特表 2021-513545 コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-513545(P2021-513545A)

(43)【公表日】2021年5月27日

(54)【発明の名称】コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/37 20060101AFI20210430BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20210430BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20210430BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20210430BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210430BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20210430BHJP

   C07K 14/755 20060101ALN20210430BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/37

   A61P7/04ZNA

   A61P43/00 111

   A61K9/16

   A61K47/06

   A61K47/20

   A61K47/44

   A61K47/24

   A61K48/00

   C12N15/12

   C07K14/755

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2020-543162(P2020-543162)

(86)(22)【出願日】2019年2月12日

(85)【翻訳文提出日】2020年9月14日

(86)【国際出願番号】KR2019001709

(87)【国際公開番号】WO2019156541

(87)【国際公開日】20190815

(31)【優先権主張番号】10-2018-0017075

(32)【優先日】2018年2月12日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0016076

(32)【優先日】2019年2月12日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】520200609

【氏名又は名称】ジーアンドピー バイオサイエンス カンパニー，リミテッド

(71)【出願人】

【識別番号】520200610

【氏名又は名称】レヨン ファーマシューティカル カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】ホ，ソン−ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】パク，ス ジン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA31

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB31

4C076CC14

4C076DD35

4C076DD55

4C076DD63

4C076EE52

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084DC15

4C084MA17

4C084MA41

4C084MA44

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA531

4C084ZA532

4H045DA66

4H045FA71

(57)【要約】

【課題】本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物に関する。
【解決手段】本発明の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物は、血液凝固第８因子又はその変異体遺伝子と共に生体に投与される場合、前記遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。前記組成物は、遺伝子治療剤と共に投与する場合、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができるので有用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物であって、
前記コアは、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、
前記血液凝固因子遺伝子は、ヒト血液凝固第８因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）遺伝子又はその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子であることを特徴とする血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項2】

前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びその混合物から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項3】

前記ハロゲン化炭化水素はペルフルオロ化炭化水素であることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項4】

前記ペルフルオロ化炭化水素は、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物であることを特徴とする、請求項３に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項5】

前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項6】

前記リン脂質は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項7】

前記グリセロ糖脂質は、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド及びグリコシルジグリセリドからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項8】

前記スフィンゴ糖脂質は、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド又はガングリオシドであることを特徴とする、請求項５に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項9】

前記陽イオン脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）及び３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項10】

前記血液凝固第８因子は、序列番号１で表示されるアミノ酸序列からなり、前記血液凝固第８因子の変異体は、序列番号３で表示されるアミノ酸序列からなることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項11】

前記組成物は、前記血液凝固因子遺伝子の発現量を３０％以上増加させることを特徴とする、請求項１に記載の血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物。

【請求項12】

請求項１の組成物；及びヒト血液凝固第８因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）遺伝子又はその変異体遺伝子；を含む出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物。

【請求項13】

前記出血疾患は、Ａ型血友病、血液凝固第８因子又は血液凝固第８因子ａに対する抑制性抗体によってもたらされたり複合化された血友病又はＢ型血友病であることを特徴とする、請求項１２に記載の出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物。

【請求項14】

前記出血疾患又は出血は、新生凝固病症；重症肝疾患；低血小板症；因子Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ又はＸＩの先天性欠乏；及びフォン・ヴィレブランド因子に対する阻害剤を有するフォン・ヴィレブランド病；からなる群から選ばれた一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物。

【請求項15】

前記出血は、高危険外科手術過程の血液損失、外傷性血液損失、骨髓移植による血液損失又は脳出血と関連した血液損失によるものであることを特徴とする、請求項１２に記載の出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）は、深刻な遺伝疾患の一つである。Ａ型血友病は、Ｘ遺伝子関連疾患として、男性５０００人のうち１人が発病しており、血液凝固過程の重要な成分である血漿糖タンパク質ヒト血液凝固第８因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ、Ｆａｃｔｏｒ ８、ＦＶＩＩＩ又はＦ８とも称する）の変異によって発生する。

【0003】

１９８０年代以前の血友病患者達には、治療のために他人の血漿から抽出した血液凝固第８因子が投与されたが、このような方法では、ウイルス感染などの問題が深刻であった。このような短所を補完するために、１９８０年代から組換えタンパク質の研究を通じて全長血液凝固第８因子（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）をＣＨＯ細胞などで生産し、これを治療に使用した。

【0004】

本発明の発明者等は、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができる遺伝子治療剤を開発するために研究した結果、コアがハロゲン化炭化水素及び／又はハロゲン化硫黄で、外郭シェルが脂質成分で構成されたコア−シェル構造のマイクロ粒子が血液凝固第８因子遺伝子と共に生体内に投与される場合、前記血液凝固因子遺伝子の発現量を著しく増加させることを具体的に確認し、本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】大韓民国登録特許第１０−１５４２７５２号

【特許文献2】大韓民国公開特許第１０−２０１８−０１１８６５９号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明が解決しようとする第一の課題は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物を提供することにある。

【0007】

本発明が解決しようとする第二の課題は、前記組成物を含む出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0008】

前記のような目的を達成するために、本発明は、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子の発現増加用組成物であって、前記コアは、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、前記血液凝固因子遺伝子は、ヒト血液凝固第８因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）遺伝子又はその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子であることを特徴とする血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物を提供する。

【0009】

本発明の一実施例において、前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン及びその混合物から選ばれ得る。
本発明の一実施例において、前記ハロゲン化炭化水素は、ペルフルオロ化炭化水素であり得る。

【0010】

本発明の一実施例において、前記ペルフルオロ化炭化水素は、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物であり得る。

【0011】

本発明の一実施例において、前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であり得る。

【0012】

本発明の一実施例において、前記リン脂質は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン及び水素添加リン脂質からなる群から選ばれたものであり得る。

【0013】

本発明の一実施例において、前記グリセロ糖脂質は、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド及びグリコシルジグリセリドからなる群から選ばれたものであり得る。

【0014】

本発明の一実施例において、前記スフィンゴ糖脂質は、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド又はガングリオシドであり得る。

【0015】

本発明の一実施例において、前記陽イオン脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）及び３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）からなる群から選ばれたものであり得る。

【0016】

本発明の一実施例において、前記血液凝固第８因子遺伝子は、序列番号１で表示されるアミノ酸序列からなるものであって、前記血液凝固第８因子の変異体遺伝子は、序列番号３で表示されるアミノ酸序列からなるものであり得る。

【0017】

本発明の一実施例において、前記組成物は、前記血液凝固因子遺伝子の発現量を３０％以上増加させ得る。

【0018】

また、本発明は、前記組成物、及びヒト血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子を含む出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0019】

本発明の一実施例において、前記出血疾患は、Ａ型血友病、血液凝固第８因子又は血液凝固第８因子ａに対する抑制性抗体によってもたらされたり複合化された血友病又はＢ型血友病であり得る。

【0020】

本発明の一実施例において、前記出血疾患又は出血は、新生凝固病症；重症肝疾患；低血小板症；因子Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ又はＸＩの先天性欠乏；及びフォン・ヴィレブランド因子に対する阻害剤を有するフォン・ヴィレブランド病；からなる群から選ばれた一つであり得る。

【0021】

本発明の一実施例において、前記出血は、高危険外科手術過程の血液損失、外傷性血液損失、骨髓移植による血液損失又は脳出血と関連した血液損失によるものであり得る。

【発明の効果】

【0022】

本発明の遺伝子発現増加用組成物は、血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子（例えば、遺伝子を暗号化するポリヌクレオチド又はこれを含むベクター）と共に生体に投与される場合、前記血液凝固因子遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。これにより、前記組成物は、遺伝子治療剤と共に投与する場合、少量の遺伝子によっても治療効果を得ることができるので有用である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】本発明の一実施例に係る血液凝固第８因子変異体（Ｆ８Ｍ）をデザインする過程を示す模式図である。

【図2】本発明の一実施例に係るｐＧＰベクターの開裂地図を示した図である。

【図3】マウスにおいて、ｐＧＰ−Ｆ８Ｍ（遺伝子のみ）、対照群の薬学組成物（Ｆ８Ｍ−ＪｅｔＰＥＩ）及び実施例に係る薬学組成物（Ｆ８Ｍ−ＭＰ１及びＦ８Ｍ−ＭＰ２）の投与によるＦ８タンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図4】マウスにおいて、ｐＧＰ−Ｆ９（遺伝子のみ）及び比較例に係る薬学組成物（Ｆ９−ＭＰ１及びＦ９−ＭＰ２）の投与によるＦ９タンパク質の発現量を比較して示すグラフである。

【図5】本発明の一実施例に係るヒト血液凝固第８因子を構成するドメイン構造を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0024】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0025】

本発明の一側面によると、コア−シェル構造のマイクロ粒子を有効成分として含む血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物であって、前記コアは、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物で、前記シェルは、脂質又はその誘導体を含んで構成され、前記血液凝固因子遺伝子は、ヒト血液凝固第８因子（Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）遺伝子又はその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子であることを特徴とする血液凝固因子遺伝子発現増加用組成物を提供する。

【0026】

＜コア＞
本発明の明細書において、前記「コア」は、生体適合性基体として、ハロゲン化炭化水素、ハロゲン化硫黄又はこれらの混合物からなり得る。

【0027】

前記生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄、オクタフルオロプロパン、ブロモクロロジフルオロメタン、クロロジフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、クロロトリフルオロメタン、クロロペンタフルオロエタン、ジクロロテトラフルオロエタン、又はその混合物であり得る。

【0028】

前記ハロゲン化炭化水素は、ペルフルオロ化炭化水素であることが好ましい。

【0029】

前記ペルフルオロ化炭化水素としては、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、ペルフルオロペンタン、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロヘプタン、ペルフルオロプロペン、ペルフルオロブテン、ペルフルオロブタジエン、ペルフルオロブタ−２−イン、ペルフルオロシクロブタン、ペルフルオロメチルシクロブタン、ペルフルオロジメチルシクロブタン、ペルフルオロトリメチルシクロブタン、ペルフルオロシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロペンタン、ペルフルオロジメチルシクロペンタン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン、ペルフルオロメチルシクロヘキサン又はその混合物を挙げることができる。

【0030】

本発明の生体適合性基体は、ヘキサフルオロ化硫黄又はペルフルオロブタンであることが好ましい。

【0031】

＜シェル＞
本発明の明細書において、前記「シェル」は、脂質又はその誘導体を含む成分で構成され得る。

【0032】

前記脂質は、単純脂質、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、コレステロール及び陽イオン脂質からなる群から選ばれた１種以上であり得るが、特にリン脂質であることが好ましい。

【0033】

前記リン脂質としては、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルエタノールアミン誘導体、ホスファチジルセリン誘導体、ジアセチル化リン脂質、Ｌ−α−ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレイン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール化リン脂質、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質などを挙げることができる。

【0034】

前記グリセロ糖脂質としては、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリドなどを挙げることができる。

【0035】

前記スフィンゴ糖脂質としては、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどを挙げることができる。

【0036】

また、前記陽イオン脂質としては、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシプロパン−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジエチルヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、３β−［Ｎ−（Ｎ'Ｎ'−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）などを挙げることができる。

【0037】

＜マイクロ粒子＞
本発明のマイクロ粒子は、コアである基体を取り囲むシェルによって安定化され、基体の周囲液体への拡散を遅延させ、その結果、マイクロ粒子間の融合を防止する。

【0038】

前記マイクロ粒子は、生体内に投入される場合、標的細胞又は組織付近に到着するまでは形状を維持しているが、標的細胞又は組織付近で破壊されながら気体を噴射するようになる。このとき、噴射される気体は標的細胞の細胞膜に変化を起こし、気体の噴射力は、遺伝子が標的細胞の細胞質環境中に進入できるように促進する役割をすることができる。
前記マイクロ粒子は、平均直径が１μｍ〜１０μｍ、好ましくは２μｍ〜８μｍ、さらに好ましくは２μｍ〜４μｍである。

【0039】

＜遺伝子発現増加用組成物＞
最近、基体をコアとするコア−シェルマイクロ粒子と関連して多様な研究がなされてきた。既存の各研究では、マイクロ粒子と共に超音波を照射しないと遺伝子発現増加効果が表れなかった。

【0040】

具体的に、Ｓａｎｇ−Ｃｈｏｌ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｒｅａｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｊ ２００６；３６：３２−３８；「低周波超音波を用いた微細気泡の破壊を通じた筋肉組織への遺伝子伝達増強に対する研究」には、超音波の照射なしでルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子−マイクロ粒子混合物のみを注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。

【0041】

ＺＰ Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１１４７−１１５５；「Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｖｉａ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ」には、超音波の照射しでルシフェラーゼ遺伝子−マイクロ粒子混合物のみを注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。

【0042】

また、Ｘｉｎｇｓｈｅｎｇ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ Ｍｅｄ ２００８；２７：４５３−４６０；「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔｓ」には、超音波の照射なしでＨＧＦ遺伝子−リポソームマイクロ粒子混合物を注入する場合は遺伝子発現増加効果が表れないという内容が開示されている。

【0043】

しかし、本発明者等は、前記マイクロ粒子の用途に対して研究した結果、本発明に係るマイクロ粒子を血液凝固因子のうち血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体と共に注入する場合は、特異的に超音波の照射なしでも前記遺伝子の発現量を著しく増加させることを確認し、本発明を完成するに至った。一方、下記の実験例で具体的に示したように、前記血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子以外の血液凝固因子遺伝子（例えば、血液凝固第９因子（Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、Ｆａｃｔｏｒ ９、ＦＩＸ又はＦ９とも称する））では、前記マイクロ粒子による遺伝子発現量の増加効果が表れなかった。

【0044】

本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子と共に生体に投与される場合、前記血液凝固因子遺伝子の発現量を少なくとも３０％以上増加させ得る。

【0045】

下記の実施例において、本発明の遺伝子発現増加用組成物は、ヒト血液凝固第８因子変異体遺伝子と共にマウスに投与される場合、血液凝固第８因子遺伝子の発現量を著しく増加させることを確認した。さらに具体的には、本発明の遺伝子発現増加用組成物と前記血液凝固第８因子変異体遺伝子を動物モデルに共に投与する場合、血液凝固第８因子遺伝子の発現量が４０％以上増加することを確認した。一方、血液凝固第９因子遺伝子の場合は、本発明の遺伝子発現増加用組成物と共にマウスに投与したとしても遺伝子発現がほとんど増加しないことを確認した。

【0046】

すなわち、本発明の遺伝子発現増加用組成物は、血液凝固因子のうちヒト血液凝固第８因子遺伝子及びその変異体遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子と共に投与される場合にのみ特異的に前記血液凝固因子遺伝子の発現量を増加させる効果を有すると判断される。

【0047】

前記組成物は、安定化剤、緩衝剤、浸透圧の調節のための塩、賦形剤、防腐剤などの薬剤学的補助剤又はその他の治療的に有用な物質をさらに含有することができ、通常の方法によって多様な経口又は非経口の形態に剤形化できるが、非経口の形態であることが好ましい。代表的な非経口投与用剤形は、注射用剤形として等張性水溶液又は懸濁液であることが好ましい。又は、前記組成物を粉末化した後、投与直前に溶剤と共に懸濁して使用することもできる。

【0048】

本発明の遺伝子発現増加用組成物において、前記マイクロ粒子の含量は、特に制限されないが、０．５μｌ／ｍｌ〜２，０００μｌ／ｍｌ、好ましくは１μｌ／ｍｌ〜１，０００μｌ／ｍｌであってもよく、５μｇ／ｍｌ〜２，０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌ〜１，０００μｇ／ｍｌであってもよい。

【0049】

前記マイクロ粒子の含量が前記範囲を逸脱する場合は、期待する効果を得ることができない。

【0050】

そして、前記組成物は、遺伝子と混合された混合液の形態で投与されることが効果の面で好ましい。

【0051】

＜遺伝子＞
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、下記の各遺伝子と共に投与される場合、下記の遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0052】

〔血液凝固第８因子〕
本明細書において、「血液凝固第８因子」、「因子ＶＩＩＩ」、「ＦＶＩＩＩ」及び「Ｆ８」という用語は、本明細書で相互交換的に使用される。成熟したヒト血液凝固第８因子は、２３５１個（シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む）のアミノ酸が図５に示したドメイン構造で配列されて構成される。

【0053】

図５において、ａ１、ａ２及びａ３は酸性領域で、酸性領域ａ３は、血液凝固に重要な役割をするフォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）への血液凝固第８因子分子の結合に関与するものと知られている。分泌される過程で、血液凝固第８因子においては、Ｂ−ドメインとａ３酸性領域との間が切断され、その結果、ヘテロ二量体ポリペプチドが生成される。血液凝固第８因子ヘテロ二量体は、軽鎖（Ａ３、Ｃ１及びＣ２を含む）と、大きさが可変的な重鎖（Ａ１、Ａ２及びＢを含む）とからなる。重鎖は、Ｂ−ドメイン内での制限的なタンパク質分解によって異質性を有する。ヘテロ二量体Ｂ−ドメインが欠失した血液凝固第８因子の場合、「重鎖」はＡ１及びＡ２を含むが、Ｂ−ドメインが一部又は全部欠失する。

【0054】

ヒト血液凝固第８因子の成熟野生型のアミノ酸序列を序列番号１に示した。特定序列のアミノ酸位置に対する参照番号は、ＶＩＩＩ野生型タンパク質内での該当のアミノ酸位置を意味し、言及される序列内の他の位置で突然変異（例：欠失、挿入及び／又は置換）の存在を排除しない。前記序列番号１の暗号化ＤＮＡ序列は序列番号２に該当する。

【0055】

「血液凝固第８因子」は、野生型血液凝固第８因子のみならず、野生型血液凝固第８因子の凝固促進活性を有する野生型血液凝固第８因子の誘導体を含む。前記誘導体は、野生型血液凝固第８因子のアミノ酸序列と比較して欠失、挿入及び／又は付加された序列を有し得る。好ましい誘導体は、Ｂ−ドメインの全部又は一部が欠失した血液凝固第８因子の分子である。本明細書の全般に表記されたアミノ酸の位置は、常に全長成熟（シグナルペプチドを含む）野生型血液凝固第８因子での個々のアミノ酸の位置を示す。

【0056】

〔血液凝固第８因子変異体〕
本明細書において、「変異体」という用語は、アミノ酸序列又は核酸序列などの保存的又は非保存的な置換、挿入又は欠失を含み、このような変化は、それぞれのＦＶＩＩＩの生物学的活性を付与する活性部位又は活性ドメインを実質的に変更させない。

【0057】

本発明の実施例に係る血液凝固第８因子変異体は、単一鎖の血液凝固第８因子変異体として、序列番号１で表示される血液凝固第８因子からＡｓｐ７８４〜Ａｒｇ１６７１のアミノ酸が欠失したものである。前記血液凝固第８因子変異体は、Ｂ−ドメインの一部（各残基７８４−１６６７）及びａ３領域の一部（各残基１６６８−１６７１）が欠失したものであって、前記変異体は、血液凝固第８因子、Ｂ−ドメインが欠失した血液凝固第８因子に比べてタンパク質の発現量が増大し、血液凝固活性及び安定性が向上する。前記血液凝固第８因子変異体は、序列番号３で表示されるアミノ酸序列を有する。

【0058】

前記「単一鎖の血液凝固第８因子」は、前記血液凝固第８因子分子を発現する細胞から分泌される間、タンパク質の分解によって二鎖（例：重鎖と軽鎖）に切断されず、単一ポリペプチド鎖として存在する血液凝固第８因子分子を意味する。
また、前記血液凝固第８因子変異体は、前記アミノ酸序列を暗号化するポリヌクレオチドで表現され得る。

【0059】

＜ポリヌクレオチド＞
本明細書において、「ポリヌクレオチド」という用語は、非変形ＲＮＡ又はＤＮＡ、又は変形ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。本発明のポリヌクレオチドは、単一鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。本明細書に使用された「ポリヌクレオチド」という用語は、変形塩基及び／又は独特の塩基、例えば、イノシンを含むＤＮＡ又はＲＮＡを含む。前記ＤＮＡ又はＲＮＡの場合、公知の有用な目的を提供する多様な変形が可能であることは自明である。本明細書に使用された「ポリヌクレオチド」という用語は、このような化学的、酵素的又は代謝的に変形したポリヌクレオチドを含む。

【0060】

当業者等は、遺伝子暗号の縮退性によって前記血液凝固第８因子変異体が多くのポリヌクレオチドによって暗号化され得ることを理解できると見なされる。すなわち、本発明で利用可能な血液凝固第８因子変異体を暗号化するポリヌクレオチド序列は、前記アミノ酸序列と実質的な同一性を示すヌクレオチド序列も含まれるものと解釈される。

【0061】

＜プラスミド＞
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、前記遺伝子を暗号化する単一鎖ポリヌクレオチドを含む各プラスミドと共に投与される場合、遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0062】

本明細書において、「プラスミド」という用語は、一般に、外来遺伝子が宿主細胞で発現できるようにベクターに作動的に連結されて形成された環状のＤＮＡ分子を言う。しかし、プラスミドは、目的とする遺伝子を含むように遺伝子組換えによって特定の制限酵素によって分解され、新しい遺伝子を導入するベクターとして使用され得る。よって、本願では、プラスミドとベクターは相互交換的に使用され、遺伝工学分野で通常の知識を有する者であれば、それらの名称を区分しないとしても、その意味を十分に理解するだろう。

【0063】

本明細書において、「ベクター」という用語は、外来遺伝子を宿主細胞内に安定的に運搬できる運搬体としてのＤＮＡ分子を言う。有用なベクターになるためには複製されるべきであり、宿主細胞内に流入し得る方案を備えるべきで、自分の存在を検出できる手段を備えるべきである。

【0064】

＜発現＞
〔発現ベクター〕
本発明に係る遺伝子発現増加用組成物は、前記遺伝子を暗号化する単一鎖ポリヌクレオチドを含む各発現ベクターと共に投与される場合、遺伝子の発現効率及びこれによる効能をさらに増大させ得る。

【0065】

本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、細胞での前記遺伝子の生成を意味する。

【0066】

本明細書において、「発現ベクター」という用語は、適当な宿主で前記遺伝子を発現できるベクターであって、遺伝子挿入物が発現されるように作動可能に連結された必須的な調節要素を含む遺伝子コンストラクトを言う。

【0067】

本明細書において、「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、一般的な機能を行うように核酸発現調節序列と前記遺伝子を暗号化するポリヌクレオチドとが機能的に連結（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを意味する。例えば、プロモーターと前記遺伝子を暗号化するポリヌクレオチドとが作動可能に連結され、前記ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼし得る。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野でよく知られている遺伝子組換え技術を用いて行うことができ、部位−特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当該技術分野で一般的に知られている酵素などを用いて行う。

【0068】

本発明の発現ベクターは、プラスミド、ベクター又はウイルスベクターを用いて製作されるが、これに限定されることはない。適切な発現ベクターは、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーなどの発現調節エレメントなどを含むことができ、目的に応じて多様に製造可能であり、ベクターのプロモーターは構成的又は誘導性であり得る。現在、プラスミドがベクターの最も通常的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は時々相互交換的に使用される。本発明の目的上、プラスミドベクターを用いることが好ましい。このような目的に使用可能な典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たりに数個から数百個のプラスミドベクターを含むように複製を効率的に行わせる複製開始点、及び（ｂ）外来ＤＮＡ切片が挿入され得る制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しないとしても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡとを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。

【0069】

本発明に係る遺伝子の過剰発現のために使用されるベクターは、当業界で公知となった発現ベクターであり得る。本発明の骨格ベクターとしては、特に制限されることはないが、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＧＰ、ｐＥＦ、ｐＶＡＸ、ｐＵＤＫ、ｐＣＫ、ｐＱＥ４０、ｐＴ７、ｐＥＴ／Ｒｂ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）及びｐＧＥＸからなる群から選ばれる多様なベクターを使用することができ、ｐＧＰ、ｐＥＦ、ｐＣＫ、ｐＵＤＫ及びｐＶＡＸからなる群から選ばれる一つのベクターを用いることが効果の面で好ましい。
好ましい具体例において、本発明の発現ベクターは、図２の開裂地図を有するｐＧＰベクターを含む発現ベクターであり得る。

【0070】

＜薬学的組成物＞
また、本発明は、前記遺伝子発現増加用組成物、及び前記血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子を含むことを特徴とする出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

【0071】

前記出血疾患は、Ａ型血友病、血液凝固第８因子又は血液凝固第８因子ａに対する抑制性抗体によってもたらされたり複合化された血友病又はＢ型血友病であり得る。また、前記出血疾患又は出血は、新生凝固病症；重症肝疾患；低血小板症；因子Ｖ、ＶＩＩ、Ｘ又はＸＩの先天性欠乏；及びフォン・ヴィレブランド因子に対する阻害剤を有するフォン・ヴィレブランド病；からなる群から選ばれた一つであり得る。

【0072】

そして、前記出血は、高危険外科手術過程の血液損失、外傷性血液損失、骨髓移植による血液損失又は脳出血と関連した血液損失によるものであり得る。

【0073】

前記出血疾患又は出血の予防又は治療用薬学的組成物は、少量の血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子によっても体内で前記遺伝子の発現が増加することによって優れた治療効果を示すので、前記出血疾患又は出血の予防又は治療に有用に利用可能である。
本発明の薬学組成物において、前記遺伝子発現増加用組成物：前記血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体遺伝子は、１：０．５〜１：３０の体積比（ｗ／ｖ）で含まれ得る。
本発明の薬学的組成物は、遺伝子の治療のためのものであり得る。

【0074】

〔剤形〕
本発明に記述された薬学的組成物は、治療用薬剤学的製剤に剤形化され得る。

【0075】

このような薬剤学的担体及び賦形剤のみならず、適当な薬剤学的剤形は当業界に公知となっている（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｆｒｏｋｊａｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）又は「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００））。特に、本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥形態又は安定した液体の形態に剤形化され得る。本発明の組成物は、当業界に公知となった多様な手順を通じて凍結乾燥され得る。凍結乾燥された剤形は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水などの一つ以上の薬剤学的に許容される希釈剤を添加して使用する前に再構成する。

【0076】

組成物の剤形は、任意の薬剤学的に適当な投与手段によって個体に伝達される。多様な伝達システムが公知となっており、組成物を任意の便利な経路で投与するのに使用され得る。主に、本発明の組成物は全身投与される。全身投与用の場合、本発明の挿入タンパク質は、通常の方法によって非経口（例：静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内又は経皮）伝達又は腸（例：経口、膣又は直腸）伝達用に剤形化される。最も優先的な投与経路は静脈内及び筋肉内投与である。これらの剤形は、注入又は一時注射によって連続して投与され得る。一部の剤形は徐放型システムを含む。

【0077】

本発明の組成物は、許容できない副作用を起こす容量に至らず、治療する病態又は兆候の病度又は拡散を予防又は縮小させながら所望の効果を生産するに十分な容量を意味する治療学的有効量で患者に投与する。正確な容量は、兆候、剤形、投与方式などの多様な要因によって変わり得るので、それぞれの兆候ごとに臨床前に及び臨床試験を通じて決定されるべきである。

【0078】

本発明の薬学的組成物は、単独で投与することもでき、他の治療剤と併用して投与することもできる。このような製剤は、同一の薬剤の一部として含まれ得る。

【0079】

〔治療方法〕
また、本発明は、Ａ型血友病、Ｂ型血友病又は後天的血友病などの出血疾患を病んでいる個体；又は慢性疾患又は肝疾患を病んでいる個体；を治療する方法に関する。前記治療方法は、本発明の薬学的組成物を有効量で個体に投与する段階を含み得る。
本発明の一具現例によると、本発明の血液凝固第８因子遺伝子又はその変異体などの遺伝子は、１０ｎｇ〜１００ｍｇの投与量で投与され得る。前記血液凝固第８因子又はその変異体、又はこれを暗号化するポリヌクレオチドの投与が１回を超えて繰り返されるとき、投与量は毎回同一又は異なり得る。

【0080】

以下、好ましい実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれによって制限されないことは当業界の通常の知識を有する者にとって自明であろう。

【実施例】

【0081】

＜材料の準備＞
〔遺伝子〕
（血液凝固第８因子（Ｆ８））
序列番号１で表示される全長血液凝固第８因子（Ｆ８）の遺伝子をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社（ＵＳＡ）に依頼して製作した。

【0082】

（血液凝固第８因子の変異体（Ｆ８Ｍ））
序列番号１で表示される全長血液凝固第８因子（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ）遺伝子を鋳型とし、プライマー１及びプライマー２を用いて重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて序列番号４で表示される切片１を製造した。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ２μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各１μｌ、２．５ ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌ、ｐｆｕ ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）１μｌ、１０ｘバッファー２．５μｌ及び滅菌した３次蒸留水５０μｌを充填することによって混合液を作った後、この溶液を９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒間反応させる過程を４０回繰り返し行った。プライマー３及びプライマー４を用いて前記方法のようなＰＣＲを通じて序列番号５で表示される切片２を製造した。その後、前記切片１及び切片２に対してプライマー５及びプライマー６を用いてオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行うことによって単一鎖血液凝固第８因子変異体を製造した。オーバーラップＰＣＲは、ＤＮＡ切片をそれぞれ２μｌ入れ、他の酵素、緩衝剤、プライマー、反応時間及び方法はＰＣＲと同一に使用した。図１は、本発明の一実施例に係る血液凝固第８因子変異体（Ｆ８Ｍ）をデザインする過程を示す模式図である。
前記各プライマーをまとめて下記の表１に示した。

【0083】

【表1】

【0084】

（血液凝固第９因子（Ｆ９））
序列番号６で表示される全長血液凝固第９因子（ＧｅｎＢａｎｋ塩基序列ＦＲ８４６２３９．１参考）の遺伝子をバイオニクス社（大韓民国）に依頼して製作した。

【0085】

（プラスミド（ｐＧＰ））
Ｌｅｅ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｙ ｎａｋｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００；２７２（１）：２３０−２３５）の論文を参考にしてｐＣＫプラスミドを合成した後、下記の表２のプライマー７及びプライマー８を用いて上述した方法と同一の方法でＰＣＲを行うことによって切片を収得し、ＥｃｏＲＩ酵素で３７℃で１時間にわたって反応した後、Ｅｘｐｉｎ Ｇｅｌ ＳＶ（ＧｅｎｅＡｌｌ、Ｋｏｒｅａ）キットを用いてＤＮＡを精製した。その後、Ｔ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いて３０分間ライゲーションを行った後、Ｅ．ｃｏｌｉに一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養した。翌日にコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を培養した後、ミニ−プレップ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ）によってＤＮＡを分離し、序列番号７で表示されるｐＧＰプラスミドを製作した。図２は、本発明の一実施例に係るｐＧＰベクターの開裂地図を示した図である。

【0086】

【表2】

【0087】

＜製造例＞
〔遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの製造〕
前記のように準備した各遺伝子のそれぞれとｐＧＰプラスミドをそれぞれＮｈｅＩとＮｏｔＩ酵素で１時間にわたって切断し、アガロースゲルに電気泳動することによって切片を分離した。分離された切片をＴ４リガーゼを用いて３０分間ライゲーションし、Ｅ．Ｃｏｌｉに一晩培養した。翌日にコロニーを培養した後、ミニ−プレップによってＤＮＡを分離し、これをＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで確認した。クローニングが完了したＤＮＡは、制限酵素で確認されたＥ．Ｃｏｌｉ上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を４Ｌのフラスコ２個にカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）と共に入れて一晩培養した後、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｇｉｇａ ｐｒｅｐ．キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドＤＮＡに生産し、これを動物実験に使用した。前記製造されたそれぞれのプラスミドＤＮＡを下記の表３にまとめて示した。

【0088】

【表3】

【0089】

＜実施例＞
〔実施例：遺伝子発現増加用組成物及びＦ８Ｍを含む薬学組成物の製造（Ｆ８Ｍ−ＭＰ１及びＦ８Ｍ−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
平均直径が約２．５μｍで、コアはヘキサフルオロ化硫黄、シェルは脂質を含んで構成されており、標準コード６２１４００２１０で表示されるコア−シェル構造のマイクロ粒子をブラッコイメージングコリアから購入した（ＭＰ１）。また、平均直径が約２．４μｍ 〜３．６μｍで、コアはペルフルオロブタン、シェルは脂質及び界面活性剤を含んで構成されており、標準コード６４６３００２１０で表示されるコア−シェル構造のマイクロ粒子をＧＥヘルスケアＡＳ韓国支店から購入した（ＭＰ２）。

【0090】

（遺伝子発現増加用組成物及びＦ８Ｍを含む薬学組成物の製造）
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−Ｆ８Ｍ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物Ｆ８Ｍ−ＭＰ１及びＦ８Ｍ−ＭＰ２を製造した

【0091】

〔比較例：遺伝子発現増加用組成物及びＦ９を含む薬学組成物の製造（Ｆ９−ＭＰ１及びＦ９−ＭＰ２）〕
（遺伝子発現増加用組成物）
前記実施例と同一の方法で遺伝子発現増加用組成物を製造した。

【0092】

〔遺伝子発現増加用組成物及びＦ９を含む薬学組成物の製造〕
前記それぞれの遺伝子発現増加用組成物（ＭＰ１及びＭＰ２）１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−Ｆ９ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによってそれぞれの薬学組成物Ｆ９−ＭＰ１及びＦ９−ＭＰ２を製造した。

【0093】

＜対照群＞
〔遺伝子発現増加用組成物〕
ｉｎ ｖｉｖｏ ＪｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、ＵＳＡ）の製造社のマニュアルによってＪｅｔＰＥＩ １２８μｌを２ｍｌの５％グルコースと混合することによって懸濁液（遺伝子発現増加用組成物に対応）を製造した。

【0094】

〔遺伝子発現増加用組成物及びそれぞれの遺伝子を含む薬学組成物の製造〕
前記組成物１５μｌと前記製造されたｐＧＰ−Ｆ８Ｍ ７０μｇ／３５μｌとを混合することによって薬学組成物Ｆ８Ｍ−ＪｅｔＰＥＩを製造した。

【0095】

＜実験例＞
〔実験例：マウスでのタンパク質の発現量〕
前記対照群、実施例及び比較例に係る薬学組成物のそれぞれをＣ５７ｂ１／６マウスの下肢の腓腹筋に７５μｇ／５０μｌ／ｌｅｇずつそれぞれ注射した。

【0096】

投与後、７日目にマウスを屠殺し、注射した部位の筋肉を切り取った。そして、前記切り取ったそれぞれの筋肉を液体窒素及びタンパク質抽出キット（ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）を用いて粉砕した後、総タンパク質を分離した。分離された総タンパク質量は、ＤＣタンパク質分析キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を用いて測定した。

【0097】

Ｆ８タンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＥＬＩＳＡキット（Ｓｔａｇｏ Ａｓｓｅｒｃｈｒｏｍ ＶＩＩＩ：Ａｇ、Ｆｒａｎｃｅ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図３に示した。

【0098】

図３を通じて、本発明に係る薬学組成物（実施例）を投与した場合、遺伝子のみを投与した場合又は対照群の組成物を投与した場合に比べて統計的に有意に高い発現量を示すことが分かる。具体的に、実施例において、Ｆ８Ｍ−ＭＰ１を投与した群は、遺伝子のみを投与した群（ｐＧＰ−Ｆ８Ｍ）に比べて４４％高い発現量を示し、Ｆ８Ｍ−ＭＰ２を投与した群は、遺伝子のみを投与した群に比べて１１６％高い発現量を示した。

【0099】

Ｆ９タンパク質の測定のためには、同一の量のタンパク質を用いてＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を通じて各遺伝子の発現量を測定し、その結果を図４に示した。

【0100】

図４を通じて、比較例の組成物を投与した場合は、遺伝子のみを投与した場合に比べて遺伝子の発現がほとんど増加しないことが分かる。

【0101】

すなわち、図３及び図４を通じて、本発明に係る薬学組成物（実施例）を投与した場合は、遺伝子のみを投与した場合、又は対照群や比較例の組成物を投与した場合に比べて著しく高い発現量を示すことが分かる。

【0102】

以上では、本発明を前記言及した好ましい実施例として説明したが、発明の要旨及び範囲から逸脱しない限り、多様な修正や変形を行うことが可能である。また、添付の特許請求の範囲は、本発明の要旨に属するこのような修正や変形を含む。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2021513545000001.app

【国際調査報告】