特表 2021-512589 フェニルアラニンの添加により食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を高める方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-512589(P2021-512589A)

(43)【公表日】2021年5月20日

(54)【発明の名称】フェニルアラニンの添加により食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を高める方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/04 20060101AFI20210423BHJP

   C12R 1/645 20060101ALN20210423BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/04 B

   C12R1:645

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-535638(P2020-535638)

(86)(22)【出願日】2018年2月1日

(85)【翻訳文提出日】2020年8月20日

(86)【国際出願番号】CN2018074935

(87)【国際公開番号】WO2019148418

(87)【国際公開日】20190808

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】丁重陽

(72)【発明者】

【氏名】馬忠宝

(72)【発明者】

【氏名】徐萌萌

(72)【発明者】

【氏名】王瓊

(72)【発明者】

【氏名】許正宏

(72)【発明者】

【氏名】趙麗▲てい▼

(72)【発明者】

【氏名】劉高強

(72)【発明者】

【氏名】顧正華

(72)【発明者】

【氏名】石貴陽

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AF11

4B064BJ10

4B064CA05

4B064CC03

4B064CD13

4B064DA10

(57)【要約】

本発明は、フェニルアラニンの添加により食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を高める方法であって、微生物発酵分野に属する。本方法は、食用・薬用真菌の液体発酵培養過程において一定量のフェニルアラニンを外部から添加することで、食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を４０％向上させ、食用・薬用真菌多糖を効率よく安定的に合成できるものであり、食用・薬用真菌多糖の収量の高める研究のために新たな方向を提供し、さらに工業的生産・応用にも有利である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

真菌発酵の初期又は発酵中にフェニルアラニンを添加することを特徴とする真菌細胞外多糖の収量を高める方法。

【請求項2】

前記真菌は食用・薬用真菌であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記真菌は、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）、アギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆｅｒｕｌａｅ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉrｓｕｔｕｓ）又はスエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

フェニルアラニンの最終濃度が０．０５〜３．５ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

フェニルアラニンは発酵の０〜９６ｈで添加されることを特徴とする請求項４に記載の方法。

【請求項6】

フェニルアラニンはバッチ添加又は連続流加により添加されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

真菌を発酵培地に接種して発酵を行い、発酵の０〜９６時間で発酵培地にフェニルアラニンを添加することを特徴とする食用・薬用真菌の細胞外多糖の製造方法。

【請求項8】

真菌発酵の初期又は発酵中に、フェニルアラニンを最終濃度が０．０５〜３．５ｇ／Ｌとなるように発酵培地に添加し、２５〜３３℃、１５０〜２００ｒ・ｍｉｎ^−１で５〜７日間、発酵させることを特徴とする請求項７に記載の方法。

【請求項9】

３〜６ｇの菌糸体湿重量／Ｌ培地の接種量で食用・薬用真菌を接種することを特徴とする請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

細胞外多糖を含む製品を製造するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フェニルアラニンの添加により食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を高める方法に関し、微生物発酵分野に属する。

【背景技術】

【0002】

食用菌は重要な食料源の１つであり、多種のビタミン、ミネラルおよび食物繊維に富み、高タンパク質、低脂肪、低カロリーで、老若に適している食品であり、また、２１世紀の人類食料ではめったにないグリーンフードでもある。食用・薬用真菌に含まれる真菌多糖、ポリペプチド類及びその他の極めて豊富な生物活性成分には、抗腫瘍、血中脂質低下、生体の免疫調節、心臓・脳血管保護など、さまざまな薬用価値がある。たとえば、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）は、優れた栄養機能及び薬用価値を備えた貴重な食用・薬用真菌である。霊芝多糖は霊芝の主要な生物活性物質の一つであり、免疫調節、抗腫瘍、抗酸化、血糖低下、肝臓保護などの活性を有する。これらの生物活性は、霊芝多糖が食品、医薬及び化粧品の分野に巨大な応用可能性を有することになる。

【0003】

現在、液体深部発酵技術による食用・薬用真菌の培養は、食用・薬用の真菌多糖を得るための主な発酵方式となっており、固相発酵に比べて発酵サイクルが短く、抽出コストが低くなるものの、多糖の収量は比較的低く、食用・薬用真菌多糖の発酵収量を如何に大幅に増加させて製造コストをさらに低減し、上記分野での幅広い用途を達成することは、食用・薬用真菌の液体発酵において解決すべき急務となっている。

【発明の概要】

【0004】

本発明の第１目的は、真菌発酵の初期又は発酵中にフェニルアラニンを添加する真菌細胞外多糖の収量を高める方法を提供することである。

【0005】

本発明の一実施形態では、前記真菌は食用・薬用真菌である。

【0006】

本発明の一実施形態では、前記食用・薬用真菌には、霊芝、キクラゲ、シイタケ、チョレイマイタケ、シロキクラゲ、マイタケ、マツホド、カワラタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草及び通常の生物分類学的に近縁種である又は形質が近い食用・薬用真菌の子実体又は菌糸体が含まれるが、これらに制限されない。

【0007】

本発明の一実施形態では、前記真菌には、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）、アギタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｆｅｒｕｌａｅ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｈｉｓｕｔｕｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍｃｏｍｍｕｎｅ）が含まれるが、これらに制限されない。

【0008】

本発明の一実施形態では、前記方法において、発酵の０〜９６ｈでフェニルアラニンを添加する。

【0009】

本発明の一実施形態では、前記フェニルアラニンの最終濃度が０．０５〜３．５ｇ／Ｌである。

【0010】

本発明の一実施形態では、前記方法では、真菌を発酵培地に接種して、発酵培地にフェニルアラニンを添加する。

【0011】

本発明の一実施形態では、発酵培地は、食用・薬用真菌によく使用される液体発酵培地である。

【0012】

本発明の一実施形態では、前記液体発酵培地１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、トリプトン５ｇ、アミノ酸不含酵母（ＹＮＢ）５ｇ、リン酸二水素カリウム４．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇが含まれ、この培地は自然ｐＨである。

【0013】

本発明の第２目的は、真菌細胞外多糖の製造方法を提供し、前記方法では、真菌を発酵培地に接種し、真菌発酵の初期又は発酵中に発酵培地へフェニルアラニンを添加し、２５〜３３℃、１５０〜２００ｒ・ｍｉｎ^−１で５〜７日間、発酵させる。

【0014】

本発明の一実施形態では、３〜６ｇ菌糸体湿重量／Ｌ培地の接種量で接種する。

【0015】

本発明は、細胞外多糖を含む製品を製造するための、前記方法の使用をさらに提供する。

【0016】

有益な効果は以下のとおりである。本発明では、発酵中にフェニルアラニンを添加することにより、元の発酵サイクルを延ばすことなく、食用・薬用真菌の細胞外多糖の収量を著しく増加させ、最大では４０％以上向上させ、食用・薬用真菌多糖の製造コストを大幅に低減させ、工業的生産や製品の応用に寄与する。

【発明を実施するための形態】

【0017】

多糖の抽出
発酵液のろ液を１００ｍＬ採取し、４倍の９５％アルコールを加え、２０ｍｉｎ撹拌して、４０００ｒ・ｍｉｎ^−１で５ｍｉｎ遠心分離し、タンパク質を除去して、上澄み液に２．２５倍の９５％アルコールを加え、２０ｍｉｎ撹拌後、４℃で一晩静置した。溶液を１００００ｒ・ｍｉｎ^−１で５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを除去して、沈殿に蒸留水３０ｍＬを加えて振とうして溶解させ、１００００ｒ・ｍｉｎ^−１で１０ｍｉｎ遠心分離し、透明液として水溶性多糖溶液を得た。
多糖の測定
多糖の含有量測定には、フェノール硫酸法が使用され、測定系は、サンプル溶液２ｍＬ、６％フェノール１ｍＬ、濃硫酸５ｍＬである。反応終了後、冷却し、その後、４９０ｎｍ波長でＯＤ値を測定した。

【0018】

実施例１
霊芝のシード培養
サイズ０．５ｃｍ^２の菌塊を採取し、シード培地の液体仕込み量が８０ｍＬ／２５０ｍＬの三角フラスコに接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
霊芝の発酵培養
５００ｍＬ三角フラスコに発酵培地１５０ｍＬを加え、１１５℃で２０分殺菌した。発酵培地に湿重量０．５ｇの霊芝菌糸体を接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
前記シード培地と発酵培地の配合は以下のとおりである。１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、トリプトン５ｇ、無アミノ基酵母（ＹＮＢ）５ｇ、リン酸二水素カリウム４．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇが含まれ、この培地は自然ｐＨである。
発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、７日間培養した霊芝多糖の収量は０．３２０ｇ／Ｌ発酵上澄み液であった。

【0019】

実施例２
０ｈに発酵培地へフェニルアラニンを培地中のフェニルアラニンの最終濃度が０．０５ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４００ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１よりも２５％向上した。

【0020】

実施例３
０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が３．５ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．３８４ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１よりも２０％向上した。

【0021】

実施例４
０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が１ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４３２ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１よりも３５％向上した。

【0022】

実施例５
４８ｈの発酵でフェニルアラニンをその最終濃度が２ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４４８ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１よりも４０％向上した。

【0023】

実施例６
９６ｈの発酵でフェニルアラニンをその最終濃度が１ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４１６ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１よりも３０％向上した。

【0024】

実施例７
霊芝のシード培養
サイズ０．５ｃｍ^２の菌塊を採取し、シード培地の液体仕込み量が８０ｍＬ／２５０ｍＬの三角フラスコに接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
霊芝の発酵培養
５００ｍＬの三角フラスコに発酵培地１５０ｍＬを加え、１１５℃で２０分殺菌した。発酵培地に湿重量０．５ｇの霊芝菌糸体を接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
前記シード培地と発酵培地の配合は以下のとおりである。１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ふすま１０ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇが含まれ、この培地は自然ｐＨである。
発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、７日間、発酵させたとき、霊芝多糖の収量は０．３６８ｇ／Ｌ発酵上澄み液であった。

【0025】

実施例８
０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が１ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例７と同様であった。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４４２ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例７よりも２０％向上した。

【0026】

実施例９
霊芝のシード培養
サイズ０．５ｃｍ^２の菌塊を採取し、シード培地の液体仕込み量が８０ｍＬ／２５０ｍＬの三角フラスコに接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
霊芝の発酵培養
５Ｌ発酵タンクに発酵培地３Ｌを加え、１１５℃で２０分殺菌した。湿重量１０ｇの霊芝菌糸体を接種し、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、通気量１．５Ｌ・ｍｉｎ^−１、３０℃で７日間、培養した。
前記シード培地と発酵培地の配合は以下のとおりである。１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、トウモロコシ粉１０ｇ、ふすま１０ｇ、リン酸二水素カリウム３ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇが含まれ、この培地は自然ｐＨである。
２４〜９６時間の発酵中には、濃度２０ｇ／Ｌのフェニルアラニンを連続流加して、７日間、発酵させ、合計１６０ｍＬ流加し、その最終濃度が１ｇ／Ｌとなるようにした。発酵中に、霊芝細胞外多糖の収量を測定した。その結果から明らかなように、霊芝多糖の収量は０．４７１ｇ／Ｌであり、実施例７よりも２８％向上した。

【0027】

実施例１０
アギタケのシード培養
サイズ０．５ｃｍ^２の菌塊を採取し、シード培地の液体仕込み量が８０ｍＬ／２５０ｍＬの三角フラスコに接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、２８℃で７日間、培養した。
アギタケの発酵培養
５００ｍＬの三角フラスコに発酵培地１５０ｍＬを加え、１１５℃で２０分殺菌した。発酵培地に湿重量０．５ｇの菌糸体を接種して、１５０ｒ・ｍｉｎ^−１、２８℃で７日間、培養した。
前記シード培地と発酵培地１の配合は以下のとおりである。１Ｌあたり、グルコース２０ｇ、トリプトン５ｇ、無アミノ基酵母（ＹＮＢ）５ｇ、リン酸二水素カリウム４．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物２ｇが含まれ、この培地は自然ｐＨである。
発酵中に、アギタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、アギタケ細胞外多糖の収量は０．２０１ｇ／Ｌ発酵上澄み液であった。

【0028】

実施例１１
０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が１ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１０と同様であった。発酵中に、アギタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、アギタケ細胞外多糖の収量は０．２６４ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１０よりも３１％向上した。

【0029】

実施例１２
実験菌株にはアラゲカワラタケが使用される以外、培地及び培養方法は実施例１０と同様であった。発酵中に、アラゲカワラタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、アラゲカワラタケ細胞外多糖の収量は０．２８０ｇ／Ｌ発酵上澄み液であった。

【0030】

実施例１３
実験菌株にはアラゲカワラタケが使用され、且つ、０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が２ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１０と同様であった。発酵中に、アラゲカワラタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、アラゲカワラタケ細胞外多糖の収量は０．３２２ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１２よりも１５％向上した。

【0031】

実施例１４
実験菌株にはスエヒロタケが使用される以外、培地及び培養方法は実施例１０と同様であった。発酵中に、スエヒロタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、スエヒロタケ細胞外多糖の収量は０．４５２ｇ／Ｌ発酵上澄み液であった。

【0032】

実施例１５
実験菌株にはスエヒロタケが使用され、且つ、０ｈに発酵培地へフェニルアラニンをその最終濃度が３ｇ／Ｌとなるように添加する以外、培地及び培養方法は実施例１０と同様であった。発酵中に、スエヒロタケ細胞外多糖の収量を測定し、その結果から明らかなように、スエヒロタケ細胞外多糖の収量は０．５６３ｇ／Ｌ発酵上澄み液であり、実施例１４よりも２５％向上した。

【0033】

実施例１６
実施例１〜１５と同様な方策によって、キクラゲ、シイタケ、チョレイマイタケ、シロキクラゲ、マツホド、カワラタケ、ヤマブシタケ、冬虫夏草などの食用・薬用真菌の発酵中にフェニルアラニンをそれぞれ添加し、その結果から明らかなように、細胞外多糖の収量は、異なる程度の向上を有する。
比較例１
発酵液にアミノ酸を最終濃度が１ｇ／Ｌとなるようにそれぞれ添加する以外、実施例１と同様にして、細胞外多糖の収量を測定し、結果を下記表1に示した。本比較例では、実施例1と比較して、添加したアミノ酸をトリプトファン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、イソロイシン、プロリン、バリンに変えた。

【0034】

本願に記載の食用・薬用真菌は、今のところ知られている細胞外多糖を産生するための食用・薬用真菌に限定されず、既知の食用・薬用真菌に類似性のある既知又は未知の属種の真菌は、いずれも本願の方法に適用でき、細胞外多糖の収量向上には類似した効果を達成することができる。

【0035】

以上、本発明を好適な実施例により開示したが、これらは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の趣旨及びその範囲から逸脱することなく、様々な変更や修飾を行うことができるため、本発明の特許範囲は、特許請求の範囲によって定められるものとする。

【国際調査報告】