特表 2021-506243 Ｔ細胞受容体及びβ２ミクログロブリン発現を排除するように遺伝子改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-506243(P2021-506243A)

(43)【公表日】2021年2月22日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞受容体及びβ２ミクログロブリン発現を排除するように遺伝子改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20210125BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210125BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20210125BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210125BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210125BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210125BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20210125BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20210125BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210125BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210125BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20210125BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20210125BHJP

   C07K 14/725 20060101ALN20210125BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 Z

   C12N5/10ZNA

   C12N5/0783

   C12N15/13

   C12N15/12

   C12N15/09 100

   C12N15/09 110

   C12N15/86 Z

   A61K35/17 Z

   A61P35/00

   A61P25/00

   C07K19/00

   C07K16/00

   C07K14/725

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】49

(21)【出願番号】特願2020-531949(P2020-531949)

(86)(22)【出願日】2018年12月11日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月11日

(86)【国際出願番号】US2018064971

(87)【国際公開番号】WO2019118475

(87)【国際公開日】20190620

(31)【優先権主張番号】62/598,032

(32)【優先日】2017年12月13日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】リー，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ムーニー，ジル

(72)【発明者】

【氏名】ナソ，マイケル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA42

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、改変された不死化Ｔ細胞株と、薬剤としてのそれらの調整及び使用の方法、特に免疫療法のための方法に関する。本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、例えば、不死化Ｔ細胞を非アロ反応性にするために、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ遺伝子を選択的に非活性化することができるエンドヌクレアーゼを使用することによって、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が阻害されることを特徴とする。加えて、免疫抑制ポリペプチドの発現は、宿主生物におけるこれらのＴ細胞の生存を延長するために、改変された不死化Ｔ細胞上で実施され得る。かかる改変された不死化Ｔ細胞は、特に宿主の免疫系による拒絶リスク及び移植片対宿主病の発症リスクの両方を低減するため、同種移植に特に好適である。本発明は、がん、感染症、及び自己免疫疾患を治療するための不死化Ｔ細胞を使用して、標準的かつ手頃な養子免疫療法戦略への道を開く。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変された不死化Ｔ細胞株であって、
（ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記不死化Ｔ細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない、
前記不死化Ｔ細胞株。

【請求項2】

前記抗原結合領域が腫瘍関連抗原に結合する、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項3】

前記腫瘍関連抗原がＢＣＭＡである、請求項２に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項4】

前記抗原結合領域がフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに結合する、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項5】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がノックアウトされる、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項6】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＴＣＲαである、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項7】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体が、ＫＩＲ３ＤＬ２である、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項8】

Ｂ２Ｍがノックアウトされる、請求項１に記載の不死化Ｔ細胞株。

【請求項9】

ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記ＴＡＬＬ−１０４細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない、
前記ＴＡＬＬ−１０４細胞株。

【請求項10】

前記抗原結合領域が腫瘍関連抗原に結合する、請求項９に記載の細胞株。

【請求項11】

前記腫瘍関連抗原がＢＣＭＡである、請求項１０に記載の細胞株。

【請求項12】

前記抗原結合領域がフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに結合する、請求項９に記載の細胞株。

【請求項13】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がノックアウトされる、請求項９に記載の細胞株。

【請求項14】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＴＣＲαである、請求項９に記載の細胞株。

【請求項15】

前記少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＫＩＲ３ＤＬ２である、請求項９に記載の細胞株。

【請求項16】

Ｂ２Ｍがノックアウトされる、請求項９に記載の細胞株。

【請求項17】

ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
（ｂ）配列番号８〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、
前記細胞株。

【請求項18】

ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号５４及び５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記ＴＡＬＬ−１０４細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、
前記ＴＡＬＬ−１０４細胞株。

【請求項19】

ＣＡＲを発現する改変された不死化Ｔ細胞株を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．不死化Ｔ細胞株を提供する工程と、
ｂ．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体及びＢ２Ｍの発現を阻害する工程と、
ｃ．前記不死化Ｔ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入する工程とを含む、
前記方法。

【請求項20】

工程ｂが工程ｃの前に行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

工程ｃが工程ｂの前に行われる、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

工程ｂがエンドヌクレアーゼを使用することによって実施される、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＣａｓ９である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

工程ｃが、エレクトロポレーション又はウイルス系遺伝子移入システムによって前記不死化Ｔ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入することとして更に定義される、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記ウイルス系遺伝子移入システムが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターを含む、請求項４に記載の方法。

【請求項26】

請求項１〜１８のいずれか一項に記載の改変された免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項27】

治療有効量の請求項２６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんの治療を必要とする前記対象における、がんを治療する方法。

【請求項28】

前記がんが多発性硬化症である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

請求項１〜１８のいずれか一項に記載の改変された不死化Ｔ細胞株を薬学的に許容される担体と組み合わせて前記医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物を製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１８年１１月２０日に作成された、ファイル名はＪＢＩ５１４６ＷＯＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは６７，２５８バイトである。

【0002】

本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変された不死化Ｔ細胞株と、薬剤としてのそれらの調整及びそれらの使用、特に免疫療法のための方法に関する。本発明の改変された不死化ＣＡＲ Ｔ細胞は、例えば、不死化ＣＡＲ Ｔ細胞を非アロ反応性にするために、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ遺伝子を選択的に非活性化することができるエンドヌクレアーゼを使用することによって、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が阻害されることを特徴とする。改変された不死化ＣＡＲ Ｔ細胞株は、特に宿主の免疫系による拒絶リスク及び移植片対宿主病の発症リスクの両方を低減するため、同種移植に特に好適である。本発明は、がん、感染症、及び自己免疫疾患を治療するためのＴ細胞を使用した標準的かつ手頃な養子免疫療法戦略への道を開く。

【背景技術】

【0003】

ｅｘ ｖｉｖｏで生成された自己抗原特異的Ｔ細胞の移入を伴う養子免疫療法は、ウイルス感染及びがんを治療する有望な戦略である。養子免疫療法に使用されるＴ細胞は、遺伝子工学を介した抗原特異的なＴ細胞の拡大又はＴ細胞のリダイレクトのいずれかによって生成され得る（Ｐａｒｋ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。

【0004】

Ｔ細胞における新規な特異性は、遺伝子組み換えのＴ細胞受容体又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子移入を介して成功裏に生成されてきた（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ＣＡＲは、単一融合分子内の１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連付けられた標的化部分からなる合成受容体である。一般に、ＣＡＲの結合部分は、例えば、可撓性リンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖及び可変フラグメントを含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインからなる。第１世代ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ又はＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第１世代ＣＡＲは、Ｔ細胞毒性を正常にリダイレクトすることが証明されている。しかしながら、第１世代ＣＡＲでは、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期的な拡大及び抗腫瘍活性をもたらすことに失敗した。ＣＤ２８、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含む共刺激分子からのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ改変Ｔ細胞の生存率を高め、増殖を増加させるために単独で（第２世代）又は組み合わせて（第３世代）添加されてきた。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形がんを含む様々な悪性腫瘍から腫瘍細胞の表面で発現した抗原に対して、Ｔ細胞をリダイレクトさせることに成功してきた（Ｊｅｎａ，Ｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１０）。

【0005】

養子免疫療法を用いた患者の治療の現在のプロトコルは、自己細胞移入に基づいている。このアプローチでは、Ｔリンパ球を患者から回収し、遺伝子改変するか又はｅｘ ｖｉｖｏで選択し、必要に応じて細胞数を増幅させるためにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、最後に患者に注入する。リンパ球注入に加えて、宿主は、Ｔ細胞の生着又は免疫反応へのそれらの関与、例えば、プレコンディショニング（放射線又は化学療法による）及びリンパ球成長因子（ＩＬ−２など）の投与を支持する他の方法で操作され得る。それぞれの患者は、患者自身のリンパ球（すなわち、自己療法）を使用して、個別に組まれた治療を受ける。自己療法は、実用的用途に対する技術的にも物流的にも大きな障害に直面し、それらの世代は高価な専用施設及び専門家を必要とし、患者の診断後に短時間で生成されなければならず、多くの場合、患者の前処理は免疫機能の低下をもたらし、その結果、患者のリンパ球は機能が不十分となり、数が非常に少なくなり得る。これらの障害のため、それぞれの患者の自己細胞調製は、事実上新たな産物であり、有効性及び安全性に実質的な変化をもたらす。理想的には、治療用同種細胞が予め製造され、詳細に特徴付けられ、患者への即時投与に利用可能であり得る標準化治療法の使用が好ましい。同種とは、同じ種に属するが遺伝的に異なる個体から細胞が得られることを意味する。しかしながら、同種細胞の使用は、現在、多くの欠点を有する。免疫能力のある宿主では、同種細胞は、素早く拒絶され、プロセスは宿主対移植片拒絶（ＨｖＧ）と称され、これは、移入された細胞の有効性を実質的に制限する。免疫能力のない宿主では、同種細胞は生着することできるが、それらの内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）特異性は、宿主組織を異物として認識する場合があり、その結果、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）が生じ、深刻な組織損傷及び死につながり得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、当該技術分野において、患者固有のＴ細胞産物に関する時間、製造費、及び拒絶リスクを回避する方法及び試薬を開発する必要性が残っている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、免疫療法の目的に好適な、改変された不死化Ｔ細胞株を提供する。本発明は、とりわけ免疫認識及び組織適合性に重要な特定のエフェクター分子の発現のないＴ細胞株を提供する。

【0008】

一般的な一態様では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、ＣＡＲを発現する改変された不死化Ｔ細胞株に関し、細胞外ドメインは抗原結合領域を含む。本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない。

【0009】

一実施形態では、少なくとも１つの内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現は、遺伝子ノックアウトによって排除される。特定の実施形態では、本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、ＴＣＲαを発現しない。別の実施形態では、本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、ＫＩＲ３ＤＬ２を発現しない。

【0010】

別の実施形態では、本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、Ｂ２Ｍを発現しない。

【0011】

別の実施形態では、本発明の改変された不死化Ｔ細胞株は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含む。特定の実施形態では、改変された不死化Ｔ細胞株は、ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み得る。

【0012】

別の実施形態では、改変された不死化Ｔ細胞株は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み得る。

【0013】

別の一般的な態様では、本発明は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株に関し、細胞外ドメインは抗原結合領域を含む。本発明の改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない。

【0014】

一実施形態では、少なくとも１つの内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現は、遺伝子ノックアウトによって排除される。特定の実施形態では、本発明の改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株は、ＴＣＲαを発現しない。別の実施形態では、本発明の改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株は、ＫＩＲ３ＤＬ２を発現しない。

【0015】

別の実施形態では、本発明の改変されたＴＡＬＬ−１０４株は、Ｂ２Ｍを発現しない。

【0016】

別の実施形態では、本発明の改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含む。特定の実施形態では、改変されたＴＡＬＬ−１０４株は、ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み得る。

【0017】

別の実施形態では、改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに特異的に結合する細胞外ドメインを含むＣＡＲを含み得る。

【0018】

別の一般的な態様では、本発明は、ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
（ｂ）配列番号８〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、
該細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、細胞株に関する。

【0019】

別の一般的な態様では、本発明は、ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号５４及び５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、
該細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、細胞株に関する。

【0020】

別の一般的な態様では、本発明はまた、ＣＡＲを発現する改変された不死化Ｔ細胞株を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．不死化Ｔ細胞株を提供する工程と、
ｂ．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体及びＢ２Ｍの発現を阻害する工程と、
ｃ．不死化Ｔ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、を含む、方法に関する。

【0021】

一実施形態では、工程ｂは工程ｃの前に行われる。

【0022】

別の実施形態では、工程ｃは工程ｂの前に行われる。

【0023】

別の実施形態では、工程ｂはエンドヌクレアーゼを使用することによって実施される。特定の実施形態では、ＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼは、ＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（zing-finger）ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＣａｓ９である。

【0024】

別の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによって不死化Ｔ細胞に導入される。

【0025】

別の実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、ウイルス系遺伝子移入システムを介して不死化Ｔ細胞に導入される。特定の実施形態では、ウイルス系遺伝子移入システムは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターを含む。

【0026】

別の一般的な態様では、本発明は、本発明の改変された不死化Ｔ細胞を含む医薬組成物に関する。

【0027】

別の一般的な態様では、本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんの治療を要する対象における、がんを治療する方法に関する。好ましい実施形態では、がんは多発性骨髄腫である。

【0028】

別の一般的態様では、本発明は、本発明の改変された不死化Ｔ細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物の産生方法に関する。

【0029】

本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1A】ＴＡＬＬ−１０４細胞におけるＨＬＡクラスＩ（Ａ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集のフローサイトメトリー分析。製造業者の指示に従って、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を用いてエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞をＦＡＣＳ染色バッファーに再懸濁させ、抗体を添加した。細胞を暗所にて４℃で４５分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上のデータを収集した。

【図1A(1)】ＴＡＬＬ−１０４細胞におけるＨＬＡクラスＩ（Ａ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集のフローサイトメトリー分析。製造業者の指示に従って、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を用いてエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞をＦＡＣＳ染色バッファーに再懸濁させ、抗体を添加した。細胞を暗所にて４℃で４５分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上のデータを収集した。

【図1B】ＴＡＬＬ−１０４細胞におけるＴＣＲ（Ｂ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集のフローサイトメトリー分析。製造業者の指示に従って、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を用いてエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞をＦＡＣＳ染色バッファーに再懸濁させ、抗体を添加した。細胞を暗所にて４℃で４５分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上のデータを収集した。

【図1B(1)】ＴＡＬＬ−１０４細胞におけるＴＣＲ（Ｂ）のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集のフローサイトメトリー分析。製造業者の指示に従って、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）及びＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を用いてエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞をＦＡＣＳ染色バッファーに再懸濁させ、抗体を添加した。細胞を暗所にて４℃で４５分間インキュベートし、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上のデータを収集した。

【図2A】Ｂ２Ｍ／ＨＬＡ−１（Ａ）の精製。Ｂ２Ｍ又はＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のいずれかで前もってエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞を、ＰＥ抗Ｂ２Ｍ（Ａ）で標識した。抗体標識した細胞を抗ＰＥマイクロビーズと共にインキュベートし、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレータに取り付けたＬＳカラムに通過させた。溶出液中に収集したＢ２Ｍ及びＣＤ３−ＫＯ細胞亜集団を遠心分離させ、３７℃でＣｏｍｐｅｔｅ ＴＡＬＬ−１０４細胞培地及び培養物に再懸濁させた。

【図2B】ＴＣＲ（Ｂ）ノックアウトＴＡＬＬ−１０４細胞集団の精製。Ｂ２Ｍ又はＴＣＲαリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のいずれかで前もってエレクトロポレーションされたＴＡＬＬ−１０４細胞を、ＰＥ抗ＣＤ３抗体で標識した。抗体標識した細胞を抗ＰＥマイクロビーズと共にインキュベートし、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレータに取り付けたＬＳカラムに通過させた。溶出液中に収集したＢ２Ｍ及びＣＤ３−ＫＯ細胞亜集団を遠心分離させ、３７℃でＣｏｍｐｅｔｅ ＴＡＬＬ−１０４細胞培地及び培養物に再懸濁させた。

【図3A】フローサイトメトリーによるＴＡＬＬ−１０４細胞上のＢＣＭＡ又はＦＮ３ドメインを標的にするＣＡＲの発現及び検出。ＴＡＬＬ−１０４ ＢＣＭＡ−ＣＡＲ細胞（Ａ）を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して、Ｍｏｃｋ（ｍＲＮＡなし）エレクトロポレーションした対照細胞（グレイ）への結合と比較して、それぞれ細胞に対するポリクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体及び共役ＦＮ３ドメインの結合について測定した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０を使用してデータを分析して、Ａｌｅｘａ６４７又はＡＰＣ強度による散乱及び正の結合によって細胞集団にゲートを設定した。

【図3B】フローサイトメトリーによるＴＡＬＬ−１０４細胞上のＢＣＭＡ又はＦＮ３ドメインを標的にするＣＡＲの発現及び検出。ＴＡＬＬ−１０４抗ＦＮ３ドメインＣＡＲ細胞（Ｂ）を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用して、Ｍｏｃｋ（ｍＲＮＡなし）エレクトロポレーションした対照細胞（グレイ）への結合と比較して、それぞれ細胞に対するポリクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体及び共役ＦＮ３ドメインの結合について測定した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０を使用してデータを分析して、Ａｌｅｘａ６４７又はＡＰＣ強度による散乱及び正の結合によって細胞集団にゲートを設定した。

【図4A】ＢＣＭＡ標的細胞のＴＡＬＬ−１０４ ＣＡＲ発現細胞殺傷。ＴＡＬＬ−１０４抗ＦＮ３ドメインＣＡＲ細胞を、ＢＣＭＡ特異的又は非標的対照（ＮＴ）ＦＮ３ドメインと共インキュベートしてから２０時間（Ａ）後のＢＣＭＡ標的細胞の殺傷について評価した。

【図4B】ＢＣＭＡ標的細胞のＴＡＬＬ−１０４ ＣＡＲ発現細胞殺傷。ＴＡＬＬ−１０４抗ＦＮ３ドメインＣＡＲ細胞を、ＢＣＭＡ特異的又は非標的対照（ＮＴ）ＦＮ３ドメインと共インキュベートしてから４０時間（Ｂ）後のＢＣＭＡ標的細胞の殺傷について評価した。

【図4C】ＢＣＭＡ標的細胞のＴＡＬＬ−１０４ ＣＡＲ発現細胞殺傷。ＴＡＬＬ−１０４ ＢＣＭＡ−ＣＡＲ細胞（Ｃ）を、細胞を共インキュベートしてから２０時間後のＢＣＭＡ標的細胞の殺傷について評価した。

【図5】ＴＡＬＬ−１０４細胞を、ヒトのＴＥＲＴ遺伝子及びＥＧＦＰをコードするレンチウイルスを用いて形質転換した。細胞をＥＧＦＰ発現のために選別し、次いで、ＴＡＬＬ−１０４培養条件で拡大させた。野生型非形質転換細胞が培養中の増殖を停止した後の成長特性が表示される。

【図6】レンチウイルスｐ１０２を用いてｈＴＥＲＴ陽性ＴＡＬＬ−１０４細胞を形質転換し、外因性ＩＬ−２の非存在下で維持した。

【図7】細胞内ＩＬ−２（ｐ１０２）を安定的に発現するＴＡＬＬ−１０４細胞又は野生型ＴＡＬＬ−１０４細胞を、Ｆ１１ ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ配列をコードするｍＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、様々なＥ：Ｔ比でＭＭ１ｓ細胞と共にインキュベートした。死標的ＭＭ１ｓ細胞の割合がＥ：Ｔ比に対してプロットされている。

【発明を実施するための形態】

【0031】

定義
発明の背景において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0032】

別の定義がなされない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によって恰もその全体が本明細書に記載されているものと同様にして組み込まれる。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意すべきである。

【0033】

特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

【0034】

細胞培養には、３つの一般的な種類、（１）初代−ヒト又は動物組織及び器官に由来（多能性幹細胞及び組織特異的前駆細胞がこのカテゴリに含まれる）、（２）不死化（又は連続性）−培養中で無期限に分裂及び増殖するように改変された初代細胞に由来（これらの細胞は、付着性線維芽細胞の場合の成長の接触阻害など、正常な初代細胞の多くの特徴を保持する）、及び（３）形質転換−がん性組織に由来又はがん誘発ウイルスによってｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍形成的に形質転換（これらの細胞は、正常な初代細胞に似ておらず、腫瘍細胞のように挙動する）が存在する。形質転換細胞は、接触阻害の喪失、増殖因子非依存性、又は可溶性増殖因子及び血清に対する必要性の低減、並びに足場（ＥＣＭ）非依存性増殖を示す（Ｆｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ，２００４）。ほとんどの生物医学的及び製薬学的研究開発用途（例えば、薬理学的薬物候補のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性及び毒性試験）については、正常な生理学的条件を厳密に再現する細胞の背景を使用することが一般的に望ましい。初代培養物は、正常な組織微小環境に最もよく似ているが、これらの細胞をヒト又は動物組織及び複雑な規制要件（例えば、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｕｓａｇｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ；Ｈｕｍａｎ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄｓ）から得ることは著しく困難であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの初代細胞の維持及び増殖（増殖因子依存性及び間質依存性）に関連付けられた一般的な困難により、ほとんどの用途にこれらの細胞を使用することが難しくなっている。初代細胞は、危機に陥り、老化するまでに有限の倍加能（通常は４０〜６０回の複製サイクル）を有する（ＲＡ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，２００７）。初代培養物の使用はまた、これらの細胞が複数の実験を行うために連続的に再単離されなければならないため、有意な再現性誤差をもたらし得る。

【0035】

したがって、初代細胞由来の細胞株の細胞特性に関して、本明細書で使用するところの「不死化」又は「連続性」なる用語は、培養中で無期限に分裂及び増殖するよう、改変されたＴリンパ球（又はＴ細胞）を指す。これらの細胞は、例えば、付着性細胞及びＩＬ−２依存の場合の増殖の接触阻害など、正常な初代細胞の多くの特性を保持する。

【0036】

本明細書で使用するところの「Ｔ細胞」なる用語は、胸腺内で成熟するリンパ球の種類を指す。Ｔ細胞は、細胞性免疫において重要な役割を果たし、Ｔ細胞受容体が細胞表面上に存在することによって、Ｂ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、単離されるか、又は市販の供給源から得られるかのいずれかであり得る。「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びγ−δＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する全ての種類の免疫細胞を含む。「細胞毒性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球を含み、細胞は、細胞毒性反応を媒介することができる。市販のＴ細胞株の非限定的な例としては、ＢＣＬ２（ＡＡＡ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０２（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ７０Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９００（商標））、ＢＣＬ２（Ｓ８７Ａ）Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２９０１（商標））、ＢＣＬ２ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９９（商標））、Ｎｅｏ Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２８９８（商標））、ＴＡＬＬ−１０４細胞毒性ヒトＴ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１１３８６）といった株が挙げられる。更なる例としては、限定するものではないが、例えば、Ｄｅｇｌｉｓ、ＥＢＴ−８、ＨＰＢ−ＭＬｐ−Ｗ、ＨＵＴ ７８、ＨＵＴ １０２、Ｋａｒｐａｓ ３８４、Ｋｉ ２２５、Ｍｙ−Ｌａ、Ｓｅ−Ａｘ、ＳＫＷ−３、ＳＭＺ−１、及びＴ３４などの成熟Ｔ細胞株と、例えば、ＡＬＬ−ＳＩＬ、Ｂｅ１３、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＣＭＬ−Ｔ１、ＤＮＤ−４１、ＤＵ．５２８、ＥＵ−９、ＨＤ−Ｍａｒ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｈ−ＳＢ２、ＨＴ−１、ＪＫ−Ｔ１、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋａｒｐａｓ ４５、ＫＥ−３７、ＫＯＰＴ−Ｋ１、Ｋ−Ｔ１、Ｌ−ＫＡＷ、Ｌｏｕｃｙ、ＭＡＴ、ＭＯＬＴ−１、ＭＯＬＴ ３、ＭＯＬＴ−４、ＭＯＬＴ １３、ＭＯＬＴ−１６、ＭＴ−１、ＭＴ−ＡＬＬ、Ｐ１２／Ｉｃｈｉｋａｗａ、Ｐｅｅｒ、ＰＥＲ０１１７、ＰＥＲ−２５５、ＰＦ−３８２、ＰＦＩ−２８５、ＲＰＭＩ−８４０２、ＳＴ−４、ＳＵＰ−Ｔ１〜Ｔ１４、ＴＡＬＬ−１、ＴＡＬＬ−１０１、ＴＡＬＬ−１０３／２、ＴＡＬＬ−１０４、ＴＡＬＬ−１０５、ＴＡＬＬ−１０６、ＴＡＬＬ−１０７、ＴＡＬＬ−１９７、ＴＫ−６、ＴＬＢＲ−１、−２、−３、及び−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２（ＣＣＬ−１２０．１）、Ｊ．ＲＴ３−Ｔ３．５（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５３）、Ｊ４５．０１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１９９０）、Ｊ．ＣａＭ１．６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０６３）、ＲＳ４；１１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８７３）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＣＣＬ−１１９）などの未成熟Ｔ細胞株と、例えば、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ ＣＲＭ−ＴＩＢ−１６１）、ＭＪ［Ｇ１１］（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８２９４）、ＨｕＴ１０２（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１６２）などの皮膚Ｔ細胞リンパ腫株と、が挙げられる。限定するものではないが、ＲＥＨ、ＮＡＬＬ−１、ＫＭ−３、Ｌ９２−２２１を含む、ヌル白血病細胞株は、Ｋ５６２赤白血病、ＴＨＰ−１単球性白血病、Ｕ９３７リンパ腫、ＨＥＬ赤白血病、ＨＬ６０白血病、ＨＭＣ−１白血病、ＫＧ−１白血病、Ｕ２６６骨髄腫などの他の白血病及びリンパ腫由来の細胞株であり、免疫細胞の別の市販の供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示の供給源としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、すなわちＡＴＣＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／）及びＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／）が挙げられる。

【0037】

本明細書で使用するところの「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」なる用語は、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体とも称され、特定の免疫エフェクター細胞上に人工特異性を移植する改変された受容体を包含し得る。ＣＡＲは、Ｔ細胞上にモノクローナル抗体の特異性を付与するために用いられてもよく、それによって、例えば養子細胞療法に使用する際に、多数の特異的Ｔ細胞が生成されることを可能にする。特定の実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に方向付ける。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通及びエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合を含む。他の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合したフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの融合を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体（例えば、ペプチド）のリガンドに又はＤｅｃｔｉｎｓに由来し得る。特定の実施形態では、Ｂ系列分子に特異的なキメラ免疫受容体（ＢＣＭＡ）を使用してＴ細胞の特異性をリダイレクトすることによって、悪性Ｂ細胞を標的にし得る。特定の場合では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ １０、及び／又はＯＸ４０などの追加の共刺激性シグナル伝達のためのドメインを含む。いくつかの場合では、分子はＣＡＲと同時発現し得る。これらには、共刺激分子、撮像用のレポーター遺伝子（例えば、陽電子放出断層撮影用）、プロドラッグの添加時にＴ細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体が挙げられる。

【0038】

本明細書で使用するところの「細胞外ドメイン」なる用語は、細胞膜の外側に位置し、抗原、標的、又はリガンドに結合することができるＣＡＲの部分を指す。

【0039】

本明細書で使用するところの「膜貫通ドメイン」なる用語は、細胞膜を横切って延在し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの部分を指す。

【0040】

本明細書で使用するところの「細胞内シグナル伝達ドメイン」なる用語は、細胞膜の内側に位置し、エフェクター信号を伝達することができるＣＡＲの部分を指す。

【0041】

本明細書で使用するところの「発現する」なる用語は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現したＴ細胞受容体及びβ２ミクログロブリン（microbulin）は、Ｔ細胞膜に固定され得る。

【0042】

本明細書で使用するところの「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」なる用語は、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指すが、いくつかの細胞では、ＴＣＲは、ガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖からなる。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、メモリＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びγδＴ細胞を含むＴＣＲを含む、任意の細胞上で改変されてもよい。

【0043】

「Ｂ２Ｍ」としても知られる「β２ミクログロブリン」は、ＭＨＣクラスＩ分子の軽鎖であり、それ自体、主要組織適合遺伝子複合体の不可欠な部分である。ヒトにおいて、Ｂ２Ｍは、染色体６上の遺伝子クラスターとして位置する他のＭＨＣ遺伝子とは反対の、染色体１５上に位置するｂ２ｍ遺伝子によってコードされる。ヒトタンパク質は、１１９個のアミノ酸からなり、１１．８キロダルトンの分子量を有する。β２ミクログロブリンが欠乏しているマウスモデルは、Ｂ２ＭがＭＨＣクラスＩの細胞表面発現及びペプチド結合溝の安定性に必要であることを示している。正常な細胞表面ＭＨＣＩ発現が欠乏しているマウスからの造血細胞移植は、β２ミクログロブリン遺伝子における標的突然変異により、正常なマウスにおけるＮＫ１．１＋細胞によって拒絶され、ＭＨＣ Ｉ分子の不十分な発現により、骨髄細胞が宿主免疫系による拒絶を受けやすくなることを示唆することを更に示した（Ｂｉｘ ｅｔ ａｌ．１９９１）。

【0044】

本明細書で使用するところの「ＢＣＭＡ」なる用語は、形質細胞上及び成熟Ｂ細胞上で発現される腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーメンバーであるＢ細胞成熟抗原タンパク質（ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＣＭ又はＣＤ２６９とも呼ばれる）のことを指す。例えば、ヒトＢＣＭＡは、ヌクレオチド９９４個の長さの一次ｍＲＮＡ転写産物によりコードされるアミノ酸１８４個の長さのタンパク質である（ＮＭ＿００１１９２．２）。ヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１８３．２に示される。本明細書で使用するところの「ＢＣＭＡ」なる用語は、例えば、完全長の野生型ＢＣＭＡの点突然変異、フラグメント、挿入、欠失、及びスプライス変異体などの突然変異を有するタンパク質を含む。「ＢＣＭＡ」なる用語には、ＢＣＭＡのアミノ酸配列の翻訳後修飾も含まれる。翻訳後修飾としては、これらに限定されるものではないが、Ｎ−及びＯ−結合グリコシル化が挙げられる。

【0045】

本明細書で使用するところの用語「フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン」又は「ＦＮ３ドメイン」は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体、及び原核酵素を含むタンパク質（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７５：１９１０−１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６５：１５６５９−１５６６５，１９９０）、又はその誘導体において頻繁に生じるドメインを指す。例示的なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び非天然の合成ＦＮ３ドメインがある（例えば米国特許第８２７８４１９号に記載される）。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号及びタンパク質名によって称される（例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０））。

【0046】

本明細書で使用するところの「担体」なる用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するところの「医薬的に許容される担体」なる用語は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。

【0047】

本明細書で使用するところの「対象」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。特定の実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。

【0048】

本明細書で使用するところの「がん」なる用語は、当該技術分野において既知であるように、未調節の細胞成長又は複製によって特徴付けられる任意の疾患、状態、形質、遺伝子型、又は表現型を意味する。「がん細胞」は、未制御の成長で異常に分裂及び複製する細胞である。この細胞は、転移と称されるプロセスにおいて、その起源の部位（例えば、腫瘍）から離脱し、身体の他の部分に移動し、別の部位（例えば、別の腫瘍）を生じさせ得る。「腫瘍」は、未制御かつ進行性の過剰な細胞分裂から生じる異常な組織塊であり、新生物とも称される。腫瘍は、良性（がん性ではない）又は悪性のいずれかであり得る。本明細書に記載される組成物及び方法は、がん及び腫瘍細胞、すなわち悪性腫瘍及び良性腫瘍の両方の治療に有用である。このように、本明細書に記載される方法及び組成物の様々な実施形態では、がんとしては、限定するものではないが、ヘムがん、リンパ腫、乳がん、肺がん、前立腺がん、大腸直腸がん、食道がん、胃がん、膀胱がん、膵臓がん、腎臓がん、子宮頸がん、肝臓がん、卵巣がん、及び精巣がんが挙げられ得る。

【0049】

本明細書で使用するところの「治療的有効量」なる用語は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を誘導する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ一般的な方法で決定することができる。

【0050】

本明細書で使用するところの「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はいずれも、がん又は自己免疫に関連した少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはより好ましくはがんなどの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。

【0051】

発明の一般的な実施形態
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメインを膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続することによって、養子免疫療法用に設計される。腫瘍細胞に提示された特異的抗原を認識し、Ｔ細胞を活性化してこれらの腫瘍細胞を特異的に溶解させるために、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞の養子移入によって腫瘍細胞を根絶することは、有用な抗腫瘍アプローチである。このＣＡＲ戦略の重要な態様は、腫瘍上で特異的又は選択的に発現し、全ての腫瘍細胞上に存在し、細胞表面から落としにくい又は調節しにくい膜エピトープである、標的エピトープの選択である。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、任意の哺乳類（ヒトなど）レシピエントに好適な普遍的試薬又は薬物として使用可能になることが理想的である。このような方法で細胞を用いるために、ＣＡＲ依存性エフェクター機能を損なうことなく、移植片対宿主反応におけるそれらの拒絶を防止する必要がある。

【0052】

本発明の実施形態では、「普遍的」Ｔ細胞に基づく免疫療法を確立するための、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）からのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）α破壊が提供される。Ｔ細胞特異性を所望の抗原にリダイレクトすることは、ＣＡＲを通して達成され得る。しかしながら、患者からのＣＡＲ−Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ生成は、時間及び費用によって制限される。更に、患者に由来するＴ細胞は、リンパ球毒性（リンパ球除去）化学療法の繰り返しのために機能的に欠陥がある場合がある。この目的を達成するため、本発明の実施形態は、「既製の試薬」として機能し得る不死化Ｔ細胞からのＣＡＲ−Ｔ細胞の生成に関する。換言すれば、改変された不死化Ｔ細胞を予め調製し、次いで複数のレシピエントに注入することができる。これにより、普遍的Ｔ細胞の「一元化」製造、及び必要に応じて注入するための地域施設でのＴ細胞の後続的な事前配置が促進され、効力を発揮する臨床試験の実行が可能になり、普遍的Ｔ細胞が投与され得る、他の生物学及び治療学との併用療法が促進されることになる。これを達成するために、同種免疫反応を引き起こす内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍ発現を排除し得る。かかる工程は、例えば、ＴＣＲ α定常領域又はβ定常領域を標的にするなど、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を導入することを含む、任意の好適な方法によって行われ得る。本発明の実施形態は、（ｉ）ＣＡＲを導入することによって不死化Ｔ細胞の特異性をリダイレクトすることと、（ｉｉ）内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現を排除して、所望のＴ細胞産物を生成することと、を組み合わせるという固有なものである。特定の実施形態では、ＣＡＲの導入及びＴＣＲ／Ｂ２Ｍの排除は、ＣＡＲを安定的に発現させるためのエレクトロポレーション及びｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡの所望の一過性トランスフェクションによって達成される。本発明の実施形態では、特定の改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、既製の試薬として必要に応じて注入されるように、予め調製され、解凍される。

【0053】

本発明者らは、Ｔ細胞中の内因性ＴＣＲ又はＢ２Ｍのいずれかを標的にするＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体が、ＴＣＲ発現の所望の喪失をもたらしたことを実証している。予期されるように、これらの改変Ｔ細胞は、混合リンパ球反応アッセイにおいてＴＣＲ刺激に反応しなかったが、例示の抗原、ＢＣＭＡに対するそれらのＣＡＲを媒介としてリダイレクトされた特異性を維持した。

【0054】

本発明の特定の実施形態では、不死化Ｔ細胞は、キメラ光源受容体（ＣＡＲ）を発現して腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異性をリダイクレクトするように、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変され、それによってｉｎ ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を与える。ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、特異性ドメインが抗ＢＣＭＡ ＦＮ３ドメインからクローン化されるため、ＭＨＣとは無関係の複数のレシピエントにおいてＢ細胞悪性疾患を認識する。本発明は、複数のレシピエントに投与され得る「普遍的」な改変された不死化ＴＡＡ特異的Ｔ細胞を生成することによって、患者別のＴ細胞を生成する必要性を排除することへの大きな一歩を包含する。これは、内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現を排除して、ＣＡＲ依存性エフェクター機能を損なうことなく移植片対宿主反応を防止するよう、特異的なＣＡＲ Ｔ細胞を遺伝子的に編集することによって達成された。遺伝子改変Ｔ細胞は、デザイナーＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いてＴＣＲ及びＢ２Ｍを恒久的に欠失させた後、所望の特異的なＣＡＲを安定的に導入することによって生成された。本発明者らは、これらの改変されたＴ細胞が、ＴＣＲ刺激に反応することなく、ＢＣＭＡのリダイレクトされた特異性を有するという予期された特性を示すことを示している。これらの改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、多くの種類のがんの治験的治療のための既製の療法として使用されてもよい。

【0055】

具体的には、改変された不死化ＣＡＲ⁻Ｔ細胞を使用することの実現可能性を試験するために、本発明者らは、ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現を不可逆的に排除するため、不死化Ｔ細胞のゲノムの編集を含むように、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成する培養プロセスを改変した。ＴＣＲ及びＢ２Ｍ遺伝子座をノックアウトするために、本発明者らは、内因性ＴＣＲ及びＢ２Ｍの定常領域内のゲノム配列を標的にした、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼからＤＮＡ開裂ドメインに融合されたＤＮＡ結合ドメインからなるＣａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体を開発した。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、ゲノム中のＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）の形成を触媒することによってゲノム編集を媒介する。遺伝子のコード配列内の所定の部位に対するＤＳＢを標的にすることは、誤差の発生しやすい細胞修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を介した機能的標的遺伝子発現の恒久的な喪失につながり、開裂部位におけるヌクレオチドの挿入又は欠失をもたらすことは、以前より示されてきた（Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００８）。

【0056】

キメラ抗原受容体
本明細書で使用するところの「抗原」なる用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって結合することができる分子である。加えて、抗原は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の産生につながる体液性免疫反応及び／又は細胞性免疫反応を誘導することが可能である。

【0057】

本発明は、免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）、細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド、膜貫通ドメイン、及び１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む核酸を伴う。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原間の共有空間からなるエピトープを認識し得る。特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補的決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／又はその抗原結合フラグメントを含み得る。相補的決定領域（ＣＤＲ）は、抗原を相補し、それにより、該特定の抗原に対するその特異性を受容体に提供する、抗原受容体（例えば、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列である。抗原受容体のそれぞれのポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。抗原受容体は、典型的には、２つのポリペプチド鎖からなるため、抗原に接触し得る抗原受容体ごとに６つのＣＤＲが存在する。すなわち、それぞれの重鎖及び軽鎖は３つのＣＤＲを含有する。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連付けられたほとんどの配列変動がＣＤＲに見出されるため、これらの領域は、高頻度可変性ドメインと称されることもある。中でも、ＣＤＲ３は、ＶＪ（重鎖及びＴＣＲ αβ鎖の場合はＶＤＪ）領域の組み換えによってコードされるときの最大の変動性を示す。ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者の細胞免疫療法を強化するためのヒト遺伝子であることが想到される。

【0058】

他の実施形態では、該特異性は、Ｔｅｎｃｏｎとして知られるヒトテネイシンＣの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然には存在しないＦＮ３ドメインに由来する（Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である、７個のβストランドをつなぐ６個の表面露出ループを示し、βストランドは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと称され、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと称されている（Ｂｏｒｋ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：８９９０−８９９２，１９９２；米国特許第６６７３９０１号）。これらのループ又はそれぞれのループ内の選択された残基をランダム化することでＦＮ３ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて、所望の抗原に結合する新規分子を選択することができる。したがって、Ｔｅｎｃｏｎ配列（配列番号１）に基づいて設計されたライブラリは、ループ又はストランドのうちの１つ以上にランダム化された配列を有することができる。例えば、テンコンに基づくライブラリは、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、及びＦＧループのうちの１つ以上にランダム化配列を有することができる。例えば、テンコンのＢＣループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＢＣループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＣＤループはアミノ酸６個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＣＤループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＥＦループはアミノ酸５個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＥＦループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＦＧループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＦＧループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンライブラリのループにおける更なる多様性を、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることができる。例えば、ＢＣ、ＣＤ、ＥＦ及び／又はＦＧループをアミノ酸１〜２２個だけ伸長することができ、又はアミノ酸１〜３個だけ減少させることができる。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を得るためには、残基４〜２８個の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応するように、ＦＧループの配列及び長さを多様化させることができる。例えば、更に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸によってループを伸長することにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることができる。テンコン配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成する、２個以上のβ鎖と少なくとも１つのループを含む、ランダム化された別の表面を有してもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。テンコンの別のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計については、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリには、１１、１７、４６、及び／又は８６位の残基の置換を有し、その変異体が改善された熱安定性を示すＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されたライブラリが含まれる。例示のＴｅｎｃｏｎ変異体は、米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、Ｔｅｎｃｏｎと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ、及びＥ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号２）を含む。テンコンライブラリ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、ランダムな又は既定のアミノ酸の組を用いて、選択された残基の位置でランダム化することができる。例えば、ライブラリにおいて無作為置換を有する変種を、天然に存在する２０個全てのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。あるいは、ＮＮＳコドンを用いて２０種全てのアミノ酸残基を生じさせると同時に終止コドンの頻度を低減することもできる。多様化させる位置で偏りのあるアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な普遍的構成単位として機能する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを用いたものである。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するために必要な、全ての考えられる配列組み合わせを示す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。

【0059】

特定の実施形態では、本発明は、完全長のＣＡＲ ｃＤＮＡ又はコード化領域を含む。抗原結合領域又はドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のフラグメントを含み得る。抗原結合領域又はドメインはまた、ＦＮ３ドメインを含み得る。

【0060】

本発明のキメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」なる用語は、分化細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であってもよい。メモリ又はメモリ型Ｔ細胞におけるエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」なる用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に対して特殊機能を実行するように指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用されるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用され得る範囲内で、かかる切断部分は、依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用されてもよい。このように、細胞内シグナル伝達ドメインなる用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。例としては、Ｔ細胞受容体のζ鎖、又はそのホモログのいずれか（例えば、η、δ、γ、又はε）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、ＦｃｙＲＵＴ、ＦｃｙＲ、並びにＯ’Ｏ３ζ及びＣＤ２．８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、及びこれらの組み合わせなどのシグナル伝達分子の組み合わせと、他の類似の分子及びフラグメントと、が挙げられる。ＦｃｙＲＩＩＩ及びＦｃｓＲＬなど、活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分が使用され得る。これらの代替膜貫通及び細胞内ドメインを使用するｃＴＣＲの開示について、Ｇｒｏｓｓ ｅｌ ａｌ．（１９９２）、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉ ｅｌ ａｌ．（１９９３）、Ｍｏｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、Ｗｅｉｊｔｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、及びＨｅｋｅｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）を参照されたい。好ましい実施形態では、ヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを活性化のために採取した。

【0061】

抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＩｇＧ_４Ｆｃヒンジ及びＦｃ領域、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトＣＤ３ドメイン、若しくはシステイン変異ヒト∈Ｏ３ζドメイン、又はＣＤ１６及びＣＤ８並びにエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からの他のヒト膜貫通ドメインといった膜貫通ドメインによって連結され得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び改変ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、限定するものではないが、ＣＤ２８、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−ＩＢＢ（ＣＤ１３７）のうちの１つ以上が挙げられる。ＣＤ３によって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激性受容体によって提供される追加のシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に重要であり、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性及び養子免疫療法の治療的成功の改善を助け得る。特定の実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を組み込む、単離された核酸セグメント及び発現カセットに関する。本発明のベクターは、主に、調節された真核生物プロモータ、例えば、ＭＮＤＵ３プロモータ若しくはＥＦｌａｐｈａプロモータ、又はＵｂｉｑｕｉｔｉｎプロモータの制御下で、免疫細胞、好ましくはＴ細胞に所望の遺伝子を送達するように設計される。また、ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作を促進するために、他に理由がなくとも選択可能マーカーを含有してもよい。

【0063】

キメラ抗原受容体分子は組み換えであり、それらの細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して、抗原に結合し、活性化シグナルを伝達する両方の能力によって区別される。抗原結合部分（例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される）を利用する受容体コンストラクトは、ＨＬＡ非依存様式で標的細胞表面上の天然抗原に結合するという点で「普遍的」であるという付加的な利点をもたらす。例えば、いくつかの実験室は、ＣＤ３複合体のゼータ鎖（ζ）、Ｆｃ受容体のγ鎖、及びスカイチロシンキナーゼの細胞内部分をコードする配列に融合したｓｃＦｖコンストラクトについて報告している（Ｅｓｈｈａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｆｉｔｚｅｒ−Ａｔｔａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。腫瘍認識及びＣＴＬによる溶解を含むリダイレクトされたＴ細胞エフェクター機構は、いくつかのマウス及びヒト抗原ｓｃＦｖ：ζ系の中で文書化されている（Ｅｓｈｈａｒ，１９９７；Ａｌｔｅｎｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0064】

現在の非ヒト抗原結合領域は、典型的には、キメラ抗原受容体を構築するのに使用される。マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗原結合領域を使用する潜在的な問題は、ヒトエフェクター機能の欠如、及び腫瘍塊に浸透する能力がないことである。換言すれば、かかる抗体は、ＣＡＲを発現する細胞を破壊するために、抗体依存性細胞毒性又はＦｃ受容体媒介性貪食作用を介して、補体依存性溶解を媒介すること又はヒト標的細胞を溶解することができない場合がある。更に、非ヒトモノクローナル抗体は、外来タンパク質としてヒト宿主によって認識され得、したがって、かかる外来抗体の繰り返し注入は、有害な過敏症反応につながる免疫反応の誘発をもたらし得る。マウスベースのモノクローナル抗体については、これは多くの場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応と称される。したがって、ヒト抗体の使用は、マウス抗体ほど強くＨＡＭＡ反応を惹起しないため、より好ましい。同様に、ＣＡＲにおけるヒト配列の使用は、レシピエント内に存在し、ＨＬＡとの関連において処理された抗原を認識する内因性Ｔ細胞による免疫媒介性の認識、延いては排除を回避し得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、（ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む。

【0065】

特定の実施形態では、ＣＡＲ内の細胞内受容体シグナル伝達ドメインとしては、Ｔ細胞抗原受容体複合体のもの、例えばＣＤ３のζ鎖、また、単独の又はＣＤ３ζとの連続のＦｃγＲＩＩＩ共刺激シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８、ＤＡＰ１０、ＣＤ２が挙げられる。特定の実施形態では、細胞内ドメイン（細胞質ドメインと称される場合がある）は、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃｓＲＴｙ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ分子、ＣＤ２７、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、及びＣＤ４０のうちの１つ以上の一部又は全てを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメイン内の内因性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を用いる。１つ又は複数の細胞質ドメインが用いられてもよく、いわゆる第３世代ＣＡＲは、例えば、相加効果又は相乗効果のために一緒に融合された少なくとも２つ又は３つのシグナル伝達ドメインを有する。キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称される場合がある）は、腫瘍関連抗原又は病原体特異的抗原を含む。

【0066】

腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上で発現される限り、任意の種類であってもよい。腫瘍関連抗原の例示の実施形態としては、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、αフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓなどが挙げられる。

【0067】

特定の実施形態では、ＨＡ−１、ＷＴ１、又はｐ５３など、細胞内腫瘍関連抗原が標的にされてもよい。これは、ＨＬＡとの関連において細胞内腫瘍関連抗原から記載される、処理されたペプチドを認識する、普遍的Ｔ細胞上に発現したＣＡＲによって達成され得る。更に、普遍的Ｔ細胞は、ＨＬＡとの関連において処理された細胞内腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体対形成を発現するように遺伝子改変されてもよい。

【0068】

病原体は、任意の種類であってもよいが、特定の実施形態では、病原体は、例えば、真菌、細菌、又はウイルスである。例示のウイルス病原体としては、アデノウイルス科、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、ピコルナウィルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミキソウイルス科（Parainyxoviridae）、パポーバウイルス科、ポリオーマウイルス科、ラブドウイルス科、及びトガウイルス科（Togavkidae）のファミリーのものが挙げられる。例示の病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ出血熱、及び風疹を引き起こす。例示の病原真菌としては、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、ニューモシスチス、及びスタキボトリスが挙げられる。例示の病原菌としては、ストレプトコッカス、シュードモナス、赤痢菌、カンピロバクター、ブドウ球菌、ヘリコバクター、大腸菌、リケッチア、桿菌、ボルデテラ、クラミジア、スピロヘータ、及びサルモネラが挙げられる。一実施形態では、病原体受容体デクチン−１を使用して、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲが生成され得る。デクチン−１の特異性に基づいてＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞は、アスペルギルス及び標的菌糸成長を認識し得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス感染及び病理を妨害するために、ウイルス決定子（例えば、ＣＭＶ及びエボラからの糖タンパク質）を認識する抗体に基づいて作製され得る。いくつかの実施形態では、病原性抗原は、ＣＡＲ内の細胞外ドメインが真菌細胞壁の炭水化物のパターンを認識するアスペルギルス炭水化物抗原である。

【0069】

本発明によるキメラ免疫受容体は、当該技術分野において既知の任意の手段によって産生することができるが、好ましくは、組み換えＤＭＡ技術を用いて産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準技術（ゲノムライブラリスクリーニング、ＰＣＲ、プライマ支援ライゲーション、酵母及び細菌由来のｓｃＦｖライブラリ、部位特異的突然変異誘発など）によって、完全なコード配列に調製され、組み立てられ得る。得られたコード領域は、発現ベクターに挿入され、好適な発現宿主不死化Ｔ細胞株を形質転換するために使用され得る。本明細書で使用するところの「核酸コンストラクト」又は「核酸配列」又は「ポリヌクレオチド」は、Ｔ細胞に形質転換又は導入され、産物（例えば、キメラ受容体）を産生するように転写及び翻訳され得るＤＮＡ分子を意味することを意図する。

【0070】

本発明で用いられる例示の核酸コンストラクト（ポリヌクレオチド）では、プロモータは、本発明のキメラ受容体をコードする核酸配列に操作可能に（operablv）連結される。すなわち、プロモータは、キメラ受容体をコードするＤＮＡからのメッセンジャＲＮＡの転写を促進するように位置付けられる。プロモータは、ゲノム起源のものであるか、又は合成的に生成され得る。Ｔ細胞で使用するための様々なプロモータは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｒｏｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）によって開示されたＣＤ４プロモータ）。プロモータは、構成型又は誘導型であってよく、誘導型は、例えば、特定の細胞型又は特定の成熟レベルに関連付けられる。あるいは、多くの周知のウイルスプロモータも好適である。所望のプロモータとしては、βアクチンプロモータ、ＳＶ４０初期及び後期プロモータ、免疫グロブリンプロモータ、ヒトサイトメガロウイルスプロモータ、レトロウイルスプロモータ、及びフレンド脾フォーカス形成ウイルスプロモータが挙げられる。プロモータは、エンハンサと関連付けられても又は関連付けられなくてもよく、エンハンサは、自然に特定のプロモータと関連付けられても又は異なるプロモータと関連付けられてもよい。キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得られ得るか、又は、（例えば、ＰＣＲを介して）合成され得るか、又はそれらの組み合わせであり得る。イントロンがｍＲＮＡを安定化させるか、又はＴ細胞特異的発現を提供することが見出されていることから（Ｂａｒｔｉｅｌ ａｎｄ Ｇｏｌｄｆｅｋｉ，２００３）、ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡ又はそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化させるために内因性又は外因性の非コード領域を使用することが更に有利であり得る。

【0071】

本発明のキメラ受容体の発現のために、キメラ受容体のＮ末端構成成分をコードする核酸配列の自然発生又は内因性転写開始領域を使用して、標的宿主内にキメラ受容体が生成され得る。あるいは、構成型又は誘導型発現を可能にする外因性転写開始領域が使用され得、発現は、標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質などに応じて制御され得る。

【0072】

同様に、キメラ受容体を表面膜に方向付けるシグナル配列は、キメラ受容体のＮ末端構成成分の内因性シグナル配列であり得る。任意選択的に、いくつかの事例では、この配列を異なるシグナル配列に交換することが望ましい場合がある。しかしながら、選択されるシグナル配列は、キメラ受容体がＴ細胞の表面上に提示されるように、Ｔ細胞の分泌経路と適合すべきである。同様に、終結領域は、キメラ受容体のＣ末端構成成分をコードする核酸配列の自然発生又は内因性転写終結領域によって提供されてもよい。あるいは、終結領域は、異なる供給源に由来してもよい。ほとんどの場合、終結領域の供給源は、一般に、組み換えタンパク質の発現にとって重要であるとは見なされず、発現に悪影響を及ぼすことなく、多種多様な終結領域が用いられ得る。当業者には理解されるように、いくつかの事例において、例えば、ＣＡＲ内の抗原結合ドメインの末端部にある数個のアミノ酸、通常は１０個以下、より通常は５個以下の残基が欠失され得る。また、境界に少数のアミノ酸、通常は１０個以下、より通常は５個以下の残基を導入することが望ましい場合がある。アミノ酸の欠失又は挿入は、構成の必要性の結果であり、制限部位の便宜、操作の容易さ、発現レベルの改善などをもたらし得る。加えて、同様の理由から、異なるアミノ酸との１つ以上のアミノ酸の置換が行われ得、置換するアミノ酸は、いずれのドメインにおいても通常は約５個を超えない。

【0073】

本発明によるキメラ受容体をコードするキメラコンストラクトは、従来の方法で調製され得る。ほとんどの場合、天然配列が用いられ得るため、天然遺伝子は、様々な構成成分の適切な結合を可能にするように、適宜、単離され、操作され得る。このように、キメラ受容体のＮ末端及びＣ末端タンパク質をコードする核酸配列は、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適切なプライマを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることによって単離され得る。あるいは、クローン化遺伝子の制限消化物を使用して、キメラコンストラクトが生成され得る。いずれの場合でも、平滑末端化される制限部位を提供するか、又は相補的な重なりを有する配列が選択され得る。

【0074】

キメラコンストラクトを調製するための様々な操作は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができ、特定の実施形態では、キメラコンストラクトは、標準的な形質転換又はトランスフェクション法を使用した適切な宿主内でのクローン化及び発現のために、ベクターに導入される。このように、それぞれの操作後、ＤＮＡ配列の結合から得られたコンストラクトがクローン化され、ベクターが単離され、配列がスクリーニングされて、配列が所望のキメラ受容体をコードすることが確実になる。配列は、制限分析、配列決定などによってスクリーニングされ得る。本発明のキメラコンストラクトは、腫瘍のサイズを減少させることによって、又は対象における腫瘍の成長若しくは再成長を予防することによって、がんを有する又はがんを有することが疑われるこれらの対象に応用される。したがって、本発明は更に、改変された不死化Ｔ細胞に本発明のキメラコンストラクトを導入し、改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞を対象に導入することによって、対象における腫瘍成長を軽減するか又は腫瘍形成を防止し、それにより、対象において腫瘍を減少させる又は排除する抗腫瘍反応をもたらす方法に関する。使用され得る好適な不死化Ｔ細胞としては、細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）又は破壊を必要とするＴ細胞受容体を有する任意の不死化細胞が挙げられる。

【0075】

キメラコンストラクトは、ネイキッドＤＮＡとしての不死化Ｔ細胞又は好適なベクター内の不死化Ｔ細胞に導入され得る。ネイキッドＤＮＡを用いたエレクトロポレーションによりＴ細胞を安定的にトランスフェクションする方法は、当該技術分野において既知である。例えば米国特許番号第６，４１０，３１９号を参照されたい。ネイキッドＤＮＡは、一般に、発現のために適切な配向でプラスミド発現ベクターに含有される、本発明のキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。有利には、ネイキッドＤＮＡの使用は、本発明のキメラ受容体を発現する不死化Ｔ細胞を産生するのに必要な時間を短縮する。

【0076】

あるいは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター）を使用して、キメラコンストラクトが不死化Ｔ細胞に導入され得る。本発明の方法に従って使用するのに好適なベクターは、不死化Ｔ細胞において非複製的である。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞内に維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存性を維持するのに十分に少ない。例証的なベクターとしては、ｐＦＢ−ｎｅｏベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標））、並びにＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、ＡＡＶ、又はＢＰＶに基づくベクターが挙げられる。

【0077】

トランスフェクション又は形質転換された不死化Ｔ細胞が、所望の調節により、所望のレベルで表面膜タンパク質としてキメラ受容体を発現できることが確立された後は、キメラ受容体は、所望のシグナル誘導を提供するように宿主細胞内で機能するか否かが決定され得る。続いて、形質転換された不死化Ｔ細胞は、対象における抗腫瘍反応を活性化するために、対象に再導入又は投与される。投与を容易にするために、本発明による形質転換されたＴ細胞は、適切な担体又は希釈剤を用いて医薬組成物に作製され得るか、又はｉｎ ｖｉｖｏの投与に適切な留置剤に作製され得、更に製薬的に許容され得る。このような組成物又は留置剤を作製する手段は、当該技術分野において記載されている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ，ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。適切な場合、形質転換された不死化Ｔ細胞は、カプセル、溶液、注射剤、吸入剤、又はエアロゾルなどの半固体又は液体形態で、それらの対応の投与経路に対応する通常の方法で、調製物に配合され得る。組成物が標的組織若しくは器官に到達するまで組成物の遊離及び吸収を防止する若しくは最小限に抑えるため、又は組成物の時効性を確実にするために、当該技術分野において既知の手段が利用され得る。しかしながら、キメラ受容体を発現する細胞を無効にする、製薬的に許容される形態を用いることが望ましい。したがって、形質転換された不死化Ｔ細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、又は正常な生理食塩水を含有する医薬組成物に作製され得ることが望ましい。

【0078】

例示のＢＣＭＡ特異的キメラＴ細胞受容体（又はキメラ抗原受容体、ＣＡＲ）
ＭＭ治療の潜在的標的は、成熟Ｂ細胞で主に発現される腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーである、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）である（Ｃｏｑｕｅｒｙ ａｎｄ Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；３２（４）：２８７−３０５）。ＢＣＭＡは、そのリガンドであるＴＮＦファミリーのＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に結合すると、細胞生存促進性（Ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）のシグナルを与える。ＢＣＭＡは、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫシグナル伝達に依存するＢ細胞の抗原提示を誘発する。健康な個体では、ＢＣＭＡは、長期の体液性免疫を維持する形質細胞の生存を媒介する役割を果たしているが、その発現は、多くのがん、自己免疫疾患、及び感染症にも関連している。例えば、ＢＣＭＡ ＲＮＡは、ＭＭ細胞中及び他のリンパ腫中に普遍的に検出されており、ＢＣＭＡタンパク質は、ＭＭ患者からの形質細胞の表面上で検出されている（Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４ Ｊａｎ １５；１０３（２）：６８９−９４；Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｏｃｔ １；１３（１９）：５９０３−９；Ｂｅｌｌｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ Ｍａｙ １５；１０５（１０）：３９４５−５０；Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００４ Ａｐｒ １５；１０３（８）：３１４８−５７）。

【0079】

一態様では、本発明の組成物は、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを含むＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを含む。

【0080】

一態様では、本発明は、
ａ．ＢＣＭＡに特異的に結合するＦＮ３ドメインを有する細胞外ドメインと、
ｂ．膜貫通ドメインと、
ｃ．細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ＣＡＲに関する。

【0081】

いくつかの実施形態では、新生ＣＡＲでは、細胞外ドメインの先にはＮ末端にシグナルペプチドが付いている。任意の適当なシグナルペプチドを本発明で使用することができる。シグナルペプチドは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。一実施形態によれば、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＣＤ３δシグナルペプチド、ヒトＣＤ３εシグナルペプチド、ヒトＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ヒト４−１ＢＢシグナルペプチド、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号４６〜４９のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５０〜５３のうちの１つのアミノ酸配列を有する。シグナルペプチドは、移行中又は移行の完了後にシグナルペプチダーゼによって切断されることで、シグナルペプチドを含まない成熟ＣＡＲを生成することができる。

【0082】

本発明の実施形態によれば、ＣＡＲの細胞外ドメインはＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを含む。配列番号８〜４４によるアミノ酸配列を含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態による任意のＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを、ＣＡＲの細胞外ドメインに用いることができる。

【0083】

本発明の実施形態によれば、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含むことができる。ヒンジ領域は、改変された免疫細胞の表面から離れるように細胞外ドメインを動かして、適切な細胞／細胞間の接触、標的又は抗原との結合、及び活性化を可能とする機能を有する（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。任意の適当なヒンジ領域を本発明のＣＡＲに使用することができる。ヒンジ領域は、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲのヒンジ領域は、６ｘＧＳペプチド（配列番号６６）、若しくはそのフラグメント、若しくはＣＤ８タンパク質に由来するヒンジ領域、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有する。

【0084】

任意の適当な膜貫通ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＧＭＣＳＦＲなどの分子の膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５０〜５３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５０〜５３のうちの１つのアミノ酸配列を有する。

【0085】

任意の適当な細胞内シグナル伝達ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられる。他の特定の実施形態では、エフェクターシグナルを伝達するシグナル伝達ドメインの切頭部分が用いられる。本発明の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、これらに限定されるものではないが、増殖、活性化、及び／又は分化を含む、ＣＡＲ保有細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。特定の実施形態では、シグナルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性、ヘルパー活性、及び／又はサイトカイン分泌を促進する。

【0086】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ−４０としても知られる）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭドメイン、又はＣＤ６６ｄなどに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。

【0087】

特定の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0088】

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ由来の機能性シグナル伝達ドメインを有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列を有する。

【0089】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定の実施形態では、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有する。

【0090】

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号４５のアミノ酸配列を有する。

【0091】

特定の実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン（センチリン）、ヒトＣＤ８ヒンジ領域、ヒトＣＤ８膜貫通領域、ヒト４−１ＢＢ細胞内ドメイン、及びヒトＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む構造を有する。新生ＣＡＲはヒトＣＤ８シグナルペプチドを更に含み、このペプチドはその後、成熟したＣＡＲでは切断される。

【0092】

一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞に付随する。

【0093】

別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、改変された不死化Ｔ細胞中に存在する。

【0094】

更に別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の他の構成成分から精製又は単離される。

【0095】

例示的なＦＮ３ドメイン標的化キメラＴ細胞受容体（又はキメラ抗原受容体、ＣＡＲ）
他の一般的な態様では、本発明は、ＦＮ３ドメイン特異的ｓｃＦｖを含むＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲに関する。

【0096】

一態様では、本発明は、
ａ．ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを有する細胞外ドメインと、
ｂ．膜貫通ドメインと、
ｃ．細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ＣＡＲに関する。

【0097】

ＦＮ３ドメイン特異的ｓｃＦｖを含むＣＡＲは、毒性を防ぐために改変された細胞に予め充填されるか、又は投与及び制御され得る標的ＦＮ３ドメインを使用して、Ｔ細胞媒介殺傷を制御するのに使用され得る。また、非標的化ＦＮ３ドメインは、リガンドと共役して、リガンド／受容体特異的様式で他の細胞型と係合するか、又は複数のリガンドと同時に係合する選択性を達成し得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、新生ＣＡＲでは、細胞外ドメインの先にはＮ末端にシグナルペプチドが付いている。任意の適当なシグナルペプチドを本発明で使用することができる。シグナルペプチドは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。

【0099】

本発明の実施形態によると、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。配列番号５４及び５５によるアミノ酸配列を含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態によるＦＮ３ドメインに特異的に結合する任意のｓｃＦｖを、ＣＡＲの細胞外ドメインに用いることができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、新生ＣＡＲでは、細胞外ドメインの先にはＮ末端にシグナルペプチドが付いている。任意の適当なシグナルペプチドを本発明で使用することができる。シグナルペプチドは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。一実施形態によれば、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８シグナルペプチド、ヒトＣＤ３δシグナルペプチド、ヒトＣＤ３εシグナルペプチド、ヒトＧＭＣＳＦＲシグナルペプチド、ヒト４−１ＢＢシグナルペプチド、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列を有する。他の特定の実施形態によれば、シグナルペプチドは、配列番号４６〜４９のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５０〜５３のうちの１つのアミノ酸配列を有する。シグナルペプチドは、移行中又は移行の完了後にシグナルペプチダーゼによって切断されることで、シグナルペプチドを含まない成熟ＣＡＲを生成することができる。

【0101】

任意の適当な膜貫通ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＧＭＣＳＦＲなどの分子の膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列を有する。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５０〜５３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号５０〜５３のうちの１つのアミノ酸配列を有する。

【0102】

任意の適当な細胞内シグナル伝達ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられる。他の特定の実施形態では、エフェクターシグナルを伝達するシグナル伝達ドメインの切頭部分が用いられる。本発明の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、これらに限定されるものではないが、増殖、活性化、及び／又は分化を含む、ＣＡＲ保有細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。特定の実施形態では、シグナルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性、ヘルパー活性、及び／又はサイトカイン分泌を促進する。他の実施形態では、本発明のＣＡＲにおいて細胞内シグナル伝達ドメインは使用されず、本発明のＦＮ３ドメインに特異的に結合するｓｃＦｖを含むＣＡＲは、エフェクター細胞を標的細胞に標的化するためのＦＮ３ドメインと共に使用される。

【0103】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ−４０としても知られる）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭドメイン、又はＣＤ６６ｄなどに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。

【0104】

特定の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。

【0105】

一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ由来の機能性シグナル伝達ドメインを有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号７のアミノ酸配列を有する。

【0106】

いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定の実施形態では、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を有する。

【0107】

一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞に付随する。

【0108】

別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の単離細胞膜中に存在する。

【0109】

更に別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の他の構成成分から精製又は単離される。

【0110】

ＴＣＲ及びＢ２Ｍを破壊するための例示のエンドヌクレアーゼ
本発明の結果として、改善された特徴を有する、改変された不死化Ｔ細胞を得ることができる。具体的には、本発明は、ＴＣＲ及びＢ２Ｍの発現が阻害されることを特徴とする、改変されたＴ細胞、好ましくは不死化Ｔ細胞を提供する。

【0111】

特定の実施形態によると、改変された不死化Ｔ細胞は、ＴＣＲ又はＢ２Ｍをコードする遺伝子などの所望の遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に非活性化することができるエンドヌクレアーゼを発現する。「エンドヌクレアーゼ」なる用語は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（開裂）を触媒することができる野生型又は変異酵素を指す。特に、該エンドヌクレアーゼは、非常に特異的であり、長さが１０〜４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は長さが１０〜３５塩基対の範囲、より通常は１２〜２０塩基対の範囲の核酸標的部位を認識する。本発明によるエンドヌクレアーゼは、更に「標的配列」と称される特定のポリヌクレオチド配列において認識し、該エンドヌクレアーゼの分子構造に応じて、これらの標的配列の内部で又はそれに隣接する配列へと核酸を切断する。エンドヌクレアーゼは、特定のポリヌクレオチド配列で単一又は二重鎖切断を認識し、生成し得る。

【0112】

特定の実施形態では、該エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ複合体である。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９がＲＮＡ分子と関連するゲノム工学ツールの新たな世代をなす。この系では、ＲＮＡ分子ヌクレオチド配列は、標的特異性を決定し、エンドヌクレアーゼを活性化する（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｃｏｎｇ，Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍａｌｉ，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１３）。Ｃｓｎ１とも称されるＣａｓ９は、ｃｒＲＮＡの生合成及び侵入性ＤＮＡの破壊の両方に関与する大きなタンパク質である。Ｃａｓ９は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ，Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ（Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｂａｒｒａｎｇｏｕ ｅｔ ａｌ．２０１２；Ｊｉｎｅｋ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１２）及びＳ．Ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２０１１）などの異なる細菌種において記載されている。大きなＣａｓ９タンパク質（＞１２００アミノ酸）は、予測される２つのヌクレアーゼドメイン、すなわちタンパク質の中央に位置するＨＮＨ（ＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメイン、及び分断されたＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン（ＲＮａｓｅ Ｈ ｆｏｌｄ）を含有する。Ｃａｓ９変異体は、自然界に自然には存在せず、タンパク質工学又はランダム突然変異誘発によって得られる、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。本発明によるＣａｓ９変異体は、例えば、突然変異、すなわちＳｉ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ（ＣＯＧ３５１３）のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基からの欠失、又はその挿入若しくは置換によって得られ得る。

【0113】

他の実施形態では、該エンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼの名称でも知られるホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野において周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、非常に特異的であり、長さが１２〜４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は長さが１４〜４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号６７）エンドヌクレアーゼに、ＨＮＨエンドヌクレアーゼ、又はＧＩＹ−ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−Ｃｒｅｌ変異体であり得る。「変異体」エンドヌクレアーゼ、すなわち、自然界に自然には存在せず、遺伝子工学又はランダム突然変異誘発によって得られるエンドヌクレアーゼは、野生型エンドヌクレアーゼによって認識されるものとは異なるＤＮＡ配列に結合し得る（国際出願公開第２００６／０９７８５４号を参照されたい）。

【0114】

他の実施形態では、該レアカットエンドヌクレアーゼは、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）であってもよく、一般に、ＩＩＳ型制限酵素の開裂ドメイン、Ｆｏｋｌと、３つ以上のＣ２Ｈ２ジンクフィンガーモチーフを含有するＤＮＡ認識ドメインとの間の融合である。正確な配向及び間隔での２つの個々のＺＦＮのＤＮＡ中の特定の位置におけるヘテロ二量体化は、ＤＮＡ中の二重鎖切断（ＤＳＢ）につながる。このようなキメラエンドヌクレアーゼの使用は、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．により検討されているように、当該技術分野において広範に報告されている（Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：６３６−６４６）。標準ＺＦＮは、開裂ドメインをそれぞれのジンクフィンガードメインのＣ末端に融合させる。２つの開裂ドメインがＤＮＡを二量体化及び切断することを可能にするために、２つの個々のＺＦＮは、Ｃ末端が一定の距離離れた状態でＤＮＡの反対側のストランドを結合する。ジンクフィンガードメインと開裂ドメインとの間の最も一般的に使用されるリンカー配列は、それぞれの結合部位の５’エッジが５〜７ｂｐ分断されることを必要とする。新しいジンクフィンガーアレイを生成するための最も単純な方法は、既知の特異性のより小さいジンフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラーアセンブリプロセスは、それぞれ３塩基対のＤＮＡ配列を認識し得る３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対標的部位を認識し得る３フィンガーアレイを生成することを伴う。所望の配列を標的にすることができるジンフィンガーアレイを生成するために、多数の選択方法が使用されてきた。初期選択の取り組みでは、部分的にランダム化されたジンクフィンガーアレイの大きなプールから所与のＤＮＡ標的を結合したタンパク質を選択するために、ファージディスプレイを利用した。より最近の取り組みでは、酵母ワンハイブリッド系、細菌型ワンハイブリッド及びツーハイブリッド系、並びに哺乳類細胞を利用してきた。

【0115】

他の実施形態では、該エンドヌクレアーゼは、典型的に転写活性化因子様エフェクタータンパク質（ＴＡＬＥ）又はモジュラー塩基対塩基結合性ドメイン（ＭＢＢＢＤ）に由来するＤＮＡ結合ドメインの、エンドヌクレアーゼ活性を有する触媒ドメインとの融合から得られる、「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」又は「ＭＢＢＢＤヌクレアーゼ」である。このような触媒ドメインは、通常、例えば、Ｉ−Ｔｅｖｌ、ＣｏＩＥ７、ＮｕｃＡ、及びＦｏｋ−Ｉなどの酵素に由来する。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、選択された触媒ドメインに応じて、単量体又は二量体形態で形成され得る（国際公開第２０１２１３８９２７号）。このような改変されたＴＡＬＥ−ヌクレアーゼは、商標名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，８ ｒｕｅ ｄｅ ｌａ Ｃｒｏｉｘ Ｊａｒｒｙ，７５０１３ Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）で市販されている。一般に、ＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来し、配列特異性は、非限定的な例としてキサントモナス又はラルストニア細菌タンパク質ＡｖｒＢｓ３、ＰｔｈＸｏ１、ＡｖｒＨａｈ１、ＰｔｈＡ、Ｔａｌ１ｃに起源を持つ一連の３３〜３５個のアミノ酸反復によって駆動される。これらの反復は、塩基対との相互作用を指定する２つのアミノ酸位置によって、本質的に異なる（Ｂｏｃｈ，Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍｏｓｃｏｕ及びＢｏｇｄａｎｏｖｅ ２００９）。ＤＮＡ標的中のそれぞれの塩基対は単一反復によって接触され、特異性は、２つの変異アミノ酸の反復からもたらされる（いわゆる反復可変ジペプチド、ＲＶＤ）。ＴＡＬＥ結合ドメインは、標的配列の第１のチミン塩基（ＴＯ）の必要性を担うＮ末端転座ドメインと、核局在シグナル（ＮＬＳ）を含有するＣ末端ドメインと、を更に含み得る。ＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、一般に、複数のＴＡＬＥ反復配列を含む改変されたコアＴＡＬＥスカフォールドに相当し、それぞれの反復は、ＴＡＬＥ認識部位のそれぞれのヌクレオチド塩基に特異的なＲＶＤを含む。本発明では、該コアスカフォールドのそれぞれのＴＡＬＥ反復配列は、３０〜４２個、より好ましくは３３又は３４個のアミノ酸から作製され、１２位及び１３位に位置する２つの重要なアミノ酸（いわゆる反復可変ジペプチド、ＲＶＤ）は、該ＴＡＬＥ結合部位配列の１つのヌクレオチドの認識を媒介し、等価な２つの重要なアミノ酸は、特に３３又は３４個のアミノ酸長よりも高いＴＡＬＥ反復配列において、１２位及び１３位以外に位置し得る。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連付けられたＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、Ｇ又はＡを認識するためのＮＮである。別の実施形態では、重要なアミノ酸１２及び１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ、及びＧに向かうそれらの特異性を調節するため、特にこの特異性を強化するために、他のアミノ酸残基に向かって変異され得る。ＴＡＬＥ核酸結合ドメインは、通常、８〜３０個のＴＡＬＥ反復配列を含む。より好ましくは、本発明の該コアスカフォールドは、８〜２０個のＴＡＬＥ反復配列を含み、更により好ましくは、１５個のＴＡＬＥ反復配列を含む。これはまた、ＴＡＬＥ反復配列の該セットのＣ末端に位置する２０個のアミノ酸で作製された、追加の単一の切断ＴＡＬＥ反復配列、すなわち追加のＣ末端半ＴＡＬＥ反復配列を含み得る。他のモジュラー塩基対塩基特異性核酸結合ドメイン（ＭＢＢＢＤ）は、国際公開第２０１４／０１８６０１号に記載されている。該ＭＢＢＢＤは、例えば、内部共生菌Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ Ｒｈｉｚｏｘｉｎｉｃａの最近配列されたゲノムから新たに同定されたプロテイン、すなわちＥＡＶ３６＿ＢＵＲＲＨ、Ｅ５ＡＷ４３＿ＢＵＲＲＨ、Ｅ５ＡＷ４５＿ＢＵＲＲＨ、及びＥ５ＡＷ４６＿ＢＵＲＲＨタンパク質から改変され得る。これらの核酸結合ポリペプチドは、塩基特異的である約３１〜３３個のアミノ酸のモジュールを含む。これらのモジュールは、キサントモナスＴＡＬＥ共通の反復と４０％未満の配列同一性を示し、より多くのポリペプチド配列の変異性を提示する。バークホルデリア及びキサントモナス由来の上記タンパク質（モジュール、Ｎ末端及びＣ末端）とは異なるドメインは、特定の核酸配列に対する結合特性を有する新しいタンパク質又はスカフォールドを改変するのに有用であり、キメラＴＡＬＥ−ＭＢＢＢＤタンパク質を形成するために組み合わせることもできる。

【0116】

本発明の実施形態に関連する方法及び組成物
特定の態様では、本発明は、ＴＣＲ／Ｂ２Ｍが欠損している不死化Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードするＤＮＡコンストラクトを含有する発現ベクターを用いてトランスフェクトすることを含む、抗原特異的にリダイレクトされた改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製及び／又は拡大する方法を含む。

【0117】

別の態様では、本発明は、エレクトロポレーションにより、改変された不死化Ｔ細胞を安定的にトランスフェクトし、リダイレクトする方法、又はネイキッドＤＮＡを使用した他の非ウイルス遺伝子移入（限定するものではないが例えば、ソノポレーション）の方法である。ほとんどの研究者は、異種遺伝子をＴ細胞に運ぶためにウイルスベクターを使用してきた。ネイキッドＤＮＡを使用することにより、リダイレクトされたＴ細胞を産生するのに必要な時間を短縮することができる。「ネイキッドＤＮＡ」は、発現に適切な配向で発現カセット又はベクターに含有されるキメラＴ細胞受容体（ｃＴＣＲ）をコードするＤＮＡを意味する。本発明のエレクトロポレーション方法は、キメラＴＣＲ（ｃＴＣＲ）をその表面上に発現させ、担持する安定発現株を産生する。

【0118】

「キメラＴＣＲ」は、Ｔ細胞によって発現され、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞外ドメインを含む受容体を意味し、細胞外ドメインは、ＭＨＣ非制限的な様式で、その様式ではＴ細胞受容体によって正常に結合されない抗原に特異的に結合することができる。適切な条件下での抗原によるＴ細胞の刺激は、細胞の増殖（拡大）をもたらす。本発明の例示のＢＣＭＡ及びＦＮ３ドメイン特異的キメラ受容体は、キメラＴＣＲの例である。しかしながら、この方法は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、腎細胞がん、並びにＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ２０及びｇｐ４１に特異的なキメラＴＣＲなど、他の標的抗原に特異的なキメラＴＣＲとのトランスフェクションに適用可能である。他の細胞表面標的抗原としては、限定するものではないが、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、メソセリン、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ５６、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＧＤ２、ＧＤ３、アルファフェトプロテイン（aiphafetoprotein）、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＩＬ−ｌｌＲａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＤ７０、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲ及び変異体、上皮腫瘍抗原などが挙げられる。

【0119】

特定の態様では、Ｔ細胞は不死化ヒトＴ細胞である。条件としては、ｍＲＮＡ及びＤＮＡの使用、並びにエレクトロポレーションが挙げられる。トランスフェクションに続き、細胞は直ちに注入されてもよく、又は保存されてもよい。特定の態様では、トランスフェクションに続き、細胞は、細胞への遺伝子移入後、約１、２、３、４、５日又はそれ以上の内に、混合集団としてｅｘ ｖｉｖｏで数日間、数週間、又は数ヶ月にわたって伝搬され得る。更なる態様では、トランスフェクションに続き、トランスフェクタントがクローン化され、単一の統合された又はエピソーム的に維持された発現カセット又はプラスミドの存在とキメラ受容体の発現とを実証するクローンが、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大される。拡大のために選択されたクローンは、ＢＣＭＡ発現標的細胞を特異的に認識し、溶解する能力を実証する。組み換え不死化Ｔ細胞は、ＩＬ−２、又は共通のγ鎖（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及び他のもの）に結合する他のサイトカインによる刺激によって拡大され得る。更なる態様では、遺伝子改変された細胞は凍結保存されてもよい。

【0120】

注入後のＴ細胞伝播（生存）は、（ｉ）ＣＡＲに特異的なプライマを使用するｑ−ＰＣＲ、及び／又は（ｉｉ）ＣＡＲに特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーによって評価され得る。

【0121】

本発明はまた、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ発現を欠いているリダイレクトされた不死化Ｔ細胞を使用する、細胞表面エピトープがＢＣＭＡ特異的である、がん、より具体的には多発性骨髄腫の標的化を表す。Ｂ細胞は、Ｔ細胞の免疫活性化抗原提示細胞として機能し得ることから、悪性Ｂ細胞は、リダイレクトされたＴ細胞の優れた標的である。本発明の特定の実施形態では、本発明の改変された不死化Ｔ細胞は、がん又は感染を有する個体など、それを必要とする個体に送達される。次いで、細胞は、個体の免疫系を強化して、対応のがん又は病原性細胞を攻撃する。場合によっては、個体には、抗原特異的な改変された不死化Ｔ細胞の１回以上の投与が提供される。個体に抗原特異的な改変された不死化Ｔ細胞の２回以上の投与を提供する場合、投与間の時間は、個体における伝搬時間を考慮に入れるのに十分であるべきであり、特定の実施形態では、投与間の時間は１、２、３、４、５、６、７日又はそれ以上である。

【0122】

キメラ抗原受容体を含むように改変され、かつ機能的ＴＣＲ及びＢ２Ｍを欠いている不死化Ｔ細胞の供給源は、任意の種類であってもよいが、特定の実施形態では、細胞は、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、又は誘導多能性幹細胞のバンクから得られる。異なるバンクは同じＨＬＡを共有しないため、複数のバンクが用いられてもよい。

【0123】

治療効果に好適な投与量は、例えば、好ましくは一連の投与サイクルで、投与１回当たり少なくとも１０^５、又は約１０^５〜約１０^１０細胞となる。例示の投与レジメンは、０日目に少なくとも約１０５個の細胞で開始し、例えば、患者内投与量漸増法を開始する数週間以内に約１０^１０細胞の目標投与量まで徐々に増加させる、１週間の投与サイクルで４回の漸増投与で構成される。好適な投与形態としては、静脈内、皮下、心臓内（例えば、リザーバアクセスデバイスによる）、腹腔内、及び腫瘍塊への直接注射が挙げられる。

【0124】

本発明の医薬組成物は、単独で、又はがんの治療に有用な他の十分に確立された薬剤と組み合わせて使用することができる。単独で送達されるか又は他の薬剤と組み合わせて送達されるかにかかわらず、本発明の医薬組成物は、特定の効果を達成するために、様々な経路で、哺乳類、特にヒトの体内の様々な部位に送達され得る。当業者であれば、２つ以上の経路を投与に使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりも即効性のある反応を提供し得ることを認識するであろう。例えば、皮内送達は、黒色腫の治療のために吸入よりも有利に使用され得る。局所送達又は全身送達は、製剤の身体空洞への塗布若しくは滴下、エアロゾルの吸入若しくは送気を含む投与によって、又は筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹膜、皮下、又は皮内投与を含む非経口導入によって達成され得る。

【0125】

本発明の組成物は、単位剤形で提供することができ、それぞれの投与単位、例えば注射は、単独で又は他の活性剤との適切な組み合わせで所定量の組成物を含有する。本明細書で使用するところの「単位剤形」なる用語は、ヒト及び動物対象の単一投与量として好適な物理的に分離した単位を指し、それぞれの単位は、本発明の所定量の組成物を、単独で、又は適宜、薬学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤と関連して、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された他の活性剤との組み合わせで含有する。本発明の新規単位剤形の仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連付けられた特定の薬力学に依存する。

【0126】

望ましくは、改変された不死化Ｔ細胞の有効量又は十分な数が組成物中に存在し、対象に導入され、それにより、長期的に特異的な抗腫瘍反応が確立されて、そのような治療がない場合よりも、腫瘍のサイズが低減されるか又は腫瘍成長若しくは再成長が排除される。望ましくは、対象に再導入された改変された不死化Ｔ細胞の量は、改変された不死化Ｔ細胞が存在しない他の同じ条件と比較して、腫瘍サイズの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は１００％の減少を引き起こす。

【0127】

したがって、投与される改変された不死化Ｔ細胞の量は、投与経路を考慮すべきであり、所望の治療反応を達成するために、十分な数の改変された不死化Ｔ細胞が導入されるようなものであるべきである。更に、本明細書に記載される組成物中に含まれるそれぞれの活性剤の量（例えば、接触されるそれぞれの細胞当たりの量又は特定の体重当たりの量）は、用途によって異なり得る。一般に、改変された不死化Ｔ細胞の濃度は、望ましくは、治療される対象に少なくとも約１×１０^６〜約１×１０^９個の改変された不死化Ｔ細胞を提供するのに十分であるべきであり、更により望ましくは、約１×１０^７〜約５×１０^８個の改変された不死化Ｔ細胞であるが、上記のいずれか、例えば、５×１０^８個を超える細胞、又は例えば１×１０^７個未満の細胞など、任意の好適な量を利用することができる。投与スケジュールは、十分に確立された細胞系療法に基づき得るか（例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９８７；米国特許番号第４，６９０，９１５号を参照されたい）、又は代替的な連続注入戦略が用いられ得る。

【0128】

これらの値は、本発明の実施のために本発明の方法を最適化する際に、施術者によって利用される改変された不死化Ｔ細胞の範囲の一般的な指針を提供する。本明細書におけるこのような範囲の記載は、特定の用途において保証され得るように、より多い又はより少ない量の構成成分の使用を妨げるものではない。例えば、実際の投与量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、又は薬物動態、薬物消長、及び代謝における個体差によって変化し得る。当業者は、特定の状況の緊急性に応じて、任意の必要な調整を容易に行うことができる。

【0129】

免疫系及び免疫療法
いくつかの実施形態では、医学的障害は、特定の免疫反応を引き出す、リダイレクトされた不死化Ｔ細胞の移入によって治療される。本発明の一実施形態では、がん又は医学的障害は、特異的免疫反応を引き出す、リダイレクトされたＴ不死化Ｔ細胞の移入によって治療される。ゆえに、免疫学的反応の基本的な理解が必要である。

【0130】

適応免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる白血球の一種である。Ｂ細胞及びＴ細胞は、主な種類のリンパ球である。Ｂ細胞及びＴ細胞は、同じ多能性造血幹細胞に由来し、活性化された後まで区別がつかない。Ｂ細胞は、体液性免疫反応において大きな役割を果たすが、Ｔ細胞は、細胞性免疫反応に密接に関与する。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる特別な受容体がそれらの細胞表面上に存在することにより、Ｂ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。ほぼ全ての他の脊椎動物において、Ｂ細胞及びＴ細胞は、骨髄中の幹細胞によって産生される。Ｔ細胞は、胸腺へと移動し、胸腺内で発達するものであり、名前はそれに由来している。ヒトにおいて、リンパ球プールの約１％〜２％は、毎時再循環して、抗原特異的リンパ球がそれらの特異的抗原を二次リンパ組織内に見出す機会を最適化する。

【0131】

Ｔリンパ球は、骨髄内の造血幹細胞から生じ、胸腺に遊走して成熟する。Ｔ細胞は、その膜上に固有の抗原結合受容体を発現し（Ｔ細胞受容体）、これは、他の細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子との関連においてのみ抗原を認識し得る。ヘルパーＴ細胞及び細胞毒性Ｔ細胞として知られる、Ｔ細胞の少なくとも２つの集団が存在する。ヘルパーＴ細胞及び細胞毒性Ｔ細胞は、それぞれ、膜結合糖タンパク質ＣＤ４及びＣＤ８のそれらのディスプレイによって主に区別される。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞、細胞毒性Ｔ細胞、マクロファージ、及び免疫系の他の細胞の活性化に重要な様々なリンホカインを分泌する（secret）。対照的に、抗原−ＭＨＣ複合体を認識する細胞毒性Ｔ細胞は、増殖し、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞（effector ceil）に分化され、ＣＬＴは、細胞溶解をもたらす物質を産生することによって、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞などの本体を示している抗原（body displaying antigen）の細胞を排除する。ナチュラルキラー細胞（又はＮＫ細胞）は、自然免疫系の主要構成成分を構成する細胞毒性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した腫瘍及び細胞の拒絶において大きな役割を果たす。この細胞は、アポトーシスによって標的細胞を死滅させる、パーフォリン及びグランザイムと呼ばれるタンパク質の小細胞質顆粒を放出することによって死滅させる。

【0132】

Ｂ細胞は、その表面上の抗体が特定の外来抗原に結合するときに、病原体を同定する。この抗原／抗体複合体は、Ｂ細胞によって取り入れられ、ペプチドへのタンパク質分解によって処理される。次いで、Ｂ細胞は、これらの抗原ペプチドを、その表面のＭＨＣクラスＩＩ分子上に表示する。ＭＨＣと抗原とのこの組み合わせは、一致するヘルパーＴ細胞を誘引し、これによりリンホカインが放出され、Ｂ細胞が活性化される。次いで、活性化Ｂ細胞が分裂し始めると、その子孫（形質細胞）は、この抗原を認識する抗体の何百万ものコピーを分泌する。これらの抗体は、血漿及びリンパ液中で循環し、抗原を発現する病原体に結合し、それらに（（hem）補体活性化による破壊のため、又は食細胞による取り込み及び破壊のためのマークを付ける。抗体はまた、細菌毒素に結合することによって、又はウイルス及び細菌が細胞を感染させるために使用する受容体に干渉することによって、負荷を直接中和し得る。

【0133】

ＮＫ細胞、すなわちナチュラルキラー細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）又はＰａｎ ＴマーカーＣＤＳ又は表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体を発現しないが、通常、ヒトにおいて表面マーカーＣＤ１６（ＦｃｙＲＩＩＩ）及びＣＤ５６を発現し、特定のマウス系統においてＮＫ１．１／ＮＫ１．２を発現する、大型顆粒リンパ球として定義されている。

【0134】

マクロファージ、Ｂリンパ球、及び樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現によって区別される。ＡＰＣは、その外側細胞膜上のＭＨＣ分子と共に、抗原を内部移行し、その抗原の一部を再発現する。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、複数の遺伝子座を有する大きな遺伝的複合体である。ＭＨＣ病巣は、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣと称される、ＭＨＣ膜分子の２つの主要クラスをコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般に、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連付けられた抗原を認識し、Ｔ細胞毒性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連付けられた抗原を認識する。ヒトにおいて、ＭＨＣは、ＨＬＡ複合体と称され、マウスにおいてはＨ−２複合体と称される。

【0135】

Ｔ細胞受容体、すなわちＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に概ね関与する、Ｔリンパ球（又はＴ細胞）の表面上に見出される分子である。これは、Ｔ細胞の９５％中のα鎖及びβ鎖からなるヘテロ二量体であり、５％のＴ細胞は、γ鎖及びδ鎖からなるＴＣＲを有する。抗原及びＭＨＣとのＴＣＲの係合は、関連する酵素、共受容体、及び特殊なアクセサリ分子によって媒介される一連の生化学的事象を介して、そのＴリンパ球の活性化をもたらす。免疫学において、ＣＤＳ抗原（ＣＤは分化のクラスタを表す）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖として知られる分子と会合してＴリンパ球中で活性化シグナルを生成する、哺乳類における４つの異なる鎖（ＣＤＳｖ、ＣＤ３５、及び２ｘＣＤＳｅ）からなるタンパク質複合体である。ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤＳ分子は共に、ＴＣＲ複合体を含む。ＣＤ３ｙ鎖、ＣＤ３８鎖、及びＣＤ３ｓ鎖は、単一細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの関連性の高い細胞表面タンパク質である。ＣＤＳ鎖の膜貫通領域は負に帯電し、これらの鎖が正に帯電したＴＣＲ鎖（ＴＣＲα及びＴＣＲｆｉ）と会合することを可能にすることが特徴である。ＣＤＳ分子の細胞内末端は、‘Ｔ’ＣＲのシグナル伝達能力に必須である、免疫受容体チロシナーゼ系活性化モチーフ、略してＩＴ ＡＭとして知られる単一の保存モチーフを含有する。

【0136】

ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要とされる共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞上で発現される分子のうちの１つである。ＣＤ２８は、Ｂ７．１（ＣＤ８０）及びＢ７．２（ＣＤ８６）の受容体である。Ｔｏｉｌ様受容体リガンドによって活性化されると、Ｂ７．１発現は、抗原提示細胞（antigen presenting ceils）（ＡＰＣ）中で上方調節される。抗原提示細胞上のＢ７．２発現は構成型である。ＣＤ２８は、ナイーブＴ細胞上で恒常的に発現される唯一のＢ７受容体である。ＴＣＲに加えてＣＤ２８を介した刺激は、様々なインターロイキン（特に、ＩＬ−２及びＩＬ−６）の産生のために、強力な共刺激シグナルをＴ細胞に提供し得る。

【0137】

ヒト疾患の治療的介入として抗原特異的Ｔ細胞を単離及び拡大する戦略は、臨床治験において検証されている（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｈｅｓｌｏｐ ｅｔ ａｌ，１９９６）。

【0138】

Ｂ細胞は、Ｔ細胞の免疫活性化抗原提示細胞として機能し得ることから、悪性Ｂ細胞は、リダイレクトされたＴ細胞の優れた標的と見なされる（Ｇｌｉｍｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ，１９８２）。リンパ腫は、そのリンパ節向性によって、Ｔ細胞性認識及び排除のために解剖学的に理想的な位置に定められる。多数のリンパ節に注入されたＴ細胞の局在性は、ＨＩＶ特異的ＣＤ８^＋ＣＴＬクローンの注入を受けたＨＩＶ患者において記録されている。これらの患者において、リンパ節生検材料の評価により、注入されたクローンは、リンパ節の約２％〜８％のＣＤ８＋細胞を構成することが明らかになった。この接着分子は、循環Ｔ細胞をリンパ節に向かわせ、ｉｎ ｖｉｔｒｏの拡大によって下方調節されるため（Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）、リンパ節ホーミングは、構成型プロモータ下でＬ選択分子をコードするｃＤＮＡコンストラクトとＴ細胞を同時トランスフェクトすることによって更に改善され得る。本発明は、上記のように、治療的有効量の組み換えヒトＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ発現細胞を患者に注入することを含む、内因性ＢＣＭＡを発現する細胞に関連付けられたヒト疾患状態を治療する方法を提供し得る。内因性ＢＣＭＡを発現する細胞に関連付けられたヒト疾患状態は、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、及びＢ細胞関連の自己免疫疾患からなる群から選択され得る。

【0139】

多発性骨髄腫（ＭＭ）は、クローン性形質細胞の蓄積を特徴とするがんである。ＭＭは、２番目に多い血液悪性疾患であり、全てのがんによる死亡の２％をも占める。ＭＭは異質性疾患であり、広範な侵攻性及び治療抵抗性を特徴とする。診断後１０年以上生存する患者がいる一方で、２年以内に急速な治療抵抗性が進行し、死亡する患者もいる。新たな治療法の開発における進歩にもかかわらず、現在のところ、ＭＭに対する治療は存在していない。現在の治療法はしばしばＭＭの寛解につながるが、疾患は、いずれはほぼ全ての患者において再発し、最終的に致死的である（Ｎａｙｍａｇｏｎ ａｎｄ Ａｂｄｕｌ−Ｈａｙ，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｊｕｎ ３０；９（１）：５２）。更に、化学療法及び放射線治療を含む従来の治療方法は、有害な副作用のためにその有用性は限定的である。

【0140】

白血病は、血液又は骨髄のがんであり、血液細胞、通常は白血細胞（白血球）の異常増殖（増殖による産生）によって特徴付けられる。これは、血液腫瘍と呼ばれる広範な疾患群の一部である。白血病は、疾患のスペクトルを網羅する広義の用語である。白血病は、その急性及び慢性形態へと臨床的及び病理学的に分割される。

【0141】

急性白血病は、未熟血液細胞の急速な増殖を特徴とする。このクラウディングは、骨髄が健康な血液細胞を産生できないようにする。急性形態の白血病は、小児及び若年成人において発生し得る。実際に、これは、任意の他の種類の悪性疾患よりも、米国の小児のより一般的な死因である。悪性細胞が迅速に進行して蓄積され、次いで血流に乗って身体の他の器官に広がるため、急性白血病においては即時治療が必要である。中枢神経系（ＣＮＳ）の関与は一般的ではないが、この疾患は時々、脳神経麻痺を引き起こし得る。慢性白血病は、比較的成熟しているが異常な血液細胞の過剰な蓄積によって区別される。典型的には、数ヶ月〜数年を経て、細胞は正常細胞よりもはるかに高い速度で産生され、血液中に多くの異常な白血球をもたらす。慢性白血病は、大部分が高齢者において生じるが、理論的にはいずれの年齢群でも発生し得る。急性白血病は直ちに治療されなければならないが、慢性形態は、治療の最大有効性を確保するために治療前にしばらくの間監視される場合がある。

【0142】

更に、この疾患は、リンパ球を形成するために正常に進行する骨髄細胞の一種においてがん化が起こったことを示すリンパ球性又はリンパ芽球性と、赤血球、一部の種類の白血球、及び血小板を形成するために正常に進行する骨髄細胞（marrow ceil）の一種においてがん化が起こったことを示す骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ又はｍｙｅｌｏｉｄ）と、に分類される（リンパ系細胞対骨髄系細胞を参照されたい）。

【0143】

急性リンパ性白血病（急性リンパ球性白血病、又はＡＬＬとしても知られる）は、若年小児における白血病の最も一般的な種類である。この疾患は、成人、特に６５歳以上でも発症する。慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、５５歳を超える成人で発症することが多い。これは、より若い成人において生じることがあるが、小児ではほとんど発症しない。急性骨髄性白血病（acute myelogenous leukemia）（急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia）、すなわちＡＭＬとしても知られる）は、小児よりも成人でより一般的に生じる。この種の白血病は、以前は「急性非リンパ性白血病」と呼ばれた。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は主に成人で生じるが、非常に少数の小児もこの疾患にかかる。

【0144】

リンパ腫は、リンパ球（脊椎動物免疫系内の白血球の種類）に起こるがんの種類である。多くの種類のリンパ腫が存在する。米国国立衛生研究所によれば、リンパ腫は、米国におけるがんの全ての症例の約５パーセントを占め、ホジキンリンパ腫は特に、米国におけるがんの全ての症例の１パーセント未満を占める。リンパ系は、身体の免疫系の一部（pari）であるため、ＨＩＶ感染又は特定の阻害要因若しくは薬物適用などから免疫力が低下した患者も、より高いリンパ腫の発生率を有する。

【0145】

１９世紀及び２０世紀には、この症状は、１８３２年にＴｈｏｍａｓ Ｈｏｄｇｋｉｎによって発見されたことから、ホジキン病と呼ばれた。口語的に、リンパ腫は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫（全ての他の種類のリンパ腫）として広く分類されている。リンパ腫の種類の科学的分類は、より詳細である。以前の分類は、組織球性リンパ腫を指したが、これらは、新しい分類においてＢ細胞系統、Ｔ細胞系統、又はＮＫ細胞系統として認識される。

【0146】

自己免疫疾患又は自己免疫は、「自己」として自身の構成部分（サブ分子レベルまで）を認識するための生物の欠如であり、それ自体の細胞及び組織に対する免疫反応をもたらす。かかる異常免疫反応から生じる任意の疾患は、自己免疫疾患と称される。顕著な例としては、セリアック病、真性糖尿病１型（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫病、及び関節リウマチ（ＥＡ）が挙げられる。

【0147】

自己免疫疾患を含む炎症性疾患は、Ｂ細胞障害に関連付けられた疾患のクラスでもある。自己免疫疾患の例としては、限定するものではないが、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、へノッホ・シェーンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎、結節性紅斑、脈なし病、アジソン病、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、類肉腫症、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発性動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、スロンボアンジチビテランス、シェーグレン症候群、原発性胆汁性硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維性肺胞炎が挙げられる。最も一般的な治療は、コルチコステロイド及び細胞毒性薬物であり、これらは非常に有毒であり得る。これらの薬物はまた、免疫系全体を抑制し、重篤な感染をもたらして、骨髄、肝臓、及び腎臓に悪影響を及ぼし得る。現在までクラスＩＩＩ自己免疫疾患を治療するために使用されてきた他の治療学は、Ｔ細胞及びマクロファージに対して指向されている。自己免疫疾患、特にクラスＩＩＩ自己免疫疾患を治療する、より効果的な方法が必要とされている。

【0148】

本発明のキットの実施形態
本明細書に記載される任意の組成物がキットに含まれてもよく、いくつかの実施形態では、改変された不死化ＣＡＲ−Ｔ細胞がキットで提供され、このキットはまた、培地など、細胞を拡大するのに好適な試薬を含んでもよい。

【0149】

非限定的な例では、キメラ受容体発現コンストラクト、キメラ受容体発現コンストラクトを生成するための１つ以上の試薬、発現コンストラクトのトランスフェクションのための細胞、及び／又は、発現コンストラクトのトランスフェクションのために不死化Ｔ細胞を得るための１つ以上の器具（かかる器具は、注射器、ピペット、ピンセット、及び／又はこのような医学的に承認された任意の装置であってもよい）である。

【0150】

いくつかの実施形態では、内因性ＴＣＲ発現及びＢ２Ｍを排除するための発現コンストラクト、コンストラクトを生成するための１つ以上の試薬、及び／又はＣＡＲ＋Ｔ細胞がキットで提供される。

【0151】

いくつかの実施形態では、そこにＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトが含まれる。

【0152】

いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーションのための試薬又は装置を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、キットは、人工抗原提示細胞を含む。

【0154】

キットは、本発明の１つ以上の好適に等分された組成物又は本発明の組成物を生成するための試薬を含んでもよい。キットの構成成分は、水性培地又は凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。キットの容器手段は、少なくとも１つのバイアル瓶、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、又は他の容器手段を含んでもよく、その中に構成成分が入れられてもよく、好ましくは、好適に等分されてもよい。キット内に２つ以上の構成成分が存在する場合、キットはまた一般に、追加の構成成分を別々に入れることができる第２、第３、又は他の追加の容器を含むことになる。しかしながら、構成成分の様々な組み合わせがバイアル瓶に含まれてもよい。本発明のキットは、典型的には、キメラ受容体コンストラクトを収容するための手段と、商用販売のために密閉された任意の他の試薬容器とを含むことになる。このような容器としては、例えば、所望のバイアルが保持される射出成形又は吹込成形プラスチック容器が挙げられ得る。

【0155】

実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する改変された不死化Ｔ細胞株であって、
（ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
不死化Ｔ細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない、不死化Ｔ細胞株。
２．抗原結合領域が腫瘍関連抗原に結合する、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
３．腫瘍関連抗原がＢＣＭＡである、実施形態２に記載の不死化Ｔ細胞株。
４．抗原結合領域がフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに結合する、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
５．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がノックアウトされる、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
６．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＴＣＲαである、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
７．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＫＩＲ３ＤＬ２である、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
８．Ｂ２Ｍがノックアウトされる、実施形態１に記載の不死化Ｔ細胞株。
９．ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
ＴＡＬＬ−１０４細胞株は、少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体を発現せず、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を発現しない、ＴＡＬＬ−１０４細胞株。
１０．抗原結合領域が腫瘍関連抗原に結合する、実施形態９に記載の細胞株。
１１．腫瘍関連抗原がＢＣＭＡである、実施形態１０に記載の細胞株。
１２．抗原結合領域がフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインに結合する、実施形態９に記載の細胞株。
１３．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がノックアウトされる、実施形態９に記載の細胞株。
１４．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＴＣＲαである、実施形態９に記載の細胞株。
１５．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体がＫＩＲ３ＤＬ２である、実施形態９に記載の細胞株。
１６．Ｂ２Ｍがノックアウトされる、実施形態９に記載の細胞株。
１７．ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドと、
（ｂ）配列番号８〜４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｅ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、
細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、ＴＡＬＬ−１０４細胞株。
１８．ＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞株であって、
（ａ）配列番号５４及び５５のいずれか１つのアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメイン及び配列番号７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含み、
ＴＡＬＬ−１０４細胞株は、ＴＲＣＡ、ＫＩＲ３ＤＬ２、及びＢ２Ｍを発現しない、ＴＡＬＬ−１０４細胞株。
１９．ＣＡＲを発現する改変された不死化Ｔ細胞株を生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
ａ．不死化Ｔ細胞株を提供する工程と、
ｂ．少なくとも１つの内因性Ｔ細胞受容体及びＢ２Ｍの発現を阻害する工程と、
ｃ．前記不死化Ｔ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入する工程と、を含む、方法。
２０．工程ｂが工程ｃの前に行われる、実施形態１９に記載の方法。
２１．工程ｃが工程ｂの前に行われる、実施形態１９に記載の方法。
２２．工程ｂがエンドヌクレアーゼを使用することによって実施される、実施形態１９に記載の方法。
２３．エンドヌクレアーゼが、ＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＣａｓ９である、実施形態２２に記載の方法。
２４．工程ｃが、エレクトロポレーション又はウイルス系遺伝子移入システムによって不死化Ｔ細胞にＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを導入することとして更に定義される、実施形態１９に記載の方法。
２５．ウイルス系遺伝子移入システムが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターを含む、実施形態４に記載の方法。
２６．実施形態１〜１８のいずれか１つの改変された免疫細胞と薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
２７．治療有効量の実施形態２６の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんの治療を必要とする対象における、がんを治療する方法。
２８．がんが多発性骨髄腫である、実施形態２７に記載の方法。
２９．実施形態１〜１８のいずれか１つの改変された不死化Ｔ細胞株を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物を製造する方法。

【実施例】

【0156】

以下の本発明の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。

【0157】

実施例１：エレクトロポレーション用のＴＡＬＬ−１０４細胞の調製
指数関数的に成長しているＴＡＬＬ−１０４細胞を、０．７×１０^６細胞／ｍＬの密度で、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＡＬＬ−１０４細胞培地［Ｍｙｅｌｏｃｕｌｔ Ｈ５１００ Ｍｅｄｉａ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０５１５０）；１％ピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１３６０−０７０）；１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１１４０−０５０）；４ｕＭヒドロコルチゾン（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ０７９０４）；１００ ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２０２−ＩＬ、２．１Ｅ４ ＩＵ／ｕｇ）］にて播種し、３７℃でインキュベートした。翌日、所望の数の細胞（１×１０^６／エレクトロポレーション）を、１００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。細胞を１０ｍＬの冷Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３１９８５０６２）で２回洗浄し、１００ｘｇで１０分間遠心分離し、予め室温に均衡化した０．１ｍＬ×（エレクトロポレーション実験の総数＋１）のＯＰＴＩ−ＭＥＭに再懸濁させた。

【0158】

実施例２：リボ核タンパク質複合体の調製
ガイドＲＮＡ
ＴＣＲα遺伝子の定常鎖（ＴＲＡＣ）の第１のエクソンを標的とするｇＲＮＡを設計した。ＴＣＲαの膜貫通ドメインの上流に位置する、標的にされた配列は、ＴＣＲα及びβアセンブリ、及び細胞表面へのアドレス指定に必要である。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ媒介ＤＮＡ開裂の際、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組み換え修復（ＨＤＲ）によるＣＡＲの組み込みのいずれかが、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊をもたらすことになる。Ｂ２Ｍ遺伝子座の破壊のために、第１のエクソンを標的にするｇＲＮＡを設計した。ナチュラルキラー細胞及びＴ細胞のサブセット上に膜貫通糖タンパク質を産生することに関与する遺伝子、ＫＩＲ３ＤＬ２については、第３のエクソンを標的にするｇＲＮＡを設計した。

【0159】

【表1】

【0160】

ｇＲＮＡの形成：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重
標的特異的なＡｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによってカスタム合成した。ｇＲＮＡにハイブリダイズさせる普遍的な６７ｍｅｒ Ａｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡ（１０７２５３４）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。Ａｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ及びＡｌｔ−Ｒ（商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｔｒａｃｒＲＮＡをＩＤＴＥバッファー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１−０１−０３−０１）中に最終濃度の２００μＭまで再懸濁させた。２つのＲＮＡオリゴを無菌マイクロ遠心管中にて等モル濃度で最終二重濃度の１００μＭまで混合した。ｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ混合物を９５℃で５分間加熱した後、ベンチトップ上で室温まで冷却して二重形成を促進した。

【0161】

リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形成
滅菌ＰＣＲチューブにおいて、２．１μＬのＰＢＳ、１．２ｕＬ（１２０ｐｍｏｌ）のｇＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重、及び１．７ｕｌ（１０４ｐｍｏｌ）のＡｌｔ−Ｒ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９酵素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０７８７２８）混合物を添加し、室温で２０分間インキュベートしてＲＮＰ形成を可能にする。

【0162】

実施例３：ＲＮＰ複合体を用いたＴＡＬＬ−１０４細胞のエレクトロポレーション
５μＬのＲＮＰ複合体及び０．１μＬ（１×１０＾６細胞）の調製されたＴＡＬＬ−１０４細胞を２ｍｍギャップサイズＢＴＸエレクトロポレーションキュベット（ＢＴＸ、４５−０１３５）に添加した。製造業者のプロトコルに従ってＥＣＭ ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ）を使用して、細胞に対して２００Ｖで１０ミリ秒間、単一パルスでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、３７℃で以前に平衡化したＴＡＬＬ−１０４細胞培地を含有する１つの１２ウェルプレートに即座に移入した。エレクトロポレーションから２４時間後に培地を交換した。

【0163】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集の効率を、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ又はＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかでフローサイトメトリーによって分析した。１００，０００細胞を、１００×ｇで１０分間遠心分離することにより、ＲＮＰ複合体のエレクトロポレーションから５日後に回収した。細胞を２００μＬの染色バッファー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，５５４６５７）で２回洗浄し、１００μＬの染色バッファーに再懸濁させた。製造業者の指示に従って、関連抗体（ＰＥ標識マウス抗ヒトβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，５５１３３７）又はアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４００２１４）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３００４３９）、又はアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４００１２０）を暗所にて４℃で４５分間インキュベートした。細胞を１００×ｇで遠心分離し、染色バッファーで２回洗浄し、２００μＬの染色バッファーに再懸濁させた。フローサイトメトリーによってデータを収集し、ＦｌｏＪｏソフトウェアを使用して分析した。図１は、関連するＲＮＰ複合体を用いたエレクトロポレーション後の、Ｂ２Ｍ及びＴＣＲノックアウト亜集団のレベルを示す。

【0164】

実施例４：ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９媒介編集後の遺伝子編集されたＴＡＬＬ−１０４亜集団の単離
抗フィリコエリトリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）でコーティングされた磁気ビーズを使用して、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）技術によって、非編集の野生型細胞から遺伝子編集されたＴＡＬＬ−１０４細胞を単離した。簡潔に述べると、ＴＡＬＬ−１０４細胞を計数し、４℃で１０分間、１００×ｇで遠心分離し、５ｍＬの冷脱ガスバッファーＸ（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を１ｍＬのバッファーＸに再懸濁させ、製造業者の指示に従って所望のタンパク質を標的にするＰＥコンジュゲート抗体（ＰＥ抗ＣＤ３又はＰＥ抗Ｂ２Ｍ）を用いて４℃で４５〜６０分間インキュベートした。細胞を４℃で１０分間、１００ｘｇで遠心分離し、抗ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，カタログ番号１３０−１０５−６３９）を含有する０．５ｍＬの冷バッファーＸ中に再懸濁させた。混合物を４℃で暗所にて３０分間インキュベートし、遠心分離し、５００μＬのバッファーＸ中に再懸濁させた。細胞を、３ｍＬのバッファーＸで以前に平衡化したＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−０９０−９７６）に置いたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ １３０−０４２−４０１）に充填した。カラムを１ｍＬのバッファーＸで２回洗浄した。遺伝子編集されたノックアウトＴＡＬＬ−１０４細胞を単離させ、素通り画分に収集し、３７℃及び５％のＣＯ_２で、ＴＡＬＬ−１０４ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ細胞培地（０．７×１０^６細胞／ｍＬ）にて培養した。図２は、ＭＡＣＳ磁気ビーズ標識技術を使用した遺伝子編集されたノックアウト細胞の単離を示す。

【0165】

実施例５：ＢＣＭＡ又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを標的にするＣＡＲを発現する改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞の生成及び分析
２つの異なるＣＡＲ配列のアミノ酸配列を逆翻訳し、シグナルペプチド、ヒンジ配列、ＴＭドメイン、及びシグナル伝達ドメインを用いて改変した。市販のｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７ ＵＬＴＲＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、完成したコンストラクトをＴ７ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ベクターにクローン化してｍＲＮＡを生成した。

【0166】

【表2】

【0167】

【表3】

【0168】

ＥＣＭ ８３０ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ）を使用して、ｍＲＮＡをＴＡＬＬ−１０４細胞にエレクトロポレーションした。Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＴＡＬＬ−１０４培地中で３週間成長していた３．５ｘ１０^６個のＴＡＬＬ−１０４細胞は、製造業者のプロトコルに従って、１０μｇのＣＡＲ ｍＲＮＡを用いるか又は用いないかのいずれかで単一電気パルス（４００Ｖ、７５０ｕｓ）を受信した。ＡＳ７Ｂ９１抗ＦＮ３ドメイン抗体を使用して、Ｄ０８ ＣＡＲの表面発現を２４時間後に評価した。同様に、コンジュゲートされたＦＮ３ドメインを使用して、ＡＳ７Ｂ９１ ＣＡＲの表面発現を２４時間後に評価した。図３に示す結果は、ＴＡＬＬ−１０４がＢＣＭＡ及び抗ＦＮ３ドメインＣＡＲを発現することを実証している。

【0169】

実施例６：エフェクター細胞としてＴＡＬＬ−１０４改変細胞を使用した細胞毒性アッセイ
ＢＣＭＡ標的化（Ｄ０８）及びＦＮ３ドメイン標的化（ＡＳ７Ｂ９１）ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞殺傷を、ＢＣＭＡを発現し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎで染色されたＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１５５）、Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２１３）、及びＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２４３）（これらは全て、様々なレベルでＢＣＭＡを発現する）を標的細胞として使用して評価した。ＡＳ７Ｂ９１−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞、Ｄ０８−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞、及びｍｏｃｋ ＴＡＬＬ−１０４細胞（ｍＲＮＡでエレクトロポレーションされていない）を、ウェル当たり〜０．２のＥ：Ｔ比で２０時間、ＢＣＭＡ標的細胞と共インキュベートした。ＡＳ７Ｂ９１−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞については、ＢＣＭＡ特異的又は非標的対照（ＮＴ）ＦＮ３ドメインを該細胞と共インキュベートした。実験の終わりに、細胞を、ＨＯＥＣＨＳＴ ３３３４２（核）染色及びヨウ化プロピジウム（死細胞染色）で１５分間染色した。

【0170】

細胞を、２０ＸのＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａ共焦点顕微鏡でウェル当たり５枚の画像に撮像して、ＨＯＥＣＨＳＴ ３３３４２（全ての細胞の核を検出するＵＶランプ）、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ（標的細胞のみを検出する４８８ｎｍレーザー）、及びヨウ化プロピジウム（全ての死細胞を検出する５６１ｎｍレーザー）を検出した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｃｏｌｕｍｂｕｓソフトウェアを使用して画像を分析して、標的細胞を識別し（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ強度を使用）、それらを核中のヨウ化プロピジウム染色の強度に基づいて生又は死として定義した。ウェル当たりの死標的細胞のパーセントを、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアにプロットした。ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを添加してから４０時間後に、元の殺傷アッセイ反応混合物から細胞のアリコートを収集し、再度染色し、死標的細胞パーセントについて評価した。図４は、標的特異的な方法でのＴＡＬＬ−１０４ ＣＡＲ発現細胞による標的細胞の殺傷を示す。細胞の共インキュベーションから２０時間後のＡＳ７Ｂ９１−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞の場合（図４Ａ）、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の殺傷は、１０ｎＭの非標的化対照（ＮＴ）ＦＮ３ドメイン（２７％）と比較して、共インキュベートされた０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン（４０％殺傷）の存在下で増加した。Ｄａｕｄｉ細胞の殺傷は、共インキュベートされた０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの存在下で、１７％（ＮＴ）から５８％に増加した。Ｋ５６２細胞の殺傷は、共インキュベートされた０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの存在下では増加しなかった。４０時間（図４Ｂ）では、Ｄａｕｄｉ細胞のＡＳ７Ｂ９１−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞殺傷は、１０ｎＭ ＮＴ ＦＮ３ドメインの場合の１５％から、０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの存在下で７０％に増加した。ＲＰＭＩ−８２２６細胞のＡＳ７Ｂ９１−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞殺傷は、ＮＴ対照の場合の４５％と比較して、共インキュベートされた０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの存在下で５９％であった。４０時間では、ＢＣＭＡ特異的殺傷は、Ｋ５６２細胞において観察されなかった。細胞の共インキュベーションから２０時間後のＤ０８−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞については（図４Ｃ）、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の殺傷は、共インキュベートされた０．３２ｎＭ ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメイン（２３％）の存在下でＭｏｃｋ ＴＡＬＬ−１０４細胞と比較して増加した（３７％殺傷）。Ｄａｕｄｉ細胞の殺傷は、共インキュベートされたＤ０８−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞の存在下で、１１％（Ｍｏｃｋ ＴＡＬＬ−１０４）から４２％に増加した。Ｋ５６２細胞の殺傷は、共インキュベートされたＤ０８−ＣＡＲ−ＴＡＬＬ−１０４細胞の存在下で、１１％（Ｍｏｃｋ ＴＡＬＬ−１０４）から２０％に増加した。

【0171】

実施例７：増殖能力の高まったｈＴＥＲＴ改変されたＴＡＬＬ−１０４細胞
ＴＡＬＬ−１０４細胞に、ヒトＴＥＲＴ遺伝子及びＥＧＦＰレポーター遺伝子をコードするレンチウイルスベクターを用いて形質転換した。正常に形質転換され、導入遺伝子と安定的に統合された緑色蛍光細胞は、ＦＡＣＳによってＥＧＦＰ陽性細胞に選択され、標準的な培養手順に従ってヒトＩＬ−２が補充されたＴＡＬＬ−１０４培地中で拡大することができる。細胞は経時的に拡大することが可能になり、非形質転換細胞が増殖を停止している間も拡大し続けた（図５）。

【0172】

実施例８：ＩＬ−２非依存性成長のためのＴＡＬＬ−１０４細胞の改変
ｈＴＥＲＴ形質転換細胞を、細胞の小胞体にコードされたタンパク質を保持する、Ｃ末端修飾、ＫＤＥＬ（配列番号６８）を有するヒトＩＬ−２導入遺伝子を持つ第２のレンチウイルスベクターを用いて更に形質転換した。外因性ＩＬ−２の非存在下でのこれらの形質転換細胞の培養は、正常に形質転換された細胞の拡大をもたらしたが、非形質転換細胞は拡大を停止して死滅した（図６）。

【0173】

次いで、ｐ１０２細胞にＦ１１ ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ ｍＲＮＡを過渡的にエレクトロポレーションすることによって、それらの細胞の標的殺傷を試験した。図７に見られるように、外因性ＩＬ−２の非存在下で成長するが、ＥＲ保持のＩＬ−２を安定的に発現するｐ１０２細胞は、外因性ＩＬ−２と共に成長し、同じＦ１１ ＢＣＭＡ標的化ＣＡＲを発現する野生型ＴＡＬＬ−１０４細胞と同程度に効果的にＭＭ１ｓ細胞を殺傷する。

【図1A】

【図1A(1)】

【図1B】

【図1B(1)】

【図2A】

【図2A(1)】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】