特表 2021-517972 新規の免疫グロブリンＥのエピトープ、それと結合する抗体および前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-517972(P2021-517972A)

(43)【公表日】2021年7月29日

(54)【発明の名称】新規の免疫グロブリンＥのエピトープ、それと結合する抗体および前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20210702BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20210702BHJP

   C07K 16/42 20060101ALI20210702BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20210702BHJP

   C07K 7/08 20060101ALI20210702BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 N

   G01N33/53 Q

   G01N33/543 521

   C07K16/42ZNA

   C07K16/00

   C07K7/08

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2021-503687(P2021-503687)

(86)(22)【出願日】2019年4月5日

(85)【翻訳文提出日】2020年10月6日

(86)【国際出願番号】KR2019004104

(87)【国際公開番号】WO2019194656

(87)【国際公開日】20191010

(31)【優先権主張番号】10-2018-0040605

(32)【優先日】2018年4月6日

(33)【優先権主張国】KR

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT,TZ

(71)【出願人】

【識別番号】520170911

【氏名又は名称】エスエルエスバイオ・カンパニー・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100121728

【弁理士】

【氏名又は名称】井関 勝守

(74)【代理人】

【識別番号】100165803

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 修平

(74)【代理人】

【識別番号】100170900

【弁理士】

【氏名又は名称】大西 渉

(72)【発明者】

【氏名】ギム ボンフィ

(72)【発明者】

【氏名】バク ウンヨン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン ハギョン

(72)【発明者】

【氏名】ホン グァンウォン

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045AA30

4H045AA40

4H045BA10

4H045BA16

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA86

4H045EA50

4H045FA71

(57)【要約】

新規の免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ：ＩｇＥ）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）である配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドと、前記ペプチドに結合する抗免疫グロブリンＥ抗体に関し、前記ペプチドおよび抗体をアレルギー疾患の診断または治療剤の研究等に活用することができる。また、前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキットおよび前記キットを用いたアレルギー疾患の診断方法に関し、韓国人において発生頻度の高い代表的な吸入性、食物アレルギーの有無を定性分析することが可能であり、採血後に短時間内にアレルギーを診断することができる。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ：ＩｇＥ）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）である配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載のペプチドに結合する抗免疫グロブリンＥ抗体。

【請求項3】

請求項２に記載の抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキット。

【請求項4】

担体または希釈剤をさらに含むものである、請求項３に記載のキット。

【請求項5】

前記試料は、個体をアレルゲンと接触させた後、個体から分離した生物学的試料である、請求項３に記載のキット。

【請求項6】

前記試料は、接触後１０分〜４０分に分離したものである、請求項５に記載のキット。

【請求項7】

前記キットは、アレルゲンおよび前記抗体がコーティングされたメンブレンを含むものである、請求項３に記載のキット。

【請求項8】

前記アレルゲンは、チリダニ、ホソムギ、オーク、ヨモギ、カナムグラ、ニンニク、豚肉、マグロ、かび、犬、ゴマ、ピーナッツ、牛肉、ハルガヤ、エビ、りんご、猫、ハンノキ、シラカンバ、大豆、クルミ、マダラ、カモガヤ、牛乳、桃、ジャガイモ、ブタクサ、卵白、小麦、カニ、麦、ヨシ、ゴキブリ、ソバおよびイエダニよりなる群から選ばれるいずれか1つ以上である、請求項７に記載のキット。

【請求項9】

前記メンブレンは、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフルオリン化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ガラスおよびプラスチックよりなる群から選ばれるものである、請求項７に記載のキット。

【請求項10】

前記キットは、免疫クロマトグラフィー分析用である、請求項３に記載のキット。

【請求項11】

請求項３に記載のキットと、検体滴下部と、を含むアレルギーの診断または予後予測用デバイス。

【請求項12】

個体の血液を採取して検体希釈液に混合する段階と、
前記希釈液を検体滴下部に滴下（ｄｒｏｐ）して反応させる段階と、を含むアレルギー疾患の診断方法。

【請求項13】

前記反応は、１０〜４０分間行われる、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記血液の体積は、０．５ｍｌ〜２ｍｌである、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記血液は、血しょうまたは血清である、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記血しょうまたは血清の体積は、０．１ｍｌ〜１ｍｌである、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

新規の免疫グロブリンＥのエピトープ、それと結合する抗体および前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

生物体が或る外来性物質と接することになると、抗原−抗体反応により生体内に急激かつ過敏な変化が起こるが、これをアレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）といい、これを起こす外来性物質をアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）という。様々なタイプのアレルギー反応のうち免疫グロブリンＥ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ；ＩｇＥ）が関与するアレルギーを１型アレルギーという。

【0003】

１型アレルギーは、マスト細胞（ｍａｓｔ ｃｅｌｌ）や好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）の表面に付いている免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）にアレルゲンが付くと、マスト細胞や好塩基球が刺激されて過敏反応を起こす化合物を放出することによって起こる。一般的に、アレルギー症状は、喘息（ａｓｔｍａ）、湿疹（ｅｃｚｅｍａ）、じんましん（ｈｉｖｅｓ）、皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、鼻炎（ｒｈｉｎｉｔｉｓ）等を含む。

【0004】

全体ＩｇＥ抗体およびアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、アレルギーがある個人の血液で増加しうるので、血清中総ＩｇＥ濃度あるいはアレルゲン特異的ＩｇＥ濃度の測定は、典型的なアレルギー反応による症状とアレルギーと類似した疾病を区分するのに有用な検査として使用されている。一般的に、出生時の臍帯血内総ＩｇＥ抗体の濃度は、１ＩＵ／ｍｌ（２．４ｎｇ＝１ＩＵ）程度であり、年を取るにつれて次第に増加して、成人の場合、たいてい８３．３ＩＵ／ｍｌ（２００ｎｇ／ｍｌ）以下に維持される。

【0005】

特異的なアレルギー抗原の識別は、疾病を追跡するための情報を提供し、アレルギー抗原は、ダニ、花粉、動物の上皮細胞と多様な食物を含む。血清中のＩｇＥ抗体の測定がアレルギー患者の治療に有用な臨床情報を提供することができる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

一態様は、免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ：ＩｇＥ）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）である配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。

【0007】

他の態様は、前記ペプチドに結合する抗免疫グロブリンＥ抗体を提供する。

【0008】

さらに他の態様は、前記抗体を含む試料のうち免疫グロブリンＥを分析するためのキットを提供する。

【0009】

さらに他の態様は、前記キットと、検体滴下部とを含むアレルギーの診断または予後予測用デバイスを提供する。

【0010】

他の態様は、個体の血液を採取して検体希釈液に混合する段階、前記希釈液を検体滴下部に滴下（ｄｒｏｐ）して反応させる段階とを含むアレルギー疾患の診断方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

一態様は、免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ：ＩｇＥ）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）である配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。

【0012】

前記エピトープは、免疫原性を増加させる物質または担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と接合されたものであり得、前記免疫原性を増加させる物質または担体は、例えば、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）であり得る。

【0013】

前記ペプチドは、免疫グロブリンＥのアミノ酸配列の一部のアミノ酸配列からなり得、免疫グロブリンＥのエピトープ、すなわち抗体の結合部位として用いられる。前記ペプチドは、前記抗免疫グロブリンＥと結合時にその結合力に優れている。

【0014】

前記免疫グロブリンＥのエピトープのアミノ酸配列は、１２個〜１５個のアミノ酸配列からなるペプチドであり得、より具体的に、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。

【0015】

前記用語「ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、アミド結合またはペプチド結合で連結された２つ以上のアミノ酸からなるポリマーを意味する。前記ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列からなり得る。前記配列番号３のアミノ酸配列とそれぞれ約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９２％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含むことができる。

【0016】

また、さらに良好な化学的安定性、強化された薬理特性（半減期、吸収性、力価、効能等）、変更された特異性（例えば、広範囲な生物学的活性スペクトル）、減少した抗原性を獲得するために、前記ペプチドのＮ−またはＣ−末端に保護基が結合されていてもよい。前記保護基は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得るが、ペプチドの改質、特にペプチドの安定性を増進させることができる成分であれば、制限されることなく含まれ得る。

【0017】

前記用語「安定性」は、生体内タンパク質分解酵素の攻撃から前記ペプチドを保護するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）をも意味するものであり得る。

【0018】

なお、前記ペプチドは、標的化配列、タグ（ｔａｇ）、標識された残基のための特定目的で製造されたアミノ酸配列をも追加的に含むことができる。

【0019】

前記用語「相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、野生型アミノ酸配列との類似性の程度を示すためのものであって、このような相同性の比較は、当業界において広く知られた比較プログラムを用いて行うことができ、２つ以上の配列間相同性を百分率（％）で計算することができる。

【0020】

前記ペプチドは、天然に由来するものであってもよく、当該分野において広く公知となった多様なペプチド合成方法で獲得することができる。一例として、ポリヌクレオチド組換えとタンパク質発現システムを用いて製造したり、ペプチド合成のような化学的合成を通じて試験管内で合成する方法および無細胞タンパク質合成法等で製造することができる。また、一例として、前記ペプチドは、ポリペプチド、植物由来組織や細胞の抽出物、微生物（例えば細菌類または真菌類、そして特に酵母）の培養により得られた生産物であってもよく、具体的には、免疫グロブリンＥに由来するものであってもよく、より具体的に、免疫グロブリンＥのアミノ酸配列の一部であってもよい。

【0021】

また、一態様は、前記エピトープをコードする遺伝子を提供し、前記遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドをコードする。

【0022】

また、一態様は、前記エピトープをコードする遺伝子を含むベクターを提供する。

【0023】

前記ベクターは、宿主に導入されて宿主が前記遺伝子を発現させるのに使用され得、これによって、前記ペプチドを製造するのに使用され得る。また、前記ベクターは、当該分野において公知となった発現ベクターに前記遺伝子が導入されたものであり得る。

【0024】

前記ベクターは、プロモーター、信号配列をコードするヌクレオチド配列と発現調節配列が連結されたベクターであり得、前記ベクターは、ベクターが導入された宿主の選別のために抗生剤抵抗性マーカーを含むことができ、これは、ベクターに内在したものであるか、外部から導入されたものであり得る。

【0025】

他の態様は、前記ペプチドに結合する抗免疫グロブリンＥ抗体を提供する。

【0026】

前記抗体は、前記ペプチドをエピトープと認識して当該部分に結合することができて、免疫グロブリンＥに特異的に結合することができる。前記抗体は、前記ペプチドとの結合力に優れていると共に、免疫グロブリンＥとの結合力も優れている。前記抗体は、公知の抗体製造方法で製造され得、具体的には、多クローン抗体または単クローン抗体を生成する細胞等から製造され得る。

【0027】

さらに他の態様は、個体に試料を接触させた後、１０分〜４０分以内にアレルゲン（ａｌｌｅｒｇｅｎ）特異免疫グロブリンＥ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ、ＩｇＥ）の定性分析が可能なアレルギー疾患の診断または予後分析用キットであって、前記抗体を含むキットを提供する。

【0028】

前記キットは、アレルゲンおよび前記抗体がコーティングされたメンブレンを含むことができる。具体的に、前記アレルゲンは、韓国人において発生頻度の高い代表的な吸入性または食物アレルギーであり得る。例えば、チリダニ、ホソムギ、オーク、ヨモギ、カナムグラ、ニンニク、豚肉、マグロ、かび、犬、ゴマ、ピーナッツ、牛肉、ハルガヤ、エビ、りんご、猫、ハンノキ、シラカンバ、大豆、クルミ、マダラ、カモガヤ、牛乳、桃、ジャガイモ、ブタクサ、卵白、小麦、カニ、麦、ヨシ、ゴキブリ、ソバまたはイエダニ等であり得る。前記抗体は、前述した通りである。

【0029】

前記メンブレンは、マーカーを含むことができる素材であり得、例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフルオリン化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ガラスまたはプラスチック等であり得る。

【0030】

また、一具体例によるキットは、免疫クロマトグラフィー分析用であり得る。具体的に、前記キットは、免疫クロマトグラフィー法を原理として検査線部位にそれぞれのアレルゲンを固定（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させたニトロセルロースメンブレン上にヒト血清または血しょうを展開させてアレルゲンに対する特定ＩｇＥ抗体の存在有無を検査するものであり得る。

【0031】

前記用語「免疫クロマトグラフィー法（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｓｓａｙ；ＩＣＡ）」とは、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）と薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）技術を応用した検査方法であって、抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）に対する抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）の特異的な反応性、コロイダルゴールドの発色特性および流動性、多孔性ニトロセルロースメンブレン上での毛細管力（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｆｏｒｃｅ）による検体および分子の移動を応用したものである。

【0032】

すなわち、一具体例によるキットは、アレルゲンに対する特定ＩｇＥ抗体が含まれた検体と抗ＩｇＥゴールドコンジュゲートを先に反応させた後、検査線部位には、アレルゲンを固定（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、対照線部位には、マウスＩｇＧを固定させた多孔性ニトロセルロースメンブレン上で検体を展開させる。メンブレンに沿って移動する抗原（検体）−抗ＩｇＥ抗体ゴールド複合体のうちメンブレン上に固定させたそれぞれのアレルゲンに対する特定ＩｇＥ抗体が検体内に存在する場合、ゴールド抗原−抗体複合体は、それぞれのアレルゲンが固定された部位を通過することになるので、該当位置で赤紫色バンドを形成し、また、対照線部位では、ヤギ抗マウスＩｇＧゴールドコンジュゲートがマウスＩｇＧと抗原−抗体反応により捕獲されるので、対照線は常に発色されるように構成され得る。

【0033】

さらに他の態様は、前記キットと、検体滴下部とを含むアレルギーの診断または予後予測用デバイスを提供する。前記キットの具体的な内容は、前述した通りである。

【0034】

前記検体滴下部は、展開溶液が含まれるものであり得、前記展開溶液は、例えば、ウシ血清アルブミン、ヤギ血清、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ポリソルベート２０、アジ化ナトリウム、３次蒸留水、プロクリン３００、トリアミノメタンまたはその混合溶液であり得る。

【0035】

さらに他の態様は、個体の血液を採取して検体希釈液に混合する段階と、前記希釈液を検体滴下部に滴下（ｄｒｏｐ）して１０〜４０分間反応させる段階とを含むアレルギー疾患の診断方法を提供する。

【0036】

一具体例による方法は、個体の血液を採取して検体希釈液に混合する段階を含む。前記血液は、公知の方法で採取することができ、希釈液に混合する血液の体積は、０．５ｍｌ〜２ｍｌであり得る。例えば、０．５ｍｌ〜１．８ｍｌ、０．５ｍｌ〜１．５ｍｌ、０．７ｍｌ〜２ｍｌ、０．７ｍｌ〜１．５ｍｌ、０．８ｍｌ〜１．４ｍｌ、または１ｍｌ〜１．５ｍｌであり得る。この際、血液の体積が前記範囲未満である場合、抗原−抗体反応が十分に起こらないので、診断の正確度が落ちることがあるという問題点がある。前記検体希釈液は、検体を２倍〜６４倍希釈したものであり得、例えば、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍または６４倍に希釈したものであり得る。

【0037】

一具体例による方法は、前記血液は、血しょうまたは血清であり得る。前記検体希釈液に血しょうまたは血清を混合する場合、前記血しょうまたは血清の体積は、０．１ｍｌ〜１ｍｌであり得る。例えば、０．１ｍｌ〜１ｍｌ、０．１ｍｌ〜０．９ｍｌ、０．１ｍｌ〜０．８ｍｌ、０．２ｍｌ〜１ｍｌ、または０．２ｍｌ〜０．８ｍｌであり得る。この際、血しょうまたは血清の体積が前記範囲未満である場合、抗原−抗体反応が十分に起こらないので、診断の正確度が落ちることがあるという問題点がある。

【0038】

一具体例による方法は、前記希釈液を検体滴下部に滴下して１０〜４０分間反応させる段階を含む。具体的に、前記希釈液をスポイトを用いて検体滴下部に１〜５滴滴下（ｄｒｏｐ）することができ、例えば、１〜５滴、１〜４滴、２〜５滴、または２〜４滴滴下することができる。以後、１０〜４０分間反応させるが、例えば、１０〜４０分、１０〜３５分、１０〜３０分、１５〜４０分、１５〜３５分、または１５〜３０分間反応させることができる。この際、反応時間が前記範囲未満である場合、検体希釈液が検体滴下部のＩｇＥと十分に反応できないという問題点がある。

【0039】

一具体例による方法は、前記反応が完了したデバイスに結果確認用カードを用いて各アレルゲン特異抗体の有無を確認する段階を追加で含むことができる。

【発明の効果】

【0040】

一態様によるペプチドおよび抗体は、免疫グロブリンＥのエピトープとして免疫学、アレルギー等の診断または治療剤の研究等に活用され得る。また、前記抗体を含むキットは、韓国人において発生頻度の高い代表的な吸入性、食物アレルギーの有無を定性分析することが可能であり、採血後に短時間内に肉眼で結果の確認が可能である。また、検査に必要な検体量の最小化が可能なので、採血が難しい小児にも適用が可能であるという利点がある。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】図１は、一態様によるキットの反応模式図である。

【図2】図２は、一具体例によるデバイスの製造工程を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記の実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

【0043】

［実施例］
実施例１．新規免疫グロブリンＥエピトープの確認
（１）多クローン抗体の製造および力価の確認
抗原（ＩｇＥ ｐｅｐ−４０）１００μｌと同量のコンプリートアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して抗原乳化液を作った後、６週齢の雌マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）の皮下に投与して免疫反応を誘導した。１次投与後、２週間隔で同じ抗原１００μｌと同量のインコンプリートアジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を用いて前記マウスの皮下に投与した（表１）。

【0044】

【表1】

【0045】

抗原の投与を３回進めた後、前記マウスの尾静脈から血清（ｓｅｒｕｍ）を少量採血してＥＬＩＳＡ ｔｅｓｔを通じて血清内多クローン抗体の力価を確認した。具体的に、抗原（ＩｇＥ ｐｅｐ−４０）２μｇ／ｍｌをｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ４℃で１８時間の間反応させた後、コーティングした。翌日、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて室温で１時間の間反応（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。以後、マウスの血液から得られた血清を使用して倍率に合うように希釈してウェルに１００μｌを分注した後、１時間の間室温で反応させた。反応が完了したプレートは、ＰＢＳＴを使用して洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されているＧｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ−ＨＲＰを１：２０００の割合で希釈してウェルに１００μｌを分注し、室温で１時間の間反応させた。以後、ＰＢＳＴを使用して洗浄し、ＴＭＢ溶液を分注して１５分間反応させた後、反応停止液を使用して反応を終結した。４５０／６２０ｎｍで吸光度の値を測定して血清中の力価（ｔｉｔｅｒ）を確認した（表２）。

【0046】

【表2】

【0047】

（２）ハイブリドーマ細胞の製造
抗体力価の確認実験を通じて確認されたマウスの血清中の力価を基準として高い力価を有する抗体が生成されたことを確認し、前記マウスのリンパ球を分離して細胞融合を実施した。免疫反応が誘導されたマウスの脾臓を損傷なしに摘出してＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ／Ｖｏｇｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）培地で洗浄し、リンパ球を分離して、６０ｍｍディッシュ（ｄｉｓｈ）にＤＭＥＭ培地を加えて単一細胞に分離させた。以後、ＲＢＣ溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を使用してリンパ球に混ざっている赤血球を除去した後、ＤＭＥＭ培地で洗浄し、準備された骨髄腫細胞（Ｍｙｅｌｏｍａ ｃｅｌｌ、ＳＰ２／０ Ａｇ １４−ＡＴＣＣ ＃ＣＲＬ−１５８１）とリンパ球を細胞数対比１：５で混合した。その後、前記混合された細胞にＰＥＧ１５００ １．７ｍｌを添加して細胞融合を誘導し、９６ウェルプレートにウェル当たり２００μｌずつ細胞を分注した後、ＣＯ２インキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養した。細胞融合２日後、各ウェル当たり５０％をＨＡＴ培地（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｍｅｄｉｕｍ）に交替し、１２日後、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を確認して、ＩｇＥ ｐｅｐ−４０タンパク質ペプチド（ＥＬＩＳＡ確認用抗原）との反応の有無を上記のＥＬＩＳＡ（Ａｂｓ．４５０ｎｍ）方式で進めて決定した。前記ＥＬＩＳＡ結果のうち、Ｏ．Ｄ値を基準として１．０以上である場合、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）と選定して単クローン細胞を選別した。

【0048】

（３）単クローン抗体を生産するハイブリドーマ細胞株の選別
製造した融合細胞群のうちＩｇＥ ｐｅｐ−４０にのみ特異的に反応する細胞を選別し、抗体の生成の有無を確認するために、酵素免疫方法を用いてスクリーニングした。細胞融合後１２日目に培地を交換し、交換した培地を１次抗体としてＥＬＩＳＡ試験を行った。ＥＬＩＳＡ試験後、当該抗原に陽性を示すウェルを選択して２４ウェルに移して培養した。２４ウェルで培養したハイブリドーマ細胞株を同じ方法でさらにＥＬＩＳＡ試験を行って抗体力価を確認した。２４ウェルで成長させた融合細胞の吸光度（Ｏ．Ｄ値）をＥＬＩＳＡで確認し、吸光度が１を超える融合細胞のみを選択して６ウェル培養フラスコに移して培養し、遠心分離した後、上澄み液を集めて、ＥＬＩＳＡ確認して、３次スクリーニングを行った。３次スクリーニングに基づいて選択された融合細胞をさらに７５Ｔ／Ｃ培養フラスコに移して培養し、ＥＬＩＳＡで吸光度を確認して、吸光度が１を超える融合細胞のみを選択した。

【0049】

（４）ＩｇＥ ｐｅｐ−４０タンパク質に対する単クローン抗体のエピトープ分析（ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ）
抗体の生産に使用したペプチドを使用してエピトープマッピング（ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ）を実施した。マッピングに使用されたペプチドは、従来抗原の生産に使用されたＩｇＥ ｐｅｐ−４０タンパク質の一部である１２、１３、１５個のアミノ酸配列を有するペプチドを使用した（表３）。

【0050】

そのうちＰｅｐ−６ペプチドと結合する抗体を発見し、Ｐｅｐ−６は、従来知られていない新規抗原（ＩｇＥ ｐｅｐ−４０）の結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）であると判断した。

【0051】

【表3】

【0052】

実施例２．アレルギー疾患の診断または予後分析用キットの製造
（１）アレルゲンの分離
下記表４に示した原材料をＴＳＭ Ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｓｏｕｒｃｅが浸る程度にＥｔｈｅｒを入れた後、よく撹拌しながら常温で５分間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた。

【0053】

【表4】

【0054】

その後、Ｅｔｈｅｒを用心深く注ぎ出し、さらにｆｒｅｓｈ ｅｔｈｅｒを入れて、前記過程を３回繰り返して脱脂（Ｄｅｆａｔｔｉｎｇ）させて、それぞれのサンプルを準備した。以後、ｉ）前記それぞれのサンプルをＰＢＳ（ｐＨ８．０）と１：５（ｖ／ｖ）の割合で混合した後、氷上でＰｏｌｙｔｒｏｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒを用いて抽出し、４℃で２４時間の間インキュベーションさせるか、またはｉｉ）前記サンプルに５倍体積のＣＯＣＡ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した後、４℃で２４時間の間回転しつつインキュベーションさせた。

【0055】

その後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、その上澄み液を分離した後、ワットマン紙（ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ）を用いて濾過した。以後、前記サンプルを０．１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．５）を用いて２４〜４８時間の間透析させた。透析させたサンプルをその状態で冷蔵室で大気乾燥（ａｉｒ ｄｒｙ）させながら、体積が１／１０程度に減少するまで乾燥した。４℃、１５，０００ｒｐｍで１時間の間遠心分離した後、４５μｍのＳｙｒｉｎｇｅ Ｆｉｌｔｅｒを用いて濾過した。以後、Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙを用いてタンパク質を定量し、凍結乾燥させた。

【0056】

（２）Ｐｅｐ−６に結合する抗体の製造
１）抗体の力価の確認
前記Ｐｅｐ−６ペプチドと結合する抗体を発見し、これを用いた単クローン抗体細胞株の確立後、細胞培養液を用いて抗体の力価の確認試験を実施した。この際、Ｐｅｐ−６のキャリアとしてＫＬＨタンパク質を使用した。

【0057】

【表5】

【0058】

その結果、前記表５のような結果を確認することができ、８−７＿１００ｃｅｌｌ、１４０−１３＿５００ｃｅｌｌ、３０２−２＿１００ｃｅｌｌがＫＬＨには結合せず、組換えＩｇＥ ｗｈｏｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎには結合力を有し、ｐｅｐ−６−ＫＬＨに高い結合力を有することを確認することができた。

【0059】

２）既販売抗体との性能比較
前記抗体の力価の確認においてＰｅｐ−６−ＫＬＨに結合力が高かった８−７＿１００ｃｅｌｌ、１４０−１３＿５００ｃｅｌｌ、３０２−２＿１００ｃｅｌｌを既販売されている抗ＩｇＥ抗体との性能比較試験を進めた（表６）。

【0060】

【表6】

【0061】

その結果、前記表６に示されたように、抗体３種（８−７＿１００ｃｅｌｌ、１４０−１３＿５００ｃｅｌｌ、３０２−２＿１００ｃｅｌｌ）は、既販売されている抗体と異なる結合部位を有する抗体であるが、組換えＩｇＥに対する結合力は類似した程度であることが分かり、前記抗体３種（８−７＿１００ｃｅｌｌ、１４０−１３＿５００ｃｅｌｌ、３０２−２＿１００ｃｅｌｌ）をキットの製造に使用することができると判断された。

【0062】

３）選別された抗体のｎａｔｉｖｅ ＩｇＥに対する結合力の確認
キットの製造に使用された抗体の選別基準は、組換えＩｇＥに対する結合力が販売製品と類似した３種の抗体（８−７＿１００ｃｅｌｌ、１４０−１３＿５００ｃｅｌｌ、３０２−２＿１００ｃｅｌｌ）を選定した。また、３種の抗体が血液内存在するｎａｔｉｖｅ ＩｇＥに対する結合力の程度を確認するために、下記の方法でＥＬＩＳＡ試験を通じて確認した。

【0063】

販売されているｈｕｍａｎ ＩｇＥに対する抗体２μｇ／ｍｌをｗｅｌｌ当たり１００μｌずつ４℃で１８時間の間反応させてコーティングした。翌日、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて室温で１時間の間反応（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。ブロッキングが進行される間、商用化しているｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔの使用説明によって選別した３種の抗体をｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎした。以後、組換えＩｇＥタンパク質とアレルギーがあるものと判定された患者の血清を各ウェルに１０μｌを分注した後、１時間の間室温で反応させた。反応が完了したプレートは、ＰＢＳＴを使用して洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）されているｓｔｒeｐｔａｖｉｄｉｎを１：５０００の割合で希釈してウェルに１００μｌを分注し、室温で１時間の間反応させた。以後、ＰＢＳＴを使用して洗浄し、ＴＭＢ溶液を分注して１５分間反応させた後、反応停止液を使用して反応を終結した。４５０／６２０ｎｍで吸光度の値を測定して選別した抗体の組換えＩｇＥ、ｎａｔｉｖｅ ＩｇＥに結合程度を確認した。

【0064】

【表7】

【0065】

試験結果、前記表７に示されたように、選別した抗体３種は、組換えＩｇＥ、ｎａｔｉｖｅ ＩｇＥに結合したことを確認することができ、抗体３種全部をキットの製造に使用することができると判断された。

【0066】

（３）ゴールド接合体の準備
塩化金酸と還元剤を使用して直径４０〜６０ｎｍのコロイド性金粒子を製造した。コロイド性金粒子を５２０ｎｍでＯＤ値が１．０±１．０になるように３次蒸留水を添加する。ゴールド溶液１ｍｌに実施例１−２で準備した単クローンａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＥ抗体５μｇ〜１５μｇを添加した後、室温で１時間の間振とう反応させた。反応が完了した金粒子を洗浄し、吸光度計を用いて５２０ｎｍで測定して定量した後、濃度がＯＤ値５．０±１．０になるように希釈し、保存剤を添加した。

【0067】

（４）キットおよびデバイスの製作
ホウ酸塩緩衝液を使用して実施例１−（１）で準備したアレルゲン抗原は、５ｍｇ／ｍｌでそれぞれ希釈し、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧは、２ｍｇ／ｍｌで希釈して、自動定量分注器を使用して検査線および対照線位置にそれぞれ分注してメンブレンをコーティングした。以後、前記コーティングされたメンブレンを確認検査台に載置し、各コーティング液が正常に分注されたか否かを全量肉眼で検査した。正常に分注されたメンブレンを１時間以上３７±２℃で恒温乾燥した後、組立前まで密封して、除湿された状態で保管した。

【0068】

前記実施例１−（３）で製造したゴールド接合体を安定剤と混合してガラス繊維に均質に吸収させた。この際、ガラス繊維１．１ｃｍｘ０．４ｃｍ当たり１９．６３μｌを使用するので、1つのデバイスには、単クローンａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＥ抗体ゴールド接合体が１４．５９±１．０６μｇ原液基準質量で添加される。３７±２℃で１時間乾燥したガラス繊維を組立前まで密封して、除湿状態で保管した。

【0069】

上記でコーティングしたメンブレンの下端に接合体パッドと検体パッドを順次に重畳するようにして付着し、上端には吸収パッドを付着した。専用切削器を使用して（４５±５．２）ｍｍｘ（４．４±１．５）ｍｍの規格で切断し、デバイス組立前まで防湿包装して保管した。以後、切断したストリップを下部プラスチックデバイスの上に載置した後、上部プラスチックデバイスを覆い、乾燥したシリカゲルと共に銀箔布に入れて密封包装した。

【0070】

［実験例］
検出限界の確認
前記実施例２で製作したキットの検出限界を確認するために、ｉｍｍｕｎｏ−ＣＡＰ検査で陽性（３．５ＩＵ／ｍｌ以上）判定を受けた検体を原液、２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍希釈した後、各アレルゲンに対する検体を３回繰り返して標準試験法によって試験を行い、判定基準によって判定し、その結果を下記表８に示した。

【0071】

【表8】

【0072】

その結果、表８に示されたように、各アレルゲン別に複数の検体を５段階で希釈して希釈検体当たり３回繰り返し試験を行い、試験３回の全部で陽性判定された検体としてＩｍｍｕｎｏ−Ｃａｐ定量値が最低値を示す値を各アレルゲンの検出限界に設定した。すなわち、一具体例によるキットの検出限界は、定量値２〜８ｎｇの範囲以上で陽性と判定したが、１．６８〜８．３９ｎｇの検体を全部陽性と判定しなかったため、ＥＩＡ ｃｌａｓｓを基準として定量値８．４ｎｇ以上を検出限界に設定した。

【0073】

精密度および正確度の確認
前記実施例２で製作したキットの（１）試験者間、（２）試験日間、（３）試験（Ｌｏｔ）間、（４）同一試験日、試験場所間のアレルゲンに対する正確度を判定するために、標準試験法によってテストした。アレルゲンに対する陰性標準物質および陽性標準物質をそれぞれ準備して、下記の試験方法でテストを進め、その結果を下記表９に示した。

【0074】

（１）試験者間
前記実施例２で製作したキットに対して３人のそれぞれ異なる試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。
（２）試験日間
前記実施例２で製作したキットに対して1人の試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して１日間隔で合計５日間試験を行い、その結果を分析した。
（３）試験（Ｌｏｔ）間
前記実施例２で製作したキット３つに対して1人の試験者がそれぞれ陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。
（４）同一試験日（試験場所）間
前記実施例２で製作したキットに対し1人の試験者がそれぞれ異なる３か所の場所（実験室、ＱＣ室等）で陰性標準物質および陽性標準物質を使用して試験を行い、その結果を分析した。

【0075】

【表9】

【0076】

その結果、表９に示されたように、実施例２のデバイスは、同一人、試験者、試験日、Ｌｏｔ間および試験場所間に関係なく、陰性標準物質を用いた試験では陰性、陽性標準物質を用いた試験では陽性であって、同じ試験結果が示されることを確認することができた。

【0077】

特異度の確認
偽陽性／偽陰性の有無の確認
検体内に存在する物質による干渉効果を測定するために、陰性標準物質および陽性標準物質に下記表１０の物質を添加して偽陽性（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ）および偽陰性（ｆａｌｓｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ）の有無を試験し、その結果を下記表１１に示した。

【0078】

【表10】

【0079】

【表11】

【0080】

この際、偽陽性とは、干渉物質により陰性標準物質が陽性と判明されることを意味し、偽陰性とは、干渉物質が含まれている陽性標準物質が干渉物質の影響によって陰性と判定されることを意味する。

【0081】

その結果、表１１に示されたように、本発明によるキットは、干渉物質８種に対する影響がいずれもないことを確認することができた。

【0082】

交差反応の有無の確認
また、検査過程で使用される抗体と検体内に存在可能な免疫グロブリン亜種の非特異的な結合による交差反応の有無を確認するために、陰性標準物質にＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＤをそれぞれ３ｍｇ／ｍｌ添加して、標準試験法によって試験を行い、判定基準によって判定した。

【0083】

その結果、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＤを添加した陰性標準物質は、いずれも、陰性と示されて、干渉反応がないことを確認することができた。

【0084】

既販売製品とのユニキャップ検査比較
実施例１−２によって製造および選別された抗体３種のうち８−７＿１００ ｃｅｌｌを用いて実施例２によってアレルギーｋｉｔを製造して、既販売中のキット（ＬＧ、Ａｌｌｏｓｃａｎ）とアレルゲン３９種のうち発生頻度数の高いアレルゲン１３種（ヤケヒョウヒダニ（ＤＰ）、コナヒョウヒダニ（ＤＦ）、猫、イエダニ、犬、シラカンバ、ａｌｔｅｒｎａｒｉａ、桃、りんご、ホソムギ、ハルガヤ、カモガヤ、オオアワガエリ、オーク、卵白、ジャガイモ）に対する一致率確認試験を進めた。試験は、１３種に対して1つ以上のアレルゲンに対して陽性を示す１６０検体を使用し、不一致を示す検体は、第３の検査法であり且つアレルギー検査において標準試験法と見なされるユニキャップ検査を進めて結果を判定した。既販売製品キットを用いた試験とユニキャップ検査は、受託機関に依頼して実施し、自社開発したキットは、2人の検査員が検査する形態で自主的に実施した（表１２）。

【0085】

【表12】

【0086】

その結果、表１２に示されたように、１６０個の検体のうち５２個の検体において不一致が示され、不一致が示された検査においてユニキャップ試験結果、自社開発した抗体を用いたキットとの一致は３６個の検体であり、既販売中のキットを用いた検査と一致する検体は１６個であった。

【0087】

上記の結果は、実施例２による抗体を用いたアレルギー検査キットが、抗体の非特異反応あるいはアレルゲンとの結合力に優れていて、一致率が高いことを意味することが分かった。

【0088】

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。

【図1】

【図2】

【配列表】

2021517972000001.app

【国際調査報告】