特表 2021-513544 コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-513544(P2021-513544A)

(43)【公表日】2021年5月27日

(54)【発明の名称】コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/16 20060101AFI20210430BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20210430BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/18 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 38/30 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210430BHJP

   C12N 15/18 20060101ALN20210430BHJP

【ＦＩ】

   A61K9/16

   A61K47/04

   A61K47/06

   A61K47/44

   A61K47/24

   A61K47/28

   A61K47/26

   A61K47/18

   A61K38/30

   A61K38/22

   A61K48/00

   A61P1/16

   A61P9/00

   A61P25/00

   A61P13/12

   A61P3/04

   A61P19/08

   A61P29/00

   A61P1/00

   A61P3/10

   A61P27/02

   C12N15/18ZNA

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2020-543153(P2020-543153)

(86)(22)【出願日】2019年2月12日

(85)【翻訳文提出日】2020年9月14日

(86)【国際出願番号】KR2019001708

(87)【国際公開番号】WO2019156540

(87)【国際公開日】20190815

(31)【優先権主張番号】10-2018-0017075

(32)【優先日】2018年2月12日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0014955

(32)【優先日】2019年2月8日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】520200609

【氏名又は名称】ジーアンドピー バイオサイエンス カンパニー，リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】520200610

【氏名又は名称】レヨン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ホ，ソン−ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ス ジン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076BB11

4C076CC09

4C076DD21

4C076DD35

4C076DD49

4C076DD52

4C076DD63

4C076DD69

4C076DD70

4C076EE51

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DB52

4C084DB58

4C084DB62

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA331

4C084ZA332

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA661

4C084ZA662

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZA751

4C084ZA752

4C084ZA811

4C084ZA812

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZC211

4C084ZC212

4C084ZC351

4C084ZC352

(57)【要約】

【課題】本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物に関する。
【解決手段】本発明の成長因子遺伝子発現増加用組成物は、遺伝子と共に生体に投与される場合、共に投与される遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。特に、前記組成物は、本発明に適したヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子、又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ−１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子と共に投与される場合は、前記遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。前記組成物は、遺伝子治療剤と共に投与する場合、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができるので有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物であって、
前記コアは、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、
前記成長因子遺伝子は、ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；であることを特徴とする成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項2】

前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びその混合物から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項3】

前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロ化炭化水素であることを特徴とする、請求項１に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項4】

前記ペルフルオロ化炭化水素は、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物であることを特徴とする、請求項３に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項5】

前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項6】

前記リン脂質は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項7】

前記グリセロ糖脂質は、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド及びグリコシルジグリセリドからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項8】

前記スフィンゴ糖脂質は、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド又はガングリオシドであることを特徴とする、請求項５に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項9】

前記陽イオン脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）及び３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項10】

前記組成物は、成長因子遺伝子の発現量を３０％以上増加させることを特徴とする、請求項１に記載の成長因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項11】

請求項１の組成物；及びヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含む虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項12】

前記ヒト肝細胞成長因子遺伝子は序列番号２の塩基序列からなることを特徴とする、請求項１１に記載の虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項13】

前記ヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子は、序列番号３〜序列番号６の塩基序列から選ばれるいずれか一つからなることを特徴とする、請求項１１に記載の虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項14】

請求項１の組成物；及びヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含む、ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項15】

前記ヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子は、序列番号７の塩基序列からなることを特徴とする、請求項１４に記載のＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項16】

前記症状又は疾患は、低身長、肥満、体重減少、悪液質、食慾不振、神経退行性障害、線維症−関連症状、軟骨障害、骨疾患、炎症障害、腸障害、インスリン耐性、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、ラブソン・メンデンホール症侯群（Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、網膜症、末端肥大症（ａｃｒｏｍｅｇａｌｙ）、線維筋性異形成症（ｆｉｂｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）及び心臓障害からなる群から選ばれた１種であることを特徴とする、請求項１４に記載の薬学組成物。

【請求項17】

前記低身長に対する治療が要求される個体は、インスリン類似成長因子−１欠乏症（ＩＧＦＤ）を有しているヒト小児個体であって、前記組成物は、ヒト小児個体でＩＧＦＤの治療に有効であることを特徴とする、請求項１６に記載の薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）は、中胚葉起源の各細胞から分泌されて多くの細胞に作用し、対象細胞及び環境によって多様な機能を行う（Ｓｔｅｌｌａ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｃｏｍｏｇｌｉｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３１：１３５７−１３６２（１９９９））。それらの機能を要約すると、第一、上皮細胞の細胞分裂を促進し、細胞の運動性を促進しながら基質（ｍａｔｒｉｘ）の浸透能力を増進するが、これらの各機能は、結果的に、上皮細胞が細尿管構造（ｔｕｂｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成することを誘導する。第二、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）のいずれにおいても内皮細胞による血管新生を促進する。第三、抗−細胞自滅（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）活性を有しており、肝及び腎臓の再生と連関している。第四、発生過程中には、腎臓、卵巣、精巣の機関形成に関与する。第五、破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）及び造骨細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の機能を調節し、骨の生成過程を調節する。第六、赤血球造血前駆細胞（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）の成長及び分化を促進する。第七、神経の軸索発生（ａｘｏｎ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）に関与する。これらの多様な機能に基づいて、肝細胞成長因子は、多様な疾患、例えば、虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患及び肝疾患に対する治療剤として開発され得る。

【0003】

また、ヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）は、インスリン類似活性及びミトゲン性生物学的成長活性を有している７０個のアミノ酸からなるポリペプチドホルモンである。このようなホルモンは、筋骨格系、肝、腎臓、腸、神経系組織、心臓及び肺などの多様な組織で細胞成長を強化させる。

【0004】

当該技術分野の当業者によく知られているように、ＩＧＦ１の公知の潜在的な用途は、多様且つ多い方である。例えば、神経退行性症状を治療するための潜在的な治療剤としてのＩＧＦ１の用途に対して多くの研究が報告されている。例えば、Ｋａｎｊｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，４８６：３９６−３９８（１９８９）；Ｈａｎｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１２９：１２２−１２６（１９９５）；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２７４：１４４３−１４９９（１９９５）；Ｄｉ Ｇｉｕｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２２：１９６０（１９９６）；Ｄｉ Ｇｉｕｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２３：８９４（１９９７）；Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，６０（２）：１４２−１４８（１９９７）；Ｇｏｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，８２：１０２９−１０３７（１９９８）を参照する。ＩＧＦ１療法は、ＡＬＳ、脳卒中、癲癇、パーキンソン疾患、アルツハイマー疾患、急性外傷性傷害及び外傷、老化、疾患又は傷害と関連するその他の障害などの数多くの神経症状に対して処方されている。例えば、米国登録特許第５，０９３，１３７号、第５，６５２，２１４号及び第５，７０３，０４５号；国際公開特許第１９９０−００１４８３号及び第１９９３−００２６９５号を参照する。

【0005】

他の多様な症状に対するＩＧＦ１療法の使用に対しては、多数の公開文献に言及されている。例えば、Ｓｃｈａｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ｉ（ｒｈＩＧＦ−１） ｉｎ ｔｙｐｅ ＩＩ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ」．Ｍｏｄｅｒｎ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓｐｅｎｃｅｒ，ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．ｐｐ．７０５−７１４（１９９１）；Ｃｌｅｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，７９（１）：４−６（１９９４）；及びＬａｎｇｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２３（９）：５０３−５１６（１９９３）（例えば、インスリン−耐性状態及び糖尿病が言及される）；Ｏ’ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２６４：Ｆ９１７−Ｆ９２２（１９９３）（例えば、腎臓機能の減少が言及される）を参照する。また、米国登録特許第７，２５８，８６４号（例えば、低身長が言及される）；米国登録特許第５，１１０，６０４号及び第５，４２７，７７８号（例えば、傷の治癒が言及される）；米国登録特許第５，１２６，３２４号（例えば、心臓障害及び成長遅延が言及される）；米国登録特許第５，３６８，８５８号（例えば、軟骨欠陥又は傷害が言及される）；米国登録特許第５，５４３，４４１号及び第５，５５０，１８８号（例えば、組織増大が言及される）；米国登録特許第５，６８６，４２５号（例えば、瘢痕組織、局所筋肉機能不全及び尿失禁が言及される）；及び米国登録特許第５，６５６，５９８号（例えば、骨の成長が言及される）を参照する。また、国際公開特許第１９９１−０１２０１８号（例えば、腸の障害が言及される）；国際公開特許第１９９２−００９３０１号及び国際公開特許第１９９２−０１４４８０号（例えば、傷の治癒が言及される）；国際公開特許第１９９３−００８８２８号（例えば、虚血症、低酸素症又は神経退行と関連した神経損傷が言及される）；国際公開特許第１９９４−０１６７２２号（例えば、インスリン耐性が言及される）；国際公開特許第１９９６−００２５６５号（例えば、骨形成の促進及び骨リモデリングの調節のためのＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ複合体が言及される）；米国公開特許第２００３−０１００５０５号（例えば、骨粗鬆症が言及される）；及び米国公開特許第２００５−００４３２４０号（例えば、肥満が言及される）を参照する。

【0006】

本発明の発明者等は、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができる遺伝子治療剤を開発するために研究した結果、コアがハロゲン化炭化水素及び／又はハロゲン化硫黄で、外郭シェルが脂質成分で構成されたコア−シェル構造のマイクロ粒子が前記ＨＧＦ又はＩＧＦ１などの遺伝子と共に生体内に投与される場合、成長因子遺伝子の発現量を著しく増加させることを具体的に確認し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明が解決しようとする第一の課題は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物を提供することにある。
本発明が解決しようとする第二の課題は、前記組成物を含む虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。
本発明が解決しようとする第三の課題は、前記組成物を含む、ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記のような目的を達成するために、本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物であって、前記コアは、生体適合性基体としてハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、前記成長因子遺伝子は、ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；であることを特徴とする成長因子遺伝子発現増加用組成物を提供する。

【0010】

本発明の一実施例において、前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びその混合物から選ばれ得る。

【0011】

本発明の一実施例において、前記ハロゲン化炭化水素は、ペルフルオロ化炭化水素であり得る。

【0012】

本発明の一実施例において、前記ペルフルオロ化炭化水素は、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物であり得る。

【0013】

本発明の一実施例において、前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であり得る。

【0014】

本発明の一実施例において、前記リン脂質は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質からなる群から選ばれたものであり得る。

【0015】

本発明の一実施例において、前記グリセロ糖脂質は、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド及びグリコシルジグリセリドからなる群から選ばれたものであり得る。
本発明の一実施例において、前記スフィンゴ糖脂質は、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド又はガングリオシドであり得る。

【0016】

本発明の一実施例において、前記陽イオン脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）及び３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）からなる群から選ばれたものであり得る。

【0017】

本発明の一実施例において、前記ヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子は、序列番号３〜序列番号６の塩基序列から選ばれるいずれか一つからなるものであり得る。
本発明の一実施例において、前記組成物は、成長因子遺伝子の発現量を３０％以上増加させ得る。

【0018】

また、本発明は、前記組成物；及びヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含む虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

【0019】

前記虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物において、前記ヒト肝細胞成長因子遺伝子は、序列番号２の塩基序列からなるものであって、前記ヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子は、序列番号３〜序列番号６の塩基序列から選ばれるいずれか一つからなるものであり得る。
また、本発明は、前記組成物；及びヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含む、ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

【0020】

前記ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物において、前記ヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子は、序列番号７の塩基序列からなるものであり得る。

【0021】

本発明の一実施例において、前記症状又は疾患は、低身長、肥満、体重減少、悪液質、食慾不振、神経退行性障害、線維症−関連症状、軟骨障害、骨疾患、炎症障害、腸障害、インスリン耐性、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、ラブソン・メンデンホール症侯群（Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、網膜症、末端肥大症（ａｃｒｏｍｅｇａｌｙ）、線維筋性異形成症（ｆｉｂｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）及び心臓障害からなる群から選ばれた１種であり得る。

【0022】

本発明の一実施例において、前記低身長に対する治療が要求される個体は、インスリン類似成長因子−１欠乏症（ＩＧＦＤ）を有しているヒト小児個体であって、前記組成物は、ヒト小児個体でＩＧＦＤの治療に有効なものであり得る。

【発明の効果】

【0023】

本発明の成長因子遺伝子発現増加用組成物は、遺伝子（例えば、遺伝子を暗号化するポリヌクレオチド又はこれを含むベクター）と共に生体に投与される場合、成長因子遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。

【0024】

特に、前記組成物は、本発明に適したヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；と共に投与される場合は、前記成長因子遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。

【0025】

前記組成物は、遺伝子治療剤と共に投与する場合、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができるので有用である。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】本発明の一実施例に係るｐＧＰベクターの開裂地図を示した図である。

【図2】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＨＧＦ（遺伝子のみ）、対照群の薬学組成物（ＨＧＦ−ＪｅｔＰＥＩ）及び実施例１に係る薬学組成物（ＨＧＦ−ＭＰ１、ＨＧＦ−ＭＰ２及びＨＧＦ−ＭＰ３）の投与によるＨＧＦタンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図3】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＨＧＦＸ７（遺伝子のみ）、対照群の薬学組成物（ＨＧＦＸ７−ＪｅｔＰＥＩ）及び実施例２に係る薬学組成物（ＨＧＦＸ７−ＭＰ１及びＨＧＦＸ７−ＭＰ２）の投与によるＨＧＦタンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図4】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＩＧＦ１（遺伝子のみ）、対照群の薬学組成物（ＩＧＦ１−ＪｅｔＰＥＩ）及び実施例３に係る薬学組成物（ＩＧＦ１−ＭＰ１、ＩＧＦ１−ＭＰ２及びＩＧＦ１−ＭＰ３）の投与によるＩＧＦ１タンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図5】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＶＥＧＦ（遺伝子のみ）、対照群の薬学組成物（ＶＥＧＦ−ＪｅｔＰＥＩ）及び比較例１に係る薬学組成物（ＶＥＧＦ−ＭＰ１及びＶＥＧＦ−ＭＰ２）の投与によるＶＥＧＦタンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図6】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＦＧＦ１（遺伝子のみ）及び比較例２に係る薬学組成物（ＦＧＦ１−ＭＰ１及びＦＧＦ１−ＭＰ２）の投与によるＦＧＦ１タンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図7】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＦＧＦ４（遺伝子のみ）及び比較例３に係る薬学組成物（ＦＧＦ４−ＭＰ１及びＦＧＦ４−ＭＰ２）の投与によるＦＧＦ４タンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図8】マウスにおいて、ｐＧＰ−ＰＤＧＦ−Ｂ（遺伝子のみ）及び比較例４に係る薬学組成物（ＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ１及びＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ２）の投与によるＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図9】糖尿病で誘発された末梢神経障害（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）ラットモデルに本発明の実施例２（ＨＧＦＸ７−ＭＰ２）の組成物を投与し、２週経過後にＰＷＴ値が著しく上昇することを示すグラフである。

【図10】慢性絞扼損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ）手術によって誘発された神経障害（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）ラットモデルにおいて、実施例１（ＨＧＦ１−ＭＰ２）の組成物を投与し、２週経過後にＰＷＴ値が著しく上昇することを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0028】

本発明の一側面によると、本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む成長因子遺伝子発現増加用組成物であって、前記コアは、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、前記成長因子遺伝子は、ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；であることを特徴とする成長因子遺伝子発現増加用組成物を提供する。

【0029】

＜コア＞
本発明の明細書において、前記「コア」は、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物からなり得る。

【0030】

前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、又はその混合物であり得る。

【0031】

前記ハロゲン化炭化水素は、ペルフルオロ化炭化水素であることが好ましい。

【0032】

前記ペルフルオロ化炭化水素としては、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物を挙げることができる。

【0033】

本発明の生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄又はペルフルオロブタンであることが好ましい。

【0034】

＜シェル＞
本発明の明細書において、前記「シェル」は、脂質又はその誘導体を含む成分で構成され得る。

【0035】

前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であり得るが、特にリン脂質であることが好ましい。

【0036】

前記リン脂質としては、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質などを挙げることができる。

【0037】

前記グリセロ糖脂質としては、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどを挙げることができる。

【0038】

前記スフィンゴ糖脂質としては、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどを挙げることができる。

【0039】

また、前記陽イオン脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）などを挙げることができる。

【0040】

＜マイクロ粒子＞
本発明のマイクロ粒子は、コアである基体を取り囲むシェルによって安定化され、基体の周囲液体への拡散を遅延させ、その結果、マイクロ粒子間の融合を防止する。
前記マイクロ粒子は、生体内に投入される場合、標的細胞又は組織付近に到着するまでは形状を維持しているが、標的細胞又は組織付近で破壊されながら気体を噴射するようになる。このとき、噴射される気体は標的細胞の細胞膜に変化を起こし、気体の噴射力は、成長因子遺伝子が標的細胞の細胞質環境中に進入できるように促進する役割をすることができる。

【0041】

前記マイクロ粒子は、平均直径が１μｍ〜１０μｍ、好ましくは２μｍ〜８μｍ、さらに好ましくは２μｍ〜４μｍである。

【0042】

＜遺伝子発現増加用組成物＞
最近、基体をコアとするコア−シェルマイクロ粒子と関連して多様な研究がなされてきた。既存の各研究では、マイクロ粒子と共に超音波を照射しないと遺伝子発現増加効果が表れなかった。

【0043】

具体的に、Ｓａｎｇ−Ｃｈｏｌ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊ ２００６；３６：３２−３８；「低周波超音波を用いた微細気泡の破壊を通じた筋肉組織への遺伝子伝達増強に対する研究」には、超音波の照射なしでルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子−マイクロ粒子混合物のみを注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。
ＺＰ Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１１４７−１１５５；「Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｖｉａ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」には、超音波の照射しでルシフェラーゼ遺伝子−マイクロ粒子混合物のみを注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。

【0044】

また、Ｘｉｎｇｓｈｅｎｇ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ ２００８；２７：４５３−４６０；「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ」には、超音波の照射なしでＨＧＦ遺伝子−リポソームマイクロ粒子混合物を注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。

【0045】

しかし、本発明者等は、マイクロ粒子の用途に対して研究した結果、本発明に係るマイクロ粒子をＨＧＦ又はＩＧＦ遺伝子と共に注入する場合は、特異的に超音波の照射なしでも遺伝子の発現量を著しく増加させることを確認し、本発明を完成するに至った。一方、下記の実験例で具体的に示したように、前記ＨＧＦ及びＩＧＦ１以外の成長因子系列の他の遺伝子では、前記マイクロ粒子による遺伝子発現量の増加効果が表れなかった。

【0046】

本発明に係る成長因子遺伝子発現増加用組成物は、遺伝子と共に生体に投与される場合、成長因子遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。

【0047】

特に、本発明に係る成長因子遺伝子発現増加用組成物は、本発明に適したヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子、又はヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子と共に投与される場合は、前記遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上、好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、最も好ましくは１００％以上増加させ得る。

【0048】

下記の実施例において、本発明の遺伝子発現増加用組成物は、ＨＧＦ、ＨＧＦＸ７又はＩＧＦ１遺伝子と共にマウスに投与する場合、前記ＨＧＦ、ＨＧＦＸ７又はＩＧＦ１遺伝子の発現量を著しく増加させることを確認した。さらに具体的には、ＨＧＦは４５％以上、ＨＧＦＸ７は１２０％以上、ＩＧＦ１は３５％以上発現量を増加させることを確認した。一方、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ４又はＰＤＧＦ−Ｂの場合は、本発明の遺伝子発現増加用組成物と共にマウスに投与したとしても遺伝子発現増加率が有意に増加しないことを確認した。具体的には、ＶＥＧＦは最大１６％、ＦＧＦ４は最大１４％、ＰＤＧＦ−Ｂは最大４％程度にのみ発現量が増加し、ＦＧＦ１の場合は、むしろ発現量が４０％以上減少した。

【0049】

すなわち、本発明の遺伝子発現増加用組成物は、成長因子遺伝子のうちヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、その異型体及びその変異体から選ばれる１種以上の遺伝子；又はヒト１型インスリン類似成長因子（ＩＧＦ１）、その異型体及びその変異体から選ばれる１種以上の遺伝子；と共に投与される場合にのみ特異的に遺伝子の発現量を増加させる効果を有すると判断される。

【0050】

前記組成物は、安定化剤、緩衝剤、浸透圧の調節のための塩、賦形剤、防腐剤などの薬剤学的補助剤又はその他の治療的に有用な物質をさらに含有することができ、通常の方法によって多様な経口又は非経口の形態に剤形化できるが、非経口の形態であることが好ましい。代表的な非経口投与用剤形は、注射用剤形として等張性水溶液又は懸濁液であることが好ましい。又は、前記組成物を粉末化した後、投与直前に溶剤と共に懸濁して使用することもできる。

【0051】

本発明の遺伝子発現増加用組成物において、前記マイクロ粒子の含量は、特に制限されないが、０．５μｌ／ｍｌ〜２，０００μｌ／ｍｌ、好ましくは１μｌ／ｍｌ〜１，０００μｌ／ｍｌであってもよく、５μｇ／ｍｌ〜２，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌであってもよい。

【0052】

前記マイクロ粒子の含量が前記範囲を逸脱する場合は、期待する効果を得ることができない。

【0053】

そして、前記組成物は、遺伝子と混合された混合液の形態で投与されることが効果の面で好ましい。

【0054】

＜遺伝子＞
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、下記の各遺伝子と共に投与される場合、前記遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0055】

〔ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）遺伝子〕
ヒト肝細胞成長因子遺伝子は、序列番号２の塩基序列からなるものであり得る。ヒト肝細胞成長因子遺伝子は、遺伝子治療剤の形態に開発されてもよく、タンパク質治療剤の形態に開発されてもよい。

【0056】

〔ヒト肝細胞成長因子の異型体〕
本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ）」は、全ての対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む、動物で自然に生成される（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＨＧＦアミノ酸序列と少なくとも８０％同じアミノ酸序列を有するＨＧＦポリペプチドを意味する。例えば、ＨＧＦ異型体は、ＨＧＦの正常型（ｎｏｒｍａｌ ｆｏｒｍ）又は野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、そして、ＨＧＦの多様な変異体（例えば、スプライシング変異体及び欠損変異体）を全て包括する意味を有する。

【0057】

〔ヒト肝細胞成長因子の変異体〕
本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の変異体」は、ＨＧＦの二つの異型体（ＨＧＦ及びｄＨＧＦ）を全て発現できるハイブリッドＨＧＦ遺伝子であり得る（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参照）。具体的に、前記「ハイブリッドＨＧＦ遺伝子」は、ＨＧＦ ｃＤＮＡのエクソン４とエクソン５との間にヒトＨＧＦ遺伝子のイントロン４又はその断片序列が挿入された、遺伝子発現効率が高く、ＨＧＦ及びｄＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｖａｒｉｅｎｔ ｏｆ ＨＧＦ）の二つの異型体を同時に発現するハイブリッドＨＧＦ遺伝子（序列番号３〜序列番号５）を意味する。
本発明の遺伝子治療剤の戦略によると、ＨＧＦの２種類以上の異型体を暗号化する一つ以上のヌクレオチド序列を用いることが治療効果の面で好ましい。２種類以上のＨＧＦ異型体−暗号化ヌクレオチド序列には、一つのポリヌクレオチドが提供されてもよく、別途のポリヌクレオチドが提供されてもよい。

【0058】

また、本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の変異体」は、ＨＧＦＸ６（序列番号３）（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参照）であり得る。

【0059】

また、本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の変異体」は、ＨＧＦＸ７（序列番号４）（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参照）であり得る。

【0060】

また、本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の変異体」は、ＨＧＦＸ８（序列番号５）（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参照）であり得る。

【0061】

また、本明細書において、「ヒト肝細胞成長因子の変異体」は、欠損された変異型ＨＧＦ（ｄｅｌｅｔｅｄ ｖａｒｉｅｎｔ ｏｆ ＨＧＦ；ｄＨＧＦ）（序列番号６）（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参照）であり得る。本明細書で使用される「ｄＨＧＦ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物でＨＧＦ遺伝子の選択的スプライシングによって生成されるＨＧＦタンパク質の欠損された変異体、より好ましくは全長ＨＧＦ序列（７２８個のアミノ酸）からα鎖の１番目のクリングルドメインで５個のアミノ酸（Ｆ、Ｌ、Ｐ、Ｓ及びＳ）が欠損された７２３個のアミノ酸からなるヒトＨＧＦを称する。

【0062】

〔ヒト１型インスリン類似成長因子（ＩＧＦ１）遺伝子〕
ヒトインスリン類似成長因子遺伝子、特に、ヒト１型インスリン類似成長因子（ＩＧＦ１）遺伝子は、序列番号７の塩基序列からなるものであり得る。ヒトインスリン類似成長因子遺伝子は、タンパク質形態の治療剤に開発されてもよく、遺伝子治療剤の形態に開発されてもよい。

【0063】

ＩＧＦ１は、主に、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）による刺激の結果として肝によって分泌される。人体のほぼ全ての細胞、特に、筋肉、軟骨、骨、肝、腎臓、神経、皮膚及び肺内の細胞はＩＧＦ１によって影響を受ける。前記ＩＧＦ１は、インスリン−類似効果のみならず、細胞成長調節効果を有する。

【0064】

〔ヒト１型インスリン類似成長因子の異型体〕
本明細書で使用される「ＩＧＦ１異型体（ｉｓｏｆｏｒｍ）」という用語は、全ての対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む、動物で自然に生成される（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ＩＧＦ１アミノ酸序列と少なくとも８０％同じアミノ酸序列を有するＩＧＦ１ポリペプチドを意味する。例えば、ＩＧＦ１異型体は、ＩＧＦ１の正常型（ｎｏｒｍａｌ ｆｏｒｍ）又は野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、そして、ＩＧＦ１の多様な変異体（例えば、スプライシング変異体、欠損変異体、置換変異体）を全て包括する意味を有する。

【0065】

ＩＧＦ１異型体の具体的な例としては、ＩＧＦ１ Ｅａ、ＩＧＦ１ Ｅｂ、ＩＧＦ１ Ｅｃなどがある。

【0066】

〔ヒト１型インスリン類似成長因子の変異体〕
本明細書において、「ＩＧＦ１変異体」は、欠損された変異型ＩＧＦ１（ｄｅｌｅｔｅｄ ｖａｒｉｅｎｔ ｏｆ ＩＧＦ１；ｄＩＧＦ１）又は特定位置のアミノ酸が置換された変異型ＩＧＦ１であり得る。本明細書で使用される「ｄＩＧＦ１」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物でＩＧＦ１遺伝子の選択的スプライシングによって生成されるＩＧＦ１タンパク質の欠損された変異体を称する。また、置換された変異型ＩＧＦ１の具体的な例として、「ＩＧＦ１変異体」は、位置４２のアミノ酸グリシンがセリンによって置換されたポリペプチドであり得る。又は、具体的な他の例として、「ＩＧＦ１変異体」は、ＩＧＦ１タンパク質のアミノ酸Ｇ１、Ｐ２、Ｅ３、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｋ６８、Ｓ６９及び／又はＡ７０に突然変異があるポリペプチドであり得る。

【0067】

〔プラスミド〕
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、前記遺伝子を暗号化する単一鎖ポリヌクレオチドを含む各プラスミドと共に投与される場合、遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0068】

本明細書において、「プラスミド」という用語は、一般に、外来遺伝子が宿主細胞で発現できるようにベクターに作動的に連結されて形成された環状のＤＮＡ分子を言う。しかし、プラスミドは、目的とする遺伝子を含むように遺伝子組換えによって特定の制限酵素によって分解され、新しい遺伝子を導入するベクターとして使用され得る。よって、本願では、プラスミドとベクターは相互交換的に使用され、遺伝工学分野で通常の知識を有する者であれば、それらの名称を区分しないとしても、その意味を十分に理解するだろう。

【0069】

本明細書において、「ベクター」という用語は、外来遺伝子を宿主細胞内に安定的に運搬できる運搬体としてのＤＮＡ分子を言う。有用なベクターになるためには複製されるべきであり、宿主細胞内に流入し得る方案を備えるべきで、自分の存在を検出できる手段を備えるべきである。

【0070】

＜発現＞
〔発現ベクター〕
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、前記遺伝子を暗号化する単一鎖ポリヌクレオチドを含む各発現ベクターと共に投与される場合、遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0071】

本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、細胞での前記遺伝子の生成を意味する。

【0072】

本明細書において、「発現ベクター」という用語は、適当な宿主で前記遺伝子を発現できるベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子コンストラクトを言う。

【0073】

本明細書において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一般的な機能を行うように核酸発現調節序列と前記遺伝子を暗号化するポリヌクレオチドとが機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを意味する。例えば、プロモーターと前記遺伝子を暗号化するポリヌクレオチドとが作動可能に連結され、前記ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を用いて行うことができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られている酵素などを用いて行う。

【0074】

本発明の発現ベクターは、プラスミド、ベクター又はウイルスベクターを用いて製作されるが、これに限定されることはない。適切な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節エレメントなどを含むことができ、目的に応じて多様に製造可能であり、ベクターのプロモーターは構成的又は誘導性であり得る。現在、プラスミドがベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は時々相互交換的に使用される。本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりに数個から数百個のプラスミドベクターを含むように複製を効率的に行わせる複製開始点、及び（ｂ）外来ＤＮＡ切片が挿入され得る制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しないとしても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡとを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。

【0075】

本発明に係る遺伝子の過剰発現のために使用されるベクターは、当業界で公知となった発現ベクターであり得る。本発明の骨格ベクターとしては、特に制限されることはないが、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＧＰ、ｐＥＦ、ｐＶＡＸ、ｐＵＤＫ、ｐＣＫ、ｐＱＥ４０、ｐＴ７、ｐＥＴ／Ｒｂ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）及びｐＧＥＸからなる群から選ばれる多様なベクターを使用することができ、ｐＧＰ、ｐＣＫ、ｐＵＤＫ及びｐＶＡＸからなる群から選ばれる一つのベクターを用いることが効果の面で好ましい。

【0076】

好ましい具体例において、本発明の発現ベクターは、図１の開裂地図を有するｐＧＰベクターを含む発現ベクターであり得る。

【0077】

＜薬学組成物＞
また、本発明は、前記遺伝子発現増加用組成物；及び前記ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含むことを特徴とする虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。前記虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療用薬学組成物は、少量のヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ）遺伝子、ヒト肝細胞成長因子の異型体遺伝子又はその変異体遺伝子によっても体内で前記遺伝子の発現が増加することによって優れた治療効果を示すので、虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患の予防又は治療に有用に利用可能である。

【0078】

前記ヒト肝細胞成長因子遺伝子は、序列番号２の塩基序列からなるものであって、前記ヒト肝細胞成長因子遺伝子の変異体は、序列番号３〜序列番号６の塩基序列から選ばれるいずれか一つからなるものであり得る。

【0079】

前記「虚血性疾患」は、虚血性脳血管疾患、虚血性心臓疾患、虚血性心筋梗塞、糖尿病性血管心臓疾患、虚血性心不全、虚血性血管疾患、閉塞性動脈硬化症、心筋肥大症、虚血性網膜症、虚血性下肢疾患、虚血性大腸炎、虚血性急性腎不全症、虚血性肺疾患、虚血性脳卒中、虚血性怪死、脳外傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、新生児低酸素症、緑内障及び糖尿病性神経病症からなる群から選ばれるものであり得る。

【0080】

前記「神経疾患」は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｃｈｏｒｅａ）、脊髓小脳変性症、脊髓損傷、脳梗塞、脳虚血及び多発性硬化症からなる群から選ばれる中樞神経疾患であり得る。

【0081】

前記「腎臓疾患」は、急性腎不全又は慢性腎不全であり得る。

【0082】

前記「肝疾患」は、肝虚血、脂肪肝、肝炎症、肝癌、肝線維化又は肝硬変症であり得る。

【0083】

また、本発明は、前記遺伝子発現増加用組成物；及びヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１）遺伝子、ヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子の異型体遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子；を含む、ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。前記ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療用薬学組成物は、少量のヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子によっても体内で前記遺伝子の発現が増加することによって優れた治療効果を示すので、前記ＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患の予防又は治療に有用に利用可能である。

【0084】

前記ヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子は、序列番号７の塩基序列からなるものであり得る。

【0085】

本発明の薬学組成物において、前記遺伝子発現増加用組成物：前記成長因子遺伝子は、１：０．５〜1：３０の体積比（ｗ／ｖ）で含まれ得る。

【0086】

一方、前記症状又は疾患は、低身長、肥満、体重減少、悪液質、食慾不振、神経退行性障害、線維症−関連症状、軟骨障害、骨疾患、炎症障害、腸障害、インスリン耐性、糖尿病、糖尿病性ケトアシドーシス、ラブソン・メンデンホール症侯群（Ｒａｂｓｏｎ−Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、網膜症、末端肥大症（ａｃｒｏｍｅｇａｌｙ）、線維筋性異形成症（ｆｉｂｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）及び心臓障害からなる群から選ばれた１種であり得る。

【0087】

特に、前記低身長に対する治療が要求される個体は、インスリン類似成長因子−１欠乏症（ＩＧＦＤ）を有しているヒト小児個体であって、本発明の薬学組成物は、ヒト小児個体でＩＧＦＤの治療に非常に有効である。

【0088】

本発明の薬学組成物は、遺伝子の治療のためのものであり得る。

【0089】

〔剤形〕
本発明に記述された薬学組成物は、治療用薬剤学的製剤に剤形化され得る。

【0090】

このような薬剤学的担体及び賦形剤のみならず、適当な薬剤学的剤形は当業界に公知となっている（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｆｒｏｋｊａｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）又は「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００））。特に、本発明の薬学組成物は、凍結乾燥形態又は安定した液体の形態に剤形化され得る。本発明の組成物は、当業界に公知となった多様な手順を通じて凍結乾燥され得る。凍結乾燥された剤形は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水などの一つ以上の薬剤学的に許容される希釈剤を添加して使用する前に再構成する。

【0091】

組成物の剤形は、任意の薬剤学的に適当な投与手段によって個体に伝達される。多様な伝達システムが公知となっており、組成物を任意の便利な経路で投与するのに使用され得る。主に、本発明の組成物は全身投与される。全身投与用の場合、本発明の組成物は、通常の方法によって非経口（例：静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内又は経皮）伝達又は腸（例：経口、膣又は直腸）伝達用に剤形化される。最も優先的な投与経路は静脈内及び筋肉内投与である。これらの剤形は、注入又は一時注射によって連続して投与され得る。一部の剤形は徐放型システムを含む。

【0092】

本発明の組成物は、許容できない副作用を起こす容量に至らず、治療する病態又は兆候の病度又は拡散を予防又は縮小させながら所望の効果を生産するに十分な容量を意味する治療学的有効量で患者に投与する。正確な容量は、兆候、剤形、投与方式などの多様な要因によって変わり得るので、それぞれの兆候ごとに臨床前に及び臨床試験を通じて決定されるべきである。

【0093】

本発明の薬学組成物は、単独で投与することもでき、他の治療剤と併用して投与することもできる。このような製剤は、同一の薬剤の一部として含まれ得る。

【0094】

〔治療方法〕
また、本発明は、虚血性疾患、神経疾患、腎臓疾患又は肝疾患を病んでいる個体、又はＩＧＦ１受容体の結合によって媒介される症状又は疾患を病んでいる個体を治療する方法に関する。前記治療方法は、本発明の薬学組成物を有効量で個体に投与する段階を含み得る。

【0095】

本発明の一具現例によると、本発明のＨＧＦ又はＩＧＦ１などの遺伝子は、１０ｎｇ〜１００ｍｇの投与量で投与され得る。前記ＨＧＦ又はＩＧＦ１、又はこれを暗号化するポリヌクレオチドの投与が１回を超えて繰り返されるとき、投与量は毎回同一又は異なり得る。

【0096】

以下、好ましい実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれによって制限されないことは当業界の通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【実施例】

【0097】

＜材料の準備＞
〔遺伝子〕
（ヒト肝細胞成長因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＨＧＦ））
序列番号２で表示されるヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の遺伝子（ＮＣＢＩ塩基序列ＮＭ＿０００６０１．６参考）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0098】

（ヒト肝細胞成長因子の変異体（ＨＧＦＸ６））
序列番号３で表示されるヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子、ＨＧＦＸ６（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参考）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0099】

（ヒト肝細胞成長因子の変異体（ＨＧＦＸ７））
序列番号４で表示されるヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子、ＨＧＦＸ７（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参考）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0100】

（ヒト肝細胞成長因子の変異体（ＨＧＦＸ８））
序列番号５で表示されるヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子、ＨＧＦＸ８（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参考）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0101】

（ヒト肝細胞成長因子の変異体（ｄＨＧＦ））
序列番号６で表示されるヒト肝細胞成長因子の変異体遺伝子、ｄＨＧＦ（大韓民国登録特許第１０−０５６２８２４号参考）をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0102】

（ヒト１型インスリン類似成長因子（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＩＧＦ１））
序列番号７で表示されるヒト１型インスリン類似成長因子遺伝子、ＩＧＦ１（ＮＣＢＩ塩基序列ＮＭ＿００１１１１２８３．２参考）をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0103】

（ヒト血管内皮細胞成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＥＧＦ））
序列番号８で表示されるヒト血管内皮成長因子遺伝子、ＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ塩基序列ＡＢ０２１２２１．１参考；ＶＥＧＦ_１６５）をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0104】

（ヒト１型線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−１；ＦＧＦ１））
序列番号９で表示されるヒト１型線維芽細胞成長因子遺伝子、ＦＧＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ塩基序列Ｘ６５７７８．１参考）をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0105】

（ヒト４型線維芽細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ−４；ＦＧＦ４））
序列番号１０で表示されるヒト４型線維芽細胞成長因子遺伝子、ＦＧＦ４（ＧｅｎＢａｎｋ塩基序列Ｍ１７４４６．１参考）をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0106】

（ヒトＢ型血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＰＤＧＦ−Ｂ））
序列番号１１で表示されるヒトＢ型血小板由来成長因子遺伝子、ＰＤＧＦ−Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ塩基序列Ｘ０２８１１．１参考）をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0107】

〔プラスミド（ｐＧＰ）〕
Ｌｅｅ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７２（１）：２３０−２３５）の論文を参考にしてｐＣＫプラスミドを合成した後、下記の表１のプライマー１及びプライマー２を用いて上述した方法と同一の方法でＰＣＲを行うことによって切片を収得し、ＥｃｏＲＩ酵素で３７℃で１時間にわたって反応した後、Ｅｘｐｉｎ Ｇｅｌ ＳＶ（ＧｅｎｅＡｌｌ、Ｋｏｒｅａ）キットを用いてＤＮＡを精製した。その後、Ｔ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いて３０分間ライゲーションを行った後、Ｅ．ｃｏｌｉに一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養した。翌日にコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を培養した後、ミニ−プレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）によってＤＮＡを分離し、序列番号１で表示されるｐＧＰプラスミドを製作した。図１は、本発明の一実施例に係るｐＧＰベクターの開裂地図を示した図である。

【0108】

【表1】

【0109】

＜製造例＞
〔遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの製造〕
前記のように準備した各遺伝子のそれぞれとｐＧＰプラスミドをそれぞれＮｈｅＩとＮｏｔＩ酵素で１時間にわたって切断し、アガロースゲルに電気泳動することによって切片を分離した。分離された切片をＴ４リガーゼを用いて３０分間ライゲーションし、Ｅ．Ｃｏｌｉに一晩培養した。翌日にコロニーを培養した後、ミニ−プレップによってＤＮＡを分離し、これをＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで確認した。クローニングが完了したＤＮＡは、制限酵素で確認されたＥ．Ｃｏｌｉ上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を４Ｌのフラスコ２個にカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）と共に入れて一晩培養した後、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｇｉｇａ ｐｒｅｐ．キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドＤＮＡに生産し、これを動物実験に使用した。前記製造されたそれぞれのプラスミドＤＮＡを下記の表２にまとめて示した。

【0110】

【表2】

【0111】

＜実施例＞
〔実施例１：遺伝子発現増加用組成物及びＨＧＦを含む薬学組成物の製造（ＨＧＦ−ＭＰ１、ＨＧＦ−ＭＰ２及びＨＧＦ−ＭＰ３）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
平均直径が約２．５μｍで、コアはヘキサフルオロ化硫黄、シェルは脂質を含んで構成されており、標準コード６２１４００２１０で表示されるコア−シェル構造のマイクロ粒子をブラッコイメージングコリアから購入した（ＭＰ１）。また、平均直径が約２．４μｍ 〜３．６μｍで、コアはペルフルオロブタン、シェルは脂質及び界面活性剤を含んで構成されており、標準コード６４６３００２１０で表示されるコア−シェル構造のマイクロ粒子をＧＥヘルスケアＡＳ大韓民国支店から購入した（ＭＰ２）。また、平均直径が約１．１μｍ〜３．３μｍで、コアはペルフルオロプロパン、シェルは脂質及び界面活性剤を含んで構成されており、標準コード６６２９０００２０で表示されるコア−シェル構造のマイクロ粒子をＢｏｏ Ｋｙｕｎｇ Ｓ．Ｍから購入した（ＭＰ３）。

【0112】

前記マイクロ粒子ＭＰ１は、製造社のマニュアルによって２２５μｇに２ｍｌの生理食塩水を混合することによって懸濁液（遺伝子発現増加用組成物）に製造し、ＭＰ２は、製造社のマニュアルによって１６μｌを２ｍｌの注射用水と混合することによって懸濁液（遺伝子発現増加用組成物）に製造した。また、生理食塩水と混合されたマイクロ粒子溶液ＭＰ３（１５０μｌ／ｍｌ）は、製造社のマニュアルによって４５秒間強く振って懸濁液（遺伝子発現増加用組成物）に製造した。

【0113】

（遺伝子発現増加用組成物及びＨＧＦを含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１、ＭＰ２及びＭＰ３）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＨＧＦ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＨＧＦ−ＭＰ１、ＨＧＦ−ＭＰ２及びＨＧＦ−ＭＰ３を製造した。

【0114】

〔実施例２：遺伝子発現増加用組成物及びＨＧＦＸ７を含む薬学組成物の製造（ＨＧＦＸ７−ＭＰ１及びＨＧＦＸ７−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0115】

（遺伝子発現増加用組成物及びＨＧＦＸ７を含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＨＧＦＸ７ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＨＧＦＸ７−ＭＰ１及びＨＧＦＸ７−ＭＰ２を製造した。

【0116】

〔実施例３：遺伝子発現増加用組成物及びＩＧＦ１を含む薬学組成物の製造（ＩＧＦ１−ＭＰ１、ＩＧＦ１−ＭＰ２及びＩＧＦ１−ＭＰ３）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0117】

（遺伝子発現増加用組成物及びＩＧＦ１を含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１、ＭＰ２及びＭＰ３）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＩＧＦ１ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＩＧＦ１−ＭＰ１、ＩＧＦ１−ＭＰ２及びＩＧＦ１−ＭＰ３を製造した。

【0118】

〔比較例１：遺伝子発現増加用組成物及びＶＥＧＦを含む薬学組成物の製造（ＶＥＧＦ−ＭＰ１及びＶＥＧＦ−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0119】

（遺伝子発現増加用組成物及びＶＥＧＦを含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＶＥＧＦ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＶＥＧＦ−ＭＰ１及びＶＥＧＦ−ＭＰ２を製造した。

【0120】

〔比較例２：遺伝子発現増加用組成物及びＦＧＦ１を含む薬学組成物の製造（ＦＧＦ１−ＭＰ１及びＦＧＦ１−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0121】

（遺伝子発現増加用組成物及びＦＧＦ１を含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＦＧＦ１ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＦＧＦ１−ＭＰ１及びＦＧＦ１−ＭＰ２を製造した。

【0122】

〔比較例３：遺伝子発現増加用組成物及びＦＧＦ４を含む薬学組成物の製造（ＦＧＦ４−ＭＰ１及びＦＧＦ４−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0123】

（遺伝子発現増加用組成物及びＦＧＦ４を含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＦＧＦ４ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＦＧＦ４−ＭＰ１及びＦＧＦ４−ＭＰ２を製造した。

【0124】

〔比較例４：遺伝子発現増加用組成物及びＰＤＧＦ−Ｂを含む薬学組成物の製造（ＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ１及びＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例１と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0125】

（遺伝子発現増加用組成物及びＰＤＧＦ−Ｂを含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−ＰＤＧＦ−Ｂ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ１及びＰＤＧＦ−Ｂ−ＭＰ２を製造した。

【0126】

〔対照群〕
（遺伝子発現増加用組成物）
ｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、ＵＳＡ）の製造社のマニュアルによってＪｅｔＰＥＩ １２８μｌを２ｍｌの５％グルコースと混合することによって懸濁液（遺伝子発現増加用組成物に対応）を製造した。

【0127】

（遺伝子発現増加用組成物及びそれぞれの遺伝子を含む薬学組成物の製造）
前記遺伝子発現増加用組成物１５μｌと各ＤＮＡ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物ＨＧＦ−ＪｅｔＰＥＩ、ＨＧＦＸ７−ＪｅｔＰＥＩ、ＩＧＦ１−ＪｅｔＰＥＩ、及びＶＥＧＦ−ＪｅｔＰＥＩを製造した。

【0128】

＜実験例＞
〔実験例１：マウスでのタンパク質の発現量〕
前記対照群、実施例及び比較例に係る薬学組成物のそれぞれをＢａｌｂ／ｃマウス（Ｓａｍｔａｋｏ Ｂｉｏ）の下肢の腓腹筋に７５μｇ／５０μｌ／ｌｅｇずつ注射した。

【0129】

投与後、７日目にマウスを屠殺し、注射した部位の筋肉を切り取った。そして、前記切り取ったそれぞれの筋肉を液体窒素及びタンパク質抽出キット（ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を用いて粉砕した後、総タンパク質を分離した。分離された総タンパク質量は、ＤＣタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

【0130】

ＨＧＦタンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図２及び図３に示した。

【0131】

ＩＧＦ１タンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＩＧＦ１ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図４に示した。

【0132】

図２〜図４を通じて、本発明に係る薬学組成物（実施例１〜実施例３）を投与した場合、各対照群の組成物に比べて統計的に有意に高いＨＧＦ又はＩＧＦ１遺伝子の発現量を示すことが分かる。

【0133】

ＶＥＧＦタンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図５に示した。

【0134】

ＦＧＦ１タンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＦＧＦ１ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図６に示した。

【0135】

ＦＧＦ４タンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＦＧＦ４ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図７に示した。

【0136】

ＰＤＧＦ−Ｂタンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＰＤＧＦ−Ｂ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図８に示した。

【0137】

図５〜図８を通じて、比較例１〜比較例４の組成物を投与した場合は、各対照群の組成物に比べて有意に発現量が増加しないことが分かる。
以上の各結果を通じて、本発明に係る実施例１〜実施例３の組成物において、ＨＧＦ又はＩＧＦ１遺伝子の発現量を有意的に増加できることを確認した。

【0138】

〔実験例２：糖尿病で誘発された末梢神経障害ラットモデルにおける本発明の薬学組成物の効能評価〕
糖尿病性神経病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ、ＤＰＮ）の原因は、糖尿病の誘発によって血糖が上昇し、これを通じた微細血管の損傷によって末梢神経損傷が誘発され、臨床的に痛み、異常などの症状が発病される虚血性疾患及び神経疾患の複合疾患である。本研究で使用したストレプトゾトシンで誘発された糖尿病性神経病症（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）が代表的な動物モデルである。

【0139】

Ｓａｍｔａｋｏ Ｂｉｏで購入した６週齢雄のスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットの静脈にＳＴＺ（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）７０ｍｇ／ｋｇを注入し、１型糖尿を誘発した。ＳＴＺの注入後、１週目に非絶食血糖が３００ｍｇ／ｄＬ以上になる個体を選別し、各個体別に痛み誘発程度を測定するためのマニュアルフォンフレイ（ｍａｎｕａｌ Ｖｏｎ Ｆｒｅｙ）テストを通じてＰＷＴ（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を測定し、痛みが誘発された個体（ＰＷＴ値が４．０以下）を選別した後、各群当たりに５匹ずつ２群に分離した。

【0140】

その後、対照群には、ｐＧＰ−ＨＧＦＸ７ ＤＮＡ ４００μｇを両側の腓腹筋にそれぞれ２００μｇ／２００μｌずつ投与し、実施例２のＨＧＦＸ７−ＭＰ２を両側の腓腹筋に対照群と同量（４００μｇ）で投与した。

【0141】

投与後、２週目に痛み尺度であるＰＷＴを測定した結果、実施例２のＨＧＦＸ７−ＭＰ２を投与した群では、対照群と比較して統計的に有意にＰＷＴ値が上昇したことを確認した（図９参照）。

【0142】

〔実験例３：慢性絞扼損傷手術によって誘発された神経障害ラットモデルにおける本発明の薬学組成物の効能評価〕
神経性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）は、神経系異常に起因した慢性神経疾患として知られており、臨床的に痛みの敏感性が増加し、異常、痛みなどを示すようになる。このような慢性神経性疼痛は、本研究で使用した座骨神経の結紮によって発生する慢性絞扼損傷が代表的な動物モデルである。

【0143】

オリエントバイオで購入した５週齢雄のスプラーグドーリーラットを呼吸麻酔（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ、二酸化窒素、酸素混合）し、左側大腿部の中間部を切開することによって座骨神経を露出させた。露出した座骨神経を４−０ｃａｔｇｕｔの縫合糸３本を用いて１．０ｍｍ〜１．５ｍｍの間隔で緩やかに結紮して縫合した。手術１週目にマニュアルフォンフレイテストを通じてＰＷＴ（ｐａｗ ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を測定し、痛みが誘発された個体（ＰＷＴ値が４．０以下）を選別し、各群当たりに５匹ずつ２群に分離した。

【0144】

その後、対照群には、ｐＧＰ−ＨＧＦ ＤＮＡ １ｍｇを左側大腿筋に２５０μｇ／２５０μｌずつ４ヶ所に投与し、実施例１のＨＧＦ−ＭＰ２を対照群と同一の部位に同一に２５０μｇ／２５０μｌずつ４ヶ所（合計１ｍｇ）に投与した。

【0145】

投与後、２週目に痛み尺度であるＰＷＴを測定した結果、実施例１のＨＧＦ−ＭＰ２を投与した群では、対照群と比較して統計的に有意にＰＷＴ値が上昇し、痛みを感じる力の大きさが有意に増加することが確認された（図１０参照）。

【0146】

以上の結果を通じて、本発明の組成物が遺伝子の発現量を著しく増加させることによって、様々な疾患モデルで遺伝子の効能を向上させることを証明した。

【0147】

具体的に、前記実験例２では、本発明の遺伝子発現増加用組成物をＨＧＦＸ７と共に糖尿病性神経病症が誘発されたラットモデルに投与した後、２週目になる日にＰＷＴ値を測定した結果、対照群に比べて８０％ほどＰＷＴ値が上昇したことを確認した。

【0148】

また、前記実験例３では、本発明の遺伝子発現増加用組成物をＨＧＦと共に神経性疼痛が誘発されたラットモデルに投与した後、２週目になる日にＰＷＴ値を測定した結果、対照群に比べて４０％以上ＰＷＴ値が上昇したことを確認した

【0149】

前記のように、ＰＷＴ値が上昇することは、痛みを感じる力の大きさが有意に増加すること、すなわち、痛みが緩和されることを意味する。このように、糖尿病性神経病症又は神経性疼痛が誘発された動物モデルで痛みが緩和される効果が表れることは、本発明の遺伝子発現増加用組成物によって体内でＨＧＦ又はＨＧＦＸ７の発現が増加したためであると見なされる。

【0150】

すなわち、前記各実験例を通じて、本発明の遺伝子発現増加用組成物及びヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、その異型体及びその変異体から選ばれる１種以上の遺伝子を含む薬学組成物が、神経性疼痛の動物モデルと糖尿病性神経病症の動物モデルのいずれにおいても痛みを緩和させる効果を有することを確認することができた。したがって、本発明の遺伝子発現増加用組成物及びヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、その異型体及びその変異体から選ばれる１種以上の遺伝子を有効成分として含む薬学組成物を用いる場合、糖尿病性神経病症又は神経性疼痛などの多様な神経疾患を予防、緩和又は治療できると判断される。

【0151】

以上では、本発明を前記言及した好ましい実施例として説明したが、発明の要旨及び範囲から逸脱しない限り、多様な修正や変形を行うことが可能である。また、添付の特許請求の範囲は、本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】