特表 2021-519289 ガイダンス及びナビゲーションコントロール蛋白質の生産及び使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-519289(P2021-519289A)

(43)【公表日】2021年8月10日

(54)【発明の名称】ガイダンス及びナビゲーションコントロール蛋白質の生産及び使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20210712BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210712BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20210712BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20210712BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210712BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210712BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20210712BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20210712BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210712BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20210712BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210712BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20210712BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/17 Z

   C12N5/10ZNA

   C12N5/0783

   A61K47/66

   A61K45/00

   A61K39/395 T

   A61K39/395 E

   A61K38/43

   A61K38/00

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 121

   A61K47/42

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2020-551503(P2020-551503)

(86)(22)【出願日】2019年3月26日

(85)【翻訳文提出日】2020年11月20日

(86)【国際出願番号】US2019024111

(87)【国際公開番号】WO2019191125

(87)【国際公開日】20191003

(31)【優先権主張番号】62/648,888

(32)【優先日】2018年3月27日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/648,880

(32)【優先日】2018年3月27日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】517218697

【氏名又は名称】システィミューン， インク．

【氏名又は名称原語表記】ＳＹＳＴＩＭＭＵＮＥ， ＩＮＣ．

(71)【出願人】

【識別番号】519457719

【氏名又は名称】シーチュアン バイリ ファーマスーティカル シーオー． エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＳＩＣＨＵＡＮ ＢＡＩＬＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ． ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】ツー， イ

(72)【発明者】

【氏名】オルセン， オーレ

(72)【発明者】

【氏名】ハリ， ジャハン

(72)【発明者】

【氏名】シア， ドン

(72)【発明者】

【氏名】ジェリーマン， デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ブイコワ， カトリーナ

(72)【発明者】

【氏名】ルソー， アン−マリー

(72)【発明者】

【氏名】ワン， カミラ

(72)【発明者】

【氏名】ガオ， ゼレン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン， ホイ

(72)【発明者】

【氏名】ランディ， スティーブン ケー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BA22

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA44

4C084DC01

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB27

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085CC23

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087DA20

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA13

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC75

(57)【要約】

本願は、治療用組成物の生産方法を提供する。一実施形態では、この方法は、細胞傷害性細胞を含む細胞材料を提供する工程、前記細胞材料を第一のGNC蛋白質とインキュベートし、活性化細胞組成物を提供する工程、ここで、前記活性化細胞組成物は第一の治療用細胞を含み、及び活性化細胞組成物を調整し、治療用組成物を提供する工程、ここで、前記治療用組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA又はRNAを実質的に含まない、を含む。前記第一のGNC蛋白質は、第一の細胞傷害性結合部位及び第一のがん標的化部位を含み、ここで、前記第一の細胞傷害性結合部位は、第一の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、且つ前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合を介して前記第一の細胞傷害性細胞を活性化するように構成され、且つ前記第一のがん標的化部位は、前記第一のがん細胞受容体に対する特異性を有している。前記第一の治療用細胞は、前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して前記細胞傷害性細胞に結合した前記第一のGNC蛋白質を含む。
【選択図】図1

【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療用組成物の生産方法であって、
細胞傷害性細胞を含む細胞材料を提供する工程、
前記細胞材料を第一のGNC蛋白質とインキュベートし、活性化細胞組成物を提供する工程であって、前記活性化細胞組成物は、第一の治療用細胞を含む、工程、
ここで、前記第一のGNC蛋白質は、第一の細胞傷害性結合部分及び第一のがん標的化部分を含み、ここで、前記第一の細胞傷害性結合部分は、第一の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、且つ前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合を介して前記第一の細胞傷害性細胞を活性化するように構成され、且つ、ここで、前記第一のがん標的化部分は、第一のがん細胞受容体に対して特異性を有し、且つ
ここで、前記第一の治療用細胞は、前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞に結合した第一のGNC蛋白質を含み、及び
前記活性化細胞組成物を調製し、治療用組成物を提供する工程であって、前記治療用組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA又はRNAを実質的に含まない、工程、
を含む、方法。

【請求項2】

前記インキュベートする工程は、第二のGNC蛋白質を活性化細胞組成物とインキュベートすることによって繰り返され、
前記第二のGNC蛋白質は、第二の細胞傷害性結合部位及び第二のがん標的化部位を含み、前記第二の細胞傷害性結合部位は第二の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、且つ前記第二のがん標的化部位は第二のがん細胞受容体に対する特異性を有し、
前記活性化細胞組成物は第二の治療用細胞をさらに含み、
前記第二の治療用細胞は、前記第二の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して前記細胞傷害性細胞又は前記第一の治療用細胞に結合した第二のGNC蛋白質を含む、
請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記第二のGNC蛋白質が前記第一のGNC蛋白質と同じである、請求項2の方法。

【請求項4】

前記第二のGNC蛋白質が前記第一のGNC蛋白質と異なる、請求項2の方法。

【請求項5】

前記第一又は第二のがん標的化部位がB細胞に対する特異性を有し、且つ前記治療用組成物がB細胞を実質的に含まない、請求項1又は2の方法。

【請求項6】

前記細胞傷害性細胞受容体が、T細胞受容体、NK細胞受容体、マクロファージ受容体、樹状細胞受容体、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1の方法。

【請求項7】

前記細胞材料を前記第一のGNC蛋白質とインキュベートするとき、前記第一のGNC蛋白質と前記細胞傷害性細胞とのモル対細胞比が少なくとも30対1である、請求項1の方法。

【請求項8】

前記治療用組成物が、1 ml当たり少なくとも10⁶細胞を含む、請求項1の方法。

【請求項9】

前記治療用組成物が、前記第一の治療用細胞、前記第一のGNC蛋白質、前記細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項1の方法。

【請求項10】

前記治療用組成物が、前記第二の治療用細胞、前記第二のGNC蛋白質、前記第一の治療用細胞、前記第一のGNC蛋白質、前記細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項2の方法。

【請求項11】

前記細胞材料がPBMCを含む、請求項1の方法。

【請求項12】

前記第一及び第二のがん標的化部位は独立してCD19、PDL1、又はそれらの組み合わせに対する特異性を有する、請求項1の方法。

【請求項13】

第一及び第二の細胞傷害性結合部位は独立してCD3、PDL1、41BB、又はそれらの組み合わせに対する特異性を有する、請求項1の方法。

【請求項14】

がんを有する対象の治療方法であって、
細胞傷害性細胞を含む細胞材料を提供する工程、
前記細胞材料を第一のGNC蛋白質とインキュベートし、活性化細胞組成物を提供する工程であって、前記活性化細胞組成物は、第一の治療用細胞を含む、工程、
ここで、前記第一のGNC蛋白質は、第一の細胞傷害性結合部分及び第一のがん標的化部分を含み、ここで、前記第一の細胞傷害性結合部分は、第一の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、且つ前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合を介して前記第一の細胞傷害性細胞を活性化するように構成され、且つ、ここで、前記第一のがん標的化部分は、第一のがん細胞受容体に対して特異性を有し、且つ
ここで、前記第一の治療用細胞は、前記第一の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞に結合した第一のGNC蛋白質を含み、及び
前記活性化細胞組成物を調製し、治療用組成物を提供する工程であって、前記治療用組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA又はRNAを実質的に含まない、工程、
前記治療用組成物を前記対象に投与する工程、
を含む、方法。

【請求項15】

前記インキュベートする工程は、第二のGNC蛋白質を活性化細胞組成物とインキュベートすることによって繰り返され、
ここで、前記第二のGNC蛋白質が、第二の細胞傷害性結合部位及び第二のがん標的化部位を含み、ここで、前記第二の細胞傷害性結合部位が第二の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、且つ、ここで、前記第二のがん標的化部位が第二のがん細胞受容体に対する特異性を有し、
ここで、前記活性化細胞組成物が第二の治療用細胞をさらに含み、
ここで、前記第二の治療用細胞は、前記第二の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して前記細胞傷害性細胞又は前記第一の治療用細胞に結合した第二のGNC蛋白質を含む、
請求項14に記載の方法。

【請求項16】

前記第二のGNC蛋白質が前記第一のGNC蛋白質と同じである、請求項14の方法。

【請求項17】

前記第二のGNC蛋白質が前記第一のGNC蛋白質と異なる、請求項14の方法。

【請求項18】

前記第一又は第二のがん標的化部位がB細胞に対する特異性を有し、且つ前記治療用組成物がB細胞を実質的に含まない、請求項14又は15の方法。

【請求項19】

細胞材料を提供する前に、末梢血単核細胞（PBMC）から前記細胞傷害性細胞を単離する工程をさらに含む、請求項14の方法。

【請求項20】

前記末梢血単核細胞（PBMC）を血液から単離する工程をさらに含む、請求項19の方法。

【請求項21】

前記血液が対象由来である、請求項20の方法。

【請求項22】

前記血液が対象由来ではない、請求項20の方法。

【請求項23】

前記治療用組成物を前記対象に投与した後、追加のGNC蛋白質を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項14の方法。

【請求項24】

前記細胞傷害性細胞がT細胞、NK細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項14の方法。

【請求項25】

前記細胞傷害性細胞を単離する工程が、細胞傷害性細胞の少なくとも1つのサブ集団を単離し、治療用T細胞を提供する工程を含む、請求項19の方法。

【請求項26】

前記細胞傷害性細胞のサブ集団が、CD3+細胞、CD4+細胞、CD8+細胞、CD56+細胞、CD28+細胞、CD69+細胞、CD107a+細胞、CD45RA+細胞、CD45RO+細胞、γδ TCR+細胞、αβ TCR+細胞、CD25+細胞、CD127 ^lo/-細胞、CCR7+細胞、PD-1+細胞又はそれらの組み合わせを含む、請求項25の方法。

【請求項27】

前記投与工程の後に、治療効果を評価する工程をさらに含む、請求項14の方法。

【請求項28】

前記治療効果を評価する工程が、がんの1つ以上のバイオマーカーをチェックする工程、前記治療用細胞のライフスパンをモニターする工程、又はそれらの組み合わせを含む、請求項26の方法。

【請求項29】

前記バイオマーカーが、腫瘍抗原、サイトカイン、例えば、ガンマインターフェロン、IL-2、IL-8、及び/又はケモカインの放出、及び/又は様々な細胞型の表面上のCDマーカー、例えば、CD69、PD-1、TIGIT、及び/又は死滅時の腫瘍、循環腫瘍細胞によって血流に放出される変異核酸、及びその関連核酸、又はエキソソーム関連核酸、宿主炎症性メディエーター、又は腫瘍由来分析物、又はそれらの組み合わせを含む、請求項28の方法。

【請求項30】

前記対象がヒトである請求項14の方法。

【請求項31】

前記がんが、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRVIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、又はそれらの組み合わせを発現する細胞を含む、請求項14の方法。

【請求項32】

前記がんが、乳がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん、尿道がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳腫瘍、グリオーマ、ニューロブラストーマ、食道がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、眼がん、サルコーマ、骨がん、白血病、ミエローマ又はリンパ腫を含む、請求項14の方法。

【請求項33】

前記がんがCD19陽性である、請求項14の方法。

【請求項34】

前記治療用組成物を前記対象に投与した後、有効量の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項14の方法。

【請求項35】

前記治療剤が、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、化学療法剤、酵素、蛋白質、共刺激剤、アポトーシス増感剤、腫瘍血管障害剤、又はそれらの組み合わせを含む、請求項34の方法。

【請求項36】

前記共刺激剤が、前記対象の細胞傷害性T細胞の量を増加させるように構成される、請求項35の方法。

【請求項37】

細胞傷害性細胞、GNC蛋白質、及び治療用細胞を含む、治療用組成物であって、
前記GNC蛋白質は、細胞傷害性結合部位及びがん標的部位を含み、前記細胞傷害性結合部位は細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、前記がん標的部位はがん細胞受容体に対する特異性を有し、且つ前記細胞傷害性結合部位は前記細胞傷害性細胞受容体との結合を介して前記細胞傷害性細胞を活性化するように構成され、
前記治療用細胞は、細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して前記細胞傷害性細胞に結合したGNC蛋白質を含み、且つ
前記治療用細胞組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA及びRNAを実質的に含まない、
治療用組成物。

【請求項38】

前記がん標的化部位がB細胞に対する特異性を有し、前記治療用組成物が実質的にB細胞を含まない、請求項37の治療用組成物。

【請求項39】

第二のGNC蛋白質、第二の治療用細胞、又はそれらの組み合わせをさらに含み、前記第二の治療用細胞が、前記細胞傷害性細胞又は前記第一の治療用細胞に結合した第二のGNC蛋白質を含む、請求項37の治療用組成物。

【発明の詳細な説明】

【関連出願への相互参照】

【0001】

この出願は、2018年3月27日出願の米国仮特許出願第62648888号及び2018年3月27日出願の米国仮特許出願第62648880号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。

【技術分野】

【0002】

本願は、典型的には、免疫細胞及び腫瘍細胞の両方の表面分子に対する多重特異的な結合活性を有するガイダンス及びナビゲーションコントロール（Guidance and Navigation Control、GNC）蛋白質の技術分野に関し、より詳細には、GNC蛋白質の生産及び使用に係り、さらに詳細には、GNC蛋白質の生産及び使用に関する。

【背景技術】

【0003】

がん細胞は、免疫システムを回避するためのさまざまな戦略を実施する。免疫エスケープの根底にあるメカニズムの1つは、免疫系によるがん細胞の認識の低下である。がん特異的抗原の欠陥のある提示又はその欠如は、免疫寛容及びがんの進行をもたらす。効果的な免疫認識が存在する場合、腫瘍は他のメカニズムを使用して免疫系による排除を回避する。免疫能のある腫瘍は抑制性の微小環境を作り出し、免疫応答をダウンレギュレートする。腫瘍細胞、制御性T細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、間質細胞、その他の細胞型など、抑制性の腫瘍微小環境の形成には複数のプレーヤーが関与している。免疫応答の抑制は、免疫抑制性サイトカインの分泌又は局所環境からの不可欠な生存因子の除去を介して、細胞接触依存型及び細胞接触非依存型で実行され得る。細胞接触依存性抑制は、細胞表面に発現する分子（例えば、プログラムドデスリガンド1（PD-L1）、Tリンパ球関連蛋白質4（CTLA-4）、及び他の分子）に依存している（Dunn, Old et al. 2004, Adachi and Tamada 2015）。

【0004】

腫瘍が免疫系による認識を回避するメカニズムがよりよく理解され続けるにつれて、これらのメカニズムを標的とする新しい治療法が最近現れてきた。2011年3月25日に、米国食品医薬品局（FDA）は、切除不能又は転移性メラノーマの治療のためのイピリムマブ注射（ヤーボイ、ブリストル・マイヤーズスクイブ）を承認した。ヤーボイは、活性化T細胞に発現する細胞傷害性Tリンパ球関連蛋白質4（CTLA-4）に結合し、CTLA-4と抗原提示細胞のCD80/86との相互作用をブロックし、それにより、CTLA-4を介してT細胞に送達されるネガティブ又は阻害シグナルをブロックし、多くの患者で腫瘍の根絶につながる抗原特異的T細胞の再活性化をもたらす。数年後の2014年、FDAは進行性メラノーマの治療薬としてキイトルーダ（ペンブロリズマブ、メルク）とオプジーボ（ニボルマブ、ブリストルマイヤーズスクイブ）を承認した。これらのモノクローナル抗体は、活性化及び/又は疲弊T細胞で発現するPD-1に結合し、腫瘍で発現したPD-L1とPD-1の相互作用をブロックし、それにより、PD-1を介したT細胞への阻害シグナルが除去され、その結果、抗原特異的T細胞が再活性化され、多くの患者で再び腫瘍が根絶される。それ以降、進行性メラノーマの治療において、単一のモノクローナル抗体ヤーボイをモノクローナル抗体ヤーボイとオプジーボの組み合わせと比較する追加の臨床試験が実施され、抗体の組み合わせで治療された患者の全生存期間と無増悪生存期間の改善を示した（Hodi, Chesney et al. 2016, Hellmann, Callahan et al. 2018）。但し、多くの臨床試験では、1つ以上の免疫チェックポイント分子に特異的なモノクローナル抗体でがん患者を治療することの大きな利点が示され、抗原特異的T細胞によって認識される新規T細胞エピトープを生成する高い変異負荷を有する患者のみが臨床反応を示すというデータが浮かび上がってきた（Snyder, Makarov et al. 2014）。腫瘍の変異負荷が低い患者は、目的の臨床反応をほとんど示さない（Snyder, Makarov et al. 2014, Hellmann, Callahan et al. 2018）。

【0005】

近年、他のグループは、T細胞を活性化する抗原提示細胞によるネオエピトープ提示の存在を必要としない代替アプローチを開発した。一例は、二重特異性抗体の開発である。ここで、腫瘍関連抗原（例えば、CD19）に特異的な抗体の結合ドメインが、T細胞上のCD3に特異的な抗体結合ドメインにリンクされ、従って、二重特異性T細胞エンゲージャー又はBiTe分子を生成する。2014年、FDAは、前駆体B細胞急性リンパ芽球性白血病の治療のためにブリナツムマブ（Blinatumumab）と呼ばれる二重特異性抗体を承認した。ブリナツムマブは、白血病細胞に発現するCD19に特異的な短鎖可変フラグメント（scFv）とT細胞に発現するCD3に特異的なscFvをリンクする（Benjamin and Stein 2016）。但し、再発又は難治性のALL患者の初期応答率が＞50％にもかかわらず、多くの患者はブリナツムマブ療法又はブリナツムマブによる治療の成功後の再発に抵抗力がある。ブリナツムマブに対する耐性またはブリナツムマブ治療後の再発は、活性化T細胞に発現するPD-1を介して抑制シグナルを駆動するPD-L1などの腫瘍細胞に発現する免疫チェックポイント阻害分子の発現に起因するという証拠が現れてきている（Feucht, Kayser et al. 2016）。ブリナツムマブによる治療に抵抗性を示した患者の事例研究では、モノクローナル抗体（ペンブロリズマブ（キートルーダ、メルク））を追加して、ブリナツムマブ療法のセカンドラウンドが行われた。ブリナツムマブは、PD-1に特異的に結合し、T細胞発現PD-1と腫瘍細胞発現PD-L1との相互作用をブロックし、1人の患者では、劇的な反応が起こり、骨髄の腫瘍細胞が45％から5％未満に減少した（Feucht, Kayser et al. 2016）。これらの結果は、二重特異性BiTe分子を1つ以上のモノクローナル抗体と組み合わせることにより、いずれかの薬剤単独と比較して臨床活性が顕著に向上し得ることを示す。有望な結果が得られているにもかかわらず、複数の臨床試験や、代表集団の募集の困難性のために、併用療法に至るまでの費用が高額になることが予想されている。

【0006】

キメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）による養子細胞療法は、がん治療のためのもう一つの有望な免疫療法である。CAR-T療法の臨床的成功により、CD19陽性の治療抵抗性B細胞悪性腫瘍患者の耐久性のある完全寛解と生存期間の延長が明らかにされている（Gill and June 2015)。しかしながら、パーソナライズされ且つ遺伝子的に改変されたCAR-T免疫療法の生産に関連するコスト及び複雑さのために、その生産及び使用は、比較的少数の患者を治療するための専門センターに制限されている。サイトカインストームとしても知られるサイトカイン放出症候群（CRS）は、人工CAR-T細胞の注入後の主な副作用と考えられる（Bonifant, Jackson et al. 2016)。多くの場合、CRSの発症及び重症度は、患者個人に特有であるように思われる。CRSを緩和する現在の選択肢は、T細胞注入前にCRSをコントロールする選択肢が限られているため、迅速な対応及び管理ケアに主に焦点が当てられている。

【0007】

CD19陽性B細胞悪性腫瘍に特異的なCAR-T療法の有効性は現在明確に確立されているが、固形腫瘍に対するCAR-T療法の有効性は現在のところ明確に示されていない。現在、多くの臨床試験が進行中であり、CAR-T療法のために様々な固形腫瘍関連抗原（TAA）を探索している。腫瘍への非効率的なT細胞トラフィッキング、免疫抑制性の腫瘍微小環境、サブオプショナル抗原認識特異性、及び治療関連有害事象のコントロールの欠如は、現在、固形腫瘍CAR-T療法の主要な障害と考えられている（Li, Li et al. 2018）。治療効果だけでなく、CAR-T細胞注入前後の任意の有害事象を管理する選択肢は限られている。

【発明の概要】

【0008】

本願は、とりわけ、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質を含む治療用組成物の生産方法、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質を用いたがん状態の治療方法、及びGNC蛋白質又はGNC蛋白質で被覆（又は結合）された細胞傷害性細胞を有する治療用組成物を提供する。

【0009】

一側面において、本願は、治療用組成物を提供する。一実施形態では、治療用組成物は、細胞傷害性細胞、GNC蛋白質、及び治療用細胞を含む。治療用細胞は、細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞に結合したGNC蛋白質を含み、治療用細胞組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA及びRNAを実質的に含まない。

【0010】

一実施形態では、治療用組成物は、第二のGNC蛋白質、第二の治療用細胞、又はそれらの組み合わせをさらに含み、ここで、前記第二の治療用細胞は、前記第二のGNC蛋白質が結合しているか、又は前記第一のGNC蛋白質と前記第二のGNC蛋白質の両方が結合している細胞傷害性細胞を有する。

【0011】

GNC蛋白質は、細胞傷害性結合部位とがん標的化部位とを含む。細胞傷害性結合部位は、細胞傷害性細胞受容体に対する結合特異性を有し、細胞傷害性細胞受容体との結合により細胞傷害性細胞を活性化するように構成されている。がん標的化部位は、がん細胞受容体に対する結合特異性を有する。

【0012】

一実施形態では、GNC蛋白質は、T細胞受容体に対する結合ドメインを含む。例示的なT細胞受容体は、限定されないが、CD3、CD28、PDL1、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40L、VISTA、ICOS、BTLA、Light、CD30、NKp30、CD28H、CD27、CD226、CD96、CD112R、A2AR、CD160、CD244、CECAM1、CD200R、TNFRSF25 (DR3)、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、GNC蛋白質は、T細胞結合部位をT細胞上のT細胞受容体に結合させることにより、T細胞を活性化できる。一実施形態では、GNC蛋白質は、T細胞上の複数のT細胞結合部位を結合させることによってT細胞を活性化できる。

【0013】

一実施形態では、GNC蛋白質は、NK細胞受容体に対する結合ドメインを含む。例示的なNK細胞受容体は、限定されないが、CD16、NKG2D、KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS4、KIR3DS1、NKG2C、NKG2E、NKG2HなどのNK細胞の活性化のための受容体、NKp30a、NKp30b、NKp46、NKp80、DNAM-1、CD96、CD160、4-1BB、GITR、CD27、OX-40、CRTAMなどのアゴニスト受容体、及びKIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、NKG2A、NKp30c、TIGIT、SIGLEC7、SIGLEC9、LILR、LAIR-1、KLRG1、PD-1、CTLA-4、CD161などのアンタゴニスト受容体を含む。

【0014】

一実施形態では、GNC蛋白質は、マクロファージ受容体に対する結合ドメインを含む。例示的なマクロファージ受容体は、限定されないが、TLR2、TLR4、CD16、CD64、CD40、CD80、CD86、TREM-1、TREM-2、ILT-1、ILT-6a、ILT-7、ILT-8、EMR2、Dectin-1、CD69などのマクロファージ上のアゴニスト受容体、CD32b、SIRPα、LAIR-1、VISTA、TIM-3、CD200R、CD300a、CD300f、SIGLEC1、SIGLEC3、SIGLEC5、SIGLEC7、SIGLEC9、ILT-2、ILT-3、ILT-4、ILT-5、LILRB3、LILRB4、DCIRなどのアンタゴニスト受容体、及びCSF-1R、LOX-1、CCR2、FRβ、CD163、CR3、DC-SIGN、CD206、SR-A、CD36、MARCOなどの他の表面受容体を含む。

【0015】

一実施形態では、GNC蛋白質は、樹状細胞受容体に対する結合ドメインを含む。例示的な樹状細胞受容体は、限定されないが、TLR、CD16、CD64、CD40、CD80、CD86、HVEM、CD70などの樹状細胞上のアゴニスト受容体、VISTA、TIM-3、LAG-3、BTLAなどのアンタゴニスト受容体、及びCSF-1R、LOX-1、CCR7、DC-SIGN、GM-CSF-R、IL-4R、IL-10R、CD36、CD206、DCIR、RIG-1、CLEC9A、CXCR4などの他の表面受容体を含む。

【0016】

一実施形態では、GNC蛋白質は、T細胞結合部位及びがん標的化部位を含んでもよい。一実施形態では、T細胞結合部位は、CD3、CD28、PDL1、PDL2、PD1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40L、VISTA、ICOS、BTLA、Light、CD30、CD27、又はそれらの組み合わせを含むT細胞受容体への結合特異性を有する。一実施形態では、がん標的化部位は、がん細胞受容体への結合特異性を有する。一実施形態では、がん細胞受容体は、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、まだ発見されていない腫瘍関連抗原、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

【0017】

一実施形態では、GNC蛋白質は、T細胞及び腫瘍細胞の表面分子に対する多重特異的抗原結合活性を有していてもよい。一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、T細胞活性化受容体に対する結合ドメイン、腫瘍関連抗原に対する結合ドメイン、免疫チェックポイント受容体に対する結合ドメイン、及びT細胞共刺激受容体に対する結合ドメインを含む。

【0018】

一実施形態では、腫瘍関連抗原に対する結合ドメインは、T細胞共刺激受容体に対する結合ドメインに隣接していない。一実施形態では、T細胞活性化受容体に対する結合ドメインは、腫瘍関連抗原（TAA）に対する結合ドメインに隣接している。

【0019】

T細胞活性化受容体は、限定されないが、CD3を含んでもよい。T細胞共刺激性受容体は、限定されないが、4-1BB、CD28、OX40、GITR、CD40L、ICOS、Light、CD27、CD30、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。免疫チェックポイント受容体は、限定されないが、PD-L1、PD-1、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、BTLA、VISTA、PDL2、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

【0020】

腫瘍関連抗原（TAA）は、限定されないが、ROR1、CD19、EGFRVIII、BCMA、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、CEA、HER2、EGFR、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ROR1であってもよい。一実施形態では、腫瘍関連抗原はCD19であってもよい。一実施形態では、腫瘍関連抗原はEGFRVIIIであってもよい。

【0021】

一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、抗体又は抗体モノマー又はそのフラグメントであってもよい。一実施形態では、GNC蛋白質は、三重特異性抗体であってもよい。一実施形態では、GNC蛋白質は、四重特異性抗体であってもよい。一実施形態では、GNC蛋白質は、Fcドメイン又はそのフラグメントを含む。抗体からの任意のFcドメインを使用してもよい。例示的なFcドメインは、IgG、IgA、IgD、IgM、IgE、又はそれらのフラグメントもしくは組み合わせからのFcドメインを含んでもよい。Fcドメインは、天然又は人工的なものであってもよい。一実施形態では、Fcドメインは、抗原結合部位を含んでもよい。

【0022】

一実施形態では、GNC蛋白質は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、又はそれらの組み合わせを含み、GNC蛋白質上に最大8個の結合モチーフをもたらす。抗体、抗体モノマー、その抗原結合断片の例が本明細書に開示されている。一実施形態では、GNC蛋白質は、2つの重鎖及び2つの軽鎖を有する免疫グロブリンG（IgG）部位を含み、少なくとも2つのscFv部位は、重鎖又は軽鎖のC末端又はN末端のいずれかに共有結合で接続されている。IgG部位は、scFv部位に安定性を提供してもよく、三重特異性GNC蛋白質は、T細胞上の表面分子を結合するための2つの部位を有してもよい。

【0023】

一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、抗体であってもよい。一実施形態では、腫瘍関連抗原は、ROR1、CD19、又はEGRFVIIIを含む。一実施形態では、T細胞活性化受容体はCD3を含み、CD3に対する結合ドメインは、リンカーを介して腫瘍関連抗原（TAA）に対する結合ドメインに連結し、CD3-TAAペアを形成してもよい。一実施形態では、IgG Fcドメインは、CD3-TAAペア及び免疫チェックポイント受容体に対する結合ドメインを仲介してもよい。一実施形態では、免疫チェックポイント受容体は、PD-L1であってもよい。

【0024】

リンカーは、共有結合又はペプチドリンカーであってもよい。一実施形態では、ペプチドリンカーは、約2から約100アミノ酸残基を有していてもよい。

【0025】

一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、N末端及びC末端を有し、N末端からC末端へタンデムに、CD3に対する結合ドメイン、EGFRVIIIに対する結合ドメイン、IgG Fcドメイン、PD-L1に対する結合ドメイン、及び41-BBに対する結合ドメインを含む。

【0026】

一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、N末端及びC末端を有し、N末端からC末端へタンデムに、4-1BBに対する結合ドメイン、PD-L1に対する結合ドメイン、IgG Fcドメイン、ROR1に対する結合ドメイン、及びCD3に対する結合ドメインを含む。一実施形態では、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、N末端及びC末端を有し、N末端からC末端へタンデムに、CD3に対する結合ドメイン、CD19に対する結合ドメイン、IgG Fcドメイン、PD-L1に対する結合ドメイン、及び4-1BBに対する結合ドメインを含む。

【0027】

一実施形態では、GNC蛋白質は、配列番号50、52、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、及び110に対するパーセンテージ相同性を有するアミノ酸を含む。パーセンテージ相同性は70％、80％、90％、95％、98％、又は99％未満ではない。

【0028】

別の側面において、本願は、開示されたGNC蛋白質又はその断片をコードする核酸配列を提供する。一実施形態では、核酸は、配列番号49、51、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、及び109に対するパーセンテージ相同性を有する。パーセンテージ相同性は、70％、80％、90％、95％、98％、又は99％未満ではない。

【0029】

別の側面において、本願は、治療用組成物の生産方法を提供する。一実施形態では、この方法は、細胞傷害性細胞を含む細胞材料を提供する工程、細胞材料を第一のGNC蛋白質とインキュベートし、活性化細胞組成物を提供する工程、及び活性化細胞組成物を調製し、治療用組成物を提供する工程を含んでもよい。活性化細胞組成物は、第一の治療用細胞を含む。第一の治療用細胞は、第一の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞に結合した第一のGNC蛋白質を含む。治療用組成物は、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA又はRNAを実質的に含まない。

【0030】

一実施形態では、細胞材料は、PBMCを含むか、又は由来する。

【0031】

第一のGNC蛋白質は、第一の細胞傷害性結合部位及び第一のがん標的化部位を含んでもよい。第一の細胞傷害性結合部位は、第一の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、第一の細胞傷害性細胞受容体との結合を介して第一の細胞傷害性細胞を活性化するように構成されている。第一のがん標的化部位は、第一のがん細胞受容体に対する特異性を有する。

【0032】

一実施形態では、方法は、第二のGNC蛋白質と活性化細胞組成物をインキュベートすることによってインキュベート工程を繰り返してもよい。第二のGNC蛋白質は、第二の細胞傷害性結合部位及び第二のがん標的部位を含み、第二の細胞傷害性結合部位は、第二の細胞傷害性細胞受容体に対する特異性を有し、及び第二のがん標的部位は、第二のがん細胞受容体に対する特異性を有する。活性化細胞組成物は、第二の治療用細胞を含み、且つ第二の治療用細胞は、第二の細胞傷害性細胞受容体との結合相互作用を介して細胞傷害性細胞又は第一の治療用細胞に結合した第二のGNC蛋白質を含む。

【0033】

一実施形態では、第一及び第二のがん標的化部位は独立してCD19、PDL1、又はそれらの組み合わせに対する特異性を有する。一実施形態では、第一及び第二の細胞傷害性結合部位は独立してCD3、PDL1、41BB、又はそれらの組み合わせに対する特異性を有する。

【0034】

方法は、追加のGNC蛋白質と活性化組成物をインキュベートすることによって繰り返しインキュベートする工程をさらに含んでもよい。追加のGNC蛋白質は、第三のGNC蛋白質、第四のGNC蛋白質などであってもよく、それぞれが細胞傷害性細胞に結合した追加の蛋白質を有する追加の治療用細胞を提供する。

【0035】

第一、第二、及び追加のGNC蛋白質は、同じであってもよく、異なってもよい。治療用細胞は、1つのGNC蛋白質、複数の同じGNC蛋白質、又はそこに結合した複数の異なるGNC蛋白質を有していてもよい。一実施形態では、治療用細胞は、そこに結合した第一のGNC蛋白質を有してもよい。一実施形態では、治療用細胞は、そこに結合した第一び第二のGNC蛋白質の両方を有してもよい。一実施形態では、治療用細胞は、そこに結合した第一、第二、及び追加のGNC蛋白質を有してもよい。

【0036】

一実施形態では、治療用細胞は、少なくとも1つの結合したGNC蛋白質を有する細胞傷害性細胞を含む。一実施形態では、治療用細胞は、少なくとも10、20、50、100、200、300、400の結合したGNC蛋白質を有する細胞傷害性細胞を含む。

【0037】

治療用組成物は、第一の治療用細胞、第一のGNC蛋白質、細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、治療用組成物は、第二の治療用細胞、第二のGNC蛋白質、第一の治療用細胞、第一のGNC蛋白質、細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、治療用組成物は、追加のGNC蛋白質及び追加の治療用細胞を含んでもよい。

【0038】

一実施形態では、インキュベート工程は、治療用細胞をエクスパンドさせるのに役立つ。一実施形態では、治療用細胞をエクスパンドする工程は、治療用細胞と追加量のGNC蛋白質をインキュベートし、エクスパンド細胞集団を提供する工程を含んでもよい。一実施形態では、エクスパンド細胞集団は、1ml当たり少なくとも10²、少なくとも10³、少なくとも10⁴、少なくとも10⁵、少なくとも10⁶、少なくとも10⁷、少なくとも10⁸、少なくとも10⁹、少なくとも10¹⁰個の細胞を含む。一実施形態では、エクスパンド細胞集団は、GNC結合細胞、GNC蛋白質、細胞傷害性細胞、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、PD-1+ T細胞を消耗させるために、GNC蛋白質を増殖培地に追加して、PD-1+ T細胞に殺傷をリダイレクトし、PD-1+疲弊T細胞を減少させてもよい。一実施形態では、PD-1+ T細胞を優先的にサポートするために、GNC蛋白質を増殖培地に追加して、T細胞上のPD-1を介したチェックポイントシグナル伝達を軽減し、PD-1+ T細胞の機能を改善してもよい。一実施形態では、第3世代CAR-Tを介した4-1BB媒介共刺激をアイソレートするために、GNC蛋白質を増殖培地に追加して、4-1BB+ T細胞に殺傷をリダイレクトするか、CAR-T細胞などの治療用細胞で4-1BB刺激のレベルを制御する治療組成物を得てもよい。

【0039】

一実施形態では、がん標的化部位は、B細胞に対する特異性を有し、治療用組成物は、B細胞を実質的に含まない。従って、本明細書に開示の方法は、治療用細胞のための活性化と精製の機能をカップルさせ、これにより、任意の外来材料（ビーズなど）や任意の外来遺伝材料（ウイルス及び非ウイルスDNA又はRNAベクターなど）を導入する必要なく、B細胞を含まない治療用組成物を生産することが可能になる。

【0040】

一実施形態では、細胞材料をGNC蛋白質とインキュベートするときの、GNC蛋白質と細胞傷害性細胞との比は、少なくとも30対1である。

【0041】

一実施形態では、治療用組成物は、1ml当たり少なくとも10⁷個の細胞を含んでもよい。

【0042】

さらなる側面では、本願は、がん治療のためのガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質の使用方法を提供する。一実施形態において、がんを有する対象の治療方法は、細胞傷害性細胞を提供する工程、GNC蛋白質と細胞傷害性細胞を結合させ、治療用細胞を提供する工程、任意に治療用細胞をエクスパンドしてエクスパンド細胞集団を提供する工程、及び治療用細胞又はエクスパンド細胞集団を対象に投与する工程を含む。

【0043】

一実施形態では、方法は、細胞傷害性細胞を含む細胞材料を提供する工程、細胞材料を第一のGNC蛋白質とインキュベートし、活性化細胞組成物を提供する工程、ここで、活性化細胞組成物が第一の治療用細胞を含み、活性化細胞組成物を調整し、治療用組成物を提供する工程、ここで、治療用組成物が、外因性ウイルス及び非ウイルス性DNA又はRNAを実質的に含まない、及び治療用組成物を対象に投与する工程、を含む。

【0044】

一実施形態では、方法は、第二のGNC蛋白質を活性化細胞組成物とインキュベートし、第二の治療用細胞をさらに含む活性化細胞組成物を提供する工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、方法は、追加のGNC蛋白質を活性化細胞組成物とインキュベートし、追加の治療用細胞をさらに含む活性化細胞組成物を提供する工程をさらに含んでもよい。

【0045】

一実施形態では、方法は、細胞傷害性細胞を提供する前に、末梢血単核細胞（PBMC）から細胞傷害性細胞を単離する工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、方法は、血液から末梢血単核細胞（PBMC）を単離する工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、血液は、対象由来である。一実施形態では、血液は対象由来ではない。一実施形態では、細胞傷害性細胞は、治療中の患者由来であってもよいし、ユニバーサルドナーなどの別の個体由来であってもよい。

【0046】

一実施形態では、細胞傷害性細胞は、自家T細胞、アロ反応性T細胞、又はユニバーサルドナーT細胞であってもよい。一実施形態では、自家ドナーT細胞が使用される場合、コンタミネーションされたがん細胞の注入を防止するために、GNC蛋白質を増殖培地に追加し、腫瘍抗原に殺傷をリダイレクトしてもよく、例示的な腫瘍抗原は、B細胞悪性腫瘍のCD19、乳がんのEpcam、メラノーマのMCP1を含んでもよい。

【0047】

一実施形態では、方法は、対象者由来の血液を提供する工程、血液から末梢血単核球（PBMC）を単離する工程、PBMCから細胞傷害性細胞を単離する工程、GNC蛋白質を細胞傷害性細胞と結合させ、治療用細胞を提供する工程と、任意に治療用細胞をエクスパンドしてエクスパンド細胞集団を提供する工程、及び治療用細胞又はエクスパンド細胞集団を対象者に投与する工程を含む。

【0048】

一実施形態では、方法は、治療用組成物を対象に投与した後に、追加のGNC蛋白質を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、細胞傷害性細胞は、CD3+ T細胞、NK細胞、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。

【0049】

一実施形態では、細胞傷害性細胞の単離は、細胞傷害性細胞の少なくとも1つのサブ集団を単離し、治療用T細胞を提供する工程を含む。一実施形態では、細胞傷害性細胞のサブ集団は、CD4+細胞、CD8+細胞、CD56+細胞、CD69+細胞、CD107a+細胞、CD45RA+細胞、CD45RO+細胞、CD2+細胞、CD178+細胞、Granzyme+細胞、又はそれらの組み合わせを含む。

【0050】

一実施形態では、GNC蛋白質と細胞傷害性細胞の結合は、約2時間から約14日間、約1日から約7日間、約8時間から約24時間、約4日から約7日間、又は約10日から約14日間の期間、GNC蛋白質を細胞傷害性細胞とインキュベートする工程を含む。一実施形態では、インキュベーション期間は約14日超であってもよい。一実施形態では、インキュベーション期間は、2時間未満であってもよい。

【0051】

一実施形態では、GNC蛋白質と細胞傷害性細胞の比は、少なくとも600対1、500対1、400対1、300対1、200対1、100対1、又は1対1である。一実施形態では、GNC蛋白質と細胞傷害性細胞の間の比率は、約1対1、約10対1、約100対1、又は約1000対1の比率である。

【0052】

一実施形態では、方法は、投与工程の後に治療効果を評価する工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、治療効果を評価する工程は、がんの1つ以上のバイオマーカーをチェックする工程、治療用細胞のライフスパンをモニターする工程、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、治療効果を評価する工程は、がんの1つ以上のバイオマーカーをチェックする工程、治療用細胞のライフスパンをモニターする工程、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、バイオマーカーは、腫瘍抗原、サイトカイン、例えば、ガンマインターフェロン、IL-2、IL-8、及び/又はケモカインの放出、及び/又は様々な細胞型の表面上のCDマーカー、例えば、CD69、PD-1、TIGIT、及び/又は死滅時の腫瘍、循環腫瘍細胞によって血流に放出される変異核酸、及びその関連核酸、又はエキソソーム関連核酸、宿主炎症性メディエーター、又は腫瘍由来分析物、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、バイオマーカーは、腫瘍抗原、腫瘍関連アポトーシス小体、低分子代謝物、サイトカインの放出、リンパ球表面マーカー発現、リン酸化/脱リン酸化シグナル分子、転写因子、又はそれらの組み合わせを含む。

【0053】

本明細書に開示の方法は、細胞傷害性細胞をDNAベクター又はウイルスベクターでトランスフェクトする工程を含まない。一実施形態では、治療用細胞又はエクスパンド細胞集団は、DNAベクター又はウイルスベクターを実質的に含まない。

【0054】

本発明の方法は、がんに罹患しているヒト対象を治療するために使用できる。一実施形態では、がんは、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、BCMA、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30、CD19、まだ同定されていない腫瘍関連抗原、又はそれらの組み合わせを発現する細胞を含む。一実施形態では、方法は哺乳類を治療するために使用されてもよい。

【0055】

本明細書に開示の方法を用いて、様々ながんを治療してもよい。例示的ながんは、限定されないが、乳がん、大腸がん、肛門がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、頭頸部がん、鼻咽頭がん、皮膚がん、メラノーマ、卵巣がん、前立腺がん、尿道がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、脳腫瘍、グリオーマ、ニューロブラストーマ、食道がん、胃がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、甲状腺がん、眼がん、サルコーマ、骨がん、白血病、ミエローマ又はリンパ腫を含む。

【0056】

一実施形態では、方法は、治療用細胞又はエクスパンド細胞集団を対象に投与した後、有効量の治療剤を投与する工程をさらに含んでもよい。一実施形態では、治療剤は、モノクローナル抗体、化学療法剤、酵素、蛋白質、共刺激剤、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、共刺激剤は、対象における細胞傷害性T細胞の量を増加させるように構成されている。

【0057】

本願はさらに、有効濃度のGNC蛋白質を含む溶液を提供する。一実施形態では、溶液は、治療中の対象の血漿である。一実施形態では、溶液は、細胞に結合したGNC蛋白質を含む。一実施形態では、溶液は、GNC蛋白質を含むGNCクラスター、GNC蛋白質のT細胞結合部位に結合したT細胞、及びGNC蛋白質のがん標的化部位に結合したがん細胞を含む。

【0058】

本願の目的及び利点は、添付の図面に関連して、好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0059】

本明細書の開示の前述及び他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明及び添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。図面は、本明細書の開示に従って用意されたいくつかの実施形態のみを示しており、従って、その範囲を限定するものと見なされるべきではなく、本明細書の開示は、添付の図面の使用を通じてさらなる特異性及び詳細が説明されるであろう。

【0060】

【図1】図1は、CD19陽性細胞への標的特異性を有する抗体構造における、4つの抗原特異的結合ドメインを含むGNC蛋白質を示す。

【図2】図2は、四重特異性GNC抗体がT細胞と腫瘍細胞の間の多重特異的結合を媒介することを示す。

【図3】図3は、GNC-T細胞療法（左）とCAR-T細胞療法（右）の製造工程を比較したフローチャートである。

【図4】図4は、GNC活性化治療用細胞組成物を調製するための細胞材料のソースを示す図である。

【図5】図5は、GNC活性化治療用組成物を調製するための選択されたT細胞のソースを示す図である。

【図6】図6は、GNC活性化治療用T細胞組成物の調製を示す図である。

【図7】図7は、GNC-T細胞療法用の第一のGNC活性化T細胞を調製するためのインキュベート及び調整工程を示す図である。

【図8】図8は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がPBMCからIL-2分泌を誘導することを示す図である。

【図9】図9は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がPBMCからのグランザイムB分泌を誘導することを示す。

【図10】図10は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD4+ T細胞において活性化マーカーCD69の発現を誘導することを示す。

【図11】図11は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD8+ T細胞において活性化マーカーCD69の発現を誘導することを示す。

【図12】図12は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD56+ NK細胞において活性化マーカーCD69の発現を誘導することを示す。

【図13】図13は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD4+ T細胞において細胞傷害性脱顆粒マーカーCD107aの発現を誘導することを示している。

【図14】図14は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD8+ T細胞において細胞傷害性脱顆粒マーカーCD107aの発現を誘導することを示す。

【図15】図15は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD56+ NK細胞において細胞傷害性脱顆粒CD107aのマーカーの発現を誘導することを示す。

【図16】図16は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD3+ T細胞を活性化し、増殖させることを示す。

【図17】図17は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がCD3+ T細胞を活性化し、ガンマインターフェロンを分泌させることを示す。

【図18】図18は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がナイーブCD8+/CD45RA+ T細胞を活性化し、増殖させることを示す。

【図19】図19は、GNC蛋白質（SI-35Eクラス）がナイーブCD8+/CD45RA+ T細胞を活性化し、ガンマインターフェロンを分泌させることを示す。

【図20】図20は、6ウェルG-RexプレートにおけるGNC活性化細胞の経時的な増殖の画像を示す。

【図21】図21は、本明細書に開示の治療用組成物の例示的な生産方法(A)、及び解凍後のPBMC、GET及びGNC-T細胞の細胞生存率(B)を示す。

【図22】図22は、PBMC由来の、第一のGNC（SI-38E17）活性化治療用細胞組成物（製品A）（22A）、第二のGNC（SI-38E17）被覆治療用細胞組成物（製品B）（22B）、及びインプットPBMC細胞材料（22C）のフローサイトメトリー分析の結果を示す。

【図23】図23は、解凍後のG-Rex 100MバイオリアクターからのGET細胞及び調整GNC-T細胞のGNC-T治療用細胞組成物を示す。

【図24】図24は、GNC（SI-35Eクラス）被覆PBMC細胞を用いたCHO-ROR1細胞のRTCCの結果を示す。

【図25】図25は、前駆体B細胞白血病Kasumiの殺傷に関する、PBMC由来のSI-38E17 GNC活性化治療用細胞の経時的な動態を示す。

【図26】図26は、PMBC由来のSI-38E17 GNC活性化治療用細胞を用いたNalm-6、MEC-1、Daudi、及びJurkat細胞の殺傷効果を示す。

【図27】図27は、スパイクインモデルにおけるPBMC由来のSI-38E17 GNC活性化治療用細胞を用いたNalm-6、MEC-1、Daudi、及びJurkat白血病細胞の殺傷を示す。

【発明を実施するための形態】

【0061】

以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付図面を参照する。図面では、文脈からそうでないことが示されない限り、同様の記号は通常は、同様のコンポーネントを識別する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意図していない。本明細書に提示される主題の精神又は範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加えることがしてもよい。本明細書に一般的に記載され、図に示される本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、及び設計できることは容易に理解されよう。これらはすべて本明細書で明確に検討されている。

【0062】

一実施形態において、ガイダンス及びナビゲーションコントロール（GNC）蛋白質は、複数の抗原特異的結合ドメイン（AgBD）の組成によって、及びT細胞及び腫瘍細胞上の複数の表面分子の結合を介して、T細胞（又は他のエフェクター細胞）をがん細胞（又はバイスタンダーサプレッサー細胞などの他の標的細胞）に誘導（directing）する能力によって特徴付けられる。一実施形態では、GNC蛋白質は、表1に示されるように、T細胞上の少なくとも1つの表面分子を結合するための部位1、及びがん細胞上の少なくとも1つの表面抗原を結合するための部位2から構成される。図1は、図2に示すような、CD3、PD-L1、及び/又は4-1BBを発現するT細胞及びCD19を発現する標的B細胞の両方に結合するためのAgBDを含む例示的な四重特異性GNC抗体の構造を示す。

【0063】

T細胞療法において、細胞傷害性T細胞は、T細胞受容体複合体蛋白質、及びその表面上のアゴニスト受容体又はアンタゴニスト受容体のいずれかを介した共刺激シグナル伝達蛋白質によって制御される。このシグナル伝達、及びT細胞とがん細胞との間の相互作用を制御するために、複数のAgBDsがそれぞれ部位1及び部位2を構成してもよい。部位1及び部位2のアゴニスティック又はアンタゴニスティック結合ドメインによって標的化され得る分子の例は、表1に示されている。一実施形態では、GNC蛋白質は、部位1及び部位2を連結するための少なくとも1つのリンカーを有していてもよい。一例のGNC蛋白質において、任意のリンカー分子は、限定されないが、ビオチン-アビジン、ロイシン-ジッパー、及び任意のツーハイブリッドポジティブ蛋白質を含む、DNA/RNA又は蛋白質-蛋白質相互作用の相補的なリンカーを使用して、インビトロ又はインビボのいずれかで、2つ以上のAgBDを一緒に連結するために使用できる。いくつかの実施形態では、リンカーは、GNC蛋白質及びGNC抗体が同じ意味、例えば、図1の例示的な四重特異性GNC抗体の構造を有するように、抗体バックボーン構造又は抗体フラグメントであってもよい。

【0064】

GNC蛋白質又は抗体は、複数のAgBDの結合能（図2）を介して、T細胞をインビボ又はエクスビボでがん細胞に誘導できる。T細胞は、同じ患者又は異なる個体に由来するものであってもよく、がん細胞は、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで存在するものであってもよい。本願で提供される実施例によれば、養子移植に先立って、細胞傷害性T細胞をエクスビボで活性化及びコントロールするためのT細胞療法、即ちGNC-T細胞療法におけるプライム剤としてのGNC蛋白質を可能にする。

【0065】

本願は、GNC活性化治療用細胞組成物の生産方法に関する。複数のAgBDは、それぞれT細胞及びがん細胞のインターフェイスにより、部位1及び部位2に分けることができる（表1）。2つのAgBDsを有するGNC蛋白質は、T細胞上のCD3などの表面分子と、腫瘍細胞上のROR1などの腫瘍抗原と、T細胞を腫瘍細胞にリダイレクトするために同時に結合してもよい。

【0066】

第三のAgBD、例えば、41BBに特異的に結合するAgBDの追加は、41BBが共刺激因子であり、結合が活性化されたT細胞に対するそのアゴニスト活性を刺激するので、抗CD3誘導T細胞活性化を増強するのに役立ち得る。GNC蛋白質への第四のAgBD、例えば、腫瘍細胞上のPD-L1に特異的に結合するAgBDの追加は、T細胞上のPD-1への結合を介して媒介される腫瘍細胞上のPD-L1の阻害経路をブロックできる。

【0067】

いくつかの実施形態では、これらの基本原理により、GNC蛋白質は、活性化されたT細胞を腫瘍細胞にリダイレクトするだけでなく、インビボでその活性を制御するために、不均等な数のT細胞アンタゴニスト及びアゴニストを特異的に結合するための複数のAgBDsを獲得するように構築される（表2）。従って、いくつかの実施形態では、GNC蛋白質は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、又は八重特異性の蛋白質であってもよい。

【0068】

一実施形態は、本願はGNC-T細胞療法に関し、ここで、GNC蛋白質は、養子移植に先立ってT細胞をエクスビボでエクスパンドさせるために使用される（図3）。自家T細胞のエクスビボプライミングは、細胞傷害性T細胞のガイダンス及びナビゲーションコントロールを提供する。例えば、末梢血単核細胞（PBMC）又はPBMC内の特定のタイプの細胞集団、例えば、CD8+、CD45RO+メモリーT細胞は単離され、そしてGNC蛋白質によってエクスビボでプライミングされてもよい。これらのエクスパンド細胞傷害性T細胞は、調製され、養子移植を介して患者に再び注入され得る。インビボでがんを攻撃している間、細胞傷害性の有効性及びライフスパンを管理するために、追加のGNC蛋白質を患者に注入してもよい。このように、GNC-T細胞療法は、GNC蛋白質を患者に直接投与するGNC蛋白質ベース免疫療法とは異なる。しかしながら、GNC-T細胞療法は、注入された細胞傷害性T細胞の有効性をインビボで制御された様式で管理するために、GNC蛋白質を直接投与することを排除するものではない。追加のGNC蛋白質は、AgBDsの形態に依存して、細胞溶解活性を促進し、T細胞増殖を促進できる。

【0069】

一側面において、本願は、治療用GNC-T細胞の生産に関する。治療用CAR-T細胞の生産と比較、区別するために、一般的なプロセスが、比較目的のために、図3に示されている。CAR-T療法では、細胞材料、例えば、患者白血球がアフェレシスによって収集され、CD3+ T細胞のサブセットが選択及び活性化され、細胞材料への遺伝子導入が促進され、次に、T細胞集団へのサポートのための外来材料スキャフォールドの導入によって、例えば、抗CD3/抗CD28抗体被覆ビーズを使用して、数が増える。有利な点として、GNC-T細胞材料は、患者白血球由来T細胞エクスパンションのためのスキャフォールド不純物の導入を必要としない。

【0070】

CAR-T療法細胞材料は、CAR-TベクターDNAの調製及びトランスフェクションを伴う遺伝子導入を受けなければならず、これによりT細胞のゲノムが遺伝子的に改変される。さらに、これらの遺伝子的に改変されたT細胞は、患者に再び移植される前に、T細胞エクスパンションの別のラウンドを受けてもよい。CAR-TベクターDNAのランダムな統合は、原発性白血病発生を導くT細胞の形質転換のリスク、又はCAR標的抗原の内部隔離のメカニズムによって再発のリスクを増加させる、CAR-Tベクターの白血病細胞への導入のリスクをもたらす（Zhang, Liu et al. 2017）。

【0071】

対照的に、GNC-T細胞療法は、任意のベクターDNAのトランスフェクションを伴わないという利点があり、従って、養子移植の前に遺伝子改変のリスクがなく、これは、既存のCAR-T療法よりも重要な利点及び技術的な改善の一つを提供する。GNC-T細胞療法に外因性ジェネリック材料のコンタミネーションやがんリスクがないという利点に加えて、GNC-T細胞療法の有効性は、図5及び図6に示すように、PBMC又は異なるT細胞サブセットがex vivoでプライミング及び活性化される場合に向上し得る。同様のアプローチは、CAR-T療法の使用において探索されており、このとき、選択された特定比率のT細胞のいくつかのサブセットが患者に戻され得る（Turtle, Hanafi et al. 2016, Turtle, Hanafi et al. 2016）。

【0072】

いくつかの実施形態では、白血病又は他のがん細胞を、細胞エクスパンションに先立って細胞材料から除去することが有益であり得る（図7）。特にB細胞悪性腫瘍由来の、循環白血病細胞を有する患者のPBMCは、細胞組成を大きく変化させ、従って最終的な治療用細胞製品の適合性に影響を与え得る。例えば、高レベルの循環白血病芽球（WBCの10％を超える）は、GNC媒介細胞エクスパンションの前に白血病細胞を枯渇させる必要があるかもしれない。患者に由来するPBMC中の白血病細胞の割合は、細胞分画法を使用して減少させてもよい。これらの方法は、密度勾配分離、又は免疫蛍光細胞分離又は蛍光活性化細胞選別、免疫磁気細胞分離、又はマイクロ流体フローチャンバー法を含むステップを含んでもよい。これらの方法は、遠心分離、細胞洗浄、インキュベーション、又は温度調節に先行してもよい。これらの方法は、非細胞基材（磁気ビーズ、プラスチック、ポリマー）、非細胞基材の修飾（蛋白質、抗体、電荷状態）、抗体処理、多重抗体処理、多重特異的抗原結合蛋白質、及び細胞表面抗原ベース細胞カップリングを利用してもよい。これらの方法は、酵素消化又はイオンキレート化又は機械的撹拌又は細胞容器回転を使用してもよい。白血病芽球の減少方法は、抗体医薬コンジュゲート、又は白血病増感剤を利用してもよい。方法は、これらのアプローチの組み合わせで構成されてもよい。

【0073】

一実施形態では、GNC蛋白質でプライミング（又はコーティング又は結合）された治療用T細胞の生産を可能にするために、四重特異性抗体が生産され、GNC蛋白質として使用される。一実施形態では、四重特異性抗体/GNC蛋白質は、そのバックボーンとして抗体断片によって連結された4つの異なる結合ドメインを含む。1つの結合ドメインは、T細胞上のCD3に特異的であり、第二の結合ドメインは、限定されないが、ROR1、CEA、HER2、EGFR、EGFRvIII、LMP1、LMP2A、メソセリン、PSMA、EpCAM、グリピカン-3、gpA33、GD2、TROP2、BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CD22、CD30を含む腫瘍関連抗原に特異的であり、且つ第三及び第四に対する結合ドメインは、PD-L1、PD-L2、PD-1、OX40、4-1BB、GITR、TIGIT、TIM-3、LAG-3、CTLA4、CD40L、VISTA、ICOS、BTLA、Lightなどの2つの異なる免疫チェックポイントモジュレーターに特異的である。

【0074】

理論に拘束されることなく、従来のCAR-T療法に対するGNC蛋白質媒介GNC-T細胞療法の利点は、限定されないが、以下を含む。第一に、IgG Fcドメインを包含することで、二重特異性BiTe分子と比較して血清中の半減期がより長いという特性を付与できる。第二に、免疫チェックポイントモジュレーターに特異的な2つの結合ドメインを含むことで、抑制経路を阻害し、同時に共刺激経路にエンゲージし得る。第三に、腫瘍に関連する抗原とT細胞上のCD3を架橋させることで、患者からT細胞を除去し、患者に再導入する前に腫瘍細胞に特異的であるように遺伝的に改変する（これはキメラ抗原受容体T細胞（CAR-T）療法としても知られている）必要なしに、T細胞を腫瘍細胞を殺傷するようにリダイレクト及びガイドする。さらに、第四に、GNC蛋白質媒介抗体療法又はT細胞療法が、T細胞の遺伝子改変を伴わないことであり、ここで、後者は、改変されたT細胞をクローンエクスパンション、即ちT細胞白血病に形質転換させるリスクを有し得る。

【0075】

本明細書の開示は、本明細書に含まれる特定の実施形態及び実施例の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解されてもよい。本明細書の開示は、その特定の実施形態の特定の詳細を参照して説明されたが、そのような詳細な説明は、開示の範囲に対する限定とみなされるべきではない。

【実施例】

【0076】

以下の実施例は、説明のために提供されたものであり、限定のために提供されたものではない。当業者であれば、本質的に同じ又は類似の結果を得るために変更又は修正され得る様々な非重要なパラメータを容易に認識するであろう。

【0077】

実施例1：GNC蛋白質及び四重特異性GNC抗体
本願において、GNC蛋白質の例は四重特異性GNC抗体のクラスであり、4つのAgBDsはIgG抗体をバックボーンとして使用して共有結合で連結されている（図1）。この蛋白質のN末端から最初のscFvは、IgG抗体の定常ドメインC_H1、2、及び3のFabドメインに連結され、さらに、C末端で別のscFvに連結されている。scFvドメインのそれぞれが独立した結合特異性を示すため、これらのAgBDsの連結は、IgG抗体の定常ドメインを用いて行う必要はない。四重特異性GNC抗体として構造化されたGNC蛋白質は、腫瘍関連抗原（TAA）に直接結合し、宿主内因性T細胞をエンゲージし、抗原特異的T細胞受容体へのMHCによる腫瘍抗原提示とは独立して、腫瘍細胞を殺傷する（図2）。図1に示すように、CD19は、CD19陽性B細胞及び腫瘍細胞を標的とするTAAである。また、PD-L1は、免疫抑制性の腫瘍微小環境を克服し、腫瘍微小環境内の疲弊T細胞を完全に活性化し得る四重特異性GNC抗体の免疫チェックポイント調節成分の一例である。

【0078】

四重特異性GNC抗体のうち、SI-35Eクラスは、抗ヒトCD3結合ドメイン（配列番号1〜4）、抗ヒトPD-L1（配列番号5〜12）、抗ヒト4-1BB（配列番号13〜24）、及びヒトROR1（配列番号25〜32）、即ちTAAを標的とするものを含む。これに関連して、SI-38E及びSI-39Eのクラスは、それぞれCD19（配列番号47〜50）及びEGFR（配列番号51〜54）を標的とする。

【0079】

四重特異性GNC抗体を構築するために、AgBDsを、GNC蛋白質のN末端ドメイン1（D1）に配置するためのscFv及びVLVH、又はC末端ドメイン3（D3）及び4（D4）に配置するためのscFv及びVHVLで変換した。ここに記載の全てのscFv分子は、V領域の配向（LH又はHL）に関係なく、操作可能にVH及びVLを連結する20アミノ酸のフレキシブルgly-gly-gly-gly-ser (G4S) X4リンカーを含む。四重特異性GNC抗体の残りの位置であるドメイン2（D2）は、IgG1重鎖、VH-CH1-ヒンジ-CH2-CH3、及びその対応する軽鎖VL-CLからなり、これはカッパ鎖又はラムダ鎖のいずれかであり得る。D1及びD2は、D2、D3、D4と同様に、10アミノ酸(G4S)x2リンカーを介して遺伝的に連結されており、連続した〜150kDaの重鎖モノマーペプチドをもたらす。適切な軽鎖と共トランスフェクトした場合、最終的な対称四重特異性GNCペプチドは、IgG1 Fc（Protein A/Protein G）を介して精製でき、機能活性を評価するためにアッセイできる。重鎖及び軽鎖遺伝子の「カセット」は、制限酵素サイト（重鎖はHindIII/NheI、軽鎖はHindIII/BsiWI）又はGibson Assembly (SGI-DNA, La Jolla, CA), Infusion (Takara Bio USA)又はNEBuilder (NEB, Ipswich, MA)などの「制限フリークローニング」のいずれかを使用してV-領域を容易にクローニングできるように以前構築されたが、ここでは後者が使用された。

【0080】

四重特異性GNC抗体は、インタクト分子の設計、各ドメインのヌクレオチド配列の合成及びクローニング、哺乳類細胞での発現、及び最終産物の精製を含むプロセスを経て生産できる。ここでは、ヌクレオチド配列は、Geneious 10.2.3ソフトウェアパッケージ（Biomatters, Auckland, NZ）を用いて組み立てられ、遺伝子合成のためにそれらの構成ドメインに分けられた（Genewiz, South Plainsfield, NJ）。この実施例では、SI-35E18（配列番号65及び67）は、抗41BBのscFvであるVL-VHがD1を占め、抗ヒトPD-L1クローンPL230C6がD2（Fab位置）を占め、抗ヒトROR1 Igドメイン特異的クローン323H7 VHVL scFvがD3を占め、且つ抗ヒトCD3 scFvであるVHVLがC末端D4を占める構成ドメインに分割した。NEBuilderウェブベースツールを用いて、5'及び3'ヌクレオチドを、各ドメインが部位特異的組換えを誘導する20〜30ヌクレオチドでその隣接するドメインとオーバーラップするように、より大きな蛋白質中のそれらの位置に応じて各ドメインに付加した。このようにして、単一遺伝子組み立てステップで各ドメインを遺伝子学的に融合させることができる。四重特異性ヌクレオチド配列における相同領域の数が多いため、N末端ドメイン1及び2は、C末端D3及びD4とは別個に組み立てる。次に、N末端断片及びC末端断片を、第二のNEBuilder反応で一緒に組み立てた。少量のアリコートを大腸菌DH10b（Invitrogen, Carlsbad, CA）に形質転換し、TB+カルベニシリン100ug/mlプレート（Teknova, Hollister, CA）にプレートし、37℃で一晩インキュベートした。結果として得られたコロニーを選択し、2mLの一晩培養物をTB+カルベニシリンに播種した。一晩培養物からDNAを調製し（Thermo-Fisher, Carlsbad, CA）、各ドメインに隣接するプライマー（Sigma,St. Louis, MO）を用いて配列決定を行った（Genewiz, South Plainsfield, NJ）。全てのDNA配列は、Geneiousで組み立てられ、解析された。

【0081】

別の四重特異性GNC蛋白質、ヒトCD19を標的とするSI-38E17（配列番号47〜50）において、複数のAgBDsは、抗ヒト4-1BB（scFv 466F6、配列番号17〜20）、及び抗ヒトPD-L1（scFv PL221G5、配列番号9〜13）、及び抗ヒトCD3結合ドメイン（配列番号1〜4）を有する。この四重特異性抗体を生産するための方法及び手順は同じであった。

【0082】

GNC蛋白質は、T細胞上の少なくとも1つの表面分子を結合するための部位1、及びがん細胞上の少なくとも1つの表面抗原を結合するための部位2を含む（表1A）。四重特異性GNC抗体は、体の内因性T細胞に直接エンゲージし、抗原特異的T細胞受容体へのMHCによる腫瘍抗原提示とは独立して、腫瘍細胞を殺傷するために使用できる。これは、抗原認識によって制限されてきた免疫チェックポイント遮断のみに基づく治療とは対照的である。状況に応じて、免疫チェックポイントモジュレーター成分は、四重特異性GNC抗体の一部として構築されてもよく、これは、標準的なチェックポイント遮断療法と同様の利点を提供し得る。

【0083】

T細胞に加えて、他の細胞傷害性細胞もまた、がんの殺傷又は予防目的のためにGNC蛋白質によって標的化されてもよい。表1Bは、NK細胞結合ドメインを有するGNC蛋白質における機能性部位（部位1及び部位2）及び抗原結合ドメインの例示的な組成物を示す。表1Cは、マクロファージ結合ドメインを有するGNC蛋白質における機能性部位（部位1及び部位2）及び抗原結合ドメインの例示的な組成物を示す。表1Dは、樹状細胞結合ドメインを有するGNC蛋白質における機能性部位（部位1及び部位2）及び抗原結合ドメインの例示的な組成を示す。

【0084】

GNC蛋白質を、不均等な数のT細胞アンタゴニスト及びアゴニストの結合のために特異的な複数のAgBDsを獲得するように構築する。このようにして、GNC蛋白質は、活性化T細胞を腫瘍細胞にリダイレクトでき、インビボでその活性を特定のレベルで制御することができる（表2）。従って、GNC蛋白質は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、五重特異性、六重特異性、七重特異性、又はさらには八重特異性な蛋白質であってもよい。本発明において、3つのクラスの四重特異性GNC抗体、即ち、SI-39E、SI-35E、及びSI-38Eを作製し、GNC-T細胞療法を可能とした。その抗体ドメイン及びその特異性は、表3に記載されている。EGFRvIII (SI-39E)、ROR1 (SI-35E)、及びCD19 (SI-38E)を標的とする四重特異性GNC抗体の構造を表4に示す。

【0085】

実施例2：GNC活性化、PBMS由来の細胞組成物
表4に記載のSI-35クラスについて、PBMC内のCD4+及び/又はCD8+ T細胞及び/又はCD56+ナチュラルキラー細胞（NK）などの異なる細胞型の活性化及び増殖を誘導する能力を試験した。四重特異性GNC抗体を2X最終濃度で調製し、200ulのRPMI+10%FBS中、96ウェルプレートの6ウェルで1:10の連続希釈で滴定した。ヒトPBMCを、正常ヒト末梢血から採取した濃縮ロイカフェレシス産物である「ロイコパック」から標準フィコール密度勾配によって精製した。最終の96ウェルプレートにおいて、アッセイの各ウェルに100μLのPBMC（100,000）及び100μLの各抗体希釈物を添加することによって、PBMCと連続的に滴定されたGNC蛋白質を結合させた。アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を収集し、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、CD56+ NK細胞の数をFACSで分析した。細胞を各ウェルから収集し、新しい96ウェルV底プレートに移し、400xgで3分間遠心分離した。IL-2とグランザイムBの分析のために、上清を96ウェルプレートに移した。細胞をFACS抗体の2％FBS/PBS 200μLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。プレートを400xgで3分間遠心し、上清を吸引した。この洗浄工程をさらに1回繰り返し、細胞を100μLの2％FBS/PBS中に再懸濁し、BD LSR FORTESSAで分析した。

【0086】

図8に示すように、位置2（SI-35E37）及び位置4（SI-35E39）においてscFv結合ドメインがFITCで置換されたものを除いて、全てのSI-35E四重特異性GNC抗体は、PBMCからのIL-2の生産を誘導した。これら2つの蛋白質は、それぞれPD-L1又はCD3に対する結合ドメインを欠いていた。培養上清へのグランザイムBの分泌は、図9に示すように、IL-2生産と同様のパターンであった。また、SI-35E37及びSI-35E3の両方は、PBMC培養におけるCD4+（図10）、CD8+（図11）及びCD56+（図12）細胞における活性化マーカーCD69の細胞表面発現の誘導において、はるかに低い活性を示した。細胞傷害性脱顆粒マーカーCD107a（LAMP-1）の表面発現は、CD56+（図15）では一貫性が低いが、CD4+（図13）、CD8+（図14）では位置2及び4に結合を欠くものを除いて、試験した全てのGNC蛋白質によって誘導された。低濃度では、GNC蛋白質のうちの3つ（SI-35E42、SI-35E43、及びSI-35E46）は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、及びCD56+ NK細胞上でCD69の発現を誘導し、これらのGNCによって誘導されるIL-2及びグランザイムB分泌（図8及び9）のレベルとよく相関していた。

【0087】

ガンマインターフェロンの増殖及び生産を、SI-35クラス抗体のパネルで5日間刺激したCD3⁺又はナイーブCD8⁺ T細胞（70,000細胞/ウェル）の培養物から測定した。ヒトCD3⁺又はCD8⁺CD45RA+ナイーブT細胞を、メーカーのプロトコルに従って、EasySep^TMヒトCD3⁺又はナイーブCD8⁺ T細胞分離キット（StemCell Technologies）を使用して正常なドナー由来の末梢血単核細胞から濃縮した。最終的な細胞集団は、フローサイトメトリーにより、＞98％のCD3⁺又はCD8⁺CD45RA⁺ T細胞であると決定された。培養中の増殖は、アラマーブルー（ThermoFisher Cat. No. DAL1100）で37℃で1時間染色した後、Spectramax plus 384ウェルリーダー（Molecular Devices）で読み取って測定した。GNCエクスパンドCD3⁺ T細胞の増殖は、GNCを含まない細胞培養におけるCD3⁺ T細胞のバックグラウンドと比較して、細胞数の倍の増加として見られた（図16）。CD3結合ドメインを欠いたものを除いて、試験した全てのコンストラクトによって増殖が誘導された。また、培養上清をこれらの培養物から収集し、ELISAによりガンマインターフェロンの存在を分析した。ガンマインターフェロンの分泌（図17）は、GNCコンストラクトにおいてCD3又はROR1結合ドメインがFITCに変更されていない限り、高かった。ナイーブCD8⁺CD45RA⁺ T細胞の増殖（図18）は、GNC上の4-1BB結合が存在しない培養物に可溶性抗4-1BBモノクローナル抗体を添加することによって示されるように、総CD3⁺ T細胞と比較して、4-1BB結合ドメインの有無により感受的であった。同様のパターンは、ナイーブCD8+ T細胞からのガンマインターフェロンの分泌についても見られた（図19）。

【0088】

実施例3：第一のGNC活性化治療用細胞組成物のスケールアップ及び調製
10E9の臨床的に有意な量のGNC活性化及び被覆T細胞の製造を、7日間の培養後に行った。ヒトPBMCを、正常なヒト末梢血から採取した濃縮ロイカフェレシス産物であるロイコパックから標準フィコール密度勾配によって、LRSコーン白血球から単離した。収集後、細胞を-80℃で凍結し、その後、培養前に解凍した。G-Rexプレート及びバイオリアクター培養システムを用いて、SI-38E17 GNC刺激PBMC培養物の増殖を最大14日間モニターした。培地は、RPMI 1640、10％子牛胎児血清、1％非必須アミノ酸、1％GlutaMax、0.6％グルタミン-アラニンサプリメント、15 ng/mlヒトIL-2、及び1nM GNC蛋白質で構成した。6ウェルのG-Rex培養物は、推奨量を大幅に上回る2500万〜1億個PBMC/ウェルの播種密度を6日間耐え、一方で7日目に1回の50％培地交換を行うことで系内の細胞に耐性を付与した。細胞のクラスタリングは、培地中の細胞の活性化を示した（図20）。1つのロイカフェレシスドナーからの少なくとも2億5千万個の細胞を2つのG-Rex 100Mバイオリアクターに播種し、1リットルの培地で7日間培養した。培地の容量が大きいため、培地の交換を必要とせずに培養を継続することができた。各100Mバイオリアクターにおける細胞収量は、88％超の生存率で12〜14億個であった。

【0089】

実施例4：第二のGNC活性化治療用細胞組成物
バイオリアクターからの細胞を第一のGNC活性化治療用細胞組成物として収集し、これをLOVO自動細胞処理システム（Fresenius Kabi）を用いて任意に濃縮した。第二のGNC活性化治療用細胞組成物を調製するために、1つのサンプル（製品B）を、本件では第一のGNCと同一である1nMのSI-38E17に曝した。これは、CD19陽性悪性腫瘍（図21A）を有する患者を治療するための標的として使用され得る。

【0090】

LOVOシステムでの処理中の第二の濃縮工程（100mLの体積）の後、第二のGNC活性化治療用細胞を2回洗浄した後、無菌処理バッグ中の54mLの最終体積に溶出させた。他のサンプル（製品A）は、培養段階で第一のGNC蛋白質にのみ曝し、LOVOシステムでの処理中には再曝露しなかった（図21A）。細胞をバッグから取り出し、CryoStor CS10試薬と1:1で混合し、-80℃まで凍結した。処理された細胞を解凍し、培養前の同じドナーからの解凍された未刺激PBMCと比較した。

【0091】

GNCエクスパンドT細胞（GET）培養からの細胞生存率は＞75％であり、処理中の追加のGNC試薬（GNC-T、製品B）への曝露によって影響を受けなかった（図21B）。細胞の平均直径は培養中に増加し、細胞の活性化を示した。インプットしたPBMC細胞材料及び解凍後の2つの調製物について、生/死（e780）、CD45、TCRα/β、CD56、CD4、CD8、CD14、TCRγ/δ、及びCD20のために染色するための抗体のマルチカラーパネルを使用してフローサイトメトリーを行った。GNC活性化T細胞（製品A）及び追加のGNC被覆GNC-T細胞（製品B）に関する、異なる細胞サブセットの定量化のためのゲーティングを示す（図22A及び22B）。細胞の各サブ集団の割合は、製品A及び製品Bの間で類似していたが、インプットPBMCの割合とは大きく異なっていた（図22C）。図23は、細胞の各サブ集団の総数及び割合を要約したものである。インプットPBMC細胞材料と比較して、白血球の総数が2億5000万から10億又は4倍に増加した一方で、T細胞の各サブポピュレーションの総数は、α/βT細胞では55倍、CD4＋T細胞では45倍、CD8＋T細胞では78倍と膨大に増加した。これに関連して、γ/δT細胞の増加は5倍と控えめで、TCRα/β-/lo、γ/δ+、CD8+ T細胞が最も多く存在しているように思われた。最後に、製品A及び製品B細胞組成物の両方の特徴は、検出可能なB細胞が存在しなかったという事実である。

【0092】

この実施例は、CAR-T細胞調製物と比較した、GNC-T細胞の多くの利点を示している。第一に、出発材料の細胞組成物は、ドナーからの新鮮なPBMCであり、細胞の特定のサブセットを事前に選択する必要はなく、フィーダー細胞又は合成ビーズの添加を必要としなかった。GNC蛋白質は、100％非ヌクレオチド生物学的材料であり、細胞内へのRNA又はDNAの導入、又はウイルスベクターによるトランスフェクションを必要としなかった。GNC誘導エクスパンションは、CAR-T細胞エクスパンションが平均40日であるのに対し、9日で治療用の用量をもたらした。得られた細胞にはB細胞はなく、特定の標的に対して強力な殺傷能力を持つ活性化CD4+及びCD8+ T細胞が高度に濃縮されていた。GNC治療用組成物は、-80℃から解凍すると生存能力及び生理活性を有していた。これらの利点を合わせて、CAR-T細胞治療に関連する待ち時間、コスト、インフラストラクチャーやトレーニングに関連する問題を大幅に削減されることが期待される。最終製品の純度、安全性、量の改善は、患者にとって大きな利益となるだろう。

【0093】

実施例5：GNC蛋白質で事前に活性化されたPBMCは、腫瘍細胞を強力に殺傷するためにリダイレクトされる
表4に記載のGNC SI-35クラスの6つの蛋白質について、ヒトROR1トランスフェクトCHO細胞株に対するリダイレクトT細胞傷害（RTCC）活性のためにPBMCを活性化する能力を試験した（図24）。GNC蛋白質を2X最終濃度で調製し、200ulのRPMI+10％FBS中、96ウェルプレートの10ウェルで1:3で滴定した。最終の96ウェルプレートにおいて、アッセイの各ウェルに100μLのPBMC（200,000）及び100μLの各抗体希釈物を添加することによって、PBMCと連続的に滴定された抗体を結合させた。CFSE標識CHO-ROR1細胞を添加する前に、アッセイプレートを37℃で約72時間インキュベートした。CHO-ROR1標的細胞5×10e6を、10 mLの培地中の0.5μMのCFSE（Invitrogen, #C34554）で標識し、37℃で20分間インキュベートした。CHO-ROR1細胞を50 mLの培地で3回洗浄した後、10 mLの培地で再懸濁し、再度カウントした後、5,000個のCFSE標識CHO-ROR1細胞をGNC活性化PBMCの各ウェルに添加した。細胞を別に72時間インキュベートした後、各アッセイウェルの内容物を収集し、残りのCFSE標識標的細胞の数について分析した。図24に示すように、試験した全てのGNC蛋白質はRTCC活性を誘導し、SI-35E42、SI-35E43、及びSI-35E46は、ウェル内のCHO-ROR1細胞の数を減少させる最も強力なものであった。

【0094】

ヒト腫瘍細胞に対するGNC標識PBMCの殺傷効果をさらに実証するために、IncuCyte S3生細胞分析システム（Sartorius/Essen Biosciences）を使用して、GNC用量及びエフェクター：標的比のエスカレーション実験を実施し、経時的に細胞をモニターした。健康なドナーからのPBMCを、0.01〜100nMまでの10倍の連続投与量で、37℃で30分間、GNC蛋白質SI-38E17で標識し、培養前に洗浄した。GNC蛋白質SI-38E17は、B細胞表面に発現するCD19抗原を標的とすることから、Kasumi-2前駆体B細胞白血病株を標的細胞として選択した。使用したKasumi-2細胞に、緑色蛍光蛋白質（GFP）を発現するように導入し、これにより、腫瘍細胞の存在を、6日間にわたって9回収集した4枚の画像/ウェルにおける平均緑色蛍光を測定することによって追跡した。エフェクター：標的（E：T）比は、5,000（1：1）〜160,000（32：1）細胞の連続2倍希釈でGNC標識PBMCを複製ウェルに添加することによってエスカレートさせた。図25に示すように、Kasumi-2細胞は、無標識PBMCの1：1〜8：1までのE：T比を持つウェルで数が増加した。わずか0.1nMのGNCへの曝露により、E：T比が2倍になるごとに抑制が増し、1：1の培養ではKasumi-2の増殖が減少することにつながった。1nM超の濃度のGNCでPBMCをコーティングすると、全てのE：T比で42時間培養後にKasumi-2細胞をほぼ完全に除去することができた。

【0095】

フォローアップ実験として、他の3つの形質転換B細胞株：NALM-6、MEC-1、及びDaud、及び急性T細胞白血病株Jurkatを標的細胞として使用した。これらの標的細胞は、NucRed647分子を恒常的に発現するようにレンチウイルスによって以前にトランスフェクトされた。このアッセイでは、PBMCを10倍量のGNC蛋白質SI-38E17に37℃で30分間曝し、その後、以前と同様に洗浄した。PBMCを1.2x10⁶細胞/ウェルでプレーティングし、50,000個の標的腫瘍細胞を添加した。細胞をIncuCyte S3セットに入れ、5.5日の期間にわたって10回の時点で収集した赤色蛍光画像(4画像/ウェル)を収集した（図26）。成長曲線を、PBMC（ヌル）の非存在下で、4つの腫瘍細胞株すべてについて確立した。PBMCを1nM以上のGNC蛋白質SI-38E17で標識すると、3つのB細胞株全ての増殖が停止したが、Jurkat T細胞白血病ではそうではなかった。このB細胞株は、0.1nMのGNC蛋白質にあらかじめ曝したPBMC細胞に対する感受性にばらつきがあった。

【0096】

腫瘍細胞とGNC-T細胞の培養の結果を定量する別の方法として、フローサイトメトリーによる検出のための定量限界（LOQ）曲線を確立した。ダウディレッド細胞を200,000個から20個の範囲で10倍に連続的に希釈し、100万個のPBMCと1:1で混合して、10％、1.0％、0.1％、0.01％、0.001％の腫瘍細胞のサンプルを作成し、これをフローサイトメトリーで分析した（図27）。次に、細胞を、時間0で10％、1％、又は0.1％のNALM-6、MEC-1、Daudi、又はJurkat腫瘍細胞をスパイクした1nMのGNCエクスパンドT細胞の15日6ウェルG-Rex培養から収集し、上記と同じフローサイトメトリーの設定を用いて分析した。腫瘍細胞は、44個の細胞が検出された、MEC-1腫瘍株を10%でスパイクした培養を除き、全ての条件で0.001%未満に減少し、これに関連して、MEC-1細胞は、培養において＜0.01%に減少した。

【0097】

本明細書の開示は、特定の実施形態又は実施例を参照して説明されたが、実施形態は例示であり、開示範囲はそのように限定されないことが理解されてもよい。本明細書の開示の代替の実施形態は、本明細書の開示が関係する当業者に明らかになり得る。そのような代替実施形態は、本明細書の開示の範囲内に包含されると見なされる。従って、本明細書の開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義され、前述の説明によってサポートされている。本明細書の開示において引用又は言及された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【表1A】

【表2】

【表3】

【表4】

四重特異性GNC抗体のGNC-T配列リスト

アミノ酸配列中の下線はCDR

>配列番号01 抗CD3 284A10 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCA

>配列番号02 抗CD3 284A10 VHv1 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSS

>配列番号03 抗CD3 284A10 VLv1 nt
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号04 抗CD3 284A10 VLv1 aa
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK

>配列番号05 抗PD-L1 PL230C6 VHv3 nt
CAGTCGGTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAATCGACCTTAATACCTACGACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTTGGAATCATTACTTATAGTGGTAGTAGATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGATTATATGAGTGGTTCCCACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTAGT

>配列番号06 抗PD-L1 PL230C6 VHv3 aa
QSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDLNTYDMIWVRQAPGKGLEWVGIITYSGSRYYANWAKGRFTISKDNTKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYMSGSHLWGQGTLVTVSS

>配列番号07 抗PD-L1 PL230C6 VLv2 nt
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAAGTGTCAGGCCAGTGAGGACATTTATAGCTTCTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATTCTGCATCCTCTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTTATGGTAAAAATAATGTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号08 抗PD-L1 PL230C6 VLv2 aa
AYDMTQSPSSVSASVGDRVTIKCQASEDIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIHSASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGKNNVDNAFGGGTKVEIK

>配列番号09 抗PD-L1 PL221G5 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>配列番号10 抗PD-L1 PL221G5 VHv1 aa
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSS

>配列番号11 抗PD-L1 PL221G5 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号12 抗PD-L1 PL221G5 VLv1 aa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIK

>配列番号13 抗4-1BB 420H5 VHv3 nt
CAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>配列番号14 抗4-1BB 420H5 VHv3 aa
QSLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIACIYVGSSGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSSSYYMFNLWGQGTLVTVSS

>配列番号15 抗4-1BB 420H5 VLv3 nt
GCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTATGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号16 抗4-1BB 420H5 VLv3 aa
ALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIK

>配列番号17 抗4-1BB 466F6 VHv2 nt
CGGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACCATCAGTAGCTACCACATGCAGTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAACCATTAGTAGTGGTGGTAATGTATACTACGCGAGCTCCGCGAGAGGCAGATTCACCATCTCCAGACCCTCGTCCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACTCTGGTTATAGTGATCCTATGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>配列番号18 抗4-1BB 466F6 VHv2 aa
RSLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTISSYHMQWVRQAPGKGLEYIGTISSGGNVYYASSARGRFTISRPSSKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARDSGYSDPMWGQGTLVTVSS

>配列番号19 抗4-1BB 466F6 VLv5 nt
GACGTTGTGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACCTGTCAGGCCAGTCAGAACATTAGGACTTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGCCTGGCGATGCTGCAACTTACTATTGTCAGTCTACCTATCTTGGTACTGATTATGTTGGCGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号20 抗4-1BB 466F6 VLv5 aa
DVVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIRTYLSWYQQKPGKAPKLLIYAAANLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISDLEPGDAATYYCQSTYLGTDYVGGAFGGGTKVEIK

>配列番号21 抗4-1BB 460C3 VHv1 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTAGGAGATACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATATATACTGGTAGCCGCGATACTCCTCACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGAAGGTAGCCTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC

>配列番号22 抗4-1BB 460C3 VHv1 aa
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSRRYYMCWVRQAPGKGLEWIACIYTGSRDTPHYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSLWGQGTLVTVSS

>配列番号23 抗4-1BB 460C3 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACTGGTTCTCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCGCAGGCGGTTACAATACTGTTATTGATACTTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号24 抗4-1BB 460C3 VLv1 aa
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYSNWFSWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGYNTVIDTFAFGGGTKVEIK

>配列番号25 抗ROR1 323H7 VHv4 nt
GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTCGCTACCACATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGACATATTTATGTTAATAATGATGACACAGACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATTGGATGTTGGTGGTGGTGGTGCTTATATTGGGGACATCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCA

>配列番号26 抗ROR1 323H7 VHv4 aa
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRYHMTWVRQAPGKGLEWIGHIYVNNDDTDYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARLDVGGGGAYIGDIWGQGTLVTVSS

>配列番号27 抗ROR1 323H7 VLv1 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAACGACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATGATACGGATGGTCTTGATACGTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号28 抗ROR1 323H7 VLv1 aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGKVPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYDTDGLDTFAFGGGTKVEIK

>配列番号29 抗ROR1 338H4 VHv3 nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACTGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGATCGGAATCATTTATGCTAGTGGTAGCACATACTACGCGAGCTCGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGGATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAATTTATGACGGCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCA

>配列番号30 抗ROR1 338H4 VHv3 aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSYAMSWVRQAPGRGLEWIGIIYASGSTYYASSAKGRFTISKDNTKNTVDLQMNSLRAEDTAVYYCARIYDGMDLWGQGTLVTVSS

>配列番号31 抗ROR1 338H4 VLv4 nt
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCGCCTGATCTATCTGGCATCTACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGCAATTATAACGGTAATTATGGTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号32 抗ROR1 338H4 VLv4 aa
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTINCQASQNIYSYLSWYQQKPGKVPKRLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQSNYNGNYGFGGGTKVEIK

>配列番号33 抗FITC 4420 VH nt
GAGGTGAAGCTGGATGAGACTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGAGGCCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAAGGACTGGAGTGGGTAGCACAAATTAGAAACAAACCTTATAATTATGAAACATATTATTCAGATTCTGTGAAAGGCAGATTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGTTGAAGACATGGGTATCTATTACTGTACGGGTTCTTACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA

>配列番号34 抗FITC 4420 VH aa
EVKLDETGGGLVQPGRPMKLSCVASGFTFSDYWMNWVRQSPEKGLEWVAQIRNKPYNYETYYSDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRVEDMGIYYCTGSYYGMDYWGQGTSVTVSS

>配列番号35 抗FITC 4420 VL nt
GATGTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACGTTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

>配列番号36 抗FITC 4420 VL aa
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLRWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK

>配列番号37 ヒトIgG1ヌル(ADCC/CDCヌル変異を伴うG1m-fa) nt
GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

>配列番号38 ヒトIgG1ヌル(ADCC/CDCヌル変異を伴うG1m-fa) aa
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

>配列番号39 ヒトIgカッパnt
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

>配列番号40 ヒトIgカッパaa
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>配列番号41 SI-35E18 (460C3-L1H1-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)重鎖nt

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAGTAACTGGTTCTCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCGCAGGCGGTTACAATACTGTTATTGATACTTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTAGGAGATACTACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATATATACTGGTAGCCGCGATACTCCTCACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGAAGGTAGCCTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCCAGTCGGTGGAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGAATCGACCTTAATACCTACGACATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTAGAGTGGGTTGGAATCATTACTTATAGTGGTAGTAGATACTACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAGACAATACCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCAGAGATTATATGAGTGGTTCCCACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTAGTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTCGCTACCACATGACTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGACATATTTATGTTAATAATGATGACACAGACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGAGATTGGATGTTGGTGGTGGTGGTGCTTATATTGGGGACATCTGGGGCCAGGGAACTCTGGTTACCGTCTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAACAACAACGACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTTCCTAAGCTCCTGATCTATTATGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATGATACGGATGGTCTTGATACGTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号42 SI-35E18 (460C3-L1H1-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)重鎖aa

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYSNWFSWYQQKPGKAPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCAGGYNTVIDTFAFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGIDFSRRYYMCWVRQAPGKGLEWIACIYTGSRDTPHYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGSLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSQSVEESGGGLVQPGGSLRLSCTASGIDLNTYDMIWVRQAPGKGLEWVGIITYSGSRYYANWAKGRFTISKDNTKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYMSGSHLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISRYHMTWVRQAPGKGLEWIGHIYVNNDDTDYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYFCARLDVGGGGAYIGDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQSVYNNNDLAWYQQKPGKVPKLLIYYASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYDTDGLDTFAFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIK

>配列番号43 SI-35E18 (460C3-L1H1-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)軽鎖nt

GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAAGTGTCAGGCCAGTGAGGACATTTATAGCTTCTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCCATTCTGCATCCTCTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGGTTATGGTAAAAATAATGTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

>配列番号44 SI-35E18 (460C3-L1H1-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)軽鎖aa

AYDMTQSPSSVSASVGDRVTIKCQASEDIYSFLAWYQQKPGKAPKLLIHSASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYGKNNVDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

>配列番号45 抗CD3 284A10 VHv1b nt
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACGGTGGTTCTTCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCGACA

>配列番号46 抗CD3 284A10 VHv1b aa
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVST

>配列番号47 抗huCD19 21D4 VH nt
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAACCAGGAGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTAGCAGTTCATGGATCGGCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGGAAAGGCCTGGAATGGATGGGGATCATCTATCCTGATGACTCTGATACCAGATACAGTCCATCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGGACTGCCTACCTGCAGTGGAGTAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCTATGTATTACTGTGCGAGACATGTTACTATGATTTGGGGAGTTATTATTGACTTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

>配列番号48 抗huCD19 21D4 VH aa
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFSSSWIGWVRQAPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSIRTAYLQWSSLKASDTAMYYCARHVTMIWGVIIDFWGQGTLVTVSS

>配列番号49 抗huCD19 21D4 VL nt
GCCATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGGCATTAGCAGTGCTTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCTCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCCTCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTAATAGTTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA

>配列番号50 抗huCD19 21D4 VL aa
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPFTFGPGTKVDIK

>配列番号51 抗huEGFRvIII 806 VH nt
GATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTAGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGCTGGAGTGGATGGGCTACATAAGTTATAGTGGTAACACTAGGTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGCGACACATCCAAGAACCAATTCTTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAACGGCGGGACGCGGGTTTCCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA

>配列番号52 抗huEGFRvIII 806 VH aa
DVQLQESGPSLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTIEDTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSA

>配列番号53 抗huEGFRvIII 806 VL nt
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATTCAAGTCAGGACATTAACAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAGACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGACGATGAAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGCTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA

>配列番号54 抗huEGFRvIII 806 VL aa
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIYHGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIK

>配列番号55 GGGGSGGGGSGリンカーnt
GGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGA

>配列番号56 GGGGSGGGGSGリンカーaa
GGGGSGGGGSG

>配列番号57 GGGGSGGGGSリンカー01 nt
GGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCA

>配列番号58 GGGGSGGGGSリンカー01 aa
GGGGSGGGGS

>配列番号59 GGGGSGGGGSリンカー02 nt
GGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCC

>配列番号60 GGGGSGGGGSリンカー02 aa
GGGGSGGGGS

>配列番号61 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSリンカーnt
GGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCA

>配列番号62 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSリンカーaa
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

>配列番号63 SI-39E18 (284A10-L1H1-scFv x 806-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)重鎖nt
GACGTCGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAAGCCAGTGAGAGCATTAGCAGTTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGAAGCATCCAAACTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCTATTTTTATTTTATTAGTCGTACTTATGTAAATTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCATCAGTACCAATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAGTCATTACTGGTCGTGATATCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGCGCGACGGTGGATCATCTGCTATTACTAGTAACAACATTTGGGGCCAAGGAACTCTGGTCACCGTTTCTTCAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTAGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTTTGCCTGGAACTGGATTCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGCTGGAGTGGATGGGCTACATAAGTTATAGTGGTAACACTAGGTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGCGACACATCCAAGAACCAATTCTTCCTGCAGTTGAACTCTGTGACTATTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGTAACGGCGGGACGCGGGTTTCCTTATTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCGCGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCGGGTACGACATGTGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGCATTGCTGCTGGTAGTGCTGGTATCACTTACGACGCGAACTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGATCGGCGTTTTCGTTCGACTACGCCATGGACCTCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTTCCCACTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGGGTTATAGTTGGGGTAATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAGGCGGTGGAGGGTCCGGCGGTGGTGGATCCCAGTCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAACTACTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATGTATTTATGTTGGTAGTAGTGGTGACACTTACTACGCGAGCTCCGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATAGTAGTAGTTATTATATGTTTAACTTGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGGCGGTGGCGGTAGTGGGGGAGGCGGTTCTGGCGGCGGAGGGTCCGGCGGTGGAGGATCAGCCCTTGTGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGATACCTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTTACGCATCCGATCTGGCATCTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAAGGCGGTTACTATACTAGTAGTGCTGATACGAGGGGTGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA

>配列番号64 SI-39E18 (284A10-L1H1-scFv x 806-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)重鎖aa
DVVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASESISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYEASKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGYFYFISRTYVNSFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTISTNAMSWVRQAPGKGLEWIGVITGRDITYYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGSSAITSNNIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSDVQLQESGPSLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDFAWNWIRQFPGNKLEWMGYISYSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTIEDTATYYCVTAGRGFPYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSGYDMCWVRQAPGKGLEWIACIAAGSAGITYDANWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSAFSFDYAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYSWGNVDNVFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSQSLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSSNYWICWVRQAPGKGLEWIACIYVGSSGDTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSSSYYMFNLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSALVMTQSPSTLSASVGDRVTINCQASEDIDTYLAWYQQKPGKAPKLLIFYASDLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQGGYYTSSADTRGAFGGGTKVEIK

>配列番号65 SI-39E18 (284A10-L1H1-scFv x 806-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)軽鎖nt
GACATCCTGATGACCCAATCTCCATCCTCCATGTCTGTATCTCTGGGAGACACAGTCAGCATCACTTGCCATTCAAGTCAGGACATTAACAGTAATATAGGGTGGTTGCAGCAGAGACCAGGGAAATCATTTAAGGGCCTGATCTATCATGGAACCAACTTGGACGATGAAGTTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGAGCCGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGAATCTGAAGATTTTGCAGACTATTACTGTGTACAGTATGCTCAGTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

>配列番号66 SI-39E18 (284A10-L1H1-scFv x 806-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)軽鎖aa
DILMTQSPSSMSVSLGDTVSITCHSSQDINSNIGWLQQRPGKSFKGLIYHGTNLDDEVPSRFSGSGSGADYSLTISSLESEDFADYYCVQYAQFPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC


>配列番号67 SI-39E29 (806-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)重鎖nt
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>配列番号68 SI-39E29 (806-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)重鎖aa
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>配列番号69 SI-39E29 (806-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)軽鎖nt
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>配列番号70 SI-39E29 (806-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 420H5-H3L3-scFv)軽鎖aa
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>配列番号71 SI-35E20 (466F6-L5H2-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)重鎖nt
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>配列番号72 SI-35E20 (466F6-L5H2-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)重鎖aa
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>配列番号73 SI-35E20 (466F6-L5H2-scFv x PL230C6-Fab x 323H7-H4L1-scFv x 284A10-H1L1-scFv)軽鎖nt
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>配列番号89 SI-38E17 (284A10-L1H1-scFv x 21D4-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 466F6-H2L5-scFv)軽鎖nt
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>配列番号90 SI-38E17 (284A10-L1H1-scFv x 21D4-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 466F6-H2L5-scFv)軽鎖aa
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>配列番号92 SI-38E33 (21D4-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 466F6-H2L5-scFv)重鎖aa
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配列番号94 SI-38E33 (21D4-LH-scFv x 284A10-Fab x PL221G5-H1L1-scFv x 466F6-H2L5-scFv)軽鎖aa
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図22C】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【配列表】

2021519289000001.app

【国際調査報告】