特表 2021-518435 治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-518435(P2021-518435A)

(43)【公表日】2021年8月2日

(54)【発明の名称】治療用ツールとしての精密なグリココンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/113 20060101AFI20210705BHJP

   A61K 39/385 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/08 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/09 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/095 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/102 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/05 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 38/38 20060101ALI20210705BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20210705BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20210705BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20210705BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20210705BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20210705BHJP

   C07K 14/285 20060101ALI20210705BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20210705BHJP

   C07K 14/765 20060101ALI20210705BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20210705BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20210705BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210705BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20210705BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20210705BHJP

【ＦＩ】

   C07K1/113

   A61K39/385ZNA

   A61K39/08

   A61K39/12

   A61K39/09

   A61K39/095

   A61K39/102

   A61K39/05

   A61K38/19

   A61K38/38

   A61P37/04

   A61K39/39

   A61P35/00

   A61K39/00 H

   A61K47/55

   A61P31/00

   C07K14/195

   C07K14/285

   C07K14/52

   C07K14/765

   G01N33/53 N

   G01N33/574 A

   G01N33/50 Z

   G01N33/15 Z

   C12N15/31

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】87

(21)【出願番号】特願2021-500322(P2021-500322)

(86)(22)【出願日】2019年3月22日

(85)【翻訳文提出日】2020年10月28日

(86)【国際出願番号】CA2019050353

(87)【国際公開番号】WO2019178699

(87)【国際公開日】20190926

(31)【優先権主張番号】62/647,151

(32)【優先日】2018年3月23日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520363915

【氏名又は名称】コラネックス・キャピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100126985

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 充利

(72)【発明者】

【氏名】シャオ，ツェ・ジェ

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，ルネ

【テーマコード（参考）】

2G045

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA40

2G045DA37

4C076CC06

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC32

4C076CC35

4C076CC41

4C076DD69

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA03

4C084BA44

4C084CA01

4C084CA04

4C084DA01

4C084DA36

4C084MA05

4C084NA05

4C084ZB09

4C084ZB26

4C084ZB31

4C085AA03

4C085AA38

4C085BA10

4C085BA12

4C085BA13

4C085BA14

4C085BA16

4C085BA18

4C085BA51

4C085BB01

4C085CC07

4C085CC08

4C085CC21

4C085DD51

4C085DD59

4C085EE01

4C085EE06

4C085FF01

4C085FF02

4C085FF03

4C085FF11

4C085FF13

4C085FF18

4C085FF19

4C085FF20

4C085FF21

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA53

4H045CA40

4H045CA42

4H045DA83

4H045DA86

4H045EA31

4H045EA50

4H045EA52

4H045FA52

(57)【要約】

本発明の記載は、免疫原性担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原を含む、グリココンジュゲート、グリココンジュゲート免疫原およびグリココンジュゲートワクチン、または得られた抗体の検出およびスクリーニングに使用される材料に関する。光触媒性チオール−エン反応に基づく「クリックケミストリー」アプローチなどの、より直接的かつ正確に、炭水化物抗原を免疫原性担体タンパク質の遊離チオール基にコンジュゲートする改善された方法が記載される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および
（ｃ）光触媒性チオール−エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、該炭水化物抗原を該担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程
を含み、
該担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、該炭水化物抗原の該担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該対象に投与されるときの該炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。

【請求項2】

前記アルケニル炭水化物抗原が、水溶性である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記光触媒性チオール−エン反応が、担体タンパク質の変性を回避する、および／または担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行される、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記光触媒性チオール−エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行されるか、または前記光触媒性チオール−エン反応が、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度での有機溶媒の存在下で実行される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記光触媒性チオール−エン反応が、触媒の存在下で実行される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記触媒が、
（ａ）水溶性触媒、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ−０４４）；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；過酸化物；ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド；過酸化ベンゾイル；過硫酸アンモニウム；もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体；または
（ｂ）水不溶性触媒、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’−アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、もしくは光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記光触媒性チオール−エン反応が、短波紫外光下での放射線照射を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記光触媒性チオール−エン反応が、約２５４ｎｍでの放射線照射を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記光触媒性チオール−エン反応が、長波紫外光下での放射線照射を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記光触媒性チオール−エン反応が、約３５５ｎｍまたは３６５ｎｍでの放射線照射を含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記光触媒性チオール−エン反応が、前記担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１〜２００モル当量の前記アルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または前記光触媒性チオール−エン反応が、１０〜３００、１０〜２７０、１０〜２４０、１０〜２１０、１０〜１８０、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜９０、１０〜６０、または１０〜３０分間実行されるか、および／または前記担体タンパク質中の総遊離チオール濃度の、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間実行される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記光触媒性チオール−エン反応が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで、および／または担体タンパク質の変性を回避するｐＨで実行される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記炭水化物抗原が、前記担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、前記対象の内因性酵素によって前記担体タンパク質から切断可能ではない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記アルケニル炭水化物抗原が、前記末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または前記炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ−グリコシド結合、Ｓ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、もしくはＣ−グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、前記担体タンパク質にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において体液性免疫応答を誘導し；ならびに／またはＴ細胞エピトープを含むか、および／もしくは前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であるか、またはそれを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ−Ｔｎ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）−Ｓ−ＴＦ、（２，６）−Ｓ−ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ−グリコリル−ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記光触媒性チオール−エン反応が、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、前記担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記炭水化物抗原が、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記細菌ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ、またはインフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

（ａ）における前記炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記末端アルケンに連結されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記担体タンパク質が、前記１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含むか、または任意選択で、例えば前記担体タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、または溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記担体タンパク質が、ヒトＴ細胞エピトープを含むか、および／または前記対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１−８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

（ｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ、または２−メルカプトエタノールなどの還元剤で前処理されるか；
（ｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２−イミノチオランまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理されるか；
（ｉｉｉ）前記担体タンパク質が、前記光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤、例えば２−イミノチオランまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ）で前処理され、その後、還元剤で前処理されるか；
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、該１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、前記光触媒性チオール−エン反応の後、影響を受けないままであるか；
（ｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を還元剤で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させるか；または
（ｉｖ）前記担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、前記担体タンパク質を、チオール化剤（例えば２−イミノチオランまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ））で前処理して、前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させ、その後、還元剤で前処理する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、コンジュゲーション前の前記担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記グリココンジュゲート免疫原が、前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

（ｄ）前記グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

グリココンジュゲートワクチンまたは適応免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法であって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。

【請求項31】

前記アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えばＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ−２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ、Ｓｔｉｍｕｎｅ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、該１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、該免疫原性担体タンパク質に連結されており、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の該免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、該１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項33】

前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、リンカーを介して、前記１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されている、請求項３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項34】

前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、請求項１３または１４で定義された結合を介して、前記リンカーに連結されている、請求項３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項35】

前記１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、請求項２、１５、１６、１７、２０、または２１で定義された通りである、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項36】

請求項１８または１９で定義された多価グリココンジュゲート免疫原である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項37】

前記担体タンパク質が、請求項２３、２４、２５、または２６で定義された通りである、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項38】

前記グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、前記担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項39】

前記対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項３２〜３８のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項40】

請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製される、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項41】

請求項３０または３１に記載の方法によって生産された、および／もしくは請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤、ならびに／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチン。

【請求項42】

予防ワクチンまたは治療ワクチンである、請求項４１に記載のグリココンジュゲートワクチン。

【請求項43】

対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、請求項３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または請求項４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチンを該対象に投与することを含む、上記方法。

【請求項44】

疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、もしくは対象を処置することにおいて使用するための、または前記グリココンジュゲートに特異的に結合する抗体の存在を検出するための、または前記免疫化、ワクチン接種、または処置（例えば、前記対象からの生物学的サンプルにおける）を検出するための、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または請求項４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチン。

【請求項45】

担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【化1】

（式中、
− ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
− Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；
− Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項46】

担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【化2】

（式中、
− ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
− Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項47】

担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【化3】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、１つまたはそれより多くの糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、該１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【化4】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項48】

担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【化5】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【化6】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項49】

担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【化7】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、ｚ個の遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【化8】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５であり；
− Ｒ_５は、Ｓ−ＰＣ、共有結合、または構造：

【化9】

のラジカルであり、ここでＲ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項50】

前記リンカーが、構造：

【化10】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、請求項４９に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項51】

前記リンカーが、構造：

【化11】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、請求項４９に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項52】

前記リンカーが、構造：

【化12】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、請求項４９に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項53】

ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、または１から１０の範囲の整数である、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項54】

前記糖抗原が、請求項１５、１６、１７、２０、または２１で定義された炭水化物抗原である、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項55】

前記担体タンパク質が、請求項２３、２４、または２５で定義された担体タンパク質である、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項56】

多価グリココンジュゲート免疫原である、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項57】

前記多価グリココンジュゲート免疫原が、前記担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、請求項５６に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項58】

前記グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、前記炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【請求項59】

請求項４５〜５８のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチン。

【請求項60】

前記アジュバントが、請求項３１で定義された通りである、請求項５９に記載のワクチン。

【請求項61】

ワクチンの製造のための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または請求項３２〜４０および４５〜５８のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。

【請求項62】

前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、請求項３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、請求項３２〜４０および４５〜５８のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または請求項５９または６０に記載のワクチンの使用。

【請求項63】

グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を生産するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、請求項３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、請求項３２〜４０および４５〜５８のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または請求項５９または６０に記載のワクチンの使用。

【請求項64】

グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、請求項３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、請求項３２〜４０および４５〜５８のいずれか一項で定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。

【請求項65】

グリココンジュゲートを生産するための方法であって、
（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、該末端アルケンは、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；
（ｂ）本明細書に記載されるチオール−エン反応を介した前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート材料を提供する工程であって、前記コンジュゲート材料は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する、工程；および
（ｃ）光触媒性チオール−エン反応を実行して、該炭水化物抗原を、該１個またはそれより多くの遊離チオール基において前記コンジュゲート材料に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲートを生産する工程
を含む、上記方法。

【請求項66】

前記コンジュゲート材料が、ポリマー、ポリペプチド、前記請求項のいずれか一項で定義された担体タンパク質、固体支持体、粒子、または本明細書に記載されるチオール−エン反応を介して前記炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

請求項１〜６４のいずれか一項で定義された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、請求項６５または６６に記載の方法。

【請求項68】

炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍循環細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出またはスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種の結果生じる抗体の存在を検出するための、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートの使用。

【請求項69】

前記検出またはスクリーニングが、あらゆる好適な検出方法、例えば免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析を介して実行される、請求項６８に記載の使用。

【請求項70】

対象を処置する方法であって、前記請求項のいずれかで定義された、または前記請求項のいずれかで定義された方法によって生産されたグリココンジュゲートまたはグリココンジュゲート免疫原を投与して、炭水化物抗原に対する前記対象における免疫応答を生じさせること、および前記対象からの生物学的サンプルを、該炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法。

【請求項71】

前記請求項に記載された１つまたはそれより多くの特徴をさらに含む、請求項７０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の記載は、治療用ツールであるグリココンジュゲートに関する。より具体的には、本発明の記載は、免疫原性および抗原性の担体であるペプチドおよびタンパク質の遊離チオール基に非ランダムにカップリングされた炭水化物抗原、および例えば、光触媒性チオール−エン「クリックケミストリー」反応を使用して、それを生産する改善された方法に関する。抗原、免疫原、ワクチンとしての、および診断における適用も記載される。

【0002】

本発明の記載は、多数の文書を参照し、それらの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0003】

免疫療法の最終的な目的は、感染または腫瘍の進行中に生じる方法と類似した方法で免疫系の自然応答と適応応答を引き起こすことである。自然応答と適応免疫応答との間の主要な境界は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特定には、樹状細胞（ＤＣ）である。ＡＰＣは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）などのパターン認識受容体（ＰＲＲ）を介して微生物を認識することができる。微生物表面の決定基または異常な天然にはない抗原を認識するとき、ＡＰＣは、成熟および活性化を経て、細胞内区画から細胞表面へのＭＨＣ分子の再分配、サイトカインおよびケモカインの分泌を引き起こす。微生物または腫瘍およびそれらに関連する抗原性マーカーは、エンドサイトーシス経路を介してＡＰＣにより取り込まれる可能性があり、通常そこで分解される。タンパク質のプロセシングによって放出されたペプチドおよび共有結合で連結された抗原は次いで、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示され、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識され、それに続いて、ＡＰＣから共刺激シグナルを受け取ると、異なるサブセット、例えばＴｈ１またはＴｈ２細胞への機能的な成熟を経る。Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌と共に主として炎症促進性の応答を引き起こし、それに対してＴｈ２細胞は、典型的なサイトカインを分泌する。Ｔｈ１細胞は主として細胞媒介性の応答に関連するが、Ｔｈ細胞の両方のタイプは、Ｂ細胞による抗体の生産を支持し、順に抗体のアイソタイプおよび機能に影響を与える。例えば、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、Ｔｈ１細胞の分化および１型ＩｇＧサブクラスの生産に関連し、それに対してＩＬ−６および他のＴｈ２サイトカインは、２型ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１）生産に寄与する。したがって、ワクチンで誘導された免疫性を適切な応答に適合させて、目的の病原体または腫瘍抗原を処理できることが望ましい。

【0004】

炭水化物は、タンパク質およびペプチドとは対照的に、Ｔｈ細胞の参加を引き起こす能力を適切に備えていないＴ細胞と無関係の抗原であるため、免疫細胞の増殖、抗体クラススイッチ、および親和性／特異性成熟を誘導することができない。炭水化物ベースのワクチンが初期に遭遇する主要な初期の進歩は、タンパク質担体に適切にコンジュゲートされる場合、Ｔ細胞依存性エピトープとしての機能を果たし、細菌莢膜多糖体が、オプソニン作用性の抗体を生産する必須の免疫化学能力を獲得することが可能になるという発見によって支持されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来、炭水化物抗原を担体タンパク質にコンジュゲートするための戦略は、リシン残基のε−アミノ基上におけるアルデヒド由来の糖の還元的アミノ化、または単なるアミドカップリング反応のいずれかに頼っている。いずれの場合においても、一般的に、部分的およびランダムな炭水化物抗原コンジュゲーションが起こる。さらに、炭水化物コンジュゲーションのために全てのアミドパートナー（グルタミン酸／アスパラギン酸からのリシンまたは酸からのアミン）が使用される場合、あまりにも多くの炭水化物抗原が、担体タンパク質に結合するようになるため、結果として、免疫原性の本来の減損／消滅を伴う必須のＴ細胞ペプチドエピトープのマスキングを引き起こす可能性がある。したがって、現状におけるグリココンジュゲートワクチンを調製するための戦略は不十分であり、調製物は、その炭水化物分布および再現性に関して必要な均一性が欠如しているため（すなわち、タンパク質上への糖の結合点がランダムに分布しており、バッチ間で様々な密度で存在する）、重大な規制および／または商業上の障害に直面している。したがって、より大きい炭水化物抗原均一性、より正確に特徴付け可能な構造、およびバッチ間の再現性を有するグリココンジュゲートワクチンが、極めて望ましいと予想される。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の記載は、正確な（非ランダムな）位置で免疫原性担体タンパク質に直接カップリングされた炭水化物抗原を含むグリココンジュゲート免疫原に関する。より特定には、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、システイン残基の側鎖に対応する）を含み、炭水化物抗原は、これらの遊離チオール基の１つまたはそれより多くにおいて、担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の記載はまた、例えば「クリックケミストリー」アプローチ（例えば、光触媒性チオール−エン反応）を使用して、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートすることを含む、グリココンジュゲート免疫原／ワクチンを合成するための改善された方法にも関する。本明細書に記載される改善されたコンジュゲーション方法は、コンジュゲーションの特異性に影響を及ぼさずに、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を破壊すること（例えば、天然のジスルフィド架橋の切断および／または変性）を回避するために、十分に穏やかな条件下（例えば、水溶性試薬のみの使用、有機溶媒の非存在、または担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）および／または相対的に中性のｐＨでの有機溶媒の使用）で実行することができる。さらに、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、紫外光下（例えば、３５５ｎｍまたは３６５ｎｍ）、触媒の存在下で実行してもよいし、または短波紫外光下（例えば、２５４ｎｍ）、プロセスをさらに簡易化するために触媒の非存在下で実行してもよい。

【0007】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および（ｃ）光触媒性チオール−エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、炭水化物抗原を担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程を含み、担体タンパク質は、対象に投与される場合、免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法に関する。

【0008】

一部の実施態様において、光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質の変性を回避する反応条件下で実行される。実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、水溶性であり、光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で（例えば、いずれの有機溶媒の非存在下で、または担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）での有機溶媒の存在下で）実行される。光触媒性チオール−エン反応は、触媒（例えば、水溶性または水不溶性触媒）の存在下で、短波（例えば、２５４ｎｍ）および／または長波（例えば、３５５または３６５ｎｍ）紫外光での放射線照射下において実行してもよい。

【0009】

一部の実施態様において、光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１〜２００モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含み；および／または光触媒性チオール−エン反応は、約３〜１０、３．５〜９．５、４〜９、４．５〜８．５、５〜８、５．５〜８、６〜８、または６．５〜７．５のｐＨで実行される。

【0010】

一部の実施態様において、炭水化物抗原は、担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質から切断可能ではない。一部の実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ−グリコシド結合、Ｓ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、もしくはＣ−グリコシド結合、または還元的アミノ化により得られた結合を介して、例えばアリルアミンと還元糖（細菌ＣＰＳを含む）との間で、担体タンパク質にコンジュゲートされている。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｔ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含む、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）、例えばＴｎ、Ｓ−Ｔｎ、トムゼン−フリーデンライヒ（Thomsen-Friedenreich：ＴＦ）、（２，３）−Ｓ−ＴＦ、（２，６）−Ｓ−ＴＦ、グロボＨ（Globo H）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ−グリコリル−ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、もしくはそれを含む。一部の実施態様において、光触媒性チオール−エン反応は、同じ炭水化物抗原の少なくとも２つ、または１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原（例えば、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む）を生産する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）（例えば、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ；インフルエンザ（例えばインフルエンザａ型またはｂ型）ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む。

【0011】

一部の実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるリンカー）を介して、末端アルケンに連結されている。

【0012】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含む。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｔ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0013】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｂ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープの両方を含む、および／または対象において体液性および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導する。一部の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌（H. influenzae）のプロテインＤ（ＨｉＤ）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカイン、免疫原性ペプチド、例えば破傷風毒素８３１−８４４（配列番号１または２）、アルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、（ｉ）１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、前記光触媒性チオール−エン反応の後、影響を受けないままであり；または（ｉｉ）担体タンパク質を還元剤で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる。

【0014】

一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する。

【0015】

一部の実施態様において、本明細書に記載される方法は、（ｄ）グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む。

【0016】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートワクチンを生産するための方法であって、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバント（例えば、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム（calcium phosphate hydroxide）、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えば、ＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ−２１、ムラミルジペプチド、またはそれらのあらゆる組合せ）を用いて製剤化することを含む、上記方法に関する。

【0017】

一部の形態において、本発明の記載は、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、本明細書に記載されるリンカーを介して、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、本明細書に記載される通りである。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原であり、本明細書に記載される担体タンパク質を使用する。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される方法によって調製される。

【0018】

一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、および／または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原を含むグリココンジュゲートワクチン、ならびに医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントに関する。一部の実施態様において、グリココンジュゲートワクチンは、予防ワクチンまたは治療ワクチンである。

【0019】

一部の形態において、本発明の記載は、対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法に関する。一部の実施態様において、本発明の記載は、疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、もしくは対象を処置することにおいて使用するための、またはグリココンジュゲートに特異的に結合する抗体の存在を検出するための、もしくは前記免疫化、ワクチン接種、または処置を検出するための（例えば、対象からの生物学的サンプルにおける）、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原またはグリココンジュゲートワクチンに関する。

【0020】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0021】

【化1】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0022】

【化2】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0023】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0024】

【化3】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0025】

【化4】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0026】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0027】

【化5】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0028】

【化6】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５であり；
− Ｒ_５は、Ｓ−ＰＣ、共有結合、または構造：

【0029】

【化7】

のラジカルであり、ここでＲ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0030】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0031】

【化8】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0032】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0033】

【化9】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0034】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0035】

【化10】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0036】

一部の実施態様において、本発明の記載は、ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、１から１０、１から５、または１から３の範囲の整数である、上記で設計された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0037】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0038】

【化11】

（式中、ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；ｎは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0039】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0040】

【化12】

（式中、ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；ｎは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0041】

一部の実施態様において、糖抗原は、本明細書に記載される炭水化物抗原であり、担体タンパク質は、本明細書に記載される通りであり、合成グリココンジュゲート免疫原は、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原である。

【0042】

一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに本明細書に記載される医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチンに関する。

【0043】

一部の形態において、本発明の記載は、ワクチンの製造のための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原の使用に関する。

【0044】

一部の形態において、本発明の記載は、前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。

【0045】

一般的な定義
見出し、および他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書と特許請求の範囲を読みやすくするために提示される。明細書または特許請求の範囲における見出しまたは他の識別子の使用は、工程または要素が、アルファベットまたは数の順で、またはそれらが提示された順で実行されることを必ずしも必要としない。

【0046】

言葉「１つの」（aまたはan）の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において用語「含む」と共に使用される場合、「１つの」を意味する場合があるが、「１つまたはそれより多くの」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つより多くの」の意味とも一致する。

【0047】

用語「約」は、値が、値を決定するために採用されるデバイスまたは方法の誤差の標準偏差を含むことを示すのに使用される。一般的に、用語「約」は、１０％までの起こり得る変動を表すことを意味する。それゆえに、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の変動が、用語「約」に含まれる。別段の指定がない限り、範囲の前での用語「約」の使用は、その範囲の両端の値に適用される。

【0048】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、言葉「含む」（および含む（comprising）のあらゆる形態、例えば「含む（comprise）」および「含む（comprises）」）、「有する」（および有する（having）のあらゆる形態、例えば「有する（have）」および「有する（has）」）、「包含する」（および包含する（including）のあらゆる形態、例えば「包含する（includes）」および「包含する（include）」）または「含有する」（および含有する（containing）のあらゆる形態、例えば「含有する（contains）」および「含有する（contain）」）は、包括的であるか、または非限定的であり、追加の、記載されていないエレメントまたは方法の工程を排除しない。

【0049】

本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」（例えば、表現「担体タンパク質」における）は、あらゆるペプチド結合したアミノ酸の鎖を意味し、これは、修飾が本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原およびグリココンジュゲートワクチンの免疫原性を破壊しない限り、あらゆるタイプの修飾（例えば、化学的または翻訳後修飾、例えばアセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化、ＳＵＭＯ化（sumoylation）、プレニル化、ユビキチン化など）を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。さらに明確にするために言えば、用語「タンパク質」および「担体タンパク質」は、本明細書で使用される場合、ペプチドとポリペプチドの両方を包含する。

【0050】

本明細書で使用される場合、用語「投与」は、投与経路が対象において免疫応答の発生を引き起こしさえすれば、非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内）、経口、経皮、鼻腔内などの投与経路を含み得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、「対象」は、一般的に、霊長類を含む哺乳動物を指し、特定にはヒトを指す。

【0052】

本発明の記載の他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照しながら、単なる例として例示された以下に示すそれらの具体的な実施態様の非制限的な記載を読むことで、より明らかになると予想される。

【0053】

添付の図面は以下の通りである。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１は、ヒト糖タンパク質（ＭＵＣ）からの主要な腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）の典型的な化学構造の例を示す。

【図2】図２は、免疫原性担体タンパク質（例えば、Ｔ細胞エピトープ、例えば破傷風トキソイド）の利用可能なチオール基に炭水化物抗原（Ｂ細胞エピトープ）を直接コンジュゲートするための、提唱されている「クリックケミストリー」アプローチを示す。

【図3】図３は、光触媒性チオール−エン反応によって、担体タンパク質である破傷風トキソイド上の６つの天然の「遊離」システイン残基にＴｎまたはＴＦ抗原をコンジュゲートすることにより調製された「精密なグリココンジュゲート」の例を示す。

【図4】図４は、チオール特異的なヨードアセトアミドまたはマレイミド基に連結されたＴｎまたはＴＦ抗原を使用して、これらを次いで、８未満のｐＨでの反応（ヨードアセトアミドまたはマレイミド基）またはチオール−エン反応（マレイミド基）により、担体タンパク質上の「遊離」システイン残基にコンジュゲートさせることによって調製される「精密なグリココンジュゲート」の例を示す。

【図5】図５は、実施例２〜６に記載されるように、担体タンパク質へのコンジュゲーションの準備が整っているアリルＴｎ抗原およびアリルＴＦ抗原の合成のための反応スキームを示す。

【図6A】図６Ａ〜６Ｄは、アリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図6B】図６Ａ〜６Ｄは、アリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図6C】図６Ａ〜６Ｄは、アリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図6D】図６Ａ〜６Ｄは、アリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図６Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図６Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図６Ｃおよび６Ｄ）を示す。

【図7A】図７Ａ〜７Ｄは、アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図7B】図７Ａ〜７Ｄは、アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図7C】図７Ａ〜７Ｄは、アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図7D】図７Ａ〜７Ｄは、アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図７Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図７Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図７Ｃおよび７Ｄ）を示す。

【図8A】図８Ａ〜８Ｃは、アリル２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図８Ａ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図８Ｂおよび８Ｃ）を示す。

【図8B】図８Ａ〜８Ｃは、アリル２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図８Ａ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図８Ｂおよび８Ｃ）を示す。

【図8C】図８Ａ〜８Ｃは、アリル２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図８Ａ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図８Ｂおよび８Ｃ）を示す。

【図9A】図９Ａ〜９Ｄは、アリル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図９Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図９Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図９Ｃおよび９Ｄ）を示す。

【図9B】図９Ａ〜９Ｄは、アリル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図９Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図９Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図９Ｃおよび９Ｄ）を示す。

【図9C】図９Ａ〜９Ｄは、アリル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図９Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図９Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図９Ｃおよび９Ｄ）を示す。

【図9D】図９Ａ〜９Ｄは、アリル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図９Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図９Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図９Ｃおよび９Ｄ）を示す。

【図10A】図１０Ａ〜１０Ｄは、化合物７に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１０Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１０Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１０Ｃおよび１０Ｄ）を示す。

【図10B】図１０Ａ〜１０Ｄは、化合物７に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１０Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１０Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１０Ｃおよび１０Ｄ）を示す。

【図10C】図１０Ａ〜１０Ｄは、化合物７に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１０Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１０Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１０Ｃおよび１０Ｄ）を示す。

【図10D】図１０Ａ〜１０Ｄは、化合物７に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１０Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１０Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１０Ｃおよび１０Ｄ）を示す。

【図11A】図１１Ａ〜１１Ｄは、アリル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１１Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１１Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。

【図11B】図１１Ａ〜１１Ｄは、アリル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１１Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１１Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。

【図11C】図１１Ａ〜１１Ｄは、アリル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１１Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１１Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。

【図11D】図１１Ａ〜１１Ｄは、アリル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）に関する^１Ｈ−ＮＭＲ（図１１Ａ）および^１３Ｃ−ＮＭＲ（図１１Ｂ）スペクトル、ならびに質量分析の結果（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す。

【図12】図１２は、ＴＦ−ＴＴグリココンジュゲート単独（左上のパネル）、ピーナッツレクチン単独（右上のパネル）、または両方の組合せ（下のパネル）の動的光散乱（ＤＬＳ）分析の結果を示す。

【図13】図１３は、Ｏ−アリル−ＴｎおよびＯ−アリル−ＴＦとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応における時間に対するペプチドｄＴＴ８３１−８４０のチオール濃度を示す。

【図14】図１４は、ペプチドのシステイン位置およびＡＡＰＨまたはＤＭＰＡの存在に対するＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応におけるペプチドｄＴＴ８３１−８４０のチオールの低減倍率を示す。

【図15】図１５は、ペプチドのシステインの位置およびＡＡＰＨまたはＤＭＰＡの存在に対する、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってレクチンのＴｎにコンジュゲートしたペプチドｄＴＴ８３１−８４０への反応性を示す。

【図16】図１６は、ＡＡＰＨまたはＤＭＰＡの存在下での、異なる波長における、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応におけるペプチドｄＴＴ８３１−８４０のチオール濃度の速度論を示す。

【図17】図１７は、ＡＡＰＨまたはＤＭＰＡの存在下での、異なる波長における、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってＴｎにコンジュゲートしたペプチドｄＴＴ８３１−８４０へのナヨクサフジ（Vicia Villosa）レクチンの反応性を示す。

【図18】図１８は、Ｃ−アリルおよびＯ−アリル糖との光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応におけるペプチドｄＴＴ８３１−８４０のチオール濃度の速度論を示す。

【図19】図１９は、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートしたペプチドｄＴＴ８３１−８４０に対するレクチンおよび抗ＴＦ抗体の反応性を示す。

【図20】図２０は、還元ｄＴＴまたはＯ−アリル−ＴＦとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートした還元ｄＴＴに対する抗ＴＦ抗体の反応性を示す。

【図21】図２１は、光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応の様々な工程における、およびコンジュゲートしたｄＴＴの還元後の、ｄＴＴのチオールのモル比を示す。

【図22】図２２は、Ｏ−アリル−Ｔｎへの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートしたｄＴＴの、レクチンおよび抗ＴＦｍＡｂへの反応性を示す。

【図23】図２３は、少量または大量のＡＡＰＨの存在下におけるＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートした、またはコンジュゲートされていない、化学的にチオール化したｄＴＴのチオールのモル比を示す。

【図24】図２４は、２つの異なる時間での、少量または大量のＡＡＰＨの存在下でのＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートした化学的にチオール化したｄＴＴに対するナヨクサフジレクチンの反応性を示す。

【図25】図２５は、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートした還元ＢＳＡに対するレクチンおよび抗ＴＦ抗体の反応性を示す。

【図26】図２６は、還元条件と還元ＢＳＡのチオールのモル比との関係を示す。

【図27】図２７は、様々な遊離チオールのモル比を有し、様々な量のＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートしたＢＳＡに対する、Ｔｎ特異的ナヨクサフジレクチンおよび抗ＴＦ抗体の反応性を示す。

【図28】図２８は、還元条件、還元ＢＳＡのチオールのモル比、およびＯ−アリル−ＴＦとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートした還元ＢＳＡのＴＦ反応性の関係を示す。

【図29】図２９は、ＡＡＰＨおよびＯ−アリル−Ｔｎの存在または非存在下における化学的チオール化単独または同時の光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応を伴うチオール化による、時間に対するＢＳＡにおけるチオール付加物のモル比を示す。

【図30】図３０は、チオール化されたＢＳＡとの、またはＡＡＰＨおよびＯ−アリル−Ｔｎの存在または非存在下において、光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によって同時にチオール化およびコンジュゲートされたＢＳＡとのＴｎ特異的ナヨクサフジレクチンの反応性を示す。

【図31】図３１は、時間に対する、チオールのモル比と、Ｏ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートしたＢＳＡのＴｎ特異的ナヨクサフジレクチンの反応性との関係を示す。

【図32】図３２は、天然のＢＳＡ、または少量または大量のＡＡＰＨの存在下、および２種の波長におけるＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応によってコンジュゲートしたチオール化ＢＳＡに対する、Ｔｎ特異的ナヨクサフジレクチンの反応性を示す。

【図33】図３３は、ガラクトースのモル比と、チオール化および少量または大量のＡＡＰＨにおけるＯ−アリル−Ｔｎとの光触媒性チオール−エンコンジュゲーション反応の異なる工程における、ＢＳＡに対する抗ＴＦｍＡｂの反応性との関係を示す。

【図34】図３４は、ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａおよびＣおよびＮ末端にシステイン残基を有するＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａの化学構造を、それぞれそれらの表形式のＬＣ−ＭＳデータと共に示す。

【図35】図３５は、ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａの詳細なＬＣ−ＭＳデータを示す。

【図36】図３６は、ペプチドＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａの詳細なＬＣ−ＭＳデータを示す。

【図37】図３７は、Ｃ末端ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａにおけるＯ−アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール−エン反応を示す。

【図38】図３８は、Ｃ末端ペプチドにおけるＯ−アリルＴｎのＬＣ−ＭＳプロファイルを示す。

【図39】図３９は、Ｎ末端ペプチドＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａにおけるＯ−アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール−エン反応を示す。

【図40】図４０は、Ｎ末端ペプチドにおけるＯ−アリルＴｎのＬＣ−ＭＳプロファイルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0055】

配列表
本出願は、約４ＫＢのサイズを有する２０１９年３月１９日に作成されたコンピューター可読の形態の配列表を含有する。コンピューター可読の形態は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0056】

詳細な説明
本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原（例えば、ワクチンとして使用するための、診断における、または特異的な抗グリココンジュゲート抗体などの診断または治療用ツールを生成するための）に関する。本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、一般的に、免疫原性担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原を含む。より特定には、担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、システイン残基の側鎖に対応する）を含み、炭水化物抗原は、これらの遊離チオール基の１つまたはそれより多くにおいて、担体タンパク質にコンジュゲートされている。本発明の記載はまた、例えば「クリックケミストリー」アプローチ（例えば、光触媒性チオール−エン反応）を使用して、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートすることを含む、グリココンジュゲート免疫原／ワクチンを合成するための改善された方法にも関する。本明細書に記載される改善されたコンジュゲーション方法は、コンジュゲーションの特異性に影響を及ぼさずに、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を破壊すること（例えば、天然のジスルフィド架橋の切断および／または変性）を回避するために、十分に穏やかな条件下（例えば、水溶性試薬のみの使用、有機溶媒の非存在、担体タンパク質の変性を回避するのに十分に低い濃度（例えば、＜５％）および／または相対的に中性のｐＨでの有機溶媒の使用）で実行することができる。さらに、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、紫外光下（例えば、３５５ｎｍまたは３６５ｎｍ）、触媒の存在下で実行してもよいし、または短波紫外光下（例えば、２５４ｎｍで）、プロセスをさらに簡易化するために触媒の非存在下で実行してもよい。

【0057】

本明細書に記載されるコンジュゲーション方法によって提供される精密さがより大きいために、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原／ワクチンは、より大きい均一性（その炭水化物分布に関して）、再現性を有することができ、さらに、他のアミノ酸側鎖（例えば、リシンからのアミン、またはグルタミン酸／アスパラギン酸残基からの酸）へのランダムカップリングを頼るグリココンジュゲートと比較してより簡単に特徴付けすることができる。このような特徴は、グリココンジュゲートワクチンの規制当局の承認および／または商業化を容易にする可能性があり、これらはどちらも、従来のアプローチに基づいた場合では難しいことが歴史的に証明されている。

【0058】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法（例えば、対象への投与のための）に関する。用語「対象」は、本明細書で使用される場合、一般的に、好ましくはグリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体の生産を引き起こす、本明細書に記載されるようなグリココンジュゲート免疫原に対する免疫応答を起こすことができる生物（例えば、動物またはヒト）を指す。一部の実施態様において、本明細書に記載される対象は、治療的に処置しようとする患者（例えば、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原でのワクチン接種を介して）であってもよいし、または調査、診断、および／または治療目的のためのツール（例えば、抗体）を生成するための手段として採用される場合もある。グリココンジュゲート免疫原を生産するための方法は、一般的に、チオール特異的な官能基を有する（例えば、それを含むように化学修飾された）炭水化物抗原を提供する工程；１個またはそれより多くの遊離チオール基（例えば、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステイン）を有する担体タンパク質を提供する工程；および炭水化物抗原を担体タンパク質と反応させ、それによって、担体タンパク質の遊離チオール基の位置に対応する１つまたはそれより多くの予測可能な（非ランダム）結合点で炭水化物抗原を担体タンパク質にカップリングする工程を含む。一部の実施態様において、本方法は、グリココンジュゲート免疫原を精製または単離する工程をさらに含んでいてもよく、次いでグリココンジュゲート免疫原は、ワクチン（例えば、アジュバントを含む）として製剤化してもよい。

【0059】

用語「グリココンジュゲート」は、本明細書で使用される場合、目的の対象における炭水化物抗原の免疫原性を強化するために担体タンパク質にカップリングされた炭水化物抗原（例えば、抗原性の単糖、二糖、オリゴ糖、または多糖）を指す。表現「炭水化物抗原」および「糖抗原」は、本明細書で使用される場合、同じ意味を有する。用語「免疫原」は、免疫系の成分（例えば、抗体および／またはリンパ球）によって特異的に結合し、目的の対象において体液性および／または細胞媒介性免疫応答を生じさせることが可能な物質を指す。「グリココンジュゲート免疫原」などの表現における用語「免疫原」は、本明細書で使用される場合、特定の使用（例えば、対象において免疫応答を生じさせるための免疫原としての使用）に対する、グリココンジュゲートそれ自体に限らないグリココンジュゲートの能力（すなわち、物理的な特徴または特性）を指す。例えば、一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、生物学的サンプル（例えば、対象からの）におけるグリココンジュゲート免疫原に結合する抗体の存在または非存在を検出するための診断アッセイまたは方法（例えば、インビトロの方法）において採用することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体（例えば、診断的または治療的に適用可能なモノクローナル抗体）をスクリーニングする、同定する、または評価するのに使用することができる。

【0060】

一部の形態において、本発明の記載は、炭水化物抗原を担体タンパク質の遊離チオール基に直接コンジュゲートするための「クリックケミストリー型」のアプローチの使用に関する。より具体的には、図２で示されるように、光触媒性チオール−エン反応は、炭水化物抗原（Ｒ_２）が、光触媒性チオール反応を使用する担体タンパク質のシステインチオール基（−ＳＨ）（Ｒ_１）への直接の共有結合に好適な末端アルケン官能基（アルケニル炭水化物抗原）を含有するように改変されている反応であることが好ましい。図３を参照すれば、Ｂ細胞エピトープを含む炭水化物抗原（例えば腫瘍関連炭水化物抗原ＴｎおよびＴＦ）は、チオール−エン反応を介して、破傷風トキソイド（ＴＴ）などの免疫原性担体タンパク質に光化学的にコンジュゲートさせることができ、破傷風トキソイドは、その６個の利用可能なシステイン残基（ただしジスルフィド架橋に関与する４つのシステイン残基は除く）のために６個の遊離チオール基を有することがわかっている。本明細書に記載されるコンジュゲーション方法は、図３に示される破傷風トキソイド担体タンパク質の場合、好ましくは、予測可能な（非ランダムな）結合点でコンジュゲートされた正確に６個の炭水化物抗原をもたらす。本明細書に記載される方法は、末端をアルケン基（末端アルケン）にすることができる、天然または合成のあらゆる単糖、オリゴ糖、および多糖に適用可能である。

【0061】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、末端アルケンに連結されるように（直接的に、またはリンカーまたはスペーサーを介して間接的に）（例えば、グリコシド結合を介して、または例えばアリルアミンと還元糖との間での、好ましくはＮａＢＨ_４および／またはＮａＢＨ_３ＣＮを使用した還元的アミノ化により得られた結合を介して）化学修飾されていてもよく、この場合、アルケニル炭水化物抗原の末端アルケン基は、チオール−エン反応（例えば、光触媒性チオール−エン反応）を介して、担体タンパク質の遊離チオール（例えば、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステイン）にコンジュゲート可能である。アルケニル炭水化物抗原の末端アルケン基は、一置換されたアルケン、ビニル基、またはアリル基であり得る。好ましい実施態様において、アルケニル炭水化物抗原は、水溶性であることから、本明細書に記載される水性ベースのチオール−エン反応におけるその使用を可能にする。

【0062】

「グリコシド結合」は、本明細書で使用される場合、Ｓ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、Ｏ−グリコシド結合、もしくはＣ−グリコシド結合、または還元糖の還元的アミノ化（例えば、ＮａＢＨ_４または好ましくはＮａＢＨ_３ＣＮを使用）により得られた結合の１つまたはそれより多くを含んでいてもよい。一部の実施態様において、グリコシド結合は、投与される対象の内因性酵素（例えば、グリコヒドロラーゼ）によって切断可能ではないグリコシド結合であり得る。このような切断不可能なグリコシド結合は、対象への投与後により長い半減期を有するグリココンジュゲート免疫原をもたらすことができ、これが順に、治療目的および／または抗体生成目的にとってより好都合な免疫応答を生じさせることができる。一部の実施態様において、グリコシド結合は、Ｓ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、もしくはＣ−グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合であり得る。

【0063】

一部の実施態様において、「リンカー」または「スペーサー」の使用が好ましく、このような用語は、本明細書において、炭水化物抗原を対象の免疫系によって認識させることを可能にする（例えば、担体タンパク質によってマスクされるのとは対照的に）、炭水化物抗原と、それがコンジュゲートされている担体タンパク質との十分な物理的な分離を提供する化学的な連結を指すものとして使用される。一部の実施態様において、リンカーは、Ｃ、Ｓ、Ｎ、およびＯから選択される、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の連続する残基の鎖を含んでいてもよい。

【0064】

用語「コンジュゲート可能な」は、本明細書で使用される場合、実際に分子が互いに共有結合で結合しているかどうかに関係なく、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原および担体タンパク質）が化学反応を介して互いに共有結合で結合する能力または可能性を指す。対照的に、用語「コンジュゲートした」は、少なくとも２つの分子（例えば、炭水化物抗原および担体タンパク質）が互いに共有結合で結合していることを指す。

【0065】

一部の実施態様において、様々なタイプの炭水化物抗原の末端を、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能な末端アルケン基にすることができる。例えば、末端アルケン基を有する炭水化物抗原は、アリルＴｎおよびアリルＴＦ反応物の合成に関する本明細書の実施例２〜７に記載されるアプローチを適合させることによって合成することができる。

【0066】

一部の実施態様において、末端アルケン基を有する炭水化物抗原は、光触媒性チオール−エン反応を使用して、例えば、Ｔｎ−ＴＴおよびＴＦ−ＴＴコンジュゲートの合成に関する本明細書の実施例８および９に記載されるアプローチを適合させることによって、担体タンパク質の遊離チオール基にコンジュゲートさせることができる。例えば、水性溶媒（例えば、ＰＢＳなどの緩衝液）中に溶解させた１種またはそれより多くのアルケニル炭水化物抗原を、紫外光照射に好適な容器（例えば、石英セル）中で、同様に水性溶媒（例えば、ＰＢＳなどの緩衝液）中に溶解させた担体タンパク質と混合する。次いで混合物を、触媒（例えば、光開始剤または活性化剤）の存在または非存在下において、短波、中波または長波紫外光（例えば、約２５４ｎｍ、約３５５ｎｍ、または約３６５ｎｍにピーク波長を有する）下で放射線照射する。本明細書においてチオール−エン反応の文脈で使用される場合、用語「触媒」、「光開始剤」、および「活性化剤」は、光触媒性チオール−エン反応を介した、１個またはそれより多くの遊離チオール基における、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションを促進する物質を指すのに同義的に使用することができる。

【0067】

一部の実施態様において、触媒は、水溶性光開始剤、例えば水溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］ジヒドロクロリド（Ｖａｚｏ ４４またはＶＡ−０４４）；２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）ジヒドロクロリド（ＡＡＰＨ）；本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応において光開始剤活性を有する金属もしくは金属イオン；または光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であり得る。一部の実施態様において、触媒は、水溶性光開始剤、例えば水溶性過酸化物、例えばｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシドもしくは過酸化ベンゾイル、もしくは過硫酸アンモニウム、または他の好適な触媒であり得る。

【0068】

一部の実施態様において、触媒は、水不溶性光開始剤、例えば水不溶性のフリーラジカルを生成するアゾ化合物；２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（ＡＣＶＡ）、１，１’−アゾビス（シアノシクロヘキサン）（ＡＣＨＮ）、ジアゼンジカルボン酸ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド）（ＴＭＡＤ）；アゾジカルボン酸ジピペリジド（ＡＤＤ）、または本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応において光開始剤活性を有するそれらのあらゆる誘導体であり得る。

【0069】

一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、例えば糖の重合を低減する、最小化する、または回避するために、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たりのアルケニル炭水化物抗原（すなわち、末端アルケンを含む炭水化物抗原）のモル当量の比率を制御することを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり、１〜３００、１〜２５０、１〜２００、１〜１００、または１〜１０、１〜５、または１〜２モル当量の炭水化物抗原を反応させることを含んでいてもよい。

【0070】

一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質中の総遊離チオール濃度の、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０分の１の低減を達成するのに十分な時間実行される（例えば、エルマン試験によって決定した場合）。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、１０〜３００、１０〜２７０、１０〜２４０、１０〜２１０、１０〜１８０、１０〜１５０、１０〜１２０、１０〜９０、１０〜６０、または１０〜３０分間実行される。

【0071】

一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで実行されてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、担体タンパク質の変性を回避するｐＨで実行されてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される光触媒性チオール−エン反応は、４〜５のｐＨで、好ましくはｐＨ４．４で（例えば、酢酸緩衝液中で）実行されてもよい。

【0072】

一部の実施態様において、水溶性光開始剤の使用（有機溶媒を必要とする光開始剤に優先して）は、本明細書に記載されるチオール−エンコンジュゲーション反応を、水性試薬および水性溶媒のみを使用して実行できるため有利である可能性があり、これは、有機溶媒は、Dondoniら、2009およびDondoniら、2012に記載されたように、担体タンパク質の変性、加えて、遊離ではないシステイン残基（例えば、分子内および／または分子間のジスルフィド結合に関与するシステイン）への望ましくない／予測不可能なコンジュゲーションに寄与する可能性があるためである。

【0073】

代替の実施態様において、水不溶性光開始剤は、必要に応じて、その溶解のために有機溶媒と共に採用してもよい。好ましくは、有機溶媒の存在または濃度は、担体タンパク質の変性、加えて遊離ではないシステイン残基（例えば、分子内および／または分子間のジスルフィド結合に関与するシステイン）への望ましくない／予測不可能なコンジュゲーションに寄与しないものとする。例えば、このような光開始剤は、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）などであり得る。

【0074】

本明細書に記載されるチオール−エンアプローチの代替の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くのチオール特異的な官能基、例えばヨードアセトアミド、マレイミド、ハロゲン化ベンジル、またはブロモメチルケトンを有するように修飾することができ、これらの官能基は、チオールのＳ−アルキル化によって反応して安定なチオエーテル生成物を生成する（例えばこれは、リシン残基への不要な、ランダムな炭水化物抗原コンジュゲーションを回避することができる、相対的に低いｐＨ、例えば９、８、７．５、または７未満、および５、５．５、または６を超えるｐＨで行われる）。図４に、チオール特異的な官能基（例えば、ヨードアセトアミドおよびマレイミド基）を含むように修飾された炭水化物抗原の例を示す。一部の実施態様において、マレイミド基は、チオール−エン反応を介して担体タンパク質のチオール基にコンジュゲート可能な末端アルケンとして適格である。

【0075】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くのＢ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／もしくは体液性免疫応答を誘導することができ、および／またはＴ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／または投与のときに対象において細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、少なくとも、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答（例えば、体液性応答に加えて）を誘導することができる。

【0076】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えば、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。がん細胞の外側の細胞膜の糖タンパク質および糖脂質は、特定のＯ−グリカンを過剰発現する。これらの糖タンパク質は、ムチン（ＭＵＣ）として公知のタンパク質ファミリーを集合的に構成し、なかでもＭＵＣ１が最も広く調査されているものの一つである。正常細胞上のＭＵＣは、複雑なグリコシル化パターンを生じさせる活性なグリコシルトランスフェラーゼのために、高度にＯ−グリコシル化されている。がん細胞において、主要なグリコシルトランスフェラーゼの下方調節は、それより短いグリカンの蓄積を引き起こし、ムチン上でより一層限定的なＯ−グリコシル化を引き起こす。これらの変更された、正常細胞とがん性細胞との間のグリコシル化パターンの結果は、ＴＡＣＡの過剰累積であり、これは、他の状況では、正常な組織における複雑なグリコシル化によって隠される（マスクされる）。最も一般的なＴＡＣＡとしては、Ｔｎ抗原（構造Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を有する単糖）、ＴＦ抗原（トムゼン−フリーデンライヒ抗原、構造Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１を有する二糖）、およびそれらそれぞれの同源のシアル化類似体が挙げられる。数種のタイプの腫瘍細胞の細胞表面上におけるＴｎ抗原とＴＦ抗原両方の過剰発現は、がん細胞接着およびレクチン受容体を含有する部位（肺、肝臓、リンパ節など）への重篤な転移に寄与する。したがって、一部の実施態様において、本明細書に記載されるＴＡＣＡは、Ｔｎ抗原、ＳＴｎ抗原、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）抗原、（２，３）−Ｓ−ＴＦ、（２，６）−Ｓ−ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ−グリコリル−ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、ｓＬｅｘ、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。図１に、一部の共通のＴＡＣＡの構造を示す。本明細書で使用される場合、表現「由来（〜から）」は、炭水化物抗原に関して使用される場合、公知の炭水化物抗原から誘導された炭水化物バリアントを指し、この場合、バリアントは、少なくとも公知の炭水化物抗原の抗原性を保持する。当業者にとって、アルケニル末端を有するＴＡＣＡの合成は、Danishefskyら、2015に記載されたように、化学的なプロセスに加えて化学酵素的なプロセスの両方によって実行することができる。

【0077】

一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、これらに限定されないが、細菌および／もしくはウイルスなどの感染因子に関連する炭水化物抗原、またはこれらに限定されないが、細菌感染および／もしくはウイルス感染などの感染に関連する炭水化物抗原であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される炭水化物抗原は、例えば、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であってもよいし、またはそれを含んでいてもよい。一部の実施態様において、細菌ＣＰＳは、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型、髄膜炎菌ＣＰＳ、またはインフルエンザ（例えばインフルエンザａ型およびｂ型）ＣＰＳであるか、それ由来であるか、またはそれを含む。

【0078】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるコンジュゲーション方法は、同じまたは１つより多くのタイプの炭水化物抗原を担体タンパク質にコンジュゲートでき、それによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産することができる。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質上の単一の遊離チオール基にコンジュゲートされている（例えば、分岐状リンカーを介して）１種より多くの炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される多価グリココンジュゲート免疫原は、デンドリマーとして（例えば、多数の分岐を有するリンカーを介して）、担体タンパク質上の単一の遊離チオール基にコンジュゲートされている複数の（例えば、少なくとも３、４、５、６、７８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの）炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を含む。「遊離チオール」または「遊離チオール基」は、本明細書で使用される場合、化学修飾および／またはコンジュゲーション（例えば、本明細書に記載される炭水化物抗原に対する）に利用可能な１つまたはそれより多くのスルフヒドリル基を有する担体タンパク質を指す。一部の実施態様において、所与の担体タンパク質の遊離チオール濃度は、例えば、本発明の実施例に記載されたようにシステイン標準曲線を使用するエルマン試験を使用して測定することができる。所与の担体タンパク質の遊離チオール濃度は、遊離チオール濃度の低減倍率として表す場合がある。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲートは、本明細書に記載されるコンジュゲーション方法の後、遊離チオール濃度の少なくとも５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、または２分の１に減少し得る（例えば、エルマン試験によって測定される場合）。

【0079】

一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、例えば、担体タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端、またはそれらの間のあらゆる溶媒接近可能な位置に、１個またはそれより多くのさらなるシステイン残基が付加されるように操作されていてもよい（溶媒接近可能ではないか、またはタンパク質担体の３次元構造内に「埋め込まれた」位置とは対照的に）。一部の実施態様において、本明細書に記載されるタンパク質担体の遊離チオール基は、反応が、担体タンパク質の免疫原性、構造、または活性を破壊しない程度に穏やかな条件下で実行される場合、光触媒性チオール−エン反応によってアルケニル炭水化物抗原に容易にコンジュゲート可能なシステインと定義することもできる。一部の実施態様において、用語「活性」は、本明細書において担体タンパク質に関して使用される場合、炭水化物抗原の免疫原性（例えば、炭水化物抗原に特異的に結合することがわかっている抗体に対する）を保存する担体タンパク質の能力を指す。

【0080】

一部の実施態様において、遊離チオール基は、担体タンパク質の１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基、および／またはジスルフィド架橋に関与しないシステインを指す場合もあり、これらは、一部の場合において、担体タンパク質の構造を維持するために重要な場合もある。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であってもよく、その場合、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋は、炭水化物抗原へのコンジュゲーションの後、影響を受けないままである（すなわち、無傷である）。一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、それらのＮおよび／またはＣ末端に遊離チオール基を含まない。代替として、一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、そのＮおよび／またはＣ末端に、遊離チオール基を含んでいてもよいし、またはそれを含むように操作されていてもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であってもよく、担体タンパク質を、還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ）で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる。このような前処理は、例えば、変性した（還元された）担体タンパク質が、対象において、天然の（還元されていない）担体タンパク質より高い免疫原性を有する場合有用であり得る。

【0081】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、還元剤（例えば、本明細書に記載される）で前処理されてもよい。この前処理は、コンジュゲーションに利用可能な追加の遊離チオール基を露出させることができる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤（例えば、２−イミノチオラン（imminothiolane）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジチオプロピオネート（ＤＰＳ））で前処理されてもよい。この前処理は、コンジュゲーションに利用可能な遊離チオール基の数を増加させるのに採用することができる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、光触媒性チオール−エン反応を実行する前に、または実行と共に、チオール化剤で前処理され、その後、還元剤で前処理されてもよい。

【0082】

一部の実施態様において、担体タンパク質上の隣接する位置にコンジュゲートした複数の炭水化物抗原が多くなりすぎないようにすることが有利な場合がある。一部の実施態様において、担体タンパク質は、好ましくは、システインリッチドメイン（例えば、少なくとも５０％のシステイン残基を含む、少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続したアミノ酸のセグメント）を欠如していてもよい。

【0083】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の総システイン残基を含んでいてもよい。一部の実施態様において、担体タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の総遊離システイン残基を含んでいてもよい。

【0084】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数は、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、担体タンパク質１個当たり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の炭水化物抗原を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本発明の記載は、炭水化物コンジュゲーション種に関して、約または少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の均一性を有する（例えば、組成物中のグリココンジュゲート免疫原種／分子の少なくとも９０％が、同じ数の、担体タンパク質にコンジュゲートした炭水化物抗原を有する）、グリココンジュゲート免疫原を含む組成物に関する。

【0085】

一部の実施態様において、本明細書に記載される担体タンパク質は、好ましくは、グリココンジュゲート免疫原が投与されることになる対象に対して免疫原性であるタンパク質（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）である。好ましくは、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与（すなわち、対象に単独で投与される炭水化物抗原）と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。

【0086】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、Ｔ細胞エピトープを含んでいてもよいし、および／または投与のときに対象において細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。

【0087】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、投与されることになる対象にとって外因性であるタンパク質であり、好ましくは、対象において（近接した）オーソログがない上記タンパク質である。ヒトワクチン生産の状況において、本明細書に記載される担体タンパク質は、「ヒトでの使用に好適な担体タンパク質」または単に「好適な担体タンパク質」を指し、これは、担体タンパク質がヒトにおいて「自己抗原」と認識されないように、ヒトタンパク質とは抗原的に異なる担体タンパク質を意味する。対応するヒトタンパク質に抗原的に類似しすぎている担体タンパク質の使用は、担体タンパク質が「自己抗原」と認識されることを引き起こす可能性があり、これは、ヒトワクチンにおいて理想的ではない場合がある。これまでに、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリシン残基のε−アミノ基にランダムにコンジュゲートしたＴＦ抗原からなるグリココンジュゲート免疫原が記載され、特徴付けられている（例えば、Demianら、2014；Rittenhouse-Diakunら、1998；Heimburgら、2006；Tatiら、2017）。しかしながら、ＢＳＡの５９個のリシン残基における炭水化物のレベルがランダムで非効率的であるだけでなく（ＢＳＡ分子１個当たり４〜６個以下のＴＦ抗原がコンジュゲートされた）、ＢＳＡは、ヒトアルブミンに抗原的に類似しすぎているため、ヒトワクチンにおける担体タンパク質として好適ではないと予想される。一部の実施態様において、担体タンパク質は、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）ではない。

【0088】

好ましくは、本明細書に記載される担体タンパク質は、すでにヒト対象への投与（例えば、承認されたワクチン）に関して規制当局（例えば、ＦＤＡ）の承認を受けたタンパク質であり得る。一部の実施態様において、担体タンパク質は、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、またはそれらの免疫原性フラグメント（またはバリアント）であるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む。

【0089】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、１０個のシステイン残基を含有するＴＴであってもよく、これらのシステイン残基のうち４個はジスルフィド架橋に組み込まれ、６個のコンジュゲートした炭水化物抗原を有するグリココンジュゲート免疫原を生じさせる。一部の実施態様において、担体タンパク質は、４個のシステイン残基を含有するＣＲＭ１９７であってもよく、４個のコンジュゲートした炭水化物抗原を有するグリココンジュゲート免疫原を生じさせる。

【0090】

一部の実施態様において、担体タンパク質は、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために追加の遊離チオール基を導入するために、追加のシステイン残基が導入されるように操作することができる。一部の実施態様において、システイン残基は、担体タンパク質の溶媒に露出した部分において操作することができる。

【0091】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートワクチンまたは免疫応答を引き起こす組成物を生産するための方法に関する。本方法は、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含んでいてもよい。一部の実施態様において、アジュバントは、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド（例えば、ＣＰＧ）、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ−２１、ムラミルジペプチド、ＴｉｔｅｒＭａｘ（商標）、Ｓｔｅｖｉｕｎｅ（商標）、Ｓｔｉｍｕｎｅ（商標）、もしくはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む。

【0092】

一部の形態において、本発明の記載は、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されている、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる。用語「合成」は、本明細書において使用される場合、ヒトの介入によって生産される、天然産物ではない化合物を指す。

【0093】

一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートした、１つより多くの種の炭水化物抗原（例えば、１つより多くのタイプのＴＡＣＡ）を含んでいてもよい。例えば、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くのタイプまたは種の炭水化物抗原（例えば、ＴＡＣＡ）を含んでいてもよい。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、Ｔｎ、Ｓ−Ｔｎ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）−Ｓ−ＴＦ、（２，６）−Ｓ−ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、Ｎ−グリコリル−ＧＭ３、Ｌｅａ、ｓＬｅａ、Ｌｅｘ、およびｓＬｅｘから選択されるＴＡＣＡのあらゆる組合せを含んでいてもよい。一部の実施態様において、各ＴＡＣＡの組合せにおける比率は、標的化される腫瘍に応じて様々であってもよく、１〜２０のモル比を含んでいてもよい。このようにして、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原は、例えば、複数のＴＡＣＡの特定の組合せの発現の増加に関連するがんの具体的な形態に、適合させることができる。

【0094】

一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される方法によって生産されるグリココンジュゲートワクチン、および／または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原を含み、さらに、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチンに関する。用語「ワクチン」は、本明細書で使用される場合、対象に治療上の利益を提供するために対象に投与される、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原を含む組成物を指す。一部の実施態様において、本明細書に記載されるグリココンジュゲートワクチンは、予防ワクチンまたは治療ワクチンであり得る。

【0095】

ワクチン組成物は、レシピエント動物の年齢、性別、体重、種および状態、ならびに投与経路のような要因を考慮して、医療または獣医学分野における当業者に周知の投薬量および技術によって投与することができる。投与経路は、経皮で、粘膜投与（例えば、口腔、鼻、眼）を介して、または非経口経路（例えば、皮内、筋肉内、皮下）を介してなされ得る。ワクチン組成物は、単独で投与してもよいし、または他の処置または療法と共投与もしくは逐次的に投与してもよい。投与の形態としては、非経口、皮下、皮内または筋肉内投与（例えば、注射投与）のための懸濁液および調製物、例えば滅菌懸濁液またはエマルジョンを挙げることができる。ワクチンは、スプレーとして投与してもよいし、または食物および／または水中に混合されてもよいし、または好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理的食塩水、グルコースなどと混和して送達してもよい。組成物は、望ましい投与経路および調製物に応じて、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、ゲル化または粘度を強化する添加剤、保存剤、矯味矯臭剤、色素などの補助剤を含有していてもよい。余計な実験を行わずに好適な調製物を調製するために、標準的な製薬に関する教本、例えば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、1990を参照することができる。

【0096】

一部の形態において、本発明の記載は、対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、本明細書に記載されるグリココンジュゲート免疫原またはグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法に関する。

【0097】

一部の形態において、本発明の記載は、スルフヒドリル特異的な（チオール特異的な）官能基に連結されるように化学修飾された炭水化物抗原に関する。一部の実施態様において、炭水化物抗原は、末端アルケンに連結されるように（例えば、グリコシド結合を介して）化学修飾されており、この場合、末端アルケン基は、チオール−エン反応を介して担体タンパク質の遊離チオールにコンジュゲート可能である。一部の実施態様において、炭水化物抗原および末端アルケン基は、本明細書に記載されるリンカーを介して連結されている。一部の実施態様において、末端アルケン基は、ビニル基またはアリル基であり得る。

【0098】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0099】

【化13】

（式中、ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；ｎは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅである）を有するか、またはその立体異性体（例えば、ジアステレオマー）である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0100】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0101】

【化14】

（式中、ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；Ｓ−ＰＣは、担体タンパク質であり；Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；ｎは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；ｑは、１、２、３、４、または５であり；Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１である）を有するか、またはその立体異性体（例えば、ジアステレオマー）である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。一部の実施態様において、ＸがＯである場合、糖抗原は、ＴｎまたはＳＴｎを含まない。

【0102】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0103】

【化15】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0104】

【化16】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0105】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0106】

【化17】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0107】

【化18】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0108】

一部の形態において、本発明の記載は、担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、構造：

【0109】

【化19】

（式中、
− ｙは、少なくとも１であり；
− ＳＡは、糖抗原またはその免疫原性部位からなる群から選択され、ｙが１より大きい場合、ＳＡは、同一であるか、または異なり；
− ［Ｓ］_ｚ−ＰＣは、１個またはそれより多くの遊離チオール基に由来する１個またはそれより多くの硫黄原子を有する担体タンパク質であり；
− ｚは、少なくとも１であり、少なくともｙに等しく；
− Ｌは、構造：

【0110】

【化20】

を有するリンカーからなる群から選択されるリンカーであり、式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５であり；
− Ｒ_５は、Ｓ−ＰＣ、共有結合または構造：

【0111】

【化21】

のラジカルであり、
式中、Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１であり；
ｙが１より大きい場合、Ｌは、同一であるか、または異なる）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0112】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0113】

【化22】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１、２、３、４または５である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0114】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0115】

【化23】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0116】

一部の実施態様において、本発明の記載は、リンカーが、構造：

【0117】

【化24】

（式中、
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− ｒは、１または２である）
を有する、上記で定義された合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0118】

一部の実施態様において、本発明の記載は、ｙが、１から５０、１から４０、１から３０、１から２０、または１から１０、１から５、または１から２の範囲の整数である、上述した合成グリココンジュゲート免疫原に関する。

【0119】

一部の実施態様において、糖抗原は、本明細書に記載される炭水化物抗原であってもよく、および／または担体タンパク質は、本明細書に記載される担体タンパク質であってもよい。一部の実施態様において、合成グリココンジュゲート免疫原は、多価グリココンジュゲート免疫原であってもよく、例えば、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれより多くの同一または異なるタイプの炭水化物抗原を含む、多価グリココンジュゲート免疫原であってもよい。一部の実施態様において、グリココンジュゲート免疫原は、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導することができる。

【0120】

一部の形態において、本発明の記載は、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバント（例えば、本明細書に記載されるようなアジュバント）を含むワクチンに関する。

【0121】

一部の形態において、本発明の記載は、ワクチンの製造のための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原の使用に関する。

【0122】

一部の形態において、本発明の記載は、前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。

【0123】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を生産するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。

【0124】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲート免疫原に特異的に結合する抗体を検出するための、本明細書に記載される方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、本明細書に記載される合成グリココンジュゲート免疫原、または本明細書に記載されるワクチンの使用に関する。

【0125】

一部の形態において、本発明の記載は、グリココンジュゲートを生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）本明細書に記載されるチオール−エン反応を介した炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適なコンジュゲート材料を提供する工程であって、前記コンジュゲート材料は、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する、工程；および（ｃ）光触媒性チオール−エン反応を実行して、炭水化物抗原を、１個またはそれより多くの遊離チオール基においてコンジュゲート材料に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲートを生産する工程を含む、上記方法に関する。一部の実施態様において、コンジュゲート材料は、ポリマー、ポリペプチド、本明細書において定義される担体タンパク質、固体支持体、粒子、または本明細書に記載されるチオール−エン反応を介して炭水化物抗原へのコンジュゲーションに好適な遊離チオール基を有する他のあらゆる材料であるか、またはそれを含む。

【0126】

一部の形態において、本発明の記載は、炭水化物抗原または炭水化物抗原を含む腫瘍循環細胞に特異的に結合する抗体の存在を検出またはスクリーニングするための、または炭水化物抗原での免疫化またはワクチン接種の結果生じる抗体の存在を検出するための、本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートの使用に関する。一部の実施態様において、検出またはスクリーニングは、あらゆる好適な検出方法、例えば免疫吸着測定法、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ、または免疫ブロット分析を介して実行されてもよい。

【0127】

一部の形態において、本発明の記載は、対象を処置する方法であって、本明細書において定義された、または本明細書に記載される方法によって生産されたグリココンジュゲートまたはグリココンジュゲート免疫原を投与して、炭水化物抗原に対する前記対象における免疫応答を生じさせること、および前記対象からの生物学的サンプルを、炭水化物抗原に特異的に結合する抗体の存在に関してスクリーニングすることを含む、上記方法に関する。

【0128】

本発明の記載の他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照しながら、単なる例として例示された以下に示すそれらの具体的な実施態様の非制限的な記載を読むことでより明らかになると予想される。

【0129】

項目
１．対象への投与のためのグリココンジュゲート免疫原を生産するための方法であって、（ａ）末端アルケン（アルケニル炭水化物抗原）に共有結合で連結された炭水化物抗原を提供する工程であって、末端アルケンは、チオール−エン反応を介してチオール基に直接コンジュゲート可能である、工程；（ｂ）１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する担体タンパク質を提供する工程；および（ｃ）光触媒性チオール−エン反応を実行して、１個またはそれより多くの遊離チオール基において、炭水化物抗原を担体タンパク質に直接コンジュゲートすることによって、グリココンジュゲート免疫原を生産する工程を含み、担体タンパク質は、対象に対して免疫原性であり、炭水化物抗原の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、対象に投与されるときの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記方法。

【0130】

２．アルケニル炭水化物抗原が、水溶性である、項目１に記載の方法。

【0131】

３．前記光触媒性チオール−エン反応が、担体タンパク質の活性、抗原性、および／または構造を保持する反応条件下で実行される、項目１または２に記載の方法。

【0132】

４．前記光触媒性チオール−エン反応が、いずれの有機溶媒の非存在下で実行される、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【0133】

５．前記光触媒性チオール−エン反応が、触媒の存在下で実行される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【0134】

６．触媒が、水溶性触媒である、項目５に記載の方法。

【0135】

７．前記光触媒性チオール−エン反応が、短波紫外光下での放射線照射を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【0136】

８．前記光触媒性チオール−エン反応が、約２５４ｎｍでの放射線照射を含む、項目７に記載の方法。

【0137】

９．前記光触媒性チオール−エン反応が、長波紫外光下での放射線照射を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【0138】

１０．前記光触媒性チオール−エン反応が、約３６５ｎｍでの放射線照射を含む、項目９に記載の方法。

【0139】

１１．前記光触媒性チオール−エン反応が、担体タンパク質の遊離チオール基１つ当たり１〜１０モル当量のアルケニル炭水化物抗原を反応させることを含む、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【0140】

１２．前記光触媒性チオール−エン反応が、約３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、または４．０から、約４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、または１０までの間のｐＨで実行される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【0141】

１３．前記炭水化物抗原が、担体タンパク質へのコンジュゲーションの後、対象の内因性酵素によって担体タンパク質から切断可能ではない、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【0142】

１４．前記アルケニル炭水化物抗原が、末端アルケンに共有結合で連結されているか、および／または炭水化物抗原が、グリコシド結合を介して、例えば、Ｏ−グリコシド結合、Ｓ−グリコシド結合、Ｎ−グリコシド結合、もしくはＣ−グリコシド結合、または例えばアリルアミンと還元糖との間での還元的アミノ化により得られた結合を介して、担体タンパク質にコンジュゲートされている、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【0143】

１５．炭水化物抗原が、Ｂ細胞エピトープを含むか、および／または対象において体液性免疫応答を誘導する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。

【0144】

１６．炭水化物抗原が、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）であるか、またはそれを含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。

【0145】

１７．ＴＡＣＡが、Ｔｎ、Ｓ−Ｔｎ、トムゼン−フリーデンライヒ（ＴＦ）、（２，３）−Ｓ−ＴＦ、（２，６）−Ｓ−ＴＦ、グロボＨ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＧＭ３、またはそれらのあらゆる組合せであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、項目１６に記載の方法。

【0146】

１８．前記光触媒性チオール−エン反応が、１つより多くのタイプの炭水化物抗原を、担体タンパク質にコンジュゲートさせることによって、多価グリココンジュゲート免疫原を生産する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【0147】

１９．前記多価グリココンジュゲート免疫原が、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くの異なるタイプの炭水化物抗原を含む、項目１８に記載の方法。

【0148】

２０．炭水化物抗原が、ウイルス多糖抗原、または細菌莢膜多糖体（ＣＰＳ）であるか、またはそれを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。

【0149】

２１．細菌ＣＰＳが、肺炎球菌および／または連鎖球菌多糖体の血清型であるか、それ由来であるか、またはそれを含む、項目２０に記載の方法。

【0150】

２２．（ａ）における炭水化物抗原が、リンカーを介して、末端アルケンに連結されている、項目１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【0151】

２３．担体タンパク質が、１個またはそれより多くの遊離チオール基を有する１個またはそれより多くのシステイン残基を含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。

【0152】

２４．担体タンパク質が、ヒトＴ細胞エピトープを含むか、および／または対象において細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。

【0153】

２５．担体タンパク質が、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応性物質１９７（ＣＲＭ１９７）、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、インフルエンザ菌のプロテインＤ（ＨｉＤ）、サイトカイン、またはそれらの免疫原性フラグメントであるか、それ由来であるか、もしくはそれを含む、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。

【0154】

２６．担体タンパク質が、１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋を有するタンパク質であり、（ｉ）１つまたはそれより多くのジスルフィド架橋が、前記光触媒性チオール−エン反応の後、影響を受けないままであり；または（ｉｉ）担体タンパク質を還元剤で前処理して、炭水化物抗原へのコンジュゲーションのために、１つまたはそれより多くの追加の遊離チオール基を露出させる、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。

【0155】

２７．グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、コンジュゲーション前の担体タンパク質上の利用可能な遊離チオール基の数に等しい、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。

【0156】

２８．グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。

【0157】

２９．（ｄ）グリココンジュゲート免疫原を精製する工程をさらに含む、項目１〜２８のいずれか一項に記載の方法。

【0158】

３０．グリココンジュゲートワクチンを生産するための方法であって、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原を、医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを用いて製剤化することを含む、上記方法。

【0159】

３１．アジュバントが、無機化合物、鉱油、微生物誘導体、植物誘導体、サイトカイン、スクアレン、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、免疫刺激ポリヌクレオチド、免疫刺激脂質、フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント、ＱＳ−２１、ムラミルジペプチド、もしくはそれらのあらゆる組合せであるか、またはそれを含む、項目３０に記載の方法。

【0160】

３２．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原および１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基を有する免疫原性担体タンパク質を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原は、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基において、免疫原性担体タンパク質に連結されており、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性担体タンパク質へのコンジュゲーションは、対象に投与されると、コンジュゲートしていない炭水化物抗原の投与と比較した場合、１つまたはそれより多くの炭水化物抗原の免疫原性を増加させる、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【0161】

３３．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、リンカーを介して、１つまたはそれより多くの溶媒接近可能なシステイン残基に連結されている、項目３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0162】

３４．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、項目１３または１４で定義された結合を介して、リンカーに連結されている、項目３２に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0163】

３５．１つまたはそれより多くの炭水化物抗原が、項目２、１５、１６、１７、２０、または２１で定義された通りである、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0164】

３６．項目１８または１９で定義された多価グリココンジュゲート免疫原である、項目３２〜３５のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0165】

３７．担体タンパク質が、項目２３、２４、２５、または２６で定義された通りである、項目３２〜３６のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0166】

３８．グリココンジュゲート免疫原に含まれる炭水化物抗原の総数が、担体タンパク質における溶媒接近可能なシステイン残基の数に等しい、項目３２〜３７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0167】

３９．対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目３２〜３８のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0168】

４０．項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製される、項目３２〜３９のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0169】

４１．項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、ならびに／または項目３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤、および／またはアジュバントを含むグリココンジュゲートワクチン。

【0170】

４２．予防ワクチンまたは治療ワクチンである、項目４１に記載のグリココンジュゲートワクチン。

【0171】

４３．対象を免疫化する、対象にワクチン接種する、または対象を処置する方法であって、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲート免疫原、項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、項目３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または項目４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチンを対象に投与することを含む、上記方法。

【0172】

４４．疾患を有する対象を免疫化すること、対象にワクチン接種をすること、または対象を処置することにおいて使用するための、項目３２〜４０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、または項目４１または４２に記載のグリココンジュゲートワクチン。

【0173】

４５．担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0174】

【化25】

（式中、
− ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
− ＰＣは、担体タンパク質であり；
− Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ_１、またはＣＨ_２であり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＣＨ_３、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅである）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【0175】

４６．担体タンパク質の１個またはそれより多くの遊離チオール基にリンカーを介して共有結合で連結された１つまたはそれより多くの糖抗原を含む合成グリココンジュゲート免疫原であって、各リンカーは、構造：

【0176】

【化26】

（式中、
− ＳＡは、糖抗原またはその一部であり；
− ＰＣは、担体タンパク質であり；
− Ｘは、Ｓ、ＮＲ_１、ＣＨ_２またはＯであり；
− Ｒ_１は、−Ｈ、−ＣＯＨ、−ＣＯＭｅ、または−ＣＯＥｔであり；
− ｎは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_２は、ＨまたはＭｅであり；
− ｑは、１、２、３、４、または５であり；
− Ｒ_３およびＲ_４はそれぞれ、水素原子であり、ｍは、１、２、３、４もしくは５であるか、またはＲ_３およびＲ_４は、一緒になって、窒素原子に連結されたカルボニルと、ラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−またはラジカル−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を形成し、ｍは、１である）
を有するか、またはその立体異性体である、上記合成グリココンジュゲート免疫原。

【0177】

４７．前記糖抗原が、項目１５、１６、１７、２０、または２１で定義された炭水化物抗原である、項目４５または４６に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0178】

４８．前記担体タンパク質が、項目２３、２４、または２５で定義された担体タンパク質である、項目４５〜４７のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0179】

４９．多価グリココンジュゲート免疫原である、項目４５〜４９のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0180】

５０．前記多価グリココンジュゲート免疫原が、担体タンパク質にコンジュゲートした、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれより多くの異なるタイプの炭水化物抗原を含む、項目４９に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0181】

５１．グリココンジュゲート免疫原が、対象に投与されると、炭水化物抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導する、項目４５〜５０のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原。

【0182】

５２．項目４５〜５１のいずれか一項に記載の合成グリココンジュゲート免疫原、ならびに医薬的に許容される賦形剤および／またはアジュバントを含むワクチン。

【0183】

５３．アジュバントが、項目３１で定義された通りである、項目５２に記載のワクチン。

【0184】

５４．ワクチンの製造のための、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、または項目３２〜４０および４５〜５１のいずれか１つで定義された合成グリココンジュゲート免疫原の使用。

【0185】

５５．前記１つまたはそれより多くの炭水化物または糖抗原の発現の増加に関連する疾患を有する対象を処置するための、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって調製されたグリココンジュゲート免疫原、項目３０または３１に記載の方法によって生産されたグリココンジュゲートワクチン、項目３２〜４０および４５〜５１のいずれか１つで定義された合成グリココンジュゲート免疫原、または項目５２または５３に記載のワクチンの使用。

【実施例】

【0186】

実施例１：一般的な方法
反応を、商業的に入手可能なＨＰＬＣグレードを使用したアルゴン雰囲気下で行った。商業的に入手可能な試薬（シグマ・アルドリッチ（Sigma Aldrich））をそれ以上精製せずに使用した。Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸は、ローズサイエンティフィック社（Rose Scientific Ltd.）、アルバータ州、カナダから提供された。Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂およびＦｍｏｃアミノ酸は、ペプチドテクノロジー社（Peptide Technologies Ltd）、ピエールフォン、Ｑｃ、カナダから商業的に入手可能であった。反応の進行を、シリカゲル６０Ｆ_２５４でコーティングされたプレート（Ｅ．メルク（E. Merck））を使用した薄層クロマトグラフィーによってモニターした。クリックチオール−エン光化学反応によるコンジュゲーションを、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（ＵＶ−ＡＣハンドランプ、デュアル２５４／３６５ｎｍ ＵＶ；１１５Ｖ〜６０Ｈｚ、０．１６ａｍｐ、ＶＷＲカナダ（VWR Canada）、カタログ番号８９１３１−４９２）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー・サイエンティフィック・カナダ（Fisher Scientific Canada）、カタログ番号１４−９５８−１３０）中で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、カナダのライフサイエンス（Life Science）からのＺＥＯｐｒｅｐ（商標）シリカゲル６０（４０〜６３μｍ）を使用して実行した。検出を、紫外線下で、または２０％エタノールを含む硫酸またはモリブデン酸塩またはＫＭｎＯ_４溶液と共にスプレーし、続いて加熱することによって行った。ＮＭＲスペクトルを、ブルカー（Bruker）のＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００ＭＨｚおよびブルカーのＡｖａｎｃｅ（商標）ＩＩＩ ＨＤ ６００ＭＨｚ分光計で記録した。プロトンおよび炭素の化学シフト（ｄ）は、７．２６ｐｐｍ（^１Ｈ）および７７．１６ｐｐｍ（^１３Ｃ）で設定された残留ＣＨＣｌ_３の化学シフトに対するｐｐｍで報告される。結合定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で報告され、ピーク多重度に関しては以下の略語が使用される：一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、二重項の二重項（ｄｄ）、等しい結合定数を有する二重項の二重項（ｔ_ａｐ）、三重項（ｔ）、多重項（ｍ）。分析および割り当てを、ＣＯＳＹ（相関分光法）およびＨＳＱＣ（異核単一量子干渉）実験を使用して行った。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を、アジレント・テクノロジーズ（Agilent technologies）からのＬＣ−ＭＳ−ＴＯＦ（高速液体クロマトグラフィー／飛行時間型質量分析）機器を用いて、ＵＱＡＭの分析プラットフォームによってポジティブおよび／またはネガティブエレクトロスプレーモードで測定した。実験式の確認のために、プロトン化イオン（Ｍ＋Ｈ）^＋またはナトリウム付加物（Ｍ＋Ｎａ）^＋のいずれかを使用した。天然のＴＴおよびＴＴ−コンジュゲートを、２０００ＫＤａのベンゾイル化透析チューブ（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）（オンタリオ州、カナダ）を使用して透析した。天然の、およびコンジュゲートしたＴＴの両方のチオール含量を、４１２ｎｍでのエルマン試験によって決定した（Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959、82、70〜77）。ＴＴ−コンジュゲートの全糖含量を、ＵＶ／ＶＩＳウルトロスペック（Ultrospec）１００プロット分光光度計（バイオクロム（Biochrom）、米国）を使用して４９２ｎｍで測定された比色ＤｕＢｏｉｓ試験によって決定した（Dubois, M.； Gilles, K. A.；Hamilton, J. K.； Rebers, P. A.；Smith, F. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem.、1956、28、350〜356）。動的光散乱（ＤＬＳ）、粒度分布を、マルバーン（Malvern）からのゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）Ｓ９０を使用して、ＰＢＳ中で測定した。マウスモノクローナルＩｇＧ３抗体ＪＡＡ−Ｆ１１を、これまでにRittenhouse-Diakunら、1998に記載されたようにして生産された。

【0187】

■一般的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）の手順は、文献の手順（Papadopoulosら、2012）に従い、Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００〜２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から開始した。反応を、１．５×１４ｃｍのＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ使い捨てカラム（２０ｍＬ）（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、オンタリオ州、カナダ）で回転によるかき混ぜによって実行した。１時間の間に、樹脂をＣＨ_２Ｃｌ_２中で膨潤させ、次いでろ過し、１時間の間に、ＤＭＦ中で再度調整した。商業的な樹脂またはアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの溶液（５ｍＬ、２×５分、次いで１×１０分）を用いて除去した。溶媒および試薬をろ過によって除去し、樹脂を、ＤＭＦ、ＣＨ_２Ｃｌ_２およびＭｅＯＨで洗浄した（各溶媒で３回）。遊離アミノ基の存在を、カイザー試験またはＴＮＢＳ試験によって検証した。樹脂上の遊離アミンを、ＤＭＦ中の、予め活性化させたＦｍｏｃアミノ酸：３当量のアミノ酸、３当量のＨＢＴＵ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および触媒的な量のＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の溶液で４℃で（１０分）処理した。次いでこの混合物にＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルアミン、９当量）を添加し、室温で１時間３０分撹拌した。カップリングの完了は、カイザーまたはＴＮＢＳ比色試験を使用して決定した。ろ過の後、樹脂を洗浄し、Ｆｍｏｃ除去手順を再度繰り返した。合成配列の末端に、最後の遊離アミンを、アセチル化（１：１：８のＡｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦ、１時間）によってキャッピングした。ろ過の後、溶液を切って、樹脂を真空中で乾燥させ、トリフルオロ酢酸／水／エタンジチオール／トリイソプロピルシラン（triisopropysilane）（９４．０／２．５／２．５／１．０）を使用して切断を３時間行った。得られたペプチドをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを用いて沈殿させ、遠心分離（２０分、２０００ｒｐｍ、３×）によって樹脂ビーズから単離した。沈殿を空気噴流を用いて慎重に乾燥させた。未精製ペプチドをＨ_２Ｏ中に溶解させて、樹脂から分離した。次いで溶液を凍結乾燥して、所望のペプチドを得た。

【0188】

■ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａ
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００〜２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI⁺-LC-MS：[M+2H]⁺² C₈₃H₁₃₅O₂₄N₁₉Sの計算値、906.9819；実測値、906.9849；CAN/H₂O 5〜95% 5.42分。

【0189】

■Ｃｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａ
Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（６５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、１．０当量；１００〜２００メッシュ、ローディング＝０．５２ｍｍｏｌ／ｇ）から、所望のペプチドＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａを白色の粉末として単離した（６２ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、１０％）。ESI⁺-LC-MS：[M+2H]⁺² C₈₃H₁₃₅O₂₄N₁₉Sの計算値、906.9819；実測値、906.9844；CAN/H₂O 5〜95% 5.32分。

【0190】

実施例２：アリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）

【0191】

【化27】

図５を参照すれば、塩化アセチル（２．７６ｍＬ、３８．８０ｍｍｏｌ、３．４３当量）を、アルゴン雰囲気下で、０℃で、アリルアルコール（２０．８ｍＬ）に一滴ずつ添加した。室温で、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（化合物１）（２．５０ｇ、１１．３ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。反応混合物を７０℃で３時間撹拌し、次いでｐＨ７まで固体ＮａＨＣＯ_３を添加することによってクエンチした。懸濁液をセライトのパッドに通過させてろ過し、ＭｅＯＨで数回洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、未精製のアリル２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコサミンを、Ｅｔ_２Ｏ／エタノールでの粉砕によって沈殿させた。次いで粉砕後、溶媒を減圧下で数回除去した。−１５℃、窒素雰囲気下で、無水ジクロロメタン−ピリジン（４５ｍＬ、ｖ／ｖ、１：２）の混合物中の、未精製のアリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド中間体の懸濁液に、塩化ピバロイル（３．９０ｍＬ、３１．６４ｍｍｏｌ、２．８０当量）を一滴ずつ添加した。反応混合物を２時間撹拌し、室温に温め、望ましいα−アノマー（化合物２）（Ｒｆ＝０．３２）を一部のβ−アノマー（Ｒｆ＝０．１８）と共に得た；１：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ）。次いで混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、有機相を連続的にＨＣｌ（１Ｍ）、ＫＨＳＯ_４の飽和水溶液、ＮａＨＣＯ_３の飽和溶液、およびブラインで数回洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させた。黄色がかった油をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（６：４〜１：１のヘキサン−ＥｔＯＡｃ）で精製し、望ましい化合物であるアリル２−アセトアミド−３，６−ジ−Ｏ−ピバロイル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（化合物２）を白色の固体として得た（４．８５ｇ、６．７８ｍｍｏｌ、６０％）。Ｒｆ＝０．３２；１：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ；図６Ａおよび６Ｂ：¹H NMR (CDCl_3, 600 MHz)：δ 5.87 (dddd, 1H, J_H,H = 16.8, 10.5, 6.2, 5.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.77 (d, 1H, J_NH,H2 = 9.7 Hz, NH), 5.31-5.25 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.22 (dd, 1H, J_H,H = 10.4, 1.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.09 (dd, 1H, J_3,4 = 10.7, J_2,3 = 9.3 Hz, H-3), 4.83 (d, 1H, J_1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.39 (m, 1H, H-6a), 4.35-4.25 (m, 2H, H-6bおよびH-2), 4.19 (m, 1H, OCH₂), 4.02-3.93 (m, 1H, OCH₂), 3.85 (m, 1H, H-5), 3.59-3.48 (m, 1H, H-4), 3.03 (d, 1H, J_4,OH = 5.1 Hz, OH-4), 1.93 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.23 (s, 9H, tert-ブチル)および1.19 ppm (s, 9H, tert-ブチル) ；¹³C NMR (CDCl_3, 150 MHz)：δ 179.8, 179.1 (tert-BuCO), 169.7 (NHCO), 133.2 (OCH₂CH=CH₂), 118.1 (OCH₂CH=CH₂), 96.4 (C-1), 73.4 (C-3), 70.5 (C-5), 69.1 (C-4)。68.2 (OCH₂), 63.1 (C-6), 51.4 (C-2), 39.0、38.9 (2×C(CH₃)₃), 27.2、27.0 (2×C(CH₃)₃)および23.2 ppm (CH₃)。図６Ｃおよび６Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C₂₁H₃₆O₈Nの計算値、430.2435；実測値、430.2445。β−アノマーを白色の固体として単離した（９７１ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ、２０％）。Ｒｆ＝０．１８；１：１のヘキサン／ＥｔＯＡｃ；¹H NMR (CDCl_3、300 MHz)：δ 6.00 (d, 1H, J_NH,H2 = 9.3 Hz, NH), 5.95-5.75 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.35-5.03 (m, 3H, OCH₂CH=CH₂およびH-3), 4.55 (d, 1H, J_1,2 = 8.4 Hz, H-1), 4.47-425 (m, 3H, H-6a, 6bおよびOCH₂), 4.14-3.90 (m, 2H, OCH₂およびH-2), 3.65-3.43 (m, 2H, H-5およびH-4), 3.23 (sb, 1H, OH-4), 1.92 (s, 3H, NHCOCH₃), 1.23 (s, 9H, tert-ブチル)および1.20 ppm (s, 9H, tert-ブチル)。

【0192】

実施例３：アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴｎ）

【0193】

【化28】

図５を参照すれば、無水ジクロロメタン−ピリジン（１２６ｍＬ、ｖ／ｖ、２０：１）の混合物中のジ−Ｏ−ピバロイル化合物（化合物２）（５．５０ｇ、１２．８０ｍｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で−３５℃に冷却した。次いでトリフルオロメタンスルホン酸無水物（２．５８ｍＬ、１５．３６ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、混合物をこの温度で撹拌した。温度を２時間かけて室温にした。次いでこの溶液に水（１２ｍＬ）を添加した。混合物を加熱し、還流しながら（約５０℃）一晩（１２時間）撹拌した。室温に達した後、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１ＭのＨＣｌ水溶液で数回洗浄した。有機層を、Ｈ_２Ｏ、飽和ＮａＨＣＯ_３、およびブラインで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ゼンプレン（Zemplen）条件（メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド溶液、４０ｍＬ、ｐＨ９）下で処理した。この溶液を５０℃で一晩撹拌した。室温に冷却した後、この溶液を、イオン交換樹脂（アンバーライト（Amberlite）（登録商標）ＩＲ１２０、Ｈ^＋）に添加することによって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。凍結乾燥後、ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中での沈殿によってアリルＴ_Ｎを白色の固体として単離した（２．３６ｇ、９．１０ｍｍｏｌ、７１％）。Ｒｆ＝０．３２；４：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ；図７Ａおよび７Ｂ：¹H NMR (CD₃OD, 600 MHz)：δ 5.99-5.88 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.31 (dd, 1H, J_trans= 17.3, J_gem = 1.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.17 (dd, 1H, J_cis = 10.5 Hz, OCH₂CH=CH₂), 4.86 (d, 1H, J_1,2 = 3.8 Hz, H-1), 4.27 (dd, 1H, J_2,3 = 11.0 Hz, H-2), 4.20 (m, 1H, OCH₂), 4.00 (m, 1H, OCH₂), 3.89 (dd, J_3,4= J_4,5 = 2.6 Hz, H-4), 3.85-3.77 (m, 2H, H-3およびH-5), 3.72 (m, 2H, H-6aおよびH-6b)および1.99 ppm (s, 3H, CH₃) ；¹³C NMR (CD₃OD, 150 MHz)：δ 172.5 (NHCO), 134.2 (OCH₂CH=CH₂), 116.1 (OCH₂CH=CH₂), 96.6 (C-1), 71.2 (C-3), 69.0 (C-4), 68.3 (C-5)。67.8 (OCH₂), 61.4 (C-6), 50.2 (C-2)および21.2 ppm (CH₃)。図７Ｃおよび７Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C₁₁H₂₀O₆Nの計算値、262.1285；実測値、262.1294。

【0194】

■手順Ｂ
アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシドはまた、文献の手順（Fengら、2004）に従ってＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）から直接調製することもできる。アリルアルコール（８ｍＬ）中のＮ−アセチルガラクトサミン（４４２ｍｇ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、室温でＢＦ_３・Ｅｔ_２Ｏ（２５０μＬ、２ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、混合物を７０℃で２時間撹拌した。この溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。乾燥粗生成物を最小限のＥｔＯＨ（５ｍＬ）中に溶解させた。所望のアリルＴ_Ｎ生成物を、ジイソプロピルエーテル中で沈殿させ、白色の固体として単離した（４１７ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、８０％）。

【0195】

Ｃ−アリルＧａｌＮＡｃ類似体（図５）［１−（２’−アセトアミド−２’−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−プロペン］を、文献の手順に従って調製した（Cipollaら、2000：３−（２−アセトアミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−１−プロペン（Cuiら、1998）（３７１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、１．０当量）を、ゼンプレン条件（メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド溶液、５ｍＬ、ｐＨ８〜９）下で処理した。この溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物を、イオン交換樹脂（アンバーライト（登録商標）ＩＲ１２０、Ｈ^＋）に添加することによって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、溶媒を減圧下で除去した。Ｃ−アリルＴ_Ｎをシリカゲルでのクロマトグラフィー（９：１〜４：１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ）によって精製し、続いてＥｔＯＨ中で白色の固体として結晶化させた（２１３ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、８７％）。Ｒｆ＝０．２８；ＥｔＯＨ ４：１；ｍｐ２３０℃（文献値２１５〜２１７℃、ＥｔＯＡｃ／ＥｔＯＨ）；文献のＮＭＲデータにより：¹H NMR (CD₃OD, 600 MHz)：δ 5.81 (m, 1H, ¹CH₂CH=CH₂), 5.08 (dd, 1H, J_trans= 17.2, J_gem = 1.7 Hz, ¹CH₂CH=CH₂), 5.02 (dd, 1H, J_cis = 10.2 Hz, ¹CH₂CH=CH₂), 4.22 (dd, 1H, J = 9.3、5.0 Hz, H-2’), 4.14 (dt, 1H, J = 10.0、5.0 Hz, H-1’), 3.91 (dd, 1H, J = 3.0 Hz, H-4’), 3.82-3.64 (m, 4H, H-3’, H-5’およびH-6’ab), 2.45 (m, 1H, H-1a), 3.17 (m, 1H, H-1b)および1.97 ppm (s, CH₃) ；¹³C NMR (CD₃OD, 150 MHz)：δ 173.6 (NHCO), 136.2 (¹CH₂CH=CH₂), 117.1 (¹CH₂CH=CH₂), 72.9 (C-1’), 69.7 (C-4’), 69.5 (C-3’およびC-5’), 61.8 (C-6’), 52.0 (C-2’), 32.4 (¹CH₂)および22.5 ppm (CH₃)。ESI⁺-LCMS：[M+H]⁺ C₁₁H₂₀O₅Nの計算値、246.1336；実測値、246.1332；CAN/H₂O 5〜95% 1.4分。

【0196】

Ｓ−アリルＧａｌＮＡｃ類似体（図５）を文献：Knappら、2002に従って調製した。

【0197】

実施例４：アリル２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物４）

【0198】

【化29】

図５を参照すれば、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアリルＧａｌＮＡｃ（Ｔｎ）（２．３５ｇ、９．０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびベンズアルデヒドジメチルアセタール（６．７５ｍＬ、４５．０ｍｍｏｌ、５．０当量）の溶液に、触媒的な量のｐ−トルエンスルホン酸一水和物を添加した。混合物を室温で撹拌した。５時間の後、混合物をＣＨＣｌ_３で希釈し、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液で洗浄した。有機層を分離し、水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮して、白色の固体を得た。ベンジリデンアセタール（４）を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン中での沈殿によって白色の固体として単離した（２．６４ｇ、７．５６、８４％）。Ｒｆ＝０．２１；９．０：０．５のＤＣＭ／ＭｅＯＨ；図８Ａ：¹H NMR (CDCl_3、300 MHz)：δ 7.59-7.46 (m, 2H, H-ar), 7.43-7.31 (m, 3H, H-ar), 5.91 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.75 (d, 1H, J_NH,H2 = 9.0 Hz, NH), 5.58 (s, 1H, PhCH), 5.34-5.17 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂), 5.01 (d, 1H, J_1,2 = 3.5 Hz, H-1), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J_2,3 = 10.9 Hz, J_2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J_5,6a = 1.5 Hz, J_6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4およびOCH₂), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J_5,6b= 1.6 Hz, J_6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH₂), 3.86 (dd, 1H, J_3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J_3,OH= 10.7 Hz, OH-3)および2.05 ppm (s, 3H, CH₃) ；図８Ｂおよび８Ｃ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C₁₈H₂₄O₆Nの計算値、350.1598；実測値、350.1608。

【0199】

実施例５：アリル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（化合物６）

【0200】

【化30】

図５を参照すれば、化合物４（２．０ｇ、５．７２ｍｍｏｌ、１．０当量）およびシアン化第二水銀（２．１７ｇ、８．６０ｍｍｏｌ、１．５当量）を、アルゴン雰囲気下で、４Åの分子篩を含有する無水ニトロメタン−トルエン（１００ｍＬ、３：２、ｖ／ｖ）の混合物中に溶解させた。混合物を室温で３０分撹拌した。混合物に、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド（化合物５）（５．６６ｇ、８．５８ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。この溶液を７０℃で５時間撹拌し、次いで室温で一晩（８時間）撹拌し続けた。ＴＬＣ（９．０：０．５のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によって示されるように出発材料（化合物４）が全部消費された後、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＥｔＯＡｃ中に溶解させ、続いてセライトパッドを介してろ過した。ろ液を連続的に１０％ヨウ化カリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム溶液および水で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で蒸発させて、白色の発泡体を得た。粗生成物を、１００％ヘキサンから１：２のヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配を使用したシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製して、望ましい二糖（化合物６）を白色の固体として得た（４．９８、５．３８ｍｍｏｌ、９４％）。ｍｐ：１１０〜１１１℃、Ｒｆ＝０．２０；１：２のヘキサン／ＥｔＯＡｃ；図９Ａおよび９Ｂ：¹H NMR (CDCl_3、600 MHz)：δ 8.06-7.19 (m, 5H, H-ar), 5.98 (dd, 1H, J_3,4’ = 3.3 Hz, J_4,5’ = 1.0 Hz, H-4^II), 5.85-5.78 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂およびH-2^II), 5.60 (dd, 1H, J_2,3’ = 10.2 Hz, J_3,4’ = 3.4 Hz, H-3^II), 5.48 (sb, 1H, NH), 5.23 (m, 3H, OCH₂CH=CH₂およびH-1), 4.68 (dd, 1H, J_5’,6a’ = 6.9 Hz, J_6a’,6b’ = 11.4 Hz, H-6a^I), 4.63-4.58 (m, 1H, H-2), 4.46-4.36 (m, 3H, H-4, H-5およびH-6b^II), 4.14-4.07 (m, 3H, H-6a, OCH₂およびH-3), 3.96 (m, 1H, OCH₂), 3.75 (m, 1H, H-6b), 3.51 (m, 1H, H-5)および1.40 ppm (s, 3H, CH₃) ；¹³C NMR (CDC_13、150 MHz)：δ 170.0 (NHCO), 166.0、165.5、165.4、165.2 (CO), 137.6-126.2 (multi, 30 C-arom), 133.2 (OCH₂CH=CH₂), 117.8 (OCH₂CH=CH₂), 102.0 (C-1^II), 100.9 (CPhCH), 97,3 (C-1^I), 76.1 (C-3), 75.4 (C-4), 71.7 (C-3^IIおよびC-5^II), 70.2 (C-2^II), 69.1 (C-6), 68.6 (OCH₂), 68.1 (C-4^II), 62.9 (C-5), 62.6 (C-6^I), 48.2 (C-2)および22.5 ppm (CH₃)。図９Ｃおよび９Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C₅₂H₅₀O₁₅Nの計算値、928.3175；実測値、928.3133。

【0201】

実施例６：アリル（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（アリルＴＦ）

【0202】

【化31】

図５を参照すれば、メタノール中の１Ｍナトリウムメトキシド（１２ｍＬ、ｐＨ８〜９）中の化合物６（１．１２ｇ、１．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、出発材料が消費されるまで室温で撹拌した。１時間３０分後、この溶液をイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０、Ｈ^＋）の添加によって中和し、ろ過し、ＭｅＯＨで洗浄し、この溶液にシリカゲルを懸濁し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去した。シリカゲルを、１００％ＥｔＯＡｃで数回洗浄し、続いて第２の溶液（１：１：０．１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ）で洗浄した。合わせたろ液を減圧下で蒸発させて、中間体（化合物７）を白色の固体として得た。Ｒｆ＝０．２０；１１：６：１のＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；図１０Ａおよび１０Ｂ：¹H NMR (D₂O, 600 MHz)：δ 7.47-7.39 (m, 2H, H-ar), 7.37-7.26 (m, 3H, H-ar), 5.82 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.61 (s, 1H, PhCH), 5.20-5.09 (m, 2H, OCH₂CH=CH₂), 4.88 (d, 1H, J_1,2 = 3.4 Hz, H-1), 4.47 (dd, H-4), 4.37-4.25 (m, 2H, H-2およびH-1^II), 4.13-3.98 (m, 4H, H-3, H-6a, H-6b, OCH₂), 3.96-3.88 (m, 1H, H-5), 4.56-4.42 (ddd, 1H, J_2,3 = 10.9 Hz, J_2,OH = 9.1 Hz, H-2), 4.34 (dd, 1H, J_5,6a = 1.5 Hz, J_6a,6b = 12.5 Hz, H-6a), 4.19 (m, 2H, H-4およびOCH₂), 4.04 (m, 1H, dd, 1H, J_5,6b= 1.6 Hz, J_6a,6b = 12.5 Hz, H-6b), 4.01 (m, OCH₂), 3.86 (dd, 1H, J_3,4 = 10.9 Hz, H-3), 3.71 (sb, 1H, H-5), 2.80 (d, 1H, J_3,OH= 10.7 Hz, OH-3)および2.05 ppm (s, 3H, CH₃) ；3.83 (s, 1H, OCH₂), 3.72 (d, 1H, J_3’,4’ = J_4’,5’ = 3.2 Hz, H-4^II), 3.65-3.55 (m, 2H, H-6a,b), 3.49, (m, 1H, H-5^II), 3.43 (dd, 1H, J_{2’,3’ =} 10.0 Hz, J_{3’,4’ =} 3.3 Hz, H-3^II), 3.33-3.24 (m, 1H, H-2^II)および1.86 ppm (s, 3H, CH₃) ；¹³C NMR (D₂O, 150 MHz)：δ 174.6 (NHCO), 136.8 (C-arom), 133.6 (OCH₂CH=CH₂), 129.9、128.7、126.5 (C-arom), 118.0 (OCH₂CH=CH₂), 104.9 (C-1^II), 101.3 (CHPh), 97.0 (C-1), 76.0 (C-4), 75.0 (C-3), 75.0 (C-5^II), 72.4 (C-3^II), 70.4 (C-2^II), 69.0 (C-6), 68.7 (OCH₂CH=CH₂), 68.6 (C-4^II), 63.0 (C-5), 61.0 (C-6^II), 48.6 (C-2)および22.0 ppm (CH₃)。Ｒｆ＝０．３８；７：３：０．１のＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；Ｒｆ＝０．４６；７：２：１のＡＣＮ／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ。図１０Ｃおよび１０Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+H]⁺ C₂₄H₃₄O₁₁Nの計算値、512.2126；実測値、512.2119。

【0203】

次いで白色の固体である中間体を、１０ｍＬの６０％酢酸水溶液中に溶解させ、得られた溶液を６０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を凍結乾燥して、最終的なアリルＴＦを白色の固体として得た（４２７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、８４％）。ｍｐ＝２３０〜２３２℃；Ｒｆ＝０．５３；１１：６：１のＣＨＣｌ_３／ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ；図１１Ａおよび１１Ｂ：¹H NMR (D₂O, 600 MHz)：δ 5.80 (m, 1H, OCH₂CH=CH₂), 5.19 (dd, 1H, J_trans = 17.3 Hz, OCH₂CH=CH₂), 5.09 (dd, 1H, J_cis = 10.4 Hz, OCH₂CH=CH₂), 4.77 (d, 1H, J_1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J_1,2 = 3.7 Hz, H-1), 4.29 (d, 1H, J_1,2= 7.8 Hz, H-1^II), 4.16 (dd, 1H, J_2,3 = 11.2 Hz, J_1,2= 3.7 Hz, H-2), 4.08-4.01 (m, 2H, H-4およびOCH₂), 3.92-3.82 (m, 3H, H-3, H-5およびOCH₂), 3.73 (dd, 1H, H-4^II), 3.63-3.52 (m, 4H, H-6a,bおよびH-6’a,b), 3.47 (m, 2H, H-3^IIおよびH-5^II), 3.39 (dd, 1H, J_2’,3’= 10.0 Hz, J_1’,2’ = 7.7 Hz, H-2^II)および1.85 ppm (s, 3H, CH₃) ；¹³C NMR (150 MHz, CDC₁₃)：δ 174.6 (NHCO), 133.7 (OCH₂CH=CH₂), 117.9 (OCH₂CH=CH₂), 104.7 (C-1^II), 96.4 (C-1), 77.2 (C-3), 75.0 (C-5^II), 72.5 (C-3^II), 70.7 (C-5), 70.6 (C-2^II), 68.8 (C-4), 68.6 (C-4^II), 68.4 (OCH₂), 61.2 (C-6^II), 61.0 (C-6), 48.6 (C-2)および22.0 ppm (CH₃)。図１１Ｃおよび１１Ｄ：ESI⁺-HRMS：[M+Na]⁺ C₁₇H₂₉O₁₁NNaの計算値、446.1633；実測値、446.1613。

【0204】

実施例７：破傷風トキソイド単量体の精製
破傷風トキソイド（ＴＴ）単量体を、コンジュゲーション前に、ゲルろ過クロマトグラフィーによって得た。１ミリリットルの４．５ｍｇ／ｍｌタンパク質を含有する液体調製物（改変されたローリータンパク質アッセイによって決定した場合）を、ＰＢＳ（２０ｍＭのＮａＨＰＯ_４［ｐＨ７．２］、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で平衡化したスーパーデックス（Superdex）（登録商標）２００Ｐｒｅｐグレード（ＧＥヘルスケア・ライフサイエンス（GE Healthcare Life Sciences）、ウプサラ、スウェーデン）を充填したＸＫ１６−１００カラム上にローディングし、同じ緩衝液で溶出した。２つのピークでカラムから溶出したタンパク質：先に溶出したピークは、オリゴマー化されたトキソイドを含有し、後に溶出したピークは、ＴＴ単量体を含有する１５０，０００のＭｒに対応する。後の（単量体）ピークに対応する画分をプールし、脱イオン水に対して脱塩し、セントリコン（Centricon）（登録商標）プラス−７０遠心フィルターデバイス（３０Ｋ ウルトラセルＰＬ（Ultracel PL）膜；ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州ビレリカ）を使用して濃縮し、次いで凍結乾燥した。

【0205】

実施例８：Ｔｎ−破傷風トキソイドコンジュゲート（Ｔｎ−ＴＴコンジュゲート）

【0206】

【化32】

■手順Ａ
石英セル中で、５００μＬのＰＢＳ中のアリルＴｎ（０．１５ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、１８．０当量）の溶液に、４．７ｍｇ（０．０３μｍｏｌ）の破傷風トキソイドを含有する１．５ｍＬのＰＢＳを添加した。この溶液を、アルゴン雰囲気下で脱気した後、２５４ｎｍで７時間放射線照射した。この溶液を、二重に蒸留した水でのいくつかの洗浄液に対して２４時間透析し、凍結乾燥して、Ｔｎ−ＴＴ−Ａコンジュゲートを白色の固体として得た（２．０ｍｇ、４３％）。手順Ｂ：同じチオール−エンクリック反応下で、アセトニトリル（１００μＬ）中の触媒的な量のＤＭＰＡを、ＰＢＳ中の破傷風トキソイド（２ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、０．０６μｍｏｌ）を含有するアリルＴｎ（３ｍｇ、１０．８μｍｏｌ、１８０．０当量）の溶液に添加した。この溶液を３６５ｎｍで１５分間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、Ｔｎ−ＴＴ−Ｂコンジュゲートを白色の固体として得た（５．４ｍｇ、６１％）。

【0207】

実施例９：ＴＦ−破傷風トキソイドコンジュゲート（ＴＦ−ＴＴコンジュゲート）

【0208】

【化33】

■手順Ａ
石英セル中で、５００μＬのＰＢＳ中のアリルＴＦ（０．２４ｍｇ、０．５６μｍｏｌ、１８．０当量）の溶液に、１．５ｍＬの４．７ｍｇ（０．０３μｍｏｌ）の破傷風トキソイドを含有するＰＢＳを添加した。この溶液を、アルゴン雰囲気下で脱気した後、２５４ｎｍで７時間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、ＴＦ−ＴＴ−Ａコンジュゲートを白色の固体として得た（２．１ｍｇ、４５％）。手順Ｂ：同じチオール−エンクリック反応下で、アセトニトリル（１００μＬ）中の触媒的な量のＤＭＰＡを、ＰＢＳ（２ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、０．０６μｍｏｌ）中の破傷風トキソイドを含むアリルＴＦ（５ｍｇ、１０．８μｍｏｌ、１８０．０当量）の溶液に添加した。この溶液を３６５ｎｍで１５分間放射線照射した。次いで溶液を２４時間透析し、凍結乾燥して、ＴＦ−ＴＴ−Ｂコンジュゲートを白色の固体として得た（５．３ｍｇ、６０％）。

【0209】

実施例１０：Ｔｎ−ＴＴおよびＴＦ−ＴＴコンジュゲートの特徴付け
破傷風トキソイド（ＴＴ）単独およびワクチンコンジュゲート（Ｔｎ−ＴＴ−Ａ；Ｔｎ−ＴＴ−Ｂ；ＴＦ−ＴＴ−Ａ；およびＴＦ−ＴＴ−Ｂ）を、ＳＤＳゲル電気泳動によって、糖含量の存在に関して比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）によって、チオール含量に関してエルマン試験によって、動的光散乱（ＤＬＳ）（図１２）によって分析し、さらに、公知のマウスモノクローナル抗体ＪＡＡ−Ｆ１１との反応性を、二重の放射免疫拡散を使用して分析した。ＳＤＳゲル電気泳動の結果から、炭水化物抗原（ＴｎおよびＴＦ）の存在に関して、コンジュゲートのモノマー形態も陽性染色されたことが明らかに示された。比色分析（Ｄｕｂｏｉｓ試験）から、コンジュゲーションの後、炭水化物抗原の存在（１０重量％）、および担体タンパク質上に残留した遊離チオール基がないことが確認された。二重の放射免疫拡散分析から、沈殿のバンドは明らかに、新しいＴＦ−ＴＴコンジュゲートの、抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡ−Ｆ１１との交差反応性を示すことが解明され、したがって、ＴＦ−ＴＴコンジュゲート上における免疫原性炭水化物抗原（ＴＦ）の存在が確認され、担体タンパク質（破傷風トキソイド）単独の沈殿バンドは観察されなかった。

【0210】

■コンジュゲートのＨＰＬＣ分析
グリココンジュゲート調製物のＨＰＬＣ分析を、サイズ排除クロマトグラフィーによって行った。クロマトグラフ分離は、ＳＢ−８０７Ｇガードカラム（昭和電工株式会社（Showa Denko））を先頭に有する、直列に接続した３つの８×３００ｍｍのＳｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋゲルろ過カラム（２つのＳＢ−８０４および１つのＳＢ−８０３）を用いて実行された。グリココンジュゲート免疫原を、示差屈折計（ＲＩ）検出器モデル２３００および波長２８０ｎｍでのＵＶ検出器モデル２６００を備えたナウアー（Knauer）のスマートライン（Smartline）システムを使用して、０．４ｍＬ／分の流速で、０．１ＭのＮａＮＯ_３で溶出させた。コンジュゲート調製物（移動相中、８ｍｇ／ｍＬ溶液）を、５０μΛ注入ループを使用して注入した。選択された実験において、空隙容量で溶出する画分は、コンジュゲート画分に対応し、これをプールし、スペクトラポア（Spectra/Por）；分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１２，０００〜１４，０００［スペクトラムラボラトリーズ（Spectrum Laboratories）］）で水に対して透析し、凍結乾燥した。これは、２：１の分画されたコンジュゲートに相当する。

【0211】

実施例１１：ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａの遊離チオールにおけるチオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−糖のコンジュゲーションの作用
ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａ（破傷風毒素（８３１−８４４）；ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、３．７×１０^−３Ｍのペプチド濃度で水（５００ｕＬ）に溶解させ、これを、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、（６ｕＬ、０．１Ｍ、３．０当量の）Ｏ−アリル−ＴｎまたはＯ−アリル−ＴＦおよび水溶性触媒ＡＡＰＨ（２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル、２３ｕＬ、０．０２５Ｍ、３．０当量と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、０、４５、９０および１３５分でサンプリングし、遊離チオール濃度をシステイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１３は、遊離チオール濃度が、光チオール−エン反応の結果として、時間依存性の方式で低減されることを示す。

【0212】

実施例１２：Ｏ−アリル−Ｔｎのコンジュゲーションおよびチオール−エン光反応生成物の免疫反応性に対する、ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａにおけるシステインの位置決定／接近しやすさ、および採用される活性化剤のタイプの作用
Ｎ末端またはＣ末端にシステインを有するペプチドｄＴＴ８３１−８４４を合成し、２ｍＭ（１ｍＬ）の濃度で水に溶解させ、これを、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、２つの手持ち式のＵＶ３６５ｎｍランプ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００ｕＬ、０．１Ｍ、１０当量のＯ−アリル−Ｔｎおよび触媒的な量（０．２当量）の活性化剤ＡＡＰＨと共に室温で撹拌した。活性化剤を添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分反応させた。０および６０分の時間に、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。遊離チオールにおける低減倍率は、ｔ＝０／ｔ＝６０におけるチオール濃度に相当する。

【0213】

図１４に示される結果は、チオール−エン光化学反応コンジュゲーションにおける、Ｎ末端（「ＳＨ−ペプチド」）またはＣ末端（「ペプチド−ＳＨ」）にシステインを有するｄＴＴ８３１−８４４ペプチドの、水溶性（ＡＡＰＨ）または水不溶性活性化剤（ＤＭＰＡ）のいずれかを使用した、遊離チオール濃度における低減倍率を提示する。

【0214】

チオール−エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の１μｇのペプチドを、９６−ウェルプレート（マキシソープ（Maxisorp）（商標）、ヌンク（Nunc））に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（Tween）（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡブロッキング溶液を３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（抗Ｔｎ ＶＶＡ）またはピーナッツ凝集素（抗ＴＦ ＰＮＡ）（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＰＮＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ（EY LAbs））の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ultra TMB-ELISA）、サーモ・サイエンティフィック（Thermo Scientific））を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテック（Biotek）ＥＬ８０８）においてプレートをＯＤ４５０ｎｍで読んだ。

【0215】

図１５に示される結果は、水溶性（ＡＡＰＨ）または水不溶性活性化剤（ＤＭＰＡ）のいずれかを使用した、異なるＴｎ−ペプチド（すなわち、コンジュゲートしていない：「ｐｅｐ−Ｃｙｓ」および「Ｃｙｓ−ｐｅｐ」；Ｔｎ−コンジュゲートした：「Ｔｎ−ｐｅｐ」および「ｐｅｐ−Ｔｎ」；「ｕｎｃ」：コーティングされていないプレート）へのレクチン反応性を提示する。興味深いことに、Ｃ末端システインを有するＴＴペプチドは、抗ＴｎレクチンＶＶＡによって特異的に認識され、コンジュゲーション反応は、水溶性活性化剤ＡＡＰＨを用いた場合に最も有効であった。Ｔｎグリココンジュゲートはどれも、陰性対照として使用された抗ＴＦレクチン（ピーナッツレクチン、ＰＮＡ）によって認識されなかった。

【0216】

実施例１３：Ｏ−アリル−ＴｎへのペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａのチオール−エン光化学反応によるコンジュゲーションに対する波長の作用
ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａ（ＭＷ：１８１３、配列番号２）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは３５５ｎｍのいずれか（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１ｍＬの水中の０．５５ｍＭのＯ−アリル−ＴｎおよびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）またはＤＭＰＡ（０．３ｍｇ、１．１ｎｍｏｌ、２．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにし、６０分後にオフにして反応を止めた。またペプチドを、活性化剤の非存在下で、ＵＶ２５４ｎｍでも、Ｏ−アリル−Ｔｎにコンジュゲートした。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。図１６は、３つの異なるコンジュゲーション条件（「３５５ｎｍ＋ＡＡＰＨ」；「３６５ｎｍ＋ＤＭＰＡ」；および「２５４ｎｍ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。

【0217】

チオール−エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイ（ＥＬＬＡ）によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の指定された量のペプチドを、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、ウェルをブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0218】

ＥＬＬＡの結果は、図１７に提示され、ＡＡＰＨまたはＤＭＰＡＰの存在下における３６５ｎｍでの、または活性化剤の非存在下における２５４ｎｍでの、チオール−エン光化学反応によってコンジュゲートした様々な量のＴｎ−ペプチドへのＶＶＡレクチン反応性を示す。コンジュゲーション生成物は、レクチンによって検出されたが、コンジュゲートしていないペプチド（「ペプチド」）またはＯ−アリル−Ｔｎ単独（「Ｔｎ」）は非反応性であった。興味深いことに、図１７は、活性化剤の非存在下における２５４ｎｍでのコンジュゲーションが、活性化剤の存在下における３６５ｎｍまたは３５５ｎｍによって生成したものより免疫反応性のグリココンジュゲート生成物を生成したことを示す。

【0219】

実施例１４：チオール−エン光化学反応によるＣ−アリルおよびＯ−アリル糖のペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａへのコンジュゲーションおよび反応性
ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａペプチド（ＭＷ：１８１３）を、０．５５ｍＭの濃度で水に溶解させ、その１ｍＬを、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ−アリル−Ｔｎ、Ｏ−アリル−ＴＦ、またはＣ−アリル−Ｔｎ（１００ｕＬ、１１ｍＭ、２．０当量）およびＡＡＰＨ（１．４４ｍｇ、５．５ｎｍｏｌ、１０．０当量）と共に室温で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにした。この溶液を、指定された時間でサンプリングし、遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用して測定した。図１８は、試験された異なるアリル糖：Ｏ−アリル−Ｔｎ（「Ｔｎ」）、Ｏ−アリル−ＴＦ（「ＴＦ」）、またはＣ−アリル−Ｔｎ（「ｃＴｎ」）の経時的な（分）遊離チオールの減少を示す。

【0220】

チオール−エン光反応生成物の免疫反応性を酵素結合レクチンアッセイおよび酵素結合免疫吸着測定法によって測定した。１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の指定された量のペプチドコンジュゲートを、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）に、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＰＮＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍｌのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ（Jackson Immunoresearch））と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0221】

図１９は、Ｏ−アリル−Ｔｎ（ただしＣ−アリル−Ｔｎではなく）を用いて生成したペプチドコンジュゲートのみが抗ＴｎレクチンＶＶＡによって認識されたことを示す。これらの結果は、Ｃ−アリル−Ｔｎは、ペプチドにコンジュゲートしていながらも、レクチンへの結合を可能にするコンフォメーションを有さないことを示唆する。

【0222】

実施例１５：チオール−エン光化学反応による化学的に還元されたｄＴＴへのＯ−アリル−ＴＦのコンジュゲーション
弱毒化破傷風トキソイド（ｄＴＴ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ２，０００）、次いで、１０００当量のＤＴＴと共にインキュベートした。室温および回転下で２時間のインキュベーションの後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン（Amicon））によって洗浄した。次いで還元タンパク質（１ｍＬ、３．５１ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｎｍｏｌ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、１．０ｍＬのＰＢＳの最終容量で、Ｏ−アリル−ＴＦ（３０．０当量）およびＡＡＰＨ（２．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで２時間後に止めた。

【0223】

天然のｄＴＴと比較した、ＤＴＴ処理によって生成した還元ｄＴＴの遊離チオール濃度を、緩衝液交換ｄＴＴサンプルで、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定し、タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0224】

ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μＬの０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0225】

図２０は、ＪＡＡＦ１１（「ｄＴＴ（ＤＴＴ）−ＴＦ」）に対するｄＴＴ−ＴＦの免疫反応性を示すが、還元ｄＴＴ（「ｄＴＴ（ＤＴＴ）」）または天然のｄＴＴ（データは示されない）は非反応性であった。これは、Ｏ−アリル−ＴＦが、実際に、免疫反応性のコンフォメーションでチオール−エン光反応によってｄＴＴにコンジュゲートしたことを示す。

【0226】

実施例１６：チオール−エン光化学反応による化学的に還元されたｄＴＴへのＯ−アリル−Ｔｎのコンジュゲーション
ｄＴＴを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で透析し（ＭＷＣＯ３０，０００）、次いで０．５ｍＬ（５．８ｍｇ／ｍＬ）を、５０または５００当量のＤＴＴと共に、室温、回転下でインキュベートした。２時間後、還元タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで５００当量のＤＴＴ（７０ｕＬ、０．５ｍｍｏｌ／ｍＬ）で還元されたタンパク質を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、０．１ＭのＯ−アリル−ＴＦ（６０．０当量）および０．１ＭのＡＡＰＨ（４．０当量）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして反応を開始させ、次いで４５分後に止めた。還元ｄＴＴの遊離チオールが、コンジュゲーションの結果として還元耐性チオエーテル結合を形成したか、またはジスルフィド結合に再酸化したことを検証するために、コンジュゲートした生成物を、１００当量のＤＴＴで１時間処理し、次いで遠心ろ過によって洗浄し、次いで還元処理の前および後にチオール含量を測定した。遊離チオールの適用量を、システイン標準曲線を使用したエルマン試験によって測定した。タンパク質濃度を、ＢＳＡ標準曲線を使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0227】

図２１は、異なるコンジュゲーション条件後のｄＴＴにおける遊離チオールのモル比を示す。結果から、ｄＴＴタンパク質が用量依存性の方式で還元され、５００当量のＤＴＴでの処理で、９個の遊離チオールに達した（ｄＴＴにおける１０個のシステインの最大限の理論上の数から）ことが示される。チオール−エン光反応によるＯ−アリル−ＴｎまたはＯ−アリル−ＴＦのコンジュゲーションは、非還元ｄＴＴのレベルに、またはそれ未満に遊離チオールを低減した。還元に対するｄＴＴ−Ｔｎコンジュゲートの耐性は、チオール−エン光反応によって形成された還元耐性チオエーテル結合の存在を確認した。

【0228】

ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＰＮＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含むウェルを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共にさらに６０分インキュベートした。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0229】

図２２は、コンジュゲートしていないｄＴＴと比較した、ｄＴＴ−ＴｎコンジュゲートのレクチンＶＶＡへの高い反応性を示す。

【0230】

天然のｄＴＴおよびｄＴＴ−Ｔｎコンジュゲートを、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、次いでクーマシーブルーで染色した。ゲル電気泳動の結果は、ｄＴＴ−Ｔｎコンジュゲートが、天然の非コンジュゲートｄＴＴより高い分子量に移動したことを示した（データは示されない）。

【0231】

実施例１７：チオール−エン光反応性によるＯ−アリル−Ｔｎの化学的にチオール化したｄＴＴへのコンジュゲーションに対するＡＡＰＨ濃度の作用
ｄＴＴを、ｐＨ８のＰＢＳ（ＭＷＣＯ３０，０００）中で透析し、次いで１００μＬ（０．８ｍｇ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、水中の０．１Ｍの２−イミノチオラン塩酸塩の２００当量／タンパク質（シグマ（Sigma））、水中の２００当量／タンパク質の０．１ＭのＯ−アリル−ＴＦ、および水中の０．８当量／タンパク質またはおよそ４５０当量／タンパク質のＡＡＰＨの溶液と共に、１２４μＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。光化学反応中、１５分に、および４５分での反応の完了時に、サンプルを回収した。セファデックス（Sephadex）（商標）Ｇ２５が充填されたミニスピンカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、コンジュゲーション生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0232】

図２３は、２−イミノチオランでの化学的チオール化およびＯ−アリル−Ｔｎの非存在下におけるチオール−エン光化学反応の後のｄＴＴサンプル中の遊離チオールの比率が、２５〜３０に達するが、Ｏ−アリル−Ｔｎの存在は、ｄＴＴのチオール比率を、ＡＡＰＨ濃度に対する用量依存性の方式でおよそ２０および５に低減させることを示し、これは、チオエーテル結合がチオール−エン光反応によって形成されたことを示唆している。

【0233】

ｄＴＴサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0234】

図２４は、レクチンＶＶＡ−ｈｒｐに対するｄＴＴサンプルの反応性を示す。天然のコンジュゲートしていないｄＴＴと比較してＴｎコンジュゲートは、より高い反応性を有することが観察された。さらに、反応性は、光反応の持続時間および使用されるＡＡＰＨ活性化剤の量と相関する。

【0235】

ｄＴＴコンジュゲート（５μｇ）を、１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、クーマシーブルーでの染色、またはウェスタンブロット分析のための膜（イモビロン−Ｐ、メルク・ミリポア（Merck Millipore））への移行のいずれかを行った。膜をＰＢＳ−Ｔ＋１％ＢＳＡ中で１時間ブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、ＰＢＳ−Ｔ中のホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１／１００希釈物と共に室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。次いで膜をＰＢＳ−Ｔで徹底して洗浄し、結合したＶＶＡ−ｈｒｐを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ発色性基質である４−クロロ１−ナフトール（Naphtol）（０．０３％過酸化水素を含有するＰＢＳ中、０．３ｍｇ／ｍＬ、シグマ）を用いて検出した。クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥと対応するＶＶＡ−ｈｒｐで染色したウェスタンブロットの両方からの結果から、ｄＴＴ−Ｔｎが、天然のｄＴＴより高い分子量に移動したこと、およびＶＶＡへの特異的な反応性を有することが解明され、これは、生成物が実際にＴｎにコンジュゲートしていることを示す（データは示されない）。

【0236】

実施例１８：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−ＴｎおよびＯ−アリル−ＴＦの化学的に還元されたＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（１ｍＬＰＢＳ、ｐＨ７．４中の７ｍｇ）を、６００当量のＤＴＴと共に２時間インキュベートし、次いでｐＨ７．４のＰＢＳ中で、遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄した。次いで還元タンパク質を、チオール−エン光化学反応によってＯ−アリル−ＴｎまたはＯ−アリル−ＴＦにコンジュゲートした。還元ＢＳＡ（６００ｕＬ、５．３ｍｇ／ｍＬ、０．０４７ｎｍｏｌ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、Ｏ−アリル−糖（６０当量）およびＡＡＰＨ（４．０当量）およびｐＨ７．４のＰＢＳ（７２０ｕＬ）と共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。４５分後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、全ての未反応のＯ−アリルおよび試薬を除去した。還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0237】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチンもしくはピーナッツ凝集素（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＰＮＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0238】

図２５は、これらの条件下で生成したＢＳＡ−ＴＦおよびＢＳＡ−Ｔｎが、抗ＴＦＪ ＡＡＦ１１モノクローナル抗体および抗ＴｎレクチンＶＶＡそれぞれに対して高度に反応性を有し、特異的であったことを示す。

【0239】

ＢＳＡ−ＴｎおよびＢＳＡ−ＴＦコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。使用された条件下でのＢＳＡの還元は、エルマン試験によって測定したところ、１９．２９のチオールのモル比を生じた。いずれかのＯ−アリル−糖とのコンジュゲーションの後、エルマン試験は陰性であったことから、チオール−エン光化学反応によって遊離チオールがＯ−アリル糖に化学的にカップリングされたことが示唆される（データは示されない）。クーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから、両方のＢＳＡ−コンジュゲートが、期待されるＢＳＡの分子量に移動するか、それより高い分子量種に移動したことが示された（データは示されない）。

【0240】

実施例１９：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−Ｔｎの化学的に還元されたＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（５００μＬ、７ｍｇ／ｍＬ）を、４００、２００または１０００当量のＤＴＴ（０．５Ｍ）と共に、室温で１時間、回転させながらインキュベートした。次いで還元ＢＳＡ溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で一晩透析した。次いで還元ＢＳＡの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定し、それらから遊離チオール／ＢＳＡのモル比を計算した。

【0241】

図２６は、生成した遊離チオールの量と還元剤であるＤＴＴの量との相関を示し、それによれば、還元が、採用された条件下で１０００当量のＤＴＴを用いて実行された場合、約１０のチオール／ＢＳＡに到達する。

【0242】

次いで還元タンパク質を、様々な比率のＯ−アリル−Ｔｎにコンジュゲートした。還元ＢＳＡ（５ｎｍｏｌ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、ＡＡＰＨと共に、ｐＨ７．４のＰＢＳ５００μＬの最終容量で、１００当量のＯ−アリル−Ｔｎ／還元ＢＳＡまたは１００当量のＯ−アリル−Ｔｎ／ＢＳＡ−チオールと共に撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。４５分後、生成物を、ｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、未反応のＯ−アリルおよび試薬を除去した。

【0243】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００ｕｌのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0244】

図２７は、レクチンＶＶＡおよび抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１（＋ヤギ抗マウスＩｇＧ−ｈｒｐコンジュゲート）に対する様々なＢＳＡ−Ｔｎコンジュゲートの反応性を示す。Ｏ−アリルの最大比率でコンジュゲートしたＢＳＡ−コンジュゲートのうち２つが、チオール−エン光化学反応の結果として、特異的にＶＶＡへの高度な反応性を有することを見出した。

【0245】

ＢＳＡ−Ｔｎコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析するか、または糖タンパク質に関して製造元（ピアース（Pierce））の説明書に従って分析した。結果から、高い分子量に移動したＢＳＡコンジュゲートはグリカンに関して陽性染色されたが、天然のコンジュゲートしていないＢＳＡはそうではなかったことが示された（データは示されない）。

【0246】

実施例１９：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−ＴＦの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（１ｍＬ、０．０８８μｍｏｌ、５．８９ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．０のＰＢＳ）を、５、１０、または２０当量の２−イミノチオラン（５、１０、２０μＬ、０．１ｍｍｏｌ／ｍＬ）と共に１時間インキュベートした。次いでチオール化ＢＳＡを遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して未反応の試薬を除去し、その後、チオール−エン光コンジュゲーションによってＯ−アリル−ＴＦにコンジュゲートした。チオール化ＢＳＡ（４４０；４８０；５７５μＬ、６．８；６．４；５．２ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、３当量／チオールのＯ−アリル−ＴｎおよびＡＡＰＨ（０．２当量／チオール）およびｐＨ７．４のＰＢＳと共に、１ｍＬの最終容量で撹拌した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。１時間後、生成物をｐＨ７．４のＰＢＳで遠心ろ過（ＭＷＣＯ１０，０００、アミコン）によって洗浄して、未反応のＯ−アリルおよび他の試薬を除去した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0247】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、レクチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたピーナッツ凝集素（ＰＮＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物、または０．１μｇ／ｍＬのＴＦ特異的な精製マウスモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、ＪＡＡＦ１１を含有するウェルを、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）と共にさらに６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0248】

図２８において、二軸グラフは、ＴＦコンジュゲーション前に測定されたそれぞれのコンジュゲートのチオールの比率に対する、抗ＴＦレクチンＰＮＡまたはｍＡｂ ＪＡＡＦ１１へのＢＳＡ−ＴＦコンジュゲートの反応性を示す。これらの結果は、最もチオール化されたＢＳＡでＪＡＡＦ１１反応性が検出されることを示す。

【0249】

実施例２０：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−Ｔｎの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２−イミノチオラン（シグマ）と共に、２００当量の０．１ＭのＯ−アリル−Ｔｎおよびおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。ＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0250】

図２９は、ＢＳＡを、２−イミノチオランと、単独で、または３６５ｎｍの光の存在下で反応させたときの遊離チオール官能基の時間依存性の増加を示すが、光化学反応におけるＯ−アリル−Ｔｎの存在または非存在下でのＡＡＰＨの添加は、検出可能な遊離チオールの形成を防ぐ。

【0251】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0252】

図３０において、レクチンＶＶＡに対するＢＳＡコンジュゲートの反応性は、ＥＬＬＡにおいて、Ｏ−アリル−Ｔｎの存在下におけるチオール−エン光化学反応によって生成したＢＳＡのみがＶＶＡによって検出されるが、Ｏ−アリル−Ｔｎの非存在下で生成した生成物は、陰性であることを示す。これらの結果は、ＡＡＰＨおよびＵＶ３６５ｎｍ光が、Ｏ−アリル−糖の非存在下で遊離ジスルフィドのジスルフィドへの再酸化を触媒し、これは、Ｏ−アリル−Ｔｎの存在下におけるチオエーテル結合の形成と競合することを示唆する。

【0253】

実施例２１：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−Ｔｎの化学的にチオール化ＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（２５０μＬ、４．３ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２−イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ−アリル−Ｔｎ、および０．８当量のＡＡＰＨまたはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。コンジュゲーションに対する抗酸化剤ビタミンＣ（およそ５ｍＭ）の作用を、大量のＡＡＰＨを含有する条件で試験した。キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に、キュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。サンプルを反応中の指定された時間に取った。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。コンジュゲートしたＢＳＡサンプルの遊離チオール濃度を、システイン標準曲線を使用したエルマンアッセイによって測定し、タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0254】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0255】

図３１は、２つのＹ軸を有し、Ｏ−アリル−ＴｎのＢＳＡへのチオール−エン光コンジュゲーションの結果としての、時間の関数としてのレクチンＶＶＡに対するコンジュゲーション生成物の反応性の増加、および対応する遊離チオールの減少を示す。これらの結果は、反応が、より高い濃度のＡＡＰＨでより有効であったことを示唆する。ビタミンＣの存在下で生成した生成物は、ＶＶＡレクチンに対して反応性を有していなかった（示されていない）。

【0256】

ＢＳＡ−Ｔｎコンジュゲート（５μｇ）を、クーマシーブルーで染色した１０％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。結果から、より少ないＡＡＰＨでの反応と比べて、より多くのＡＡＰＨでの反応で高分子量種の量が多いことが示された。ビタミンＣは、高分子量種の形成を防いだ（データは示されない）。

【0257】

実施例２２：タンパク質のチオール化の機能におけるチオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−ＴｎのＢＳＡへのコンジュゲーション
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２−イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ−アリル−Ｔｎおよび０．０８当量、０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨのいずれか、ならびにｐＨ８のＰＢＳと共に、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。一部のサンプルでは、２−イミノチオランおよび／またはＡＡＰＨを省き、ｐＨ８のＰＢＳで置き換えた。キュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍまたは２５４ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間にキュベットを設置した。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。

【0258】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングされたナヨクサフジレクチン（ＶＶＡ−ｈｒｐ、ＥＹラボ）の１００μＬの１／１００希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0259】

図３２は、コンジュゲーションが、タンパク質のチオール化の非存在下で実行される場合、またはチオール化したタンパク質が、活性化剤であるＡＡＰＨの非存在下でコンジュゲートされる場合の、ＶＶＡに対する生成物の最小の反応性を示す。しかしながら、ＶＶＡ反応性生成物は、タンパク質チオール化およびＡＡＰＨの非存在下で、ＵＶ２５４ｎｍによって生成される。

【0260】

実施例２３：高いコンジュゲーション比率におけるＢＳＡ−ＴＦ反応性の非存在
ＢＳＡ（９３μＬ、１１．７ｍｇ／ｍＬ）を、室温のベンチ上で、またはキュベットから２〜５ｃｍの距離で、３６５ｎｍ（０．１６ａｍｐ、ＶＷＲ）の２つの手持ち式の紫外線ランプの間に設置した石英キュベット（１０×１０ｍｍのパス長、フィッシャー）中で、２００当量の０．１Ｍの２−イミノチオラン（シグマ）、２００当量の０．１ＭのＯ−アリル−ＴＦおよび０．８当量またはおよそ４５０当量のＡＡＰＨおよびｐＨ８のＰＢＳの存在または非存在下で、３１６μＬの最終容量でインキュベートした。ＡＡＰＨを添加した直後に、ＵＶをオンにして、反応を開始させた。反応を４５分後に止め、その後、セファデックス（商標）Ｇ２５ミニスピンカラムを使用したゲルろ過クロマトグラフィーによって生成物の緩衝液をｐＨ７．４のＰＢＳに交換した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用したブラッドフォードアッセイによって測定した。ＴＦエピトープのコンジュゲートしたガラクトースを、ガラクトース標準を使用したＤｕｂｏｉｓの方法によって測定した。

【0261】

ＢＳＡサンプルの免疫反応性を測定するために、１μｇのタンパク質サンプルを、１００μＬのｐＨ７．４のＰＢＳで希釈し、９６−ウェルプレート（マキシソープ、ヌンク）のウェルに、最低限でも室温で１時間または４℃で一晩吸着させた。次いでウェルをＰＢＳ−トゥイーン（商標）０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）で２回洗浄し、次いでブロッキング溶液で３０分にわたり充填した。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、抗ＴＦモノクローナル抗体ＪＡＡＦ１１の１００μＬの０．１μｇ／ｍＬ希釈物で充填した。穏やかに振盪しながらの室温で１時間または４℃で１２時間のインキュベーションの後、次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、さらに、二次抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ｈｒｐ（ジャクソン・イムノリサーチ）の１００μＬの１／１０００希釈物と共に６０分インキュベートした。次いでウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのｈｒｐ基質（ウルトラＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、サーモ・サイエンティフィック）を各ウェルに添加した。反応を、１００μＬの０．５Ｎ硫酸の添加によって止め、プレートリーダー（バイオテックＥＬ８０８）においてプレートを４５０ｎｍで読んだ。

【0262】

図３３は、２つのＹ軸を有し、より低いガラクトースコンジュゲートと比較して、ＢＳＡ−ＴＦのより低い免疫反応性と、高いガラクトース比率を示す。２つのコンジュゲートにおいてガラクトースが検出されたことによって、ＴＦが、ＢＳＡにコンジュゲートされているが、コンジュゲートしたＴＦの免疫反応性は、高い比率で損なわれることを確認する。

【0263】

実施例２４：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−ＴｎのペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−（Ｔｎ）−βＡｌａ ＢＳＡへのコンジュゲーション
図３４は、ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａおよびＣおよびＮ末端にシステイン残基を有するＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａの化学構造を、それぞれそれらの表形式のＬＣ−ＭＳデータと共に示す。

【0264】

図３５は、ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａ（Ｃ末端）の詳細なＬＣ−ＭＳデータを示す。

【0265】

図３６は、ペプチドＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａ（Ｎ末端）の詳細なＬＣ−ＭＳデータを示す。

【0266】

■手順Ａ
ＵＶキュベット中で、水（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ_２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＯ−アリル−Ｔｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ−ＭＳから、望ましいＴｎ−コンジュゲートペプチドの存在が示された；LC-MS：[M] C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0780；CAN/H₂O 5〜95% 5.08分。

【0267】

■手順Ｂ（有機溶媒中）
ｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−（Ｔｎ）−βＡｌａ（図３４）。ＵＶキュベット中で、ＭｅＯＨ（１ｍＬ、２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ_２Ｏ（２００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡＰを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ−ＭＳから、望ましいペプチド−ＴＮの存在が確認された。LC-MS：[M] C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0675；CAN/H₂O 5〜95% 5.07分。

【0268】

図３７は、Ｃ末端ペプチドｄＴＴ８３１−８４４−Ｃｙｓ−βＡｌａにおけるＯ−アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール−エン反応を示す。

【0269】

図３８は、Ｃ末端ペプチドにおけるＯ−アリルＴｎのＬＣ−ＭＳプロファイルを示す。

【0270】

実施例２５：チオール−エン光化学反応によるＯ−アリル−ＴｎのペプチドＣｙｓ−（Ｔｎ）−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａへのコンジュゲーション
■手順Ａ
ＵＶキュベット中で、水（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドＣｙｓ−（Ｔｎ）−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａ（図３３）の溶液に、Ｈ_２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＡＡＰＨを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ−ＭＳから、望ましいペプチド−Ｔｎコンジュゲートの存在が示された。LC-MS：[M] C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0719；CAN/H₂O 5〜95% 5.11分。

【0271】

■手順Ｂ
Ｃｙｓ−（Ｔｎ）−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａ（図３３）。ＵＶキュベット中で、メタノール（２ｍＬ、０．４８２ｍＭ）中のペプチドの溶液に、Ｈ_２Ｏ（１００μＬ、０．１Ｍ、１０当量）中のＴｎの溶液および触媒的な量のＤＭＰＡを添加した。混合物を、３６５ｎｍの放射線照射下で、室温で６０分撹拌した。エルマン試験から、４５分で反応が完成したことが示された。次いで溶液を凍結乾燥して、白色の粉末を得て、ＬＣ−ＭＳから、望ましいペプチド−Ｔｎの存在が示された。LC-MS：[M] C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀Sの計算値、2089.0653；実測値、2089.0817；CAN/H₂O 5〜95% 5.10分。

【0272】

図３９は、Ｎ末端ペプチドＣｙｓ−ｄＴＴ８３１−８４４−βＡｌａにおけるＯ−アリルＴｎの光分解性のＡＡＰＨによって触媒されたチオール−エン反応を示す。

【0273】

図４０は、Ｎ末端ペプチドにおけるＯ−アリルＴｎの詳細なＬＣ−ＭＳプロファイルを示す。

【0274】

参考文献
Cipolla et al., “Stereoselective synthesis of α- C-glycosides of N-acetylgalactosamine”, Tetrahedron Asymm. (2000), 11 ：295-303.
Cui et al., “Stereocontrolled allylation of 2-amino-2-deoxy sugar derivatives by a free-radical procedure”, Carbohydr. Res., (1998), 309：319-330.
Danishefsky et al., “Development of Globo-H Cancer Vaccine”, Acc. Chem Res., (2015), 48(3)：643-652.
Demian et al., “Direct targeted glycation of the free sulfhydryl group of cysteine residue (Cys-34) of BSA. Mapping of the glycation sites of the anti-tumor Thomsen-Friedenreich neoglycoconjugate vaccine prepared by Michael addition reaction,” J. Mass Spectrom., (2014), 49：1223-1233.
Dondoni et al., “A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation：Photoinduced thiol-ene coupling”, Chem. Eur. J., (2009), 15：11444-11449.
Dondoni et al., “Recent applications in thiol-ene coupling as a click process for glycoconjugation”, Chem. Soc. Rev., (2012), 41：573-586.
Feng et al., “Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated 2-N-acetamidosugar nucleotides using UDP-GlcNAc pyrophosphorylase”, Org. Biomol. Chem. (2004), 2：1617-1623.
Heimburg et al., “Inhibition of spontaneous breast cancer metastasis by anti-Thomsen-Friedenreich antigen monoclonal antibody JAA-F11.”, Neoplasia, (2006) 8(11)：939-48.
Knapp et al., “Synthesis of α-GalNAc Thioconjugates from an α-GalNAc Mercaptan”, J. Org. Chem. (2002), 67：2995-2999.
Papadopoulos, “Diazo transfer and click chemistry in the solid phase syntheses of lysine-based glycodendrimers as antagonists against Escherichia coli FimH.” Molecular Pharmaceutics (2012), 9(3)：394-403.
Rittenhouse-Diakun et al., “Development and characterization of monoclonal antibody to T-antigen：(gal beta1-3GalNAc-alpha-O)”, Hybridoma, (1998), 17：165-173.
Tati et al., “Humanization of JAA-F11, a Highly Specific Anti-Thomsen-Friedenreich Pancarcinoma Antibody and InVitro Efficacy Analysis.”, Neoplasia, (2017), 19(9)：716-733.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

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【国際調査報告】