特表 2021-519110 細胞培養のマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための装置及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-519110(P2021-519110A)

(43)【公表日】2021年8月10日

(54)【発明の名称】細胞培養のマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための装置及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20210712BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210712BHJP

   C12M 1/12 20060101ALI20210712BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20210712BHJP

   G01N 33/483 20060101ALI20210712BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20210712BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   C12M1/34 B

   C12M1/12

   C12M1/34 D

   G01N33/48 M

   G01N33/483 Z

   C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2021-501085(P2021-501085)

(86)(22)【出願日】2019年3月26日

(85)【翻訳文提出日】2020年11月24日

(86)【国際出願番号】EP2019057479

(87)【国際公開番号】WO2019185565

(87)【国際公開日】20191003

(31)【優先権主張番号】18163900.6

(32)【優先日】2018年3月26日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520375321

【氏名又は名称】ドク メディクス ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100079049

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100084995

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 和詳

(72)【発明者】

【氏名】ピヒラー、ヴェレナ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B029

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045BB20

2G045CB01

2G045FA40

2G045FB04

2G045FB08

4B029AA07

4B029BB01

4B029CC02

4B029CC10

4B029CC11

4B029FA01

4B029FA09

4B029FA11

4B029GA08

4B029GB04

4B029GB05

4B029GB06

4B029GB09

4B029HA05

4B029HA06

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ02

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QR82

4B063QR85

4B063QR90

4B063QS12

4B063QS17

4B063QS31

4B063QS32

4B063QS39

4B063QX01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA51

4H045EA50

(57)【要約】

本発明は、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための生体適合性カラム１を提供し、カラムは、入口２、軸方向に配向した灌流チャンバ３、及び出口４を含み、灌流チャンバ３は（絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、又はメチルセルロースなどの）生体高分子を含むスポンジ７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄを含む多孔質固相、水性液相５、第１の細胞培養物６ａ、及び第２の細胞培養物６ｂを含み、第１の細胞培養物６ａ及び第２の細胞培養物６ｂは固相と接触しており、第１の細胞培養物６ａは、第２の細胞培養物６ｂとは固相により隔てられている。また、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための方法及びキットも提供される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体適合性カラム（１）における少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロ陽電子放出断層撮影（マイクロＰＥＴ）又はマイクロ単一光子放出コンピュータ断層撮影（マイクロＳＰＥＣＴ）のための方法であって、
前記カラムは、入口（２）、軸方向に配向した灌流チャンバ（３）、及び出口（４）を含み、ここで、前記入口（２）は前記灌流チャンバ（３）と流体接続しており、前記出口（４）は前記灌流チャンバ（３）と流体接続しており、前記灌流チャンバ（３）は、多孔質固相、水性液相（５）、第１の細胞培養物（６ａ）、及び第２の細胞培養物（６ｂ）を含み、前記第１の細胞培養物（６ａ）の少なくとも一部及び前記第２の細胞培養物（６ｂ）の少なくとも一部は前記固相と接触しており、前記第１の細胞培養物（６ａ）は、前記第２の細胞培養物（６ｂ）とは前記固相の少なくとも一部により隔てられており、
前記方法は以下の工程：
（Ａ）前記カラム（１）をマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーに挿入すること、
（Ｂ）前記第１の細胞培養物（６ａ）の細胞の少なくとも一部及び前記第２の細胞培養物（６ｂ）の細胞の少なくとも一部が放射性トレーサーと接触するように、前記入口（２）を通り前記灌流チャンバ（３）を通り抜け前記出口（４）に向かって前記放射性トレーサーを含む水性標識液体を流通させること、
（Ｃ）前記放射性トレーサーの少なくとも一部が前記灌流チャンバ（３）から前記出口（４）を通って除去されるように、前記入口（２）を通り前記灌流チャンバ（３）を通り抜け前記出口（４）に向かって水性洗浄液体を流通させること、及び
（Ｄ）前記カラム（１）を前記マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーでスキャンすること、
を含む。

【請求項2】

前記第１の細胞培養物（６ａ）及び／又は前記第２の細胞培養物（６ｂ）がスフェロイド又はオルガノイドである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１の細胞培養物（６ａ）及び／又は前記第２の細胞培養物（６ｂ）が多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＴＳ）である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）の流通させることが、前記灌流チャンバ（３）を通る乱流液体流を含み、該乱流液体流は、好ましくは０．０１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分の流速（好ましくは０．０２５ｍＬ／分〜７．５ｍＬ／分の流速、より好ましくは０．０５ｍＬ／分〜５ｍＬ／分の流速、特に０．１ｍＬ／分〜２ｍＬ／分の流速）である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記多孔質固相が、少なくとも１つの生体高分子を含む少なくとも１つのスポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）を含み、
ここで、好ましくは、前記生体高分子が、絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択され、及び／又は前記灌流チャンバ（３）に収まるように前記スポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）があらかじめ切断されている、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記多孔質固相が５０μｍ〜１０００μｍ（好ましくは７５μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは１００μｍ〜６００μｍ、さらにより好ましくは１２５μｍ〜５００μｍ、さらに一層より好ましくは１５０μｍ〜４５０μｍ、特に２００μｍ〜４００μｍ）の平均孔径を有する、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１の細胞培養物（６ａ）と前記第２の細胞培養物（６ｂ）との間の最小距離が６００μｍ以上（好ましくは７００μｍ以上、より好ましくは８００μｍ以上、さらにより好ましくは９００μｍ以上、さらに一層より好ましくは１０００μｍ以上、特に２０００μｍ以上、又はさらに５０００μｍ以上）である、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記多孔質固相が前記スポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）のうち少なくとも第１と第２のものを含み、前記第１の培養物（６ａ）の少なくとも一部が前記第１のスポンジ（７ａ）と接触しており、前記第２の培養物（６ｂ）の少なくとも一部が前記第２のスポンジ（７ｂ）と接触している、請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記第１のスポンジ（７ａ）が、前記第１の細胞培養物（６ａ）の少なくとも一部を含む凹部（８ａ）を有し、前記第２のスポンジ（７ｂ）が、前記第２の細胞培養物（６ｂ）の少なくとも一部を含む凹部（８ｂ）を有する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための生体適合性カラム（１）であって、
前記カラムは、入口（２）、軸方向に配向した灌流チャンバ（３）、及び出口（４）を含み、ここで、前記入口（２）は前記灌流チャンバ（３）と流体接続されており、前記出口（４）は前記灌流チャンバ（３）と流体接続されており、前記灌流チャンバ（３）は、少なくとも１つの生体高分子を含む少なくとも１つのスポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）を含む多孔質固相、水性液相（５）、第１の細胞培養物（６ａ）、及び第２の細胞培養物（６ｂ）を含み、前記第１の細胞培養物（６ａ）の少なくとも一部及び前記第２の細胞培養物（６ｂ）の少なくとも一部は前記固相と接触しており、前記第１の細胞培養物（６ａ）は、前記第２の細胞培養物（６ｂ）とは前記固相の少なくとも一部により隔てられている、前記カラム。

【請求項11】

前記生体高分子が絹フィブロインである、請求項１０に記載のカラム（１）。

【請求項12】

前記入口（２）及び／又は前記出口（４）を介してポンプに流体接続された請求項１０〜請求項１１のいずれか一項に記載のカラム（１）を含む、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのシステムであって、
好ましくは前記システムが前記カラム（１）のための温度制御及び／又は前記カラム（１）の前記入口（２）に流体接続されたサンプル注入器をさらに有する、前記システム。

【請求項13】

請求項１０〜請求項１１のいずれか一項に記載のカラム（１）が挿入されたマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナー。

【請求項14】

少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのキットであって、
少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための少なくとも１つの生体適合性カラム（１）、ここで、該カラムは、入口（２）、軸方向に配向した灌流チャンバ（３）、及び出口（４）を含み、前記入口（２）が前記灌流チャンバ（３）と流体接続されており、前記出口（４）が前記灌流チャンバ（３）と流体接続されている；並びに
少なくとも１つの生体高分子を含み、前記灌流チャンバ（３）に収まるようにあらかじめ切断されている、少なくとも２つのスポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）、ここで、該スポンジは、好ましくは絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択される；
を含む、前記キット。

【請求項15】

前記灌流チャンバ（３）に収まるようにあらかじめ切断された少なくとも２つのフィルター（５０）をさらに含み、好ましくは前記フィルター（５０）が前記少なくとも２つのスポンジ（７ａ、７ｂ、７ｃ、７ｄ）より高い密度（より好ましくは１．２５倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、特に２倍以上高い密度）を有する、請求項１４に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養のマイクロ陽電子放出断層撮影（マイクロＰＥＴ）又はマイクロ単一光子放出コンピュータ断層撮影（マイクロＳＰＥＣＴ）のための装置及び方法に関する。

【背景技術】

【0002】

陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）又は単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）のための潜在的な診断用化合物の前臨床スクリーニングに向けての現在の戦略は、主に、従前の生物学的知識、生体外でのオートラジオグラフィー及び小動物の生体内ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴに基づいている。

【0003】

しかしながら、生体外でのオートラジオグラフィーと関連がある従前の生物学的知識に基づいた生体内での化合物の吸収、分布、代謝、及び排出の予測は今もなお非常に限定されている。有望なリード化合物は、費用のかかる生体内実験の結果に基づいた、標的への選択性の欠如、高代謝及びクリアランス、又は非特異的相互作用が原因でしばしば中止する必要がある。したがって、例えば、特にＰＥＴ／ＳＰＥＣＴに適用されるより良い細胞培養系を有する治療化合物だけでなく、そのような診断用化合物の生体内挙動の改良予測が必要である。

【0004】

Ｋｅｓｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．は、超偏極磁気共鳴／ＰＥＴ互換性バイオリアクターにおけるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害に対する前立腺がんの代謝反応に関している。減少した体積の細胞培養物におけるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害への反応の翻訳可能なバイオマーカーを開発するための超偏極磁気共鳴及びＰＥＴと互換性のある灌流バイオリアクターが開示されている。前立腺がん細胞の単細胞培養物をアルギン酸ハイドロゲルに埋め込み、バイオリアクター内で培養した（１６０３ページ、左欄、§２）。ＰＥＴ画像化には、小動物用マイクロＰＥＴ／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナー（Ｉｎｖｅｏｎ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いた。５μＣｉ／ｍＬの２−デオキシ−２−［^１８Ｆ］フルオログルコース（［^１８Ｆ］ＦＤＧ）を含む培地をバイオリアクターシステムで４０分間灌流させ、４０分間洗浄した。より高いスループットのため、ＰＥＴ検出器内で４つのバイオリアクターを同時に操作し、アルギン酸を含まない１つを対照として封入した（１６０４ページ、左欄、§２）。しかしながら、この手法は複雑であり計装負荷が高いため、費用がかかる。

【0005】

Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１２は、生物学的及び画像化の応用のための人工組織バイオリアクターに関している。開示されたバイオリアクターは、マイクロＰＥＴスキャナーと一体化されている。開示されたバイオリアクターの細胞チャンバは、１．４〜１．７ｍｍの直径を有するホウケイ酸ガラスビーズを含むガラス容器である（２４２０ページ、右欄、§２）。ＨｅｐＧ２肝細胞株の単独培養物をシリンジに吸引し、バイオリアクターの細胞チャンバに注入した（２４２１ページ、左欄、§５）。細胞を約１６時間ビーズマトリクスになじませ、ブドウ糖負荷試験、及びその次の放射線トレーサーとして［^１１Ｃ］パルミチン酸を用いたマイクロＰＥＴスキャンを受ける前に５日間増殖させた（２４２１ページ、右欄、§１−５）。Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１３は、画像化バイオマーカー及び放射性医薬品の研究、発見、及び検証のための同様のガラスビーズバイオリアクターを開示している。しかしながら、このガラスビーズバイオリアクターのスループットは比較的低い。

【発明の概要】

【0006】

よって、本発明は、細胞培養ＰＥＴのための改良された方法及び装置を提供すること、特により高い測定スループットを達成することを目的とする。

【0007】

本発明は、生体適合性カラムにおける少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための方法を提供する。カラムは入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、入口及び出口はいずれも灌流チャンバと流体接続している。灌流チャンバは、多孔質固相、水性液相に第１の細胞培養物及び第２の細胞培養物を含む。第１の細胞培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）、及び第２の細胞培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）は上記固相と接触しており、第１及び第２の細胞培養物のそれぞれの他の部分は、典型的には上記液相と接触している。第１の細胞培養物は、第２の細胞培養物とは上記固相の少なくとも一部により隔てられている。上記方法は以下の工程を含む：
（Ａ）上記カラムをマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーに挿入すること、
（Ｂ）第１の細胞培養物の細胞の少なくとも一部及び第２の細胞培養物の細胞の少なくとも一部が放射性トレーサーと接触するように（好ましくは、画分、例えば、放射性トレーサーの０．５重量％以上、５重量％以上、又は１０重量％以上が、第１及び／又は第２の細胞培養物と結合したままである；このような結合は、細胞外及び／又は細胞内であってもよい）、上記入口を通り上記灌流チャンバを通り抜け上記出口に向かって上記放射性トレーサーを含む水性標識液体を流通させること、
（Ｃ）放射性トレーサーの少なくとも一部が上記灌流チャンバから上記出口を通って除去されるように、上記入口を通り上記灌流チャンバを通り抜け上記出口に向かって水性洗浄液体を流通させること、及び
（Ｄ）上記カラムを上記マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーでスキャンすること。

【0008】

この方法には、Ｂ−Ｃ−Ａ−Ｄ又はＢ−Ａ−Ｃ−Ｄなどの、工程の異なる順番も包含される。しかしながら、順番Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄが最も好ましい。

【0009】

本発明はまた、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための生体適合性カラムを提供する。上記カラムは、入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、上記入口及び上記出口は両方とも上記灌流チャンバと流体接続されている。上記灌流チャンバは、少なくとも１つの生体高分子を含む（特に、少なくとも１つの生体高分子で作られた）、少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、さらにより好ましくは少なくとも４つの、さらに一層より好ましくは少なくとも５つの、特に少なくとも６つの）スポンジを含む多孔質固相を含む。上記灌流チャンバは、水性液相、第１の細胞培養物、及び第２の細胞培養物をさらに含む。第１の細胞培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）、及び第２の細胞培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）は上記固相と接触しており、第１及び第２の細胞培養物のそれぞれの他の部分は、典型的には上記液相と接触している。第１の細胞培養物は、第２の細胞培養物とは、上記固相の少なくとも一部により隔てられている。

【0010】

本発明の他の態様において、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのシステムが提供される。上記システムは、本発明のカラムを含み、上記カラムは、その入口及び／又はその出口を介してポンプと流体接続されている。上記システムは、上記カラムのための温度制御及び／又は上記カラムの入口に流体接続されたサンプル注入器をさらに有することが好ましい。

【0011】

本発明のさらなる他の態様において、本発明のカラムが挿入されたマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーが提供される。

【0012】

本発明のよりさらなる他の態様において、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのキットが提供される。上記キットは、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための少なくとも１つの生体適合性カラムを含み、上記カラムは、入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、上記入口及び上記出口の両方とも上記灌流チャンバと流体接続されている。上記キットは、少なくとも１つの生体高分子を含む（特に、少なくとも１つの生体高分子で作られた）、少なくとも２つの（好ましくは少なくとも３つの、さらにより好ましくは少なくとも５つの、さらに一層より好ましくは少なくとも１０の、特に少なくとも２０の）スポンジをさらに含み、生体高分子は、絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択されることが好ましい。これらのスポンジは、灌流チャンバに収まるようにあらかじめ切断されている。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、細胞培養物（スフェロイド類及びオルガノイド類などの三次元細胞培養物でさえも）のより高いスループットを有するＰＥＴ（及びＳＰＥＣＴも）を可能にする。本発明は、加速放射性トレーサーの開発に非常に適している。生物基質における細胞又は多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＴＳ）を用いた放射性トレーサーの代謝研究にだけでなく、特に、蓄積、組織透過性、標的特異性の測定に有用である。さらに、本発明は、複雑な組織サンプル内の血流を刺激するための流速の調整を可能にする。本発明はまた、前臨床薬剤開発で必要とされる動物の数を減らす助けとなり、それにより、そのような開発をより効率的にし、生命倫理の問題を減少させる。

【0014】

ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化とは全く無関係であるが、Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、三次元コラーゲンスポンジ内の軟骨細胞に静水圧を付与するための静水圧システムについて述べている。上記システムは、静水圧を付与可能なカラムを含む。軟骨細胞は、カラムに浮かせたコラーゲンスポンジ内で培養される。とりわけ、画像化アーチファクトはスポンジの付着位置のまわりに蓄積する溶液の洗浄が妨げられることによると考えられるため、開示されたシステムはＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化には適しているとは言えない。

【0015】

また、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ画像化とは全く無関係であるが、米国特許出願公開第２０１７／１９８２４６号明細書は、生成物結合培地を含む捕捉カラムに接続された、細胞培養培地を保持するための容器を含む、小さな灌流バイオリアクターを開示している。上記培養培地が容器から流れ出してカラムに流れると、捕捉カラムは発現した生成物を捕捉することを可能とする。培養培地が排出され、よってカラム内に残っていない場合、細胞培養物は単にカラムを通過するだけとなる。

【0016】

マイクロＰＥＴ及びマイクロＳＰＥＣＴ装置はそれぞれ、小型化されたＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ装置であり、げっ歯類及びその他の小動物モデルの画像化研究用途のために開発された（これらの技術の概略は、例えば、Ｃｈａｔｚｉｉｏａｎｎｏｕに示される）。一般的に、マイクロＰＥＴ及びマイクロＳＰＥＣＴの空間分解能は、（ヒト患者の画像化のための）ジェネリックのＰＥＴ及びＳＰＥＣＴ装置の空間分解能よりも高い。また、マイクロＰＥＴ及びマイクロＳＰＥＣＴ画像化の機能性を所望によりＣＴなどの付加的な画像化の機能性と単一の装置内で組み合わせることができる（すなわち、マイクロＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）。例えば、Ｋｏｂａ ｅｔ ａｌ．を参照のこと。また、少なくともマイクロＰＥＴは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）と一つの装置内で組み合わせることが可能である（すなわち、マイクロＰＥＴ／ＭＲＩ）。

【0017】

また、高い分解能のため、これらの装置は細胞培養物を画像化するために用いることが可能である（既に上で述べたＫｅｓｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１２、及びＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１３を参照のこと）。

【0018】

好ましくは、本発明の文脈において、「マイクロＰＥＴスキャナー」は、５０ｃｍ未満、好ましくは４０ｃｍ未満、より好ましくは３０ｃｍ未満、さらにより好ましくは２５ｃｍ未満、さらに一層より好ましくは２０ｃｍ未満、特に１５ｃｍ未満、又はさらに１０ｃｍ未満（しかし通常は１ｃｍ又は２ｃｍを超える）長軸断視野（ＦＯＶ）直径、及び／又は４ｍｍ未満、好ましくは３ｍｍ未満、より好ましくは２ｍｍ未満、特に１．５ｍｍ未満（一般的に、この分解能は約１ｍｍである）のＦＯＶの中心の再構成分解能を有するＰＥＴスキャナーである。よって、「マイクロＰＥＴ」という用語は単独で、マイクロＰＥＴスキャナーにおけるＰＥＴ測定に関する。本発明の文脈において、マイクロＰＥＴスキャナーもまた、ＭＲＩ、ＳＰＥＣＴ、及び／又はＣＴなどの付加的な画像化の機能性を有してもよく、すなわち、例えば、マイクロＰＥＴ／ＣＴ、マイクロＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴ、又はマイクロＰＥＴ／ＭＲＩスキャナーでもよい。

【0019】

好ましくは、本発明の文脈において、「マイクロＳＰＥＣＴスキャナー」は、４ｍｍ未満、好ましくは３ｍｍ未満、より好ましくは２ｍｍ未満、特に１．５ｍｍ未満、又はさらに１．０ｍｍ未満（一般的に、この分解能は約０．７５ｍｍである）の空間分解能を有するＳＰＥＣＴスキャナーである。よって、「マイクロＳＰＥＣＴ」という用語は単独で、マイクロＳＰＥＣＴスキャナーにおけるＳＰＥＣＴ測定に関する。本発明の文脈において、マイクロＳＰＥＣＴスキャナーもまた、ＰＥＴ及び／又はＣＴなどの付加的な画像化の機能性を有してもよく、すなわち、例えば、マイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴ又はマイクロＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ／ＣＴスキャナーでもよい。

【0020】

本発明の文脈において、例えば、（第１及び／又は第２の）細胞培養物は、例えば、哺乳類（好ましくはヒト）患者（例えばがん患者）からの生検由来の初代細胞培養物であってもよい。また、（第１及び／又は第２の）細胞培養物は、例えば、哺乳類又はヒト細胞株などの細胞株の細胞培養物であってもよい。例えば、（第１及び／又は第２の）細胞培養物はまた、異なる細胞型の共培養であってもよい。第１及び第２の細胞培養物は、同じ細胞型（例えば、同じ灌流チャンバ内において生物学的複製を持たせるため）であっても、異なる細胞型（例えば、同じ灌流チャンバ内において異なる細胞型に及ぼす放射性トレーサーの効果を研究するため）であってもよい。

【0021】

第１の細胞培養物及び／又は第２の細胞培養物は、三次元細胞培養、特にスフェロイド又はオルガノイドであることが好ましい。特に、第１の細胞培養物及び／又は第２の細胞培養物はＭＴＳである（例えば、Ｈｉｒｓｃｈｈａｅｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照のこと）。本発明は、これらのタイプの細胞培養物に特に適している。

【0022】

本発明の好適な実施形態において、カラムは、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つの上記細胞培養物を含む。これにより、本発明の測定スループットがさらに高くなる。例えば、カラムは、それぞれが他の細胞培養物と接触している（例えば、各細胞培養物をその凹部に含む）５つのスポンジ、及び細胞培養物と接触していない他のスポンジを含んでいてもよい。

【0023】

本発明の文脈において、放射性トレーサーは、陽電子放出化合物（^１８Ｆ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^８２Ｒｂ、又は^６８Ｇａの少なくとも１つを含む化合物など）又はγ線放出化合物（^９９ｍＴｃ、^１７７Ｌｕ、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、又は^１１１Ｉｎの少なくとも１つを含む化合物など）である。例えば、ＰＥＴに対して一般的に用いられる放射性トレーサーは、２−デオキシ−２−［^１８Ｆ］フルオログルコース、［^１８Ｆ］フルオロアルキル−コリン、［^１８Ｆ］フルオロウラシル、［^６８Ｇａ］エドトレオチド、及び［^１１Ｃ］アセテートである。例えば、ＳＰＥＣＴに対して一般的に用いられる放射性トレーサーは、［^９９ｍＴｃ］セスタミビ又は［^１２３Ｉ］−メタ−ヨードベンジルグアニジンである。しかしながら、本発明は一般的に用いられる放射性トレーサーに限定されない。

【0024】

好ましくは、水性標識液体は、特に生理的ｐＨを有する放射性トレーサーの緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は増殖培地中の放射性トレーサーである。好ましくは、水性洗浄液体は、特に生理的ｐＨを有する緩衝液、例えば、ＰＢＳ又は増殖培地である。最も典型的には、洗浄溶液はどのような放射性トレーサーも含まない。

【0025】

本発明のとりわけ好適な実施形態において、カラムの灌流チャンバに存在する多孔質固相は、少なくとも１つの生体高分子を含む（特に、少なくとも１つの生体高分子で作られた）、少なくとも１つの（好ましくは少なくとも２つの、より好ましくは少なくとも３つの、さらにより好ましくは少なくとも４つの、さらに一層より好ましくは少なくとも５つの、特に少なくとも６つの）スポンジを含む。この生体高分子は、絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択されることが好ましい。このようなスポンジは、例えば、Ｒｎｊａｋ−Ｋｏｖａｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．、Ｗｉｄｄｏｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｒｏｈａｎｉｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．、Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｒｆｉ−Ｐａｖｉａ ｅｔ ａｌ．、及びＰｏｏｎａｍ ｅｔ ａｌ．に開示されている。本発明の過程で、絹フィブロインスポンジは、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴ分析の間、発明のカラム内で細胞培養物（特にＭＴＳなどの三次元細胞培養物）を支持するのに特に適している一方、放射性トレーサーとの低い相互作用のみを示すということが分かった。例えば、絹フィブロインスポンジは、Ｔｅｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．に開示されている。スポンジは、灌流チャンバに収まるようにあらかじめ切断されていることが特に好ましい。例えば、灌流チャンバが円形の輪郭を有する場合は、円形ブレードを有する打抜装置でスポンジをあらかじめ切断することができる。

【0026】

本発明の文脈において、スポンジは、０．５ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜４０ｍｍ、より好ましくは１．５ｍｍ〜２５ｍｍ、特に２ｍｍ〜１０ｍｍの最大直径を有することが好ましい。

【0027】

本発明のさらに好適な実施形態において、多孔質固相（例えば、少なくとも１つのスポンジ）は、５０μｍ〜１０００μｍ、好ましくは７５μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは１００μｍ〜６００μｍ、さらにより好ましくは１２５μｍ〜５００μｍ、さらに一層より好ましくは１５０μｍ〜４５０μｍ、特に２００μｍ〜４００μｍの平均孔径を有する。前述の平均孔径範囲は、細胞を支持するのに適している一方で、灌流チャンバを通る流速をさらに適切なものにするということが分かった。

【0028】

マイクロＰＥＴ及びマイクロＳＰＥＣＴの空間分解能は限られているため、第１の細胞培養物に結合した放射性トレーサーの信号が第２の細胞培養物に結合した放射性トレーサーによって著しく阻害されないように、灌流チャンバ内の細胞培養物がお互いに充分な距離を有することが有利である。最小距離が６００μｍ〜５０００μｍであることが特に効果的であることが分かった。したがって、好適な実施形態において、第１の細胞培養物と第２の細胞培養物との間の最小距離は、６００μｍ以上、好ましくは７００μｍ以上、より好ましくは８００μｍ以上、さらにより好ましくは９００μｍ以上、さらに一層より好ましくは１０００μｍ以上、特に２０００μｍ以上、又はさらに５０００μｍ以上である。

【0029】

本発明の特に好ましい実施形態によると、多孔質固相は、上記スポンジのうち少なくとも第１と第２のものを含む。この実施形態において、第１の培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）が第１のスポンジと接触しており、第２の培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）が第２のスポンジと接触している。第１の培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）が第１のスポンジに付着しており、第２の培養物の少なくとも一部（例えば（細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）が第２のスポンジに付着していることが好ましい。本明細書において、スポンジに「付着した」細胞培養物という表現は、細胞培養物の細胞の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の表面の１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは２０％以上、さらに一層より好ましくは３０％以上、特に４０％以上、又はさらに５０％以上）が、それらの細胞接着分子（ＣＡＭ）（セレクチン、インテグリン、又はカドヘリンなど）により、スポンジへの付着を形成していることを意味する。例えば、そのような細胞接着は、増殖培地において３７℃で２〜３時間、スポンジと接触した状態で細胞培養物をインキュベートすることにより促進される。

【0030】

他に優先することとして、第１のスポンジは、第１の培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の体積の５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２５％以上、さらにより好ましくは５０％以上、さらに一層より好ましくは７５％以上、特に９０％以上、又はさらに９５％以上）を含む凹部を有し、第２のスポンジは、第２の細胞培養物の少なくとも一部（例えば、細胞培養物（例えばＭＴＳ）の体積の５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２５％以上、さらにより好ましくは５０％以上、さらに一層より好ましくは７５％以上、特に９０％以上、又はさらに９５％以上）を含む凹部を有する。この凹部は、その位置における細胞培養物を安定化させるだけでなく、細胞培養物とスポンジの生体高分子との間の相互作用面を増加させることにより、細胞培養物とスポンジの生体高分子との間の好ましい相互作用を強化する働きをする。典型的には、凹部の最大直径は、多孔質固相の（及び／又は凹部を有するスポンジの）平均孔径よりも大きく、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに一層より好ましくは４倍以上、特に５倍以上大きい。例えば、凹部は１ｍｍ超の、さらに２ｍｍ超の、特に３ｍｍ超の最大直径を有してもよい。

【0031】

ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャンにおいて個々の細胞培養物を識別するために、好適な実施形態において、カラムは、カラム内の細胞培養物の少なくとも１つの位置を示すための付加的な放射性標識又は放射性不透過性標識を含む。標識が放射性、例えば陽電子放出化合物（^１８Ｆ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^８２Ｒｂ、又は^６８Ｇａの少なくとも１つを含む化合物など）又はγ線放出化合物（^９９ｍＴｃ、^１２３Ｉ、^１３１Ｉ、又は^１１１Ｉｎの少なくとも１つを含む化合物など）である場合、標識は溶液中（例えば水溶液中）に存在することが好ましい。カラムは、好ましくは溶液の形で、放射性標識を含む付加的なチャンバを含むことが有利である。標識が放射性不透過性（特に、例えば、ＰＥＴ画像及びＣＴ画像の重ね合わせに対してなどのマイクロＰＥＴ／ＣＴ又はマイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴで用いるＸ線に対して）（例えば、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、フェライト、マグネタイト、カリウム塩、又は重金属粒子などの金属酸化物）である場合、標識は固体として（例えば小さなプレート又はディスクの形で）存在することが好ましい。カラムは、好ましくは小さなプレート又はディスクの形で、放射性標識を含む付加的なチャンバを含むことが有利である。

【0032】

例として、カラムは、灌流チャンバの軸に沿って、複数の空の（小さい）チャンバを含んでいてもよい。灌流チャンバはスポンジで満たされており、それぞれのスポンジは細胞培養物を含んでいる。それぞれの細胞培養物について、その細胞培養物に最も近いチャンバのみが放射性標識を有する溶液又は放射性不透過性プレート若しくはディスクで満たされている。ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャンにおいて（又は重ね合わせＣＴスキャンにおいて）、これらのチャンバは検出され、それぞれの細胞培養物の位置を示す付加的な対照（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）としての機能を果たすこととなる。言うまでもなく、チャンバの特徴は、溶液又はプレート若しくはディスクで満たされているかどうかによって異なる。

【0033】

他の好ましい実施形態において、灌流チャンバは、カラム内の細胞培養物の少なくとも１つの位置を示す少なくとも１つの固形マーカーをさらに含む。この固形マーカーは、多孔質固相（例えば、スポンジ）より高い密度を有し、好ましくは１．２５倍以上、より好ましくは１．５倍以上、特に２倍以上高い密度を有する。これにより、画像化方法において細胞培養物の識別をより容易にすることが可能である。言うまでもなく、固形マーカーは灌流チャンバ内の流れを完全には阻害しない。したがって、固形マーカーは多孔質であることが好ましい。例えば、固形マーカーはフィルターであってもよい（例えば、図７参照）。固形マーカーは、２つのスポンジの間に位置していてもよい（同様に、図７参照）。それぞれの密度を計算する場合、多孔質固相の孔の含有量及び多孔質固形マーカー（あるとすれば）の孔の含有量をそれぞれ考慮し、すなわち、孔が水で満たされている場合には、物質の全質量対その体積を考慮する。

【0034】

さらに好適な実施形態によると、好ましくは灌流チャンバの中身の少なくとも一部が外から見えるように、カラムの少なくとも一部は透明である。これは、例えば、カラムをＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャナーに挿入する前に、灌流チャンバの状態を確認するのに有用である。

【0035】

さらに好適な実施形態によると、第１の細胞培養物の放射性トレーサーに対する結合親和性は、第２の細胞培養物よりも高い。

【0036】

発明の方法の文脈において、工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）の実施は、好ましくは０．０１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分の流速の、好ましくは０．０２５ｍＬ／分〜７．５ｍＬ／分の流速の、より好ましくは０．０５ｍＬ／分〜５ｍＬ／分の流速の、特に０．１ｍＬ／分〜２ｍＬ／分の流速の灌流チャンバを通る乱流液体流（層流とは対照的）を含むことが好ましい。乱流は、細胞培養物に対して生理的状況に近い状況を引き起こすことになる（すなわち、組織を通る液体流は一般的に乱れる）。これは、ほとんどの場合に層流液体流を有するマイクロ流体システムに対する本発明の決定的な利点である。

【0037】

本発明のキットの態様に戻ると、特に、キットは使用指示書（例えば、キットのカラムのＰＥＴ又はＳＰＥＣＴスキャナーでの使用指示書、特に発明の方法によるキットの使用指示書）をさらに含んでいてもよい。発明のキットは、キットのカラムの灌流チャンバに収まるようにあらかじめ切断された少なくともフィルターを２つさらに含むことが好ましい。さらに好みに合わせて、キットは、少なくとも１つの無菌フィルター、すなわち、１μｍ未満、好ましくは０．５μｍ未満、特に０．２５μｍ未満の平均孔径を有するフィルター、をさらに含む。例えば、この無菌フィルターは、カラムの入口及び／又は出口に取り付けてもよい。また、発明のキットは管類（ｔｕｂｉｎｇ）を含んでもよい。

【0038】

また、本発明のキットは、例えば小さなプレート又はディスクの形で、上述の放射性不透過性標識の少なくとも１つを含んでもよい。特にこの場合、カラムは、所望による放射性不透過性標識の充填のための付加的なチャンバを有してもよい。

【0039】

本発明の文脈において、カラムは、０．５ｍｍ〜２０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｍｍ、特に２ｍｍ〜８ｍｍの直径を有することが好ましい。

【0040】

さらに、本発明の文脈において、多孔質固相がハイドロゲルを含まないことが非常に好ましい。あるいは、又はそれに加えて、多孔質固相は不規則な孔を有することが好ましい。

【0041】

本明細書において、好ましくは、「生体適合性カラム」という表現は、使用中に細胞培養物と接触するカラムの表面（例えば、灌流チャンバ内）が細胞増殖を（著しく）阻害しない、すなわち、（著しい）細胞毒性がないことを意味する。

【0042】

本発明は、さらに以下の実施形態に関する。
実施形態１．生体適合性カラムにおける少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロ陽電子放出断層撮影（マイクロＰＥＴ）又はマイクロ単一光子放出コンピュータ断層撮影（マイクロＳＰＥＣＴ）のための方法であって、
上記カラムは、入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、ここで、上記入口は上記灌流チャンバと流体接続しており、上記出口は上記灌流チャンバと流体接続しており、上記灌流チャンバは、多孔質固相、水性液相、第１の細胞培養物、及び第２の細胞培養物を含み、上記第１の細胞培養物の少なくとも一部及び上記第２の細胞培養物の少なくとも一部は上記固相と接触しており、上記第１の細胞培養物は、上記第２の細胞培養物とは上記固相の少なくとも一部により隔てられており、
上記方法は、以下の工程：
（Ａ）上記カラムをマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーに挿入すること、
（Ｂ）上記第１の細胞培養物の細胞の少なくとも一部及び上記第２の細胞培養物の細胞の少なくとも一部が放射性トレーサーと接触するように、上記入口を通り上記灌流チャンバ（３）を通り抜け上記出口に向かって上記放射性トレーサーを含む水性標識液体を流通させること、
（Ｃ）上記放射性トレーサーの少なくとも一部が上記灌流チャンバから上記出口を通って除去されるように、上記入口を通り上記灌流チャンバを通り抜け上記出口に向かって水性洗浄液体を流通させること、及び
（Ｄ）上記カラムを上記マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナーでスキャンすること、
を含む。

【0043】

実施形態２．上記第１の細胞培養物及び／又は上記第２の細胞培養物がスフェロイド又はオルガノイドである、実施形態１に記載の方法。

【0044】

実施形態３．上記第１の細胞培養物及び／又は上記第２の細胞培養物が多細胞腫瘍スフェロイド（ＭＴＳ）である、実施形態２に記載の方法。

【0045】

実施形態４．工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）の流通させることが、上記灌流チャンバを通る乱流液体流を含み、該乱流液体流は、好ましくは０．０１ｍＬ／分〜１０ｍＬ／分の流速（好ましくは０．０２５ｍＬ／分〜７．５ｍＬ／分の流速、より好ましくは０．０５ｍＬ／分〜５ｍＬ／分の流速、特に０．１ｍＬ／分〜２ｍＬ／分の流速）である、実施形態１〜３のいずれか一つに記載の方法。

【0046】

実施形態５．上記多孔質固相が、少なくとも１つの生体高分子を含む少なくとも１つのスポンジを含み、
ここで、好ましくは、上記生体高分子が、絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択され、及び／又は上記灌流チャンバに収まるように上記スポンジがあらかじめ切断されている、実施形態１〜４のいずれか一つに記載の方法。

【0047】

実施形態６．上記多孔質固相が、５０μｍ〜１０００μｍ（好ましくは７５μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは１００μｍ〜６００μｍ、さらにより好ましくは１２５μｍ〜５００μｍ、さらに一層より好ましくは１５０μｍ〜４５０μｍ、特に２００μｍ〜４００μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１〜５のいずれか一つに記載の方法。

【0048】

実施形態７．上記第１の細胞培養物と上記第２の細胞培養物との最小距離が６００μｍ以上（好ましくは７００μｍ以上、より好ましくは８００μｍ以上、さらにより好ましくは９００μｍ以上、さらに一層より好ましくは１０００μｍ以上、特に２０００μｍ以上、又はさらに５０００μｍ以上）である、実施形態１〜６のいずれか一つに記載の方法。

【0049】

実施形態８．上記多孔質固相が上記スポンジのうち少なくとも第１及び第２のものを含み、上記第１の培養物の少なくとも一部が第１のスポンジと接触しており、上記第２の培養物の少なくとも一部が第２のスポンジと接触している、実施形態５〜７のいずれか一つに記載の方法。

【0050】

実施形態９．上記第１の培養物の少なくとも一部が上記第１のスポンジに付着しており、上記第２の培養物の少なくとも一部が上記第２のスポンジに付着している、実施形態８に記載の方法。

【0051】

実施形態１０．上記第１のスポンジが、上記第１の細胞培養物の少なくとも一部を含む凹部を有し、上記第２のスポンジが、上記第２の細胞培養物の少なくとも一部を含む凹部を有する、実施形態８又は９に記載の方法。

【0052】

実施形態１１．上記カラムが、上記カラム内の上記細胞培養物の少なくとも１つの位置を示す付加的な放射性標識又は放射線不透過性標識を含む、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載の方法。

【0053】

実施形態１２．上記カラムが、上記放射性標識又は上記放射線不透過性標識を含む付加的なチャンバを含む、実施形態１１に記載の方法。

【0054】

実施形態１３．上記灌流チャンバが、上記カラム内の上記細胞培養物の少なくとも１つの位置を示す少なくとも１つの固形マーカーをさらに含み、上記固形マーカーが、上記多孔質固相より高い密度（好ましくは１．２５倍以上、より好ましくは１．５倍以上、特に２倍以上高い密度）を有する、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。

【0055】

実施形態１４．上記カラムの少なくとも一部が透明である、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載の方法。

【0056】

実施形態１５．上記第１の細胞培養物の上記放射性トレーサーに対する結合親和性が、上記第２の細胞培養物よりも高い、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載の方法。

【0057】

実施形態１６．少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための生体適合性カラムであって、
上記カラムは、入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、ここで、上記入口は上記灌流チャンバと流体接続されており、上記出口は上記灌流チャンバと流体接続されており、
上記灌流チャンバは、少なくとも１つの生体高分子を含む少なくとも１つのスポンジを含む多孔質固相、水性液相、第１の細胞培養物、及び第２の細胞培養物を含み、上記第１の細胞培養物の少なくとも一部及び上記第２の細胞培養物の少なくとも一部は上記固相と接触しており、上記第１の細胞培養物は、上記第２の細胞培養物とは上記固相の少なくとも一部により隔てられている、上記カラム。

【0058】

実施形態１７．上記第１の細胞培養物及び／又は上記第２の細胞培養物がスフェロイド又はオルガノイドである、実施形態１６に記載のカラム。

【0059】

実施形態１８．上記第１の細胞培養物及び／又は上記第２の細胞培養物がＭＴＳである、実施形態１７に記載のカラム。

【0060】

実施形態１９．上記生体高分子が、絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択される、実施形態１６〜１８のいずれか一つに記載のカラム。

【0061】

実施形態２０．上記生体高分子が絹フィブロインである、実施形態１９に記載のカラム。

【0062】

実施形態２１．上記灌流チャンバに収まるように、上記スポンジがあらかじめ切断されている、実施形態１６〜２０のいずれか一つに記載のカラム。

【0063】

実施形態２２．上記多孔質固相が、５０μｍ〜１０００μｍ（好ましくは７５μｍ〜７５０μｍ、より好ましくは１００μｍ〜６００μｍ、さらにより好ましくは１２５μｍ〜５００μｍ、さらに一層より好ましくは１５０μｍ〜４５０μｍ、特に２００μｍ〜４００μｍ）の平均孔径を有する、実施形態１６〜２１のいずれか一つに記載のカラム。

【0064】

実施形態２３．上記第１の細胞培養物と上記第２の細胞培養物との最小距離が、６００μｍ以上（好ましくは７００μｍ以上、より好ましくは８００μｍ以上、さらにより好ましくは９００μｍ以上、さらに一層より好ましくは１０００μｍ以上、特に２０００μｍ以上、又はさらに５０００μｍ以上）である、実施形態１６〜２２のいずれか一つに記載のカラム。

【0065】

実施形態２４．上記多孔質固相が、第１及び第２の上記スポンジを少なくとも含み、上記第１の培養物の少なくとも一部が上記第１のスポンジと接触しており、上記第２の培養物の少なくとも一部が上記第２のスポンジと接触している、実施形態１６〜２３のいずれか一つに記載のカラム。

【0066】

実施形態２５．上記第１の培養物の少なくとも一部が上記第１のスポンジに付着しており、上記第２の培養物の少なくとも一部が上記第２のスポンジに付着している、実施形態２４に記載のカラム。

【0067】

実施形態２６．上記第１のスポンジは、上記第１の細胞培養物の少なくとも一部を含む凹部を有し、上記第２のスポンジは、上記第２の細胞培養物の少なくとも一部を含む凹部を有する、実施形態２４又は２５に記載のカラム。

【0068】

実施形態２７．上記カラムが、上記カラム内の上記細胞培養物の少なくとも１つの位置を示す付加的な放射性標識又は放射線不透過性標識を含む、実施形態１６〜２６のいずれか一つに記載のカラム。

【0069】

実施形態２８．上記カラムが、上記放射性標識又は上記放射線不透過性標識を含む付加的なチャンバを含む、実施形態２７に記載のカラム。

【0070】

実施形態２９．上記灌流チャンバが、上記カラム内の上記細胞培養物の少なくとも１つの位置を示す少なくとも１つの固形マーカーをさらに含み、上記固形マーカーが上記多孔質固相より高い密度（好ましくは１．２５倍以上、より好ましくは１．５倍以上、特に２倍以上高い密度）を有する、実施形態１６〜２８のいずれか一つに記載のカラム。

【0071】

実施形態３０．上記カラムの少なくとも一部が透明である、実施形態１６〜２９のいずれかに記載のカラム。

【0072】

実施形態３１．上記第１の細胞培養物の放射性トレーサーへの結合親和性が上記第２の細胞培養物よりも高い、実施形態１６〜３０のいずれか一つに記載のカラム。

【0073】

実施形態３２．上記入口及び／又は上記出口を介してポンプと流体接続された実施形態１６〜３０のいずれか一つに記載のカラムを含む、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのシステムであって、
好ましくは、上記システムが上記カラムのための温度制御及び／又は上記カラムの上記入口と流体接続されたサンプル注入器をさらに有する、上記システム。

【0074】

実施形態３３．実施形態１６〜３０のいずれか一つに記載のカラムが挿入されたマイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴスキャナー。

【0075】

実施形態３４．少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのキットであって、
少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための少なくとも１つの生体適合性カラム、ここで、該カラムは、入口、軸方向に配向した灌流チャンバ、及び出口を含み、上記入口が上記灌流チャンバと流体接続されており、上記出口が上記灌流チャンバと流体接続されている；並びに
少なくとも１つの生体高分子を含み、上記灌流チャンバに収まるようにあらかじめ切断されている、少なくとも２つのスポンジ、ここで、該スポンジは、好ましくは絹、絹フィブロイン、コラーゲン、ゼラチン、アガロース、アルギン酸、ポリ乳酸、寒天、メチルセルロース、及びそれらの混合物から選択される；
を含む上記キット。

【0076】

実施形態３５．上記灌流チャンバに収まるようにあらかじめ切断されている少なくとも２つのフィルターをさらに含み、好ましくは上記フィルターが上記少なくとも２つのスポンジより高い密度（より好ましくは１．２５倍以上、さらにより好ましくは１．５倍以上、特に２倍以上高い密度）を有する、実施形態３４に記載のキット。

【0077】

実施形態３６．少なくとも１つの無菌フィルターをさらに含む、実施形態３４又は３５に記載のキット。

【0078】

本発明は、限定されるものではないが、以下の図面及び実施例によりさらに例示される。

【図面の簡単な説明】

【0079】

【図1】図１は、本発明の生体適合性カラムの一実施形態を示す。

【図2】図２は、発明の生体適合性カラムのプロトタイプのスキーム及び写真を示す。カラムは、プラスチックハウジング及びフリットを有し、プラスチックハウジングは、複数の絹フィブロインスポンジからなる固体多孔質相及び細胞増殖培地からなる液相を有する灌流チャンバを形成する。写真の下側カラムの２つの点は、スポンジの凹部内の２つの細胞培養物の存在を示す（それぞれ約１ｍｍの直径を有するＭＴＳである）。

【図3】図３は、液相の輸送のためのポンプシステム、放射性トレーサーの注入のための注入バルブ、細胞培養物を有する生体適合性カラム、検出システムとしてのマイクロＰＥＴ（μＰＥＴ）、及び廃棄用ボトルを含む、少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴのための完全自動化システムの概念設計を示す。いくつかの部品がプロセス制御、データ収集及び再構成のためのコンピュータに接続されている。

【図4】図４は、生体適合性カラムの準備の一例を示す。１）細胞培養懸濁液をスポンジに付与し、２）細胞を６時間以上なじませ、３）スポンジをカラムに挿入して培養培地で湿らせ、４）放射性トレーサーをストップフロー機構に加え、５）残存する放射性トレーサーを除去し、６）放射性トレーサーの蓄積を検出する。

【図5】図５は、５つのＭＴＳを含んだ本発明のカラムのＰＥＴスキャンを示す。水溶液の［^１８Ｆ］ＦＤＧを、手動で５つのＭＴＳ（それぞれ直径が〜７００μｍ）を有する多孔質固相を通して移動させた。６０分のインキュベーション時間の後、非結合の［^１８Ｆ］ＦＤＧを洗浄し、その後、カラムをマイクロＰＥＴスキャナーに挿入しスキャンした。互いに極めて接近したＭＴＳ２及び３は区別することができなかった一方で、ＭＴＳ１、４、及び５は普通とは異なる信号対雑音比によって充分に分離することができた。

【図6】図６は、２つの細胞培養物（２つの異なる絹スポンジに播種したＨＴ２９ヒト結腸直腸腺がん細胞株の細胞）を含んだ本発明のカラムのＰＥＴスキャンを示す。［^１８Ｆ］ＦＤＧ水溶液を、手動で５つのＭＴＳ（それぞれ直径が〜７００μｍ）を有する多孔質固相を通して移動させた。６０分のインキュベーション時間の後、非結合の［^１８Ｆ］ＦＤＧを洗浄し、続いて、カラムをマイクロＰＥＴスキャナーに挿入しスキャンした。スキャンにおいて、２つのＨＴ２９細胞培養物はお互いに明確に区別できる。

【図7】図７は、本発明のカラムのその他のプロトタイプの写真を示す。カラムは、プラスチックハウジング及びフリットを有し、プラスチックハウジングは、４つの絹フィブロインスポンジ（カラムに記された標識により示される）及びフィルター（灌流チャンバ内の白色物質）からなる固体多孔質相、並びに細胞増殖培地からなる液相を有する灌流チャンバを形成する。絹フィブロインスポンジはそれぞれ、その凹部に約０．５ｍｍの直径を有するＭＴＳを含む。スポンジはそれぞれ、隣接する２つのフィルターを有する。フィルターがスポンジよりも高い密度を有することで、測定における各ＭＴＳの識別を容易にすることができる。言い換えると、各フィルターはカラム内の細胞培養（ＭＴＳ）の少なくとも１つの位置を示す固形マーカーである。

【実施例】

【0080】

実施例１：生体適合性カラム
図１は、第１の細胞培養物６ａ及び第２の細胞培養物６ｂの同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのための生体適合性カラム１を示し、ここで、第１の細胞培養物６ａ及び第２の細胞培養物６ｂはいずれもＭＴＳである。カラムは、入口２、軸方向に配向した灌流チャンバ３、及び出口４を含む。入口２及び出口４はいずれも灌流チャンバ３に流体接続されている。灌流チャンバ３は４つのスポンジ７ｃ、７ｄ、７ａ、７ｂにより形成された多孔質固相を含み、ここで、これらのスポンジは生体高分子で作られ、灌流チャンバ３に収まるようにあらかじめ切断されていた。増殖培地からなる液相５は、入口２からスポンジ７ｃ、７ｄ、７ａ、７ｂを通って出口４へ延びている。スポンジ７ａ、７ｂはそれぞれ凹部８ａ、８ｂを有する。第１の細胞培養物６ａは、スポンジ７ａと接触した状態で凹部８ａ内に位置し、第２の細胞培養物６ｂは、スポンジ７ｂと接触した状態で凹部８ｂ内に位置する。スポンジ７ｃ、７ｄは、凹部と細胞培養のどちらも有しない。第１の細胞培養物６ａ及び第２の細胞培養物６ｂは、スポンジ７ａにより互いに隔てられている。カラム１は、入口２に隣接する１つのフィルター５０、及び出口４に隣接する無菌フィルター５１に隣接する別のフィルター５０をさらに有する。

【0081】

実施例２：少なくとも２つの細胞培養物の同時マイクロＰＥＴ又はマイクロＳＰＥＣＴのためのシステム
このシステムの主な目的は、間質性ストップフロー条件の三次元バイオスキャホールド内の薬剤の分布、蓄積、代謝、及び排出の評価に適用できる方法を提供することにより、生体外での薬剤、特にＰＥＴ又はＳＰＥＣＴトレーサーの開発を促進することである。このシステムは、生体高分子スポンジに埋め込まれた細胞、ＭＴＳ、又はオルガノイドからなる生物学的固定相を通る一定流量の薬剤／トレーサー又は改良剤、並びに栄養素、Ｏ_２及びＣＯ_２を輸送する移動相からなる。生物学的固定相を有するカラムのプロトタイプを図２に示す。

【0082】

さらに、このシステムは、制御可能なポンプシステム、カラムを固定し温度を制御するための装置、及び検出ユニットとしてのマイクロＰＥＴスキャナーを含む（図３参照）。

【0083】

生体適合性カラムの準備のための一例を図４に示す。

【0084】

実施例３：実験結果
下記の４つの異なるカラムをマイクロＰＥＴスキャナーに導入しスキャンした。
ａ）細胞培養物なしで絹スポンジを用いて準備したカラム（バックグラウンド測定）
ｂ）［^１８Ｆ］ＦＤＧでプレインキュベートしたスフェロイドを用いて準備したカラム（信号対雑音比測定）
ｃ）異なる距離に配置されたスフェロイドを用いて準備し、［^１８Ｆ］ＦＤＧをストップフロー機構に導入したカラム（図５参照）
ｄ）無細胞のスポンジを間に有する絹スポンジ上で増殖した細胞を用いて準備したカラム（図６参照）

【0085】

カラムａ）のスキャンにより、一般に、絹スポンジへの［^１８Ｆ］ＦＤＧ結合性は低く、絹への極性化合物の非特異的結合性は低いが示された。

【0086】

カラムｂ）のスキャンにより、カラム内にスフェロイドがうまく検出されたことが明確に示された。

【0087】

カラムｃ）のスキャンにより、絹スキャホールドへの［^１８Ｆ］ＦＤＧの特異的結合性は低いことが確認され、スフェロイド２、３を除く全てのスフェロイドについては別々に画像化できたことから、スフェロイド間の驚くほど高い分解能が表出された。スフェロイドの大きさは約７００μｍであり、使用したマイクロＰＥＴ装置の分解能を下回るため、この結果は特に重要である。

【0088】

カラムｄ）のスキャンにより、ＨＴ２９細胞を有する領域が明確に強調され（図６参照）、本発明の高い可能性がさらに示された。

【0089】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【国際調査報告】