形態において、デコイ受容体は、循環系内で安定するように調製されてよい。一部の実施形態において、デコイ受容体は、例えば、内因性ＬＲＰ１０とのＬＲＰ１０リガンドの結合と競合することでこれを減少させ、または妨げることによって、１つまたは複数のＬＲＰ１０リガンドを中和かつ／または阻害する。特定の実施形態において、デコイ受容体は、ＬＲＰ１０エクトドメインのみよりも効果的に作用し得る。

【0093】

可溶性の受容体は、組換えＤＮＡ技術によって融合タンパク質を生成する等の、当該技術において知られている方法によって調製することができる。ＬＲＰ１０エクトドメインまたはその官能部分（例えばリガンド結合フラグメント）が、抗体（例えばＩｇＧ１）の定常末端に融合されてもよい。例えば、ヒトＬＲＰ１０エクトドメインまたはその官能部分をコードするＤＮＡ配列が、場合によってはリンカーを介して、ＩｇＧ１のＦｃ末端についてのヒト遺伝子をコードするＤＮＡ配列に連結するように操作されてもよい。次に、操作されたＤＮＡは、ＬＲＰ１０エクトドメインをＩｇＧ１ Ｆｃに連結するタンパク質を生成するように発現されてよい。

【0094】

抗ＬＲＰ１０抗体の調製
抗ＬＲＰ１０抗体を、当該技術において通常知られている種々の方法を用いて製造することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を用いて、ヒト抗体ライブラリーをスクリーニングして、治療用の完全ヒトモノクローナル抗体を生成することができる。高親和性バインダーを、中和研究用の候補と考えることができる。これ以外にも、マウスまたはウサギをヒトタンパク質で免疫化して、候補バインダーを同定かつ試験して、重鎖および軽鎖の結合部位を、ヒト抗体コーディング配列中にグラフティングすることによって、ヒト化抗体を最終的に生成することができる、従来のモノクローナルアプローチが用いられてもよい。

【0095】

抗体は、典型的に、ポリペプチド鎖の２つの同じ対を含み、各対は、１つの全長「軽」鎖（典型的には分子量が約２５ｋＤａである）および１つの全長「重」鎖（典型的には分子量が約５０〜７０ｋＤａである）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的に、抗原認識を典型的に担う、約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクタ機能を担う定常領域を定義する。重鎖および軽鎖の各可変領域は、典型的に、３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる）によって結合された、４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む、同じ一般的な構造を示す。各対の２本鎖由来のＣＤＲは、典型的に、フレームワーク領域によってアラインされ、このアラインメントにより、特異的なエピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は双方とも、典型的に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、典型的に、Ｒａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、またはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３）の定義に従う。

【0096】

抗体は、モノクローナル抗体の開発と共に、医薬剤として有用となり、かつ注目されるようになった。モノクローナル抗体は、培養において継代細胞株によって抗体分子を生成するあらゆる方法を用いて生成される。モノクローナル抗体を調製する適切な方法の例として、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）のハイブリドーマ法およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５１−６３）が挙げられる。

【0097】

モノクローナル抗体は、治療薬としての使用用に修飾されてもよい。一例として、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りが、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体がある。他の例として、所望の生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントがある。米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５を参照。関連した開発として、抗体が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一方、抗体鎖の残りが、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の、対応する配列と同一または相同である「ＣＤＲグラフト化」抗体がある。

【0098】

別の開発は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術において周知である（米国特許第５，５８５，０８９号明細書、および米国特許第５，６９３，７６２号明細書を参照；また、ラマ抗体のヒト化について、Ｃｅｃｉｌｅ Ｖｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００９；２８４：３２７３−３２８４も参照）。通常、ヒト化抗体は、非ヒト動物によって生成され、そして、典型的には抗体の非抗原認識部分に由来する、特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体内の前記残基に相同であるように修飾される。例えば、ヒト化は、当該技術において記載される方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６）を用いて、齧歯類可変領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域と置換することによって、実行することができる。

【0099】

より最近では、抗原を、ヒトに曝露せずに、ヒト抗体（「完全ヒト抗体」）が開発されている。ヒト抗体のレパートリを、内因性マウス免疫グロブリン産生の非存在下で生成することでできるトランスジェニック動物（例えばマウス）を用いて、そのような抗体が、場合によってはキャリアにコンジュゲートした、抗原（典型的には少なくとも６つの連続したアミノ酸を有する）による免疫化によって生成される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８；およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照。これらの方法の一例において、マウス免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化して、そのゲノム中にヒト重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって、トランスジェニック動物が生成される。次に、部分的に修飾された動物（修飾の完全な相補体には満たない）が交雑されて、所望の免疫系修飾の全てを有する動物が得られる。免疫原が投与されると、当該トランスジェニック動物は、可変領域を含むヒト（マウスではない）アミノ酸配列を有する、抗原に免疫特異的である抗体を生成する。国際公開第９６／３３７３５号パンフレットおよび国際公開第９４／０２６０２号パンフレット（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照。更なる方法が、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書および欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。また、ヒト抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞内での組換えＤＮＡの発現によって生成されてもよいし、ハイブリドーマ細胞内での発現によって生成されてもよい。

【0100】

一部の実施形態において、ファージディスプレイ技術が、治療抗体の有無に関してスクリーニングするのに用いられてもよい。ファージディスプレイにおいて、抗体レパートリが、糸状バクテリオファージの表面上に提示され得、そして構築されたライブラリーは、免疫原に結合するファージの有無に関してスクリーニングされてもよい。抗体ファージは、バクテリオファージの遺伝子工学、ならびに抗原ガイド選択およびファージ増殖の繰り返されるラウンドに基づく。この技術により、ＬＲＰ１０モノクローナル抗体のインビトロ選択が可能となる。ファージディスプレイプロセスは、抗体−ライブラリー調製で始まって、ファージディスプレイベクター中への可変重鎖（ＶＨ）ＰＣＲ産物および可変軽鎖（ＶＬ）ＰＣＲ産物のライゲーションが後に続いて、モノクローナル抗体のクローンの分析に達する。抗体レパートリを表すＶＨおよびＶＬ ＰＣＲ産物は、ファージディスプレイベクター（例えば、ファージミドｐＣｏｍｂ３Ｘ）中にライゲートされ、これは、ＶＨおよびＶＬを、元々Ｍ１３バクテリオファージに由来した、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の糸状バクテリオファージのｐｉｌｌマイナーカプシドタンパク質に融合したｓｃＦｖとして発現するように操作されている。しかしながら、ファージディスプレイベクターｐＣｏｍｂ３Ｘが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で完全なバクテリオファージをコードするのに必須の他の遺伝子全てを有するわけではない。それらの遺伝子について、ヘルパーファージが、ファージディスプレイベクターライブラリーで形質転換される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えられる。ファージのライブラリーが生じ、各々が、その表面上にＬＲＰ１０モノクローナル抗体を発現し、そして各ヌクレオチド配列を有するベクターを保有する。また、ファージディスプレイは、ＬＲＰ１０モノクローナル抗体それ自体（ファージカプシドタンパク質に付着していない）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の株において生成するのに用いることができる。ファージディスプレイベクター内で、生成されたｍＡｂの特性評価および精製を可能にするように、付加的なｃＤＮＡが、ＶＬ配列およびＶＨ配列の後に操作される。具体的には、組換え抗体は、溶液からの簡単な精製を可能にするヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグおよびポリヒスチジンを有してもよい。

【0101】

多様な抗体ファージライブラリーが、ヘルパーファージが感染した約１０^８個の独立した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体から生成される。バイオパニングを用いて、ライブラリーが、先にリストした免疫原配列またはそのフラグメントに結合するファージの有無について、モノクローナル抗体の発現された表面を介してスクリーニングされ得る。環状パニングが、潜在的に非常に稀な抗原結合クローンを引き出すことを可能にし、（ＥＬＩＳＡプレート上に、または、溶液中で細胞表面上に固定された）抗原へのファージ結合、洗浄、溶出、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのファージバインダーの再増幅の複数のラウンドからなる。各ラウンド中に、非バインダーを洗浄して、結合ファージクローンを選択的に溶出することによって、特異的なバインダーがプールから選択される。３または４ラウンド後の、それらの表面ＬＲＰ１０モノクローナル抗体を介してのファージクローンの高度に特異的な結合が、固定された免疫原の特異的選択にとって特徴的である。

【0102】

別の方法は、親和性クロマトグラフィによる精製に適したＣ末端Ｈｉｓタグを、先でリストした免疫原配列に加えるものである。精製したタンパク質を、適切なアジュバントと一緒にマウスに接種してよい。ハイブリドーマ内で生成されたモノクローナル抗体が、免疫原への結合について試験されてよく、そして、本明細書中のアッセイにおいて記載されるように、陽性バインダーがスクリーニングされてよい。

【0103】

また、完全ヒト抗体を、ファージディスプレイライブラリーから生成することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１中に開示されている）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上での抗体レパートリの提示、および選択抗原への結合によるファージの以降の選択を介した免疫選択を模倣する。そのような一技術が、国際公開第９９／１０４９４号パンフレット（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されており、これは、そのようなアプローチを用いた、ＭＰＬ受容体およびｍｓｋ受容体についての高親和性かつ機能性のアゴニスト抗体の単離を記載している。

【0104】

一部の実施形態において、７１３個のアミノ酸のヒトＬＲＰ１０タンパク質配列のアミノ酸１８〜７１３からなるヒトＬＲＰ１０エクトドメインを、免疫原として用いることができる。また、ＬＲＰ１０エクトドメインのフラグメントまたは一部を、免疫原として用いることもできる。１つまたは複数の免疫原を用いて、モノクローナル抗体を高めることができる。潜在的治療抗ＬＲＰ１０抗体を生成することができる。

【0105】

一例において、マウスＬｒｐ１０遺伝子中にノックインされたヒトＬＲＰ１０エクトドメイン、およびヒトＴ細胞（ヒトドナー由来のＪｕｒｋａｔまたは初代Ｔ細胞）を有するマウスモデルを用いて、ノックアウト突然変異を表現型模写するモノクローナル抗体を試験して、潜在的抗ＬＲＰ１０抗体候補として同定することができた。ノックアウト突然変異を表現型模写するモノクローナル抗体として、血中のＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）の数が多く、Ｂ：Ｔ細胞比が低く、かつ／またはＮＫ細胞数が低いものが挙げられる。そのような試験として、例えばウェスタンブロットで検出されるエンドポイント、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよび／またはＰ２１タンパク質発現の増強、そして二次的に、照射または化学療法後のＴ細胞移動の増強、および造血再構成の増強のスクリーニングが挙げられる。スクリーニングの後に、完全ヒトモノクローナル抗体が、臨床前試験用に開発されてから、安全性および効力について臨床ヒト治験において試験されてよい。そのような抗体は、化学療法もしくは照射の後に対象において造血回復を増強し、かつ／または、癌免疫治療を（例えば、腫瘍浸潤リンパ球の数を増大させることによって）向上させることができる臨床候補であり得る。

【0106】

上述の抗体をコードするヌクレオチド配列を決定することができる。また、その後、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体を、組換え方法によって生成してもよい。抗体をコードする核酸を、当該技術において通常知られている材料および手順を用いて、宿主細胞中に導入して、発現させることができる。

【0107】

本開示は、ＬＲＰ１０に対する１つまたは複数のモノクローナル抗体を提供する。好ましくは、抗体は、ＬＲＰ１０エクトドメインに結合する。好ましい実施形態において、本開示は、重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、ならびにこれらを含むアミノ酸配列、特にそれらの可変領域に相当する配列を提供する。好ましい実施形態において、具体的にはＣＤＲ１からＣＤＲ３の、ＣＤＲに相当する配列が提供される。更なる実施形態において、本開示は、ハイブリドーマ細胞株であって、ヒトＬＲＰ１０に対する免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体、好ましくは精製されたヒトモノクローナル抗体を、そこから生成されるように発現するハイブリドーマ細胞株を提供する。

【0108】

本開示の抗ＬＲＰ１０抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲは、同じ種、または別の種由来のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされてもよい。特定の実施形態において、抗ＬＲＰ１０抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲにグラフトされてもよい。コンセンサスヒトＦＲを生じさせるために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲがアラインされて、コンセンサスアミノ酸配列が同定される。抗ＬＲＰ１０抗体の重鎖または軽鎖のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖由来のＦＲで置換されてもよい。抗ＬＲＰ１０抗体の重鎖および軽鎖のＦＲ内の稀なアミノ酸は、典型的に置換されない一方、残りのＦＲアミノ酸が置換されてよい。稀なアミノ酸は、ＦＲ内に通常見出されない位置にある特定のアミノ酸である。本開示の抗ＬＲＰ１０抗体由来のグラフト化可変領域は、抗ＬＲＰ１０抗体の定常領域と異なる定常領域に用いられてもよい。これ以外にも、グラフト化可変領域は、単鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲグラフト化は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，５８５，０８９号明細書、および米国特許第５，５３０，１０１号明細書（あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。

【0109】

一部の実施形態において、本開示の抗体は、ハイブリドーマ株によって生成されてよい。当該実施形態において、本開示の抗体は、おおよそ４ｐＭ〜１μＭの解離定数（Ｋｄ）でＬＲＰ１０に結合する。本開示の特定の実施形態において、抗体は、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＫｄでＬＲＰ１０に結合する。

【0110】

好ましい実施形態において、本開示の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり、ＩｇＧ１アイソタイプが最も好ましい。本開示の好ましい実施形態において、抗体は、ヒトカッパ軽鎖、およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４重鎖を含む。特定の実施形態において、抗体の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプについての定常領域以外の定常領域にライゲートされる。特定の実施形態において、本開示の抗体は、哺乳動物の細胞内での発現用にクローニングされた。

【0111】

代わりの実施形態において、本開示の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株内で発現されてよい。当該実施形態において、特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物の宿主細胞のトランスフォーメーション用に用いられてよい。当該実施形態に従えば、トランスフォーメーションは、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する、知られているあらゆる方法を用いて達成され得、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中（またはウイルスベクター中）にパッケージングすること、および宿主細胞をウイルス（またはベクター）で形質導入すること、または当該技術において知られているトランスフェクション手順によるものが挙げられる。そのような手順は、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，９１２，０４０号明細書、米国特許第４，７４０，４６１号明細書、および米国特許第４，９５９，４５５号明細書（これらの特許は全て、あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする）によって例示されている。通常、用いたトランスフォーメーション手順は、形質転換されることとなる宿主によって決まり得る。哺乳動物細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入する方法が、当該技術において周知であり、以下に限定されないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム析出、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核中へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。

【0112】

本開示の方法の特定の実施形態に従えば、本開示のＬＲＰ１０抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域、または軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的なライゲーション技術を用いて、適切な発現ベクター中に挿入される。好ましい実施形態において、ＬＲＰ１０重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、適切な可変領域のＣ末端に取り付けられて、発現ベクター中にライゲートされる。ベクターは典型的に、使用される特定の宿主細胞内で機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が起こり得るように、宿主細胞機構と適合する）。発現ベクターのレビューについて、Ｇｏｅｄｄｅｌ（ｅｄ．），１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｎ．Ｙ．を参照。

【0113】

典型的には、あらゆる宿主細胞に用いられる発現ベクターは、プラスミド維持のための、そして外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有してよい。そのような配列として、典型的に、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよび受容体スプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されることとなるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカー要素のヌクレオチド配列の１つまたは複数が挙げられる。これらの配列は、当該技術において周知である。

【0114】

本開示の発現ベクターは、出発ベクター、例えば市販のベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもよいし、全てを含有しなくてもよい。本明細書中に記載されるフランキング配列の１つまたは複数が、ベクター内にまだ存在しない場合、それらを個々に得て、ベクター中にライゲートしてもよい。各フランキング配列を得るのに用いられる方法が、当業者に周知である。

【0115】

ベクターが構築され、そして抗ＬＲＰ１０抗体を含む軽鎖、もしくは重鎖、または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子が、ベクターの適切な部位中に挿入された後に、完成したベクターは、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞中に挿入されてもよい。選択された宿主細胞中への抗ＬＲＰ１０抗体用の発現ベクターのトランスフォーメーションは、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共析出、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、または他の知られている技術が挙げられる周知の方法によって達成されてよい。選択される方法は、部分的に、用いられることとなる宿主細胞のタイプによることとなる。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．内に示されている。

【0116】

宿主細胞は、適切な条件の下で培養される場合、抗ＬＲＰ１０抗体を合成し、これはその後、（宿主細胞が培地中に分泌するならば）培地から、または（分泌されないならば）生成する宿主細胞から直接的に収集されてよい。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因、例えば、所望の発現レベル、活性に所望され、または必須であるポリペプチド修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子への折畳みの容易さによって決まることとなる。

【0117】

発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株が、当該技術において周知であり、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株（以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨＥＰ Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞株が挙げられる）が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態において、どの細胞株が高い発現レベルを有して、構成的ＬＲＰ１０結合特性を有する抗体を生成するかを判定することによって、細胞株を選んでもよい。別の実施形態において、それ自体抗体を製造しないが、異種抗体を製造かつ分泌する能力を有するＢ細胞系列（例えば、マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０およびＳＰ２／０）から、細胞株を選択してもよい。

【0118】

医薬組成物およびその使用
一態様において、癌免疫治療および／または造血回復用の医薬の製造のためのＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターの使用が提供される。別の態様において、患者において腫瘍増殖を抑制する方法が提供され、当該方法は、患者に有効量のＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターを投与することを含む。

【0119】

別の態様において、本明細書中に開示される方法に用いることができる医薬組成物、すなわち、例えば化学療法もしくは照射の後に、対象において造血回復を増強し、かつ／または癌免疫治療を実現する医薬組成物が提供される。

【0120】

一部の実施形態において、医薬組成物は、ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターおよび薬学的に許容されるキャリアを含む。ＬＲＰ１０インヒビターまたはコンペティターは、薬学的に許容されるキャリアと共に、医薬組成物に製剤化されてよい。加えて、医薬組成物は、例えば、化学療法もしくは照射の後に対象において造血回復を増強し、かつ／または癌免疫治療を実現する、患者の処置のための組成物の使用についての指示を含んでよい。

【0121】

一実施形態において、ＬＲＰ１０インヒビターは、抗ＬＲＰＫ抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。

【0122】

本明細書中で用いられる「薬学的に許容されるキャリア」として、あらゆる全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、ならびに生理的に適合する他の賦形剤が挙げられる。好ましくは、キャリアは、非経口投与、経口投与、および局所投与に適している。投与経路に応じて、活性化合物、例えば小分子または生物剤は、化合物を、酸の作用、および化合物を不活化し得る他の自然条件から保護する材料でコーティングされてもよい。

【0123】

薬学的に許容されるキャリアとして、滅菌水溶液または分散系、および滅菌注射可能な溶液または分散系の即座の調製用の滅菌粉末、ならびにタブレット、ピル、カプセル等の調製用の従来の賦形剤が挙げられる。医薬的に活性の物質の製剤化用のそのような媒体および剤の使用が、当該技術において知られている。従来のあらゆる媒体または剤が活性化合物と適合しないこと以外は、その、本明細書中で提供される医薬組成物での使用が意図される。また、補完活性化合物が、組成物中に組み込まれてもよい。

【0124】

薬学的に許容されるキャリアとして、薬学的に許容される抗酸化剤が挙げられ得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例として、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫化水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウム等、（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファ−トコフェロール等、ならびに（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸等が挙げられる。

【0125】

本明細書中で提供される医薬組成物に使用されてもよい適切な水性キャリアおよび非水性キャリアの例として、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合液、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。必要とされる場合、例えば、コーティング材料、例えばレシチンの使用によって、分散系の場合には必要とされる粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性が維持され得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが有用であり得る。組成物中に、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアレートの塩およびゼラチンを含むことによって、注射可能な組成物の長期間にわたる吸収がもたらされ得る。

【0126】

また、これらの組成物は、機能的賦形剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含有してもよい。

【0127】

治療組成物は、典型的に、滅菌されており、非系統発生的であり、かつ製造および保存の条件の下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または他の、高い薬物濃度に対して適切な規則性のある（ｏｒｄｅｒｅｄ）構造体として製剤化されてよい。

【0128】

活性化合物を、適切な溶媒中に必要とされる量で、必要に応じて、先で列挙される成分の１つまたは組合せと共に組み込んでから、滅菌、例えば微量濾過することによって、滅菌注射可能な溶液が調製されてよい。通常、活性化合物を、基本分散媒、および先で列挙されるもの由来の他の必要とされる成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、分散系が調製される。滅菌注射可能な溶液の調製用の滅菌粉末の場合、調製方法は、減圧乾燥およびフリーズ乾燥（凍結乾燥）を含み、これにより、活性成分、および溶液の、以前に滅菌濾過した溶液由来の所望のあらゆる追加成分の粉末が生じる。活性剤は、滅菌条件下で、付加的な薬学的に許容されるキャリアと、そして必要とされる場合があるあらゆる保存剤、バッファー、または推進剤と混合されてもよい。

【0129】

微生物の存在の防止は、前掲の滅菌手順、そして種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の包含の双方によって、確実にされてよい。また、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムが組成物中に含まれることが所望されてもよい。また、注射可能な医薬形態の長期間にわたる吸収が、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの包含によってもたらされてもよい。

【0130】

ＬＲＰ１０インヒビターを含む医薬組成物は、単独療法で投与されても併用療法で投与されてもよい。例えば、併用療法は、ＬＲＰ１０インヒビターおよび少なくとも１つまたは複数の付加的な治療剤、例えば、当該技術において知られている、以下でさらに詳細に考察される１つまたは複数の化学療法剤を含む、本明細書中で提供される組成物を含んでよい。また、医薬組成物は、放射療法および／または外科手術と併せて投与されてもよい。

【0131】

投薬レジメンは、所望される最適な応答（例えば治療応答）を実現するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよいし、用量が、治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に増減されてもよい。

【0132】

抗体の投与についての例示的な投薬量範囲として、１０〜１０００ｍｇ（抗体）／ｋｇ（患者の体重）、１０〜８００ｍｇ／ｋｇ、１０〜６００ｍｇ／ｋｇ、１０〜４００ｍｇ／ｋｇ、１０〜２００ｍｇ／ｋｇ、３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、３０〜８００ｍｇ／ｋｇ、３０〜６００ｍｇ／ｋｇ、３０〜４００ｍｇ／ｋｇ、３０〜２００ｍｇ／ｋｇ、５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ、５０〜８００ｍｇ／ｋｇ、５０〜６００ｍｇ／ｋｇ、５０〜４００ｍｇ／ｋｇ、５０〜２００ｍｇ／ｋｇ、１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ、１００〜９００ｍｇ／ｋｇ、１００〜８００ｍｇ／ｋｇ、１００〜７００ｍｇ／ｋｇ、１００〜６００ｍｇ／ｋｇ、１００〜５００ｍｇ／ｋｇ、１００〜４００ｍｇ／ｋｇ、１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、および１００〜２００ｍｇ／ｋｇが挙げられる。例示的な投薬スケジュールとして、３日毎に１回、５日毎に１回、７日毎に１回（すなわち、１週に１回）、１０日毎に１回、１４日毎に１回（すなわち、２週毎に１回）、２１日毎に１回（すなわち、３週毎に１回）、２８日毎に１回（すなわち、４週毎に１回）、そして１ヵ月に１回が挙げられる。

【0133】

非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、ユニット剤型で製剤化することが有利であり得る。本明細書中で用いられるユニット剤型は、処置されることとなる患者用のユニタリ投薬として適した物理的に別個のユニットを指し；各ユニットは、所望の治療効果をもたらすように算出された活性剤の予め定められた量を、必要とされるあらゆる医薬キャリアを伴って含有する。ユニット剤型についての仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、および達成されることとなる特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）について活性な化合物を混ぜ合わせる、当該技術に固有の制限事項に直接依存して、決定される。

【0134】

本明細書中で開示される医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者に所望される治療応答を達成するのに有効である活性成分の量、組成、および投与モードが、患者に有毒であることなく得られるように変動してもよい。投与の文脈で本明細書中で用いられる「非経口」は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与モードを意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外、そして胸骨内の注射および点滴が挙げられる。

【0135】

本明細書中で用いられるフレーズ「非経口投与」および「非経口的に投与された」は、通常は注射または点滴による、経腸投与（すなわち、消化管を経る）および局所投与以外の投与モードに言及し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊椎内、硬膜外、そして胸骨内の注射および点滴が挙げられる。静脈内の注射および点滴は、多くの場合（排他的にではない）、抗体投与に用いられる。

【0136】

本明細書中で提供される剤が、医薬として、ヒトまたは動物に投与される場合、単独で、または、例えば、薬学的に許容されるキャリアと組み合わされて、０．００１〜９０％（例えば０．００５〜７０％、例えば０．０１〜３０％）の活性成分を含有する医薬組成物として、与えられてよい。

【0137】

特定の実施形態において、化学療法もしくは照射の後に対象において造血回復を増強し、かつ／または癌免疫治療を向上させるための、本明細書中で提供される方法および使用は、ＬＲＰ１０インヒビター、およびＬＲＰ１０インヒビターでない少なくとも１つの付加的な抗癌剤の投与を含んでもよい。

【0138】

一実施形態において、少なくとも１つの付加的な抗癌剤は、少なくとも１つの化学療法薬を含む。そのような化学療法薬の非限定的な例として、白金ベースの化学療法薬（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、ＥｎｄｏＴＡＧ−１（商標）、（正に帯電する脂質ベースの複合体内にカプセル化されたパクリタキセルの製剤；ＭｅｄｉＧｅｎｅ）、アブラキサン（登録商標）（アルブミンに結合したパクリタキセルの製剤）、チロシンキナーゼインヒビター（例えば、イマチニブ／グリベック（登録商標）、スニチニブ／スーテント（登録商標）、ダサチニブ／スプリセル（登録商標））、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0139】

別の実施形態において、少なくとも１つの付加的な抗癌剤は、ＥＧＦＲインヒビター、例えば抗ＥＧＦＲ抗体、またはＥＧＦＲシグナリングの小分子インヒビターを含む。例示的な抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（アービタックス（登録商標））である。セツキシマブは、ＩｍＣｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販されている。抗ＥＧＦＲ抗体の他の例として、マツズマブ（ＥＭＤ７２０００）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）；Ａｍｇｅｎ）；ニモツズマブ（ＴｈｅｒａＣＩＭ（商標））、およびｍＡｂ ８０６が挙げられる。ＥＧＦＲシグナリング経路の例示的な小分子インヒビターは、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））であり、これはＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａおよびＴｅｖａから市販されている。ＥＧＦＲシグナリング経路の小分子インヒビターの他の例として、エルロチニブＨＣｌ（ＯＳＩ−７７４；タルセバ（登録商標）、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａ）；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；カネルチニブ（カネルチニブジヒドロクロリド、Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＤ１５８７８０；およびＡｇ １４７８（４−（３−クロロアニリノ）−６，７−ジメトキシキナゾリン）が挙げられる。

【0140】

さらに別の実施形態において、少なくとも１つの付加的な抗癌剤は、ＶＥＧＦインヒビターを含む。例示的なＶＥＧＦインヒビターは、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ（Ａｖａｓｔａｔｉｎ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））を含む。

【0141】

さらに別の実施形態において、少なくとも１つの付加的な抗癌剤は、抗ＥｒｂＢ２抗体を含む。適切な抗ＥｒｂＢ２抗体として、トラスツズマブおよびペルツズマブが挙げられる。

【0142】

一態様において、本開示に従う組合せの有効性の向上は、治療的相乗効果を達成することによって実証され得る。

【0143】

用語「治療的相乗効果」は、所定の用量の２つの製品の組合せが、同じ用量の２つの製品の各々のみの最良よりも有効である場合に用いられる。一例において、治療的相乗効果は、パラメータ腫瘍容積についての繰返し測定による２元配置分散分析から得た推定値（例えば時間因子）を用いて、最良の単剤に対して組合せを比較することによって、評価することができる。

【0144】

用語「相加的」は、所定の用量の２つ以上の製品の組合せが、２つ以上の製品の各々により得られる効力の合計に等しく有効である場合に言及する一方、用語「超相加的」は、組合せが、２つ以上の製品の各々により得られる効力の合計よりも有効である場合に言及する。

【0145】

有効性（組合せの有効性を含む）が定量化され得る別の尺度が、ｌｏｇｉｃ細胞死滅の算出によるものであり、これは、ｌｏｇｉｃ細胞死滅＝Ｔ−Ｃ（日）／３．３２×Ｔ_ｄの式に従って求められる（式中、Ｔ−Ｃは、細胞の増殖の遅れを表し、これは、処置群（Ｔ）の腫瘍および対照群（Ｃ）の腫瘍が、予め定められた値（例えば、１ｇまたは１０ｍＬ）に達した平均時間（日）であり、そしてＴ_ｄは、対照動物において腫瘍の容積が２倍になるのに必要な時間（日）を表す）。この尺度を用いる場合、ｌｏｇｉｏ細胞死滅が０．７以上であれば、製品は活性であると考えられ、ｌｏｇｉｃ細胞死滅が２．８を超えれば、製品は非常に活性であると考えられる。

【0146】

この尺度を用いて、それ自体の最大耐量にて用いられる組合せ（各構成成分が通常その最大耐量以下の用量で存在している）は、ｌｏｇｉｃ細胞死滅が、単独で投与される場合の最良の構成成分のｌｏｇｉｃ細胞死滅の値よりも大きい場合に、治療相乗効果を示す。例示的な場合では、組合せのｌｏｇｉｃ細胞死滅は、組合せの最良の構成成分のｌｏｇｉｃ細胞死滅の値を、少なくとも１ ｌｏｇ細胞死滅だけ超える。

【0147】

癌免疫治療を実現する組成物および方法が本明細書中で開示される。当該方法は、それを必要とする対象において、ＬＲＰ１０を阻害すること、または内因性ＬＲＰ１０との結合について競合することを含んでよい。特定の実施形態において、ＬＲＰ１０を阻害すること、または内因性ＬＲＰ１０との結合について競合することは、リンパ球、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞および細胞毒性Ｔリンパ球の腫瘍浸潤を増強することによって癌免疫治療を実現することができる。ＬＲＰ１０阻害（例えば抗ＬＲＰ１０抗体）は、例えば細胞毒性Ｔリンパ球腫瘍浸潤を増強することによって、スタンドアロン癌免疫治療として用いられてよい。一部の実施形態において、ＬＲＰ１０阻害は、他の癌免疫治療と併用されてよい。

【0148】

造血回復を増強する方法であって、それを必要とする対象において、ＬＲＰ１０を阻害することと、内因性ＬＲＰ１０との結合について競合することとを含む方法も本明細書中で提供される。特定の実施形態において、前記阻害は、全ての造血系列、好ましくはリンパ系列の回復を増強する。一部の実施形態において、対象は、化学療法および／または放射線療法を受けた。

【0149】

種々の実施形態において、本明細書中で開示される方法は、対象に、抗ＬＲＰ１０抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはデコイ可溶性ＬＲＰ１０の有効量を投与することを含んでよい。一般に、有効量は、治療的かつ／または予防的に投与されてよい。

【0150】

処置は、そのような癌に苦しむ、癌を抱える、癌に感受性のある、または癌を進行させるリスクのある対象、特にヒトに適切に施されてよい。「リスクのある」対象の決定は、診断試験、または対象もしくはヘルスケアプロバイダーの意見（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、家族歴等）によるあらゆる客観的判定または主観的判定によってなされてよい。そのような処置が必要な対象の同定は、対象またはヘルスケア専門家の判断であってよく、そして主観的（例えば意見）であっても客観的（例えば試験または診断法によって測定可能）であってもよい。

【0151】

製剤の投与
本開示の製剤（再構成される液体製剤が挙げられるがこれに限定されない）は、抗ＬＲＰ１０抗体による処置が必要な哺乳動物、好ましくはヒトに、知られている方法、例えばボーラスとしての静脈内投与に従って、または筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、もしくは吸入経路による、一定期間にわたる連続点滴によって、投与される。

【0152】

好ましい実施形態において、製剤は、皮下（すなわち、皮膚の下への）投与によって、哺乳動物に投与される。そのような目的で、製剤は、シリンジを用いて注射されてもよい。しかしながら、製剤の投与用の他の装置が利用可能であり、例えば、注射装置（例えば、ＩＮＪＥＣＴ−ＥＡＳＥ（商標）およびＧＥＮＪＥＣＴ（商標）装置）；インジェクタペン（例えばＧＥＮＰＥＮ（商標））；自動インジェクタ装置、無針装置（例えば、ＭＥＤＩＪＥＣＴＯＲ（商標）およびＢＩＯＪＥＣＴＯＲ（商標））；および皮下パッチ送達系がある。

【0153】

特定の実施形態において、本開示は、単回用量投与ユニット用のキットに関する。そのようなキットは、治療タンパク質または抗体の水性製剤のコンテナを含み、単一の、またはマルチチャンバの予め充填されたシリンジが挙げられる。例示的な予め充填されたシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ、Ｒａｖｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。

【0154】

タンパク質の適切な投薬量（「治療的に有効な量」）は、例えば、処置されることとなる症状、症状の重症度および経過、タンパク質が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の臨床履歴および抗ＬＲＰ１０抗体に対する応答、用いられる製剤のフォーマット、ならびに主治医の裁量によって決まることとなる。抗ＬＲＰ１０抗体は、一度に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与され、診断から後は、患者にいつ投与されてもよい。抗ＬＲＰ１０抗体は、唯一の処置として、または問題の症状を処置するのに有用な他の薬物もしくは治療と併せて、投与されてもよい。

【0155】

抗ＬＲＰ１０抗体について、最初の候補投薬量が、患者への投与について約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇに及んでよく、これは、１つまたは複数の別々の投与の形態をとってもよい。しかしながら、他の投薬レジメンが有用である場合がある。そのような治療の経過は、従来技術によって容易に監視される。

【0156】

本開示の特定の実施形態に従えば、抗ＬＲＰ１０抗体（または、本明細書中で言及される、抗ＬＲＰ１０抗体、および付加的な治療活性剤のいずれかの組合せを含む医薬組成物）の複数回用量が、定義された時間にわたって対象に投与されてもよい。本開示のこの態様に従う方法は、本開示の抗ＬＲＰ１０抗体の複数回用量を、対象に順次投与することを含む。本明細書中で用いられる「順次投与する」は、抗ＬＲＰ１０抗体の各用量が、異なる時点にて、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週、または数ヵ月）によって分離された異なる日に、対象に投与されることを意味する。本開示は、抗ＬＲＰ１０抗体の初回単回用量に続いて、抗ＬＲＰ１０抗体の１回または複数回の第２の用量、そして場合によってはその後、抗ＬＲＰ１０抗体の１回または複数回の第３の用量を患者に順次投与することを含む方法を含む。抗ＬＲＰ１０抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量にて投与されてもよい。

【0157】

用語「初回用量」、「第２の用量」、および「第３の用量」は、本開示の抗ＬＲＰ１０抗体の投与の時間的順序に言及する。ゆえに、「初回用量」は、処置レジメンの初めに投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり；「第２の用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；そして「第３の用量」は、第２の用量の後に投与される用量である。初回用量、第２の用量、および第３の用量は全て、同じ量の抗ＬＲＰ１０抗体を含有してもよいが、通常、投与頻度に関して、互いに異なってもよい。しかしながら、特定の実施形態において、初回用量、第２の用量、および／または第３の用量に含有される抗ＬＲＰ１０抗体の量は、処置中に、互いに変動してもよい（例えば、必要に応じて、上方調整または下方調整される）。特定の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、または５回）の用量が、処置レジメンの初めに「ローディング用量」として投与されてから、以降の用量が、頻度を減らして投与される（例えば「維持用量」）。

【0158】

本開示の特定の例示的な実施形態において、第２の用量および／または第３の用量はそれぞれ、直前の用量の１〜２６（例えば、１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４、４と１／２、５、５と１／２、６、６と１／２、７、７と１／２、８、８と１／２、９、９と１／２、１０、１０と１／２、１１、１１と１／２、１２、１２と１／２、１３、１３と１／２、１４、１４と１／２、１５、１５と１／２、１６、１６と１／２、１７、１７と１／２、１８、１８と１／２、１９、１９と１／２、２０、２０と１／２、２１、２１と１／２、２２、２２と１／２、２３、２３と１／２、２４、２４と１／２、２５、２５と１／２、２６、２６と１／２、またはそれ以上）週後に投与される。本明細書中で用いられるフレーズ「直前の用量」は、複数回投与の順序において、順序内の直ぐ次の用量の投与の前に（用量が間に入ることなく）患者に投与される抗ＬＲＰ１０抗体の用量を意味する。

【0159】

本開示のこの態様に従う方法は、患者に、抗ＬＲＰ１０抗体の任意の回数の第２の用量および／または第３の用量を投与することを含んでもよい。例えば、特定の実施形態において、単回の第２の用量のみが、患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の第２の用量が、患者に投与される。同様に、特定の実施形態において、単回の第３の用量のみが、患者に投与される。他の実施形態において、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の第３の用量が、患者に投与される。

【0160】

複数回の第２の用量を包含する実施形態において、第２の各用量は、他の第２の用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、第２の各用量は、直前の用量の１〜２週または１〜２ヵ月後に患者に投与されてもよい。同様に、複数回の第３の用量を包含する実施形態において、第３の各用量は、他の第３の用量と同じ頻度で投与されてもよい。例えば、第３の各用量は、直前の用量の２〜１２週後に患者に投与されてもよい。本開示の特定の実施形態において、第２の用量および／または第３の用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンのコースにわたって変動してよい。また、投与頻度は、臨床調査後の個々の患者の必要に応じて、医師によって処置中に調整されてもよい。

【0161】

本開示は、２〜６回のローディング用量が、第１の頻度（例えば、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、月１回、２ヵ月毎に１回その他）にて患者に投与され、続いて２回以上の維持用量が、頻度を減らして患者に投与される投与レジメンを含む。例えば、本開示のこの態様に従えば、ローディング用量が、例えば月１回の頻度で投与される（例えば、２、３、４回、またはそれ以上のローディング用量が、月１回投与される）ならば、維持用量が、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、８週毎に１回、１０週毎に１回、１２週毎に１回等、患者に投与されてもよい。

【実施例】

【0162】

行った実験および達成された結果を含む以下の実施例を、説明の目的でのみ記載しており、本開示を限定するものとして解釈するべきでない。

【0163】

［実施例１］
ヒトに用いられる抗体標的としてのＬＲＰ１０の発見
概要
ＥＮＵ突然変異誘発を用いて、ランダムな生殖細胞系列突然変異を生じさせて、現在まで、末梢血中の普通でないフローサイトメトリ表現型について、２，２８９血統から合計６５，１３０匹のＧ３突然変異マウスをスクリーニングした。これらのマウスは、プロテオームの全体にわたってコーディングまたはスプライシングに影響を及ぼす合計１２６，２２０個の点突然変異のキャリアであった。一血統（Ｒ０７６５）は、多数のＴ細胞（ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の双方）が血中に存在する表現型を示した。他の異常として、低いＢ：Ｔ細胞比、および低いＮＫ細胞数が挙げられた。原因となる突然変異を、ＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーをコードする遺伝子、Ｌｒｐ１０（Ｌｒｐ９としても知られている）内で同定した。続いて、類似の発見を、遺伝子の他の突然変異対立遺伝子で観察し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化は、８ｂｐのフレームシフト欠失突然変異によりこの影響を確認した。

【0164】

ＣＲＩＳＰＲノックアウトマウスを用いて、ホモ接合突然変異Ｔ細胞を、ケモカインＣＸＣＬ１２による刺激に応答する遊走活性について調査した。細胞は、この刺激に向かう、大いに増強された移動を示した。

【0165】

ＷＴ骨髄と５０：５０の比率にて混合して、照射したＷＴマウスに移植した場合、突然変異細胞は、ＷＴ細胞をかなり上回って増殖することが観察された。このことは、非常に強い増殖活性を示唆している。

【0166】

癌化学療法中に、必要に応じて、適切なモノクローナル抗体でＬＲＰ１０を中和することで、化学療法または照射の後の造血回復が補助されるであろうと提唱する。さらに、ＬＲＰ１０阻害が、チェックポイント阻害と同等であり、ＣＤ８ Ｔ細胞が、普通よりもずっと効果的に腫瘍に浸潤することを可能にし得ると提唱する。

【0167】

突然変異マウスおよびスクリーニング
以前に記載されるように（Ｗａｎｇ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１５ Ｆｅｂ ３；１１２（５），ＰＭＩＤ：２５６０５９０５）、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した８〜１０週齢の純血Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドの雄に、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）で突然変異を起こさせて、ランダムな生殖細胞系列突然変異を生じさせた。突然変異を起こしたＧ０雄を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交雑させて、結果として生じたＧ１雄を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌と交雑させて、Ｇ２マウスを生じさせた。Ｇ２雌を、そのＧ１雄親と戻し交雑させて、Ｇ３マウスを生じさせた。Ｇ３マウスを、末梢血中の普通でないフローサイトメトリ表現型の有無に関してスクリーニングした。現在まで、合計６５，１３０匹のＧ３突然変異マウスを、２，２８９血統からスクリーニングした。これらのマウスは、プロテオームの全体にわたってコーディングまたはスプライシングに影響を及ぼす合計１２６，２２０個の点突然変異のキャリアであった。

【0168】

ＦＡＣＳ分析
突然変異Ｇ３マウスを、先で述べたように、（Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア）ＥＮＵ−突然変異誘発および戦略的育種によって生成した。末梢血を、＞６週齢のＧ３マウスから頬採血によって収集した。ＲＢＣを、低張バッファー（ｅｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ、＃００−４３００−５４）で溶解した。サンプルを、ＦＡＣｓ染色バッファー（１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ入りＰＢＳ）で、５００×ｇにて６分間、１回洗浄した。ＲＢＣ枯渇サンプルを、蛍光コンジュゲート抗体の、主要な免疫系列を包含する１５個の細胞表面マーカー：Ｂ２２０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５７９５７）；ＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ、＃５６３５５７）；ＩｇＭ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５０８８１）；ＩｇＤ、ＣＤ３ｓ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５５３０６２）；ＣＤ４（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６２４６４）；ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７５２）；ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１０１２３７）；ＣＤ１１ｃ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６３０４８）；Ｆ４／８０（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５０−４８０１−Ｕ１００）；ＣＤ４４（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６２４６４）；ＣＤ６２Ｌ（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃６０−０６２１−Ｕ１００）；ＣＤ５（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６２７３９）；ＣＤ４３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５６０６６３）；ＮＫ １．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃５６４１４３）、および１：２００ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃３５２２３５）に対する１００μｌ １：２００カクテル中で、４℃にて１時間染色した。フローサイトメトリのデータを、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ細胞アナライザで収集して、各Ｇ３マウスにおける免疫細胞集団の割合を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。結果として生じたスクリーニングデータを、原因となる対立遺伝子の自動化マッピングのために、Ｍｕｔａｇｅｎｅｔｉｘにアップロードした。

【0169】

免疫の調節因子としてのＬＲＰ１０の発見
先のスクリーニング方法を用いて、ＥＮＵ突然変異マウスの血統Ｒ０７６５由来の複数のＧ３マウスは、末梢血ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合の増大を示した。他の異常として、低いＢ：Ｔ細胞比、および低いＮＫ細胞数が挙げられた。この表現型を、ｃｈｏｗｍｅｉｎと命名して、低密度リポタンパク質関連受容体１０（Ｌｒｐ１０）をコードする遺伝子（ＬＤＬ受容体ファミリーのメンバーをコードする遺伝子）のコーディング配列内の、おそらく有害なミスセンス突然変異にマッピングした。続いて、類似の発見を、遺伝子の他の突然変異対立遺伝子で観察し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９標的化は、８ｂｐのフレームシフト欠失突然変異によりこの影響を確認した。ＥＮＵ対立遺伝子は、単一の貫通受容体タンパク質のエクトドメイン内で、ポリペプチド鎖の位置２４６にて、アスパラギン酸のチロシンへの変化（Ｄ２４６Ｙ）をもたらした。

【0170】

原因および影響を確認するために、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、６．５Ｕの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃３６７２２２）に続く、４８時間後の６．５Ｕのヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｃ１０６３）の注射によって、過剰排卵させた。続いて、過剰排卵マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスと一晩交配させた。後日、受精卵を卵管から収集して、インビトロ転写したＣａｓ９ ｍＲＮＡ（５０ｎｇ／ｐｌ）およびＬｒｐ１０小塩基対合ガイドＲＮＡ（５０ｎｇ／ｐｌ；５’−ＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧＴＴＡ−３’）を、胚の細胞質または前核中に注入した。ＰＣＲプライマーは、
（フォワード）ＡＧＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡ（配列番号７１）
（リバース）ＴＣＡＣＣＴＡＧＧＴＴＣＴＣＡＣＴＡＧＣＣＣＣ ＧＴ（配列番号７２）
であった。

【0171】

配列決定プライマーは、ｔｇｇｇａｇｔｔｃｔｇｇｃａｃｔｔｃｃｃｔｇであった。注入した胚を、Ｍ１６培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｍ７２９２）内で３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２にて培養した。突然変異マウスの生成のために、２細胞ステージの胚を、偽妊娠ＨｓｄＴＣＲ（ＣＤ−１）（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃０３０）雌の卵管のアンプル中に移した（卵管あたり１０〜２０個の胚）。創始者Ｌｒｐ１０^−／−マウスは、第５のエキソン（ＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＧ（ＴＴＡＣＧＧＡＧ）ＡＴＧＣＡＧＴＧＣＡ）（配列番号７３）内に８ｂｐの欠失を有し（８ｂｐの欠失を括弧内に表す）、７１３個のアミノ酸の野生型ＬＲＰ１０タンパク質と比較して、１１７個のアミノ酸の後ろに、早期終了の原因となると予測されるフレームシフトが生じた。ＣＲＩＳＰＲ Ｌｒｐ１０ ＫＯ株を、ＦＡＣＳスクリーンに供したところ、ｃｈｏｗｍｅｉｎ内で観察される末梢ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の増大を再現していた。

【0172】

骨髄キメラ
レシピエントマウスに、５時間の間隔にて２回、Ｘ線照射器による６Ｇｙの照射をした。抗生物質の水を、照射後のレシピエントに与えた。

【0173】

ドナーＣ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．１）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯ（ＣＤ４５．２）ホモ接合体由来の大腿骨を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１００８２−１４７）、１０ユニット／ｍｌペニシリン、およびストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１５１４０−１２２）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃７２４００−１２０）を含有する小皿（氷上）内に入れた。大腿骨を、２５Ｇの針を用いて、この培地で洗い流した。小さい骨を除去するために、骨髄をホモジナイズして、溶液を滅菌４０μｍナイロン細胞ストレーナ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃３５２３４０）に通過させて、５０ｍｌチューブ内に収集した。容量を、培地で５０ｍｌにしてから、７００×ｇ、４℃にて５分間、遠心分離した。次に、細胞を、５ｍｌの赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｒ７７５７）中に再懸濁させて、１〜２分間インキュベートした。５ｍｌの滅菌ＰＢＳをチューブに加えて、１０μｌの細胞および１０μｌのトリパンブルーを混合して、細胞の総数をカウントした。次に、細胞を、７００×ｇにて５分間、遠心分離してから、細胞を１ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させて、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中に移して、氷上で維持した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．１）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）由来の骨髄細胞、または１：１の混合物を、眼窩後注射により、示したレシピエントマウス中に移した（図１）。末梢血を、移植後の時点にてサンプリングして、主要な免疫細胞集団内のドナーキメラの画分を、ＣＤ４５コンジェニックマーカー（ＣＤ４５．１ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１１０７３２、ＣＤ４５．２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１０９８１４）、ＣＤ３ｓ（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５５３０６２）、ＣＤ４（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６２４６４）、ＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７５２）、Ｂ２２０（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５７９５７）、ＣＤ１９（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｎｃｅ、＃５６３５５７）、ＣＤ１１ｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１０１２３７）、およびＮＫ １．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃５６４１４３）に対する蛍光コンジュゲート抗体を用いるフローサイトメトリで評価した。全体として、各実験において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯマウス（ＣＤ４５．２）由来の突然変異細胞は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．１）細胞を有意に上回って増殖することが観察され、このことは、非常に強い増殖活性を示唆した（図２、図３、および図４）。

【0174】

Ｔ細胞およびＨＳＣ遊走アッセイ
ＣＲＩＳＰＲノックアウトマウスを用いて、ホモ接合突然変異Ｔ細胞を、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）による刺激に応答する遊走活性について調査した（図５）。この実験を実行するために、総Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯホモ接合体の脾臓およびリンパ節から、陰性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９８５１）を用いて単離した。次に、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、これらのマウスの骨髄から、ＨＳＣ濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９７５６）を用いて単離した。次に、１０μｌの細胞および１０μｌのトリパンブルーを一緒に混合して、細胞の総数をカウントした。次に、細胞を、１０^７／ｍｌの密度にて１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ中に再懸濁させた。１００μｌのこの懸濁液（１０^６細胞）を、５ミクロンのポリカーボネート膜インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃ＣＬＳ３４２１−４８ＥＡ）を含有する２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上方チャンバに加えた。０、２０、または２００ｎｇ／ｍｌの間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２５０−２０Ａ）（ＣＸＣＬ１２としても知られている）を含有する６００μｌのＲＰＭＩ／１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを、下方チャンバに加えた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートを、３７度にて３．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、上方チャンバを破棄して、下方チャンバに移動した細胞を、ＣＤ４（ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ、＃５６２４６４）およびＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１００７５２）に対する蛍光コンジュゲート抗体で染色した。ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で３０秒以内に収集した総事象を測定することによって、細胞数を評価した。各ケモカイン濃度にて収集された事象の数を、インプット細胞集団の１：６希釈から３０秒以内に収集された事象の数で割ることによって、移動細胞のパーセンテージを算出した。全体として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｌｒｐ１０ ＫＯマウス由来の突然変異細胞は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス細胞と比較して、ＣＸＣＬ１２ケモカイン刺激に向かう、大いに増強された移動を示した（図５）。

【0175】

ｐ２１およびＦｒｉｚｚｌｅｄ−６についてのウェスタンブロットアッセイ：
Ｗｎｔシグナリング経路は、動物において、多く細胞の分化、増殖、および機能、ならびに発達、成長、およびホメオスタシスのプロセスにおいて、基本的な役割を果たす。低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質（ＬＲＰ）５およびＬＲＰ６は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体と共に、Ｗｎｔタンパク質の共受容体であり、標準的なＷｎｔ／ベータ−カテニンシグナリングの活性化をトリガーする。ＬＲＰ１０がどのようにＷｎｔ／β−カテニンシグナリングを調節するかについて理解するために、Ｔ細胞およびＨＳＣを、先に記載するように富化した。次に、バッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＫＣｌ）中に１％ＳＤＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃ＡＭ９８２０）、１：１０，０００ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｅ１０１４）、および１：１００プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃５８７１Ｓ）を含有するバッファー中に、非刺激細胞（約１０^６個）を溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。細胞抽出物（各２０μｌ；約１×１０^６細胞に相当）を、ＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ（商標）４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＮＰ０３３６ＢＯＸ）上で分離させて、タンパク質を、１２ボルトにて１時間、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１６２−０１１５）に転写した。０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を５（ｗ／ｖ）％ＢＳＡと共に含有するトリス緩衝生理食塩水中での室温にて２時間のブロッキングの後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ中５（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ内の一次抗体抗Ｐ２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ、＃ＳＣ−６２４６）、抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ、＃ＳＣ−３９３１１３）、および抗βアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃３７００Ｓ）と４℃にて一晩、穏やかに揺らしながらインキュベートした。次に、膜を、室温にて１時間、第２の抗体ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１０２１−０５）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１６０９６）、またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１６０９６）とインキュベートした。化学ルミネセンスシグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃ＰＩＡ３４０７５）を用いることによって発生させて、Ｇ：Ｂｏｘ Ｃｈｅｍｉ ＸＸ６系（Ｓｙｎｇｅｎｅ）によって検出した。図６に示すように、Ｌｒｐ１０^−／−Ｔ細胞、およびＬｒｐ１０^−／−造血細胞は、Ｗｎｔシグナリングの最終生成物であるｐ２１の発現がより高い。また、Ｌｒｐ１０^−／−Ｔ細胞およびＬｒｐ１０^−／−造血細胞は双方とも、膜貫通受容体、Ｆｉｚｚｌｅｄ ６を発現する。合わせて、このデータは、Ｌｒｐ１０^−／−Ｔ細胞およびＬｒｐ１０^−／−造血細胞の競合潜在性の増大が、非標準的なＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路に依存することを実証している。

【0176】

フローサイトメトリ：
末梢血球を単離して、赤血球（ＲＢＣ）溶解バッファーを加えて、ＲＢＣを除去した。細胞を、主要な免疫系列を包含する以下のマウス細胞表面マーカー、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ３ｓ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４４、ＣＤ４３、ＣＤ２５、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＢＰ−１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＮＫ１．１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、Ｆ４／８０、ＣＤ６２Ｌ（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的な１５個のマウス蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体で、抗マウスＣＤ１６／３２抗体（Ｔｏｎｂｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で４℃にて１時間、１：２００の希釈にて染色した。染色後、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄して、フローサイトメトリによって分析した。

【0177】

図７に示すように、Ｌｒｐ１０の細胞外ドメイン内の点突然変異（Ｄ２４６Ｙ）が、ＥＮＵ突然変異誘発中に生じた。この突然変異についてホモ接合のマウスは、その末梢血中のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増大を示した。これを、ｃｈｏｗｍｅｉｎ（Ｌｒｐ１０^{ｃｈ／ｃｈ}）と命名した。この突然変異は、遺伝形式が劣性であった。というのも、ヘテロ接合体（Ｌｒｐ１０^＋／ｃｈ）および野生型マウス（Ｌｒｐ１０^＋／＋）が影響を受けなかったからである。

【0178】

腫瘍接種、抗ＰＤ−１処置、および腫瘍測定：
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を、１０ｖｏｌ／ｖｏｌ％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させた。１００μＬのＤＰＢＳ中の合計２×１０^５個のＢ１６Ｆ１０細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、野生型、ヘテロ接合、およびホモ接合のＬＲＰ１０ ＣＲＩＳＰＲ ＫＯマウスの右脇腹中にｓ．ｃ．注射して、腫瘍を確立した。抗ＰＤ−１処置のために、２００ｐＬのＤＰＢＳ中３００μｇの抗ＰＤ−１を、腫瘍接種後の５、８、および１１日目にマウス中にｉ．ｐ．注射した。腫瘍を、デジタルキャリパ（Ｆｉｓｈｅｒ）で測定して、腫瘍サイズを、容積＝０．５×長さ×幅^２の式を用いて算出した。腫瘍の長さまたは幅が２ｃｍに達したときに、マウスを殺した。

【0179】

図８に示すように、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いてＬｒｐ１０ノックアウトマウス（Ｌｒｐ１０^−／−）を用意した。Ｌｒｐ１０^＋／＋マウスおよびＬｒｐ１０^−／−マウスに、同系のＢ１６黒色腫腫瘍細胞株を皮下注射した。腫瘍細胞注射の７日後に、マウスに、チェックポイント阻害用の抗ＰＤ１の腹腔内注射を与えた。腫瘍容積を、腫瘍注射後の１７、１９、および２４日目に測定した。Ｌｒｐ１０^−／−は、これらの時点にて有意に低い平均腫瘍容積を示した。

【0180】

図９に示すように、腫瘍注射後１９日目に、末梢血を、Ｂ１６を有するＬｒｐ１０^＋／＋マウスおよびＬｒｐ１０^−／−マウスから収穫した。担腫瘍Ｌｒｐ１０^−／−マウスは、末梢血中の総Ｔ細胞の割合がより高かった。腫瘍ナイーブＬｒｐ１０^−／−と対照的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞のみが、担腫瘍Ｌｒｐ１０^−／−マウスにおいて上昇し、そして、ＣＤ４４発現によって測定されるエフェクタ表現型が活性化された。

【0181】

［実施例２］
ＬＲＰ１０モノクローナル抗体の生成
ＮＣＢＩ ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／６５１０７）ＬＲＰ１０の分析に基づいて、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＬＲＰ１０由来の２つのフラグメント（ＸＰ＿００６５１９４２１．１およびＮＰ＿０７５３６９．２）が、Ｌｒｐ１０ ＥＳＴライブラリー由来の代わりにスプライスした転写産物として予測されると判断した。また、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／２６０２０）ＬＲＰ１０（ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）においてＬＲＰ９としても知られている）の分析に基づいて、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＬＲＰ１０由来の３つのフラグメント（ＮＰ＿００１３１６１５５．１、ＮＰ＿０５４７６４．２、ＸＰ＿００５２６７５６７）が、Ｌｒｐ１０ ＥＳＴライブラリー由来の代わりにスプライスした転写産物として予測されると判断した。標準的なＬＲＰ１０タンパク質としてのヒトＮＰ＿０５４７６４．２およびマウスＮＰ＿０７５３６９．２は双方とも、ＳｉｇｎａｌＰ ４．１（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）によって分析されるように、１７残基シグナルペプチドを有する７１３残基長である。ヒトＬＲＰ１０タンパク質は、マウスＬＲＰ１０タンパク質に対する同一性が８８％である。５１６−、７１３−、または７２１−残基変異体が挙げられる３つのヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＬＲＰ１０タンパク質変異体を、ＣｌｕｓｔａｌＷによってアラインした。標準的なタンパク質と比較して、２つのアイソフォームは、残基１３５〜１４３を欠いており、そしてヒトＬＲＰ１０アイソフォーム２は、最後の１５７残基を欠いている。標準的なヒトＬＲＰ１０タンパク質は、最初の４４０残基からなるエクトドメイン、残基４４１〜４６３からなる膜貫通ドメイン、および残基４６４〜７１３からなる細胞内ドメインを有する。ヒトＬＲＰ１０タンパク質の全てのアイソフォームを標的化するために、アイソフォーム２を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ／Ｐｒｏｔｅａｎによって分析した。この分析に基づいて、残基第１５９〜第１９２、第２９４〜第３６０、および第３７８〜第４３４のポリペプチドは、抗ヒトＬｒｐ１０抗体の候補である。

【0182】

免疫原としての使用について表すことができる、タンパク質の最初の４２０アミノ酸のアミノ酸配列は、
＞ｓｐ｜Ｑ７Ｚ４Ｆ１｜ＬＲＰ１０＿ＨＵＭＡＮ 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１０ ＯＳ＝ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ） ＧＮ＝ＬＲＰ１０ ＰＥ＝１ ＳＶ＝２（配列番号７４）である。
ＭＬＬＡＴＬＬＬＬＬＬＧＧＡＬＡＨＰＤＲＩＩＦＰＮＨＡＣＥＤＰＰＡＶＬＬＥＶＱＧＴＬＱＲＰＬＶＲＤＳＲＴＳＰＡＮＣＴＷＬＩＬＧＳＫＥＱＴＶＴＩＲＦＱＫＬＨＬＡＣＧＳＥＲＬＴＬＲＳＰＬＱＰＬＩＳＬＣＥＡＰＰＳＰＬＱＬＰＧＧＮＶＴＩＴＹＳＹＡＧＡＲＡＰＭＧＱＧＦＬＬＳＹＳＱＤＷＬＭＣＬＱＥＥＦＱＣＬＮＨＲＣＶＳＡＶＱＲＣＤＧＶＤＡＣＧＤＧＳＤＥＡＧＣＳＳＤＰＦＰＧＬＴＰＲＰＶＰＳＬＰＣＮＶＴＬＥＤＦＹＧＶＦＳＳＰＧＹＴＨＬＡＳＶＳＨＰＱＳＣＨＷＬＬＤＰＨＤＧＲＲＬＡＶＲＦＴＡＬＤＬＧＦＧＤＡＶＨＶＹＤＧＰＧＰＰＥＳＳＲＬＬＲＳＬＴＨＦＳＮＧＫＡＶＴＶＥＴＬＳＧＱＡＶＶＳＹＨＴＶＡＷＳＮＧＲＧＦＮＡＴＹＨＶＲＧＹＣＬＰＷＤＲＰＣＧＬＧＳＧＬＧＡＧＥＧＬＧＥＲＣＹＳＥＡＱＲＣＤＧＳＷＤＣＡＤＧＴＤＥＥＤＣＰＧＣＰＰＧＨＦＰＣＧＡＡＧＴＳＧＡＴＡＣＹＬＰＡＤＲＣＮＹＱＴＦＣＡＤＧＡＤＥＲＲＣＲＨＣＱＰＧＮＦＲＣＲＤＥＫＣＶＹＥＴＷＶＣＤＧＱＰＤＣＡＤＧＳＤＥＷＤＣＳＹＶＬＰＲＫ

【0183】

完全長とは対照的に、上述のエクトドメインの一部を免疫原として用いることもできる。当該技術において知られている様々な方法、および本明細書中に開示した方法を、完全ヒトまたはヒト化抗ＬＲＰ１０抗体を生成するのに用いてもよい。また、例えば、先に述べたように、完全ヒトＬＲＰ１０抗体を、ファージディスプレイライブラリーから生成することもできる。ヒト化抗ＬＲＰ１０抗体を、ハイブリドーマから得たモノクローナル抗体をヒト化することによって調製することができる。

【0184】

例えば、親和性クロマトグラフィによる精製に適したＣ末端Ｈｉｓタグを、免疫原に加えてよい。精製したタンパク質を、適切なアジュバントと共にマウスに接種してもよい。ハイブリドーマ内で生成されたモノクローナル抗体を、免疫原への結合について試験してもよく、そして陽性のバインダーを、Ｔ細胞の移動を中和し、または先に記載するアッセイにおいてヒトリンパ系細胞内でＦｒｉｚｚｌｅｄおよび／もしくはｐ２１発現に影響を与える能力の有無に関してスクリーニングしてもよい。その後、抗体を、臨床前研究および臨床研究のためにヒト化してもよい。

【0185】

バイオパニングおよびスクリーニング：
典型的なバイオパニングは、許容可能な富化を達成するために、３〜５ラウンドを含む。
１．ライブラリーバイオパニング
１）ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、５０ｐＬのコーティングバッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＣｈ、ｐＨ９．６）中の対象とする２μｇ標的でコーティングして、４℃にて一晩インキュベートする。コーティング溶液を捨てて、ウェルを、０．１％ＰＢＳＴ［０．１（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ ２０入りＰＢＳ］の洗浄バッファーで３回洗浄して、３００ｐＬブロッキングバッファー［２％ＰＢＳＭ（２％スキムミルクを含有するＰＢＳ）］を加えることによって、ウェルをブロックする。シールして、４℃にて一晩インキュベートする。
２）ブロッキングバッファーを捨てて、５０〜１００ｐＬのファージライブラリー（約１０^１１個のファージ粒子）を各ウェル（４ウェル）に加える。シールして、３７℃にて２時間インキュベートする。
３）使い終ったファージ溶液を除去する。ＥＬＩＳＡプレートウォッシャ機を用いて、コーティングした表面を９回洗浄する
４）最終洗浄溶液を除去した後に、２００ｐＬの溶出バッファーを加えて、３７℃にて１０分間インキュベートする。激しく１０回ピペッティングする。溶出液を、１００ｐＬの中和バッファーを含有するミクロフュージチューブに移す。
２．ファージ滴定
１）２×ＹＴ培地中にファージの連続希釈を用意する（ファージインプットについて、１０^{１２〜１３}ファージ／ｍＬの力価を予想する。１０^−８〜１０^−１０に希釈する。ファージアウトプットについて、ラウンド１について１０^−１〜１０^−４に希釈する一方、ラウンド２および３について１０^−２〜１０^−６に希釈する）。
２）５００ｐＬの対数期大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１（ＯＤ６００≪０．５）（３０分３７℃）を加える。
３）２％グルコースおよび１００ｐｇ／ｍＬアンピシリンを含有する２×ＹＴアガー上に１００ｐＬの感染細胞をプレーティングして、３７℃にてＯ／Ｎ増殖させる。
３．選択したファージの救出
１）総アウトプットを６ｍＬ ＴＧ１（ＯＤ_６００、^３／４０．５）に加えることによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１を、溶出したファージアウトプットで感染させる。
２）感染を、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートする。
３）９ｍＬ ２×ＹＴ−ＡＧ培地を加える。３７℃にて一晩増殖させる。
４）４℃、５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離する。ペレットを、１５％グリセロールを含有する２×ＹＴ培地中に再懸濁させて、−８０℃にて保存する。今後の選択用に救出されるべきストックをマスターする。
４．バイオパニングの次のラウンド用のファージ増幅
１）救出したグリセロールストックの一部を、２５ｍＬ ２×ＹＴ−ＡＧ培地中に接種する。
２）３７℃での振盪によって指数期（ＯＤ_６００、≒０．５）まで増殖させる。
３）約２×１０^１１ｐｆｕ Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを加える。
４）感染を、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートする。
５）５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離する。
６）ペレットを、２５ｍＬの２×ＹＴ−ＡＫ培地中に再懸濁させる。
７）２５０ｍＬフラスコに移す。３０℃にて一晩振盪（２２５ｒｐｍ）して、増殖させる。
５．バイオパニングの次のラウンド用のファージ精製
１）５０ｍＬ遠心管内の培養体を、４，０００ｇにて２０分間スピンして、細菌をペレット化させる。
２）上清に、５×ＰＥＧ／ＮａＣｌの容積の５分の１を加えて、少なくとも１時間氷上に置く。
３）４℃、１２，０００ｇにて１５分間スピンすることによって、ファージをペレット化させる。
４）上清を捨てる。
５）ペレットを１ｍＬ滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させる。
６）１．５ｍＬマイクロ遠心管に移す。
７）マイクロ遠心管内でスピンして（２分、最大ｇ）、残りの細菌を除去する。
８）上清を新しいチューブに移す。この時、ファージは、更なるスクリーニングラウンドまたは選択アッセイに用いる準備が整っている。ファージを、力価の大きな低下なく、４℃にて保存することができる。長期保存のために、グリセロールを２０％まで加えて、−８０℃にて保存する。

【0186】

抗体の発現および精製
１．抗体の軽鎖および重鎖のｃＤＮＡを、哺乳動物の発現用に最適化して化学的に合成した。ｃＤＮＡを、発現ベクター中にクローニングした。
２．軽鎖および重鎖のコーディング遺伝子を、３０ｍＬの２９３Ｆ細胞に共形質移入した。上清を、トランスフェクション後の６日目に収穫した。
３．抗体を、固定したプロテインＡを用いる親和性クロマトグラフィによって精製した。
１）１ｍｌのプロテインＡピュアレジンを、新しいディスポーザブルプラスチック重力流カラムに移す。樹脂を、１０カラム容量（ＣＶ）の超高純度水で洗浄してから、１０ＣＶのＴＢＳ、ｐＨ７．５／８．０バッファーで平衡化させる。
２）濾過した抗体上清をカラムにアプライして、重力によって流を通過させる。１０ＣＶのＰＢＳで樹脂を２回洗浄する。上清および洗浄液の双方からフロースルーを収集して、氷上に、または４℃にて、更なる分析用に維持する。
３）結合した抗体の溶出のために、４ｍｌのグリシン−ＨＣｌ溶出バッファー（ｐＨ２．７）を加えて、フロースルーを、１ｍｌのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ７．６）で予備充填したチューブ中に収集する。上記のように、更なる画分を収集する。画分のＯＤ２８０ｎｍがゼロであるときに（これは通常、３〜５画分後である）、溶出を止める。
４）溶出後、樹脂を、１０ＣＶのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）、１０ＣＶのＰＢＳ、１０ＣＶの超高純度水、および１０ＣＶの２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％エタノールでの順次的な洗浄にかける。樹脂を、今後の使用のために、２０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％エタノール中に４℃にて保存する。
５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって全ての画分を分析する。
６）画分を、可視タンパク質バンドと組み合わせて、透析チューブを用いて、＞３０容量の低エンドトキシンＰＢＳバッファーに対して４℃にて少なくとも２時間透析する。
７）透析されたタンパク質を、ＰＢＳで予め洗浄した遠心濃縮器（＜１０ｋＤａのカットオフ）を用いて濃縮する。
８）濃縮したサンプルを、シリンジ駆動０．２２ｐｍフィルターによって濾過して、タンパク質濃度をＢＣＡ法によって算出する。

【0187】

ＥＬＩＳＡ試験：
１）特定のコーティングバッファー（０．１Ｍ ＮａＨＣＣｂ、ｐＨ９．６）中の標的タンパク質ＬＲ１０（１ｐｇ／ｍｌ、０．１ｐｇ／ウェル）をコーティングする。４℃にて一晩インキュベートする。
２）ウェルあたり３００ｐＬの洗浄バッファー（０．１％ＰＢＳＴ）でウェルを３回洗浄する。
３）３００ｐＬのブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ）で３７℃にて１時間、ウェルをブロックする。
４）ブロッキングバッファーを捨てて、洗浄バッファーでプレートを３回洗浄して、プレートをうつ伏せにして、毎回、紙タオルのきれいな部分にたたきつける。
５）ウェルあたり１００ｐＬの段階希釈抗体を加える。３７℃にて１時間インキュベートする。
６）洗浄バッファーで３回洗浄する。ＨＲＰヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：４，０００）をブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ）中に希釈する。ウェルあたり１００ｐＬの希釈コンジュゲートを加えて、３７℃にて１時間インキュベートする。
７）洗浄バッファーで３回洗浄する。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を０．１ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸−リン酸バッファー中に溶解して、１μＬ／ｍＬ Ｈ２Ｏ２を溶液に加える。ウェルあたり１００μＬの基質溶液を加えて、室温にて１５分間インキュベートする。
８）１００ｐＬの２ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４溶液を加えて、反応を止める。
９）４９０ｎｍにセットしたマイクロプレートリーダーを用いて、プレートを読む。

【0188】

結果：
Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．のファージディスプレイＨｕＳｃｌ−２（商標）ライブラリーを、３ラウンドのバイオパニングに用いた。Ｈｉｓタグを付けた組換えヒトＬＲＰ１０タンパク質、ＬＲＰ１０−５１６Ｈを、抗原として用いた。第３ラウンドのバイオパニング由来のサブライブラリーの配列決定により、以下のＶＬ配列およびＶＨ配列（アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の双方）を有する固有の９クローンを同定した。なお、完全な抗体配列について、各ＶＬは、軽鎖定常領域、例えばＣｋ（配列番号３１）に連結されて、完全な軽鎖を形成し得、そして各ＶＨは、重鎖定常領域、例えばヒトＩｇＧ１ ＣＨ１２３（配列番号３２）に連結されて、完全な重鎖を形成し得る。

【0189】

クローン１（ＡＢ１）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＡＳＤＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＳＲＴＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号２）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＱＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号３）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号４）：
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クローン２（ＡＢ２）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号５）：
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ＶＨ（配列番号２）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＱＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＰＰＧＧＰＮＴＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号６）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＣＣＣＧＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号４）：
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＡＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
クローン３（ＡＢ３）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号７）：
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ＶＨ（配列番号８）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＱＩＧＴＭＧＲＰＴＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＧＫＫＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号９）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＣＣＧＡＣＴＴＣＧＴＴＧＣＣＴＣＴＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号１０）：
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クローン４（ＡＢ４）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＡＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＤＳＹＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号１２）：
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ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号１３）：
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ＶＨ（配列番号１４）：
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クローン５（ＡＢ５）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１５）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＲＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＩＫＴＲＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号１６）：
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ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号１７）：
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ＶＨ（配列番号１８）：
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クローン６（ＡＢ６）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１９）：
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ＶＨ（配列番号２０）：
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ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号２１）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＣＴＴＣＴＧＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号２２）：
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クローン７（ＡＢ７）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号２３）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＤＹＹＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号２４）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＡＴＴＧＮＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＴＡＴＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号２５）：
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ＶＨ（配列番号２６）：
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クローン８（ＡＢ８）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＡＳＤＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＳＲＴＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号２７）：
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ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号３）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号２８）：
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クローン９（ＡＢ９）
タンパク質配列
ＶＬ（配列番号１）：
ＴＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＡＳＤＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＳＲＴＰＴＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
ＶＨ（配列番号２９）：
ＭＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＹＴＳＧＡＡＴＴＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＳＹＰＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ヌクレオチド配列
ＶＬ（配列番号３）：
ＡＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＣＣＧＡＴＴＴＧＣＡＡＡＧＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＣＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＣＧＣＧＧＡＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ
ＶＨ（配列番号３０）：
ＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＡＡＡＧＴＴＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＧＡＧＣ
Ｃｋアミノ酸配列（配列番号３１）：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
ＩｇＧ１ ＣＨ１２３アミノ酸配列（配列番号３２）：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ

【0190】

発明者らは、哺乳動物細胞の発現用のこれらの抗体のｃＤＮＡを化学的に合成した。軽鎖および重鎖の遺伝子をそれぞれ、発現ベクター中にクローニングして、２９３Ｆ細胞中に共形質移入した。発明者らは、最初に、抗体発現試験用の各クローンについて、８０ｍＬの培養液を用いた。図１０に示すように、８抗体が首尾よく発現した一方、ＡＢ５の発現は低過ぎて、検出できなかった。プロテインＡベースの親和性クロマトグラフィによる精製の後、８つの抗体は全て、高い純度を達成した。

【0191】

クローンＡＢ５について、発明者らはまた、ＣＨＯ発現系を試みたが、その発現レベルはなお、非常に低かった。このことは、このクローンの不十分な発現度が、抗体配列それ自体に起因することを示している。

【0192】

８つの十分に発現された抗体について、発明者らは、ＥＬＩＳＡによって、標的抗原に対する結合活性を試験した（表７および図１１）。８クローンのうち、５つ［ＡＢ１（Ｌ１＋Ｈ１）、ＡＢ２（Ｌ２＋Ｈ１）、ＡＢ３（Ｌ３＋Ｈ２）、ＡＢ７（Ｌ７＋Ｈ６）、およびＡＢ８（Ｌ１＋Ｈ７）］が、抗原への高い親和性を示したが、他の３つの抗体は、結合活性を示さなかった。

【0193】

５つの高親和性抗体について、ＡＢ１およびＡＢ２は、最良の結合活性を示した。このことは、これらの２つの配列の頻度が最も高いという配列決定の結果と一致した。

【0194】

【表7】

【0195】

［実施例３］
モノクローナル抗体の機能試験
ウェスタンブロット
Ｐ２１の発現を、ヒト抗体によるＬｒｐ１０機能のブロッキングについて調査した。直接的ウェスタンブロット分析のために、陰性選択方法（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９８５１）を用いて単離した精製脾臓汎Ｔ細胞を、１００μｇ／ｍｌヒト抗Ｌｒｐ１０抗体ＡＢ１、ＡＢ２、ＡＢ３、ＡＢ４、ＡＢ６、ＡＢ７、ＡＢ８、またはＡＢ９と共に、または無しで４時間培養して、バッファーＡ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＫＣｌ）中１（ｗ／ｖ）％ＳＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ）、０．０１（ｗ／ｖ）％ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のバッファー中に溶解した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて測定した。１０μｇのタンパク質を、４〜１２％ビス−トリスタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離させて、タンパク質を、１３ボルトにて４５分間、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。５（ｗ／ｖ）％スキムミルク（ＮＦＤＭ）入り０．０５（ｖ／ｖ）％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するトリス緩衝生理食塩水内での室温にて１時間のブロッキングの後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ中５（ｗ／ｖ）％ＢＳＡ内の一次抗体抗Ｐ２１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）および抗βアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と４℃にて一晩、穏やかに揺らしながらインキュベートした。次に、膜を、室温にて１時間、第２の抗体ヤギ抗ウサギまたはマウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）と、穏やかに揺らしながらインキュベートした。化学ルミネセンスシグナルを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｄｕｒａ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｕｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いることによって発生させて、Ｇ：Ｂｏｘ Ｃｈｅｍｉ ＸＸ６系（Ｓｙｎｇｅｎｅ）によって検出した。全体として、ＡＢ２は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス細胞において、Ｐ２１発現の大きな増強を示した。

【0196】

発明者らは、Ｌｒｐ１０^−／−マウスから精製したＴ細胞が、Ｌｒｐ１０^＋／＋Ｔ細胞と比較して、細胞周期インヒビターｐ２１の発現を増大させたことを以前に観察した。Ｔ細胞を、Ｌｒｐ１０^＋／＋マウスの脾臓から精製して、様々な抗ヒトＬｒｐ１０クローンとインキュベートした。Ｐ２１発現レベルを、ウェスタンブロットで測定した。図１２に示すように、非処理のＴ細胞と、抗Ｌｒｐ１０抗体で処理したＴ細胞との間に、ｐ２１発現の差異はなかった。抗体２で処理したＴ細胞は、約３５ｋｄにて強い免疫反応バンドを示した。これは、翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはＳＵＭＯ化）の誘導を反映しているかもしれない。左右のパネルは、２つの別個の実験を示す。

【0197】

Ｔ細胞遊走アッセイ
Ｃ５７ＢＬ／６を用いて、Ｔ細胞を、Ｃ−Ｘ−Ｃのモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）による刺激に応答する遊走活性について調査した。この実験を実行するために、総Ｔ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓およびリンパ節から、陰性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１９８５１）を用いて単離した。次に、１０μｌの細胞および１０μｌのトリパンブルーを一緒に混合して、細胞の総数をカウントした。次に、細胞を、１０^７／ｍｌの密度にて１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを含有するＲＰＭＩ中に再懸濁させた。１００μｌのこの懸濁液（１０^６細胞）を、５０μｇ／ｍｌ Ｌｒｐ１０抗体と、または無しで３０分間前処理してから、細胞を、５ミクロンのポリカーボネート膜インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃ＣＬＳ３４２１−４８ＥＡ）を含有する２４ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上方チャンバに加えた。２００ｎｇ／ｍｌの間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２５０−２０Ａ）（ＣＸＣＬ１２としても知られている）を含有する、５０μｇ／ｍｌ Ｌｒｐ１０抗体入り、または無しの６００μｌのＲＰＭＩ／１（ｗ／ｖ）％ＢＳＡを、下方チャンバに加えた。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートを、３７度にて３．５時間インキュベートした。インキュベーションの後、上方チャンバを破棄して、下方チャンバに移動した細胞を、ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ上で６０秒以内に収集した総事象を測定することによって評価した。各ケモカイン濃度にて収集された事象の数を、インプット細胞集団の１：６希釈から６０秒以内に収集された事象の数で割ることによって、移動細胞のパーセンテージを算出した。全体として、ＡＢ２およびＡＢ７は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス細胞において、ＣＸＣＬ１２ケモカイン刺激に向かう、大いに増強された移動を示した。

【0198】

群間の差異の統計学的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて、示す統計学的検定を実行することによって分析した。Ｐ＜０．０５とき、群間の生の値の差異を、統計学的に有意であると考えた。Ｐ値を、^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．０１；^＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、Ｐ＞０．０５（有意でない）によって表す。

【0199】

発明者らは以前に、Ｌｒｐ１０^−／−Ｔ細胞が、トランスウェルアッセイにおいて、ＳＤＦ−１（Ｃｘｃｌ１２、ＣＸＣＲ４のリガンド）に応答する移動速度の増大を示すことを観察した。Ｌｒｐ１０^＋／＋脾細胞を、様々な抗Ｌｒｐ１０抗体クローンと、またはビヒクルとインキュベートして、トランスウェルチャンバの上方ウェル内に入れた。下方チャンバは、ＳＤＦ−１を２００ｎｇ／ｍｌにて含有した。細胞を、３．５時間移動させた。その後、下方チャンバ内の移動したＴ細胞の数を、フローサイトメーターでカウントした。移動速度を、インプット数に対する、移動したＴ細胞の数として表現する。図１３に示すように、抗Ｌｒｐ１０抗体は全て、ビヒクルのみと比較して、より高い移動速度を誘導した。抗体２、７、および８は、ＳＤＦ−１に応答して、ビヒクルよりも約２倍高い最高移動速度を誘導した。

【0200】

本開示の種々の態様は、単独で、組み合わせて、または先に記載される実施形態において具体的に考察されていない種々の配置で用いられてもよいので、その用途において、先の説明で示される、または図中で例示される構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一実施形態に記載される態様は、いかなる方法であれ、他の実施形態に記載される態様と組み合わされてもよい。

【0201】

本開示の特定の実施形態が考察されてきた一方、上の詳述は実例であって、制限ではない。本開示の多くの変形が、本明細書をレビューして直ぐに、当業者に明らかとなろう。本開示の完全な範囲は、特許請求の範囲、およびその均等物の完全な範囲、ならびに本明細書、およびそのような変形の参照によって決定されるべきである。

【0202】

引用による組込み
本明細書中で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が、全ての目的についてその全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとすることが具体的に示されているかの如く、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】