特表 2021-518110 薬剤ＡＤＭＥ研究のための高密度３Ｄ肝細胞スフェロイドプラットフォーム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-518110(P2021-518110A)

(43)【公表日】2021年8月2日

(54)【発明の名称】薬剤ＡＤＭＥ研究のための高密度３Ｄ肝細胞スフェロイドプラットフォーム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20210705BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20210705BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20210705BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20210705BHJP

   C12M 3/00 20060101ALN20210705BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02

   C12Q1/26

   C12Q1/68

   C12M1/00 A

   C12M3/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2020-548969(P2020-548969)

(86)(22)【出願日】2019年3月12日

(85)【翻訳文提出日】2020年11月13日

(86)【国際出願番号】US2019021771

(87)【国際公開番号】WO2019178039

(87)【国際公開日】20190919

(31)【優先権主張番号】62/642,447

(32)【優先日】2018年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】397068274

【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100073184

【弁理士】

【氏名又は名称】柳田 征史

(74)【代理人】

【識別番号】100123652

【弁理士】

【氏名又は名称】坂野 博行

(74)【代理人】

【識別番号】100175042

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 秀明

(72)【発明者】

【氏名】ゴラール，ヴァシリー ニコラエヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】リー，フォン

(72)【発明者】

【氏名】マーティン，グレゴリー ロジャー

(72)【発明者】

【氏名】タナー，アリソン ジーン

(72)【発明者】

【氏名】ズオ，ロンジュン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B029AA08

4B029BB11

4B029CC01

4B029CC02

4B029GA03

4B063QQ08

4B063QQ22

4B063QR02

4B063QR77

(57)【要約】

本開示は、様々な生化学及び分子生物学的研究での使用のための、生体外培養における候補化合物と３Ｄ肝細胞スフェロイドとの相互作用の評価（候補化合物の代謝の評価を含む）のための方法に関する。上記方法は、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた実験器具で実施され、上記設計により、同一条件下での複数から数百のスフェロイドの処理や、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究に関する十分な材料（例えば親薬剤、薬剤代謝産物、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び細胞由来のタンパク質）の生産並びに比較的高い信号強度の生成が可能となる。上記方法により、他の用途の中でも特に、正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成が可能となり、従って、特に低クリアランス化合物を用いた、生体内クリアランスのより正確な予測が可能となる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上の候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法であって、前記アッセイ法は：
ａ）肝細胞を細胞培養用物品中で培養してスフェロイドを形成するステップであって、ここで前記細胞培養用物品はチャンバを備え、前記チャンバは、マイクロキャビティのアレイを備え、各マイクロキャビティは、３Ｄスフェロイド形態で成長するように肝細胞に制約を与えるような構造を有し、前記チャンバの各前記マイクロキャビティは：
側壁；上部アパーチャ；及び凹状表面を備える液体非透過性底部であって、前記底部の少なくとも一部分は、前記凹状表面内又は前記凹状表面上に低接着性又は非接着性材料を含む、液体非透過性底部
を備える、ステップ；
ｂ）３Ｄ肝細胞スフェロイドを前記１つ以上の候補化合物と接触させるステップ；並びに
ｃ）前記１つ以上の候補化合物の生体外固有クリアランスを測定するステップ
を含む、アッセイ法。

【請求項2】

前記凹状表面を備える前記液体非透過性底部は、ガス透過性であるか；
前記側壁は不透明であるか；
前記底部の少なくとも一部分は透明であるか；又は
これらの組み合わせ
である、請求項１に記載のアッセイ法。

【請求項3】

前記凹面は、半球面、側壁から前記底面への３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１又は２に記載のアッセイ法。

【請求項4】

前記側壁の表面は、垂直な円筒、前記チャンバの上部から底面に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分、前記凹状の底面に向かう円錐状移行部分を有する垂直な四角形シャフト、又はこれらの組み合わせを備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項5】

前記細胞培養用物品は１〜約２，０００個の前記チャンバを備え、各前記チャンバは他のいずれの前記チャンバから物理的に隔てられている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項6】

前記１つ以上の低クリアランス候補化合物の前記生体外固有クリアランスは、前記１つ以上の候補化合物の消失によって測定されるか；
前記１つ以上の低クリアランス候補化合物の前記生体外固有クリアランスは、前記１つ以上の候補化合物からの代謝産物の形成によって測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項7】

測定された前記１つ以上の候補化合物の前記生体外固有クリアランスを利用して、前記１つ以上の候補化合物の生体内半減期を予測するか；
前記１つ以上の候補化合物の前記生体外固有クリアランスを利用して、前記１つ以上の候補化合物の生体内クリアランスを予測する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項8】

前記１つ以上の候補化合物は、低クリアランス候補化合物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項9】

複数の候補化合物を同時に評価するステップを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【請求項10】

前記肝細胞は、初代ヒト肝細胞又は肝細胞株を含むか；
前記３Ｄスフェロイド肝細胞は、少なくとも３週間にわたって機能的に安定しているか；
前記３Ｄスフェロイド肝細胞の機能的安定性は、代謝活性、細胞機能、遺伝子発現、若しくはこれらの組み合わせを測定することによって決定されるか；
前記機能的安定性は、ＣＹＰ３Ａ４活性によって測定されるか；又は
これらの組み合わせ
である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ法。

【発明の詳細な説明】

【関連出願の相互参照】

【0001】

本出願は、米国特許法第１２０条の下で、２０１８年３月１３日出願の米国仮特許出願第６２／６４２４４７号の優先権の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の内容は依拠され、その全体が参照により本出願に援用される。

【技術分野】

【0002】

本開示は一般に、様々な生化学及び分子生物学的研究での使用のための、生体外培養における候補化合物と３Ｄ肝細胞スフェロイドとの相互作用の評価（候補化合物の代謝の評価を含む）のための方法に関する。上記方法は、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた実験器具で実施され、上記設計により、肝臓の細胞（例えば肝細胞）の生存率及び機能性の長期的な維持が可能となるだけでなく、同一条件下での複数から数百のスフェロイドの処理や、より正確な検出のための、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）並びに他の関連する研究に関する十分な材料（例えば親薬剤、薬剤代謝産物、並びに細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質）の生産並びに比較的高い信号強度の生成が可能となる。上記方法により、他の用途の中でも特に、化合物に関する正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成が可能となり、従って、特に低クリアランス化合物を用いた、生体内クリアランスのより正確な予測が可能となる。

【背景技術】

【0003】

化合物のＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）特性は、該化合物の臨床的な成功を予測するための重要な要素である。早期ＡＤＭＥ／Ｔｏｘスクリーニングを薬剤発見プロセス中に用いて、プロファイルに問題がある薬剤を選択し、代謝の障害を低減し、最終的に所望の投薬計画を実現可能とする。医薬品発見プログラムにおける低クリアランス化合物の増大は、クリアランス研究のための従来の生体外システムに課題を提示する。生体外データを用いて化合物の生体内肝クリアランスを予測できることは、薬剤の発見及び開発において重要である。というのは、化合物の固有クリアランスパラメータを理解することは、薬剤半減期、経口バイオアベイラビリティ、用量、及び投薬計画を決定するための最も重要なパラメータであるためである。更に、薬剤候補の予想外の生体内クリアランスは、曝露に関する問題及び安全性に関する懸念につながる可能性がある。しかしながら、現行の生体外肝臓モデルは、これらのモデルの検出限界により、低クリアランス薬剤候補の生体内クリアランス又は半減期を確実に予測することはできない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従って、化合物に関する、より詳細には生体外モデルに関する、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ特性の調査が可能な別の生体外モデル及び方法、並びに低クリアランス化合物の生体内クリアランス又は半減期を確実かつ正確に予測できる生体外モデル及び方法に対して、継続的な需要が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本開示の様々な実施形態によると、様々な生化学及び分子生物学的研究、特にＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究での使用のための、生体外培養における候補化合物と３Ｄ肝細胞スフェロイドとの相互作用を評価するための、方法及び実験器具が開示される。複数の態様では、上記方法及び実験器具を用いて、生体外３Ｄ肝細胞スフェロイド培養における候補化合物の代謝を評価できる。上記方法により、他の使用法の中でも特に、化合物の正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成が可能となり、従って、特に低クリアランス候補化合物を用いた場合の、生体内クリアランスのより正確な予測が可能となる。

【0006】

様々な実施形態では、１つ以上の低クリアランス候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法が開示される。上記アッセイ法は、肝細胞を細胞培養用物品中で培養してスフェロイドを形成するステップを含み、ここで上記細胞培養用物品はチャンバを備える。上記チャンバは例えば、マルチウェルプレートのウェル、又はフラスコである。実施形態では、各上記ウェルの底部には、マイクロキャビティのアレイが存在してよい。各上記マイクロキャビティは、３Ｄスフェロイド形態で成長するように肝細胞に制約を与えるような構造を有する。上記アッセイ法は更に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞を上記１つ以上の低クリアランス候補化合物と接触させるステップを含む。上記アッセイ法はまた、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体外固有クリアランスを測定するステップを含む。実施形態では、上記培養は、長期間培養である。いくつかの実施形態では、上記長期間培養は、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日にわたる。

【0007】

いくつかの実施形態では、上記細胞培養用物品の上記チャンバの各上記マイクロキャビティは、上部アパーチャと、底面を備える液体非透過性底部とを含む。実施形態では、上記底面の少なくとも一部分は、上記底面内又は上記底面上に、低接着性又は非接着性材料を含む。いくつかの実施形態では、上記底面を含む上記液体非透過性底部は、ガス透過性である。いくつかの実施形態では、上記底部の少なくとも一部分は透明である。

【0008】

いくつかの実施形態では、上記底面は、凹状の底面を備える。いくつかの実施形態では、上記チャンバの各上記マイクロキャビティの上記少なくとも１つの凹面は、半球面、側壁から上記底面への３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、上記チャンバは更に側壁を備える。いくつかの実施形態では、上記チャンバの上記側壁は、垂直な円筒、上記チャンバの上部から底面に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分、上記少なくとも１つの凹状の底面に向かう円錐状移行部分を有する垂直な四角形シャフト、又はこれらの組み合わせを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、各上記マイクロキャビティは側壁を備える。いくつかの実施形態では、各上記マイクロキャビティの上記側壁は、垂直な円筒、上記チャンバの上部から底面に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分、上記少なくとも１つの凹状の底面に向かう円錐状移行部分を有する垂直な四角形シャフト、又はこれらの組み合わせを含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、上記細胞培養用物品は１〜約２，０００個の上記チャンバを含み、各上記チャンバは他のいずれの上記チャンバから物理的に隔てられている。実施形態では、上記チャンバはマルチウェルプレートのウェルである。例えば、細胞培養用物品は、１、６、１２、２４、９６、３８４、又は１５３６個のチャンバを有してよい。いくつかの実施形態では、各上記チャンバは、約２５〜約１，０００個の上記マイクロキャビティを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスは、上記１つ以上の候補化合物の消失によって測定される。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の候補化合物の上記生体外固有クリアランスは、上記１つ以上の候補化合物からの代謝産物の形成によって測定される。

【0013】

いくつかの実施形態では、測定された上記１つ以上の候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の候補化合物の生体内半減期を予測する。いくつかの実施形態では、測定された上記１つ以上の候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の候補化合物の生体内クリアランスを予測する。

【0014】

いくつかの実施形態では、上記アッセイ法は更に、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の代謝産物を分析するステップを含み、上記代謝産物は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成される。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の同定を含む。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の定量化を含む。

【0015】

いくつかの実施形態では、上記アッセイ法は更に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中の、遺伝子及び／又はタンパク質発現の変化を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞によって産生された（例えば上記細胞、細胞抽出物、及び／又は培地から単離された）ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を測定するステップを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、上記肝細胞は初代ヒト肝細胞を含む。いくつかの実施形態では、上記肝細胞は肝細胞株を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、上記アッセイ法は更に、複数の候補化合物を同時に評価するステップを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、上記３Ｄ肝細胞スフェロイドは、少なくとも３週間にわたって機能的に安定している。いくつかの実施形態では、上記３Ｄ肝細胞スフェロイドの機能的安定性は、代謝活性、細胞機能、遺伝子発現、又はこれらの組み合わせを測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、上記３Ｄ肝細胞スフェロイドの上記機能的安定性は、ＣＹＰ３Ａ４活性によって測定される。

【0019】

本開示の主題の更なる特徴及び利点は、以下の「発明を実施するための形態」に記載され、またその一部は、当業者には「発明を実施するための形態」から容易に明らかとなるか、又は以下の「発明を実施するための形態」、特許請求の範囲及び添付の図面を含む本明細書に記載された本開示の主題を実践することによって認識されるだろう。

【0020】

以上の「発明の概要」及び以下の「発明を実施するための形態」はいずれも、本開示の主題の実施形態を提示するものであり、請求対象である本開示の主題の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することを意図したものであることを理解されたい。添付の図面は本開示の主題の更なる理解を提供するために含まれており、本明細書に組み込まれて本明細書の一部を構成する。これらの図面は、本開示の主題の様々な実施形態を図示し、本記述と併せて、本開示の主題の原理及び動作を説明する役割を果たす。更に、これらの図面及び記述は単なる例示を意図したものであり、いかなる点においても特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。

【0021】

以下の本開示の具体的実施形態の詳細な説明は、以下の図面と併せて読んだ場合に最もよく理解できる。これらの図面では、同様の構造は同様の参照番号で示されている。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】マルチウェルマイクロプレート、この場合は９６ウェルスフェロイドマイクロプレートの一実施形態を示し、上記マイクロプレートは、９６個のウェルそれぞれに複数のスフェロイドを提供するために、各ウェルの底面にマイクロキャビティのアレイを有する。図１Ａはマルチウェルマイクロプレートを示す。

【図1B】図１Ｂは、マルチウェルプレートの単一のウェルを示す。

【図1C】図１Ｃは、図１ＢのボックスＣ内に示されている単一のウェルの底面の領域の拡大図である。

【図2A】図２Ａは、例示的なマイクロキャビティのアレイの図である。

【図2B】図２Ｂは、更なる例示的なマイクロキャビティのアレイの図である。

【図3A】図３Ａは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＨｅｐａｔｏＣｅｌｌｓスフェロイドの、複数の上記スフェロイドを０時間の時点において最初に手動で集めたときの写真である。

【図3B】図３Ｂは、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨｅｐａｔｏＣｅｌｌｓスフェロイドの、複数の上記スフェロイドを手動で集めて２２時間にわたってインキュベートしたときの写真である。

【図4】本明細書で開示される方法の一実施形態

【図5】９６ウェルスフェロイドプレート中で培養された３Ｄ肝細胞スフェロイドの２つのロットのＣＹＰ３Ａ４活性を、２Ｄで培養された肝細胞のＣＹＰ３Ａ４活性と比較して示すグラフ

【図6A】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6B】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6C】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6D】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6E】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6F】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6G】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6H】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図6I】本明細書で開示される方法の一実施形態を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図7A】図７Ａは、マイクロキャビティインサートを示す図である。

【図7B】図７Ｂは、２４ウェルマイクロキャビティインサート中で培養された初代ヒト肝細胞の１日目の写真である。

【図7C】図７Ｃは、２４ウェルマイクロキャビティインサート中で培養された初代ヒト肝細胞の３日目の写真であり、３Ｄスフェロイドの形成を実証する。

【図8A】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8B】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8C】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8D】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8E】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8F】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8G】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8H】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【図8I】浮遊細胞を用いた従来の低クリアランス化合物の生体外測定を示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0023】

これより、本開示の主題の様々な実施形態に対する言及を更に詳細に行うが、これらのうちのいくつかの実施形態は、添付の図面に図示されている。図面中で使用される同様の番号は、同様の構成要素、ステップ等を指す。しかしながら、所与の図面においてある構成要素を指すためにある番号を使用することは、当該構成要素を、別の図面において同一の番号で標識されるように制限することを意図していないことが理解されるだろう。更に、複数の構成要素を指すために異なる番号を使用することは、異なる番号を付与されたこれらの構成部品が、他の番号を付与された構成部品と同一又は同様のものとなり得ないことを指示することを意図したものではない。

【0024】

以下の１つ以上の特定の実施形態の説明は、単なる例示的な性質のものであり、本発明、その用途、又は使用法（これらは当然のことながら様々であり得る）の範囲を限定することは一切意図していない。本発明は、本明細書に含まれる非制限的な定義及び用語法に関連して説明される。これらの定義及び用語法は、本発明の範囲又は実践に対する制限として機能するように設計されたものではなく、例示及び説明のみを目的として提示されている。特段の記載が無い限り、本明細書中で使用される（技術用語及び科学用語を含む）全ての用語は、本開示が属する分野の当業者が一般に理解するような意味と同一の意味を有する。更に、一般的に使用されている辞書で定義されている用語等の用語は、関連技術及び本開示の文脈中での意味と矛盾しない意味を有するものとして解釈されるべきものであり、本明細書中で明確に定義されていない限り、理想的な又は過度に形式的な意味で解釈してはならないことが理解されるだろう。

【0025】

定義
本明細書中で使用される場合、単数形「ある（ａ、ａｎ）」及び「上記（ｔｈｅ）」は、そうでないことが文脈によって明示されていない限り、複数の指示物を含む。従って例えば、ある「構造形成された底面（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｂｏｔｔｏｍ ｓｕｒｆａｃｅ）」に関する言及は、そうでないことが文脈によって明示されていない限り、２つ以上のこのような「構造形成された底面」を有する例を含む。

【0026】

本明細書及び添付の請求項中で使用される場合、用語「又は（ｏｒ）」は、そうでないことが文脈によって明示されていない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味で一般に使用される。用語「及び／又は」は、列挙されている要素のうちの１つ若しくは全て、又は列挙されている要素のうちのいずれの２つ以上の組み合わせを意味する。

【0027】

本明細書中で使用される場合、「有する（ｈａｖｅ、ｈａｓ、ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等は、非限定的かつ非包括的な意味で使用され、一般に「…を含むがそれに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ／ｉｎｃｌｕｄｅｓ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ／又はｉｎｃｌｕｄｉｎｇ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。

【0028】

「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」又は「任意に（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載されているイベント、状況、又は構成要素が、発生してもしなくてもよいこと、及びこの記述が、該イベント、状況、又は構成要素が発生する例と発生しない例とを含むことを意味する。

【0029】

単語「好ましい（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）」及び「好ましくは（ｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」は、特定の状況下において特定の利益をもたらす可能性がある本開示の実施形態を指す。しかしながら、同一の又は他の状況下において、他の実施形態が好ましい場合もある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを含意するものではなく、また他の実施形態を本発明の技術の範囲から排除することを意図したものではない。

【0030】

本明細書では、範囲を、「約（ａｂｏｕｔ）」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現できる。範囲がこのように表される場合、実施例は、上記１つの特定の値から、及び／又は上記別の特定の値までを含む。同様に、先行語句「約」の使用によって、値が近似値として表現されている場合、上記特定の値は別の態様を形成することが理解されるだろう。更に、各範囲の端点は、他方の端点との関係においても、他方の端点とは独立しても、重要であることが理解されるだろう。

【0031】

また本明細書では、複数の端点による数値範囲の記載は、該範囲内に含まれる全ての数値を含む（例えば１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。本明細書全体を通して与えられている全ての数値範囲は、このような比較的広い数値範囲内に収まる全ての比較的狭い数値範囲を含むことになり、このような比較的狭い数値範囲の全てが本明細書に明示的に記載されているかのように扱われることを理解されたい。ある数値範囲がある特定の値「より大きい（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ）」、「より小さい（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）」等の場合、上記値はこの範囲に含まれる。

【0032】

本明細書中で使用される場合、「…を提供するような構造を有する（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ）」又は「…を提供するよう構成される（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ）」は、その物品が、記載されている結果をもたらすような特徴を有することを意味している。

【0033】

本明細書で使用されるいずれの方向、例えば「上部（ｔｏｐ）」、「底部（ｂｏｔｔｏｍ）」、「左（ｌｅｆｔ）」、「右（ｒｉｇｈｔ）」、「上側（ｕｐｐｅｒ）」、「下側（ｌｏｗｅｒ）」、「上方（ａｂｏｖｅ）」、「下方（ｂｅｌｏｗ）」、並びに他の方向及び配向は、本明細書では、分かりやすさのために図面を参照して記述されるものであり、実際のデバイス若しくはシステム、又は上記デバイス若しくはシステムの使用を制限するためのものではない。細胞培養装置に関して本明細書中で使用される方向記述子は、上記装置内で細胞を培養する目的で上記装置を配向したときの方向を指すことが多い。

【0034】

また、本明細書中の記載は、ある構成要素がある特定の方法で機能する「よう構成される（ｃｏｎｆｉｇｕｒｅｄ）」又は「よう適合される（ａｄａｐｔｅｄ ｔｏ）」ことを指すことに留意されたい。この点に関して、このような構成要素は、ある特定の特性を実現するよう、又はある特定の様式で機能するよう、「構成され」又は「適合され」ており、このような記述は、目的とする使用法の記述ではなく、構造に関する記述である。より具体的には、本明細書中での、ある構成要素が「構成される」又は「適合される」様式に関する言及は、該構成要素の既存の物理的条件を示すものであり、従って該構成要素の構造的特徴の決定的な記載として解釈されるべきものである。

【0035】

本明細書中で使用される場合、用語「細胞培養（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、細胞を生体外で生存したまま維持することを指す。この用語には、（例えば不死化表現型を有する）連続細胞株、初代細胞培養、有限細胞株（例えば形質転換していない細胞）、並びに生体外で維持される他のいずれの細胞集団（卵細胞及び胚を含む）が含まれる。

【0036】

本明細書中で使用される場合、用語「生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）」は、人工環境、及び人工環境で発生するプロセス又は反応を指す。生体外環境としては、限定するものではないが、試験管及び細胞培養が挙げられる。用語「生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）」は、天然環境（例えば動物又は細胞）、及び天然環境で発生するプロセス又は反応を指す。

【0037】

本明細書中で使用される場合、「長期間培養（ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅ）」は、少なくとも約１２時間、任意に少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日にわたって培養された細胞（例えば限定するものではないが肝細胞）を指すことを意図したものである。長期間培養は、培養物中での代謝経路等の機能的特性の確立を促進する。

【0038】

本明細書中で使用される場合、用語「細胞培養用物品（ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｒｔｉｃｌｅ）」は、細胞の培養に使用できるいずれのコンテナを意味し、プレート、ウェル、フラスコ、マルチウェルプレート、多層フラスコ、トランスウェルインサート、トランスウェルマイクロキャビティインサート、及び細胞培養のための環境を提供する灌流システムを含む。

【0039】

本明細書中で使用される場合、「チャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）」は、細胞培養容器を意味し、フラスコ、又は皿、又はマルチウェルプレートのウェルであってよい。いくつかの実施形態では、細胞培養用物品は１〜約２，０００個の上記チャンバを含み、各チャンバは他のいずれのチャンバから物理的に隔てられている。実施形態では、チャンバは、マルチウェルプレートのウェルである。例えば細胞培養用物品は、単一のチャンバを備えたフラスコであってよく、細胞培養表面又は底面上にマイクロキャビティのアレイを有する。あるいは細胞培養用物品は、１、６、１２、２４、９６、３８４、又は１５３６個のチャンバ又はウェルを有するマルチウェルプレートであってよい。いくつかの実施形態では、各チャンバは、約２５〜約１，０００個の上記マイクロキャビティを含む。

【0040】

実施形態では、「ウェル（ｗｅｌｌ）」は、マルチウェルプレートのフォーマットで提供される、個々の細胞培養環境である。実施形態では、ウェルは、４ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、５３８ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、又は他のいずれのマルチウェルプレート構成のウェルとすることができる。

【0041】

実施形態では、単一のチャンバは、この単一のチャンバ内で単一の３Ｄ細胞集団として、即ち単一のスフェロイドとして成長するように関心対象の細胞に制約を与えるような構造を有する、マルチウェルプレートのウェルとすることができる。例えば、９６ウェルプレートのウェル（従来の９６ウェルプレートのウェル）は、深さがおよそ１０．６７ｍｍであり、およそ６．８６ｍｍの上部アパーチャを有し、ウェル底部直径はおよそ６．３５ｍｍである。

【0042】

実施形態では、「スフェロイドプレート（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｐｌａｔｅ）」は、単一のスフェロイドチャンバ又はウェルのアレイを有するマルチウェルプレートを意味する。即ち実施形態では、マルチウェルプレートは複数のチャンバ又はウェルを有してよく、各チャンバ又はウェルは、単一のスフェロイドを内包するよう構成される。

【0043】

本明細書中で使用される場合、「３Ｄスフェロイド形態で成長するように関心対象の細胞に制約を与えるような構造を有する（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｔｏ ｇｒｏｗ ｉｎ ３Ｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」等とされた「マイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）」又は「マイクロキャビティ（ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｙ）」は、細胞の２次元シートではなく３Ｄ又はスフェロイド形態で成長するように培養物中の細胞を促進する寸法若しくは処理は寸法と処理との組み合わせを有する、マイクロウェル又はマイクロキャビティを意味する。処理としては例えば、低結合溶液による処理、表面の疎水性を低減する処理、又は滅菌処理が挙げられる。

【0044】

実施形態では、「マイクロキャビティ」又は「マイクロウェル」は例えば、上側アパーチャ及び最下点、上側アパーチャの中心、並びに最下点と上側アパーチャの中心との間の中心軸を画定するマイクロウェルとすることができる。実施形態では、マイクロキャビティ又はマイクロウェルは、上記軸に関して回転対称である（即ち側壁が円筒形である）。いくつかの実施形態では、上側アパーチャは、２５０μｍ〜１ｍｍ、又はこれらの測定値の間のいずれの範囲の、上側アパーチャを横断する距離を画定する。いくつかの実施形態では、上側アパーチャから最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、２００μｍ〜９００μｍ、又は４００〜６００μｍである。マイクロキャビティのアレイは様々な幾何学的形状、例えば放物線状、双曲線状、シェブロン状、及び同等の断面幾何学形状、又はこれらの組み合わせを有してよい。

【0045】

実施形態では、ウェルは、「マイクロキャビティ」のアレイを有してよい。実施形態では、「マイクロキャビティ」は例えば、上側アパーチャ及び最下点、上側アパーチャの中心、並びに最下点と上側アパーチャの中心との間の中心軸を画定するマイクロウェルとすることができる。実施形態では、ウェルは、上記軸に関して回転対称である（即ち側壁が円筒形である）。いくつかの実施形態では、上側アパーチャは、２５０μｍ〜１ｍｍ、又はこれらの測定値の間のいずれの範囲の、上側アパーチャを横断する距離を画定する。いくつかの実施形態では、上側アパーチャから最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、２００μｍ〜９００μｍ、又は４００〜６００μｍである。マイクロキャビティのアレイは様々な幾何学的形状、例えば放物線状、双曲線状、シェブロン状、及び十字状の幾何学的形状、又はこれらの組み合わせを有してよい。

【0046】

実施形態では、「マイクロキャビティスフェロイドプレート（ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｙ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｐｌａｔｅ）」は、ウェルのアレイを有するマルチウェルプレートを意味し、各ウェルはマイクロキャビティのアレイを有する。

【0047】

実施形態では、ウェル又はマイクロキャビティの「丸底（ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ）」は例えば、ウェル又はマイクロキャビティの底部を構成する、半球、又は半球の水平断片若しくはスライスといった半球の一部分とすることができる。

【0048】

実施形態では、用語「３Ｄスフェロイド（３Ｄ ｓｐｈｅｒｏｉｄ）」又は「スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）」は例えば、培養物中の細胞のボールであってよく、これは細胞の平坦な２次元シートではない。用語「３Ｄスフェロイド」及び「スフェロイド」は、ここでは交換可能なものとして使用される。実施形態では、スフェロイドは、例えばスフェロイド中の細胞のタイプに応じて例えば約１００〜約５００マイクロメートル、より好ましくは約１５０〜約４００マイクロメートル、更に好ましくは約１５０〜約３００マイクロメートル、最も好ましくは約２００〜約２５０マイクロメートル（中間値及び範囲を含む）の直径を有する、単一の細胞タイプ又は複数の細胞タイプからなる。スフェロイドの直径は、例えば約２００〜約４００マイクロメートルとすることができる。スフェロイドの最大サイズは、一般に拡散に関する考慮事項による制約を受ける（スフェロイド及びスフェロイド容器のレビューに関しては、Ａｃｈｉｌｌｉ， Ｔ‐Ｍ， ｅｔ． ａｌ． Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． （２０１２） １２（１０）を参照）。

【0049】

本明細書中で使用される場合、「肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）」は、肝臓の主要な実質組織に由来するいずれの細胞を意味する。肝細胞は、ヒトを含む動物から取得若しくは単離された初代肝細胞とすることができ、又は肝細胞は、肝細胞株若しくは初代肝細胞由来細胞とすることができる。

【0050】

本明細書中で使用される場合、「インサート（ｉｎｓｅｒｔ）」は、スフェロイドプレート又はマイクロキャビティスフェロイドプレートのウェルに適合する細胞培養ウェルを意味する。インサートは、細胞を培養するためのキャビティを画定する側壁及び底面を有する。本明細書中で使用される場合、「トランスウェルマイクロキャビティインサート（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｙ ｉｎｓｅｒｔ）」は、底面がマイクロキャビティのアレイを有するインサートを意味する。

【0051】

本明細書中で使用される場合、「インサートプレート（ｉｎｓｅｒｔ ｐｌａｔｅ）」は、マルチウェルプレートのウェルのアレイに適合するような構造を有するインサートのアレイを内包する、インサートプレートを意味する。本明細書中で使用される場合、「マイクロキャビティインサートプレート（ｍｉｃｒｏｃａｖｉｔｙ ｉｎｓｅｒｔ ｐｌａｔｅ）」は、インサートのアレイ中の各インサートが、マイクロキャビティのアレイを備えた底面を有する、インサートプレートを意味する。

【0052】

本明細書中で使用される場合、「候補化合物（ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」等（例えば「化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」、「関心対象の化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、又は「薬剤化合物（ｄｒｕｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」）は、化合物のＡＤＭＥ／Ｔｏｘ特性の決定が望まれる、（外因的に投与された、又は内因的に生成された）いずれの化合物を指すことを意図している。例示的な候補化合物としては：一般に「薬剤（ｄｒｕｇ）」と呼ばれる生体異物低分子量治療剤、及び他の治療剤；発癌性物質及び環境汚染物質；並びにステロイド、胆汁酸、脂肪酸、及びプロスタグランジンといった生物体内物質が挙げられる。候補化合物は、あらゆる種類の作用を含む薬剤を含んでよく、上記作用としては、限定するものではないが、抗腫瘍剤、免疫抑制剤、免疫刺激剤、抗増殖剤、抗トロンビン剤、抗血小板剤、抗脂質剤、抗炎症剤、抗生物質、血管新生剤、抗血管新生剤、ビタミン、ＡＣＥ阻害剤、血管作動性物質、抗有糸分裂剤、メテロプロテイナーゼ阻害剤、ＮＯドナー、エストラジオール、抗硬化剤、ホルモン、フリーラジカルスカベンジャー、毒素、アルキル化剤（単独又は組み合わせ）が挙げられる。候補化合物としては、限定するものではないが例として生物剤も挙げられ、上記生物剤としては、限定するものではないが、ペプチド、脂質、タンパク質薬剤、タンパク質複合体薬剤、酵素、オリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝物質、プリオン、ウイルス、及びバクテリアが挙げられる。

【0053】

本明細書中で使用される場合、「クリアランス（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）」は、単位時間あたりに化合物（限定するものではないが例えば薬剤）が完全に除去される血液の体積を指すことを意図している。クリアランスは典型的には、ｍｌ／分又はｍｌ／分／ｋｇで測定される。

【0054】

本明細書中で使用される場合、「固有クリアランス（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）」又は「Ｃｌ_ｉｎｔ」は、流れの制限及び血中の細胞又はタンパク質への結合がない状態で、肝臓が化合物（限定するものではないが例えば薬剤）を除去する能力を指すことを意図している。よって固有クリアランスは、肝酵素が薬剤を代謝する固有の能力である。

【0055】

本明細書中で使用される場合、「低クリアランス化合物（ｌｏｗ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、クリアランスが＜５ｍｌ／分／ｋｇである化合物を指すことを意図している。

【0056】

特段の明示的記載がない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、その複数のステップを特定の順序で実施する必要があるものとして解釈されることは全く意図されていない。従って、その複数のステップが従うべき順序が方法クレームに実際に記述されていない場合、又は請求項若しくは本説明中に、これらのステップが特定の順序に限定されるべきであることが具体的に記載されていない場合、いかなる特定の順序を暗示することも意図されていない。いずれの１つの請求項中に記載されたいずれの単一又は複数の特徴又は態様は、他のいずれの１つ以上の請求項中に記載された他のいずれの特徴又は態様と、組み合わせる又は交換することができる。

【0057】

特定の実施形態の様々な特徴、要素、又はステップが、移行句「…を含む」を用いて開示される場合があるが、移行句「…からなる」又は「…から実質的になる」を用いて記述され得るものを含む代替実施形態が含意されていることを理解されたい。

【0058】

上述のように、化合物のＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）特性は、該化合物の臨床的な成功を予測するための、及びプロファイルに問題がある薬剤を選択し、代謝の障害を低減し、最終的に１日１回の投薬を実現可能とするための、重要な要素である。従来の生体外システムはある程度成功しており、医薬品発見プログラムにおける低クリアランス化合物のパーセンテージの増大をもたらしているが、課題は残っている。生体外データを用いて生体内肝臓代謝及び毒性を予測できることは、重要である。更に、ゆっくりとした代謝を示す薬剤候補化合物に関してさえ、薬剤候補化合物を、予測されたそのクリアランスに基づいて正確に区別することが重要である。例えば、化合物の生体内肝クリアランスの予測は、薬剤の発見及び開発において重要である。というのは、化合物のクリアランスパラメータを理解することは、薬剤半減期、経口バイオアベイラビリティ、用量、及び投薬計画を決定するための必須の因子であるためである。正確な生体外固有クリアランスデータを生成できることは、生体内ヒトクリアランスの予測に必須の要素である。というのは、薬剤候補の予想外の生体内クリアランスは、曝露に関する問題及び安全性に関する懸念につながる可能性があるためである。

【0059】

しかしながら、現行の生体外肝臓モデルは、低クリアランス化合物（限定するものではないが例えば低クリアランス薬剤候補）の生体内クリアランス又は半減期を、高い信頼性で正確に（例えば実際の２倍又は３倍以内で）予測できない。例えば、肝細胞が肝臓内に存在する酸化／還元、加水分解、及び複合薬物代謝酵素の完全な補体（従って肝クリアランス経路の完全なセット）を含むという事実、並びに新鮮な肝細胞及び凍結保存された肝細胞の両方の利用可能性の上昇により、生体内肝クリアランスを予測するためには、生体外肝細胞懸濁液を一般に用いる。しかしながら、肝細胞懸濁液及びヒト肝臓ミクロソームは一般に、特に低クリアランス化合物に関して、生体内クリアランスを過小予測する。これは主に、生体外肝細胞懸濁液（典型的には４〜６時間以内）及びヒト肝臓ミクロソーム（典型的には約１〜２時間に制限される）の酵素活性が時間と共に急速に喪失し、これによって、ゆっくりと代謝される低クリアランス化合物の代謝安定性を正確に評価する能力が阻害されることを原因とする。それどころか、ヒト肝臓ミクロソームの使用における固有クリアランス測定の下限は、典型的には１０ｍｌ／分／ｋｇであり、ヒト肝細胞懸濁液の使用における固有クリアランス測定の下限は、典型的には６．３ｍｌ／分／ｋｇである。上述のように、低クリアランス候補化合物のクリアランスは＜５ｍｌ／分／ｋｇである。

【0060】

本開示は特に、様々な生化学及び分子生物学的研究、特にＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究での使用のための、候補化合物と３Ｄ肝細胞スフェロイドとの相互作用を評価するための、方法及び実験器具を説明する。複数の態様では、上記方法及び実験器具を用いて、生体外３Ｄ肝細胞スフェロイド培養における候補化合物の代謝を評価できる。上記方法は、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた実験器具で実施され、上記設計により、肝臓の細胞（例えば肝細胞）の生存率及び機能性の長期的な維持が可能となるだけでなく、同一の条件及び培地下での（例えば長期間培養中の）複数から数百のスフェロイドの処理や、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究に関する十分な材料（例えば親薬剤、薬剤、代謝産物、並びに細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質）の生産並びに比較的高い信号強度の生成が可能となるが、これらは全て、個々の３Ｄスフェロイドの間に物理的なバリアを提供することにより、培養又は試験中のいずれのスフェロイドの融合を防止する。本開示の方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物は低クリアランス化合物である。上述のように、低クリアランス化合物は、クリアランスが＜５ｍｌ／分／ｋｇ分である化合物である。低クリアランス化合物としては、限定するものではないが、ワルファリン、メロキシカム、トルブタミド、ジアゼパム、アルプラゾラム、グリメピリド、プレドニゾロン、リルゾール、及びボリコナゾールが挙げられる。低クリアランス薬剤候補の生体内クリアランス又は半減期を高い信頼性で予測できない大半の現行の生体外肝臓モデルとは異なり、本方法により、他の使用法の中でも特に、正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成が可能となり、従って、特にこのような低クリアランス化合物を用いた場合の、生体内クリアランスの正確な予測が可能となる。例えば、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた本開示の方法は、９個の低クリアランス化合物の生体外固有クリアランスデータを生成したが、上記データは、実際の２倍以内が４４％、及び実際の３倍以内が６７％という生体内クリアランスの予測の精度を有していた。対照的に、２Ｄ単層を利用した方法は、同じ９個の低クリアランス化合物に関して、実際の２倍以内が３３％、及び実際の３倍以内が４４％という生体内クリアランスの予測の精度を有する生体外固有クリアランスデータしか生成しなかった。更に、ＨｅｐａｔｏＰａｃ（登録商標）等の他の同時培養システムと比較すると、本方法は、３Ｄスフェロイド培養において動物間質細胞を必要とせず、大幅に低いコストで完了させることができる。更に、生体外リレー法と比較すると、本方法は、肝細胞の解凍及び上清の移動を繰り返す必要がないため、労力がはるかに小さい。

【0061】

様々な実施形態では、１つ以上の低クリアランス候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法が開示される。複数の態様では、生体外３Ｄ肝細胞スフェロイド培養における低クリアランス候補化合物の代謝を評価するためのアッセイ法が開示される。上記アッセイ法は、肝細胞を細胞培養用物品中で培養してスフェロイドを形成するステップを含み、ここで上記細胞培養用物品はチャンバを備え、上記チャンバはマイクロキャビティのアレイを備え、各上記マイクロキャビティは、３Ｄスフェロイド形態で成長するように肝細胞に制約を与えるような構造を有する。上記アッセイ法は更に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞を上記１つ以上の低クリアランス候補化合物と接触させるステップを含む。上記アッセイ法はまた、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物と、３Ｄ肝細胞スフェロイドとの、生体外培養における相互作用を測定するステップを含み、このような相互作用としては、限定するものではないが：クリアランス研究（取り込みクリアランス、基底外側流出クリアランス、毛細胆管流出クリアランス、代謝クリアランス）；代謝産物ＩＤ及び代謝安定性（親寿命）；候補化合物の細胞内濃度；培養された３Ｄスフェロイド肝細胞の、タンパク質及び遺伝子調節（誘導／抑制）並びに他の分子的、生化学的、及び遺伝的分析；毒物学的効果；化合物動態；細胞内蓄積並びに浮遊濃度又は総細胞内濃度（結合濃度と浮遊濃度との合計）；胆管全体のクリアランス；Ｐ４５０及びトランスポーター薬剤相互作用；並びに薬物動態が挙げられる。実施形態では、測定された生体外相互作用を用いて、１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体内堆積を予測する。

【0062】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、（複数の態様では１つ以上の低クリアランス候補化合物と共に）３Ｄスフェロイドを形成する肝細胞を含むがこれに限定されない、培養される細胞は、長期間培養物として培養される。いくつかの実施形態では、培養される細胞は、少なくとも約１２時間、任意に少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日にわたって、（複数の態様では１つ以上の低クリアランス候補化合物と共に）培養される。長期間培養は、培養中の代謝経路等の機能的特性の確立を促進する。例えば図５に示すように、３Ｄ肝細胞スフェロイドを形成するための本開示の実験器具及び方法を用いて、９６ウェルスフェロイド培養プレート内で培養された、２人のドナー（Ｌｏｔ ２９９（上）及びＬｏｔ ３９７（下））からの初代ヒト肝細胞は、２Ｄで培養された肝細胞に比べて、長期間にわたって高い（テストステロンの添加によって活性化及び測定された）ＣＹＰ３Ａ４活性を維持した。本開示の方法のいくつかの実施形態では、培養された３Ｄスフェロイド肝細胞は、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、又は少なくとも約４週間にわたって、機能的に安定している。機能的安定性は、代謝活性、細胞機能、遺伝子発現、又はこれらの組み合わせの測定を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の方法で測定できる。いくつかの実施形態では、機能的安定性はＣＹＰ３Ａ４活性によって測定される。

【0063】

いくつかの実施形態では、上記チャンバの各上記マイクロキャビティは、上部アパーチャと、底面を備える液体非透過性底部とを備え、上記底面の少なくとも一部分は、上記底面内又は上記底面上に、低接着性又は非接着性材料を備える。いくつかの実施形態では、上記底面を含む上記液体非透過性底部は、ガス透過性である。いくつかの実施形態では、上記底部の少なくとも一部分は透明である。いくつかの実施形態では、上記底面は、凹状の底面を備える。いくつかの実施形態では、上記チャンバの各上記マイクロキャビティの上記少なくとも１つの凹状の底面は、半球面、側壁から上記底面への３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、上記チャンバは更に側壁を備える。いくつかの実施形態では、上記細胞培養用物品は１〜約２，０００個の上記チャンバを含み、各上記チャンバは他のいずれの上記チャンバから物理的に隔てられている。いくつかの実施形態では、各上記チャンバは、約２５〜約１，０００個の上記マイクロキャビティを含む。限定するものではないが例えば、６ウェルプレートは、この６ウェルプレートの１つのウェルにおよそ７００個のマイクロキャビティを備えてよく、従って１つのウェルに７００個のスフェロイド（合計およそ１２０万個の細胞）を収容する。同様に、２４ウェルプレートは、ウェル１個あたりおよそ１００〜２００個のマイクロキャビティを備えてよく、９６ウェルプレートは、ウェル１個あたりおよそ５０個のマイクロキャビティを備えてよい。

【0064】

スフェロイド等の３次元で培養された細胞は、単層として２次元で培養された同等の細胞に比べて、より生体内に近い機能性を示すことができる。２次元細胞培養システムでは、細胞は、これらの細胞が培養される基材に付着し得る。しかしながら、細胞をスフェロイド等の３次元で成長させると、細胞は基材に付着するのではなく、互いに相互作用する。３次元で培養された細胞は、細胞のコミュニケーション及び細胞外マトリックスの発達に関して、生体内組織により類似している。例えば、肝細胞の３Ｄスフェロイド培養により、持続的な肝細胞薬剤代謝活性及び細胞生存率が得られる。よって、肝細胞３Ｄスフェロイドは、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ研究（特にこのような低クリアランス化合物を用いた場合の生体内クリアランスのより正確な予測のための、正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成を含む）のための優れたモデルを提供する。

【0065】

ここで図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃを参照すると、マイクロキャビティスフェロイドプレート、この場合は９６ウェルマイクロキャビティスフェロイドプレートである、細胞培養用物品の一実施形態が示されており、これは、各ウェルの底面にマイクロキャビティのアレイを有し、各マイクロキャビティは、３Ｄスフェロイド形態で成長するように、培養された細胞に制約を与えるような構造を有し、これにより、９６個のウェルそれぞれにおいて複数のスフェロイドを提供する。図１Ａは、ウェルのアレイ１１０を有するマルチウェルプレート１０を示す。図１Ｂは、図１Ａのマルチウェルプレート１０の単一のウェル１０１を示す。単一のウェル１０１は、上部アパーチャ１１８、液体非透過性底面１０６、及び側壁１１３を有する。図１Ｃは、図１ＢのボックスＣに示されているウェル１０１の底面１０６の領域の拡大図であり、図１Ｂに示されている単一のウェルの底面のマイクロキャビティのアレイ１１２を示す。マイクロキャビティのアレイ１１２の各マイクロキャビティ１１５は、側壁１２１及び液体非透過性底面１１６を有する。個々のウェル１０１の底部においてマイクロキャビティのアレイ１１２を提供する、図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに示されているマイクロキャビティスフェロイドプレートを用いて、マルチウェルプレートの個々のウェルの各マイクロキャビティ内で１つの独立した３Ｄスフェロイドを成長させることができる。このタイプの容器を用いることにより、ユーザは、マルチウェルプレートの各ウェルで多数のスフェロイドを成長させることができ、これにより、長期の生存率及び機能性を維持し、かつ本明細書で提供されるアッセイでの使用のための培養及び実験条件と同一の条件下で処理できる、多数の肝臓細胞スフェロイドを提供できる。更に、このタイプの容器は、個々の３Ｄスフェロイド間に物理的なバリアを提供することにより、培養又は試験中のいずれのスフェロイドの融合を防止する。図３Ａ、及び図３Ｂに示すように、（図３Ａの時点０に示されている）Ｃｏｒｎｉｎｇ ＨｅｐａｔｏＣｅｌｌｓから作製されたスフェロイドを手動で集めて２２時間にわたってインキュベートすると、スフェロイドは１つに融合した（図３Ｂに示されている）。スフェロイドの融合は、総体積に対する露出した細胞表面積の比率の変化につながり得る。よって、本開示のマイクロウェルの設計は、ウェル全体にわたる均質な拡散及び薬剤代謝活性を可能とするために、試験化合物との長期のインキュベーション時間中に、各スフェロイドの完全性を維持できるようにする、物理的なバリアを提供する。

【0066】

ここで図２Ａを参照すると、マイクロキャビティのアレイ１１２の一例が示されている。図２Ａはマイクロキャビティ１１５を示し、これらはそれぞれ、上部アパーチャ１１８、底面１１９、深さｄ、及び側壁１２１によって画定される幅ｗを有する。図２Ａ、及び図２Ｂに示すように、マイクロキャビティのアレイは、液体非透過性の凹状弓形底面１１６を有する。実施形態では、マイクロキャビティの底面は、丸底若しくは円錐型、角度付き、平坦、又は３Ｄスフェロイドの形成に好適ないずれの形状とすることができる。丸底が好ましい。丸底１１９は、垂直な側壁が丸底１１９に移行する際の移行ゾーン１１４を有することができる。これは、平滑な又は角度付きの移行ゾーンとすることができる。実施形態では、「マイクロキャビティ」は例えば、上側アパーチャ１１８及び最下点１１６、上側アパーチャの中心、並びに最下点と上側アパーチャの中心との間の中心軸１０５を画定する、マイクロウェル１１５とすることができる。実施形態では、ウェルは、軸に関して回転対称である（即ち側壁が円筒形である）。いくつかの実施形態では、上側アパーチャは、２５０μｍ〜１ｍｍ、又はこれらの測定値の間のいずれの範囲の、上側アパーチャを横断する距離（幅ｗ）を画定する。いくつかの実施形態では、上側アパーチャから最下点までの距離（深さ「ｄ」）は、２００μｍ〜９００μｍ、又は４００〜６００μｍである。マイクロキャビティのアレイは様々な幾何学的形状、例えば放物線状、双曲線状、シェブロン状、及び同等の断面幾何学形状、又はこれらの組み合わせを有してよい。実施形態では、マイクロキャビティは、マイクロキャビティをラボベンチ又はテーブルといった表面との直接接触から保護するために、マイクロキャビティの下に保護層１３０を有してよい。いくつかの実施形態では、ウェルの底部１１９と保護層との間に空間１１０が設けられていてよい。実施形態では、空間１１０は、外部環境と連通していてよく、又は閉鎖されていてよい。３Ｄ肝細胞スフェロイド２５は、いくつかの独立したマイクロキャビティ１１５の底部に示されている。ここで図２Ｂを参照すると、マイクロキャビティのアレイ１１２の更なる例が示されている。図２Ｂは、マイクロキャビティのアレイ１１２が、正弦曲線又は放物線形状を有してよいことを示している。この形状は、丸みを帯びた上縁部又はマイクロキャビティ縁部を形成し、これにより、実施形態では、マイクロキャビティの上部の鋭利なコーナー又は９０°の角度における、空気の閉じ込めが低減される。図２Ｂに示すように、複数の態様では、マイクロキャビティ１１５は、上部直径Ｄｔｏｐを有する上部開口、マイクロキャビティの底部１１６からマイクロキャビティの上部までの高さＨ、マイクロキャビティの上部とマイクロキャビティの底部１１６との間の半分の高さにおけるマイクロキャビティの直径Ｄ_Ｈ、及び側壁１１３を有する。このような実施形態では、ウェルの底部は丸底（例えば半球状）であり、側壁の直径はウェルの底部から上部に向かって増大し、ウェルの間の境界は丸みを帯びている。従って、ウェルの上部は直角に終端しない。いくつかの実施形態では、ウェルは、底部と上部との間の半分の地点における直径Ｄ（Ｄ_Ｈとも呼ばれる）、ウェルの上部における直径Ｄ_ｔｏｐ、及びウェルの底部から上部までの高さＨを有する。これらの実施形態では、Ｄ_ｔｏｐはＤより大きい。

【0067】

実施形態では、少なくとも１つの凹状弓形底面又は「カップ（ｃｕｐ）」を有するマイクロキャビティの底面は例えば、半球面、丸底を有する円錐面、及び類似の表面幾何学形状、又はこれらの組み合わせとすることができる。マイクロキャビティの底部は、ディンプル、ピット、及び同様の凹状の円錐台状起伏表面、又はこれらの組み合わせといった、スフェロイドに「好都合な（ｆｒｉｅｎｄｌｙ）」丸みを帯びた又は湾曲した表面で終端するか、終了するか、又はこのような表面となる。実施形態では、チャンバ内の各マイクロキャビティの少なくとも１つの凹面は、半球面、側壁から底面に向かって３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの凹状弓形底面は例えば、例えば選択されたウェルの幾何学的形状、各ウェル内の凹状弓型表面の数、プレート内のウェルの数、及び同等の考慮事項に応じて、例えば約２５０〜約５，０００マイクロメートル（即ち０．０１０〜０．２００インチ）（中間値及び範囲を含む）の直径を有する、半球の水平断片又はスライスといった半球の一部分とすることができる。他の凹状弓型表面は、放物線状、双曲線状、シェブロン状、及び同等の幾何学的形状、又はこれらの組み合わせを有することができる。

【0068】

実施形態では、チャンバを備える細胞培養用物品（各チャンバはマイクロキャビティ（例えばマルチウェルプレート、マイクロキャビティスフェロイドプレート、マイクロキャビティインサート、マイクロキャビティインサートプレート等）を備える）は、低接着性、超低接着性、又は非接着性コーティングを更に備えることができる。このコーティングは、各マイクロキャビティの少なくとも１つの底面若しくは少なくとも１つの凹状の底面、及び／又は各マイクロキャビティの１つ以上の側壁といった、マイクロキャビティの一部分の上にあってよい。非接着性材料の例としては、パーフルオロ化ポリマー、オレフィン、若しくは同等のポリマー、又はこれらの混合物が挙げられる。他の例としては：アガロース；ポリアクリルアミド等の非イオン性ヒドロゲル；ポリエチレンオキシド、若しくはポリビニルアルコール等のポリオールといった、ポリエーテル；若しくは同等の材料；又はこれらの混合物が挙げられる。

【0069】

実施形態では、チャンバ及び／又は各マイクロキャビティの側壁表面（即ち周囲）は例えば：垂直な円筒又はシャフト；チャンバの上部からチャンバの底部に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分；ウェルの上部が正方形又は楕円形であり、円錐へと移行して、少なくとも１つの凹状弓型表面を有する（即ち丸みを帯びた又は湾曲した）底部で終端する、垂直な正方形シャフト又は垂直な楕円形シャフト；あるいはこれらの組み合わせとすることができる。他の幾何学的形状の例としては：孔が空いた円筒形；孔が空いた円錐；初めは円筒形で、その後円錐になる形状；及び他の同等の幾何学的形状；又はこれらの組み合わせが挙げられる。

【0070】

例えば、低接着性の基材、マイクロキャビティの本体及び基部のウェルの湾曲、並びに重力のうちの１つ以上によって、腫瘍細胞を、スフェロイドへと自己集合するように誘導できる。例えば、個々の細胞は、マイクロキャビティの底部へと落下して互いに接着し（マイクロウェルの低結合性コーティング済み表面には接着せず）、スフェロイドへと成長できる。肝細胞は、２Ｄ単層で成長した細胞に比べてより生体内に近い応答の指標である、分化した細胞機能を維持する。実施形態では、例えばスフェロイド中の細胞のタイプに応じて、スフェロイドは例えば、直径が例えば約１００〜約５００マイクロメートル、より好ましくは約１５０〜約４００マイクロメートル、更に好ましくは約１５０〜約３００マイクロメートル、最も好ましくは約２００〜約２５０マイクロメートル（中間値及び範囲を含む）の略球体とすることができる。スフェロイドの直径は例えば約２００〜約４００マイクロメートルとすることができ、直径の上限は拡散に関する考慮事項によって制約を受ける。

【0071】

実施形態では、チャンバ及び／又はチャンバ内の各マイクロキャビティを含む細胞培養用物品は、不透明の側壁、及び／又は少なくとも１つの凹面を備えるガス透過性かつ液体非透過性の底部を更に含むことができる。不透明の側壁は、蛍光撮像を採用した場合にウェル又はマイクロウェル間のクロストークを防止する。いくつかの実施形態では、上記底部の、少なくとも１つの凹面を備える少なくとも一部分は、透明である。このような特徴部分を有する細胞培養用物品（例えばマイクロキャビティスフェロイドプレート、マイクロキャビティインサート、マイクロキャビティインサートプレート等）は、本開示の方法に関する複数の利点を提供でき、上記利点としては、培養した細胞のスフェロイドを、（スフェロイドが形成され、視認できる）あるマルチウェルプレートから、アッセイを実施するための別のプレートに移す必要がなくなり、従って時間が節約され、またスフェロイドの不必要な破壊が回避されることが挙げられる。更に、ガス透過性底部（例えば特定の所与の厚さにおいてガス透過特性を有するポリマーから作製されたウェル底部）により、３Ｄ肝細胞スフェロイドにより多量の酸素を付加できる。例示的なガス透過性底部は、特定の厚さの、パーフルオロ化ポリマー、又はポリ４メチルペンタン等のポリマーから形成できる。

【0072】

ガス透過性ポリマーの代表的な厚さ及び範囲は例えば、約０．００１インチ（２５．４マイクロメートル）〜約０．０２５インチ（６３．５マイクロメートル）、０．００１５インチ（３８．１マイクロメートル）〜約０．０３インチ（７６．２マイクロメートル）（中間値及び範囲を含む）とすることができる（ここで１インチ＝２５，４００マイクロメートル；０．００００３９インチ＝１マイクロメートルである）。更に、又はあるいは、ポリジメチルシロキサンポリマー等の高いガス透過性を有する他の材料が、例えば最大約１インチ（２．５４ｃｍ）の厚さにおいて、十分なガス拡散を提供できる。

【0073】

ここで図４を参照すると、様々な生化学及び分子生物学的研究、特にＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究での使用のための、生体外培養における候補化合物と３Ｄ肝細胞スフェロイドとの相互作用を評価するための、本開示の方法及び実験器具の一実施形態が示されている。複数の態様では、本開示の方法及び実験器具を用いて、生体外３Ｄ肝細胞スフェロイド培養における１つ以上の低クリアランス候補化合物の代謝を評価する。図４に示すように、（肝臓から単離できる肝細胞及び／又は非実質細胞を含むがこれらに限定されない）肝臓細胞等の関心対象の細胞２０１を、３Ｄ形態で成長するように肝臓細胞に制約を与えるような構造を有する細胞培養用物品（例えばマイクロキャビティスフェロイドプレート、マイクロキャビティインサート、マイクロキャビティインサートプレート等）のキャビティのマイクロキャビティ内の培地中で成長させる（即ち長期間であってよい培養を行う）（２０３）。この場合、図示されているように、細胞培養用物品は２４ウェルマイクロキャビティスフェロイドプレートであり、また（肝細胞及び／又は非実質細胞を含むがこれらに限定されない）肝臓細胞等の関心対象の細胞は、マイクロキャビティのアレイ１１２を有するマルチウェルプレート１０のウェル１０１内で成長（２０３）し、各マイクロキャビティ１１５は、３Ｄスフェロイド形態２５で成長するように関心対象の細胞に制約を与えるような構造を有し、これにより、マルチウェルプレートのウェルの底面上のマイクロキャビティのアレイ中の各マイクロキャビティにおいて１つずつの、スフェロイドのアレイの発生が得られる。培養において細胞が成長及び増殖する際、細胞は、スフェロイドとして成長するように制約を受ける。スフェロイド２５が発生する。複数の態様では、マイクロキャビティインサート又はマイクロキャビティインサートプレートを用いて、関心対象の細胞を、３Ｄスフェロイド形態で成長するように培養できる。例えば図７Ａに示すように、インサートは、上部アパーチャ４１８と、側壁４２１と、マイクロキャビティ４２０のアレイを形成する底面４１９とを有する。マイクロキャビティインサート又はマイクロキャビティインサートプレートの使用により、より迅速にスフェロイドを形成できる。例えば図７Ｂ（肝細胞培養の１日目）及び図７Ｃ（肝細胞培養の３日目）に示すように、２４ウェルマイクロキャビティインサートを用いて、３日間の培養で肝細胞スフェロイドを形成できる。インサートは多数の構成で利用でき、上記構成としては、限定するものではないが、６ウェルマイクロキャビティインサート、１２ウェルマイクロキャビティインサート、２４ウェルマイクロキャビティインサート、４８ウェルマイクロキャビティインサート、９６ウェルマイクロキャビティインサート、及び単一のプレートが複数のインサートを内包しており、マルチウェルインサートプレートは、相補的なマルチウェルプレートのウェルのアレイに挿入されるような構造を有する、インサートプレート構成が挙げられることを理解されたい。

【0074】

再び図４を参照すると、（肝細胞及び／又は非実質細胞を含むがこれらに限定されない）肝臓細胞がスフェロイド２５へと成長した後、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ（吸収、分布、代謝、排泄、及び毒性）研究を含む肝臓代謝研究を、１つ以上の低クリアランス候補化合物２０５に関して実施できる。例えば、３Ｄ肝臓細胞スフェロイド及び候補化合物が共にインキュベートされるように、１つ以上の低クリアランス候補化合物をマルチウェルプレートの各ウェルに加えることができる。次に、適切な期間の後、１つ以上の低クリアランス候補化合物と細胞との相互作用を評価する。１つ以上の低クリアランス候補化合物と３Ｄ肝臓細胞スフェロイド（例えば３Ｄ肝細胞スフェロイド）との評価可能な相互作用としては、限定するものではないが：クリアランス研究（取り込みクリアランス、基底外側流出クリアランス、毛細胆管流出クリアランス、代謝クリアランス）；代謝産物ＩＤ及び代謝安定性（親寿命）；候補化合物の細胞内濃度；培養された３Ｄスフェロイド肝細胞の、タンパク質及び遺伝子調節（誘導／抑制）並びに他の分子的、生化学的、及び遺伝的分析；毒物学的効果；化合物動態；細胞内蓄積並びに浮遊濃度又は総細胞内濃度（結合濃度＋浮遊濃度）；胆管全体のクリアランス；Ｐ４５０及びトランスポーター薬剤相互作用；並びに薬物動態が挙げられる。これらの相互作用及び効果は、生体染色技法、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織化学、並びに様々な従来の分子、生化学及び遺伝的アッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知のいずれの適当な手段によって測定してよい。上述のように、本発明の方法は、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた実験器具で実施され、上記設計により、肝臓の細胞（例えば肝細胞）の生存率及び機能性の長期的な維持が可能となるだけでなく、同一条件下での複数から数百のスフェロイドの処理や、上述の様々な研究に関する十分な材料（例えば親薬剤、薬剤、代謝産物、並びに細胞由来のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質）の生産並びに比較的高い信号強度の生成が可能となる。インキュベーション期間は、１つ以上の低クリアランス候補化合物に応じて様々となる。インキュベーション時間の調整は予備実験で行うことができ、十分に当業者の一般的な技能の範囲内である。

【0075】

いくつかの実施形態では、１つ以上の低クリアランス候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法は、細胞培養用物品中で肝細胞を培養してスフェロイドを形成するステップを含み、上記細胞培養用物品はチャンバを備え、上記チャンバはマイクロキャビティのアレイを備え、各上記マイクロキャビティは、３Ｄスフェロイド形態で成長するように上記肝細胞に制約を与えるような構造を有する。上記アッセイ法は更に、３Ｄ肝細胞スフェロイドを１つ以上の低クリアランス候補化合物と接触させるステップを含む。適切な期間の後、上記アッセイ法はまた、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体外固有クリアランスを測定するステップを含む。このインキュベーション期間は、候補化合物に応じて様々となる。インキュベーション時間の調整は予備実験で行うことができ、十分に当業者の一般的な技能の範囲内である。

【0076】

いくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物の生体外固有クリアランスは、上記１つ以上の候補化合物からの代謝産物の形成によって測定される。しかしながら、薬剤代謝産物の形成（例えば存在又は不在）から固有クリアランスを計算するためには、十分に定義されたクリアランス経路（例えば候補化合物クリアランスの要因となる特定の酵素）、及び確実な代謝産物基準が必要であり、これらは常に判明しているわけではなく、又は常に利用可能であるわけではない。よって実施形態では、１つ以上の候補化合物の生体外固有クリアランスを、この１つ以上の消失によって測定する。１つ以上の候補化合物からの代謝産物の形成及び／又は１つ以上の候補化合物の消失はいずれも、当該技術分野で公知のいずれの手段で測定でき、上記手段としては、限定するものではないが、質量分光分析、液体クロマトグラフィ‐質量分光分析、液体クロマトグラフィ‐タンデム質量分光分析、又は高速液体クロマトグラフィが挙げられる。生体外クリアランスは、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ ４１：２０２４‐２０３２（この文献はその全体が参照により本出願に援用される）で開示されているような、当該技術分野で公知の方法で計算できる。

【0077】

いくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物の、測定された生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の候補化合物の生体内半減期を予測する。いくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物の、測定された生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の候補化合物の生体内クリアランスを予測する。例えば、十分に撹拌したモデルを用いて、実施例において示されるように、計算された生体外固有クリアランスから、生体内肝クリアランスを計算できる。

【0078】

いくつかの実施形態では、上記アッセイ法は更に、１つ以上の低クリアランス候補化合物の代謝産物を分析するステップを含み、上記代謝産物は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成される。いくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析するステップは、１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された１つ以上の候補化合物の代謝産物の同定を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の候補化合物の代謝産物を分析するステップは、１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された１つ以上の候補化合物の代謝産物の定量化を含む。１つ以上の低クリアランス候補化合物からの代謝産物の形成の測定は、代謝産物の同定のためであるか代謝産物の定量化のためであるかに関わらず、当該技術分野で公知のいずれの手段によって測定でき、上記手段としては、限定するものではないが、質量分光分析、液体クロマトグラフィ‐質量分光分析、液体クロマトグラフィ‐タンデム質量分光分析、又は高速液体クロマトグラフィが挙げられる。

【0079】

いくつかの実施形態では、上記アッセイ法は、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析するステップを含む。インキュベーション期間中の１つ以上の低クリアランス候補化合物による３Ｄスフェロイド肝細胞への影響は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって測定でき、上記手段としては、細胞、細胞抽出物、又は培地の遺伝子、代謝又はタンパク質分析、例えば公知の可視化技法、蛍光測定、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫組織化学アッセイ、並びに様々な従来の分子、生化学及び遺伝的アッセイが挙げられる。いくつかの実施形態では、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中の、遺伝子及び／又はタンパク質発現の変化を測定するステップを含む。いくつかの実施形態では、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞によって産生された（例えば上記細胞、細胞抽出物、及び／又は培地から単離された）ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を測定するステップを含む。

【0080】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、候補化合物としては：一般に「薬剤（ｄｒｕｇ）」と呼ばれる生体異物低分子量治療剤、及び他の治療剤；発癌性物質；環境汚染物質；並びにステロイド、胆汁酸、脂肪酸、及びプロスタグランジンといった生物体内物質が挙げられる。候補化合物は、あらゆる種類の作用を含む薬剤を含んでよく、上記作用としては、限定するものではないが、抗腫瘍剤、免疫抑制剤、免疫刺激剤、抗増殖剤、抗トロンビン剤、抗血小板剤、抗脂質剤、抗炎症剤、抗生物質、血管新生剤、抗血管新生剤、ビタミン、ＡＣＥ阻害剤、血管作動性物質、抗有糸分裂剤、メテロプロテイナーゼ阻害剤、ＮＯドナー、エストラジオール、抗硬化剤、ホルモン、フリーラジカルスカベンジャー、毒素、アルキル化剤（単独又は組み合わせ）が挙げられる。候補化合物としては、限定するものではないが例として生物剤も挙げられ、上記生物剤としては、限定するものではないが、ペプチド、脂質、タンパク質薬剤、タンパク質複合体薬剤、酵素、オリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝物質、プリオン、ウイルス、及び微生物が挙げられる。

【0081】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、上記方法は、複数の候補化合物を同時に評価するステップを含む。本開示の方法のいくつかの実施形態では、上記方法は、１つ以上の候補化合物を３Ｄスフェロイド肝細胞に繰り返し曝露する／接触させるステップを含む。

【0082】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、肝細胞は、肝臓の主要な実質組織に由来するいずれの細胞とすることができる。肝細胞は、ヒトを含む動物から取得若しくは単離された初代肝細胞とすることができ、又は肝細胞は、肝細胞株若しくは初代肝細胞由来細胞とすることができる。実施形態では、細胞集団は、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、サル細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、モルモット細胞、魚類細胞を含むがこれらに限定されない１つ以上の種に由来するものとすることができる。更に、上記細胞は、新鮮なものであっても凍結保存されたものであってもよい。

【0083】

本開示の方法のいくつかの実施形態では、非実質細胞を、培養される肝細胞と共に含むことができ、又は培養される肝細胞と同時培養できる。非実質細胞としては、限定するものではないが、クッパー細胞、（伊東細胞、類洞内皮細胞、及び胆管細胞を含むがこれらに限定されない）肝臓細胞、（線維芽細胞、及び周皮細胞を含むがこれらに限定されない）間質細胞、（Ｔ細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、肥満細胞を含むがこれらに限定されない）免疫細胞、並びに（肝臓前駆細胞、胚性幹細胞、及び造血幹細胞を含むがこれらに限定されない）幹細胞が挙げられる。これらの細胞集団は、ヒト細胞、ラット細胞、マウス細胞、サル細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、モルモット細胞、魚類細胞を含むがこれらに限定されない１つ以上の種に由来するものとすることができる。更に、上記細胞は、新鮮なものであっても凍結保存されたものであってもよい。本開示の方法のいくつかの実施形態では、３Ｄスフェロイド培養における動物間質細胞に要件はない。

【0084】

いくつかの実施形態では、肝細胞の培養中にマトリックス又は足場を使用できる。よって、肝細胞（及び非実質細胞を含む他の同時に培養される可能性がある細胞）を、培養中にマトリックス若しくは足場に埋め込む、混合する、又はマトリックス若しくは足場で覆うことができる。代表的なマトリックス又は足場としては、限定するものではないがコラーゲン、ラミニン、及びマトリゲル（登録商標）といった、いずれの好適な天然又は合成マトリックス又は足場が挙げられる。

【0085】

いくつかの実施形態では、上記方法は、当該技術分野で公知の、（例えば栄養分（例えばタンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギ（例えば炭水化物）、必須金属及び無機物（例えばカルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩、硫酸塩）、緩衝剤（例えばリン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化のインジケータ（例えばフェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択された作用剤（例えば化学物質、抗微生物剤）等を含む）培養培地を含む。

【0086】

態様
方法、システム、組成物、及びキットの様々な態様を本明細書に記載した。このような方法、システム、組成物、及びキットのいくつかの選択された例の概要を以下に提供する。

【0087】

第１の態様は、１つ以上の低クリアランス候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法であり、上記アッセイ法は：
肝細胞を細胞培養用物品中で培養してスフェロイドを形成するステップであって、ここで上記細胞培養用物品はチャンバを備え、上記チャンバは、マイクロキャビティのアレイを備え、各上記マイクロキャビティは、肝細胞スフェロイドを形成するために、３Ｄスフェロイド形態で成長するように肝細胞に制約を与えるような構造を有し、上記チャンバの各上記マイクロキャビティは：
上部アパーチャ；及び底面を備える液体非透過性底部であって、上記底部の少なくとも一部分は、上記底面内又は上記底面上に低接着性又は非接着性材料を含む、液体非透過性底部
を備える、ステップ；
３Ｄ肝細胞スフェロイドを上記１つ以上の低クリアランス候補化合物と接触させるステップ；並びに
上記１つ以上の候補化合物の生体外固有クリアランスを測定するステップ
を含む、アッセイ法である。

【0088】

第２の態様は、上記培養が長期間培養である、第１の態様に記載の方法である。

【0089】

第３の態様は、上記長期間培養が、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日にわたる、第１又は第２の態様に記載の方法である。

【0090】

第４の態様は、上記底面を備える上記液体非透過性底部が、ガス透過性である、第１〜第３の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0091】

第５の態様は、上記底面が凹状の底面を備える、第１〜第４の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0092】

第６の態様は、上記底部の少なくとも一部分が透明である、第１〜第５の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0093】

第７の態様は、上記凹面が、半球面、側壁から上記底面への３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む、第５の態様に記載の方法である。

【0094】

第８の態様は、上記チャンバの各上記マイクロキャビティが更に側壁を備える、第１〜第７の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0095】

第９の態様は、上記側壁の表面が、垂直な円筒、上記チャンバの上部から底面に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分、上記凹状の底面に向かう円錐状移行部分を有する垂直な四角形シャフト、又はこれらの組み合わせを備える、第８の態様に記載の方法である。

【0096】

第１０の態様は、上記細胞培養用物品が１〜約２，０００個の上記チャンバを備え、各上記チャンバは他のいずれの上記チャンバから物理的に隔てられている、第１〜第９の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0097】

第１１の態様は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスが、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の消失によって測定される、第１〜第１０の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0098】

第１２の態様は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスが、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物からの代謝産物の形成によって測定される、第１〜第１１の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0099】

第１３の態様は、測定された上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体内半減期を予測する、第１〜第１２の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0100】

第１４の態様は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体内クリアランスを予測する、第１〜第１３の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0101】

第１５の態様は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の代謝産物を分析するステップを更に含み、上記代謝産物は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成される、第１〜第１４の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0102】

第１６の態様は、上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップが、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の同定を含む、第１５の態様に記載の方法である。

【0103】

第１７の態様は、上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップが、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の定量化を含む、第１５の態様に記載の方法である。

【0104】

第１８の態様は、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析するステップを更に含む、第１〜第１７の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0105】

第１９の態様は、上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップが、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞によって産生されたＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を測定するステップを含む、第１８の態様に記載の方法である。

【0106】

第２０の態様は、上記肝細胞が初代ヒト肝細胞を含む、第１〜第１９の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0107】

第２１の態様は、上記肝細胞が肝細胞株を含む、第１〜第２０の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0108】

第２２の態様は、複数の候補化合物を同時に評価するステップを更に含む、第１〜第２１の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0109】

第２３の態様は、上記３Ｄスフェロイド肝細胞が、少なくとも３週間にわたって機能的に安定している、第１〜第２２の態様のいずれか１つに記載の方法である。

【0110】

第２４の態様は、上記３Ｄスフェロイド肝細胞の機能的安定性が、代謝活性、細胞機能、遺伝子発現、又はこれらの組み合わせを測定することによって決定される、第２３の態様に記載の方法である。

【0111】

第２５の態様は、上記機能的安定性が、ＣＹＰ３Ａ４活性によって測定される、第２４の態様に記載の方法である。

【実施例】

【0112】

以下の実施例は、本開示の具体的な特徴及び態様を例示することを意図したものであり、本開示の範囲の限定として解釈してはならない。

【0113】

実施例１
初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）高密度（ＨＤ）スフェロイド培養
スフェロイドインサートの予備湿潤：ピペットエイドを低分散速度とした。５ｍＬピペットを使用し、チップを側壁に対して底部に位置決めして、２ｍＬのウィリアムＥ培地＋（ＷＥＭ＋）培地（ＦＢＳ非含有）を、およそ７００マイクロウェル／ウェルインサートを有する６ウェルスフェロイドインサートに加えた。２００μｌのピペットチップを用いて、マイクロウェル内に閉じ込められたいずれの気泡を吹き飛ばした。顕微鏡下でプレートを検査して、全ての気泡が除去されたことを確認した。

【0114】

６ウェル高密度スフェロイドインサート（〜７００マイクロウェル／インサート）へのＰＨＨの播種：ＰＨＨを標準的な手順として解凍し、ＷＥＭ播種培地中に再懸濁した。ＰＨＨを計数し、ＷＥＭ播種培地を用いて細胞密度を０．３５ｅ６／ｍｌに調整した。ＰＨＨの播種のために、ピペットエイドを低分散速度に設定した。播種の直前に、５ｍＬピペットを用いて、予備湿潤済みのインサートから大半の培地を除去した。穏やかに上下にピペッティングすることにより、均一な細胞懸濁液を調製した。５ｍＬピペットを、チップが側壁に対して底部に位置決めされた状態で使用して、２ｍＬの細胞懸濁液（細胞７００Ｋ個、〜１０００個／マイクロウェル）を６ウェルスフェロイドインサートに加えた。プレートをフード内に１５〜２０分間静置した。４倍対物レンズを備えた顕微鏡下でプレートを検査して、各マイクロウェル内に同数の細胞が定着したことを確認した。

【0115】

実施例２
３Ｄ ＰＨＨ高密度スフェロイド薬剤クリアランスアッセイ
ＷＭＥ＋培地での培地の半量の交換：ピペットエイドを低分散速度とした。５ｍＬピペットを用いて、１ｍＬの古い培地を各インサートからゆっくりと取り出した。１０００μＬピペットチップをインサート側壁の上部に対して位置決めし、１ｍＬの予熱したＷＭＥ＋培地を、この培地が側壁を流れ落ちるようにして、ゆっくりと加えた。培地の半量の交換の度に５〜１０分間待機して、培地の半量の交換を更に３回繰り返した。ＰＨＨを顕微鏡下で、スフェロイドの形成に関して検査した。

【0116】

表１に示すような、最終ＤＭＳＯ濃度が０．２％未満の２Ｘクリアランスアッセイ溶液の調製

【0117】

【表1】

【0118】

クリアランス試験の対象である１つ以上の候補化合物と、培養されたスフェロイドとのインキュベーション：ピペットエイドを低分散速度に設定した。５ｍＬピペットを用いて、１ｍＬの古い培地を各インサートからゆっくりと取り出した。１０００μＬピペットチップをインサート側壁の上部に対して位置決めし、クリアランス試験の対象である候補化合物を含有する１ｍＬの２×基質溶液を、この培地が側壁を流れ落ちるようにして、ゆっくりと加えた。５〜１０分後、培養物を３７℃のインキュベータに戻した。インキュベーションのタイマーをこの時点で開始した。

【0119】

サンプリング：４０μＬ／ウェルの停止溶液ラベタロール（０．０５％ＦＡ／５０％ＡＣＮ中で０．２μＭ）を、アッセイプレートに分注し、氷上で保持した。所望のアッセイインキュベーション時点（０時間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、３週、４週、又はこれらの間のいずれの値若しくは範囲）において、各インキュベーションウェルから４０μＬのサンプルを抽出し、停止溶液と十分に混合して、−８０℃で保存した。

【0120】

ＬＣ／ＭＳ分析：候補化合物の量を、当該技術分野で公知であるように、液体クロマトグラフィ／質量分光分析を用いて測定した。

【0121】

実施例３
データ分析及びクリアランスの計算
除去率定数（ｋ_ｅｌ）の計算：当該技術分野において公知であるように、特定のインキュベーション時点における質量分光分析ピーク面積比を、ゼロ時点におけるもので除算することによって、培養物中に残存する候補化合物の百分率を計算した。残存する候補化合物の百分率の自然対数を時間に対してプロットし、傾きからの絶対値としてｋ_ｅｌを計算した。

【0122】

候補化合物の欠乏半減期の計算：候補化合物に関してｋ_ｅｌを決定した後、当該技術分野において公知であるように、候補化合物の欠乏半減期を等式１によって決定した。

【0123】

【数1】

【0124】

候補化合物の生体外クリアランス（Ｃｌｉｎｔ）の計算：当該技術分野において公知であるように、候補化合物の生体外クリアランスを、等式１からの生体外半減期と等式２の倍率とを用いて計算した。

【0125】

【数2】

【0126】

予測生体内肝クリアランス（ＣＬ_ｈ）の計算：当該技術分野において公知であるように、生体内肝クリアランスを、等式２によって決定された生体外クリアランスから、十分に混合されたモデル等式３を用いて計算した。

【0127】

【数3】

【0128】

実施例４
結果
図６Ａ〜Ｉに示すように、本開示の方法及び実験器具は、ワルファリン（図６Ａ）、メロキシカム（図６Ｂ）、トルブタミド（図６Ｃ）、ジアゼパム（図６Ｄ）、グリメピリド（図６Ｅ）、アルプラゾラム（図６Ｆ）、プレドニゾロン（図６Ｇ）、リルゾール（図６Ｈ）、及びボリコナゾール（図６Ｉ）といった古典的な低クリアランス化合物を測定できた。更に、表２に示すように、３Ｄスフェロイド培養を微小パターン形成設計と組み合わせた本開示の方法は、９個の低クリアランス化合物の生体外固有クリアランスデータを生成したが、上記データは、実際の２倍以内が４４％、及び実際の３倍以内が６７％という生体内肝クリアランスの予測の精度を有していた。対照的に、２Ｄ単層を利用した方法は、同じ９個の低クリアランス化合物に関して、実際の２倍以内が３３％、及び実際の３倍以内が４４％という生体内クリアランスの予測の精度を有する生体外固有クリアランスデータしか生成しなかった。よって、低クリアランス薬剤候補の生体内クリアランス又は半減期を高い信頼性で予測できない、大半の現行の生体外肝臓モデルとは異なり、本開示のデータは、本発明の方法により、他の用途の中でもとりわけ、低クリアランス化合物の正確な生体外固有クリアランスデータの調査及び生成、従って特に上述のような低クリアランス化合物を用いた場合の生体内クリアランスのより正確な予測が可能となることを実証している。対照的に、浮遊フォーマットで成長させたＰＨＨでは、ワルファリン（図８Ａ）、メロキシカム（図８Ｂ）、トルブタミド（図８Ｃ）、ジアゼパム（図８Ｄ）、グリメピリド（図８Ｅ）、アルプラゾラム（図８Ｆ）、プレドニゾロン（図８Ｇ）、リルゾール（図８Ｈ）、及びボリコナゾール（図８Ｉ）といった古典的な低クリアランス化合物を測定できなかった。

【0129】

【表2】

【0130】

本明細書中で言及された全ての刊行物及び特許は、参照により本出願に援用される。本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術に対して様々な修正及び変更を実施できることは、当業者には明らかであろう。本開示は、特定の好ましい実施形態との関連で記述されているが、請求対象となる本開示は、これらの特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。本発明の技術の精神及び実態を組み込んだ本開示の実施形態の修正、組み合わせ、部分的組み合わせ、及び変更は、当業者に想起され得るものであるため、本発明の技術は、添付の請求項及びその均等物の範囲内の全てを含むものとして解釈されるものとする。

【0131】

以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。

【0132】

実施形態１
１つ以上の低クリアランス候補化合物と肝細胞との相互作用を評価するためのアッセイ法であって、上記アッセイ法は：
肝細胞を細胞培養用物品中で培養してスフェロイドを形成するステップであって、ここで上記細胞培養用物品はチャンバを備え、上記チャンバは、マイクロキャビティのアレイを備え、各上記マイクロキャビティは、肝細胞スフェロイドを形成するために、３Ｄスフェロイド形態で成長するように肝細胞に制約を与えるような構造を有し、上記チャンバの各上記マイクロキャビティは：
上部アパーチャ；及び底面を備える液体非透過性底部であって、上記底部の少なくとも一部分は、上記底面内又は上記底面上に低接着性又は非接着性材料を含む、液体非透過性底部
を備える、ステップ；
３Ｄ肝細胞スフェロイドを上記１つ以上の低クリアランス候補化合物と接触させるステップ；並びに
上記１つ以上の候補化合物の生体外固有クリアランスを測定するステップ
を含む、アッセイ法。

【0133】

実施形態２
上記培養は長期間培養である、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0134】

実施形態３
上記長期間培養は、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約７日、少なくとも約１４日、少なくとも約２１日、又は少なくとも約２８日にわたる、実施形態２に記載のアッセイ法。

【0135】

実施形態４
上記底面を備える上記液体非透過性底部は、ガス透過性である、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0136】

実施形態５
上記底面は凹状の底面を備える、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0137】

実施形態６
上記底部の少なくとも一部分は透明である、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0138】

実施形態７
上記凹面は、半球面、側壁から上記底面への３０〜約６０°のテーパを有する円錐面、又はこれらの組み合わせを含む、実施形態５に記載のアッセイ法。

【0139】

実施形態８
上記チャンバの各上記マイクロキャビティは更に側壁を備える、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0140】

実施形態９
上記側壁の表面は、垂直な円筒、上記チャンバの上部から底面に向かって直径が減少する垂直な円錐の一部分、上記凹状の底面に向かう円錐状移行部分を有する垂直な四角形シャフト、又はこれらの組み合わせを備える、実施形態８に記載のアッセイ法。

【0141】

実施形態１０
上記細胞培養用物品は１〜約２，０００個の上記チャンバを備え、各上記チャンバは他のいずれの上記チャンバから物理的に隔てられている、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0142】

実施形態１１
上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の消失によって測定される、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0143】

実施形態１２
上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物からの代謝産物の形成によって測定される、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0144】

実施形態１３
測定された上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体内半減期を予測する、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0145】

実施形態１４
上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記生体外固有クリアランスを利用して、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の生体内クリアランスを予測する、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0146】

実施形態１５
上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の代謝産物を分析するステップを更に含み、上記代謝産物は、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成される、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0147】

実施形態１６
上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の同定を含む、実施形態１５に記載のアッセイ法。

【0148】

実施形態１７
上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に生成された上記１つ以上の候補化合物の上記代謝産物の定量化を含む、実施形態１５に記載のアッセイ法。

【0149】

実施形態１８
上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析するステップを更に含む、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0150】

実施形態１９
上記３Ｄスフェロイド肝細胞に対する上記１つ以上の低クリアランス候補化合物の上記分子的、生化学的、又は遺伝的影響を分析する上記ステップは、上記１つ以上の低クリアランス候補化合物を用いた上記３Ｄスフェロイド肝細胞のインキュベーション中に、上記３Ｄスフェロイド肝細胞によって産生されたＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はタンパク質を測定するステップを含む、実施形態１８に記載のアッセイ法。

【0151】

実施形態２０
上記肝細胞は初代ヒト肝細胞を含む、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0152】

実施形態２１
上記肝細胞は肝細胞株を含む、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0153】

実施形態２２
複数の候補化合物を同時に評価するステップを更に含む、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0154】

実施形態２３
上記３Ｄスフェロイド肝細胞は、少なくとも３週間にわたって機能的に安定している、実施形態１に記載のアッセイ法。

【0155】

実施形態２４
上記３Ｄスフェロイド肝細胞の機能的安定性は、代謝活性、細胞機能、遺伝子発現、又はこれらの組み合わせを測定することによって決定される、実施形態２３に記載のアッセイ法。

【0156】

実施形態２５
上記機能的安定性は、ＣＹＰ３Ａ４活性によって測定される、実施形態２４に記載のアッセイ法。

【符号の説明】

【0157】

１０ マルチウェルプレート
２５ ３Ｄ肝細胞スフェロイド
１０１ ウェル
１０５ 中心軸
１０６ 液体非透過性底面、底面
１１０ ウェルのアレイ、空間
１１２ マイクロキャビティのアレイ
１１３ 側壁
１１４ 移行ゾーン
１１５、４２０ マイクロキャビティ
１１６ 液体非透過性底面、凹状弓形底面、最下点、底部
１１８ 上部アパーチャ
１１９ 底面、丸底、底部
１２１ 側壁
１３０ 保護層
２０１ 関心対象の細胞
２０３ 成長
２０５ 低クリアランス候補化合物
４１８ 上部アパーチャ
４１９ 底面
４２１ 側壁

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図6I】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【国際調査報告】