特表 2021-514680 ヒト臍帯から幹細胞を分離する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-514680(P2021-514680A)

(43)【公表日】2021年6月17日

(54)【発明の名称】ヒト臍帯から幹細胞を分離する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20210521BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALI20210521BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/0735

   C12N5/0775

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2020-571324(P2020-571324)

(86)(22)【出願日】2019年3月28日

(85)【翻訳文提出日】2020年9月8日

(86)【国際出願番号】KR2019003674

(87)【国際公開番号】WO2019190246

(87)【国際公開日】20191003

(31)【優先権主張番号】10-2018-0036230

(32)【優先日】2018年3月29日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】520348004

【氏名又は名称】エースソステム バイオストラテジーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】チョ，ヒョン チョル

(72)【発明者】

【氏名】イ，ア−ヨン

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065BB01

4B065BC31

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、臍帯由来幹細胞の分離方法に関し、より詳しくは、本発明の臍帯由来幹細胞の分離方法によって一定サイズの臍帯から顕著に多数の幹細胞を分離することができる。本発明の分離方法は、酵素的処理無しに臍帯組織から幹細胞を分離できるので、細胞に与えられるストレスを顕著に抑制できるという点で非常に大きい長所がある。また、本発明の分離方法で分離された幹細胞は、従来の分離方法で分離された幹細胞に比べて優れた細胞増殖能を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記の段階を含む臍帯由来幹細胞の分離方法：
（ａ）分離された臍帯組織を、横と縦の長さがそれぞれ２〜４ｍｍに粉砕された切片として製造する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階で得られた切片を培養培地上で培養する段階。

【請求項2】

前記（ａ）段階は、臍帯組織を培養培地内に含入させた後、横と縦の長さがそれぞれ２〜４ｍｍの切片として細かく切断する段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の臍帯由来幹細胞の分離方法。

【請求項3】

前記臍帯組織１ｇ当たりに０．５〜３．０ｍｌの培養培地を添加することを特徴とする、請求項２に記載の臍帯由来幹細胞の分離方法。

【請求項4】

前記培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ、Ｈａｍｓ Ｆ−１０、Ｈａｍｓ Ｆ−１２、ａ−ＭＥＭ（ａ−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の臍帯由来幹細胞の分離方法。

【請求項5】

前記切片は単位面積（ｃｍ^２）当たりに０．０００７〜０．００６８ｇが含まれるように培養することを特徴とする、請求項１に記載の臍帯由来幹細胞の分離方法。

【請求項6】

前記（ｂ）段階は６０〜１２０分間行われることを特徴とする、請求項１に記載の臍帯由来幹細胞の分離方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［技術分野］
本発明は、臍帯由来幹細胞の分離方法に関し、特に、本発明の臍帯由来幹細胞の分離方法を用いて一定サイズの臍帯から顕著に多い数の間葉系幹細胞を分離することができる。
［背景技術］
幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は生物組織を構成する様々な細胞に分化可能な細胞であり、胚芽、胎児及び成体の各組織から得られる分化される前段階の未分化細胞を総称する。幹細胞はその分化能によって、万能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）及び単分化能（ｕｎｉｐｏｔｅｎｃｙ）幹細胞に分けられる。万能幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は全ての細胞に分化できる潜在力を持つ全分化能（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）の細胞であり、胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＥＳ ｃｅｌｌｓ）及び誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ）などがこれに該当する。多分化能及び／又は単分化能幹細胞としては成体幹細胞を挙げることができ、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）などがこれに該当する。

【0002】

幹細胞の利用技術は難病治療の新しい対策案として考えられており（大韓民国公開特許２０１５−００１６１１７号）、これまでは難病治療のために臓器移植や遺伝子治療などが提示されたが、免疫拒否反応や供給臓器不足、又はベクター開発や疾患遺伝子に対する知識不足によって効率的な実用化には至っていない現状である。

【0003】

そこで、幹細胞研究に対する関心が高まりつつあり、幹細胞を用いた臓器再生やパーキンソン病、糖尿病、脊髄損傷などの治療に様々な幹細胞の可能性が提示されてきている。

【0004】

幹細胞源（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ）の確保のための様々な方法がある。倫理的な問題がない成体幹細胞を確保する方法にも、最近、ｉＰＳが新しい可能性を提示しているが、まだ研究のごく初期の段階であり、現実的な代案になるまでは多くの科学的検証を受ける必要がある。

【0005】

上記のような問題点から、骨髄、脂肪などの成体幹細胞源を活用する技術が台頭しているが、前記細胞の増殖はあるレベル以上は不可能である。特に、成人の骨髄及び脂肪由来間葉系幹細胞は、継代培養が続くと幹細胞の老化が急激に進行され、年齢の高い骨髄幹細胞では継代培養そのものが困難となる問題点がある。言い換えると、年齢が高いか、慢性疾患があるほど、幹細胞の品質も低下するといえよう。

【0006】

具体的に、幹細胞の採取年齢が増加すると、採取された幹細胞のコロニー形成能と増殖速度及び分化能が減少し、骨関節炎などの慢性疾患を持つ患者は、採取した幹細胞の増殖力及び分化能が正常群に比べて減少することを確認したことがある。

【0007】

したがって、幹細胞の採取は、患者自身も不便を訴え、品質が悪くて使用できない場合が殆どであり、同種の間葉系幹細胞を移植したり治療するためには品質はもとより迅速な使用を担保し、移植に必要な感染性標識子検査などの移植適合性を判定するために十分な量の幹細胞供給が切実な実情である。すなわち、従来の幹細胞培養、分離技術は非常に制限的であるため、既存に用いた技術では十分な量の幹細胞を提供するに限界がある。

【0008】

成体幹細胞の供給源として、新生児出産と共に排出される生物学的廃棄物は最も若い細胞で構成されている。臍帯血、臍帯、胎盤、羊膜などがそれに該当する組織であり、特に、臍帯血は既に造血幹細胞の供給源として治療において認定されている。しかし、臍帯血由来間葉系幹細胞は分離成功率が非常に低いことが大問題であり、臍帯血保管後に間葉系幹細胞が分離されない場合は諸問題点を引き起こすことがあり、Ｈｏｗｓ等及びＷｅｘｌｅｒ等は、臍帯血からは間葉系幹細胞を分離できないと報告するなど、分離成功率があまり高くない問題がある（Ｈｏｗｓ，１９９２；Ｗｅｘｌｅｒ，２００３；Ｐｏｊｄａ，２００５；Ｂｉｅｂａｃｋ，２００４）。

【0009】

そこで、臍帯組織が新しい細胞治療源として台頭しており、臍帯は胎児組織であるから、胚芽以外の幹細胞を採取できる最も若い組織であり、年齢及び様々な疾患による幹細胞‘品質’の低下を根本的に避けることができ、胚幹細胞と成体幹細胞の短所をともに避けることができるという根本的な長所がある。特に、臍帯由来幹細胞は骨髄由来幹細胞に比べてＣＦＵ−Ｆの数字が大きく、増殖速度が速く、継代培養能力も大きいと報告されている（Ｋａｒａｈｕｓｅｙｉｎｏｇｌｕ，２００７；Ｌｕｎｄ，２００７；Ｂａｋｓｈ，２００７；Ｌｕ，２００６）。

【0010】

これによって、臍帯から最大限の細胞活性を維持しながら多い数の幹細胞を分離する技術が台頭している実情である。

【0011】

上述した背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当するものとして理解してはならないだろう。
［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明者らは、幹細胞を臍帯組織から大量生産できる方法を見つけようと鋭意努力した。その結果、多数の優れた増殖能を有する幹細胞分離ができる戦略を考案し、それを用いて臍帯組織を外植的方法で製造した後、これを培養して幹細胞を大量生産できることを確認し、本発明を完成するに至った。

【0012】

したがって、本発明の目的は、臍帯由来幹細胞の分離方法を提供することにある。

【0013】

本発明の他の目的は、前記分離方法で分離された臍帯由来幹細胞を提供することにある。

【0014】

本発明のさらに他の目的は、前記臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供することにある。

【0015】

本発明のさらに他の目的は、前記臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む薬学組成物を提供することにある。

【0016】

本発明の他の目的及び利点は、下記する発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面からより明らかになる。
［課題を解決するための手段］
本発明は、上記の目的を達成するために、（ａ）分離された臍帯組織を、横と縦の長さが２〜４ｍｍに粉砕された切片として製造する段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階で得られた切片を培養培地上で培養する段階を含む臍帯由来幹細胞の分離方法を提供する。

【0017】

前記臍帯組織１ｇ当たりに０．５〜３．０ｍｌの培養培地を添加することができる。

【0018】

前記培養培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ、Ｈａｍｓ Ｆ−１０、Ｈａｍｓ Ｆ−１２、ａ−ＭＥＭ（ａ−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）からなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり得る。

【0019】

前記切片は、単位面積（ｃｍ^２）当たりに０．０００７〜０．００６８ｇが含まれるように培養することができる。

【0020】

前記（ｂ）段階は６０〜１２０分間行われ得る。

【0021】

本発明は、上記の他の目的を達成するために、前記分離方法から製造された臍帯由来幹細胞を提供する。

【0022】

本発明は、上記のさらに他の目的を達成するために、前記臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。

【0023】

前記分化された細胞は、中胚葉、内胚葉及び外胚葉由来細胞からなる群から選ばれる一つ以上であり得る。

【0024】

前記分化された細胞は、神経細胞、希突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、造骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱又は靭帯細胞及び筋肉細胞からなる群から選ばれる一つ以上であり得る。

【0025】

前記細胞治療剤は、タンパク質又はペプチド製剤、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び遺伝子治療剤からなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことができる。

【0026】

前記細胞治療剤は、抗炎症製剤、幹細胞動員因子及び血管成長誘導因子からなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことができる。

【0027】

前記細胞治療剤は、臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む注射剤形態で提供されたり、或いは支持体又は運搬体に含まれて提供され得る。

【0028】

本発明は、上記のさらに他の目的を達成するために、臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む薬学組成物を提供する。

【0029】

前記薬学組成物は、骨、軟骨、筋肉、腱又は靭帯疾患の予防又は治療用であり得る。

【0030】

前記薬学組成物は、骨代謝性疾患の予防又は治療用であり得る。

【0031】

前記骨代謝性疾患は、骨多孔症、ページェット病、歯周疾患、骨転移癌又はリウマチ関節炎であり得る。
［発明の効果］
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ｉ）本発明は、臍帯から幹細胞を効率的に分離できる方法を提供する。

【0032】

（ｉｉ）また、本発明の分離方法を用いる場合、従来に知られた方法と比較して同一サイズの臍帯から顕著に多数の幹細胞を分離することができる。

【0033】

（ｉｉｉ）本発明の分離方法は、酵素的処理無しに臍帯組織から幹細胞を分離できるので、細胞に与えられるストレスを顕著に抑制できるという点で非常に大きな長所がある。また、本発明の分離方法で分離された幹細胞は、従来の分離方法で分離された幹細胞に比べて優れた細胞増殖能を有する。

【0034】

すなわち、本発明の臍帯由来幹細胞の分離方法は、外植的方法を用いて一定サイズの臍帯から多数の幹細胞を簡単ながらも効率的に分離できる技術であり、この機能を用いて、幹細胞を大量に必要とする分野或いは治療用途に有用に活用することができる。
［図面の簡単な説明］
［図１Ａ］実施例１〜５から製造された時間による組織切片の数を測定して示す図である。

【0035】

［図１Ｂ］実施例１〜５から製造された切片サイズによる細胞数を示すグラフである。

【0036】

［図１Ｃ］実施例１〜５から製造された切片サイズによって培養されたコロニーのサイズを示すグラフである。

【0037】

［図２Ａ］０ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇの培地が入っている培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総切られた組織を示すグラフである。

【0038】

［図２Ｂ］０ｍｌ／ｇ、０．３ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇ、２ｍｌ／ｇ、３ｍｌ／ｇ、４ｍｌ／ｇ、５ｍｌ／ｇの培地が入っているそれぞれの培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総分離細胞数を測定して示すグラフである。

【0039】

［図３Ａ］切片の重量による臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示す。

【0040】

［図３Ｂ］切片の重量による臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフである。

【0041】

［図４Ａ］実施例８から製造された臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフである。

【0042】

［図４Ｂ］実施例８から製造された臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示す。

【0043】

［図５Ａ］実施例９から製造された臍帯由来幹細胞のモルフォロジーを観察するための光学顕微鏡写真である。

【0044】

［図５Ｂ］酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例１）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の培養期間によるＣＰＤＬを測定して示すグラフである。

【0045】

［図５Ｃ］酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例１）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の群集倍加時間（ＰＤＴ）を測定して示すグラフである。

【0046】

［図６］実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の流細胞分析機を用いて分析した免疫表面学的特性を示すグラフである。

【0047】

［図７］実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の脂肪生成（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ａ）、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｂ）、軟骨形成（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃ）、腱発生（Ｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄ）への分化能力を示す図である。
［発明を実施するための形態］
本発明の一態様によれば、本発明は、臍帯由来幹細胞の分離方法を提供する。

【0048】

従来の胚幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）は倫理的な問題が存在し、誘導万能幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）が新しい可能性を提示しているが、まだ研究のごく初期段階であるため現実的な代案となるには多くの科学的検証を受ける必要がある。また、成体幹細胞として脚光を浴びている骨髄又は脂肪幹細胞は、年齢によって幹細胞の頻度、増殖能、分化能が低下し、幹細胞を分離する組織を得るために侵襲的な手術が必要であるという問題がある。

【0049】

このような限界点及び問題点を解決するために、臍帯から酵素や付加的な過程無しに、一定のサイズの切片から、体外増殖能力に優れるとともに分化能力が著しい幹細胞が高収率で得られることを確認し、本発明を完成するに至った。

【0050】

本発明において用語、“臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ）”とは、胎盤と胎児とを結びつけているへその緒を意味する。

【0051】

本発明において用語“臍帯由来幹細胞”とは、臍帯及びこれに関連した組織から分離された幹細胞のことを指し、好ましくは、臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、臍帯静脈内皮（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｖｅｉｎ ｓｕｂｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）、臍帯血管周囲メトリックス（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）、臍帯ウォートンジェリー（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ Ｊｅｌｌｙ）、臍帯羊膜下部位（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｓｕｂａｍｎｉｏｎ）及び羊膜（ａｍｎｉｏｎ）又は羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）と胎盤（ｐｌａｃｅｎｔａ）及び絨毛膜（ｃｈｏｒｉｏｎ）を含み、より好ましくは、臍帯血、臍帯静脈内皮、臍帯血管周囲メトリックス、臍帯ウォートンジェリー又は臍帯羊膜下部位から分離されたものである。

【0052】

特に、臍帯は他の臓器又は組織とは違い、分娩過程で捨てられる物質であり、分娩過程で特別な操作や手術無しで容易に得ることができ、その量に比べて多い幹細胞を含んでいると知られているが、体外で臍帯から幹細胞を培養するためには様々な条件を全て満足させなければならず、培養しても回収可能な幹細胞は非常に少量であるため、治療剤開発に限界があった。

【0053】

本発明の臍帯由来幹細胞の分離方法は、下記の段階を含む：
（ａ）分離された臍帯組織を、横と縦の長さを２〜４ｍｍに粉砕された切片として製造する段階；及び
（ｂ）前記ａ）段階で得られた切片を培養培地上で培養する段階。

【0054】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の分離方法は、培養された臍帯由来幹細胞を回収する段階をさらに含む（段階ｃ）。

【0055】

臍帯は代表的な幹細胞由来組織であり、分娩過程で特別な操作や手術及び副作用無しで採取できるので、幹細胞を分離及び培養するための組織需給上の問題点がなく、異質的細胞から汚染される可能性が低いので、難治性疾患の細胞治療剤の製造目的で分離、培養するのに利点がある。

【0056】

ただし、前述したように、臍帯由来幹細胞は、体外で培養することが非常に複雑で困難であり、たとえ可能であるとしても、収率が顕著に低いため、回収される幹細胞の数が非常に低いか、分化能力が非常に低下しているという問題点がある。

【0057】

したがって、本発明は、幹細胞を大量で回収できながらも、分化能に非常に優れた幹細胞を分離するための方法を提供する。

【0058】

本発明は、まず、（ａ）分離された臍帯組織を横と縦の長さがそれぞれ２〜４ｍｍに粉砕された切片として製造する段階を含む。本発明の分離された臍帯組織の粉砕された切片は、横と縦の長さが２〜４ｍｍサイズの切片が３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上含まれる。最も好ましくは、前記粉砕された切片は、横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍである切片が５０％〜７０％含まれ得るが、組織の切片は六面体であるので、横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍとなるように組織を切片として細かく切断する場合、片のサイズがより均一になって、後述する実験例のように、分離される細胞の数が大きく増加する効果を有する。本発明の臍帯由来幹細胞分離方法の一例として、前記（ａ）段階は、臍帯組織を培養培地内に含入させた後、横と縦の長さがそれぞれ２〜４ｍｍになるように組織を切片として細かく切断する段階を含むことができる。これは、均一なサイズの切片の製造が容易であり、最小限のはさみ作業で少量の組織を均一なサイズの切片として製造できるので、汚染される可能性が低くて分離培養が容易であるという利点がある。

【0059】

このとき、前記臍帯組織１ｇ当たりに０〜１０ｍｌ、好ましくは０〜５．０ｍｌ、より好ましくは０．５〜３．０ｍｌの培養培地が添加されることが好ましいが、仮に前記臍帯組織１ｇ当たりに培養培地が１０．０ｍｌを超える場合、分離細胞数がより減少する問題点が生じ得る。

【0060】

次いで、（ｂ）前記（ａ）段階で得られた切片を培養培地上で培養する。このとき、前記切片は、培養容器の単位面積（ｃｍ^２）当たりに０．０００１〜０．０５ｇ、好ましくは０．０００６〜０．０３ｇ、より好ましくは０．０００６〜０．０１３５ｇ、最も好ましくは０．０００７〜０．００６８ｇが含まれるように培養することが好ましい。仮に、前記切片が培養容器の単位面積（ｃｍ^２）当たりに０．０００１ｇ未満で含まれるか、或いは０．０５ｇを超えて含まれる場合、分離細胞数が顕著に減少する問題が生じ得る。

【0061】

また、前記（ｂ）段階は、１分〜６００分、好ましくは１０分〜１８０分、より好ましくは３０分〜１２０分、最も好ましくは６０分〜１２０分間行われることが好ましいが、これも同様、１分未満で培養されるか、６００分を超えて培養される場合、分離細胞数が顕著に減少することがある。

【0062】

本発明は、上述したそれぞれの培養条件を全て満たして培養する場合、切片１ｇ当たりに１×１０^６〜５×１０^６個の細胞を分離でき、好ましくは１．５×１０^６〜２×１０^６個を分離できることを確認した。これは従来の様々な方法に比べて最も優れた効果であることを、次表１から確認できる。

【0063】

【表1】

【0064】

前記培養培地は、生体外で臍帯由来幹細胞の活性を維持したり或いは増殖を誘導できる培地を意味でき、哺乳動物細胞培養に用いられる通常の培地を全て含むことができる。本発明の一例として、商業的に製造された培養培地であるＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ、Ｈａｍｓ Ｆ−１０、Ｈａｍｓ Ｆ−１２、ａ−ＭＥＭ（ａ−Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）及びＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）などを用いることができる。

【0065】

また、本発明の培養培地内には、臍帯由来幹細胞の増殖を促進させ得る血清（すなわち、ヒトを含む動物の血清）及び／又は成長因子をさらに含むことができ、これらの成長因子は、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、インスリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｇａｃｔｏｒ）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＲＰ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ ｐｌａｓｍａ）及びＳＣＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ（ＰＬ）、ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）などを含むことができるが、これに制限されない。

【0066】

また、前記成長培養液は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどの抗生剤を含むことができる。

【0067】

本発明の培養培地は、ＤＭＥＭ：ＨａｍｓＦ１２（１：１）培養液、ウシ胎児血清、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ゲンタマイシンで構成され得、より具体的に７０〜９５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のＤＭＥＭ：ＨａｍｓＦ１２（１：１）培養液、５〜１５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％のウシ胎児血清、５〜５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、０．５〜１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、５〜５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、５〜５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンで構成され得る。

【0068】

最終的に、培養された幹細胞を回収する。前記過程によって製造された臍帯由来幹細胞を増幅させることができ、この増幅方法は特に限定されないが、好ましくは単層培養法を用いることができる。前記過程によって回収した臍帯由来幹細胞を培養容器に播種後、培養容器表面積の６０〜９０％を占めると、それらの細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで処理して培養容器から剥がし、新しい培養容器に再び播種する継代培養を用いて、治療容量に必要な細胞数を増幅培養することができる。

【0069】

本発明の臍帯由来幹細胞の培養方法は、少量の臍帯からこれを無限反復して培養できるので、反復的臍帯組織の採取無しで難治性疾患の治療に必要な量の幹細胞を分離することができる。

【0070】

前記臍帯由来幹細胞は間葉系幹細胞であり、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）及びこれら由来の組織及び組織細胞に分化可能である。

【0071】

本発明の好ましい具現例によれば、前記中胚葉起源細胞は、造骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞及び骨格筋細胞からなる群から選ばれる一つ以上である。

【0072】

本発明の一実施例によれば、本発明の臍帯由来幹細胞は、脂肪分化（Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）、骨粉化（Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）、軟骨分化（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ）及び腱／靭帯分化（Ｔｅｎｏ／ｌｉｇａｍｅｎｔｏｇｎｉｃ）能力を有することを確認した。

【0073】

前記臍帯由来幹細胞は、１つの細胞が２つの細胞に分裂する倍加時間が３０〜５０時間であり、優れた体外成長能力を示し得る。従来の培養方法によって得た間葉系幹細胞では１つの細胞が２つの細胞に分裂するのに６０時間以上がかかる点に比べて、体外成長能力に優れるので、短時間で難治性疾患の治療に必要な有効容量の幹細胞を確保できるという長所がある。

【0074】

前記臍帯由来幹細胞は間葉系幹細胞であり得、神経細胞、希突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、造骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱及び靭帯細胞、筋肉細胞などに分化でき、これに制限されない。

【0075】

前記臍帯由来幹細胞が自発的に分化可能な細胞はその種類に特に限定はないが、好ましくは、造骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱及び靭帯細胞、筋肉細胞などに分化できる。

【0076】

本発明の他の態様によれば、本発明は、前記分離方法によって製造された臍帯由来幹細胞を提供する。

【0077】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記分離方法によって製造された臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。

【0078】

前記細胞治療剤は、臍帯由来幹細胞を、特別な分化過程無しに直接利用することもでき、或いは、細胞治療をしようと目的する細胞に分化して利用することができる。

【0079】

前記細胞治療剤における分化された細胞は特に限定されるものではないが、一例として、神経細胞、希突起膠細胞、星状細胞、シュワン細胞、造骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、腱及び靭帯細胞、筋肉細胞などからなる群から選ばれる一つ以上の細胞を含むことができる。

【0080】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の細胞治療剤は、タンパク質又はペプチド製剤、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び遺伝子治療剤からなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことができる。

【0081】

また、本発明の細胞治療剤は、前記幹細胞が内胚葉、中胚葉及び外胚葉などに分化して示す効果の他にも、幹細胞が分泌するｍｉＲＮＡなどを含有するエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）やマイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を含むＭＳＣ由来細胞外小胞（ＭＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）及び基質による周辺分泌効果（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）をさらに保有することができ、前記幹細胞の周辺分泌効果については当業界によく知られている（韓国公開特許第２０１７−０１０３６９７号（肝線維症の治療）、米国公開特許第２０１５−０１９０４２９号（抗炎及び免疫抑制作用）、ヨーロッパ公開特許第３１４５４９３号（肺疾患の治療）、中国公開特許第１０１８５４９４１号（急性腎不全の治療）など）。

【0082】

前記細胞治療剤の臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を細胞治療剤として用いる方法は特に限定されないが、従来の当業界に公知の方法を用いることができ、好ましくは、前記臍帯由来幹細胞を支持体或いは運搬体に入れて提供することができる。

【0083】

前記支持体或いは運搬体は、宿主に実質的に有害な反応を誘発せず、必要時に生分解又は生物学的システムから自然的に除去可能な及び／又は生物学的システムに化学的に混入可能なものであり得る。前記支持体或いは運搬体はその種類に特に限定はないが、好ましくは、フィブリン、血小板溶解物（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｌｙｓａｔｅ）、血小板豊富血漿（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ，ＰＲＰ）、天然及び合成高分子などを含むゲル又はハイドロゲルの形態であり得る。

【0084】

前記臍帯由来幹細胞は、ハイドロゲルと混合して細胞治療剤として用いることができる。前記使用可能なハイドロゲルは特に限定されないが、天然高分子で構成されたハイドロゲルであり得、好ましくはコラーゲンハイドロゲルであり得る。一例として、コラーゲンハイドロゲルを使用時に、コラーゲン濃度を調節して生体内で分解速度を調節することができる。前記ハイドロゲルは、細胞注入時に血液内に消失される短所を防止することができ、また、損傷部位内炎症細胞及び酵素による細胞損傷を減少させることができる。

【0085】

前記細胞治療剤はさらに、抗炎症製剤、幹細胞動員因子及び血管成長誘導因子からなる群から選ばれる一つ以上を含むことができる。

【0086】

前記抗炎症製剤は、ハイドロゲルが移植された臍帯由来幹細胞を、過度な炎症反応から保護するために用いることができ、幹細胞動員因子又は血管成長誘導因子を含むことによって末梢神経内幹細胞の動員及び血管成長を誘導し、細胞再生効果を増大させることができる。

【0087】

前記抗炎症製剤は特に限定されないが、一例として、ＣＯＸ抑制剤、ＡＣＥ抑制剤、サリチル酸塩（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）及びテストステロン（Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）などを含むステロイド及びタンパク同化ステロイド（ａｎａｂｏｌｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄ）製剤及びその前駆物質などからなる群から選ばれる一つ以上を含むことができる。

【0088】

前記幹細胞動員因子は特に限定されないが、一例として、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＥＧＦからなる群から選ばれる一つ以上を含むことができる。

【0089】

前記血管成長誘導因子は特に限定されないが、一例として、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＣＧＦ及びアンギオゲニン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）からなる群から選ばれる一つ以上を含むことができる。

【0090】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の細胞治療剤は、タンパク質又はペプチド製剤、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び遺伝子治療剤から構成された群から選ばれる一つ以上の物質と共に用いることができる。

【0091】

本発明の細胞治療剤は、臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む注射剤の形態で提供されたり、或いは支持体又は運搬体に含まれて提供され得る。

【0092】

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む薬学組成物を提供する。

【0093】

本発明の薬学組成物は、幹細胞が保有する組織再生能及びこれを用いた疾患の予防又は治療効果、幹細胞の周辺分泌効果（ｐａｒａｃｒｉｎｅ ｅｆｆｅｃｔ）に起因した抗炎症及び免疫調節効果を呈することができる。

【0094】

本発明の薬学組成物が保有する組織再生能及びこれを用いた疾患の予防又は治療効果は、好ましくは、１）循環系において、心臓、血液及び血管の損傷及びこれによる疾患、２）外皮系において、皮膚、毛髪、脂肪、爪の損傷及びこれによる疾患、３）骨格系において、骨、軟骨、腱、靭帯及び筋肉の損傷及びこれによる疾患、４）生殖器官において、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、皐丸、精管、精液及び前立腺のような性器の損傷及びこれによる疾患、５）消化器官において、唾液腺、食道、胃、肝、胆嚢、膵臓、内臓、直腸及び肛門の損傷及びこれによる疾患、６）泌尿器官において、体液、電解質均衡、腎臓、尿管、膀胱及び尿道の損傷及びこれによる疾患、７）呼吸器システムにおいて、気管、咽頭、喉頭、気管支、肺及び横隔膜の損傷及びこれによる疾患、８）内分泌系において、視床下部脳下垂体、松果体又は松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎及び内分泌腺の損傷及びこれによる疾患、９）免疫体系において、免疫体系の損傷及びこれによる疾患、１０）リンパ系において、リンパノードと血管の損傷及びこれによる疾患、１１）筋肉系において、骨格筋肉、平滑筋及び心臓筋肉の損傷及びこれによる疾患、１２）神経系において、脳、脊髄、自律神経及び末梢神経系の損傷及びこれによる疾患を含むが、これに限定されない。

【0095】

本発明の薬学組成物が保有する抗炎症及び免疫調節効果は、好ましくは、１）関節炎、ベーチェット病、痛風などをはじめとする関節炎及び様々な器官及び組織における炎症性疾患、２）ループス、アトピー、リウマチ関節炎などの疾患、３）癌をはじめとする腫瘍、４）感染性疾患及びショック、５）移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）時拒否反応治療及びＧＶＨＤ治療を含むが、これに制限されない。

【0096】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬学組成物は、骨、軟骨、筋肉、腱又は靭帯疾患の予防又は治療用に用いることができる。

【0097】

本発明の薬学組成物は骨代謝性疾患の予防又は治療用に用いることができ、好ましくは、骨多孔症、ページェット病、歯周疾患、骨転移癌又はリウマチ関節炎の予防又は治療目的に用いることができる。

【0098】

本発明の分離方法によって６０〜１２０分内に多量の臍帯由来幹細胞を培養することができ、ＰＤＴが３０〜５０時間であって体外成長能力に優れるので、短時間内に細胞治療剤として使用可能な有効量を得ることができる。

【0099】

本発明の臍帯由来幹細胞は、体外増殖能力、優れた多分化能を有するので、組織再生能及びこれを用いた疾患の予防又は治療効果及び／又は抗炎症及び免疫調節効果を示す薬学組成物として効果的に活用することができる。

【0100】

本発明の薬学組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。

【0101】

本発明の薬学組成物は、経口又は非経口で投与でき、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与できる。

【0102】

本発明の薬学組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師は、所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。

【0103】

本発明の薬学組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されてもよく、多回容量の容器内に内入させて製造されてもよい。このとき、剤形は、本発明の臍帯由来幹細胞又はその分化された細胞を有効成分として含む注射剤の形態で提供されてもよく、支持体又は運搬体に含まれて提供されてもよく、必要によって、タンパク質又はペプチド製剤、グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、プロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、成長因子（ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）及び遺伝子治療剤から構成された群から選ばれる一つ以上の物質と共に提供され得る。
［発明を実施するための形態]
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の要旨によって本発明の範囲がそれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0104】

実験方法
１．ＣＦＵ−Ｆ実験（Ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＣＦＵ−Ｆ ａｓｓａｙ）
培養１４日に培養容器をＤＰＢＳで２回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した後、０．１％クリスタルバイオレット（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液で１０分間染色した。染色された細胞の数が５０個以上の細胞集合体をＣＦＵ−Ｆで定義し、個数と面積を測定した。

【0105】

２．幹細胞の増殖能分析（Ｇｒｏｗｔｈ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｓｓａｙ）
増殖能は累積集団倍加数（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ；ＣＰＤＬ）と集団倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ；ＰＤＴ）を測定して分析した。９継代間培養し、総培養期間は分離期間を含めて６０日がかかった。累積集団倍加数を測定するために、臍帯幹細胞を培養容器に３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で接種後、各継代培養ごとに細胞数をトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）で測定した。次のような公式を用いて値を算出し、Ｎｉは初期細胞数、Ｎｆは最後の細胞数を表す。全ての実験は３回反復した。ＰＤ＝Ｌｏｇ（Ｎｆ／Ｎｉ）／Ｌｏｇ２、ＰＤＴ＝ＣＴ／ＰＤ
３．免疫表現型分析（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
細胞表面抗原の免疫表現型を分析するために３世代継代培養細胞（Ｐ３）を用いて流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行った。ＤＰＢＳで洗浄した細胞を２×１０^５個ずつ分注し遠心分離後に、冷たい染色緩衝溶液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、ＤＰＢＳ、０．１％アジ化ナトリウム、及び２％ウシ胎児血清）を入れる。

【0106】

総８個の抗体（ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０（以上、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＣＤ１０５（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）又はＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）が結合された抗体を、４℃、暗室で３０分間反応させた。その後、ＤＰＢＳで洗浄後に１％パラホルムアルデヒドで細胞を固定させた。それぞれに該当する同種対照抗体（ｉｓｏｔｙｐｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌｓ）としてＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１−ＰＥ、ＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ（以上、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）が用いられた。データは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａとＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）を用いて総１０，０００個のイベントを分析した。

【0107】

４．実時間逆転写重合酵素連鎖反応
実時間逆転写重合酵素連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｑＰＣＲ）を用いて脂肪、骨、軟骨、腱細胞特異遺伝子の発現を確認した。まず、各細胞の全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）を分離するために、ＨｉＹｉｅｌｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｒｅａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｗａｎ）を利用し、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）を用いて２６０ｎｍと２８０ｎｍにおける吸光度を測定した後、流出液中の全ＲＮＡを定量した。それぞれの全ＲＮＡ １μｇを５０μＭオリゴ（ｄＴ）、１０ｍＭ ｄＮＴＰと混合し、最終体積が１０ｕｌになるように蒸留水を加えた後、６５℃で５分間反応させた後、この溶液を１０Ｘ ＲＴバッファー、２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１Ｍ ＤＴＴ、４０Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅＯｕｔ、２００Ｕ／ｍＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））混合溶液と混ぜて５０℃、５０分間反応させ、８５℃で５分反応させた。４℃で冷ました溶液に２Ｕ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ｈ溶液を添加した後、３７℃で２０分間反応させてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは、Ｔａｑ−Ｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて次の遺伝子発現を実時間で確認した；ａＰ２（ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ０１０８６１７７＿ｍ１）、ＯＰＮ（ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００９５９０１０＿ｍ１）、Ａｇｇｒｅｃａｎ（ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ００１５３９３６＿ｍ１）、ＳＣＸ Ａ／Ｂ（ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ０３０５４６３４＿ｇ１）、ＧＡＰＤＨ（ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１）。重合酵素連鎖反応はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）機械を用いて、変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）段階９５℃で１０分、アニール段階９５℃１０秒、６０℃１分、７２℃４秒であり、６０サイクル数に合わせて実験した後、重合反応（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）は７２℃で７分間反応して結果を観察した。遺伝子発現の定量化は、ＧＡＰＤＨの発現程度を対照群にして計算した。

【0108】

実施例
＜実施例１〜５＞臍帯組織由来幹細胞の培養
臍帯は、臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。大量の臍帯をはさみで均一に切るために、およそ、横、縦及び高さがそれぞれ５ｃｍである単位片に切った後、臍帯組織を、横、縦及び高さがそれぞれ１ｍｍ未満のものから１０ｍｍまで（≦１ｍｍ（実施例１）、１〜２ｍｍ（実施例２）、２〜４ｍｍ（実施例３）、＞４ｍｍ（実施例４）、１０ｍｍ（実施例５））多様に切断した切片（ｅｘｐｌａｎｔ）を、それぞれ滅菌された状態のＤＭＥＭ培地が入っている培養容器（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）に整列して接種した後、切片が培養容器に完全に付着された後、培養培地を添加した。

【0109】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0110】

＜実施例６＞切片製造時に、培養培地の有無による臍帯組織由来幹細胞の培養
臍帯は、臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。

【0111】

採取した臍帯は多量で粘性の特徴があるので、はさみで切断時に時間がかかるとい不具合がある。そのため、分離時間を節約し、多い数の細胞を分離するために、前記回収した臍帯組織を、臍帯組織１ｇ当たり０〜５ｍｌの培養培地を添加した後、横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍとなるように細かく切って切片を製造した。前記切片を培養容器に整列して接種し、完全に付着された後、培養培地を添加した。

【0112】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0113】

＜実施例７＞臍帯の初期接種容量による臍帯組織由来幹細胞の培養
臍帯は臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。

【0114】

前記臍帯組織をさらに横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍとなるように切って切片を製造した後、前記切片（ｅｘｐｌａｎｔ）を培養容器の面積（ｃｍ^２）に対して重量が０〜１３．５ｍｇになるように培養容器に整列して接種した。切片が培養容器に完全に付着された後、培養培地を慎重に添加した。

【0115】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0116】

＜実施例８＞付着時間による臍帯組織由来幹細胞の培養
臍帯は、臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。

【0117】

前記臍帯組織を横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍとなるように切断して切片（ｅｘｐｌａｎｔ）を製造した。前記切片を培養容器（ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）に付着させて３７℃、５％ ＣＯ_２が供給される培養器内で１０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分間それぞれインキュベーターに放置した。

【0118】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0119】

＜実施例９＞全ての条件を満たす臍帯由来幹細胞の分離
臍帯は、臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。

【0120】

前記回収した臍帯組織を臍帯組織１ｇ当たり０〜２ｍｌの培養培地を添加した後、横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍとなるように細かく切って切片（ｅｘｐｌａｎｔ）を製造した。前記切片（ｅｘｐｌａｎｔ）を培養容器の面積（ｃｍ^２）に対して重量が０．７〜６．８ｍｇとなるように培養容器に整列して接種した。これを３７℃、５％ ＣＯ_２が供給される培養器内で６０分間それぞれインキュベーターに放置した。

【0121】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0122】

＜比較例１＞臍帯組織由来幹細胞の培養
臍帯は臨月の正常産婦から帝王切開又は経膣分娩後に産婦の同意下に採取した。前記採取した臍帯は、抗生剤（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（抗生物質−抗真菌剤溶液；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ））が添加されたカルシウム及びマグネシウム不在Ｄｕｌｂｅｃｃｏリン酸塩緩衝食塩水（Ｃａ^２＋，Ｍｇ^２＋−ｆｒｅｅ Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＤＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）で２〜３回洗浄して臍帯外部の血液を除去した後、長さと重さを測定した。大量の臍帯をはさみで均一に切るために約５ｃｍ単位に切った。

【0123】

前記臍帯をはさみとカッターを用いてそれぞれ１〜２ｍｍ横、縦及び高さに細かく切った後、０．１％第１型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と抗生剤が含まれている低グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＬＧ ＤＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）内で軽く撹拌しながら３７℃で２時間処理した。その後、同量の培養培地（ＬＧ ＤＭＥＭ，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）、及び抗生物質−抗真菌剤溶液）を添加した後、分解されていない組織を１００−μｍ細胞濾過器を用いて除去した。２０℃で５００ｇで１５分間遠心分離して細胞を集め、培養培地で２回洗浄した。分離された細胞をトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて細胞数を計数し、１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２密度で１５０ｍｍ培養容器に入れ、３７℃、５％ ＣＯ_２が供給される培養器内で培養した。培養３日後、培養容器の底に付着していない細胞を培地交換によって除去した後、１週に２〜３回培養液を入れ替えた。

【0124】

培養容器の６０〜８０％程度に細胞が育つとＤＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．０５％トリプシン及び０．５３ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ；Ｗｅｌｇｅｎｅ，Ｄａｅｇｕ，Ｋｏｒｅａ）を３分間処理して付着された細胞を剥がした後、細胞はトリパンブルー除外方式（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）を用いて染色した後に計数し、３，３３３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養し続けた。

【0125】

実験例１．実施例１〜５及び比較例１による臍帯由来幹細胞の分離細胞数測定
実施例１〜４及び比較例１から回収した細胞の数を数えた。その結果は図１及び表２の通りである。

【0126】

図１Ａは、はさみ作業時間によって製造された実施例１〜４の臍帯由来幹細胞を示す図であり、図１Ｂは、実施例１から製造された切片サイズによる臍帯由来幹細胞の分離細胞数を示すグラフであり、図１Ｃは、実施例１から製造された切片サイズによって培養された臍帯由来幹細胞のコロニーサイズを示すグラフである。

【0127】

図１によれば、実施例３から分離した臍帯由来幹細胞の細胞数を測定した結果、１．８６±０．４９×１０^６／ｇ細胞数が測定され、ＣＦＵ−ｆ染色結果からも同一の結果が測定された。すなわち、比較例１、実施例１、２、４、５に比べてより多くの細胞が実施例３から分離されたことを確認した。また、効率的な細胞分離のために理想的な臍帯サイズである実施例３の切片を製造するためには、はさみ作業１分が最も好適であることを確認した。

【0128】

また、はさみ作業を１分行った結果、横、細胞及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍである切片が５０％以上含まれ、これによって製造された実施例３の臍帯由来幹細胞は、後述する実験例から、細胞増殖などの面において非常に容易であることが分かる。

【0129】

【表2】

【0130】

実験例２：実施例６による分離細胞数測定
図２Ａは、０ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇの培地が入っている培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総切られた組織を示すグラフであり、図２Ｂは、０ｍｌ／ｇ、０．３ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇ、２ｍｌ／ｇ、３ｍｌ／ｇ、４ｍｌ／ｇ、５ｍｌ／ｇの培地が入っているそれぞれの培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総分離細胞数を測定して示すグラフである。

【0131】

【表3】

【0132】

【表4】

【0133】

図２及び表３、表４に示すように、培地を入れて臍帯組織を切ると、より細かく、より多くの切片に切られることを確認した。臍帯組織１ｇ当たりに０、０．３、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍｌの培養培地を入れて臍帯を切った後、８０％占有率（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になると細胞数測定をした。臍帯組織を切片にして外植する時、培地の量が多いほど臍帯組織がより細かく切られるが、分離細胞数はより減少することを確認した。

【0134】

したがって、臍帯組織１ｇを基準に培養培地の量は０〜５．０ｍｌ、好ましくは０．５〜３ｍｌであることを確認した。具体的に、培地を入れずに切片を製造した時に比べて、培地と一緒に臍帯組織を切る場合、切片の個数が１．４倍増加した。

【0135】

また、実施例３の臍帯由来幹細胞において、その他サイズの切片を用いた場合に比べて有意に大きいＣＦＵ−Ｆ面積を示すことを確認した。特に、切片１ｇ当たりに２〜４ｍｍサイズの切片を５０％以上含んでいる実施例３は、総ＣＦＵ−Ｆ面積が９．０±０．４ｃｍ^２で、実施例２は４．２±１．２ｃｍ^２で、比較例１は４．５±０．０ｃｍ^２であった。

【0136】

実験例３：切片の量による分離細胞数測定
１５０ｍｍ培養容器に移送された、外植片（ｅｘｐｌａｎｔ）の重量（ｇ）による分離細胞数変化を確認した。１５０ｍｍ培養容器に０．１ｇ、０．５ｇ、１．０ｇ、２．０ｇの２〜４ｍｍ切片を整列した後、２週間培養した後、８０％占有率になった時、分離細胞数を測定し、ＣＦＵ−ｆをした。

【0137】

図３Ａは、切片の重量による実施例７の臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示している。図３Ｂは、切片の重量による臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフである。

【0138】

【表5】

【0139】

図３及び表５に示すように、切片の重量によって分離細胞数は大きな差を示さなかたったが、切片の重量が多いほど、コロニーの個数が増加したことを確認した。特に、０．１ｇ、１ｇ、２ｇ、５ｇでは有意の差を示し、１．０ｇ及び２．０ｇの切片を含めた場合、これから分離された臍帯由来幹細胞のコロニー個数には差がなかった。

【0140】

しかも、切片の重量による培養容器の単位面積に換算すれば（０．０００７〜０．０１３５ｇ／ｃｍ^２）、却って２．０ｇの切片を入れた培養容器では臍帯由来幹細胞の分離細胞数が減少することが確認された。すなわち、実施例５のように切片重量によって分離された臍帯由来成体幹細胞は臍帯組織の重量が過度に多いほど却って低下するので、前記切片が単位面積（ｃｍ^２）当たりに０．０００７〜０．００６８ｇ含まれるように培養することが、最も多い臍帯由来幹細胞が得られることが確認できる。

【0141】

実験例４：付着時間による臍帯由来幹細胞の分離細胞数分析
付着時間による効果を評価するために、実施例８によって製造された臍帯由来幹細胞をＣＯ_２培養器で１０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分間培養及び付着させ、その分離細胞数を測定し、ＣＦＵ−ｆをした。

【0142】

図４Ａは、実施例８から製造された臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフであり、図４Ｂは、実施例８から製造された臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示している。

【0143】

【表6】

【0144】

図４及び表６に示すように、切片を長く付着させるほど分離細胞数も漸次増加したことを確認し、６０分間付着時に最大分離細胞数が測定された。

【0145】

しかし、１２０分を超えると分離細胞数がますます減少し、これはＣＦＵ−ｆの数を測定した結果からも同一傾向を示すことが確認された。具体的に、ＣＦＵ−Ｆの面積は６０分付着時に４５．７±６．９ｃｍ^２と最大面積を示し、１２０分及び１８０分付着時に、６０分付着時と比べて有意の差がなかった。

【0146】

要すると、横、縦及び高さがそれぞれ２〜４ｍｍに製造された臍帯組織の切片を培養容器に整列した後に培養器で６０分間培養することが、最も好ましいということを確認した。

【0147】

実験例５：成長特性
培養培地から回収した臍帯由来幹細胞の群集倍加時間（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ，ＰＤＴ）を測定するために、実施例９から製造された細胞を４８−マルチウェル培養容器に播種して培養した。ＰＤＴは公式、ＰＤＴ＝［（ｄａｙｓ ｉｎ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｐｈａｓｅ）／（（ｌｏｇＮ２−ｌｏｇＮ１）／ｌｏｇ２）］によって算定した。このとき、Ｎ１は指数成長期の初期における細胞数であり、Ｎ２は指数成長期の末期における細胞数である。

【0148】

図５Ａは、実施例９から製造された臍帯由来幹細胞のモルフォロジーを観察するための光学顕微鏡写真であり、図５Ｂは、酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例２）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の培養期間によるＣＰＤＬを測定して示すグラフであり、図５Ｃは、酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例２）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の群集倍加時間（ＰＤＴ）を測定して示すグラフである。

【0149】

【表7】

【0150】

図５Ａに示すように、本発明の方法を用いて製造された臍帯由来幹細胞は防錘形の形状を示し、継代培養においても繊維芽細胞形態の特徴的な幹細胞形状を維持していることを確認した。

【0151】

図５Ｂ及び図５Ｃに示すように、実施例９から製造された臍帯由来幹細胞のＣＰＤＬは、培養６０日と８８日後、それぞれ３５．５±２．３６と５５．８±１．９６であり、比較例１から製造された臍帯由来幹細胞及び既存に報告された研究における値よりも顕著に大きいことを確認した。

【0152】

また、図５及び表７に示すように、本発明の実施例９から製造された臍帯由来幹細胞は、比較例１から分離された臍帯由来幹細胞に比べて、Ｐ２、Ｐ５、Ｐ７、及びＰ９の培養段階のいずれにおいても有意に小さなＰＤＴを示した。また、実施例９の臍帯由来幹細胞は、継代培養が増加することに伴うＰＤＴ変化が観察されなかった。

【0153】

実験例６：免疫表現型分析（Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
前述した免疫表現型分析法を用いて分析した。一般に、間葉系幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５で陽性であり、ＣＤ１１ｂ（又はＣＤ１４）、ＣＤ１９（又はＣＤ７９ａｌｐｈａ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲで陰性を示すものと知られている。したがって、本発明の方法で分離された臍帯由来幹細胞もこの基準に適する所見が見られると予想し、分析を行った。

【0154】

図６は、実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の流細胞分析機を用いて分析した免疫表面学的特性を示すグラフであり、その結果を表８に整理した。これによれば、実施例９から分離した臍帯由来幹細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５（＞９５％）で強く陽性であったが、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ３４及びＣＤ４５では陰性であった（＜１．５％）。

【0155】

【表8】

【0156】

実験例７：臍帯由来幹細胞の多分化能力
１）脂肪細胞への分化能力
実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の脂肪細胞で分化能力を評価するために、８，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養容器に入れて６０〜８０％程度に満たされると、脂肪細胞分化培養液（１０％ウシ胎児血清、１％抗生剤溶液、０．５ｍＭ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、１μＭデキサメタゾン、５μｇ／ｍｌインスリン（Ｇｉｂｃｏ）、６０μＭインドメタシン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＬＧ−ＤＭＥＭ）で２１日間培養した。オイルレッドＯ（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ）染色と脂肪細胞マーカー遺伝子発現によって分化程度を確認した。オイルレッドＯ染色は、培養した細胞を１回蒸留水で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定させた後、３回洗浄後に０．１８％オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）溶液を適用して常温で１０分間反応させ、蒸留水で洗浄後に観察した。

【0157】

図７は、実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の脂肪細胞（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ａ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｂ）、軟骨細胞（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃ）、腱細胞（Ｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄ）への分化能力を示す図である。

【0158】

図７Ａで提示するように、臍帯由来幹細胞は脂肪細胞への分化を誘導した後、中性脂質蓄積を示す赤色が観察され（ＰＰＡＲγ２）、脂タンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び脂肪細胞タンパク質２（ａＰ２）の発現が有意に増加することを確認した。具体的に、脂肪分化マーカーであるａＰ２が３５５±３１．９４倍と未分化細胞においてより高く測定された。

【0159】

２）骨細胞への分化能力
実施例９から分離された臍帯由来幹細胞の骨細胞への分化能力を評価するために、８，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２の密度で細胞を培養皿に入れ、６０〜８０％程度に満たされると粉化培養液（１０％ウシ胎児血清、１％抗生剤溶液、１００ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、１０ｍＭ β−グリセロリン酸塩（Ｓｉｇｍａ）、０．２ｍＭアスコルビン酸２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ）を添加したＬＧ−ＤＭＥＭ）で２１日間培養した。フォン−コッサ（Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ）染色と骨マーカー遺伝子発現によって分化程度を確認した。フォン−コッサ染色は＜蒸留水で１回洗浄した培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温で１時間固定させ、３回洗浄後、５％硝酸銀（Ｓｉｇｍａ）溶液を６０Ｗランプ下で１時間適用して反応させた。その後、蒸留水で３回洗浄後、５％チオ硫酸ナトリウムで５分間処理し、０．１％ニュークリアファストレッド（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｓｔ ｒｅｄ）溶液を５分間反応させて観察した。

【0160】

図７Ｂに示すように、細胞外カルシウムの存在を確認し、実時間ＰＣＲでＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）、ＡＬＰ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）及びＯＰＮ（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ）発現レベルが未分化細胞に比べて有意に高いことを確認した。具体的に、骨分化マーカーであるＯＰＮが未分化細胞に比べて５．９±１．９４倍さらに高く検出された。したがって、本発明による臍帯由来幹細胞は造骨細胞への分化能力を有することが確認できる。

【0161】

３）軟骨細胞への分化能力
軟骨細胞への分化能力を評価するために、実施例９から製造された臍帯由来幹細胞を、ウシ胎児血清が含まれないＨＧ−ＤＭＥＭ培地に２×１０^５個の細胞を浮遊した後、１５ｍｌポリプロピレンチューブ（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｔｕｂｅ）に入れて遠心分離し、３次元培養のためのペレットを得た。ＤＭＥＭ−ＨＧに５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２−リン酸塩、１００ｎＭデキサメタゾン、１００μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム、４０μｇ／ｍｌプロリン、１０ｎｇ／ｍｌ形質転換成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）−β１、１Ｘインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｒｅｎｉｔｅ）（ＩＴＳ；Ｇｉｂｃｏ）が添加された分化培地で２１日間培養した。軟骨細胞への分化程度を確認するために、サフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ Ｏ）染色と軟骨細胞マーカー遺伝子発現によって分化程度を確認した。サフラニンＯ染色をするために、ペレットを４％パラホルムアルデヒド溶液に４℃で２４時間固定した後、５μｍ標本として作った。０．２％サフラニンＯ溶液で１０分間染色し、蒸留水で洗浄後、０．０４％ファストグリーン（ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ）溶液で１５秒間反応させて軟骨細胞分化の有無を観察した。

【0162】

図７Ｃに示すように、分化された臍帯由来幹細胞でサフラニンＯ染色されたアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）が確認されたところ、未分化細胞に比べて軟骨細胞分化能が高いことを確認した。また、軟骨分化マーカーであるアグレカンが未分化細胞に比べて５．１±１．６５倍さらに高く検出されたところ、このことから、本発明に係る臍帯由来幹細胞は軟骨細胞に分化可能であることを確認した。

【0163】

４）腱細胞への分化能力
腱細胞への分化能力を評価するために、実施例９から製造された臍帯由来幹細胞は腱細胞に分化させるために、まず、３５ｍｍ培養皿にＳＹＬＧＡＲＤ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ，ＵＳＡ）を注いで１〜２週間コーティングさせた後、５ｍｍサイズの２つの絹縫合糸（ｓｉｌｋ ｓｕｔｕｒｅ）をＳＹＬＧＡＲＤ上に入れた。培養皿と縫合糸はクリーンベンチで１００％エタノール及びＵＶを用いて滅菌し、２時間乾かした後、ＤＭＥＭを３７℃ ＣＯ_２インキュベーターで１時間あらかじめ浸して置く。２×１０^５個の細胞をトロンビン混合溶液（ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅ；１０％ウシ胎児血清追加ＤＭＥＭ、１％抗生剤溶液、１Ｕ／ｍｌトロンビン（Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＫ）、２００μＭアミノヘキサン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ））と混ぜ、１０ｍｇ／ｍｌフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）溶液を入れた。この混合溶液をＳＹＬＧＡＲＤがコーティングされた培養皿の表面に迅速に展開し、３７℃で１時間放置した。その後、ＤＭＥＭ−ＨＧに２５０μＭアスコルビン酸、５０μＭ Ｌ−プロリンが含まれている腱細胞分化培養液で１４日間培養した。腱細胞への分化程度を確認するためにＨ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）、ピクロシリウスレッド（ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）、免疫組織化学染色を施した。また、腱細胞マーカー遺伝子発現によって分化程度を確認した。細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液に２４時間固定した後、パラフィンに包埋して１０μｍの薄切標本にした後、Ｈ＆Ｅ（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）染色とピクロシリウスレッド染色を施し、また、免疫組織化学染色のためにａｎｔｉ−Ｃｏｌ Ｉ（Ａｂｃａｍ）を１：２００に希釈して常温で２時間反応させ、ＨＲＰが結合されている２次抗体を室温で３０分反応させた後に観察した。

【0164】

図７Ｄに示すように、長い軸に沿って整列された繊維素構造の存在を確認したが、具体的に、Ｈ＆Ｅ染色を用いて、健康な腱基質と類似の薄い赤色で染色された基質及び防錘形の細胞を確認した。前記腱基質がピクロシリウスレッドによって黄色に染色される第１型コラーゲンであることが確認できた。第１型コラーゲン抗体を用いた免疫組織化学染色によって前記部分が第１型コラーゲンであることを再び確認した。

【0165】

実時間ＰＣＲで分化された実施例９から製造された臍帯由来幹細胞は、Ｓｃｌｅｒａｘｉｓ（ＳＣＸ）とＭｏｈａｗｋ（ＭＫＸ）発現レベルが未分化細胞においてより有意に高いことを確認したが、具体的に、ＳＣＸが５７．４±１．９７倍さらに高く分析されたところ、本発明に係る臍帯由来幹細胞は腱細胞への分化能力を有することが確認できる。

【0166】

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、当該具体的な記述は単に好ましい具現例であるだけで、これらに本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物によって定義されるといえよう。

【図面の簡単な説明】

【0167】

【図1A】実施例１〜５から製造された時間による組織切片の数を測定して示す図である。

【図1B】実施例１〜５から製造された切片サイズによる細胞数を示すグラフである。

【図1C】実施例１〜５から製造された切片サイズによって培養されたコロニーのサイズを示すグラフである。

【図2A】０ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇの培地が入っている培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総切られた組織を示すグラフである。

【図2B】０ｍｌ／ｇ、０．３ｍｌ／ｇ、０．５ｍｌ／ｇ、１ｍｌ／ｇ、２ｍｌ／ｇ、３ｍｌ／ｇ、４ｍｌ／ｇ、５ｍｌ／ｇの培地が入っているそれぞれの培養容器において、臍帯組織を外植した結果、総分離細胞数を測定して示すグラフである。

【図3A】切片の重量による臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示す。

【図3B】切片の重量による臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフである。

【図4A】実施例８から製造された臍帯由来幹細胞の分離細胞数を測定して示すグラフである。

【図4B】実施例８から製造された臍帯由来幹細胞のＣＦＵ−ｆｓの数を示すもので、クリスタルバイオレット染色結果であり、下段のグラフは、形成されたＣＦＵ−ｆｓの数とサイズを示す。

【図5A】実施例９から製造された臍帯由来幹細胞のモルフォロジーを観察するための光学顕微鏡写真である。

【図5B】酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例１）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の培養期間によるＣＰＤＬを測定して示すグラフである。

【図5C】酵素的方法で製造された臍帯由来幹細胞（比較例１）と実施例９から製造された臍帯由来幹細胞の群集倍加時間（ＰＤＴ）を測定して示すグラフである。

【図6】実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の流細胞分析機を用いて分析した免疫表面学的特性を示すグラフである。

【図7-1】実施例９から分離した臍帯由来幹細胞の脂肪生成（Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ａ）、骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｂ）、軟骨形成（Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃ）、腱発生（Ｔｅｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｄ）への分化能力を示す図である。

【図7-2】図７−１の続き。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【国際調査報告】