特表 2021-517906 がんにおける免疫療法との併用タキソイドナノエマルジョン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-517906(P2021-517906A)

(43)【公表日】2021年7月29日

(54)【発明の名称】がんにおける免疫療法との併用タキソイドナノエマルジョン

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20210702BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20210702BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210702BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210702BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210702BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210702BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210702BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/54

   A61K9/107ZNA

   A61P35/00

   A61K39/395 T

   A61P35/02

   A61P43/00 121

   C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】45

(21)【出願番号】特願2020-557314(P2020-557314)

(86)(22)【出願日】2018年12月19日

(85)【翻訳文提出日】2020年10月15日

(86)【国際出願番号】US2018066465

(87)【国際公開番号】WO2019126302

(87)【国際公開日】20190627

(31)【優先権主張番号】62/608,015

(32)【優先日】2017年12月20日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】518432056

【氏名又は名称】タルガジェニックス，インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴＡＲＧＡＧＥＮＩＸ， ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】508095256

【氏名又は名称】ザ リサーチ ファウンデーション フォー ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク

(71)【出願人】

【識別番号】591127113

【氏名又は名称】ノースイースタン・ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】特許業務法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】イーガン、ジェイムズ イー．

(72)【発明者】

【氏名】アミジ、マンスール

(72)【発明者】

【氏名】オジマ、イワオ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

【Ｆターム（参考）】

4C076AA17

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA14

4C085EE03

(57)【要約】

ＰＤＡＣなどの難治性がんにおける治療有効性を強化するために、免疫−腫瘍学（ＩＯ）薬剤と組み合わせて水中油型ナノエマルジョン（ＮＥ）薬物送達システムに製剤化されたオメガ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートの組成物。ＮＥ薬物送達システムにカプセル化されたＩＯ薬剤と組み合わせてオメガ０３ ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、がんを処置することによって、がんを処置する方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫−腫瘍学（ＩＯ）薬剤と組み合わせて水中油型ナノエマルジョン（ＮＥ）薬物送達システムに製剤化されたオメガ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートを含む医薬組成物。

【請求項2】

ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびα−リノレン酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項4】

タキソイドが、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１３、ＳＢＴ−１２８５４、ＳＢＴ−１２１３０３；ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１およびＳＢＴ−１２８５５−３からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項5】

ＩＯ薬剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項6】

ＩＯ薬剤が、イピルムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピジルズマブ（ｐｉｄｉｌｕｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、抗ＣＤ４７抗体、インドールアミン（２，３）−ジオキシゲナーゼ阻害剤、抗ＧＤ２抗体、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブおよびサイトカインからなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項7】

水中油型ＮＥが、オメガ−３脂肪酸に富む食用油を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項8】

オメガ−３脂肪酸に富む食用油が、魚油、亜麻仁油、松の実油、ベニバナ油、サクラソウ油、ブラックカラント油、ボラージ油、小麦胚芽油、チア油、麻油、ペリラ油、ブドウ油、スクアレン油および真菌油からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

オメガ−３脂肪酸に富む食用油が、界面活性剤および標的化剤からなる群から選択される化合物で修飾されている、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項10】

ＩＯ薬剤と組み合わせてＮＥ薬物送達システムにカプセル化されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与するステップと、
がんを処置するステップと
を含む、がんを処置する方法。

【請求項11】

腫瘍微小環境でのＰＤ−Ｌ１の発現を増加させるステップと、ＣＤ４^＋腫瘍浸潤リンパ球およびＣＤ８^＋腫瘍浸潤リンパ球を増加させるステップと、対象をＩＯ薬剤に対してより反応性にするステップとをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

がんが高度薬剤耐性である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

がんが、乳がん、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、黒色腫、脳がん、前立腺がん、白血病、肉腫、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、膀胱がん、神経膠腫、子宮内膜がんおよび腎がんからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項14】

腫瘍で生存遺伝子を下方制御し、ｐ５３およびｐ２１を活性化するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項15】

ＰＵＦＡが、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびα−リノレン酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項16】

ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートがＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である、請求項１０に記載の方法。

【請求項17】

タキソイドが、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１３、ＳＢＴ−１２８５４、ＳＢＴ−１２１３０３；ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１およびＳＢＴ−１２８５５−３からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項18】

ＩＯ薬剤が抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１０に記載の方法。

【請求項19】

ＰＤ−Ｌ１を上方制御するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＩＯ薬剤が、抗ＰＤ−１抗体、イピルムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、ピジルズマブ（ｐｉｄｉｌｕｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、抗ＣＤ４７抗体、インドールアミン（２，３）−ジオキシゲナーゼ阻害剤、抗ＧＤ２抗体、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブおよびサイトカインからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項21】

水中油型ＮＥが、オメガ−３脂肪酸に富む食用油を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項22】

オメガ−３脂肪酸に富む食用油が、魚油、亜麻仁油、松の実油、ベニバナ油、サクラソウ油、ブラックカラント油、ボラージ油、小麦胚芽油、チア油、麻油、ペリラ油、ブドウ油、スクアレン油および真菌油からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。

【請求項23】

オメガ−３脂肪酸に富む食用油が、界面活性剤および標的化剤からなる群から選択される化合物で修飾されている、請求項２０に記載の方法。

【請求項24】

処置された腫瘍が、処置後、低密度の間質を有する、請求項１０に記載の方法。

【請求項25】

腫瘍内ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞を増加させるステップと、炎症性マクロファージの浸潤を誘導するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

助成金情報
本出願の研究は、アメリカ国立衛生研究所からの助成金（ＮＩＨ助成金番号ＣＡ１０３３１４、ＣＡ１３２３９６およびＨＨＳＮ２６１２０１５０００１８Ｃ）によって部分的にサポートされた。政府は本発明における一定の権利を有する。

【0002】

本発明は、がん、特に多剤耐性がんの処置に関する。より具体的には、本発明は、タキソイドと免疫療法の併用処置に関する。

【背景技術】

【0003】

ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１阻害剤は、様々な形態のがんを処置するために使用される免疫チェックポイント阻害剤である。残念ながら、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤と相関し、その有効性に必要とされる可能性さえある重要なパラメータの１つであり得る、腫瘍細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現は、腫瘍型および個々の患者によって異なる（例えば、Ｔａｕｂｅら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２０（１９）：５０６４−７４（２０１４）ならびにＳｕｎｓｈｉｎｅおよびＴａｕｂｅ、薬理学における近年の動向（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２３：３２−３８（２０１５）参照）。ＣＴＬＡ−４阻害剤も、様々な形態のがんを処置するために開発されているチェックポイント阻害剤である。ＣＴＬＡ−４発現も、ＣＴＬＡ−４阻害剤の有効性と相関することが示されている。

【0004】

膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は致死的で侵攻性の疾患であり、日常的に追跡されている腫瘍型の中で５年患者生存率が最も低い（６％）。ＰＤＡＣの発生率は上昇しており、２０２５年までに米国でがん関連死の２番目に多い原因になると予測されている。ＰＤＡＣは、線維芽細胞、細胞外マトリックスおよび炎症性白血球に富む高密度の線維形成性間質によって区別される（ただし、浸潤性エフェクターＴ細胞はほとんどない）。一定の併用化学療法はＰＤＡＣに対してますます有効であるが、腫瘍反応率は低いままであり、持続性が短い。ヒト膵臓腫瘍の亜集団としてのがん開始細胞またはがん幹細胞（ＣＳＣ）の存在が確認されており、ＣＳＣは腫瘍増殖、浸潤および転移の増加、ならびに化学療法および放射線療法への耐性に起因するとされている。コラーゲンおよびヒアルロン酸に富むＰＤＡＣの精巧な線維形成性細胞外マトリックスは、腫瘍内の血管系およびリンパ液排出を激しく歪め、灌流減少および間質液圧上昇をもたらす。したがって、血管機能障害は、腫瘍塊内に深く巣くったがん細胞に浸透し、薬物を送達する能力を制限する、ＰＤＡＣの別の特徴となる特性である。血管機能障害はさらに、腫瘍内の最適以下の酸素利用可能性に関連しており、化学療法および放射線療法に対する耐性の付与、ならびにがん細胞の侵襲性および転移能の増加に関係している低酸素微小環境を生じさせる。低酸素環境には、ＣＳＣ様形質を示す高度薬剤耐性の静止細胞が含まれているため、この幹細胞の亜集団が、疾患を有効に処置し、臨床的再発に対処するための療法の重要な標的である。連携して機能するこれらの因子の全てが、ＰＤＡＣに対する安全で有効な療法を設計する上で克服できない障害を提示する。

【0005】

ここ約２０年間、ゲムシタビンがＰＤＡＣの化学療法の大黒柱であった。無作為化第ＩＩＩ相試験では、生活の質において５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）よりもゲムシタビンが優れていること、および中央全生存期間４．４１ヶ月〜５．６５ヶ月が実証された。この研究の後、化学療法剤とゲムシタビンの様々な組み合わせで複数の試験が行われた。残念ながら、最近まで、これらの試験のほとんどは、いくつかの例外を除いて、がっかりするほど否定的であった。著しく改善された全生存期間を示す最初の第ＩＩＩ相臨床試験は、ロイコボリン調節５−フルオロウラシル、イリノテカンおよびオキサリプラチン（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）との新たな併用療法で報告され、中央生存期間１１．１ヶ月をもたらした。しかしながら、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸレジメンは、好中球減少症、下痢および感覚性ニューロパチーを含む重大な毒性を伴い、パフォーマンスステータスが良好な患者のみに使用が制限される。ナノ粒子アルブミン結合（ｎａｂ）−パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））との別の新たな併用ゲムシタビンレジメンが、転移性膵臓腺癌試験（ＭＰＡＣＴ）の第ＩＩＩ相臨床試験で導入された。ゲムシタビン＋ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、ゲムシタビン単剤療法の６．６ヶ月と比較して、中央全生存期間を８．７ヶ月まで増加させた。さらに、ゲムシタビン＋（ｎａｂ）−パクリタキセルは、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸと比較して毒性が低く、米国で新たに転移性膵臓がん（ＰＣ）と診断された患者の社会環境で最も広く使用されるレジメンになっている。しかしながら、２つの新たなレジメン−ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸとゲムシタビン＋（ｎａｂ）−パクリタキセル−で改善が行われたにもかかわらず、両レジメンでの無増悪生存期間は依然として悲惨なままである。２つのレジメンのいずれかで処置された多くの患者は最終的には再発し、第二選択療法を必要とする。さらに、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体療法などの新たな免疫腫瘍学「ＩＯ」薬剤は、高度な免疫抑制性の微小環境およびＴ細胞の腫瘍塊への浸潤を阻害する高密度間質のため、ＰＤＡＣで有効性を示していない。そのため、侵攻性で難治性のＰＤＡＣには、悲惨な生存統計を改善することができるより優れた治療選択肢を開発するという重大な満たされていないニーズがある。

【0006】

ＰＤＡＣにおける最適な治療効果の欠如は、ＣＳＣ種からの腫瘍の再増殖に加えて初期処置後の腫瘍獲得耐性の両方に関連している。併用処置レジメンで提供するための理想的な薬物は、腫瘍を減量すると同時にがん幹細胞集団を標的とする薬物であるだろう。パクリタキセルなどの薬物の利点の１つは、細胞生存に絶対に必要な細胞の基本成分であるチューブリン／微小管を標的とすることである。しかしながら、排出ポンプなどの多剤耐性（ＭＤＲ）機構の上方制御またはチューブリン突然変異によって、耐性が達成され得る。したがって、がん化学療法における継続的な課題は、腫瘍に対する選択性が高く、ＭＤＲを克服し、薬理学が改善され、毒性が減少した新たな細胞傷害性薬剤を開発することである。

【0007】

ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４などの次世代タキソイドの１つが、これらの課題に対処する。これは、単独処置として、または他の治療様式と組み合わせて、診療所で潜在的に有用な療法となるいくつかの固有の特性を有する。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、多くの薬剤耐性腫瘍型に対して活性であり、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）トランスポーターの過剰発現などの、いくつかのＭＤＲ機構の基質ではなく、処置によって、膵臓がん、結腸がんおよび前立腺がんの異種移植モデルで完全な腫瘍退縮が得られる。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＭＤＲ表現型を発現する薬剤耐性細胞株に対して、パクリタキセルおよびドセタキセルよりも２〜３桁高い効力を示した。次に、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、３つのヒト結腸がん細胞株ＤＬＤ−１、ＨＴＣ−１１６およびＨＴ−２９から精製されたＣＳＣの幹関連遺伝子を下方制御することが示されている。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、パクリタキセルが完全に効果がなく、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）が腫瘍増殖の遅延および生存率の改善にごくわずかしか有効でなかった、患者由来の前立腺がん幹細胞異種移植モデルで有効であった。パクリタキセルおよびドセタキセルは、最初は乳がん、卵巣がんおよび肺がんに対して有効であり、膵臓がんに対しては限られた有効性しか示さないが、ヒトアルブミン製剤化パクリタキセルは、いくつかの利点を示している。ＰＤＡＣは、パクリタキセルおよびドセタキセルを含む疎水性抗がん剤を排出する有効なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣトランスポーター）であるＰｇｐの過剰発現により、本質的に難治性である。パクリタキセルとは明確に対照的に、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ＰＤＡＣ細胞および腫瘍異種移植片を含むＭＤＲ表現型を発現する薬剤耐性がん細胞に対して顕著な活性を示す。したがって、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４が、パクリタキセル、ドセタキセルおよびＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の弱点を克服する強力な腫瘍標的化学療法剤であり、ＰＤＡＣ患者の生活の質を大幅に改善するというあらゆる示唆がある。

【0008】

ＰＤＡＣの臨床処置のための治療薬としてのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４およびその他のタキソイドを開発するためには、いくつかの重要な考慮事項を満たさなければならない。第一に、これらの薬物は極めて疎水性であるため、分子を可溶化し、全身送達可能性を提供できる安全な製剤が必要である。第二に、エステル結合を通して結合したＤＨＡ分子が、水性環境、特にエステラーゼの存在下で切断されやすい。第三に、腫瘍塊への標的化送達を強化することによって、タキソイドのオフターゲット効果を減少させることが重要である。これらの要件に基づいて、水中油型ナノエマルジョン製剤を含有するオメガ３に富む魚油を開発し、ナイーブマウスとＰＰＴ−２ヒト前立腺腫瘍保有マウスの両方を使用して、溶液製剤と比較して、薬物の生体内分布および薬物動態を評価した。

【0009】

ナノエマルジョンは、超音波または高圧均質化法のいずれかを使用して、油滴がナノメートルサイズに縮小されている水中油で構成された不均一系である。油滴の表面は、界面張力を低下させ、水性媒体の存在下で安定性を提供するよう両親媒性分子で装飾されている。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、ナノエマルジョンの油滴にカプセル化することができ、エステラーゼによる加水分解から保護される。ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）による油滴の表面修飾は、全身投与時の循環半減期を延長し、血管透過性・滞留性亢進（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）（ＥＰＲ）効果によって、漏出性血管系による固形腫瘍への受動的標的化を行う。さらに、腫瘍におけるオメガ３に富む油のより高い蓄積を示唆し、全身投与時に腫瘍塊へのタキソイドの送達において追加の選択性を提供する可能性もある証拠が存在する。

【0010】

がんの処置は、がん免疫療法の出現によって近年著しく進歩している。チェックポイント阻害剤（ＣＩ）は、今や外科手術、放射線療法および化学療法のより確立された様式と共にがんを処置し、多くのがん患者に新たな治療上の希望を提供するための基本的な新しい様式として確立されている。既にＰＤ−１阻害剤ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））およびニボルマブ（ＯＰＤＩＶＡ（登録商標））が、第一選択転移性黒色腫、Ｂ−ｒａｆ阻害剤またはイピリムマブによる療法に失敗した転移性黒色腫、および白金ベースの療法に失敗した非小細胞肺がんの処置に承認されている。近年、ペンブロリズマブが、腎がんの第二選択処置として承認され、ＰＤ−Ｌ１阻害剤であるデュルバルマブ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））が、手術不能または再発性の転移性膀胱がんのための画期的指定を受けた。臨床的成功にもかかわらず、これらの薬物は少数の患者でしか作用せず、ＰＤＡＣ患者には最小限の効果しか示していない。チェックポイント阻害剤に対する患者の反応率を高めることができる化合物を特定するために多大な努力が払われており、Ｗｉｎｏｇｒａｄらは、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）などの化学療法剤と組み合わせることによって、ＣＩに対する完全な耐性を克服することができることをマウスモデルで示した。標的の発現増加およびＴ細胞浸潤を通した抗腫瘍免疫学的効果の促進におけるタキソイドの効果を示す出願人自身のデータを含む、有意な肯定的な証拠が存在する。タキサン処置は、腫瘍関連マクロファージ細胞傷害性を刺激し、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を誘導し、制御性Ｔ細胞（「Ｔ_ｒｅｇｓ」）を下方制御することが示されている。これが、骨髄由来サプレッサー細胞の機能を阻害することも示されている。このようなアプローチを抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１療法と組み合わせると、臨床的利益が広がり、より多くの割合の患者が含まれるようになる。

【0011】

提示された予備的な証拠に基づいて、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、腫瘍の減量とがん幹細胞の殺傷の両方を行う固有の機会を提供し、よって、ＩＯ薬剤と組み合わせるよう仕向ける前例のない道を切り開く。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４とＩＯ療法の併用の時間的順序付けは、この併用療法の潜在的な相乗効果を明らかにする上で重要になる。腫瘍を減量し、間質透過性に影響を及ぼすことによって、抗原を系に潜在的に放出し、がん幹細胞を殺傷することによって、がん幹細胞抗原を放出すると同時にこれらの細胞の再増殖効果を減少させている。腫瘍を減量することの追加の効果は、腫瘍の固有の免疫抑制のレベルを減少させていることである（例えば、免疫抑制サイトカインおよび免疫抑制リガンドを放出する腫瘍細胞の数の減少）。減量はまた、線維形成性間質の存在により、ＰＤＡＣの重大な障壁である腫瘍間質へのＴ細胞透過性を強化する。

【0012】

より有効ながん処置の必要性、およびがん処置における免疫学薬剤の有効性を高める必要性が依然として残っている。

【発明の概要】

【0013】

本発明は、ＰＤＡＣなどの難治性がんにおける治療有効性を強化するために、免疫−腫瘍学（ＩＯ）薬剤と組み合わせて水中油型ナノエマルジョン（ＮＥ）薬物送達システムに製剤化されたオメガ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートの組成物を提供する。

【0014】

本発明はまた、ＮＥ薬物送達システムにカプセル化されたＩＯ薬剤と組み合わせてオメガ−３ ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、がんを処置することによって、がんを処置する方法を提供する。

【0015】

本発明の他の利点は、添付の図面に関連して考慮した場合、以下の詳細な説明を参照することによってよりよく理解されるようになるので、容易に理解される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】分子ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の描写を示す図である。

【0017】

【図2】ＣＦＰＡＣ−１腫瘍移植後の中央腫瘍体積のグラフである。

【0018】

【図3】ＰＡＮＣ−１腫瘍移植後の中央腫瘍体積のグラフである。

【0019】

【図4】Ｐａｎｃ−０２腫瘍移植後の中央腫瘍体積のグラフである。

【0020】

【図5A】Ｐａｎｃ０２細胞に対する様々な抗がん剤の活性のグラフである。

【図5B】Ｐａｎｃ０２細胞に対する様々な抗がん剤の活性のグラフである。

【0021】

【図6A】ナノエマルジョンの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）である。

【図6B】油滴粒径の決定（ｎｍ）を示す図である。

【図6C】油滴のゼータ電位または表面電荷の測定（ｍＶ）を示す図である。

【図6D】Ｐａｎｃ０２細胞におけるローダミンカプセル化ナノエマルジョン製剤の取り込みを示す図である。

【0022】

【図7】インビトロでの様々な抗がん剤処置に応答した、およびインビボでの処置なしのＰＤ−Ｌ１表面タンパク質発現のグラフである。

【0023】

【図8】Ｐａｎｃ０２マウス腫瘍と比較した、未処置Ｐａｎｃ０２細胞およびＩＦＮ−γ（２０ｎｇ／ｍｌで４時間）処置Ｐａｎｃ０２細胞のウエスタンブロットを示す図である。

【0024】

【図9】試験した処置についての腫瘍体積対時間のグラフである。

【0025】

図１０Ａ〜図１０Ｊは、様々な処置様式からの採取時に撮影された腫瘍画像である。

【図10A】ビヒクルで処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10B】ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10C】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＩｇＧ（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10D】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10E】ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＩｇＧ（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10F】ゲムシタビン＋ＩｇＧ（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10G】ゲムシタビン＋ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10H】ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（１０ｍｇ／ｋｇ）＋ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10I】ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧ（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【図10J】ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１（２００μｇ）で処置されたマウスの腫瘍を示す図である。

【0026】

【図11】様々な併用療法による処置によって誘導された体重変化を示すグラフである。

【0027】

【図12】ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された様々なマウス腫瘍処置群からのＰＤ−Ｌ１のｍＲＮＡ発現のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲデータの相対的遺伝子発現をマウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0028】

【図13】ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された様々なマウス腫瘍処置群からのＰＤ−１のｍＲＮＡ発現のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲデータの相対的遺伝子発現をマウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0029】

【図14】ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された様々なマウス腫瘍処置群からのＣＤ−４のｍＲＮＡ発現のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲデータの相対的遺伝子発現をマウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0030】

【図15】ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された様々なマウス腫瘍処置群からのＣＤ−８のｍＲＮＡ発現のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲデータの相対的遺伝子発現をマウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0031】

【図16】ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析された様々なマウス腫瘍処置群からのＡｒｇｉｎａｓｅ−１のｍＲＮＡ発現のグラフである。ＲＴ−ＰＣＲデータの相対的遺伝子発現をマウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0032】

【図17】調製された様々な処置群からの腫瘍組織溶解物、およびウエスタンブロッティングを使用して分析された様々なタンパク質のタンパク質レベルを示す図である。

【0033】

図１８Ａ〜図１８Ｊは、対照および様々な併用処置マウスから収集されたＰａｎｃ０２誘発腫瘍組織（ヘマトキシリンおよびエオシン染色）の組織病理学的評価を示している。

【図18A】未処置の図である。

【図18B】ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図18C】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＩｇＧの図である。

【図18D】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図18E】ゲムシタビン＋ＩｇＧの図である。

【図18F】ゲムシタビン＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図18G】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図18H】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図18I】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図18J】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【0034】

図１９Ａ〜図１９Ｊは、免疫組織化学による浸潤ＣＤ４細胞の分析を示している。

【図19A】未処置の図である。

【図19B】ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図19C】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＩｇＧの図である。

【図19D】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図19E】ゲムシタビン＋ＩｇＧの図である。

【図19F】ゲムシタビン＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図19G】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図19H】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図19I】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図19J】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【0035】

図２０Ａ〜図２０Ｊは、免疫組織化学による浸潤ＣＤ８細胞の分析を示している。

【図20A】未処置の図である。

【図20B】ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図20C】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＩｇＧの図である。

【図20D】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図20E】ゲムシタビン＋ＩｇＧの図である。

【図20F】ゲムシタビン＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図20G】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図20H】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図20I】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図20J】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【0036】

図２１Ａ〜図２１Ｊは、免疫組織化学による浸潤ＰＤ１細胞の分析を示している。

【図21A】未処置の図である。

【図21B】ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図21C】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＩｇＧの図である。

【図21D】ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図21E】ゲムシタビン＋ＩｇＧの図である。

【図21F】ゲムシタビン＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図21G】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図21H】１０ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【図21I】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＩｇＧの図である。

【図21J】２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４＋ＰＤ−Ｌ１の図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、概して、がんを処置するための組成物に関する。組成物は、好ましくは免疫−腫瘍学（ＩＯ）薬剤と組み合わせて水中油型ナノエマルジョン（ＮＥ）薬物送達システムに製剤化されたオメガ−３多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）−タキソイドコンジュゲートである。好ましい実施形態は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが、その構造が図１に示されるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４である）である。

【0038】

「第二世代タキソイド」という用語は、（ｉ）Ｃ−３’−フェニル基がアルケニルまたはアルキル基で置き換えられており、（ｉｉ）Ｃ−１０位が一定のアシル基で修飾されており、Ｃ−３’Ｎ位がｔ−Ｂｏｃ基である、パクリタキセル（タキソール）およびドセタキセル（タキソイド）などの第一世代タキサンを指すために使用される。「ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート」という用語は、Ｃ２’位で多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）にコンジュゲートしたタキソイドを指すために使用される。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、腫瘍に優先的に蓄積され、長期間滞在する能力を特徴としながら、特に多剤耐性腫瘍に対して印象的な有効性を示す（Ｏｊｉｍａ，Ｉ．、がんを処置するためのタキソイド―脂肪酸コンジュゲートおよびその医薬組成物（Ｔａｘｏｉｄ−Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、米国特許第７，８２０，８３９号明細書、２０１０年１０月２６日）。

【0039】

「ナノエマルジョン」（ＮＥ）という用語は、平均液滴直径が５０〜１０００ｎｍの範囲であり、直径２００ｎｍ超が好ましい水中油型エマルジョンを指すために使用される。好ましいＮＥ油相は、魚油または亜麻仁油などのオメガ−３脂肪酸に富む食用油を使用して、Ａｍｉｊｉらの米国特許出願公開第２００７０１４８１９４号明細書のように調製される。それだけに限らないが、松の実油、ベニバナ油、サクラソウ油、ブラックカラント油、ボラージ油、小麦胚芽油、チア油、麻油、ペリラ油、ブドウ油、スクアレン油および真菌油などの他の油を使用することができる。油滴は、リン脂質（例えば、ＬＩＰＯＩＤ（登録商標））およびポリ（エチレンオキシド）含有非イオン性界面活性剤（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃまたはＴｗｅｅｎ）を含む界面活性剤で修飾される。油滴の表面はまた、葉酸塩、ＥＧＦＲペプチドおよび他の既知の標的化リガンドの使用を含む、標的化剤による腫瘍細胞への選択的標的化のために修飾することもできる。組成物はまた、フルオロフォア、ＭＲＩ造影剤または放射性化合物を含む画像造影剤を含有することもできる。

【0040】

本明細書で使用される「免疫腫瘍学薬剤」または「ＩＯ薬剤」という用語は、がんに対する反応を提供するために体の免疫系を標的とする任意の薬剤を指す。多くのがん細胞は、体の免疫系によって認識され得る腫瘍関連抗原を有し、これらの抗原が能動免疫療法で標的化され得る。受動免疫療法は、体の既存の抗腫瘍反応を強化することができる。免疫系の必須の役割は、悪性細胞の増殖から体を保護することである。免疫調節は、ますます多くのがんの処置にとって重要であると見なされている。いくつかの新たながん免疫療法について規制当局の承認が達成されており、その他多くが開発段階にある。特に、免疫浸潤の程度およびエフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞の比は、多くの異なる種類のがんの多変量解析において、療法に関係なく、堅牢な予後因子であることが示されている。高レベルの免疫浸潤を伴うがんは、一般的に進行が遅くなる。免疫浸潤の再現性のある定量化のため方法論が現在検証されている。

【0041】

いくつかの免疫抑制経路は、Ｔ細胞が悪性腫瘍に有効に浸潤するのを防ぐ、および／またはリンパ球に浸潤する機能を抑制することが知られている。これらの経路には、（１）機能障害性抗原提示細胞の産生；（２）Ｔｈ２応答、がんの免疫拒絶反応のための有効性の低い経路に向けた免疫系の分極化；（３）制御性Ｔ細胞および骨髄由来サプレッサー細胞などの免疫調節細胞の誘導；（４）ＩＬ１０およびトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）などの免疫抑制性サイトカインの誘導または分泌；ならびに（５）Ｔ細胞アネルギーまたはＴ細胞枯渇の誘導が含まれる。腫瘍細胞に対する宿主反応を遅延または防止し、腫瘍進行を可能にし、最終的に患者を殺傷することを可能にし得るこの一連の免疫抑制経路は、標的化免疫調節がん療法の安全で、有効で、かつ適切な実施に対する極めて複雑な診断上および治療上の課題となる。追加の困難は、これらの免疫抑制経路が機能的抗腫瘍免疫応答によって誘導され得ることである。

【0042】

正と負の両方の調節経路を調節することによって抗腫瘍免疫応答を強化することができる薬剤が、腫瘍学においてますます重要になっている。エフェクターＴ細胞サブセットから「ブレーキを取り除く」チェックポイント阻害剤は、いくつかの異なるがんにおける重要な臨床活性を媒介することができる。複数の免疫チェックポイント阻害剤またはＴ細胞アゴニストを組み込んだ一定の併用免疫療法が、臨床試験でさらに大きな活性を示している。

【0043】

コンジュゲート中のＰＵＦＡは、好ましくはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（Ｃ−２２）であるが、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、Ｃ−２０）またはα−リノレン酸（ＬＮＡ、Ｃ−１８）であることもできる。

【0044】

本発明は、全体が本明細書に組み込まれる、Ａｍｉｊｉらの米国特許出願公開第２００７０１４８１９４号明細書（２００７）に開示されるように、ＮＥ中でナノ粒子にカプセル化されるＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートの製剤を含む。あるいは、任意のタキソイド、またはタキソイドの組み合わせをＮＥでカプセル化することができ、これには、それだけに限らないが、共に全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｊｉｍａの米国特許第７，８２０，８３９号明細書に記載されるＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲート、ならびにＯｊｉｍａ ＩおよびＤａｓ Ｍ（２００９）に記載されるタキソイドのいずれかが含まれる。

【0045】

ＮＥ製剤として本発明に含まれ得る他のタキソイドには、それだけに限らないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＢＴ−１２１３、ＳＢＴ−１２８５４、ＳＢＴ−１２１３０３；ＳＢＴ−１２１６、ＳＢＴ−１１０３３、ＳＢＴ−１２１３１３、ＳＢＴ−１２１６０２、カバジタキセル、ＳＢＴ−１２１２、ＳＢＴ−１２１７、ＳＢＴ−１１０２、ＳＢＴ−１１０３、ＳＢＴ−１１０４、ＳＢＴ−１１０６、ＳＢＴ−１１０７、ＳＢＴ−１２１３０１、ＳＢＴ−１２１３０２、ＳＢＴ−１２１３０４、ＳＢＴ−１２１４０３、ＳＢＴ−１１０３１、ＳＢＴ−１１０３２、ＳＢＴ−１１０３４、ＳＢＴ−１２８５１、ＳＢＴ−１２８５２、ＳＢＴ−１２８５３、ＳＢＴ−１２８５５、ＳＢＴ−１２８５１−１、ＳＢＴ−１２８５１−３、ＳＢＴ−１２８５２−１、ＳＢＴ−１２８５２−３、ＳＢＴ−１２８５３−１、ＳＢＴ−１２８５３−３、ＳＢＴ−１２８５４−１、ＳＢＴ−１２８５４−３、ＳＢＴ−１２８５５−１およびＳＢＴ−１２８５５−３（Ｏｊｉｍａら、２００９）が含まれる。それだけに限らないが、ＤＨＡ−パクリタキセル（Ｂｒａｄｌｅｙら、２００１）；ＤＨＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０３、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１１０４、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１６、ＬＮＡ−ＳＢＴ−１２１３、ＬＮＡ−パクリタキセル、ＬＮＡ−ドセタキセル、ＤＨＡ−カバジタキセルおよびＬＮＡ−カバジタキセル（ＬＮＡ＝α−リノレン酸）を含むＰＵＦＡコンジュゲート第二世代タキソイドも含まれる。上記の第二世代タキソイドのいずれかのＤＨＡまたはＬＮＡエステルを使用することもできる。当業者であれば、このようなエステルを容易に調製することができる。これらの製剤化および有効性の実施例は、全体が本明細書に組み込まれる、示される参考文献内に見出される。

【0046】

ＩＯ薬剤は、個体の免疫系を使用してがんを攻撃および処置する薬剤であり、最も好ましくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。しかしながら、それだけに限らないが、抗ＰＤ−１抗体、イピルムマブ（ＣＴＬＡ−４阻害剤）、ニボルマブ（ＰＤ−１チェックポイント阻害剤）、ペンブロリズマブ（ＰＤ−１チェックポイント阻害剤）、アテゾリズマブ（ＰＤ−Ｌ１チェックポイント阻害剤）、ピジルズマブ（ｐｉｄｉｌｕｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ、抗ＣＤ４７抗体、インドールアミン（２，３）−ジオキシゲナーゼ阻害剤、抗ＧＤ２抗体、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、またはサイトカイン（インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γもしくはインターロイキン（１−３６）などの任意の他のＩＯ薬剤を使用することもできる。

【0047】

本発明は、ＩＯ薬剤と組み合わせてＮＥ薬物送達システムにカプセル化されたＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートを含む有効量の医薬組成物を、処置を必要とする対象に投与し、がんを処置することによって、がんを処置する方法を提供する。組み合わせの効果は、ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートが腫瘍微小環境でＰＤ−Ｌ１の発現を増加させ、ＣＤ４^＋腫瘍浸潤リンパ球とＣＤ８^＋腫瘍浸潤リンパ球の両方の増加を引き起こす能力によって駆動される。腫瘍微小環境におけるこれらの変化は、一般的に患者をＩ／Ｏ薬剤に対してより反応性にすることが以前に示されている。

【0048】

本明細書の方法で処置されるがんは、それだけに限らないが、乳がん、卵巣がん、肺がん、頭頸部がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、黒色腫、脳がん、前立腺がん、白血病、肉腫、甲状腺がん、非ホジキンリンパ腫、膀胱がん、神経膠腫、子宮内膜がんおよび腎がんなどのあらゆる種類のがんであり得る。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートは、本明細書に記載されているもののいずれか、特にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４であり得る。ＰＵＦＡ−タキソイドコンジュゲートはＮＥでカプセル化されているため、体に積極的に取り込まれ、ＤＨＡは通常の送達方法よりも効率的に切断される。ＩＯ薬剤は好ましくは抗ＰＤ−Ｌ１抗体であるが、上記の任意のＩＯ薬剤であり得る。抗ＰＤ−Ｌ１が投与される場合、この方法は、ＰＤ−Ｌ１を上方制御するステップをさらに含む。

【0049】

ＤＨＡコンジュゲートＳＢＴ−１２１４（図１）は、マウスの高度薬剤耐性腫瘍異種移植片に対して顕著な有効性を発揮し、ＤＨＡコンジュゲートパクリタキセル（ＴＡＸＯＰＲＥＸＩＮ（登録商標））；Ｌｕｉｔｐｏｌｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ヒト第Ｉ〜ＩＩＩ相臨床試験）パクリタキセル、およびｎａｂ−パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））は、意味のある活性を示さない。オメガ−３脂肪酸コンジュゲートがＤＨＡ−パクリタキセルの有益な特性（例えば、パクリタキセルと比較して大幅に減少した毒性、腫瘍内での延長した滞留時間および血漿中のより高い安定性）を有するという仮説に基づいて、ＤＨＡ−をＳＢＴ−１２１４に連結した。ＤＨＡコンジュゲーションは、オメガ−３脂肪酸ベースのナノエマルジョンへの組み込みも助け、薬物濃度の５倍増加を達成することができる。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、微小管の安定化などのいくつかの活性をパクリタキセルと共有しているが、追加の抗腫瘍機構を有する。微小管ネットワークに対するこれらの化合物の効果は、古典的なタキサン（ドセタキセルおよびパクリタキセル）で観察されるものとは異なり、細胞での異なる束化を誘導し、微小管が極めて短くなり、極めて速い核形成効果を示し、これらの高い集合誘導力およびチューブリン突然変異を有する様々な細胞株の細胞分裂を阻害する能力を反映している。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、３つの結腸がん幹細胞株で多くの生存遺伝子を下方制御し、ｐ５３およびｐ２１を活性化することが示されている。まとめると、これらのデータは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４をパクリタキセル、ドセタキセルまたはＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）と区別するいくつかの機構が存在することを示唆している。いくつかの腫瘍異種移植片、特にそれぞれＰａｎｃ−１およびＣＦＰＡＣ−１（膵臓）（図２および図３）、ならびにＣＳＣに対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の観察された顕著な有効性は、これが単なる漸進的な改善ではなく、化学療法パラダイムの重大な変化であることを明確に実証している。

【0050】

図２で、この実験は、ヒトＣＦＰＡＣ−１膵臓腫瘍異種移植片を使用して、パクリタキセル、ＤＨＡ−パクリタキセルおよびＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の有効性を比較した。２４０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇの全用量を使用したＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４が極めて有効であり、それぞれ５匹中５匹または４匹中４匹で完全な退縮および治癒をもたらした。パクリタキセルおよびＤＨＡ−パクリタキセルは、ビヒクルと比較したわずかな腫瘍増殖遅延のみで、はるかに有効性が低かった。ＳＢＴ−１２１４（１２０ｍｇ／ｋｇ全用量）は、６匹中６匹のマウスについて腫瘍退縮を有し、パクリタキセルよりも優れた結果を示したが、６匹中１匹しか治癒せず、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４よりも毒性であるように見え、２０日目までわずかな体重減少（４％未満）を示したが、２４０ｍｇ／ｋｇまたは３００ｍｇ／ｋｇの全用量でのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４については、体重減少が無視できる程度であった。

【0051】

図３で、この実験は、ＲＰＣＩ ＳＣＩＤマウスでヒトＰＡＮＣ−１膵臓腫瘍異種移植片を使用して、パクリタキセルおよびＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のｑ７ｄ×３およびｑ３ｄ×３のスケジュールを比較した。結果は、両スケジュールがこのヒト膵臓腫瘍異種移植片において極めて有効であることを示した（腫瘍増殖遅延９０日超）。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４についてのＭＴＤは２４０ｍｇ／ｋｇ全投与量（８０ｍｇ／ｋｇ×３注射＝２４０ｍｇ／ｋｇ）であるように思われ、３００ｍｇ／ｋｇの全用量で１例の毒性死が発生した。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を受けた全てのマウスがＣＲを達成し、本質的に治癒した。パクリタキセルはごく弱く有効性であるにすぎず、ｑ７ｄ×３スケジュールでは１８日、ｑ３ｄ×３スケジュールでは１３日の腫瘍増殖遅延を示し、ＣＲは示さなかった。

【0052】

開発されたナノエマルジョン（ＮＥ）技術は、ＰＵＦＡに富む食用油の水への分散によって形成され、両親媒性リン脂質単層で安定化された、単純で、用途が広く、臨床的に翻訳可能なコロイド担体である。これらのＮＥは、流体力学的直径が２００ｎｍ未満であり、油相の高体積画分にかなりの量の疎水性薬物を組み込むことができ、全身送達と経口送達の両方に適している。ＮＥは、薬物を組み込むための柔軟性の高いビヒクルであり、極めて好ましい安全性プロファイルを有する、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）材料で完全に構成されており、高圧ホモジナイザーを使用した大規模なＧＭＰ製造に適しており、これが迅速な臨床採用にとっての大きな利点である。

【0053】

以前の製剤と比較した本発明におけるナノエマルジョンの改善点の１つは、それがどのように細胞に取り込まれるかである。伝統的な製剤は、脂質二重層を通した受動拡散によって細胞に取り込まれる。対照的に、ナノエマルジョンは、Ｐ−糖タンパク質／ｍｄｒ−１媒介薬物排出を迂回して、受容体媒介エンドサイトーシスによって取り込まれる。細胞内に入ると、タキソイドと脂肪酸尾部との間のエステル結合が切断され、活性化合物が放出される。出願人らは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０またはＳｏｌｕｔｏｌ−ＨＳ１５中６ｍｇ／ｍｌと比較して、３０ｍｇ／ｍｌもの濃度でＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を製剤化することに成功した。液滴サイズは一貫して直径２００ｎｍ未満であり、最終製剤を濾過滅菌することを可能にする。ナノエマルジョンのゼータ電位は、−２３ｍＶ〜−３３ｍの範囲内である。脂質層上の負電荷によりナノエマルジョン液滴が合体しないことが保証されるので、これが重要な点であり、出願人らはＳｏｌｕｔｏｌ−ＨＳ１５中では２４時間未満であるのに対して、４℃で最大１年間の安定性データを有している。初期の毒物学研究は、侵攻性の患者由来異種移植モデルにおいて、２５ｍｇ／ｋｇの安全で効果的な用量を提供した。Ｐａｎｃ−１細胞株に対するＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の７２時間ＩＣ_５０は２．３ｎＭであり、Ｔｗｅｅｎ−８０で製剤化されたＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と比較して２５分の１に減少し、有効性はインビボで少なくとも３倍高い。

【0054】

２つのヒト膵臓腫瘍モデル（図２および図３）でＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を使用した実験の結果、および患者由来ＣＳＣモデルでの概念実証を以下で説明する。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４前臨床活性の注目せざるを得ない側面は、ＣＳＣに対する効果である。高度形成性ＣＳＣは、難治性腫瘍の処置における重要な新たな薬物標的である。ＣＳＣを特異的に標的とする（または腫瘍細胞に加えてＣＳＣを標的とする）薬物の開発を通して、より耐久性のある臨床反応が可能となり得る。細胞培養における前記の細胞傷害性アッセイに加えて、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を、幹細胞の特徴であるＣＤ１３３^ｈｉｇｈ／ＣＤ４４^ｈｉｇｈとして選択された細胞からスフェロイドとして増殖した結腸がんおよび前立腺がん細胞株で試験した。このアッセイでは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４への曝露によってスフェロイドの数が大幅に減少した。さらに、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、著しく長期の腫瘍増殖遅延（１６７日超）により、全ての生存マウスで薬剤耐性結腸腫瘍異種移植片の完全な退縮を誘導した。おそらくより重要なのは、ミクロスフェアとして成長したいくつかの結腸がんおよび前立腺がん細胞株での「幹細胞性」に関連する遺伝子の発現に対する、比較的低濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（１００ｎＭ〜１μＭ）への２４時間の曝露の効果であった（６、７）。さらに、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４は、患者由来ＰＰＴ２前立腺がん幹細胞異種移植モデルにおいてＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）よりも優れており、膵臓がんオルガノイドでも同様に有効である。

【0055】

ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４および前立腺がん幹細胞を用いた研究で、出願人らは以前に、低濃度のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（０．１〜１μＭ）が、幹細胞性を促進する培養条件下で維持された高度腫瘍原性および高度薬剤耐性の前立腺ＣＤ１３３^＋細胞の最大８０〜９０％の死を誘導することを決定した。さらに、処置により、以前は存在しなかったアポトーシス促進タンパク質、ｐ５３およびｐ２１の発現の有意な上方制御がもたらされ（「遺伝子覚醒（ｇｅｎｅ ｗａｋｅ−ｕｐ）」効果）、結果として、処置に対する感受性が劇的に増加した。患者由来前立腺ＣＳＣ異種移植モデルでは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４がＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）よりも優れており、腫瘍クリアランスをもたらした。これは、インビボでの薬剤耐性膵臓がん、前立腺がんおよび乳がん腫瘍に対するＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の長期的有効性を、バルク腫瘍とがん幹細胞亜集団の両方に対するその効果によって説明することができることを示している。

【0056】

ＣＳＣに富むＰＤＡＣモデルでの有効性の評価に加えて、ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント阻害剤を標的とする抗体と組み合わせたＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の有効性を、Ｃ５６ＢＬ／６マウスで開発された皮下（ｓｕｂＱ）Ｐａｎｃ−２同系膵臓がんモデルで調べた。Ｐａｎｃ−２細胞の移植後、ＩｇＧ対照または抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２００μｇ／投与）と組み合わせたいずれかの単剤としての、ビヒクル（対照として）、ゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（１２０ｍｇ／ｋｇ）およびＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与による毎週の処置のために、マウスを群に分けた。抗体を腹腔内投与した。腫瘍塊が５０〜１５０ｍｍ^３の体積で触知できるようになった腫瘍移植の２週間後に処置を開始した。

【0057】

対照および試験製剤の毎週の注射を３セット後、腫瘍体積の変化を測定し、屠殺時に腫瘍を切除した。図４に示される結果は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせた２５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４群で腫瘍増殖抑制が有意に大きかった（ｐ＜０．０５）ことを示している。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４とは対照的に、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の最適用量（１２０ｍｇ／ｋｇ）は、Ｐａｎｃ−２誘発腫瘍のごくわずかな抑制しか引き起こさず、ゲムシタビンは中程度の効果を示した。様々な薬物の組み合わせによる処置によって、有意な体重変化は誘導されなかった。ＩＡＣＵＣプロトコルに述べられているように、未処置対照腫瘍が最大直径約１ｃｍに達したら、全ての動物を屠殺した。屠殺時に、腫瘍塊を切除したところ、他と比較してＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４（２５ｍｇ／ｋｇ）＋抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置群から最小の腫瘍塊が示される。

【0058】

以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は、特に明記されていない限り、例示のみを目的として提供されており、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、以下の例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになる任意のおよび全ての変形を包含すると解釈されるべきである。

【0059】

例１

【0060】

材料および方法

【0061】

ＳＢＴ−１２１４のドコサヘキサエン酸コンジュゲート（すなわち、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４）は、以前報告された方法に従って、ＣｈｅｍＭａｓｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（ストーニーブルック、ＮＹ）によって合成された。超高純度グレードのオメガ−３に富む魚油はＪｅｄｗａｒｄｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（クインシー、ＭＡ）から、Ｌｉｐｏｉｄ Ｅ８０はＬｉｐｏｉｄ ＧＭＢＨ（ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）から、ＤＳＰＥ ＰＥＧ２０００はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（アラバスター、ＡＬ）から、Ｔｗｅｅｎ ８０はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（セントルイス、ＭＯ）から、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）およびＬＡＬ発色性エンドトキシン定量キットはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ）から購入した。ペニシリン、ストレプトマイシンおよびトリプシンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（グランドアイランド、ＮＹ、米国）から入手した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（４〜６週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｏｄｅｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ−ＮＣＩ）（ケンブリッジ、ＭＡ、米国）から購入した。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５ｍｌ、遠心フィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（コーク、アイルランド）製とした。他の全ての分析グレードの試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを通して購入した。本研究では、膵臓がんを処置するために一般的に使用される薬剤であるゲムシタビン（ＧＥＭ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）およびＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）を使用した。全ての薬剤は使用前に直ちに調製した。ＧＥＭおよびＰＴＸは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（セントルイス、ＭＯ）から購入した。

【0062】

ナノエマルジョン製剤の調製および特性評価

【0063】

ナノエマルジョン製剤の調製は、いくつかの修正を加えて、最近報告されている確立されたプロトコルを使用して行った。超音波処理法の代わりに、高圧均質化法によって水中油型ナノエマルジョンを調製した。

【0064】

細胞培養

【0065】

Ｃ５７Ｂｌ／６マウスと同系のマウス膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ０２は、ネブラスカ州オマハのＵＮＭＣのＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ教授からの親切な贈り物であった。Ｐａｎｃ０２細胞を、７５ｃｍ^２の細胞培養フラスコで増殖させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（共にＧｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、ＣＡ、米国製）を補充したＤＭＥＭ培地で維持した。細胞を、５％ＣＯ_２を含有する加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。

【0066】

ナノエマルジョンの取り込みおよび細胞分布のインビトロ評価

【0067】

Ｐａｎｃ０２細胞（０．５×１０^６）を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で一晩、６ウェルプレートのガラスカバースリップに播種した。次いで、細胞を２μＭのＮＥ−ローダミンナノ粒子と共に０．５時間〜４時間の範囲の様々な時点にわたってインキュベートして、細胞によるナノ粒子の取り込みを可能にした。最後のインキュベーション時点の後、ガラスカバースリップをＰＢＳで洗浄した後、ホルマリン中で、室温で１５分間固定した。固定された細胞の核を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ローダミンナノエマルジョンの取り込みを、異なる時点間で同等の取り込みを有するように固定パラメータを使用して、蛍光共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）によって調べた。

【0068】

細胞生存率研究

【0069】

様々な薬物およびナノエマルジョン製剤の細胞傷害性効果を確認するために、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で一晩、９６ウェルプレートの各ウェルに５０００個の細胞を播種した。様々な薬物（パクリタキセル、Ａｂｒａｘａｎｅ、ゲムシタビン、ならびにＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の溶液およびナノエマルジョン）を、０ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭ〜１００００ｎＭの範囲の濃度で希釈し、Ｐａｎｃ０２細胞をこれらの濃度で９６時間処置した。インキュベーション後、細胞を３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）で処置した。ＭＴＴ結晶をＤＭＳＯで溶解し、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＨＴＸマルチモードマイクロプレートリーダーを使用して、プレートを５７０ｎｍの吸光度で読み取った。

【0070】

様々な治療薬への曝露後のＰＤ−Ｌ１の発現

【0071】

細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で一晩、６ウェルプレートに、０．５×１０^６細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、ＩＣ_５０値の図５Ａおよび図５Ｂに述べられている様々な薬物に４８時間曝露した。最大反応率を、Ｐａｎｃ０２細胞に投与した場合の抗がん剤の関数として示す。細胞生存率は、３７℃で９６時間のインキュベーション後に、ＭＴＴアッセイによって測定した。データは平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。有意差は以下のように示される：＊ｐ＜０．０５、および＊＊ｐ＜０．０１。ＰＤ−Ｌ１の発現レベルを、以下のようにフローサイトメトリーを使用して決定した。手短に言えば、インビトロ培養物から収穫した細胞を、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ラット抗ＰＤ−Ｌ１またはアイソタイプ対照抗体（マウス、ＢｉｏＸｃｅｌｌ、ウェストレバノン、ＮＨ、米国）と共に４℃で３０分間インキュベートし、次いで、３回洗浄し、抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート抗体と共にインキュベートした。細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳで１回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターのフローサイトメーターおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏバージョン６．０ソフトウェア（共にＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．製）によって分析した。

【0072】

イムノブロッティング

【0073】

細胞および腫瘍組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２％プロテイナーゼ阻害剤（共にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、セントルイス、ＭＯ、米国製）を含有する氷冷溶解緩衝液中で溶解した。細胞をセルスクレーパーで回収し、攪拌し、氷上で１５分間インキュベートした。マウス腫瘍組織を、ソニケーターを用いて氷上で１０秒間超音波処理した。溶解物を遠心分離し、上清を収集し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を使用してタンパク質濃度を決定した。上清を溶解緩衝液で希釈して、等濃度のタンパク質を作成した。５０μｇのタンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離し、ｉＢｌｏｔ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（全てＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットをＴＢＳ−Ｔ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０ｖ／ｖ］中１％粉乳で、室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔで１回洗浄した。膜を、ＴＢＳ−Ｔ（１：１，０００希釈）中抗ＰＤ−Ｌ１（Ａｂｃａｍ製）、ＰＤ−１、Ｆ４／８０およびヒストン３（全てＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製）抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ（１：１０，０００希釈）中二次抗ウサギおよびマウスＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に室温で１時間インキュベートした。ウエスタンブロッティング（ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｔｄ．、バッキンガムシャー、英国）を使用して免疫複合体を検出した。

【0074】

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）

【0075】

前記のようにリアルタイムＰＣＲを使用して他のタンパク質についてのＰＤ−Ｌ１およびｍＲＮＡの発現レベルを決定した。ｍＲＮＡ単離に使用した試料は、膵臓がん細胞（Ｐａｎ０２）または腫瘍組織から取り出した。記載のプロトコル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ））に従って、市販のＲＮＡ抽出キットを使用して全ｍＲＮＡを抽出した。単離したＲＮＡを、リアルタイムＰＣＲに使用するまで−８０℃で保存した。後者では、１μｇの抽出ＲＮＡを、市販のｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ））を使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、マウスＰＤ−Ｌ１の以下のプライマーを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ロックフォード、ＩＬ））を用いてＲＴ−ＰＣＲに供した：（順方向プライマー、５’−ＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＣＡＴＡＣＣＧ−３’（配列番号１）および逆方向プライマー、５’−ＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＧＴ−３’（配列番号２））；マウスＰＤ−１（順方向プライマー、５’−ＴＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＡＡ−３’（配列番号４）および逆方向プライマー、５’−ＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＴＧＧ−３’（配列番号５））；ＣＤ４：（順方向プライマー、５’−ＡＣＡＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＣＡ−３’（配列番号６）および逆方向プライマー、５’−ＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号７））；マウスＣＤ８（順方向プライマー、５’−ＣＴＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＣＣＴＡＣＣ−３’（配列番号８）および逆方向プライマー、５’−ＡＴＣＣＧＧＴＣＣＣＣＴＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号９））；マウスＡｒｇｉｎａｓｅ−１（順方向プライマー、５’−ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＣ−３’（配列番号１０）および逆方向プライマー、５’−ＴＧＣＴＴＡＧＣＴＣＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１１））；およびマウスβ−アクチン（順方向プライマー、５’−ＣＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣＡＡＧＴＡＣＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号１２）および逆方向プライマー、５’−ＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＴＣＣ−３’（配列番号１３））。リアルタイムＰＣＲシステム（７３００；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、ＣＡ、米国）を使用してＰＣＲを実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータによる遺伝子発現の相対的定量化を、マウスβ−アクチンと比較して計算した。

【0076】

インビボ研究−皮下腫瘍の誘導および増殖

【0077】

動物の使用を伴う全ての実験は、ノースイースタン大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された研究プロトコルを介して、アメリカ国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する手引きの推奨に厳密に従って行った。手短に言えば、十分に増殖した後、Ｐａｎｃ０２マウス膵臓がん細胞を１：１ ＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌに再懸濁し、２×１０^５個の細胞を６週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の発達を週に２回監視した。腫瘍サイズは週単位でノギスで測定し、おおよその腫瘍体積を、式０．５ａｂ^２（式中、ｂは２つの垂直直径のうちの小さい方である）を使用して決定した。腫瘍サイズが直径１５００ｍｍ^２以上に達したら、マウスを屠殺した。

【0078】

インビボ単剤療法および併用療法

【0079】

ＰＤ−Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）に対するマウス抗体および関連するアイソタイプＩｇＧ対照は、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌから購入した。２００μｇのＰＤ−Ｌ１に対する抗体および関連するアイソタイプＩｇＧ対照を、マウス１匹当たりＩＰを介して週２回、３週間注射した。ゲムシタビン溶液およびＡｂｒａｘａｎｅ １２０ｍｇ／ｋｇを週１回ｉ．ｐ．を通して注射した。パクリタキセル１２０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇのいずれかのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を週１回ｉ．ｖ．を通して注射した。全ての化学療法薬を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはアイソタイプＩｇＧ対照と組み合わせて注射した。合計で、１実験当たり３回処置を行った。

【0080】

腫瘍組織の組織学および免疫組織化学（ＩＨＣ）分析

【0081】

マウスの腫瘍量の組織学的分析を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、ホルムアルデヒド固定およびパラフィン包埋腫瘍組織で行った。ＩＨＣを、ＰＤ−１、ＣＤ４およびＣＤ８抗体のパラフィン包埋組織切片で行った。ＰＤ−１、ＣＤ４およびＣＤ８に対する全てのマウス特異的抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＩＨＣは、プロトコルおよびＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの推奨希釈に従って処理した。

【0082】

統計解析

【0083】

全ての結果は平均±ＳＤとして表す。治療実験では、１処置群当たり３匹のマウスを割り当てた。統計解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して実施した。対応のないスチューデントのｔ検定およびＡＮＯＶＡを使用してデータを分析し、その差がｐ＜０．０５で有意であると見なした。

【0084】

結果

【0085】

ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルジョン製剤の特性評価

【0086】

ナノエマルジョン送達アプローチは、出願人らの以前の研究で、強化された治療可能性を示した。この研究では、出願人らは、オメガ−３およびオメガ−６脂肪酸などのＰＵＦＡに富む魚油を使用して、新世代タキソイドであるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の水中油型ナノエマルジョンを製剤化した。このタキソイドカプセル化ナノエマルジョンを使用して、膵臓がん前臨床マウスモデルで免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせてその治療有効性を調べた。出願人らは、高圧均質化技術を使用して、この均一で乳白色の安定なナノエマルジョンを製剤化した。図６Ａ〜図６Ｄに示されるように、ナノエマルジョン液滴は、光散乱および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって観察されるように、形態がほぼ球形であり、平均直径がおよそ２２０ｎｍであった。青色（核）、赤色（ローダミンカプセル化ナノエマルジョン）および紫色のオーバーレイ画像を示す蛍光顕微鏡画像。画像は６３倍の倍率で撮影した。画像スケールバーは１００μｍである。粒径に加えて、ナノエマルジョンの均一性および電荷もそれらの生物学的利用能を予測する。均一性は多分散性指数（ＰＤＩ）で表され、ＰＤＩの値が低い（０．２未満）と、ナノエマルジョンの均一で安定な形態を示す。薬物カプセル化ナノエマルジョンのＰＤＩ値は０．１未満であった。ナノエマルジョン中の油滴の平均表面電荷は−２８．９ｍＶであった（図６Ｃ）。ナノエマルジョンの負電荷は、これらのナノエマルジョンの調製に使用される魚油の遊離脂肪酸の存在に起因し得る。

【0087】

ＨＰＬＣアッセイを使用して、ナノエマルジョン製剤中の薬物濃度を決定した。２０ｍｇ／ｍｌのＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルジョンは、９７％の薬物負荷効率を表す。ナノエマルジョンのこの高い薬物カプセル化効率は、この薬物がナノエマルジョンの油コアに保持されるので、薬物の相対的親油性に起因した。全ての製剤を０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、貯蔵期間中にＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）アッセイで確認した場合、最小レベルのエンドトキシンを有していた。

【0088】

Ｐａｎｃ０２細胞におけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４製剤のインビトロ評価

【0089】

ナノエマルジョンがＰａｎｃ０２細胞に内在化されているかどうかを調べるために、ローダミンをナノエマルジョンにカプセル化し、共焦点顕微鏡検査を実施した。ローダミンカプセル化ナノエマルジョン製剤の最適な細胞およびスフェロイド取り込みを、様々な時点で、ローダミン２μＭインキュベーション後に観察した（図６Ｄ）。図６Ｄに示されるように、画像は、ナノエマルジョンがカプセル化色素を細胞内に効率的に送達し、ローダミンナノエマルジョン処置細胞の増加した時点での蛍光シグナルの増加がＰａｎｃ０２細胞による高い細胞内取り込みを示していることを明確に示している。ナノエマルジョン製剤の内在化が細胞取り込み実験によって確認されたため、ナノエマルジョン製剤においてローダミンをＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で置き換え、細胞生存率に対するその効果を様々な抗がん剤と比較した。

【0090】

様々な抗がん剤の細胞殺傷効率を、ＭＴＴアッセイを使用してＰａｎｃ０２細胞で調べた。ブランクナノエマルジョンまたはビヒクル対照に加えて、これらの研究のために選択したＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の最終濃度は、ＳＢＴ−１２１４の以前の研究^６に基づいて０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１，０００ｎＭ〜１０，０００ｎＭであった。Ｐａｎｃ０２細胞におけるＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４および他の抗がん剤に対する濃度−反応研究を図５Ａ〜図５Ｂに示す。結果は、３７℃で９６時間の薬物曝露後の処置の関数としての残っている生細胞の割合として示される。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を１０ｎＭおよび１００ｎＭの濃度で投与した場合、水溶液と比較して、ナノエマルジョン製剤でより高い細胞傷害性が観察された。しかしながら、インビトロ条件下では、ゲムシタビンが１５４ｎＭの平均ＩＣ_５０値で最高の効力を示し、引き続いてＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルジョンで２１５ｎＭ、溶液中ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で２６２ｎＭであった。対照的に、パクリタキセルおよびＡｂｒａｘａｎｅ（商標）の平均ＩＣ_５０値は、それぞれ４４３ｎＭおよび４２８ｎＭで有意に高かった。

【0091】

Ｐａｎｃ０２細胞における薬物療法後のＰＤ−Ｌ１発現の評価

【0092】

Ｐａｎｃ０２細胞を、ゲムシタビン、Ａｂｒａｘａｎｅ（商標）、パクリタキセルおよび溶液とナノエマルジョンの両方のＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で、４８時間処置し、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を誘導できるかどうかを決定した。腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１発現レベルをフローサイトメトリーによって決定し、Δ平均蛍光強度（ΔＭＦＩ；アイソタイプ対照から差し引かれた、抗ＰＤ−Ｌ１を使用したＭＦＩ）として表す。図７に示されるように、ＩＣ_５０値の様々な抗がん剤で４８時間処置すると、Ｐａｎｃ０２マウス膵臓がん細胞でＰＤ−Ｌ１表面の発現が誘導された。試験した抗がん剤に応答したＰＤ−Ｌ１の上方制御は、未処置対照と比較して有意に増加した。ＰＤ−Ｌ１の発現を、フローサイトメトリーを使用して分析し、ΔＭＦＩ（アイソタイプ対照から差し引かれた抗ＰＤ−Ｌ１を使用したＭＦＩ）として表す。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。以前報告されたように、ＰＤ−Ｌ１レベルは、図８に示されるように、インビトロで増殖している細胞と比較して膵臓腫瘍組織で強化された。

【0093】

併用薬物および抗ＰＤ−Ｌ１抗体療法のインビボ評価

【0094】

出願人らは、インビボでのＰａｎｃ０２誘発腫瘍増殖に対する、単独でのまたはＰＤ−Ｌ１に対する遮断抗体と組み合わせた、様々な抗がん剤の効果を調べた。Ｐａｎｃ０２細胞を直接皮下注射し、１週間後に腫瘍体積を測定し、実験が終了するまで継続した。腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ^３に達した後、出願人らは、全ての処置群間でほぼ等しい腫瘍体積を有するようにマウスを無作為化した。次いで、マウスを単独で、またはＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて、抗がん剤で３週間処置した。図９および図１０Ａ〜図１０Ｊは、３週間の処置後の各処置群の腫瘍増殖阻害効果を示している。図９は、全ての処置様式を要約するグラフである。値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。有意差は以下のように示される：＊ｐ＜０．０５、および＊＊ｐ＜０．０１。未処置対照群と比較して、各処置群は、ＩｇＧ処置群と抗体組み合わせ処置群の両方において、２５ｍｇ／ｋｇのＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４で最も顕著な阻害効果を有した。これらの結果は、ＰＤ−Ｌ１のみの遮断は腫瘍増殖の減少に効率的ではなかったが、２５ｍｇ／ｋｇ ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と組み合わせると、腫瘍増殖を有意に阻害したことを示している。ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせたＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置は、１０ｍｇ／ｋｇでさえ、標準的な化学療法薬であるゲムシタビンと比較して、腫瘍増殖の抑制に有効であった。１０ｍｇ／ｋｇ ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４での処置は、１２０ｍｇ／ｋｇのＡｂｒａｘａｎｅ処置よりも優れていた。全体として、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と抗ＰＤ−Ｌ１抗体の併用処置は、単一処置と比較して相乗効果を示した。図１１に示されるように、毒性の大まかな代用として、各処置群内で有意な体重変化はなかった。

【0095】

抗がん剤はＰａｎｃ０２腫瘍モデルにおいてインビボでＰＤ−Ｌ１発現を誘導する

【0096】

抗がん剤が膵臓がん腫瘍組織でＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４、ＣＤ８およびＡｒｇｉｎａｓｅ−１のｍＲＮＡ発現をどのように誘導するかを調査するために、単独での、または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、ＣＤ４、ＣＤ８およびＡｒｇｉｎａｓｅ−１のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図１２に示されるように、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡレベルは、それぞれのＩｇＧ対照群と比較して、全ての抗がん剤間で、併用療法で上方制御された。しかしながら、ＰＤ−１およびＣＤ４ ｍＲＮＡレベルは、図１３および図１４にそれぞれ示されるようにＩｇＧ処置群と比較して有意には高くなかったゲムシタビンを除いて、抗ＰＤ−Ｌ１＋抗がん剤で低かった。ＣＤ８ ｍＲＮＡレベルは、それぞれ図１５に示されるように、ＩｇＧ処置群と比較して、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた場合、全ての抗がん剤の併用処置に応答して上方制御された。しかしながら、Ａｒｇｉｎａｓｅ−１レベルは、図１６に記載されるように、免疫チェックポイント阻害剤と比較してＩｇＧ処置群で有意に高かった。図１７に示されるように、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた抗がん剤の処置は、ＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡ発現レベルの上方制御に加えて、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現レベルも強化する。データは、少なくとも３回の独立した実験の平均±標準偏差を表す；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現と同様に、ＩｇＧ処置群と比較して、高用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を除いてＰＤ−１発現も上方制御された。より高いＰＤ−Ｌ１タンパク質レベルは、この高用量のＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置群におけるマクロファージの存在に起因し得るが、これは図１７のＦ４／８０のより高いタンパク質レベルから明らかである。

【0097】

Ｐａｎｃ０２腫瘍におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＰＤ−１細胞の浸潤

【0098】

次いで、出願人らは、組織学（図１８Ａ〜図１８Ｊ）および免疫組織化学（図１９Ａ〜図１９Ｊ、図２０Ａ〜図２０Ｊ、および図２１Ａ〜図２１Ｊ）によって、２１日目の腫瘍組織におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびＰＤ−１細胞の浸潤を調べた。様々な処置群からの腫瘍組織の組織学は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置群からの腫瘍が他の処置群からの固形腫瘍塊と比較して低密度の間質を有することを示した（図１８Ａ〜図１８Ｊ）。画像は６３倍の倍率で撮影した。

【0099】

未処置対照腫瘍組織では、比較的少数のＣＤ４＋細胞が見られた。未処置腫瘍と比較して、ＣＤ４＋細胞の浸潤は、抗ＰＤ−Ｌ１処置および様々な抗がん剤の併用処置によって有意に増加した（図１９Ａ〜図１９Ｊ）。

【0100】

対照腫瘍組織では、少数のＣＤ８＋細胞浸潤しか観察されなかった。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置は、腫瘍微小環境におけるＣＤ８＋細胞浸潤の有意な増加をもたらした（図２０Ａ〜図２０Ｊ）。膵臓腫瘍のコアにおけるＣＤ８＋細胞の浸潤は、おそらく、様々な処置群の各々における腫瘍増殖の抑制を担っている。しかしながら、Ｔ細胞でのＰＤ−１の発現は、全ての処置群で同等であった（図２１Ａ〜図２１Ｊ）。

【0101】

考察

【0102】

膵臓がんは、従来の抗がん剤に対する耐性が発達しているため、依然として難病である。現在、免疫チェックポイント阻害剤の成功およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法などの新世代の養子細胞移植療法により、多くの処置レジメンでの免疫療法の可能性に大きな熱意が注がれている。しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤は、多くの腫瘍型、特にＰＤＡＣなどの一定の固形腫瘍で単一処置レジメンとして使用された場合、有望な結果を示していない。そのため、反応率および有効性を改善することを目的として、免疫ベースと非免疫ベースのがん療法を有効に組み合わせることに多大な努力が払われている。

【0103】

ＰＤＡＣ患者の場合、ゲムシタビンはＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）と組み合わせてフロントライン処置として使用されているが、延命効果はごくわずかである。パクリタキセルは依然として多くの固形腫瘍型のフロントライン処置であり、アポトーシスを開始し、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期停止を引き起こす。タキサン、特にＣｒｅｍｏｐｈｏｒ−エタノール製剤（ＴＡＸＯＬ（登録商標））のパクリタキセルは、その送達ビヒクルおよび腫瘍特異的送達の欠如のために、いくつかの毒性の課題を抱えている。パクリタキセルの効率をさらに改善するために、シクロデキストリン、リポソームおよびアルブミン結合ナノ粒子（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））製剤などの、その水溶性を高める多数の製剤ならびにパクリタキセルのプロドラッグが開発されてきた。しかしながら、結腸および前立腺を含む一部のがんは、有効なＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーターであるＰ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）を過剰発現し、パクリタキセルを排出する。これが、パクリタキセルがこれらのがんに対して有効でない理由である。排出の課題を克服するために、ＤＨＡコンジュゲート薬が血流中でＰＵＦＡの主要な担体であるヒト血清アルブミンに対してより高い親和性を有するため、パクリタキセルをＤＨＡとコンジュゲートしたが、Ｐｇｐおよび／または他のＡＢＣトランスポーターを過剰発現するがんでは、パクリタキセルがエステラーゼの存在下でＤＨＡから解放されると、ゆっくり放出されるが、排出ポンプによって捕捉され、がん細胞から排除される。

【0104】

パクリタキセルとは対照的に、ＳＢＴ−１２１４と呼ばれる新世代タキソイドは、ＭＤＲ表現型を発現する薬剤耐性がん細胞に対して優れた活性を示した。以前の研究では、ＤＨＡコンジュゲートＳＢＴ−１２１４が、ＥＰＲ効果を通して腫瘍部位での薬物の蓄積を増加させることにより、治療有効性を改善した。ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の有効性をさらに改善するために、出願人らは、魚油液滴中にＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を含有するナノエマルジョン担体系の製剤化および研究に成功し、これは薬物リザーバーとして有利に作用した。このコロイド系は、インビトロで製剤の安定性を維持し、インビボでの性能を強化するのに望ましい粒径およびゼータ電位を有する。表面形態ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ナノエマルジョン製剤は、形態が球形であり、目に見える薬物結晶はなかった。定性的な細胞取り込み分析は、ナノエマルジョン製剤がＰａｎｃ０２細胞に効率的に内在化されることを実証した。これは、ナノエマルジョンが、ペイロードを細胞中の細胞内部位に効率的に送達し、その薬物溶液よりも強力であったことを示唆している。近年の研究で、出願人らは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４がナノエマルジョン製剤で送達された場合に腫瘍増殖をより高程度に抑制し、単独療法として使用された場合のより高い治療有効性を強調することを認めた。結論として、その研究からの出願人らのデータは、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４コンジュゲートのナノエマルジョンが優れた退縮および腫瘍増殖阻害を誘導し、新規な抗がん剤候補としての高い可能性を有することを実証した。

【0105】

本研究で、出願人らは、膵臓がんにおける免疫療法と抗がん剤の組み合わせの有効性を調査した。以前報告されたように、膵臓がん細胞株Ｐａｎｃ０２におけるＰＤ−Ｌ１表面発現は、パクリタキセル、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）、ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４およびゲムシタビンによって上方制御された。

【0106】

出願人らの知る限り、これは、同系膵臓がんマウスモデルにおけるＰＤ−Ｌ１発現に対するチェックポイント阻害剤と組み合わせた抗がん剤の効果に取り組む最初の研究である。ＰＤ−Ｌ１発現に対する化学療法剤の効果は以前の研究で議論されているが、相反する所見があった。例えば、３つの研究は、抗がん剤が表面ＰＤ−Ｌ１の発現を上方制御することを実証したが、１つの研究は、表面ＰＤ−Ｌ１の下方制御を報告した。例えば、Ｇｏｎｇらは、パクリタキセルが２つの異なるがん細胞モデルでＰＤ−Ｌ１表面タンパク質およびｍＲＮＡの発現を誘導することを報告した。同様に、Ｐｅｎｇは、卵巣がん細胞株におけるＰＤ−Ｌ１発現が、パクリタキセル、ゲムシタビンまたはカルボプラチン処置によりＮＦ−κＢシグナル伝達を介して増強されることを報告した。対照的に、Ｇｈｅｂｅｈらは、ドキソルビシンが乳がん細胞におけるＰＤ−Ｌ１の表面発現を下方制御し、ＰＤ−Ｌ１の核発現を上方制御することを報告した。これらの以前の研究間の違いの１つの考えられる説明は、各研究で使用された細胞株および抗がん剤の違いによるものであり得る。

【0107】

本研究では、出願人らは、膵臓がんを処置する際に、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）、ゲムシタビン、パクリタキセル、およびＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の溶液とナノエマルジョン製剤の両方を、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用した。出願人らの実験における各抗がん剤の濃度は、Ｐａｎｃ０２細胞のＩＣ_５０値に基づいていた。抗がん剤間の薬物濃度のそれぞれの違いは、薬剤によるＰＤ−Ｌ１誘導の程度に有意な影響を及ぼさず、フローサイトメトリーによって決定されるように、ＰＤ−Ｌ１表面タンパク質の発現は全ての抗がん剤に応答して増強された。ＰＤ−Ｌ１調節の機構に関して、Ｐａｒｄｏｌｌは、自然免疫および適応免疫耐性が、腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を調節する２つの一般的な機構であると報告した。一般に、抗がん剤は細胞傷害性を引き起こすだけでなく、腫瘍免疫応答を変化させ、腫瘍免疫エスケープを誘導し得る。この研究では、出願人らは、同系マウス膵臓がんモデルを使用することによって、インビボでのＰＤ−Ｌ１遮断と組み合わせた様々な抗がん剤の抗腫瘍効果を実証した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用が負の調節を誘導することは周知であり、これはＴ細胞の活性化後の免疫恒常性にとって重要である。この負の調節は、がん細胞が腫瘍特異的Ｔ細胞免疫から逃れるのに有益であると考えられている。ＰＤ−Ｌ１遮断が腫瘍の発生を阻害することを示した膵臓がん細胞株を使用した研究もあるが、これらの研究では免疫チェックポイント阻害剤と一緒に抗がん剤を使用していない。がん免疫は種特異的な白血球動員によって高度に調節されているため、出願人らは、マウス膵臓がん細胞のマウス膵臓への皮下注射によって確立された膵臓がんモデルを使用した。結果として、ＰＤ−Ｌ１の遮断は、単一処置選択肢として使用した場合、または膵臓がんに対して一般的に使用される抗がん剤（パクリタキセル、Ａｂｒａｘａｎｅおよびゲムシタビン）と組み合わせて使用した場合、膵臓がんモデルで腫瘍増殖速度を減少させた。しかしながら、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４とＰＤ−Ｌ１遮断の組み合わせは、有意な腫瘍抑制を示し、処置後でさえも腫瘍退縮を維持し、ＰＤ−Ｌ１が膵臓がんの処置の標的となる可能性があることを示している。

【0108】

Ｆｒｅｅｍａｎらは、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞増殖を減少させることを報告したが、出願人らは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置後に腫瘍浸潤細胞の数が増加することを発見した。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断によるＩＦＮ−γの増加は、がん免疫に加えて、慢性感染症を含むいくつかのモデルで実証されている。抗ＰＤ−Ｌ１抗体による処置は、ＰＤ−Ｌ１の発現を増加させ、これはＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋細胞の腫瘍組織への浸潤の増加により得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体処置後のＰＤ−Ｌ１ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの上方制御の別の考えられる理由は、ＰＤ−Ｌ１も発現するマクロファージおよび骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の動員である。長期間のエフェクターＴ細胞からの大量のＩＦＮ−γ発現は、抗腫瘍免疫を強化するＭ１マクロファージなどの炎症細胞の浸潤を誘導し得るので、腫瘍組織への浸潤ＣＤ８＋細胞によるＩＦＮ−γ増加は抗腫瘍効果に寄与し得る。腫瘍微小環境のマクロファージはＡｒｇｉｎａｓｅ−１を過剰発現しており、ＭＤＳＣの存在の可能性に加えてこれらのマクロファージがＭ１であることを示している。したがって、腫瘍増殖に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の抑制効果は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４併用処置群における腫瘍浸潤エフェクター細胞の数の増加によって主に説明することができると考えられる。換言すれば、未処置群では、ＰＤ−Ｌ１が、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞およびＭ１マクロファージの浸潤を減少させることによって、このがんモデルで腫瘍免疫を減弱し得る。膵臓腫瘍を形成するためにマウスに注射された同じ細胞は、インビトロでのＩＦＮ−γ処置後に極めて高レベルのＰＤ−Ｌ１を発現した。出願人らの研究では、腫瘍浸潤ＣＤ４＋Ｔ細胞の数はＰＤ−Ｌ１遮断後に減少しなかった。まとめると、結果は、ＰＤ−Ｌ１遮断が、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４の相乗効果を通して膵臓腫瘍負荷を減少させることができることを示している。さらに、様々な処置群からの腫瘍組織の組織学は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４処置群からの腫瘍が他の処置群からの固形腫瘍塊と比較して低密度の間質を有することを示した。しかしながら、最も一般的に使用される抗がん剤の単剤療法および併用療法は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４を除いて、相加的な抗腫瘍効果を予想外に示さなかった。ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のより高い有効性についての１つの考えられる説明は、他の抗がん剤と比較して、がん幹細胞の処置におけるその役割である。

【0109】

結論

【0110】

要約すると、出願人らの結果は、ＮＥ−ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４と組み合わせてＰＤ−Ｌ１を遮断することによる有意な腫瘍抑制を示している。ＰＤ−Ｌ１の遮断により、腫瘍内ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞および炎症性マクロファージの浸潤が増加し、これが抗腫瘍効果に直接つながる。対照的に、ＰＤ−１レベルとＰＤ−Ｌ１レベルの両方が、一般的に使用される抗がん剤の組み合わせで高く、Ｔｒｅｇ細胞の腫瘍浸潤の増加を強調し、これは主に非抗腫瘍効果が原因であり得る。

【0111】

本出願を通して、米国特許を含む様々な刊行物は著者および年によって参照され、特許は番号によって参照される。刊行物の完全な引用を以下に列挙する。これらの刊行物および特許の開示の全体が、本発明が関連する先行技術をより完全に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。

【0112】

本発明は例示的な方法で説明されており、使用されてきた用語は、限定ではなく説明の語の性質となることを意図していることを理解されたい。

【0113】

明らかに、本発明の多くの修正および変形が上記の教示に照らして可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明を、具体的に記載されている以外の方法で実施することができることを理解されたい。
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１６．Ｈａｒｒｉｅｓ Ｍ、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ Ａ、Ｓｃｕｒｒ Ｍ、Ｒｅａｄｅ Ｓ、Ｃｏｌｅ Ｃ、Ｊｕｄｓｏｎ Ｉ、Ｇｒｅｙｓｔｏｋｅ Ａ、Ｔｗｅｌｖｅｓ Ｃ、Ｋａｙｅ Ｓ．進行した悪性固形腫瘍を有する患者におけるカルボプラチンと組み合わせたＤＨＡ−パクリタキセルの第Ｉ／ＩＩ相試験（Ｐｈａｓｅ Ｉ／ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＤＨＡ−ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ）．英国癌ジャーナル（Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ）２００４；９１：１６５１−５．
１７．Ｈｅｎｎｅｎｆｅｎｔ ＫＬ、Ｇｏｖｉｎｄａｎ Ｒ．タキサンの新規な製剤：概説．新たなボトルに入った古いワイン？（Ｎｏｖｅｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔａｘａｎｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ．Ｏｌｄ ｗｉｎｅ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｂｏｔｔｌｅ？）Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６；１７：７３５−４９．
１８．Ｋｕｚｎｅｔｓｏｖａ Ｌ、Ｃｈｅｎ Ｊ、Ｓｕｎ Ｌ、Ｗｕ Ｘ、Ｐｅｐｅ Ａ、Ｖｅｉｔｈ ＪＭ、Ｐｅｒａ Ｐ、Ｂｅｒｎａｃｋｉ ＲＪ、Ｏｊｉｍａ Ｉ．有望な抗がん剤としての新規な脂肪酸−第二世代タキソイドコンジュゲートの合成と評価（Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔａｘｏｉｄ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ）．生物有機＆医薬品化学レター２００６（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６）；１６：９７４−７．
１９．Ａｈｍａｄ Ｇ、Ｅｌ Ｓａｄｄａ Ｒ、Ｂｏｔｃｈｋｉｎａ Ｇ、Ｏｊｉｍａ Ｉ、Ｅｇａｎ Ｊ、Ａｍｉｊｉ Ｍ．新規なタキソイドＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４のナノエマルジョン製剤は、前立腺がん幹細胞誘発性腫瘍増殖を阻害する（Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｘｏｉｄ ＤＨＡ−ＳＢＴ−１２１４ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ）．癌レター（Ｃａｎｃｅｒ ｌｅｔｔｅｒ）２０１７；４０６：７１−８０．
２０．Ｃｏｕｚｉｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ Ｊ．２０１３年のブレークスルー（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０１３）．がん免疫療法（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０１３；３４２：１４３２−３．
２１．Ｃｈｅｎ Ｌ．Ｔ細胞免疫の制御下でのＢ７−ＣＤ２８ファミリーの共抑制分子（Ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｂ７−ＣＤ２８ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）．ネイチャーレビューズイミュノロジー２００４（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００４）；４：３３６−４７．
２２．Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ、Ｈａｍｍｅｒｓ Ｈ、Ｌｉｐｓｏｎ ＥＪ．ニボルマブ：抗腫瘍免疫を支持するためのＰＤ−１の標的化（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＤ−１ ｔｏ ｂｏｌｓｔｅｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ ２０１５；１１：１３０７−２６．
２３．Ｂｒａｈｍｅｒ Ｊ、Ｒｅｃｋａｍｐ ＫＬ、Ｂａａｓ Ｐ、Ｃｒｉｎｏ Ｌ、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ ＷＥ、Ｐｏｄｄｕｂｓｋａｙａ Ｅ、Ａｎｔｏｎｉａ Ｓ、Ｐｌｕｚａｎｓｋｉ Ａ、Ｖｏｋｅｓ ＥＥ、Ｈｏｌｇａｄｏ Ｅ、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ Ｄ、Ｒｅａｄｙ Ｎら．進行した扁平上皮細胞非小細胞肺がんにおけるニボルマブ対ドセタキセル（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｖｅｒｓｕｓ Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｑｕａｍｏｕｓ−Ｃｅｌｌ Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ）．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５；３７３：１２３−３５．
２４．Ｌａｒｋｉｎ Ｊ、Ｈｏｄｉ ＦＳ、Ｗｏｌｃｈｏｋ ＪＤ．未処置黒色腫におけるニボルマブとイピリムマブの併用または単剤療法（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ａｎｄ Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｏｒ Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ）．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５；３７３：１２７０−１．
２５．Ｍｏｔｚｅｒ ＲＪ、Ｒｉｎｉ ＢＩ、ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ＤＦ、Ｒｅｄｍａｎ ＢＧ、Ｋｕｚｅｌ ＴＭ、Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＭＲ、Ｖａｉｓｈａｎｐａｙａｎ ＵＮ、Ｄｒａｂｋｉｎ ＨＡ、Ｇｅｏｒｇｅ Ｓ、Ｌｏｇａｎ ＴＦ、Ｍａｒｇｏｌｉｎ ＫＡ、Ｐｌｉｍａｃｋ ＥＲら．転移性腎細胞癌のためのニボルマブ：無作為化第ＩＩ相試験の結果（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ ｆｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｒｅｎａｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩ Ｔｒｉａｌ）．臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の公式ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）２０１５；３３：１４３０−７．
２６．Ｌｉ Ｘ、Ｈｕ Ｗ、Ｚｈｅｎｇ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｃ、Ｄｕ Ｐ、Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｙａｎｇ Ｙ、Ｗｕ Ｊ、Ｊｉ Ｍ、Ｊｉａｎｇ Ｊ、Ｗｕ Ｃ．がん療法のための新たな免疫チェックポイント（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ）．Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ ２０１５；５４：１７０６−１３．
２７．Ｊｉａｎｇ Ｃ、Ｃａｉ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｈ、Ｘｉａ Ｘ、Ｚｈａｎｇ Ｂ、Ｘｉａ Ｌ．難治性固形腫瘍の処置におけるプログラム細胞死−１遮断抗体の活性と免疫相関（Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ａ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ−１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ）．Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２０１８；９：２０５−１２．
２８．Ｘｕ−Ｍｏｎｅｔｔｅ ＺＹ、Ｚｈａｎｇ Ｍ、Ｌｉ Ｊ、Ｙｏｕｎｇ ＫＨ．ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断：抗腫瘍免疫反応を解放する鍵を見つけたか？（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ：Ｈａｖｅ Ｗｅ Ｆｏｕｎｄ ｔｈｅ Ｋｅｙ ｔｏ Ｕｎｌｅａｓｈ ｔｈｅ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ？）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；８：１５９７．
２９．Ｗａｎｇ Ｙ、Ｗｕ Ｌ、Ｔｉａｎ Ｃ、Ｚｈａｎｇ Ｙ．悪性リンパ腫におけるＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１免疫チェックポイント遮断（ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１ ｉｍｍｕｎｅ−ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）．Ａｎｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１７．
３０．Ｔｏｒｐｈｙ ＲＪ、Ｓｃｈｕｌｉｃｋ ＲＤ、Ｚｈｕ Ｙ．新興免疫チェックポイント：将来のがん療法の展望（Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ：Ｐｒｏｍｉｓｅｓ ｆｏｒ Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ ２０１７；１８．
３１．Ｔｈｅｙ Ｌ、Ｍｉｃｈａｕｄ ＨＡ、Ｂｅｃｑｕａｒｔ Ｏ、Ｌａｆｏｎｔ Ｖ、Ｇｕｉｌｌｏｔ Ｂ、Ｂｏｉｓｓｉｅｒｅ−Ｍｉｃｈｏｔ Ｆ、Ｊａｒｌｉｅｒ Ｍ、Ｍｏｌｌｅｖｉ Ｃ、Ｅｌｉａｏｕ ＪＦ、Ｂｏｎｎｅｆｏｙ Ｎ、Ｇｒｏｓ Ｌ．腫瘍エスケープ時のＰＤ−１遮断は黒色腫標的化モノクローナル抗体の免疫媒介抗腫瘍効果を増強する（ＰＤ−１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｔ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｅｓｃａｐｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）．腫瘍免疫学（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２０１７；６：ｅ１３５３８５７．
３２．Ｎｏｍｉ Ｔ、Ｓｈｏ Ｍ、Ａｋａｈｏｒｉ Ｔ、Ｈａｍａｄａ Ｋ、Ｋｕｂｏ Ａ、Ｋａｎｅｈｉｒｏ Ｈ、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｓ、Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｋ、Ｙａｇｉｔａ Ｈ、Ａｚｕｍａ Ｍ、Ｎａｋａｊｉｍａ Ｙ．ヒト膵臓がんにおけるプログラム細胞死−１リガンド／プログラム細胞死−１経路の臨床的意義と治療可能性（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１ ｌｉｇａｎｄ／ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）．臨床癌研究：米国癌学会の公式ジャーナル（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２００７；１３：２１５１−７．
３３．Ｏｋｕｄａｉｒａ Ｋ、Ｈｏｋａｒｉ Ｒ、Ｔｓｕｚｕｋｉ Ｙ、Ｏｋａｄａ Ｙ、Ｋｏｍｏｔｏ Ｓ、Ｗａｔａｎａｂｅ Ｃ、Ｋｕｒｉｈａｒａ Ｃ、Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ａ、Ｎａｇａｏ Ｓ、Ａｚｕｍａ Ｍ、Ｙａｇｉｔａ Ｈ、Ｍｉｕｒａ Ｓ．Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣの遮断はマウス膵臓がんモデルで抗腫瘍効果を誘導する（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｂ７−Ｈ１ ｏｒ Ｂ７−ＤＣ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ）．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ ２００９；３５：７４１−９．
３４．Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ、Ｄｒａｋｅ ＣＧ、Ｗｏｌｌｎｅｒ Ｉ、Ｐｏｗｄｅｒｌｙ ＪＤ、Ｐｉｃｕｓ Ｊ、Ｓｈａｒｆｍａｎ ＷＨ、Ｓｔａｎｋｅｖｉｃｈ Ｅ、Ｐｏｎｓ Ａ、Ｓａｌａｙ ＴＭ、ＭｃＭｉｌｌｅｒ ＴＬ、Ｇｉｌｓｏｎ ＭＭ、Ｗａｎｇ Ｃら．難治性固形腫瘍における単剤抗プログラム細胞死―１（ＭＤＸ−１１０６）の第Ｉ相試験：安全性、臨床活性、薬物動態および免疫学的相関（Ｐｈａｓｅ Ｉ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ａｇｅｎｔ ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１（ＭＤＸ−１１０６）ｉｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ：ｓａｆｅｔｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ）．臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の公式ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）２０１０；２８：３１６７−７５．
３５．Ｂｒａｈｍｅｒ ＪＲ、Ｔｙｋｏｄｉ ＳＳ、Ｃｈｏｗ ＬＱ、Ｈｗｕ ＷＪ、Ｔｏｐａｌｉａｎ ＳＬ、Ｈｗｕ Ｐ、Ｄｒａｋｅ ＣＧ、Ｃａｍａｃｈｏ ＬＨ、Ｋａｕｈ Ｊ、Ｏｄｕｎｓｉ Ｋ、Ｐｉｔｏｔ ＨＣ、Ｈａｍｉｄ Ｏら．進行がん患者における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の安全性および活性（Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｃａｎｃｅｒ）．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２；３６６：２４５５−６５．
３６．Ｌｅ ＤＴ、Ｌｕｔｚ Ｅ、Ｕｒａｍ ＪＮ、Ｓｕｇａｒ ＥＡ、Ｏｎｎｅｒｓ Ｂ、Ｓｏｌｔ Ｓ、Ｚｈｅｎｇ Ｌ、Ｄｉａｚ ＬＡ，Ｊｒ．、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ ＲＣ、Ｊａｆｆｅｅ ＥＭ、Ｌａｈｅｒｕ ＤＡ．以前処置された膵臓がんにおけるＧＭ−ＣＳＦ遺伝子でトランスフェクトされた同種膵臓腫瘍細胞と組み合わせたイピリムマブの評価（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ＧＭ−ＣＳＦ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ２０１３；３６：３８２−９．
３７．Ｌｕｔｚ ＥＲ、Ｗｕ ＡＡ、Ｂｉｇｅｌｏｗ Ｅ、Ｓｈａｒｍａ Ｒ、Ｍｏ Ｇ、Ｓｏａｒｅｓ Ｋ、Ｓｏｌｔ Ｓ、Ｄｏｒｍａｎ Ａ、Ｗａｍｗｅａ Ａ、Ｙａｇｅｒ Ａ、Ｌａｈｅｒｕ Ｄ、Ｗｏｌｆｇａｎｇ ＣＬら．免疫療法は非免疫原性膵臓腫瘍を免疫調節の免疫原性病巣に変換する（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｃｏｎｖｅｒｔｓ ｎｏｎｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｆｏｃｉ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ２０１４；２：６１６−３１．
３８．Ｚｈａｎｇ Ｐ、Ｓｕ ＤＭ、Ｌｉａｎｇ Ｍ、Ｆｕ Ｊ．化学予防剤は、乳がん細胞でプログラム細胞死−１−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）表面発現を誘導し、ＰＤ−Ｌ１媒介Ｔ細胞アポトーシスを促進する（Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１−ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ−Ｌ１）ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ＰＤ−Ｌ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；４５：１４７０−６．
３９．Ｇｈｅｂｅｈ Ｈ、Ｌｅｈｅ Ｃ、Ｂａｒｈｏｕｓｈ Ｅ、Ａｌ−Ｒｏｍａｉｈ Ｋ、Ｔｕｌｂａｈ Ａ、Ａｌ−Ａｌｗａｎ Ｍ、Ｈｅｎｄｒａｙａｎｉ ＳＦ、Ｍａｎｏｇａｒａｎ Ｐ、Ａｌａｉｙａ Ａ、Ａｌ−Ｔｗｅｉｇｅｒｉ Ｔ、Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａ Ａ、Ｄｅｒｍｉｍｅ Ｓ．ドキソルビシンは、乳がん細胞において細胞表面Ｂ７−Ｈ１発現を下方制御し、その核発現を上方制御する：抗アポトーシス分子としてのＢ７−Ｈ１の役割（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ Ｂ７−Ｈ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂ７−Ｈ１ ａｓ ａｎ ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）．乳がん研究（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）：ＢＣＲ ２０１０；１２：Ｒ４８．
４０．Ｇｏｎｇ Ｗ、Ｓｏｎｇ Ｑ、Ｌｕ Ｘ、Ｇｏｎｇ Ｗ、Ｚｈａｏ Ｊ、Ｍｉｎ Ｐ、Ｙｉ Ｘ．パクリタキセルはＭＡＰＫ経路を介してがん細胞でＢ７−Ｈ１発現を誘導した（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂ７−Ｈ１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｈｅ ＭＡＰＫ ｐａｔｈｗａｙ）．Ｊ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ２０１１；２３：２９５−９．
４１．Ｐｅｎｇ Ｊ、Ｈａｍａｎｉｓｈｉ Ｊ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｎ、Ａｂｉｋｏ Ｋ、Ｍｕｒａｔ Ｋ、Ｂａｂａ Ｔ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｋ、Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｎ、Ｈｏｓｏｅ Ｙ、Ｍｕｒｐｈｙ ＳＫ、Ｋｏｎｉｓｈｉ Ｉ、Ｍａｎｄａｉ Ｍ．化学療法は、卵巣がんで核内因子κＢを介してプログラム細胞死―リガンド１の過剰発現を誘導して、免疫抑制腫瘍微小環境を促進する（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ １ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｉａ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ ｔｏ Ｆｏｓｔｅｒ ａｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｎｃｅｒ）．癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０１５；７５：５０３４−４５．
４２．Ｏｊｉｍａ Ｉ、Ｗａｎｇ Ｔ、Ｍｉｌｌｅｒ ＭＬ、Ｌｉｎ Ｓ、Ｂｏｒｅｌｌａ ＣＰ、Ｇｅｎｇ Ｘ、Ｐｅｒａ Ｐ、Ｂｅｒｎａｃｋｉ ＲＪ．新たな第二世代タキソイドの合成と構造−活性関係（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｎｅｗ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｔａｘｏｉｄｓ）．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ １９９９；９：３４２３−８．
４３．Ｏｊｉｍａ Ｉ、Ｓｌａｔｅｒ ＪＣ、Ｍｉｃｈａｕｄ Ｅ、Ｋｕｄｕｋ ＳＤ、Ｂｏｕｎａｕｄ ＰＹ、Ｖｒｉｇｎａｕｄ Ｐ、Ｂｉｓｓｅｒｙ ＭＣ、Ｖｅｉｔｈ ＪＭ、Ｐｅｒａ Ｐ、Ｂｅｒｎａｃｋｉ ＲＪ．第二世代抗腫瘍タキソイドの合成と構造−活性関係：薬剤耐性がん細胞に対する例外的な活性（Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｔａｘｏｉｄｓ：ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ）．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９６；３９：３８８９−９６．
４４．Ｓｈａｈ Ｌ、Ｇａｔｔａｃｃｅｃａ Ｆ、Ａｍｉｊｉ ＭＭ．ナノサイズの水中油型エマルジョン製剤で投与されたＤＡＬＤＡ鎮痛ペプチド類似体のＣＮＳ送達および薬物動態学的評価（ＣＮＳ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＡＬＤＡ ａｎａｌｇｅｓｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｉｎ Ｎａｎｏ−ｓｉｚｅｄ ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）．製薬研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０１４；３１：１３１５−２４．
４５．Ｋａｄａｋｉａ Ｅ、Ｓｈａｈ Ｌ、Ａｍｉｊｉ ＭＭ．細胞バリアを通るナノエマルジョンベースの薬物輸送の数学的モデリングと実験的検証（Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｒｏｓｓ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂａｒｒｉｅｒｓ）．製薬研究（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０１７；３４：１４１６−２７．
４６．Ｇａｎｔａ Ｓ、Ｓｉｎｇｈ Ａ、Ｒａｗａｌ Ｙ、Ｃａｃａｃｃｉｏ Ｊ、Ｐａｔｅｌ ＮＲ、Ｋｕｌｋａｒｎｉ Ｐ、Ｆｅｒｒｉｓ ＣＦ、Ａｍｉｊｉ ＭＭ、Ｃｏｌｅｍａｎ ＴＰ．卵巣がんの多剤耐性を克服するためのドセタキセルの新規な標的化セラノスティックナノエマルジョンの製剤開発（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ ｏｆ ｄｏｃｅｔａｘｅｌ ｔｏ ｏｖｅｒｃｏｍｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ ２０１６；２３：９６８−８０．
４７．Ｍｏｒｉｋａｎｅ Ｋ、Ｔｅｍｐｅｒｏ ＲＭ、Ｓｉｖｉｎｓｋｉ ＣＬ、Ｎｏｍｏｔｏ Ｍ、Ｖａｎ Ｌｉｔｈ ＭＬ、Ｍｕｔｏ Ｔ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ＭＡ．臓器特異的膵臓腫瘍増殖特性と腫瘍免疫（Ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）１９９９；４７：２８７−９６．
４８．Ｓａｒｋｅｒ ＤＫ．薬物送達のためのナノエマルジョンの設計（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）．現在の薬物送達（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）２００５；２：２９７−３１０．
４９．Ｍａｕｄｅ ＳＬ、Ｆｒｅｙ Ｎ、Ｓｈａｗ ＰＡ、Ａｐｌｅｎｃ Ｒ、Ｂａｒｒｅｔｔ ＤＭ、Ｂｕｎｉｎ ＮＪ、Ｃｈｅｗ Ａ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＶＥ、Ｚｈｅｎｇ Ｚ、Ｌａｃｅｙ ＳＦ、Ｍａｈｎｋｅ ＹＤ、Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ ＪＪら．白血病における持続的寛解のためのキメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ）．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７１：１５０７−１７．
５０．Ｒｏｗｉｎｓｋｙ ＥＫ．タキサンクラスの抗微小管化学療法剤の開発と臨床的有用性（Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｘａｎｅ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇｅｎｔｓ）．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ １９９７；４８：３５３−７４．
５１．ＭｃＧｕｉｒｅ ＷＰ、Ｒｏｗｉｎｓｋｙ ＥＫ、Ｒｏｓｅｎｓｈｅｉｎ ＮＢ、Ｇｒｕｍｂｉｎｅ ＦＣ、Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ＤＳ、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ＤＫ、Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ ＲＣ．タキソール：進行した卵巣上皮新生物で有意な活性を有するユニークな抗新生物剤（Ｔａｘｏｌ：ａ ｕｎｉｑｕｅ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｏｖａｒｉａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）．Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １９８９；１１１：２７３−９．
５２．Ｓｃｈｉｆｆ ＰＢ、Ｈｏｒｗｉｔｚ ＳＢ．タキソールはマウス線維芽細胞の微小管を安定化する（Ｔａｘｏｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９８０；７７：１５６１−５．
５３．Ｊｏｒｄａｎ ＭＡ、Ｔｏｓｏ ＲＪ、Ｔｈｒｏｗｅｒ Ｄ、Ｗｉｌｓｏｎ Ｌ．低濃度のタキソールによる有糸分裂ブロックおよび細胞増殖の阻害の機構（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｍｉｔｏｔｉｃ ｂｌｏｃｋ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔａｘｏｌ ａｔ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９３；９０：９５５２−６．
５４．Ｍａｅｄａ Ｈ、Ｗｕ Ｊ、Ｓａｗａ Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ Ｙ、Ｈｏｒｉ Ｋ．高分子治療薬における腫瘍血管透過性とＥＰＲ効果：レビュー（Ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｒ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ＥＰＲ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ）．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０００；６５：２７１−８４．
５５．Ｒｏｓｓｉ Ｊ、Ｇｉａｓｓｏｎ Ｓ、Ｋｈａｌｉｄ ＭＮ、Ｄｅｌｍａｓ Ｐ、Ａｌｌｅｎ Ｃ、Ｌｅｒｏｕｘ ＪＣ．固形腫瘍を標的とする長期循環ポリ（エチレングリコール）コーティングエマルジョン（Ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｃｏａｔｅｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）．Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ ２００７；６７：３２９−３８．
５６．Ｂｏｃｃｉ Ｇ、Ｄａｎｅｓｉ Ｒ、Ｄｉ Ｐａｏｌｏ ＡＤ、Ｉｎｎｏｃｅｎｔｉ Ｆ、Ａｌｌｅｇｒｉｎｉ Ｇ、Ｆａｌｃｏｎｅ Ａ、Ｍｅｌｏｓｉ Ａ、Ｂａｔｔｉｓｔｏｎｉ Ｍ、Ｂａｒｓａｎｔｉ Ｇ、Ｃｏｎｔｅ ＰＦ、Ｄｅｌ Ｔａｃｃａ Ｍ．がん患者における従来のおよび減量された試験投与後の５−フルオロウラシルとその主要代謝物５−フルオロ−５，６−ジヒドロウラシルの比較薬物動態分析（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｎｄ ｉｔｓ ｍａｊｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ５−ｆｌｕｏｒｏ−５，６−ｄｉｈｙｄｒｏｕｒａｃｉｌ ａｆｔｅｒ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｅｓｔ ｄｏｓｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ）．臨床癌研究：米国癌学会の公式ジャーナル（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０００；６：３０３２−７．
５７．Ｋｒｏｅｐ ＪＲ、Ｇｉａｃｃｏｎｅ Ｇ、Ｖｏｏｒｎ ＤＡ、Ｓｍｉｔ ＥＦ、Ｂｅｉｊｎｅｎ ＪＨ、Ｒｏｓｉｎｇ Ｈ、ｖａｎ Ｍｏｏｒｓｅｌ ＣＪ、ｖａｎ Ｇｒｏｅｎｉｎｇｅｎ ＣＪ、Ｐｏｓｔｍｕｓ ＰＥ、Ｐｉｎｅｄｏ ＨＭ、Ｐｅｔｅｒｓ ＧＪ．ゲムシタビンおよびパクリタキセル：非小細胞肺がん患者における薬物動態学的および薬力学的相互作用（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ａｎｄ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）．臨床腫瘍学ジャーナル：米国臨床腫瘍学会の公式ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）１９９９；１７：２１９０−７．
５８．Ｓａｋａｉ Ｈ、Ｋｏｋｕｒａ Ｓ、Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｔ、Ｔｓｕｃｈｉｙａ Ｒ、Ｏｋａｊｉｍａ Ｍ、Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｔ、Ａｄａｃｈｉ Ｓ、Ｋａｔａｄａ Ｋ、Ｋａｍａｄａ Ｋ、Ｕｃｈｉｙａｍａ Ｋ、Ｈａｎｄａ Ｏ、Ｔａｋａｇｉ Ｔら．末梢血単核細胞の細胞生存率、増殖活性およびサイトカイン産生に対する抗がん剤の効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｕｔｒ ２０１３；５２：６４−７１．
５９．Ｏｋｉｎｏ Ｈ、Ｍａｅｙａｍａ Ｒ、Ｍａｎａｂｅ Ｔ、Ｍａｔｓｕｄａ Ｔ、Ｔａｎａｋａ Ｍ．光硬化ゼラチンゲルからのゲムシタビンのトランス組織徐放はヌードマウスにおける異所性ヒト膵臓腫瘍の増殖を阻害する（Ｔｒａｎｓ−ｔｉｓｓｕｅ，ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ ｆｒｏｍ ｐｈｏｔｏｃｕｒｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｇｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｔｏｐｉｃ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ）．臨床癌研究：米国癌学会の公式ジャーナル（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２００３；９：５７８６−９３．
６０．Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．がん免疫療法における免疫チェックポイントの遮断（Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）．ネイチャーレビューズキャンサー（Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ）２０１２；１２：２５２−６４．
６１．Ｆｒｅｅｍａｎ ＧＪ、Ｌｏｎｇ ＡＪ、Ｉｗａｉ Ｙ、Ｂｏｕｒｑｕｅ Ｋ、Ｃｈｅｒｎｏｖａ Ｔ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ、Ｆｉｔｚ ＬＪ、Ｍａｌｅｎｋｏｖｉｃｈ Ｎ、Ｏｋａｚａｋｉ Ｔ、Ｂｙｒｎｅ ＭＣ、Ｈｏｒｔｏｎ ＨＦ、Ｆｏｕｓｅｒ Ｌら．新規なＢ７ファミリーメンバーによるＰＤ−１免疫抑制受容体の会合はリンパ球活性化の負の調節をもたらす（Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＰＤ−１ ｉｍｍｕｎｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ａ ｎｏｖｅｌ Ｂ７ ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０００；１９２：１０２７−３４．
６２．Ｌａｔｃｈｍａｎ Ｙ、Ｗｏｏｄ ＣＲ、Ｃｈｅｒｎｏｖａ Ｔ、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ Ｄ、Ｂｏｒｄｅ Ｍ、Ｃｈｅｒｎｏｖａ Ｉ、Ｉｗａｉ Ｙ、Ｌｏｎｇ ＡＪ、Ｂｒｏｗｎ ＪＡ、Ｎｕｎｅｓ Ｒ、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ＥＡ、Ｂｏｕｒｑｕｅ Ｋら．ＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１の第２のリガンドであり、Ｔ細胞活性化を阻害する（ＰＤ−Ｌ２ ｉｓ ａ ｓｅｃｏｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＰＤ−１ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；２：２６１−８．
６３．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ、Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ＰＤ−１：末梢性免疫寛容に関与する抑制性免疫受容体（ＰＤ−１：ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；２２：２６５−８．
６４．Ｏｋａｚａｋｉ Ｔ、Ｍａｅｄａ Ａ、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｈ、Ｋｕｒｏｓａｋｉ Ｔ、Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ＰＤ−１免疫受容体は、ｓｒｃ相同性２ドメイン含有チロシンホスファターゼ２をホスホチロシンに動員することによって、Ｂ細胞受容体媒介シグナル伝達を阻害する（ＰＤ−１ ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２ ｔｏ ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２００１；９８：１３８６６−７１．
６５．Ｉｗａｉ Ｙ、Ｔｅｒａｗａｋｉ Ｓ、Ｈｏｎｊｏ Ｔ．ＰＤ−１遮断はエフェクターＴ細胞の動員の強化によって免疫原性の低い腫瘍細胞の血行性拡散を阻害する（ＰＤ−１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｈｅｍａｔｏｇｅｎｏｕｓ ｓｐｒｅａｄ ｏｆ ｐｏｏｒｌｙ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ）．Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００５；１７：１３３−４４．
６６．Ｄｏｎｇ Ｈ、Ｓｔｒｏｍｅ ＳＥ、Ｓａｌｏｍａｏ ＤＲ、Ｔａｍｕｒａ Ｈ、Ｈｉｒａｎｏ Ｆ、Ｆｌｉｅｓ ＤＢ、Ｒｏｃｈｅ ＰＣ、Ｌｕ Ｊ、Ｚｈｕ Ｇ、Ｔａｍａｄａ Ｋ、Ｌｅｎｎｏｎ ＶＡ、Ｃｅｌｉｓ Ｅら．腫瘍関連Ｂ７−Ｈ１はＴ細胞アポトーシスを促進する：免疫回避の潜在的な機構（Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｂ７−Ｈ１ ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ）．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００２；８：７９３−８００．
６７．Ｈｉｒａｎｏ Ｆ、Ｋａｎｅｋｏ Ｋ、Ｔａｍｕｒａ Ｈ、Ｄｏｎｇ Ｈ、Ｗａｎｇ Ｓ、Ｉｃｈｉｋａｗａ Ｍ、Ｒｉｅｔｚ Ｃ、Ｆｌｉｅｓ ＤＢ、Ｌａｕ ＪＳ、Ｚｈｕ Ｇ、Ｔａｍａｄａ Ｋ、Ｃｈｅｎ Ｌ．モノクローナル抗体によるＢ７−Ｈ１およびＰＤ−１の遮断はがん治療免疫を増強する（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ Ｂ７−Ｈ１ ａｎｄ ＰＤ−１ ｂｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）．癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）２００５；６５：１０８９−９６．
６８．Ｌｕｋｅｎｓ ＪＲ、Ｃｒｕｉｓｅ ＭＷ、Ｌａｓｓｅｎ ＭＧ、Ｈａｈｎ ＹＳ．ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１相互作用の遮断はＣ型肝炎ウイルスコアマウスモデルにおいてエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞応答を回復する（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＰＤ−１／Ｂ７−Ｈ１ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｃｏｒｅ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ）．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８；１８０：４８７５−８４．
６９．Ｇｕｉｄｕｃｃｉ Ｃ、Ｖｉｃａｒｉ ＡＰ、Ｓａｎｇａｌｅｔｔｉ Ｓ、Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ Ｇ、Ｃｏｌｏｍｂｏ ＭＰ．インビボ誘発腫瘍浸潤マクロファージおよび樹状細胞の腫瘍拒絶への方向変換（Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）．癌研究（Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ）２００５；６５：３４３７−４６．

【配列表フリーテキスト】

【0114】

配列表１ ＜２２３＞順方向プライマー マウスＰＤ−Ｌ１
配列表２ ＜２２３＞逆方向プライマー マウスＰＤ−Ｌ１
配列表３ ＜２２３＞順方向プライマー マウスＰＤ−１
配列表４ ＜２２３＞逆方向プライマー マウスＰＤ−１
配列表５ ＜２２３＞順方向プライマー ＣＤ４
配列表６ ＜２２３＞逆方向プライマー ＣＤ４
配列表７ ＜２２３＞順方向プライマー マウスＣＤ８
配列表８ ＜２２３＞逆方向プライマー マウスＣＤ８
配列表９ ＜２２３＞順方向プライマー マウスＡｒｇｉｎａｓｅ−１
配列表１０ ＜２２３＞逆方向プライマー マウスＡｒｇｉｎａｓｅ−１
配列表１１ ＜２２３＞順方向プライマー マウスβ−アクチン
配列表１２ ＜２２３＞逆方向プライマー マウスβ−アクチン

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A-10J】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図18G】

【図18H】

【図18I】

【図18J】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図19G】

【図19H】

【図19I】

【図19J】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図20E】

【図20F】

【図20G】

【図20H】

【図20I】

【図20J】

【図21A】

【図21B】

【図21C】

【図21D】

【図21E】

【図21F】

【図21G】

【図21H】

【図21I】

【図21J】

【配列表】

2021517906000001.app

【国際調査報告】