特表 2021-517552 リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-517552(P2021-517552A)

(43)【公表日】2021年7月26日

(54)【発明の名称】リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全によって特徴付けられる障害を治療するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20210625BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61K 31/7016 20060101ALI20210625BHJP

   A61K 31/4375 20060101ALI20210625BHJP

   A61K 31/445 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20210625BHJP

【ＦＩ】

   A61K45/00

   A61P25/00

   A61P37/02

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   A61P43/00 121

   A61K31/7016

   A61K31/4375

   A61K31/445

   A61P3/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】76

(21)【出願番号】特願2019-531851(P2019-531851)

(86)(22)【出願日】2017年4月21日

(85)【翻訳文提出日】2019年2月22日

(86)【国際出願番号】US2017028904

(87)【国際公開番号】WO2017185010

(87)【国際公開日】20171026

(31)【優先権主張番号】62/325,535

(32)【優先日】2016年4月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/475,295

(32)【優先日】2017年3月23日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

３．Ｎｏｎｉｄｅｔ

(71)【出願人】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100152984

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 秀明

(74)【代理人】

【識別番号】100148080

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100168985

【弁理士】

【氏名又は名称】蜂谷 浩久

(74)【代理人】

【識別番号】100149401

【弁理士】

【氏名又は名称】上西 浩史

(72)【発明者】

【氏名】サーディエロ，マルコ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084MA13

4C084MA17

4C084MA21

4C084MA23

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4C086MA59

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4C086ZB07

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC21

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、リソソーム蓄積障害を治療する組成物および方法、ならびにトレハロースを使用する方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、プロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。

【請求項2】

前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースおよびＭＫ−２２０６から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記トレハロースがトレハロース類似体である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項12】

前記投与が１２０分以内に完了する、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で非経口投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項14】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項15】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与される、請求項７に記載の方法。

【請求項16】

前記組成物が１日１回投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項17】

前記組成物が１日２回投与される、請求項４に記載の方法。

【請求項18】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記組成物が、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記組成物が約１００〜約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

前記組成物が非経口投与される、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

前記組成物が、ＭＫ−２２０６の１回投与用量が約１００ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇで投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記組成物が１日１回投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記組成物が１日２回投与される、請求項２１に記載の方法。

【請求項25】

リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項26】

前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

トレハロースを含む組成物の治療有効量を投与することにより、プロテインキナーゼＢの活性を阻害する、請求項２５に記載の方法。

【請求項30】

前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与される、請求項２５に記載の方法。

【請求項32】

前記投与が１２０分以内に完了する、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与される、請求項２２に記載の方法。

【請求項34】

前記組成物が１日１回投与される、請求項２２に記載の方法。

【請求項35】

前記組成物が１日２回投与される、請求項２２に記載の方法。

【請求項36】

リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、ＭＫ−２２０６を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項37】

前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記組成物が、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記組成物が約１００〜約３００ ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項40】

前記組成物が、１００ｍｇ／ｋｇから１５０ｍｇ／ｋｇの間の１回投与用量で投与される、請求項３６に記載の方法。

【請求項41】

前記組成物が１日１回投与される、請求項３６に記載の方法。

【請求項42】

前記組成物が１日２回投与される、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項44】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロース類似体を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項47】

前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するための前記トレハロース類似体からなる単一活性成分を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項49】

前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項50】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースおよびトレハロース阻害剤を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項52】

リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記トレハロースがトレハロース類似体である、請求項５１に記載の方法。

【請求項56】

前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で非経口投与される、請求項５３に記載の方法。

【請求項58】

前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与される、請求項５３に記載の方法。

【請求項59】

前記組成物が１日１回投与される、請求項５１に記載の方法。

【請求項60】

前記組成物が１日２回投与される、請求項５１に記載の方法。

【請求項61】

トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロースを含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法。

【請求項62】

前記トレハロースがトレハロース類似体である、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記プロテインキナーゼＢが、プロテインキナーゼＢを有する細胞をトレハロースを含む組成物と接触させることによって接触させられる、請求項６１に記載の方法。

【請求項65】

前記プロテインキナーゼＢが、トレハロースを含む組成物を対象に投与することによって接触させられる、請求項６１に記載の方法。

【請求項66】

プロテインキナーゼＢによって媒介される病状を、それを必要とする対象において治療するために使用される、請求項６１に記載の方法。

【請求項67】

前記病状が、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、および免疫障害から選択される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロース類似体を含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法。

【請求項70】

前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項72】

過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。

【請求項73】

過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項74】

免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項75】

免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。

【請求項76】

免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項77】

機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強する方法であって、前記細胞をプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物と接触させることによって前記細胞中のプロテインキナーゼＢを阻害することを含む方法。

【請求項78】

前記細胞がインビトロで接触させられる、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記細胞が、ある量のプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによってインビボで接触させられる、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤が、トレハロース、トレハロース類似体、およびＭＫ−２２０６から選択される、請求項７７に記載の方法。

【請求項81】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである、請求項７７に記載の方法。

【請求項82】

前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項84】

前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である、請求項８０に記載の方法。

【請求項86】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロース類似体である、請求項８０に記載の方法。

【請求項87】

前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、請求項８６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／３２５，５３５号および２０１７年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，２９５号の利益を主張するものであり、当該出願はその全開示内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害の治療のための、プロテインキナーゼＢの阻害剤を含む組成物を提供する。本開示はさらに、リソソーム蓄積障害およびリソソームの機能不全および状態を特徴とする障害を、トレハロースを含む組成物を用いて治療する方法、ならびにトレハロースを用いて、ＡＫＴによって媒介される疾患状態を治療する方法を提供する。

【背景技術】

【0003】

リソソームは、動物細胞における分解過程の中心となる膜結合型細胞小器官である。食作用によって取り込まれた微生物、エンドサイトーシスによって取り込まれた巨大分子、および不要な細胞小器官などの細胞外物質は、リソソームと融合し、それらの基本分子に分解される。したがって、リソソームは細胞のリサイクル単位である。リソソームはまた、分泌、原形質膜修復、細胞シグナル伝達、およびエネルギー代謝におけるそれらの役割のために細胞恒常性にも関与している。

【0004】

細胞分解過程におけるリソソームの本質的な役割が、これらの細胞小器官を、健康および疾患にとって重大な関わりのあるいくつかの細胞過程の分岐点に据えている。６０種のリソソーム酵素、膜貫通タンパク質、またはこの細胞小器官の他の成分の１つに欠陥があると、標的分子の分解が妨げられ、まとめてリソソーム蓄積障害として知られる６０を超えるさまざまなヒト遺伝子疾患の原因となる。異常なリソソーム機能によって引き起こされない限り、特徴付けられる多種多様なヒトの病態は、細胞代謝に対するオートファジー−リソソーム経路の決定的な重要性を強調する。これらの疾患ならびにリソソーム機能不全を特徴とする疾患では、分解されていない物質がリソソーム内に蓄積し、リソソーム蓄積障害から神経変性疾患、癌、心血管疾患に至るまでの疾患の存在または重症度に寄与する。例えば、バッテン病としても知られているリソソーム蓄積障害である神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）は、いくつかの集団において１２，５００人に１人の有病率を有する、最も一般的な神経遺伝性蓄積症と考えられる一群の神経変性障害である。現在のところ、１４種類のバッテン病のいずれに対しても治療法または承認済みの治療法は存在しない。

【0005】

本発明者らは、細胞クリアランス経路が、マスター転写調節因子がＴＦＥＢであるＣＬＥＡＲ遺伝子ネットワーク（Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）と名付けられた統合制御系によって調和されることをすでに発見している。しかしながら、ＴＦＥＢおよびＣＬＥＡＲネットワークを調節するインビボ経路は十分に理解されておらず、このような疾患を治療するための薬物開発を困難にしている。例えば、ＴＦＥＢを標的とする治療法または承認済みの治療法は現在存在しない。さらに、これらの疾患のいくつかに対する治療候補について臨床試験が進行中であるが、大多数のリソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全によって特徴付けられる多くの障害に対する承認済みの治療は現在のところ存在しない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、当技術分野において、リソソームクリアランスの増強および細胞凝集体の除去に基づく、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を治療するための組成物および方法が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を、それを必要とする対象において治療する方法を提供する。この方法は、プロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。プロテインキナーゼＢ阻害剤は、トレハロースおよびＭＫ−２２０６から選択することができる。

【0008】

いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼＢ阻害剤はトレハロースであり得る。プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである場合、組成物は、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含み得る。プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである場合、組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。ミグルスタットは、約３０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／Ｋｇの投薬量範囲で投与することができる。さらに、プロテインキナーゼＢ阻害剤はトレハロース類似体であり得る。好ましくは、トレハロース類似体は、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される。トレハロースを含む組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与でき、投与は１２０分以内に完了させてよい。組成物がミグルスタットをさらに含む場合、組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で非経口投与することができる。

【0009】

または、トレハロースを含む組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与することができる。組成物がミグルスタットをさらに含む場合、組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与することができる。

【0010】

プロテインキナーゼＢ阻害剤はＭＫ−２２０６であり得る。プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６であるとき、組成物は約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。または、組成物は約１００〜約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である場合、組成物は、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇの１回投与用量で投与することができる。ＭＫ−２２０６を含む組成物は１日１回投与することができる。または、ＭＫ−２２０６を含む組成物は１日２回投与してもよい。組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。

【0011】

トレハロースを含む組成物は１日１回投与することができる。または、トレハロースを含む組成物は１日２回投与してもよい。

【0012】

いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼＢ阻害剤はＭＫ−２２０６であり得る。組成物は、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。または、組成物は約１００〜約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。組成物は非経口投与することができる。組成物は、ＭＫ−２２０６の１回投与用量が約１００ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。組成物は１日１回投与される。または、組成物は１日２回投与される。

【0013】

別の態様では、本開示は、トレハロースを含む組成物の治療有効量を対象に投与することによって、それを必要とする対象におけるリソソーム機能不全を特徴とするリソソーム蓄積障害を治療する方法を提供する。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。トレハロースを含む組成物の治療有効量を投与することにより、プロテインキナーゼＢの活性を阻害することができる。

【0014】

組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。または、組成物は、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含み得る。

【0015】

組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与することができ、投与は１２０分以内に完了してよい。または、組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与することができる。組成物は１日１回または１日２回投与することができる。

【0016】

さらに別の態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、ＭＫ−２２０６を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。組成物は、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６、または約１００〜約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。組成物は、１００ｍｇ／ｋｇから１５０ｍｇ／ｋｇの間の１回投与用量で投与することができる。組成物は１日１回または１日２回投与される。

【0017】

組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。ミグルスタットは、約３０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／Ｋｇの投薬量範囲で投与することができる。

【0018】

別の態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハラーゼ類似体を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。組成物は、トレハロース類似体からなるプロテインキナーゼＢを阻害するための単一活性成分を含み得る。組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。

【0019】

さらなる態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースおよびトレハラーゼ阻害剤を含む組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。ミグルスタットは、約３０〜約１００ｍｇ／Ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／Ｋｇの投薬量範囲で投与することができる。トレハロースはトレハロース類似体であってもよく、前記トレハロース類似体はレンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択することができる。組成物がミグルスタットを含む場合、前記組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、およびミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／ｋｇの範囲で非経口投与することができる。組成物がミグルスタットを含む場合、前記組成物は、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与することができる。組成物は１日１回または１日２回投与することができる。

【0020】

さらに別の態様では、本開示は、トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロースを含む組成物とを接触させることによってプロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法を提供する。トレハロースはトレハロース類似体であってもよい。トレハロース類似体は、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択することができる。プロテインキナーゼＢは、プロテインキナーゼＢを有する細胞を接触させることによって、トレハロースを含む組成物と接触させることができる。または、プロテインキナーゼＢは、トレハロースを含む組成物を対象に投与することによって接触させることができる。

【0021】

この方法は、プロテインキナーゼＢによって媒介される病状を、それを必要とする対象において治療するために使用することができる。病状は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、および免疫障害から選択することができる。リソソーム機能不全障害は、若年性神経セロイドリポフスチン症であり得る。

【0022】

別の態様では、本開示は、トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロース類似体を含む組成物とを接触させることによってプロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法を提供する。トレハロース類似体は、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択することができる。

【0023】

さらなる態様では、本開示は、過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0024】

一態様では、本開示は、過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0025】

さらに別の態様では、本開示は、免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0026】

別の態様では、本開示は、免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを対象に投与することを含む方法を提供する。

【0027】

さらなる態様では、本開示は、免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を対象に投与することを含む方法を提供する。

【0028】

さらに別の態様では、本開示は、機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強する方法であって、前記細胞をプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物と接触させることによって細胞中のプロテインキナーゼＢを阻害することを含む方法を提供する。細胞はインビトロで接触させることができる。または、細胞は、ある量のプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによってインビボで接触させることができる。プロテインキナーゼＢ阻害剤は、トレハロース、トレハロース類似体、およびＭＫ−２２０６から選択さすることができる。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼＢ阻害剤はトレハロースである。組成物は、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む。または、組成物はトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットであり得る。

【0029】

いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼＢ阻害剤は、ＭＫ−２２０６またはトレハロース類似体であり得る。トレハロース類似体は、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択することができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】トレハロースを給餌したＪＮＣＬマウスにおける疾患病状の改善を示す図である。（ａ）トレハロースはＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの生存期間を有意に延長した。処置（Ｔｒｅ）Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス：ｎ＝１３。未処置（ＵＴ）Ｃｌｎ３^{４ｅｘ７−８}マウス：ｎ＝１２。（ｂ）トレハロース処置を行った、および行わなかった１２ヶ月齢のＷＴマウスおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの脳重量。すべてのマウス群、ｎ＝４または５。（ｃ）トレハロース処置を行った、および行わなかった１２ヶ月齢のＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの脳の異方性比率。左パネル：４つの群の脳の代表的な冠状画像；脳梁は黄色い矢印で示されている。右パネル：脳梁容積の定量化。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、２μｍ。処置群および対照群のマウスにおける脳梁の３次元再構成は、補足動画１〜４で報告される。（ｄ）ホットプレートテストでは、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスは、野生型（ＷＴ）同腹仔と比較して５０℃の加熱された金属表面に置かれ多場合の反応が遅くなり、痛覚感受性が低下することを示している。トレハロース（Ｔｒｅ）処置により、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおいてこの表現型は救済された。すべてのマウス群、ｎ＝１４〜１９。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0031】

【図2】処置マウスおよび未処置マウスにおける体重の評価を示す図である。１２ヶ月齢のＷＴマウスおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの体重のヒストグラムは、トレハロース（Ｔｒｅ）処置にかかわらず、遺伝子型間に差がないことを明らかにしている。ｎｓ、非有意。すべてのマウス群、ｎ＝８〜１１。データは平均値±ＳＥＭを表す。

【0032】

【図3】処置および未処置マウスにおける聴覚機能の評価を示す図である。（ａ）生後１０ヶ月の聴性脳幹反応（ＡＢＲ）は、ＷＴ同腹仔と比較してＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおいてＡＢＲ閾値の上昇を示し、これは聴力損失を示す。（ｂ）トレハロース処置は両方の遺伝子型においてＡＢＲ閾値を低下させ、これは聴覚の改善を示している。すべてのマウス群、ｎ＝４〜６。データは平均値±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５。

【0033】

【図4】蓄積負荷の評価を示す図である。（ａ、ｂ）トレハロース処置（Ｔｒｅ）マウスおよび未処置マウスの、７ヶ月齢での一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ａ）、および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｂ）における蓄積物質の共焦点画像および定量化。閾値画像分析により、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの皮質および視床においてより高レベルの自己蛍光蓄積物質が明らかになり、これがトレハロース処置により減少した。スケールバー、５０μｍすべてのマウス群、ｎ＝３または４。（ｃ、ｄ）１２ヶ月齢のトレハロース処置マウスおよび対照マウスの、一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ｃ）、および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｄ）における蓄積物質の量の共焦点画像および定量化。閾値画像分析により、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの皮質および視床においてより高レベルの自己蛍光蓄積物質が明らかになり、これがトレハロース処置により部分的に減少した。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、５０μｍ（ａ〜ｄ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ、ｆ）未処理（ＵＴ）Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス脳のＴＥＭ分析は、プルキンエ細胞（ｅ）および皮質ニューロン（ｆ）の両方において、高電子密度の細胞質物質（黄色の矢じり）の顕著な蓄積を示す。ＦＰＰ計数の頻度分布は、トレハロース（Ｔｒｅ）処置マウスにおけるＦＰＰの有意な減少を明らかにした。マウスの群当たりの細胞数ｎ＝１８。頻度分析にはコルモゴロフ−スミルノフ検定を適用した。スケールバー、２μｍ。

【0034】

【図5】処置および未処置のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおける１２ヶ月齢でのリソソーム蓄積負荷の透過型電子顕微鏡観察を示す図である。電子顕微鏡写真は、未処置のＪＮＣＬマウスのリソソームにおけるフィンガープリントプロファイル（ＦＰＰ）の存在を示し、これは処置マウスでは劇的に減少している。顕微鏡写真は、未処置（ＵＴ）および処置（Ｔｒｅ）マウスのコホートからのプルキンエ細胞の代表例である。矢印はＦＰＰを示す。スケールバーは０．２μｍである。

【0035】

【図6】神経炎症の評価の図である。（ａ、ｂ）一次体性感覚皮質（Ｓ１ＢＦ；ａ）および相互接続視床中継核（ＶＰＭ／ＶＰＬ；ｂ）におけるＧＦＡＰの免疫組織化学的染色を用いた、７ヶ月齢でのトレハロース処置（Ｔｒｅ）および未処置（ＵＴ）のＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおける星状細胞増加症の分析および定量化。（ｃ、ｄ）Ｓ１ＢＦ（ｃ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｄ）脳領域におけるＣＤ６８の免疫組織化学的染色を用いたミクログリア活性化の分析および定量化。ミクログリア活性化は、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスのＳ１ＢＦおよびＶＰＭ／ＶＰＬ領域の両方で明らかであり、これはＳ１ＢＦ領域におけるトレハロース処置によって有意に救済される。すべてのマウス群、ｎ＝４または５。（ｅ、ｆ）Ｓ１ＢＦ（ｅ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｆ）におけるＧＦＡＰの免疫組織化学的染色を用いた、１２ヶ月齢でのトレハロース処置（Ｔｒｅ）マウスおよび対照（ＵＴ）マウスにおける星状細胞増加症の分析および定量化。トレハロース処置は、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおけるＧＦＡＰ免疫反応性を、Ｓ１ＢＦ領域で４３％およびＶＰＭ／ＶＰＬ領域で６７％減少させた。（ｇ、ｈ）Ｓ１ＢＦ（ｇ）およびＶＰＭ／ＶＰＬ（ｈ）脳領域における、ＣＤ６８に対する免疫組織化学的染色を用いたミクログリア活性化の分析および定量化。ミクログリア活性化は、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスのＳ１ＢＦおよびＶＰＭ／ＶＰＬ領域の両方において明らかであり、これはトレハロース処置によりＶＰＭ／ＶＰＬ領域において４８％減少される。すべてのマウス群、ｎ＝３または４。スケールバー、５０ｍｍ。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0036】

【図7】トレハロース処理におけるＴＦＥＢのｍＴＯＲＣ１非依存性核内移行を示す図である。（ａ）トレハロース処理におけるＴＦＥＢの時間依存性核内移行（緑色のシグナル）を示すＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の共焦点顕微鏡分析。（ｂ）２４時間のトレハロース処理（Ｔｒｅ）後または未処理細胞（ＵＴ）中のＴＦＥＢ細胞内局在化（Ｃ、細胞質；Ｎ、核）の定量化。ａ、ｂのスケールバーは４０μｍである。（ｃ）免疫ブロット分析により、ｍＴＯＲＣ１の下流の基質の発現レベルが示される。野生型（ＷＴ）およびＴＳＣ２ヌルＭＥＦ細胞をトレハロース（Ｔｒｅ；１００ｍＭ）で２４時間処理するか、または未処理のままにした。対照として、細胞をＴｏｒｉｎ１（３００ｎＭ）またはラパマイシン（３００ｎＭ）で２時間処理し、その後溶解物を抽出した。ホスホ−および総Ｓ６Ｋ１（Ｐ−Ｓ６Ｋ１およびＴ−Ｓ６Ｋ１）、ホスホ−および総Ｓ６（Ｐ−Ｓ６およびＴ−Ｓ６）、ならびにホスホ−および総４Ｅ−ＢＰ１（Ｐ−４Ｅ−ＢＰ１およびＴ−４Ｅ−ＢＰ１）が、ｍＴＯＲＣ１活性の読み出しとして検出された。（ｄ）ＷＴ細胞および（ｅ）ＴＳＣ２ヌルＭＥＦ細胞をＴＦＥＢ−３×ＦＬＡＧで一過性にトランスフェクトし、トレハロース投与後のＴＦＥＢの核内移行について試験した。（ｆ）ＴＦＥＢ−３×ＦＬＡＧおよびｍＴＯＲまたは（ｇ）ＴＦＥＢ−３×ＦＬＡＧおよび構成的に活性なｍＴＯＲ（ＣＡ−ｍＴＯＲ、Ｃ２４１９Ｋ）構築物を同時トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、トレハロース処理（１００ｍＭで２４時間）または未処理のままにし、その後、それぞれＦＬＡＧおよびｍＴＯＲ抗体を用いてＴＦＥＢ（赤）およびｍＴＯＲ（緑）を免疫蛍光標識した。スケールバー、１０μｍ（ｄ〜ｇ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【0037】

【図8】トレハロースがｍＴＯＲＣ１活性を変化させないことを示す図である。ＨｅＬａ細胞を、トレハロースで２４時間または４８時間、またはｍＴＯＲＣ１阻害の対照としてラパマイシン（６００ｎＭ、１６時間）またはＴｏｒｉｎ１（３００ｎＭ、２時間）で処理した。ｍＴＯＲＣ１基質の免疫ブロット分析は、トレハロース処理においてそれらのリン酸化状態が変化しないことを示している。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。

【0038】

【図9】トレハロースはＳ２１１でＴＦＥＢのリン酸化を修正しない。ＴＦＥＢ−Ｆｌａｇを、ＴＦＥＢ−ＦｌａｇをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から免疫沈降させ、２４時間トレハロースで処理するか、または未処理のままにした。免疫ブロット分析は、ホスホ（Ｓｅｒ）−１４−３−３結合モチーフに対する抗体および対照抗体を用いて行った。

【0039】

【図10】ＴＦＥＢの細胞内局在はｍＴＯＲＣ２には依存しないことを示す図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞に、指示されている場合にはＲｉｃｔｏｒに対するｓｉＲＮＡを７２時間トランスフェクトした。細胞を、指示されている場合、分析前に２４時間トレハロースで処理した。棒グラフは、３回の繰り返しの平均値を表す。データは平均値±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１（ｂ）ＨｅＬａ／ＴＦＥＢ−Ｆｌａｇ細胞を（ａ）のように処理し、免疫蛍光共焦点分析のために標識した。スケールバーは２０μｍである。

【0040】

【図11】トレハロースによるＣＬＥＡＲネットワークの活性化を示す図である。（ａ、ｂ）トレハロース処理におけるリソソーム遺伝子の上方制御を示す、対照（ＣＴＲＬ；ａ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｂ）の発現分析。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。（ｃ）トレハロース投与により上方制御された遺伝子を表すＣｙｔｏｓｃａｐｅ生成ネットワーク。ドット（遺伝子を表す）は青い線によって接続されており、色強度は共調節の程度に比例している。ネットワークはＴＦＥＢリソソーム標的を含むより緊密な発現関係を有する遺伝子のコア（ネットワークの中心）を有するが、よりゆるやかに相関している他の遺伝子がネットワークの周辺に見出される。（ｄ、ｅ）リソソーム遺伝子を用いた、ＣＴＲＬ（ｄ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｅ）へのトレハロース投与後のトランスクリプトーム変化のＧＳＥＡ。上のパネルは、ランク付けされた遺伝子発現データについてのＧＳＥＡによって生成された濃縮プロットを示す（左、赤：上方制御；右、青：下方制御）。垂直の青いバーは、ランク付けされたリスト内の各選択された遺伝子セットにおける遺伝子の位置を示す。下のパネルは、ランク付けされたリスト内のリソソーム遺伝子の累積分布を示す。分析した遺伝子の５０％を含むランキング位置が示されている。分析は、トレハロース投与後に上方制御された遺伝子の中のリソソーム遺伝子の濃縮を示す。（ｆ、ｇ）ＣＴＲＬ（ｆ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（ｇ）へのトレハロース投与後の、リソソーム遺伝子およびリソソーム代謝において公知の役割を有するＴＦＥＢ標的を含むトランスクリプトームの変化のＧＳＥＡを報告している。ＴＦＥＢリソソーム標的は、一般的なリソソーム遺伝子よりも高いＥＳスコアを有し、トレハロースが、対照およびＪＮＣＬ線維芽細胞の両方においてリソソーム機能に関与するＴＦＥＢ標的を優先的に上方制御したことを示している。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【0041】

【図12】インビボでのＴＦＥＢ核内移行とＣＬＥＡＲネットワーク活性化を示す図である。（ａ、ｂ）Ｅ１７．５でのＷＴ（ａ）およびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}胚（ｂ）からの培養皮質ニューロンの発現分析は、トレハロース投与におけるリソソーム遺伝子の転写活性化を示す。（ｃ、ｄ）ＷＴ（ｃ）およびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}（ｄ）マウスからの脳切片の共焦点顕微鏡観察は、処置マウスのプルキンエにおけるＴＦＥＢの優勢な核分布を示す。棒グラフのＣとＮは、それぞれ細胞質ゾルおよび核の分布を示している。スケールバー、２０μｍ。（ｅ、ｆ）未処置マウスと比較した、トレハロース投与におけるＷＴ（ｅ）およびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}（ｆ）マウスからの脳ホモジネートの発現分析は、リソソーム遺伝子の転写活性化を示している。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子Ｓ１６に対して正規化した。赤い破線は未処置マウスにおける相対的遺伝子発現を示す。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。

【0042】

【図13】ＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス由来の処理された星状細胞におけるリソソームの増強を示す図である。野生型（ＷＴ）およびＪＮＣＬ（Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}）マウスから単離した培養星状細胞におけるリソソームマーカー、Ｌａｍｐ１の免疫ブロット分析。

【0043】

【図14】ＡｋｔがＴＦＥＢをＳｅｒ４６７でリン酸化することを示す図である。（ａ）トレハロースおよびキナーゼ阻害剤の添加時のＴＦＥＢの核内移行を示すＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の共焦点顕微鏡分析（ＡｋｔについてはＭＫ２２０６；ＰＩ３ＫについてはＬＹ２９４００２；ｍＴＯＲについてはｔｏｒｉｎ１およびラパマイシン）。破線ボックス（上段）は、高出力インサート（下段）の位置を示している。（ｂ）同じキナーゼ阻害剤と共にインキュベートしたＨｅＬａ／ＴＦＥＢ細胞の細胞内分画。（ｃ）以下の種からのＴＦＥＢアミノ酸配列のマルチアラインメント：Ａｃ、グリーンアノール（Ａｎｏｌｉｓ ｃａｒｏｌｅｎｓｉｓ）；Ｂｔ、ウシ（ボース・タウルス（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ））；Ｄｒ、ゼブラフィッシュ（ダニオ・レニオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））；Ｆｃ、イエネコ（フェリス・カトゥース（Ｆｅｌｉｘ ｃａｔｕｓ））；Ｇｇ、セキショクヤケイ（ガルス・ガルス（ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）；Ｈｓ、ホモサピエンス；Ｌａ、アフリカゾウ（ロクソドンタ・アフリカーナ（Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ ａｆｒｉｃａｎａ））；Ｍｍ、ハツカネズミ（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））；Ｒｎ、ドブネズミ（ラトス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ Ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））；Ｓｈ、タスマニアデビル（Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｒｒｉｓｉｉ）；Ｓｐ、アメリカムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）；ＸＩ、アフリカツメガエル（キセノプス・レヴィス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ））。Ａｋｔリン酸化部位のコンセンサスロゴ（ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／ｌｏｇｏ．ｃｇｉで作成）はＴＦＥＢ配列と整列している。位置４６７はヒトタンパク質配列を指す。（ｄ）ＴＦＥＢおよびＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）の細胞内局在化。（ｅ）ＴＦＥＢまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞におけるリソソームおよびオートファジー遺伝子の発現分析。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。破線は、空のベクターをトランスフェクトした細胞における相対的遺伝子発現を示す。（ｆ）ＨｅＬａ細胞における１４−３−３タンパク質とＴＦＥＢ−ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）との共局在化アッセイ。（ｇ）ＴＦＥＢまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）と１４−３−３タンパク質との免疫共沈降アッセイ。（ｈ）Ａｋｔインビトロキナーゼアッセイ。組換え活性ＡＫＴ１および精製ＴＦＥＢ−ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）−Ｆｌａｇを［^３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でインキュベートしたところ、ＡｋｔがＴＦＥＢをリン酸化すること、およびこの反応がＳ４６７を必要とすることが明らかになった。（ｉ）３つの異なるＡＫＴｓｉＲＮＡによって媒介されるＡＫＴサイレンシングは、ウエスタンブロット分析によって示されるように、ＴＦＥＢ核内移行およびリソソーム拡大をもたらした。（ｊ）ＨｅＬａ細胞の経時分析は、ＬＡＭＰ１、ｐ６２およびＬＣ３マーカーによって示されるように、トレハロース誘導性ＡＫＴ不活性化およびオートファジーフラックスの増加を示す。（ｋ）ＴＦＥＢ−ＦＬＡＧと、ＡＫＴ−ＧＦＰまたはＡＫＴ（ＤＤ）−ＧＦＰのいずれかとを共トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を、２４時間トレハロースで処理し、その後ＴＦＥＢ（赤色）およびＡＫＴ−ＧＦＰ（緑色）で免疫蛍光標識した。ＤＡＰＩは細胞の核を示す。（１）トレハロース処置マウスからのＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}の脳ホモジネートにおいてＡＫＴの活性化の減少が観察された。スケールバー、１０μｍ（ａ、ｅ、ｆ、ｋ）。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５。

【0044】

【図15】血清刺激がＡｋｔ活性を調節することによりＴＦＥＢの細胞内局在を調節することを示す図である。（ａ）ＷＴ細胞およびＴｓｃ２^−／−細胞を血清飢餓状態にし（１６時間）、指示されている場合は飢餓の最後の２時間にＭＫ２２０６で処理し、指示されている場合は最後の３０分間透析血清で刺激した。示したように細胞溶解物を抗体でプローブした。（ｂ）ＷＴ細胞およびＴｓｃ２^−／−細胞にＴＦＥＢ−Ｆｌａｇを一過性にトランスフェクトし、（ａ）と同様に処理し、免疫蛍光共焦点顕微鏡によって分析した。スケールバーは６０μｍである。

【0045】

【図16】トレハロースがＧＳＫ３β非依存的にＴＦＥＢのＡｋｔ調節を制御することを示す図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞を２４時間トレハロースで処理するか、または未処理のままにした。免疫ブロット分析を用いて、ＧＳＫ３３のレベルおよびそのリン酸化状態を評価した。ＧＡＰＤＨを負荷対照として使用した。（ｂ）ＨｅＬａ細胞に、ＴＦＥＢ−３×Ｆｌａｇおよび構成的に活性なＧＳＫ３β（ＣＡ−ＧＳＫ３β）を同時トランスフェクトし、トレハロースまたはＭＫ２２０６で２４時間処理し、Ｆｌａｇ（赤色）およびＧＳＫ３β（緑色）についての免疫蛍光標識により調べた。スケールバーは２０＆ｍである。（ｃ）ＨｅＬａ細胞に、ＴＦＥＢ−３×Ｆｌａｇおよび構成的に活性なＡｋｔ（Ａｋｔ−ＤＤ）を同時トランスフェクトし、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１で２４時間処理し、Ｆｌａｇ（赤）およびＡｋｔ（緑）についての免疫蛍光標識により調べた。スケールバーは２０μｍである。

【0046】

【図17】トレハロースがＥＲＫを阻害しないことを示す図である。ＴＦＥＢ−ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ−Ｓ４６７Ａ−Ｆｌａｇプラスミドを一過性にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、ＴＦＥＢ−Ｓ４６７Ａのより低い分子量へのシフトを示す。

【0047】

【図18】Ｓ４６７Ａ ＴＦＥＢ型の分子量のシフトを示す図である。ＴＦＥＢ−ＦｌａｇまたはＴＦＥＢ−Ｓ４６７Ａ−Ｆｌａｇプラスミドを一過性にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの全タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、ＴＦＥＢ−Ｓ４６７Ａのより低い分子量へのシフトを示す。

【0048】

【図19】ＴＦＥＢ−Ｓ１４２ＡおよびＴＦＥＢ−Ｓ２１１Ａの共焦点顕微鏡分析を示す図である。ＨｅＬａ細胞に指示された構築物を一過性にトランスフェクトし、免疫蛍光共焦点顕微鏡分析により分析した。スケールバーは１０μｍである。

【0049】

【図20】ＷＴおよびＴｓｃ２^−／−マウス胚性線維芽細胞におけるＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）核局在化を示す図である。Ｔｓｃ２^−／−マウス胚性線維芽細胞。ＷＴおよびＴｓｃ２^−／−ＭＥＦにＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）を一過性にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡によって分析した。スケールバーは１０μｍである。

【0050】

【図21】ＡｋｔがＴＦＥＢの安定性を調節することを示す図であるバイシストロン性ＴＦＥＢ−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰまたはＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと、Ａｋｔ（ＤＤ）−ＧＦＰベクターを同時トランスフェクトした細胞、またはＡｋｔ（ＤＤ）−ＧＦＰベクターをトランスフェクトしない細胞由来の溶解物の免疫ブロットは、変異型ＴＦＥＢタンパク質が野生型ＴＦＥＢよりも安定であることを示す。

【0051】

【図22】ＡｋｔがＴＦＥＢと相互作用することを示す図である。（ａ）ＴＦＥＢとＡｋｔとの相互作用を示す免疫共沈降アッセイ。（ｂ）ＡｌａによるＴＦＥＢ Ｓｅｒ４６７の置換は、Ａｋｔとの結合に影響を及ぼさない。

【0052】

【図23】ＡＫＴの薬理学的阻害は、ＴＦＥ３およびＭＩＴＦの核内移行を誘導する。ＨｅＬａ細胞にＴＦＥ３−３×Ｆｌａｇ（ａ）およびＭＩＴＦ−３×Ｆｌａｇ（ｂ）を一過性にトランスフェクトし、共焦点顕微鏡により分析した。スケールバーは１０μｍである。

【0053】

【図24】Ａｋｔ阻害が、ＴＦＥＢ核内移行およびＣＬＥＡＲネットワークの活性化を促進することを示す図である。（ａ）トレハロースまたはＭＫ２２０６で処理した細胞における点の数の増加を示すＬＣ３染色。（ｂ）ＬＣ３脂質化のイムノブロット分析。（ｃ）トレハロースまたはＭＫ２２０６で処理した試料中の自食性小胞（黄色の矢印）の数の増加を示すＨｅＬａ細胞の顕微鏡写真。（ｄ）ＭＫ２２０６で処理したＨｅＬａ細胞におけるリソソームおよびオートファジー遺伝子の発現分析。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。破線は未処理細胞における相対的遺伝子発現を示す。（ｅ〜ｇ）Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスへのＭＫ２２０６の腹腔内注射により、Ａｋｔの不活性化（ｅ）、ＴＦＥＢの核内移行（ｆ）、およびリソソーム遺伝子とオートファジー遺伝子の上方制御（ｇ）が示される。スケールバー、１０μｍ（ａ）、５０ｎｍ（ｃ）、２０μｍ（ｆ）。

【0054】

【図25】Ａｋｔの薬理学的阻害が、リソソーム内セロイド脂肪色素を有する患者からの初代細胞における細胞クリアランスを調節することを示す図である。（ａ〜ｄ）欠陥のあるＣＬＮ３（ｃ．４６１−６７７ｄｅｌ；ａ）、ＰＰＴ１（ｃ．６６５Ｔ＞Ｃ、ｐ．Ｌ２２２Ｐ；ｂ）、ＴＰＰ１（ｃ．３８０Ｇ＞Ａ、ｐ．Ｒ１２７Ｑ；ｇ．３５５６、ＩＶＳ５−１Ｇ＞Ｃ；ｃ）またはＭＦＳＤ８（ｃ．１０３Ｃ＞Ｔ、ｐ．Ｒ３５Ｘ；ｄ）を有する初代線維芽細胞の共焦点顕微鏡分析は、ＭＫ２２０６およびトレハロースがセロイド脂肪色素沈着物（緑色）のクリアランスを誘導することを示す。欠陥タンパク質が示されている。各パネルについて６０を超える細胞が分析された。スケールバー、３０μｍ。（ｅ）ＴＦＥＢのＡｋｔ依存性トレハロース活性化の概略図。データは平均値±平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【0055】

【図26】リソソーム内セロイド脂肪色素の蓄積に対するトレハロースおよびＡｋｔの効果を示す図である。欠陥のあるＣＬＮ３を有する初代線維芽細胞の共焦点顕微鏡分析（ｃ．４６１−６７７ｄｅｌ）。（ａ）細胞をトレハロースで７日間または４日間処理し、続いてトレハロースを除去し、さらに３日間増殖させた。（ｂ）細胞を４日間７日間ＭＫ２２０６で処理し、続いてＭＫ２２０６を除去し、さらに３日間増殖させた。データは平均値±ＳＥＭを表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１。スケールバーは３０μｍである。

【0056】

【図27】図７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２１、２２および２４に示すウエスタンブロットの全スキャンを示す図である。

【0057】

【図28】トレハロースおよびレンツトレハロースＡ、Ｂ、およびＣの化学構造を示す図である。

【0058】

【図29】トレハロースおよびその類似体であるラクトトレハロース（ｂ）；ガラクトトレハロース（ｃ）；６−アジドトレハロース（ｄ）の化学構造を示す図である。

【0059】

【図30】バッテン病マウスの神経細胞死に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットの併用の効果を示す図である。野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＣＡＳ−３陽性細胞の密度のヒストグラム（細胞数／面積）。

【0060】

【図31】バッテン病マウスのアストログリア増殖症に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットとの併用の効果を示す図である。（Ａ）野生型マウス、未処置のバッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウス由来の神経組織におけるＧＦＡＰ染色を示す顕微鏡画像。（Ｂ）野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＧＦＡＰ陽性細胞の密度（細胞数／面積）のヒストグラム。

【0061】

【図32】バッテン病マウスのマクロファージ浸潤に対するトレハロース、ミグルスタット、およびトレハロースとミグルスタットとの併用の効果を示す図である。（Ａ）野生型マウス、未処置のバッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウス由来の神経組織におけるＣＤ６８染色を示す顕微鏡画像。（Ｂ）野生型マウス、未処置バッテン病マウス、ならびにトレハロース、低濃度のミグルスタット、高濃度のミグルスタット、およびミグルスタットとトレハロースとの併用で処置したバッテン病マウスにおけるＣＡＳ−３陽性細胞の密度（細胞数／面積）のヒストグラム。

【発明を実施するための形態】

【0062】

本開示は、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢおよびＲｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ａ ａｎｄ Ｃ（ＲＡＣ）としても知られる；これ以降ＡＫＴとも呼ばれる）がリソソーム蓄積障害、リソソーム機能不全を特徴とする障害ならびにリソソーム関連細胞クリアランス経路の主な調節因子であるという発見に部分的に基づく。本発明者らは、インビボで、ＡＫＴがＴＦＥＢ、およびＴＦＥＢによって転写的に調節されるＣＬＥＡＲ遺伝子ネットワークをｍＴＯＲＣ１非依存的に調節することを発見した。さらに、ＡＫＴを阻害すると、ＴＦＥＢのＡＫＴリン酸化が防止され、それによってＴＦＥＢおよびＣＬＥＡＲ遺伝子ネットワークおよびＣＬＥＡＲ遺伝子ネットワークによって調整される細胞クリアランス経路が活性化され、リソソーム依存性細胞クリアランス経路によるクリアランスの増強をもたらすことを発見した。驚くべきことに、公知のＡＫＴ阻害剤を使用してＡＫＴを阻害すると、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害において未分解物質の除去が誘導される。例えば、ＡＫＴを阻害すると、リソソーム代謝の障害によって引き起こされる神経変性疾患において、未分解物質が取り除かれ、症状が改善された。重要なことには、ＡＫＴを、二糖であるトレハロースを含む組成物を用いて阻害できることもまた顕著に発見された。

【0063】

したがって、本開示は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害ならびにリソソーム機能不全および細胞老廃物の蓄積を特徴とする、またはこれらにより悪化する他の状態を治療する組成物および方法に関する。本開示はさらに、対象においてプロテインキナーゼＢによって媒介される病状を治療するためにトレハロースを使用する方法に関する。これらの知見に基づく組成物および方法を、以下に詳細に記載する。

【0064】

Ｉ．組成物
一態様では、本開示は、活性成分としてプロテインキナーゼＢの阻害剤（ＡＫＴ）を含む組成物を提供する。ＡＫＴは、他の細胞プロセスの中でもとりわけ、グルコース代謝、アポトーシス、細胞増殖、転写、および細胞遊走において中心的な役割を果たすセリン／スレオニン特異的プロテインキナーゼ酵素である。

【0065】

本開示の組成物に適したＡＫＴ阻害剤は、任意のＡＫＴタンパク質アイソフォームを阻害することができる。ヒトにおける公知のＡＫＴタンパク質アイソフォームとしては、ＡＫＴ１（ＰＫＢα）、ＡＫＴ２（ＰＫＢβ）、およびＡＫＴ３（ＰＫＢγ）が挙げられる。本開示の組成物は、ＡＫＴアイソフォームのうちの１つに特異的なＡＫＴ阻害剤を含み得る。例えば、組成物は、ＡＫＴ１阻害剤、ＡＫＴ２阻害剤、またはＡＫＴ３阻害剤を含み得る。または、組成物は、２つ以上のＡＫＴアイソフォームを阻害できるＡＫＴ阻害剤を含み得る。例えば、組成物は、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を阻害し得るＡＫＴ阻害剤、ＡＫＴ１およびＡＫＴ３を阻害し得るＡＫＴ阻害剤、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３を阻害し得るＡＫＴ阻害剤、またはＡＫＴ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３を阻害し得る汎−ＡＫＴ阻害剤を含み得る。組成物はまた、１または複数のＡＫＴアイソフォームに特異的なＡＫＴ阻害剤の組み合わせを含み得る。

【0066】

「ＡＫＴ阻害剤」または「ＡＫＴの阻害剤」という用語は本明細書では互換的に使用され、ＡＫＴの活性を優先的に直接低下させるかまたは遮断する効果を有する任意の化合物を指すことができる。ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴの活性を阻害することによってＡＫＴに直接作用し得る。例えば、直接ＡＫＴ阻害剤は、基質が酵素の活性部位に入るのを阻害することによって、ＡＫＴキナーゼ活性を直接阻害することができる。直接ＡＫＴ阻害剤はまた、阻害剤が基質結合部位以外のＡＫＴ上の部位に結合するアロステリック阻害剤であり得る。または、直接ＡＫＴ阻害剤は、阻害剤がＡＫＴリガンドの結合に影響を及ぼすことによって、ＡＫＴの活性を阻害するオルソステリック阻害剤であり得る。ＡＫＴ阻害剤は、競合的、不競合的、非競合的な阻害剤、または可逆的阻害剤であり得る。さらに、ＡＫＴ阻害剤によるＡＫＴの阻害は不可逆的であり得る。

【0067】

ＡＫＴ阻害剤はまた、ＡＫＴの１または複数の上流のアクチベーターを阻害することによって、またはＡＫＴ活性を調節し得る１または複数のシグナル伝達経路におけるＡＫＴの１または複数の上流の阻害剤の活性化を介してＡＫＴ活性を阻害することができる。ＡＫＴ阻害剤はまた、効果的な阻害が達成されるように複数の経路を遮断することによって、ＡＫＴ活性を直接的または間接的に阻害するためのメカニズムの組み合わせを介して作用することができる。さらに、ＡＫＴの阻害剤は、ＡＫＴの転写、翻訳、翻訳後プロセシング、動員（すなわち、ＡＫＴの発現を減少させる）、またはＡＫＴの発現の上流のアクチベーター、またはこれらの組み合わせを防止または減少させることによってＡＫＴ活性を阻害することができる。したがって、本開示の組成物に適したＡＫＴ阻害剤の非限定的な例としては、ＰＩ３ＫまたはＰＩ３Ｋの下流エフェクターを阻害する化合物、ＰＤＰＫ１および／またはｍＴＯＲＣ２または関連キナーゼを阻害する化合物、コリンキナーゼを阻害する化合物、ｂｃｌ−２を阻害する化合物、Ｈｓｐ−９０を阻害する化合物、ｍＴＯＲキナーゼを阻害する化合物、プロテアソーム阻害剤、マルチキナーゼ阻害剤、ＡＫＴを直接阻害する化合物、ＰＴＥＮを活性化する化合物、およびＡＫＴ活性化の低下をもたらす他の化合物が挙げられる。さらに、ＡＫＴ阻害剤は、小さな化学物質、ペプチド、抗体、抗体フォーマット、タンパク質ならびに非タンパク質結合剤、低分子干渉ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、またはリボザイムであり得る。阻害剤が、ＡＫＴに結合してその活性を阻害するＡＫＴ基質ではない場合、ＡＫＴの阻害はアロステリックであり得る。直接ＡＫＴ阻害剤はまた、阻害剤がＡＫＴリガンドの結合に影響を及ぼすことによってＡＫＴの活性を阻害するオルソステリック阻害剤であり得る。

【0068】

（ａ）トレハロース
上記のように、本発明者らはトレハロースがＡＫＴを阻害することを発見した。したがって、本開示はまた、活性成分としてトレハロースを含む組成物を提供する。本明細書で使用される「トレハロース」という用語は、トレハロース化合物自体の形態、ならびに塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、誘導体などの任意の他の形態を、前記塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、または誘導体が、ＡＫＴを阻害することができるトレハロース類似体として薬理学的に適していることを条件に指す。

【0069】

トレハロースは、ミコースまたはトレマロースとしても知られており、２つのグルコース分子が１，１配置で結合している安定な非還元二糖である。トレハロースの構造を以下に図示する。トレハロースはタンパク質安定化特性を有し、冷凍食品の安定剤として、生物系および細胞の凍結乾燥において、治療用非経口タンパク質の安定剤として、ならびに錠剤およびＩＶ溶液中の賦形剤として広く使用されている。トレハロースは、ＦＤＡによりＧＲＡＳ（食品医薬品局合格証）食品成分として認識されており、ＵＳＰ−ＮＦ（米国薬局方全国処方集）、ＥＰ（欧州薬局方）およびＪＰ（日本薬局方）に記載されている。トレハロースの安全性と毒性は広く研究されており、この物質は、意図された治療用量よりも実質的に高い用量で経口投与と静脈内投与の両方で投与した場合に安全であることが見出されている。

【化1】

トレハロース

【0070】

トレハロースは酵素トレハロースによって効率的に加水分解され、微生物を含む多くの生物において広く発現されている。ヒトでは、トレハロースは、上皮刷子縁において消化管内のトレハラーゼによって２つのＤ−グルコース分子に代謝される。摂取されたトレハロースの０．５％未満が血流に吸収され、そこで腎臓刷子縁細胞のトレハラーゼにより肝臓および腎臓によってさらに代謝される。１日当たり４０〜５０グラムを超える量の経口トレハロースは下痢および腹部膨満を引き起こす可能性がある。したがって、当業者は、治療量のトレハロースの増強を提供するために、胃腸管または腎臓におけるトレハロースの代謝を、トレハロースを非経口投与して、胃腸管における代謝を迂回することによって、トレハロースを含む組成物中にトレハラーゼ阻害剤をさらに提供することによって、またはこれらの組み合わせによって迂回することができる。組成物中にトレハラーゼ阻害剤を使用して、組成物中のトレハロースの安定性を高めることもできる。したがって、トレハロースが活性成分である場合、本開示の組成物は１または複数のトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。

【0071】

トレハロース類似体またはトレハロースベースの化合物もまた、トレハロースと同様の治療特性を有することがある。さらに、トレハロース類似体は、トレハラーゼまたは他の分解酵素による分解に対してさらに耐性があり得る。したがって、本開示はまた、ＡＫＴを阻害することができる任意のトレハロース類似体またはトレハロースベースの化合物の使用を想定している。当技術分野で公知のトレハロース類似体は、Ｗａｌｍａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１５，１６，１３７２９−１３７４５；Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，６４，７１２１−７１２６；Ｗｙａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０１５，４１１，４９−５５；Ｂａｂｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．２００５，２４，１６９−１７７；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９６７，２０，３８８；Ｕｒａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．１９６７，２０，２３６；に開示されているものであってよく、これらの開示内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。本開示の組成物への使用に適し得るトレハロース類似体の非限定的な例としては、レンツトレハロース化合物、マンノピラノシル置換トレハロース化合物、ＧｌｃＮＡｃ−α−（１，１）−α−ＧｌｃおよびＧｌｃＮＡｃ−α−（１，１）−α−Ｍａｎ、などのトレハロースのアミノ類似体、グルコース以外の炭水化物部分を含有するトレハロースの類似体、トレハロースの非還元α−（１，１）−α連結を維持する二糖、オリゴ糖または多糖が挙げられる。本開示の組成物への使用に適し得るトレハロース類似体の非限定的な例としては、図２８に示すトレハロースベースのトリ−、テトラ−およびペンタオリゴ糖、ネオサルトース（ｎｅｏｓａｒｔｏｓｅ）、フィシェロース（ｆｉｓｃｈｅｒｏｓｅ）、ラクトトレハロース、レンツトレハロースＡ、ＢまたはＣ、ならびに図２９に示すラクトトレハロース、ガラクトトレハロース、または６−アジドトレハロースが挙げられる。

【0072】

トレハロースまたはトレハロース類似化合物が本開示の組成物中の活性成分である場合、活性成分は薬学的に許容される形態である。活性成分は、化合物自体の形態、ならびに塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、誘導体などを、前記塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、または誘導体が、薬理学的に適していることを条件に投与することができる。活性薬剤の塩、エステル、アミド、プロドラッグ、および他の誘導体は、有機合成化学の当業者に公知の手順を使用して調製することができ、例えば、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２）に記載されている。エナンチオマー形態で存在し得る任意の活性薬剤について、活性薬剤は、ラセミ体としてまたはエナンチオマー的に純粋な形態のいずれかで本組成物に組み込むことができる。

【0073】

さらに、トレハロースまたはトレハロース類似体を含み、トレハラーゼ阻害剤を含むか、または含まない組成物は、好ましくは医療用グレードのトレハロースを含む。好ましくは、トレハロースは、トレハロースの単離および精製プロセスから生じる汚染物質を実質的に含まない。トレハロースは、乾燥酵母などからの抽出によって、酵素的産生および単離によって、および微生物の培養によって単離することができる。したがって、トレハロースは、酵素、アンモニウム、アセトニトリル、アセトアミドなどの有機溶媒、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、またはイソプロパノール）、ＴＦＡ、エーテル、またはトレハロースを調製および精製する工程で使用される他の汚染物質などの汚染物質を実質的に含まないことが好ましい。汚染物質を「実質的に」含まないという用語は、汚染物質含有量が、好ましくはトレハロースの総重量の０．５％未満、０．３％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３未満％、０．０２％未満、０．０１％未満、０．００５％未満、０．００３％未満、または０．００１％未満のトレハロースを指すことができる。汚染物質の含有量を決定する方法は当技術分野において公知であり、ガスクロマトグラフィーなどの従来の方法によって決定することができる。好ましくは、本発明の精製トレハロース中の残留溶媒は、ＩＣＨガイドライン、例えば、ＩＭＰＵＲＩＴＩＥＳ：ＧＵＩＤＥＬＩＮＥ ＦＯＲ ＲＥＳＩＤＵＡＬ ＳＯＬＶＥＮＴＳ Ｑ３Ｃ（Ｒ５）（ｗｗｗ．ｉｃｈ．Ｏｒｇ／ｆｉｌｅａｄｍｉｎ／Ｐｕｂｌｉｃ＿Ｗｅｂ＿Ｓｉｔｅ／ＩＣＨ＿Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ／Ｑｕａｌｉｔｙ／Ｑ３Ｃ／Ｓｔｅ ｐ４／Ｑ ３Ｃ＿Ｒ５＿Ｓｔｅｐ４．ｐｄｆで利用可能）に設定されている限度未満である。例えば、精製トレハロースは、＜５０００ｐｐｍのエタノール（例えば＜１４０ｐｐｍ）、および／または＜３０００ｐｐｍのメタノールを含有する。

【0074】

トレハロースまたはトレハロース類似体を含み、トレハラーゼ阻害剤を含むか、または含まない組成物は、好ましくは低レベルのエンドトキシンを含む。細菌性エンドトキシンはリポ多糖類（ＬＰＳ）であり、血流に注入されると発熱や病気を引き起こすことが知られているグラム陰性菌細胞壁の成分である。細菌内エンドトキシンは熱安定性であり、毒性は細菌細胞の存在には依存しない。トレハロースを含む多くの治療薬は細菌で産生され得るので、治療用製品がエンドトキシンを含まないことを確実にするためにエンドトキシン試験が用いられる。トレハロースを含む組成物は、１．０、０．９、０．８、０．７５、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１以下のエンドトキシン単位／ｍＬを含有してもよい。好ましくは、トレハロースを含む組成物は、０．７５エンドトキシン単位／ｍＬを含有する。

【0075】

上記のように、本開示の組成物中の活性成分がトレハロースである場合、組成物はトレハロースに加えてトレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。トレハラーゼは、小腸の刷子縁細胞および他の細胞中の、トレハロースのグルコースへの変換を触媒するグリコシドヒドロラーゼ酵素である。トレハラーゼは炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙ）分類のファミリーＧＨ３７に分類される（ＥＣ ３．２．１．２８）。トレハラーゼの酵素活性を阻害することができる任意の化合物をトレハラーゼ阻害剤として使用することができる。トレハラーゼ阻害剤の非限定的な例としては、バリドキシルアミンＡ、バリダマイシンＡ、トレハゾリン、１−チアトレハゾリン、スイダトレスチン（ｓｕｉｄａｔｒｅｓｔｉｎ）、サルボスタチン、ＭＤＬ ２６５３７、カスアリン−６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、ミグルスタット、およびワモンゴキブリ（ペリプラネタ・アメリカーナ（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））由来の８６ｋＤタンパク質が挙げられ（Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８９；２６４（２７）：１６１６５−１６１６９を参照されたい）、その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。他のトレハラーゼ阻害剤は、米国特許第５３５４６８５号および中国特許第１０１６２７７６３号に記載のものであってよく、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらなる適切なトレハラーゼ阻害剤は、当技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。例えば、化合物のトレハラーゼへの結合親和性を用いて、該化合物がトレハラーゼの阻害剤であり得るかどうかを決定することができ、化合物のトレハラーゼへの親和性結合の高さが、該化合物がトレハラーゼの阻害剤であり得ることを示す。さらに、化合物の存在下でのトレハラーゼの酵素活性を使用して、該化合物がトレハラーゼの阻害剤であるかどうかを決定することができ、酵素活性の低下が、該化合物がトレハラーゼの阻害剤であることを示す。さらに、化合物は、該化合物がトレハラーゼの阻害剤であるかどうかを決定するためにトレハラーゼの活性部位上でモデル化することができ、化合物がトレハラーゼの活性部位において多数の相互作用を有するようにモデル化される場合、そのときは該化合物はトレハラーゼ阻害剤である。例えば、Ｇｉｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ ２００７；４６：４１１５−４１１９は、トレハラーゼの構造を実証し、トレハラーゼ阻害剤を決定する方法を特定しており、当該文献の開示内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、適切なトレハラーゼ阻害剤はミグルスタットである。

【0076】

本明細書に開示される組成物中のトレハロースまたはトレハロース類似体、および任意選択のトレハラーゼ阻害剤の量は、対象ごとに変動し得るものであり、実際に変動すると思われ、いくつかの要因に依存する。このような要因としては、組成物に使用されるトレハロースの形態（プロドラッグまたは塩など）、治療されるリソソーム蓄積障害、または治療されるリソソーム機能不全を特徴とする障害、該障害の症状の重症度、トレハロースを含む組成物の投与経路、投与される組成物中のトレハラーゼ阻害剤の有無、患者の年齢、体重および全身状態、ならびに処方医の判断が挙げられる。

【0077】

一般に、本開示の組成物は、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または約５％以下（ｗ／ｖ）のトレハロースを含むトレハロースの水溶液である。組成物が経口投与を意図している場合、組成物は約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または約１％以下のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。例えば、経口投与を意図した組成物は、約５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、約４０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、または約３０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、または約２０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、または約１０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、または約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または約１％以下のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。好ましくは、経口投与を意図したトレハロースを含む組成物は、約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または約１％以下のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。

【0078】

トレハロースを含む組成物が非経口投与を意図している場合、組成物は約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、または約１％のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。例えば、非経口投与を意図した組成物は、約５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、もしくは約４０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、もしくは約３０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、もしくは約２０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、約１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、もしくは約１０％のトレハロース（ｗ／ｖ）、または約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、もしくは約１％以下のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。好ましくは、経口投与を意図したトレハロースを含む組成物は、約２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、または約２０％のトレハロース（ｗ／ｖ）を含み得る。本明細書に開示されているトレハロースを含む非経口組成物中のトレハロース、および任意選択のトレハラーゼ阻害剤の量についての他のガイドラインは、米国特許第９，１２５，９２４号に記載されている通りであってよく、当該特許の開示はその全体が本明細書に組み込まれる。

【0079】

トレハロースを含む組成物のｐＨは、約２から約９の範囲であり得る。好ましくは、トレハロースのｐＨは約４．５から約８．０の範囲である。より好ましくは、トレハロースのｐＨは約４．５から約７．０の範囲である。

【0080】

上記のように、トレハロースを含む組成物は、トレハラーゼ阻害剤をさらに含み得る。好ましくは、トレハラーゼ阻害剤はミグルスタットである。トレハロースを含む組成物がミグルスタットをさらに含む場合、該組成物は約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または約５００ｍｇのミグルスタットを含み得る。例えば、トレハロースを含む組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、もしくは約２００ｍｇのミグルスタット、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは約２００ｍｇのミグルスタット、約２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、もしくは約３５０ｍｇのミグルスタット、または約３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、もしくは約４００ｍｇのミグルスタットをさらに含む。

【0081】

本開示の組成物がトレハロースを含む場合、該組成物はトレハロースからなる、プロテインキナーゼＢを阻害するための単一活性成分を含むことが当業者には理解されよう。したがって、好ましい組成物は単一の活性成分としてトレハロースを含む組成物である。別の好ましい組成物はトレハロースおよびミグルスタットを含む組成物である。

【0082】

または、本開示の組成物がトレハロースを含む場合、該組成物はトレハロース以外の１または複数のＡＫＴ阻害剤をさらに含み得る。例えば、トレハロースを含む組成物は、トレハロース以外の１、２、３、またはそれ以上のＡＫＴ阻害剤をさらに含み得る。トレハロース以外のＡＫＴ阻害剤は、下記のものであり得る。

【0083】

（ｂ）他のＡＫＴ阻害剤
本開示の組成物は、トレハロース以外のＡＫＴ阻害剤も含み得る。トレハロース以外のＡＫＴ阻害剤の非限定的な例としては、抗体または抗体フラグメント、受容体リガンド、小分子、ペプチド、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、デンドリマー、マイクロバブル、もしくはアプタマー、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。トレハロース以外の本開示の組成物に適したＡＫＴ阻害剤は当技術分野において公知である。本開示の組成物に適したＡＫＴ阻害剤の非限定的な例としては、８−［４−（１−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン（ＭＫ−２２０６）、Ｎ−｛（１Ｓ）−２−アミノ−１−［（３，４−ジフルオロフェニル）メチル］エチル｝−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−２−フランカルボキサミド、ＡＰＩ−２、ＡＫＴ ＶＩＩＩ、ペリフォシン、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＳＫ２１４１７９５、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８）、ＳＲ１３６６８、ＢＡＹ１１２５９７６、ＡＺＤ５３６３、ＢＫＭ１２０、ＴＩＣ１０、Ａｋｔｉ−１／２、ＳＣ７９、アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、ＰＦ−０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８、類似体、トリシリビン、ＰＨＴ−４２７、Ａ−６７４５６３、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ−４４３６５４、ＶＱＤ−００２、パロミド５２９、ホノキオール、Ａ−６７４５６３、ＢＸ７９５、ミルテフォシン、ペリフォシン、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）抗体、ホスホ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）Ａｋｔ基質抗体、汎−ＡＫＴ抗体、およびＡＫＴ抗体が挙げられる。当該技術分野において以前に記載された他のＡＫＴ阻害剤は、国際特許公開第２００８０７００１６号、第２００６１３５６２７号、第２００８００６０４０号、第２００８０７０１３４号、第２０１１０５５１１５号、第２０１００８８１７７号、第２０１１０７７０９８号、および第２００８０７００４１号のＡＫＴ阻害剤を含むことができ、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。当業者には、本開示の組成物に適したＡＫＴ阻害剤が開発中のＡＫＴ阻害剤および／または臨床試験を受けているＡＫＴ阻害剤であってもよいことが認識されるであろう。例えば、臨床試験を受けているＡＫＴ阻害剤は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｒｅｓｕｌｔｓ？ｔｅｒｍ＝ＡＫｔ＆Ｓｅａｒｃｈ＝Ｓｅａｒｃｈに記載されているものであってよい。

【0084】

トレハロース以外のＡＫＴ阻害剤を含む組成物は、トレハロース以外の複数のＡＫＴ阻害剤の組み合わせを含み得る。例えば、組成物はトレハロース以外の１、２、３種、またはそれ以上のＡＫＴ阻害剤を含み得る。さらに、上記のように、本開示の組成物がトレハロース以外のＡＫＴ阻害剤を含む場合、該組成物はトレハロースをさらに含み得ることが認識されるであろう。

【0085】

本開示の組成物に適した好ましいＡＫＴ阻害剤はＭＫ−２２０６である。ＭＫ−２２０６は、抗悪性腫瘍活性を有する経口で生物学的に利用可能なアロステリック汎ＡＫＴ阻害剤である。ＭＫ−２２０６は、非ＡＴＰ競合的にＡＫＴに結合して、その活性を阻害する。ＭＫ−２２０６の化学構造式を以下に示す。

【化2】

【0086】

当業者に認識されるように、本開示の組成物中のＡＫＴ阻害剤の量は、ＡＫＴ阻害剤、投与経路、リソソーム障害、症状の重症度、対象の年齢、体重、および全身状態、ならびに医師の判断などの要因に応じて変動し得るものであり、実際に変動すると思われ、実験的に決定することができる。本開示の組成物がＡＫＴ阻害剤としてＭＫ−２２０６を含む場合、該組成物は好ましくは経口投与用に製剤化され、約１から約５００ｍｇのＭＫ−２２０６、約１０から約２００ｍｇのＭＫ−２２０６、約３０から約１００ｍｇのＭＫ−２２０６、または約１００から約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含み得る。

【0087】

（ｃ）医薬組成物
本開示は、ＡＫＴ阻害剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。賦形剤は希釈剤であり得る。希釈剤は、圧縮性（すなわち、塑性変形可能）または摩耗性で脆いものであり得る。適切な圧縮性希釈剤の非限定的な例としては、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、セルロース誘導体、セルロース粉末、セルロースエステル（すなわち、アセテートおよびブチレート混合エステル）、エチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コーンスターチ、リン酸化コーンスターチ、アルファ化コーンスターチ、米デンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、デンプン−ラクトース、デンプン−炭酸カルシウム、デンプングリコール酸ナトリウム、グルコース、フルクトース、ラクトース、ラクトース一水和物、スクロース、キシロース、ラクチトール、マンニトール、マリトール、ソルビトール、キシリトール、マルトデキストリン、およびトレハロースが挙げられる。適切な摩耗性脆性希釈剤の非限定的な例としては、二塩基性リン酸カルシウム（無水または二水和物）、リン酸カルシウム三塩基性、炭酸カルシウム、および炭酸マグネシウムが挙げられる。

【0088】

賦形剤は結合剤でもあり得る。適切な結合剤としては、限定するものではないが、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ_１２−Ｃ_１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

【0089】

賦形剤は充填剤であり得る。適切な充填剤としては、限定するものではないが、炭水化物、無機化合物、およびポリビニルピロリドンが挙げられる。非限定的な例として、充填剤は、硫酸カルシウム、二塩基性および三塩基性の両方、デンプン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、微結晶セルロース、二塩基性リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸カルシウム、タルク、加工デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールであり得る。

【0090】

賦形剤は緩衝剤であり得る。適切な緩衝剤の代表例としては、限定するものではないが、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、Ｔｒｉｓ緩衝液、および緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。賦形剤はまた、浸透圧を変えるための塩であってもよい。

【0091】

賦形剤はｐＨ調整剤であり得る。非限定的な例として、ｐＨ調整剤は炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、またはリン酸であり得る。

【0092】

賦形剤は、浸透圧を変えるための塩であり得る。当業者に認識されるように、非経口製剤の浸透圧は、通常、ヒト血漿の浸透圧（２９０ｍ Ｏｓｍ／Ｌ）と一致するように調整される。したがって、本開示の非経口製剤の浸透圧は、約２８０から約３３０ｍ Ｏｓｍ／ｋｇであり得る。

【0093】

賦形剤は崩壊剤であり得る。崩壊剤は、非発泡性または発泡性であり得る。非発泡性崩壊剤の適切な例としては、限定するものではないが、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化デンプンおよび加工デンプンなどのデンプン、甘味料、ベントナイトなどの粘土、微結晶セルロース、アルギン酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、グアー、ローカストビーン、カラヤ、ペチチン、トラガカントなどのガムが挙げられる。適切な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、重炭酸ナトリウムとクエン酸との組み合わせ、および重炭酸ナトリウムと酒石酸との組み合わせが挙げられる。

【0094】

賦形剤は、分散剤または分散促進剤であり得る。適切な分散剤としては、限定するものではないが、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスケイ酸塩（ｉｓｏａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、および微結晶セルロースが挙げられ得る。

【0095】

賦形剤は防腐剤であり得る。適切な防腐剤の非限定的な例としては、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはレチニルパルミテート、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどの酸化防止剤；ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのキレート剤；ならびにパラベン、クロロブタノール、フェノールなどの抗菌剤が挙げられる。

【0096】

賦形剤は滑沢剤であり得る。適切な滑沢剤の非限定的な例としては、タルクまたはシリカなどの鉱物、ならびに植物性ステアリン、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸などの脂肪が挙げられる。

【0097】

賦形剤は矯味剤であり得る。矯味剤としては、セルロースエーテル；ポリエチレングリコール；ポリビニルアルコール；ポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールコポリマー；モノグリセリドまたはトリグリセリド；アクリル系ポリマー；アクリルポリマーとセルロースエーテルとの混合物；酢酸フタル酸セルロース；ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。

【0098】

賦形剤は香味剤であり得る。香味剤は、合成香味油および香味芳香剤および／または天然油、植物、葉、花、果実からの抽出物、ならびにこれらの組み合わせから選択することができる。

【0099】

賦形剤は着色剤であり得る。適切な着色添加剤としては、限定するものではないが、食品、薬物および化粧品色素（ＦＤ＆Ｃ）、薬物および化粧品色素（Ｄ＆Ｃ）、または外用薬物および化粧品色素（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）が挙げられる。

【0100】

組成物中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、組成物の総重量の約９９％以下、約９７％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７５％以下、約７０％以下、約６５％以下、約６０％以下、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％、または約１％以下であり得る。

【0101】

本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化することができる。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコール、メチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与用バイアルに封入することができる。

【0102】

経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含み得る。経口組成物は、ゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与の目的では、活性化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤として使用するための流体担体を使用して調製されてもよく、ここで、流体担体中の化合物は経口適用され、局所使用され、吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質の化合物を含有していてもよい：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプン、もしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤、スクロース、もしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味などの香味剤。吸入による投与のために、化合物は、適切な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0103】

本発明の医薬組成物はまた、非経口投与に適合するように製剤化することもできる。例えば、注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。例示的実施形態では、本発明の医薬組成物はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて製剤化される。

【0104】

すべての場合において、組成物は無菌であり得、そして容易な注射可能性が存在する程度まで流動性であり得る。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定であり得、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合がある。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

【0105】

滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に適切な溶媒中に組み入れ、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と任意の追加の所望成分との粉末が、予め滅菌濾過したこれらの溶液から得られる。

【0106】

全身投与もまた、経粘膜的手段または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与のためには、浸透させるべき障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られており、例えば、経粘膜投与用には、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含み得る。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られている軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。化合物はまた、坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含む）または直腸送達用の停留浣腸剤の形態で調製することもできる。

【0107】

活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な排泄に対して化合物を保護するであろう担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って製造することができる。

【0108】

特定の実施形態では、本開示の活性成分は、化合物の標的細胞への送達を助けるため、組成物の安定性を高めるため、または組成物の潜在的な毒性を最小限に抑えるために適切なビヒクルに封入される。当業者には理解されるように、さまざまなビヒクルが本発明の組成物を送達するのに適している。適切な構造化流体送達システムの非限定的な例としては、ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、デンドリマーおよび他のリン脂質含有システムを挙げることができる。組成物を送達媒体に組み込む方法は当技術分野において公知である。

【0109】

一代替実施形態では、リポソーム送達ビヒクルを利用することができる。リポソームは、その実施形態にもよるが、それらの構造的および化学的性質の観点から、本発明の化合物の送達に適している。一般的に言って、リポソームはリン脂質二重層膜を有する球状小胞である。リポソームの脂質二重層は他の二重層（例えば、細胞膜）と融合することができ、したがってリポソームの内容物を細胞に送達することができる。このようにして、本開示の活性成分は、標的細胞の膜と融合するリポソーム中に封入することによって細胞に選択的に送達することができる。

【0110】

リポソームは、さまざまな炭化水素鎖長を有するさまざまな異なる種類のリン脂質から構成され得る。リン脂質は一般に、グリセロールリン酸を介してさまざまな極性基のうちの１つに連結された２つの脂肪酸を含む。適切なリン脂質としては、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジホスファチジルグリセロール（ＤＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）が挙げられる。リン脂質を含む脂肪酸鎖は、長さが約６〜約２６個の炭素原子の範囲であり得、脂質鎖は飽和であっても、または不飽和であってもよい。適切な脂肪酸鎖としては（一般名を括弧内に示す）、ｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）、ｎ−トレトラデカン酸（ｔｒｅｔｒａｄｅｃａｎｏａｔｅ）（ミリスチン酸）、ｎ−ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ｎ−オクタデカン酸（ステアリン酸）、ｎ−エイコサン酸（アラキジン酸）、ｎ−ドコサン酸（ベヘン酸）、ｎ−テトラコサン酸（ｔｅｔｒａｃｏｓａｎｏａｔｅ）（リグノセリン酸）、シス−９−ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）、シス−９−オクタデカン酸（オレイン酸）、シス，シス−９，１２−オクタデカジエン酸（リノール酸）、オールシス−９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（リノレン酸）、およびオールシス−５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）が挙げられる。リン脂質の２つの脂肪酸鎖は同一であっても、または異なっていてもよい。許容されるリン脂質としては、ジオレオイルＰＳ、ジオレオイルＰＣ、ジステアロイルＰＳ、ジステアロイルＰＣ、ジミリストイルＰＳ、ジミリストイルＰＣ、ジパルミトイルＰＧ、ステアロイル、オレオイルＰＳ、パルミトイル、リノレニルＰＳなどが挙げられる。

【0111】

リン脂質は、任意の天然源に由来してよく、したがって、リン脂質の混合物を含んでもよい。例えば、卵黄はＰＣ、ＰＧ、およびＰＥが豊富で、大豆はＰＣ、ＰＥ、ＰＩ、およびＰＡを含有し、動物の脳または脊髄はＰＳが豊富である。リン脂質は合成起源由来であってもよい。さまざまな比率の個々のリン脂質を有するリン脂質の混合物を使用することができる。異なるリン脂質の混合物は、有利な活性または活性特性の安定性を有するリポソーム組成物をもたらし得る。上記のリン脂質は、カチオン性脂質、例えばＮ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロアラート（ｐｅｒｃｈｌｏａｒａｔｅ）、３，３’−デヘプチルオキサカルボシアニンヨージド、１，１’−デドデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロアラート（ｐｅｒｃｈｌｏａｒａｔｅ）、１，１’−ジオレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンメタンスルホネート、Ｎ−４−（デリノレイルアミノスチリル）−Ｎ−メチルピリジニウムヨージド、または１，１，−ジリノレイル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロアラート（ｐｅｒｃｈｌｏａｒａｔｅ）、と最適な比率で混合することができる。

【0112】

リポソームは、スフィンゴシンがグリセロールの構造的対応物であり、ホスホグリセリドの脂肪酸の１つであるスフィンゴ脂質、または動物細胞膜の主成分であるコレステロールを任意選択で含んでもよい。リポソームは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のポリマーに共有結合した脂質であるペグ化脂質を任意選択で含有してもよい。ＰＥＧは、約５００〜約１０，０００ダルトンのサイズ範囲であり得る。

【0113】

リポソームは適切な溶媒をさらに含み得る。溶媒は有機溶媒であっても、または無機溶媒であってもよい。適切な溶媒としては、限定するものではないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルピロリドン、Ｎ−メチルピロリドン、アセトニトリル、アルコール、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはこれらの組み合わせが挙げられる。

【0114】

本開示の活性成分を担持する（すなわち、少なくとも１つのメチオニン化合物を有する）リポソームは、例えば米国特許第４，２４１，０４６号、第４，３９４，４４８号、第４，５２９，５６１号、第４，７５５，３８８号、第４，８２８，８３７号、第４，９２５，６６１号、第４，９５４，３４５号、第４，９５７，７３５号、第５，０４３，１６４号、第５，０６４，６５５号、第５，０７７，２１１号および第５，２６４，６１８号に詳述されているような、薬物送達用のリポソームの任意の公知の調製方法によって調製することができ、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、リポソームは、水溶液中で脂質を超音波処理すること、溶媒注入、脂質水和、逆蒸発、または凍結融解を繰り返すことによる凍結乾燥によって調製することができる。好ましい実施形態において、リポソームは超音波処理によって形成される。リポソームは、タマネギのような多くの層を有する多層でも、または単層でもあり得る。リポソームは大きくても小さくてもよい。継続的な高剪断超音波処理は、より小さい単層リポソームを形成する傾向がある。

【0115】

当業者に明らかであるように、リポソーム形成を支配するすべてのパラメータは変動し得る。これらのパラメータには、限定するものではないが、温度、ｐＨ、メチオニン化合物の濃度、脂質の濃度および組成、多価カチオンの濃度、混合速度、溶媒の存在および濃度が含まれる。

【0116】

別の実施形態では、本開示の活性成分はマイクロエマルジョンとして細胞に送達されてもよい。マイクロエマルジョンは、一般に、水溶液、界面活性剤、および「油」を含む透明で熱力学的に安定な溶液である。この場合の「油」は超臨界流体相である。界面活性剤は油−水界面に留まる。本明細書に記載されているもの、または当技術分野で公知の他のものを含むさまざまな界面活性剤のすべてが、マイクロエマルジョン製剤における使用に適している。本発明での使用に適した水性マイクロドメインは一般に、約５ｎｍから約１００ｎｍまでの特徴的な構造寸法を有する。このサイズの凝集体は、可視光の散乱性が低いため、これらの溶液は光学的に透明である。当業者によって理解されるように、マイクロエマルジョンは、球状、棒状、または円盤状凝集体を含む多数の異なる微視的構造を有し得るものであり、実際に有すると思われる。一実施形態では、構造はミセルであってもよく、これは一般に球形または円筒形の物体である最も単純なマイクロエマルジョン構造である。ミセルは水中油の液滴のようなもので、逆ミセルは油中水の液滴のようなものである。代替の実施形態では、マイクロエマルジョン構造はラメラである。ラメラは界面活性剤の層によって分離された水と油の連続層を含む。マイクロエマルジョンの「油」は最適にはリン脂質を含む。リポソームについて上で詳述したリン脂質のすべてがマイクロエマルジョンを対象とする実施形態に適している。本開示の活性成分は、当技術分野において一般的に知られている任意の方法によってマイクロエマルジョン中に封入することができる。

【0117】

さらに別の実施形態では、本開示の活性成分は、樹状巨大分子またはデンドリマー中で送達され得る。一般的に言えば、デンドリマーは分枝した木のような分子で、それぞれの枝が一定の長さの後に２つの新しい枝（分子）に分かれる分子の連結した鎖である。この分枝は枝（分子）がとても密集して天蓋が球体を形成するまで続く。一般に、デンドリマーの性質はそれらの表面の官能基によって決まる。例えば、カルボキシル基などの親水性末端基は、典型的には水溶性デンドリマーを形成する。または、リン脂質をデンドリマーの表面に組み込んで皮膚を越える吸収を促進することができる。リポソームの実施形態での使用について詳述されたリン脂質のいずれも、デンドリマーの実施形態での使用に適している。当技術分野において一般的に知られている任意の方法を利用して、デンドリマーを製造し、その中に本開示の活性成分を封入することができる。例えば、デンドリマーは、反応工程の連続反復によって生成されてもよく、その場合、さらなる反復のたびに、より高次のデンドリマーがもたらされる。その結果、それらは、ほぼ均一なサイズおよび形状を有する、規則的で高度に分枝した３Ｄ構造を有する。さらに、デンドリマーの最終サイズは典型的には、合成中に使用される反復工程の数によって制御される。さまざまなデンドリマーサイズが本発明における使用に適している。一般に、デンドリマーのサイズは、約１ｎｍから約１００ｎｍの範囲であり得る。

【0118】

医薬組成物のさらなる製剤は、例えば、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９７５）およびＬｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）中のものであってよい。

【0119】

当業者は、医薬組成物中の本発明の活性成分の濃度が、投与経路、対象、および投与の理由に部分的に依存して変動し得るものであり、実際に変動すると思われ、実験的に決定できることを認識されよう。医薬組成物中の本発明のナノ粒子などの活性剤の濃度を実験的に決定する方法は、当技術分野において公知である。

【0120】

ＩＩ．リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全によって特徴付けられる障害を治療する方法
別の態様では、本開示は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を、対象において治療する方法を提供する。本発明の方法は、対象においてＡＫＴを阻害することによって、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害を、対象において治療することを含む。ＡＫＴは、ＡＫＴ阻害剤を含む組成物の治療有効量を対象に投与することによって対象において阻害することができる。ＡＫＴ阻害剤はトレハロースであり得る。または、ＡＫＴ阻害剤はトレハロース以外のＡＫＴ阻害剤である。

【0121】

本明細書中で使用される場合、用語「治療する」は、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全および／またはその関連症状の１または複数を特徴とする障害の予防、改善、防止または治癒を説明するために使用することができる。例えば、既存のリソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害の治療は、その障害を軽減、改善、または完全に排除する、またはそれが悪化することを防ぐことができる。予防的治療は、障害が発症するリスクを低減し、および／または障害が後に発症する場合にその重症度を低下させる可能性がある。

【0122】

用語「リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害」は、本明細書において、リソソーム代謝の損傷によって引き起こされ得る任意の状態、またはリソソーム機能不全を示すか、もしくはそれによって悪化する任意の状態を説明するために使用され得る。少なくとも６０の公知のリソソーム蓄積障害および骨格、脳、皮膚、心臓、および中枢神経系を含む体のさまざまな部分に影響を及ぼし得るリソソーム機能不全を特徴とする他の多くの障害がある。リソソーム機能不全を特徴とするさらなる障害が同定され続けている。本開示の方法を用いて治療することができるリソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害の非限定的な例としては、アスパルチルグルコサミン尿症、若年性神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ、若年性バッテン病またはＣＬＮ３病）、シスチン症、ファブリ病、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症Ｉ型（テイ・サックス病）、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症ＩＩ型（サンドホフ病）、異染性白質ジストロフィー、ムコリピド症Ｉ型、ＩＩ／ＩＩＩ型およびＩＶ型、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病およびその変種、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、モルキオ症候群Ａ型およびＢ型、マルトー・ラミー症候群、およびスライ病）、ニーマンピック病Ａ／Ｂ型、Ｃ１およびＣ２、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症、パーキンソン病およびアルツハイマー病、ならびにシンドラー病Ｉ型およびＩＩ型が挙げられる。

【0123】

本開示の方法は、対象においてＡＫＴを阻害することによって、若年性神経性セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ）を患っている対象においてＪＮＣＬを治療することを含み得る。したがって、本開示の方法は、ＡＫＴ阻害剤を含む組成物の治療有効量を対象に投与することによって、対象においてＪＮＣＬを治療することを含む。好ましくは、ＡＫＴ阻害剤はトレハロースである。また好ましくは、ＡＫＴ阻害剤はＭＫ−２２０６である。

【0124】

ＪＮＣＬは小児期の最も一般的な神経変性障害である。ＪＮＣＬの特徴は、オートファジー−リソソーム経路の損傷を示す、大部分の神経細胞およびさまざまな脳外組織におけるセロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積である。ＪＮＣＬは視力障害と難聴を示し、発作、運動機能障害、および認知症を含むように進行する。ＪＮＣＬ患者は、人生の３０年間で死に至る容赦のない身体的および認知的機能低下を経験する。したがって、本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することは、ＪＮＣＬを有する対象の神経細胞およびさまざまな脳外組織におけるセロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積を防ぐことができ、またはセロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積を低減または排除することができる。セロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積を判定する方法は当技術分野において公知であり、実施例に記載されている通りであり得る。さらに、本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することにより、対象における認知機能低下を予防、逆転、または阻止することができる。対象におけるＪＮＣＬに起因する認知機能低下を判定する方法は当技術分野において公知であり、実施例に記載されている通りであり得る。例えば、本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することにより、視力障害を予防、逆転、または阻止することができる。本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することによりまた、難聴を予防、逆転、または阻止することができる。本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することによりまた、発作の重症度および／または強度を低減させることができる。さらに、本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することにより、運動機能障害を改善または予防することができる。本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することによりまた、認知症を改善または予防することができる。

【0125】

本開示の方法を使用してＪＮＣＬを治療することによりまた、それを必要とする対象の寿命を延ばすことができる。本開示の方法を使用することにより、ＪＮＣＬを有する対象の寿命中央値は、約１％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは約９０％、または障害がもはや対象の寿命の要因ではなくなる時点まで延ばすことができる。例えば、本開示の方法は、ＪＮＣＬを有する対象の寿命の中央値を約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、もしくは約９０％、または障害がもはや対象の寿命の要因ではなくなる時点まで延ばすことができる。または、本開示の方法により、ＪＮＣＬを有する対象の寿命の中央値を約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または約５０％延ばすことができる。本開示の方法によりまた、ＪＮＣＬを有する対象の寿命の中央値を約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、または約２５％延ばすことができる。

【0126】

さらに別の態様では、本開示は、トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロースを含む組成物とを接触させることによってプロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法を提供する。プロテインキナーゼＢは、プロテインキナーゼＢを有する細胞をトレハロースを含む組成物と接触させることによって、またはトレハロースを含む組成物を対象に投与することによって接触させる。病状は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全特徴とする障害、過剰増殖性疾患、または免疫障害であり得る。

【0127】

別の態様では、本開示は、機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強する方法であって、前記細胞をプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物と接触させることによって細胞中のプロテインキナーゼＢを阻害することを含む方法を提供する。細胞はインビトロで接触させることができる。または、細胞は、ある量のプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによってインビボで接触させることができる。

【0128】

（ａ）対象
対象は、げっ歯類、ヒト、家畜動物、コンパニオンアニマル、または動物学上の動物であり得る。一実施形態では、対象はげっ歯類、例えばマウス、ラット、モルモットなどであり得る。別の実施形態では、対象は家畜動物であり得る。適切な家畜動物の非限定的な例は、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラマおよびアルパカを含み得る。さらに別の実施形態では、対象はコンパニオンアニマルであり得る。コンパニオンアニマルの非限定的な例は、イヌ、ネコ、ウサギ、およびトリなどのペットを含み得る。さらに別の実施形態では、対象は動物学上の動物であり得る。本明細書中で使用される場合、「動物学上の動物」とは、動物園で見ることができる動物を指す。そのような動物には、非ヒト霊長類、大型ネコ科動物、オオカミ、およびクマが含まれ得る。いくつかの好ましい実施形態において、対象はマウスである。他の好ましい実施形態では、対象はヒトである。

【0129】

対象は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害に関連する徴候または症状を有していても、または有していなくてもよい。当業者には、病理学的リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害に関連する症状の診断もしくは発症前に始まっている可能性が高いことは理解されよう。したがって、それを必要とする対象は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害に関連する症状を有する対象、またはリソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害に関連する任意の症状を有さない対象、またはリソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害に関連する症状の１つもしくはいくつかのみを有する対象であり得る。

【0130】

（ｂ）投与
治療適用のためには、治療有効量の本発明の組成物が対象に投与される。本明細書中で使用される場合、「治療有効量」のＡＫＴ阻害剤という用語は、治療されるリソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害に対して測定可能な効果を生じるのに十分な量のＡＫＴ阻害剤を指す。本発明の治療用組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の対象に対して所望の治療応答を達成するのに有効な量の（１または複数の）活性成分を投与するように変動させてよい。

【0131】

ＡＫＴのいずれの阻害剤についても、治療期間は、一回限りで投与される単回投与から生涯にわたる一連の治療的治療までの範囲であり得る。治療期間は、治療される対象および疾患に応じて変動し得るものであり、実際に変動すると思われる。例えば、治療期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日間であり得る。または、治療期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間であり得る。または、治療期間は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月であり得る。治療期間は、１年、２年、３年、４年、５年、または５年を超えることもあり得る。投与はある期間頻繁であり得、次いで投与は一定期間間隔が空いてもよいこともまた企図される。例えば、治療期間は５日間であり、次いで９日間は治療がなく、その後５日間の治療であり得る。

【0132】

疾患自体に対する治療の投与のタイミングおよび治療期間は、症例を取り巻く状況によって決定されるであろう。診断時などに治療を直ちに開始することも、他の治療の後に治療を開始することも可能である。治療は、病院または診療所自体で、または退院後の後の時点で、または外来診療所で診察された後に開始してもよい。

【0133】

本明細書中に記載される組成物の投与は、ＡＫＴ阻害剤を含む１または複数の組成物の投与、ならびに他の薬学的に活性な組成物の投与の複数の過程を含み得る治療レジメンの一部として行うことができる。このようなレジメンは、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害の治療方法として、および／または障害の治療後の患者の健康の長期維持方法（防止）として設計することができる。治療レジメンは、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害について無症候性である対象を治療する方法として設計することができる。このような治療レジメンは、対象において、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害の発症、および／またはリソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害の症状を遅らせることができる。適切な治療レジメンの決定は当業者の技量の範囲内であることが理解されよう。

【0134】

投与は、末梢（すなわち、中枢神経系への投与によるものではない）または中枢神経系への局所投与を含む標準的な有効な技術を用いて行うことができる。末梢投与は、限定するものではないが、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、および腹腔内を含み得る。中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与を含む局所投与としては、限定するものではないが、腰椎、脳室内、または実質内カテーテルを介した投与、または外科的に埋め込まれた制御放出製剤の使用が挙げられる。本発明の組成物は注入（連続またはボーラス）によって投与することができる。

【0135】

当業者であれば、本開示の複数の組成物の組み合わせが使用可能であることは理解されよう。本開示の組成物による治療の前、後、および／または最中に、本開示の組成物を他の治療剤と組み合わせて使用できることも当業者には理解されよう。さらに、本発明の方法は、特定のリソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害に対する標準的な治療法と組み合わせて使用することができる。

【0136】

選択された投薬量レベルは、組成物中のＡＫＴの特定の阻害剤、治療用組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、疾患および寿命、ならびに治療を受けている対象の体調および過去の病歴を含むさまざまな要因に依存し得る。例えば、活性成分がトレハロースである場合、組成物中のトレハラーゼ阻害剤の存在ならびにトレハロースおよび任意選択でトレハラーゼを含む組成物の意図される投与経路は、選択されたトレハロースの投薬量レベルへの要因であり得る。

【0137】

トレハロースは、意図された治療用量より実質的に高い用量で安全かつ無毒性であると判定されている。トレハロース以外のＡＫＴ阻害剤を含む組成物の毒性および治療有効性は、未知であれば、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば最大耐量（ＭＴＤ）、ＥＤ_５０および治療指数（ＴＩ）を決定するために用いられる手順によって決定することができ、ＥＤ_５０は最大応答の５０％を達成するための有効量であり、治療指数（ＴＩ）はＥＤ_５０に対するＭＴＤの比である。明らかに、高いＴＩを有する組成物が本明細書における最も好ましい組成物であり、好ましい投薬量計画は、トレハロースの血漿レベルを所望の治療効果を維持するための最小濃度以上に維持するものである。いくつかの実施形態では、ＡＫＴ阻害剤を含む組成物の最小用量を投与することができ、用量制限毒性がない場合は用量を漸増させる。治療有効用量の決定および調整、ならびにそのような調整をいつ、どのように行うかの評価は、医薬の当業者には公知である。

【0138】

投与経路が経口である場合、トレハロースを含む組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００ｍｇ／ｋｇ体重／日から、または約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日までの投薬量範囲で投与することができる。例えば、トレハロースを含む組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、または約３００ｍｇ／Ｋｇ体重／日の投薬量範囲で経口投与することができる。トレハロースを含む組成物はまた、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量範囲で経口投与することもできる。または、トレハロースを含む組成物はまた、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量範囲で経口投与することもできる。好ましくは、トレハロースを含む組成物は、約０．１ｇ／ｋｇ／日から１ｇ／ｋｇ／日の投薬量範囲で経口投与することができる。

【0139】

または、トレハロースを含む本開示の組成物が非経口投与される場合、トレハロース組成物は、米国特許第９，１２５，９２４号に開示されているように投与されてもよく、当該特許の開示はその全体が本明細書に組み込まれる。投与経路が非経口である場合、トレハロースを含む組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００ｍｇ／ｋｇ体重／日から、または約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日までの投薬量範囲で投与することができる。例えば、トレハロースを含む組成物は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、または約３００ｍｇ／Ｋｇ体重／日の投薬量範囲で非経口投与することができる。トレハロースを含む組成物はまた、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量範囲で非経口投与することもできる。または、トレハロースを含む組成物はまた、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量範囲で非経口投与することもできる。トレハロースを含む組成物は、約０．１グラム／ｋｇ／日から１ｇ／ｋｇ／日の投薬量範囲で投与することができる。用量は０．５４グラム／ｋｇ／日未満であり得る。

【0140】

本開示の投与組成物がトレハロースを含み、トレハラーゼ阻害剤としてミグルスタットをさらに含む場合、ミグルスタットは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００ｍｇ／ｋｇ体重／日から、または約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日までの投薬量範囲で投与することができる。例えば、組成物は、約３０から約１００ｍｇ／ｋｇのミグルスタット、約１００から約３００ｍｇ／ｋｇのミグルスタット、または約１００から約１５０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットの投薬量範囲で投与することができる。

【0141】

静脈内投与する場合、トレハロースを含む組成物は、約５分から数日または数週間にわたって投与することができる。好ましくは、静脈内投与する場合、トレハロースを含む組成物は、約７５、８０、８５、９０、９５から約１２０分かけて投与することができる。より好ましくは、静脈内投与する場合、トレハロースを含む組成物は９０分以内に投与することができる。

【0142】

さらに、トレハロースを含む組成物は、最大エンドトキシンレベルが５ＥＵ／キログラム体重／時未満になるように静脈内投与することができる。特に、トレハロースを含む組成物は、エンドトキシンレベルが約１、２、３、または約４エンドトキシン単位／キログラム体重／時未満になるように静脈内投与することができる。

【0143】

経口投与でも非経口投与でも、トレハロースを含む組成物は、トレハロース投与後約１０から約２０、または３０、または４０、または５０、または６０分以内にトレハロースの有効血清レベルを達成するように投与することができる。特定の実施形態では、有効成分の有効血清レベルは、トレハロース投与後約５から約２０、または３０、または４０、または５０、または６０分以内に達成される。特定の実施形態では、有効成分の有効血清レベルは、トレハロース投与後約１０から約２０、または３０、または４０、または５０、または６０分以内に達成される。特定の実施形態では、有効成分の有効血清レベルは、トレハロース投与後約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または６０分以内に達成される。

【0144】

トレハロースを含む組成物は、（投与当日の）１日の総用量が約５グラムから５０グラムの間になるように投与することができる。好ましい実施形態では、トレハロースの投与用量の合計は８、１５または３０グラムである。特定の実施形態では、トレハロースは５、８、１５、３０、４０または５０グラムの単回用量として投与される。

【0145】

トレハロースの投与頻度は、症状または疾患を効果的に治療するために必要に応じて、１日１回、２回、３回、もしくはそれ以上、または１週間もしくは１ヶ月に１回、２回、３回もしくはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、投与頻度は、１日に１、２または３回であり得る。例えば、用量は、２４時間ごと、１２時間ごと、または８時間ごとに投与することができる。特定の実施形態では、投与頻度は１週間に３回であり得る。別の特定の実施形態では、投与頻度は週に１回であり得る。さらに別の特定の実施形態では、投与頻度は毎日であり得る。

【0146】

組成物がＡＫＴ阻害剤としてＭＫ−２２０６を含む場合、ＭＫ−２２０６は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、３００ｍｇ／Ｋｇ体重／日の投薬量範囲で投与することができる。例えば、ＭＫ−２２０６は約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、または約３００ｍｇ／Ｋｇ体重／日の投薬量範囲で投与することができる。ＭＫ−２２０６はまた、約１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、または約３００ｍｇ／Ｋｇ体重／日の投薬量範囲で投与することもできる。または、ＭＫ−２２０６はまた、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投薬量範囲で投与することもできる。好ましくは、ＭＫ−２２０６はまた、約１００ｍｇ／ｋｇ／日〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日の投薬量範囲で投与することもできる。

【0147】

ＩＩＩ．トレハロースの使用法
別の態様では、本開示はトレハロースを使用する方法を提供する。この方法は、トレハロースをそれを必要としている対象に投与して、その対象においてプロテインキナーゼＢによって媒介される病状を治療することを含む。プロテインキナーゼＢによって媒介される病状は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、子宮内膜症、代謝性疾患、および関節炎疾患であり得る。好ましくは、トレハロースを使用する方法は、リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害を治療することを含み、上記の通りであり得る。

【0148】

トレハロースを使用する方法は、癌などの過剰増殖性疾患を治療することをさらに含み得る。トレハロースを含む組成物およびトレハロースを投与する方法は、上記の通りであり得る。治療され得る新生物または癌細胞の非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫（小児小脳または脳）、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺癌／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児期、消化管）、未知の原発性癌、中枢神経系リンパ腫（原発）、小脳星状細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、腫瘍のユーイングファミリーのユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍（小児期）、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃癌（胃）癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、生殖細胞腫瘍（小児期頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛腫瘍、神経膠腫（成人、小児の脳幹、小児脳星状細胞腫、小児視経路および視床下部）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、視床下部および視経路神経膠腫（小児）、眼球内黒色腫、膵島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性、急性骨髄性、慢性リンパ球性、慢性骨髄性、有毛性）、口唇および口腔癌、肝癌（原発性）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、原発性中枢神経系）、マクログロブリン血症（ワンデルストレーム（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ））、骨／骨肉腫の悪性線維性組織球腫、髄芽腫（小児）、黒色腫、眼球内黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫（成人悪性、小児）、原発不明転移性扁平上皮頸部癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群（小児）、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病（慢性）、骨髄性白血病（成人急性、小児急性）、多発性骨髄腫、骨髄増殖性障害（慢性）、鼻腔および副鼻腔癌、上咽頭癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、骨の骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵臓癌（膵島細胞）、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児）、下垂体腺腫、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌（腎臓癌）、尿管；腎盂移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫（小児期）、唾液腺癌、肉腫（腫瘍のユーイングファミリー、カポジ、軟部組織、子宮）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、黒色腫）、皮膚癌（メルケル細胞）、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明扁平上皮頸部癌（転移性）、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍（小児）、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚）、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫（小児）、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌（小児）、尿管；腎盂移行上皮癌、絨毛性腫瘍（妊娠性）、未知の原発部位（成人、小児）、尿管；腎盂移行上皮癌、尿道癌、子宮癌（子宮内膜）、子宮肉腫、膣癌、視経路および視床下部神経膠腫（小児）、外陰癌、ワンデルストレームクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍（小児）が挙げられる。

【0149】

トレハロースを使用する方法は、ＡＫＴによって媒介される免疫障害を治療することをさらに含み得る。したがって、本発明の方法はまた、関節リウマチ、変形性関節症、クローン病、血管線維腫、眼疾患（例えば、網膜血管新生、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、黄斑変性など）、肥満、アルツハイマー病、再狭窄、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、静脈グラフト狭窄、前立腺肥大、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、組織修復による神経障害の抑制、瘢痕組織形成（および創傷治癒を助けることができる）、多発性硬化症、炎症性腸疾患、感染症、特に細菌性、ウイルス性、レトロウイルス性または寄生虫性感染症（アポトーシスの増加による）、肺疾患、新生物、パーキンソン病、移植拒絶反応（免疫抑制剤として）、敗血症性ショックなど疾患および状態を治療するためにトレハロースを使用することを含み得る。

【0150】

定義
本開示またはその（１または複数の）実施形態の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、１または複数の要素の存在を意味することを意図している。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味することを意図している。

【0151】

本明細書で使用される用語「治療すること」および「治療」は、徴候または症状の重症度および／または頻度の減少、徴候または症状および／または根本原因の排除、症状の発生および／またはそれらの根本原因の予防（例えば、予防的治療）、ならびに損傷の改善または改善を指す。

【0152】

「有効量」および「治療有効量」という用語は互換的に使用され、所望の効果を提供するための薬物または薬剤の無毒ではあるが十分な量を指す。

【0153】

「薬学的に許容される」という用語は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の他の成分のいずれとも有害な方法で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る物質を指す。「薬学的に許容される」という用語が薬学的担体または賦形剤を指すために使用される場合、その担体または賦形剤は毒性試験および製造試験の要求基準を満たしていること、またはそれは米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれることを意味する。

【0154】

本明細書に記載された開示はさまざまな修正および代替の反復の影響を受けやすいが、その特定の実施形態は上記により詳細に記載されている。しかしながら、詳細な説明は、本開示を開示された特定の実施形態に限定することを意図したものではないことを理解されたい。むしろ、本開示は、特許請求の範囲の文言によって定義されるような本開示の精神および範囲内に含まれるすべての修正形態、等価物、および代替形態を網羅するように意図されていることを理解されたい。

【実施例】

【0155】

以下の実施例は本発明のさまざまな実施形態を例示するものである。

【0156】

実施例１〜３の導入
神経変性疾患は、平均余命の延長および世界的な人口高齢化のために今後数十年で増加すると予想される、公衆衛生に大きな負担をかけるものである。他のヒトの健康状態とは異なり、神経変性疾患はその進行を停止させたり遅らせたりしようとする試みに対して非常に難治性であることが証明されている。実際、寿命を大幅に延ばしたり臨床経過を変えたりする、神経変性疾患のための承認済みの治療法は存在しない^１。したがって、神経変性疾患は、有効な薬理学的に作用可能な標的の同定が緊急に必要とされている、未だ対処されていない医学的状態の代表である。

【0157】

増加している遺伝的および実験的証拠は、神経変性疾患の病因に関与する主な過程として細胞クリアランス経路に集中している。確かに、神経変性状態を有する患者の圧倒的多数は、圧倒されたまたは損なわれた細胞分解系の結果として、未消化の巨大分子の異常なニューロン蓄積を有する^２、３。同定された原因の中には、細胞によって効率的に廃棄されない凝集しやすいタンパク質の異常な生成、および直接または間接的にオートファジー−リソソーム分解経路に影響を及ぼす遺伝的欠陥がある^４。したがって、これらの疾患状態における細胞クリアランスの増強が細胞の恒常性を維持しそして神経細胞死を防ぐのを助けることを提唱する一般的なパラダイムが出現している^５、６。リソソームの生合成および機能を監督する遺伝的プログラムの本発明者らによる最近の同定は、リソソーム分解経路を操作するための適切な標的を提供した^７。基本的なヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）は実際に、リソソーム増殖^８、分解酵素の発現^８、９、オートファジー^１０、リソソームエキソサイトーシス^１１、およびリソソームタンパク質恒常性^１２を含むいくつかの過程の強化を通じて細胞クリアランスの主な調節因子として作用する。ＴＦＥＢの異種発現に基づくインビボ研究は、アルツハイマー病^{１３、１４}、タウオパチー^１５、パーキンソン病^１６、ハンチントン病^８、１７などの神経変性障害のげっ歯類モデルにおいて、クリアランスの改善と疾患表現型の改善を示している。ＴＦＥＢの薬理学的活性化の機会は細胞ベースの研究から生じており、ＴＦＥＢはオートファジー誘導を制限する主要な公知の因子であるラパマイシン複合体１（ｍＴＯＲＣ１）^{１８〜２０}の機構的標的によって負に調節されることを示している。細胞におけるｍＴＯＲＣ１の触媒阻害はＴＦＥＢ活性化をもたらすが、ラパマイシン（その類似体と同様にｍＴＯＲ関連の翻訳用途において研究を先導しているｍＴＯＲＣ１アロステリック阻害剤）は、ＴＦＥＢ^{１８〜２０}の活性化には全く効果がない。実際に、ＴＦＥＢ活性化の薬理学的療法はまだ提案されていない。したがって、ＴＦＥＢを活性化するための代替経路の同定は、翻訳用途においてこの分野を前進させるために必要とされる。

【0158】

以下の実施例は、セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）を、ｍＴＯＲＣ１とは無関係にＴＦＥＢ活性を制御する薬理学的に作用可能な標的として同定する。グルコースの非還元性二糖のα−Ｄ−グルコピラノシル、α−Ｄ−グルコピラノシドまたはトレハロースであるｍＴＯＲ非依存性オートファジー誘導物質^２１は、Ａｋｔを阻害することによってＴＦＥＢの核内移行を促進することがわかった。トレハロース投与は、原型の神経変性疾患のマウスモデルにおいて疾患負荷を軽減し、未分解タンパク質物質の異常なリソソーム内蓄積を提示することが示されている。ＴＦＥＢ活性がＳｅｒ４６７におけるＡｋｔリン酸化によって調節されること、およびＡｋｔの薬理学的阻害がリソソーム経路の障害を呈する遺伝病のさまざまなモデルにおいて細胞クリアランスを促進することが実証されている。Ａｋｔ活性の調節は、重要な臨床試験の主題である。

【0159】

実施例１〜３の方法
細胞培養および処理
対照（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）およびＪＮＣＬ線維芽細胞（Ｇａｓｌｉｎｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｔａｌｙ）を、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＤＭＥＭ（１：１、ＨｙＣｌｏｎｅ）中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞を、ＬＹ２９４００２（５０ｍＭ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｔｏｒｉｎ １（３００ｎＭ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）と共に２時間、またはトレハロース（１００ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ラパマイシン（３００ｎＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＭＫ２２０６（１μＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、Ｕ０１２６（１０ｍＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）と共に２４時間および透析血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。

【0160】

皮質および海馬のニューロン培養
皮質および海馬ニューロンをＥ１７．５および生後０〜１日のマウスから調製し、ポリ−Ｄ−リジンコーティング６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ−２７および１％ＦＢＳを添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地にプレーティングした。インビトロでの日数（ＤＩＶ）４にニューロンを１００ｍＭトレハロースで処理した。ＤＩＶ８において、ニューロンを収集し、ＲＮＡ抽出を行った。

【0161】

皮質星状細胞培養
星状細胞をＰ０−１マウスから単離し、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ高グルコースの存在下でポリ−Ｄ−リジンコーティング６ウェルプレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にプレーティングした。７日後、グリア細胞層を除去し、星状細胞を処理のためにプレーティングした。翌日、１００ｍＭの量のトレハロースを培地に溶解し、４日間保持した。最後に、星状細胞を収集し、タンパク質抽出物をウエスタンブロットアッセイにより分析した。

【0162】

免疫蛍光アッセイ
免疫蛍光アッセイのために、細胞を２４ウェルプレート中のカバーガラス上で増殖させた。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノールで１０分間固定した。次いで細胞をブロッキング剤（ＰＢＳ中０．１％サポニン、１０％ウシ血清）で１時間ブロックし、適切な一次抗体（１：１００）と共に室温で３時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を適切な二次抗体（１：５００）と共に室温で１時間インキュベートした。次いで、共焦点顕微鏡による画像化のために、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｈ−１２００）を含有するベクタシールド（ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）でカバーガラスを封入した。

【0163】

ウエスタンブロット
脳組織および培養細胞を収集し、プロテアーゼのカクテル（Ｒｏｃｈｅ）およびホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ）阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１％ＮＰ４０、０．５％Ｎａ−デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ ＮａＦ）中で溶解した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを使用して、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて測定した。溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ブロットをブロッキング緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水、ｐＨ７．４および０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＢＳＴ中５％ｗ／ｖの乾燥脱脂粉乳）中でインキュベートし、続いてブロッキング緩衝液（５％乾燥乳）中に希釈した適切な抗体と共に一晩インキュベートした。ウエスタンブロット画像をＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって取得し、ＩｍａｇｅＪを用いて定量化した。画像を発表用にトリミングした。フルサイズ画像を図２７に示す。

【0164】

抗体
以下に対する抗体：Ａｋｔ（＃９２７２、１：１，０００）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｓ４７３）（＃４０６０、１：５００）、ホスホ−Ａｋｔ（Ｔ３０８）（＃１３０３８、１：５００）、ｐ７０ Ｓ６Ｋ（＃９２０２、１：１，０００）、ホスホ−Ｐ７０ Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）（＃９２０５、１：５００）、４Ｅ−ＢＰ１（＃３９４５２、１：１，０００）、ホスホ−４ＥＢＰ１（Ｔ３７／４６）（＃９４５９、１：５００）、Ｓ６リボソームタンパク質（＃２２１７、１：１，０００）、ホスホ−Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓ２４０／２４４）（＃２２１４、１：１，０００）、ＬＡＭＰ１（＃３２４３、１：１，０００）、ヒストン３（＃４４６９、１：１，０００）、ホスホ−（Ｓｅｒ）１４−３−３結合モチーフ（＃９６０１Ｓ、１：５００）、Ｒｉｃｔｏｒ（＃２１１４、１：５００）、Ｒａｐｔｏｒ（＃２２８０、１：５００）、ＥＲＫ１／２（＃９１０２、１：１，０００）、蛍光体−ＥＲＫ１／２（＃９１０１、１：１，０００）、ＧＳＫ−３ｂ（Ｄ５Ｃ５Ｚ）ＸＰ（＃１２４５６Ｓ、１：１，０００）、ホスホ−ＧＳＫ−３ｂ（Ｓｅｒ９）（＃９３３６Ｓ、１：５００）、ＧＦＰ（Ｄ５．１）（＃２９５５６、１：１，０００）およびヒトＴＦＥＢ（＃４２４０、１：５００）を、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した。ＧＡＰＤＨに対する抗体（＃３２２３３、１：１，０００）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。ＧＦＡＰに対する抗体はＤＡＫＯから購入した（＃Ｚ０３３４、１：１，０００）。ＣＤ６８に対する抗体はＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（＃ＭＣＡ１９５７、１：１，０００）から購入した。マウスＴＦＥＢに対する抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈから購入した（＃１３３７２−１−ＡＰ、１：５００）。マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２（＃Ｆ１８０４、１：１，０００）およびウサギ抗ＦＬＡＧ（＃Ｆ７４２５、１：１，０００）抗体は、Ｓｉｇｍａから購入した。汎１４−３−３抗体（Ｋ−１９）（＃ＳＣ６２９、１：３００）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚから購入した。ＴＳＣ２に対する抗体はＡｂｃａｍから購入した（＃３２５５４、１：１，０００）。

【0165】

細胞質ゾルおよび核タンパク質の分取
細胞ペレットを、阻害剤と共に溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７．９、１０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．４％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０）中にピペッティングにより再懸濁し、氷中で３０分間保持した。最高速度で１分間遠心した後、上清を細胞質ゾル画分として回収した。ペレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有する核緩衝液（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．９、０．４Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。エッペンドルフシェーカーで１５分間激しく振とうした後、ペレットを１０分間最高速度で遠心沈殿させた。上清を核画分として使用した。

【0166】

インビトロキナーゼアッセイ
精製された活性ＡＫＴ１酵素（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｎａｄａ）を使用してインビトロキナーゼアッセイを実施した。ＩＰ用の全細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤および１ｍＭのＮａ_３ＶＯ_４を含有するＩＰ溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で調製した。細胞溶解物（１，０００μｇ）を、プロテインＡ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ ＩＰキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に架橋した１０μｇのマウス抗ＦＬＡＧ抗体またはマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のいずれかと共に４℃において一晩インキュベートし、ＩＰ溶解緩衝液で総量３００μｌにした。免疫複合体を遠心分離により収集し、ＩＰ溶解緩衝液中で５回洗浄し、１０μｌの３×ＦＬＡＧペプチドで溶出した。溶出液を、１×キナーゼ緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ β−グリセロールホスフェート、１０μＭ ＡＴＰ、２ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４および１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で３０μｌに希釈した。２０μｌのキナーゼ緩衝液中２００ｎｇのＡＫＴ１および０．５μＣｉの［γ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加することによって、キナーゼ反応を開始させた。３０℃で１５分間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加液を添加し、９５℃で１０分間加熱することにより反応を停止させた。試料を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、オートラジオグラフィーで分析した。ＴＦＥＢ−Ｓ４６７Ａ−３ｘＦｌａｇを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）および以下のオリゴ：５０−ＡＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＴＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧ−３’、５−ＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＴ−３’を、製造業者の指示書に従って使用することによって生成した。

【0167】

定量的リアルタイムＰＣＲ
製造業者の説明書に従ってＲＮＥａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、対照およびＪＮＣＬ線維芽細胞ならびにＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}皮質ニューロン培養物から全ＲＮＡを抽出した。マウス脳の半分をＲＮＡ抽出のために処理し、１マイクログラムをＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）による相補的ＤＮＡ合成に使用した。逆転写反応を用いるＰＣＲ用のプライマーを表Ｓ１に列挙する。定量的リアルタイムＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）においてｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用することによって実施した。試料を９５℃で３分間加熱し、９５℃で１１秒間、６０℃で４５秒間で３９サイクル、および最終サイクルは９５℃で１０秒間、６５℃で５秒間および９５℃で５秒間で増幅させた。分析は、ＣＦＸマネージャーソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行い、閾値サイクル（Ｃ_Ｔ）はＰＣＲ増幅プロットから抽出した。相対的遺伝子発現は、ΔΔＣ_Ｔ法を使用して決定し、ＧＡＰＤＨ（ヒト遺伝子について）およびシクロフィリン（マウス遺伝子について）に対して正規化した。遺伝子のメッセンジャーＲＮＡレベルの変化は、以前に記載されたように倍数変化で表した。エラーバーは平均値の標準誤差を表す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。

【表1】

【0168】

ＲＮＡ干渉
ｓｉＲＮＡノックダウンのために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、細胞に、Ｓｔｅａｌｔｈ ＲＮＡｉ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｄｕｐｌｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １２９３５−３００）またはＡＫＴ１を標的とするＳｔｅａｌｔｈ ｓｉＲＮＡ二本鎖（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＨＳＳ１７６６１４、ＨＳＳ１００３４６およびＨＳＳ１００３４５）をトランスフェクトした。Ｒｉｃｔｏｒに対するｓｉＲＮＡはＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから購入した（８６２２）。トランスフェクションの７２時間後に細胞を分析した。

【0169】

マイクロアレイ実験
トレハロース処理あり、およびなしの対照およびＪＮＣＬ線維芽細胞由来の全ＲＮＡ（１００ｍＭ、４日間）を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ ＨＴ−１２ Ｖ４．０アレイプラットフォームへのハイブリダイゼーションのための相補的ＤＮＡを調製した。実験は３連に行った。発現分析は、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｃｏｒｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、ＵＳＡで行った。差次的遺伝子発現を評価するための有意性の閾値として、Ｐｏ０．０１を用いた。ＧＳＥＡを前記のように実施した^{１０、１１}。累積分布関数は、１，０００個のランダム遺伝子セットメンバーシップ割り当てを行うことによって構築した。名目上のＰ＜０．０１およびＦＤＲ＜１０％を、ＥＳの有意性についての閾値として使用した。遺伝子オントロジー解析は、デフォルトパラメータを使用し、ウェブツールＤＡＶＩＤ（ｈｔｔｐｓ：／／ｄａｖｉｄ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）を用いて行った。経路共発現分析は、前記のように行われ^８、９、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅを使用して発現相関データをグラフで表した。

【0170】

動物の飼育
Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス（ストック番号００４６８５；Ｃｌｎ３^{ｔｍ１．１Ｍｅｍ}／Ｊ；ＣＤ−１バックグラウンド）^３２をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。対照（ＣＤ−１）マウスおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスを３〜４匹／ケージで、１２時間明期／１２時間暗期周期の部屋で飼育した。食料と水は自由に与えた。この研究で使用されたすべてのマウスは、生後８ヶ月齢および１２ヶ月齢において分析し、ヘテロ接合性Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスを交配することによって産生された同腹仔であった。この分析には雄のみを使用した。データを分析する際に研究者は盲検化されており、無作為化は不要であった。この研究から除外されたデータはなかった。

【0171】

腹腔内注射
マウスにＭＫ２２０６（１２０ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに４回腹腔内注射した。ＭＫ２２０６は水中３０％のカプチソール中に配合した。４匹のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにＭＫ２２０６を注射し、４匹にビヒクル対照として３０％のカプチソールを注射した。

【0172】

トレハロース治療
トレハロース（Ｓｗａｎｓｏｎ）を飲料水に最終濃度２％まで溶解し、週に２回交換した。トレハロース含有水を、２１日齢から始めてマウスが自然に死亡するかまたは他の研究のために屠殺する日まで継続する自発経口投与（寿命評価）によってＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスおよびＷＴマウスに与えた。

【0173】

免疫組織化学
８ヶ月齢および１２ヶ月齢のホモ接合性Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスおよび同齢対照をイソフルランで麻酔し、経心的にＰＢＳで潅流し、続いて０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中４％の緩衝化パラホルムアルデヒドで灌流した。続いて脳を取り出し、一晩後固定した。切片化する前に、Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水（ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）中３０％のスクロースを含有する溶液中で脳を凍結保護した。連続した４０ｍｍの浮遊冠状切片を９６ウェルプレートに収集した。次に一連の切片をＣＤ６８またはＧＦＡＰに対する一次抗血清、続いてウサギ抗ラット（ＶｅｃｔｏｒＬａｂ）およびブタ抗ウサギ（ＤＡＫＯ）二次抗体のいずれかで染色し、そして免疫反応性をＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ（アビジン−ビオチン）キット（Ｖｅｃｔｏｒ）および色素原としてのジアミノベンジジンで検出した。

【0174】

グリア表現型の定量分析
目的の各領域を通して、３つの連続した切片において３０の重複しない画像を撮影した。すべてのＲＧＢ画像は、Ｘ４０対物レンズを用いたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡に据え付けられたライブビデオカメラ（ＪＶＣ、３ＣＣＤ、ＫＹ−Ｆ５５Ｂ）により撮影し、ＪＰＥＧとして保存した。ランプ強度、ビデオカメラの設定および較正を含むすべてのパラメータは、画像撮影の間を通じて一定に維持された。続いて、ＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、背景より上の前景免疫反応性を選択する適切な閾値を使用して、画像を分析した。次いで、この閾値を、動物のバッチごとに分析したすべてのその後の画像および各領域の各抗原についての免疫反応性の特異的領域を決定するために使用した試薬に定数として適用した。この分析は遺伝子型に対して盲検的に行われた。データは、各領域について視野当たりの免疫反応性の平均面積百分率±平均値の標準誤差としてグラフにプロットした。

【0175】

蓄積負荷
各脳領域に存在する自己蛍光蓄積物質の相対レベルを分析するために、Ｓ１ＢＦおよびＶＰＭ／ＶＰＬにまたがるマウス脳切片をゼラチンクロムコーティングスライド上に載置し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）で封入した。各切片からの非重複画像を、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡および４８８ｎｍ励起レーザー（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して倍率×６３で撮影した。各領域に存在する蓄積負荷を決定するために閾値画像分析を実施した。画像撮影中、すべてのレーザーパラメータおよび較正は一定に保たれた。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いて半定量的閾値画像分析を行った。

【0176】

ＴＥＭ
マウスを麻酔し、生理食塩水、続いて０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中２％ホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒドで心臓内灌流した。脳を摘出し、小脳および皮質の小片を収集し、さらに２％ホルムアルデヒド＋ ２．５％グルタルアルデヒド、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で２４時間後固定した。１００マイクロメートルの冠状切片をビブラトームで切断し、０．１Ｍカコジル酸中１％ＯｓＯ_４で１時間固定し、脱水した酢酸ウラニルで染色し、Ｅｐｏｎａｔｅ ８１２に包埋した。６０ｎｍの超薄切片をＲＭＣ ＭＴ６０００ウルトラミクロトームで得て、日立Ｈ７５００透過型電子顕微鏡で調べた。Ｇａｔａｎ ＵＳ１０００高解像度デジタルカメラおよびＤｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈソフトウェア（ｖ１．８２．３６６）を用いて画像を撮影した。

【0177】

ＭＲＩ用の組織標本
画像化の前にマウスを経心的に灌流した。頭部を取り除き、次いで頭蓋骨を露出させるために皮膚、筋肉、耳、鼻の先端および下顎を取り除いた。頭部を４℃の４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。次に頭部をＰＢＳ中０．０１％アジ化ナトリウム４０ｍＬに移し、４℃で７日間振とうした。頭部をＰＢＳ中５ｍＭガドペンテト酸ジメグルミン（Ｂａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｙｎｅ、ＮＪ）および０．０１％アジ化ナトリウムの溶液に移し、４℃で２５〜３５日間振とうした。ガドペンテト酸ジメグルミンとのインキュベーションによりシグナル対ノイズ比が改善された。画像化前に、頭部を６〜８時間室温に平衡化した。

【0178】

磁気共鳴プロトコル
マウスあたり合計４８スキャンを、９．４ Ｔ Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ Ｂｉｏｓｐｅｃ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、内径２１−ｃｍの水平スキャナー（３５ｍｍ容積共振器付き）（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）でＰａｒａｖｉｓｉｏｎ ５．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて取得した。３次元ＤＴＩスキャンパラメータは以下の通りである：スピンエコー、ｂ値＝０および１，０００ｓ／ｍｍ^２、２０の拡散方向および１つの非拡散強調画像、ＴＲ＝５００ｍｓ、ＴＥ＝１４．８ｍｓ、ＦＯＶ＝１．７×１．２×２．４ｃｍまたは２．０×１．４×３．２ｃｍ、マトリックス＝１２８×９６×９６、ＮＥＸ＝１、δ＝３ｍｓ、Δ＝７ｍｓ。取得時間は約１５時間であった。

【0179】

ＭＲＩ画像処理
ＭＲＩ画像を最初にＤＴＩスタジオで処理して、異方性比率を推定した。その後、Ａｍｉｒａソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してＣＣのＲＯＩを定義し、各マウスの容積を計算した。ＣＣの容量測定は盲検法で行った。

【0180】

ＡＢＲ測定
ＡＢＲを以前に記載されたように測定した^６９。簡単に説明すると、１０ヶ月齢のマウス（ｎ＝４〜６／遺伝子型／治療群）をケタミン（１００ ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて麻酔し、次いでヘッドホルダーに固定した。マウスを加温パッドの上に置くことによって、この手順の間を通して通常の体温を維持した。４〜４８ｋＨｚの純音刺激を、Ｔｕｃｋｅｒ−Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｙｓｔｅｍ ３デジタル信号処理ハードウェアおよびソフトウェア（Ｔｕｃｋｅｒ−Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｌａｃｈｕａ、ＦＬ、ＵＳＡ）を使用して発生させ、音刺激の強度をタイプ４，９３８の１／４インチ音圧音場較正マイクロホン（Ｂｒｕｅｌ ａｎｄ Ｋｊａｒ、Ｎａｅｒｕｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して較正した。応答信号を、頭皮の頂点、耳介後部および後脚（接地）に挿入された皮下針電極を用いて記録した^６９。聴覚閾値は、応答において再現可能で認識可能な波を有する最低の音強度に達するまで、９０から１０ｄＢまで５ｄＢごとに各刺激の音強度を減少させることによって決定した。平均聴覚閾値±標準偏差（ｄＢ ＳＰＬ）を刺激周波数（ｋＨｚ）の関数としてプロットした。統計分析は、周波数固有の効果を評価するために、個々の周波数で両側スチューデントｔ検定を伴う全体的な傾向を明らかにするための一元配置分散分析で構成された。Ｔ検定のＰ値はＨｏｌｍ法を用いて多重比較について調整した。Ｒ（バージョン２．１３）をすべての統計分析に使用した。

【0181】

Ａｋｔリン酸化予測
Ａｋｔが標的とする可能性がある候補リン酸化部位を同定するために、実験的に決定された非重複性Ａｋｔリン酸化部位配列をＰｈｏｓｐｈｏｃｉｔｅＰｌｕｓウェブサイト（ｗｗｗ．ｐｈｏｓｐｈｏｓｉｔｅ．ｏｒｇ／）からダウンロードし、ＭＥＭＥ Ｓｕｉｔｅ ４．１１．０（ｍｅｍｅ−ｓｕｉｔｅ．ｏｒｇ／）を用いてＴＦＥＢアミノ酸配列をスキャンするＰＷＭの構築に使用した。ＴＦＥＢ配列は、デフォルトパラメータを用いてＭｕｌｔＡｌｉｎ（ｍｕｌｔａｌｉｎ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ／）を使用することによりアライメントした。

【0182】

統計
結果は平均値±平均値の標準誤差として表す。各パラメータの平均差の統計的有意性は、特に明記しない限り、遺伝子型と治療の分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙの事後検定によって決定した。Ｐ＜０．０５を有意と見なした。

【0183】

研究の承認
すべてのマウス実験手順は、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって検討および承認された。

【0184】

データの可用性
著者らは、この研究の調査結果を裏付けるデータはすべて、この論文とその補足情報ファイルに含まれていることを宣言する。遺伝子発現マイクロアレイのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓアクセッション番号はＧＳＥ７６６４３である。

【0185】

［実施例１］
トレハロースは、ＪＮＣＬのモデルにおいて神経病理を減弱させる。
細胞クリアランスのｍＴＯＲＣ１非依存性活性化の最も実証された例は、トレハロースによって発揮されたものである^{２２〜２６}。本発明者らは、トレハロースがこれまでに特徴付けられていない経路を介してＴＦＥＢを活性化するという仮説を立て、小児の最も一般的な神経変性障害である幼若ニューロンセロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬまたはバッテン病；ＯＭＩＭ＃２０４２００）に代表される異常なリソソーム内蓄積の原型モデルを用いてこの仮説を検証することにした。ＪＮＣＬは、リソソームのホメオスタシスの調節に関与する遺伝子であるＣＬＮ３の突然変異によって引き起こされ^{２７〜２９}、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡で検出可能なオートファジーの障害およびセロイド脂肪色素のリソソーム内蓄積によって特徴付けられる^{３０、３１}。

【0186】

ＪＮＣＬ^３２の確立されたモデルであるＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスへの経口トレハロース投与は、それらの寿命を有意に延長した。Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの生存期間中央値は４５４日から５２２日に延び（１５％増加、ログランクＰ＝０．００５６６）、最大寿命は５４４日から６９９日に延びた（２８％増加；図１ａ）。ＪＮＣＬ患者の死後検査および神経画像化研究は、脳梁（ＣＣ）および脳幹の有意な菲薄化を含む全般的脳萎縮を示した^{３３、３４}。ＪＮＣＬマウスにおける磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の研究は、ＣＬＮ３タンパク質の欠乏が脳の同様の全般的萎縮をもたらし、それによってヒトの状態に反映されることを報告している^３５。この研究では、１２ヶ月齢のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの脳湿重量（０．３５５±０．０２４ｇ）を測定したところ、それは同齢野生型（ＷＴ）マウスの脳湿重量（０．５１６±０．０２１ｇ；Ｐ＝０．００１６）よりも有意に低いことがわかった。しかし、この差はトレハロース処置によって大部分救済された（０．４７３±０．０２８ｇ；未処置のＣｌｎ^{３Δｅｘ７−８}マウスとの差、Ｐ＝０．０３２；図１ｂ）。対照的に、トレハロース投与はＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}またはＷＴマウスの体重に影響を及ぼさなかった（図２）。次に、ＭＲＩ分析により固定脳のＣＣ体積を評価した。４８スタック／試料の定量的測定により、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスが、それらのＷＴ対応物（１６．８１±０．８９ｍｍ^３；Ｐ＝０．００８１；図１ｃ）と比較してＣＣの体積の顕著な減少（１２．９６±０．４３ｍｍ^３）を有することが示され、これらも処置によって救済された（１５．０２±０．３３ｍｍ^３；未処置Ｃｌｎ３^{△ｅｘ７−８}マウスとの差、Ｐ＝０．０２７；図１ｃ）。トレハロースで処置したＷＴマウスの分析では、ＣＣ体積に有意な変化は見られなかった（１８．２７±０．６６ｍｍ^３；図１ｃ）。

【0187】

６ヶ月齢のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスは、ホットプレートアッセイにおいて痛覚感受性の低下を示し、これはトレハロースによって完全に回復した（図１ｄ）。１０ヶ月齢のマウスにおける聴性脳幹反応（ＡＢＲ）分析は、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスがＷＴマウスと比較してＡＢＲ閾値の上昇を有することを示し（Ｐ＝０．０１０２７）、これは低周波聴力損失を示す（図３）。トレハロース処置は、未処置の同齢対照と比較して両方の遺伝子型においてＡＢＲ閾値の低下をもたらし、聴覚機能の保護を示した（図３）。網膜機能の評価はまた、１１ヶ月齢のマウスの網膜電図分析を行うことによって試みられた。しかしながら、いくつかの未処置ＷＴマウスは、試験に対する反応が悪く、重度の視力喪失を示した。本明細書で使用されるマウスコロニー（ＣＤ−１）の遺伝的背景は、これまで雄の約６０％における遺伝性網膜変性および他の視力低下表現型と関連していた^{３６、３７}。したがって、網膜電図での治療関連変化の評価は実施できなかった。

【0188】

次に、トレハロースがセロイド脂肪色素の蓄積を修正するかどうかを確かめるために、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスの脳の顕微鏡分析を行った。これらの研究は、一次体性感覚野バレル領域皮質（Ｓ１ＢＦ）と、感覚情報をＳ１ＢＦに中継する視床腹側後方内側および外側核（ＶＰＭ／ＶＰＬ）に焦点を当てており、それは、脳の他の領域とは異なり、両方の構造がバッテン病のマウスモデルでは一貫してひどく影響を受けているからである^３８。７ヶ月齢および１２ヶ月齢のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス由来の両領域は、ＷＴマウスと比較して点状の自己蛍光物質の強い存在を示し、これが両方の時点でトレハロース処置によって有意に減少することが見出された（図４ａ〜ｄ）。Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウス脳の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析により、プルキンエ細胞および皮質ニューロンの両方における電子密度の高い細胞質の顕著な蓄積が確認された（図４ｅ、ｆ）。倍率を上げると、このような電子密度の高い材料が、ヒトおよびマウスの両方のＪＮＣＬ病理学にすでに関連している特徴的なフィンガープリントプロファイル構造（図５）からなることが明らかになった^{３１、３２}。トレハロース処置は、プルキンエ細胞（Ｐ＝０．０４７）および皮質ニューロン（Ｐ＝０．０１７；図４ｅ、ｆ）におけるフィンガープリントプロファイルの数を有意に減少させ、ニューロンにおける細胞クリアランスの増強が確認された。次に、炎症に対するトレハロースの効果を評価した。以前の研究は、Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスのＶＰＭ／ＶＰＬおよびＳ１ＢＦ領域における反応性神経膠症およびミクログリア活性化を報告した^３８。立体分析により、７ヶ月齢のＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスは同齢のＷＴマウスと比較してこれらの脳領域でＧＦＡＰおよびＣＤ６８免疫反応性が著しく増加していることが示され、反応性神経膠症およびミクログリア活性化が確認された（図６ａ〜ｄ）。星状細胞増加症およびミクログリア活性化の両方が１２ヶ月齢で悪化した（図６ｅ〜ｈ）。この進行性の神経炎症はトレハロース投与によって軽減された（図６ａ、ｃ、ｅ、ｆ、ｈ）。まとめると、データは、クリアランスのｍＴＯＲＣ１非依存性エンハンサーによる処置が、リソソーム系の一次障害によって引き起こされる原型型蓄積障害のモデルにおいて脳萎縮、脂肪色素の蓄積、および神経炎症を減少させることを示す。

【0189】

［実施例２］
ＴＦＥＢおよびＣＬＥＡＲネットワークのｍＴＯＲＣ１非依存的活性化。
Ｃｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスにおいて観察された蓄積物質の減少は、トレハロースがリソソーム機能を増強することを示唆している。ＴＦＥＢは、それらのプロモーターに存在する「協調的リソソーム発現および調節（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」（ＣＬＥＡＲ）部位に直接結合することにより、リソソーム遺伝子の発現を調節する^８。トレハロースがＴＦＥＢの核内移行（ＴＦＥＢ活性化の特徴）を誘導するかどうかを試験するために、ＴＦＥＢ−３ｘＦＬＡＧ（ＨｅＬａ／ＴＦＥＢ）^８を安定に発現する細胞を調べた。共焦点顕微鏡により、トレハロース投与による２４時間以内の進行性ＴＦＥＢ核内移行が示された（図７ａ）。定量分析は、この時間枠内で、核ＴＦＥＢを有する細胞が２０から＞８０％に増加したことを明らかにした（図７ｂ）。最近の報告は、ｍＴＯＲＣ１がＴＦＥＢをリン酸化し、それによってＴＦＥＢの細胞質ゾル保持を促進することを示している^{１８〜２０}。トレハロースがｍＴＯＲＣ１非依存性経路を介してＴＦＥＢを活性化するかどうかを機構的に試験するために、ｍＴＯＲＣ１の構成的活性化の２つのモデルを使用した。第１のモデルは、結節性硬化症複合体２遺伝子、Ｔｓｃ２（Ｔｓｃ２^−／−）に関してヌルである細胞によって表される^３９。ＴＳＣ２は、ＴＳＣ１とｍＴＯＲＣ１活性を抑制するヘテロ二量体複合体を形成し、したがって、ＴＳＣ２またはＴＳＣ１のいずれかが失われると、ｍＴＯＲＣ１の構成的活性化が起こる^４０。Ｔｓｃ２^−／−マウス胚性線維芽細胞および対照マウス胚性線維芽細胞のウエスタンブロットおよび共焦点顕微鏡分析は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤（ラパマイシンおよびＴｏｒｉｎ１）とは異なり、トレハロースがｍＴＯＲＣ １シグナル伝達を変化させず（図７ｃ；図８）、ＴＦＥＢ Ｓ２１１（ｍＴＯＲＣ１標的部位）のリン酸化を修正しないことを示したが^{１８、１９}（図９）が、活性ｍＴＯＲＣ１を用いてもＴＦＥＢ核内移行を誘導する（図７ｄ、ｅ）ことを示した。使用された第２のモデルは、ｍＴＯＲキナーゼドメインにおいてＥ２４１９Ｋアミノ酸置換を有する構築物により得られ、これは構成的に活性なｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ^{Ｅ２４１９Ｋ}）をもたらす^４１。共焦点顕微鏡分析は、トレハロース処理が、ＷＴ ｍＴＯＲまたはｍＴＯＲ^{Ｅ２４１９Ｋ}をトランスフェクトされた細胞においてＴＦＥＢの核内移行を誘導することを示した（図７ｆ、ｇ）。まとめると、これらのデータは、トレハロースシグナル伝達が、ＴＦＥＢ局在化のｍＴＯＲＣ１制御を無効にすることを示している。ｍＴＯＲＣ２がＴＦＥＢ核内移行を調節しないことを示す以前の研究と一致して、ｍＴＯＲＣ２特異的成分ＲＩＣＴＯＲの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）媒介性枯渇は、ＴＦＥＢ細胞内局在化に影響を及ぼさなかった（図１０ａ、ｂ）^１８。

【0190】

次に、ＴＦＥＢのトレハロース活性化がＣＬＥＡＲネットワークに特異的な転写効果を発揮するかどうか、またはトレハロースがＴＦＥＢとは無関係であり得る追加のプログラムを活性化するかどうかを求めた。この問題に取り組むために、トレハロースが正常および病理学的条件においてヒト初代細胞においてＣＬＥＡＲネットワークを活性化することを最初に確認した。培養培地由来のトレハロース投与後に、患者由来のＪＮＣＬ線維芽細胞および対照線維芽細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。結果は、どちらの遺伝的背景を有する線維芽細胞でも、処理された線維芽細胞対未処理の線維芽細胞において試験されたＣＬＥＡＲ遺伝子の発現の増加を示した（図１１ａ、ｂ）。次に、トレハロース処理後のＪＮＣＬおよび対照線維芽細胞のマイクロアレイ発現分析を行った。未処理の対照と比較して少なくとも２倍の発現レベルの変化を有する遺伝子の遺伝子オントロジー分析は、唯一過剰に表されたクラスの遺伝子がＪＮＣＬおよび対照線維芽細胞においてリソソーム代謝に関連するものであることを示した（両方の分析について濃縮倍数＞５およびＰ＜１０^−１０）。共調節分析^８、９により、ＣＬＥＡＲ遺伝子はトレハロースによって誘導される遺伝子ネットワークの中心にあることが明らかになり（図１１ｃ）、ＴＦＥＢ活性化がトレハロース投与時の細胞の最初の転写応答であり得ることが示唆された。対照線維芽細胞における発現変化の遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）により、大多数のリソソーム遺伝子がトレハロース投与で上方制御されたことが確認された（濃縮スコア、ＥＳ＝０．６７、Ｐ＜０．０００１；図１１ｄ）。リソソーム代謝において公知の役割を有するＴＦＥＢ直接標的のＧＳＥＡはさらに高い濃縮度を示し（ＥＳ＝０．８２、Ｐ＜０．０００１；図１１ｅ）、これはトレハロースがＴＦＥＢ媒介リソソーム調節を特異的に活性化することを示す。ＪＮＣＬ線維芽細胞におけるＧＳＥＡの遺伝子発現変化は、同様の結果をもたらし（図１１ｆ、ｇ）、したがって、ＣＬＮ３欠損症がＴＦＥＢ媒介性リソソーム濃縮を妨害することはない。

【0191】

ＴＦＥＢ活性化は、リアルタイムｑＰＣＲにより、ＷＴマウスおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスからの初代皮質ニューロン培養においてＣＬＥＡＲネットワークを誘導することが確認された（図１２ａ、ｂ）。ＷＴマウスおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスからの初代皮質星状細胞培養物から抽出したタンパク質の免疫ブロットは、トレハロース投与時にＬＡＭＰ１レベルの増加（リソソームのマーカー）を示し（図１３）、グリア細胞におけるリソソーム拡大が確認された。マウス脳切片の共焦点顕微鏡検査およびリアルタイムｑＰＣＲによるＷＴおよびＣｌｎ３^{Δｅｘ７−８}マウスからの全脳ホモジネートの発現分析は、経口トレハロース投与がＴＦＥＢ核内移行（図１２ｃ、ｄ）ならびにリソソームおよびオートファジー遺伝子の上方制御をもたらすことを示した（図１２ｅ、ｆ）。したがって、ＴＦＥＢおよびＣＬＥＡＲネットワークはインビボで活性化される。

【0192】

［実施例３］
Ｓ４６７において、Ａｋｔはリン酸化を介してＴＦＥＢ活性を制御する。
データは、薬理学的に作用可能な経路が、ｍＴＯＲＣ１とは無関係に、ＴＦＥＢを活性化し、細胞クリアランスを増強することを示している。真核細胞では、調節経路は、絶えず変化する細胞条件への適応性を維持しながら、出力の有効性を最大化する冗長で動的に階層化されたシグナル伝達ネットワークに基づく傾向がある^{４２、４３}。したがって、ＴＦＥＢの上流調節因子は、ｍＴＯＲＣ１を含む同じシグナル伝達カスケードにあり得ると推論された。ｍＴＯＲＣ１のキナーゼ活性はＴＳＣ２によって厳密に調節されており、ＴＳＣ２はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達経路によるリン酸化により不活性になる^４４。ＰＩ３ＫまたはＡｋｔのいずれかを阻害すると、Ｔｏｒｉｎ １によるｍＴＯＲＣ１阻害と同様のＴＦＥＢ核内移行が生じたので（図１４ａ、ｂ）、ＡｋｔがｍＴＯＲＣ１とは無関係にＴＦＥＢ活性を直接調節するかどうかを調べた。Ｔｓｃ２^−／−細胞を用いて、ｍＴＯＲＣ１の構成的活性化の条件下でＡｋｔ活性に対するＴＦＥＢの応答性を試験した。以前の研究^４４と一致して、ｍｔＯＲＣ１経路が血清除去または刺激に対して非感受性であるＴｓｃ２^−／−細胞では、Ａｋｔ活性は血清補充によって刺激される可能性がある（図１５ａ）。重要なことに、血清飢餓Ｔｓｃ２^−／−細胞の血清再刺激は、ＴＦＥＢ核から細胞質ゾルへの移行をもたらし、これはＡｋｔ阻害剤ＭＫ２２０６とのプレインキュベーションによって防止された（図１５ｂ）。したがって、Ａｋｔ活性はｍＴＯＲＣ１とは無関係に血清刺激におけるＴＦＥＢ細胞質ゾル局在化に必要である。ＴＦＥＢの細胞内局在を調節するもう１つの因子であるＧＳＫ３βとの相互依存の可能性も確認した^{４５〜４７}。免疫ブロット分析は、ＧＳＫ３β活性に対するトレハロースの検出可能な効果を示さず（図１６ａ）、共焦点顕微鏡分析は、トレハロースおよびＭＫ２２０６の両方が構成的に活性なＧＳＫ３βを発現する細胞においてＴＦＥＢの核内移行を誘導できることを示した（ＣＡ−ＧＳＫ３β／Ｓ９Ａ−ＧＳＫ３β；図１６ｂ）。相互実験では、ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲ−９９０２１は、構成的に活性なＡｋｔ（Ａｋｔ^{３０８Ｄ／４７３Ｄ}またはＡｋｔ−ＤＤ）を発現する細胞においてＴＦＥＢの核内移行を促進した^４８（図１６ｃ）。したがって、これらの結果は、ＡｋｔおよびＧＳＫ３βが独立してＴＦＥＢを調節することを示している。トレハロースが、以前に報告されたＴＦＥＢ活性の調節因子であるＥＲＫを阻害しないことも確認した^１０（図１７）。

【0193】

ＡｋｔがＴＦＥＢを直接リン酸化するかどうかを決定するために、Ａｋｔ標的配列の位置重み行列（ＰＷＭ）を、最初に実験的に確認されたＡｋｔ基質を用いて構築し、Ａｋｔ ＰＷＭを用いて複数の種からのＴＦＥＢアミノ酸配列をスキャンした。この分析により、Ｓ４６７がＡｋｔの保存された候補ホスホアクセプターモチーフとして同定された（図１４ｃ）。ＴＦＥＢの変異型（Ｓ４６７Ａ）は、ウエスタンブロットで分析すると低分子量にシフトし（図１８）、ｍＴＯＲＣ１標的部位の変異体（図１９）と同様に細胞質ゾル局在の減少および二重核−細胞質ゾル分布の増加（図１４ｄ）を示した。重要なことに、ＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）は、ＷＴ ＴＦＥＢと比較してＴＦＥＢ標的遺伝子の発現を誘導する能力の増加を示した（図１４ｅ）。細胞質ゾルＴＦＥＢは１４−３−３タンパク質と相互作用することが示されている^{１８、１９}。予想通り、ＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）は、おそらくその核局在化の増大に起因して、１４−３−３タンパク質との共局在化および相互作用の減少を示した（図１４ｆ、ｇ）。ＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）はまた、構成的に活性なｍＴＯＲＣ１を有する細胞において核局在化を示した（図２０）。

【0194】

インビトロＡｋｔキナーゼアッセイにより、Ａｋｔが精製ＴＦＥＢをリン酸化するが、Ｓ４６７Ａ変異型のＴＦＥＢをリン酸化しないことが示された（図１４ｈ）。それ故、これらの結果はＴＦＥＢをＡｋｔの直接リン酸化基質として同定し、Ｓ４６７がこのようなリン酸化のための重要な残基であることを実施している。バイシストロン性ＴＦＥＢ−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＴＦＥＢ（Ｓ４６７Ａ）−Ｆｌａｇ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターのトランスフェクションは、変異型ＴＦＥＢタンパク質がＷＴ ＴＦＥＢよりも安定であり、したがってＡｋｔもまたＴＦＥＢの安定性を調節していることを示した（図２１）。ＡＫＴのノックダウンは、ＴＦＥＢの核内移行を増強し、そしてＬＡＭＰ１発現を増加させ（図１４ｉ）、したがって、ＡｋｔがＴＦＥＢ活性を負に調節することが確認された。重要なことに、トレハロースはオートファジーフラックスを増加させながらＡｋｔ活性を阻害し（図１４ｊ）、構成的に活性なＡｋｔ（Ａｋｔ−ＤＤ）の発現はＴＦＥＢ核内移行に対するトレハロースの効果を無効にした（図１４ｋ）。これらの実験は、Ａｋｔ阻害がＴＦＥＢのトレハロース活性化を媒介することを機構的に実証する。トレハロース媒介性Ａｋｔ阻害は、トレハロース処置マウスの脳において確認された（図１４ｌ）。共免疫沈降（ＩＰ）実験により、ＡｋｔがＴＦＥＢと相互作用し（図２２ａ）、このような相互作用はＴＦＥＢのＳ４６７Ａ変異型を使用しても実質的に変化しないことが確認され（図２２ｂ）、トレハロースがＴＦＥＢとのその相互作用ではなく、Ａｋｔの活性に影響を及ぼすことを示唆している。ＴＦＥＢパラログ、ＭＩＴＦおよびＴＦＥ３がＡｋｔ活性に応答性であるかどうかも試験した。ＭＩＴＦおよびＴＦＥ３構築物をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡分析は、ＭＫ２２０６によるＡｋｔの阻害がこれら２つの因子の核内移行を促進することを示し（図２３）、したがってこの調節機構の保存可能性を示唆する。

【0195】

Ａｋｔは癌に関与しているため、集中的な臨床研究の対象である。Ａｋｔ調節剤の中で、ＭＫ２２０６は現在、前臨床および第Ｉ相臨床試験中である強力なＡｋｔ経口阻害剤である^{４９、５０}。トレハロースと同様に、ＨｅＬａ細胞へのＭＫ２２０６の投与は、ＴＥＭにより観察されるように、ＬＣ３点の数の増加（図２４ａ）、ＬＣ３−ＩＩタンパク質レベルの増加（図２４ｂ）、およびオートファジー小胞数の増加をもたらし（図２４ｃ）、ＭＫ２２０６がオートファジーを活性化することを示した。さらに、ＭＫ２２０６処理はまた、リソソームおよびオートファジー遺伝子の発現を上方制御した（図２４ｄ）。ＭＫ２２０６の腹腔内注射はＡｋｔ活性の阻害をもたらし（図２４ｅ）、マウス脳においてＴＦＥＢ核内移行（図２４ｆ）をもたらし、次ぎに全脳ホモジネートの発現分析によって検出されるように、リソソームおよびオートファジー遺伝子の上方制御を促進した（図２４ｇ）まとめると、これらのデータは、Ａｋｔの薬理学的阻害がインビトロおよびインビボでオートファジー−リソソーム経路を増強するという証拠を提供する。

【0196】

最後に、直接読み取りとしてセロイド脂肪色素の蓄積を用いて、ＭＫ２２０６が細胞クリアランスを調節するかどうかを試験した。ＪＮＣＬ線維芽細胞におけるＭＫ２２０６によるＡｋｔの阻害は実際に、トレハロース処理で観察されたものと同様のセロイド脂肪色素のクリアランスをもたらし（図２５ａ）、これはＭＫ２２０６またはトレハロースの中止によって逆転した（図２６）。次に、他のリソソーム遺伝子に突然変異を有する細胞株を用いて、その機能不全が異常なリソソーム内蓄積の蓄積をもたらす分子経路とは無関係に、Ａｋｔ阻害が細胞クリアランスを増強するかどうかを試験した。その欠損がパルミトイル化タンパク質のリソソーム内蓄積および神経変性をもたらす、タンパク質の分解に関与する酵素であるパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ−１（ＰＰＴ１）（ＯＭＩＭ＃６００７２２）をコードする遺伝子の突然変異を有する細胞株を最初に試験した。以前の研究は、パルミトイル化タンパク質中のチオエステル結合の化学的切断が、ＰＰＴ１欠損マウスモデルにおいて神経保護をもたらし、したがって未分解タンパク質の蓄積が疾患の病因に直接結び付くことを示している^５１。ＭＫ２２０６を用いたＡｋｔの阻害は、ＰＰＴ１に変異を有する患者由来の初代線維芽細胞におけるリソソーム内タンパク質の蓄積を劇的に減少させた（図２５ｂ）。同様に、ＭＫ２２０６投与は、タンパク質のＮ末端からトリペプチドを連続的に除去し、その欠損が神経変性を引き起こすエキソペプチダーゼであるトリペプチジルペプチダーゼＩ（ＴＰＰ１；図２５ｃ）（ＯＭＩＭ＃６０７９９８）の欠損を有する初代線維芽細胞においてタンパク質蓄積を減少させた。最後に、膜貫通輸送体、ＭＦＳＤ８（ＯＭＩＭ＃６１１１２４）の欠損により引き起こされるリソソーム内蓄積のモデルを試験した。ＭＦＳＤ８機能をタンパク質性物質の蓄積に結び付ける分子経路は現在知られていないが、このような異常な蓄積は神経変性と関連している。ＭＫ２２０６によるＡｋｔ阻害は、ＭＦＳＤ８を欠損した初代線維芽細胞において細胞クリアランスの著しい増強をもたらした（図２５ｄ）。まとめると、これらのデータは、Ａｋｔ阻害が下流の細胞クリアランスを、一次破壊経路とは無関係に増強できることを実証している。本明細書に提示された結果に基づいて、Ａｋｔ−ＴＦＥＢシグナル伝達経路（図２５ｅに図式化されている）を小分子で利用して神経変性疾患における有毒物質のクリアランスを改善することが提案されている。

【0197】

実施例１〜３に関する考察
この研究は、神経変性蓄積疾患の治療に関連する可能性のあるｍＴＯＲＣ１非依存性の薬理学的に作用可能な標的としてのＴＦＥＢ活性のＡｋｔ制御を特定している。ＴＦＥＢは実際にリソソームベースの細胞クリアランスを制御する中心的なハブであり^８、その潜在的な治療上の関連性は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病を含む主要な神経変性疾患のモデルにおいてＴＦＥＢの異種発現に基づく原理証明研究を通して実証されている^{８、１３〜１７}。ニューロンのリソソーム内蓄積のインビボモデルとしてバッテン病マウスを使用して本明細書に提示されたデータは、リソソームの恒常性および機能の一次障害によるクリアランス経路の欠陥を打ち消すためにリソソーム増強を利用できることを実証している。これらの所見は、若年型のバッテン病のように、骨髄移植または遺伝子治療に基づくアプローチが本質的に適用困難である、膜結合タンパク質の欠損によって引き起こされるリソソーム蓄積障害に関連している^５２。さらに広くは、この知見は、有効な治療標的がまだ確立されていない神経変性蓄積疾患に対する潜在的対象であるが、実験的証拠により、細胞クリアランス経路の増強が治療標的候補として同定されている。先駆的な遺伝的および機構的研究は、実際、これらの疾患における病原性機構とリソソーム機能の間の強い関連性を明らかにした^２〜６。

【0198】

どのようにしてＴＦＥＢ活性を薬理学的に制御するかを理解することは、この分野を前進させ、神経変性疾患におけるＴＦＥＢ媒介リソソーム増強の有効性を評価するための臨床試験の設定を助けるために緊急に必要である。最近の細胞ベースの研究は、栄養状態の変化に応じて、ＴＦＥＢ活性が特定のセリン残基でのｍＴＯＲＣ１媒介リン酸化によって調節されている可能性があることを示している^{１８〜２０}。ｍＴＯＲＣ１自体がオートファジーの調節に関与していることが知られており、したがって神経変性疾患のモデルにおける前臨床試験の対象となっているので、これは重要な発見を意味していた。複数の研究の結果から、ハンチントン病^５３、アルツハイマー病^{５４、５５}、タウオパチー^５６、前頭側頭葉性認知症^５７、脊髄小脳性失調症ＩＩＩ型^５８、および家族性プリオン病^５９のマウスモデルにおいて、ｍＴＯＲＣ１阻害によるオートファジーの上方制御は神経変性病理を減弱さえることが示された。しかし、ｍＴＯＲＣ１は、タンパク質、脂質、およびヌクレオチド^６０の合成を調節することによって細胞増殖などの同化経路を制御する中心的な調節ハブとして作用し、長期のｍＴＯＲＣ１阻害は免疫抑制の誘導および創傷治癒障害の原因となる^３、６１。臨床的には、ｍＴＯＲＣ１阻害は、最初に同定されたｍＴＯＲＣ１アロステリック阻害剤のラパマイシン^６２、または薬理学的プロファイルの改善を示すラパマイシン類似体を使用することによって得られる。しかし、ラパマイシンによるｍＴＯＲＣ１のアロステリック阻害はＴＦＥＢの活性化にほとんどまたは全く影響を与えない^{１８〜２０}。ＴＦＥＢを薬理学的に活性化するためのｍＴＯＲＣ１非依存性経路の本発明者らの同定は、神経変性疾患における細胞クリアランスのＴＦＥＢ媒介増強を試験するための新たな手段を提供する。興味深いことに、ＴＦＥＢの薬理学的活性化とｍＴＯＲＣ１アロステリック阻害は、オートファジー−リソソームクリアランス経路の直交性相乗的アクチベーターとして使用でき、理想的にはどちらかの薬物の潜在的な副作用を最小限に抑える薬物投薬量を特定する。それ故、Ａｋｔ阻害剤、そして重要なことには、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤の利用可能性の増大は、将来の前臨床試験および臨床試験にとって有益であることが証明され得る。

【0199】

ＡＧＣセリン／トレオニンキナーゼファミリーの一員であるＡｋｔは、細胞生存およびアポトーシス阻害において重要な役割を果たす。Ａｋｔの異常な活性化は、Ａｋｔの突然変異や上流のシグナル伝達経路の調節異常などの機構を介して起こる可能性があり、悪性化および化学療法抵抗性の重要な推進力となっている^６３。このことが、Ａｋｔを癌治療の有望な治療標的としている。懸命な前臨床的および臨床的取り組みが、実際にＡｋｔによって調節される下流経路の特徴付けおよび癌患者におけるＡｋｔの化学的阻害の試験に置かれている^{４９、５０、６４、６５}。興味深いことに、先駆的な研究は、Ａｋｔがマクロオートファジー^６６とシャペロン媒介オートファジー^６７を調節することを示している。トレハロースのような二糖類がＡｋｔの活性化をどのように調節するかはまだ決定されていないが、ＡｋｔがＴＦＥＢを介してリソソーム機能を調節するという知見は、オートファジー−リソソームクリアランス経路におけるＡｋｔの役割の特徴付けに重要な層を追加し、Ａｋｔ阻害剤の臨床使用によって影響される細胞プロセスを理解する新しい角度を提供する。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路は、ｍＴＯＲＣ１活性を刺激するための分泌増殖因子からのシグナルの統合において重要な役割を果たすので、トレハロースによるＡｋｔ阻害がｍＴＯＲＣ１を阻害しないこともまた興味深い。成長因子に応答して、ＡｋｔはＴＳＣ２をリン酸化し、それを阻害し、ＴＳＣ２はｍＴＯＲＣ１直接アクチベーターのＲｈｅｂをその不活性ＧＤＰ結合状態に維持することによりｍＴＯＲＣ１の負の調節因子として作用する^６８。同じＴＳＣ２／Ｒｈｅｂカスケードを介してＡｋｔと並行して作用するｍＴＯＲＣ１の別の上流調節因子はＥＲＫであり、これは成長因子からのシグナルをＲａｓ−ＥＲＫ Ｑ ５経路を介して統合する。Ａｋｔと同様に、ＥＲＫもまたＴＳＣ２を阻害する。トレハロースはＡｋｔを阻害するが、ＥＲＫ活性は阻害しないことがわかり、したがって、活性なＥＲＫがＴＳＣ２を不活性に保つために十分であり、その結果修正されていないｍＴＯＲＣ１シグナル伝達がもたらされる。ＴＳＣタンパク質は他の経路からのシグナルも統合するため、追加の調節層がトレハロースに対するｍＴＯＲＣ１の非感受性の原因となる可能性がある。

【0200】

まとめると、ＴＦＥＢのｍＴＯＲＣ１非依存性調節因子としてのＡｋｔの同定は、ＴＦＥＢ媒介細胞クリアランスの薬理学的制御のための新たな展望を開くものである。ＴＦＥＢのＡｋｔ調節は、神経変性蓄積障害における細胞クリアランスを増強するために治療的に利用することができ、Ａｋｔ−ＴＦＥＢシグナル伝達経路を標的とする薬物の利用可能性は、神経変性疾患におけるＴＦＥＢ媒介リソソーム増強の臨床翻訳を目的とする将来の研究を保証する。

【0201】

［実施例４］
ミグルスタットならびにトレハロースとミグルスタットとの併用は、バッテン病マウスにおいて神経細胞死を阻害する。
バッテン病マウス（Ｃｌｎ３ ＫＯマウス）にトレハロース、低用量のミグルスタット、高用量のミグルスタット、またはトレハロースとミグルスタットの併用を投与した。これらの実験では２つの対照を使用した：（１）未処置のバッテンマウス、および（２）未処置の野生型マウス。神経細胞死（ＣＡＳ−３陽性細胞の密度（細胞数／面積）で測定）、神経炎症（神経系のＧＦＡＰ陽性星状細胞の数で測定）、および神経系へのマクロファージ浸潤（ＣＤ６８の面積％により測定した）を測定した。

【0202】

ミグルスタットで処置したすべてのバッテン病マウスは、未処置のバッテン病マウスよりも神経細胞死が少ない（Ｐ＜０．０５）。さらに、ミグルスタットで処置したすべてのバッテン病マウスは、神経細胞死に関して野生型マウスと識別不能である。（図３０）

【0203】

ミグルスタットで処置したマウスはすべて、未処置のバッテンマウスよりもＧＦＡＰ陽性細胞が少ない（Ｐ＜０．０５）。さらに、ミグルスタットで処置されたすべてのバッテン病マウスは、アストログリア増殖症に関して野生型マウスと識別不能である。（図３１）

【0204】

ミグルスタットで処置されたすべてのマウスは、未処置のバッテン病マウスよりもマクロファージ浸潤が少ない（Ｐ＜０．０５）。さらに、ミグルスタットで処置したすべてのバッテン病マウスは、マクロファージ浸潤に関して野生型マウスと識別不能である。（図３２）
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８．Ｓａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｎｅ ｎｅｔｗｏｒｋ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５，４７３−４７７（２００９）．
９．Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＬＥＡＲ ｎｅｔｗｏｒｋ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２０，３８５２−３８６６（２０１１）．
１０．Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＴＦＥＢ ｌｉｎｋｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｔｏ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２，１４２９−１４３３（２０１１）．
１１．Ｍｅｄｉｎａ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｌｅａｒａｎｃｅ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ ２１，４２１−４３０（２０１１）．
１２．Ｓｏｎｇ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．ＴＦＥＢ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２，１９９４−２００９（２０１３）．
１３．Ｘｉａｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ Ａｂｅｔａ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３４，９６０７−９６２０（２０１４）．
１４．Ｘｉａｏ，Ｑ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＴＦＥＢ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｐｐ，ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｂｅｔａ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｌａｑｕｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３５，１２１３７−１２１５１（２０１５）．
１５．Ｐｏｌｉｔｏ，Ｖ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ａｂｅｒｒａｎｔ ｔａｕ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＥＢ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６，１１４２−１１６０（２０１４）．
１６．Ｄｅｃｒｅｓｓａｃ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＴＦＥＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１０，Ｅ１８１７−Ｅ１８２６（２０１３）．
１７．Ｔｓｕｎｅｍｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．ＰＧＣ−１ａｌｐｈａ ｒｅｓｃｕｅｓ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ＴＦＥＢ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１４２ｒａ１９７ ４，１４２ｒａ１９７（２０１２）．
１８．Ｍａｒｔｉｎａ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｇｕｃｅｋ，Ｍ．＆Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ，Ｒ．ＭＴＯＲＣ１ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｂｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ＴＦＥＢ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ８，９０３−９１４（２０１２）．
１９．Ｒｏｃｚｎｉａｋ−Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＴＦＥＢ ｌｉｎｋｓ ｍＴＯＲＣ１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．５，ｒａ４２（２０１２）．
２０．Ｓｅｔｔｅｍｂｒｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ｔｏ−ｎｕｃｌｅｕｓ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｓｅｎｓｅｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｖｉａ ｍＴＯＲ ａｎｄ ＴＦＥＢ．Ｅｍｂｏ Ｊ．３１，１０９５−１１０８（２０１２）．
２１．Ｓａｒｋａｒ，Ｓ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｕａｎｇ，Ｚ．，Ｔｕｎｎａｃｌｉｆｆｅ，Ａ．＆Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ，Ｄ．Ｃ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍＴＯＲ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ，ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ ａｎｄ ａｌｐｈａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２，５６４１−５６５２（２００７）．
２２．Ｔａｎａｋａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０，１４８−１５４（２００４）．
２３．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔａｕｏｐａｔｈｙ．Ｂｒａｉｎ １３５，２１６９−２１７７（２０１２）．
２４．Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｅｌａｙｓ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ９，１３０８−１３２０（２０１３）．
２５．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．ＭＴＯＲ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｐｒｏｌｏｎｇｓ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｔｈｅ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｆｌｕｘ ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ １０，５８８−６０２（２０１４）．
２６．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｄ ｔａｕ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｐａｒｋｉｎ ｄｅｌｅｔｅｄ／ｔａｕ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．３９，４２３−４３８（２０１０）．
２７．Ｃａｒｃｅｌ−Ｔｒｕｌｌｏｌｓ，Ｊ．，Ｋｏｖａｃｓ，Ａ．Ｄ．＆Ｐｅａｒｃｅ，Ｄ．Ａ．Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ＮＣＬ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｗｈａｔ ｔｈｅｙ ｄｏ ａｎｄ ｄｏｎ’ｔ ｄｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １８５２，２２４２−２２５５（２０１５）．
２８．Ｃｏｔｍａｎ，Ｓ．Ｌ．＆Ｓｔａｒｏｐｏｌｉ，Ｊ．Ｆ．Ｔｈｅ ｊｕｖｅｎｉｌｅ Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＬＮ３，ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｅｒｏｇｒａｄｅ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ ｐｏｓｔ−Ｇｏｌｇｉ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｃｌｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．７，７９−９１（２０１２）．
２９．Ｒａｋｈｅｊａ，Ｄ．，Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＮ３Ｐ，ｔｈｅ Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｔａｂ．９３，２６９−２７４（２００８）．
３０．Ｃａｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｓ ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ ｉｎ ａ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１，２０４８３−２０４９３（２００６）．
３１．Ｊａｌａｎｋｏ，Ａ．＆Ｂｒａｕｌｋｅ，Ｔ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７９３，６９７−７０９（２００９）．
３２．Ｃｏｔｍａｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｎ３（Ｄｅｌｔａｅｘ７／８）ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ＪＮＣＬ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｘｈｉｂｉｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｈａｔ ｂｅｇｉｎｓ ｂｅｆｏｒｅ ｂｉｒｔｈ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１，２７０９−２７２１（２００２）．
３３．Ａｕｔｔｉ，Ｔ．，Ｒａｉｎｉｎｋｏ，Ｒ．，Ｖａｎｈａｎｅｎ，Ｓ．Ｌ．＆Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ，Ｐ．ＭＲＩ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ．Ｉ Ｃｒａｎｉａｌ ＭＲＩ ｏｆ ３０ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌｏｇｙ ３８，４７６−４８２（１９９６）．
３４．Ａｕｔｔｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｍａｎｎｅｒｋｏｓｋｉ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｌｅｅｍｐｕｔ，Ｋ．Ｖ．＆Ａｂｅｒｇ，Ｌ．Ｅ．ＪＮＣＬ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｓｈｏｗ ｍａｒｋｅｄ ｂｒａｉｎ ｖｏｌｕｍｅ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ ＭＲＩ ｉｎ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５５，１２２６−１２３０（２００８）．
３５．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｎ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＭＲＩ ｒｅｖｅａｌｓ ｇｌｏｂａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｒａｉｎｓ ｏｆ Ｃｌｎ３ ｍｕｔａｎｔ ｍｉｃｅ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．５，１０３−１０７（２００１）．
３６．Ｔａｒａｄａｃｈ，Ｃ．＆Ｇｒｅａｖｅｓ，Ｐ．Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｅｙｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｉｍａｌｓ：ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ａｇｅ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１２，１２１−１４７（１９８４）．
３７．Ｓｅｒｆｉｌｉｐｐｉ，Ｌ．Ｍ．，Ｐａｌｌｍａｎ，Ｄ．Ｒ．，Ｇｒｕｅｂｂｅｌ，Ｍ．Ｍ．，Ｋｅｒｎ，Ｔ．Ｊ．＆Ｓｐａｉｎｈｏｕｒ，Ｃ．Ｂ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｏｕｔｂｒｅｄ ａｌｂｉｎｏ ｍｉｃｅ．Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４，６９−７６（２００４）．
３８．Ｐｏｎｔｉｋｉｓ，Ｃ．Ｃ．，Ｃｏｔｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｍ．Ｅ．＆Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｄ．Ｔｈａｌａｍｏｃｏｒｔｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎ ｌｏｓｓ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｌｎ３Ｄｅｌｔａｅｘ７／８ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｂａｔｔｅｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２０，８２３−８３６（２００５）．
３９．Ｏｎｄａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｓｃ２ ｎｕｌｌ ｍｕｒｉｎｅ ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｔｕｂｅｒ ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｓｈｏｗ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｍＴＯＲ ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，５６１−５７４（２００２）．
４０．Ｔｅｅ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｏｍｐｌｅｘ−１ ａｎｄ −２ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（ｍＴＯＲ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，１３５７１−１３５７６（２００２）．
４１．Ｕｒａｎｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＴＯＲ ｃｏｎｆｅｒ Ｒｈｅｂ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｆｉｓｓｉｏｎ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＴＯＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０４，３５１４−３５１９（２００７）．
４２．Ｆａｍｂｒｏｕｇｈ，Ｄ．，ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｋ．，Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ，Ａ．＆Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｂｒｏａｄｌｙ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ，ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｓｅｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ．Ｃｅｌｌ ９７，７２７−７４１（１９９９）．
４３．Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−−２０００ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｃｅｌｌ １００，１１３−１２７（２０００）．
４４．Ｍｅｎｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｓｐａｔｉａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ＴＳＣ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲＣ１ ａｔ ｔｈｅ ｌｙｓｏｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ １５６，７７１−７８５（２０１４）．
４５．Ｐａｒｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２，４４１０−４４１８（２０１２）．
４６．Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｂ．，Ａｒｓｅｎａｕｌｔ，Ｄ．，Ｒａｙｍｏｎｄ−Ｆｌｅｕｒｙ，Ａ．，Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｆ．Ｍ．＆Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ−３（ＧＳＫ３）ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｓｕｒｖｉｖａｌ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０，５５９２−５６０５（２０１５）．
４７．Ｌｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｌｙｓｏｓｏｍｅ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ｍＴＯＲＣ１．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８，１０６５−１０７７（２０１６）．
４８．Ｗａｔｔｏｎ，Ｓ．Ｊ．Ｄｏｗｎｗａｒｄ Ｊ．Ａｋｔ／ＰＫＢ ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ３’ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｔ ｓｉｔｅｓ ｏｆ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９，４３３−４３６（１９９９）．
４９．Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎ ｏｒａｌ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＭＫ−２２０６）ｏｎ ｈｕｍａｎ ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｔｈｅｒ．８，１８２７−１８３７（２０１４）．
５０．Ｙａｐ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｐａｎ−ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＭＫ−２２０６ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９，４６８８−４６９５（２０１１）．
５１．Ｓａｒｋａｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｆｅｓｐａｎ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｐｔ１（ − ／− ）ｍｉｃｅ ｂｙ ＮｔＢｕＨＡ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＩＮＣＬ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，１６０８−１６１７（２０１３）．
５２．Ｈｏｂｅｒｔ，Ｊ．Ａ．＆Ｄａｗｓｏｎ，Ｇ．Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｒｏｉｄ ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｅｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ：ｐａｓｔ，ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７６２，９４５−９５３（２００６）．
５３．Ｒａｖｉｋｕｍａｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｆｌｙ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３６，５８５−５９５（２００４）．
５４．Ｓｐｉｌｍａｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ ｂｙ ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５，ｅ９９７９（２０１０）．
５５．Ｊｉａｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．８１，５４−６３（２０１４）．
５６．Ｃａｃｃａｍｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ｍＴＯＲ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔａｕｏｐａｔｈｉｅｓ．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １２，３７０−３８０（２０１３）．
５７．Ｗａｎｇ，Ｉ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｒｅｓｃｕｅ ａｎｄ ａｌｌｅｖｉａｔｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＡＲ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ４３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０９，１５０２４−１５０２９（２０１２）．
５８．Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ ｉｍｐａｉｒｓ ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９０，１０２３−１０３７（２０１０）．
５９．Ｃｏｒｔｅｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｑｉｎ，Ｋ．，Ｃｏｏｋ，Ｊ．，Ｓｏｌａｎｋｉ，Ａ．＆Ｍａｓｔｒｉａｎｎｉ，Ｊ．Ａ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ｄｅｌａｙｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎｓｅｔ ａｎｄ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＰｒＰ ｐｌａｑｕｅ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３２，１２３９６−１２４０５（２０１２）．
６０．Ｚｏｎｃｕ，Ｒ．，Ｅｆｅｙａｎ，Ａ．＆Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．ｍＴＯＲ：ｆｒｏｍ ｇｒｏｗｔｈ ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｔｏ ｃａｎｃｅｒ，ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ａｇｅｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２，２１−３５（２０１１）．
６１．Ｌａｍｍｉｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｙｅ，Ｌ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｍ．＆Ｂａｕｒ，Ｊ．Ａ．Ｒａｐａｌｏｇｓ ａｎｄ ｍＴＯＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｓ ａｎｔｉ−ａｇｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，９８０−９８９（２０１３）．
６２．Ｂｌｏｍｍａａｒｔ，Ｅ．Ｆ．，Ｌｕｉｋｅｎ，Ｊ．Ｊ．，Ｂｌｏｍｍａａｒｔ，Ｐ．Ｊ．，ｖａｎ Ｗｏｅｒｋｏｍ，Ｇ．Ｍ．＆Ｍｅｉｊｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆｏｒ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｒａｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２３２０−２３２６（１９９５）．
６３．Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＩ３Ｋ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ９，５５０−５６２（２００９）．
６４．Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８５，３９９−４０８（２００５）．
６５．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｕｓｚ，Ｃ．＆Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ａｎｇｕｌｏ，Ａ．Ｍ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＰＩ３Ｋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ １６，１２１−１３０（２０１２）．
６６．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｋｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｅｃｌｉｎ １ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３８，９５６−９５９（２０１２）．
６７．Ａｒｉａｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｍＴＯＲＣ２／ＰＨＬＰＰ１／Ａｋｔ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５９，２７０−２８４（２０１５）．
６８．Ｄｉｂｂｌｅ，Ｃ．Ｃ．＆Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．Ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｍＴＯＲＣ１ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｉｎｐｕｔ ｗｉｔｈ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｕｔｐｕｔ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５，５５５−５６４（２０１３）．
６９．Ｃａｉ，Ｔ．，Ｓｅｙｍｏｕｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｆ．Ａ．＆Ｇｒｏｖｅｓ，Ａ．Ｋ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔｏｈ１ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｅｒｉｏｄｓ ｆｏｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈａｉｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｇａｎ ｏｆ Ｃｏｒｔｉ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ３３，１０１１０−１０１２２（２０１３）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図27-1】

【図28】

【図29a】

【図29b】

【図29c】

【図29d】

【図30】

【図31】

【図32】

【手続補正書】

【提出日】2020年4月20日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リソソーム蓄積障害、リソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、または免疫障害を治療するための、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）阻害剤を含む組成物。

【請求項2】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤が、好ましくは汚染物質を含まない、トレハロース、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）を阻害することができるその塩、多形体、エステル、アミド、プロドラッグ、類似体、または誘導体である、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択されるトレハロース類似体である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

トレハラーゼ阻害剤と一緒に投与されることを特徴とし、好ましくは、前記トレハラーゼ阻害剤が、バリドキシルアミンＡ、バリダマイシンＡ、トレハゾリン、１−チアトレハゾリン、スイダトレスチン（ｓｕｉｄａｔｒｅｓｔｉｎ）、サルボスタチン、ＭＤＬ ２６５３７、カスアリン−６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシド、ミグルスタット、およびワモンゴキブリ由来の８６ｋＤタンパク質からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記トレハラーゼ阻害剤が、ミグルスタットであり、好ましくは、３０〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で存在する、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％以下のトレハロース（ｗ／ｖ）を含むトレハロースの水溶液として投与されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記組成物が非経口投与されることが意図される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

前記組成物が、３０〜１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、請求項１または８に記載の組成物。

【請求項10】

前記組成物が、経口または非経口投与用、好ましくは静脈内投与用である、請求項１〜９に記載の組成物。

【請求項11】

前記リソソーム蓄積障害が、アスパルチルグルコサミン尿症、若年性神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ、若年性バッテン病またはＣＬＮ３病）、シスチン症、ファブリ病、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症Ｉ型（テイ・サックス病）、ＧＭ２−ガングリオシド蓄積症ＩＩ型（サンドホフ病）、異染性白質ジストロフィー、ムコリピド症Ｉ型、ＩＩ／ＩＩＩ型およびＩＶ型、ムコ多糖蓄積症（ハーラー病およびその変種、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、モルキオ症候群Ａ型およびＢ型、マルトー・ラミー症候群、およびスライ病）、ニーマンピック病Ａ／Ｂ型、Ｃ１およびＣ２、ハンチントン病、脊髄小脳性運動失調症、パーキンソン病およびアルツハイマー病、ならびにシンドラー病Ｉ型およびＩＩ型からなる群から選択され、好ましくは、若年性神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ３病）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

プロテインキナーゼＢを、トレハロースを含む組成物と接触させることにより、前記プロテインキナーゼＢの活性を阻害するためのインビトロ方法。

【請求項13】

機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強するインビトロ方法であって、前記方法は、前記細胞をプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物と接触させることによって前記細胞中のプロテインキナーゼＢを阻害することを含む、方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0029】

いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼＢ阻害剤は、ＭＫ−２２０６またはトレハロース類似体であり得る。トレハロース類似体は、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択することができる。
本発明は、たとえば、以下の項目を提供する。
（項目１）
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、プロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
（項目２）
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースおよびＭＫ−２２０６から選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与される、項目４に記載の方法。
（項目１２）
前記投与が１２０分以内に完了する、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で非経口投与される、項目７に記載の方法。
（項目１４）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与される、項目４に記載の方法。
（項目１５）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与される、項目７に記載の方法。
（項目１６）
前記組成物が１日１回投与される、項目４に記載の方法。
（項目１７）
前記組成物が１日２回投与される、項目４に記載の方法。
（項目１８）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記組成物が、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記組成物が約１００〜約３００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記組成物が非経口投与される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記組成物が、ＭＫ−２２０６の１回投与用量が約１００ｍｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇで投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記組成物が１日１回投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物が１日２回投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
（項目２６）
前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
トレハロースを含む組成物の治療有効量を投与することにより、プロテインキナーゼＢの活性を阻害する、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で非経口投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
前記投与が１２０分以内に完了する、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間で経口投与される、項目２２に記載の方法。
（項目３４）
前記組成物が１日１回投与される、項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記組成物が１日２回投与される、項目２２に記載の方法。
（項目３６）
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、ＭＫ−２２０６を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
（項目３７）
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記組成物が、約３０〜約１００ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記組成物が約１００〜約３００ ｍｇのＭＫ−２２０６を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記組成物が、１００ｍｇ／ｋｇから１５０ｍｇ／ｋｇの間の１回投与用量で投与される、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記組成物が１日１回投与される、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記組成物が１日２回投与される、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロース類似体を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
（項目４７）
前記リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するための前記トレハロース類似体からなる単一活性成分を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
リソソーム蓄積障害またはリソソーム機能不全を特徴とする障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、トレハロースおよびトレハロース阻害剤を含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法。
（項目５２）
リソソーム機能不全障害が若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記ミグルスタットが、約３０〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００〜約３００ｍｇ／ｋｇ、または約１００〜約１５０ｍｇ／ｋｇの投薬量範囲で投与される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目５１に記載の方法。
（項目５６）
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で非経口投与される、項目５３に記載の方法。
（項目５８）
前記組成物が、トレハロースの１回投与用量が０．１ｇ／ｋｇから１ｇ／ｋｇの間、ならびにミグルスタットの１回投与用量が約３０から約１００ｍｇ／ｋｇ、約１００から約３００ｍｇ／Ｋｇ、または約１００から約１５０ｍｇ／Ｋｇの範囲で経口投与される、項目５３に記載の方法。
（項目５９）
前記組成物が１日１回投与される、項目５１に記載の方法。
（項目６０）
前記組成物が１日２回投与される、項目５１に記載の方法。
（項目６１）
トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロースを含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法。
（項目６２）
前記トレハロースがトレハロース類似体である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記プロテインキナーゼＢが、プロテインキナーゼＢを有する細胞をトレハロースを含む組成物と接触させることによって接触させられる、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
前記プロテインキナーゼＢが、トレハロースを含む組成物を対象に投与することによって接触させられる、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
プロテインキナーゼＢによって媒介される病状を、それを必要とする対象において治療するために使用される、項目６１に記載の方法。
（項目６７）
前記病状が、リソソーム蓄積障害およびリソソーム機能不全を特徴とする障害、過剰増殖性疾患、および免疫障害から選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記リソソーム機能不全障害が、若年性神経セロイドリポフスチン症である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
トレハロースを使用する方法であって、プロテインキナーゼＢとトレハロース類似体を含む組成物とを接触させることによって前記プロテインキナーゼＢの活性を阻害することを含む方法。
（項目７０）
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
（項目７２）
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。
（項目７３）
過剰増殖性疾患をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。
（項目７４）
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、および任意選択でトレハラーゼ阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
（項目７５）
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース、およびミグルスタットを前記対象に投与することを含む方法。
（項目７６）
免疫障害をそれを必要とする対象において治療する方法であって、治療有効量のトレハロース類似体を前記対象に投与することを含む方法。
（項目７７）
機能不全リソソームクリアランスを示す細胞中の未分解物質のクリアランスを増強する方法であって、前記細胞をプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物と接触させることによって前記細胞中のプロテインキナーゼＢを阻害することを含む方法。
（項目７８）
前記細胞がインビトロで接触させられる、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記細胞が、ある量のプロテインキナーゼＢ阻害剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することによってインビボで接触させられる、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤が、トレハロース、トレハロース類似体、およびＭＫ−２２０６から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロースである、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記組成物が、プロテインキナーゼＢを阻害するためのトレハロースからなる単一活性成分を含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記組成物がトレハラーゼ阻害剤をさらに含む、項目８１に記載の方法。
（項目８４）
前記トレハラーゼ阻害剤がミグルスタットである、項目８３に記載の方法。
（項目８５）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がＭＫ−２２０６である、項目８０に記載の方法。
（項目８６）
前記プロテインキナーゼＢ阻害剤がトレハロース類似体である、項目８０に記載の方法。
（項目８７）
前記トレハロース類似体が、レンツトレハロースＡ、レンツトレハロースＢ、およびレンツトレハロースＣから選択される、項目８６に記載の方法。

【国際調査報告】