特表 2021-517582 細胞外ヒストンによって媒介される病理を処置及び予防するための化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-517582(P2021-517582A)

(43)【公表日】2021年7月26日

(54)【発明の名称】細胞外ヒストンによって媒介される病理を処置及び予防するための化合物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7028 20060101AFI20210625BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 33/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20210625BHJP

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   A61P 37/06 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20210625BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20210625BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210625BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7028

   A61P43/00 111

   A61P31/04

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   A61P1/18

   A61P13/12

   A61P29/00

   A61P9/10 101

   A61P9/00

   A61P11/00

   A61P11/16

   A61P9/10

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   A61P37/06

   A61P25/00

   A61P37/02

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   A61P17/06

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   A61P3/10

   A61P3/06

   A61P25/14

   A61P7/06

   A61P43/00 121

   A61K45/00

【審査請求】有

【予備審査請求】有

【全頁数】196

(21)【出願番号】特願2020-552068(P2020-552068)

(86)(22)【出願日】2018年12月14日

(85)【翻訳文提出日】2020年8月12日

(86)【国際出願番号】AU2018051337

(87)【国際公開番号】WO2019113645

(87)【国際公開日】20190620

(31)【優先権主張番号】2017905024

(32)【優先日】2017年12月15日

(33)【優先権主張国】AU

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】501004316

【氏名又は名称】ジ・オーストラリアン・ナショナル・ユニヴァーシティ

(71)【出願人】

【識別番号】520211948

【氏名又は名称】グリフィス・ユニヴァーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(72)【発明者】

【氏名】パリッシュ，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】オメーラ，コナー

(72)【発明者】

【氏名】クープランド，ルーシー

(72)【発明者】

【氏名】カー，ベンジャミン・ジュー・チャイ

(72)【発明者】

【氏名】コルドバッチェ，ファルザネ

(72)【発明者】

【氏名】ベゾス，アンナ

(72)【発明者】

【氏名】ブラウン，アンナ

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴンス，ロス

(72)【発明者】

【氏名】トレドウェル，グレゴリー・デイヴィッド

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ，リー・アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ノックス，カレン

(72)【発明者】

【氏名】フォン・イツシュタイン，ローレンス・マーク

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チー‐ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ブリュストル，アン

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィス，デイヴィッド・アナク・サイモン

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA19

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4C086ZB37

4C086ZC02

4C086ZC33

4C086ZC35

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、化学的安定性が高い化合物及び対象における細胞外ヒストンの病理学的活性を阻害する方法に関する。具体的には、本発明は、化学的安定性が高い化合物、その使用並びに細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、全身性免疫反応症候群（ＳＩＲＳ）及び虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）等）を阻害するか又は寛解させる方法に関する。より具体的には、本発明は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドの方法及び使用であって、この置換基の存在は、化学的安定性が高い分子を、細胞外ヒストンによって媒介される病気の治療で有効であるこの分子の能力に影響を及ぼすことなくもたらす、方法及び使用に関する。例えば、本発明は、対象における細胞外ヒストンによって媒介される様々な病気の治療における、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）又はその薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）の方法及び使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防に使用するための化合物であって、この化合物が、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む、化合物。

【請求項2】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）例えば、敗血症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば循環器疾患又は慢性循環器疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を含む群から選択される、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシドが、

【化1】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ小さい非荷電Ｏ結合置換基又はサルフェート基である）
の全体構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ１は、Ｏ又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基である、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項8】

硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項9】

ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。

【請求項10】

細胞外ヒストンによって媒介される病気を処置又は予防する方法であって、この方法が、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を対象に投与することを含む、方法。

【請求項11】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば循環器疾患又は慢性循環器疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する方法であって、この方法が、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項13】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連し、且つ前記方法が、前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩの状態又は疾患を処置又は予防するのに十分である、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記医学的状態又は疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドの前記治療上有効な量が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害するのに十分である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記治療上有効な量が、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性である、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となる、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させる、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、細胞外ヒストンを、減少させる、最小限に抑える又は阻害するのに十分である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

単回用量において、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

複数回用量において、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記処置される医学的状態又は疾患のための補助的処置として、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤を同時に又は付随して前記対象に投与することをさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置することを含む、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を予防することを含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を少なくとも含む、治療用組成物。

【請求項24】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤とを少なくとも含む、医薬組成物。

【請求項25】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の使用。

【請求項26】

前記敗血症又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２５に記載の使用。

【請求項27】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２５又は２６に記載の使用。

【請求項28】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２７に記載の使用。

【請求項29】

前記細胞外ヒストンが、前記対象の内皮に対して細胞毒性であり、及び／又は前記対象の内皮機能障害の一因となる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項30】

前記薬物が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害する、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項31】

前記薬物が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害する、請求項３０に記載の使用。

【請求項32】

前記薬物が、前記対象への単回用量投与のために製剤化される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項33】

前記薬物が、前記対象への複数回用量投与のために製剤化される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項34】

前記薬物が、前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患のための補助的処置としての、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤の同時の又は付随する前記対象への投与のために製剤化される、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項35】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項37】

前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項38】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の使用。

【請求項39】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３９に記載の使用。

【請求項40】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３８又は３９に記載の使用。

【請求項41】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３９に記載の使用。

【請求項42】

前記細胞外ヒストンが、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項43】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド若しくはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害するのに十分であり、及び／又は前記使用が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項44】

前記治療上有効な量が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害するのに十分であり、及び／又は前記使用が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の単回用量の使用を含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項46】

前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の複数回用量の使用を含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項47】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量と、前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患のための補助的処置としての、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤の量との使用を含む、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項48】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある患者において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置することを含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項50】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある患者において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を予防することを含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項51】

前記処置が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは前記疾患を寛解させることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３に記載の治療用、又は請求項２４に記載の医薬組成物、又は請求項２５〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項52】

前記処置が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは前記疾患を阻害することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３に記載の治療用、又は請求項２５に記載の医薬組成物、又は請求項２５〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項53】

前記敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩと関連する医学的状態又は疾患が、非敗血症性疾患状態、非ＳＩＲＳ疾患状態又は非ＩＲＩ疾患状態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３に記載の治療用、又は請求項２４に記載の医薬組成物、又は請求項２５〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象における細胞外ヒストンの病理活性を阻害するための化合物及び方法に関する。具体的には、本発明は、細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、全身性免疫反応症候群（ＳＩＲＳ）及び虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）等）を阻害するか又は寛解させるための化合物、使用及び方法に関する。より具体的には、本発明は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドの方法及び使用であって、この置換基の存在は、化学的安定性が高い分子を、細胞外ヒストンによって媒介される病気の治療で有効であるこの分子の能力に影響を及ぼすことなくもたらす、方法及び使用に関する。例えば、本発明は、対象における細胞外ヒストンによって媒介される様々な病気の治療における、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）又はその薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）の方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒストンは、ＤＮＡと複合体化してヌクレオソームを形成することにより遺伝子発現を調節するように細胞核中で機能する小さい塩基性タンパク質であり、このヌクレオソームは、クロマチン構造に集合する。核内機能に加えて、Ｘｕら（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９．１５：１３１８−２１）は、炎症プロセスに反応して放出されるヒストンの細胞毒性活性を報告しており、この細胞外ヒストンは、敗血症における内皮細胞の機能障害、臓器不全及び死のメディエータとして作用する。

【0003】

ヒストンは、現在、核から核外空間に移行する際の内因性危険シグナル又はＤＡＭＰとしても認識されている。ヒストンは、ストレスに反応して、免疫細胞、小脳ニューロン、シュワン細胞及びミクログリアの細胞表面において又は細胞質中で検出されることが多く、Ｔｏｌｌ様レセプタ及びインフラマソーム経路を活性化することにより全身性の炎症反応及び毒性反応を引き起こすことが分かっている。ヒストン及びヌクレオソームの循環レベルの上昇は、疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患及び癌）の複数の病態生理学的プロセス及び進行に関与しており、多くのヒト疾患での細胞外ヒストンの役割を支持している。

【0004】

近年、細胞外ヒストンによって媒介される疾患の有効な新規の治療法を見出そうといういくつかの試みが行われている。例えば、炎症の重要なメディエータに対するモノクローナル抗体を作製するために相当な努力が払われているが、これらは、臨床的に効果がないことが証明されており、特に敗血症患者で危険な副作用があることも分かっている。

【0005】

抗ヒストン処置（例えば、中和抗体、活性化プロテインＣ、組換えトロンボモジュリン及びヘパリン）は、致死性の内毒血症、敗血症、虚血／再灌流傷害、外傷、膵炎、腹膜炎、脳卒中、凝血及び血栓症からマウスを保護することが分かっているが、有効性の欠如又は容認できない副作用に起因して臨床的価値が限定されている。例えば、精製済ヒト凝固因子（例えば、組換えヒトＡＰＣ（例えば、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））等の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ））は、臨床的影響がほとんどない。これにはいくつかの理由がある。１つの理由として、出血のリスクの増加につながるＡＰＣの抗凝固活性が挙げられ、そのため、ＡＰＣ薬物は、手術後又は外傷後の患者で発症する可能性があるＳＩＲＳの治療から除外されている。同様の理由から、ＡＰＣをベースとする治療薬は、出血のリスクが高い白血病患者で生じる敗血症での使用から除外されている。さらに、敗血症は、急速に発症することから、ＡＰＣの比較的遅い作用様式は、不利である。実際に、有効性の欠如に起因して、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）は、２０１１年１０月２５日に販売が中止された。

【0006】

そのため、これらの努力にもかかわらず、細胞外ヒストンによって媒介される疾患は、ヒトに存在する最も衰弱させて致死的である疾患のいくつかであるものの、ほとんど処置されないままである。従って、重要な臨床的問題が示されている。

【0007】

細胞外ヒストンによって媒介される状態又は疾患（例えば、敗血症）の処置に適用されている化合物の１つのクラスが米国特許第９，２２６，９３９号明細書で開示されている。この米国特許は、対象における細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害する方法に関する発明を対象としており、この方法は、対象へのポリアニオンの有効量の投与を必要とする。この米国特許公報では、構造が非常に異なる多様なポリアニオンが開示された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、複数の疾患における細胞外ヒストンの役割の認識の高まりというこの背景に対して開発されている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

炎症性チャレンジに反応して放出される細胞外ヒストンは、内皮機能障害、臓器不全及び細胞死（特に敗血症中）の一因となるメディエータである。本発明は、選択された非常に安定なポリアニオン性化合物がヒストンと静電気的に相互作用して、この分子の細胞変性特性、赤血球損傷特性、血小板活性化特性及び凝血促進特性を中和し得るという発見に基づいている。生きている動物の循環中でのそのようなポリアニオン性分子と細胞外ヒストンとの複合体化は、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を少なくとも改善する手段を提供する。

【0010】

具体的には、本発明者らは、特定の硫酸化二糖類がヒストンのこれらの病理学的効果の中和で有効であることを確認している。例えば、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ）に対して非常に有効な処置も提供し得、且つ患者においてこれらの状態を少なくとも寛解させ得る化学的に安定したポリアニオンを提供する。

【0011】

本発明者らは、本発明の化合物が、細胞外ヒストンによって媒介される病気の診断、予後及び管理のための方法を提供することも確認している。

【0012】

本発明は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドが濃度依存的に細胞外ヒストンの細胞毒性から内皮細胞を保護し、且つヒストンによって誘発される損傷（例えば、赤血球の凝集及び溶解）を減少させるか又はさらに反転させ、且つ例えば敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩの対象において細胞傷害及び臓器機能不全から保護するという本発明者らの発見にも基づいている。

【0013】

結果的に化学的に安定であるポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシドの使用により、ヒストンによって媒介される病理に罹患している患者の処置の分野及び／又はリスクのある患者においてヒストンによって媒介される病理が生じることを予防する分野での、適用の新規の一般的原理が提示又は提供される。

【0014】

本発明の第１の態様では、細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防での使用のための化合物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む化合物が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0015】

本発明の化合物は、治療上有効な量又は薬学的に有効な量で存在する場合、細胞外ヒストンによって媒介される病気を寛解させるか、処置するか又は予防する手段を提供する。

【0016】

本発明のある実施形態では、この改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、全体構造：

【化1】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基、例えばＯ又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルであり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ（ｉ）小さい非荷電Ｏ結合置換基、又は（ｉｉ）サルフェート基から選択される）
を有する。

【0017】

好ましくは、Ｒ１は、Ｏ又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである。好ましくは、Ｒ１は、Ｒ１でサルフェート基を有する同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0018】

好ましくは、Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれ（ａ）非改変ヒドロキシル基、又は（ｂ）サルフェート基から選択される。

【0019】

より好ましくは、Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択されるサルフェート基である。

【0020】

望ましくは、このクラスの化合物は、高い正味の負電荷を有し、即ちポリアニオンである。

【0021】

この小さい非荷電グリコシド置換基（Ｒ１）のアノマー配置は、α位又はβ位のいずれかであり得る。好ましくは、この小さい非荷電置換基は、β配置である。

【0022】

本発明の非常に好ましい形態では、本化合物は、硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖であるｍＣＢＳ又はその薬学的に許容される塩である。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩、即ちナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0023】

ｍＣＢＳは、ＣＢＳと比べて非常に安定しており、高濃度で良好に耐容性である。ｍＣＢＳは、抗凝固効果が最小限に抑えられており、ヒストンによって誘発される血漿凝固撹乱を減少させ得る。ｍＣＢＳの抗凝固活性は、低分子量ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。

【0024】

本発明の第２の態様では、対象における細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を（治療的又は予防的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0025】

例えば、本発明の第２の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ又は敗血症及び／若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するか、又は予防するか、又は寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0026】

本発明のこの実施形態によれば、この敗血症／ＳＩＲＳの処置により、敗血症／ＳＩＲＳ若しくは敗血症性／ＳＩＲＳ状態又はこれらと関連する疾患が寛解され、二次的な状態を処置するために医師が他の薬物を投与することを可能にする。

【0027】

本発明の第２の態様の別の実施形態では、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するか、又は予防するか、又は寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0028】

本発明の第３の態様では、対象における細胞外ヒストンの蓄積を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0029】

例えば、本発明の第３の態様のある実施形態では、この方法を使用して、細胞外ヒストン関連の合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩ）と関連する状態又は病気を予防する。

【0030】

本発明の第２又は第３の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された方法は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っているか若しくは患うリスクがある１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の医薬組成物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を、この改変されている硫酸化セロビオシドと一緒に又はこの硫酸化セロビオシドに付随（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0031】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンに関連する合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ）及び／又はそのような合併症と関連する医学的状態若しくは疾患を対象とする処置に対して補助的処置を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0032】

好ましくは、第２の活性剤は、本発明の化合物によって処置される医学的病気に関連するか又はこの医学的病気と異なる、患者が患っている疾患の医学的介入の手段を提示し、前記第２の活性剤は、この患者に補助的処置を提供する。

【0033】

本発明の第４の態様では、対象における細胞外ヒストンと関連する医学的状態又は疾患を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0034】

本発明の第４の態様の好ましい一例では、この方法を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であり、及び／又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となる細胞外ヒストンを中和する。加えて又は代わりに、この方法を使用して、対象における感染、炎症若しくは低酸素症又はあらゆる感染、炎症若しくは低酸素症の反応後の対象における細胞外ヒストンの放出であるか、それによって引き起こされるか、又はそれによって媒介される敗血症性状態若しくはＳＩＲＳ状態、又はＩＲＩ、又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する疾患を処置する。

【0035】

本発明の第５の態様では、細胞外ヒストン関連の合併症の処置での使用のための治療用組成物又は医薬組成物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を少なくとも含む治療用組成物又は医薬組成物が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。好ましくは、この化合物は、治療用組成物又は医薬組成物中に治療上有効な量又は薬学的に有効な量で存在する。この組成物は、治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤も含み得る。この治療又は医薬での化合物は、中性遊離塩基形態又は塩形態のいずれかである。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシド化合物は、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0036】

本発明の第５の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された組成物は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物も含み得る。

【0037】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、望ましくは、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩの補助的治療又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0038】

本発明の第６の態様では、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療用有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0039】

例えば、本発明の第６の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0040】

そのような使用の一実施形態では、この薬物は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳ又は敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置により、前記敗血症若しくはＳＩＲＳ又は前記敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する前記状態若しくは疾患が寛解されるか又は阻害される。

【0041】

そのような使用の別の実施形態では、この薬物は、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置により、前記ＩＲＩ又は前記傷害と関連する前記状態若しくは疾患が寛解されるか又は阻害される。

【0042】

そのような使用のさらに別の実施形態では、この薬物を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを中和する。

【0043】

さらに別の実施形態では、製造された薬物は、第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量も含み得る。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための補助的治療を提供する。望ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩの処置のための補助的治療又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される。より好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0044】

本発明の方法のいずれかにおいて、改変されている硫酸化セロビオシド化合物を使用する場合、この化合物を、製剤の単回用量において、それを必要とする対象に投与し得るか、又はこの投与のために製剤化し得る。特定の代替実施形態では、この改変されている硫酸化セロビオシド化合物を、複数回用量製剤として、それを必要とする対象に投与するか、又はこの投与のために製剤化する。

【0045】

追加の目的、利点及び新規の特徴は、下記の説明に記載されるか、又は図面及び下記に続くいくつかの非限定的な実施形態の詳細な説明の考察により当業者に明らかになるであろう。

【0046】

本開示は、下記の図面を参照して、好ましい実施形態の下記の説明で詳細を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】ＨＰＬＣで測定した場合における、５±３℃（図１Ａ）、２５±２℃／６０％ＲＨ（図１Ｂ）及び４０±２℃／７５％ＲＨ（図１Ｃ）で貯蔵した際のｍＣＢＳに対するＣＢＳの安定性の比較を示す。この図は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳの開始量（Ｔ＝０）に対するこれらのパーセント（％）変化を示す。

【図2】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒト肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図3】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのラット肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒトラットミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図4】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのイヌ肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、イヌ肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図5】Ａ〜Ｄは、フローサイトメトリーのアウトプットを示すグラフであり、パネルＥ〜Ｇは、ｍＣＢＳがヒストン損傷からヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を保護することを示す共焦点顕微鏡観察の結果を示す画像である。培養したＨＭＥＣを（Ａ及びＥ）水体積等量、（Ｂ及びＦ）ヒストン４００μｇ／ｍＬ、（Ｃ及びＧ）ｍＣＢＳ １００μｇ／ｍＬ＋ヒストン４００μｇ／ｍＬ、又は（Ｄ）ｍＣＢＳ ２５μｇ／ｍＬ＋ヒストン４００μｇ／ｍＬで６０分にわたり処理し、次いで色素カルセイン−ＡＭ及びＰＩで標識し、フローサイトメトリー（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は共焦点顕微鏡（Ｅ、Ｆ及びＧ）を使用して、色素取り込みの程度に関して分析した。四分の一区中の数字は、各四分の一区中に存在する細胞の割合を示す。生存細胞は、カルセイン−ＡＭ（緑色）を取り込み且つＰＩを排除するが、損傷細胞及び死滅細胞は、ＰＩ（赤色）を取り込み且つカルセイン−ＡＭを保持し得ない。フローサイトメトリーをベースとするアッセイは、ＨＥＭＣの懸濁液を使用したが（パネルＡ〜Ｄ）、共焦点顕微鏡実験は、ＨＭＥＣ単層を使用しており（パネルＥ〜Ｇ）、ＨＥＭＣの単層は、ヒストン損傷に対してより敏感である。

【図6】ヒストンによって誘発されるＨＭＥＣへの損傷に対するｍＣＢＳの保護効果は、濃度依存的であることを示すグラフである。培養したＨＭＥＣを、上昇する濃度のｍＣＢＳの添加後に４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いでフローサイトメトリーを使用してカルセイン−ＡＭ（生存）又はＰＩ（死滅）の取り込みに関して分析した。死滅／生存細胞をコントロール未処理細胞の％として表した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図7】１時間にわたりヒストンに曝露したＨＭＥＣの一部においてｍＣＢＳが損傷を反転させ得ることを示すグラフである。培養したＨＭＥＣを６０分にわたり４００μｇ／ｍｌのヒストンに曝露し、１０分にわたりｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、次いでフローサイトメトリーを使用してＰＩ取り込みに関して分析した。細胞毒性を、６０分にわたりヒストン（＋ｖｅコントロール）で処理した細胞によるＰＩ取り込みの割合として表した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図8】パネルＡ〜Ｃは、フローサイトメトリーのアウトプットのグラフを示し、パネルＤ〜Ｆは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集がｍＣＢＳにより防止されることを示す走査型電子顕微鏡観察の結果の図を示す。単離ヒトＲＢＣを、（Ａ及びＤ）処理なし後、（Ｂ及びＥ）６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション後及び（Ｃ及びＦ）６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）による処理、次いで１０分にわたるｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）への曝露後の凝集の程度に関して、ｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ自己蛍光（ＦＬ−１チャネル）パラメータを使用するフローサイトメトリーで分析するか、又は走査型電子顕微鏡を使用して可視化した。

【図9】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示すグラフである。単離ヒトＲＢＣを６０分にわたり様々な濃度のヒストンに曝露し（パネルＡ）、凝集の程度を、図８のように自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルにより測定した。４００μｇ／ｍＬのヒストンの添加前に様々な濃度のｍＣＢＳをＲＢＣに添加することを除いて（Ａ）と同様である（パネルＢ）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、コントロール（ヒストンが存在しない）との有意差を示し、Ｐ値は、＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図10】ｍＣＢＳは、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化する効果である、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害することを示すグラフである。６０％の生理食塩水（６：４の比率での通常の生理食塩水：水）で希釈した単離ヒトＲＢＣを６０分にわたり、上昇する濃度のヒストンと共にインキュベートし、次いでロボットシステム内において、４０回反復で次第に早い流速（ｍｍ／秒）に曝露する（パネルＡ）か、１００ｍｍ／秒の流速で様々な反復のピペッティングに曝露する（パネルＢ）か、又は様々な濃度のｍＣＢＳで処理し、次いで６０分にわたり且つ１００ｍｍ／秒のせん断流速及び４０回ピペッティング反復で４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露した（パネルＣ）。次いで、各サンプルからの上清を、ＲＢＣ溶解の程度の指標としてのＡ５４０ｎｍでのヘモグロビン含有量に関して測定した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、これまでの処理との有意差を示し、Ｐ値は、＜０５（^＊）、＜００１（^＊＊＊）及び＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図11】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣの溶解及び凝集に対する感受性を反転させることを示すグラフである。単離ヒトＲＢＣを５５分にわたり４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いで５分にわたり様々な濃度のｍＣＢＳに曝露した後（パネルＡ）、せん断力（１００ｍｍ／秒の流速及び４０回ピペッティング反復）を適用し、Ａ５４０ｎｍにより上清中のヘモグロビンの測定し、フローサイトメトリーを使用するＦＬ１での自己蛍光のレベルにより測定してＲＢＣ凝集の程度を分析した（パネルＢ）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、コントロール処理（ヒストンのみ、ｍＣＢＳは存在しない）との有意差を示し、全てのＰ値は、＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図12】ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される病理の効果的な阻害剤であるには、ｍＣＢＳの高レベル硫酸化が必要であることを示す。ａ．完全に硫酸化された（ヘプタ硫酸化）ｍＣＢＳと比較した、ジ−、トリ−、テトラ−及びペンタ−硫酸化ｍＣＢＳ調製物の構造。ｂ．ペンタ硫酸化ｍＣＢＳのみが、ＨＭＥＣ−１に関するヒストンによって媒介される細胞毒性を弱く阻害することを示す阻害曲線。ｃ．ヒストンによって誘発される赤血球脆弱性の阻害の調査時に得られた同様の結果。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）で表した。

【図13】ヒストンは、血小板の凝集及び脱顆粒を誘発し、且つこれらの効果は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳにより阻害され得ることを示すグラフである。（パネルＡ）単離ヒト血小板を１時間にわたり様々な濃度のヒストンと共にインキュベートした後、ＦＳＣ及びＳＳＣを使用するフローサイトメトリーによる凝集の分析により、単一の血小板と凝集した血小板とを識別した。（パネルＢ）（Ａ）と同様であるが、ヒストン（１５０μｇ／ｍＬ）の前に様々な濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ及び非硫酸化ＣＢを添加した。（パネルＣ）全血中のヒト血小板を、ケミルミノメトリ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）を使用して、上昇する濃度のヒストンの添加後の脱顆粒（ＡＴＰ放出）に関して分析し、陽性コントロールとしてトロンビンを含めた。（パネルＤ）ヒストンの添加（４００μｇ／ｍＬ）前に、上昇する濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ及び非硫酸化ＣＢを添加したことを除いて（Ｃ）と同様である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図14】ヒストンによって媒介される細胞に対する細胞毒性は、細胞表面のヘパラン硫酸を必要としない。ａ．懸濁液中のＨＭＥＣ−１を細菌ヘパリナーゼ１、２及び３（フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来）又はヒト血小板へパラナーゼのいずれかで処理した。次いで、未処理（ヒストン単独）及びヘパリン化した／へパラナーゼ処理したＨＥＭＣ−１の、ヒストンによって媒介される細胞毒性に対する感受性を決定した。ＨＭＥＣ−１からのヘパラン硫酸の酵素的除去は、ヒストンによって媒介される細胞毒性に対する細胞の感受性に影響を及ぼさず、処理は、ＨＭＥＣの生存率（Ｈｅｐ’ａｓｅのみ）にいかなる影響も及ぼさなかった。ｂ．野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＧＡＧ欠損ｐｇｓＡ−７４５ ＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁液を、上昇する濃度のヒストンと共に３７℃で１時間にわたりインキュベートし、フローサイトメトリーにより死滅細胞を検出した。ＧＡＧの非存在により、高ヒストン濃度で、ヒストン細胞毒性に対する細胞の感受性がごくわずかではあるが有意に減少した。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）で表した。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｉｄａｋの多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡ）。

【図15】ヒストンは、脂質二重層を破壊して細胞内Ｃａ^２＋流動を誘発するが、このプロセスは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳによりブロックされることを示す。ａ．ヒストン（ＨＩＳ）（１μｍ）単独（ｎ＝４７）又はＣＢＳ（ｎ＝５２）（１０μＭ）の存在下で曝露した人工脂質二重層の寿命。コントロール二重層（ｎ＝１２５）は、ＲμＲ１イオンチャネルタンパク質を含んだ。ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用してＰ値を算出した。ｂ．ヒストン添加（１００μｇｍｌ^−１）後のＣａ^２＋流動ＨＭＥＣ−１を示す、Ｃａ^２＋感受性色素Ｉｎｄｏ−１を使用する代表的なフローサイトメトリープロット。ｃ．ＨＭＥＣ−１による、ヒストンによって誘発されるＣａ^２＋流動へのｍＣＢＳ（１００μｇｍｌ^−１）の効果の時間経過。

【図16】ヒストンは、血液凝固を減少させることを示すグラフである。ＲＯＴＥＭ全血凝固分析（パネルＡ）を使用して、ヒト全血への増加するヒストン濃度の添加により、全てのアッセイで凝固時間が長くなったが、特にＮＡＴＥＭアッセイ及びＩＮＴＥＭアッセイで長くなった。（パネルＢ）凝固へのヒストンの同一の抗凝固効果を、血漿ベースの凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ））を使用して実証した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図17】全血凝固への硫酸化糖類の効果のＲＯＴＥＭ分析を示すグラフである。（パネルＡ）ＮＡＴＥＭ（非活性化）アッセイ、ＥＸＴＥＭ（外因性経路活性化）アッセイ、ＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化）アッセイ及びＦＩＢＴＥＭ（中和した血小板による外因性経路活性化）アッセイを実施する直前に全血にｍＣＢＳ、マルトトリオースサルフェート又はメレチトースサルフェート（２００μｇ／ｍＬ）を補充した。データは、水コントロ−ルの倍数増加として表される凝固時間を示す。（パネルＢ）様々な濃度のｍＣＢＳ、メレチトースサルフェート又はマルトトリオースサルフェートを補充した全血を、凝固時間に関してＮＡＴＥＭアッセイを使用して分析した。データが２０分での血餅振幅（ｃｌｏｔ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を示すことを除いて（Ｂ）と同様である（パネルＣ）。５０及び１００μｇ／ｍＬでは２種の三糖類により凝固が検出されなかった。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図18】ｍＣＢＳの抗凝固効果と、ヘパリン及び低分子量ヘパリンであるエノキサパリンとの比較を示すグラフである。ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、括弧内に示す濃度（μｇ／ｍＬ）でのヘパリン、エノキサパリン、三糖であるマルトトリオースサルフェート及びｍＣＢＳの添加後に全血凝固を測定した。

【図19】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発される全血凝固の混乱を阻害することを示すグラフである。ＥＸＴＥＭアッセイを使用して、４００μｇ／ｍＬ及び８００μｇ／ｍＬのヒストンによって誘発される凝固時間の延長を２００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳの事前の添加により阻害し得た。同量の水の添加は、阻害効果がなかった。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図20】ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される臓器損傷からマウスを保護することを示すグラフである。マウスに対し、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈注射の１０分前に、示した濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ若しくは非硫酸化ＣＢ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射した。４時間後、細胞傷害のマーカー（ＬＤＨ−乳酸デヒドロゲナーゼ）、肝臓機能障害のマーカー（ＡＬＴ−アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び腎臓機能障害のマーカー（Ｃｒｅａ−クレアチニン）の分析のために眼窩後から血液を採取した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡ）。

【図21】ｍＣＢＳは、循環している白血球、血小板及び赤血球のヒストンによって媒介される減少を弱めるか又は予防することを示すグラフである。マウスに対し、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈内注射の１０分前に１００ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射し、次いで１０分後に後眼窩出血させた。ＡＤＶＩＡ ２１２０血液システムを使用して、全血を白血球数、血小板数及び赤血球数並びにヘモグロビン濃度に関して分析した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、ＰＢＳ＋ＨＩＳコントロールとの有意差を示し、ｐ値は、＜０１（^＊＊）、＜００１（^＊＊＊）である（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡ）。

【図22】ｍＣＢＳは、中程度の敗血症によって誘発される細胞損傷からラットを保護することを示す。中程度の敗血症のラットモデルにおいて（パネルＡ）、ｍＣＢＳで処理した（ｍＣＢＳ）ラット及び未処理の（コントロール）ラットの生存率を示し、中程度の敗血症の動物モデルにおいて（パネルＢ）、ｍＣＢＳが細胞損傷（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ））を減少させることを示すグラフである。雄のＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝８／群）を、開腹して盲腸の結紮及び穿刺（ＣＬＰ）を行って、便性腹膜炎及びその後の敗血症を刺激し、次いで術後０、５及び１０時間でｉ．ｐ．注射により生理食塩水（コントロールＣＬＰ）又は５０ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳで処理し、２０時間にわたりモニタリングした。ラットが重度の病的状態に達すると、その時点で人道的に安楽死させ、死亡を記録した。パネルＡで見られるように、ｍＣＢＳで処理したラットは、１００％の生存率を示し、パネルＢで見られるように、ｍＣＢＳ処理は、コントロールＣＬＰ群のラットと比較して循環ＬＤＨレベルを有意に低下させた（統計解析：両側、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ≦０．０５）。

【図23】ＣＢＳは、重度の敗血症によって誘発される病的状態及び臓器損傷からラットを保護する。ａ．盲腸の結紮及び穿刺（ＣＬＰ）が行われ、生理食塩水（コントロール）及びＣＢＳが投与されたラット（ｎ＝８／群）の生存率。Ｐ値をＬｏｇ ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により得た。ｂ．それぞれＡＬＴ及びクレアチニンの血中レベルにより測定した、ＣＬＰラットにおける肝臓及び腎臓の損傷。

【図24】ＣＢＳは、心臓虚血再灌流傷害モデルにおける微小血管閉塞及び心筋壊死を減少させる。左心室（ＬＶ）での虚血域（ＩＺ）、微小血管閉塞（ＭＶＯ）及び心筋壊死（梗塞領域）を測定した、心臓ＩＲＩへのＣＢＳ（ｎ＝６／群）の効果。

【図25】ｍＣＢＳは、虚血再灌流後の組織弁の生存率を改善することを示す。筋膜弁を、血管茎を無傷のままにしてラット（ｎ＝３〜５／群）の腹部から切除し、栄養血管を１０時間にわたりクランプし、次いで解放した。クランプの適用５分前及びこのクランプの除去５分後、ｍＣＢＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水をｉ．ｐ．投与した。ラットを、術後２４時間及び４８時間で追加の化合物又は生理食塩水をラットにｉ．ｐ．投与した７２時間の総実験期間にわたりモニタリングした。示した代表的な写真による弁の壊死（黒くなったか又は赤くなった領域）の程度を用いて、弁の生存率を７２時間で決定した。

【図26】ＣＢＳは、ヒストンによって誘発される深部静脈血栓症を予防することを示す。マウス（ｎ＝８／群）の下大静脈（ＩＶＣ）を約１０％の開存性まで結紮し、その後、全てのマウスに尾静脈を介してヒストン（１０ｍｇ／ｋｇ）又は等量の生理食塩水をｉ．ｖ．注射し、続いて５分後にＣＢＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水をｉ．ｖ．注射した。マウスを４８時間にわたりモニタリングし、その後、再び麻酔して、ＩＶＣ狭窄の遠位で発症していた任意の血栓を分析のために取り出した。データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。^＊Ｐ≦０．０５。（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。

【図27】多発性硬化症モデルにおけるｍＣＢＳ活性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ／ＰＴで免疫付与して、ＥＡＥを誘発させた。０〜９日目に、ｍＣＢＳ又はＰＢＳのみ（ビヒクル）を毎日ｉ．ｐ．投与した。マウスを疾患の徴候に関して免疫付与後の１７〜３５日の期間にわたり毎日モニタリングした。ｍＣＢＳ処理（ｎ＝３６）及びビヒクル処理（ｎ＝３３）、ＥＡＥ誘発のみ（ｎ＝１４）、未処理コントロール（ｎ＝３２）の平均臨床スコア。データを、６個の独立してプールした実験から得ている。示しているのは、平均疾患スコア＋／−ＳＥＭである。統計的有意性を、Ｓｉｄａｋ−Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用して決定した。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本発明は、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩ）の処置又は予防における、化学的安定性が高い、改変されている硫酸化セロビオシド化合物の使用を対象とする。そのような化合物により、対象における細胞外ヒストンの細胞毒性効果を寛解させ得るか、又は阻害し得るか、又は予防し得る。

【0049】

便宜のために、下記のセクションは、本明細書で使用される用語の様々な意味を全体的に概説する。この議論後、本発明を例示する一般的な例示的実施形態を開示し、続いて本発明の様々な例示的実施形態の特性のより具体的な例示を提供する具体例を開示する。

【0050】

概要
本明細書で説明されている本発明は、本明細書で説明されている本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、具体的に説明されているもの以外に変形及び改変される余地があることを当業者は認識するであろう。本発明は、全てのそのような変形形態及び改変形態を含む。本発明はまた、個々に又はまとめて、本明細書で言及されるか又は示される全てのステップ、特徴、組成物及び構成要素と、前記ステップ又は特徴の任意の及び全ての組み合わせ又は任意の２つ以上とを含む。機能的に均等な製品、物質の組成及び方法は、明らかに、本明細書で説明されている本発明の範囲内である。

【0051】

上記参照又は下記参照のいずれかで本明細書で引用されている全ての刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、これは、これらの刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願が本文の一部として読まれるべきであり且つ見なされるべきであることを意味する。本文で引用されている任意の刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願を本文中で繰り返さないのは、単に簡潔さのためである。しかしながら、本明細書で言及されている刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願は、これらの刊行物で報告されており且つ本発明に関連して使用される可能性があるプロトコル、試薬及び生成物を説明及び開示するために引用されている。本明細書のいかなるものも、先行発明により又はあらゆる他の理由により、本発明がそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。これらの文献の日付に関する全ての記載又は内容に関する表示は、本出願人らが入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関していかなる承認も構成しない。

【0052】

本明細書で言及されているか又は参照により本明細書に組み込まれる任意の文献で言及されている任意の製品のあらゆる製造業者の指示書、説明書、製品仕様書及び製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、且つ本発明の実施で用いられ得る。

【0053】

本明細書で使用される選択された用語の定義は、本発明の要約及び本発明の詳細な説明内に見出され得、且つ全体を通して適用される。別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての他の科学用語及び技術用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用法と、本明細書に記載されているこの用語の定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、本明細書内に記載されている定義が優先されるものとする。

【0054】

定義
作業実施例又は別途指示されている場合を除いて、本明細書で使用されている成分又は反応条件の量を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」により修飾されていると理解すべきである。例えば、用語「約」は、百分率と関連して使用される場合、±１０％を意味し得る。

【0055】

別途文脈が必要としない限り又は本明細書が明確に反対のことを述べない限り、単数の整数、ステップ又は要素として本明細書で列挙されている本発明の整数、ステップ又は要素は、列挙された整数、ステップ又は要素の単数形及び複数形の両方を明確に包含する。本明細書全体を通して、別途述べない限り又は別途文脈が必要としない限り、単一のステップ、組成物若しくは物質、ステップの群又は物質の組成物の群への言及は、１つ及び複数（即ち１つ以上）の又はこれらのステップ、組成物若しくは物質、ステップの群又は物質の組成物の群を包含すると見なすものとする。従って、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。そのため、例えば、「硫酸化セロビオシドであって、その還元末端で小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩」への言及は、複数のそのような改変されている硫酸化セロビオシド化合物又は複数のその塩及び同類のものを含む。

【0056】

本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、別途文脈が必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」等のバリエーションは、述べられているステップ、若しくは要素、若しくは整数又はステップ、若しくは要素、若しくは整数の群の包含を暗示するが、あらゆる他のステップ、若しくは要素、若しくは整数又はステップ、若しくは要素、若しくは整数の群の排除を暗示しないと理解されるであろう。

【0057】

本明細書で使用される場合、用語「包含している」並びに「包含する」及び「包含される」等のバリエーションも限定的ではないと理解されるであろう。

【0058】

本出願では、「又は」の使用は、別途述べない限り「及び／又は」を意味する。

【0059】

本明細書で説明されている本発明は、１つ又は複数の範囲の値（例えば、サイズ、変位及び電界強度等）を含み得る。値の範囲は、この範囲を定義する値等のこの範囲内の全ての値と、この範囲の境界を定義する値に直接隣接する値と同一の又は実質的に同一の結果を導く、この範囲に隣接する値とを含むと理解されるであろう。例えば、関連分野の当業者は、範囲の上限又は下限の１０％変動が完全に適切であり得、且つ本発明に包含されることを理解するであろう。より具体的には、範囲の上限又は下限の変動は、５％であるか、又は当該技術分野で一般的に認識されているようにいずれかがより大きい。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「状態」、「病気」又は「疾患」（互換的に使用される）は、細胞外ヒストンの放出によって媒介される細胞外ヒストン関連の合併症を意味する。

【0061】

本明細書で使用される場合、語句「細胞外ヒストン関連の合併症」は、特に限定されることなく、ヒストンによって媒介される、（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば心血管疾患又は慢性心血管疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を意味する。

【0062】

本明細書で使用される場合、用語「敗血症」は、その意味において、標準的な医学参考文献で特徴付けられており、及び／又は当業者に既知である敗血症の疾患又は状態の全てのステージを含む。例えば、敗血症は、重度の敗血症、急性及び慢性の敗血症並びに敗血症性ショックを含む。用語「敗血症」は、本明細書で使用される場合、感染と関連するエピソードも含む。本明細書で使用される用語「ＳＩＲＳ」（全身性免疫反応症候群）は、感染と関連しないエピソード（例えば、外傷、熱傷、膵炎、臓器移植、手術、癌の治療レジーム後の腫瘍溶解、周産期合併症及び同種移植片の免疫抑制予防）を含む。

【0063】

本明細書で使用される場合、用語「敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態」又は「敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する疾患」は、それらの意味において、標準的な医学参考文献で特徴付けられており、及び／又は当業者に既知である敗血症又はＳＩＲＳの疾患又は状態の任意の又は全てのステージと直接的に又は間接的に関連するか、それに由来するか、それによって引き起こされるか又はそれを伴う全ての徴候及び症状を含む。例えば、敗血症又はＳＩＲＳと関連する医学的状態又は疾患として、感染の有無にかかわらず対象において現れる場合がある対象における敗血症又はＳＩＲＳの疾患又は状態の任意の又は全てのステージと関連するか、それに由来するか、それによって引き起こされるか又はそれを伴う下記の徴候又は症状の１つ又は複数が挙げられる：動脈性低血圧、代謝性アシドーシス、全身性血管抵抗減少、心拍数増加（頻脈）、呼吸速度増加（頻呼吸）、全体炎症若しくは全身性炎症、白血球数上昇若しくは白血球減少（白血球増加症又は白血球減少症）、血液中の細胞外ヒストンの増加、臓器機能不全、例えば急性臓器機能不全、循環系の機能不全、多臓器不全症候群、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、１種若しくは複数の臓器の微小血管系中でのフィブリンの沈着、発熱、錯乱、肺炎、肺炎を伴う咳、腎感染、腎感染を伴う排尿時痛及び／又は敗血症性ショック。

【0064】

本明細書で使用される場合、用語「低減する」、「低減した」、「低減」、「減少する」又は「阻害する」は、全て統計的に有意な量の減少を意味するために概して使用される。しかしながら、疑念を回避するために、「低減した」、「低減」若しくは「減少する」又は「阻害する」は、例えば、薬剤の非存在下で基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の減少を意味する。

【0065】

本明細書で使用される場合、用語「改善する」、「増加した」、「増加する」若しくは「増強する」又は「活性化する」は、全て統計的に有意な量の増加を概して意味するように使用され、あらゆる疑念を回避するために、用語「改善する」、「増加した」、「増加する」若しくは「増強する」又は「活性化する」は、例えば、薬剤の非存在下で基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加を意味し、例えば少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％）、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％の増加又は少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増加又は基準レベルと比較して２倍〜１０倍以上の任意の増加を意味する。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」、「投与した」及び「投与すること」は、所望の効果が生じるように、所望の部位での組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、この組成物の対象への配置を指す。本明細書で説明されている化合物又は組成物を、当該技術分野で既知の任意の適切な経路により投与し得、この経路として経口経路又は非経口経路が挙げられるが、これらに限定されず、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、経鼻投与、直腸投与並びに局所（例えば、頬側及び舌下）投与が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本化合物は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩である。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。上記化合物が治療用組成物又は治療用組成物等の組成物中に存在する場合、この化合物は、非経口投与のために調製されるか、又は標的部位への送達を可能にする別の他の方法のために調製される。いくつかの例示的な投与形態として、注射、注入、点滴、吸入又は経口摂取が挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

本明細書で使用される場合、用語「注射」は、下記を含むが、これらに限定されない：静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内の注射及び注入。好ましい実施形態では、本組成物を静脈内注入又は静脈内注射により投与する。

【0068】

本明細書で使用される場合、本明細書で列挙されている状態又は疾患のいずれかに関する限り、本発明に関連して、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」及び同類のものは、そのような状態又は疾患と関連する少なくとも１種の症状又は合併症の進行、悪化（ａｇｇｒａｖａｔｉｏ）、悪化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）、進行、予想される進行又は重症度を軽減するか、緩和するか、寛解させるか、阻害するか、減速させるか、反転させるか又は停止させることを意味する。ある実施形態では、状態又は疾患の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％緩和される。

【0069】

本明細書で使用される場合、語句「有効量」、「治療上有効な量」又は「有効用量」（本明細書では互換的に使用される）は、これらの意味において、本発明の化合物又は組成物の、所望の効果が生じるのに十分であるが、非毒性である量を含む。必要とされる化合物又は組成物の正確な量は、所望の効果、処置する種、対象の年齢及び全身状態、処置する状態の重症度、投与する薬剤、投与様式及び同類のもの等の因子に応じて対象毎に異なるであろう。そのため、正確な「有効量」を指定することは、不可能である。しかしながら、任意の所与の場合に関して、適切な有効量（用量）を、日常的な実験のみを使用して当業者により決定し得る。一般に、治療上有効な量は、対象の病歴、年齢、状態、性別及び対象の医学的状態の重症度及び種類並びに他の薬学的に活性な薬剤の投与により変化し得る。

【0070】

本明細書で使用される場合、治療用途又は医薬用途での化合物及び組成物の使用への言及は、ヒト用途及び非ヒト（例えば、獣医）用途にも同様に適用可能であることが理解されるであろう。従って、別途指示されている場合を除いて、「患者」、「対象」又は「個体」（本明細書では互換的に使用される）への言及は、ヒト又は非ヒト（例えば、社会的に重要な、経済的に又は研究上重要なあらゆる種の個体）を意味することが理解され、この個体として下記が挙げられるが、これらに限定されない：哺乳類、鳥類、ウサギ類、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類及び齧歯類の種。より好ましくは、患者、対象又は個体は、哺乳類の種に属する動物である。この哺乳類の種は、望ましくは、ヒト若しくは非ヒトの霊長類であるか、又はコンパニオン動物（例えば、家畜化されたイヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ若しくはブタ）である。特に好ましい一例では、患者、対象又は個体は、ヒトである。

【0071】

本明細書で使用される選択された用語の定義は、本発明の詳細な説明中に見出され得、且つ全体を通して適用される。別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての他の科学用語及び技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

【0072】

本発明の例示的実施形態
下記の本発明の詳細な説明は、本発明を例示する目的のためにのみ含まれており、上記に記載されているような本発明の広範な説明への限定として決して理解されるべきではない。

【0073】

１．本発明の化合物
本発明の第１の態様では、細胞外ヒストンによって媒介される合併症の処置での使用のための化合物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む化合物が提供される。この置換基は、同一のポリアニオンであるが、還元末端で硫酸化されているポリアニオンと比べて、分子に高い化学的安定性を付与する。好ましくは、このクラスの化合物は、高い正味の負電荷を有するはずである。

【0074】

本発明の化合物は、細胞外ヒストンによって媒介される合併症（例えば、敗血症又は虚血再灌流傷害）を、予防的（即ち医療処置に対する予防的前処置として）又はこの状態若しくは疾患が発生した後の処置中の治療的の両方で寛解させ得る。

【0075】

本発明のある実施形態では、この改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、全体構造：

【化2】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、例えばＯ又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルであり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ（ｉ）小さい非荷電Ｏ結合置換基、又は（ｉｉ）サルフェート基から選択される）
を有する。

【0076】

好ましくは、Ｒ１は、Ｏ又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである。好ましくは、Ｒ１は、Ｒ１でサルフェート基を有する同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0077】

好ましくは、Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれ（ａ）非改変ヒドロキシル基、又は（ｂ）サルフェート基から選択される。

【0078】

より好ましくは、Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択されるサルフェート基である。

【0079】

望ましくは、この化合物のクラスは、高い正味の負電荷を有し、即ちポリアニオンである。

【0080】

この小さい非荷電グリコシド置換基（Ｒ１）のアノマー配置は、α位又はβ位のいずれかであり得る。好ましくは、この小さい非荷電置換基は、β配置である。

【0081】

本発明の非常に好ましい形態では、本化合物は、硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖であるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート又はその薬学的に許容される塩である。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0082】

ｍＣＢＳは、ＣＢＳと比べて非常に安定しており、高用量で良好に耐容性である。ｍＣＢＳは抗凝固効果が最小限に抑えられており、ヒストンによって誘発される血漿凝固撹乱を減少させ得る。ｍＣＢＳの抗凝固活性は、低分子量ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。

【0083】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0084】

化学的安定性は、本明細書で使用される場合、本発明の化合物の、変化（具体的には自然環境中での分解又は空気、熱、光、圧力若しくは他の自然条件に曝露された際の分解又は内部反応に起因する分解）に抵抗する傾向を表す。

【0085】

本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べて有意に分解していない場合に「安定」である。

【0086】

本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に３個以上のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。好ましくは、本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に２個のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。最も好ましくは、本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に１個のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。

【0087】

好ましくは、本発明の化合物は、ｐＨ７．５に緩衝化されたリン酸塩製剤中に保存され且つ２〜８℃で保存された場合、少なくとも２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月又は２４ヶ月にわたり化学的に安定である。より好ましくは、ｐＨ７．５に緩衝化されたリン酸塩製剤中で保存され且つ約２〜８℃で保存されている化合物では、６ヶ月〜２年の期間にわたり安定性が測定される。

【0088】

本明細書で使用される場合、語句「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び同類のものを伴うことなくヒト及び下級動物の組織との接触での使用に適しており、且つ合理的な利益／リスク比に見合う塩を含む。

【0089】

薬学的に許容される塩は、当該技術分野で公知である。この塩として、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸及び同類のもの）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成されている）が挙げられる。同様に、タンパク質の遊離カルボキシル基で形成された塩も、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは第二鉄の水酸化物）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン及び同類のもの）に由来し得る。

【0090】

本発明の好ましい形態では、本発明の改変されている硫酸化セロビオシドは、薬学的に許容される塩として存在する。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩であり、即ちナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0091】

本発明の方法又は組成物で使用される、改変されている硫酸化セロビオシド化合物又はその薬学的に許容される塩は、当業者に既知の方法により調製され得る。例えば、硫酸化化合物であって、その還元末端において非荷電置換基で改変されている硫酸化化合物を調製する方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫａｔｒｉｎ Ｃ Ｐｒｏｂｓｔ ａｎｄ Ｈａｎｓ Ｐｅｔｅｒ Ｗｅｓｓｅｌ，２００１，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（７＆８）：５４９−５６０で概して説明されている。

【0092】

２．処置方法
本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の病理活性を寛解させ得るか又は予防し得ることから、本発明は、本発明の第２の態様として、細胞外ヒストン関連の合併症の処置又は予防の方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0093】

さらに、本発明の第３の態様では、対象における細胞外ヒストンの蓄積を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0094】

本発明の第２及び第３の態様により説明されているような本発明は、ヒストンの放出及びその結果として生じる細胞外毒性によって引き起こされる様々な異なる細胞外ヒストン病気を処置又は予防することを企図する。本発明のこれらの態様によれば、それぞれの方法を、下記を有する対象における細胞外ヒストン関連の合併症の処置又は予防に使用し得る：（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば心血管疾患又は慢性心血管疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病。

【0095】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、それぞれの方法は、本発明の化合物と同時に又はこの化合物に付随して、対象が罹患しているか又は罹患する可能性がある医学的状態のための補助的処置を提供する、本発明の化合物と異なる第２の治療薬（例えば、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は他の形態の医学的介入）を対象に投与することをさらに含み得る。

【0096】

好ましくは、本発明のこれらの態様の一例として、それぞれの方法は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳ又は敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する手段を提供する。本発明のこれらの態様の別の例として、それぞれの方法は、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する手段を提供する。

【0097】

好ましくは、この方法は、二次的な状態を処置するために医師が他の薬物を投与することを可能にするためにこの状態又は疾患状態を十分に寛解させる。そのため、本発明は、患者における細胞外ヒストン関連の合併症を寛解させる目的で、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を対象に投与することも含む。

【0098】

本発明の第２又は第３の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された方法は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っているか若しくは患うリスクがある１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の医薬組成物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を、この改変されている硫酸化セロビオシドと一緒に又はこの硫酸化セロビオシドに付随して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0099】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストン関連の合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ）及び／又はそのような合併症と関連する医学的状態若しくは疾患を対象とする処置に対して補助的処置を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0100】

好ましくは、第２の活性剤は、本発明の化合物によって処置される医学的病気に関連するか又はこの医学的病気と異なる、患者が患っている疾患の医学的介入の手段を提示し、前記第２の活性剤は、この患者に補助的処置を提供する。

【0101】

本明細書で開示されている本発明の治療用及組成物及び／又は医薬組成物を治療的又は予防的に投与し得る。治療用途では、化合物及び組成物を、細胞外ヒストン関連の合併症又はヒストン関連の合併症と関連する病気を既に罹患している患者に、この症状を治癒するか又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この化合物又は組成物を、単回用量において又は処置レジーム（例えば、複数回用量処置レジーム）の一部として、この患者を効果的に処置するのに十分な量の活性化合物で提供すべきである。予防的用途では、本発明の化合物及び組成物を、細胞外ヒストン関連の合併症と関連する病気を発症するリスクがある対象に、この病気の症状及び／又は合併症を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。

【0102】

本発明の第４の態様では、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理と関連する医学的状態、病気又は疾患を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。

【0103】

好ましくは、この硫酸化セロビオシドは、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）又はその薬学的に許容される塩である。

【0104】

好ましい一例では、この方法を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを処置する。

【0105】

本明細書で説明されているあらゆる態様、実施形態又は例に係る本発明の非常に好ましい例示的形態では、本発明の化合物を使用して、後に論じる病気又は状態の１つ又は複数を処置又は予防する。

【0106】

Ａ．敗血症
敗血症（敗血症性ショックを含む）とは、動脈性低血圧、代謝性アシドーシス、全身性血管抵抗減少、頻呼吸及び臓器機能不全を特徴とする、感染に対する全身反応のことである。敗血症（敗血症性ショックを含む）は、サイトカインネットワーク、白血球並びに補体及び凝固線維素溶解系を含む多くの宿主防御機構の活性化と関連し且つこの活性化によって媒介される、感染に対する全身炎症反応でもある。様々な臓器の微小血管系中に線維素が広範に沈着した播種性血管内凝固（ＤＩＣ）は、敗血症の初期症状の場合がある。ＤＩＣは、多臓器不全症候群の発症において重要なメディエータであり、敗血症性ショックの患者の予後不良の一因となる。

【0107】

敗血症を引き起こす免疫学的反応は、炎症及び凝固経路の広範な活性化を引き起こす全身性炎症反応である。これは、循環器系の機能障害に進行する場合があり、たとえ最適な処置を受けても多臓器不全症候群を引き起こし、最終的に死に至る場合がある。

【0108】

敗血症の症状は、基礎となる感染プロセスに関連することが多く、未処置まま放置すると、重度の敗血症（急性臓器機能不全を伴う敗血症）又は敗血症性ショック（難治性の動脈性低血圧を伴う敗血症）として現れる可能性がある。全身性炎症反応症候群の基準（例えば、全身の炎症、発熱、白血球数の上昇（白血球増多症）並びに心拍数の上昇（頻脈）及び呼吸速度の上昇（頻呼））の２つ以上が感染の証拠なく満たされる場合、患者は、全身に影響を及ぼす敗血症性炎症状態である「ＳＩＲＳ」と単に診断される場合がある。

【0109】

敗血症の多くの患者は、２４〜４８時間にわたる急速な衰弱を示す。敗血症の効果的な処置のために迅速な処置が不可欠である。残念ながら、感染のタイプの診断には、数日を要する場合がある病原体を同定するための微生物学的分析が必要である。従って、病原体を除去するための治療（例えば、抗生物質治療）は、病原体のタイプ及び種を知ることなく且つ感染の程度を知る手段がない状態で開始されなければならない。本発明は、そのような方法を提供する。

【0110】

敗血症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、敗血症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0111】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の敗血症を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0112】

本明細書で実証されているように、本発明の化合物（特にｍＣＢＳ）は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし、それにより敗血症の処置として有用である。

【0113】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と敗血症が発症した後の処置との両方を含む、敗血症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0114】

Ｂ．非感染性ＳＩＲＳ
非感染性の全身炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）は、全身に影響を及ぼす炎症状態である。非感染性ＳＩＲＳは、非感染性の侵襲に対する身体の反応である。ＳＩＲＳの定義は、非感染性ＳＩＲＳを「炎症性」の反応と称するが、非感染性ＳＩＲＳは、実際には炎症誘発性成分及び抗炎症性成分を有する。

【0115】

ＳＩＲＳは、全身の炎症、臓器機能障害及び臓器不全に関連する重篤な状態である。ＳＩＲＳは、サイトカインストームのサブセットであり、様々なサイトカインの異常な調節が存在する。ＳＩＲＳは、敗血症とも密接に関係しており、この敗血症では、患者は、ＳＩＲＳの基準を満たしており、且つ感染が疑われるか又は感染が証明されている。非感染性ＳＩＲＳの原因として、例えば外傷、手術、外傷性出血、熱傷及び急性膵炎が実例として挙げられる。

【0116】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の非感染性ＳＩＲＳを（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0117】

本明細書で実証されているように、本発明の化合物（特にｍＣＢＳ）は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし、それにより非感染性ＳＩＲＳの処置として有用である。

【0118】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と非感染性ＳＩＲＳが発症した後の処置との両方を含む、非感染性ＳＩＲＳにおける細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0119】

Ｂ．１ 外傷
身体外傷とは、重篤で身体が変わる身体的損傷（例えば、四肢の粉砕又は切断）のことである。

【0120】

鈍力外傷は、鈍器から又は鈍器により加えられる衝撃又は他の力によって引き起こされる身体外傷の一種であり、貫通性外傷は、物体が皮膚又は組織を貫く身体外傷の一種である。外傷は、事故等の無計画なもの又は手術の場合の計画的なものの両方としても説明され得る。両方とも軽度〜重度の組織損傷、出血及び／又はショックを特徴とし得、両方ともＳＩＲＳを引き起こす可能性があるが、その後の感染及び敗血症のリスクも著しく高める。

【0121】

ヒストンは、感染の非存在下において、外傷又は重度の細胞ストレス後に放出される。例えば、血清ヒストンレベルは、重度の非胸部鈍的外傷後に有意に上昇する。高い血清ヒストンレベルは、重度の合併症、発生率及び予後不良と正の相関がある。インビトロでは、外因性ヒストンは、様々なサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１０）の産生及び分泌を引き起こし、ミエロペルオキシダーゼの放出を刺激し、免疫細胞及び内皮細胞におけるカルシウム流入を増加させ、これにより、ヒストンによって誘発される細胞毒性が部分的に媒介される。インビボでは、ヒストン投与は、動物の外傷モデルにおいて、サイトカイン放出、内皮損傷、凝固活性化及び肺損傷も促進する。

【0122】

外傷を受けている患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、外傷の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0123】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の外傷を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0124】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため外傷患者での処置として有用である。

【0125】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と外傷性傷害が生じた後の処置との両方を含む、外傷における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0126】

Ｂ．２．手術
手術は、身体の機能若しくは外観の改善に役立つために又はときにいくつかの他の理由のために、疾患又は傷害等の病的状態を調査及び／又は処置するために患者に手術的な手技又は機器技術を使用する。本発明は、下記でさらに定義されるように、手術に起因する外傷に対処し得る。

【0127】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の外科的外傷を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0128】

概して、処置は、患者の組織の切除又は以前から持続する傷の縫合を伴う場合に手術と見なされる。必ずしもこの範疇に該当しない他の処置（例えば、血管形成術又は内視鏡検査）も、一般的な外科的処置又は外科的設定（例えば、無菌環境、麻酔、無菌条件、典型的な手術器具及び縫合又はステープリングの使用）を伴う場合に手術と見なされる場合がある。手術の全ての形態は、侵襲的処置と見なされるが、いわゆる非侵襲的手術は、通常、対象となる構造を貫通しない切除（例えば、角膜のレーザー焼灼術）又は放射線外科的処置（例えば、腫瘍の照射）を指す。

【0129】

本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させ得ることから、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と外科的傷害が生じた後の処置との両方を含む、外科的外傷での使用のための処置を提供する。

【0130】

Ｂ．３．外傷性出血
外傷性出血は、傷害の広範にわたる国際的影響の大半を占めており、死亡の大部分の原因となり、負傷者に大きい罹患率をもたらす。病院前救護の差異にもかかわらず、外傷性出血の急性期管理は、世界中で類似しており、十分に受け入れられる公表されたガイドラインに従う。重傷の患者のケアは、蘇生段階、手術段階及び救命治療段階の４つの多くの場合に重複するセグメントとして起こる。出血の診断及びコントロールは、外傷ケアの全ての段階で高い優先度であるべきであり、出血性ショックの状態である患者で特に重要である。出血コントロールの初期の試みは、直接圧迫、圧迫包帯又は止血帯による、目に見える重度の出血源の直接コントロール；長骨及び骨盤の骨折の安定化；並びに患者の保温を含む。蘇生段階では、温めた静脈内輸液、出血の外科的コントロール前の低血圧蘇生並びに血液及び血液製剤の適切な注入が行われる。手術段階では、出血及び任意の他の傷害の外科的コントロール並びに追加の輸血が行われる。最後に、救命治療段階では、術後のサポート及び組織潅流が提供される）。

【0131】

本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させ得ることから、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と外傷性出血が生じた後の処置との両方を含む、外傷性出血での使用のための処置を提供する。

【0132】

Ｂ．４．熱傷
熱傷は、熱、寒さ、電気、化学物質、摩擦又は放射線によって引き起こされる傷害であり得る。第１度熱傷は、通常、発赤（紅斑）、白斑及び受傷部位での軽度の痛みに限定される。この熱傷は、通常、表皮中にのみ広がる。第２度熱傷は、透明な液体でさらに満たされ、皮膚の表面に水膨れができ、且つ神経関与のレベルに応じて多少の痛みを伴う可能性がある。第２度熱傷は、表皮（真皮乳頭層）に及ぶが、深い真皮層（真皮網状層）にも及ぶ場合がある。第３度熱傷は、皮膚の炭化をさらに有し、硬くて革のような焼痂が生じる。焼痂とは、身体の影響を受けていない部分から分離している痂皮のことである。多くの場合、紫色の液体も存在する。このタイプの熱傷は、火傷した領域中では神経末端が破壊されていることから痛みを伴わないことが多い。深刻な熱傷（特に身体の広範な領域を覆う場合）は、死をもたらす可能性があり、（例えば、煙の吸入による）肺への熱傷のあらゆる兆候は、医療的緊急事態である。

【0133】

皮膚の下にある組織（例えば、筋肉又は骨）を傷つける熱傷は、第４度熱傷に分類されることがある。この熱傷は、下記のさらなる３段階に分けられる：皮膚が取り返しのつかないほど失われる第４度熱傷、筋肉が取り返しのつかないほど失われる第５度熱傷及び骨が炭化している第６度熱傷。

【0134】

様々な熱傷が細胞外ヒストンレベルの上昇につながり、その結果、毒性と関連している。この毒性がヒストンの細胞外作用により少なくとも部分的に引き起こされる限り、本発明は、本発明の医薬組成物を使用してこの毒性を低減し、それにより患者側の不快感を低減又は緩和し、さらにより高用量の治療を可能にしようとする。

【0135】

熱傷に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、熱傷の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0136】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象への熱傷によって引き起こされるヒストンによって誘発される細胞毒性を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0137】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため熱傷患者での処置として有用である。

【0138】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の熱傷における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0139】

Ｂ．５．急性膵炎
急性膵炎は、無菌性炎症及び腺房細胞死（例えば壊死及びアポトーシス）による膵臓の急速に発症する炎症を特徴とする。この点において、活性化免疫細胞における細胞外ヒストンによって媒介されるＨＭＧＢ１放出は、ＨＭＧＢ１膵臓条件付きノックアウトマウスにおけるｌ−アルギニン誘発性急性膵炎の原因となる。膵臓におけるＨＭＧＢ１の喪失により、広範な核損傷及び細胞死後の循環中へのヒストン放出が増加する。循環しているヒストンは、マクロファージを補充し、マクロファージの活性化及びさらなるＨＭＢＧ１放出をもたらす。

【0140】

急性膵炎は、その重症度に応じて、重度の合併症を有する可能性があり、処置にもかかわらず高い死亡率を有する可能性がある。軽症例では、保存的処置又は腹腔鏡検査による処置が成功することが多いが、重症例では、疾患プロセスを抑制するために侵襲的手術（多くの場合に複数の介入）が必要である。

【0141】

急性膵炎に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、急性膵炎の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0142】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の急性膵炎を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0143】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため急性膵炎患者での処置として有用である。

【0144】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と急性膵炎が発症した後の処置との両方を含む、急性膵炎における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0145】

Ｃ．虚血再灌流傷害
虚血再灌流傷害（例えば、移植関連の虚血再灌流傷害）及び薬剤介在組織傷害は、微生物の非存在下で起こるプロセスである無菌性炎症を生じる。

【0146】

虚血とは、組織への血液供給が制限され、細胞の代謝に必要な酸素が欠乏することである。長期にわたる虚血（６０分以上）では、ＡＴＰ代謝の分解産物としてヒポキサンチンが形成される。酵素キサンチンデヒドロゲナーゼは、酸素のより高い利用可能性の結果として、キサンチンオキシダーゼに変換される。この酸化により、分子酸素が、反応性がより高いスーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルに変換される。キサンチンオキシダーゼは、尿酸も産生し、この尿酸は、酸化促進剤と、ペルオキシニトライト等の反応種の捕捉剤との両方として作用する場合がある。再灌流中に生成された過剰な一酸化窒素は、スーパーオキシドと反応して強力な反応種ペルオキシナイトライトを生成する。そのようなラジカル及び活性酸素種は、細胞膜脂質、タンパク質及びグリコサミノグリカンを攻撃し、さらなる損傷を与える。このラジカル及び活性酸素種は、酸化還元シグナル伝達により特定の生物学的プロセスを開始する場合もある。

【0147】

再灌流傷害は、損傷した組織の炎症反応に部分的に起因する損傷を指す。新たに戻る血液により、この領域に運ばれた白血球は、インターロイキン等の炎症性因子のホストを放出し、組織損傷に反応してフリーラジカルも放出する。血流の回復により細胞内に酸素が再導入され、細胞のタンパク質、ＤＮＡ及び原形質膜が損傷を受ける。その結果、細胞膜への損傷がさらなるフリーラジカルの放出を引き起こす可能性がある。そのような反応種は、酸化還元シグナル伝達で間接的に作用してアポトーシスを活性化する。白血球も小さい毛細血管中に蓄積し、この毛細血管を閉塞させ、より多くの虚血を引き起こす。

【0148】

再灌流傷害は、脳卒中及び脳外傷に関与する脳の虚血性カスケードにも関与する。虚血及び再灌流傷害の発作の繰り返しも、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍等の慢性創傷の形成及び治癒不全につながる要因であると考えられている。連続的な圧力は、血液供給を制限して虚血を引き起こし、再灌流中に炎症が生じる。このプロセスが繰り返されるうちに、最終的に創傷が生じるのに十分な損傷を組織が受ける。

【0149】

血清ヒストンレベルは、肝臓、腎臓、肺及び脳の傷害を伴う動物の虚血再灌流モデルにおいて有意に上昇しており、これは、無菌性炎症の調節におけるヒストンの重要な役割を示唆する。実際に、循環しているヒストンは、いくつかの肝臓傷害モデル（例えば、コンカナバリンＡ誘発性肝傷害、アセトアミノフェン誘発性肝毒性、肝臓Ｉ／Ｒ及び急性肝不全）において、動物の死亡の主要なメディエータである。

【0150】

放出されると、ヒストンは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９２７等のＴｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）に選択的に結合して炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）を生じ、その結果、炎症反応及び組織傷害が促進される。

【0151】

細胞外ヒストンは、肝臓だけでなく、直接的毒性又は炎症促進効果を介して急性腎傷害又は虚血性脳卒中も媒介する。同様に、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４によって媒介されるシグナル伝達経路（例えば、ＭｙＤ８８、ＮＦ−κｂ及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ））は、細胞外ヒストンによって媒介される急性腎傷害の原因となる。

【0152】

ヒストン注入により脳梗塞のサイズが増大し、脳卒中の転帰が悪化する。急性肺傷害（ＡＬＩ）の動物モデル又は患者の気管支肺胞洗浄液では、血清Ｈ３及びＨ４レベルが顕著に増加している。

【0153】

まとめると、細胞外ヒストンは、ＤＡＭＰとして機能し、無菌性炎症及び臓器損傷を媒介する。ヒストンの放出及び活性の阻害は、組織傷害の治療戦略を提示する。

【0154】

虚血再灌流傷害（例えば、移植関連の虚血再灌流傷害）及び薬剤介在組織傷害に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0155】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連のＩＲＩ及び／又は薬剤介在組織傷害を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0156】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害の患者での処置として有用である。

【0157】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害が発症した後の処置との両方を含む、虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0158】

Ｄ．凝血及び血栓症
凝血は、血液が血餅を形成する生物学的プロセスである。正確な調節機構により、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）（出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ））又は閉塞性凝固（血栓症）のリスクの増加をもたらす異常な凝血が防止される。マウスでのヒストン投与は、例えば、血管バリアの喪失を伴う微小血管血栓症を増加させ、この微小血管血栓症は、多臓器の機能障害及び不全の一因となる。

【0159】

ヒストン（例えば、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３，及びＨ４）は、インビボ及びインビトロで血小板凝集及びその後の血小板依存性のトロンビン形成を誘発する。これらの中でも、Ｈ４は、血小板活性に最も強く影響を及ぼす。ヒストンは、ヒト血小板においてプロコアグラント表現型も誘発し、このプロコアグラント表現型は、トロンビンの生成を増強し、且つ血液凝固プロセスを促進する。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４は、シグナル伝達経路（例えば、ＥＲＫ、Ａｋｔ、ｐ３８及びＮＦ−κＢ）の活性化、カルシウム流入の誘発並びにフィブリノゲンの動員を介して、ヒストンによって媒介される血小板活性化に関与する。

【0160】

ヒストン−ＤＮＡ複合体は、トロンビン生成を増強するが、このプロセスは、ＡＰＣの投与により破壊される。ヘパリン及びアルブミンは、インビトロ及びインビボでヒストン毒性を中和し、ヒストン関連の血小板活性化も中和する。加えて、ヒストン注入によりマウスにおけるフォン・ヴィレブランド因子の血漿レベルが上昇し、血小板活性化及びその後の深部静脈血栓症の発症の一因となる。血小板以外にも、ヒストンは、プロテインＣ−トロンボモジュリン系を損なう。外因性ヒストンは、トロンボモジュリンの存在下において、血漿トロンビン生成を用量依存的に増加させる。興味深いことに、日本において播種性血管内凝固患者の処置に承認されている組換えトロンボモジュリン（ｒＴＭ）は、ヒストンに直接結合し、マウスでは致死性の血栓症からマウスを保護する。ヒストン毒性に対するｒＴＭの保護効果は、ＡＰＣ依存的方法及びＡＰＣ非依存的方法の両方によって媒介される。

【0161】

細胞外ヒストンによって引き起こされる凝血及び又は血栓症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、凝血及び又は血栓症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0162】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における凝血及び血栓症を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0163】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため凝血及び又は血栓症の患者での処置として有用である。

【0164】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と凝血又は血栓症が発症した後の処置との両方を含む、細胞外ヒストンタンパク質によって引き起こされる凝血及び又は血栓症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0165】

Ｅ．自己免疫／炎症性疾患
本発明は、多発性硬化症、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎又は乾癬等の様々な自己免疫及び／又は炎症性疾患状態の処置を企図する。これらの疾患の診断及び処置は、文献に十分に記述されている。

【0166】

ヒストンは、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、小型血管炎及び輸血関連疾患等のいくつかの自己免疫疾患及び自己炎症性疾患に関与している。自己免疫障害における直接的な自己抗原としての作用に加えて、細胞外ヒストンは、ヒストン−ＤＮＡ複合体の形成によりＤＮＡ分解を防止し得、これにより自己免疫反応が増強される。加えて、タンパク質アルギニンデアミナーゼ（例えばＰＤＡ４）は、ヒストンの脱イミノ化及びシトルリン化を媒介し、その結果、ヒストンの免疫原性が増加する。

【0167】

自己免疫及び／又は炎症性疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、自己免疫及び／又は炎症性疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0168】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における自己免疫及び／又は炎症性疾患を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0169】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため自己免疫及び／又は炎症性疾患の患者での処置として有用である。

【0170】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と自己免疫及び／又は炎症性疾患が発症した後の処置との両方を含む、自己免疫及び／又は炎症性疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0171】

Ｆ．急性呼吸促迫症候群
呼吸促迫症候群（ＲＤＳ）又は成人呼吸促迫症候群（ＩＲＤＳとは対照的）としても既知である急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）とは、肺への様々な形態の傷害に対する重篤な反応のことである。これは、透過性肺水腫の増加をもたらす最も重要な障害である。

【0172】

ＡＲＤＳは、様々な直接的侵襲及び間接的侵襲によって引き起こされる。ＡＲＤＳは、炎症、低酸素血症を引き起こし且つ多臓器不全を引き起こすことが多い炎症性メディエータの全身放出を伴うガス交換の障害につながる肺実質の炎症を特徴とする。この状態は、生命を脅かし、多くの場合に致死的であり、通常、人工呼吸器及び集中治療室への入院を必要とする。重症度が低い形態は、輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）等の急性肺傷害（ＡＬＩ）と呼ばれている。

【0173】

ＡＲＤＳは、傷害又は急性疾病の発作の２４〜４８時間以内に発症する可能性がある。そのような場合、患者は、通常、息切れ、頻呼吸及び根本的原因（即ちショック）に関連する症状を呈する。マラリア等の長期にわたる疾病がＡＲＤＳの引き金になる可能性もある。次いで、ＡＲＤＳは、特に急性感染の発症後しばらくしてから発症する場合がある。

【0174】

ＡＲＤＳに罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、ＡＲＤＳの病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0175】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の急性呼吸促迫症候群を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0176】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのためＡＲＤＳの患者での処置として有用である。

【0177】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置とＡＲＤＳが発症した後の処置との両方を含む、ＡＲＤＳにおける細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0178】

Ｇ．心血管疾患
心血管疾患は、心臓又は血管（動脈及び静脈）に関与する疾患のクラスを指す。この用語は、技術的には、心血管系に影響を及ぼすあらゆる疾患を指すが、通常、粥状動脈硬化（動脈疾患）に関連するものを指すために使用される。これらの状態は、原因、機序及び処置が類似している。

【0179】

心血管疾患の処置は、各患者における疾患の特定の形態に依存するが、効果的な処置は、上記で論じた予防的な生活様式の変化を常に含む。血圧を下げる薬物、アスピリン及びスタチン系コレステロール降下薬等の薬物が有用な場合がある。状況によっては、手術又は血管形成術により、損傷した血管を再開するか、修復するか又は置き換えることが正当化される場合がある。

【0180】

心血管疾患の様々な形態として、下記が挙げられる：動脈瘤、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、心筋症、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞及び静脈血栓塞栓。

【0181】

ヒストン関連の心血管疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、ヒストン関連の心血管疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0182】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の心血管疾患を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0183】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのためヒストン関連の心血管疾患の患者での処置として有用である。

【0184】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置とヒストン関連の心血管疾患が発症した後の処置との両方を含む、ヒストン関連の心血管疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0185】

Ｈ．網膜剥離
網膜剥離とは、網膜の神経層が網膜色素上皮から剥がれ落ちる眼の障害のことであり、通常、網膜破裂又は網膜裂傷によって引き起こされる。網膜剥離の患者の眼では、正常な眼と比べてヒストンの硝子体中濃度が高い。

【0186】

細胞外ヒストンは、毒性であり、ＴＬＲ４／ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２及びｐ３８）依存性経路を介してインビボ及びインビトロでＩＬ−８産生を誘発する。硝子体ヒアルロン酸は、ヒストンの拡散を阻害することにより、ヒストンによって媒介される毒性を低減する。そのため、瀕死の網膜から放出されたヒストンは、ＤＡＭＰとして作用して、炎症促進性サイトカインの放出を誘発し、且つ細胞毒性を媒介する可能性がある。

【0187】

網膜剥離に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、網膜剥離の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0188】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における網膜剥離を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0189】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため網膜剥離患者での処置として有用である。

【0190】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と網膜剥離が発症した後の処置との両方を含む、網膜剥離における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0191】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、熱傷対象者における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0192】

Ｉ．線維症
線維症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、線維症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0193】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象におけるヒストン誘発細胞毒性によって引き起こされる線維症を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0194】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため線維症患者での処置として有用である。

【0195】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と線維症が発症した後の処置との両方を含む、対象の線維症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0196】

Ｊ．糖尿病
糖尿病に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、糖尿病の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0197】

本発明は、糖尿病におけるヒストン関連の合併症（例えば、炎症及び創傷治癒の遅延）を処置する方法を提供する。この方法は、１型糖尿病、１．５型糖尿病又は２型糖尿病と診断されている対象に本発明の少なくとも１種の化合物の治療上有効な量を投与することを含む。

【0198】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象における糖尿病を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0199】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため糖尿病患者での処置として有用である。

【0200】

特定の実施形態では、ヒストンが関与している糖尿病の症状は、炎症である。炎症の減少を理学的検査及び炎症マーカーの存在の減少によりモニタリングし得る。

【0201】

特定の実施形態では、糖尿病を処置する方法であって、糖尿病を処置するために使用される薬剤と、本発明の少なくとも１種の化合物との治療上有効な量の投与を含む方法が提供される。糖尿病を処置するために使用される薬剤は、インスリンであり得るか、又は下記から選択される別の薬剤であり得る：ビグアナイド、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、液状メトホルミン（Ｒｉｏｍｅｔ）、徐放メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ ＸＲ、Ｆｏｒｔａｍｅｔ、Ｇｌｕｍｅｔｚａ）、スルホニル尿素、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ、Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ ＸＬ）、微粒子化グリブリド（Ｇｌｙｎａｓｅ）、メグリチニド（Ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ）、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、Ｄ−フェニルアラニン誘導体、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン（ＴＺＤｓ）、ピオグリタゾン、（Ａｃｔｏｓ）、ＤＰＰ−４阻害剤、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、サキサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ）、リナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ）、アルファ−グルコシダーゼ、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、胆汁酸捕捉剤、コレセベラム（Ｗｅｌｃｈｏｌ）、ピオグリタゾン及びメトホルミン（Ａｃｔｏｐｌｕｓ Ｍｅｔ）、グリブリド及びメトホルミン（Ｇｌｕｃｏｖａｎｃｅ）、グリピジド及びメトホルミン（Ｍｅｔａｇｌｉｐ）、シタグリプチン及びメトホルミン（Ｊａｎｕｍｅｔ）、サキサグリプチン及びメトホルミン（ｋｏｍｂｉｇｌｙｚｅ）、レパグリニド及びメトホルミン（Ｐｒａｎｄｉｍｅｔ）並びにピオグリタゾン及びグリメピリド（Ｄｕｅｔａｃｔ）。

【0202】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の糖尿病における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。従って、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と糖尿病が発症した後の処置との両方を含む、対象における糖尿病の処置を提供する。

【0203】

Ｋ．化学療法、放射線療法及びサイトカイン療法の毒性
様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン）は、癌患者において毒性を伴い、ときに重篤である。この毒性がヒストンの細胞外作用により少なくとも部分的に引き起こされる限り、本発明は、本発明の医薬組成物を使用してこの毒性を低減し、それにより患者側の不快感を低減又は緩和し、さらにより高用量の治療を可能にしようとする。

【0204】

様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用を罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、この副作用の重要なメディエータとして示唆されている。

【0205】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0206】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用の処置として有用である。

【0207】

本発明の非常に好ましい形態では、様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）を受けている患者における、そのような治療の副作用の処置で使用される化合物は、化合物β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート又はその薬学的に許容される塩である。例えば、この方法で使用される化合物は、ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである。

【0208】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と、様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）を行った後の処置との両方を含む、これらの治療の副作用における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0209】

Ｌ．創傷治癒
同様に提供されるのは、創傷治癒での使用のための方法である。本明細書で使用される場合、「創傷治癒」は、皮膚（又は別の臓器−組織）が傷害後に自己を修復する複雑なプロセスを指す。創傷治癒の古典的なモデルは、下記の３つ又は４つの連続した（さらに重複している）時期に分けられる：（１）血餅が止血した場合の止血、（２）炎症、（３）増殖、及び（４）再構築。皮膚が傷害を受けると、損傷を修復するために、一連の複雑な生化学的事象が、密接に組織化されたカスケードで起こる。炎症期中、白血球により、細菌及び細胞残屑が貪食されて創傷から除去される。血小板由来の成長因子（血小板のアルファ顆粒中に貯蔵されている）が創傷中に放出され、増殖期中に細胞の遊走及び分裂を引き起こす。増殖期は、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮化及び創傷収縮を特徴とする。新たな血管が形成され、線維芽細胞が成長し、コラーゲン及びフィブロネクチンが排泄されることにより新たな仮の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が形成される。同時に、表皮の再上皮化が起こり、上皮細胞が増殖して創傷床の上を「這い」、新たな組織のカバーを生成する。

【0210】

創傷治癒の困難さに悩まされている患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、創傷治癒の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0211】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象の創傷治癒中に生じるヒストン誘発細胞毒性を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0212】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため創傷治癒の困難さに悩まされている患者での処置として有用である。

【0213】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の創傷の処置における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0214】

Ｍ．中枢神経系疾患におけるヒストン
中枢神経系疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、中枢神経系疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。例えば、ハンチントン病は、ポリグルタミンの反復伸長によって引き起こされる常染色体優性の神経変性障害であり、ハンチントンタンパク質中のポリグルタミントラック（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｔｒａｃｋ）が伸長される。最近の証拠は、ヒストン改変によって媒介される転写脱制御がハンチントン病における重要な発病機序であることを示す。

【0215】

ヒストンデアセチラーゼ活性の薬理学的操作は、中枢神経系疾患（例えば、ハンチントン病、てんかん及びアルツハイマー病）の様々な実験モデルにおいて有益であった。神経細胞死、炎症反応及び反応性神経膠症は、主要な神経疾患のマーカーである。より最近の証拠は、細胞外ヒストンＨ１が、神経毒性のある炎症促進因子であり、中枢神経系で反応性神経膠症を引き起こすことを示す。これらの発見は、ヒストン改変及び細胞外ヒストンの両方が中枢神経系疾患の一因となることを示唆する。

【0216】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象におけるヒストンによって誘発される中枢神経系疾患を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0217】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため中枢神経系疾患での処置として有用である。

【0218】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と中枢神経系疾患が発症した後の処置との両方を含む、対象の中枢神経系疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0219】

３．治療形態及び医薬形態
本発明の第５の態様では、細胞外ヒストン関連の合併症の処置での使用のための治療用組成物又は医薬組成物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその治療上許容されるか若しくは薬学的に許容される塩を少なくとも含む治療用組成物又は医薬組成物が提供される。好ましくは、この組成物は、治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤を含む。この治療又は医薬での化合物は、中性遊離塩基形態であり得るか又は塩形態であり得る。好ましくは、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0220】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」又は「治療上許容される」は、合理的な利益／リスク比に見合っており、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わず、健全な医学的判断の範囲内でヒト及び動物の組織との接触での使用に適している化合物、物質、組成物及び／又は剤形を指す。

【0221】

投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に明らかであり、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．でより詳細に説明されている。

【0222】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」、又は「薬学的に許容される添加剤」、又は「薬学的に許容される希釈剤」、「治療上許容される担体」、又は「治療上許容される添加剤」、又は「治療上許容される希釈剤」は、ある臓器又は身体の部分から別の臓器又は身体の部分への対象化合物の担持又は輸送に関与する物質、組成物又はビヒクル（例えば、液体又は固体の充填剤、希釈剤、添加剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム、若しくはステアリン酸亜鉛、若しくはステアリン酸）又は溶媒カプセル化物質）を意味する。各担体、希釈剤及び添加剤は、製剤の他の成分と適合し且つ患者に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。これは、生物学的に又は他の方法で望ましくないものではない物質であり、即ち、この物質は、許容されない生物学的効果を引き起こすことなく又はこれが含まれる組成物の成分の任意の１つ又は複数と有害な方法で相互作用することなく、活性剤と共に個体に提供され得る。薬学的に許容される担体、希釈剤及び添加剤として機能し得る物質のいくつかの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン類、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク；（８）添加剤、例えばココアバター及び座薬ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル類、ポリカーボネート類及び／又はポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸；（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ；（２２）Ｃ_２〜Ｃ_１２アルコール、例えばエタノール；並びに（２３）医薬製剤で用いられる他の非毒性の適合性物質。製剤中に湿潤剤、結合剤、充填剤、潤滑剤、着色剤、崩壊剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、着香料、芳香剤、保存料、水、塩溶液、アルコール、抗酸化剤、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及び同類のものも存在し得る。「添加剤」、「担体」、「希釈剤」及び「薬学的に許容される単体」又は同類のもの等の用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0223】

治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤の例は、下記である：脱塩水又は蒸留水；生理食塩水；植物ベースの油、例えばピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、例えばピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油又はヤシ油；シリコーン油、例えばポリシロキサン類、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサン；揮発性シリコーン；鉱油、例えば流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアラン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール類、例えばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール類（ｌｏｗｅｒ ａｒａｌｋａｎｏｌｓ）；低級ポリアルキレングリコール類又は低級アルキレングリコール類、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン；脂肪酸エステル類、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラギーナン；トラガントガム又はアカシアゴム並びにワセリン。典型的には、担体は、組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成するであろう。

【0224】

本明細書で説明されている組成物は、医薬組成物中に従来見出される他の補助成分を、この補助成分の技術的に確立された使用レベルでさらに含み得る。そのため、例えば、この組成物は、追加の適合性の薬学的に活性な物質（例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬又は抗炎症剤）を含み得る。しかしながら、そのような物質は、添加された場合、本明細書で説明されている組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。

【0225】

下記で詳細に説明するように、本明細書で説明されている治療上許容されるか又は薬学的に許容される組成物は、固体又は液体の形態での投与のために特に製剤化され得、下記に適合したものが挙げられる：（１）経口投与、例えば水薬（水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸薬、錠剤（例えば、頬側吸収、舌下吸収及び全身吸収を目標とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒、舌への塗布のためのペースト；（２）例えば、滅菌溶液若しくは滅菌懸濁液又は徐放性製剤として、例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射又は硬膜外による非経口投与；（３）例えば、（脳中の）実質内投与、髄腔内投与、心室内投与若しくは肝内投与による、処置を必要とする臓器への直接注射；（４）例えば、皮膚に適用されるクリーム、ローション、ジェル、軟膏又は放出制御されたパッチ若しくはスプレーとしての局所適用；（５）吸入（例えば経鼻吸入若しくは経口吸入）による投与に適したエアロゾル形態；（６）例えば、ペッサリー、クリーム、座薬若しくは泡沫剤としての膣内用又は直腸内用；（７）舌下；（８）点眼薬としての眼用；（９）経皮用；（１０）経粘膜用；又は（１１）経鼻用。

【0226】

一実施形態では、本発明の組成物を非経口注射（例えば、皮下注射、筋肉内注射若しくは静脈内注射）等の注射により投与するか、又は例えば（脳中の）実質内投与、髄腔内投与、心室内投与若しくは肝内投与により組織及び臓器に局所投与する。

【0227】

注射に適した医薬組成物として、滅菌の水溶液（水溶性）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。理想的には、この組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、微生物（例えば細菌及び真菌）の夾雑作用に対してこの組成物を安定化させるための保存料を含み得る。

【0228】

上記で列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に、適切な溶媒に必要な量の本発明の医薬組成物を組み込み、必要に応じて続いて滅菌ろ過することにより、滅菌注射用溶液を調製し得る。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、液体１０００ｍｌに添加し得るか、又は提案されている注入部位で注射し得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照されたい）。

【0229】

注射溶液の場合、担体は、下記を含む溶媒又は分散媒体であり得る：例えば、水、リンゲル液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール（例えば１，２プロピレングリコール）及び液体ポリエチレングリコール並びに同類のもの）、これらの適切な混合物並びに植物油。

【0230】

例えば、レシチン等のコーティングを使用して、分散系の場合には必要な粒径の維持により且つ界面活性を使用して、適切な流動性を維持し得る。微生物の作用の予防を、様々な抗菌剤及び又は抗真菌剤を含むことにより達成し得る。適切な薬剤は、当業者に公知であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）及び同類のものが挙げられる。多くの場合、本組成物が等張剤を含むことが好ましい場合があり、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合がある。注射用組成物の持続的吸収を、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）をこの組成物に含めることによりもたらし得る。

【0231】

第２の実施形態では、本発明の組成物を例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に経口投与する。経口治療的投与のために、この医薬組成物を添加剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース及び同類なものの形態で使用し得る。

【0232】

経口使用に適した担体、希釈剤、添加剤、アジュバントの一部の例として、ピーナッツ油、液体パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントゴム、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン及びレシチンが挙げられる。加えて、これらの経口製剤は、適切な着香料及び着色料を含み得る。

【0233】

カプセル形態で使用する場合、このカプセルは、崩壊を遅延させる化合物（例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル）でコーティングされ得る。同様に、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル及び同類のものは、下記を含み得る：結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチン；添加剤、例えばリン酸二カルシウム；追加の崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸及び同類のもの；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；並びに甘味料、例えばショ糖、ラクトース若しくはサッカリン又は着香料、例えばペパーミント、冬緑油若しくはサクランボ香料（ｃｈｅｒｒｙ ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）。

【0234】

投与単位形態がカプセルである場合、このカプセルは、上記のタイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質は、コーティングとして存在し得るか、又は他の方法でこの投与単位の物理的形状を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルをシェラック、糖又は両方でコーティングし得る。

【0235】

経口投与のための液体形態（例えばシロップ又はエリキシル）は、上記の薬剤に加えて、液体担体、甘味料（例えばショ糖）、保存料（例えばメチルパラベン及びプロピルパラベン）、色素並びに香料（例えば、サクランボフレーバー又はオレンジフレーバー）を含み得る。適切な液体担体として下記が挙げられる：水、油、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、紅花油、落花生油、ヤシ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール類、トリグリセリド類又はこれらの混合物。

【0236】

経口投与のための懸濁液は、分散剤及び／又は懸濁剤をさらに含み得る。適切な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤として下記が挙げられる：レシチン、ステアリン酸等の脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート若しくはジオレエート、ステアレート又はラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート若しくはジオレエート、ステアレート又はラルレート及び同類のもの。経口投与のための乳濁液は、１種又は複数の乳化剤をさらに含み得る。適切な乳化剤として、上記で例示したような分散剤又は天然ガム、例えばグアーガム、アカシアガム若しくはトラガカントゴムが挙げられる。

【0237】

第３の例示的な実施形態では、本発明の組成物をエアロゾルの形態において又は吸入投与により対象の気道に直接投与する。エアロゾルとしての使用のために、本発明の薬学的に許容される組成物の溶液又は懸濁液を適切な噴霧剤（例えば、プロパン、ブタン又はイソブタンのような炭化水素噴霧剤）及び従来のアジュバントと一緒に加圧エアロゾル容器に充填し得る。そのような組成物を（例えば、ネブライザ又はアトマイザ中での）非加圧形態でも投与し得る。

【0238】

気道への送達のためのエアロゾルは、当該技術分野で既知である：例えば、Ａｄｊｅｉ，Ａ．ａｎｄ Ｇａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１：５６５−５６９（１９９０）；Ｚａｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｌａｍｍ，Ｊ−Ｗ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１１４：１１１−１１５（１９９５）；Ｇｏｎｄａ，Ｉ．“Ａｅｒｏｓｏｌｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ，”ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６：２７３−３１３（１９９０）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４０：１３１７−１３２４（１９８９））を参照されたい。

【0239】

第４の例示的な実施形態では、本組成物をリポソームの形態で投与し得る。リポソームは、一般に、リン脂質又は他の脂質物質に由来し、水性媒体中に分散している単層状又は多層状の水和液晶で形成されている。リポソームを形成し得る、非毒性で生理的に許容されて代謝可能なあらゆる脂質を使用し得る。リポソーム形態の組成物は、安定剤、保存料、添加剤及び同類のものを含み得る。好ましい脂質は、リン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であり、両方とも天然及び合成である。リポソームを形成するための方法は、当該技術分野で既知であり、これに関して、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６），ｐ．３３ ｅｔ ｓｅｑ．（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）が具体的に参照される。

【0240】

加えて、本明細書で説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る本発明の治療的又は薬学的に許容される組成物を徐放性調製物及び徐放性製剤に組込み得る。そのような治療用組成物又は医薬組成物は、酸の加水分解を最小限に抑えるために、適切な緩衝剤をさらに含み得る。適切な緩衝剤は、当業者に公知であり、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0241】

本発明の化合物を「プロドラッグ」の形態で投与し得る。プロドラッグとは、インビボで活性型に変換される不活性型の化合物のことである。適切なプロドラッグとして、活性型の化合物のエステル類、ホスホン酸エステル類等が挙げられる。

【0242】

加えて、本発明の組成物を患者に移植し得るか、又は薬物送達システムを使用して注射し得る。コーティングされた送達デバイスも有用であり得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号明細書；同第６，７４７，０１４号明細書；及び同第３５３，２７０，９６０号明細書を参照されたい。

【0243】

特定の実施形態では、例えば創傷の処置のプロセスで使用されるデバイス又は包帯を使用して、本組成物を送達する。

【0244】

任意の特定の対象のための、本明細書で開示されている医薬組成物の治療上有効な量は、様々な因子に依存し、この因子として下記が挙げられる：この医薬組成物の毒性及び治療効果；病気の重症度；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与時間；投与経路；この組成物の捕捉率；処置の持続期間；医学で公知の他の関連因子と一緒に、処置と組み合わせて又は同時に使用される薬物。

【0245】

毒性及び治療上の有効性を、例えばＬＤ_５０（母集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ_５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定し得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０で表され得る。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。

【0246】

本明細書で説明されている細胞培養アッセイ及び動物モデルから得られたデータを、ヒトでの使用のための治療上有効な投与量の範囲の策定で使用し得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。この投与量は、用いられる投与形態及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。

【0247】

剤形を生成するために担体物質と組み合わされ得る、本明細書で説明されている本発明の化合物の量は、概して、治療効果を生じるこの化合物の量であるであろう。一般に、１００％の内、この量は、約０．１％〜９９％の化合物の範囲であり、好ましくは約５％〜約７０％の範囲であり、最も好ましくは１０％〜約３０％の範囲であるであろう。

【0248】

投与量は、医師により決定され得、且つ必要に応じて処置の観察された効果に適合するように調整され得る。実例のみとして、組成物を、薬学的に許容される組成物が下記の用量で投与されるように投与し得る：１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ。ここで示された範囲は、全ての中間範囲を含むことを理解すべきであり、例えば範囲１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇは、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ等を含む。上記で示されたものの中間の範囲（例えば、範囲１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇでは、２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ等の用量範囲）も、本明細書で説明されている方法及び組成物の範囲内であることをさらに理解すべきである。

【0249】

本発明の化合物がｍＣＢＳ又はｍＣＢＳ．Ｎａである場合、投与量は、１０〜８００μｇ／ｍｌであり得る。好ましくは、この投与量は、５０〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。より好ましくは、この投与量は、ヒト対象に投与される場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０又は８００μｇ／ｍｌである。

【0250】

本発明の特定の例では、改変されている硫酸化セロビオシド化合物の有効量を単回用量で投与する。特定の例では、この用量を繰り返し投与する。即ち、処置レジメンは、疾患の重症度及びタイプ、患者の全体的な健康状態及び年齢並びに処置する医師が考慮すべき様々な他の条件に応じて変わるであろう。処置の持続時間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、典型的には、対象をモニタリングして、処置が治療上の有益性をいつ提供するかを決定し、且つ投与量を増減させるかどうか、投与頻度を増減させるかどうか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうか又は処置レジメンに他の変更を行うかどうかを決定する。

【0251】

本明細書で説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る本発明の治療用組成物又は薬学的に許容される組成物は、単回のボーラス投与で投与され得るか又は複数回の用量若しくは処置で投与され得、且つ少量の治療用組成物が長期間にわたり持続的に投与される「持続的」治療により適用され得る。

【0252】

複数回投与が処置（持続的治療を含む）で使用される場合、治療用組成物又は医薬組成物を、いくつかの臨床的因子（例えば、この治療用組成物又は医薬組成物で使用される改変されている硫酸化セロビオシド化合物に対する対象の感受性）に応じて１週間に１回〜毎日で変化し得る投与スケジュールにより投与するであろう。そのようなレジームで投与する所望の用量を一度に単回用量として送達し得るか、又は部分用量（例えば、２〜４回の部分用量）に分割して、ある期間にわたり（例えば、１日中を通して適切な間隔又は他の適切なスケジュールで）投与し得る。そのような部分用量を単位剤形として投与し得る。

【0253】

いくつかの実施形態では、投与は、慢性的であり、例えば数週間又は数ヶ月の期間にわたり１日１回又は複数回の用量である。投与スケジュールに例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月若しくは６ヶ月又はより長い期間にわたり１日１回、１日２回、１日３回又は１日４回以上の投与である。

【0254】

所望の用量を、連続的注入を使用するか又は放出制御製剤による送達を使用して投与し得る。この場合、各部分用量に含まれる医薬組成物は、１日当たりの総投与量を達成するために相応に少なくなければならない。

【0255】

また、投与量単位を、例えば数日の期間にわたる医薬組成物の持続放出をもたらす従来の徐放性製剤を使用して、数日にわたる送達のためにも配合し得る。徐放性製剤は、当該技術分野で公知であり、例えば本明細書で説明されている薬剤により使用され得る、ある部位への薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、この投与量単位は、１日当たりの用量の対応する倍数を含む。

【0256】

４．併用レジーム
本発明の第５の態様に係る特定の例示的な実施形態では、特定された組成物は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物を含む場合がある。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、望ましくは、敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0257】

治療上の利点を併用レジメンにより実現できる場合がある。本発明の特定の実施形態では、説明されている方法は、予防的に送達される際、患者が有しているか、又は罹患しているか、又は有する若しくは罹患するリスクがある敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的処置である第２の活性剤を本発明の処置と同時に又は付随して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0258】

第２の活性剤として、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0259】

実例として、本方法又は本処置が、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症性疾患状態又は非敗血症性疾患状態を処置するか又は寛解させることに向けられている場合、この方法は、細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う医学的状態のための補助処置を提供する第２の抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入を同時に又は付随して対象に投与することも含み得る。

【0260】

一例では、第２の活性剤は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患（例えば、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患）のための補助的処置又は補助的予防を提供する。

【0261】

別の例では、第２の活性剤は、細胞外ヒストン細胞毒性を伴う医学的状態のための補助的処置又は補助的予防を提供する。

【0262】

実例として、本処置方法が、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩを関連する敗血症性疾患状態又は非敗血症性疾患状態を処置するか又は寛解させることに向けられている場合、この方法は、細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う医学的状態のための補助処置を提供する第２の抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入を同時に又は付随して対象に投与することも含み得る。

【0263】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗炎症剤であり、例えばステロイド、副腎皮質ステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アスピリン又はこれらの任意の組み合わせである。より具体的には、投与される追加の薬剤は、下記からなる群から選択される抗炎症剤であり得る：アルクロフェナク；プロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド（Ａｌｇｅｓｔｏｎｅ Ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）；アルファアミラーゼ；アムシナファル（Ａｍｃｉｎａｆａｌ）；アムシナフィド（Ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カプロフェン；シクロプロフェン；ジンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラク；プロピオン酸クロチカソン（Ｃｌｏｔｉｃａｓｏｎｅ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；酢酸コルメタソン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デスオキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン、ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモル（Ｆｅｎａｍｏｌｅ）；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサル；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルクアゾン（Ｆｌｕｑｕａｚｏｎｅ）；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカソン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；酢酸ハロプレドン；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール（Ｉｎｄｏｘｏｌｅ）；イントラゾル（Ｉｎｔｒａｚｏｌｅ）；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロモキシカム（Ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリゾン（Ｍｅｃｌｏｒｉｓｏｎｅ Ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ）；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソル（Ｎａｐｒｏｘｏｌ）；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；桂皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピプロフェン；プレドナゼート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）；プリフェロン；プロドリック酸；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリト；サルコレックス（Ｓａｌｃｏｌｅｘ）；サルナセジン；サルサラート；サルシレート（Ｓａｌｙｃｉｌａｔｅ）；塩化サンギナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；チキソコルトールピバレート；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート（Ｔｒｉｆｌｕｍｉｄａｔｅ）；ジドメタシン；グルココルチコイド；ゾメピラックナトリウム；及びこれらの組み合わせ。

【0264】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗生物質製剤であり、例えばカナマイシン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド及び／又はテトラサイクリンである。

【0265】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗ウイルス剤であり、例えば非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド類似体）、プロテアーゼ阻害剤及び／又はヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤である。

【0266】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗真菌剤であり、例えばイミダゾール、トリアゾール、チアゾール、アリルアミン及び／又はエキノキャンディン化合物である。

【0267】

いくつかの例では、投与される追加の薬物は、糖尿病を処置するための薬剤である。そのような薬剤として、糖尿病の処置のための及び又は抗高血糖活性を有するための、当該技術分野で既知の薬物が挙げられ、例えば下記が挙げられる：ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）の阻害剤（例えば、アログリプチン、リナグリプチン、サキサグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチン及びベルベリン）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン、ブホルミン及びフェンホルミン）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータ、例えばチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）（例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン及びトログリタゾン）、デュアルＰＰＡＲアゴニスト（例えば、アレグリタザル、ムラグリタザル及びテサグリタザル）、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリピジド、グリキドン、グリクロピラミド及びグリメピリド）、メグリチニド（「グリニド」）（例えば、ナテグリニド、レパグリニド及びミチグリニド）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及び類似体（例えば、エキセンジン−４、エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド）、インスリン及びインスリン類似体（例えば、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリングラルギン、インスリンデテミル、エクスベラ及びＮＰＨインスリン）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール及びボグリボース）、アミリン類似体（例えばプラムリンチド）、ナトリウム依存性グルコース共輸送体Ｔ２（ＳＧＬＴ Ｔ２）阻害剤（例えば、ダパグリフロジン、レモグリフロジン及びセルウグリフロジン）並びに他のもの（例えば、ベンフルオレックス及びトルレスタット）。

【0268】

説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する疾患若しくは状態の処置のための併用治療アプローチの一部として投与され得ることを当業者は認識するであろう。併用治療では、各薬剤を同時に投与し得るか又は任意の順序で逐次投与し得る。逐次投与する場合、各成分を同一経路で投与することが好ましい場合がある。

【0269】

２種の薬剤が別々に適用されるいくつかの例では、両方の薬剤が、有利に組み合わされた効果を依然として発揮し得るように、各送達の時間の間に有意な期間が失効しなかったことが概して保証されるであろう。そのような例では、両方の治療法が互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に概して投与されることが企図され、約１２時間のみの遅延時間が最も好ましいが、いくつかの状況では処置のための時間を大いに延ばすことが望ましい場合があり、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６又は７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）経過する。また、薬剤の複数回の投与が望ましいであろうことも考えられる。

【0270】

本発明の組成物と第２の活性剤とを別々の組成物で投与する場合、投与経路は、異なり得る。例えば、本発明の組成物を、当該技術分野で既知の任意の適切な経路（例えば、限定されないが、経口経路又は非経口経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、経鼻投与、直腸投与並びに局所（例えば、頬側及び舌下）投与）で投与し、第２の薬学的に活性な薬剤を別の経路（例えば、前記薬学的に活性な薬剤の投与のために当該技術分野で一般に使用される経路）で投与する。非限定的な例では、本発明の組成物を注射により投与し得、第２の活性剤を経口投与し得る。

【0271】

５．薬物の製造
本発明の第６の態様では、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0272】

例えば、本発明の第６の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0273】

そのような使用の一実施形態では、この薬物は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳを処置するためのものであるか、又は対象における敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置は、前記敗血症若しくはＳＩＲＳ又は前記敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する前記状態若しくは疾患を寛解させるか又は阻害する。

【0274】

そのような使用の別の実施形態では、この薬物は、対象におけるＩＲＩを処置するためのものであるか、又は対象におけるＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置は、前記ＩＲＩ又は前記傷害と関連する前記状態若しくは疾患を寛解させるか又は阻害する。

【0275】

そのような使用のさらに別の実施形態では、この薬物を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを中和する。

【0276】

さらに別の実施形態では、製造された薬物は、第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量も含み得る。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための補助的治療を提供する。望ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される。より好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0277】

本発明の方法のいずれかで、改変されている硫酸化セロビオシド化合物を使用する場合、この化合物を、単回用量の製剤において、それを必要とする対象に投与し得るか、又はそれを必要とする対象への投与のために製剤化し得る。特定の代替実施形態では、この改変されている硫酸化セロビオシド化合物を、複数回用量の製剤として、それを必要とする対象に投与するか、又はそれを必要とする対象への投与のために製剤化する。

【0278】

好ましくは、対象への投与ために、本治療用組成物又は医薬組成物は、薬学的に許容される組成物として提供される。この形態の場合、（１）この組成物は、１種又は複数の薬学的に許容される担体（添加剤（ａｄｄｉｔｉｖｅ））、及び／又は希釈剤、及び／又は添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と一緒に薬学的に製剤化され、（２）この組成物中の改変されている硫酸化セロビオシド化合物は、中性又は塩の形態で製剤化され得る。

【実施例】

【0279】

本発明を下記の非限定的な実施例でさらに説明し、この実施例は、例証のみを目的として提供され、本明細書全体を通して本明細書の開示の一般性を制限すると解釈すべきではない。

【0280】

実施例１：ｍＣＢＳ・Ｎａの調製方法
β−Ｏ−メチルセロビオシドを、Ｊｏｎ Ｋ Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，５７：１９７−２０５により説明されているように調製する。

【0281】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）化合物及びナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）化合物を、Ｋａｔｒｉｎ Ｃ Ｐｒｏｂｓｔ ａｎｄ Ｈａｎｓ Ｐｅｔｅｒ Ｗｅｓｓｅｌ，２００１，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（７＆８）：５４９−５６０（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により説明されているように調製した。

【0282】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）を下記の概要に従って調製した。

【化3】

【0283】

ステップ１：α−Ｄ−セロビオース１（１１６ｇ、３３８ｍｍｏｌ）及び氷酢酸（１．６Ｌ）の混合物に、室温で臭化アセチル（３００ｍＬ、５００．０ｇ、４０６５ｍｍｏｌ、１２．０当量）を添加した。得られたクリーム状の混合物を、この反応混合物が、反応の完了を示す透明な溶液に変わるまで、４５〜５５分にわたり６０℃で加熱した。

【0284】

この熱い溶液を、割れた氷（４ｋｇ）が入っているビーカ（１０Ｌ）に慎重に注ぐ。この混合物を、白色固体が沈殿するまで撹拌する（約１０分）。冷水の別の一部（１Ｌ）を添加し、１０分にわたり撹拌し続ける。

【0285】

焼結漏斗でろ別し、固体を冷水で洗浄した（７００ｍＬ×３回）。得られた漏斗中の固体をＤＣＭ（１Ｌ）に溶解させ、この漏斗をＤＣＭで洗浄した（３００ｍＬ×２回）。まとめたＤＣＭ層をブライン（１．５Ｌ）で洗浄し、ＤＣＭ（０．５Ｌ）で逆抽出した。最終ＤＣＭ層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、２時間以内に＜３５℃において減圧下で濃縮して、次のグリコシル化に直接使用する目的の臭化物２（１７２．５ｇ、７４．３％収率）を得た。

【0286】

ステップ２：ｐｅｒ−Ｏ−アセチル化セロビオシルブロミド２（１７１ｇ、２５０ｍｍｏｌ）、無水ＤＣＭ（８００ｍＬ）、無水ＭｅＯＨ（８００ｍＬ）、活性化３Ａモレキュラーシーブ（７０ｇ）の混合物に炭酸銀（Ａｇ_２ＣＯ_３、７５ｇ、２７５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。得られた混合物を１６時間にわたり光の非存在下で撹拌した。この混合物をシリカのプラグに通して精製し、ＥｔＯＡｃで溶出した。集めた画分を濃縮して褐色固体として粗生成物を得、この粗生成物を次のステップに直接使用した。化合物３のＲ_ｆ＝０．２８（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、１：１）。

【0287】

ステップ３：ステップ２で得られた粗生成物及び無水ＭｅＯＨ（１Ｌ）の混合物に室温でＮａの小片（１．７２ｇ、０．３当量、７５ｍｍｏｌ）を添加した。その後まもなく、溶液から白色固体が沈殿し始めた。得られた混合物を一晩撹拌して、脱アセチル化を確実に完了させた。最終懸濁液をろ別し、ＭｅＯＨで洗浄した（３００ｍＬ×２回）。白色固体を集め、一晩にわたり真空下で乾燥させて、最終セロビオシド４（７２．５ｇ、２段階で８１．４％）を得た。

【0288】

【化4】

ステップ４の合成及び精製の手順：
ステップ４ 化合物４（８４．０ｇ、２３６ｍｍｏｌ）、ＳＯ_３．ＴＭＡ（３６７．４ｇ、２．６４ｍｏｌ、１１．２当量）、無水ＤＭＦ（３１４０ｍＬ）及び無水ＤＣＥ（７６７ｍＬ）の混合物をＡｒ下で３回脱気し、２時間にわたり８０〜９０℃で加熱した。（反応のモニタリング：１０分にわたる加熱後、クリーム状の混合物が透明な溶液に変化した。３０分後、この溶液は再び濁った。５０分後、フラスコの表面上に、凝集した固体を観察した）。冷却後、得られた混合物を低温室（−５℃）に移し、一晩沈降させて溶媒から固体を完全に凝集させた。化合物４から５への完全な変換を１Ｈ−ＮＭＲで確認した。この溶液を排水管にデカントする。粗固体をろ別し、ＤＣＭで２〜３回洗浄した。得られた固体を脱イオン水に溶解させ、イオン交換カラム［ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８のＮａ形態：樹脂（Ｈ^＋形態）３ｋｇをガラス製重力カラムに予め充填し、１ＭのＮａＯＨ（−６Ｌ）の溶出により再生し、脱イオン水（−１２Ｌ）で中和した］に直接かけた。集めた画分を濃縮し、ガラス状固体として最終的な硫酸化セロビオシド６（２３２．１ｇ、９２．０％）を得た。

【0289】

実施例２：ｍＣＢＳ・Ｎａ化合物の安定性研究
安定性研究を５±３℃、２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨ℃条件で実行した。ＨＰＬＣにより、製剤化した臨床材料（即ちリン酸緩衝液中のｍＣＢＳ）中において、ｍＣＢＳ及びセロビオースサルフェート（ＣＢＳ）の両方のレベルを追跡した。ｍＣＢＳ及びＣＢＳの開始量（Ｔ＝０）に対するこれらのパーセント（％）変化のグラフ化により、経時的にｍＣＢＳのレベルが非常に安定していることが分かった。対照的に、ＣＢＳのレベルは非常に急激に下がり、約３ヶ月でほぼなくなっている。実際の安定性プロファイルは促進条件（即ち２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨ）で類似しており、ＣＢＳの消失速度は、より速いように見える。２ロットの製剤からのｍＣＢＳ対ＣＢＳの安定性の差異の一例を図１に示す。このデータは、ＣＢＳは水溶液中で非常に不安定であるが、ＣＢＳの還元末端にメチル基を付加することにより、水溶液中で非常に安定である分子（ｍＣＢＳ）が得られることを示す。

【0290】

加えて、安定性試験において様々なｍＣＢＳ製剤を試験した。これらの実験のデータから、ｍＣＢＳの安定性は、使用する緩衝液によって差が出ないことが分かった。表１は、使用する緩衝液に関するｍＣＢＳの様々な製剤の組成を示す。

【0291】

【表1】

【0292】

表２ａは、様々な製剤の緩衝能力に応じてｐＨが経時的に変化することを示し、且つ酢酸緩衝液による製剤のｐＨが、たとえ約５±３℃であっても約ｐＨ７．５に留まらないことを示すが、このデータ自体は、この期間中のｍＣＢＳ安定性の差異を示す。

【0293】

【表2】

【0294】

表２ｂは、２４ヶ月にわたり−２０℃で貯蔵した場合のバルク粉末の代表的なバッチにおけるｍＣＢＳレベルとＣＢＳレベルとを比較する。Ｔは、月数が単位の時間であり、Ｔ＝０又はＴ０は、製造完了時に実行した分析結果を示す。示した後続の分析は、薬物の粉末又は製剤の最初の分析と相対的である（例えば、Ｔ１＝製造日から１ヶ月）。ＣＡＤ（荷電化粒子検出器）を用いる分析方法を使用して、ｍＣＢＳの純度及びその不純物のレベルを測定し、ＣＡＤ％で表した。

【0295】

【表3】

【0296】

表２ｃは、１８ヶ月超にわたり２〜８℃で貯蔵した場合のリン酸緩衝化ｐＨ７．５臨床試験材料製剤の代表的なバッチにおけるｍＣＢＳレベルとＣＢＳレベルとを比較する。

【0297】

【表4】

【0298】

上記の表２ｂ及び２ｃは、１８〜２４ヶ月にわたる様々な条件下での貯蔵後の粉末又は溶液のいずれかにおけるｍＣＢＳ及びＣＢＳのレベルを示す。ＣＢＳは、これらの調製物中において低レベルの不純物として現れる。結果は、ＣＢＳは、レベルが経時的に顕著に変化するようには見えないことから、−２０℃で貯蔵した場合には粉末中で安定しているように見えることを示す。しかしながら、水性緩衝溶液中では、ＣＢＳは非常に不安定であり、レベルは、２〜８℃での３〜６ヶ月の貯蔵以内に０．０３ＣＡＤ％（即ち検出限界）まで低下する。対照的に、ｍＣＢＳのレベルは、経時的に顕著に変動するようには見えず、粉末中に又は溶液中に保存した場合には高い安定性を示すように見える。

【0299】

様々な緩衝製剤中におけるｍＣＢＳの２８日後のＨＰＬＣ分析（表３）も実行した。ｍＣＢＳは、たとえ促進条件２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨであっても、リン酸緩衝液中における又はクエン酸緩衝液中における２８日後の変動が公称のわずか−／＋約２％であるように見え、良好な安定性を示す。

【0300】

【表5】

【0301】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及び薬物動態プロファイルの前臨床動物研究
下記の実施例３〜１０は、本発明で使用されるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及び薬物動態（ＰＫ）プロファイルの、本発明者らが行った動物における例示的な前臨床研究を概説する。

【0302】

実施例３：動物研究で用いたｍＣＢＳ・Ｎａ化合物
この実施例は、後に説明する動物で行った毒性及びＰＫ研究で用いるナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ・Ｎａ）化合物の特性を示す。

【0303】

下記で説明するＳＴＸ研究を、特に本発明で使用されるｍＣＢＳ・Ｎａ等のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及びＰＫプロファイルの予備的な理解を提供するために実行した。この研究を、同一のロットの化合物を使用して実行し、この化合物の特性を下記の表４にまとめる。

【0304】

【表6】

【0305】

実施例４：β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの用量及び濃度
通常、本明細書で説明されている毒性及びＰＫの動物研究では、ｍＣＢＳのナトリウム塩を使用した。しかしながら、本明細書で概説されている生物学的分析測定は、ｍＣＢＳの遊離塩基形態を検出して報告したことに留意すべきである。従って、明確性のため、生物学的分析結果との関係を明確にするために、本明細書では、遊離塩基としての用量／濃度も報告している。ナトリウム含有量（塩形態に対する遊離塩基のＭＷの比率に基づく）及び試験物の純度を補正することにより、ｍＣＢＳ遊離塩基の用量を得た。しかしながら、いずれの用量（即ちナトリウム塩又は遊離塩基）も、バッチ中の化合物の効力を考慮していない。

【0306】

実施例５：β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの効力
上述したように、報告したｍＣＢＳの動物に投与した用量又は濃度は、効力（即ち含水量及び他の不純物）に関して補正しておらず、なぜなら、この研究を実行している間、使用したバッチ中のｍＣＢＳのナトリウム塩（即ちｍＣＢＳ・Ｎａ）の効力分析を決定しなかったからである。これらの研究で使用したバッチのその後の分析は、それ以降、ナトリウム塩の効力が約７４．５％であることを示している。これらの実施例で使用した実際の用量は、指示したものと比べて少なかった可能性が非常に高い。

【0307】

実施例６：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与後のｍＣＢＳの毒性
この実施例は、１週間の用量範囲探索（ＤＲＦ）研究におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの単回ボーラス用量の静脈内投与後のｍＣＢＳの急性毒性の評価と、７日にわたるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへのボーラス用量の毎日の静脈内投与後のｍＣＢＳの毒性の評価とを示す。

【0308】

この研究では、ｍＣＢＳ・Ｎａ及び遊離塩基としてのｍＣＢＳの用量を最初に調べた。この効力評価から、最大耐量（ＭＴＤ）の推定値は、ｍＣＢＳのナトリウム塩の場合には約７４５ｍｇ／ｋｇであり、ｍＣＢＳ遊離塩基の場合には約６００ｍｇ／ｋｇであった可能性が高い。

【0309】

１週間の用量範囲探索（ＤＲＦ）研究におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの単回ボーラス用量の静脈内投与後のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の急性毒性の評価
この研究では、最大１０００ｍｇ／ｋｇの用量でのラットにおけるｍＣＢＳの単回ＩＶ投与からの急性毒性を調べた。

【0310】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の急性毒性を単回ボーラス用量の静脈内投与後にＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。この用量範囲探索研究では、ナトリウム塩の形態でのｍＣＢＳ試験物（ｍＣＢＳ・Ｎａ）の１０、３０、１００、３００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量において、ｎ＝３の成体の雌ラットの合計５つの群を処理した。純度及びナトリウム含有量の補正により、これらの用量レベルは、ｍＣＢＳ遊離塩基の約８．２、２４．５、８１．５、２４４．５及び８１５ｍｇ／ｋｇに相当した。次いで、このラットを、剖検することなく終了前７日にわたり観察した。ｍＣＢＳ試験物による処理は、１０００ｍｇ／ｋｇ用量までの全ての用量レベルで良好な耐容性を示した。処理に関連すると考えられる所見はなかった。

【0311】

従って、この研究からのｍＣＢＳ・Ｎａの最大耐量（ＭＴＤ）又は急性耐量は１０００ｍｇ／ｋｇと特定し、これは、ｍＣＢＳ遊離塩基の８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。異常な所見又は（コントロール動物と比較した）体重の変化は観察しなかった。

【0312】

７日にわたるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへのボーラス用量の毎日の静脈内投与後のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の毒性の評価
この研究では、最大１０００ｍｇ／ｋｇの用量での７日にわたるラットにおけるｍＣＢＳの反復ＩＶ投与からの毒性を調べた。

【0313】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの急性耐容性及び毒性を７日の期間にわたる毎日の静脈内用量投与後のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。この反復用量研究では、ナトリウム塩の形態のｍＣＢＳ（ｍＣＢＳ・Ｎａ）の０、１００、３００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量において、ｎ＝３の成体の雌ラットの合計４つの群を処理した。純度及びナトリウム含有量の補正により、これらの用量レベルは、ｍＣＢＳ遊離塩基の約８１．５、２４４．５及び８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。次いで、このラットを終了前７日にわたり観察し、肉眼による剖検並びに終末の血液分析及び生化学分析を行った。ｎ＝３の雄ラットの追加の群も、同一の研究デザインに従って１０００ｍｇ／ｋｇの最高用量で処理した。

【0314】

ｍＣＢＳは、１０００ｍｇ／ｋｇ用量までの全ての用量レベルで良好な耐容性を示した。処理に関連すると考えられる有害な所見はなかった。処理した動物における血学的パラメータ及び生化学的パラメータは目立たないものであった。肉眼による剖検及び病理で観察した影響は、処理との関連はないと考えられた。

【0315】

従って、この研究におけるＭＴＤは１０００ｍｇ／ｋｇと特定し、これは、ｍＣＢＳ遊離塩基の８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。

【0316】

実施例７：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与後のｍＣＢＳの薬物動態
この実施例は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与したｍＣＢＳの薬物動態（ＰＫ）の評価を示す。

【0317】

下記の研究は、ｍＣＢＳのナトリウム塩及び遊離塩基の両方として報告するｍＣＢＳの用量を示す。後者は、特にｍＣＢＳ（遊離塩基）の測定した血漿レベルと投与した用量とを関連付ける場合且つクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）等の終末期ＰＫパラメータを決定するために重要であると考えられる。ＳＴＸ−０９研究は、約２５及び５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのラットにおける５時間の連続注入にわたりｍＣＢＳの血漿中濃度を示す。

【0318】

Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内経路で投与したβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの薬物動態研究
この研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるｍＣＢＳのボーラスＩＶ投与（２０ｍｇ／ｋｇ）ＰＫプロファイルを調べ、化合物のほとんどが迅速に排出され、投与した用量の９０％超が最初の４時間で中央コンパートメントから除去されており、投与した用量の残余のｍＣＢＳがより長い期間をかけてゆっくりと除去されることを示す。大きい分布容積は、ｍＣＢＳ化合物が中央コンパートメントから組織に迅速に移動していることを示す。

【0319】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の薬物動態を、ヘプタナトリウム塩の形態でのｍＣＢＳのナトリウム塩（ｍＣＢＳ・Ｎａ）としての２０ｍｇ／ｋｇのボーラス用量（又はナトリウム含有量及び純度に関する調整後の１６．３ｍｇ／ｋｇの遊離塩基）の静脈内投与後、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。

【0320】

効力を考慮して、このラットに投与した用量は、ナトリウム塩及び遊離塩基のそれぞれに関して１４．９ｍｇ／ｋｇ及び１２．６５ｍｇ／ｋｇである可能性が高いと推定した。補正したｍＣＢＳ遊離塩基の用量は約２０％低かったことから、これにより、算出したクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）の値は、同様の割合で効果的に減少した。

【0321】

投与前から投与後４８時間までの範囲の時点で３匹のラットから合計１０個の血液サンプルを採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳ（遊離塩基）の濃度に関して分析した。血漿中濃度対時間のデータを薬物動態パラメータの算出に使用した。

【0322】

時間ゼロ（Ｃ０）でのｍＣＢＳ濃度の平均（±ＳＥＭ）値は、７３４００（±８５６０）ｎｇ／ｍＬであった。時間ゼロから最後に測定した時点（ＡＵＣｌａｓｔ）までの及び無限大（ＡＵＣｉｎｆ）までの曲線下面積の平均（±ＳＥＭ）値は、それぞれ３４３００（±２４６０）ｎｇ．時間／ｍＬ及び３５０００（±２９４０）ｎｇ．時間／ｍＬであった。見かけ上の排出半減期（Ｔ１／２）の平均（±ＳＥＭ）値は７７．５（±５４．５）時間であったが、平均残留時間（ＭＲＴ）の平均（±ＳＥＭ）値は５．５８（±３．９９）時間と比較的短かった。分布容積（Ｖｚ）の平均（±ＳＥＭ）値は４６．９（±３０．７）Ｌ／ｋｇと高く、全身クリアランス（Ｃｌ）の平均（±ＳＥＭ）値は０．４７２（±０．０３７７）Ｌ／時間／ｋｇと低かった。Ｔ_１／２（１２２％ＣＶ）、Ｖｚ（１１３％ＣＶ）及びＭＲＴ（１２４％ＣＶ）の高い対象者間変動は、対数線形濃度対時間曲線の終末消失部分の不完全なキャラクタリゼーションに起因している可能性が最も高かった。

【0323】

Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内経路で投与したｍＣＢＳの薬物動態研究
この研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるボーラスＩＶ投与（１００ｍｇ／ｋｇ）後のｍＣＢＳのＰＫを調べた。

【0324】

ｍＣＢＳの薬物動態を、６匹のラットの群へのナトリウム塩の形態でのボーラス１００ｍｇ／ｋｇ用量のｍＣＢＳ（又はナトリウム含有量及び純度に関する補正後の８１．５ｍｇ／ｋｇの遊離塩基）の静脈内投与後、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。

【0325】

効力を考慮して、このラットに投与した用量をナトリウム塩及び遊離塩基のそれぞれに関して７４．５ｍｇ／ｋｇ及び６３．２５ｍｇ／ｋｇであると推定した。補正したｍＣＢＳ遊離塩基の用量は約２０％低かったことから、これにより、算出したクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）の値は、同様の割合で効果的に減少した。

【0326】

投与前から投与後１９２時間までの範囲の時点で各ラットから合計９個の血液サンプルを採取した。最初の４８時間にわたり尿サンプルも採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理した。その後、尿サンプル及び血漿サンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳ（遊離塩基）の濃度に関して分析した。

【0327】

ｍＣＢＳに関する血漿薬物動態パラメータの推定値を、プールした平均濃度対時間のデータから得た。時間ゼロ（０）での濃度は３０８，０００ｎｇ／ｍＬであった。時間ゼロから最後に測定した濃度（ＡＵＣｌａｓｔ）の時間までの曲線下面積及び無限大（ＡＵＣｉｎｆ）まで外挿された場合の曲線下面積は両方とも、１３５，０００ｎｇ．時間／ｍＬであった。１．４３時間の平均残留時間（ＭＲＴ）とは対照的に、見かけ上の終末排出半減期（Ｔ１／２）は５６．１時間であった。この化合物は、４９．０Ｌ／ｋｇという比較的高い分布容積（Ｖｚ）を示したが、終末全身クリアランス（Ｃｌ）は０．６０５Ｌ／時間／ｋｇと比較的低かった。

【0328】

ｍＣＢＳ遊離塩基に関する尿中薬物動態物質収支の推定値を、排泄された尿量のデータから得た。投与後０〜４時間、０〜２４時間及び０〜４８時間の採取間隔で排泄されたｍＣＢＳの総用量の割合の平均（±ＳＥＭ）値は、それぞれ５２．０（±５．０）％、６５．０（±７．０）％及び６９．２（±１０．８）％であった。尿の排泄は、投与後最初の４８時間における化合物の排出のための主要な経路として特定されている。

【0329】

この研究は、ｍＣＢＳが、投与直後に中央コンパートメントから迅速に除去され、大きい分布容積により示されているように組織に吸収されることを確認した。この化合物の分布半減期（これは、排出の主要な決定因子である）は０．６５時間であると推定した。終末期の多重サンプリングにより、終末排出半減期のキャラクタリゼーションが改善され、この終末排出半減期は約５６時間であると算出した。

【0330】

ｍＣＢＳを静脈内注入により投与したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける薬物動態研究
この研究は、約２５及び５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのラットにおける５時間の連続注入にわたりｍＣＢＳの血漿中濃度を調べた。

【0331】

雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの５時間にわたる注入としての静脈内投与後、ｍＣＢＳの薬物動態（ＰＫ）を研究した。この研究では、静脈内注入後にｍＣＢＳ化合物の薬物動態を調査した。この化合物を、ハルトマン溶液を使用して製剤化し、２５．３ｍｇ／ｋｇ／時間の割合でｎ＝３のラットの群に投与し（総用量：１２６．５ｍｇ／ｋｇ；群１）、且つ５０．６ｍｇ／ｋｇ／時間の割合でｎ＝３のラットの第２の群に投与した（総用量：２５３ｍｇ／ｋｇ；群２）。

【0332】

この研究では、５時間にわたる連続注入に使用したｍＣＢＳナトリウム塩の名目上の用量は、４０及び８０ｍｇ／ｋｇ／時間（又は遊離塩基としてそれぞれ３４及び６８ｍｇ／ｋｇ／時間）であった。

【0333】

投与前から注入の開始後５時間までの範囲の時点で各ラットから合計６個の血液ＰＫサンプルを採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳの濃度に関して分析した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアを使用して、０〜５時間の注入間隔をかけて濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）の値を推定した。定常状態の濃度（Ｃｓｓ）及びクリアランス（Ｃｌ）の値も推定した。

【0334】

ｍＣＢＳの濃度は、用量投与前に採取した血漿サンプルではアッセイの定量限界未満であり、投与後３０分〜５時間に採取した全ての血漿サンプルでは濃度が定量可能であった。０〜５時間の注入間隔の平均（±ＳＥＭ）ＡＵＣ値は、群１及び群２それぞれに関して２６０，０００（±３０，２００）ｎｇ．時間／ｍＬ及び５３２，０００（±２５，５００）ｎｇ．時間／ｍＬであった。群１のＣｓｓ及びＣｌの平均（±ＳＥＭ）値は、群１に関して５８，４００（±６，９２０）ｎｇ／ｍｌ及び０．６０１（±０．０８１）ｌ／時間／ｋｇであったが、群２のＣｓｓ及びＣｌの平均（±ＳＥＭ）値は、１２０，０００（±５，５６０）ｎｇ／ｍｌ及び０．５７１（±０．０２５）であった。

【0335】

これらの結果は、ｍＣＢＳが２時間の注入後に定常状態の血漿レベル（Ｃｓｓ）に達したことを示す。５０ｍｇ／ｋｇ／時間で処理したラットにおける両方のＣｓｓ及びＡＵＣは両方とも、２５ｍｇ／ｋｇ／時間で処理したラットと比べて２倍高く、これは、全身曝露が、この研究で使用した用量に比例することを示す。凝固試験は、より高い用量のｍＣＢＳで処理したラットは基準範囲と比べてＡＰＴＴスコアが高いことを示し、これは、この用量でのｍＣＢＳの存在により凝固時間が長くなることを示す。

【0336】

実施例８：ヒト、イヌ及びラットにおけるｍＣＢＳの血漿タンパク質への結合及び代謝のインビトロでの調査
この実施例は、ｍＣＢＳの代謝及び血漿タンパク質結合を調べるために実行したインビトロ研究を示す。具体的には、この研究で、ヒト、イヌ及びラットの肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝を調べ、ｍＣＢＳの代謝を検出しないと結論付けた。同様に、この研究で、限外ろ過技術を使用してヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質へのｍＣＢＳの結合を調べ、試験した全ての種において血漿タンパク質への結合が約２０％であると結論付けた。

【0337】

ヒト、イヌ及びラットの肝ミクロソームにおけるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのインビトロでの代謝
要約すると、この研究は、ラット、イヌ及びヒトの肝ミクロソームによるｍＣＢＳの第Ｉ相及び第ＩＩ相の代謝を調べるために設計されたインビトロでの調査であった。結果は、ｍＣＢＳの代謝を検出しなかったことを示す。

【0338】

（ｉ）ヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームにおけるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの第Ｉ相代謝
水中の５０％メタノールに溶解させた２５μＭのｍＣＢＳのストック濃縮物を反応管に入れた（１０μＬ）。反応混合物（最終体積２５０μＬ）は下記を含んだ：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’−ホスフェート（ＮＡＤＰＨ）（１ｍＭ）及びプールしたヒト、ラット又はイヌの肝ミクロソーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）。５分間のプレインキュベーション期間後にＮＡＤＰＨを添加することにより反応を開始させ、振盪水浴中において３７℃でインキュベートした後、氷冷アセトニトリル５００μＬで停止させた。次いで、サンプルをボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離した。サンプルの半分（３７５μｌ）をガラス管に移し、窒素流下で及び３７℃において蒸発させた。次いで、サンプルを移動相Ａ（２５０μＬ）中で再構成した。ｍＣＢＳの最終濃度は、インキュベーション媒体中で１μＭであった。

【0339】

この反応混合物を１時間にわたりインキュベートし、０、１５、３０、４５及び６０分の時点で三重にサンプリングした。研究サンプルと並行して陰性コントロール（ＮＡＤＰＨなし）を使用した。陽性コントロール；ミダゾラム、２５μＭ（１０μＬ）を１時間にわたり同一条件下でインキュベートした。ミダゾラムの最終濃度は、インキュベーション媒体中で１μＭであった。

【0340】

【表7】

【0341】

（ｉｉ）生物分析：ｍＣＢＳの較正曲線
水中の５０％メタノール中のｍＣＢＳ（３０μｇ／ｍｌ−遊離塩基として）及びミダゾラム（１０μｇ／ｍｌ）の混合ストック溶液を、水中の５０％メタノールを使用して、ｍＣＢＳの場合には２５、２０、１２．５、６．２５、２．５、１．２５、０．２５及び０．１２５μｇ／ｍｌに希釈し、且つ８３３３、６６６７、４１６７、２０８３、８３３、４１７、８３．３、４１．７ｎｇ／ｍｌに希釈し、ワーキング標準溶液のアリコート（１０μＬ）をプラスチック管に入れた。次に、この管にリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）のアリコート（１９０μＬ）及びミクロソームのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液（５０μ）を入れ、続いてアセトニトリルのアリコート５００μＬを入れた。管をボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離した。上清のアリコート（３７５μＬ）を窒素流下で蒸発させ、移動相Ａ（２５０μＬ）中で再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＣシステムに直接注入した（１０μＬ）。

【0342】

（ｉｉｉ）ヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの第ＩＩ相代謝
メタノール（５０μＬ）に溶解させた１ｍｇ／ｍｌのｍＣＢＳのストック濃縮物を反応管中で蒸発乾固させ、１００μＭの最終濃度において反応混合物に再懸濁させた。混合物（最終体積２５０μｌ）は下記を含んだ：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）、ウリジン５’−ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）（５ｍＭ）、肝ミクロソーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）及びアラメチシン（２５μｇ／タンパク質ｍｇ）。５分間のプレインキュベーション期間後にＵＤＰＧＡを添加することにより反抗混合物を開始させ、振盪水浴中において３７℃でインキュベートした後、氷冷アセトニトリル（５００μＬ）で停止させた。次いで、サンプルをボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで５分にわたり遠心分離した。

【0343】

この反応混合物を肝ミクロソーム中で２時間にわたりインキュベートした（ｎ＝３）。この研究サンプルと一緒に陰性コントロール（ＵＤＰＧＡなし）及び陽性コントロール（パラセタモール１００μＭ）をインキュベートした。

【0344】

（ｉｖ）質量分析条件
ｍＣＢＳ及びミダゾラムの分析に使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータを表６にまとめる。

【0345】

【表8】

【0346】

（Ｖ）結果
第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの代謝安定性を図２〜４に示す。これらの結果は、これらの条件下では試験化合物の有意な代謝がなかったことを示す。図２は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒト肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。図３は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのラット肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒトラット肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。図４は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのイヌ肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、イヌ肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【0347】

（ｖｉ）第ＩＩ相代謝
第ＩＩ相代謝を許容する条件下での化合物とヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームとのインキュベーション後の反応サンプル中で検出したｍＣＢＳのグルクロン酸代謝産物と一致するイオンは存在しなかった。インキュベーション媒体中でのパラセタモールグルクロニドの形成をニュートラルロス（Ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）及びＭＲＭスキャンの両方で確認した。

【0348】

このインビトロでの研究では、反応媒体中での遊離塩基の形態のレベルの変化を測定することにより、ｍＣＢＳの代謝を評価した。

【0349】

第Ｉ相代謝を許容する条件下では、評価した３種の肝ミクロソームとの１時間のインキュベーション後、ｍＣＢＳ濃度は低下しなかった。同一条件下では、陽性コントロール化合物であるミダゾラムは、３種のミクロソームの存在下でほぼ完全に代謝された。

【0350】

ｍＣＢＳの濃度は、ヒト肝ミクロソームとの反応では時間ゼロで０．６μＭ未満であったことに留意されたい（一方、添加した濃度は１μＭであった）。同様の観察が、肝ミクロソームを含むがＮＡＤＰＨを含まない陰性コントロールサンプルで見られたが、ＮＡＤＰＨを含むがミクロソームを含まない陰性コントロールサンプルでは見られなかった。肝ミクロソームは、タンパク質、リン脂質及び脂肪酸の混合物を含む複雑な組織である。肝ミクロソーム組織の成分は、質量分析計のイオン化に影響を及ぼしてシグナルを抑制する可能性がある。肝ミクロソームの成分は、種間で異なることから、イオン抑制は、ヒトミクロソームではより強く、時間及びＮＡＤＰＨの存在に依存しない化合物濃度の見かけ上の低下をもたらす場合がある。

【0351】

要約すると、ヒト、ラット及びイヌのミクロソームを用いたミクロソーム反応において、試験物の無／最小の第Ｉ相代謝を検出した。第２のインビトロでの代謝研究（第ＩＩ相）において、グルクロニド代謝産物もウリジン５’−ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）の存在下での各種の肝ミクロソームとの２時間のインキュベーション後に検出しなかった。

【0352】

いかなる理論又は特定の作用様式に拘束されることなく、本出願人らは、ｍＣＢＳの広範なインビトロでの代謝の欠如が、この分子への酵素のアクセスを妨げる７種のサルフェート（Ｓ０３）群の存在により説明され得ることを推測した。しかしながら、この結果は、第Ｉ相又は第ＩＩ相の代謝に続くインビボでの脱硫酸化の可能性を排除し得ない。

【0353】

限外ろ過技術を使用する、ヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質に結合するｍＣＢＳの調査
要約すると、この研究は、ラット、イヌ及びヒトの血漿タンパク質へのｍＣＢＳの結合を調べるために設計されたインビトロでの研究であった。得られた結果は、試験した全ての種において、血漿タンパク質への約２０％の結合が存在したことを示す。

【0354】

ここで説明されている研究では、既存の方法を、内部標準として重水素化ｍＣＢＳ（ｍＣＢＳ−ｄ３）の使用を含むように改変した。この生物学的分析方法を使用して、ラット、イヌ及びヒトの血漿とのｍＣＢＳの血漿タンパク質結合を評価した。

【0355】

３００００ダルトンの分子量カットオフポイントを有するＣｅｎｔｒｉｆｒｅｅ（登録商標）限外ろ過装置を使用する限外ろ過方法により、タンパク質結合を評価した。簡潔に説明すると、既知の濃度の（遊離塩基としての）ｍＣＢＳをヒト、ラット及びイヌの血漿サンプルに添加し、３７℃で２０分にわたりインキュベートした。次いで、このサンプルを限外ろ過にかけて、タンパク質が結合した薬物と結合していない薬物を分離した。次いで、タンパク質結合の程度を薬物の全濃度と未結合の濃度との間の百分率差として定義した（リン酸緩衝液のみの存在下での限外ろ過装置への非特異的結合の減算を含む）。

【0356】

使用した試薬を下記の表７で詳述する。ｍＣＢＳ及びｍＣＢＳ−ｄ３の分析に使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータを表８にまとめる。

【0357】

【表9】

【0358】

（ｉ）分析方法のパラメータ

【0359】

【表10】

【0360】

（ｉｉ）サンプル調製
ｍＣＢＳストック溶液（１０μＬ）を、最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬ及び２０００ｎｇ／ｍＬとなるように、下記の表９に列挙されている各試験マトリックス（４９０μＬ）の溶液にスパイクした。

【0361】

【表11】

【0362】

次いで、スパイクサンプルを水浴中で２０分にわたり３７℃でインキュベートした。各試験群からのサンプルのアリコート（５００μＬ）を限外ろ過装置に移し（ｎ＝３）、１０００ｇで２０分にわたり遠心分離した。遠心分離後、限外ろ過液のアリコート（５０μＬ）を、各試験群からの限外ろ過前のサンプルの二重のアリコートと共に、抽出のために別の試験管に移した。

【0363】

（ｉｉｉ）較正曲線の作成
２００μｇ／ｍＬでのｍＣＢＳ標準溶液アリコートを下記に示すように希釈した。

【0364】

【表12】

【0365】

次いで、得られた標準溶液のアリコート（１０μＬ）を関連マトリックス（ヒト、ラット及びイヌの血漿並びにリン酸緩衝液２．５ｍＭ、ｐＨ７．４）のそれぞれ４９０μＬにスパイクし、よく混合した。

【0366】

（ｉｖ）抽出
スパイクした標準及びサンプルのアリコート（５０μＬ）（インキュベーション及び限外ろ過後）を１μｇ／ｍＬの内部標準溶液５０μＬと混合した。純粋なアセトニトリル（１５０μＬ）を添加し、サンプルを直ちにボルテックスした。上清溶液をガラス管に移し、空気流下で３７℃において蒸発させた。次いで、乾燥したサンプルを移動相Ａ’ １５０μＬ中で再構成した。

【0367】

限外ろ過前のサンプルの定量のために、サンプルを、血漿において新たに作成した標準曲線に対して分析した。限外ろ過後に採取したタンパク質に乏しいサンプルを、２．５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４において新たに作成した較正曲線に対して定量した。非特異的結合の推定のために、限外ろ過の前後両方のサンプルをリン酸緩衝液での較正曲線に対して定量した。

【0368】

（ｖ）結果：非特異的結合
限外ろ過装置への非特異的結合は、２００及び２０００ｎｇ／ｍＬそれぞれで０．５％及び−１．９７％と推定した（下記表１０）。従って、限外ろ過装置への化合物の結合は無視できると考えられた。

【0369】

【表13】

【0370】

（ｖｉ）血漿タンパク質結合
ヒト、ラット及びイヌの血漿にスパイクしたｍＣＢＳのろ過の前後での濃度の比較により、血漿タンパク質結合を算出した。結合の程度は、１６〜２３％の範囲で３種全ての種に関して類似していた（下記の表１１〜１３を参照されたい）。ｍＣＢＳの血漿タンパク質結合は、試験した両方の濃度で類似していた。

【0371】

【表14】

【0372】

【表15】

【0373】

【表16】

【0374】

この研究では、ヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質へのｍＣＢＳ結合は約２０％であった。結合の程度は２００及び２０００ｎｇ／ｍＬで類似しており、限外ろ過装置への非特異的結合は無視できた。

【0375】

実施例９：ラットにおける７日連続の長期間にわたる連続ＩＶ注入後のｍＣＢＳの投与量及び毒性のインビボでの調査
この実施例は、７日連続の期間にわたる連続した（２４時間／日）Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットへのＩＶ注入により投与した場合の、ｍＣＢＳの用量範囲及び毒性の調査のインビボでの研究を概説する。この実施例は、ラットにおけるｍＣＢＳのこの集中投与計画下において、ラットに投与した場合、１３９４ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基；効力及び塩含有量の補正後）の投与量でｍＣＢＳの観察可能な副作用レベルが存在しなかったことを示す。

【0376】

この研究の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの、７日連続にわたる、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）の静脈内注入により投与した場合における、試験物であるｍＣＢＳの毒性を決定することであった。

【0377】

ｍＣＢＳの試験物用量製剤及びコントロール物用量製剤（ヘプタナトリウム塩ｍＣＢＳ・Ｎａの形態）を、下記の表１４で説明するように、７日連続にわたる連続（２４時間／日）の静脈内注入により、ラットの群に投与した。

【0378】

【表17】

【0379】

この研究中にモニタリングしたパラメータとして、死亡率、臨床観察、体重及び摂食量が挙げられる。加えて、９日目に血液学的パラメータ、凝固パラメータ及び臨床化学パラメータを評価した。血漿中における試験物濃度を分析するために、注入開始に対して相対的な時点で動物から血液サンプルを採取した。終了時（９日目）、全ての動物を安楽死させ、肉眼による剖検検査にかけた。選択した臓器に対して臓器重量を測定し、肉眼的病変等の組織の選択したリストを保持し、顕微鏡による評価のために調製した。

【0380】

Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの、７日連続にわたる、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）の静脈内注入によるｍＣＢＳ・Ｎａの投与により、効力及び塩レベルに関する補正後の５５７５ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で１匹の雌が死亡した。

【0381】

血漿中濃度対時間のデータは、ｍＣＢＳの定常状態の濃度が５時間〜９６時間（又は１６８時間）の注入間隔にわたり維持されたことを示す。ＡＵＣ５〜９６時間及びＣｓｓの平均（±ＳＥＭ）値は、用量と共に直線的に増加した。

【0382】

５５７５ｍｇ／ｋｇ／日においてｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した両方の性別の動物では、摂食量の減少と相関して、体重増加の減少が認められた。用量≧３４８４ｍｇ／ｋｇ／日での両方の性別の動物において、白血球系統の増加が認められ、５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での雄では、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積及び平均赤血球ヘモグロビン濃度の低下と、網状赤血球の増加とが認められた。用量≧２１７８ｍｇ／ｋｇ日での雄において及び用量≧３４８４ｍｇ／ｋｇ／日での雌において、活性化部分トロンボプラスチン時間の増加が認められた。５５７５ｍｇ／ｋｇ／日で投与した雄では、肝酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ並びにコレステロール及びトリグリセリドが増加した。加えて、５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での両方の性別の動物において、尿素が増加し、且つ総タンパク質及びアルブミンが減少した。

【0383】

腎臓では、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物において、近位尿細管の空胞化／粗鬆化を両側で観察した。この所見（単純な尿細管の空胞化／粗鬆化）は、いかなる他の病理学的変化とも関連していなかった。腎臓の顕微鏡的所見は、腎臓重量の増加と相関していた。

【0384】

脾臓では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物において、赤色髄でのアポトーシス細胞の増加と関連する泡沫状マクロファージの蓄積を観察した。これらの脾臓の変化は、間質細胞の過形成、白色髄（胚中心）の細胞充実性／サイズの増加、莢膜線維化及び造血の増加をときに伴った。脾臓の顕微鏡的所見は、脾臓重量の増加と相関していた。

【0385】

肝臓では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物では、（≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日での）類洞並列細胞の増加、（５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での）髄外造血と関連することが多い泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積が認められた。加えて、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物では単細胞壊死が見られ、２１７８及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日で処理した動物では、限局性又は多発性の巣状壊死が認められた。５５７５ｍｇ／ｋｇ／日群では、雌と比べて雄で肝変化が顕著であり及び／又は頻発しており、ｍＣＢＳに十分に曝露された両方の雄の動物は、最小〜中程度の肝変化を示した。

【0386】

様々なリンパ節（気管支、下顎、縦隔、腸間膜、膵臓、肝臓及び／又は耳介）では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した多くの動物において、泡沫状マクロファージの蓄積を観察した。

【0387】

（脾臓及びリンパ節での）泡沫状マクロファージの蓄積、（肝臓での）泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積及び（腎臓での）近位尿細管の空胞化／粗鬆化の所見は、試験物ｍＣＢＳ及び／又はその分解生成物が、（脾臓、肝臓及びリンパ節での）単核貪食細胞系に捕捉され且つ腎尿細管上皮に取り込まれる可能性が最も高かったことを示唆する。従って、いかなる特定の理論又は特定の作用様式に拘束されることなく、本出願人らは、これらの所見が、試験物及び／又はその分解生成物の食作用及び排除の結果として、単核貪食細胞系及び腎臓の適応変化を表している可能性が最も高いと推論した。加えて、脾臓での他の所見［アポトーシス細胞の増加、間質細胞の過形成、白色髄（胚中心）の細胞充実性／サイズの増加、造血の増加及び莢膜線維化］並びに肝臓での他の所見（類洞並列細胞の増加及び髄外造血）も、活性化された貪食細胞系への適応反応であると本出願人らは推論した。

【0388】

しかしながら、２１７８、３４８４及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）で認められた肝臓の単細胞壊死は、潜在的に有害であると考えられた。加えて、２１７８及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日では、肝臓の限局性又は多発性の巣状壊死が認められた。巣状壊死は、３４８４ｍｇ／ｋｇ／日で処理した動物では見られず、自然に生じる可能性があるが、この所見をｍＣＢＳで処理した動物のみで観察したという事実を考慮すると、試験物との関連性を排除できない。

【0389】

結果として、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）で肝臓において観察した病理組織学的変化に起因して、この研究では、ｍＣＢＳの無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は１３９４ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）であると決定した。

【0390】

実施例１０：イヌにおける最大１４日連続の長期間にわたる連続ＩＶ注入後のｍＣＢＳの投与量及び毒性のインビボでの調査
この実施例は、１４日の期間にわたるビーグル犬への連続ＩＶ注入により投与した場合の、ｍＣＢＳの用量範囲及び毒性の調査のインビボでの研究を概説する。この実施例は、イヌにおけるｍＣＢＳのこの集中投与レジーム下において、１４日にわたる２７８８ｍｇ／ｋｇ／日でのｍＣＢＳの連続静脈内注入（４８時間にわたる２４時間／日）は良好な耐容性を示しており、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）、臓器重量又は巨視的評価への影響がなかったことを示す。

【0391】

イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入
要約すると、この研究は、１４日連続の注入イヌ研究で使用するためにｍＣＢＳの最大用量を選択することを目的として、連続注入によるイヌにおけるｍＣＢＳの用量範囲を調べた。同様に、選択した用量は、ＭＴＤ又は少なくとも３００ｕｇ／ｍｌのｍＣＢＳ（遊離塩基）血漿レベル（即ち目標ヒト血漿レベルの約３倍）をもたらすものであった。

【0392】

特に、ビーグル犬に最大４回の用量レベルにわたり１回の用量レベル当たり４８時間で、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）静脈内注入により投与した場合における試験物ｍＣＢＳの最大耐量（ＭＴＤ）を決定するためにもこの研究を行った。

【0393】

フェーズ１：用量の段階的増大
ｍＣＢＳ用量製剤を、下記の表１５で説明しているように、最大４回の用量レベルにわたり１回の用量レベル当たり４８時間での連続（２４時間／日）静脈内注入により、ビーグル犬に投与した。

【0394】

【表18】

【0395】

この研究のこのフェーズ中にモニタリングしたパラメータには、死亡率、臨床観察、体重及び摂食量が含まれた。下記の時点でｍＣＢＳ血漿レベルを確認するために、各動物から一連の血液サンプルを採取した：各用量レベルの注入の開始後２４及び４８時間。同様に、１日目に、３日目、５日目及び７日目の新たな用量レベルの投与前且つ９日目に、臨床病理評価（血液、凝固及び臨床化学）のために各動物から血液サンプルを採取した。

【0396】

最高用量レベルまでの段階的投与後、用量制限毒性（有害臨床症状）は認められず、従って、最大耐量（ＭＴＤ）は、４８時間にわたる連続（２４時間／日）の静脈内注入により投与した２７８８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳであると見なした。定常状態の血漿中濃度（Ｃｓｓ）が、ヒトでの目標血漿中濃度と比べて３倍高い３００μｇ／ｍＬよりも高かったことから、この用量をさらに段階的に増大させなかった。

【0397】

各時点で全ての動物から採取した血漿サンプル中において、定量可能なレベルのｍＣＢＳが検出され、これは、動物にｍＣＢＳが適切に投与されることを示した。定常状態の血漿中平均濃度（Ｃ_ｓｓ）は５３．８〜３５８μｇ／ｍＬの範囲であり、ｍＣＢＳは２２２〜４５０ｍＬ／時間／ｋｇの速度で除去された（Ｃｌ）。

【0398】

イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入
要約すると、この研究は、上記のＳＴＸ−１０２研究で特定した最大耐量（ＭＴＤ）を使用して、イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入を調べた。

【0399】

ＭＴＤ（２７８８ｍｇ／ｋｇ／日）の確認後、イヌをこの研究のフェーズ２に移し、下記の表１６に示すように、さらなる６日の連続注入にわたり、投与をＭＴＤで再開した。

【0400】

【表19】

【0401】

この研究のこのフェーズ中にモニタリングしたパラメータには、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）並びに臓器重量の変化が含まれた。下記の時点で各動物から毒物動態学的分析のための一連の血液サンプルを採取した：注入の開始後２４及び４８時間、注入の終了直前、注入の終了後１５、３０分及び１、１．５、２、３、４、６、２４時間。

【0402】

さらなる６日の連続注入の完了及び最後の毒物動態学的血液サンプルの採取後、８日目に全ての動物を安楽死させて剖検検査にかけた。全ての動物の肝臓及び腎臓に対して組織学的検査を実施した。

【0403】

６日（１４４時間にわたる）２７８８ｍｇ／ｋｇ／日でのｍＣＢＳの連続静脈内注入（４８時間にわたる２４時間／日）は良好な耐容性を示し、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）、臓器重量又は巨視的評価に影響はなかった。

【0404】

顕微鏡的所見として、腎臓の腎近位尿細管の空胞化／粗鬆化及び肝臓の泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積が挙げられたが、非有害性又は適応性と考えられた。

【0405】

毒物動態学的分析は、定常状態の血漿中濃度（Ｃ_ｓｓ）が２２３〜２４６μｇ／ｍＬの範囲であり、ＡＵＣ_{０〜１４４}（ＡＵＣ_{０〜１６８}）が４３８００（４４１００）〜４８３００（４８８００）時間^＊μｇ／ｍＬの範囲であることを示した。注入終了後、ｍＣＢＳ血漿中濃度は、両方の動物に関して約１時間の推定ｔ_１／２値で急速に低下した。ｍＣＢＳは、４７２〜５２２ｍＬ／時間／ｋｇの速度で除去された（Ｃｌ）。分布容積（Ｖｚ）は７４０〜７４１ｍＬ／ｋｇの範囲であり、これは、ｍＣＢＳが組織間に広く分布していることを示唆する。性別に関する特筆すべき差異はなかった。

【0406】

実施例１１〜２２：セロビオースサルフェート及びｍＣＢＳの比較
下記の研究では、セロビオースサルフェート（ＣＢＳ）及びｍＣＢＳを比較する。ｍＣＢＳはＣＢＳと比べてはるかに化学的に安定であり、その結果、より優れた薬物候補を示す。実施例１１〜２２で使用される方法論を下記に記載する。

【0407】

下記の実施例（１１〜２２）に関する方法及び材料
ヒト対象。全てのヒト関連の研究は、ＡＮＵ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。インビトロでの研究のための赤血球及び血小板の供給源として、健康な成人ドナーを使用した。

【0408】

動物。全ての動物実験は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。病原体フリーの雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜６週齢）並びに雄のＷｉｓｔａｒラット（体重２５０〜３５０ｇ）を、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｈｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。

【0409】

細胞系統及び細胞培養条件。ヒト微小血管内皮細胞−１（ＨＭＥＣ−１）（血液型Ｏであり、そのためヒト血清中の抗血液型抗体と反応しない）を、ＡＴＣＣから供給され、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵｍｌ^−１のペニシリン及び１００μｇｍｌ^−１のストレプトマイシンが補充されたＭＣＤＢ １３１培地中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、既に説明されているように（Ｊａｆｆｅ，Ｅ．Ａ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄａ，Ｋｌｕｗｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ，１９８４）、初代培養物から確立し、２０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵｍｌ^−１のペニシリン、１００μｇｍｌ^−１のストレプトマイシン、１３０μｇｍｌ^−１のヘパリン及び１．２ｍｇｍｌ^−１の内皮細胞増殖用サプリメント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＭｅｄｉｕｍ １９９中で培養した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞並びにＨＳ及びＧＡＧが欠損しているキシロトランスフェラーゼ（ｘｙｌｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）−１−欠損ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｐｇｓＡ−７４５細胞）を、ＡＴＣＣから供給され、５％のＦＣＳ及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。全ての細胞系統を３７℃で５％ＣＯ_２及び周囲Ｏ_２下でインキュベートし、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ａｓｓａｙキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマに関して繰り返し試験した。

【0410】

ヒストンによって媒介される細胞毒性のアッセイ。子牛胸腺ヒストン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の細胞毒性を決定するために、様々な濃度のヒストン（１００〜８００μｇｍｌ^−１）を、９６ウェルプレート中のＨＭＥＣ−１又はＨＵＶＥＣ（１×１０^６ｍｌ^−１）の懸濁液に添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、死滅細胞を検出するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ；２．５μｇｍｌ^−１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、且つ生存細胞を検出するためにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（０．０４μＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で５分にわたりインキュベートし、氷上に置き、拡張データ図１に描かれているゲーティング戦略を使用するフローサイトメトリーにより、死滅細胞及び生存細胞の割合を決定した。阻害アッセイでは、ＨＭＥＣ−１を、様々な濃度の化合物（１２．５〜４００μｇｍｌ^−１）の存在下で３７℃において１時間にわたりヒストン（４００μｇｍｌ^−１）と共にインキュベートした後、ＰＩ及びカルセイン−ＡＭを添加した。次いで、各化合物濃度でのＨＭＥＣ−１細胞毒性を、式：

【数1】

に基づいて決定し、次いで各ポリアニオンのＩＣ５０値を、最良適合線（ｌｉｎｅ ｏｆ ｂｅｓｔ ｆｉｔ）に基づいて決定した。いくつかの実験では、９６ウェルプレート中のＨＭＥＣ−１のコンフルエントな単層を、希釈剤のみ（生理食塩水）、ヒストンのみ（４００μｇｍｌ^−１）又はｍＣＢＳの存在下でのヒストン（１００μｇｍｌ^−１）と共に、１時間にわたり血清フリーＭＣＤＢ１３１培地中でインキュベートし、次いでＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して、カルセイン−ＡＭ又はＰＩの取り込みにより、生存細胞及び死滅細胞それぞれを検出した。ＨＭＥＣ−１の懸濁液も、他（Ｋｈａｎｎａ，Ｍ．，Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ，Ｃ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｓ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０９９／ｊｇｖ．０．０００９２１（２０１７））で報告されているように、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ヘパリナーゼ（ＨＰＮＳＥ）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又はヒト血小板ヘパラナーゼ（ＨＰＳＥ）（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｃ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｈｅｐａｒａｎａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３０（Ｐｔ ３），１３４１−１３５０（１９９８））による消化により、細胞表面ＨＳを枯渇させ、次いでＨＭＥＣ−１に関して上記で説明したように、ヒストンによって媒介される細胞毒性への感受性を調べた。同様に、野生型ＣＨＯ−Ｋ１の懸濁液及びＨＳ／ＧＡＧ欠損ｐｇｓＡ−７４５ ＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁液を、ヒストンによって媒介される細胞毒性への感受性に関して比較した。

【0411】

脂質二重層アッセイ。既に説明されているように（Ｒｅｂｂｅｃｋ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｂｅｔａ（１ａ）ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ＤＨＰＲ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ＲｙＲ１ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｖｉａ ｉｔｓ ３５−ｒｅｓｉｄｕｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １００，９２２−９３０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１１．０１．０２２（２０１１）．）調製し、１５０ｍＭ又は２５０ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ約５．５）溶液に対称的に分離した人工脂質二重層である。二重層にヒストン（１μＭ、１５．２μｇｍｌ^−１）を単独で添加したか、又は約２０℃での１０μＭのＣＢＳ（３．５μｇｍｌ^−１）又は１０μＭのＭＴＳ（５．１μｇｍｌ^−１）と一緒の０．５〜３時間のインキュベーション後に添加した。ヒストンの添加後、この二重層が破れるか又は実験が終了するまで、電流を連続的に記録した。

【0412】

内皮細胞におけるカルシウム流動研究。ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＨＭＥＣ−１（２×１０^７ｍｌ^−１）を６０分にわたり３７℃でＩｎｄｏ−１ ＡＭ（５μＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートした。（Ｔｅｌｌａｍ，Ｒ．Ｌ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９３０，５５−６４（１９８７）＆Ｗｅｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｔｅｌｌａｍ，Ｒ．Ｌ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６９（Ｐｔ ６），３６９−３７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｃｂ．１９９１．５３（１９９１））。５％のＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地による３回の洗浄後、細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充された氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＮａＣｌ ８ｇｌ^−１、ＫＣｌ ０．４ｇｌ^−１、ＣａＣｌ_２ ０．２ｇｌ^−１、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ ０．２ｇｌ^−１、Ｄ−グルコース １．８ｇｌ^−１、ｐＨ７．４）に４×１０^６ｍｌ^−１で再懸濁させた。この細胞懸濁液を氷上で保持し、３時間以内に使用した。フローサイトメトリーを使用して、細胞内Ｃａ^２＋流動をモニタリングした。細胞を予め平衡化し、加熱水浴に接続された外部シース（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｈｅａｔｈ）を使用して、分析中に３７℃で維持した。（ＦＳＣ／ＳＳＣ光散乱に基づく）細胞残屑及び塊状の細胞の排除後、新規の化合物の存在下／非存在下でのヒストン添加前２分にわたり、基底Ｃａ^２＋レベルをモニタリングした。一定の流速（約３００事象／秒）でヒストン添加の１、４及び１０分後にＣａ^２＋レベルを測定した。Ｃａ^２＋流動をＣａ^２＋非結合Ｉｎｄｏ−１に対するＣａ^２＋結合Ｉｎｄｏ−１の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）の比率の増加として決定した。

【0413】

インビトロでの赤血球の顕微鏡観察、凝集、脆弱性及び変形能のアッセイ。ヒト赤血球のヒストンによって媒介される凝集及び様々な化合物によるこの凝集の阻害を、本発明者らの一部により既に報告されているように（Ｋｏｒｄｂａｃｈｅｈ，Ｆ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｃ．Ｈ．，Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．Ｍ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｆｒａｇｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ １３０，２８８４−２８８８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０６−７９０５１９（２０１７）を参照されたい）、前方及び側方散乱パラメータ又は赤血球自己蛍光のいずれかに基づくフローサイトメトリーと、以前に説明されているような（Ｙａｂａｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｆｌｉｐｐａｓｅ ＡＴＰ１１Ｃ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｌｔｅｒｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｈａｐｅ，ａｎｅｍｉａ，ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９，１９５３１−１９５３７，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｃ１１４．５７０２６７（２０１４））走査型電子顕微鏡とにより検出した。同様に、阻害剤の存在下又は非存在下でヒストンによって誘発される赤血球の脆弱性を、本発明者らの一部により既に報告されているような（Ｋｏｒｄｂａｃｈｅｈ，Ｆ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｃ．Ｈ．，Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．Ｍ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｆｒａｇｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ １３０，２８８４−２８８８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０６−７９０５１９（２０１７）を参照されたい）せん断ストレスアッセイを使用して定量した。最後に、ヒストンの存在下での赤血球の変形能の低下及びこのプロセスへの阻害剤の効果を、人工ヒト脾臓を通る赤血球の通過を測定することにより評価した（Ｄｅｐｌａｉｎｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｅｎ ｃａｎ ｂｅ ｍｉｍｉｃｋｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ １１７，ｅ８８−９５，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−１０−３１２８０１（２０１１）を参照されたい）。

【0414】

インビトロでの血小板の凝集及び脱顆粒のアッセイ。凝集研究のために、室温での２段階遠心分離（２０分にわたる２００×ｇ、次いで１５分にわたる血小板リッチの血漿８００×ｇ）により、クエン酸Ｎａバキュテナ中に採取したヒト全血から血小板を単離し、血小板ペレットを、カルシウム及びマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液に再懸濁させ、ヒストンを添加し、示したそれぞれの濃度において化合物の存在下／非存在下でインキュベートした。血小板の特徴的なｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ ＳＳＣ識別を使用するフローサイトメトリーにより、ヒストンへの１５分間の曝露後の血小板凝集の程度に関してサンプルを評価し、ｌｏｇ ＦＳＣの幾何平均の増加は血小板凝集を示す。

【0415】

血小板活性化アッセイのために、クエン酸Ｎａバキュテナ中に採取した全血を、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｕｍｅ試薬（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ）を用いたＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｍｏｄｅｌ ７００の発光モードを使用して、血小板の脱顆粒をモニタリングした。インサイチュでスターラーバーにより、予め温めた血液（４２０μｌ）に生理食塩水（３００μｌ）を添加した。次いで、Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｕｍｅ試薬（１００μｌ）を添加し、２分にわたりインキュベートした後、水で希釈したヒストン±化合物を、示した濃度において１８０μｌの総量で添加した。結果を、ヒストン＋生理食塩水コントロールの割合として算出したＡＴＰ放出として表した。

【0416】

インビボでのヒストン毒性アッセイ。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（５〜６週齢）（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比べて、この若い年齢で、ヒストンによって誘発される貧血を起こし易く且つＩＶ注射し易い）に、示した濃度での試験化合物のｉ．ｐ．注射の１０分後にリン酸緩衝生理食塩水中のヒストン（５０ｍｇｋｇ^−１）をｉ．ｖ．注射した。ヒストン注射の１０分後に眼窩後出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）を実施し、採取した血液を酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）に添加し、この１０分血液サンプルを、ＡＤＶＩＡ ２１２０ｉ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して血小板及び赤血球の含有量に関する血液分析にかけた。ヒストン注射の１０分後に脾臓も摘出し、ヘモグロビンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して脾臓ヘモグロビン含有量を定量した。４時間血液サンプルの場合、雄Ｃ５７／ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）に、上記のように試験化合物及びヒストンを注射し、その後の生化学的試験のために血漿を単離して凍結保存し、肝臓損傷のマーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ）、腎臓損傷のマーカー（クレアチニン、Ｃｒｅａ）及び一般組織損傷のマーカー（乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより測定した。

【0417】

マウス深部静脈血栓症（ＤＶＴ）モデル。使用する手順は大部分が既に説明されている通りである（Ｂｒｉｌｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １０，１３６−１４４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３８−７８３６．２０１１．０４５４４．ｘ（２０１２）を参照されたい）。簡潔に説明すると、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに麻酔して開腹切開を行い、腸を体外から出し、次いで腹部大動脈からの緩やかな分離後、腎静脈直下の下大静脈（ＩＶＣ）を約１０％の開存性まで結紮し、全ての関連するＩＶＣ支流を結紮した。腹膜及び皮膚を閉じ、その後、全てのマウスに尾静脈を介してヒストン（１０ｍｇｋｇ^−１）又は等量の生理食塩水をｉ．ｖ．注射し、続いて５分後に試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は生理食塩水をｉ．ｖ．注射した。マウスを４８時間にわたりモニタリングし、その後、再び麻酔して再び開き、ＩＶＣ狭窄の遠位で発症していた任意の血栓を、分析のために取り出した。偽手術するコントロール動物を開腹手術し、ＩＶＣを９０％結紮したが、この結紮をＩＶＣの閉塞直後に除去した。

【0418】

敗血症に関するラット盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）アッセイ。ＣＬＰアッセイを、既に説明されているように（Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ．Ｓｈｏｃｋ ２４ Ｓｕｐｐｌ １，５２−５７（２００５）を参照されたい）雄のＷｉｓｔａｒラットで実施した。生理食塩水に溶解させた試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は等量の生理食塩水のみ（コントロールコホート）を、ＣＬＰの５分前且つ２０時間での実験停止まで術後５、１０及び１５時間にｉ．ｐ．投与した。偽ＣＬＰラットに同一の手順を行ったが、盲腸を結紮していないか又は穿刺しておらず、このラットに、上記と同じ時間に生理食塩水を投与した。実験期間の終了時（２０時間）又は病的状態が倫理上安楽死を必要とした場合、ラットを麻酔し、後のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌによる肝臓（ＡＬＴ）及び腎臓（クレアチニン）の機能の分析のために、心臓穿刺によりＥＤＴＡ中に採血した。生理食塩水で処理したコントロールＣＬＰ動物の血液サンプル内では（ＥＤＴＡの存在にもかかわらず）血餅が形成される傾向があるため、全ての動物からの血漿サンプルの分析は成功しなかった。

【0419】

ラット心臓ＩＲＩモデル。使用する方法は、既に公開されている手順の組み合わせに基づく（Ｔａｋａｄａ，Ｙ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｋａｓａｈａｒａ，Ｊ．，Ａｉｈａｒａ，Ｋ．＆Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｋ．Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｅａｒｔ ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｄｒｉｎ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１１，１２４９−１２５５，ｄｏｉ：１０．１１２４／ｊｐｅｔ．１０４．０７０８３９（２００４）＆Ｈａｌｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｄａｅ，Ｍ．Ｗ．＆Ｋｌｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ’ｎｏ−ｒｅｆｌｏｗ’ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ５９，７１５−７２２（２００３）を参照されたい）。雄のＷｉｓｔａｒラットをイソフルレンで麻酔し、気管切開術により挿管し、１ｍｌ １５０ｇ^−１の一回換気量及び６５回の呼吸 分^−１の呼吸数で人工呼吸した。酸素補給を約３０％のＦｉＯ_２で供給した。左心室を可視化し得るように、左半開胸術を実施した。左冠動脈叢（ＬＣＡ）を、３０分にわたる再灌流前に３０分にわたり非侵襲的スネアを使用して閉塞させた。虚血を心筋充血により確認した。試験化合物（３０ｍｇｋｇ^−１）又は等量（２００μｌ）の生理食塩水を、再潅流フェーズのためのスネアの開放の５分前に、左心室の内腔（吸引で確認）に注射した。

【0420】

再潅流（３０分）の終了時、左心室の内腔にチオフラビンＳ（体重の１ｍｌ ２００ｇ^−１）を緩やかに注射して、虚血ゾーン（ＩＺ）内の微小血管閉塞（ＭＶＯ）の領域を定義した。このＩＺ領域を、非侵襲的スネアの再閉塞と、ＣＤ−６８００（Ｕｎｉｓｏｎｉｃｓ）超音波処理器を使用する超音波処理による、溶液内に分散された左心室への青色微粒子（Ｕｎｉｓｐｅｒｓｅ Ｂｌｕｅ，ＢＡＳＦ）の注入とにより決定した。次いで、心臓を胸部から切除し、等張生理食塩水ですすぎ、心室間線に対して直角において非侵襲的スネアの遠位で２ｍｍ切片を切り取った。この方法は、秤量し且つ紫外線（ＭＶＯの領域）下及び明るい光（ＩＺ領域）下で撮影した（Ｓｏｎｙ Ｈａｎｄｙｃａｍ(登録商標)，Ｚｅｉｓｓ ６０倍光学ズーム）４枚の心筋切片を作製した後、塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）中でインキュベートして、壊死心筋の領域を決定した。Ｐｌａｎｉｍｅｔｒｙ（Ｉｍａｇｅ Ｊ，Ｆｒｅｅｗａｒｅ）を使用して、ＩＺ、ＭＶＯ及び壊死の領域を定量した。

【0421】

ラット虚血再灌流組織弁モデル。用いる手順は大部分が既に説明されている方法に基づく（Ａｓｋａｒ，Ｉ．，Ｏｋｔａｙ，Ｍ．Ｆ．，Ｇｕｒｌｅｋ，Ａ．＆Ｂａｃ，Ｂ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｅｐｉｇａｓｔｒｉｃ ｉｓｌａｎｄ ｓｋｉｎ ｆｌａｐｓ．Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ２６，１９３−１９９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｉｃｒ．２０１９３（２００６））。簡潔に説明すると、雄のＷｉｓｔａｒラットに麻酔し、局所的に脱毛し、３ｃｍ×６ｃｍの筋膜弁を、血管茎を無傷のままにして摘出した。下腹壁動脈をクランプし、下の組織からの酸素拡散を防ぐために、この弁の下に細かいゴムシートを置き、この弁を所定の位置に再縫合した。この弁に血流が戻ることを可能にするために、適用の１０時間後にクランプを除去した。試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は生理食塩水を、クランプ適用の５分前及びこのクランプの除去の５分後にｉ．ｐ．投与した。ラットを、術後２４時間及び４８時間でこのラットに追加の化合物又は生理食塩水をｉ．ｐ．投与している７２時間の合計実験期間にわたりモニタリングした。「コントロールクランプなし」ラットは、摘出して再縫合前にゴムを下に置いた組織弁を有したが、血管はクランプされておらず、他のラットと同じ時点で生理食塩水を投与した。実験期間の終了時、この弁の生存率を黒色の壊死領域又は発赤領域対ピンク色の生存領域の割合で決定した。エリザベスカラーの適用及び沈降剤としての鎮痛の使用にもかかわらず、少数のラットを、その弁の自己共食いを繰り返す際に早期に安楽死させなければならなかった。

【0422】

多発性硬化症のＥＡＥモデル。１日目に、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１１５μｇ／マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５−５５ ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）による皮下免疫化により、８〜１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてＥＡＥを誘発した。０日目及び２日目に、ＰＢＳ中の３００ｎｇ／マウスの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＰＢＳ中の５０ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ又はＰＢＳのみ（ビヒクル）を、０〜９日目に毎日ｉ．ｐ．投与した。マウスを疾患の徴候に関して毎日モニタリングし、疾患の身体的症状に基づいて０〜５のスケールでスコア化した。マウスを下記のようにスコア化した：０、臨床的に正常；１、尾の弛緩及び／又は運動失調；２、後肢脱力；３、後肢麻痺；４、後肢及び前肢の麻痺；並びに５、瀕死。

【0423】

統計解析。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計試験を実施してグラフを作成し、使用した試験の詳細は図の凡例に含まれている。

【0424】

ｍＣＢＳの生物学的効果のインビトロでの証拠
下記の実施例１１〜１４は、遊離細胞外ヒストンの中和におけるｍＣＢＳの生物学的効果のインビトロでの証拠を提供する。

【0425】

実施例１１：ｍＣＢＳは内皮細胞をヒストン毒性から保護する
この実施例は、ｍＣＢＳがヒト内皮細胞をヒストン損傷から保護すること及び内皮細胞へのヒストンによって誘発される損傷に対するこのｍＣＢＳの保護効果が濃度依存的であることを示す。この実施例は、ｍＣＢＳが、ヒストンに曝露された内皮細胞の一部で損傷を反転させ得ることも示す。

【0426】

内皮細胞は血管の内腔に並んでおり、且つ血管系の完全性に必須であり、血液細胞を通過させるために基礎組織間に多くのシグナルを生じ、血液が流れる抗凝固表面として作用する。ヒストンは内皮細胞の細胞膜を損傷してこの内皮細胞の死滅を誘発し、そのため、微小血管系の完全性及び内皮の抗凝固特性が失われている。これにより血餅が広範に形成され、重要な臓器への酸素及び栄養素を含む液体の送達が損なわれ、次にこの臓器が損傷を受けて不全になる。

【0427】

ｍＣＢＳがヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をヒストン損傷から保護するかどうかを評価するために、２種の蛍光色素カルセイン−ＡＭ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して、内皮細胞の健康状態をインビトロで決定した。健康な生存細胞はカルセインＡＭを取り込み且つＰＩを排除したが、損傷しているか又は死滅した細胞では逆が真であった。図５に示すように、これらの色素の取り込み／排除を、フローサイトメトリーを使用して測定し、且つ共焦点顕微鏡を使用して可視化した。

【0428】

図５に関して、培養したＨＭＥＣを、水体積等量で（図５のパネルＡ及びＥ）、ヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＢ及びＦ）、ｍＣＢＳ １００μｇ／ｍＬ及びヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＣ及びＧ）又はｍＣＢＳ ２５μｇ／ｍＬ及びヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＤ）、６０分にわたり処理し、次いで色素カルセイン−ＡＭ及びＰＩで標識し、フローサイトメトリー（パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は共焦点顕微鏡（パネルＥ、Ｆ及びＧ）を使用して、色素取り込みの程度に関して分析した。図５に示すように、培養して未処理のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）は大部分が生存しており、７６％がカルセイン−ＡＭを含み、１９％がＰＩを含んでいた（図５Ａ）。しかしながら、ヒストン（４００μｇ／ｍＬ）に曝露した場合、３７％が生存可能なままであったが、５６％がＰＩを取り込んだ（図５Ｂ）。ヒストンへの曝露前にＨＭＥＣにｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍＬ）を添加した場合、７４％が生存可能なままであり、ＰＩ取り込みに基づいて２０％が死滅しており、そのため、ｍＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害からＨＭＥＣを保護し得る（図５Ｃ）。この保護効果は濃度依存的であり、より低い量のｍＣＢＳ（２５μｇ／ｍＬ）では保護のレベルが低下している（図５Ｄ）。ＨＭＥＣへのヒストン及びｍＣＢＳの効果を、健康な未処理内皮細胞（図５Ｅ）及びヒストンに曝露したｍＣＢＳ処理内皮細胞が、緑色の蛍光カルセイン−ＡＭ色素を蓄積するが（図５Ｇ）、未処理のヒストン曝露内皮細胞は赤色の蛍光色素ＰＩを取り込む（図５Ｆ）共焦点顕微鏡を使用しても見ることができる。

【0429】

培養したＨＭＥＣを、上昇する濃度のｍＣＢＳの添加後に４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いでフローサイトメトリーを使用してカルセイン−ＡＭ（生存）又はＰＩ（死滅）の取り込みに関して分析した。ＨＭＥＣに関するヒストンの損傷効果に対するｍＣＢＳの用量依存的な保護効果を図６に示し、図６は、ｍＣＢＳ濃度の上昇により、生存細胞（カルセイン−ＡＭの取り込み）が増加し且つ死滅細胞（ＰＩ取り込み）が減少したことを示す。従って、これらの結果は、ヒストンによって誘発されるＨＭＥＣへの損傷に対するｍＣＢＳの保護効果が濃度依存的であることを示す。

【0430】

ｍＣＢＳが、ヒストンへの曝露後の内皮細胞における損傷を反転させ得るかどうかを評価するために、培養したＨＭＥＣを６０分にわたり４００μｇ／ｍｌのヒストンに曝露し、次いで１０分にわたりｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、次いで最後の５分にわたりカルセイン−ＡＭ及びＰＩを添加した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用してＰＩ取り込みに関して分析し、結果を図７に示す。結果は、重要なことに、特に臨床状況では、ｍＣＢＳは、ＨＭＥＣの亜集団におけるヒストンの損傷効果を反転させ得たことも示す。この状況（培養したＨＭＥＣにヒストンを添加し、次いで６０分後に１０分にわたりｍＣＢＳを添加し、最後の５分にわたりカルセイン−ＡＭ及びＰＩを添加した）では、ＨＭＥＣの約３０％が、ＰＩ取り込みから、ｍＣＢＳの処理後にＰＩ排除及びカルセイン−ＡＭ取り込みに反転した。

【0431】

実施例１２：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される赤血球の凝集及び溶解を予防し、減少させ、さらに反転させる
この実施例は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を予防し、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示す。さらに、この実施例は、ｍＣＢＳが、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化する効果であるヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害することを示す。これ以外にも、この実施例は、ｍＣＢＳが、溶解及び凝集に対する、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ感受性を、ほぼ完全に反転させ得ることを示す。

【0432】

赤血球（ＲＢＣ）は組織への酸素輸送に関与しており、血栓形成の足場として作用する膜タンパク質を提供することにより血餅形成の一因となる。ＲＢＣの円盤状の形状及び柔軟な構造は、ＲＢＣが狭い毛細血管を通って圧迫して、急速に流れる血流内で経験するせん断力に抵抗することを可能にする。ＲＢＣは核を欠いていることから、ＲＢＣは、修復又はアポトーシスを介して損傷に応答することができず、代わりに、ＲＢＣが変形した場合、脾臓内のマクロファージにより除去される。しかしながら、損傷したＲＢＣは、脾臓に達する前に、ＲＢＣの円盤状の形状を失い、従って柔軟性を失う場合があり、そのため、せん断力曝露に起因する血管内溶解を起こし易くなる。敗血症等のヒストンレベルが上昇する疾患では、貧血を観察することが多い。

【0433】

ＲＢＣへのヒストンの損傷効果を、この効果を無効にするｍＣＢＳの能力と一緒に研究した。ヒストンと共にインキュベートした単離ヒトＲＢＣの初期研究では、フローサイトメトリー及び電子顕微鏡を使用して、有意な凝集を証明した。図８に示すように、このヒストンのＲＢＣ凝集効果は、ｍＣＢＳによる処理によって予防され得た（ＣＢＳにより同様のデータが見られる）。この場合、単離ヒトＲＢＣを、処理なし後（パネルＡ及びＤ）、６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション後（パネルＢ及びＥ）及びｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）の添加、次いで６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）への曝露の直後（パネルＣ及びＦ）の凝集の程度に関してｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ自己蛍光（ＦＬ−１チャネル）パラメータを使用するフローサイトメトリーを使用して分析し（図８、パネルＡ〜Ｃ）、走査型電子顕微鏡を使用して可視化した（図８、パネルＤ〜Ｆ）。図８の結果から明確に観察され得るように、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集は、ｍＣＢＳにより予防される。

【0434】

図９に示すように、ヒストンが用量依存的にＲＢＣの凝集を誘発すること、さらにｍＣＢＳ及びＣＢＳが用量依存的に再びこの凝集を有意に減少させ得ることをさらに確認する後続の実験を行った。具体的には、この場合、単離ヒトＲＢＣを、６０分にわたり様々な濃度のヒストン（０、１．２５、２５、５０、１００、２００、４００及び８００μｇ／ｍＬ）に曝露し、図９Ａに示すように、自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルによりＲＢＣ凝集の程度を測定した。次いで、４００μｇ／ｍＬのヒストンの添加前に様々な濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳ（０、１２．５、２５、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬ）をＲＢＣに添加したことを除いて、これを繰り返した。再び、図９Ｂに示すように、自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルによりＲＢＣ凝集の程度を測定した。結果は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳの両方が、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示す。

【0435】

加えて、上昇する濃度のヒストンと共に６０分にわたりインキュベートした場合の、増加するせん断力（ピペッティングの速度）及びせん断曝露（ピペッティングの反復）下での溶解に対するＲＢＣの感受性を、ロボットピペッティングシステムを使用して決定した。結果を図１０に示す。具体的には、６０％の生理食塩水（６：４の比率での通常の生理食塩水：水）で希釈した単離ヒトＲＢＣを、６０分にわたり、上昇する濃度のヒストン（０、１．２５、２５、５０、１００、２００、４００及び８００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、次いでロボットシステム内において、４０回反復で次第に早い流速（ｍｍ／秒）に曝露する（図１０Ａ）か、１００ｍｍ／秒の流速で様々な反復のピペッティングに曝露する（パネルＢ）か、又は様々な濃度（０、１２．５、２５、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬ）のｍＣＢＳで処理し（図１０Ｃ）、次いで６０分にわたり且つ１００ｍｍ／秒のせん断流速及び４０回ピペッティング反復で４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露した。次いで、各サンプルからの上清を、ＲＢＣ溶解の程度の指標としてのＡ５４０ｎｍでのヘモグロビン含有量に関して測定した。

【0436】

これらの実験を、ＲＢＣにベースラインストレスを誘発するために、６０％張度の生理食塩水で実施した。５４０ｎｍで上清中のヘモグロビンレベルを測定することにより、溶解を測定した。これらの結果は、ヒストン濃度の上昇により、増加するせん断力及びせん断曝露下でＲＢＣの溶解に対する感受性が劇的に増加することを示す（図１０Ａ及びＢ）。ヒストン曝露前のｍＣＢＳ（及びＣＢＳ、図示せず）によるＲＢＣの処理は、せん断下において、ヒストンによって誘発される溶解を用量依存的に阻害し得る（図１０Ｃ）。従って、結果は、ヒストン効果が、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化した場合でも、ｍＣＢＳ（及びＣＢＳ）が、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害したことを示す。

【0437】

臨床シナリオをより密接に再現するために、５５分にわたるヒストンへの曝露後のｍＣＢＳによる５分にわたるＲＢＣの処理により、せん断力下での溶解及び凝集への感受性のほぼ完全な阻害がもたらされることを実証した（図１１）。具体的には、単離ヒトＲＢＣを、５５分にわたり４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いで５分にわたり様々な濃度のｍＣＢＳに曝露した後（図１１Ａ）、せん断力（１００ｍｍ／秒の流速及び４０回ピペッティング反復）を適用し、Ａ５４０ｎｍにより上清中のヘモグロビンを測定し、フローサイトメトリーを使用するＦＬ１での自己蛍光のレベルにより測定してＲＢＣ凝集の程度を分析した（図１１Ｂ）。結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＲＢＣの溶解及び凝集に対する感受性を反転させ得たことを示す。

【0438】

実施例１３：ｍＣＢＳの硫酸化
上述したように、ｍＣＢＳはＣＢＳと比べて化学的にはるかに安定しており、その結果、より優れた薬物候補を示す。従って、本発明者らは、活性に関して、ＣＢＳに必要な硫酸化を試験した。ＨＭＥＣ−１細胞毒性アッセイ（図１２ｂ）及びＲＢＣ脆弱性アッセイ（図１２ｃ）を使用して、ＣＢＳ化合物のこれらの様々な硫酸化状態（図１２ａ）を試験した際、本発明者らは、抗ヒストン活性には高硫酸化ＣＢＳが必要であると決定しており、なぜなら、たとえ７個のＯ−硫酸化部位の５個が占有された場合でも、低硫酸化ｍＣＢＳはヒストン阻害活性が最低限であったからである。

【0439】

実施例１４：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される血小板の凝集及び脱顆粒を減少させる
この実施例は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される血小板の凝集及び脱顆粒を阻害することを示す。

【0440】

血小板は、血餅形成において重要な役割を果たし、血管傷害後に血漿凝固タンパク質と相互作用して効果的な栓を形成する。また、血小板は免疫細胞とも相互作用し、免疫細胞の活性化及び感染領域への遊走を支援する。

【0441】

従って、本発明者らは、血小板へのヒストンの効果及びこれらの効果を阻害するｍＣＢＳ及びＣＢＳの能力を研究した。具体的には、単離して洗浄したヒト血小板を、１時間にわたり様々な濃度のヒストン（例えば０〜１０００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした後、単一の血小板と凝集した血小板とを識別するためにＦＳＣ及びＳＳＣを使用するフローサイトメトリーにより凝集を分析した（この結果を図１３Ａに示す）。次いで、（１５０μｇ／ｍＬでの）ヒストンの添加前に、ある範囲の濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳを添加したことを除いて、これを繰り返した（図１３Ｂ）。全血中のヒト血小板を、ＡＴＰ放出を検出するためにケミルミノメトリを使用して、上昇する濃度のヒストンの添加後の脱顆粒に関して分析し、陽性コントロールとしてトロンビンを含めた（図１３Ｃ）。ヒストン（４００μｇ／ｍＬ）の添加前に、上昇する濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳを添加したことを除いて、この最後のステップを繰り返した（図１３Ｄに示す）。

【0442】

得られた結果は、単離血小板は、上昇する濃度のヒストンに曝露された際、フローサイトメトリーにより測定した場合には（図１３Ａ）凝集する傾向の上昇を示し、血小板ルミノメトリーによるＡＴＰ放出を使用して測定した場合には（図１３Ｃ）脱顆粒する傾向の上昇を示したことを示す。しかしながら、血小板調製物をｍＣＢＳ及びＣＢＳで予め処理した場合、凝集（図１３Ｂ）及び脱顆粒（図１３Ｄ）が有意に減少した。対照的に、非硫酸化セロビオース（ＣＢ）は阻害活性を有さなかった。

【0443】

従って、この結果は、ヒストンが血小板の凝集及び脱顆粒を誘発すること並びにこれらの効果はｍＣＢＳ及びＣＢＳにより阻害されることを裏付ける。

【0444】

実施例１５：ｍＣＢＳは、ヒストンによる脂質二重層破壊を予防する
次に、本発明者らは、どのようにしてヒストンがその細胞毒性を媒介し、その結果として、ＣＢＳ及びｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される損傷から細胞を保護するかを調べた。ヒストンは、細胞表面上で一様に発現されるＧＡＧ（特にＨＳ）に結合することから、ヒストンは、細胞表面ＨＳへの結合により、このヒストンの細胞傷害性エフェクター機能を開始させる可能性があると思われた。

【0445】

この考えを試すために、３種の細菌ヘパリナーゼの混合物又はヒト血小板ヘパラナーゼのいずれかとのインキュベーション後のヒストンへの曝露により、ＨＭＥＣ−１細胞の細胞表面ＨＳを枯渇させ、ＨＳ除去は、フローサイトメトリーによりモニタリングした場合、これら２種の酵素処理に関してそれぞれ８６％及び９７％であった。

【0446】

本発明者らは、細菌ＨＳ分解酵素又はヒトＨＳ分解酵素のいずれかによるＨＭＥＣ−１細胞の前処理は、ヒストンによって媒介される細胞毒性への細胞の感受性に影響を及ぼさず、これら２種の酵素による前処理は、ＨＭＥＣの生存率にも影響を及ぼさない（図１４ａ）ことを発見した。この発見を確認するために、本発明者らは、ＧＡＧ鎖生合成を開始するキシロトランスフェラーゼの変異に起因して細胞表面ＧＡＧを欠くＣＨＯ細胞系統（ｐｇｓＡ−７４５）を使用した。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統と比較して、細胞表面ＧＡＧの欠失はヒストンの細胞毒性にほとんど影響を及ぼさず、試験した最高ヒストン濃度では、細胞毒性がごくわずかではあるが有意に減少した（図１４ｂ）。そのため、細胞表面ＧＡＧは、ヒストンによって媒介される細胞毒性に必須ではない。

【0447】

ヒストンは、脂質二重層と相互作用して損傷を与えることが既に分かっており、細胞透過性タンパク質として作用することも既に分かっている。そのため、本発明者らは、ヒストンが脂質二重層を直接破壊することにより細胞毒性を媒介するかどうかを調べた。

【0448】

この可能性を調べるために、人工脂質二重層を調製し、この二重層を横切る電流の変化により、ヒストン破断に対するこの人工脂質二重層の感受性を検出した。

【0449】

脂質二重層は寿命が有限であり、通常、３０〜１２０分のオーダーである。本発明者らの実験では、リアノジン受容体１（ＲｙＲ１）イオンチャネルタンパク質を含むコントロール脂質二重層は、平均寿命が４６±４分であり、ヒストン（１μＭ）の添加により、この寿命が５．７±１．２分まで顕著に縮まった（図１５ａ）。実際には、４７個の二重層の１３個（２８％）がヒストン添加の０．３〜０．５分以内に壊れたのに対して、１２５個のコントロール二重層の２個のみ（１．６％）が同じ期間で破裂し、より高いヒストン濃度（≧５０μＭ）により、ほとんどの二重層が急速に破裂した（図示しない）。二重層は、ＣＢＳが存在する場合にはヒストンにより破裂し難く、平均二重層寿命は、ＣＢＳの場合には１８±４分及び３６±５分まで有意に増加した（図１５ａ）。ヒストン単独（２８％）と比較して、ＣＢＳの場合、急速な二重層破裂の発生が５２個の二重層の３個（５．８％）まで減少した。

【0450】

以前の研究により、ヒストンが、細胞中で非選択的なＣａ^２＋チャネル及び形質膜の脱分極を誘発し得ることも実証されている。この発見は、ヒストンが細胞表面のリン脂質と直接相互作用して膜の完全性を乱すという概念をさらに支持する。

【0451】

ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＣａ^２＋流動に対して細胞を保護するかどうかを調べるために、ＨＭＥＣ−１をＣａ^２＋感受性色素Ｉｎｄｏ−１で負荷し、ｍＣＢＳの存在下又は非存在下においてヒストンでチャレンジし、フローサイトメトリーによりＣａ^２＋取り込みを測定した（図１５ｂ）。ヒストンは、高い細胞内Ｃａ^２＋レベルを示す細胞の集団において約６倍の増加を誘発し、この反応は、ヒストン添加の４〜１０分後に定常に達する。ｍＣＢＳの存在により、この反応が実質的に阻害された（図１５ｃ）。本発明者らの発見は、ヒストンが細胞の脂質二重層を直接破壊することにより細胞膜に損傷を与え、ｍＣＢＳは、ヒストンのこの望ましくない性質を中和することを示す。

【0452】

実施例１６：ｍＣＢＳは、最低限の固有の抗凝固活性を有し、ヒストンによって誘発される血漿凝固混乱を減少させる
この実施例は、ヒストンが血液凝固を減少させること及びｍＣＢＳが最低限の抗凝固効果を有し、ヒストンによって誘発される血漿凝固混乱を減少させ得ることを示す。

【0453】

ヒストンが血小板の凝固及び脱顆粒を促進し得ることが分かったにもかからわず、本発明者らは、ヒストンが、内因性経路に関与する因子を介して血漿凝固を特異的に阻害することにより全血凝固のレベルを低下させることも発見した。

【0454】

これを、回転トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ）（図１６Ａ）及び伝統的な血漿ベースの活性化部分トロンビン時間（ＡＰＴＴ）アッセイ（図１６Ｂ）を使用して実証した。

【0455】

具体的には、ＲＯＴＥＭ（図１６Ａ）を使用して、全血への増加するヒストン濃度（０〜１０００μｇ／ｍＬ）の添加により、全てのアッセイで凝固時間（単位秒で測定）が長くなったが、特にＮＡＴＥＭアッセイ及びＩＮＴＥＭアッセイで長くなった。凝固へのヒストンの同一の抗凝固効果を、血漿ベースの凝固アッセイＡＰＴＴを使用して実証した（図１６Ｂ）。

【0456】

ｍＣＢＳは硫酸化二糖であることから、本発明者らは、ｍＣＢＳは、非分画で低分子量の抗凝固ヘパリンのはるかに小さい同類であると考えられ得ると推論した。従って、ＲＯＴＥＭを使用して、ｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）の凝固特性を研究した。比較対象として、２種の硫酸化三糖類メレチトース及びマルトトリオースを含めた（図１７）。具体的には、ＮＡＴＥＭ（非活性化）アッセイ、ＥＸＴＥＭ（外因性経路活性化）アッセイ、ＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化）アッセイ及びＦＩＢＴＥＭ（中和した血小板による外因性経路活性化）アッセイを実施する直前に、全血に、ｍＣＢＳ、マルトトリオース又はメレチトース（２００μｇ／ｍＬ）を補充した。データは、水コントロールの倍数増加として表される凝固時間を示し、図１７Ａに示す。様々な濃度（０〜１００μｇ／ｍＬ）のｍＣＢＳ、メレチトース又はマルトトリオースを補充した全血を、凝固時間に関してＮＡＴＥＭアッセイを使用して分析し、結果を図１７Ｂに示す。次いで、データが２０分での血餅振幅を示すことを除いて（パネルＢと）同じことを繰り返した。この結果を図１７Ｃに示す。５０及び１００μｇ／ｍＬでは２種の三糖類により血餅が検出されないことに気付いた。

【0457】

図１７に示す結果から、ｍＣＢＳが、全血凝固への影響が最低限か又は全くないが、２種の硫酸化三糖化合物は、ＮＡＴＥＭ（非活性化トロンボエラストメトリ（ＴＥＭ））アッセイ及びＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化ＴＥＭ）アッセイで検出された有意な抗凝固活性を有することが実証された。ＮＡＴＥＭアッセイは、これらの化合物によって誘発される変化に最も敏感であったことから、より低濃度の３種の硫酸化化合物を全血に添加して、抗凝固剤としてのこれらの効力をより明確にした。この分析は、硫酸化三糖類は２５μｇ／ｍＬでコントロールの凝固時間を２倍にしたが、同一の結果を達成するために１００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳが必要であったことを示す（図１７Ｂ）。

【0458】

さらに、ｍＣＢＳの抗凝固効果とヘパリン及び低分子量ヘパリンであるエノキサパリンとの比較を行った。具体的には、ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、（１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬの濃度での）ヘパリンの添加、（１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬの濃度での）エノキサパリンの添加、（２５μｇ／ｍＬの濃度での）三糖マルトトリオースサルフェートの添加又は（２５μｇ／ｍＬの濃度での）ｍＣＢＳの添加後、全血凝固を測定した。結果を図１８に示す。ｍＣＢＳと、非分画ヘパリン及び低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）との比較は、ＬＭＷＨ（エノキサパリン）と比較してｍＣＢＳの抗凝固活性の１１０倍の低下を示し、且つ非分画ヘパリンと比較して＞７５０倍の低下を示した。

【0459】

ＥＸＴＥＭアッセイではヒストンが凝固時間を増加させることが分かったが、ｍＣＢＳは同一のパラメータに影響を及ぼさなかったことから、ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、ヒストンに誘発される凝固の混乱を阻害するｍＣＢＳの能力も試験した。この結果を図１９に示す。実証されているように、２００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳの添加により、４００及び８００μｇ／ｍＬのヒストンの両方の抗凝固効果を阻害し得た。比較すると、同量の水は効果がなかった（図１９）。従って、この結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発される全血凝固の混乱を阻害することを示す。

【0460】

ｍＣＢＳ及びＣＢＳの生物学的効果のインビボでの証拠
実施例１７：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害から臓器を保護する
この実施例は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される臓器損傷からマウスを保護し得ることを示す。

【0461】

ヒストンのマウスへの静脈内注射により、臓器中に微小血栓が形成されて細胞傷害及び臓器機能障害が引き起こされることが実証されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９ Ｎｏｖ；１５（１１）：１３１８−２１．２００９）。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００９と同一の敗血症のマウスモデルを使用して、本発明者らは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される臓器障害からマウスを保護し得るかどうかを調べた。マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈注射の１０分前に、６．２５、２５及び１００ｍｇ／ｋｇの濃度のｍＣＢＳ若しくはＣＢＳ又は等量のＰＢＳを腹腔内注射した。先に述べたように、４時間後、細胞傷害のマーカー（乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）、肝臓機能障害のマーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ）及び腎臓機能障害のマーカー（クレアチニン、Ｃｒｅａｔ）の分析のために、眼窩後から血液を採取した。結果を図２０に示す。具体的には、これらの結果を使用して、本発明者らは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって媒介される傷害から動物を用量依存的に保護し、肝機能及び腎機能の有意な保存が実証された（図２０）が、非硫酸化ＣＢは不活性であることを示すことができた。

【0462】

実施例１８：ｍＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害から血流内の細胞を保護する
この実施例は、ｍＣＢＳが、マウス中で循環している白血球、血小板及び赤血球のヒストンによって媒介される減少を弱める及び／又は予防することを示す。

【0463】

マウスへのヒストンの注射は、重度の血小板減少症を誘発することも分かっている。従って、本発明者らは、この実施例において、ヒストンの静脈内注射後の血流内の細胞へのｍＣＢＳの保護効果を調べた。先の実施例と同一のマウスモデルを使用して、マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈内注射の１０分前に１００ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射し、次いで１０分後に後眼窩出血させた。ＡＤＶＩＡ ２１２０血液システムを使用して、全血を、白血球数、血小板数及び赤血球数並びにヘモグロビン濃度に関して分析した。結果を図２１に示す。この結果は、循環している血小板数がヒストン注射の数分以内に有意に減少するだけでなく、白血球、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））及び血漿中ヘモグロビンレベルも有意に減少することを示した。さらに、ヒストンの前にｍＣＢＳを注射した場合、これらのヒストンによって媒介される効果は、完全には消失しないにしても有意に阻害された（図２１）。

【0464】

従って、これらの結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される傷害から血流内の細胞を保護することを示す。

【0465】

実施例１９：ＣＢＳ及びｍＣＢＳは敗血症を阻害する
本発明らは、次に、中程度及び重度の敗血症のラット盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルにおけるｍＣＢＳ及びＣＢＳの有効性を調べた。死亡したのはわずかであった（図２２Ａ）がＳＩＲＳ反応が誘発されている中程度の敗血症の例では、ｍＣＢＳ処理により、コントロールＣＬＰ群と比較して循環ＬＤＨレベルが有意に低下することが実証された（０．６±０．１及び１．１±０．２Ｕ／Ｌ×１０^３、ｐ＝０．０３；図２２Ｂ）。群間にＡＬＴレベル又はクレアチニンレベルの差異は認められず、軽症型の敗血症の誘発が裏付けられた（データは示さない）。

【0466】

病的状態がはるかに明白であった重度の敗血症の例では、齧歯類の死亡率は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＣＢＳを投与した動物では有意に低く、実際には、ＣＢＳ処理群では死亡率はゼロであった（図２３Ａ）。重要なことに、広範囲に及ぶ肝臓及び腎臓の損傷を示す、未処理群で検出された高いＡＬＴレベル及びクレアチニンレベルは、ＣＢＳで処理された動物では見られなかった（図２３Ｂ）。

【0467】

まとめると、これらの結果は、ＣＢＳ及びより安定なｍＣＢＳは、敗血症及びＳＩＲＳのヒストンによって媒介される効果を制限し得、そのため、組織損傷が制限されて末端臓器の機能が保存されることを示す。

【0468】

実施例２０：ＣＢＳ及びｍＣＢＳはＩＲＩを阻害する
ＩＲＩを阻害するＣＢＳ及びｍＣＢＳの能力を調べるために、ラット心臓ＩＲＩ（ｃＩＲＩ）モデルを用いた。虚血域は群間で等しかった（図２４Ａ）。ＣＢＳ処理は、微小血管閉塞の領域（図２４Ｂ）及び虚血域における心筋壊死（図２４Ｃ）を有意に５０％減少させた。さらに、ラットの皮膚弁ＩＲＩモデルでは、ｍＣＢＳは、皮膚弁の生存領域を一貫して且つ有意に増加させた（図２５）。

【0469】

実施例２１：ＣＢＳは静脈血栓症を阻害する
ＣＢＳがヒストンの局所的な血管効果を制御するかどうかを調べるために、ヒストンによって媒介される深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のモデルを確立し、ＣＢＳによりほぼ完全に阻害されることを示した（図２６）。

【0470】

このデータは、遊離ヒストンによって媒介される全身及び局所の両方の血管病理がＣＢＳ／ｍＣＢＳによる阻害に適していることと一致する。

【0471】

実施例２２：ｍＣＢＳは自己免疫を阻害する
本発明者らは、次に、ヒトでの多発性硬化症に類似する実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）と呼ばれる自己免疫の動物モデルを阻害するｍＣＢＳの能力を評価した。データを図２７に示し、このデータから、ｍＣＢＳは、毎日投与された場合、３５日間のウインドウにわたりＥＡＥ発症からマウスを実質的に保護することが明らかになった。

【0472】

上記実施例では、本発明者らは、遊離ヒストンによって媒介される多くの病理プロセス（例えば、細胞毒性、赤血球の脆弱性／変形能及び血小板活性化）の非常に有効なインビトロ阻害剤としての小さいポリアニオン性分子の開発を説明する。

【0473】

これらのデータは、ＣＢＳ／ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＩＲＩ、血栓症及び自己免疫）を阻害し得る主要データの証明も提供する。

【0474】

ヒト及び動物では、ｍＣＢＳは非常に安定しており、且つ高用量で良好な耐容性を示し、唯一の用量制限特性は抗凝固活性であるが、この活性は、ＬＭＷ−ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。そのため、ｍＣＢＳは、相当な臨床的可能性を有する新しいクラスの治療法を示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【手続補正書】

【提出日】2020年8月13日

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、対象における細胞外ヒストンの病理活性を阻害するための化合物及び方法に関する。具体的には、本発明は、細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、全身性免疫反応症候群（ＳＩＲＳ）及び虚血再灌流傷害（ＩＲＩ）等）を阻害するか又は寛解させるための化合物、使用及び方法に関する。より具体的には、本発明は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドの方法及び使用であって、この置換基の存在は、化学的安定性が高い分子を、細胞外ヒストンによって媒介される病気の治療で有効であるこの分子の能力に影響を及ぼすことなくもたらす、方法及び使用に関する。例えば、本発明は、対象における細胞外ヒストンによって媒介される様々な病気の治療における、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）又はその薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）の方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒストンは、ＤＮＡと複合体化してヌクレオソームを形成することにより遺伝子発現を調節するように細胞核中で機能する小さい塩基性タンパク質であり、このヌクレオソームは、クロマチン構造に集合する。核内機能に加えて、Ｘｕら（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９．１５：１３１８−２１）は、炎症プロセスに反応して放出されるヒストンの細胞毒性活性を報告しており、この細胞外ヒストンは、敗血症における内皮細胞の機能障害、臓器不全及び死のメディエータとして作用する。

【0003】

ヒストンは、現在、核から核外空間に移行する際の内因性危険シグナル又はＤＡＭＰとしても認識されている。ヒストンは、ストレスに反応して、免疫細胞、小脳ニューロン、シュワン細胞及びミクログリアの細胞表面において又は細胞質中で検出されることが多く、Ｔｏｌｌ様レセプタ及びインフラマソーム経路を活性化することにより全身性の炎症反応及び毒性反応を引き起こすことが分かっている。ヒストン及びヌクレオソームの循環レベルの上昇は、疾患（例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患及び癌）の複数の病態生理学的プロセス及び進行に関与しており、多くのヒト疾患での細胞外ヒストンの役割を支持している。

【0004】

近年、細胞外ヒストンによって媒介される疾患の有効な新規の治療法を見出そうといういくつかの試みが行われている。例えば、炎症の重要なメディエータに対するモノクローナル抗体を作製するために相当な努力が払われているが、これらは、臨床的に効果がないことが証明されており、特に敗血症患者で危険な副作用があることも分かっている。

【0005】

抗ヒストン処置（例えば、中和抗体、活性化プロテインＣ、組換えトロンボモジュリン及びヘパリン）は、致死性の内毒血症、敗血症、虚血／再灌流傷害、外傷、膵炎、腹膜炎、脳卒中、凝血及び血栓症からマウスを保護することが分かっているが、有効性の欠如又は容認できない副作用に起因して臨床的価値が限定されている。例えば、精製済ヒト凝固因子（例えば、組換えヒトＡＰＣ（例えば、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））等の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ））は、臨床的影響がほとんどない。これにはいくつかの理由がある。１つの理由として、出血のリスクの増加につながるＡＰＣの抗凝固活性が挙げられ、そのため、ＡＰＣ薬物は、手術後又は外傷後の患者で発症する可能性があるＳＩＲＳの治療から除外されている。同様の理由から、ＡＰＣをベースとする治療薬は、出血のリスクが高い白血病患者で生じる敗血症での使用から除外されている。さらに、敗血症は、急速に発症することから、ＡＰＣの比較的遅い作用様式は、不利である。実際に、有効性の欠如に起因して、Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標）は、２０１１年１０月２５日に販売が中止された。

【0006】

そのため、これらの努力にもかかわらず、細胞外ヒストンによって媒介される疾患は、ヒトに存在する最も衰弱させて致死的である疾患のいくつかであるものの、ほとんど処置されないままである。従って、重要な臨床的問題が示されている。

【0007】

細胞外ヒストンによって媒介される状態又は疾患（例えば、敗血症）の処置に適用されている化合物の１つのクラスが米国特許第９，２２６，９３９号明細書で開示されている。この米国特許は、対象における細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害する方法に関する発明を対象としており、この方法は、対象へのポリアニオンの有効量の投与を必要とする。この米国特許公報では、構造が非常に異なる多様なポリアニオンが開示された。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、複数の疾患における細胞外ヒストンの役割の認識の高まりというこの背景に対して開発されている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

炎症性チャレンジに反応して放出される細胞外ヒストンは、内皮機能障害、臓器不全及び細胞死（特に敗血症中）の一因となるメディエータである。本発明は、選択された非常に安定なポリアニオン性化合物がヒストンと静電気的に相互作用して、この分子の細胞変性特性、赤血球損傷特性、血小板活性化特性及び凝血促進特性を中和し得るという発見に基づいている。生きている動物の循環中でのそのようなポリアニオン性分子と細胞外ヒストンとの複合体化は、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を少なくとも改善する手段を提供する。

【0010】

具体的には、本発明者らは、特定の硫酸化二糖類がヒストンのこれらの病理学的効果の中和で有効であることを確認している。例えば、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ）に対して非常に有効な処置も提供し得、且つ患者においてこれらの状態を少なくとも寛解させ得る化学的に安定したポリアニオンを提供する。

【0011】

本発明者らは、本発明の化合物が、細胞外ヒストンによって媒介される病気の診断、予後及び管理のための方法を提供することも確認している。

【0012】

本発明は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドが濃度依存的に細胞外ヒストンの細胞毒性から内皮細胞を保護し、且つヒストンによって誘発される損傷（例えば、赤血球の凝集及び溶解）を減少させるか又はさらに反転させ、且つ例えば敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩの対象において細胞傷害及び臓器機能不全から保護するという本発明者らの発見にも基づいている。

【0013】

結果的に化学的に安定であるポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシドの使用により、ヒストンによって媒介される病理に罹患している患者の処置の分野及び／又はリスクのある患者においてヒストンによって媒介される病理が生じることを予防する分野での、適用の新規の一般的原理が提示又は提供される。

【0014】

本発明の第１の態様では、細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防での使用のための化合物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む化合物が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0015】

本発明の化合物は、治療上有効な量又は薬学的に有効な量で存在する場合、細胞外ヒストンによって媒介される病気を寛解させるか、処置するか又は予防する手段を提供する。

【0016】

本発明のある実施形態では、この改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、全体構造：

【化1】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基、例えばＯ−又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルであり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ（ｉ）小さい非荷電Ｏ結合置換基、又は（ｉｉ）サルフェート基から選択される）
を有する。

【0017】

好ましくは、Ｒ１は、Ｏ−又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである。好ましくは、Ｒ１は、Ｒ１でサルフェート基を有する同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0018】

好ましくは、Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれ（ａ）非改変ヒドロキシル基、又は（ｂ）サルフェート基から選択される。

【0019】

より好ましくは、Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択されるサルフェート基である。

【0020】

望ましくは、このクラスの化合物は、高い正味の負電荷を有し、即ちポリアニオンである。

【0021】

この小さい非荷電グリコシド置換基（Ｒ１）のアノマー配置は、α位又はβ位のいずれかであり得る。好ましくは、この小さい非荷電置換基は、β配置である。

【0022】

本発明の非常に好ましい形態では、本化合物は、硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖であるｍＣＢＳ又はその薬学的に許容される塩である。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩、即ちナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0023】

ｍＣＢＳは、ＣＢＳと比べて非常に安定しており、高濃度で良好に耐容性である。ｍＣＢＳは、抗凝固効果が最小限に抑えられており、ヒストンによって誘発される血漿凝固撹乱を減少させ得る。ｍＣＢＳの抗凝固活性は、低分子量ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。

【0024】

本発明の第２の態様では、対象における細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を（治療的又は予防的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0025】

例えば、本発明の第２の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ又は敗血症及び／若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するか、又は予防するか、又は寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0026】

本発明のこの実施形態によれば、この敗血症／ＳＩＲＳの処置により、敗血症／ＳＩＲＳ若しくは敗血症性／ＳＩＲＳ状態又はこれらと関連する疾患が寛解され、二次的な状態を処置するために医師が他の薬物を投与することを可能にする。

【0027】

本発明の第２の態様の別の実施形態では、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するか、又は予防するか、又は寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0028】

本発明の第３の態様では、対象における細胞外ヒストンの蓄積を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0029】

例えば、本発明の第３の態様のある実施形態では、この方法を使用して、細胞外ヒストン関連の合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩ）と関連する状態又は病気を予防する。

【0030】

本発明の第２又は第３の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された方法は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っているか若しくは患うリスクがある１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の医薬組成物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を、この改変されている硫酸化セロビオシドと一緒に又はこの硫酸化セロビオシドに付随（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔｌｙ）して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0031】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンに関連する合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ）及び／又はそのような合併症と関連する医学的状態若しくは疾患を対象とする処置に対して補助的処置を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0032】

好ましくは、第２の活性剤は、本発明の化合物によって処置される医学的病気に関連するか又はこの医学的病気と異なる、患者が患っている疾患の医学的介入の手段を提示し、前記第２の活性剤は、この患者に補助的処置を提供する。

【0033】

本発明の第４の態様では、対象における細胞外ヒストンと関連する医学的状態又は疾患を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0034】

本発明の第４の態様の好ましい一例では、この方法を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であり、及び／又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となる細胞外ヒストンを中和する。加えて又は代わりに、この方法を使用して、対象における感染、炎症若しくは低酸素症又はあらゆる感染、炎症若しくは低酸素症の反応後の対象における細胞外ヒストンの放出であるか、それによって引き起こされるか、又はそれによって媒介される敗血症性状態若しくはＳＩＲＳ状態、又はＩＲＩ、又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する疾患を処置する。

【0035】

本発明の第５の態様では、細胞外ヒストン関連の合併症の処置での使用のための治療用組成物又は医薬組成物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を少なくとも含む治療用組成物又は医薬組成物が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。好ましくは、この化合物は、治療用組成物又は医薬組成物中に治療上有効な量又は薬学的に有効な量で存在する。この組成物は、治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤も含み得る。この治療又は医薬での化合物は、中性遊離塩基形態又は塩形態のいずれかである。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシド化合物は、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0036】

本発明の第５の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された組成物は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物も含み得る。

【0037】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、望ましくは、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩの補助的治療又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0038】

本発明の第６の態様では、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療用有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0039】

例えば、本発明の第６の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0040】

そのような使用の一実施形態では、この薬物は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳ又は敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置により、前記敗血症若しくはＳＩＲＳ又は前記敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する前記状態若しくは疾患が寛解されるか又は阻害される。

【0041】

そのような使用の別の実施形態では、この薬物は、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置により、前記ＩＲＩ又は前記傷害と関連する前記状態若しくは疾患が寛解されるか又は阻害される。

【0042】

そのような使用のさらに別の実施形態では、この薬物を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを中和する。

【0043】

さらに別の実施形態では、製造された薬物は、第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量も含み得る。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための補助的治療を提供する。望ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩの処置のための補助的治療又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される。より好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0044】

本発明の方法のいずれかにおいて、改変されている硫酸化セロビオシド化合物を使用する場合、この化合物を、製剤の単回用量において、それを必要とする対象に投与し得るか、又はこの投与のために製剤化し得る。特定の代替実施形態では、この改変されている硫酸化セロビオシド化合物を、複数回用量製剤として、それを必要とする対象に投与するか、又はこの投与のために製剤化する。

【0045】

追加の目的、利点及び新規の特徴は、下記の説明に記載されるか、又は図面及び下記に続くいくつかの非限定的な実施形態の詳細な説明の考察により当業者に明らかになるであろう。

【0046】

本開示は、下記の図面を参照して、好ましい実施形態の下記の説明で詳細を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】ＨＰＬＣで測定した場合における、５±３℃（図１Ａ）、２５±２℃／６０％ＲＨ（図１Ｂ）及び４０±２℃／７５％ＲＨ（図１Ｃ）で貯蔵した際のｍＣＢＳに対するＣＢＳの安定性の比較を示す。この図は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳの開始量（Ｔ＝０）に対するこれらのパーセント（％）変化を示す。

【図2】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒト肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図3】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのラット肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒトラットミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図4】第Ｉ相代謝を許容する条件下でのイヌ肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、イヌ肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【図5】Ａ〜Ｄは、フローサイトメトリーのアウトプットを示すグラフであり、パネルＥ〜Ｇは、ｍＣＢＳがヒストン損傷からヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）を保護することを示す共焦点顕微鏡観察の結果を示す画像である。培養したＨＭＥＣを（Ａ及びＥ）水体積等量、（Ｂ及びＦ）ヒストン４００μｇ／ｍＬ、（Ｃ及びＧ）ｍＣＢＳ １００μｇ／ｍＬ＋ヒストン４００μｇ／ｍＬ、又は（Ｄ）ｍＣＢＳ ２５μｇ／ｍＬ＋ヒストン４００μｇ／ｍＬで６０分にわたり処理し、次いで色素カルセイン−ＡＭ及びＰＩで標識し、フローサイトメトリー（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は共焦点顕微鏡（Ｅ、Ｆ及びＧ）を使用して、色素取り込みの程度に関して分析した。四分の一区中の数字は、各四分の一区中に存在する細胞の割合を示す。生存細胞は、カルセイン−ＡＭ（緑色）を取り込み且つＰＩを排除するが、損傷細胞及び死滅細胞は、ＰＩ（赤色）を取り込み且つカルセイン−ＡＭを保持し得ない。フローサイトメトリーをベースとするアッセイは、ＨＥＭＣの懸濁液を使用したが（パネルＡ〜Ｄ）、共焦点顕微鏡実験は、ＨＭＥＣ単層を使用しており（パネルＥ〜Ｇ）、ＨＥＭＣの単層は、ヒストン損傷に対してより敏感である。

【図6】ヒストンによって誘発されるＨＭＥＣへの損傷に対するｍＣＢＳの保護効果は、濃度依存的であることを示すグラフである。培養したＨＭＥＣを、上昇する濃度のｍＣＢＳの添加後に４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いでフローサイトメトリーを使用してカルセイン−ＡＭ（生存）又はＰＩ（死滅）の取り込みに関して分析した。死滅／生存細胞をコントロール未処理細胞の％として表した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図7】１時間にわたりヒストンに曝露したＨＭＥＣの一部においてｍＣＢＳが損傷を反転させ得ることを示すグラフである。培養したＨＭＥＣを６０分にわたり４００μｇ／ｍｌのヒストンに曝露し、１０分にわたりｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、次いでフローサイトメトリーを使用してＰＩ取り込みに関して分析した。細胞毒性を、６０分にわたりヒストン（＋ｖｅコントロール）で処理した細胞によるＰＩ取り込みの割合として表した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図8】パネルＡ〜Ｃは、フローサイトメトリーのアウトプットのグラフを示し、パネルＤ〜Ｆは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集がｍＣＢＳにより防止されることを示す走査型電子顕微鏡観察の結果の図を示す。単離ヒトＲＢＣを、（Ａ及びＤ）処理なし後、（Ｂ及びＥ）６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション後及び（Ｃ及びＦ）６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）による処理、次いで１０分にわたるｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）への曝露後の凝集の程度に関して、ｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ自己蛍光（ＦＬ−１チャネル）パラメータを使用するフローサイトメトリーで分析するか、又は走査型電子顕微鏡を使用して可視化した。

【図9】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示すグラフである。単離ヒトＲＢＣを６０分にわたり様々な濃度のヒストンに曝露し（パネルＡ）、凝集の程度を、図８のように自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルにより測定した。４００μｇ／ｍＬのヒストンの添加前に様々な濃度のｍＣＢＳをＲＢＣに添加することを除いて（Ａ）と同様である（パネルＢ）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、コントロール（ヒストンが存在しない）との有意差を示し、Ｐ値は、＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図10】ｍＣＢＳは、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化する効果である、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害することを示すグラフである。６０％の生理食塩水（６：４の比率での通常の生理食塩水：水）で希釈した単離ヒトＲＢＣを６０分にわたり、上昇する濃度のヒストンと共にインキュベートし、次いでロボットシステム内において、４０回反復で次第に早い流速（ｍｍ／秒）に曝露する（パネルＡ）か、１００ｍｍ／秒の流速で様々な反復のピペッティングに曝露する（パネルＢ）か、又は様々な濃度のｍＣＢＳで処理し、次いで６０分にわたり且つ１００ｍｍ／秒のせん断流速及び４０回ピペッティング反復で４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露した（パネルＣ）。次いで、各サンプルからの上清を、ＲＢＣ溶解の程度の指標としてのＡ５４０ｎｍでのヘモグロビン含有量に関して測定した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、これまでの処理との有意差を示し、Ｐ値は、＜０５（^＊）、＜００１（^＊＊＊）及び＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図11】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発されるＲＢＣの溶解及び凝集に対する感受性を反転させることを示すグラフである。単離ヒトＲＢＣを５５分にわたり４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いで５分にわたり様々な濃度のｍＣＢＳに曝露した後（パネルＡ）、せん断力（１００ｍｍ／秒の流速及び４０回ピペッティング反復）を適用し、Ａ５４０ｎｍにより上清中のヘモグロビンの測定し、フローサイトメトリーを使用するＦＬ１での自己蛍光のレベルにより測定してＲＢＣ凝集の程度を分析した（パネルＢ）。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、コントロール処理（ヒストンのみ、ｍＣＢＳは存在しない）との有意差を示し、全てのＰ値は、＜０００１（^＊＊＊＊）である。

【図12】ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される病理の効果的な阻害剤であるには、ｍＣＢＳの高レベル硫酸化が必要であることを示す。ａ．完全に硫酸化された（ヘプタ硫酸化）ｍＣＢＳと比較した、ジ−、トリ−、テトラ−及びペンタ−硫酸化ｍＣＢＳ調製物の構造。ｂ．ペンタ硫酸化ｍＣＢＳのみが、ＨＭＥＣ−１に関するヒストンによって媒介される細胞毒性を弱く阻害することを示す阻害曲線。ｃ．ヒストンによって誘発される赤血球脆弱性の阻害の調査時に得られた同様の結果。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）で表した。

【図13】ヒストンは、血小板の凝集及び脱顆粒を誘発し、且つこれらの効果は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳにより阻害され得ることを示すグラフである。（パネルＡ）単離ヒト血小板を１時間にわたり様々な濃度のヒストンと共にインキュベートした後、ＦＳＣ及びＳＳＣを使用するフローサイトメトリーによる凝集の分析により、単一の血小板と凝集した血小板とを識別した。（パネルＢ）（Ａ）と同様であるが、ヒストン（１５０μｇ／ｍＬ）の前に様々な濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ及び非硫酸化ＣＢを添加した。（パネルＣ）全血中のヒト血小板を、ケミルミノメトリ（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）を使用して、上昇する濃度のヒストンの添加後の脱顆粒（ＡＴＰ放出）に関して分析し、陽性コントロールとしてトロンビンを含めた。（パネルＤ）ヒストンの添加（４００μｇ／ｍＬ）前に、上昇する濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ及び非硫酸化ＣＢを添加したことを除いて（Ｃ）と同様である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図14】ヒストンによって媒介される細胞に対する細胞毒性は、細胞表面のヘパラン硫酸を必要としない。ａ．懸濁液中のＨＭＥＣ−１を細菌ヘパリナーゼ１、２及び３（フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来）又はヒト血小板へパラナーゼのいずれかで処理した。次いで、未処理（ヒストン単独）及びヘパリン化した／へパラナーゼ処理したＨＥＭＣ−１の、ヒストンによって媒介される細胞毒性に対する感受性を決定した。ＨＭＥＣ−１からのヘパラン硫酸の酵素的除去は、ヒストンによって媒介される細胞毒性に対する細胞の感受性に影響を及ぼさず、処理は、ＨＭＥＣの生存率（Ｈｅｐ’ａｓｅのみ）にいかなる影響も及ぼさなかった。ｂ．野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びＧＡＧ欠損ｐｇｓＡ−７４５ ＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁液を、上昇する濃度のヒストンと共に３７℃で１時間にわたりインキュベートし、フローサイトメトリーにより死滅細胞を検出した。ＧＡＧの非存在により、高ヒストン濃度で、ヒストン細胞毒性に対する細胞の感受性がごくわずかではあるが有意に減少した。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）で表した。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１（Ｓｉｄａｋの多重比較検定による二元ＡＮＯＶＡ）。

【図15】ヒストンは、脂質二重層を破壊して細胞内Ｃａ^２＋流動を誘発するが、このプロセスは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳによりブロックされることを示す。ａ．ヒストン（ＨＩＳ）（１μｍ）単独（ｎ＝４７）又はＣＢＳ（ｎ＝５２）（１０μＭ）の存在下で曝露した人工脂質二重層の寿命。コントロール二重層（ｎ＝１２５）は、ＲμＲ１イオンチャネルタンパク質を含んだ。ノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を使用してＰ値を算出した。ｂ．ヒストン添加（１００μｇｍｌ^−１）後のＣａ^２＋流動ＨＭＥＣ−１を示す、Ｃａ^２＋感受性色素Ｉｎｄｏ−１を使用する代表的なフローサイトメトリープロット。ｃ．ＨＭＥＣ−１による、ヒストンによって誘発されるＣａ^２＋流動へのｍＣＢＳ（１００μｇｍｌ^−１）の効果の時間経過。

【図16】ヒストンは、血液凝固を減少させることを示すグラフである。ＲＯＴＥＭ全血凝固分析（パネルＡ）を使用して、ヒト全血への増加するヒストン濃度の添加により、全てのアッセイで凝固時間が長くなったが、特にＮＡＴＥＭアッセイ及びＩＮＴＥＭアッセイで長くなった。（パネルＢ）凝固へのヒストンの同一の抗凝固効果を、血漿ベースの凝固アッセイ（活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ））を使用して実証した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図17】全血凝固への硫酸化糖類の効果のＲＯＴＥＭ分析を示すグラフである。（パネルＡ）ＮＡＴＥＭ（非活性化）アッセイ、ＥＸＴＥＭ（外因性経路活性化）アッセイ、ＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化）アッセイ及びＦＩＢＴＥＭ（中和した血小板による外因性経路活性化）アッセイを実施する直前に全血にｍＣＢＳ、マルトトリオースサルフェート又はメレチトースサルフェート（２００μｇ／ｍＬ）を補充した。データは、水コントロ−ルの倍数増加として表される凝固時間を示す。（パネルＢ）様々な濃度のｍＣＢＳ、メレチトースサルフェート又はマルトトリオースサルフェートを補充した全血を、凝固時間に関してＮＡＴＥＭアッセイを使用して分析した。データが２０分での血餅振幅（ｃｌｏｔ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）を示すことを除いて（Ｂ）と同様である（パネルＣ）。５０及び１００μｇ／ｍＬでは２種の三糖類により凝固が検出されなかった。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図18】ｍＣＢＳの抗凝固効果と、ヘパリン及び低分子量ヘパリンであるエノキサパリンとの比較を示すグラフである。ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、括弧内に示す濃度（μｇ／ｍＬ）でのヘパリン、エノキサパリン、三糖であるマルトトリオースサルフェート及びｍＣＢＳの添加後に全血凝固を測定した。

【図19】ｍＣＢＳは、ヒストンによって誘発される全血凝固の混乱を阻害することを示すグラフである。ＥＸＴＥＭアッセイを使用して、４００μｇ／ｍＬ及び８００μｇ／ｍＬのヒストンによって誘発される凝固時間の延長を２００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳの事前の添加により阻害し得た。同量の水の添加は、阻害効果がなかった。エラーバーは、ＳＥＭを示す。

【図20】ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される臓器損傷からマウスを保護することを示すグラフである。マウスに対し、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈注射の１０分前に、示した濃度のｍＣＢＳ、ＣＢＳ若しくは非硫酸化ＣＢ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射した。４時間後、細胞傷害のマーカー（ＬＤＨ−乳酸デヒドロゲナーゼ）、肝臓機能障害のマーカー（ＡＬＴ−アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び腎臓機能障害のマーカー（Ｃｒｅａ−クレアチニン）の分析のために眼窩後から血液を採取した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。^＊Ｐ≦０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡ）。

【図21】ｍＣＢＳは、循環している白血球、血小板及び赤血球のヒストンによって媒介される減少を弱めるか又は予防することを示すグラフである。マウスに対し、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈内注射の１０分前に１００ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射し、次いで１０分後に後眼窩出血させた。ＡＤＶＩＡ ２１２０血液システムを使用して、全血を白血球数、血小板数及び赤血球数並びにヘモグロビン濃度に関して分析した。エラーバーは、ＳＥＭを示す。アスタリスクは、ＰＢＳ＋ＨＩＳコントロールとの有意差を示し、ｐ値は、＜０１（^＊＊）、＜００１（^＊＊＊）である（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定による一元ＡＮＯＶＡ）。

【図22】ｍＣＢＳは、中程度の敗血症によって誘発される細胞損傷からラットを保護することを示す。中程度の敗血症のラットモデルにおいて（パネルＡ）、ｍＣＢＳで処理した（ｍＣＢＳ）ラット及び未処理の（コントロール）ラットの生存率を示し、中程度の敗血症の動物モデルにおいて（パネルＢ）、ｍＣＢＳが細胞損傷（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ））を減少させることを示すグラフである。雄のＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝８／群）を、開腹して盲腸の結紮及び穿刺（ＣＬＰ）を行って、便性腹膜炎及びその後の敗血症を刺激し、次いで術後０、５及び１０時間でｉ．ｐ．注射により生理食塩水（コントロールＣＬＰ）又は５０ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳで処理し、２０時間にわたりモニタリングした。ラットが重度の病的状態に達すると、その時点で人道的に安楽死させ、死亡を記録した。パネルＡで見られるように、ｍＣＢＳで処理したラットは、１００％の生存率を示し、パネルＢで見られるように、ｍＣＢＳ処理は、コントロールＣＬＰ群のラットと比較して循環ＬＤＨレベルを有意に低下させた（統計解析：両側、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、ｐ≦０．０５）。

【図23】ＣＢＳは、重度の敗血症によって誘発される病的状態及び臓器損傷からラットを保護する。ａ．盲腸の結紮及び穿刺（ＣＬＰ）が行われ、生理食塩水（コントロール）及びＣＢＳが投与されたラット（ｎ＝８／群）の生存率。Ｐ値をＬｏｇ ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定により得た。ｂ．それぞれＡＬＴ及びクレアチニンの血中レベルにより測定した、ＣＬＰラットにおける肝臓及び腎臓の損傷。

【図24】ＣＢＳは、心臓虚血再灌流傷害モデルにおける微小血管閉塞及び心筋壊死を減少させる。左心室（ＬＶ）での虚血域（ＩＺ）、微小血管閉塞（ＭＶＯ）及び心筋壊死（梗塞領域）を測定した、心臓ＩＲＩへのＣＢＳ（ｎ＝６／群）の効果。

【図25】ｍＣＢＳは、虚血再灌流後の組織弁の生存率を改善することを示す。筋膜弁を、血管茎を無傷のままにしてラット（ｎ＝３〜５／群）の腹部から切除し、栄養血管を１０時間にわたりクランプし、次いで解放した。クランプの適用５分前及びこのクランプの除去５分後、ｍＣＢＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水をｉ．ｐ．投与した。ラットを、術後２４時間及び４８時間で追加の化合物又は生理食塩水をラットにｉ．ｐ．投与した７２時間の総実験期間にわたりモニタリングした。示した代表的な写真による弁の壊死（黒くなったか又は赤くなった領域）の程度を用いて、弁の生存率を７２時間で決定した。

【図26】ＣＢＳは、ヒストンによって誘発される深部静脈血栓症を予防することを示す。マウス（ｎ＝８／群）の下大静脈（ＩＶＣ）を約１０％の開存性まで結紮し、その後、全てのマウスに尾静脈を介してヒストン（１０ｍｇ／ｋｇ）又は等量の生理食塩水をｉ．ｖ．注射し、続いて５分後にＣＢＳ（５０ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水をｉ．ｖ．注射した。マウスを４８時間にわたりモニタリングし、その後、再び麻酔して、ＩＶＣ狭窄の遠位で発症していた任意の血栓を分析のために取り出した。データを平均±ｓ．ｅ．ｍで表す。^＊Ｐ≦０．０５。（Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定によるＡＮＯＶＡ）。

【図27】多発性硬化症モデルにおけるｍＣＢＳ活性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＭＯＧ３５−５５／ＣＦＡ／ＰＴで免疫付与して、ＥＡＥを誘発させた。０〜９日目に、ｍＣＢＳ又はＰＢＳのみ（ビヒクル）を毎日ｉ．ｐ．投与した。マウスを疾患の徴候に関して免疫付与後の１７〜３５日の期間にわたり毎日モニタリングした。ｍＣＢＳ処理（ｎ＝３６）及びビヒクル処理（ｎ＝３３）、ＥＡＥ誘発のみ（ｎ＝１４）、未処理コントロール（ｎ＝３２）の平均臨床スコア。データを、６個の独立してプールした実験から得ている。示しているのは、平均疾患スコア＋／−ＳＥＭである。統計的有意性を、Ｓｉｄａｋ−Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法を使用して決定した。

【発明を実施するための形態】

【0048】

本発明は、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩ）の処置又は予防における、化学的安定性が高い、改変されている硫酸化セロビオシド化合物の使用を対象とする。そのような化合物により、対象における細胞外ヒストンの細胞毒性効果を寛解させ得るか、又は阻害し得るか、又は予防し得る。

【0049】

便宜のために、下記のセクションは、本明細書で使用される用語の様々な意味を全体的に概説する。この議論後、本発明を例示する一般的な例示的実施形態を開示し、続いて本発明の様々な例示的実施形態の特性のより具体的な例示を提供する具体例を開示する。

【0050】

概要
本明細書で説明されている本発明は、本明細書で説明されている本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、具体的に説明されているもの以外に変形及び改変される余地があることを当業者は認識するであろう。本発明は、全てのそのような変形形態及び改変形態を含む。本発明はまた、個々に又はまとめて、本明細書で言及されるか又は示される全てのステップ、特徴、組成物及び構成要素と、前記ステップ又は特徴の任意の及び全ての組み合わせ又は任意の２つ以上とを含む。機能的に均等な製品、物質の組成及び方法は、明らかに、本明細書で説明されている本発明の範囲内である。

【0051】

上記参照又は下記参照のいずれかで本明細書で引用されている全ての刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、これは、これらの刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願が本文の一部として読まれるべきであり且つ見なされるべきであることを意味する。本文で引用されている任意の刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願を本文中で繰り返さないのは、単に簡潔さのためである。しかしながら、本明細書で言及されている刊行物、参考文献、文献、特許及び特許出願は、これらの刊行物で報告されており且つ本発明に関連して使用される可能性があるプロトコル、試薬及び生成物を説明及び開示するために引用されている。本明細書のいかなるものも、先行発明により又はあらゆる他の理由により、本発明がそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。これらの文献の日付に関する全ての記載又は内容に関する表示は、本出願人らが入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確さに関していかなる承認も構成しない。

【0052】

本明細書で言及されているか又は参照により本明細書に組み込まれる任意の文献で言及されている任意の製品のあらゆる製造業者の指示書、説明書、製品仕様書及び製品シートは、参照により本明細書に組み込まれ、且つ本発明の実施で用いられ得る。

【0053】

本明細書で使用される選択された用語の定義は、本発明の要約及び本発明の詳細な説明内に見出され得、且つ全体を通して適用される。別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての他の科学用語及び技術用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用法と、本明細書に記載されているこの用語の定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、本明細書内に記載されている定義が優先されるものとする。

【0054】

定義
作業実施例又は別途指示されている場合を除いて、本明細書で使用されている成分又は反応条件の量を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」により修飾されていると理解すべきである。例えば、用語「約」は、百分率と関連して使用される場合、±１０％を意味し得る。

【0055】

別途文脈が必要としない限り又は本明細書が明確に反対のことを述べない限り、単数の整数、ステップ又は要素として本明細書で列挙されている本発明の整数、ステップ又は要素は、列挙された整数、ステップ又は要素の単数形及び複数形の両方を明確に包含する。本明細書全体を通して、別途述べない限り又は別途文脈が必要としない限り、単一のステップ、組成物若しくは物質、ステップの群又は物質の組成物の群への言及は、１つ及び複数（即ち１つ以上）の又はこれらのステップ、組成物若しくは物質、ステップの群又は物質の組成物の群を包含すると見なすものとする。従って、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含む。そのため、例えば、「硫酸化セロビオシドであって、その還元末端で小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩」への言及は、複数のそのような改変されている硫酸化セロビオシド化合物又は複数のその塩及び同類のものを含む。

【0056】

本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、別途文脈が必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」等のバリエーションは、述べられているステップ、若しくは要素、若しくは整数又はステップ、若しくは要素、若しくは整数の群の包含を暗示するが、あらゆる他のステップ、若しくは要素、若しくは整数又はステップ、若しくは要素、若しくは整数の群の排除を暗示しないと理解されるであろう。

【0057】

本明細書で使用される場合、用語「包含している」並びに「包含する」及び「包含される」等のバリエーションも限定的ではないと理解されるであろう。

【0058】

本出願では、「又は」の使用は、別途述べない限り「及び／又は」を意味する。

【0059】

本明細書で説明されている本発明は、１つ又は複数の範囲の値（例えば、サイズ、変位及び電界強度等）を含み得る。値の範囲は、この範囲を定義する値等のこの範囲内の全ての値と、この範囲の境界を定義する値に直接隣接する値と同一の又は実質的に同一の結果を導く、この範囲に隣接する値とを含むと理解されるであろう。例えば、関連分野の当業者は、範囲の上限又は下限の１０％変動が完全に適切であり得、且つ本発明に包含されることを理解するであろう。より具体的には、範囲の上限又は下限の変動は、５％であるか、又は当該技術分野で一般的に認識されているようにいずれかがより大きい。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「状態」、「病気」又は「疾患」（互換的に使用される）は、細胞外ヒストンの放出によって媒介される細胞外ヒストン関連の合併症を意味する。

【0061】

本明細書で使用される場合、語句「細胞外ヒストン関連の合併症」は、特に限定されることなく、ヒストンによって媒介される、（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば心血管疾患又は慢性心血管疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を意味する。

【0062】

本明細書で使用される場合、用語「敗血症」は、その意味において、標準的な医学参考文献で特徴付けられており、及び／又は当業者に既知である敗血症の疾患又は状態の全てのステージを含む。例えば、敗血症は、重度の敗血症、急性及び慢性の敗血症並びに敗血症性ショックを含む。用語「敗血症」は、本明細書で使用される場合、感染と関連するエピソードも含む。本明細書で使用される用語「ＳＩＲＳ」（全身性免疫反応症候群）は、感染と関連しないエピソード（例えば、外傷、熱傷、膵炎、臓器移植、手術、癌の治療レジーム後の腫瘍溶解、周産期合併症及び同種移植片の免疫抑制予防）を含む。

【0063】

本明細書で使用される場合、用語「敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態」又は「敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する疾患」は、それらの意味において、標準的な医学参考文献で特徴付けられており、及び／又は当業者に既知である敗血症又はＳＩＲＳの疾患又は状態の任意の又は全てのステージと直接的に又は間接的に関連するか、それに由来するか、それによって引き起こされるか又はそれを伴う全ての徴候及び症状を含む。例えば、敗血症又はＳＩＲＳと関連する医学的状態又は疾患として、感染の有無にかかわらず対象において現れる場合がある対象における敗血症又はＳＩＲＳの疾患又は状態の任意の又は全てのステージと関連するか、それに由来するか、それによって引き起こされるか又はそれを伴う下記の徴候又は症状の１つ又は複数が挙げられる：動脈性低血圧、代謝性アシドーシス、全身性血管抵抗減少、心拍数増加（頻脈）、呼吸速度増加（頻呼吸）、全体炎症若しくは全身性炎症、白血球数上昇若しくは白血球減少（白血球増加症又は白血球減少症）、血液中の細胞外ヒストンの増加、臓器機能不全、例えば急性臓器機能不全、循環系の機能不全、多臓器不全症候群、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、１種若しくは複数の臓器の微小血管系中でのフィブリンの沈着、発熱、錯乱、肺炎、肺炎を伴う咳、腎感染、腎感染を伴う排尿時痛及び／又は敗血症性ショック。

【0064】

本明細書で使用される場合、用語「低減する」、「低減した」、「低減」、「減少する」又は「阻害する」は、全て統計的に有意な量の減少を意味するために概して使用される。しかしながら、疑念を回避するために、「低減した」、「低減」若しくは「減少する」又は「阻害する」は、例えば、薬剤の非存在下で基準レベルと比較して少なくとも１０％の減少を意味し、例えば少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％の減少を意味する。

【0065】

本明細書で使用される場合、用語「改善する」、「増加した」、「増加する」若しくは「増強する」又は「活性化する」は、全て統計的に有意な量の増加を概して意味するように使用され、あらゆる疑念を回避するために、用語「改善する」、「増加した」、「増加する」若しくは「増強する」又は「活性化する」は、例えば、薬剤の非存在下で基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加を意味し、例えば少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％）、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％の増加又は少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増加又は基準レベルと比較して２倍〜１０倍以上の任意の増加を意味する。

【0066】

本明細書で使用される場合、用語「投与する」、「投与した」及び「投与すること」は、所望の効果が生じるように、所望の部位での組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路による、この組成物の対象への配置を指す。本明細書で説明されている化合物又は組成物を、当該技術分野で既知の任意の適切な経路により投与し得、この経路として経口経路又は非経口経路が挙げられるが、これらに限定されず、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、経鼻投与、直腸投与並びに局所（例えば、頬側及び舌下）投与が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本化合物は、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩である。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。上記化合物が治療用組成物又は治療用組成物等の組成物中に存在する場合、この化合物は、非経口投与のために調製されるか、又は標的部位への送達を可能にする別の他の方法のために調製される。いくつかの例示的な投与形態として、注射、注入、点滴、吸入又は経口摂取が挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

本明細書で使用される場合、用語「注射」は、下記を含むが、これらに限定されない：静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内の注射及び注入。好ましい実施形態では、本組成物を静脈内注入又は静脈内注射により投与する。

【0068】

本明細書で使用される場合、本明細書で列挙されている状態又は疾患のいずれかに関する限り、本発明に関連して、用語「処置する」、「処置」、「処置すること」及び同類のものは、そのような状態又は疾患と関連する少なくとも１種の症状又は合併症の進行、悪化（ａｇｇｒａｖａｔｉｏ）、悪化（ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ）、進行、予想される進行又は重症度を軽減するか、緩和するか、寛解させるか、阻害するか、減速させるか、反転させるか又は停止させることを意味する。ある実施形態では、状態又は疾患の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％緩和される。

【0069】

本明細書で使用される場合、語句「有効量」、「治療上有効な量」又は「有効用量」（本明細書では互換的に使用される）は、これらの意味において、本発明の化合物又は組成物の、所望の効果が生じるのに十分であるが、非毒性である量を含む。必要とされる化合物又は組成物の正確な量は、所望の効果、処置する種、対象の年齢及び全身状態、処置する状態の重症度、投与する薬剤、投与様式及び同類のもの等の因子に応じて対象毎に異なるであろう。そのため、正確な「有効量」を指定することは、不可能である。しかしながら、任意の所与の場合に関して、適切な有効量（用量）を、日常的な実験のみを使用して当業者により決定し得る。一般に、治療上有効な量は、対象の病歴、年齢、状態、性別及び対象の医学的状態の重症度及び種類並びに他の薬学的に活性な薬剤の投与により変化し得る。

【0070】

本明細書で使用される場合、治療用途又は医薬用途での化合物及び組成物の使用への言及は、ヒト用途及び非ヒト（例えば、獣医）用途にも同様に適用可能であることが理解されるであろう。従って、別途指示されている場合を除いて、「患者」、「対象」又は「個体」（本明細書では互換的に使用される）への言及は、ヒト又は非ヒト（例えば、社会的に重要な、経済的に又は研究上重要なあらゆる種の個体）を意味することが理解され、この個体として下記が挙げられるが、これらに限定されない：哺乳類、鳥類、ウサギ類、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ネコ、イヌ、霊長類及び齧歯類の種。より好ましくは、患者、対象又は個体は、哺乳類の種に属する動物である。この哺乳類の種は、望ましくは、ヒト若しくは非ヒトの霊長類であるか、又はコンパニオン動物（例えば、家畜化されたイヌ、ネコ、ウマ、サル、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ若しくはブタ）である。特に好ましい一例では、患者、対象又は個体は、ヒトである。

【0071】

本明細書で使用される選択された用語の定義は、本発明の詳細な説明中に見出され得、且つ全体を通して適用される。別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての他の科学用語及び技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。

【0072】

本発明の例示的実施形態
下記の本発明の詳細な説明は、本発明を例示する目的のためにのみ含まれており、上記に記載されているような本発明の広範な説明への限定として決して理解されるべきではない。

【0073】

１．本発明の化合物
本発明の第１の態様では、細胞外ヒストンによって媒介される合併症の処置での使用のための化合物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む化合物が提供される。この置換基は、同一のポリアニオンであるが、還元末端で硫酸化されているポリアニオンと比べて、分子に高い化学的安定性を付与する。好ましくは、このクラスの化合物は、高い正味の負電荷を有するはずである。

【0074】

本発明の化合物は、細胞外ヒストンによって媒介される合併症（例えば、敗血症又は虚血再灌流傷害）を、予防的（即ち医療処置に対する予防的前処置として）又はこの状態若しくは疾患が発生した後の処置中の治療的の両方で寛解させ得る。

【0075】

本発明のある実施形態では、この改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドは、全体構造：

【化2】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、例えばＯ−又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルであり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ（ｉ）小さい非荷電Ｏ結合置換基、又は（ｉｉ）サルフェート基から選択される）
を有する。

【0076】

好ましくは、Ｒ１は、Ｏ−又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである。好ましくは、Ｒ１は、Ｒ１でサルフェート基を有する同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0077】

好ましくは、Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれ（ａ）非改変ヒドロキシル基、又は（ｂ）サルフェート基から選択される。

【0078】

より好ましくは、Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択されるサルフェート基である。

【0079】

望ましくは、この化合物のクラスは、高い正味の負電荷を有し、即ちポリアニオンである。

【0080】

この小さい非荷電グリコシド置換基（Ｒ１）のアノマー配置は、α位又はβ位のいずれかであり得る。好ましくは、この小さい非荷電置換基は、β配置である。

【0081】

本発明の非常に好ましい形態では、本化合物は、硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖であるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート又はその薬学的に許容される塩である。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0082】

ｍＣＢＳは、ＣＢＳと比べて非常に安定しており、高用量で良好に耐容性である。ｍＣＢＳは抗凝固効果が最小限に抑えられており、ヒストンによって誘発される血漿凝固撹乱を減少させ得る。ｍＣＢＳの抗凝固活性は、低分子量ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。

【0083】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。

【0084】

化学的安定性は、本明細書で使用される場合、本発明の化合物の、変化（具体的には自然環境中での分解又は空気、熱、光、圧力若しくは他の自然条件に曝露された際の分解又は内部反応に起因する分解）に抵抗する傾向を表す。

【0085】

本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べて有意に分解していない場合に「安定」である。

【0086】

本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に３個以上のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。好ましくは、本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に２個のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。最も好ましくは、本発明の化合物は、予想される使用条件又は通常の環境条件下での少なくとも１ヶ月の貯蔵後に１個のサルフェート基が失われている場合、有意に分解されているであろう。

【0087】

好ましくは、本発明の化合物は、ｐＨ７．５に緩衝化されたリン酸塩製剤中に保存され且つ２〜８℃で保存された場合、少なくとも２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月又は２４ヶ月にわたり化学的に安定である。より好ましくは、ｐＨ７．５に緩衝化されたリン酸塩製剤中で保存され且つ約２〜８℃で保存されている化合物では、６ヶ月〜２年の期間にわたり安定性が測定される。

【0088】

本明細書で使用される場合、語句「薬学的に許容される塩」は、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応及び同類のものを伴うことなくヒト及び下級動物の組織との接触での使用に適しており、且つ合理的な利益／リスク比に見合う塩を含む。

【0089】

薬学的に許容される塩は、当該技術分野で公知である。この塩として、例えば、無機酸（例えば、塩酸若しくはリン酸）又は有機酸（例えば、クエン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸及び同類のもの）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成されている）が挙げられる。同様に、タンパク質の遊離カルボキシル基で形成された塩も、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは第二鉄の水酸化物）又は有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン及び同類のもの）に由来し得る。

【0090】

本発明の好ましい形態では、本発明の改変されている硫酸化セロビオシドは、薬学的に許容される塩として存在する。実例として、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩であり、即ちナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0091】

本発明の方法又は組成物で使用される、改変されている硫酸化セロビオシド化合物又はその薬学的に許容される塩は、当業者に既知の方法により調製され得る。例えば、硫酸化化合物であって、その還元末端において非荷電置換基で改変されている硫酸化化合物を調製する方法は、全体が参照により本明細書に組み込まれるＫａｔｒｉｎ Ｃ Ｐｒｏｂｓｔ ａｎｄ Ｈａｎｓ Ｐｅｔｅｒ Ｗｅｓｓｅｌ，２００１，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（７＆８）：５４９−５６０で概して説明されている。

【0092】

２．処置方法
本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の病理活性を寛解させ得るか又は予防し得ることから、本発明は、本発明の第２の態様として、細胞外ヒストン関連の合併症の処置又は予防の方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。好ましくは、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0093】

さらに、本発明の第３の態様では、対象における細胞外ヒストンの蓄積を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与することを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0094】

本発明の第２及び第３の態様により説明されているような本発明は、ヒストンの放出及びその結果として生じる細胞外毒性によって引き起こされる様々な異なる細胞外ヒストン病気を処置又は予防することを企図する。本発明のこれらの態様によれば、それぞれの方法を、下記を有する対象における細胞外ヒストン関連の合併症の処置又は予防に使用し得る：（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば心血管疾患又は慢性心血管疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病。

【0095】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、それぞれの方法は、本発明の化合物と同時に又はこの化合物に付随して、対象が罹患しているか又は罹患する可能性がある医学的状態のための補助的処置を提供する、本発明の化合物と異なる第２の治療薬（例えば、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は他の形態の医学的介入）を対象に投与することをさらに含み得る。

【0096】

好ましくは、本発明のこれらの態様の一例として、それぞれの方法は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳ又は敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する手段を提供する。本発明のこれらの態様の別の例として、それぞれの方法は、対象におけるＩＲＩ又はＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する手段を提供する。

【0097】

好ましくは、この方法は、二次的な状態を処置するために医師が他の薬物を投与することを可能にするためにこの状態又は疾患状態を十分に寛解させる。そのため、本発明は、患者における細胞外ヒストン関連の合併症を寛解させる目的で、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を対象に投与することも含む。

【0098】

本発明の第２又は第３の態様に係る特定の例示的実施形態では、この特定された方法は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っているか若しくは患うリスクがある１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の医薬組成物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を、この改変されている硫酸化セロビオシドと一緒に又はこの硫酸化セロビオシドに付随して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0099】

この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストン関連の合併症（例えば、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ）及び／又はそのような合併症と関連する医学的状態若しくは疾患を対象とする処置に対して補助的処置を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0100】

好ましくは、第２の活性剤は、本発明の化合物によって処置される医学的病気に関連するか又はこの医学的病気と異なる、患者が患っている疾患の医学的介入の手段を提示し、前記第２の活性剤は、この患者に補助的処置を提供する。

【0101】

本明細書で開示されている本発明の治療用及組成物及び／又は医薬組成物を治療的又は予防的に投与し得る。治療用途では、化合物及び組成物を、細胞外ヒストン関連の合併症又はヒストン関連の合併症と関連する病気を既に罹患している患者に、この症状を治癒するか又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この化合物又は組成物を、単回用量において又は処置レジーム（例えば、複数回用量処置レジーム）の一部として、この患者を効果的に処置するのに十分な量の活性化合物で提供すべきである。予防的用途では、本発明の化合物及び組成物を、細胞外ヒストン関連の合併症と関連する病気を発症するリスクがある対象に、この病気の症状及び／又は合併症を少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。

【0102】

本発明の第４の態様では、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理と関連する医学的状態、病気又は疾患を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。

【0103】

好ましくは、この硫酸化セロビオシドは、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）又はその薬学的に許容される塩である。

【0104】

好ましい一例では、この方法を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを処置する。

【0105】

本明細書で説明されているあらゆる態様、実施形態又は例に係る本発明の非常に好ましい例示的形態では、本発明の化合物を使用して、後に論じる病気又は状態の１つ又は複数を処置又は予防する。

【0106】

Ａ．敗血症
敗血症（敗血症性ショックを含む）とは、動脈性低血圧、代謝性アシドーシス、全身性血管抵抗減少、頻呼吸及び臓器機能不全を特徴とする、感染に対する全身反応のことである。敗血症（敗血症性ショックを含む）は、サイトカインネットワーク、白血球並びに補体及び凝固線維素溶解系を含む多くの宿主防御機構の活性化と関連し且つこの活性化によって媒介される、感染に対する全身炎症反応でもある。様々な臓器の微小血管系中に線維素が広範に沈着した播種性血管内凝固（ＤＩＣ）は、敗血症の初期症状の場合がある。ＤＩＣは、多臓器不全症候群の発症において重要なメディエータであり、敗血症性ショックの患者の予後不良の一因となる。

【0107】

敗血症を引き起こす免疫学的反応は、炎症及び凝固経路の広範な活性化を引き起こす全身性炎症反応である。これは、循環器系の機能障害に進行する場合があり、たとえ最適な処置を受けても多臓器不全症候群を引き起こし、最終的に死に至る場合がある。

【0108】

敗血症の症状は、基礎となる感染プロセスに関連することが多く、未処置まま放置すると、重度の敗血症（急性臓器機能不全を伴う敗血症）又は敗血症性ショック（難治性の動脈性低血圧を伴う敗血症）として現れる可能性がある。全身性炎症反応症候群の基準（例えば、全身の炎症、発熱、白血球数の上昇（白血球増多症）並びに心拍数の上昇（頻脈）及び呼吸速度の上昇（頻呼））の２つ以上が感染の証拠なく満たされる場合、患者は、全身に影響を及ぼす敗血症性炎症状態である「ＳＩＲＳ」と単に診断される場合がある。

【0109】

敗血症の多くの患者は、２４〜４８時間にわたる急速な衰弱を示す。敗血症の効果的な処置のために迅速な処置が不可欠である。残念ながら、感染のタイプの診断には、数日を要する場合がある病原体を同定するための微生物学的分析が必要である。従って、病原体を除去するための治療（例えば、抗生物質治療）は、病原体のタイプ及び種を知ることなく且つ感染の程度を知る手段がない状態で開始されなければならない。本発明は、そのような方法を提供する。

【0110】

敗血症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、敗血症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0111】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の敗血症を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0112】

本明細書で実証されているように、本発明の化合物（特にｍＣＢＳ）は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし、それにより敗血症の処置として有用である。

【0113】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と敗血症が発症した後の処置との両方を含む、敗血症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0114】

Ｂ．非感染性ＳＩＲＳ
非感染性の全身炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）は、全身に影響を及ぼす炎症状態である。非感染性ＳＩＲＳは、非感染性の侵襲に対する身体の反応である。ＳＩＲＳの定義は、非感染性ＳＩＲＳを「炎症性」の反応と称するが、非感染性ＳＩＲＳは、実際には炎症誘発性成分及び抗炎症性成分を有する。

【0115】

ＳＩＲＳは、全身の炎症、臓器機能障害及び臓器不全に関連する重篤な状態である。ＳＩＲＳは、サイトカインストームのサブセットであり、様々なサイトカインの異常な調節が存在する。ＳＩＲＳは、敗血症とも密接に関係しており、この敗血症では、患者は、ＳＩＲＳの基準を満たしており、且つ感染が疑われるか又は感染が証明されている。非感染性ＳＩＲＳの原因として、例えば外傷、手術、外傷性出血、熱傷及び急性膵炎が実例として挙げられる。

【0116】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の非感染性ＳＩＲＳを（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0117】

本明細書で実証されているように、本発明の化合物（特にｍＣＢＳ）は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし、それにより非感染性ＳＩＲＳの処置として有用である。

【0118】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と非感染性ＳＩＲＳが発症した後の処置との両方を含む、非感染性ＳＩＲＳにおける細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0119】

Ｂ．１ 外傷
身体外傷とは、重篤で身体が変わる身体的損傷（例えば、四肢の粉砕又は切断）のことである。

【0120】

鈍力外傷は、鈍器から又は鈍器により加えられる衝撃又は他の力によって引き起こされる身体外傷の一種であり、貫通性外傷は、物体が皮膚又は組織を貫く身体外傷の一種である。外傷は、事故等の無計画なもの又は手術の場合の計画的なものの両方としても説明され得る。両方とも軽度〜重度の組織損傷、出血及び／又はショックを特徴とし得、両方ともＳＩＲＳを引き起こす可能性があるが、その後の感染及び敗血症のリスクも著しく高める。

【0121】

ヒストンは、感染の非存在下において、外傷又は重度の細胞ストレス後に放出される。例えば、血清ヒストンレベルは、重度の非胸部鈍的外傷後に有意に上昇する。高い血清ヒストンレベルは、重度の合併症、発生率及び予後不良と正の相関がある。インビトロでは、外因性ヒストンは、様々なサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１０）の産生及び分泌を引き起こし、ミエロペルオキシダーゼの放出を刺激し、免疫細胞及び内皮細胞におけるカルシウム流入を増加させ、これにより、ヒストンによって誘発される細胞毒性が部分的に媒介される。インビボでは、ヒストン投与は、動物の外傷モデルにおいて、サイトカイン放出、内皮損傷、凝固活性化及び肺損傷も促進する。

【0122】

外傷を受けている患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、外傷の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0123】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の外傷を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0124】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため外傷患者での処置として有用である。

【0125】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と外傷性傷害が生じた後の処置との両方を含む、外傷における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0126】

Ｂ．２．手術
手術は、身体の機能若しくは外観の改善に役立つために又はときにいくつかの他の理由のために、疾患又は傷害等の病的状態を調査及び／又は処置するために患者に手術的な手技又は機器技術を使用する。本発明は、下記でさらに定義されるように、手術に起因する外傷に対処し得る。

【0127】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の外科的外傷を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0128】

概して、処置は、患者の組織の切除又は以前から持続する傷の縫合を伴う場合に手術と見なされる。必ずしもこの範疇に該当しない他の処置（例えば、血管形成術又は内視鏡検査）も、一般的な外科的処置又は外科的設定（例えば、無菌環境、麻酔、無菌条件、典型的な手術器具及び縫合又はステープリングの使用）を伴う場合に手術と見なされる場合がある。手術の全ての形態は、侵襲的処置と見なされるが、いわゆる非侵襲的手術は、通常、対象となる構造を貫通しない切除（例えば、角膜のレーザー焼灼術）又は放射線外科的処置（例えば、腫瘍の照射）を指す。

【0129】

本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させ得ることから、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と外科的傷害が生じた後の処置との両方を含む、外科的外傷での使用のための処置を提供する。

【0130】

Ｂ．３．外傷性出血
外傷性出血は、傷害の広範にわたる国際的影響の大半を占めており、死亡の大部分の原因となり、負傷者に大きい罹患率をもたらす。病院前救護の差異にもかかわらず、外傷性出血の急性期管理は、世界中で類似しており、十分に受け入れられる公表されたガイドラインに従う。重傷の患者のケアは、蘇生段階、手術段階及び救命治療段階の４つの多くの場合に重複するセグメントとして起こる。出血の診断及びコントロールは、外傷ケアの全ての段階で高い優先度であるべきであり、出血性ショックの状態である患者で特に重要である。出血コントロールの初期の試みは、直接圧迫、圧迫包帯又は止血帯による、目に見える重度の出血源の直接コントロール；長骨及び骨盤の骨折の安定化；並びに患者の保温を含む。蘇生段階では、温めた静脈内輸液、出血の外科的コントロール前の低血圧蘇生並びに血液及び血液製剤の適切な注入が行われる。手術段階では、出血及び任意の他の傷害の外科的コントロール並びに追加の輸血が行われる。最後に、救命治療段階では、術後のサポート及び組織潅流が提供される）。

【0131】

本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させ得ることから、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と外傷性出血が生じた後の処置との両方を含む、外傷性出血での使用のための処置を提供する。

【0132】

Ｂ．４．熱傷
熱傷は、熱、寒さ、電気、化学物質、摩擦又は放射線によって引き起こされる傷害であり得る。第１度熱傷は、通常、発赤（紅斑）、白斑及び受傷部位での軽度の痛みに限定される。この熱傷は、通常、表皮中にのみ広がる。第２度熱傷は、透明な液体でさらに満たされ、皮膚の表面に水膨れができ、且つ神経関与のレベルに応じて多少の痛みを伴う可能性がある。第２度熱傷は、表皮（真皮乳頭層）に及ぶが、深い真皮層（真皮網状層）にも及ぶ場合がある。第３度熱傷は、皮膚の炭化をさらに有し、硬くて革のような焼痂が生じる。焼痂とは、身体の影響を受けていない部分から分離している痂皮のことである。多くの場合、紫色の液体も存在する。このタイプの熱傷は、火傷した領域中では神経末端が破壊されていることから痛みを伴わないことが多い。深刻な熱傷（特に身体の広範な領域を覆う場合）は、死をもたらす可能性があり、（例えば、煙の吸入による）肺への熱傷のあらゆる兆候は、医療的緊急事態である。

【0133】

皮膚の下にある組織（例えば、筋肉又は骨）を傷つける熱傷は、第４度熱傷に分類されることがある。この熱傷は、下記のさらなる３段階に分けられる：皮膚が取り返しのつかないほど失われる第４度熱傷、筋肉が取り返しのつかないほど失われる第５度熱傷及び骨が炭化している第６度熱傷。

【0134】

様々な熱傷が細胞外ヒストンレベルの上昇につながり、その結果、毒性と関連している。この毒性がヒストンの細胞外作用により少なくとも部分的に引き起こされる限り、本発明は、本発明の医薬組成物を使用してこの毒性を低減し、それにより患者側の不快感を低減又は緩和し、さらにより高用量の治療を可能にしようとする。

【0135】

熱傷に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、熱傷の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0136】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象への熱傷によって引き起こされるヒストンによって誘発される細胞毒性を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0137】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため熱傷患者での処置として有用である。

【0138】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の熱傷における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0139】

Ｂ．５．急性膵炎
急性膵炎は、無菌性炎症及び腺房細胞死（例えば壊死及びアポトーシス）による膵臓の急速に発症する炎症を特徴とする。この点において、活性化免疫細胞における細胞外ヒストンによって媒介されるＨＭＧＢ１放出は、ＨＭＧＢ１膵臓条件付きノックアウトマウスにおけるｌ−アルギニン誘発性急性膵炎の原因となる。膵臓におけるＨＭＧＢ１の喪失により、広範な核損傷及び細胞死後の循環中へのヒストン放出が増加する。循環しているヒストンは、マクロファージを補充し、マクロファージの活性化及びさらなるＨＭＢＧ１放出をもたらす。

【0140】

急性膵炎は、その重症度に応じて、重度の合併症を有する可能性があり、処置にもかかわらず高い死亡率を有する可能性がある。軽症例では、保存的処置又は腹腔鏡検査による処置が成功することが多いが、重症例では、疾患プロセスを抑制するために侵襲的手術（多くの場合に複数の介入）が必要である。

【0141】

急性膵炎に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、急性膵炎の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0142】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の急性膵炎を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0143】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため急性膵炎患者での処置として有用である。

【0144】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と急性膵炎が発症した後の処置との両方を含む、急性膵炎における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0145】

Ｃ．虚血再灌流傷害
虚血再灌流傷害（例えば、移植関連の虚血再灌流傷害）及び薬剤介在組織傷害は、微生物の非存在下で起こるプロセスである無菌性炎症を生じる。

【0146】

虚血とは、組織への血液供給が制限され、細胞の代謝に必要な酸素が欠乏することである。長期にわたる虚血（６０分以上）では、ＡＴＰ代謝の分解産物としてヒポキサンチンが形成される。酵素キサンチンデヒドロゲナーゼは、酸素のより高い利用可能性の結果として、キサンチンオキシダーゼに変換される。この酸化により、分子酸素が、反応性がより高いスーパーオキシド及びヒドロキシルラジカルに変換される。キサンチンオキシダーゼは、尿酸も産生し、この尿酸は、酸化促進剤と、ペルオキシニトライト等の反応種の捕捉剤との両方として作用する場合がある。再灌流中に生成された過剰な一酸化窒素は、スーパーオキシドと反応して強力な反応種ペルオキシナイトライトを生成する。そのようなラジカル及び活性酸素種は、細胞膜脂質、タンパク質及びグリコサミノグリカンを攻撃し、さらなる損傷を与える。このラジカル及び活性酸素種は、酸化還元シグナル伝達により特定の生物学的プロセスを開始する場合もある。

【0147】

再灌流傷害は、損傷した組織の炎症反応に部分的に起因する損傷を指す。新たに戻る血液により、この領域に運ばれた白血球は、インターロイキン等の炎症性因子のホストを放出し、組織損傷に反応してフリーラジカルも放出する。血流の回復により細胞内に酸素が再導入され、細胞のタンパク質、ＤＮＡ及び原形質膜が損傷を受ける。その結果、細胞膜への損傷がさらなるフリーラジカルの放出を引き起こす可能性がある。そのような反応種は、酸化還元シグナル伝達で間接的に作用してアポトーシスを活性化する。白血球も小さい毛細血管中に蓄積し、この毛細血管を閉塞させ、より多くの虚血を引き起こす。

【0148】

再灌流傷害は、脳卒中及び脳外傷に関与する脳の虚血性カスケードにも関与する。虚血及び再灌流傷害の発作の繰り返しも、褥瘡及び糖尿病性足部潰瘍等の慢性創傷の形成及び治癒不全につながる要因であると考えられている。連続的な圧力は、血液供給を制限して虚血を引き起こし、再灌流中に炎症が生じる。このプロセスが繰り返されるうちに、最終的に創傷が生じるのに十分な損傷を組織が受ける。

【0149】

血清ヒストンレベルは、肝臓、腎臓、肺及び脳の傷害を伴う動物の虚血再灌流モデルにおいて有意に上昇しており、これは、無菌性炎症の調節におけるヒストンの重要な役割を示唆する。実際に、循環しているヒストンは、いくつかの肝臓傷害モデル（例えば、コンカナバリンＡ誘発性肝傷害、アセトアミノフェン誘発性肝毒性、肝臓Ｉ／Ｒ及び急性肝不全）において、動物の死亡の主要なメディエータである。

【0150】

放出されると、ヒストンは、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９２７等のＴｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）に選択的に結合して炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６）を生じ、その結果、炎症反応及び組織傷害が促進される。

【0151】

細胞外ヒストンは、肝臓だけでなく、直接的毒性又は炎症促進効果を介して急性腎傷害又は虚血性脳卒中も媒介する。同様に、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４によって媒介されるシグナル伝達経路（例えば、ＭｙＤ８８、ＮＦ−κｂ及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ））は、細胞外ヒストンによって媒介される急性腎傷害の原因となる。

【0152】

ヒストン注入により脳梗塞のサイズが増大し、脳卒中の転帰が悪化する。急性肺傷害（ＡＬＩ）の動物モデル又は患者の気管支肺胞洗浄液では、血清Ｈ３及びＨ４レベルが顕著に増加している。

【0153】

まとめると、細胞外ヒストンは、ＤＡＭＰとして機能し、無菌性炎症及び臓器損傷を媒介する。ヒストンの放出及び活性の阻害は、組織傷害の治療戦略を提示する。

【0154】

虚血再灌流傷害（例えば、移植関連の虚血再灌流傷害）及び薬剤介在組織傷害に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0155】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連のＩＲＩ及び／又は薬剤介在組織傷害を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0156】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害の患者での処置として有用である。

【0157】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害が発症した後の処置との両方を含む、虚血／再灌流及び薬剤介在組織傷害における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0158】

Ｄ．凝血及び血栓症
凝血は、血液が血餅を形成する生物学的プロセスである。正確な調節機構により、出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）（出血（ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｅ））又は閉塞性凝固（血栓症）のリスクの増加をもたらす異常な凝血が防止される。マウスでのヒストン投与は、例えば、血管バリアの喪失を伴う微小血管血栓症を増加させ、この微小血管血栓症は、多臓器の機能障害及び不全の一因となる。

【0159】

ヒストン（例えば、Ｈ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３，及びＨ４）は、インビボ及びインビトロで血小板凝集及びその後の血小板依存性のトロンビン形成を誘発する。これらの中でも、Ｈ４は、血小板活性に最も強く影響を及ぼす。ヒストンは、ヒト血小板においてプロコアグラント表現型も誘発し、このプロコアグラント表現型は、トロンビンの生成を増強し、且つ血液凝固プロセスを促進する。ＴＬＲ２及びＴＬＲ４は、シグナル伝達経路（例えば、ＥＲＫ、Ａｋｔ、ｐ３８及びＮＦ−κＢ）の活性化、カルシウム流入の誘発並びにフィブリノゲンの動員を介して、ヒストンによって媒介される血小板活性化に関与する。

【0160】

ヒストン−ＤＮＡ複合体は、トロンビン生成を増強するが、このプロセスは、ＡＰＣの投与により破壊される。ヘパリン及びアルブミンは、インビトロ及びインビボでヒストン毒性を中和し、ヒストン関連の血小板活性化も中和する。加えて、ヒストン注入によりマウスにおけるフォン・ヴィレブランド因子の血漿レベルが上昇し、血小板活性化及びその後の深部静脈血栓症の発症の一因となる。血小板以外にも、ヒストンは、プロテインＣ−トロンボモジュリン系を損なう。外因性ヒストンは、トロンボモジュリンの存在下において、血漿トロンビン生成を用量依存的に増加させる。興味深いことに、日本において播種性血管内凝固患者の処置に承認されている組換えトロンボモジュリン（ｒＴＭ）は、ヒストンに直接結合し、マウスでは致死性の血栓症からマウスを保護する。ヒストン毒性に対するｒＴＭの保護効果は、ＡＰＣ依存的方法及びＡＰＣ非依存的方法の両方によって媒介される。

【0161】

細胞外ヒストンによって引き起こされる凝血及び又は血栓症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、凝血及び又は血栓症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0162】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における凝血及び血栓症を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0163】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため凝血及び又は血栓症の患者での処置として有用である。

【0164】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と凝血又は血栓症が発症した後の処置との両方を含む、細胞外ヒストンタンパク質によって引き起こされる凝血及び又は血栓症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0165】

Ｅ．自己免疫／炎症性疾患
本発明は、多発性硬化症、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎又は乾癬等の様々な自己免疫及び／又は炎症性疾患状態の処置を企図する。これらの疾患の診断及び処置は、文献に十分に記述されている。

【0166】

ヒストンは、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、小型血管炎及び輸血関連疾患等のいくつかの自己免疫疾患及び自己炎症性疾患に関与している。自己免疫障害における直接的な自己抗原としての作用に加えて、細胞外ヒストンは、ヒストン−ＤＮＡ複合体の形成によりＤＮＡ分解を防止し得、これにより自己免疫反応が増強される。加えて、タンパク質アルギニンデアミナーゼ（例えばＰＤＡ４）は、ヒストンの脱イミノ化及びシトルリン化を媒介し、その結果、ヒストンの免疫原性が増加する。

【0167】

自己免疫及び／又は炎症性疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、自己免疫及び／又は炎症性疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0168】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における自己免疫及び／又は炎症性疾患を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0169】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため自己免疫及び／又は炎症性疾患の患者での処置として有用である。

【0170】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と自己免疫及び／又は炎症性疾患が発症した後の処置との両方を含む、自己免疫及び／又は炎症性疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0171】

Ｆ．急性呼吸促迫症候群
呼吸促迫症候群（ＲＤＳ）又は成人呼吸促迫症候群（ＩＲＤＳとは対照的）としても既知である急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）とは、肺への様々な形態の傷害に対する重篤な反応のことである。これは、透過性肺水腫の増加をもたらす最も重要な障害である。

【0172】

ＡＲＤＳは、様々な直接的侵襲及び間接的侵襲によって引き起こされる。ＡＲＤＳは、炎症、低酸素血症を引き起こし且つ多臓器不全を引き起こすことが多い炎症性メディエータの全身放出を伴うガス交換の障害につながる肺実質の炎症を特徴とする。この状態は、生命を脅かし、多くの場合に致死的であり、通常、人工呼吸器及び集中治療室への入院を必要とする。重症度が低い形態は、輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）等の急性肺傷害（ＡＬＩ）と呼ばれている。

【0173】

ＡＲＤＳは、傷害又は急性疾病の発作の２４〜４８時間以内に発症する可能性がある。そのような場合、患者は、通常、息切れ、頻呼吸及び根本的原因（即ちショック）に関連する症状を呈する。マラリア等の長期にわたる疾病がＡＲＤＳの引き金になる可能性もある。次いで、ＡＲＤＳは、特に急性感染の発症後しばらくしてから発症する場合がある。

【0174】

ＡＲＤＳに罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、ＡＲＤＳの病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0175】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の急性呼吸促迫症候群を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0176】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのためＡＲＤＳの患者での処置として有用である。

【0177】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置とＡＲＤＳが発症した後の処置との両方を含む、ＡＲＤＳにおける細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0178】

Ｇ．心血管疾患
心血管疾患は、心臓又は血管（動脈及び静脈）に関与する疾患のクラスを指す。この用語は、技術的には、心血管系に影響を及ぼすあらゆる疾患を指すが、通常、粥状動脈硬化（動脈疾患）に関連するものを指すために使用される。これらの状態は、原因、機序及び処置が類似している。

【0179】

心血管疾患の処置は、各患者における疾患の特定の形態に依存するが、効果的な処置は、上記で論じた予防的な生活様式の変化を常に含む。血圧を下げる薬物、アスピリン及びスタチン系コレステロール降下薬等の薬物が有用な場合がある。状況によっては、手術又は血管形成術により、損傷した血管を再開するか、修復するか又は置き換えることが正当化される場合がある。

【0180】

心血管疾患の様々な形態として、下記が挙げられる：動脈瘤、狭心症、不整脈、粥状動脈硬化、心筋症、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、冠動脈疾患、拡張型心筋症、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（ｈｉｇｈ ｂｌｏｏｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）（高血圧（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ））、肥大型心筋症、僧帽弁逸脱、心筋梗塞及び静脈血栓塞栓。

【0181】

ヒストン関連の心血管疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、ヒストン関連の心血管疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0182】

本発明の第２、第３又は第４の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における細胞外ヒストン関連の心血管疾患を（予防的又は治療的に）処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0183】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのためヒストン関連の心血管疾患の患者での処置として有用である。

【0184】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置とヒストン関連の心血管疾患が発症した後の処置との両方を含む、ヒストン関連の心血管疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0185】

Ｈ．網膜剥離
網膜剥離とは、網膜の神経層が網膜色素上皮から剥がれ落ちる眼の障害のことであり、通常、網膜破裂又は網膜裂傷によって引き起こされる。網膜剥離の患者の眼では、正常な眼と比べてヒストンの硝子体中濃度が高い。

【0186】

細胞外ヒストンは、毒性であり、ＴＬＲ４／ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２及びｐ３８）依存性経路を介してインビボ及びインビトロでＩＬ−８産生を誘発する。硝子体ヒアルロン酸は、ヒストンの拡散を阻害することにより、ヒストンによって媒介される毒性を低減する。そのため、瀕死の網膜から放出されたヒストンは、ＤＡＭＰとして作用して、炎症促進性サイトカインの放出を誘発し、且つ細胞毒性を媒介する可能性がある。

【0187】

網膜剥離に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、網膜剥離の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0188】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における網膜剥離を処置する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0189】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため網膜剥離患者での処置として有用である。

【0190】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と網膜剥離が発症した後の処置との両方を含む、網膜剥離における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0191】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、熱傷対象者における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0192】

Ｉ．線維症
線維症に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇しており、このタンパク質は、線維症の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0193】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象におけるヒストン誘発細胞毒性によって引き起こされる線維症を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0194】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため線維症患者での処置として有用である。

【0195】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と線維症が発症した後の処置との両方を含む、対象の線維症における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0196】

Ｊ．糖尿病
糖尿病に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、糖尿病の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0197】

本発明は、糖尿病におけるヒストン関連の合併症（例えば、炎症及び創傷治癒の遅延）を処置する方法を提供する。この方法は、１型糖尿病、１．５型糖尿病又は２型糖尿病と診断されている対象に本発明の少なくとも１種の化合物の治療上有効な量を投与することを含む。

【0198】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象における糖尿病を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0199】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため糖尿病患者での処置として有用である。

【0200】

特定の実施形態では、ヒストンが関与している糖尿病の症状は、炎症である。炎症の減少を理学的検査及び炎症マーカーの存在の減少によりモニタリングし得る。

【0201】

特定の実施形態では、糖尿病を処置する方法であって、糖尿病を処置するために使用される薬剤と、本発明の少なくとも１種の化合物との治療上有効な量の投与を含む方法が提供される。糖尿病を処置するために使用される薬剤は、インスリンであり得るか、又は下記から選択される別の薬剤であり得る：ビグアナイド、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）、液状メトホルミン（Ｒｉｏｍｅｔ）、徐放メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ ＸＲ、Ｆｏｒｔａｍｅｔ、Ｇｌｕｍｅｔｚａ）、スルホニル尿素、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ、Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ ＸＬ）、微粒子化グリブリド（Ｇｌｙｎａｓｅ）、メグリチニド（Ｍｅｇｌｉｔｉｎｉｄｅｓ）、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）、Ｄ−フェニルアラニン誘導体、ナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）、チアゾリジンジオン、ピオグリタゾン（ＴＺＤｓ）、ピオグリタゾン、（Ａｃｔｏｓ）、ＤＰＰ−４阻害剤、シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａ）、サキサグリプチン（Ｏｎｇｌｙｚａ）、リナグリプチン（Ｔｒａｄｊｅｎｔａ）、アルファ−グルコシダーゼ、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、胆汁酸捕捉剤、コレセベラム（Ｗｅｌｃｈｏｌ）、ピオグリタゾン及びメトホルミン（Ａｃｔｏｐｌｕｓ Ｍｅｔ）、グリブリド及びメトホルミン（Ｇｌｕｃｏｖａｎｃｅ）、グリピジド及びメトホルミン（Ｍｅｔａｇｌｉｐ）、シタグリプチン及びメトホルミン（Ｊａｎｕｍｅｔ）、サキサグリプチン及びメトホルミン（ｋｏｍｂｉｇｌｙｚｅ）、レパグリニド及びメトホルミン（Ｐｒａｎｄｉｍｅｔ）並びにピオグリタゾン及びグリメピリド（Ｄｕｅｔａｃｔ）。

【0202】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の糖尿病における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。従って、本発明は、（医療処置の場合における）前処置と糖尿病が発症した後の処置との両方を含む、対象における糖尿病の処置を提供する。

【0203】

Ｋ．化学療法、放射線療法及びサイトカイン療法の毒性
様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン）は、癌患者において毒性を伴い、ときに重篤である。この毒性がヒストンの細胞外作用により少なくとも部分的に引き起こされる限り、本発明は、本発明の医薬組成物を使用してこの毒性を低減し、それにより患者側の不快感を低減又は緩和し、さらにより高用量の治療を可能にしようとする。

【0204】

様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用を罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、この副作用の重要なメディエータとして示唆されている。

【0205】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、細胞外ヒストンの細胞毒性活性を阻害することにより、対象における様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0206】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）の副作用の処置として有用である。

【0207】

本発明の非常に好ましい形態では、様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）を受けている患者における、そのような治療の副作用の処置で使用される化合物は、化合物β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート又はその薬学的に許容される塩である。例えば、この方法で使用される化合物は、ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである。

【0208】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と、様々な形態の癌治療（例えば、化学療法、放射線及びサイトカイン療法）を行った後の処置との両方を含む、これらの治療の副作用における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0209】

Ｌ．創傷治癒
同様に提供されるのは、創傷治癒での使用のための方法である。本明細書で使用される場合、「創傷治癒」は、皮膚（又は別の臓器−組織）が傷害後に自己を修復する複雑なプロセスを指す。創傷治癒の古典的なモデルは、下記の３つ又は４つの連続した（さらに重複している）時期に分けられる：（１）血餅が止血した場合の止血、（２）炎症、（３）増殖、及び（４）再構築。皮膚が傷害を受けると、損傷を修復するために、一連の複雑な生化学的事象が、密接に組織化されたカスケードで起こる。炎症期中、白血球により、細菌及び細胞残屑が貪食されて創傷から除去される。血小板由来の成長因子（血小板のアルファ顆粒中に貯蔵されている）が創傷中に放出され、増殖期中に細胞の遊走及び分裂を引き起こす。増殖期は、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮化及び創傷収縮を特徴とする。新たな血管が形成され、線維芽細胞が成長し、コラーゲン及びフィブロネクチンが排泄されることにより新たな仮の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が形成される。同時に、表皮の再上皮化が起こり、上皮細胞が増殖して創傷床の上を「這い」、新たな組織のカバーを生成する。

【0210】

創傷治癒の困難さに悩まされている患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、創傷治癒の病理の重要なメディエータとして示唆されている。

【0211】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象の創傷治癒中に生じるヒストン誘発細胞毒性を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0212】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため創傷治癒の困難さに悩まされている患者での処置として有用である。

【0213】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、対象の創傷の処置における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0214】

Ｍ．中枢神経系疾患におけるヒストン
中枢神経系疾患に罹患している患者は、血液中に存在する細胞外ヒストンのレベルが上昇している可能性があり、このタンパク質は、中枢神経系疾患の病理の重要なメディエータとして示唆されている。例えば、ハンチントン病は、ポリグルタミンの反復伸長によって引き起こされる常染色体優性の神経変性障害であり、ハンチントンタンパク質中のポリグルタミントラック（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｔｒａｃｋ）が伸長される。最近の証拠は、ヒストン改変によって媒介される転写脱制御がハンチントン病における重要な発病機序であることを示す。

【0215】

ヒストンデアセチラーゼ活性の薬理学的操作は、中枢神経系疾患（例えば、ハンチントン病、てんかん及びアルツハイマー病）の様々な実験モデルにおいて有益であった。神経細胞死、炎症反応及び反応性神経膠症は、主要な神経疾患のマーカーである。より最近の証拠は、細胞外ヒストンＨ１が、神経毒性のある炎症促進因子であり、中枢神経系で反応性神経膠症を引き起こすことを示す。これらの発見は、ヒストン改変及び細胞外ヒストンの両方が中枢神経系疾患の一因となることを示唆する。

【0216】

本発明の第２又は第３の態様のある実施形態では、対象におけるヒストンによって誘発される中枢神経系疾患を寛解させる方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0217】

ｍＣＢＳ等の化合物は、細胞外ヒストンの毒性効果をブロックし得、そのため中枢神経系疾患での処置として有用である。

【0218】

そのため、本発明の化合物及び前記化合物を含む治療用組成物又は医薬組成物は、（医療処置の場合における）前処置と中枢神経系疾患が発症した後の処置との両方を含む、対象の中枢神経系疾患における細胞外ヒストンタンパク質の細胞毒性活性を寛解させる手段を提供する。

【0219】

３．治療形態及び医薬形態
本発明の第５の態様では、細胞外ヒストン関連の合併症の処置での使用のための治療用組成物又は医薬組成物であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその治療上許容されるか若しくは薬学的に許容される塩を少なくとも含む治療用組成物又は医薬組成物が提供される。好ましくは、この組成物は、治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤を含む。この治療又は医薬での化合物は、中性遊離塩基形態であり得るか又は塩形態であり得る。好ましくは、この化合物は、β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのナトリウム塩である。

【0220】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」又は「治療上許容される」は、合理的な利益／リスク比に見合っており、過度の毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を伴わず、健全な医学的判断の範囲内でヒト及び動物の組織との接触での使用に適している化合物、物質、組成物及び／又は剤形を指す。

【0221】

投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に明らかであり、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．でより詳細に説明されている。

【0222】

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」、又は「薬学的に許容される添加剤」、又は「薬学的に許容される希釈剤」、「治療上許容される担体」、又は「治療上許容される添加剤」、又は「治療上許容される希釈剤」は、ある臓器又は身体の部分から別の臓器又は身体の部分への対象化合物の担持又は輸送に関与する物質、組成物又はビヒクル（例えば、液体又は固体の充填剤、希釈剤、添加剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウム、若しくはステアリン酸亜鉛、若しくはステアリン酸）又は溶媒カプセル化物質）を意味する。各担体、希釈剤及び添加剤は、製剤の他の成分と適合し且つ患者に有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。これは、生物学的に又は他の方法で望ましくないものではない物質であり、即ち、この物質は、許容されない生物学的効果を引き起こすことなく又はこれが含まれる組成物の成分の任意の１つ又は複数と有害な方法で相互作用することなく、活性剤と共に個体に提供され得る。薬学的に許容される担体、希釈剤及び添加剤として機能し得る物質のいくつかの例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：（１）糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；（２）デンプン類、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；（３）セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク；（８）添加剤、例えばココアバター及び座薬ワックス；（９）油、例えばピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル類、ポリカーボネート類及び／又はポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチド及びアミノ酸；（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬ；（２２）Ｃ_２〜Ｃ_１２アルコール、例えばエタノール；並びに（２３）医薬製剤で用いられる他の非毒性の適合性物質。製剤中に湿潤剤、結合剤、充填剤、潤滑剤、着色剤、崩壊剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、着香料、芳香剤、保存料、水、塩溶液、アルコール、抗酸化剤、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及び同類のものも存在し得る。「添加剤」、「担体」、「希釈剤」及び「薬学的に許容される単体」又は同類のもの等の用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0223】

治療上許容されるか又は薬学的に許容される担体、添加剤又は希釈剤の例は、下記である：脱塩水又は蒸留水；生理食塩水；植物ベースの油、例えばピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、例えばピーナッツ油、紅花油、オリーブ油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、落花生油又はヤシ油；シリコーン油、例えばポリシロキサン類、例えばメチルポリシロキサン、フェニルポリシロキサン及びメチルフェニルポリシロキサン；揮発性シリコーン；鉱油、例えば流動パラフィン、軟パラフィン又はスクアラン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又はヒドロキシプロピルメチルセルロース；低級アルカノール類、例えばエタノール又はイソプロパノール；低級アラルカノール類（ｌｏｗｅｒ ａｒａｌｋａｎｏｌｓ）；低級ポリアルキレングリコール類又は低級アルキレングリコール類、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール又はグリセリン；脂肪酸エステル類、例えばパルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル又はオレイン酸エチル；ポリビニルピロリドン；寒天；カラギーナン；トラガントガム又はアカシアゴム並びにワセリン。典型的には、担体は、組成物の１０重量％〜９９．９重量％を形成するであろう。

【0224】

本明細書で説明されている組成物は、医薬組成物中に従来見出される他の補助成分を、この補助成分の技術的に確立された使用レベルでさらに含み得る。そのため、例えば、この組成物は、追加の適合性の薬学的に活性な物質（例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬又は抗炎症剤）を含み得る。しかしながら、そのような物質は、添加された場合、本明細書で説明されている組成物の成分の生物学的活性を過度に妨げるべきではない。

【0225】

下記で詳細に説明するように、本明細書で説明されている治療上許容されるか又は薬学的に許容される組成物は、固体又は液体の形態での投与のために特に製剤化され得、下記に適合したものが挙げられる：（１）経口投与、例えば水薬（水性若しくは非水性の溶液若しくは懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸薬、錠剤（例えば、頬側吸収、舌下吸収及び全身吸収を目標とするもの）、ボーラス、粉末、顆粒、舌への塗布のためのペースト；（２）例えば、滅菌溶液若しくは滅菌懸濁液又は徐放性製剤として、例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射又は硬膜外による非経口投与；（３）例えば、（脳中の）実質内投与、髄腔内投与、心室内投与若しくは肝内投与による、処置を必要とする臓器への直接注射；（４）例えば、皮膚に適用されるクリーム、ローション、ジェル、軟膏又は放出制御されたパッチ若しくはスプレーとしての局所適用；（５）吸入（例えば経鼻吸入若しくは経口吸入）による投与に適したエアロゾル形態；（６）例えば、ペッサリー、クリーム、座薬若しくは泡沫剤としての膣内用又は直腸内用；（７）舌下；（８）点眼薬としての眼用；（９）経皮用；（１０）経粘膜用；又は（１１）経鼻用。

【0226】

一実施形態では、本発明の組成物を非経口注射（例えば、皮下注射、筋肉内注射若しくは静脈内注射）等の注射により投与するか、又は例えば（脳中の）実質内投与、髄腔内投与、心室内投与若しくは肝内投与により組織及び臓器に局所投与する。

【0227】

注射に適した医薬組成物として、滅菌の水溶液（水溶性）又は分散液及び滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。理想的には、この組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、微生物（例えば細菌及び真菌）の夾雑作用に対してこの組成物を安定化させるための保存料を含み得る。

【0228】

上記で列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に、適切な溶媒に必要な量の本発明の医薬組成物を組み込み、必要に応じて続いて滅菌ろ過することにより、滅菌注射用溶液を調製し得る。実例として、単回用量を等張ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、液体１０００ｍｌに添加し得るか、又は提案されている注入部位で注射し得る（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８及び１５７０−１５８０を参照されたい）。

【0229】

注射溶液の場合、担体は、下記を含む溶媒又は分散媒体であり得る：例えば、水、リンゲル液、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール（例えば１，２プロピレングリコール）及び液体ポリエチレングリコール並びに同類のもの）、これらの適切な混合物並びに植物油。

【0230】

例えば、レシチン等のコーティングを使用して、分散系の場合には必要な粒径の維持により且つ界面活性を使用して、適切な流動性を維持し得る。微生物の作用の予防を、様々な抗菌剤及び又は抗真菌剤を含むことにより達成し得る。適切な薬剤は、当業者に公知であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）及び同類のものが挙げられる。多くの場合、本組成物が等張剤を含むことが好ましい場合があり、例えば糖類、多価アルコール類、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい場合がある。注射用組成物の持続的吸収を、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）をこの組成物に含めることによりもたらし得る。

【0231】

第２の実施形態では、本発明の組成物を例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に経口投与する。経口治療的投与のために、この医薬組成物を添加剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース及び同類なものの形態で使用し得る。

【0232】

経口使用に適した担体、希釈剤、添加剤、アジュバントの一部の例として、ピーナッツ油、液体パラフィン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、アカシアガム、トラガカントゴム、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、ゼラチン及びレシチンが挙げられる。加えて、これらの経口製剤は、適切な着香料及び着色料を含み得る。

【0233】

カプセル形態で使用する場合、このカプセルは、崩壊を遅延させる化合物（例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル）でコーティングされ得る。同様に、錠剤、トローチ、丸剤、カプセル及び同類のものは、下記を含み得る：結合剤、例えばトラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチン；添加剤、例えばリン酸二カルシウム；追加の崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸及び同類のもの；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；並びに甘味料、例えばショ糖、ラクトース若しくはサッカリン又は着香料、例えばペパーミント、冬緑油若しくはサクランボ香料（ｃｈｅｒｒｙ ｆｌａｖｏｕｒｉｎｇ）。

【0234】

投与単位形態がカプセルである場合、このカプセルは、上記のタイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質は、コーティングとして存在し得るか、又は他の方法でこの投与単位の物理的形状を修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルをシェラック、糖又は両方でコーティングし得る。

【0235】

経口投与のための液体形態（例えばシロップ又はエリキシル）は、上記の薬剤に加えて、液体担体、甘味料（例えばショ糖）、保存料（例えばメチルパラベン及びプロピルパラベン）、色素並びに香料（例えば、サクランボフレーバー又はオレンジフレーバー）を含み得る。適切な液体担体として下記が挙げられる：水、油、例えば、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油、ヒマワリ油、紅花油、落花生油、ヤシ油、液体パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪アルコール類、トリグリセリド類又はこれらの混合物。

【0236】

経口投与のための懸濁液は、分散剤及び／又は懸濁剤をさらに含み得る。適切な懸濁剤として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ポリ−ビニル−ピロリドン、アルギン酸ナトリウム又はアセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤として下記が挙げられる：レシチン、ステアリン酸等の脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート若しくはジオレエート、ステアレート又はラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート若しくはジオレエート、ステアレート又はラルレート及び同類のもの。経口投与のための乳濁液は、１種又は複数の乳化剤をさらに含み得る。適切な乳化剤として、上記で例示したような分散剤又は天然ガム、例えばグアーガム、アカシアガム若しくはトラガカントゴムが挙げられる。

【0237】

第３の例示的な実施形態では、本発明の組成物をエアロゾルの形態において又は吸入投与により対象の気道に直接投与する。エアロゾルとしての使用のために、本発明の薬学的に許容される組成物の溶液又は懸濁液を適切な噴霧剤（例えば、プロパン、ブタン又はイソブタンのような炭化水素噴霧剤）及び従来のアジュバントと一緒に加圧エアロゾル容器に充填し得る。そのような組成物を（例えば、ネブライザ又はアトマイザ中での）非加圧形態でも投与し得る。

【0238】

気道への送達のためのエアロゾルは、当該技術分野で既知である：例えば、Ａｄｊｅｉ，Ａ．ａｎｄ Ｇａｒｒｅｎ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１：５６５−５６９（１９９０）；Ｚａｎｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｌａｍｍ，Ｊ−Ｗ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１１４：１１１−１１５（１９９５）；Ｇｏｎｄａ，Ｉ．“Ａｅｒｏｓｏｌｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ，”ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，６：２７３−３１３（１９９０）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１４０：１３１７−１３２４（１９８９））を参照されたい。

【0239】

第４の例示的な実施形態では、本組成物をリポソームの形態で投与し得る。リポソームは、一般に、リン脂質又は他の脂質物質に由来し、水性媒体中に分散している単層状又は多層状の水和液晶で形成されている。リポソームを形成し得る、非毒性で生理的に許容されて代謝可能なあらゆる脂質を使用し得る。リポソーム形態の組成物は、安定剤、保存料、添加剤及び同類のものを含み得る。好ましい脂質は、リン脂質及びホスファチジルコリン（レシチン）であり、両方とも天然及び合成である。リポソームを形成するための方法は、当該技術分野で既知であり、これに関して、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ＸＩＶ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９７６），ｐ．３３ ｅｔ ｓｅｑ．（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）が具体的に参照される。

【0240】

加えて、本明細書で説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る本発明の治療的又は薬学的に許容される組成物を徐放性調製物及び徐放性製剤に組込み得る。そのような治療用組成物又は医薬組成物は、酸の加水分解を最小限に抑えるために、適切な緩衝剤をさらに含み得る。適切な緩衝剤は、当業者に公知であり、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0241】

本発明の化合物を「プロドラッグ」の形態で投与し得る。プロドラッグとは、インビボで活性型に変換される不活性型の化合物のことである。適切なプロドラッグとして、活性型の化合物のエステル類、ホスホン酸エステル類等が挙げられる。

【0242】

加えて、本発明の組成物を患者に移植し得るか、又は薬物送達システムを使用して注射し得る。コーティングされた送達デバイスも有用であり得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号明細書；同第６，７４７，０１４号明細書；及び同第３５３，２７０，９６０号明細書を参照されたい。

【0243】

特定の実施形態では、例えば創傷の処置のプロセスで使用されるデバイス又は包帯を使用して、本組成物を送達する。

【0244】

任意の特定の対象のための、本明細書で開示されている医薬組成物の治療上有効な量は、様々な因子に依存し、この因子として下記が挙げられる：この医薬組成物の毒性及び治療効果；病気の重症度；患者の年齢、体重、全体的な健康、性別及び食事；投与時間；投与経路；この組成物の捕捉率；処置の持続期間；医学で公知の他の関連因子と一緒に、処置と組み合わせて又は同時に使用される薬物。

【0245】

毒性及び治療上の有効性を、例えばＬＤ_５０（母集団の５０％に対する致死量）及びＥＤ_５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定し得る。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ_５０／ＥＤ_５０で表され得る。大きい治療指数を示す組成物が好ましい。

【0246】

本明細書で説明されている細胞培養アッセイ及び動物モデルから得られたデータを、ヒトでの使用のための治療上有効な投与量の範囲の策定で使用し得る。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。この投与量は、用いられる投与形態及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。

【0247】

剤形を生成するために担体物質と組み合わされ得る、本明細書で説明されている本発明の化合物の量は、概して、治療効果を生じるこの化合物の量であるであろう。一般に、１００％の内、この量は、約０．１％〜９９％の化合物の範囲であり、好ましくは約５％〜約７０％の範囲であり、最も好ましくは１０％〜約３０％の範囲であるであろう。

【0248】

投与量は、医師により決定され得、且つ必要に応じて処置の観察された効果に適合するように調整され得る。実例のみとして、組成物を、薬学的に許容される組成物が下記の用量で投与されるように投与し得る：１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ。ここで示された範囲は、全ての中間範囲を含むことを理解すべきであり、例えば範囲１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇは、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ等を含む。上記で示されたものの中間の範囲（例えば、範囲１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇでは、２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ等の用量範囲）も、本明細書で説明されている方法及び組成物の範囲内であることをさらに理解すべきである。

【0249】

本発明の化合物がｍＣＢＳ又はｍＣＢＳ．Ｎａである場合、投与量は、１０〜８００μｇ／ｍｌであり得る。好ましくは、この投与量は、５０〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。より好ましくは、この投与量は、ヒト対象に投与される場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０又は８００μｇ／ｍｌである。

【0250】

本発明の特定の例では、改変されている硫酸化セロビオシド化合物の有効量を単回用量で投与する。特定の例では、この用量を繰り返し投与する。即ち、処置レジメンは、疾患の重症度及びタイプ、患者の全体的な健康状態及び年齢並びに処置する医師が考慮すべき様々な他の条件に応じて変わるであろう。処置の持続時間及び頻度に関して、熟練した臨床医は、典型的には、対象をモニタリングして、処置が治療上の有益性をいつ提供するかを決定し、且つ投与量を増減させるかどうか、投与頻度を増減させるかどうか、処置を中断するかどうか、処置を再開するかどうか又は処置レジメンに他の変更を行うかどうかを決定する。

【0251】

本明細書で説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る本発明の治療用組成物又は薬学的に許容される組成物は、単回のボーラス投与で投与され得るか又は複数回の用量若しくは処置で投与され得、且つ少量の治療用組成物が長期間にわたり持続的に投与される「持続的」治療により適用され得る。

【0252】

複数回投与が処置（持続的治療を含む）で使用される場合、治療用組成物又は医薬組成物を、いくつかの臨床的因子（例えば、この治療用組成物又は医薬組成物で使用される改変されている硫酸化セロビオシド化合物に対する対象の感受性）に応じて１週間に１回〜毎日で変化し得る投与スケジュールにより投与するであろう。そのようなレジームで投与する所望の用量を一度に単回用量として送達し得るか、又は部分用量（例えば、２〜４回の部分用量）に分割して、ある期間にわたり（例えば、１日中を通して適切な間隔又は他の適切なスケジュールで）投与し得る。そのような部分用量を単位剤形として投与し得る。

【0253】

いくつかの実施形態では、投与は、慢性的であり、例えば数週間又は数ヶ月の期間にわたり１日１回又は複数回の用量である。投与スケジュールに例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月若しくは６ヶ月又はより長い期間にわたり１日１回、１日２回、１日３回又は１日４回以上の投与である。

【0254】

所望の用量を、連続的注入を使用するか又は放出制御製剤による送達を使用して投与し得る。この場合、各部分用量に含まれる医薬組成物は、１日当たりの総投与量を達成するために相応に少なくなければならない。

【0255】

また、投与量単位を、例えば数日の期間にわたる医薬組成物の持続放出をもたらす従来の徐放性製剤を使用して、数日にわたる送達のためにも配合し得る。徐放性製剤は、当該技術分野で公知であり、例えば本明細書で説明されている薬剤により使用され得る、ある部位への薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、この投与量単位は、１日当たりの用量の対応する倍数を含む。

【0256】

４．併用レジーム
本発明の第５の態様に係る特定の例示的な実施形態では、特定された組成物は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される第２の活性剤、化合物又は組成物を含む場合がある。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、望ましくは、敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0257】

治療上の利点を併用レジメンにより実現できる場合がある。本発明の特定の実施形態では、説明されている方法は、予防的に送達される際、患者が有しているか、又は罹患しているか、又は有する若しくは罹患するリスクがある敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ及びＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的処置である第２の活性剤を本発明の処置と同時に又は付随して対象に投与するステップをさらに含み得る。

【0258】

第２の活性剤として、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入が挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0259】

実例として、本方法又は本処置が、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症性疾患状態又は非敗血症性疾患状態を処置するか又は寛解させることに向けられている場合、この方法は、細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う医学的状態のための補助処置を提供する第２の抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入を同時に又は付随して対象に投与することも含み得る。

【0260】

一例では、第２の活性剤は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患（例えば、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患）のための補助的処置又は補助的予防を提供する。

【0261】

別の例では、第２の活性剤は、細胞外ヒストン細胞毒性を伴う医学的状態のための補助的処置又は補助的予防を提供する。

【0262】

実例として、本処置方法が、対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩを関連する敗血症性疾患状態又は非敗血症性疾患状態を処置するか又は寛解させることに向けられている場合、この方法は、細胞外ヒストンによって媒介される病理を伴う医学的状態のための補助処置を提供する第２の抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は本発明の化合物と異なる他の形態の医学的介入を同時に又は付随して対象に投与することも含み得る。

【0263】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗炎症剤であり、例えばステロイド、副腎皮質ステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、アスピリン又はこれらの任意の組み合わせである。より具体的には、投与される追加の薬剤は、下記からなる群から選択される抗炎症剤であり得る：アルクロフェナク；プロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド（Ａｌｇｅｓｔｏｎｅ Ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）；アルファアミラーゼ；アムシナファル（Ａｍｃｉｎａｆａｌ）；アムシナフィド（Ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カプロフェン；シクロプロフェン；ジンタゾン；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラク；プロピオン酸クロチカソン（Ｃｌｏｔｉｃａｓｏｎｅ Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；酢酸コルメタソン；コルトドキソン；デフラザコート；デソニド；デスオキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメタゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン、ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリソン；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモル（Ｆｅｎａｍｏｌｅ）；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサル；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコート；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルクアゾン（Ｆｌｕｑｕａｚｏｎｅ）；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカソン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾール；酢酸ハロプレドン；イブフェナク；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダップ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール（Ｉｎｄｏｘｏｌｅ）；イントラゾル（Ｉｎｔｒａｚｏｌｅ）；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロモキシカム（Ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリゾン（Ｍｅｃｌｏｒｉｓｏｎｅ Ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ）；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスレプタネート；モルニフルメート；ナブメトン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソル（Ｎａｐｒｏｘｏｌ）；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；フェンブタゾンナトリウムグリセレート；ピルフェニドン；ピロキシカム；桂皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピプロフェン；プレドナゼート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）；プリフェロン；プロドリック酸；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリト；サルコレックス（Ｓａｌｃｏｌｅｘ）；サルナセジン；サルサラート；サルシレート（Ｓａｌｙｃｉｌａｔｅ）；塩化サンギナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサレート；テブフェロン；テニダップ；テニダップナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；チキソコルトールピバレート；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミデート（Ｔｒｉｆｌｕｍｉｄａｔｅ）；ジドメタシン；グルココルチコイド；ゾメピラックナトリウム；及びこれらの組み合わせ。

【0264】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗生物質製剤であり、例えばカナマイシン、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アミノグリコシド、アンサマイシン、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド及び／又はテトラサイクリンである。

【0265】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗ウイルス剤であり、例えば非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（例えば、ヌクレオシド類似体）、プロテアーゼ阻害剤及び／又はヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤である。

【0266】

いくつかの例では、投与される追加の薬剤は、抗真菌剤であり、例えばイミダゾール、トリアゾール、チアゾール、アリルアミン及び／又はエキノキャンディン化合物である。

【0267】

いくつかの例では、投与される追加の薬物は、糖尿病を処置するための薬剤である。そのような薬剤として、糖尿病の処置のための及び又は抗高血糖活性を有するための、当該技術分野で既知の薬物が挙げられ、例えば下記が挙げられる：ジペプチジルペプチダーゼ４（ＤＰＰ−４）の阻害剤（例えば、アログリプチン、リナグリプチン、サキサグリプチン、シタグリプチン、ビルダグリプチン及びベルベリン）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン、ブホルミン及びフェンホルミン）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）モジュレータ、例えばチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）（例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン及びトログリタゾン）、デュアルＰＰＡＲアゴニスト（例えば、アレグリタザル、ムラグリタザル及びテサグリタザル）、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、カルブタミド、クロルプロパミド、グリクラジド、トルブタミド、トラザミド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリピジド、グリキドン、グリクロピラミド及びグリメピリド）、メグリチニド（「グリニド」）（例えば、ナテグリニド、レパグリニド及びミチグリニド）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）及び類似体（例えば、エキセンジン−４、エキセナチド、リラグルチド、アルビグルチド）、インスリン及びインスリン類似体（例えば、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、インスリングラルギン、インスリンデテミル、エクスベラ及びＮＰＨインスリン）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール及びボグリボース）、アミリン類似体（例えばプラムリンチド）、ナトリウム依存性グルコース共輸送体Ｔ２（ＳＧＬＴ Ｔ２）阻害剤（例えば、ダパグリフロジン、レモグリフロジン及びセルウグリフロジン）並びに他のもの（例えば、ベンフルオレックス及びトルレスタット）。

【0268】

説明されている任意の態様、実施形態又は例に係る組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する疾患若しくは状態の処置のための併用治療アプローチの一部として投与され得ることを当業者は認識するであろう。併用治療では、各薬剤を同時に投与し得るか又は任意の順序で逐次投与し得る。逐次投与する場合、各成分を同一経路で投与することが好ましい場合がある。

【0269】

２種の薬剤が別々に適用されるいくつかの例では、両方の薬剤が、有利に組み合わされた効果を依然として発揮し得るように、各送達の時間の間に有意な期間が失効しなかったことが概して保証されるであろう。そのような例では、両方の治療法が互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に概して投与されることが企図され、約１２時間のみの遅延時間が最も好ましいが、いくつかの状況では処置のための時間を大いに延ばすことが望ましい場合があり、それぞれの投与間に数日（２、３、４、５、６又は７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）経過する。また、薬剤の複数回の投与が望ましいであろうことも考えられる。

【0270】

本発明の組成物と第２の活性剤とを別々の組成物で投与する場合、投与経路は、異なり得る。例えば、本発明の組成物を、当該技術分野で既知の任意の適切な経路（例えば、限定されないが、経口経路又は非経口経路、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気道（エアロゾル）投与、肺投与、経鼻投与、直腸投与並びに局所（例えば、頬側及び舌下）投与）で投与し、第２の薬学的に活性な薬剤を別の経路（例えば、前記薬学的に活性な薬剤の投与のために当該技術分野で一般に使用される経路）で投与する。非限定的な例では、本発明の組成物を注射により投与し得、第２の活性剤を経口投与し得る。

【0271】

５．薬物の製造
本発明の第６の態様では、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、このポリアニオン性硫酸化セロビオシドの還元末端に存在する小さい非荷電グリコシド結合置換基は、還元末端で硫酸化されている同一のポリアニオンと比べてポリアニオンの化学的安定性を改善する。より好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0272】

例えば、本発明の第６の態様のある実施形態では、対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造における、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量又は薬学的に有効な量の使用が提供される。好ましくは、この改変されている硫酸化セロビオシドは、ｍＣＢＳであるか、又はより具体的にはｍＣＢＳの薬学的に許容される塩（例えば、ｍＣＢＳ．Ｎａ）である。

【0273】

そのような使用の一実施形態では、この薬物は、対象における敗血症若しくはＳＩＲＳを処置するためのものであるか、又は対象における敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置は、前記敗血症若しくはＳＩＲＳ又は前記敗血症若しくはＳＩＲＳと関連する前記状態若しくは疾患を寛解させるか又は阻害する。

【0274】

そのような使用の別の実施形態では、この薬物は、対象におけるＩＲＩを処置するためのものであるか、又は対象におけるＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものであり、前記処置は、前記ＩＲＩ又は前記傷害と関連する前記状態若しくは疾患を寛解させるか又は阻害する。

【0275】

そのような使用のさらに別の実施形態では、この薬物を使用して、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する細胞外ヒストンを中和する。

【0276】

さらに別の実施形態では、製造された薬物は、第２の活性剤、化合物又は組成物の治療上有効な量又は薬学的に有効な量も含み得る。この実施形態によれば、第２の活性剤、化合物又は組成物は、細胞外ヒストンを伴う医学的状態、病気又は疾患を処置するための補助的治療を提供する。望ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置のための補助的治療を提供する。好ましくは、第２の活性剤は、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び／又は対象が患っている１種若しくは複数の状態を処置する任意の他の形態の治療用化合物若しくは医薬化合物の１つ又は複数から選択される。より好ましくは、第２の活性剤、化合物又は組成物は、１種又は複数の抗炎症剤を含む。

【0277】

本発明の方法のいずれかで、改変されている硫酸化セロビオシド化合物を使用する場合、この化合物を、単回用量の製剤において、それを必要とする対象に投与し得るか、又はそれを必要とする対象への投与のために製剤化し得る。特定の代替実施形態では、この改変されている硫酸化セロビオシド化合物を、複数回用量の製剤として、それを必要とする対象に投与するか、又はそれを必要とする対象への投与のために製剤化する。

【0278】

好ましくは、対象への投与ために、本治療用組成物又は医薬組成物は、薬学的に許容される組成物として提供される。この形態の場合、（１）この組成物は、１種又は複数の薬学的に許容される担体（添加剤（ａｄｄｉｔｉｖｅ））、及び／又は希釈剤、及び／又は添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と一緒に薬学的に製剤化され、（２）この組成物中の改変されている硫酸化セロビオシド化合物は、中性又は塩の形態で製剤化され得る。

【実施例】

【0279】

本発明を下記の非限定的な実施例でさらに説明し、この実施例は、例証のみを目的として提供され、本明細書全体を通して本明細書の開示の一般性を制限すると解釈すべきではない。

【0280】

実施例１：ｍＣＢＳ・Ｎａの調製方法
β−Ｏ−メチルセロビオシドを、Ｊｏｎ Ｋ Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，５７：１９７−２０５により説明されているように調製する。

【0281】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）化合物及びナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ．Ｎａ）化合物を、Ｋａｔｒｉｎ Ｃ Ｐｒｏｂｓｔ ａｎｄ Ｈａｎｓ Ｐｅｔｅｒ Ｗｅｓｓｅｌ，２００１，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０（７＆８）：５４９−５６０（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により説明されているように調製した。

【0282】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）を下記の概要に従って調製した。

【化3】

【0283】

ステップ１：α−Ｄ−セロビオース１（１１６ｇ、３３８ｍｍｏｌ）及び氷酢酸（１．６Ｌ）の混合物に、室温で臭化アセチル（３００ｍＬ、５００．０ｇ、４０６５ｍｍｏｌ、１２．０当量）を添加した。得られたクリーム状の混合物を、この反応混合物が、反応の完了を示す透明な溶液に変わるまで、４５〜５５分にわたり６０℃で加熱した。

【0284】

この熱い溶液を、割れた氷（４ｋｇ）が入っているビーカ（１０Ｌ）に慎重に注ぐ。この混合物を、白色固体が沈殿するまで撹拌する（約１０分）。冷水の別の一部（１Ｌ）を添加し、１０分にわたり撹拌し続ける。

【0285】

焼結漏斗でろ別し、固体を冷水で洗浄した（７００ｍＬ×３回）。得られた漏斗中の固体をＤＣＭ（１Ｌ）に溶解させ、この漏斗をＤＣＭで洗浄した（３００ｍＬ×２回）。まとめたＤＣＭ層をブライン（１．５Ｌ）で洗浄し、ＤＣＭ（０．５Ｌ）で逆抽出した。最終ＤＣＭ層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、２時間以内に＜３５℃において減圧下で濃縮して、次のグリコシル化に直接使用する目的の臭化物２（１７２．５ｇ、７４．３％収率）を得た。

【0286】

ステップ２：ｐｅｒ−Ｏ−アセチル化セロビオシルブロミド２（１７１ｇ、２５０ｍｍｏｌ）、無水ＤＣＭ（８００ｍＬ）、無水ＭｅＯＨ（８００ｍＬ）、活性化３Ａモレキュラーシーブ（７０ｇ）の混合物に炭酸銀（Ａｇ_２ＣＯ_３、７５ｇ、２７５ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。得られた混合物を１６時間にわたり光の非存在下で撹拌した。この混合物をシリカのプラグに通して精製し、ＥｔＯＡｃで溶出した。集めた画分を濃縮して褐色固体として粗生成物を得、この粗生成物を次のステップに直接使用した。化合物３のＲ_ｆ＝０．２８（ＥｔＯＡｃ−ヘキサン、１：１）。

【0287】

ステップ３：ステップ２で得られた粗生成物及び無水ＭｅＯＨ（１Ｌ）の混合物に室温でＮａの小片（１．７２ｇ、０．３当量、７５ｍｍｏｌ）を添加した。その後まもなく、溶液から白色固体が沈殿し始めた。得られた混合物を一晩撹拌して、脱アセチル化を確実に完了させた。最終懸濁液をろ別し、ＭｅＯＨで洗浄した（３００ｍＬ×２回）。白色固体を集め、一晩にわたり真空下で乾燥させて、最終セロビオシド４（７２．５ｇ、２段階で８１．４％）を得た。

【0288】

【化4】

ステップ４の合成及び精製の手順：
ステップ４ 化合物４（８４．０ｇ、２３６ｍｍｏｌ）、ＳＯ_３．ＴＭＡ（３６７．４ｇ、２．６４ｍｏｌ、１１．２当量）、無水ＤＭＦ（３１４０ｍＬ）及び無水ＤＣＥ（７６７ｍＬ）の混合物をＡｒ下で３回脱気し、２時間にわたり８０〜９０℃で加熱した。（反応のモニタリング：１０分にわたる加熱後、クリーム状の混合物が透明な溶液に変化した。３０分後、この溶液は再び濁った。５０分後、フラスコの表面上に、凝集した固体を観察した）。冷却後、得られた混合物を低温室（−５℃）に移し、一晩沈降させて溶媒から固体を完全に凝集させた。化合物４から５への完全な変換を１Ｈ−ＮＭＲで確認した。この溶液を排水管にデカントする。粗固体をろ別し、ＤＣＭで２〜３回洗浄した。得られた固体を脱イオン水に溶解させ、イオン交換カラム［ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８のＮａ形態：樹脂（Ｈ^＋形態）３ｋｇをガラス製重力カラムに予め充填し、１ＭのＮａＯＨ（−６Ｌ）の溶出により再生し、脱イオン水（−１２Ｌ）で中和した］に直接かけた。集めた画分を濃縮し、ガラス状固体として最終的な硫酸化セロビオシド６（２３２．１ｇ、９２．０％）を得た。

【0289】

実施例２：ｍＣＢＳ・Ｎａ化合物の安定性研究
安定性研究を５±３℃、２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨ℃条件で実行した。ＨＰＬＣにより、製剤化した臨床材料（即ちリン酸緩衝液中のｍＣＢＳ）中において、ｍＣＢＳ及びセロビオースサルフェート（ＣＢＳ）の両方のレベルを追跡した。ｍＣＢＳ及びＣＢＳの開始量（Ｔ＝０）に対するこれらのパーセント（％）変化のグラフ化により、経時的にｍＣＢＳのレベルが非常に安定していることが分かった。対照的に、ＣＢＳのレベルは非常に急激に下がり、約３ヶ月でほぼなくなっている。実際の安定性プロファイルは促進条件（即ち２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨ）で類似しており、ＣＢＳの消失速度は、より速いように見える。２ロットの製剤からのｍＣＢＳ対ＣＢＳの安定性の差異の一例を図１に示す。このデータは、ＣＢＳは水溶液中で非常に不安定であるが、ＣＢＳの還元末端にメチル基を付加することにより、水溶液中で非常に安定である分子（ｍＣＢＳ）が得られることを示す。

【0290】

加えて、安定性試験において様々なｍＣＢＳ製剤を試験した。これらの実験のデータから、ｍＣＢＳの安定性は、使用する緩衝液によって差が出ないことが分かった。表１は、使用する緩衝液に関するｍＣＢＳの様々な製剤の組成を示す。

【0291】

【表1】

【0292】

表２ａは、様々な製剤の緩衝能力に応じてｐＨが経時的に変化することを示し、且つ酢酸緩衝液による製剤のｐＨが、たとえ約５±３℃であっても約ｐＨ７．５に留まらないことを示すが、このデータ自体は、この期間中のｍＣＢＳ安定性の差異を示す。

【0293】

【表2】

【0294】

表２ｂは、２４ヶ月にわたり−２０℃で貯蔵した場合のバルク粉末の代表的なバッチにおけるｍＣＢＳレベルとＣＢＳレベルとを比較する。Ｔは、月数が単位の時間であり、Ｔ＝０又はＴ０は、製造完了時に実行した分析結果を示す。示した後続の分析は、薬物の粉末又は製剤の最初の分析と相対的である（例えば、Ｔ１＝製造日から１ヶ月）。ＣＡＤ（荷電化粒子検出器）を用いる分析方法を使用して、ｍＣＢＳの純度及びその不純物のレベルを測定し、ＣＡＤ％で表した。

【0295】

【表3】

【0296】

表２ｃは、１８ヶ月超にわたり２〜８℃で貯蔵した場合のリン酸緩衝化ｐＨ７．５臨床試験材料製剤の代表的なバッチにおけるｍＣＢＳレベルとＣＢＳレベルとを比較する。

【0297】

【表4】

【0298】

上記の表２ｂ及び２ｃは、１８〜２４ヶ月にわたる様々な条件下での貯蔵後の粉末又は溶液のいずれかにおけるｍＣＢＳ及びＣＢＳのレベルを示す。ＣＢＳは、これらの調製物中において低レベルの不純物として現れる。結果は、ＣＢＳは、レベルが経時的に顕著に変化するようには見えないことから、−２０℃で貯蔵した場合には粉末中で安定しているように見えることを示す。しかしながら、水性緩衝溶液中では、ＣＢＳは非常に不安定であり、レベルは、２〜８℃での３〜６ヶ月の貯蔵以内に０．０３ＣＡＤ％（即ち検出限界）まで低下する。対照的に、ｍＣＢＳのレベルは、経時的に顕著に変動するようには見えず、粉末中に又は溶液中に保存した場合には高い安定性を示すように見える。

【0299】

様々な緩衝製剤中におけるｍＣＢＳの２８日後のＨＰＬＣ分析（表３）も実行した。ｍＣＢＳは、たとえ促進条件２５±２℃／６０％ＲＨ及び４０±２℃／７５％ＲＨであっても、リン酸緩衝液中における又はクエン酸緩衝液中における２８日後の変動が公称のわずか−／＋約２％であるように見え、良好な安定性を示す。

【0300】

【表5】

【0301】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及び薬物動態プロファイルの前臨床動物研究
下記の実施例３〜１０は、本発明で使用されるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及び薬物動態（ＰＫ）プロファイルの、本発明者らが行った動物における例示的な前臨床研究を概説する。

【0302】

実施例３：動物研究で用いたｍＣＢＳ・Ｎａ化合物
この実施例は、後に説明する動物で行った毒性及びＰＫ研究で用いるナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ・Ｎａ）化合物の特性を示す。

【0303】

下記で説明するＳＴＸ研究を、特に本発明で使用されるｍＣＢＳ・Ｎａ等のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート化合物の毒性及びＰＫプロファイルの予備的な理解を提供するために実行した。この研究を、同一のロットの化合物を使用して実行し、この化合物の特性を下記の表４にまとめる。

【0304】

【表6】

【0305】

実施例４：β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの用量及び濃度
通常、本明細書で説明されている毒性及びＰＫの動物研究では、ｍＣＢＳのナトリウム塩を使用した。しかしながら、本明細書で概説されている生物学的分析測定は、ｍＣＢＳの遊離塩基形態を検出して報告したことに留意すべきである。従って、明確性のため、生物学的分析結果との関係を明確にするために、本明細書では、遊離塩基としての用量／濃度も報告している。ナトリウム含有量（塩形態に対する遊離塩基のＭＷの比率に基づく）及び試験物の純度を補正することにより、ｍＣＢＳ遊離塩基の用量を得た。しかしながら、いずれの用量（即ちナトリウム塩又は遊離塩基）も、バッチ中の化合物の効力を考慮していない。

【0306】

実施例５：β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの効力
上述したように、報告したｍＣＢＳの動物に投与した用量又は濃度は、効力（即ち含水量及び他の不純物）に関して補正しておらず、なぜなら、この研究を実行している間、使用したバッチ中のｍＣＢＳのナトリウム塩（即ちｍＣＢＳ・Ｎａ）の効力分析を決定しなかったからである。これらの研究で使用したバッチのその後の分析は、それ以降、ナトリウム塩の効力が約７４．５％であることを示している。これらの実施例で使用した実際の用量は、指示したものと比べて少なかった可能性が非常に高い。

【0307】

実施例６：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与後のｍＣＢＳの毒性
この実施例は、１週間の用量範囲探索（ＤＲＦ）研究におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの単回ボーラス用量の静脈内投与後のｍＣＢＳの急性毒性の評価と、７日にわたるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへのボーラス用量の毎日の静脈内投与後のｍＣＢＳの毒性の評価とを示す。

【0308】

この研究では、ｍＣＢＳ・Ｎａ及び遊離塩基としてのｍＣＢＳの用量を最初に調べた。この効力評価から、最大耐量（ＭＴＤ）の推定値は、ｍＣＢＳのナトリウム塩の場合には約７４５ｍｇ／ｋｇであり、ｍＣＢＳ遊離塩基の場合には約６００ｍｇ／ｋｇであった可能性が高い。

【0309】

１週間の用量範囲探索（ＤＲＦ）研究におけるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの単回ボーラス用量の静脈内投与後のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の急性毒性の評価
この研究では、最大１０００ｍｇ／ｋｇの用量でのラットにおけるｍＣＢＳの単回ＩＶ投与からの急性毒性を調べた。

【0310】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の急性毒性を単回ボーラス用量の静脈内投与後にＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。この用量範囲探索研究では、ナトリウム塩の形態でのｍＣＢＳ試験物（ｍＣＢＳ・Ｎａ）の１０、３０、１００、３００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量において、ｎ＝３の成体の雌ラットの合計５つの群を処理した。純度及びナトリウム含有量の補正により、これらの用量レベルは、ｍＣＢＳ遊離塩基の約８．２、２４．５、８１．５、２４４．５及び８１５ｍｇ／ｋｇに相当した。次いで、このラットを、剖検することなく終了前７日にわたり観察した。ｍＣＢＳ試験物による処理は、１０００ｍｇ／ｋｇ用量までの全ての用量レベルで良好な耐容性を示した。処理に関連すると考えられる所見はなかった。

【0311】

従って、この研究からのｍＣＢＳ・Ｎａの最大耐量（ＭＴＤ）又は急性耐量は１０００ｍｇ／ｋｇと特定し、これは、ｍＣＢＳ遊離塩基の８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。異常な所見又は（コントロール動物と比較した）体重の変化は観察しなかった。

【0312】

７日にわたるＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへのボーラス用量の毎日の静脈内投与後のβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の毒性の評価
この研究では、最大１０００ｍｇ／ｋｇの用量での７日にわたるラットにおけるｍＣＢＳの反復ＩＶ投与からの毒性を調べた。

【0313】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの急性耐容性及び毒性を７日の期間にわたる毎日の静脈内用量投与後のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。この反復用量研究では、ナトリウム塩の形態のｍＣＢＳ（ｍＣＢＳ・Ｎａ）の０、１００、３００及び１０００ｍｇ／ｋｇの用量において、ｎ＝３の成体の雌ラットの合計４つの群を処理した。純度及びナトリウム含有量の補正により、これらの用量レベルは、ｍＣＢＳ遊離塩基の約８１．５、２４４．５及び８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。次いで、このラットを終了前７日にわたり観察し、肉眼による剖検並びに終末の血液分析及び生化学分析を行った。ｎ＝３の雄ラットの追加の群も、同一の研究デザインに従って１０００ｍｇ／ｋｇの最高用量で処理した。

【0314】

ｍＣＢＳは、１０００ｍｇ／ｋｇ用量までの全ての用量レベルで良好な耐容性を示した。処理に関連すると考えられる有害な所見はなかった。処理した動物における血学的パラメータ及び生化学的パラメータは目立たないものであった。肉眼による剖検及び病理で観察した影響は、処理との関連はないと考えられた。

【0315】

従って、この研究におけるＭＴＤは１０００ｍｇ／ｋｇと特定し、これは、ｍＣＢＳ遊離塩基の８１５ｍｇ／ｋｇに相当する。

【0316】

実施例７：Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの静脈内投与後のｍＣＢＳの薬物動態
この実施例は、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内投与したｍＣＢＳの薬物動態（ＰＫ）の評価を示す。

【0317】

下記の研究は、ｍＣＢＳのナトリウム塩及び遊離塩基の両方として報告するｍＣＢＳの用量を示す。後者は、特にｍＣＢＳ（遊離塩基）の測定した血漿レベルと投与した用量とを関連付ける場合且つクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）等の終末期ＰＫパラメータを決定するために重要であると考えられる。ＳＴＸ−０９研究は、約２５及び５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのラットにおける５時間の連続注入にわたりｍＣＢＳの血漿中濃度を示す。

【0318】

Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内経路で投与したβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの薬物動態研究
この研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるｍＣＢＳのボーラスＩＶ投与（２０ｍｇ／ｋｇ）ＰＫプロファイルを調べ、化合物のほとんどが迅速に排出され、投与した用量の９０％超が最初の４時間で中央コンパートメントから除去されており、投与した用量の残余のｍＣＢＳがより長い期間をかけてゆっくりと除去されることを示す。大きい分布容積は、ｍＣＢＳ化合物が中央コンパートメントから組織に迅速に移動していることを示す。

【0319】

β−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェート（ｍＣＢＳ）の薬物動態を、ヘプタナトリウム塩の形態でのｍＣＢＳのナトリウム塩（ｍＣＢＳ・Ｎａ）としての２０ｍｇ／ｋｇのボーラス用量（又はナトリウム含有量及び純度に関する調整後の１６．３ｍｇ／ｋｇの遊離塩基）の静脈内投与後、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。

【0320】

効力を考慮して、このラットに投与した用量は、ナトリウム塩及び遊離塩基のそれぞれに関して１４．９ｍｇ／ｋｇ及び１２．６５ｍｇ／ｋｇである可能性が高いと推定した。補正したｍＣＢＳ遊離塩基の用量は約２０％低かったことから、これにより、算出したクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）の値は、同様の割合で効果的に減少した。

【0321】

投与前から投与後４８時間までの範囲の時点で３匹のラットから合計１０個の血液サンプルを採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳ（遊離塩基）の濃度に関して分析した。血漿中濃度対時間のデータを薬物動態パラメータの算出に使用した。

【0322】

時間ゼロ（Ｃ０）でのｍＣＢＳ濃度の平均（±ＳＥＭ）値は、７３４００（±８５６０）ｎｇ／ｍＬであった。時間ゼロから最後に測定した時点（ＡＵＣｌａｓｔ）までの及び無限大（ＡＵＣｉｎｆ）までの曲線下面積の平均（±ＳＥＭ）値は、それぞれ３４３００（±２４６０）ｎｇ．時間／ｍＬ及び３５０００（±２９４０）ｎｇ．時間／ｍＬであった。見かけ上の排出半減期（Ｔ１／２）の平均（±ＳＥＭ）値は７７．５（±５４．５）時間であったが、平均残留時間（ＭＲＴ）の平均（±ＳＥＭ）値は５．５８（±３．９９）時間と比較的短かった。分布容積（Ｖｚ）の平均（±ＳＥＭ）値は４６．９（±３０．７）Ｌ／ｋｇと高く、全身クリアランス（Ｃｌ）の平均（±ＳＥＭ）値は０．４７２（±０．０３７７）Ｌ／時間／ｋｇと低かった。Ｔ_１／２（１２２％ＣＶ）、Ｖｚ（１１３％ＣＶ）及びＭＲＴ（１２４％ＣＶ）の高い対象者間変動は、対数線形濃度対時間曲線の終末消失部分の不完全なキャラクタリゼーションに起因している可能性が最も高かった。

【0323】

Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに静脈内経路で投与したｍＣＢＳの薬物動態研究
この研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるボーラスＩＶ投与（１００ｍｇ／ｋｇ）後のｍＣＢＳのＰＫを調べた。

【0324】

ｍＣＢＳの薬物動態を、６匹のラットの群へのナトリウム塩の形態でのボーラス１００ｍｇ／ｋｇ用量のｍＣＢＳ（又はナトリウム含有量及び純度に関する補正後の８１．５ｍｇ／ｋｇの遊離塩基）の静脈内投与後、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットで評価した。

【0325】

効力を考慮して、このラットに投与した用量をナトリウム塩及び遊離塩基のそれぞれに関して７４．５ｍｇ／ｋｇ及び６３．２５ｍｇ／ｋｇであると推定した。補正したｍＣＢＳ遊離塩基の用量は約２０％低かったことから、これにより、算出したクリアランス（Ｃｌ）及び分布容積（Ｖｚ）の値は、同様の割合で効果的に減少した。

【0326】

投与前から投与後１９２時間までの範囲の時点で各ラットから合計９個の血液サンプルを採取した。最初の４８時間にわたり尿サンプルも採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理した。その後、尿サンプル及び血漿サンプルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳ（遊離塩基）の濃度に関して分析した。

【0327】

ｍＣＢＳに関する血漿薬物動態パラメータの推定値を、プールした平均濃度対時間のデータから得た。時間ゼロ（０）での濃度は３０８，０００ｎｇ／ｍＬであった。時間ゼロから最後に測定した濃度（ＡＵＣｌａｓｔ）の時間までの曲線下面積及び無限大（ＡＵＣｉｎｆ）まで外挿された場合の曲線下面積は両方とも、１３５，０００ｎｇ．時間／ｍＬであった。１．４３時間の平均残留時間（ＭＲＴ）とは対照的に、見かけ上の終末排出半減期（Ｔ１／２）は５６．１時間であった。この化合物は、４９．０Ｌ／ｋｇという比較的高い分布容積（Ｖｚ）を示したが、終末全身クリアランス（Ｃｌ）は０．６０５Ｌ／時間／ｋｇと比較的低かった。

【0328】

ｍＣＢＳ遊離塩基に関する尿中薬物動態物質収支の推定値を、排泄された尿量のデータから得た。投与後０〜４時間、０〜２４時間及び０〜４８時間の採取間隔で排泄されたｍＣＢＳの総用量の割合の平均（±ＳＥＭ）値は、それぞれ５２．０（±５．０）％、６５．０（±７．０）％及び６９．２（±１０．８）％であった。尿の排泄は、投与後最初の４８時間における化合物の排出のための主要な経路として特定されている。

【0329】

この研究は、ｍＣＢＳが、投与直後に中央コンパートメントから迅速に除去され、大きい分布容積により示されているように組織に吸収されることを確認した。この化合物の分布半減期（これは、排出の主要な決定因子である）は０．６５時間であると推定した。終末期の多重サンプリングにより、終末排出半減期のキャラクタリゼーションが改善され、この終末排出半減期は約５６時間であると算出した。

【0330】

ｍＣＢＳを静脈内注入により投与したＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける薬物動態研究
この研究は、約２５及び５０ｍｇ／ｋｇ／時間でのラットにおける５時間の連続注入にわたりｍＣＢＳの血漿中濃度を調べた。

【0331】

雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットへの５時間にわたる注入としての静脈内投与後、ｍＣＢＳの薬物動態（ＰＫ）を研究した。この研究では、静脈内注入後にｍＣＢＳ化合物の薬物動態を調査した。この化合物を、ハルトマン溶液を使用して製剤化し、２５．３ｍｇ／ｋｇ／時間の割合でｎ＝３のラットの群に投与し（総用量：１２６．５ｍｇ／ｋｇ；群１）、且つ５０．６ｍｇ／ｋｇ／時間の割合でｎ＝３のラットの第２の群に投与した（総用量：２５３ｍｇ／ｋｇ；群２）。

【0332】

この研究では、５時間にわたる連続注入に使用したｍＣＢＳナトリウム塩の名目上の用量は、４０及び８０ｍｇ／ｋｇ／時間（又は遊離塩基としてそれぞれ３４及び６８ｍｇ／ｋｇ／時間）であった。

【0333】

投与前から注入の開始後５時間までの範囲の時点で各ラットから合計６個の血液ＰＫサンプルを採取した。得られた血液サンプルを血漿に処理し、その後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースの方法を使用してｍＣＢＳの濃度に関して分析した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアを使用して、０〜５時間の注入間隔をかけて濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）の値を推定した。定常状態の濃度（Ｃｓｓ）及びクリアランス（Ｃｌ）の値も推定した。

【0334】

ｍＣＢＳの濃度は、用量投与前に採取した血漿サンプルではアッセイの定量限界未満であり、投与後３０分〜５時間に採取した全ての血漿サンプルでは濃度が定量可能であった。０〜５時間の注入間隔の平均（±ＳＥＭ）ＡＵＣ値は、群１及び群２それぞれに関して２６０，０００（±３０，２００）ｎｇ．時間／ｍＬ及び５３２，０００（±２５，５００）ｎｇ．時間／ｍＬであった。群１のＣｓｓ及びＣｌの平均（±ＳＥＭ）値は、群１に関して５８，４００（±６，９２０）ｎｇ／ｍｌ及び０．６０１（±０．０８１）ｌ／時間／ｋｇであったが、群２のＣｓｓ及びＣｌの平均（±ＳＥＭ）値は、１２０，０００（±５，５６０）ｎｇ／ｍｌ及び０．５７１（±０．０２５）であった。

【0335】

これらの結果は、ｍＣＢＳが２時間の注入後に定常状態の血漿レベル（Ｃｓｓ）に達したことを示す。５０ｍｇ／ｋｇ／時間で処理したラットにおける両方のＣｓｓ及びＡＵＣは両方とも、２５ｍｇ／ｋｇ／時間で処理したラットと比べて２倍高く、これは、全身曝露が、この研究で使用した用量に比例することを示す。凝固試験は、より高い用量のｍＣＢＳで処理したラットは基準範囲と比べてＡＰＴＴスコアが高いことを示し、これは、この用量でのｍＣＢＳの存在により凝固時間が長くなることを示す。

【0336】

実施例８：ヒト、イヌ及びラットにおけるｍＣＢＳの血漿タンパク質への結合及び代謝のインビトロでの調査
この実施例は、ｍＣＢＳの代謝及び血漿タンパク質結合を調べるために実行したインビトロ研究を示す。具体的には、この研究で、ヒト、イヌ及びラットの肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝を調べ、ｍＣＢＳの代謝を検出しないと結論付けた。同様に、この研究で、限外ろ過技術を使用してヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質へのｍＣＢＳの結合を調べ、試験した全ての種において血漿タンパク質への結合が約２０％であると結論付けた。

【0337】

ヒト、イヌ及びラットの肝ミクロソームにおけるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートのインビトロでの代謝
要約すると、この研究は、ラット、イヌ及びヒトの肝ミクロソームによるｍＣＢＳの第Ｉ相及び第ＩＩ相の代謝を調べるために設計されたインビトロでの調査であった。結果は、ｍＣＢＳの代謝を検出しなかったことを示す。

【0338】

（ｉ）ヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームにおけるβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートの第Ｉ相代謝
水中の５０％メタノールに溶解させた２５μＭのｍＣＢＳのストック濃縮物を反応管に入れた（１０μＬ）。反応混合物（最終体積２５０μＬ）は下記を含んだ：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド２’−ホスフェート（ＮＡＤＰＨ）（１ｍＭ）及びプールしたヒト、ラット又はイヌの肝ミクロソーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）。５分間のプレインキュベーション期間後にＮＡＤＰＨを添加することにより反応を開始させ、振盪水浴中において３７℃でインキュベートした後、氷冷アセトニトリル５００μＬで停止させた。次いで、サンプルをボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離した。サンプルの半分（３７５μｌ）をガラス管に移し、窒素流下で及び３７℃において蒸発させた。次いで、サンプルを移動相Ａ（２５０μＬ）中で再構成した。ｍＣＢＳの最終濃度は、インキュベーション媒体中で１μＭであった。

【0339】

この反応混合物を１時間にわたりインキュベートし、０、１５、３０、４５及び６０分の時点で三重にサンプリングした。研究サンプルと並行して陰性コントロール（ＮＡＤＰＨなし）を使用した。陽性コントロール；ミダゾラム、２５μＭ（１０μＬ）を１時間にわたり同一条件下でインキュベートした。ミダゾラムの最終濃度は、インキュベーション媒体中で１μＭであった。

【0340】

【表7】

【0341】

（ｉｉ）生物分析：ｍＣＢＳの較正曲線
水中の５０％メタノール中のｍＣＢＳ（３０μｇ／ｍｌ−遊離塩基として）及びミダゾラム（１０μｇ／ｍｌ）の混合ストック溶液を、水中の５０％メタノールを使用して、ｍＣＢＳの場合には２５、２０、１２．５、６．２５、２．５、１．２５、０．２５及び０．１２５μｇ／ｍｌに希釈し、且つ８３３３、６６６７、４１６７、２０８３、８３３、４１７、８３．３、４１．７ｎｇ／ｍｌに希釈し、ワーキング標準溶液のアリコート（１０μＬ）をプラスチック管に入れた。次に、この管にリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）のアリコート（１９０μＬ）及びミクロソームのリン酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）溶液（５０μ）を入れ、続いてアセトニトリルのアリコート５００μＬを入れた。管をボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで１０分にわたり遠心分離した。上清のアリコート（３７５μＬ）を窒素流下で蒸発させ、移動相Ａ（２５０μＬ）中で再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＣシステムに直接注入した（１０μＬ）。

【0342】

（ｉｉｉ）ヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの第ＩＩ相代謝
メタノール（５０μＬ）に溶解させた１ｍｇ／ｍｌのｍＣＢＳのストック濃縮物を反応管中で蒸発乾固させ、１００μＭの最終濃度において反応混合物に再懸濁させた。混合物（最終体積２５０μｌ）は下記を含んだ：０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）、ＭｇＣｌ_２（１ｍＭ）、ウリジン５’−ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）（５ｍＭ）、肝ミクロソーム（０．３ｍｇ／ｍｌ）及びアラメチシン（２５μｇ／タンパク質ｍｇ）。５分間のプレインキュベーション期間後にＵＤＰＧＡを添加することにより反抗混合物を開始させ、振盪水浴中において３７℃でインキュベートした後、氷冷アセトニトリル（５００μＬ）で停止させた。次いで、サンプルをボルテックス混合し、１４，０００ｒｐｍで５分にわたり遠心分離した。

【0343】

この反応混合物を肝ミクロソーム中で２時間にわたりインキュベートした（ｎ＝３）。この研究サンプルと一緒に陰性コントロール（ＵＤＰＧＡなし）及び陽性コントロール（パラセタモール１００μＭ）をインキュベートした。

【0344】

（ｉｖ）質量分析条件
ｍＣＢＳ及びミダゾラムの分析に使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータを表６にまとめる。

【0345】

【表8】

【0346】

（Ｖ）結果
第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの代謝安定性を図２〜４に示す。これらの結果は、これらの条件下では試験化合物の有意な代謝がなかったことを示す。図２は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのヒト肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒト肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。図３は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのラット肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、ヒトラット肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。図４は、第Ｉ相代謝を許容する条件下でのイヌ肝ミクロソームの存在下におけるｍＣＢＳの濃度（μＭ）の測定値（平均±ＳＥＭ）で示される、イヌ肝ミクロソームにおけるｍＣＢＳの代謝安定性を示すグラフである。

【0347】

（ｖｉ）第ＩＩ相代謝
第ＩＩ相代謝を許容する条件下での化合物とヒト、ラット及びイヌの肝ミクロソームとのインキュベーション後の反応サンプル中で検出したｍＣＢＳのグルクロン酸代謝産物と一致するイオンは存在しなかった。インキュベーション媒体中でのパラセタモールグルクロニドの形成をニュートラルロス（Ｎｅｕｔｒａｌ ｌｏｓｓ）及びＭＲＭスキャンの両方で確認した。

【0348】

このインビトロでの研究では、反応媒体中での遊離塩基の形態のレベルの変化を測定することにより、ｍＣＢＳの代謝を評価した。

【0349】

第Ｉ相代謝を許容する条件下では、評価した３種の肝ミクロソームとの１時間のインキュベーション後、ｍＣＢＳ濃度は低下しなかった。同一条件下では、陽性コントロール化合物であるミダゾラムは、３種のミクロソームの存在下でほぼ完全に代謝された。

【0350】

ｍＣＢＳの濃度は、ヒト肝ミクロソームとの反応では時間ゼロで０．６μＭ未満であったことに留意されたい（一方、添加した濃度は１μＭであった）。同様の観察が、肝ミクロソームを含むがＮＡＤＰＨを含まない陰性コントロールサンプルで見られたが、ＮＡＤＰＨを含むがミクロソームを含まない陰性コントロールサンプルでは見られなかった。肝ミクロソームは、タンパク質、リン脂質及び脂肪酸の混合物を含む複雑な組織である。肝ミクロソーム組織の成分は、質量分析計のイオン化に影響を及ぼしてシグナルを抑制する可能性がある。肝ミクロソームの成分は、種間で異なることから、イオン抑制は、ヒトミクロソームではより強く、時間及びＮＡＤＰＨの存在に依存しない化合物濃度の見かけ上の低下をもたらす場合がある。

【0351】

要約すると、ヒト、ラット及びイヌのミクロソームを用いたミクロソーム反応において、試験物の無／最小の第Ｉ相代謝を検出した。第２のインビトロでの代謝研究（第ＩＩ相）において、グルクロニド代謝産物もウリジン５’−ジホスホグルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）の存在下での各種の肝ミクロソームとの２時間のインキュベーション後に検出しなかった。

【0352】

いかなる理論又は特定の作用様式に拘束されることなく、本出願人らは、ｍＣＢＳの広範なインビトロでの代謝の欠如が、この分子への酵素のアクセスを妨げる７種のサルフェート（Ｓ０３）群の存在により説明され得ることを推測した。しかしながら、この結果は、第Ｉ相又は第ＩＩ相の代謝に続くインビボでの脱硫酸化の可能性を排除し得ない。

【0353】

限外ろ過技術を使用する、ヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質に結合するｍＣＢＳの調査
要約すると、この研究は、ラット、イヌ及びヒトの血漿タンパク質へのｍＣＢＳの結合を調べるために設計されたインビトロでの研究であった。得られた結果は、試験した全ての種において、血漿タンパク質への約２０％の結合が存在したことを示す。

【0354】

ここで説明されている研究では、既存の方法を、内部標準として重水素化ｍＣＢＳ（ｍＣＢＳ−ｄ３）の使用を含むように改変した。この生物学的分析方法を使用して、ラット、イヌ及びヒトの血漿とのｍＣＢＳの血漿タンパク質結合を評価した。

【0355】

３００００ダルトンの分子量カットオフポイントを有するＣｅｎｔｒｉｆｒｅｅ（登録商標）限外ろ過装置を使用する限外ろ過方法により、タンパク質結合を評価した。簡潔に説明すると、既知の濃度の（遊離塩基としての）ｍＣＢＳをヒト、ラット及びイヌの血漿サンプルに添加し、３７℃で２０分にわたりインキュベートした。次いで、このサンプルを限外ろ過にかけて、タンパク質が結合した薬物と結合していない薬物を分離した。次いで、タンパク質結合の程度を薬物の全濃度と未結合の濃度との間の百分率差として定義した（リン酸緩衝液のみの存在下での限外ろ過装置への非特異的結合の減算を含む）。

【0356】

使用した試薬を下記の表７で詳述する。ｍＣＢＳ及びｍＣＢＳ−ｄ３の分析に使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータを表８にまとめる。

【0357】

【表9】

【0358】

（ｉ）分析方法のパラメータ

【0359】

【表10】

【0360】

（ｉｉ）サンプル調製
ｍＣＢＳストック溶液（１０μＬ）を、最終濃度が２００ｎｇ／ｍＬ及び２０００ｎｇ／ｍＬとなるように、下記の表９に列挙されている各試験マトリックス（４９０μＬ）の溶液にスパイクした。

【0361】

【表11】

【0362】

次いで、スパイクサンプルを水浴中で２０分にわたり３７℃でインキュベートした。各試験群からのサンプルのアリコート（５００μＬ）を限外ろ過装置に移し（ｎ＝３）、１０００ｇで２０分にわたり遠心分離した。遠心分離後、限外ろ過液のアリコート（５０μＬ）を、各試験群からの限外ろ過前のサンプルの二重のアリコートと共に、抽出のために別の試験管に移した。

【0363】

（ｉｉｉ）較正曲線の作成
２００μｇ／ｍＬでのｍＣＢＳ標準溶液アリコートを下記に示すように希釈した。

【0364】

【表12】

【0365】

次いで、得られた標準溶液のアリコート（１０μＬ）を関連マトリックス（ヒト、ラット及びイヌの血漿並びにリン酸緩衝液２．５ｍＭ、ｐＨ７．４）のそれぞれ４９０μＬにスパイクし、よく混合した。

【0366】

（ｉｖ）抽出
スパイクした標準及びサンプルのアリコート（５０μＬ）（インキュベーション及び限外ろ過後）を１μｇ／ｍＬの内部標準溶液５０μＬと混合した。純粋なアセトニトリル（１５０μＬ）を添加し、サンプルを直ちにボルテックスした。上清溶液をガラス管に移し、空気流下で３７℃において蒸発させた。次いで、乾燥したサンプルを移動相Ａ’ １５０μＬ中で再構成した。

【0367】

限外ろ過前のサンプルの定量のために、サンプルを、血漿において新たに作成した標準曲線に対して分析した。限外ろ過後に採取したタンパク質に乏しいサンプルを、２．５ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．４において新たに作成した較正曲線に対して定量した。非特異的結合の推定のために、限外ろ過の前後両方のサンプルをリン酸緩衝液での較正曲線に対して定量した。

【0368】

（ｖ）結果：非特異的結合
限外ろ過装置への非特異的結合は、２００及び２０００ｎｇ／ｍＬそれぞれで０．５％及び−１．９７％と推定した（下記表１０）。従って、限外ろ過装置への化合物の結合は無視できると考えられた。

【0369】

【表13】

【0370】

（ｖｉ）血漿タンパク質結合
ヒト、ラット及びイヌの血漿にスパイクしたｍＣＢＳのろ過の前後での濃度の比較により、血漿タンパク質結合を算出した。結合の程度は、１６〜２３％の範囲で３種全ての種に関して類似していた（下記の表１１〜１３を参照されたい）。ｍＣＢＳの血漿タンパク質結合は、試験した両方の濃度で類似していた。

【0371】

【表14】

【0372】

【表15】

【0373】

【表16】

【0374】

この研究では、ヒト、ラット及びイヌの血漿タンパク質へのｍＣＢＳ結合は約２０％であった。結合の程度は２００及び２０００ｎｇ／ｍＬで類似しており、限外ろ過装置への非特異的結合は無視できた。

【0375】

実施例９：ラットにおける７日連続の長期間にわたる連続ＩＶ注入後のｍＣＢＳの投与量及び毒性のインビボでの調査
この実施例は、７日連続の期間にわたる連続した（２４時間／日）Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットへのＩＶ注入により投与した場合の、ｍＣＢＳの用量範囲及び毒性の調査のインビボでの研究を概説する。この実施例は、ラットにおけるｍＣＢＳのこの集中投与計画下において、ラットに投与した場合、１３９４ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基；効力及び塩含有量の補正後）の投与量でｍＣＢＳの観察可能な副作用レベルが存在しなかったことを示す。

【0376】

この研究の目的は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの、７日連続にわたる、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）の静脈内注入により投与した場合における、試験物であるｍＣＢＳの毒性を決定することであった。

【0377】

ｍＣＢＳの試験物用量製剤及びコントロール物用量製剤（ヘプタナトリウム塩ｍＣＢＳ・Ｎａの形態）を、下記の表１４で説明するように、７日連続にわたる連続（２４時間／日）の静脈内注入により、ラットの群に投与した。

【0378】

【表17】

【0379】

この研究中にモニタリングしたパラメータとして、死亡率、臨床観察、体重及び摂食量が挙げられる。加えて、９日目に血液学的パラメータ、凝固パラメータ及び臨床化学パラメータを評価した。血漿中における試験物濃度を分析するために、注入開始に対して相対的な時点で動物から血液サンプルを採取した。終了時（９日目）、全ての動物を安楽死させ、肉眼による剖検検査にかけた。選択した臓器に対して臓器重量を測定し、肉眼的病変等の組織の選択したリストを保持し、顕微鏡による評価のために調製した。

【0380】

Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの、７日連続にわたる、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）の静脈内注入によるｍＣＢＳ・Ｎａの投与により、効力及び塩レベルに関する補正後の５５７５ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で１匹の雌が死亡した。

【0381】

血漿中濃度対時間のデータは、ｍＣＢＳの定常状態の濃度が５時間〜９６時間（又は１６８時間）の注入間隔にわたり維持されたことを示す。ＡＵＣ５〜９６時間及びＣｓｓの平均（±ＳＥＭ）値は、用量と共に直線的に増加した。

【0382】

５５７５ｍｇ／ｋｇ／日においてｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した両方の性別の動物では、摂食量の減少と相関して、体重増加の減少が認められた。用量≧３４８４ｍｇ／ｋｇ／日での両方の性別の動物において、白血球系統の増加が認められ、５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での雄では、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積及び平均赤血球ヘモグロビン濃度の低下と、網状赤血球の増加とが認められた。用量≧２１７８ｍｇ／ｋｇ日での雄において及び用量≧３４８４ｍｇ／ｋｇ／日での雌において、活性化部分トロンボプラスチン時間の増加が認められた。５５７５ｍｇ／ｋｇ／日で投与した雄では、肝酵素、アラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ並びにコレステロール及びトリグリセリドが増加した。加えて、５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での両方の性別の動物において、尿素が増加し、且つ総タンパク質及びアルブミンが減少した。

【0383】

腎臓では、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物において、近位尿細管の空胞化／粗鬆化を両側で観察した。この所見（単純な尿細管の空胞化／粗鬆化）は、いかなる他の病理学的変化とも関連していなかった。腎臓の顕微鏡的所見は、腎臓重量の増加と相関していた。

【0384】

脾臓では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物において、赤色髄でのアポトーシス細胞の増加と関連する泡沫状マクロファージの蓄積を観察した。これらの脾臓の変化は、間質細胞の過形成、白色髄（胚中心）の細胞充実性／サイズの増加、莢膜線維化及び造血の増加をときに伴った。脾臓の顕微鏡的所見は、脾臓重量の増加と相関していた。

【0385】

肝臓では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物では、（≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日での）類洞並列細胞の増加、（５５７５ｍｇ／ｋｇ／日での）髄外造血と関連することが多い泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積が認められた。加えて、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した動物では単細胞壊死が見られ、２１７８及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日で処理した動物では、限局性又は多発性の巣状壊死が認められた。５５７５ｍｇ／ｋｇ／日群では、雌と比べて雄で肝変化が顕著であり及び／又は頻発しており、ｍＣＢＳに十分に曝露された両方の雄の動物は、最小〜中程度の肝変化を示した。

【0386】

様々なリンパ節（気管支、下顎、縦隔、腸間膜、膵臓、肝臓及び／又は耳介）では、≧１３９４ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳ（遊離塩基）で処理した多くの動物において、泡沫状マクロファージの蓄積を観察した。

【0387】

（脾臓及びリンパ節での）泡沫状マクロファージの蓄積、（肝臓での）泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積及び（腎臓での）近位尿細管の空胞化／粗鬆化の所見は、試験物ｍＣＢＳ及び／又はその分解生成物が、（脾臓、肝臓及びリンパ節での）単核貪食細胞系に捕捉され且つ腎尿細管上皮に取り込まれる可能性が最も高かったことを示唆する。従って、いかなる特定の理論又は特定の作用様式に拘束されることなく、本出願人らは、これらの所見が、試験物及び／又はその分解生成物の食作用及び排除の結果として、単核貪食細胞系及び腎臓の適応変化を表している可能性が最も高いと推論した。加えて、脾臓での他の所見［アポトーシス細胞の増加、間質細胞の過形成、白色髄（胚中心）の細胞充実性／サイズの増加、造血の増加及び莢膜線維化］並びに肝臓での他の所見（類洞並列細胞の増加及び髄外造血）も、活性化された貪食細胞系への適応反応であると本出願人らは推論した。

【0388】

しかしながら、２１７８、３４８４及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）で認められた肝臓の単細胞壊死は、潜在的に有害であると考えられた。加えて、２１７８及び５５７５ｍｇ／ｋｇ／日では、肝臓の限局性又は多発性の巣状壊死が認められた。巣状壊死は、３４８４ｍｇ／ｋｇ／日で処理した動物では見られず、自然に生じる可能性があるが、この所見をｍＣＢＳで処理した動物のみで観察したという事実を考慮すると、試験物との関連性を排除できない。

【0389】

結果として、≧２１７８ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）で肝臓において観察した病理組織学的変化に起因して、この研究では、ｍＣＢＳの無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）は１３９４ｍｇ／ｋｇ／日（遊離塩基）であると決定した。

【0390】

実施例１０：イヌにおける最大１４日連続の長期間にわたる連続ＩＶ注入後のｍＣＢＳの投与量及び毒性のインビボでの調査
この実施例は、１４日の期間にわたるビーグル犬への連続ＩＶ注入により投与した場合の、ｍＣＢＳの用量範囲及び毒性の調査のインビボでの研究を概説する。この実施例は、イヌにおけるｍＣＢＳのこの集中投与レジーム下において、１４日にわたる２７８８ｍｇ／ｋｇ／日でのｍＣＢＳの連続静脈内注入（４８時間にわたる２４時間／日）は良好な耐容性を示しており、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）、臓器重量又は巨視的評価への影響がなかったことを示す。

【0391】

イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入
要約すると、この研究は、１４日連続の注入イヌ研究で使用するためにｍＣＢＳの最大用量を選択することを目的として、連続注入によるイヌにおけるｍＣＢＳの用量範囲を調べた。同様に、選択した用量は、ＭＴＤ又は少なくとも３００ｕｇ／ｍｌのｍＣＢＳ（遊離塩基）血漿レベル（即ち目標ヒト血漿レベルの約３倍）をもたらすものであった。

【0392】

特に、ビーグル犬に最大４回の用量レベルにわたり１回の用量レベル当たり４８時間で、外科的に留置されたカテーテルを介した連続（２４時間／日）静脈内注入により投与した場合における試験物ｍＣＢＳの最大耐量（ＭＴＤ）を決定するためにもこの研究を行った。

【0393】

フェーズ１：用量の段階的増大
ｍＣＢＳ用量製剤を、下記の表１５で説明しているように、最大４回の用量レベルにわたり１回の用量レベル当たり４８時間での連続（２４時間／日）静脈内注入により、ビーグル犬に投与した。

【0394】

【表18】

【0395】

この研究のこのフェーズ中にモニタリングしたパラメータには、死亡率、臨床観察、体重及び摂食量が含まれた。下記の時点でｍＣＢＳ血漿レベルを確認するために、各動物から一連の血液サンプルを採取した：各用量レベルの注入の開始後２４及び４８時間。同様に、１日目に、３日目、５日目及び７日目の新たな用量レベルの投与前且つ９日目に、臨床病理評価（血液、凝固及び臨床化学）のために各動物から血液サンプルを採取した。

【0396】

最高用量レベルまでの段階的投与後、用量制限毒性（有害臨床症状）は認められず、従って、最大耐量（ＭＴＤ）は、４８時間にわたる連続（２４時間／日）の静脈内注入により投与した２７８８ｍｇ／ｋｇ／日のｍＣＢＳであると見なした。定常状態の血漿中濃度（Ｃｓｓ）が、ヒトでの目標血漿中濃度と比べて３倍高い３００μｇ／ｍＬよりも高かったことから、この用量をさらに段階的に増大させなかった。

【0397】

各時点で全ての動物から採取した血漿サンプル中において、定量可能なレベルのｍＣＢＳが検出され、これは、動物にｍＣＢＳが適切に投与されることを示した。定常状態の血漿中平均濃度（Ｃ_ｓｓ）は５３．８〜３５８μｇ／ｍＬの範囲であり、ｍＣＢＳは２２２〜４５０ｍＬ／時間／ｋｇの速度で除去された（Ｃｌ）。

【0398】

イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入
要約すると、この研究は、上記のＳＴＸ−１０２研究で特定した最大耐量（ＭＴＤ）を使用して、イヌにおけるｍＣＢＳの連続注入を調べた。

【0399】

ＭＴＤ（２７８８ｍｇ／ｋｇ／日）の確認後、イヌをこの研究のフェーズ２に移し、下記の表１６に示すように、さらなる６日の連続注入にわたり、投与をＭＴＤで再開した。

【0400】

【表19】

【0401】

この研究のこのフェーズ中にモニタリングしたパラメータには、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）並びに臓器重量の変化が含まれた。下記の時点で各動物から毒物動態学的分析のための一連の血液サンプルを採取した：注入の開始後２４及び４８時間、注入の終了直前、注入の終了後１５、３０分及び１、１．５、２、３、４、６、２４時間。

【0402】

さらなる６日の連続注入の完了及び最後の毒物動態学的血液サンプルの採取後、８日目に全ての動物を安楽死させて剖検検査にかけた。全ての動物の肝臓及び腎臓に対して組織学的検査を実施した。

【0403】

６日（１４４時間にわたる）２７８８ｍｇ／ｋｇ／日でのｍＣＢＳの連続静脈内注入（４８時間にわたる２４時間／日）は良好な耐容性を示し、死亡率、臨床観察、体重、摂食量、臨床病理（血液、凝固及び臨床化学）、臓器重量又は巨視的評価に影響はなかった。

【0404】

顕微鏡的所見として、腎臓の腎近位尿細管の空胞化／粗鬆化及び肝臓の泡沫状Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の蓄積が挙げられたが、非有害性又は適応性と考えられた。

【0405】

毒物動態学的分析は、定常状態の血漿中濃度（Ｃ_ｓｓ）が２２３〜２４６μｇ／ｍＬの範囲であり、ＡＵＣ_{０〜１４４}（ＡＵＣ_{０〜１６８}）が４３８００（４４１００）〜４８３００（４８８００）時間^＊μｇ／ｍＬの範囲であることを示した。注入終了後、ｍＣＢＳ血漿中濃度は、両方の動物に関して約１時間の推定ｔ_１／２値で急速に低下した。ｍＣＢＳは、４７２〜５２２ｍＬ／時間／ｋｇの速度で除去された（Ｃｌ）。分布容積（Ｖｚ）は７４０〜７４１ｍＬ／ｋｇの範囲であり、これは、ｍＣＢＳが組織間に広く分布していることを示唆する。性別に関する特筆すべき差異はなかった。

【0406】

実施例１１〜２２：セロビオースサルフェート及びｍＣＢＳの比較
下記の研究では、セロビオースサルフェート（ＣＢＳ）及びｍＣＢＳを比較する。ｍＣＢＳはＣＢＳと比べてはるかに化学的に安定であり、その結果、より優れた薬物候補を示す。実施例１１〜２２で使用される方法論を下記に記載する。

【0407】

下記の実施例（１１〜２２）に関する方法及び材料
ヒト対象。全てのヒト関連の研究は、ＡＮＵ Ｈｅａｌｔｈ Ｈｕｍａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。インビトロでの研究のための赤血球及び血小板の供給源として、健康な成人ドナーを使用した。

【0408】

動物。全ての動物実験は、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を受けた。病原体フリーの雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（５〜６週齢）並びに雄のＷｉｓｔａｒラット（体重２５０〜３５０ｇ）を、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＡｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｐｈｅｎｏｍｉｃｓ Ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。

【0409】

細胞系統及び細胞培養条件。ヒト微小血管内皮細胞−１（ＨＭＥＣ−１）（血液型Ｏであり、そのためヒト血清中の抗血液型抗体と反応しない）を、ＡＴＣＣから供給され、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵｍｌ^−１のペニシリン及び１００μｇｍｌ^−１のストレプトマイシンが補充されたＭＣＤＢ １３１培地中で培養した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、既に説明されているように（Ｊａｆｆｅ，Ｅ．Ａ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．（Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ； Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄａ，Ｋｌｕｗｅｒ Ｂｏｓｔｏｎ，１９８４）、初代培養物から確立し、２０％のＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００ＩＵｍｌ^−１のペニシリン、１００μｇｍｌ^−１のストレプトマイシン、１３０μｇｍｌ^−１のヘパリン及び１．２ｍｇｍｌ^−１の内皮細胞増殖用サプリメント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＭｅｄｉｕｍ １９９中で培養した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）−Ｋ１細胞並びにＨＳ及びＧＡＧが欠損しているキシロトランスフェラーゼ（ｘｙｌｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）−１−欠損ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ｐｇｓＡ−７４５細胞）を、ＡＴＣＣから供給され、５％のＦＣＳ及び抗生物質が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。全ての細胞系統を３７℃で５％ＣＯ_２及び周囲Ｏ_２下でインキュベートし、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ａｓｓａｙキット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマに関して繰り返し試験した。

【0410】

ヒストンによって媒介される細胞毒性のアッセイ。子牛胸腺ヒストン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の細胞毒性を決定するために、様々な濃度のヒストン（１００〜８００μｇｍｌ^−１）を、９６ウェルプレート中のＨＭＥＣ−１又はＨＵＶＥＣ（１×１０^６ｍｌ^−１）の懸濁液に添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。次いで、細胞を、死滅細胞を検出するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ；２．５μｇｍｌ^−１）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に、且つ生存細胞を検出するためにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ（０．０４μＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に３７℃で５分にわたりインキュベートし、氷上に置き、拡張データ図１に描かれているゲーティング戦略を使用するフローサイトメトリーにより、死滅細胞及び生存細胞の割合を決定した。阻害アッセイでは、ＨＭＥＣ−１を、様々な濃度の化合物（１２．５〜４００μｇｍｌ^−１）の存在下で３７℃において１時間にわたりヒストン（４００μｇｍｌ^−１）と共にインキュベートした後、ＰＩ及びカルセイン−ＡＭを添加した。次いで、各化合物濃度でのＨＭＥＣ−１細胞毒性を、式：

【数1】

に基づいて決定し、次いで各ポリアニオンのＩＣ５０値を、最良適合線（ｌｉｎｅ ｏｆ ｂｅｓｔ ｆｉｔ）に基づいて決定した。いくつかの実験では、９６ウェルプレート中のＨＭＥＣ−１のコンフルエントな単層を、希釈剤のみ（生理食塩水）、ヒストンのみ（４００μｇｍｌ^−１）又はｍＣＢＳの存在下でのヒストン（１００μｇｍｌ^−１）と共に、１時間にわたり血清フリーＭＣＤＢ１３１培地中でインキュベートし、次いでＬｅｉｃａ ＳＰ５共焦点顕微鏡を使用して、カルセイン−ＡＭ又はＰＩの取り込みにより、生存細胞及び死滅細胞それぞれを検出した。ＨＭＥＣ−１の懸濁液も、他（Ｋｈａｎｎａ，Ｍ．，Ｒａｎａｓｉｎｇｈｅ，Ｃ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｓ ａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｇｅｎｔｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０９９／ｊｇｖ．０．０００９２１（２０１７））で報告されているように、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ヘパリナーゼ（ＨＰＮＳＥ）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）又はヒト血小板ヘパラナーゼ（ＨＰＳＥ）（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｃ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｈｅｐａｒａｎａｓｅ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３０（Ｐｔ ３），１３４１−１３５０（１９９８））による消化により、細胞表面ＨＳを枯渇させ、次いでＨＭＥＣ−１に関して上記で説明したように、ヒストンによって媒介される細胞毒性への感受性を調べた。同様に、野生型ＣＨＯ−Ｋ１の懸濁液及びＨＳ／ＧＡＧ欠損ｐｇｓＡ−７４５ ＣＨＯ−Ｋ１細胞の懸濁液を、ヒストンによって媒介される細胞毒性への感受性に関して比較した。

【0411】

脂質二重層アッセイ。既に説明されているように（Ｒｅｂｂｅｃｋ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｂｅｔａ（１ａ）ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ＤＨＰＲ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ＲｙＲ１ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｃｈａｎｎｅｌ ｖｉａ ｉｔｓ ３５−ｒｅｓｉｄｕｅ Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ １００，９２２−９３０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｐｊ．２０１１．０１．０２２（２０１１）．）調製し、１５０ｍＭ又は２５０ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ約５．５）溶液に対称的に分離した人工脂質二重層である。二重層にヒストン（１μＭ、１５．２μｇｍｌ^−１）を単独で添加したか、又は約２０℃での１０μＭのＣＢＳ（３．５μｇｍｌ^−１）又は１０μＭのＭＴＳ（５．１μｇｍｌ^−１）と一緒の０．５〜３時間のインキュベーション後に添加した。ヒストンの添加後、この二重層が破れるか又は実験が終了するまで、電流を連続的に記録した。

【0412】

内皮細胞におけるカルシウム流動研究。ＲＰＭＩ−１６４０培地中のＨＭＥＣ−１（２×１０^７ｍｌ^−１）を６０分にわたり３７℃でＩｎｄｏ−１ ＡＭ（５μＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートした。（Ｔｅｌｌａｍ，Ｒ．Ｌ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ９３０，５５−６４（１９８７）＆Ｗｅｓｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｔｅｌｌａｍ，Ｒ．Ｌ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍａｔｕｒｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６９（Ｐｔ ６），３６９−３７６，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｉｃｂ．１９９１．５３（１９９１））。５％のＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地による３回の洗浄後、細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳが補充された氷冷ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＮａＣｌ ８ｇｌ^−１、ＫＣｌ ０．４ｇｌ^−１、ＣａＣｌ_２ ０．２ｇｌ^−１、ＭｇＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ ０．２ｇｌ^−１、Ｄ−グルコース １．８ｇｌ^−１、ｐＨ７．４）に４×１０^６ｍｌ^−１で再懸濁させた。この細胞懸濁液を氷上で保持し、３時間以内に使用した。フローサイトメトリーを使用して、細胞内Ｃａ^２＋流動をモニタリングした。細胞を予め平衡化し、加熱水浴に接続された外部シース（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｈｅａｔｈ）を使用して、分析中に３７℃で維持した。（ＦＳＣ／ＳＳＣ光散乱に基づく）細胞残屑及び塊状の細胞の排除後、新規の化合物の存在下／非存在下でのヒストン添加前２分にわたり、基底Ｃａ^２＋レベルをモニタリングした。一定の流速（約３００事象／秒）でヒストン添加の１、４及び１０分後にＣａ^２＋レベルを測定した。Ｃａ^２＋流動をＣａ^２＋非結合Ｉｎｄｏ−１に対するＣａ^２＋結合Ｉｎｄｏ−１の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）の比率の増加として決定した。

【0413】

インビトロでの赤血球の顕微鏡観察、凝集、脆弱性及び変形能のアッセイ。ヒト赤血球のヒストンによって媒介される凝集及び様々な化合物によるこの凝集の阻害を、本発明者らの一部により既に報告されているように（Ｋｏｒｄｂａｃｈｅｈ，Ｆ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｃ．Ｈ．，Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．Ｍ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｆｒａｇｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ １３０，２８８４−２８８８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０６−７９０５１９（２０１７）を参照されたい）、前方及び側方散乱パラメータ又は赤血球自己蛍光のいずれかに基づくフローサイトメトリーと、以前に説明されているような（Ｙａｂａｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｆｌｉｐｐａｓｅ ＡＴＰ１１Ｃ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｌｔｅｒｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｓｈａｐｅ，ａｎｅｍｉａ，ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｌｉｆｅ ｓｐａｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９，１９５３１−１９５３７，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｃ１１４．５７０２６７（２０１４））走査型電子顕微鏡とにより検出した。同様に、阻害剤の存在下又は非存在下でヒストンによって誘発される赤血球の脆弱性を、本発明者らの一部により既に報告されているような（Ｋｏｒｄｂａｃｈｅｈ，Ｆ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｃ．Ｈ．，Ｃｏｕｐｌａｎｄ，Ｌ．Ａ．，Ｌｅｌｌｉｏｔｔ，Ｐ．Ｍ．＆Ｐａｒｉｓｈ，Ｃ．Ｒ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ ｆｒａｇｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ １３０，２８８４−２８８８，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１７−０６−７９０５１９（２０１７）を参照されたい）せん断ストレスアッセイを使用して定量した。最後に、ヒストンの存在下での赤血球の変形能の低下及びこのプロセスへの阻害剤の効果を、人工ヒト脾臓を通る赤血球の通過を測定することにより評価した（Ｄｅｐｌａｉｎｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｓｐｌｅｅｎ ｃａｎ ｂｅ ｍｉｍｉｃｋｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｂｌｏｏｄ １１７，ｅ８８−９５，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−１０−３１２８０１（２０１１）を参照されたい）。

【0414】

インビトロでの血小板の凝集及び脱顆粒のアッセイ。凝集研究のために、室温での２段階遠心分離（２０分にわたる２００×ｇ、次いで１５分にわたる血小板リッチの血漿８００×ｇ）により、クエン酸Ｎａバキュテナ中に採取したヒト全血から血小板を単離し、血小板ペレットを、カルシウム及びマグネシウムを含むハンクス平衡塩類溶液に再懸濁させ、ヒストンを添加し、示したそれぞれの濃度において化合物の存在下／非存在下でインキュベートした。血小板の特徴的なｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ ＳＳＣ識別を使用するフローサイトメトリーにより、ヒストンへの１５分間の曝露後の血小板凝集の程度に関してサンプルを評価し、ｌｏｇ ＦＳＣの幾何平均の増加は血小板凝集を示す。

【0415】

血小板活性化アッセイのために、クエン酸Ｎａバキュテナ中に採取した全血を、Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｕｍｅ試薬（Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ）を用いたＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｍｏｄｅｌ ７００の発光モードを使用して、血小板の脱顆粒をモニタリングした。インサイチュでスターラーバーにより、予め温めた血液（４２０μｌ）に生理食塩水（３００μｌ）を添加した。次いで、Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｕｍｅ試薬（１００μｌ）を添加し、２分にわたりインキュベートした後、水で希釈したヒストン±化合物を、示した濃度において１８０μｌの総量で添加した。結果を、ヒストン＋生理食塩水コントロールの割合として算出したＡＴＰ放出として表した。

【0416】

インビボでのヒストン毒性アッセイ。ＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（５〜６週齢）（Ｃ５７ＢＬ／６マウスと比べて、この若い年齢で、ヒストンによって誘発される貧血を起こし易く且つＩＶ注射し易い）に、示した濃度での試験化合物のｉ．ｐ．注射の１０分後にリン酸緩衝生理食塩水中のヒストン（５０ｍｇｋｇ^−１）をｉ．ｖ．注射した。ヒストン注射の１０分後に眼窩後出血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄ）を実施し、採取した血液を酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）に添加し、この１０分血液サンプルを、ＡＤＶＩＡ ２１２０ｉ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して血小板及び赤血球の含有量に関する血液分析にかけた。ヒストン注射の１０分後に脾臓も摘出し、ヘモグロビンアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して脾臓ヘモグロビン含有量を定量した。４時間血液サンプルの場合、雄Ｃ５７／ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）に、上記のように試験化合物及びヒストンを注射し、その後の生化学的試験のために血漿を単離して凍結保存し、肝臓損傷のマーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ）、腎臓損傷のマーカー（クレアチニン、Ｃｒｅａ）及び一般組織損傷のマーカー（乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌにより測定した。

【0417】

マウス深部静脈血栓症（ＤＶＴ）モデル。使用する手順は大部分が既に説明されている通りである（Ｂｒｉｌｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｄｅｅｐ ｖｅｉｎ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １０，１３６−１４４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１５３８−７８３６．２０１１．０４５４４．ｘ（２０１２）を参照されたい）。簡潔に説明すると、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに麻酔して開腹切開を行い、腸を体外から出し、次いで腹部大動脈からの緩やかな分離後、腎静脈直下の下大静脈（ＩＶＣ）を約１０％の開存性まで結紮し、全ての関連するＩＶＣ支流を結紮した。腹膜及び皮膚を閉じ、その後、全てのマウスに尾静脈を介してヒストン（１０ｍｇｋｇ^−１）又は等量の生理食塩水をｉ．ｖ．注射し、続いて５分後に試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は生理食塩水をｉ．ｖ．注射した。マウスを４８時間にわたりモニタリングし、その後、再び麻酔して再び開き、ＩＶＣ狭窄の遠位で発症していた任意の血栓を、分析のために取り出した。偽手術するコントロール動物を開腹手術し、ＩＶＣを９０％結紮したが、この結紮をＩＶＣの閉塞直後に除去した。

【0418】

敗血症に関するラット盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）アッセイ。ＣＬＰアッセイを、既に説明されているように（Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ．Ｓｈｏｃｋ ２４ Ｓｕｐｐｌ １，５２−５７（２００５）を参照されたい）雄のＷｉｓｔａｒラットで実施した。生理食塩水に溶解させた試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は等量の生理食塩水のみ（コントロールコホート）を、ＣＬＰの５分前且つ２０時間での実験停止まで術後５、１０及び１５時間にｉ．ｐ．投与した。偽ＣＬＰラットに同一の手順を行ったが、盲腸を結紮していないか又は穿刺しておらず、このラットに、上記と同じ時間に生理食塩水を投与した。実験期間の終了時（２０時間）又は病的状態が倫理上安楽死を必要とした場合、ラットを麻酔し、後のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ Ｃａｎｂｅｒｒａ Ｈｏｓｐｉｔａｌによる肝臓（ＡＬＴ）及び腎臓（クレアチニン）の機能の分析のために、心臓穿刺によりＥＤＴＡ中に採血した。生理食塩水で処理したコントロールＣＬＰ動物の血液サンプル内では（ＥＤＴＡの存在にもかかわらず）血餅が形成される傾向があるため、全ての動物からの血漿サンプルの分析は成功しなかった。

【0419】

ラット心臓ＩＲＩモデル。使用する方法は、既に公開されている手順の組み合わせに基づく（Ｔａｋａｄａ，Ｙ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｋａｓａｈａｒａ，Ｊ．，Ａｉｈａｒａ，Ｋ．＆Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｋ．Ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｈｅａｒｔ ｉｎｖｏｌｖｅｓ Ａｋｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｄｒｉｎ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１１，１２４９−１２５５，ｄｏｉ：１０．１１２４／ｊｐｅｔ．１０４．０７０８３９（２００４）＆Ｈａｌｅ，Ｓ．Ｌ．，Ｄａｅ，Ｍ．Ｗ．＆Ｋｌｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ’ｎｏ−ｒｅｆｌｏｗ’ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ａ ｒａｂｂｉｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ ５９，７１５−７２２（２００３）を参照されたい）。雄のＷｉｓｔａｒラットをイソフルレンで麻酔し、気管切開術により挿管し、１ｍｌ １５０ｇ^−１の一回換気量及び６５回の呼吸 分^−１の呼吸数で人工呼吸した。酸素補給を約３０％のＦｉＯ_２で供給した。左心室を可視化し得るように、左半開胸術を実施した。左冠動脈叢（ＬＣＡ）を、３０分にわたる再灌流前に３０分にわたり非侵襲的スネアを使用して閉塞させた。虚血を心筋充血により確認した。試験化合物（３０ｍｇｋｇ^−１）又は等量（２００μｌ）の生理食塩水を、再潅流フェーズのためのスネアの開放の５分前に、左心室の内腔（吸引で確認）に注射した。

【0420】

再潅流（３０分）の終了時、左心室の内腔にチオフラビンＳ（体重の１ｍｌ ２００ｇ^−１）を緩やかに注射して、虚血ゾーン（ＩＺ）内の微小血管閉塞（ＭＶＯ）の領域を定義した。このＩＺ領域を、非侵襲的スネアの再閉塞と、ＣＤ−６８００（Ｕｎｉｓｏｎｉｃｓ）超音波処理器を使用する超音波処理による、溶液内に分散された左心室への青色微粒子（Ｕｎｉｓｐｅｒｓｅ Ｂｌｕｅ，ＢＡＳＦ）の注入とにより決定した。次いで、心臓を胸部から切除し、等張生理食塩水ですすぎ、心室間線に対して直角において非侵襲的スネアの遠位で２ｍｍ切片を切り取った。この方法は、秤量し且つ紫外線（ＭＶＯの領域）下及び明るい光（ＩＺ領域）下で撮影した（Ｓｏｎｙ Ｈａｎｄｙｃａｍ ^{(登録商標）},Ｚｅｉｓｓ ６０倍光学ズーム）４枚の心筋切片を作製した後、塩化テトラゾリウム（ＴＴＣ）中でインキュベートして、壊死心筋の領域を決定した。Ｐｌａｎｉｍｅｔｒｙ（Ｉｍａｇｅ Ｊ，Ｆｒｅｅｗａｒｅ）を使用して、ＩＺ、ＭＶＯ及び壊死の領域を定量した。

【0421】

ラット虚血再灌流組織弁モデル。用いる手順は大部分が既に説明されている方法に基づく（Ａｓｋａｒ，Ｉ．，Ｏｋｔａｙ，Ｍ．Ｆ．，Ｇｕｒｌｅｋ，Ａ．＆Ｂａｃ，Ｂ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｅｐｉｇａｓｔｒｉｃ ｉｓｌａｎｄ ｓｋｉｎ ｆｌａｐｓ．Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ ２６，１９３−１９９，ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｉｃｒ．２０１９３（２００６））。簡潔に説明すると、雄のＷｉｓｔａｒラットに麻酔し、局所的に脱毛し、３ｃｍ×６ｃｍの筋膜弁を、血管茎を無傷のままにして摘出した。下腹壁動脈をクランプし、下の組織からの酸素拡散を防ぐために、この弁の下に細かいゴムシートを置き、この弁を所定の位置に再縫合した。この弁に血流が戻ることを可能にするために、適用の１０時間後にクランプを除去した。試験化合物（５０ｍｇｋｇ^−１）又は生理食塩水を、クランプ適用の５分前及びこのクランプの除去の５分後にｉ．ｐ．投与した。ラットを、術後２４時間及び４８時間でこのラットに追加の化合物又は生理食塩水をｉ．ｐ．投与している７２時間の合計実験期間にわたりモニタリングした。「コントロールクランプなし」ラットは、摘出して再縫合前にゴムを下に置いた組織弁を有したが、血管はクランプされておらず、他のラットと同じ時点で生理食塩水を投与した。実験期間の終了時、この弁の生存率を黒色の壊死領域又は発赤領域対ピンク色の生存領域の割合で決定した。エリザベスカラーの適用及び沈降剤としての鎮痛の使用にもかかわらず、少数のラットを、その弁の自己共食いを繰り返す際に早期に安楽死させなければならなかった。

【0422】

多発性硬化症のＥＡＥモデル。１日目に、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１１５μｇ／マウスのミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ３５−５５ ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）による皮下免疫化により、８〜１２週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいてＥＡＥを誘発した。０日目及び２日目に、ＰＢＳ中の３００ｎｇ／マウスの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ＰＢＳ中の５０ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ又はＰＢＳのみ（ビヒクル）を、０〜９日目に毎日ｉ．ｐ．投与した。マウスを疾患の徴候に関して毎日モニタリングし、疾患の身体的症状に基づいて０〜５のスケールでスコア化した。マウスを下記のようにスコア化した：０、臨床的に正常；１、尾の弛緩及び／又は運動失調；２、後肢脱力；３、後肢麻痺；４、後肢及び前肢の麻痺；並びに５、瀕死。

【0423】

統計解析。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計試験を実施してグラフを作成し、使用した試験の詳細は図の凡例に含まれている。

【0424】

ｍＣＢＳの生物学的効果のインビトロでの証拠
下記の実施例１１〜１４は、遊離細胞外ヒストンの中和におけるｍＣＢＳの生物学的効果のインビトロでの証拠を提供する。

【0425】

実施例１１：ｍＣＢＳは内皮細胞をヒストン毒性から保護する
この実施例は、ｍＣＢＳがヒト内皮細胞をヒストン損傷から保護すること及び内皮細胞へのヒストンによって誘発される損傷に対するこのｍＣＢＳの保護効果が濃度依存的であることを示す。この実施例は、ｍＣＢＳが、ヒストンに曝露された内皮細胞の一部で損傷を反転させ得ることも示す。

【0426】

内皮細胞は血管の内腔に並んでおり、且つ血管系の完全性に必須であり、血液細胞を通過させるために基礎組織間に多くのシグナルを生じ、血液が流れる抗凝固表面として作用する。ヒストンは内皮細胞の細胞膜を損傷してこの内皮細胞の死滅を誘発し、そのため、微小血管系の完全性及び内皮の抗凝固特性が失われている。これにより血餅が広範に形成され、重要な臓器への酸素及び栄養素を含む液体の送達が損なわれ、次にこの臓器が損傷を受けて不全になる。

【0427】

ｍＣＢＳがヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）をヒストン損傷から保護するかどうかを評価するために、２種の蛍光色素カルセイン−ＡＭ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用して、内皮細胞の健康状態をインビトロで決定した。健康な生存細胞はカルセインＡＭを取り込み且つＰＩを排除したが、損傷しているか又は死滅した細胞では逆が真であった。図５に示すように、これらの色素の取り込み／排除を、フローサイトメトリーを使用して測定し、且つ共焦点顕微鏡を使用して可視化した。

【0428】

図５に関して、培養したＨＭＥＣを、水体積等量で（図５のパネルＡ及びＥ）、ヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＢ及びＦ）、ｍＣＢＳ １００μｇ／ｍＬ及びヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＣ及びＧ）又はｍＣＢＳ ２５μｇ／ｍＬ及びヒストン４００μｇ／ｍＬで（図５のパネルＤ）、６０分にわたり処理し、次いで色素カルセイン−ＡＭ及びＰＩで標識し、フローサイトメトリー（パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ）又は共焦点顕微鏡（パネルＥ、Ｆ及びＧ）を使用して、色素取り込みの程度に関して分析した。図５に示すように、培養して未処理のヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）は大部分が生存しており、７６％がカルセイン−ＡＭを含み、１９％がＰＩを含んでいた（図５Ａ）。しかしながら、ヒストン（４００μｇ／ｍＬ）に曝露した場合、３７％が生存可能なままであったが、５６％がＰＩを取り込んだ（図５Ｂ）。ヒストンへの曝露前にＨＭＥＣにｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍＬ）を添加した場合、７４％が生存可能なままであり、ＰＩ取り込みに基づいて２０％が死滅しており、そのため、ｍＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害からＨＭＥＣを保護し得る（図５Ｃ）。この保護効果は濃度依存的であり、より低い量のｍＣＢＳ（２５μｇ／ｍＬ）では保護のレベルが低下している（図５Ｄ）。ＨＭＥＣへのヒストン及びｍＣＢＳの効果を、健康な未処理内皮細胞（図５Ｅ）及びヒストンに曝露したｍＣＢＳ処理内皮細胞が、緑色の蛍光カルセイン−ＡＭ色素を蓄積するが（図５Ｇ）、未処理のヒストン曝露内皮細胞は赤色の蛍光色素ＰＩを取り込む（図５Ｆ）共焦点顕微鏡を使用しても見ることができる。

【0429】

培養したＨＭＥＣを、上昇する濃度のｍＣＢＳの添加後に４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いでフローサイトメトリーを使用してカルセイン−ＡＭ（生存）又はＰＩ（死滅）の取り込みに関して分析した。ＨＭＥＣに関するヒストンの損傷効果に対するｍＣＢＳの用量依存的な保護効果を図６に示し、図６は、ｍＣＢＳ濃度の上昇により、生存細胞（カルセイン−ＡＭの取り込み）が増加し且つ死滅細胞（ＰＩ取り込み）が減少したことを示す。従って、これらの結果は、ヒストンによって誘発されるＨＭＥＣへの損傷に対するｍＣＢＳの保護効果が濃度依存的であることを示す。

【0430】

ｍＣＢＳが、ヒストンへの曝露後の内皮細胞における損傷を反転させ得るかどうかを評価するために、培養したＨＭＥＣを６０分にわたり４００μｇ／ｍｌのヒストンに曝露し、次いで１０分にわたりｍＣＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、次いで最後の５分にわたりカルセイン−ＡＭ及びＰＩを添加した。次いで、細胞を、フローサイトメトリーを使用してＰＩ取り込みに関して分析し、結果を図７に示す。結果は、重要なことに、特に臨床状況では、ｍＣＢＳは、ＨＭＥＣの亜集団におけるヒストンの損傷効果を反転させ得たことも示す。この状況（培養したＨＭＥＣにヒストンを添加し、次いで６０分後に１０分にわたりｍＣＢＳを添加し、最後の５分にわたりカルセイン−ＡＭ及びＰＩを添加した）では、ＨＭＥＣの約３０％が、ＰＩ取り込みから、ｍＣＢＳの処理後にＰＩ排除及びカルセイン−ＡＭ取り込みに反転した。

【0431】

実施例１２：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される赤血球の凝集及び溶解を予防し、減少させ、さらに反転させる
この実施例は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を予防し、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示す。さらに、この実施例は、ｍＣＢＳが、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化する効果であるヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害することを示す。これ以外にも、この実施例は、ｍＣＢＳが、溶解及び凝集に対する、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ感受性を、ほぼ完全に反転させ得ることを示す。

【0432】

赤血球（ＲＢＣ）は組織への酸素輸送に関与しており、血栓形成の足場として作用する膜タンパク質を提供することにより血餅形成の一因となる。ＲＢＣの円盤状の形状及び柔軟な構造は、ＲＢＣが狭い毛細血管を通って圧迫して、急速に流れる血流内で経験するせん断力に抵抗することを可能にする。ＲＢＣは核を欠いていることから、ＲＢＣは、修復又はアポトーシスを介して損傷に応答することができず、代わりに、ＲＢＣが変形した場合、脾臓内のマクロファージにより除去される。しかしながら、損傷したＲＢＣは、脾臓に達する前に、ＲＢＣの円盤状の形状を失い、従って柔軟性を失う場合があり、そのため、せん断力曝露に起因する血管内溶解を起こし易くなる。敗血症等のヒストンレベルが上昇する疾患では、貧血を観察することが多い。

【0433】

ＲＢＣへのヒストンの損傷効果を、この効果を無効にするｍＣＢＳの能力と一緒に研究した。ヒストンと共にインキュベートした単離ヒトＲＢＣの初期研究では、フローサイトメトリー及び電子顕微鏡を使用して、有意な凝集を証明した。図８に示すように、このヒストンのＲＢＣ凝集効果は、ｍＣＢＳによる処理によって予防され得た（ＣＢＳにより同様のデータが見られる）。この場合、単離ヒトＲＢＣを、処理なし後（パネルＡ及びＤ）、６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）とのインキュベーション後（パネルＢ及びＥ）及びｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）の添加、次いで６０分にわたるヒストン（４００μｇ／ｍＬ）への曝露の直後（パネルＣ及びＦ）の凝集の程度に関してｌｏｇ ＦＳＣ対ｌｏｇ自己蛍光（ＦＬ−１チャネル）パラメータを使用するフローサイトメトリーを使用して分析し（図８、パネルＡ〜Ｃ）、走査型電子顕微鏡を使用して可視化した（図８、パネルＤ〜Ｆ）。図８の結果から明確に観察され得るように、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集は、ｍＣＢＳにより予防される。

【0434】

図９に示すように、ヒストンが用量依存的にＲＢＣの凝集を誘発すること、さらにｍＣＢＳ及びＣＢＳが用量依存的に再びこの凝集を有意に減少させ得ることをさらに確認する後続の実験を行った。具体的には、この場合、単離ヒトＲＢＣを、６０分にわたり様々な濃度のヒストン（０、１．２５、２５、５０、１００、２００、４００及び８００μｇ／ｍＬ）に曝露し、図９Ａに示すように、自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルによりＲＢＣ凝集の程度を測定した。次いで、４００μｇ／ｍＬのヒストンの添加前に様々な濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳ（０、１２．５、２５、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬ）をＲＢＣに添加したことを除いて、これを繰り返した。再び、図９Ｂに示すように、自己蛍光（ＦＬ−１）のレベルによりＲＢＣ凝集の程度を測定した。結果は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳの両方が、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ凝集を用量依存的に阻害することを示す。

【0435】

加えて、上昇する濃度のヒストンと共に６０分にわたりインキュベートした場合の、増加するせん断力（ピペッティングの速度）及びせん断曝露（ピペッティングの反復）下での溶解に対するＲＢＣの感受性を、ロボットピペッティングシステムを使用して決定した。結果を図１０に示す。具体的には、６０％の生理食塩水（６：４の比率での通常の生理食塩水：水）で希釈した単離ヒトＲＢＣを、６０分にわたり、上昇する濃度のヒストン（０、１．２５、２５、５０、１００、２００、４００及び８００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、次いでロボットシステム内において、４０回反復で次第に早い流速（ｍｍ／秒）に曝露する（図１０Ａ）か、１００ｍｍ／秒の流速で様々な反復のピペッティングに曝露する（パネルＢ）か、又は様々な濃度（０、１２．５、２５、５０、１００及び２００μｇ／ｍＬ）のｍＣＢＳで処理し（図１０Ｃ）、次いで６０分にわたり且つ１００ｍｍ／秒のせん断流速及び４０回ピペッティング反復で４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露した。次いで、各サンプルからの上清を、ＲＢＣ溶解の程度の指標としてのＡ５４０ｎｍでのヘモグロビン含有量に関して測定した。

【0436】

これらの実験を、ＲＢＣにベースラインストレスを誘発するために、６０％張度の生理食塩水で実施した。５４０ｎｍで上清中のヘモグロビンレベルを測定することにより、溶解を測定した。これらの結果は、ヒストン濃度の上昇により、増加するせん断力及びせん断曝露下でＲＢＣの溶解に対する感受性が劇的に増加することを示す（図１０Ａ及びＢ）。ヒストン曝露前のｍＣＢＳ（及びＣＢＳ、図示せず）によるＲＢＣの処理は、せん断下において、ヒストンによって誘発される溶解を用量依存的に阻害し得る（図１０Ｃ）。従って、結果は、ヒストン効果が、より高いせん断流速及びせん断曝露の持続時間により悪化した場合でも、ｍＣＢＳ（及びＣＢＳ）が、ヒストンによって誘発されるＲＢＣ脆弱性を阻害したことを示す。

【0437】

臨床シナリオをより密接に再現するために、５５分にわたるヒストンへの曝露後のｍＣＢＳによる５分にわたるＲＢＣの処理により、せん断力下での溶解及び凝集への感受性のほぼ完全な阻害がもたらされることを実証した（図１１）。具体的には、単離ヒトＲＢＣを、５５分にわたり４００μｇ／ｍＬのヒストンに曝露し、次いで５分にわたり様々な濃度のｍＣＢＳに曝露した後（図１１Ａ）、せん断力（１００ｍｍ／秒の流速及び４０回ピペッティング反復）を適用し、Ａ５４０ｎｍにより上清中のヘモグロビンを測定し、フローサイトメトリーを使用するＦＬ１での自己蛍光のレベルにより測定してＲＢＣ凝集の程度を分析した（図１１Ｂ）。結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＲＢＣの溶解及び凝集に対する感受性を反転させ得たことを示す。

【0438】

実施例１３：ｍＣＢＳの硫酸化
上述したように、ｍＣＢＳはＣＢＳと比べて化学的にはるかに安定しており、その結果、より優れた薬物候補を示す。従って、本発明者らは、活性に関して、ＣＢＳに必要な硫酸化を試験した。ＨＭＥＣ−１細胞毒性アッセイ（図１２ｂ）及びＲＢＣ脆弱性アッセイ（図１２ｃ）を使用して、ＣＢＳ化合物のこれらの様々な硫酸化状態（図１２ａ）を試験した際、本発明者らは、抗ヒストン活性には高硫酸化ＣＢＳが必要であると決定しており、なぜなら、たとえ７個のＯ−硫酸化部位の５個が占有された場合でも、低硫酸化ｍＣＢＳはヒストン阻害活性が最低限であったからである。

【0439】

実施例１４：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって誘発される血小板の凝集及び脱顆粒を減少させる
この実施例は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される血小板の凝集及び脱顆粒を阻害することを示す。

【0440】

血小板は、血餅形成において重要な役割を果たし、血管傷害後に血漿凝固タンパク質と相互作用して効果的な栓を形成する。また、血小板は免疫細胞とも相互作用し、免疫細胞の活性化及び感染領域への遊走を支援する。

【0441】

従って、本発明者らは、血小板へのヒストンの効果及びこれらの効果を阻害するｍＣＢＳ及びＣＢＳの能力を研究した。具体的には、単離して洗浄したヒト血小板を、１時間にわたり様々な濃度のヒストン（例えば０〜１０００μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした後、単一の血小板と凝集した血小板とを識別するためにＦＳＣ及びＳＳＣを使用するフローサイトメトリーにより凝集を分析した（この結果を図１３Ａに示す）。次いで、（１５０μｇ／ｍＬでの）ヒストンの添加前に、ある範囲の濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳを添加したことを除いて、これを繰り返した（図１３Ｂ）。全血中のヒト血小板を、ＡＴＰ放出を検出するためにケミルミノメトリを使用して、上昇する濃度のヒストンの添加後の脱顆粒に関して分析し、陽性コントロールとしてトロンビンを含めた（図１３Ｃ）。ヒストン（４００μｇ／ｍＬ）の添加前に、上昇する濃度のｍＣＢＳ及びＣＢＳを添加したことを除いて、この最後のステップを繰り返した（図１３Ｄに示す）。

【0442】

得られた結果は、単離血小板は、上昇する濃度のヒストンに曝露された際、フローサイトメトリーにより測定した場合には（図１３Ａ）凝集する傾向の上昇を示し、血小板ルミノメトリーによるＡＴＰ放出を使用して測定した場合には（図１３Ｃ）脱顆粒する傾向の上昇を示したことを示す。しかしながら、血小板調製物をｍＣＢＳ及びＣＢＳで予め処理した場合、凝集（図１３Ｂ）及び脱顆粒（図１３Ｄ）が有意に減少した。対照的に、非硫酸化セロビオース（ＣＢ）は阻害活性を有さなかった。

【0443】

従って、この結果は、ヒストンが血小板の凝集及び脱顆粒を誘発すること並びにこれらの効果はｍＣＢＳ及びＣＢＳにより阻害されることを裏付ける。

【0444】

実施例１５：ｍＣＢＳは、ヒストンによる脂質二重層破壊を予防する
次に、本発明者らは、どのようにしてヒストンがその細胞毒性を媒介し、その結果として、ＣＢＳ及びｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される損傷から細胞を保護するかを調べた。ヒストンは、細胞表面上で一様に発現されるＧＡＧ（特にＨＳ）に結合することから、ヒストンは、細胞表面ＨＳへの結合により、このヒストンの細胞傷害性エフェクター機能を開始させる可能性があると思われた。

【0445】

この考えを試すために、３種の細菌ヘパリナーゼの混合物又はヒト血小板ヘパラナーゼのいずれかとのインキュベーション後のヒストンへの曝露により、ＨＭＥＣ−１細胞の細胞表面ＨＳを枯渇させ、ＨＳ除去は、フローサイトメトリーによりモニタリングした場合、これら２種の酵素処理に関してそれぞれ８６％及び９７％であった。

【0446】

本発明者らは、細菌ＨＳ分解酵素又はヒトＨＳ分解酵素のいずれかによるＨＭＥＣ−１細胞の前処理は、ヒストンによって媒介される細胞毒性への細胞の感受性に影響を及ぼさず、これら２種の酵素による前処理は、ＨＭＥＣの生存率にも影響を及ぼさない（図１４ａ）ことを発見した。この発見を確認するために、本発明者らは、ＧＡＧ鎖生合成を開始するキシロトランスフェラーゼの変異に起因して細胞表面ＧＡＧを欠くＣＨＯ細胞系統（ｐｇｓＡ−７４５）を使用した。親ＣＨＯ−Ｋ１細胞系統と比較して、細胞表面ＧＡＧの欠失はヒストンの細胞毒性にほとんど影響を及ぼさず、試験した最高ヒストン濃度では、細胞毒性がごくわずかではあるが有意に減少した（図１４ｂ）。そのため、細胞表面ＧＡＧは、ヒストンによって媒介される細胞毒性に必須ではない。

【0447】

ヒストンは、脂質二重層と相互作用して損傷を与えることが既に分かっており、細胞透過性タンパク質として作用することも既に分かっている。そのため、本発明者らは、ヒストンが脂質二重層を直接破壊することにより細胞毒性を媒介するかどうかを調べた。

【0448】

この可能性を調べるために、人工脂質二重層を調製し、この二重層を横切る電流の変化により、ヒストン破断に対するこの人工脂質二重層の感受性を検出した。

【0449】

脂質二重層は寿命が有限であり、通常、３０〜１２０分のオーダーである。本発明者らの実験では、リアノジン受容体１（ＲｙＲ１）イオンチャネルタンパク質を含むコントロール脂質二重層は、平均寿命が４６±４分であり、ヒストン（１μＭ）の添加により、この寿命が５．７±１．２分まで顕著に縮まった（図１５ａ）。実際には、４７個の二重層の１３個（２８％）がヒストン添加の０．３〜０．５分以内に壊れたのに対して、１２５個のコントロール二重層の２個のみ（１．６％）が同じ期間で破裂し、より高いヒストン濃度（≧５０μＭ）により、ほとんどの二重層が急速に破裂した（図示しない）。二重層は、ＣＢＳが存在する場合にはヒストンにより破裂し難く、平均二重層寿命は、ＣＢＳの場合には１８±４分及び３６±５分まで有意に増加した（図１５ａ）。ヒストン単独（２８％）と比較して、ＣＢＳの場合、急速な二重層破裂の発生が５２個の二重層の３個（５．８％）まで減少した。

【0450】

以前の研究により、ヒストンが、細胞中で非選択的なＣａ^２＋チャネル及び形質膜の脱分極を誘発し得ることも実証されている。この発見は、ヒストンが細胞表面のリン脂質と直接相互作用して膜の完全性を乱すという概念をさらに支持する。

【0451】

ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発されるＣａ^２＋流動に対して細胞を保護するかどうかを調べるために、ＨＭＥＣ−１をＣａ^２＋感受性色素Ｉｎｄｏ−１で負荷し、ｍＣＢＳの存在下又は非存在下においてヒストンでチャレンジし、フローサイトメトリーによりＣａ^２＋取り込みを測定した（図１５ｂ）。ヒストンは、高い細胞内Ｃａ^２＋レベルを示す細胞の集団において約６倍の増加を誘発し、この反応は、ヒストン添加の４〜１０分後に定常に達する。ｍＣＢＳの存在により、この反応が実質的に阻害された（図１５ｃ）。本発明者らの発見は、ヒストンが細胞の脂質二重層を直接破壊することにより細胞膜に損傷を与え、ｍＣＢＳは、ヒストンのこの望ましくない性質を中和することを示す。

【0452】

実施例１６：ｍＣＢＳは、最低限の固有の抗凝固活性を有し、ヒストンによって誘発される血漿凝固混乱を減少させる
この実施例は、ヒストンが血液凝固を減少させること及びｍＣＢＳが最低限の抗凝固効果を有し、ヒストンによって誘発される血漿凝固混乱を減少させ得ることを示す。

【0453】

ヒストンが血小板の凝固及び脱顆粒を促進し得ることが分かったにもかからわず、本発明者らは、ヒストンが、内因性経路に関与する因子を介して血漿凝固を特異的に阻害することにより全血凝固のレベルを低下させることも発見した。

【0454】

これを、回転トロンボエラストメトリ（ＲＯＴＥＭ）（図１６Ａ）及び伝統的な血漿ベースの活性化部分トロンビン時間（ＡＰＴＴ）アッセイ（図１６Ｂ）を使用して実証した。

【0455】

具体的には、ＲＯＴＥＭ（図１６Ａ）を使用して、全血への増加するヒストン濃度（０〜１０００μｇ／ｍＬ）の添加により、全てのアッセイで凝固時間（単位秒で測定）が長くなったが、特にＮＡＴＥＭアッセイ及びＩＮＴＥＭアッセイで長くなった。凝固へのヒストンの同一の抗凝固効果を、血漿ベースの凝固アッセイＡＰＴＴを使用して実証した（図１６Ｂ）。

【0456】

ｍＣＢＳは硫酸化二糖であることから、本発明者らは、ｍＣＢＳは、非分画で低分子量の抗凝固ヘパリンのはるかに小さい同類であると考えられ得ると推論した。従って、ＲＯＴＥＭを使用して、ｍＣＢＳ（２００μｇ／ｍＬ）の凝固特性を研究した。比較対象として、２種の硫酸化三糖類メレチトース及びマルトトリオースを含めた（図１７）。具体的には、ＮＡＴＥＭ（非活性化）アッセイ、ＥＸＴＥＭ（外因性経路活性化）アッセイ、ＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化）アッセイ及びＦＩＢＴＥＭ（中和した血小板による外因性経路活性化）アッセイを実施する直前に、全血に、ｍＣＢＳ、マルトトリオース又はメレチトース（２００μｇ／ｍＬ）を補充した。データは、水コントロールの倍数増加として表される凝固時間を示し、図１７Ａに示す。様々な濃度（０〜１００μｇ／ｍＬ）のｍＣＢＳ、メレチトース又はマルトトリオースを補充した全血を、凝固時間に関してＮＡＴＥＭアッセイを使用して分析し、結果を図１７Ｂに示す。次いで、データが２０分での血餅振幅を示すことを除いて（パネルＢと）同じことを繰り返した。この結果を図１７Ｃに示す。５０及び１００μｇ／ｍＬでは２種の三糖類により血餅が検出されないことに気付いた。

【0457】

図１７に示す結果から、ｍＣＢＳが、全血凝固への影響が最低限か又は全くないが、２種の硫酸化三糖化合物は、ＮＡＴＥＭ（非活性化トロンボエラストメトリ（ＴＥＭ））アッセイ及びＩＮＴＥＭ（内因性経路活性化ＴＥＭ）アッセイで検出された有意な抗凝固活性を有することが実証された。ＮＡＴＥＭアッセイは、これらの化合物によって誘発される変化に最も敏感であったことから、より低濃度の３種の硫酸化化合物を全血に添加して、抗凝固剤としてのこれらの効力をより明確にした。この分析は、硫酸化三糖類は２５μｇ／ｍＬでコントロールの凝固時間を２倍にしたが、同一の結果を達成するために１００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳが必要であったことを示す（図１７Ｂ）。

【0458】

さらに、ｍＣＢＳの抗凝固効果とヘパリン及び低分子量ヘパリンであるエノキサパリンとの比較を行った。具体的には、ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、（１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬの濃度での）ヘパリンの添加、（１μｇ／ｍＬ若しくは１０μｇ／ｍＬの濃度での）エノキサパリンの添加、（２５μｇ／ｍＬの濃度での）三糖マルトトリオースサルフェートの添加又は（２５μｇ／ｍＬの濃度での）ｍＣＢＳの添加後、全血凝固を測定した。結果を図１８に示す。ｍＣＢＳと、非分画ヘパリン及び低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）との比較は、ＬＭＷＨ（エノキサパリン）と比較してｍＣＢＳの抗凝固活性の１１０倍の低下を示し、且つ非分画ヘパリンと比較して＞７５０倍の低下を示した。

【0459】

ＥＸＴＥＭアッセイではヒストンが凝固時間を増加させることが分かったが、ｍＣＢＳは同一のパラメータに影響を及ぼさなかったことから、ＮＡＴＥＭアッセイを使用して、ヒストンに誘発される凝固の混乱を阻害するｍＣＢＳの能力も試験した。この結果を図１９に示す。実証されているように、２００μｇ／ｍＬのｍＣＢＳの添加により、４００及び８００μｇ／ｍＬのヒストンの両方の抗凝固効果を阻害し得た。比較すると、同量の水は効果がなかった（図１９）。従って、この結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって誘発される全血凝固の混乱を阻害することを示す。

【0460】

ｍＣＢＳ及びＣＢＳの生物学的効果のインビボでの証拠
実施例１７：ｍＣＢＳ及びＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害から臓器を保護する
この実施例は、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される臓器損傷からマウスを保護し得ることを示す。

【0461】

ヒストンのマウスへの静脈内注射により、臓器中に微小血栓が形成されて細胞傷害及び臓器機能障害が引き起こされることが実証されている（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ａｒｅ ｍａｊｏｒ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｓｅｐｓｉｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００９ Ｎｏｖ；１５（１１）：１３１８−２１．２００９）。Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，２００９と同一の敗血症のマウスモデルを使用して、本発明者らは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって誘発される臓器障害からマウスを保護し得るかどうかを調べた。マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈注射の１０分前に、６．２５、２５及び１００ｍｇ／ｋｇの濃度のｍＣＢＳ若しくはＣＢＳ又は等量のＰＢＳを腹腔内注射した。先に述べたように、４時間後、細胞傷害のマーカー（乳酸デヒドロゲナーゼ、ＬＤＨ）、肝臓機能障害のマーカー（アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＬＴ）及び腎臓機能障害のマーカー（クレアチニン、Ｃｒｅａｔ）の分析のために、眼窩後から血液を採取した。結果を図２０に示す。具体的には、これらの結果を使用して、本発明者らは、ｍＣＢＳ及びＣＢＳが、ヒストンによって媒介される傷害から動物を用量依存的に保護し、肝機能及び腎機能の有意な保存が実証された（図２０）が、非硫酸化ＣＢは不活性であることを示すことができた。

【0462】

実施例１８：ｍＣＢＳは、ヒストンによって媒介される傷害から血流内の細胞を保護する
この実施例は、ｍＣＢＳが、マウス中で循環している白血球、血小板及び赤血球のヒストンによって媒介される減少を弱める及び／又は予防することを示す。

【0463】

マウスへのヒストンの注射は、重度の血小板減少症を誘発することも分かっている。従って、本発明者らは、この実施例において、ヒストンの静脈内注射後の血流内の細胞へのｍＣＢＳの保護効果を調べた。先の実施例と同一のマウスモデルを使用して、マウスに、５０ｍｇ／ｋｇのヒストン（又は等量のＰＢＳ）の静脈内注射の１０分前に１００ｍｇ／ｋｇのｍＣＢＳ（又は等量のＰＢＳ）を腹腔内注射し、次いで１０分後に後眼窩出血させた。ＡＤＶＩＡ ２１２０血液システムを使用して、全血を、白血球数、血小板数及び赤血球数並びにヘモグロビン濃度に関して分析した。結果を図２１に示す。この結果は、循環している血小板数がヒストン注射の数分以内に有意に減少するだけでなく、白血球、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））及び血漿中ヘモグロビンレベルも有意に減少することを示した。さらに、ヒストンの前にｍＣＢＳを注射した場合、これらのヒストンによって媒介される効果は、完全には消失しないにしても有意に阻害された（図２１）。

【0464】

従って、これらの結果は、ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される傷害から血流内の細胞を保護することを示す。

【0465】

実施例１９：ＣＢＳ及びｍＣＢＳは敗血症を阻害する
本発明らは、次に、中程度及び重度の敗血症のラット盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルにおけるｍＣＢＳ及びＣＢＳの有効性を調べた。死亡したのはわずかであった（図２２Ａ）がＳＩＲＳ反応が誘発されている中程度の敗血症の例では、ｍＣＢＳ処理により、コントロールＣＬＰ群と比較して循環ＬＤＨレベルが有意に低下することが実証された（０．６±０．１及び１．１±０．２Ｕ／Ｌ×１０^３、ｐ＝０．０３；図２２Ｂ）。群間にＡＬＴレベル又はクレアチニンレベルの差異は認められず、軽症型の敗血症の誘発が裏付けられた（データは示さない）。

【0466】

病的状態がはるかに明白であった重度の敗血症の例では、齧歯類の死亡率は、ＰＢＳコントロールと比較して、ＣＢＳを投与した動物では有意に低く、実際には、ＣＢＳ処理群では死亡率はゼロであった（図２３Ａ）。重要なことに、広範囲に及ぶ肝臓及び腎臓の損傷を示す、未処理群で検出された高いＡＬＴレベル及びクレアチニンレベルは、ＣＢＳで処理された動物では見られなかった（図２３Ｂ）。

【0467】

まとめると、これらの結果は、ＣＢＳ及びより安定なｍＣＢＳは、敗血症及びＳＩＲＳのヒストンによって媒介される効果を制限し得、そのため、組織損傷が制限されて末端臓器の機能が保存されることを示す。

【0468】

実施例２０：ＣＢＳ及びｍＣＢＳはＩＲＩを阻害する
ＩＲＩを阻害するＣＢＳ及びｍＣＢＳの能力を調べるために、ラット心臓ＩＲＩ（ｃＩＲＩ）モデルを用いた。虚血域は群間で等しかった（図２４Ａ）。ＣＢＳ処理は、微小血管閉塞の領域（図２４Ｂ）及び虚血域における心筋壊死（図２４Ｃ）を有意に５０％減少させた。さらに、ラットの皮膚弁ＩＲＩモデルでは、ｍＣＢＳは、皮膚弁の生存領域を一貫して且つ有意に増加させた（図２５）。

【0469】

実施例２１：ＣＢＳは静脈血栓症を阻害する
ＣＢＳがヒストンの局所的な血管効果を制御するかどうかを調べるために、ヒストンによって媒介される深部静脈血栓症（ＤＶＴ）のモデルを確立し、ＣＢＳによりほぼ完全に阻害されることを示した（図２６）。

【0470】

このデータは、遊離ヒストンによって媒介される全身及び局所の両方の血管病理がＣＢＳ／ｍＣＢＳによる阻害に適していることと一致する。

【0471】

実施例２２：ｍＣＢＳは自己免疫を阻害する
本発明者らは、次に、ヒトでの多発性硬化症に類似する実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）と呼ばれる自己免疫の動物モデルを阻害するｍＣＢＳの能力を評価した。データを図２７に示し、このデータから、ｍＣＢＳは、毎日投与された場合、３５日間のウインドウにわたりＥＡＥ発症からマウスを実質的に保護することが明らかになった。

【0472】

上記実施例では、本発明者らは、遊離ヒストンによって媒介される多くの病理プロセス（例えば、細胞毒性、赤血球の脆弱性／変形能及び血小板活性化）の非常に有効なインビトロ阻害剤としての小さいポリアニオン性分子の開発を説明する。

【0473】

これらのデータは、ＣＢＳ／ｍＣＢＳが、ヒストンによって媒介される病気（例えば、敗血症、ＩＲＩ、血栓症及び自己免疫）を阻害し得る主要データの証明も提供する。

【0474】

ヒト及び動物では、ｍＣＢＳは非常に安定しており、且つ高用量で良好な耐容性を示し、唯一の用量制限特性は抗凝固活性であるが、この活性は、ＬＭＷ−ヘパリンと比べて１１０倍低く、非分画ヘパリンと比べて７５０倍低い。そのため、ｍＣＢＳは、相当な臨床的可能性を有する新しいクラスの治療法を示す。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防のための化合物の使用であって、前記化合物が、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む、使用。

【請求項2】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）例えば、敗血症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば循環器疾患又は慢性循環器疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を含む群から選択される、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患である、請求項１に記載の使用。

【請求項4】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシドが、

【化1】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ小さい非荷電Ｏ結合置換基又はサルフェート基である）
の全体構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項5】

Ｒ１は、Ｏ−又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである、請求項４に記載の使用。

【請求項6】

Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基である、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項8】

前記化合物が、硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項9】

前記化合物が、ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項10】

細胞外ヒストンによって媒介される病気を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を対象に投与することを含む方法。

【請求項11】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）例えば、敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）等の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）例えば、粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は例えば溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ例えば急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害等の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、例えば循環器疾患又は慢性循環器疾患、例えば粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（例えば、深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、例えば多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、例えば多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患、例えばハンチントン病を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置又は予防する方法であって、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む方法。

【請求項13】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連し、且つ前記方法が、前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩの状態又は疾患を処置又は予防するのに十分である、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を前記対象に投与することを含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記医学的状態又は疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシドの前記治療上有効な量が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害するのに十分である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記治療上有効な量が、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性である、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となる、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させる、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、細胞外ヒストンを、減少させる、最小限に抑える又は阻害するのに十分である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

単回用量において、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

複数回用量において、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記処置される医学的状態又は疾患のための補助的処置として、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤を同時に又は付随して前記対象に投与することをさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置することを含む、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を予防することを含む、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を少なくとも含む、治療用組成物の使用。

【請求項24】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤とを少なくとも含む、医薬組成物の使用。

【請求項25】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための薬物の製造のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の使用。

【請求項26】

前記敗血症又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２５に記載の使用。

【請求項27】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２５又は２６に記載の使用。

【請求項28】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項２７に記載の使用。

【請求項29】

前記細胞外ヒストンが、前記対象の内皮に対して細胞毒性であり、及び／又は前記対象の内皮機能障害の一因となる、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項30】

前記薬物が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項31】

前記薬物が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、又は阻害する、請求項３０に記載の使用。

【請求項32】

前記薬物が、前記対象への単回用量投与のために製剤化される、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項33】

前記薬物が、前記対象への複数回用量投与のために製剤化される、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項34】

前記薬物が、前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患のための補助的処置としての、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤の同時の又は付随する前記対象への投与のために製剤化される、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項35】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項３４に記載の使用。

【請求項36】

前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項37】

前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の使用。

【請求項38】

対象における敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の使用。

【請求項39】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３８に記載の使用。

【請求項40】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３８又は３９に記載の使用。

【請求項41】

前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は医学的状態若しくは疾患が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／又はそれによって媒介され、及び／又はそれを伴い、及び／又はそれと関連する、請求項３９に記載の使用。

【請求項42】

前記細胞外ヒストンが、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、又は（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、又は（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、又は（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項43】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド若しくはその薬学的に許容される塩の治療上有効な量が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害するのに十分であり、及び／又は前記使用が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の使用。

【請求項44】

前記治療上有効な量が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害するのに十分であり、及び／又は前記使用が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、請求項４３に記載の使用。

【請求項45】

前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の単回用量の使用を含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項46】

前記対象における前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患の処置又は予防のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量の複数回用量の使用を含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載の使用。

【請求項47】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩の治療上有効な量と、前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは疾患のための補助的処置としての、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤又は別の形態の医学的介入からなる群から選択される第２の活性剤の量との使用を含む、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の使用。

【請求項48】

前記第２の活性剤が、１種又は複数の抗炎症剤を含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある患者において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置することを含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項50】

敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある患者において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を予防することを含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の使用。

【請求項51】

前記処置が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは前記疾患を寛解させることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項52】

前記処置が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する前記医学的状態若しくは前記疾患を阻害することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項53】

前記敗血症、ＳＩＲＳ又はＩＲＩと関連する医学的状態又は疾患が、非敗血症性疾患状態、非ＳＩＲＳ疾患状態又は非ＩＲＩ疾患状態である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用、又は請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２３〜５０のいずれか一項に記載の使用。

【手続補正書】

【提出日】2020年12月15日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防のための薬物であって、前記薬物が、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む、薬物。

【請求項2】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、循環器疾患又は慢性循環器疾患、粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患（ハンチントン病を含む）を含む群から選択される、請求項１に記載の薬物。

【請求項3】

（ａ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患である、並びに／又は
（ｂ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、非ＳＩＲＳ疾患状態若しくは非ＩＲＩ疾患状態である、並びに／又は
（ｃ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｄ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｅ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｆ）前記細胞外ヒストンが、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、若しくは（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、若しくは（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、若しくは（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、並びに／又は
（ｇ）前記薬物が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、並びに／又は
（ｈ）前記薬物が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、並びに／又は
（ｉ）前記薬物が、前記対象への単回用量投与若しくは複数回用量投与のために製剤化される、並びに／又は
（ｊ）前記薬物が、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的処置からなる群から選択される第２の活性剤の同時の又は付随する前記対象への投与のために製剤化される、並びに／又は
（ｋ）前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において、又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項１に記載の薬物。

【請求項4】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩が、

【化1】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ小さい非荷電Ｏ結合置換基又はサルフェート基である）
の全体構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬物。

【請求項5】

（ａ）Ｒ１は、Ｏ−（Ｃ_１〜６）アルキル又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである、および／または
（ｂ）Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基である、および／または
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択される、請求項４に記載の薬物。

【請求項6】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩が、
硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖又はその薬学的に許容される塩である、または
ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬物。

【請求項7】

細胞外ヒストンによって媒介される病気の処置又は予防に適した薬物の製造のための、ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を含む化合物の使用。

【請求項8】

前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、これに限定されないが、（ａ）敗血症（細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、プリオンによって誘発される敗血症を含む）の感染又は手術、外傷、出血、熱傷、急性膵炎及び急性腎傷害を含む非感染性誘発因子に対する全身性炎症反応、（ｂ）粥状動脈硬化、血管の自然破裂、血管への外傷性損傷に起因する動脈の閉塞後の且つ心臓の及び移植に関連するＩＲＩを含む局所組織レベルでの低酸素症又は溺死、ガス曝露若しくは心肺停止に起因する呼吸停止後の且つ急性呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患及び薬剤介在組織傷害の病気を含む全身レベルでの低酸素症、（ｃ）止血又は血管閉塞、循環器疾患又は慢性循環器疾患、粥状動脈硬化、凝血及び血栓症（深部静脈血栓症）、（ｄ）自己免疫疾患状態及び炎症疾患状態、多発性硬化症、過剰炎症疾患状態、全身性エリテマトーデス、脊椎関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、腸炎性関節炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、過敏性腸疾患、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、小血管の破壊及び炎症によって特徴付けられる抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎及び顕微鏡的多発血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症）、家族性地中海熱、筋萎縮性側索硬化症、シェーグレン症候群、早期関節炎、ウイルス性関節炎、乾癬、加齢に伴う臓器線維症、特発性肺線維症、若年性糖尿病（Ｉ型）、糖尿病（２型）、抗リン脂質抗体症候群及び様々な中枢神経系疾患（ハンチントン病を含む）を含む群から選択される、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

（ａ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患である、並びに／又は
（ｂ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、非ＳＩＲＳ疾患状態若しくは非ＩＲＩ疾患状態である、並びに／又は
（ｃ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｄ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｅ）前記細胞外ヒストンによって媒介される病気が、前記対象における炎症又は炎症反応後の細胞外ヒストンの放出によって引き起こされ、及び／若しくはそれによって媒介され、及び／若しくはそれを伴い、及び／若しくはそれと関連する、並びに／又は
（ｆ）前記細胞外ヒストンが、（ｉ）対象の内皮に対して細胞毒性であるか、若しくは（ｉｉ）対象の内皮機能障害の一因となるか、若しくは（ｉｉｉ）対象の血小板を活性化させることによって凝血を開始させるか、若しくは（ｉｖ）対象において赤血球脆弱性及びその結果としての貧血を誘発する、並びに／又は
（ｇ）前記薬物が、前記対象における細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、並びに／又は
（ｈ）前記薬物が、前記対象における前記内皮に対する、細胞外ヒストンによって媒介される病理を減少させるか、最小限に抑えるか、若しくは阻害する、並びに／又は
（ｉ）前記薬物が、前記対象への単回用量投与若しくは複数回用量投与のために製剤化される、並びに／又は
（ｊ）前記薬物が、抗炎症剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は前記敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患のための補助的処置からなる群から選択される第２の活性剤の同時の又は付随する前記対象への投与のために製剤化される、並びに／又は
（ｋ）前記薬物が、敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を有するか又は有する疑いがある対象において、又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を発症するリスクがある対象において敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩ又は敗血症、ＳＩＲＳ若しくはＩＲＩと関連する医学的状態若しくは疾患を処置するためのものである、請求項７に記載の使用。

【請求項10】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩が、

【化2】

（式中、Ｒ１は、小さい非荷電グリコシド結合置換基であり、及びＲ２〜Ｒ８は、それぞれ小さい非荷電Ｏ結合置換基又はサルフェート基である）
の全体構造を有する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の使用。

【請求項11】

（ａ）Ｒ１は、Ｏ−（Ｃ_１〜６）アルキル又はＳ−（Ｃ_１〜６）アルキルである、および／または
（ｂ）Ｒ１は、メトキシ基又はエトキシ基である、および／または
（ｃ）Ｒ２〜Ｒ８は、それぞれＯ−サルフェート又はＮ−サルフェートから選択される、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

前記還元末端において小さい非荷電置換基で改変されている硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩が、
硫酸化β−Ｏ−メチルセロビオシド二糖又はその薬学的に許容される塩である、または
ナトリウムβ−Ｏ−メチルセロビオシドサルフェートである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の使用。

【請求項13】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩を少なくとも含む、治療用組成物。

【請求項14】

ポリアニオン性硫酸化セロビオシドであって、その還元末端において小さい非荷電グリコシド結合置換基で改変されているポリアニオン性硫酸化セロビオシド又はその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体、添加剤及び／又は希釈剤とを少なくとも含む、医薬組成物。

【国際調査報告】