特表 2021-505200 ゲノムインプリンティングの障害を治療するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-505200(P2021-505200A)

(43)【公表日】2021年2月18日

(54)【発明の名称】ゲノムインプリンティングの障害を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20210122BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210122BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210122BHJP

   C12N 5/074 20100101ALI20210122BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20210122BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20210122BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210122BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210122BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210122BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 ZZNA

   C12N15/62 Z

   C12N5/10

   C12N5/074

   A61K31/7105

   A61K38/46

   A61K48/00

   A61P43/00 105

   C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】72

(21)【出願番号】特願2020-550047(P2020-550047)

(86)(22)【出願日】2018年12月7日

(85)【翻訳文提出日】2020年8月5日

(86)【国際出願番号】US2018064517

(87)【国際公開番号】WO2019113472

(87)【国際公開日】20190613

(31)【優先権主張番号】62/596,397

(32)【優先日】2017年12月8日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】502139046

【氏名又は名称】ユニヴァーシティ オブ コネチカット

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100156982

【弁理士】

【氏名又は名称】秋澤 慈

(72)【発明者】

【氏名】チェンバレン ストーミー

(72)【発明者】

【氏名】コットニー ジャスティン

(72)【発明者】

【氏名】ラングエ マエヴァ

(72)【発明者】

【氏名】ラランド マーク

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA49Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA27

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084CA56

4C084DC22

4C084NA14

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZC541

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB21

4C086ZC54

(57)【要約】

本明細書では、対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための組成物、キット、及び方法が開示される。その方法は、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）結合部位を、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて低減されるように改変することを含み得る。このＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。更に、ＺＮＦ２７４結合部位又はＺＮＦ２７４タンパク質をコードする遺伝子に結合するＤＮＡターゲッティングシステムも提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１３、配列番号１４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８又は配列番号４８に相当するポリヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。

【請求項2】

ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムであって、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、ＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項3】

少なくとも１つのｇＲＮＡ内に、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項4】

ＺＮＦ２７４タンパク質をコードする遺伝子に結合するＤＮＡターゲッティングシステムであって、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、ＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項5】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項6】

Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項7】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はこれらの変異体を含む、請求項６に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項8】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、請求項７に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項9】

前記Ｃａｓタンパク質が、ＮＧＧ（配列番号２）、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＡＮ（配列番号４９）又はＮＧＮＧ（配列番号５０）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９を含む、請求項６に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【請求項10】

請求項１に記載のｇＲＮＡ分子を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。

【請求項11】

請求項２〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステムをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。

【請求項12】

請求項１０又は１１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。

【請求項13】

請求項１に記載のｇＲＮＡ分子及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードするベクター。

【請求項14】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はその変異体を含む、請求項１３に記載のベクター。

【請求項15】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、請求項１４に記載のベクター。

【請求項16】

請求項１に記載のｇＲＮＡ、請求項２〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、請求項１０若しくは１１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のベクター、又はこれらの組合せを含む細胞。

【請求項17】

前記細胞がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）患者由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１６に記載の細胞。

【請求項18】

前記ｉＰＳＣがＰＷＳ１−７大領域欠失細胞株又はＵＰＤ１−２細胞株である、請求項１７に記載の細胞。

【請求項19】

請求項１に記載のｇＲＮＡ、請求項２〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、請求項１０若しくは１１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞、又はこれらの組合せを含むキット。

【請求項20】

請求項１に記載のｇＲＮＡ、請求項２〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、請求項１０若しくは１１に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞、又はこれらの組合せを含む医薬組成物。

【請求項21】

対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法であって、
前記対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）結合部位を、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて低減されるように改変すること
を含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、方法。

【請求項22】

ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて少なくとも９０％低減される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が排除される、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置が、ＺＮＦ２７４結合部位の改変前にサイレントである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記障害がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位の完全欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の部分的欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチドの突然変異、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチド位置での切断、又はこれらの組合せにより改変される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムを前記対象又は前記対象の細胞に投与することにより改変され、前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムをコードする単離されたポリヌクレオチドを投与することにより改変され、前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＤＮＡターゲッティングシステムがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法であって、
前記対象に、ＺＮＦ２７４タンパク質と、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるＺＮＦ２７４結合部位との相互作用を対照に比べて低減する薬剤の薬学上有効な量を投与することを含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、方法。

【請求項33】

前記薬剤が配列特異的ヌクレアーゼ、又は配列特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムがＺＮＦ２７４結合部位に結合し、且つ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はその変異体を含む、請求項３７又は３８に記載の方法。

【請求項40】

前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

１５ｑ１１−ｑ１３内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

１５ｑ１１−ｑ１３のプラダー・ウィリー症候群責任領域（ＰＷＳＣＲ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

ゲノム座標ｈｇ１９ ｃｈｒ１５：２５，０１２，９６１−２５，６８５，２５３又はｃｈｒ１５：２３，６９５，６０３−２５，０２６，５５８から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＨＧ１４、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

ＳＮＲＰＮエキソン２、ＳＮＲＰＮエキソン３、ＳＮＲＰＮエキソン４、ＵＢＥ３Ａ、ＭＡＧＥＬ２、ＭＫＲＮ３、ＳＮＲＰＮエキソンＵ４、ＮＤＮ、又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの発現が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ａプロモーター、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂプロモーター、又はこれらの組合せからの転写の開始が増強される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の結合が低減される、請求項２１〜４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための製剤であって、母性ヌクレオチド配列上のＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合を対照に比べて低減する薬剤を含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、製剤。

【請求項49】

前記障害がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）である、請求項４８に記載の製剤。

【請求項50】

前記薬剤が１５ｑ１１−ｑ１３内の少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化させる、請求項４８に記載の製剤。

【請求項51】

前記薬剤が１５ｑ１１−ｑ１３のプラダー・ウィリー症候群責任領域（ＰＷＳＣＲ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化させる、請求項４８に記載の製剤。

【請求項52】

前記薬剤がゲノム座標ｈｇ１９ ｃｈｒ１５：２５，０１２，９６１−２５，６８５，２５３又はｃｈｒ１５：２３，６９５，６０３−２５，０２６，５５８から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現を活性化させる、請求項４５に記載の製剤。

【請求項53】

前記薬剤がＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＨＧ１４、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現を活性化させる、請求項４８に記載の製剤。

【請求項54】

前記薬剤がＳＮＲＰＮエキソン２、ＳＮＲＰＮエキソン３、ＳＮＲＰＮエキソン４、ＵＢＥ３Ａ、ＭＡＧＥＬ２、ＭＫＲＮ３、ＳＮＲＰＮエキソンＵ４、ＮＤＮ、又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの発現を活性化させる、請求項４８に記載の製剤。

【請求項55】

前記薬剤がＳＮＲＰＮ Ｕ１Ａプロモーター、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂプロモーター、又はこれらの組合せからの転写の開始を活性化させる、請求項４８に記載の製剤。

【請求項56】

前記薬剤がＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合を低減する、請求項４８に記載の製剤。

【請求項57】

前記対照が改変されていないＺＮＦ２７４結合部位を含む、請求項２１〜４７のいずれか一項に記載の方法又は請求項４８〜５６のいずれか一項に記載の製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１２月８日出願の米国仮特許出願第６２／５９６，３９７号の優先権を主張するものであり、その全内容が本明細書の一部として援用される。

【0002】

分野
本開示は、ゲノムインプリンティングの障害などの遺伝病を治療するための組成物及び方法に関する。

【0003】

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出した配列表を含み、その全内容が本明細書の一部として援用される。２０１８年１２月７日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーの名称は「209670-9024-WO01 Sequence Listing」であり、サイズは９，８１６バイトである。

【0004】

緒論
プラダー・ウィリー症候群(Prader-Willi syndrome)（ＰＷＳ）は、１０，０００〜３０，０００人に１人が罹患する遺伝性疾患であり、１５番染色体に位置する。この疾患は、新生児低血圧、及び発達遅延、過食と結果としての肥満並びに強迫的行動及びかんしゃくを特徴とする。ゲノムインプリンティングと呼ばれる通常のプロセスを介して、父親から受け継いだ１５番染色体はスイッチがオンの遺伝子セットを持つが、母親から受け継いだ１５番染色体上の同じ遺伝子セットはスイッチがオフである。プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）では、父性１５番染色体の正常なコピーは存在せず、従って、患者は母親から受け継いだサイレントコピーだけを有する。ＰＷＳは、父親から受け継がれた１５番染色体は転写的に活性な遺伝子セットを有するが、母親から受け継がれた１５番染色体上の同じ遺伝子セットは転写的にサイレントとなるエピジェネティックプロセスであるゲノムインプリンティングの障害である。ＰＷＳでは、父性１５番染色体の正常なコピーは存在せず、従って、患者は母親から受け継いだサイレントコピーだけを有する。

【0005】

ＰＷＳ診断は、普及している、ＤＮＡのメチル化に基づく診断試験を使用することによって生後１週間以内に確定することができる。ＤＮＡのメチル化試験は、低血圧又は発達遅延を示す全ての新生児に対して指示される。その結果、ＰＷＳの新たな症例は出生前期の初期に診断される場合が多い。ＰＷＳを有するほとんどの人は成長ホルモン欠乏を示す。組換えヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）療法が２０００年から使用され、身長及び筋肉量の増大及び体脂肪の減少を含むいくつかの利益が見られている。ＨＧＨ療法は毎日の皮下注射を含み、いくつかの治療利益があるものの、ＰＷＳ青年及び成人において食物摂取の制御に大きな障害を残す。日中の眠気などのＰＷＳの特徴を治療するための薬物も存在し、オキシトシンを用いた過食の制御に関する臨床試験も実施されている。ＰＷＳに関連する行動異常及び精神医学的異常はなお大きな治療課題である。現在のところＰＷＳの治癒は無く、ＰＷＳ遺伝子座においてサイレントとなった母性ＲＮＡ転写産物を活性化させるための現行治療戦略も無い。よって、ＰＷＳ及びそのいくつかの病像に対する有効な治療のアンメットニーズがなお存在する。

【発明の概要】

【0006】

概要
本開示は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８又は配列番号４８に相当するポリヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子に関する。

【0007】

本開示は又、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムに関する。ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

【0008】

本開示は更に、ＺＮＦ２７４タンパク質をコードする遺伝子に結合するＤＮＡターゲッティングシステムに関する。ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

【0009】

本開示は更に、上記のｇＲＮＡ分子を含む、単離されたポリヌクレオチド配列に関する。
本開示は更に、上記のＤＮＡターゲッティングシステムをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列に関する。
本開示は更に、上記の単離されたポリヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
本開示は更に、上記のｇＲＮＡ分子及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードするベクターに関する。

【0010】

本開示は更に、上記のｇＲＮＡ、上記のＤＮＡターゲッティングシステム、上記の単離されたポリヌクレオチド配列、上記のベクター、又はこれらの組合せを含む細胞に関する。
本開示は更に、上記のｇＲＮＡ、上記のＤＮＡターゲッティングシステム、上記の単離されたポリヌクレオチド配列、上記のベクター、上記の細胞、又はこれらの組合せを含むキットに関する。
本開示は更に、上記のｇＲＮＡ、上記のＤＮＡターゲッティングシステム、上記の単離されたポリヌクレオチド配列、上記のベクター、上記の細胞、又はこれらの組合せを含む医薬組成物に関する。

【0011】

本開示は更に、対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法に関する。この方法は、前記対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）結合部位を、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて低減されるように改変することを含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0012】

本開示は更に、対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法に関する。この方法は、前記対象に、ＺＮＦ２７４タンパク質と、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるＺＮＦ２７４結合部位との相互作用を対照に比べて低減する薬剤の薬学上有効な量を投与することを含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0013】

本開示は更に、対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための製剤に関する。この製剤は、母性ヌクレオチド配列上のＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合を対照に比べて低減する薬剤を含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0014】

本開示は他の態様及び実施形態を提供し、それらは下記の詳細な説明及び添付の図面から明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A-1C】図１Ａ〜１Ｃは、ＰＷＳ ｉＰＳＣにおいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトがＨ３Ｋ９ｍｅ３を低減し、ＳＮＯＲＤ１１６発現を活性化させることを示す。（図１Ａ）簡略化した１５ｑ１１．２−ｑ１３の遺伝子及び対立遺伝子発現マップ。活性及び不活性の（抑制された）転写産物がそれぞれ白い四角及び黒い四角で表される。矢印は転写の方向を示す。黒い実線は、ほとんどの細胞種で発現された父性ＳＮＵＲＦ／ＳＮＲＰＮ転写産物を表し、黒い破線は、ＳＮＲＰＮ及びＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳの上流エキソンを含むニューロン特異的転写産物を示す。ＵＢＥ３Ａはニューロンにおいて母性発現されるが、他の遺伝子は全ての細胞種は父性発現のみである。ＰＷＳ−ＩＣを黒丸（メチル化）／白丸（非メチル化）で表す。ＳＮＯＲＤ１１６クラスターの下のオレンジのダッシュは、ＳＮＯＲＮ１１６内の、グループ１として分類される６つのＺＮＦ２７４結合部位（ＳＮＯＧ１−ＢＳ１〜ＳＮＯＧ１−ＢＳ６）を表す。（図１Ｂ）ｉＰＳＣにおけるＺＮＦ２７４に関するＣｈＩＰアッセイ。この図及び次の図で、ＰＷＳ患者株を黒で、それらの対応するＺＮＦ２７４ ＫＯ系統を緑で、対照（ＣＴＲＬ）細胞株を青で、陰性対照として用いたＡＳを白で示す。この図及び次の図で、ＣｈＩＰの定量を行い、各サンプルの投入パーセントとして計算した。従前に報告されている高レベルのＨ３Ｋ９ｍｃ３シグナルに関連したＺＮＦ２７４結合部位であるＺＮＦ１８０における結合を陽性対照として使用し、各系統に関して、他の全ての結合部位をこの結合部位に対して正規化した。ＰＷＳ親系統を各パネルで１とし、この陽性サンプルに対して各細胞株で相対的正規化を行った。各細胞株で少なくとも２回の生物学的反復を行った。２種類の大領域欠失(large deletion)（ＬＤ）ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。この図及び次の図では、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１、^****Ｐ＜０．０００１。（図１Ｃ）ｉＰＳＣにおける抑制的ヒストン修飾Ｈ３Ｋ９ｍｅ３のＣｈＩＰアッセイ。ＡＳ、ＣＴＲＬ、ＰＷＳ、及びＺＮＦ２７４ ＫＯ細胞株に関して図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。

【図2A-2D】図２Ａ〜２Ｄは、ｉＰＳＣにおけるＳＮＲＰＮ発現及びＰＷＳ−ＩＣのメチル化に対するＺＮＦ２７４ ＫＯの影響を示す。ｉＰＳＣにおける（図２Ａ）ＳＮＲＰＮ Ｕエキソン（Ｕ４／ｅｘ２）、（図２Ｂ）ＳＮＲＰＮ主要プロモーター（ｅｘ １／２）、及び（図２Ｃ）ＳＮＲＰＮ ｍＲＮＡ（ｃｘ３／４）の遺伝子発現。図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。この図及び次の図で、遺伝子発現は比較ＣＴ法を用いて評価し、ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。データは各パネルについてＣＴＲＬ１に対して正規化し、平均値と標準偏差（ＳＤ）としてプロットした。各細胞株で少なくとも３回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。（図２Ｄ）ｉＰＳＣにおけるＰＷＳ−ＩＣでのＤＮＡメチル化レベルを、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、及び非修飾シトシン（Ｃ）の相対レベルを測定する定量的制限エンドヌクレアーゼアッセイ（ＥｐｉＭａｒｋ ５ｈｍＣ及び５ｍＣ分析キット）を用いて評価した。予想されたように、ＣＴＲＬ ｉＰＳＣはＰＷＳ−ＩＣにおいておよそ等レベルの５ｍＣ及びＣを示すが、ＰＷＳ ＬＤ及びＡＳ ｉＰＳＣはそれぞれ、ほぼ完全なメチル化を示し（５ｍＣ）、ほぼ全くメチル化を示さない（Ｃ）。５ｍＣから５ｈｍＣへの若干の移行が明らかであるが、ＺＮＦ２７４ ＫＯ ＰＷＳ ｉＰＳＣでは母性ＰＷＳ−ＩＣのほぼ完全なメチル化（５ｍＣ）が見られる。各細胞株で少なくとも２回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図3A-3C】図３Ａ〜３Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ神経発生中のＺＮＦ２７４ ＫＯにより媒介される母性１１６ＨＧＧＪ転写産物の活性化を示す。（図３Ａ）ｉＰＳＣ（最小ｎ＝３）、（図３Ｂ）４週齢の神経前駆細胞（ＮＰＣ）（最小ｎ＝１）、及び（図３Ｃ）成熟した１０週齢のニューロン（最小ｎ＝２）における、各細胞株における分化過程のＳＮＯＲＤ１１６宿主遺伝子群Ｉ（１１６ＨＧＧＩ）の遺伝子発現。図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。データは各パネルについてＣＴＲＬ１又はＣＴＲＬ２に対して正規化し、平均値と標準偏差（ＳＤ）としてプロットした。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図4A-4C】図４Ａ〜４Ｃは、ＺＮＦ２７４ ＫＯがＰＷＳニューロンの１５番染色体ｑ１１．２−ｑ１３にわたる転写を活性化させることを示す。成熟した１０週齢ニューロンにおける、１５ｑ１１．２−ｑ１３領域にわたる１７の転写産物の遺伝子発現。２つの正常細胞株（ＣＴＲＬ）と各親株：（図４Ａ）ＬＤ ＫＯ及び（図４Ｂ）ＵＰＤ ＫＯ由来のＺＮＦ２７４ ＫＯからのｑＲＴ−ＰＣＲデータを組み合わせた。図４Ｃは合わせたデータを示す。図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。合わせたＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び合わせたＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図5A-5E】図５Ａ〜５ＣＥは、ＺＮＦ２７４ ＫＯがＰＷＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて、ＰＷＳ−ＩＣのＤＮＡメチル化を低下させずにＳＮＲＰＮ 上流プロモーターを活性化させることを示す。ニューロンにおける（図５Ａ）ＳＮＲＰＮＵエキソン（Ｕ４／ｃｘ２）、（図５Ｂ）ＳＮＲＰＮ主要プロモーター（ｅｘ１／２）、及び（図５Ｃ）ＳＮＲＰＮ転写産物体（ｅｘ３／４）の遺伝子発現。図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。データは各パネルについてＣＴＲＬ１又はＣＴＲＬ２に対して正規化し、平均値と標準偏差（ＳＤ）としてプロットした。各細胞株で少なくとも２回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。図５Ｄは、ＺＮＦ２７４ ＫＯニューロンにおける５’ ＳＮＲＰＮエキソンの発現及びスプライシングの模式図を示す。（図５Ｅ）図２Ｂと同様に評価した成熟した１０週齢のニューロンにおけるＰＷＳ−ＩＣでのＤＮＡメチル化レベル。予想されたように、ＣＴＲＬニューロンは、ＰＷＳ−ＩＣにおいておよそ等レベルの５ｍＣ及びＣを示すが、ＰＷＳ（ＬＤ及びＵＰＤ）及びＡＳニューロンはそれぞれ、ほぼ完全なメチル化を示し（５ｍＣ）、ほぼ全くメチル化を示さない（Ｃ）。ＺＮＦ２７４ ＫＯ ＰＷＳニューロンでは、母性ＰＷＳ−ＩＣのほぼ完全なメチル化（５ｍＣ）が見られる。各細胞株で少なくとも２回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及びＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図6】図６は、ＺＮＦ２７４ ＫＯがＰＷＳ ｉＰＳＣのニューロン分化中にＳＮＲＰＮ上流プロモーターを活性化させることを示す。ｉＰＳＣ、ＮＰＣ、及びニューロンにおけるＳＮＲＰＮ Ｕエキソン（Ｕ４／ｅｘ２）の遺伝子発現。図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。データは各パネルについてＣＴＲＬ１又はＣＴＲＬ２ニューロンに対して正規化し、平均値と標準偏差（ＳＤ）としてプロットした。ｉＰＳＣ、ＮＰＣ、及びニューロンの各細胞株で少なくとも３回、１回、及び２回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図7】図７は、ＰＷＳ遺伝子座におけるＺＮＦ２７４により媒介されるサイレンシングのモデルを示す。白い四角及び黒い四角はそれぞれ、ｉＰＳＣ及びニューロンのＣＴＲＬ株及びＰＷＳ ＺＮＦ２７４ ＫＯ株に関して、発現した１５ｑ１１．２−ｑ１３遺伝子及びサイレントの１５ｑ１１．２−ｑ１３遺伝子を表す。黒丸（メチル化−５ｍＣ）／白丸（非メチル化−Ｃ）は、ＰＷＳ−ＩＣを表す。矢印は、ＳＮＲＰＮの転写開始部位を示し（本発明者らは図面が見やすいにように他の遺伝子には矢印を加えていない）；厚みは発現の程度に比例する。遺伝子名はＣＴＲＬとＰＷＳ ＺＮＦ２７４ ＫＯ株の間に順次表されている。赤いロリポップは、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３シグナルを表す。ＺＮＦ２７４は赤紫の楕円で表す。ＳＮＯＲＤ１１６上のカラーのセグメントは、ＳＮＲＰＮ上流エキソン上でシスに働く推定調節要素を表す。黄色い丸は、ＳＮＲＰＮ上流エキソンを活性化させる可能性のある脳特異的転写因子を表す。

【図8A-8B】図８Ａ〜８Ｂは、幹細胞モデルの作出を示す。（図８Ａ）ＺＮＦ２７４遺伝子の８つのエキソン、ＫＲＡＢ、ＳＣＡＮ、及びＤＢＤドメインの遺伝地図。青い四角はコード領域を表す。矢印は、２つの主要なアイソフォームの開始コドンを表す。ＰＷＳ ＬＤ及びＰＷＳ ＵＰＤにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトは、ＺＮＦ２７４の２つの主要なアイソフォームを標的とするためにＺＮＦ２７４遺伝子（ＮＭ＿１３３５０２）のエキソン２及び６内に２つの異なる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計することにより行った（表４）。フレームシフト及び未成熟終止コドンをもたらす非相同末端結合媒介挿入／欠失（インデル）をスクリーニングした後に、５つのクローン性のｉＰＳＣクローン(clonal iPSC clones)を選択した。赤紫の線はガイドＲＮＡの位置を表す。（図８Ｂ）本研究における新規なリプログラミング及び操作された幹細胞株の多能性バリデーション。位相画像、ＤＡＰＩ、ＯＣＴ４、及びＳＳＥＡ４染色は、１０倍オリンパスＣＫＸ４１倒立顕微鏡で観察した。

【図9A-9D】図９Ａ〜９Ｄは、ＺＮＦ２７４ ＫＯ時のＨ３Ｋ９ｍｅ３蓄積の影響を示す。（図９Ａ）４つの１９番染色体ＺＮＦ２７４結合部位に対するｉＰＳＣにおけるＺＮＦ２７４の結合のＣｈＩＰアッセイ。図１Ｂと同じ実験条件。（図９Ｂ及び図９Ｃ）４つのＺＮＦ２７４ １９番染色体結合部位、及びＳＮＯＲＤ１１６クラスター群２及び３（Ｇ２及びＧ３）サブ領域並びにＰＷＳ−ＩＣにおける、ｉＰＳＣの抑制的ヒストン修飾Ｈ３Ｋ９ｍｅ３に関するＣｈＩＰアッセイ。図１Ｂと同じ実験条件。（図９Ｄ）ｉＰＳＣにおける各細胞株のＳＮＯＲＤ１１６宿主遺伝子群１（１１６ＨＧＧ１）の遺伝子発現。ＰＷＳ及びＺＮＦ２７４ ＫＯ細胞株に関して図１Ｂと同じカラーコードが使用されている。遺伝子発現は比較ＣＴ法を用いて評価し、ＧＡＰＤＨを内部対照として使用した。データは各パネルについてＰＷＳ親株に対して正規化し、平均値と標準偏差（ＳＤ）としてプロットした。各細胞株で少なくとも３回の生物学的反復を行った。２種類のＬＤ ＫＯとＰＷＳ ＬＤ、及び３種類のＵＰＤ ＫＯとＰＷＳ ＵＰＤを比較するために、ダネットの事後検定とともに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を用いて有意性を計算した。

【図10】図１０は、ＰＷＳ ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＺＮＦ２７４のＣＲＩＳＰＲ媒介ノックアウトは母性転写産物の発現を再活性化させたことを示す。ＰＷＳ１−７ ｉＰＳＣのＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（Ｂ１７−２１及びＺＫＬ６）及びＵＰＤ１−２ ｉＰＳＣのＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（ＺＫＵ４Ｂ及びＺＫＵ２１Ａ）は、ＺＮＦ２７４を標的とするガイドＲＮＡを含むＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ ＣＲＩＳＰＲベクターを用いて作製した。ＰＷＳ１−７、Ｂ１７−２１、ＺＫＬ６、ＵＰＤ１−２、ＺＫＵ４Ｂ、ＺＫＵ２１Ａ、並びに正常対照株ＬｃＮＬ−１及びＭＣＨ２−１０の１０週間の分化の後にこれらのニューロンからＲＮＡを単離した。ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、及びＳＮＯＲＤ１１５の定常状態ＲＮＡレベルを、Ｔａｑｍａｎ（ＡＢＩ）アッセイを用いるＲＴ−ｑＰＣＲにより測定した。

【図11】図１１は、群１ ＳＮＯＲＤ１１６は、黄色で強調したＺＮＦ２７４モチーフ内の一塩基対置換以外、４８ｎｔセグメントのＤＮＡ配列同一性を共通に持つ。ＺＮＦ２７４は、ＳＮＯＲＤ１１６−３、−５、−７、−８、及び−９に高密度に存在する。

【図12】図１２は、ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座（３０−５ｂｉｓ１、ＳＮＯＧ１ｄｅｌ ＃１０及びＳＮＯＧ１ｄｅｌ ＃８４）においてＺＮＦ２７４結合部位が変更された操作型幹細胞株に由来するニューロンにおけるＳＮＯＲＤ１１６の母性ＳＮＲＰＮ及び残りのコピーの活性化を示す。

【0016】

詳細な説明
本明細書には、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）などのゲノムインプリンティングの障害を研究又は治療するための組成物及び方法が記載される。本発明者らは、スイッチオフ機構の成分としての、複合体を母性ＰＷＳ責任領域(PWS critical region)（ＰＷＳＣＲ）に係留するＺＮＦ２７４（ジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ２７４）と呼ばれるタンパク質を発見した。ＰＷＳＣＲは、３０のＳＮＯＲＤ１１６核小体低分子ＲＮＡのクラスターを包含する１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域上の領域である。母性ＰＷＳＣＲへのＺＮＦ２７４複合体の結合は、そこにコードされている遺伝子をサイレンシングし、正常な発達に必要とされるＲＮＡ転写産物をサイレンシングする。本明細書に開示されるようなＺＮＦ２７４タンパク質又は遺伝子の欠失は、ＰＷＳなどのゲノムインプリンティングの障害を更に調べるためのツールとして使用することができる。

【0017】

１つの開示例では、ＰＷＳ特異的誘導多能性幹細胞に由来するニューロンにおいてＺＮＦ２７４が破壊標的とされ、その結果、ＰＷＳＣＲ内の母性転写産物が完全に活性化された。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いてＺＮＦ２７４を標的化し、ニューロン分化の過程でＰＷＳ特異的ｉＰＳＣにおける母性対立遺伝子発現に対するノックアウトの影響を追跡した。

【0018】

本発明者らは又、ＰＷＳの病理に関与するＺＮＦ２７４に対する結合部位のヌクレオチド配列も見出した。ＺＮＦ２７４結合部位の修飾は、１５ｑ１１−ｑ１３領域内のサイレントの母性遺伝子の発現を回復させることができ、ＰＷＳの治療として使用することができる。本明細書に開示されるように、特定のタンパク質とＤＮＡの相互作用を遮断することによる母性ＰＷＳＣＲ転写産物の活性化は、ＰＷＳを治療する全く新規な戦略及び方法である。このＤＮＡ配列の特徴は、薬剤が開発、調剤、及び投与されるというＰＷＳに対する開示された治療アプローチがＺＮＦ２７４とＰＷＳＣＲの間の相互作用を遮断することを大幅に可能とする。

【0019】

１．定義
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が優先する。好ましい方法及び材料を以下に説明するが、本明細書に記載のものと類似又は等価の方法及び材料が本発明の実施又は試験に使用することができる。本明細書に述べられる全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、それらの全内容が本明細書の一部として援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び例は単に例示であり、限定を意図するものではない。

【0020】

本明細書で使用される用語「を含む(comprise)」、「を含む(include)」、「を有する(having）」、「を有する(has)」、「できる(can）」、「含有する(contain)」、及びこれらの変形は、付加的な実施又は構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語、又は語であることが意図される。本開示は又、明示されていようがいまいが、本明細書に提供される実施形態又は要素「を含む(comprising」、「からなる(consisting of)」、及び「から本質的になる(consisting essentially of)」他の実施形態を企図する。

【0021】

本明細書に開示される全ての範囲は終点を含み、それらの終点は独立に互いに組合せ可能である。本明細書に開示される各範囲は、開示される範囲内にあるいずれの点又は部分範囲の開示も構成する。本明細書の数値範囲の列挙については、同程度の精度でその間の介在数値が明示的に企図される。例えば６〜９の範囲では、６及び９に加えて数値７及び８が企図され、６．０〜７．０の範囲では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。

【0022】

本明細書に開示される（特に、下記の特許請求の範囲に関して）改良を説明する文脈での用語「１つの(a)」及び「１つの(an)」及び「その(the)」及び同様の性質の語の使用は、本明細書でそうではないことが示されない限り又は文脈が明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈されるべきである。更に、本明細書において用語「第１」、「第２」などはいずれの順序、量、又は相対的重要性を表すものではなく、ある要素と別の要素を区別するために使用されることに留意されたい。

【0023】

量に関して使用される修飾成句「約」は示された値を包含し、文脈が指示する意味を有する（例えば、それは少なくとも特定の量の測定に関連する程度の誤差を含む）。用語「約」は、本明細書で使用する場合、対象とする１以上の値に適用される場合には、示された参照値と同等の値を指す。ある特定の態様において、用語「約」は、そうではないことが示されない限り又はそうではないことが文脈から明らかではない限り（そのような数値が可能性のある値の１００％を超える場合を除き）示された参照値のいずれの方向にも（大きい場合又は小さい場合）２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ未満の範囲内の値の範囲を指す。

【0024】

本明細書に記載の全ての方法は、本明細書でそうではないことが示されない限り又は文脈が明らかに矛盾しない限り、ある好適な順序で実施され得る。いずれかの及び全ての例、又は例示的用語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特に断りのない限り、本発明の範囲に限定を設けるものではない。

【0025】

化学化合物は標準的な命名法を用いて記載する。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。

【0026】

本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」は、ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス科(Parvoviridae)のデペンドウイルス属に属す小型のウイルスを指す。ＡＡＶは、現在のところ疾患を引き起こすことは知られておらず、そのため、このウイルスが引き起こす免疫応答は極めて弱い。

【0027】

「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、天然及び非天然合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされているものである。アミノ酸は、本明細書では、それらの一般に知られている三文字記号又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨されている一文字記号によって表すことができる。アミノ酸には側鎖部分及びポリペプチド主鎖部分が含まれる。

【0028】

本明細書で互換的に使用される「Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ」及び「ＣＲＩＳＰＲ」は、配列決定された細菌のおよそ４０％及び配列決定された古細菌の９０％のゲノムに見られる複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座を指す。

【0029】

「コード配列」又は「核酸をコードする」とは、本明細書で使用する場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与された個人又は哺乳動物の細胞内で発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に機能的に連結された開始シグナル及び終結シグナルを更に含み得る。コード配列は、コドンの最適化を行ってもよい。

【0030】

「相補物」又は「相補性」とは、本明細書で使用する場合、核酸が核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間のワトソン−クリック型（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ及びＣ−Ｇ）又はフーグスティーン型塩基対形成を意味することを意味する。「相補性」とは、２つの核酸配列を互いに逆平行にアラインした際に各位置のヌクレオチド塩基が相補的となるような、それらの核酸配列間で共有される特性を指す。

【0031】

「相補的」とは、本明細書で使用する場合、比較ヌクレオチド配列との１００％の相補性（完全な相補性）を意味するものであり得、又は相補的とは、１００％未満の相補性（例えば、実質的相補性）（例えば、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％などの相補性）を意味し得る。相補物とは又、突然変異に対する「相補物」又は「相補する」という意味で使用することもできる。

【0032】

用語「対照」、「参照レベル」、及び「参照」は、本明細書において互換的に使用される。参照レベルは、測定結果を評価する基準として使用される所定の値又は範囲であり得る。「対照群」とは、本明細書で使用する場合、対照対象群を指す。所定のレベルは、対照群のカットオフ値であり得る。所定のレベルは、対照群の平均値であり得る。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、アダプティブ・指標・モデル(Adaptive Index Model)（ＡＩＭ）法によって決定され得る。カットオフ値（又は所定のカットオフ値）は、患者群の生体サンプル群の受信者動作特性曲線(receiver operating curve)（ＲＯＣ）分析により決定され得る。ＲＯＣ分析は、生物学分野で一般に知られているように、ある条件と別の条件を区別する試験の能力の決定である。ＲＯＣ分析の説明は、P.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)に示され、その開示は全内容が本明細書の一部として援用される。或いは、カットオフ値は、患者群の生体サンプルの四分位数分析により決定され得る。例えば、カットオフ値は、第２５〜第７５百分位数範囲のいずれかの値、好ましくは、第２５百分位数、第５０百分位数又は第７５百分位数、及びより好ましくは第７５百分位数に相当する値を選択することによって決定され得る。このような統計分析は、当技術分野で公知のいずれの方法を用いて行ってもよく、いくつかの市販のソフトウエアパッケージ（例えば、Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、リーズ、ＵＫ；ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、カレッジステーション、ＴＸ；ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ケーリー、ＮＣ．から）のいずれで実施することもできる。標的、遺伝子発現、又はタンパク質活性の健常若しくは正常レベル又は範囲は、標準的な実施に従って定義され得る。対照は、本明細書で詳説されるような薬剤又はＤＮＡターゲッティングシステムを用いない対象又は細胞であり得る。対照は、本明細書で詳説されるような改変されたＺＮＦ２７４結合部位を有さない対象又は細胞であり得る。対照は、本明細書で詳説されるような欠失ＺＮＦ２７４を有さない対象又は細胞であり得る。対照は、病状が既知の対象、又はそれ由来のサンプルであり得る。対象、又はそれ由来のサンプルは、健常、罹患、処置前の罹患、処置中の罹患、又は処置後の罹患、又はこれらの組合せであり得る。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語「遺伝子」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチマイクロＲＮＡ、調節ＲＮＡなどを生成するために使用され得る核酸分子を指す。遺伝子は、機能的タンパク質又は遺伝子産物を生成できてもできなくてもよい。遺伝子は、コード領域及び非コード領域（例えば、イントロン、調節要素、プロモーター、エンハンサー、終結配列並びに／又は５’及び３’非翻訳領域）の両方を含み得る。遺伝子は、「単離された」ものであり得、これはその天然状態で核酸と会合していることが通常見出されている成分を実質的に又は本質的に含まない核酸を意味する。このような成分としては、その他の細胞材料、組換え生産由来の培養培地、及び／又は核酸の化学合成に使用される種々の化学物質が含まれる。

【0034】

「遺伝子構築物」は、本明細書で使用する場合、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与された個体の細胞内で発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に機能的に連結された開始及び終結シグナルを含む。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞に存在する際にコード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に機能的に連結された必須調節要素を含有する遺伝子構築物を指す。

【0035】

用語「ゲノム」は、本明細書で使用する場合、生物の染色体／核ゲノム並びにミトコンドリア及び／又はプラスミドゲノムを含む。

【0036】

「同一」又は「同一性」は、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列に関して本明細書で使用する場合、配列が特定の領域にわたって同じ特定のパーセンテージの残基を有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適にアラインし、その２配列を特定の領域にわたって比較し、両配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を特定の領域内の位置の総数で割り、その商に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算すればよい。２配列の長さが異なるか又はアラインメントで１以上の食い違いが生じて、特定の比較領域が単一の配列しか含まない場合に、単一配列の残基は計算の分母には含められるが、分子には含められない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合には、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を等しいと見なせばよい。同一性の決定は、手によるか又はＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０などのコンピューター配列アルゴリズムを使用して行うことができる。

【0037】

本明細書で使用する場合、用語「増強(“increase,” “increasing,” “increased,”)」、「増大(“enhance,” “enhanced,” “enhancing,” and “enhancement”)」（及びこれらの文法的変形）は、対照と比較した場合の少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％又はそれを超える上昇を言う。

【0038】

「単離された」ポリヌクレオチド又は「単離された」ポリペプチドは、人の手による、その天然環境から離れて存在する、従って、天然の産物ではないヌクレオチド配列又はポリペプチド配列である。いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、「単離されている」。単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、天然の生物又はウイルスの他の成分、例えば、細胞若しくはウイルス構造成分、又はそのポリペプチド若しくはポリヌクレオチドと一般に会合して見られる他のポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離された精製形態で存在し得る。代表的な実施形態では、単離されたポリヌクレオチド及び／又は単離されたポリペプチドは、少なくとも約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれを超える純度である。

【0039】

他の実施形態では、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドは、例えば、組換え宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。よって、例えば、ヌクレオチド配列に関して、用語「単離された」とは、その配列が天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離されていることを意味する。ポリヌクレオチドも又、そのポリヌクレオチドが天然に存在する染色体及び／又は細胞から分離されている場合に単離されており、次に、そのポリヌクレオチドが天然には存在しない遺伝的コンテキスト、染色体及び／又は細胞に（例えば、本来見られるものとは異なる宿主細胞、異なる調節配列、及び／又はゲノム内の異なる位置に）挿入される。よって、これらのポリヌクレオチド及びそれらのコードされるポリペプチドは、人の手で、それらはそれらの天然環境から離れて存在し、従って、本来の産物ではないという意味で「単離された」ものであるが、いくつかの実施形態では、それらは組換え宿主細胞中に導入され、そこに存在し得る。

【0040】

「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用する場合、共有結合により相互に連結された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。よって、核酸は又、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体が、所与の核酸と同じ目的で使用可能である。よって、核酸は又、実質的に同一の核酸及びこれらの相補物も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。よって、核酸は又、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

【0041】

核酸は一本鎖若しくは二本鎖であり得、又は二本鎖及び一本鎖両方の配列の部分を含有してもよい。核酸は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、又は核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含有し得るハイブリッドであり得る。核酸は化学合成法又は組換え法によって得ることができる。

【0042】

「機能的に連結される」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子の発現が、空間的に接続されたプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子間の距離は、そのプロモーターが由来する遺伝子におけるプロモーターとそのプロモーターが制御する遺伝子間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知のように、この距離の変更は、プロモーター機能を低下させることなく適合させることができる。

【0043】

本明細書で使用する場合、用語「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」は、２配列を最適にアラインした際に試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比べた場合の、参照（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチドの同一のヌクレオチドのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、「同一性パーセント」は、アミノ酸配列内の同一のアミノ酸のパーセンテージを指し得る。

【0044】

本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのヘテロポリマー又は核酸分子の５’末端から３’末端までのこれらのヌクレオチドの配列を指し、ｃＤＮＡ、ＤＮＡフラグメント又はＤＮＡ部分、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学合成）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含み、これらはいずれも一本鎖であっても二本鎖であってもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」、及び「オリゴヌクレオチド」も又、ヌクレオチドのヘテロポリマーを指して本明細書で互換的に使用される。そうではないことが示されない限り、本明細書で提供される核酸分子及び／又はポリヌクレオチドは、本明細書では、左から右へ５’から３’方向に示され、米国配列規則３７ＣＦＲ§§１．８２１〜１．８２５及び世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５に示されるようなヌクレオチド文字を表すための標準コードを用いて示される。

【0045】

ポリヌクレオチドは、核酸、天然又は合成のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含有し得るハイブリッドであり得る。ポリヌクレオチドは化学合成法又は組換え法によって得ることができる。

【0046】

「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結された２つ以上のアミノ酸の連結された配列である。ポリペプチドは、天然、合成、若しくは改変又は天然と合成の組合せであり得る。ペプチド及びポリペプチドとしては、結合タンパク質、受容体、及び抗体などタンパク質が含まれる。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、局部的に秩序を持った、ポリペプチド内の三次元構造を指す。これらの構造は、ドメインとして一般に知られ、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、及び細胞質テールドメインがある。「ドメイン」は、コンパクトなポリペプチド単位を形成し、一般にアミノ酸１５〜３５０個の長さのポリペプチド部分である。例示的ドメインとしては、酵素活性又はリガンド結合活性を有するドメインが含まれる。典型的なドメインは、βシート及びαヘリックスのストレッチなど、組織化の低いセクションから構成される。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」は、独立した三次単位の非共有結合的会合によって形成される三次元構造を指す。「モチーフ」は、ポリペプチド配列の一部であり、少なくとも２個のアミノ酸を含む。モチーフは、アミノ酸２〜２０個、２〜１５個、又は２〜１０個の長さであり得る。いくつかの実施形態では、モチーフは、３、４、５、６、又は７個の連続するアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じタイプのモチーフからなり得る。

【0047】

「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、細胞において核酸の発現を付与、活性化又は増強し得る合成又は天然由来の分子を意味する。プロモーターは、核酸の発現を更に増大させるため、並びに／又は核酸の空間的発現及び／若しくは時間的発現を変更するための１以上の特定の転写調節配列を含み得る。プロモーターは又、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠隔のエンハンサー又はリプレッサー要素も含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子成分の発現を構成的に、或いは発現が起こる細胞、組織、若しくは器官に関して、又は発現が起こる発達段階に関して、又は生理学的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外的刺激に応答して差次的に調節し得る。プロモーターの代表例としては、ＥＦＳプロモーター、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター又はＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが含まれる。

【0048】

「プロトスペーサー配列」とは、標的二本鎖ＤＮＡ、及び具体的には、ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー配列に完全に又は実質的に相補的な（且つハイブリダイズする）標的ＤＮＡ（例えば、又はゲノム内の標的領域）の部分を指す。スペーサーは、プロトスペーサーと相補的となるように設計される。

【0049】

「プロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer adjacent motif)（ＰＡＭ）」は、プロトスペーサーのすぐ３’側又は５’側に存在する２〜４塩基対の短いモチーフである。

【0050】

本明細書で使用する場合、用語「低減(“reduce,” “reduced,” “reducing,” “reduction,”)」、「消失」、「抑制」及び「低下」（及びこれらの文法的変形）は、例えば、対照に比べての少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の低下を表す。特定の実施形態では、この低減は、検出可能な活性又は量を全く又は本質的に全く生じさせない（すなわち、有意でない量、例えば、約１０％未満又は更には約５％未満である）。

【0051】

「サンプル」又は「試験サンプル」は、本明細書で使用する場合、標的の存在及び／若しくはレベルが検出若しくは決定される任意のサンプル又は本明細書で詳細に示されるような薬剤、ＤＮＡターゲッティングシステム、遺伝子、又は遺伝子産物を含む任意のサンプルを意味し得る。サンプルは液体、溶液、エマルション、又は懸濁液を含み得る。サンプルは、医学的サンプルを含み得る。サンプルは、血液、全血、血漿及び血清などの血液画分、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻腔分泌物、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄液、嘔吐物、糞便、肺組織、末梢血単核細胞、全白血球、リンパ節細胞、脾臓細胞、扁桃細胞、癌細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、若しくはこれらの組合せなどのいずれの体液又は組織も含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、アリコートを含む。他の実施形態では、サンプルは、体液を含む。サンプルは当技術分野で公知のいずれの手段によって得ることもできる。サンプルは、患者から得たまま使用することもできるし、又は本明細書に述べられているような又はそうでなければ当技術分野で公知のいくつかの様式でサンプルの特徴を改質するために、濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉成分の不活性化、試薬の添加などの前処理を行うこともできる。

【0052】

本明細書で使用する場合、「配列同一性」は、最適にアラインされた２つのポリヌクレオチド配列又はペプチド配列が、成分、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸のアラインメントウインドウにおいて不変である程度を指す。「同一性」は、限定されるものではないが、Computational Molecular Biology (Lesk, A. M.編) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W.編) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G.編) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.編) Academic Press (1987); 及びSequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J.編) Stockton Press, New York (1991)に記載されるものを含む既知の方法によって容易に計算することができる。

【0053】

「対象」は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載の薬剤又は方法を欲する又は必要とする哺乳動物を意味し得る。対象は、二倍体であり得る。対象は、患者であり得る。対象は、ヒト又は非ヒト動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、霊長類又は非霊長類であり得る。哺乳動物は、ヒトなどの霊長類；例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラット、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、及びモルモットなどの非霊長類；又は例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザルなどの非ヒト霊長類であり得る。対象は、例えば、成人、青年、又は幼児など、いずれの齢又は発達段階のものであってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、特定の遺伝子マーカーを有する。

【0054】

「実質的に同一」とは、第１及び第２のアミノ酸配列が、アミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００個の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味し得る。

【0055】

本明細書で互換的に使用される用語「形質転換」、「トランスフェクション」及び「形質導入」は、異種核酸分子を細胞に導入することを指す。このような細胞への導入は、安定又は一過性のものであり得る。よって、いくつかの実施形態では、宿主細胞又は宿主生物を開示のポリヌクレオチドで安定に形質転換させる。他の実施形態では、宿主細胞又は宿主生物を開示のポリヌクレオチドで一過性に形質転換させる。ポリヌクレオチドに関して「一過性形質転換」とは、ポリヌクレオチドが細胞に導入され、その細胞のゲノムに組み込まれないことを意味する。細胞に導入されるポリヌクレオチドに関して「安定導入する」又は「安定導入される」とは、導入されたポリヌクレオチドがその細胞のゲノムに安定に組み込まれ、よって、その細胞はそのポリヌクレオチドで安定に形質転換されることを意図する。「安定形質転換」又は「安定に形質転換される」とは、本明細書で使用する場合、核酸分子が細胞に導入され、その細胞のゲノムに組み込まれることを意味する。従って、組み込まれた核酸分子は、その後代、より詳しくは、複数の連続する世代の後代に受け継がれ得る。「ゲノム」は又、本明細書で使用する場合、核、プラスミド、及びプラスチドゲノムを含み、よって、例えば、葉緑体又はミトコンドリアゲノムへの核酸構築物の組込みを含む。安定な形質転換とは又、本明細書で使用する場合、例えば、ミニ染色体又はプラスミドとして染色体外で維持される導入遺伝子も指し得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列、構築物、発現カセットは一過性で発現させることもできるし、及び／又はそれらは宿主生物のゲノムに安定に組み込むこともできる。

【0056】

「治療(“Treatment” or “treating”)」は、疾患からの対象の保護に関する場合、疾患を抑止、抑制、改善、又は完全に排除することを意味する。疾患を予防することは、その疾患の発症前に対象に本発明の組成物を投与することを含む。疾患を抑止することは、その疾患の誘発後であるがその臨床的所見の前に対象に本発明の組成物を投与することを含む。疾患を抑制又は改善することは、その疾患の臨床的所見の後に対象に本発明の組成物を投与することを含む。

【0057】

「変異体」は、ポリヌクレオチドに関して本明細書で使用する場合、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部又はフラグメント；（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列又はその一部の相補物；（ｉｉｉ）参照ポリヌクレオチド又はその相補物と実質的に同一のポリヌクレオチド；又は（ｉｖ）参照ポリヌクレオチド、その相補物、又はそれと実質的に同一の配列にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味する。

【0058】

「変異体」は、更に、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが少なくとも１つの生物活性を保持するペプチド又はポリペプチドと定義することができる。「生物活性」の代表例としては、特定の抗体若しくはポリペプチドによって結合される又は免疫応答を促進する能力が含まれる。変異体は、実質的に同一の配列を意味し得る。変異体は、その機能的フラグメントを意味し得る。変異体は又、ポリペプチドの複数のコピーのも意味し得る。複数のコピーはタンデムであっても又はリンカーによって分離されていてもよい。変異体は又、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する、参照ポリペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドも意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸の、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度及び分布）の異なるアミノ酸での置換は、当技術分野で一般に微細な変化を伴うと認識されている。これらの微細な変化は、一部には、アミノ酸の疎水性指標を考慮することにより同定することができる。Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132参照。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性及び電荷の考慮に基づく。類似の疎水性指標のアミノ酸は置換してもなおタンパク質機能を保持し得ることが当技術分野で知られている。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の疎水性は又、生物学的機能を保持するポリペプチドを生じる置換を明らかにするためにも使用することができる。ポリペプチドに関してアミノ酸の親水性を考慮することで、完全に本明細書の一部として援用される米国特許第４，５５４，１０１号に述べられているように抗原性及び免疫原性とよく相関することが報告されている有用な手段である、そのポリペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能となる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当技術分野で理解されているように、生物活性、例えば、免疫原性を保持する、ポリペプチドを生じ得る。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値は両方ともそのアミノ酸の特定の側鎖に影響を及ぼす。その所見と一致して、生物機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及びその他の特性によって明らかにされるようなアミノ酸、特に、それらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。

【0059】

変異体は、全遺伝子配列の全長又はそのフラグメントにわたって実質的に同一であるポリヌクレオチド配列であり得る。このポリヌクレオチド配列は、遺伝子配列の全長又はそのフラグメントにわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。変異体は、アミノ酸配列の全長又はそのフラグメントにわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。このアミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長又はそのフラグメントにわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であり得る。

【0060】

「ベクター」は、本明細書で使用する場合、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは自己複製する染色体外ベクターであり得、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。

【0061】

２．ゲノムインプリンティングの障害
本明細書では、ゲノムインプリンティングの障害を治療するための組成物及び方法が提供される。ゲノムインプリンティングは、遺伝子が起源する親に基づいてその遺伝子が発現されるか又は発現されない（サイレントである）、二倍体生物におけるエピジェネティックプロセスである。二倍体生物では、体細胞は、２コピーのゲノムを有し、１つは父親から、１つは母親から受け継がれる。よって、各常染色体遺伝子は、受精時に各親から１コピーずつ受け継がれる２つのコピー、又は対立遺伝子によって表される。二倍体生物のほとんどの常染色体遺伝子では、遺伝子の発現は、両対立遺伝子から同時に起こる。しかしながら、哺乳動物では、いくつかの遺伝子はインプリンティングを受け、これは遺伝子発現が１つの対立遺伝子だけから起こることを意味する。発現される対立遺伝子はその親起源に依存する。例えば、発現される対立遺伝子が無く、しかもなお存在する対立遺伝子がサイレントである場合には、様々な障害が起こり得る。ゲノムインプリンティングの障害としては、例えば、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）、及びアンジェルマン症候群が含まれる。

【0062】

ａ）プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）
プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）は、ゲノムインプリンティングの障害である。健常対象では、父親から受け継がれた１５番染色体は転写的に活性な遺伝子セットを有するが、母親から受け継がれた１５番染色体上の同じ遺伝子セットは転写的にサイレントとなる。ＰＷＳでは、父性１５番染色体の正常位コピーが存在せず、従って、対象は母親から受け継がれたサイレントコピーのみを有する。より具体的には、ＰＷＳは、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置に正常な父性寄与が無いことによって生じる。いくつかの実施形態では、父性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の不在は、およそ５，０００ｋｂのインプリンティング父性領域の大領域欠失（ＬＤ）によるものである。他の実施形態では、父性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の不在は、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の母性片親性ダイソミー(maternal uniparental disomy)（ｍＵＰＤ）によるものである。ＵＰＤは、対象が片親からの２コピーの染色体又はその一部を有し、他の親からの染色体コピー又はその一部は存在しない場合である。

【0063】

ＰＷＳは、新生児低血圧、幼児期に成長できない、発達遅延、過食、肥満、認知障害、行動異常、又はこれらの組合せを特徴とし得る。

【0064】

アンジェルマン症候群は、母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の受け継がれた欠失、又は１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の父性ＵＰＤによって生じる。アンジェルマン症候群は、発作、運動困難、認知障害、話せない、又はこれらの組合せを特徴とする。

【0065】

ｂ）遺伝子
ＰＷＳ責任領域（ＰＷＳＣＲ）は、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置内の領域である。１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３領域の生殖細胞系インプリントは、ＰＷＳ−ＩＣと呼ばれる差次的メチル化ＣＧリッチセグメントであり、核内低分子リボ核タンパク質ポリペプチドＮ(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide)（ＳＮＲＰＮ）をコードする遺伝子の第１エキソン内に存在する。ＳＮＲＰＮは、ＳＮＵＲＦ（ＳＮＲＰＮとも呼ばれる）もコードするバイシストロン性転写産物である。脳において、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃ ＲＮＡ）はＳＮＲＰＮの上流（Ｕ）エキソンで始まり（図１Ａ）、ＵＢＥ３Ａとオーバーラップするように＞６００ｋｂ遠位に及び、アンチセンス媒介機構を介して父性ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子をサイレンシングする。

【0066】

ＰＷＳＣＲは、ＳＮＯＲＤ１１６クラスター及びＩＰＷ(Imprinted In Prader-Willi Syndrome)転写産物を包含する９１ｋｂのセグメントに狭められている。ＳＮＯＲＤ１１６クラスターは、３０のＳＮＯＲＤ１１６核小体低分子ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドである。核小体低分子ＲＮＡ(small nucleolar RNA)（ｓｎｏＲＮＡ）は、主としてリボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、及び核内低分子ＲＮＡなどの他のＲＮＡの化学修飾のガイドとなる小型のＲＮＡ分子種である。２つの主要なｓｎｏＲＮＡ種は、メチル化に関連するＣ／Ｄボックス ｓｎｏＲＮＡと、偽ウリジン化に関連するＨ／ＡＣＡボックスｓｎｏＲＮＡである。長鎖非コードアンチセンスＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、ＳＮＯＲＤ１１６クラスター及びＳＮＯＲＤ１１５クラスターを含むいくつかのＣ／Ｄボックス種核小体低分子ＲＮＡに対して宿主遺伝子（ＨＧ）として働く。

【0067】

ＰＷＳＣＲ内の３０コピーのＳＮＯＲＤ１１６のクラスターは、ＤＮＡの配列類似性に基づいて３つのグループに分類される。グループ１（ＳＮＯＧ１）は、ＳＮＯＲＤ１１６ １〜９を含む。グループ２（ＳＮＯＧ２）は、ＳＮＯＲＤ１１６ １０〜２４を含む。グループ３（ＳＮＯＧ３）は、ＳＮＯＲＤ１１６ ２５〜３０を含む。ヒトｉＰＳＣ欠失モデルとマウスＰＷＳモデルの両方におけるＳＮＯＲＤ１１６の欠失は、ＰＷＳにおける神経内分泌不全に関連する可能性のあるプロホルモンコンベルターゼＰＣ１の欠乏を示すが、このことは、ＳＮＯＲＤ１１６の欠失とＰＷＳの間の関連を示し得る。

【0068】

ｃ）ジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）
ジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）は、母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置のサイレンシング機構の成分である。ＺＮＦ２７４は、複合体を母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置に係留して、正常な発達に必要とされるＲＮＡ転写産物をサイレンシングする。この複合体は、ＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ １（ＳＥＴＤＢ１）ヒストンＨ３リシン９（Ｈ３Ｋ９）メチルトランスフェラーゼを含み得る。ＺＮＦ２７４とメチルトランスフェラーゼの複合体は、母性対立遺伝子上に抑制的Ｈ３Ｋ９ｍｅ３クロマチンマークの沈着を媒介し得る。

【0069】

ｉ．ＺＮＦ２７４結合部位
ＺＮＦ２７４タンパク質は、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置内のポリヌクレオチド配列を含むＺＮＦ２７４結合部位に結合する。ＺＮＦ２７４コンセンサス結合配列は、ＳＮＯＲＤ１１６−３、−５、−７、−８及び−９の４８−ヌクレオチドの配列内に含まれる。ＳＮＯＲＤ１１６における推定ＺＮＦ２７４結合部位の機能性は、ゲノム編集技術によって確認されている。ＰＷＳＣＲ内のこの４８−ヌクレオチドのＺＮＦ２７４コンセンサス配列は非ヒト霊長類では保存されており、従って、開示されている戦略及び方法は動物モデルにおいて適用可能である。ＰＷＳの治療のための薬剤を開発する一態様では、化合物は、ＺＮＦ２７４へのＰＷＳＣＲの結合に干渉し、それにより、母性ＰＷＳＣＲ ＲＮＡ転写産物を活性化させるそれらの能力に基づいて選択又は設計される。

【0070】

本明細書で詳細に示されるように、ヒトゲノム中のＤＮＡに結合するためにＺＮＦ２７４により認識される１４−ヌクレオチドのコンセンサス結合部位配列を同定するために計算論的アプローチが使用された。この１４−ヌクレオチドのコンセンサス結合部位配列は、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置の正確なＺＮＦ２７４結合部位を見つけるために使用された。１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置のＺＮＦ２７４結合部位は、グループ１ ＳＮＯＲＤ１１６（ＳＮＯＲＤ１１６−１、２、３、４、５、６、７、８、又は９）のそれぞれの４８−ヌクレオチド配列内に含まれる１８−ヌクレオチド配列（配列番号１、ＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣ）である。ＳＮＯＲＤ１１６−１、２、３、４、５、６、７、８、及び９の４８−ヌクレオチド配列は、ＳＮＯＲＤ１１６−１、２、４及び６の１ヌクレオチド変化を除いて同一である。この１ヌクレオチドの違いは、ＺＮＦ２７４結合部位内にある（表１；図１１）。ＺＮＦ２７４は、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析により確認したところ、ＳＮＯＲＤ１１６クラスターの母性コピーのＳＮＯＲＤ１１６−３、５、７、８及び９に結合することができる(Crunivel et al. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 4674-85)。ＳＮＯＲＤ１１６−２、４、及び６はそれぞれ、ＺＮＦ２７４結合部位の８番にＧからＡへの置換を示し、ＣｈＩＰ−ＳｅｑデータによればＺＮＦ２７４によっても結合され得る。ＳＮＯＲＤ１１６−１は、コンセンサスＺＮＦ２７４結合部位から異なる１ヌクレオチド変化を含む。ＰＷＳＣＲ内のグループ１ ＳＮＯＲＤ１１６の４８−ヌクレオチドの保存された配列は、ＺＮＦ２７４結合部位内の置換を除いて非ヒト霊長類で保存されている。ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１に相当するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１に相当するポリヌクレオチからなる。

【表1】

【0071】

３．ＺＮＦ２７４タンパク質とＺＮＦ２７４結合部位の相互作用を低減する薬剤
本明細書では、ＺＮＦ２７４タンパク質とＺＮＦ２７４結合部位の相互作用を低減する薬剤が提供される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ＺＮＦ２７４タンパク質を欠損させる。他の実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位が改変される。いくつかの実施形態では、薬剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、又はＤＮＡターゲッティングシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムである。

【0072】

ａ）ＺＮＦ２７４タンパク質の欠損
本明細書では又、エピジェネティック調節及びＰＷＳ疾病機序の側面を研究するために、ＰＷＳ特異的ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）の作出及びそれらのニューロン分化のための技術も開示される。ＺＮＦ２７４／ＳＥＴＤＢ１含有エピジェネティック複合体は、母性ＰＷＳＣＲと結合して、ＰＷＳＣＲにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の蓄積によりエピジェネティックサイレンシングを果たすことが発見された。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４を標的とし、ＰＷＳ ｉＰＳＣ株であるＰＷＳ１−７大領域欠失のＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（Ｂ１７−２１及びＺＫＬ６）、及びＵＰＤ１−２のＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（ＺＫＵ４Ｂ及びＺＫＵ２１Ａ）を作出するためにＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、２つの親ＰＷＳ ｉＰＳＣ株及びそれらの２つのＺＮＦ２７４ ＫＯクローン誘導体のそれぞれ並びに２つの正常クローン（ＬｃＮＬ−１及びＭＣＨ２−１０）をニューロンに分化させることができる。

【0073】

いくつかの実施形態では、この薬剤は、対象からＺＮＦ２７４タンパク質を欠損させる。この薬剤は、対象のゲノムからＺＮＦ２７４遺伝子を欠損させる。ＺＮＦ２７４遺伝子又はタンパク質が存在しなければ、母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置からの遺伝子は発現でき、もはやサイレントでない。ＺＮＦ２７４の欠損は、ＰＷＳＣＲからの母性転写産物の発現を活性化させ得る。ＺＮＦ２７４の欠損は、ＰＷＳＣＲからのサイレントの母性転写産物の発現を再活性化させ得る。ＺＮＦ２７４の欠損は、ＰＷＳＣＲ内のＨ３Ｋ９ｍｅ３結合の低減をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４の欠損は、母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置からの転写産物の発現を、発現レベルが対照（この対照は例えば、非ＰＷＳ対照又は健常対象由来の細胞である）と同じとなるように誘導する。ＺＮＦ２７４欠損時の発現の活性化は、ＰＷＳＣＲ内だけでなく、１５番染色体のｑ１１−ｑ１３インプリンティング領域にも及び得る。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４ノックアウト時に、例えば、ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、及びＳＮＯＲＤ１１５などのＰＷＳ領域からのＲＮＡ転写産物に関して、ニューロン転写産物の完全な再活性化が達成される。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４の欠損は、ＭＡＧＥＬ２及びＭＫＲＮ３の両方の発現を増強する又は活性化させる。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４の欠損は、ＰＷＳ ＬＤニューロン及びＵＰＤニューロンにおいてＭＡＧＥＬ２及びＭＫＲＮ３の両方の発現を増強する又は活性化させる。

【0075】

ＺＮＦ２７４タンパク質のノックアウトは、ＰＷＳインプリンティングセンター（ＰＷＳ−ＩＣ）におけるＤＮＡのメチル化に影響を及ぼさずにサイレントの母性対立遺伝子の発現を救済し得る。ＺＮＦ２７４複合体は、ニューロンにおいて母性ＰＷＳ遺伝子発現を抑制する独立したインプリンティングマークであり得る。

【0076】

本明細書で詳細に示されるようなＺＮＦ２７４タンパク質のノックアウトは、研究ツールとして、又はＰＷＳなどの障害に対する様々な潜在的療法をスクリーニングするために使用可能である。ＺＮＦ２７４タンパク質のゲノムワイドなノックアウトは、ＰＷＳを治療するための実現可能なアプローチではない。ＺＮＦ２７４は、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置以外のゲノムの場所に結合し得るので、ＰＷＳを有する対象におけるＺＮＦ２７４タンパク質のゲノムワイドなノックアウトは、更なる不利な合併症を持つ可能性がある。

【0077】

ｂ）ＺＮＦ２７４結合部位の改変
いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合は、ＺＮＦ２７４結合部位に対する改変により阻害される。いくつかの実施形態では、１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置のＺＮＦ２７４結合部位は改変されるが、ゲノム内の他の場所にある他のＺＮＦ２７４結合部位は改変されない。改変は、ＺＮＦ２７４結合部位の完全欠損、ＺＮＦ２７４結合部位の部分的欠損、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチドの突然変異、１以上のヌクレオチド位置におけるＺＮＦ２７４結合部位の切断、又はこれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合は、対照に比べて少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％低減される。

【0078】

４．ＤＮＡターゲッティングシステム
いくつかの実施形態では、薬剤は、ＤＮＡターゲッティングシステムを含む。ＤＮＡターゲッティングシステムは、少なくとも１つのｇＲＮＡを含み得る。ＤＮＡターゲッティングシステムは、Ｃａｓタンパク質を更に含み得る。

【0079】

ａ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
ＤＮＡターゲッティングシステムは、ポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含み得る。ＺＮＦ２７４結合が改変される実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、これらの相補物、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、これらの相補物のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、これらの相補物、又はこれらの変異体のポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの相補物のポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0080】

ＺＮＦ２７４タンパク質が欠損している実施形態では、ｇＲＮＡは、ＺＮＦ２７４タンパク質をコードする遺伝子に結合する。ｇＲＮＡは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４７、配列番号４８、これらの相補物、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とし得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの相補物に相当するポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、これらの相補物、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの相補物に相当するポリヌクレオチド配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0081】

ｂ）ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ
ＤＮＡターゲッティングシステムは、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする核酸配列はＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ファージ及びプラスミドへの侵入に対する防御に関与する微生物のヌクレアーゼシステムであり、獲得免疫の一形態を提供する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子の組合せとＣＲＩＳＰＲ介在核酸切断の特異性を担う非コードＲＮＡ要素を含有する。

【0082】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、２種類に組織化され、それぞれ３つのシステムタイプから構成され、更に１９の異なるサブタイプに分かれる。クラス１システムは、複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用して外来核酸の切断を補助する。クラス２は、同じ目的で単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス２は単一のＣａｓタンパク質のみを必要とするので、クラス２ Ｃａｓタンパク質は、真核生物システムで利用され、その使用に適合されている。各タイプ及びほとんどのサブタイプは、このカテゴリーにほぼ例外なく見られる「シグネチャー遺伝子」により特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ゲノム工学に使用される最もよく知られているクラス２タンパク質である。

【0083】

ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、ｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲに基づくシステムの特異性は、標的配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の２つの因子に依存する。標的配列は、ｇＲＮＡの５’末端に位置し、プロトスペーサーとして知られる正確なＤＮＡ配列で宿主ＤＮＡ上の塩基対と結合するように設計されている。ｇＲＮＡの認識配列を交換するだけで、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは新たなゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は切断されるＤＮＡ上に位置し、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼにより認識される。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのＰＡＭ認識配列は、種特異的であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質若しくは分子又はＣｐｆ１タンパク質若しくは分子、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼであり得る。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼは、連鎖球菌属(Streptococcus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、ブレビバチルス属(Brevibacillus)、コリネバクテリア属(Corynebacter)、ステレラ属(Sutterella)、レジオネラ属(Legionella)、フランシセラ属(Francisella)、トレポネーマ属(Treponema)、シルファクター属(Filifactor)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、フラビイボラ属(Flaviivola)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、スフェロケタ属(Sphaerochaeta)、アゾスピリルム(Azospirillum)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、ロゼブリア属(Roseburia)、パービバキュラム(Parvibaculum)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、ニトラティフラクター属(Nitratifractor）、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、又はカンピロバクター属(Campylobacter)の細菌に由来するＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、限定されるものではないが、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、フランシセラ・ノビシダ(Francisella novicida)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophiles)、トレポネーマ・デンチコラ(Treponema denticola)、ブレビバチルス・ラテロスポルス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheria)、ユーバクテリウム・ヴェントリオスム(Eubacterium ventriosum)、ストレプトコッカス・パステウリアヌス(Streptococcus pasteurianus)、ラクトバチルス・ファーシミニス(Lactobacillus farciminis)、スフェロケタ・グロブス(Sphaerochaeta globus)、アゾスピリルム属(Azospirillum)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ロゼブリア・インテスティナリス(Roseburia intestinalis)、パルビバクルム・ラバメンティボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、ニトラティフラクター・サルスギニス(Nitratifractor salsuginis)、及びカンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)を含む群から選択される。

【0085】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質又は分子は、限定されるものではないが、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、フランシセラ・ノビシダＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、髄膜炎菌Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、トレポネーマ・デンチコラＣａｓ９（ＴｄＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、ブレビバチルス・ラテロスポルスＣａｓ９（ＢｌａｔＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）エンドヌクレアーゼ、これらの変異体エンドヌクレアーゼ、又はこれらのキメラエンドヌクレアーゼを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９変異体エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９変異体は、ＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体エンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９ Ｃａｓ９ ＶＲＥＲ変異体エンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９ Ｃａｓ９ ＥＱＲ変異体エンドヌクレアーゼ、ＳｐＣａｓ９−ＨＦ１変異体エンドヌクレアーゼ、又はｅＳｐＣａｓ９（１．１）変異体エンドヌクレアーゼである。

【0086】

ｉ．ＰＡＭ配列認識
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体はＤＮＡ二重鎖を解き、ｇＲＮＡ及び正確なＰＡＭと相補的な配列を探す。両方の条件が満たされれば、ヌクレアーゼは初めて標的ＤＮＡの切断を媒介する。ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのタイプと１以上のｇＲＮＡ分子の配列を指定することにより、ＤＮＡ切断部位を特定の標的ドメインに限局することができる。ＰＡＭ配列が変異体及び種に特異的であることを考えれば、標的配列は、ある特定のＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼのみにより認識されるように操作することができる。

【0087】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号２）又はＮＧＡ（配列番号３）を認識することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＧ（配列番号２）のＰＡＭ配列を認識する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはＳｐＣａｓ９ ＶＱＲ変異体エンドヌクレアーゼであり、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＡＮ（配列番号４９）又はＮＧＮＧ（配列番号５０）のＰＡＭ配列を認識する。

【0088】

５．ポリヌクレオチド
本明細書では更に、ｇＲＮＡを含む単離されたポリヌクレオチド配列が提供される。本明細書では又、ＤＮＡターゲッティングシステムをコードする単離されたポリヌクレオチド配列も提供される。ポリヌクレオチド配列は、ベクター内に含まれてもよい。ベクターは、ｇＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second編, Cold Spring Harbor (1989)を含む通常の技術及び容易に入手可能な出発材料によりタンパク質を生産するための発現ベクター又は発現システムであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質又は分子をコードする核酸配列を含み得る。

【0089】

ａ）構築物及びプラスミド
プラスミド、発現カセット又はベクターなどの遺伝子構築物は、本明細書に開示されるようにｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードする核酸を含み得る。遺伝子構築物は、機能性の染色体外分子として細胞内に存在し得る。遺伝子構築物は、セントロメア、テロメア又はプラスミド又はコスミドを含む線状ミニ染色体であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子構築物は、配列番号１３、１４、４３〜４８、及び／又はこれらの組合せの少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含み得る。

【0090】

遺伝子構築物は又、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス(adenovirus associated virus)、及び組換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む組換えウイルスベクターのゲノムの一部であってもよい。遺伝子構築物は、減弱された生微生物又は細胞内で生きている組換え微生物ベクター内の遺伝物質の一部であってもよい。組成物は、上記の通り、本明細書に開示されるように、改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝子構築体並びにｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードする核酸配列を含み得る。

【0091】

これらの核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成し得る。ベクターは、哺乳動物の細胞でｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムを発現する能力を持ち得る。ベクターは、組換えベクターであり得る。ベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、プラスミドであり得る。ベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードする核酸で細胞をトランスフェクトするために有用であり得、形質転換された宿主細胞をｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムの発現が起こる条件下で培養及び維持する。

【0092】

本開示の更なる実施形態では、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築体及びポリヌクレオチドは、様々な生物又は細胞で発現させるための様々なプロモーター、ターミネーター及び他の調節要素に機能的に連結することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子構築体は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含み得る。いくつかの実施形態では、この調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、又はポリアデニル化シグナルであり得る。

【0093】

代表的な実施形態では、少なくとも１つのプロモーター及び／又はターミネーターを本開示のポリヌクレオチドに機能的に連結することができる。本開示で有用ないずれのプロモーターも使用可能であり、例えば、本明細書に記載されるように、限定されるものではないが、構成的、誘導型、発生調節型などを含む、対照生物で機能的なプロモーターが含まれる。本明細書で使用される調節要素は、内在性のものでも異種のものでもよい。いくつかの実施形態では、対象生物に由来する内在性調節要素は、それが本来存在しない遺伝的コンテキストに（例えば、本来見られるものとは異なるゲノム位置に）挿入され、それにより、組換え又は非天然核酸を産生することができる。

【0094】

発現カセットは又、任意選択により、選択された宿主細胞内で機能的な転写及び／又は翻訳終結領域（すなわち、終結領域）を含んでもよい。発現カセットで使用するために様々な転写ターミネーターが利用可能であり、対象とする異種ヌクレオチド配列を超える転写の終結を担い得る。終結領域は、転写開始領域に対して天然であってもよいし、機能的に連結された対象ヌクレオチド配列に対して天然であってもよいし、宿主細胞に対して天然であってもよいし、又は別の供給源に由来してもよい（すなわち、対象ヌクレオチド配列、宿主、又はこれらのいずれかの組合せに対して外来又は異種）。本開示のいくつかの実施形態では、ターミネーターは、ＤＮＡターゲッティングシステムをコードする組換えポリヌクレオチドに機能的に連結することができる。

【0095】

発現カセットに加え、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド）は、ベクターとともに使用することができる。用語「ベクター」は、ある核酸（又たは複数の核酸）を細胞に移入、送達又は導入するための組成物を指す。ベクターは、移入、送達又は導入されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。本明細書に定義されるようなベクターは、細胞ゲノムに組み込むか又は染色体外要素（例えば、ミニ染色体）として存在するかのいずれかによって真核生物宿主を形質転換することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドは、リボヌクレオタンパク質複合体として送達することができる。

【0096】

ベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムをコードする異種核酸を含むことができ、更に、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムの上流にあり得る開始コドンと、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムの下流にあり得る終止コドンを含むことができる。開始コドン及び終結コドンは、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムとインフレームにあり得る。ベクターは又、ｇＲＮＡ及び／又はＤＮＡターゲッティングシステムに機能的に連結されたプロモーターも含み得る。

【0097】

ｂ）ウイルスのパッケージング
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ又はＤＮＡターゲッティングシステムは、ウイルスベクターにパッケージングされ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質又は分子をコードする核酸配列は、同じウイルスベクターにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質又は分子をコードする核酸配列は、異なるウイルスベクターにパッケージングされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクターであり得る。

【0098】

ｉ．改変レンチウイルスベクター
レンチウイルスベクターは、ヒト及び他の哺乳動物種に感染可能なレンチウイルス科のレトロウイルスに属すベクターである。遺伝子編集のための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、ｇＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質又は分子をコードする核酸配列をコードする１以上のポリヌクレオチド配列を含み得る。改変レンチウイルスベクターは、ｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列とＣａｓタンパク質又は分子をコードする第２のポリヌクレオチド配列を含み得る。１以上のポリヌクレオチド配列は、真核生物のプロモーターに機能的に連結することができる。プロモーターは、構成プロモーター、誘導プロモーター、抑制プロモーター、又は調節プロモーターであり得る。

【0099】

ｉｉ．アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶベクターは、ヒト及びいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス(Parvoviridae)科のデペンドウイルス(Dependovirus)属に属す小型のウイルスである。ＡＡＶは、種々の構築物構成を用いて細胞に組成物を送達するために使用することができる。例えば、ＡＡＶは、別個のベクター上にあるＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼをコードする遺伝子構築体、挿入配列、及び／又はｇＲＮＡ発現カセットを送達することができる。上記のような組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞にＣＲＩＳＰＲに基づくヌクレアーゼを送達し発現させる能力を持ち得る。例えば、改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−ＳＡＳＴＧベクターであり得る(Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646)。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ−ＰＨＰ．ｅＢを含むいくつかのキャプシドタイプのうち１以上に基づき得る。

【0100】

６．送達の方法
本発明で開示されるようなｇＲＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、ベクター、又はこれらの組合せは、非ウイルス法及びウイルス法を含む、細胞へのＤＮＡ送達法のいずれを用いて送達してもよい。一般的な非ウイルス送達法としては、形質転換及びトランスフェクションが含まれる。非ウイルス遺伝子送達は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子媒介遺伝子導入（「遺伝子銃」）、インペイルフェクション、静水圧、持続的注入、音波処理、化学トランスフェクション、リポフェクション、又はｉｎ ｖｉｖｏエレクトロポレーションを伴う及び伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種）などの物理的方法によって媒介され得る。ウイルス媒介遺伝子送達、又はウイルス形質導入は、宿主細胞内にそのＤＮＡを注入するウイルスの能力を利用する。送達を意図する遺伝子構築体は、複製欠損ウイルス粒子にパッケージングされる。使用される一般的なウイルスとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。本発明のいくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスが遺伝子構築体の送達に使用される。

【0101】

７．細胞
本明細書では更に、細胞が提供される。いずれの送達法も、限定されるものではないが、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、ブタ、又はヒト細胞などの動物細胞のような真核細胞を含む数知れない細胞種とともに利用可能である。いくつかの実施形態では、細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。これらの細胞は、エピジェネティック調節、ゲノムインプリンティング、ＰＷＳ疾病機序、又はこれらの組合せの側面を研究するために使用可能である。細胞は、ｇＲＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、ベクター、又はこれらの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ｉＰＳＣは、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）患者由来のものであり得る。ｉＰＳＣは、ニューロンに分化させてもよい。ｉＰＳＣは、ＰＷＳ１−７大領域欠失細胞株又はＵＰＤ１−２細胞株に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）である。

【0102】

８．医薬組成物
本明細書では更に、医薬組成物が提供される。本明細書で詳細に示されるような薬剤及びシステムは、製薬分野における当業者に周知の標準技術に従って医薬組成物として調剤することができる。組成物は、薬剤及び薬学上許容される担体を含み得る。用語「薬学上許容される担体」とは、本明細書で使用する場合、非毒性、不活性の固体、半固体又は液体増量剤、希釈剤、封入剤又はいずれのタイプの配合助剤も意味する。医薬組成物は、ｇＲＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、ベクター、細胞、又はこれらの組合せを含み得る。

【0103】

医薬組成物は、約１ｎｇ〜約１０ｍｇのｇＲＮＡコードＤＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、又はベクターを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に応じて調剤される。医薬組成物が注射医薬組成物である場合、それらは無菌、発熱物質不含、及び無粒子である。好ましくは、等張性製剤が使用される。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含み得る。いくつかの場合、リン酸緩衝生理食塩水などの等張性溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。

【0104】

ｇＲＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、又はベクターを含有する医薬組成物は更に、薬学上許容される賦形剤を含み得る。薬学上許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤としての機能的分子であり得る。投与方法が使用する担体の種類を規定する。所望の投与方法に好適ないずれの薬学上許容される賦形剤も使用可能である。薬学上許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得る。トランスフェクション促進剤としては、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイントの不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、多価陰イオン、多価陽イオン、若しくはナノ粒子、又はその他の既知のトランスフェクション促進剤といった界面活性剤を含み得る。トランスフェクション促進剤は、多価陰イオン、多価陽イオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む）、又は脂質であり得る。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり得る。ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、医薬組成物中に６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で存在してよい。医薬組成物は、脂質、リポソーム（レシチンリポソーム又はＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０参照）として当技術分野で公知の他のリポソームを含む）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、多価陰イオン、多価陽イオン、若しくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、又はその他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、多価陰イオン、多価陽イオン（ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む）、又は脂質である。

【0105】

開示される薬剤が投与される経路及び組成物の形態は、使用する担体の種類を規定する。医薬組成物は、例えば、全身投与（例えば、経口、直腸、舌下、口内、インプラント、鼻腔、腟内、経皮、静脈内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、又は非経口）又は局所投与（例えば、皮内、肺、鼻腔、口腔、眼内、リポソーム送達システム、又はイオン泳動）に好適な様々な形態であり得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象の中枢神経系への投与のためのものである。技術及び製剤は一般に“Remington's Pharmaceutical Sciences,” (Meade Publishing Co., Easton, Pa.)に見出すことができる。医薬組成物は一般に無菌且つ製造及び保存の条件下で安定でなければならない。全ての担体はそれらの組成物において任意選択である。

【0106】

本明細書で開示される薬剤のその他の実施形態としては、本明細書に開示される薬剤を含む製剤及び組成物が含まれ、これらの製剤及び組成物は又、薬学上許容される賦形剤及び活性又は不活性であり得る他の成分も含み得る。経口投与の場合、医薬製剤は例えば、溶液、シロップ又は懸濁液などの液体形態であってもよいし、又は使用前に水又は他の好適なビヒクルで再構成するための医薬品として提供することもできる。経口投与用製剤は、有効化合物の制御放出をもたらすように適宜調剤することができる。

【0107】

９．投与
本明細書で詳細に示されるような薬剤、又はそれを含む医薬組成物は、対象に投与することができる。薬剤を含むこのような組成物は、特定の対象の齢、性、体重、及び病態、並びに投与経路などの因子を考慮して、医学分野における当業者に周知の用量及び技術で投与することができる。

【0108】

特定の患者にとっての本明細書に開示される薬剤、組成物又は製剤の具体的な治療上有効な量は、使用する特定の化合物の活性、齢、体重、健康状態、性、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物組合せ、及び治療下の特定の疾患の重篤度を含む様々な因子に依存する。治療組成物中に見られる本明細書に記載の薬剤の濃度は、投与する薬物の用量、使用する化合物の化学的特徴（例えば、疎水性）、及び投与経路を含むいくつかの因子によって異なる。

【0109】

薬剤は予防的又は治療的に投与することができる。予防的投与では、薬剤は、応答の誘導に十分な量で投与することができる。治療的適用では、薬剤は、必要とする対象に治療効果の惹起に十分な量で投与される。これを達成するために十分な量は、「治療上有効な量」と定義される。この使用のために有効な量は、例えば、投与する化合物計画の特定の組成物、投与様式、疾患の病期及び重篤度、患者の健康状態、及び処方医の判断によって異なる。治療上有効な量は又、薬剤の毒性作用又は有害作用を治療上有益な効果が上回るものでもある。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために必要な用量及び期間で有効な量を指す。一般に、予防用量は、疾患の前又は疾患の初期段階で対象に使用されるので、予防上有効な量は治療上有効な量より少ない。

【0110】

例えば、薬剤の治療上有効な量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約９５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約９００ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約８５０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約８００ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約７００ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ〜約６５０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約６００ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ〜約５５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ〜約４５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約４００ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ〜約３５０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、及び約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり得る。

【0111】

薬剤は、Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 1997, 15, 617-648)；Felgner et al. (１９９６年１２月３日発行の米国特許第５，５８０，８５９号)；Felgner (１９９７年１２月３０日発行の米国特許第５，７０３，０５５号)；及びCarson et al. (１９９７年１０月２１日発行の米国特許第５，６７９，６４７号)（これらの全ての内容を本明細書の一部として援用する）に記載されているような当技術分野で周知の方法によって投与することができる。薬剤は、例えばワクチンガンを用いて個体に投与することができる粒子又はビーズと複合体を形成させることができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学上許容される担体の選択は例えば投与経路に依存することを知っている。

【0112】

薬剤は、様々な経路によって送達することができる。典型的な送達経路には、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内又は皮下送達が含まれる。他の経路としては、経口投与、鼻腔内、腟内、経皮、静脈内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、及び表皮経路が含まれる。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に静脈内、動脈内、又は腹膜内投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象の中枢神経系に投与される。いくつかの実施形態では、薬剤は、対象に経口投与される。

【0113】

他の実施形態では、組成物は、注射による非経口投与向けに調剤することができ、このような製剤は、保存剤を添加して又は添加せずに、単位剤形で提供することができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルションなどの形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤などの配合剤を含有し得る。

【0114】

１０．キット
本明細書では更に、キットが提供される。キットは、ｇＲＮＡ、ＤＮＡターゲッティングシステム、単離されたポリヌクレオチド配列、ベクター、細胞、又はこれらの組合せを含み得る。キットは更に使用説明書も含み得る。キットに含まれる説明書は、包装材料に添付されていてもよいし、又は添付文書として含まれてもよい。説明書は一般に書類又は印刷物であるが、これらに限定されない。このような説明書を保管してそれらを末端使用者に伝達し得るいずれの媒体も本開示より企図される。このような媒体としては、限定されるものではないが、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、それらの説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。

【0115】

１１．薬剤を使用する方法
ａ）対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法
本明細書では、対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法が提供される。方法は、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるＺＮＦ２７４結合部位を、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて低減されるように改変することを含み得る。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの相補物と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合は、対照に比べて少なくとも９０％低減される。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合は排除される。いくつかの実施形態では、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置は、ＺＮＦ２７４結合部位の改変前にサイレントである。いくつかの実施形態では、障害は、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、ＺＮＦ２７４結合部位の完全欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の部分的欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチドの突然変異、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチド位置での切断、又はこれらの組合せにより改変される。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、対象又は対象の細胞に、ＺＮＦ２７４結合部位に結合する、本明細書に記載されるようなＤＮＡターゲッティングシステムを投与することにより改変され、このＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、これらの相補物、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＺＮＦ２７４結合部位は、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムをコードする単離されたポリヌクレオチドを投与することにより改変され、このＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、これらの相補物、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

【0118】

他の実施形態では、この方法は、ＺＮＦ２７４タンパク質と、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるＺＮＦ２７４結合部位との相互作用を対照に比べて低減する薬剤の薬学上有効な量を対象に投与することを含んでよく、このＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの相補物と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、配列特異的ヌクレアーゼ、又は配列特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、１５ｑ１１−ｑ１３内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増大される。いくつかの実施形態では、１５ｑ１１−ｑ１３のプラダー・ウィリー症候群(Prader-Will syndrome)責任領域（ＰＷＳＣＲ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される。いくつかの実施形態では、ゲノム座標ｈｇ１９ ｃｈｒ１５：２５，０１２，９６１−２５，６８５，２５３又はｃｈｒ１５：２３，６９５，６０３−２５，０２６，５５８から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される。いくつかの実施形態では、ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＨＧ１４、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される。いくつかの実施形態では、ＳＮＲＰＮエキソン２、ＳＮＲＰＮエキソン３、ＳＮＲＰＮエキソン４、ＵＢＥ３Ａ、ＭＡＧＥＬ２、ＭＫＲＮ３、ＳＮＲＰＮエキソンＵ４、ＮＤＮ、又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの発現が増強される。いくつかの実施形態では、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ａプロモーター、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂプロモーター、又はこれらの組合せからの転写の開始が増強される。いくつかの実施形態では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の結合が低減される。

【0120】

ｂ）スクリーニングのための方法
本明細書では更に、ゲノムインプリンティングの障害を治療するための化合物をスクリーニングする方法が提供される。薬剤は、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４の結合に干渉し、それにより、母性ＰＷＳＣＲ ＲＮＡ転写産物を活性化させるそれらの能力に基づいて選択又は設計され得る。

【実施例】

【0121】

１２．実施例
実施例１
材料及び方法
ｉＰＳＣ及びニューロン分化の培養条件。 ｉＰＳＣは、照射したマウス胚線維芽細胞上で増殖させ、ノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、Ｌ−グルタミン、β−メルカプトエタノール、及び塩基性ＦＧＦを添加したＤＭＥＭ−Ｆｌ２から構成される従来のｈＥＳＣ培地を毎日供給した。ｉＰＳＣは、加湿インキュベーターにて３７℃、５％ＣＯ₂で培養し、週１回手で植え継いだ。

【0122】

ｉＰＳＣのニューロン分化は、一部改変した単層分化プロトコールを用いて行った。簡単に述べれば、ｉＰＳＣコロニーをｈＥＳＣ培地で２４時間培養した後にＮ２Ｂ２７培地に切り替えた。細胞に１日おきに、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、２％Ｂ−２７サプリメント、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％インスリン−トランスフェリン−セレン、１％Ｎ２サプリメント、０．５％Ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを含有するＮ２Ｂ２７培地を供給し、５００ｎｇ／ｍＬの新鮮なノギンを添加した。３週間の神経分化の後、ポリオルニチン／ラミニンでコーティングした組織培養プレートで神経前駆細胞を平板培養した。神経分化培地はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｂ−２７サプリメント、非必須アミノ酸、及びＬ−グルタミンからなり、１μＭアスコルビン酸、２００μＭサイクリックアデノシン一リン酸、１０ｎｇ／ｍＬ脳由来神経栄養因子、及び１０ｎｇ／ｍＬグリア由来神経栄養因子を添加した。特に断りのない限り、神経培養物が少なくとも１０週齢に達したところで細胞を採取した。

【0123】

レンチウイルスの生産、形質導入、及びクローンスクリーニング。 ｓｇＲＮＡは、ウェブに基づくＣＲＩＳＰＲ設計ツールを用いて設計し、ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ４９５３５及び５２９６１；Ａｄｄｇｅｎｅ、ウォータータウン、ＭＡ）及びｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅＰｕｒｏ（Ａｄｄｇｅｎｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ５２９６３、Ａｄｄｇｅｎｅ、ウォータータウン、ＭＡ）にクローニングした。２９３ＦＴ細胞を、リポフェクタミン２０００を用いた第二世代パッケージングシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバット、ＣＡ）でトランスフェクトすることにより、レンチウイルス粒子を作製した。形質導入前に、ｉＰＳＣを１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２で一晩処理した。翌日、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、バーリントン、ＭＡ）を用いてｉＰＳＣを単体とし、低結合ディッシュ中、８μｇ／ｍＬポリブレンの存在下、懸濁液としてのレンチウイルスで２時間、形質導入を行った。次に、ｉＰＳＣ／レンチウイルス混合物をｈＥＳＣ培地で１：１希釈し、１０μＭ ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２を添加したピューロマイシン耐性（ＤＲ４）ＭＥＦフィーダー上で、低密度で一晩、平板培養した。接着細胞をｈＥＳＣ培地で更に７２時間培養した後、１週目は０．５μｇ／ｍＬ、２週目は１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて薬物選択を開始した。ピューロマイシン耐性ｉＰＳＣコロニーを個々に新たなフィーダーウェルに取り、ゲノムＤＮＡでのＰＣＲ及びシーケンシングを行うことによりインデルに関してスクリーニングした。遺伝子編集ｉＰＳＣの多能性は、従前に記載されているように(Chen, et al. Sci. Rep. 2016, 6, 25368)、マウス抗ヒトステージ特異的胚抗原４(stage specific embryonic antigen 4)（ＳＳＥＡ４）及びウサギ抗ヒトＯＣＴ３／４（両方ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（ユージーン、ＯＲ）から）を用いた免疫細胞化学によってバリデートした。核型分析及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＨＤ ６．０アレイは、ＵＣＯＮＮ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｏｒｅのジェネティクス・ゲノミクス部門により実施された。各ｉＰＳＣ株からの２０のＧ分染中期細胞を調べて各株の核型を作成した。

【0124】

ＣＲＩＳＰＲは、ＰＷＳ様の欠失（父性ＳＮＯＲＤ１１６の欠失又は父性ＳＮＲＰＮ〜ＳＮＯＲＤ１１６の欠失）を有するように操作したｈＥＳＣ又はＰＷＳ ｉＰＳＣをＣａｓ９、ＺＮＦ２７４又はＺＮＦ２７４結合部位を標的とするｇＲＮＡ、及びピューロマイシン耐性カセットを有する２つの構築物でヌクレオフェクションを行うことにより一時的に導入した。ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣをピューロマイシンで４８時間選択し、得られたクローンを、欠失切断点にわたるＰＣＲを用いて特定の欠失に関してスクリーニングした。

【0125】

ＲＮＡ単離及びＲＴ反応。 ＲＮＡ−Ｂｅｅ（Ｔｅｌ Ｔｅｓｔ，Ｉｎｃ．、フレンズウッド、ＴＸ）を用いて細胞からＲＮＡを単離した。サンプルを必要に応じてＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ ＤＮａｓｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバット、ＣＡ）を用い、３７℃で４５分間、ＤＮアーゼで処理し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールズバット、ＣＡ）を製造者の説明書に従って用い、ｃＤＮＡを合成した。

【0126】

ＲＴ−ｑＰＣＲ及び発現アレイ。 単一遺伝子発現アッセイでは、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）又はＢｉｏＲＡＤ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ）にて、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）を用い、標的遺伝子の発現レベルを調べた。各反応につき２０ｕｌの容量で、３０ｎｇのＲＮＡに相当する量のＲＴ反応を使用した。反応は２回又は３回の技術的反復で実施し、内部対照としてＧＡＰＤＨ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙを製造者のプロトコールに従って使用した。キャリブレーターサンプルとして正常細胞株ＣＴＲＬ１又はＣＴＲＬ２を用い、相対量（ＲＱ）の値を２^-ΔΔCtとして計算した。

【0127】

本発明者らの１０週齢ニューロンにおいて１５ｑ１１．２−ｑ１３領域全体の遺伝子発現レベルを検討するためにＴａｑｍａｎ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ａｒｒａｙ（ＴＬＤＡ）技術を使用した。２つのハウスキーピング遺伝子を含む４８の標的遺伝子を用いて、カスタム形式のＴａｑｍａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）を設計し、これは各カード８サンプル（ＣＴＲＬ２を含む）を見込んでいる。全てのプライマー／プローブセットを表８に示す。遺伝子発現アッセイはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、ＣＡ）により供給された。ＴＬＤＡ分析では、製造者の指示に従い、各ＲＴ反応で４００ｎｇのＤＮＡｓｃ処理ＲＮＡを使用した。１５０ｎｇの有効ＲＮＡに相当するｃＤＮＡサンプル、リボヌクレアーゼ不含水、及びＰＣＲマスターミックスを各ＴＬＤＡカードフィルポートにロードした。これらのサンプルを遠心分離によりプレート上に分布させた。リアルタイムＰＣＲは７９００ＨＴ又はＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ）にて行った。同じＣＴＲＬ２サンプルを本発明者らのキャリブレーター又は内部陽性対照（ＩＰＣ）として各カードに系統的にロードし、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｌｏｕｄインターフェースを用いて、異なるプレート間のＣｑ値を正規化するためにＩＰＣ設定でデータを分析した。

【0128】

クロマチン免疫沈降。 ＣｈＩＰアッセイを記載の通りに行った(Cruvinel, et al. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 4674-4685; Cotney, et al. Cold Spring Harb. Protoc. 2015, 191-199; Martins-Taylor, et al. Epigenetics 2012, 7, 71-82)。抗ＺＮＦ２７４抗体（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ０００１０７８２−Ｍ０１；Ａｂｎｏｖａ、台湾）及び抗トリメチルヒストンＨ３（Ｌｙｓ９）抗体（Ｈ３Ｋ９ｍｃ３；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０７−４４２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、バーリントン、ＭＡ）を使用した。ＣｈＩＰの定量は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ定量的ＰＣＲを用いて行った。精製されたＤＮＡを増幅するために使用したＰＣＲプライマーは表２に見出すことができる。ＤＮＡの富化は、従前に記載されているように(Martins-Taylor, et al. Epigenetics 2012, 7, 71-82)、インプットパーセントとして計算した。正常ウサギＩｇＧをアイソタイプ対照として用いたところ、富化は示さなかった。データは平均とＳＤとして示し、独立した培養物から少なくとも２回の生物学的反復の平均を表す。

【0129】

５ｈｍｃレベルの検出。 ＤＮＡにおける５−メチルシトシン(5-methyleytosine)（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び非修飾シトシン（Ｃ）のパーセンテージを、ＥｐｉＭａｒｋ ５−ｈｍＣ ａｎｄ ５−ｍＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、ＭＡ；カタログ番号Ｅ３３ｌ ７Ｓ）を用いて評価した。これらのアッセイに使用したｑＰＣＲプライマーを表２に示す。表２は、使用したＳＹＢＲプライマー配列を一覧化したものである。報告された値は、それぞれ定量的ＰＣＲにより３反復で分析した少なくとも２回の独立した実験の平均を表す。データは独立した実験の平均及びＳＤとして表した。

【0130】

統計検定。 統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて行った。示された各条件について、独立した培養物から少なくとも２回の生物学的反復からの平均値を計算し、得られた標準偏差（ＳＤ）をエラーバーで報告した。特に断りのない限り、各実験で、各サンプルの平均値を同じ遺伝子型の親ＰＷＳ細胞株（ＰＷＳ ＬＤ又はＰＷＳ ＵＰＤ）と比較し、各非操作とＫＯペアの有意性を、一元又は二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をダネット事後検定とともに用いて計算した。

【表2】

【0131】

実施例２
ＺＮＦ２７４ ＫＯ株の作出及び特性決定
従前に特性決定されたＰＷＳ ＬＤ ｉＰＳＣ(Chamberlain, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2010, 107, 17668-17673)に加え、ｉＰＳＣ株をＰＷＳ ＵＰＤ患者から作出した（図８Ｂ及び表３）。

【表3】

【0132】

ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３蓄積に対するＺＮＦ２７４枯渇の影響を決定するために、ＰＷＳ特異的ｉＰＳＣにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトを行った。ＰＷＳ ＬＤ及びＰＷＳ ＵＰＤにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトは、ＺＮＦ２７４の２つの主要なアイソフォームを標的とするために、ＺＮＦ２７４遺伝子（ＮＭ＿１３３５０２）のエキソン２及び６内に２つの異なる単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計することにより行った（図８Ａ；表４）。フレームシフト及び未成熟終止コドンをもたらす非相同末端結合媒介挿入／欠失（インデル）をスクリーニングした後に、５つのクローン性のｉＰＳＣクローン(clonal iPSC clones)を選択した(Shalem et al., Science, 342:84-87 (2014))。ＰＷＳ ＬＤ株におけるレンチウイルス形質導入及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９組込み及び発現の更なる対照として、ヒトゲノムにおいて一致のない従前にバリデートされたスクランブルｓｇＲＮＡを使用した（表４及び５）。クローン性誘導体ＰＷＳ ＬＤ ｓｃ１を、ＣＲＩＳＰＲ構築物の導入が親ＰＷＳ ＬＤ株において遺伝子発現に影響を及ぼさなかったことを確認するために選択した。

【表4】

【表5】

【0133】

ＺＮＦ２７４ノックアウト（ＺＮＦ２７４ ＫＯ）によって誘導された遺伝子変化をＰＷＳ ＬＤ ＺＮＦ２７４ ＫＯ株（ＬＤ ＫＯ１及びＬＤ ＫＯ２）及びＵＰＤ ＺＮＦ２７４ ＫＯ株（ＵＰＤ ＫＯ１、ＵＰＤ ＫＯ２、及びＵＰＤ ＫＯ３）に関して表６にまとめる。

【表6】

【0134】

操作されたｉＰＳＣ株の核型分析は、検出可能な異常がないことを示した（表３）。多能性に関する慣例の試験を行ったところ（図８Ｂ）、上位の潜在的標的外遺伝子座内に配列変化は見られなかった（表７）。

【表7】

【0135】

実施例３
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトはＰＷＳ特異的ｉＰＳＣにおいてＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座(Iocus)でＨ３Ｋ９ｍｅ３を枯渇させる
ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ ｉＰＳＣ及びそれらの誘導体ＺＮＦ２７４ ＫＯクローン並びに対照個体（ＣＴＲ１及びＣＴＲＬ２）及び母性染色体１５ｑ１１−ｑ１３の大領域欠失を有するアンジェルマン症候群（ＡＳ）患者由来のｉＰＳＣでクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行い、全てのＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ ＺＮＦ２７４ ＫＯクローンの１２全ての既知のＺＮＦ２７４結合部位においてＺＮＦ２７４の結合が全く存在しないことが認められ、有効なＺＮＦ２７４ ＫＯを示す（図１Ｂ及び図９Ａ）。このＺＮＦ２７４結合の不在は、全てのＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ ＺＮＦ２７４ ＫＯクローンで、６つのＺＮＦ２７４結合部位（ＢＳ）（ＳＮＯＧ１−ＢＳ１〜ＳＮＯＧ１−ＢＳ６）におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の顕著な低減に関連しており、ＫＯ ｉＰＳＣ株におけるＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座でのＺＮＦ２７４機能の有効な破壊を示す。供試した既知のＺＮＦ２７４ ＢＳの全てでＺＮＦ２７４タンパク質が全く存在しないことが認められたが、参照として用いたＺＮＦ１８０ ３’ＵＴＲのＺＮＦ２７４ ＢＳにおいてはＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベルは、低減されなかった。

【0136】

もっともらしい説明は、ＺＮＦ２７４ ＢＳはほとんどの場合、第２のジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ７５Ｄ）と共有されているということである。実際に、ＫＲＡＢドメインを含有するジンクフィンガータンパク質遺伝子内のＺＮＦ２７４結合部位の８９．１％がＺＮＦ７５Ｄと共有されている。例えば、ＺＮＦ１８０及びＺＮＦ５５４の３’ ＵＴＲは、ＺＮＦ２７４及びＺＮＦ７５Ｄの両方によって結合される２つの標的領域であり、これらの部位においてＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルに対する効果はほとんど又は全く見られなかった（図９Ｂ）。他方、ＺＮＦ７８１及びＺＮＦ９０の３’末端は、ＺＮＦ２７４のみが結合した希少な部位のうちの２つであり、この所見と一致して、それら２つのＢＳに関してより顕著なＨ３Ｋ９ｍｅ３の低減が検出された（図９Ｂ）。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３のレベルは、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ ＺＮＦ２７４ ＫＯクローンにおいてＳＮＯＧ２及びＳＮＯＧ３で、すなわち、ＳＮＯＧ１−ＢＳ１〜ＳＮＯＧ１−ＢＳ６の下流に位置するＳＮＯＲＤ１１６クラスグループ２及び３遺伝子座でも低減されていた（図９Ｃ）。母性特異的ＳＮＯＧ１ ＺＮＦ２７４ ＢＳにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の沈着の広がりは、従前の所見と一致していた(Cruvinel, et al. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 4674-4685)。同時に、ＳＮＯＲＤ１１６宿主遺伝子グループ１（１１６ＨＧＧ１）転写産物の発現の活性化がＺＮＦ２７４ ＫＯ ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ ｉＰＳＣで見られた（図９Ｄ）。

【0137】

これらの結果は、ＰＷＳ ｉＰＳＣにおけるＺＮＦ２７４ ＫＯはＨ３Ｋ９ｍｅ３を低減し、クロマチンの脱凝集及びＰＷＳ遺伝子座内の１１６ＨＧＧ１の部分的な転写活性化をもたらすことを示唆した。

【0138】

実施例４
ＰＷＳ特異的ｉＰＳＣにおけるＳＮＲＰＮ活性化に対するＺＮＦ２７４ ＫＯの影響
ＰＷＳ ｌｎｃＲＮＡの調節要素を調べることにより、ＺＮＦ２７４ ＫＯが１１６ＨＧＧ１発現を活性化させる機構も検討した。このために、エキソン１内の主要プロモーター及び主に脳でＰＷＳ ｌｎｃＲＮＡを駆動するその択一的上流エキソンプロモーターＵ１Ｂ及びＵ１Ａによって駆動されるＳＮＲＰＮ転写産物を分析した。Ｕ１Ｂ及びＵ１Ａにより駆動されるＳＮＲＰＮ転写産物は、エキソン１をスキップし、エキソン２へスプライシングする。Ｕ４内部エキソンはほとんどのＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂ及びＵ１Ａ転写産物に含まれているので、本発明者らは、エキソンＵ４からエキソン２へスプライシングするＲＮＡに関してアッセイした。ＺＮＦ２７４ ＫＯにより媒介されるＵ４／エキソン２の活性化（図２Ａ）が検出されたが、エキソン１／エキソン２ ＳＮＲＰＮ転写産物の活性化は検出されず（図２Ｂ）、ＺＮＦ２７４複合体は、主要ＳＮＲＰＮエキソン１プロモーターではなくむしろＵ１Ｂ及びＵ１Ａプロモーターに対するその作用を介して母性ＰＷＳ転写産物を抑制するという所見が示唆された。この示唆に一致して、ＳＮＲＰＮ主要エキソン１プロモーターを使用しなければ（図２Ｂ）、ＳＮＲＰＮエキソン３−４コード転写産物の部分的な活性化が検出されるに過ぎなかった。ＳＮＲＰＮ及びＰＷの調節に対するＺＮＦ２７４ ＫＯの影響を更に理解するために、ＳＮＲＰＮエキソン１内に含まれる（図２Ｄ）ＰＷＳ−ＩＣのＤＮＡのメチル化（図２Ｃ）を調べた。ＰＷＳ ＬＤ ｉＰＳＣ及びそれらのＺＮＦ２７４ ＫＯ誘導体では、母性ＰＷＳ−ＩＣにおいてほとんど同一のレベルのＣｐＧのメチル化（図２Ｄ）が見られた。これらの知見は、母性ＳＮＲＰＮエキソン１プロモーターがＺＮＦ２７４ ＫＯによっては活性化されなかったという所見に一致しただけでなく、重要なことには、ＺＮＦ２７４は、ＰＷＳ−ＩＣとは独立に働く、１５番染色体のｑ１１−ｑ１３インプリンティングのエピジェネティックレギュレーターであることが示唆された。

【0139】

実施例５
ＺＮＦ２７４ ＫＯはＰＷＳニューロンにおいて母性遺伝子発現を回復させる
ＳＮＲＰＮエキソンＵ１Ｂ及びＵ１Ａは主として脳で活性があることから、ＺＮＦ２７４ ＫＯによる母性ＰＷＳ転写産物の救済の機構を更に理解するために、ｉＰＳＣ株から神経前駆細胞（ＮＰＣ）及びニューロンを誘導した（図３）。ＺＮＦ２７４ ＫＯはＰＷＳ ｉＰＳＣにおいて母性１１６ＨＧＧ１の発現を１００倍以上増強したが（図９Ｄ）、達成されたレベルは、ＣＴＲＬ ｉＰＳＣ株における１１６ＨＧＧ１に関するレベルより遙かに低かった（図３Ａ）。しかしながら、神経分化時には、よりロバストな活性化が見られ、１１６ＨＧＧ１の発現は、ＺＮＦ２７４ ＫＯ ＮＰＣではほぼ対照レベルに達し、救済されたニューロンでは、これらに達したか又は超えた（図３Ｂ及び図３Ｃ）。ＰＷＳ ＬＤ株及びＵＰＤ株のＺＮＦ２７４ ＫＯは、４週間の分化の後にＣＴＲＬ株に比べて１１６ＨＧＧ１発現の顕著な増強をもたらし（図３Ｂ）、１０週間の分化の後には、ニューロンにおける正常な発現レベルを回復させた（図３Ｃ）。

【0140】

染色体１５ｑ１１−ｑ１３にわたる転写産物の発現を、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤ、それらのＺＮＦ２７４ ＫＯ誘導体、ＣＴＲＬ及びＡＳ ＬＤからのｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて調べた。上手くいかなかったデータ点を除外した後に、全ての株を各単一アレイで実施された同じサンプル：ＣＴＲＬ２に対して正規化した。ニューロン遺伝子の発現をバリデートするために、ＰＡＸ６、ＦＯＸＧ１、ＲＢＦＯＸ１、ＲＢＦＯＸ３、及びＳＯＸ２を本発明者らのサンプルでアッセイした（オレンジの列）。図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃは、ＺＮＦ２７４ ＫＯがＰＷＳニューロンにおいて染色体１５ｑ１１．２−ｑ１３にわたる転写を活性化させることを示す。図４Ａ及び図４Ｂは、大領域欠失及びＵＰＤ ＰＷＳのデータを別に示すが、図４Ｃは合わせたデータを示す。図４Ａ、４Ｂ、及び４Ｃでは、白のＡＳ及び青のＣＴＲＬは、父性対立遺伝子由来の予想される発現を示し、黒のＰＷＳ及び緑のＫＯは、母性対立遺伝子由来の予想される発現を示した。緑のＫＯでは、１５ｑ１１−ｑ１３領域の大部分の発現が見られ、これは母性対立遺伝子からの１５ｑ１１−ｑ１３領域の全般的な再活性化を示した。２つの転写産物を除いて、１５ｑ１１−ｑ１３領域の転写産物のほとんどがＺＮＦ２７４ ＫＯ ＰＷＳニューロンにおいて再発現された。それらのうち１つはＳＮＲＰＮエキソン１／２転写産物であった（緑の発現がない＝ＺＮＦ２７５４ ＫＯ時にこの転写産物の救済がない）。表８は、Ｔａｑｍａｎアッセイリスト及びカラーコードを示す。表９は、Ｃｔ値リストを示す。表１０は、ＲＱ値リストを示す。表１１は、ＲＱ平均値リストを示す。表１２は、統計値を示す。

【0141】

１１６ＨＧＧ１と同様に、ＰＷＳ遺伝子座内の他の転写産物（ＳＮＯＲＤ１１６−１及びＩＰＷ）も、ＺＮＦ２７４ ＫＯニューロンにおいてＣＴＲＬニューロンと同レベルで発現された（図４及び表８〜１２）。又、ＰＷＳ遺伝子座の下流（ＳＮＯＲＤ１１５−１、その１１５ＨＧ宿主遺伝子及びＵＢＥ３ＡにオーバーラップするアンチセンスＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ）でも、同等レベルの、ＺＮＦ２７４ ＫＯにより媒介される母性ニューロン転写産物の再活性化が検出された（図４及び表８〜１２）。ＺＮＦ２７４ ＫＯはニューロンのＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳを正常レベルにまで活性化したが、同時に、ＵＢＥ３Ａ発現を、少なくとも正常対照ＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡレベルに比べて低下させることはなかった（図４及び表８〜１２）。

【0142】

ＳＮＲＰＮ Ｕ４／エキソン２転写産物は、ニューロンではＺＮＦ２７４ ＫＯによって完全に救済されたが、エキソン１を利用するＳＮＲＰＮ転写産物はサイレントのままであり、エキソン３／４転写産物は部分的に活性化された（図４、図５Ａ〜５Ｃ及び表８〜１２）。これらの結果は、ＺＮＦ２７４複合体がＳＮＲＰＮ上流プロモーターを介してＰＷＳ転写産物を調節するという仮説と一致した。これらの上流エキソンはニューロン及びＮＰＣで優先的に使用される。これを支持して、ＺＮＦ２７４ ＫＯ時のニューロン及びＮＰＣではｉＰＳＣよりも高レベルのＳＮＲＰＮ Ｕ４／エキソン２発現が得られ（図５Ａ及び図５Ｂ）、これはＵ１Ｂ及びＵ１Ａプロモーターが脳で活性が高いという報告と一致している（図６）。ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤニューロンにおけるＺＮＦ２７４ ＫＯは、ほとんどの母性ＰＷＳ転写産物のロバストな発現を活性化し（図４、図５Ａ〜５Ｃ、図６及び表８〜１２）、ＰＷＳ−ＩＣにおける５ｍＣレベルに変化は見られず（図２Ｄ及び図５Ｅ）、この知見は、ＺＮＦ２７４ ＫＯはＳＮＲＰＮエキソン１転写を活性化させなかったという所見（図４、図５Ｂ及び表８〜１２）と一致し、母性ＰＷＳ遺伝子座へのＺＮＦ２７４の結合がＰＷＳ−ＩＣとは独立した機構によってサイレンシングを媒介したという主張とも一致する。この仮説は、ＰＷＳ−ＩＣの欠失は脳においてインプリンティングされた発現の欠如をもたらさないという報告と一致する。

【0143】

インプリンティングされたＰＷＳ領域の更に上流では、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤニューロンでのＭＡＧＥＬ２及びＭＫＲＮ３の発現、並びにＺＮＦ２７４ ＫＯ時の両者の上方調節が検出された（図４及び表８〜１２）。ＮＤＮは、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤニューロンでは検出されず、ＺＮＦ２７４ ＫＯによって活性化されなかった（図４及び表８〜１２）。後者の結果は、ＳＮＲＰＮエキソン１と同様に（他のＰＷＳ転写産物はそうではない）、ＮＤＮインプリンティングはＰＷＳ−ＴＣによって調節されたことを示唆し、母性ＰＷＳ−ＴＣの欠失がＮｄｎの発現を活性化させたマウスモデルと一致する。１５ｑ１１−ｑ１３インプリンティング領域の外側の遺伝子であるＣＹＦＩＰ１及びＣＨＲＮＡ７は、全てのｉＰＳＣ株から誘導されたニューロンで発現された。両遺伝子のｍＲＮＡレベルは、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤにおいて同じであり、それらのＺＮＦ２７４ ＫＯ誘導体では影響がなかった（図４及び表８〜１２）。これらの結果は、インプリンティングされた染色体１５ｑ１１−ｑ１３領域の外側ではなく内側のほとんどのニューロン転写産物のＺＮＦ２７４媒介抑制の役割を示唆した。

【表8-1】

【表8-2】

【表9-1】

【表9-2】

【表10-1】

【表10-2】

【表11-1】

【表11-2】

【表12-1】

【表12-2】

【0144】

実施例６
考察
母性遺伝性のサイレントＰＷＳ転写産物は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるＺＮＦ２７４のノックアウトにより活性化された。ＺＮＦ２７４の欠如は、ＰＷＳ遺伝子座内のＨ３Ｋ９ｍｃ３の低減をもたらし（図１Ｂ、図１Ｃ、及び図９）、ＰＷＳ ｉＰＳＣ、ＮＰＣ、及びニューロンにおいて母性転写産物の発現を活性化させた（図１〜６及び表８〜１２）。ＰＷＳニューロンにおいてＺＮＦ２７４ ＫＯによって誘導される母性転写産物の発現は正常レベルに達し、ＰＷＳ遺伝子座内だけでなく染色体１５ｑ１１−ｑ１３インプリンティング領域全域にロバストな活性化が見られた（図３〜６及び表８〜１２）。ＺＮＦ２７４ ＫＯによって救済されなかった２つのＰＷＳ母性ｍＲＮＡは、エキソン１プロモーターにより駆動されるＳＮＲＰＮ転写産物及びＮＤＮであった（図２Ｂ、図４、図５Ｂ及び表８〜１２）。ＳＮＲＰＮについては、ＺＮＦ２７４ ＫＯは母性ＰＷＳ−ＩＣのＣｐＧのメチル化を変更しなかった可能性があり（図２Ｄ及び図５Ｅ）、ゆえに主要ＳＮＲＰＮエキソン１プロモーターを活性化させなかった。ＮＤＮの発現はＺＮＦ２７４ ＫＯによって救済されなかった。ＭＡＧＥＬ２及びＭＫＲＮ３の両方の発現は、ＰＷＳ ＬＤ及びＵＰＤニューロンにおいてＺＮＦ２７４ ＫＯにより上方調節され（図４及び表８〜１２）、このことはＳＮＯＲＤ１１６クラスターへのＺＮＦ２７４の結合が母性対立遺伝子のサイレンシングに寄与していたことを示唆する（図７）。

【0145】

ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳのロバストな活性化にもかかわらず、ＵＢＥ３Ａレベルの低下は検出されなかった（図４及び表８〜１２）。ＵＢＥ３ＡＡＴＳにより媒介されるＵＢＥ３Ａのサイレンシングは、ｉＰＳＣから分化させたニューロンが比較的未熟なために、又は母性ＵＢＥ３Ａ ｍＲＮＡの発現レベルが父性対立遺伝子よりも本質的に高かく、従って、アンチセンスにより媒介されるサイレンシングに対しより耐性があったことから、検出できなかった可能がある。これに関して、ＰＷＳ ＬＤ由来ニューロン及びＵＰＤ ｉＰＳＣ由来ニューロンの両方でのＵＢＥ３Ａの発現はＣＴＲＬよりも高かった（図４及び表８〜１２）。

【0146】

ヒトＰＷＳ線維芽細胞及びＰＷＳのマウスモデルにおける母性転写産物の活性化は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＧ９ａを標的とする新規な化合物を使用することによって実証された。Ｇ９ａ阻害を介した母性ＰＷＳ ＲＮＡの活性化は、ＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３及びＨ３Ｋ９ｍｅ２のレベルの低下、並びにＰＷＳ−ＩＣにおけるＨ３Ｋ９ｍｃ２のレベルの低下（ＰＷＳ−ＩＣにおけるＤＮＡメチル化レベルに影響を及ぼさない）に関連していた。少なくともヒトでは、ＺＮＦ２７４／ＳＥＴＤＢ１複合体も又、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３により媒介される、母性染色体１５ｑ１１−ｑ１３転写産物のサイレンシングに必要とされた。Ｇ９ａ−ヒストンメチル化及びＺＮＦ２７４／ＳＥＴＤＢ １−ヒストンメチル化が互いに独立であるか又は相補的であるかはまだ決定されていないが、機構的な違いであると思われる。例えば、ＮＤＮ及びＳＮＲＰＮエキソン１は、Ｇ９ａ阻害により活性化されたが、ＺＮＦ２７４ ＫＯによっては活性化されなかった（図２Ｂ、図４、図５Ｂ、及び表８〜１２）。この違いは、ＺＮＦ２７４／ＳＥＴＤＢ１複合体は脳特異的ＰＷＳ ｌｎｃＲＮＡプロモーターを特異的に調節したが、新規な化合物の使用に関しては、ＰＷＳ−ＩＣにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ２の低減が細胞種に依存せずにＮＤＮ及びＳＮＲＰＮエキソン１の発現を担ったというものであり得る。

【0147】

ＺＮＦ２７４複合体は、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂ及びＵ１Ａプロモーターから転写を開始させるために必要なシス作用調節要素を抑制し得る（図７）。ＺＮＦ２７４複合体により抑制される調節要素は、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂ／Ｕ１Ａプロモーターを活性化させるエンハンサーであり得る。或いは、この要素は、他の遺伝子の転写を調節する働きをする１１６ＨＧ ｌｎｃＲＮＡであり得る。本発明者らのモデル（図７）では、ＺＮＦ２７４ ＫＯ ｉＰＳＣにおけるＳＮＲＰＮ上流プロモーターにより駆動される転写産物の低レベルの発現が脳特異的転写因子によるニューロン分化時に上方調節された。幹細胞ノックアウトモデルにおける通常はサイレントの母性ＰＷＳニューロン転写産物の活性化は、ＺＮＦ２７４がＰＷＳの今後の治療適用の潜在的標的となり得ることを示す。これらのデータ（図１Ｂ、図９Ａ、及び図９Ｂ）は、ＺＮＦ２７４が他のＺＮＦタンパク質と協調してゲノム標的部位にＨ３Ｋ９ｍｅ３を沈着させる働きをするという所見と一致した。ＺＮＦ２７４ ＫＯは、その標的部位の約１０％にＨ３Ｋ９ｍｅ３の完全な欠如をもたらし得るにすぎない。

【0148】

実施例７
本明細書では又、エピジェネティック調節及びＰＷＳの疾病機序の側面を研究するために、ＰＷＳ特異的ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）の作出及びそれらのニューロン分化のための技術が開示される。ＰＷＳＣＲにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３の蓄積を介してエピジェネティックサイレンシングを果たすために、母性ＰＷＳＣＲに結合するＺＮＦ２７４／ＳＥＴＤＢ１含有エピジェネティック複合体が発見された。ＺＮＦ２７４を標的とするためにＣＲＩＳＰＲレンチウイルスベクターを使用し、ＰＷＳ ｉＰＳＣ株であるＰＷＳ１−７大領域欠失のＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（Ｂ１７−２１及びＺＫＬ６）、及びＵＰＤ １−２のＺＮＦ２７４ノックアウトクローン誘導体（ＺＫＵ４Ｂ及びＺＫＵ２１Ａ）を作出した。２つの親ＰＷＳ ｉＰＳＣ株及びそれらの２つのＺＮＦ２７４ ＫＯクローン誘導体のそれぞれ、並びに２つの正常対照（ＬｃＮＬ−１及びＭＣＨ２−１０）をニューロンに分化させた。ＲＴ−ｑＰＣＲ分析（図１０）は、ＺＮＦ２７４ノックアウト時に、ＰＷＳ領域からの３つのＲＮＡ転写産物ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、及びＳＮＯＲＤ１１５で、ニューロン転写産物の完全な再活性化が達成されたことを示す。これらの知見は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるＺＮＦ２７４のＫＯは、ＰＷＳ ｉＰＳＣから誘導されたニューロンにおいてサイレントの母性ＰＷＳＣＲ転写産物（ＳＮＯＲＤ１１６及びＩＰＷ）を有効に再活性化したことを示す。

【0149】

ＰＷＳの誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）モデルを用い、エピジェネティック複合体が、ジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ２７４及びＳＥＴ ｄｏｍａｉｎ ｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ １（ＳＥＴＤＢ１）ヒストンＨ３リシン９（Ｈ３Ｋ９）メチルトランスフェラーゼからなること、及びＰＷＳ遺伝子座において母性対立遺伝子をサイレンシングすることが発見された。ＺＮＦ２７４は、ＰＷＳ ｉＰＳＣ株から誘導されたニューロンにおいて、ＰＷＳインプリンティングセンター（ＰＷＳ−ＩＣ）のＤＮＡのメチル化に影響を及ぼさずにノックアウトされ、サイレントの母性対立遺伝子の発現を救済した。ＺＮＦ２７４複合体は、ニューロンにおいて母性ＰＷＳ遺伝子発現を抑制する独立したインプリンティングマークであり得、ＰＷＳ表現型を救済するための治療適用の標的となり得る。

【0150】

実施例８
ＺＮＦ２７４結合部位の欠失はＰＷＳ ｉＰＳＣから誘導されたニューロンにおいて母性ＳＮＲＰＮ及びＳＮＯＲＤ１１６の発現を回復させる
ＺＮＦ２７４の結合を遮断することによりＰＷＳＣＲ ＲＮＡ転写産物を活性化させるアプローチを開発するために、ＺＮＦ２７４に関するコンセンサスＤＮＡ結合部位を検索するための計算論的アプローチを開発した。ＥＮＣＯＤＥ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍにより実施された８つの異なる培養細胞株から２１のＺＮＦ２７４ ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータベースを分析し、ヒトゲノムで１５７２の再現性のある結合部位を同定した。これらの部位のそれぞれの配列を参照ヒトゲノムから抽出し、このセットをＭｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍ ｆｏｒ Ｍｏｔｉｆ Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ（ＭＥＭＥ）スーツで分析した。これらの推定結合領域が著しく多いＺＮＦ２７４の単一結合モチーフを同定した。このコンセンサス結合部位を用い、ＭＥＭＥスーツのＦｉｎｄ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｏｔｉｆ Ｏｃｃｕｒｅｎｃｅｓ（ＦＩＭＯ）ルーチンを用い、ゲノムワイド全体で全てのＺＮＦ２７４結合部位を推定した。ＺＮＦ２７４モチーフ（ＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣ）は、ＳＮＯＲＤ１１６のうち５つで同定された。ＰＷＳＣＲ内には３０のＳＮＯＲＤ１１６からなるクラスターが存在し、これはＤＮＡ配列類似性に基づいて３つのグループに分類された。グループ１はＳＮＯＲＤ１１６ １〜９からなり（図１１）、ＺＮＦ２７４モチーフはＳＮＯＲＤ１１６−３、−５、−７、−８、及び−９に同定された。ＺＮＦ２７４は、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑにより示されるように、これらの５つのＳＮＯＲＤ１１６領域に結合する(Crunivel et al., Hum Mol Genet. 23: 4674-85, 2014)。ＳＮＯＲＤ１１６−２、−４、及び−６はそれぞれこのモチーフの８番の位置にＧからＡへの置換を示し（図１１）、ＣｈＩＰ−ＳｅｑデータではＺＮＦ２７４により結合されることは確認されなかった。ＳＮＯＲＤ１１６−１は、ＺＮＦ２７４コンセンサス結合部位から異なる一ヌクレオチド変化を含み（図１１）、ＺＮＦ２７４により結合されるその能力は現在のところ決定されていない。グループ１ ＳＮＯＲＤ１１６間には、ＺＮＦ２７４モチーフ内の置換を除いて４８ｎｔの配列同一性が存在し（図１１）、従って、及び他のゲノムＺＮＦ２７４結合部位ではなくＳＮＯＲＤ１１６を特異的に標的とする分子を遮断する設計が可能である。

【0151】

ＰＷＳ遺伝子座におけるＺＮＦ２７４の結合を特異的に遮断又は枯渇させて母性転写産物を再活性化されるために、ＳＮＯＲＤ１１６上のＺＮＦ２７４結合部位を決定した。動物モデルに適当であるという観点では、アカゲザルの９つ全てのグループ１ ＳＮＯＲＤ１１６を含む、本発明者らが分析した全ての非ヒト霊長類種のＳＮＯＲＤ１１６ グループ１でＺＮＦ２７４モチーフが保存されている。開示される他の態様では、ＰＷＳＣＲ ＳＮＯＲＤ１１６に対するＺＮＦ２７４結合モチーフが、細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を標的として結合部位を切断しＺＮＦ２７４の結合を低減するためのガイドＲＮＡを用いてバリデートされた。

【0152】

ＣＲＩＳＰＲを用い、ＣＴＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＴＧＡＧ（配列番号４２）の異なる部分を標的とし、ＺＮＦ２７４結合コンセンサスとそのいずれかの末端にＳＮＯＲＤ１１６内のＺＮＦ２７４結合部位に対する特異性を付与する２０のヌクレオチドを含むｇＲＮＡを用い、種々の細胞から１５番染色体上の、ＺＮＦ２７４結合コンセンサスモチーフＴＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＣＡＴＡＣＣ（配列番号１）を含むＺＮＦ２７４結合部位を欠失させた。使用した細胞株は、上記のＬｃＮＬ１、ＭＣＨ２−１０、ＰＷＳ１−７、Ｂ１７−２１、及びＺＤＬ１７を含んだ。ＬｃＮＬ１及びＭＣＨ２−１０は、２つの異なる神経学的定型個体由来のｉＰＳＣである。ＰＷＳ１−７は、１５ｑ１１−ｑ１３の大領域欠失により引き起こされるＰＷＳを有する個体から誘導されたｉＰＳＣである。Ｂ１７−２１は、２種類の異なるＣＲＩＳＰＲ（ＣＣＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＣＧＡＣＧＧＣＣ（配列番号１３）及びＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＡＡＣＣＴＧＣＣＧＡ（配列番号１４））を連続的に使用してＺＮＦ２７４を突然変異誘発（フレームシフト）することによってＺＮＦ２７４をノックアウトしたＰＷＳ１−７の誘導体である。ＺＤＬ１７は、２種類のＣＲＩＳＰＲ（配列番号１３及び配列番号１４）を同時に用いてＺＮＦ２７４を欠失させたＰＷＳ１−７の誘導体である。別のｇＲＮＡ対（ＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣ（配列番号４７）及びＡＧＣＡＧＣＣＴＴＡＧＧＴＣＣＧＧＴＧＡ（配列番号４８））もＺＮＦ２７４を欠失させるために同時に用いた。

【0153】

３０−５ ｂｉｓ１は、６つのＺＮＦ２７４結合部位のうち５つを欠失させるためにレンチウイルスベクターにおいてＳｐＣａｓ９のＶＱＲ変異体（ＮＧＡＮ（配列番号４９）又はＮＧＮＧ（配列番号５０）ＰＡＭ配列）をｇＲＮＡ（ＧＡＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＧ、配列番号４３）とともに使用した、ＰＷＳ１−７の誘導体であった。この細胞株では、結合部位６も又部分的に突然変異させた。又、ｇＲＮＡ（ＣＴＣＡＧＴＴＣＣＧＡＴＧＡＧＡＡＣＧＡ、配列番号４４）をカノニカルｓｐＣａｓ９とともに使用した。ＳＮＯＧ１ｄｅｌ＃１０及びＳＮＯＧ１ｄｅｌ＃８４は、２種類のＣＲＩＳＰＲ（カノニカルＳｐＣａｓ９、ＮＧＧ ＰＡＭ配列）とＧＣＣＡＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣＧＴ（配列番号４５）及びＧＣＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＡＣＣＡＣ（配列番号４６）のｇＲＮＡを同時に用いて６つのＺＮＦ２７４結合部位の全クラスター（介在配列も）が欠失されたＰＷＳ１−７の誘導体であった。

【0154】

全ての細胞を、１０週前脳グルタミン酸作動性ニューロンに分化させた。これらのニューロンからＲＮＡを単離し、ＳＮＯＲＤ１１６ＨＧＧ２（ＳＮＯＲＤ１１６のグループ２、ＳＮＯＧ２）、ＳＮＲＰＮエキソン１及び２（ＳＮＲＰＮの第１及び第２カノニカルエキソン）、ＳＮＲＰＮエキソン３及び４（ＳＮＲＰＮの遺伝子本体）、及びＳＮＲＰＮエキソンＵ４／エキソン２（ＳＮＲＰＮの上流エキソンに起源する転写産物）を検出するために市販のＴａｑＭａｎプローブプライマーセットを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。使用したプローブプライマーは上記した。

【0155】

図１２に示されるように、ＺＮＦ２７４結合部位の欠失は、ＰＷＳ ｉＰＳＣから誘導されたニューロンにおいて母性ＳＮＲＰＮ及びＳＮＯＲＤ１１６の発現を回復させた。ＺＮＦ２７４ ＫＯを用いたＢ１７−２１及びＺＤＬ１７からの結果は上記されている。ＰＷＳ ｉＰＳＣにおいて母性ＳＮＯＲＤ１１６から６つのＺＮＦ２７４結合部位のうち５つが欠失された場合又はＰＷＳ ｉＰＳＣにおいて母性ＳＮＯＲＤ１１６から６つのＺＮＦ２７４結合部位の全クラスター（介在配列を含む）が欠失された場合、母性ＳＮＲＰＮ及びＳＮＯＲＤ１１６の残りの断片の発現の完全な活性化が得られた。この活性化は、ＰＷＳインプリンティングセンターとしても知られるカノニカルＳＮＲＰＮプロモーターの活性化ではなく、ＳＮＲＰＮの上流エキソンの活性化により生じた。上記のＺＮＦ２７４ ＫＯを用いて得られた同じ発現結果も、母性ＳＮＯＲＤ１１６内のＺＮＦ２７４結合部位を変異させることによって達成された。

【0156】

以上の特定の態様の説明は本発明の全般的性質を十分に明らかにするので、他者は当技術分野の技術の範囲内の知識を適用することにより、本開示の一般概念から逸脱することなく、過度な実験を行わずに、このような特定の態様を種々の適用のために容易に改変及び／又は適合させることができる。よって、このような適合及び改変は、本明細書に示される教示及び指針に基づき、開示される態様の等価物の意味及び範囲内にあることが意図される。本発明の表現法又は技術用語は限定ではなく説明を目的とするものであり、従って、本明細書の技術用語又は表現法は教示及び指針を鑑みて当業者により解釈されるべきであると理解される。

【0157】

本開示の幅及び範囲は、上記の例示的態様のいずれによっても限定されるべきではなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物によってのみ定義されるべきある。

【0158】

本明細書に引用されている全ての刊行物、特許、特許出願、及び／又はその他の文献は、各個の刊行物、特許、特許出願、及び／又はその他の文献があらゆる目的で本明細書の一部として援用されることが個々に示される場合と同程度に、それらの全内容があらゆる目的で本明細書の一部として援用される。

【0159】

網羅のために、本発明の種々の態様を下記の符番した項目に示す。
第１項 配列番号１３、配列番号１４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８又は配列番号４８に相当するポリヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子。
第２項 ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムであって、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、ＤＮＡターゲッティングシステム。
第３項 少なくとも１つのｇＲＮＡ内に、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、第２項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【0160】

第４項 ＺＮＦ２７４タンパク質をコードする遺伝子に結合するＤＮＡターゲッティングシステムであって、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、ＤＮＡターゲッティングシステム。
第５項 前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、第４項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。
第６項 Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、第２項〜第５項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【0161】

第７項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はこれらの変異体を含む、第６項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。
第８項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、第７項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。
第９項 前記Ｃａｓタンパク質が、ＮＧＧ（配列番号２）、ＮＧＡ（配列番号３）、ＮＧＡＮ（配列番号４９）又はＮＧＮＧ（配列番号５０）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣａｓ９を含む、第６項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム。

【0162】

第１０項 第１項に記載のｇＲＮＡ分子を含む、単離されたポリヌクレオチド配列。
第１１項 第２項〜第９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステムをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
第１２項 第１０項又は第１１項に記載の単離されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。

【0163】

第１３項 第１項に記載のｇＲＮＡ分子及びＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質をコードするベクター。
第１４項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はその変異体を含む、第１３項に記載のベクター。
第１５項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、第１４項に記載のベクター。

【0164】

第１６項 第１項に記載のｇＲＮＡ、第２項〜第９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、第１０項若しくは第１１項に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は第１２項〜第１５項のいずれか一項に記載のベクター、又はこれらの組合せを含む細胞。
第１７項 前記細胞がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）患者由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、第１６項に記載の細胞。
第１８項 前記ｉＰＳＣがＰＷＳ１−７大領域欠失細胞株又はＵＰＤ１−２細胞株である、第１７項に記載の細胞。

【0165】

第１９項 第１項に記載のｇＲＮＡ、第２項〜第９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、第１０項若しくは第１１項に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は第１２項〜第１５項のいずれか一項に記載のベクター、又は第１６項〜第１８項のいずれか一項に記載の細胞、又はこれらの組合せを含むキット。
第２０項 第１項に記載のｇＲＮＡ、第２項〜第９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲッティングシステム、第１０項若しくは第１１項に記載の単離されたポリヌクレオチド配列、又は第１２項〜第１５項のいずれか一項に記載のベクター、又は第１６項〜第１８項のいずれか一項に記載の細胞、又はこれらの組合せを含む医薬組成物。
第２１項 対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法であって、
前記対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるジンクフィンガータンパク質２７４（ＺＮＦ２７４）結合部位を、ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて低減されるように改変すること
を含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、方法。

【0166】

第２２項 ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が対照に比べて少なくとも９０％低減される、第２１項に記載の方法。
第２３項 ＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合が排除される、第２１項に記載の方法。
第２４項 前記対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置が、ＺＮＦ２７４結合部位の改変前にサイレントである、第２１項〜第２３項のいずれか一項に記載の方法。

【0167】

第２５項 前記障害がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を含む、第２１項〜第２４項のいずれか一項に記載の方法。
第２６項 前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位の完全欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の部分的欠失、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチドの突然変異、ＺＮＦ２７４結合部位の１以上のヌクレオチド位置での切断、又はこれらの組合せにより改変される、第２１項〜第２５項のいずれか一項に記載の方法。
第２７項 前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムを前記対象又は前記対象の細胞に投与することにより改変され、前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、第２１項〜第２６項のいずれか一項に記載の方法。

【0168】

第２８項 前記ＺＮＦ２７４結合部位が、ＺＮＦ２７４結合部位に結合するＤＮＡターゲッティングシステムをコードする単離されたポリヌクレオチドを投与することにより改変され、前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、又はこれらの変異体に相当するポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、第２１項〜第２６項のいずれか一項に記載の方法。
第２９項 前記ＤＮＡターゲッティングシステムは、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、第２７項又は第２８項に記載の方法。
第３０項 前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、第２７項〜第２９項のいずれか一項に記載の方法。

【0169】

第３１項 前記ＤＮＡターゲッティングシステムがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、第２７項〜第３０項のいずれか一項に記載の方法。
第３２項 対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための方法であって、
前記対象に、ＺＮＦ２７４タンパク質と、対象の母性１５番染色体の１５ｑ１１−ｑ１３の位置にあるＺＮＦ２７４結合部位との相互作用を対照に比べて低減する薬剤の薬学上有効な量を投与することを含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、方法。
第３３項 前記薬剤が配列特異的ヌクレアーゼ、又は配列特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、第３２項に記載の方法。

【0170】

第３４項 記配列特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムを含む、第３３項に記載の方法。
第３５項 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムがＺＮＦ２７４結合部位に結合し、且つ、配列番号１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列に結合し、それを標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡを含む、第３４項に記載の方法。
第３６項 前記少なくとも１つのｇＲＮＡが、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、又はこれらの変異体のうち少なくとも１つに相当するポリヌクレオチド配列を含む、第３４項又は第３５項に記載の方法。

【0171】

第３７項 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＤＮＡターゲッティングシステムがＣｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ関連（Ｃａｓ）タンパク質を更に含む、第３４項〜第３６項のいずれか一項に記載の方法。
第３８項 前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含む、第３７項に記載の方法。
第３９項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子、又はその変異体を含む、第３７項又は第３８項に記載の方法。

【0172】

第４０項 前記Ｃａｓタンパク質が化膿連鎖球菌Ｃａｓ９分子のＶＱＲ変異体を含む、第３９項に記載の方法。
第４１項 １５ｑ１１−ｑ１３内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。
第４２項 １５ｑ１１−ｑ１３のプラダー・ウィリー症候群責任領域（ＰＷＳＣＲ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。

【0173】

第４３項 ゲノム座標ｈｇ１９ ｃｈｒ１５：２５，０１２，９６１−２５，６８５，２５３又はｃｈｒ１５：２３，６９５，６０３−２５，０２６，５５８から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。
第４４項 ＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＨＧ１４、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。
第４５項 ＳＮＲＰＮエキソン２、ＳＮＲＰＮエキソン３、ＳＮＲＰＮエキソン４、ＵＢＥ３Ａ、ＭＡＧＥＬ２、ＭＫＲＮ３、ＳＮＲＰＮエキソンＵ４、ＮＤＮ、又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの発現が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。

【0174】

第４６項 ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ａプロモーター、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂプロモーター、又はこれらの組合せからの転写の開始が増強される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。
第４７項 Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の結合が低減される、第２１項〜第４０項のいずれか一項に記載の方法。
第４８項 対象においてゲノムインプリンティングの障害を治療するための製剤であって、母性ヌクレオチド配列上のＺＮＦ２７４結合部位へのＺＮＦ２７４タンパク質の結合を対照に比べて低減する薬剤を含み、前記ＺＮＦ２７４結合部位は、配列番号１又は配列番号４２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、製剤。

【0175】

第４９項 前記障害がプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）である、第４８項に記載の製剤。
第５０項 前記薬剤が１５ｑ１１−ｑ１３内の少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化させる、第４８項に記載の製剤。
第５１項 前記薬剤が１５ｑ１１−ｑ１３のプラダー・ウィリー症候群責任領域（ＰＷＳＣＲ）内の少なくとも１つの遺伝子の発現を活性化させる、第４８項に記載の製剤。

【0176】

第５２項 前記薬剤がゲノム座標ｈｇ１９ ｃｈｒ１５：２５，０１２，９６１−２５，６８５，２５３又はｃｈｒ１５：２３，６９５，６０３−２５，０２６，５５８から選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現を活性化させる、第４５項に記載の製剤。
第５３項 前記薬剤がＳＮＯＲＤ１１６、ＩＰＷ、ＳＮＯＲＤ１１５、ＳＮＨＧ１４、ＵＢＥ３Ａ−ＡＴＳ、又はこれらの組合せから選択される少なくとも１つのＲＮＡ転写産物の発現を活性化させる、第４８項に記載の製剤。
第５４項 前記薬剤がＳＮＲＰＮエキソン２、ＳＮＲＰＮエキソン３、ＳＮＲＰＮエキソン４、ＵＢＥ３Ａ、ＭＡＧＥＬ２、ＭＫＲＮ３、ＳＮＲＰＮエキソンＵ４、ＮＤＮ、又はこれらの組合せのうち少なくとも１つの発現を活性化させる、第４８項に記載の製剤。

【0177】

第５５項 前記薬剤がＳＮＲＰＮ Ｕ１Ａプロモーター、ＳＮＲＰＮ Ｕ１Ｂプロモーター、又はこれらの組合せからの転写の開始を活性化させる、第４８項に記載の製剤。
第５６項 前記薬剤がＨ３Ｋ９ｍｅ３の結合を低減する、第４８項に記載の製剤。
第５７項 前記対照が改変されていないＺＮＦ２７４結合部位を含む、第２１項〜第４７項のいずれか一項に記載の方法又は第４８項〜第５６項のいずれか一項に記載の製剤。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】