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特表2021-519746ハンチントン病の治療のためのジンセノサイドＭ１の使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】特表2021-519746(P2021-519746A)
(43)【公表日】2021年8月12日
(54)【発明の名称】ハンチントン病の治療のためのジンセノサイドＭ１の使用
(51)【国際特許分類】
A61K 31/704 20060101AFI20210716BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20210716BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20210716BHJP
【ＦＩ】
A61K31/704
A61P25/14
A61P39/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
【全頁数】23
(21)【出願番号】特願2020-538957(P2020-538957)
(86)(22)【出願日】2019年4月23日
(85)【翻訳文提出日】2020年10月22日
(86)【国際出願番号】CN2019083838
(87)【国際公開番号】WO2019206126
(87)【国際公開日】20191031
(31)【優先権主張番号】62/661,244
(32)【優先日】2018年4月23日
(33)【優先権主張国】US
(81)【指定国】
AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT
(71)【出願人】
【識別番号】520253731
【氏名又は名称】リー・シュー−ロン
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈｅａｕ−Ｌｏｎｇ ＬＥＥ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(74)【代理人】
【識別番号】100136696
【弁理士】
【氏名又は名称】時岡 恭平
(72)【発明者】
【氏名】リー・シュー−ロン
(72)【発明者】
【氏名】ホア・クオ−フォン
(72)【発明者】
【氏名】リー・ユー−チー
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA19
4C086GA17
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZC37
(57)【要約】
必要とする対象のハンチントン病（ＨＤ）を治療する医薬を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用；および、ジンセノサイドＭ１および薬学的に許容される担体を含む、ＨＤ治療用医薬組成物。【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における、ハンチントン病（ＨＤ）の治療方法。
【請求項2】
対象が、変異ＨＴＴタンパク質を発現している、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
変異ＨＴＴタンパク質が、対象の神経細胞に蓄積されている、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
ジンセノサイドＭ１が、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の低下、および／または、（ｉｉ）対象の神経細胞における細胞毒性の低下、および／または、（ｉｉｉ）運動協調性の向上、（ｉｖ）寿命の延長、および／または、（ｖ）対象の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成の減少、に有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
必要とする対象のハンチントン病（ＨＤ）を治療する医薬を製造するための、ジンセノサイドＭ１の使用。
【請求項6】
対象が、変異ＨＴＴタンパク質を発現している、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
変異ＨＴＴタンパク質が、対象の神経細胞に蓄積されている、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
医薬が、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の低下、および／または、（ｉｉ）対象の神経細胞における細胞毒性の低下、および／または、（ｉｉｉ）運動協調性の向上、（ｉｖ）寿命の延長、および／または、（ｖ）対象の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成の減少、に有効である、請求項５に記載の使用。
【請求項9】
ジンセノサイドＭ１および薬学的に許容される担体を含む、ハンチントン病（ＨＤ）治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願本願は、２０１８年４月２３日出願の米国仮出願６２／６６１，２４４の利益を主張し、その内容は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野本発明は、ハンチントン病（ＨＤ）を治療するためのジンセノサイドＭ１の新規な使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチンチン遺伝子の異常なＣＡＧトリヌクレオチド反復拡大によって引き起こされる常染色体優性神経変性疾患である。この疾患は、進行性の不随意運動障害、認知症、そして最終的に死として、臨床的な症状が現れる。現在のところ、ＨＤの効果的な治療法は確立されていない。
【0004】
高麗人参（ｇｉｎｓｅｎｇ）の主要な活性成分であるジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）は、さまざまな薬理活性、例えば抗腫瘍、抗疲労、抗アレルギーおよび抗酸化活性、を有することが知られている。ジンセノサイドは、４つの環に配置された１７個の炭素原子を有するゴナンステロイド核で構成される基本構造を有している。ジンセノサイドは体内で金属化されており、最近の多くの研究では、天然に存在するジンセノサイドよりも、ジンセノサイド代謝物が、体内に容易に吸収され、活性成分として作用することが示されている。いくつかのジンセノサイドは、いくつかの神経変性および老化障害に対して有益な効果があることが報告されている。その中でも、ジンセノサイドＭ１は、化合物Ｋ（ＣＫ）とも呼ばれ、ヒト腸内細菌によるジペノシド経路を介したプロトパナキサジオール型ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。これまで、ＨＤの治療におけるジンセノサイドＭ１の効果を報告した先行技術文献はない。
【発明の概要】
【0005】
本発明において、予想外にも、ジンセノサイドＭ１が、ハンチントン病（ＨＤ）の１つ以上の症状を緩和するのに有効であることが見出された。したがって、本発明は、対象におけるＨＤ治療のための新しいアプローチを提供する。
【0006】
したがって、本発明は、有効量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における、ハンチントン病（ＨＤ）の治療方法、を提供する。
【0007】
いくつかの実施形態では、対象は変異ＨＴＴタンパク質を発現し、特に変異ＨＴＴタンパク質は対象の神経細胞に蓄積されている。
【0008】
いくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の低下、および／または、（ｉｉ）特に対象の神経細胞における細胞毒性の低下、および／または、（ｉｉｉ）運動協調性の向上、（ｉｖ）寿命の延長、および／または、（ｖ）対象の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成の減少、に有効な量で投与される。
【0009】
いくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、非経口または経腸経路により投与される。
【0010】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下のいくつかの実施形態の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本発明を説明する目的で、図面に実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、示された好ましい実施形態に限定されないことが理解されるものである。図面中：【図1】図１Ａ〜１Ｂは、ジンセノサイドＭ１が、ｍＨｔｔ発現細胞における細胞毒性を著しく低下させたことを示している。（図１Ａ）ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の生存率は、ＭＴＴ還元アッセイによって定量化した。（図１Ｂ）ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１〜３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の生存率は、ＭＴＴ還元アッセイによって定量化した。結果は、３つのサンプルの平均値±ＳＥＭ、で表した。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間（図１Ａ）、または、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞との比較（図１Ｂ）。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図2】図２は、ジンセノサイドＭ１が、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＲＯＳ産生を著しく低下させたことを示している。ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０μＭの細胞内ＲＯＳインジケーターＨ２ＤＣＦＤＡの存在下、１〜３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、１時間処理した。細胞のＲＯＳ含有量は、蛍光プレートリーダーを使用して、蛍光強度を検出することにより測定した。結果は、３つのサンプルの平均値±ＳＥＭ、で表した。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図3】図３は、ジンセノサイドＭ１が、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化レベルを著しく低下させたことを示している。ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０または３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。ＡＭＰＫのリン酸化レベルは、ウエスタンブロッティングにより測定した。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これらの３つの実験の平均値±ＳＥＭとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図4】図４は、ジンセノサイドＭ１が、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＴＭのリン酸化レベルを著しく低下させたことを示している。ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０または３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。ＡＴＭのリン酸化レベルは、ウエスタンブロッティングにより測定した。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これらの３つの実験の平均値±ＳＥＭとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図5】図５は、ジンセノサイドＭ１が、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるγＨ２ＡＸの発現レベルを著しく低下させたことを示している。ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０または３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。γＨ２ＡＸの発現量はウエスタンブロッティングにより測定した。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これらの３つの実験の平均値±ＳＥＭとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図6】図６は、ジンセノサイドＭ１が、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるｐ５３のリン酸化レベルを著しく低下させたことを示している。ＳＴＨｄｈＱ７細胞およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０または３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）により、２４時間処理した。ｐ５３のリン酸化レベルをウエスタンブロッティングにより測定した。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これらの３つの実験の平均値±ＳＥＭとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行う。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【図7】図７は、ジンセノサイドＭ１の経口投与が、ＨＤ疾患マウスの運動協調性を有意に増加させたことを示している。Ｒ６／２ＨＤ疾患マウスに、７週齢から、４週間毎日、ジンセノサイドＭ１（３０ｍｇ／ｋｇ体重）またはビヒクルを経口投与した。野生型の健常な対照マウスに、毎日、ビヒクルを経口投与した。運動協調性は、ロータロッド装置アッセイを使用して評価した。結果は、平均値±ＳＥＭで表した。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、次いで、事後のＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を行った。ａｐ＜０．０５：ＷＴマウスとＲ６／２ビヒクルマウスの間。ｂｐ＜０．０５：Ｒ６／２ビヒクルマウスとの比較。
【発明を実施するための形態】
【0012】
特に断りのない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書において、以下の用語は、特に断りがない限り、それらに規定する意味を有する。
【0013】
本明細書において、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を表すために使用される。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの（ｏｎｅ）要素または１つよりも多い要素を意味する。
【0014】
「含む」または「含むこと」という用語（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）は、一般に、含む／含むこと（ｉｎｃｌｕｄｅ）という意味で使用され、１つまたは複数の特徴、成分または構成要素の存在を許容することを意味する。「含む」または「含むこと」という用語は、「からなる」または「からなること」という用語を包含する。
【0015】
ハンチントン病（ＨＤ）は、常染色体優性神経変性疾患であり、臨床的に、進行性不随意運動障害、認知症、そして最終的な死として、症状が現れる［１］。これは、ヒト４番染色体短腕（４ｐ６３）に位置するハンチンチン（Ｈｔｔ）遺伝子のエクソン１のＣＡＧトリヌクレオチド拡張によって引き起こされる。ＣＡＧリピートの数が３６を超えると、翻訳されたポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）を含むＨｔｔタンパク質［変異Ｈｔｔ（ｍＨｔｔ）］は、多くの細胞タンパク質の正常な機能を妨害し、続いて重要な細胞機構を危険にさらす［２］。また、ｐｏｌｙＱ拡張した変異Ｈｔｔの異常な蓄積は、神経細胞、アストロサイト、蝸牛神経細胞、および多くの様々なタイプの末梢細胞の核での凝集体形成を導く［３］。変異Ｈｔｔは、タンパク質の誤った折りたたみを促進してプロテアソーム活性の活性を阻害し、転写を調節不全にし、シナプス機能を害し、酸化ストレスを上昇させ、軸索を変性させ、最終的に神経変性と神経細胞損失を引き起こすことが知られている［３］。皮質線条体末端からのグルタミン酸の過剰放出、および神経細胞生存障害は、ＨＤの初期症状を引き起こす線条体神経変性の原因であると考えられている。黒質線条体経路の機能不全もまた、線条体興奮毒性の一因となる。あわせて、変異Ｈｔｔによって誘発された神経変性は、主に非線条体脳領域（例えば皮質および黒質）で起こり［４、５］、運動障害、認知症、および最終的に死を引き起こす［１、６］。神経細胞の調節不全に加えて、代謝異常は、ＨＤのもう１つの重要な特徴である［７］。高血糖およびグルコース代謝異常は、いくつかのＨＤのマウスモデル、およびＨＤ患者において、観察されている［８］。他のいくつかの代謝経路（例えば、コレステロール生合成および尿素回路代謝）の欠損もまた、よく報告されている［９、１０］。エネルギー代謝の欠乏は、多くの神経疾患の重要な病原因子として提案されている。最近、エネルギー欠乏が、ＨＤの重要な病原因子として浮上した［７］。高血糖とインスリン低下が、いくつかのトランスジェニックマウスモデルで報告されている［８］。グルコース代謝に関連するタンパク質の異常な発現も、いくつかのＨＤマウスモデル、およびＨＤ患者において、観察されている［８］。
【0016】
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）は、下流の標的遺伝子の配列を調節し、多くの異なる組織においてエネルギー産生を活性化およびエネルギー消費を抑制することにより、細胞エネルギーの恒常性を維持する、主要なエネルギーセンサーである［１１］。ＡＭＰＫは、α、β、およびγサブユニットで構成されるヘテロ三量体複合体である。αおよびβサブユニットは、２つの異なる遺伝子（α１およびα２、またはβ１およびβ２）によってそれぞれコード化されるが、γサブユニットは、３つの遺伝子（γ１、γ２、およびγ３）によってコード化される［１２］。そして、ＡＭＰＫは、αサブユニットの触媒ドメイン内のスレオニン残基１７２のリン酸化を介して、いくつかの上流のキナーゼ［カルモジュリン依存性プロテインキナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）およびＬＫＢ１］によって活性化され得る［１３］。その他のキナーゼ［ｃＡＭＰ依存性キナーゼ（ＰＫＡ）、およびＣａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）を含む］は、ＡＭＰＫの活性を調節することも示された［１４、１５］。ＬＫＢ１によるＡＭＰＫの活性化は、主にＡＭＰ／ＡＴＰの細胞比の増加によって引き起こされる［１６］。対照的に、ＣａＭＫＫおよびＣａＭＫ ＩＩは、刺激中にＡＭＰＫを活性化し、細胞内カルシウムのレベルを上昇させる［１７］。ＡＭＰＫのαサブユニットは触媒サブユニットであり、少なくとも２つの異なるアイソフォーム（α１およびα２）を有している。ＡＭＰＫ−α１は全身で広く発現しており、α２サブユニットは、肝臓、心臓、骨格筋において主に発現している［１８］。ＡＭＰＫの基質には、エネルギー代謝における多くのタンパク質や、多くの異なる機構に関与するタンパク質が含まれる［１９］。例えば、ＡＭＰＫの活性化は、ＲＯＳの形成を高め、次いで、ミトコンドリアの損傷とアポトーシスを引き起こすことがわかっている［２０、２１］。ＡＭＰＫはまた、転写や分泌など、他の細胞機能に関与するさまざまなタンパク質をリン酸化する［１９、２２］。さまざまな細胞でのＡＭＰＫ活性化のアポトーシス促進作用には、ストレスシグナル伝達（ｐ５３、ＪＮＫ、カスパーゼ３、ｐ３８、およびｍＴＯＲなど）の誘発、および脂肪酸シンターゼとタンパク質合成の阻害が含まれる［２３−２６］。さらに、ＡＭＰＫは、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）経路を介して軸索起始および神経細胞極性化を抑制することがわかっている。ＡＭＰＫによるモータータンパク質（Ｋｉｆ５）のリン酸化は、Ｋｉｆ５とＰＩ３Ｋの繋がりを破壊し、軸索へのＰＩ３のターゲティングを妨げ、したがって、軸索成長と神経細胞極性化を阻害する［２７］。
【0017】
脳では、ＡＭＰＫは視床下部神経細胞に存在し、食物摂取の調節に重要な役割を果たす［２８］。興味深いことに、ＡＭＰＫの機能と調節、および神経変性疾患におけるその役割は、多くの注目を集めている。例えば、ＡＭＰＫの高活性化は、虚血、ＨＤ、アルツハイマー病（ＡＤ）の神経細胞で見られた。脳卒中患者の脳では、ＡＭＰＫは、皮質および海馬の神経細胞で活性化される。ＡＭＰＫの阻害は、蓄積する損傷を低減させる［２９−３１］。ＡＭＰＫ−α２の除去は、虚血下の脳の神経保護作用である［３２］。ＡＭＰＫのより高活性化は、ＡＤ患者の神経細胞にも見られた。Ｃｈｅｎらによって報告された最近の研究では、メトホルミン（ＡＭＰＫの活性化剤）は、ＡＭＰＫ依存経路におけるβ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）のアップレギュレーションを介して、アミロイドペプチドの生合成を増強することが確認されており、これは潜在的にＡＤの進行を悪化させ得る［３３］。ＡＭＰＫの阻害は、Ａβ生成およびＢＡＣＥ１転写に対するメトホルミンの作用を著しく抑制する。Ｔｈｏｒｎｔｏｎらは、ＡＭＰＫがタウキナーゼであり、ＡＭＰＫは微小管結合ドメインにおいてタウのリン酸化を誘導することを確認した。さらに、ＡＭＰＫは、タウのリン酸化を誘導し、タウの微小管への結合を阻害した［３４］。その著者らはまた、ＡＭＰＫ−α２ではなくＡＭＰＫ−α１が、Ａβ１−４２に反応して有意に活性化されることを見つけた［３４］。Ｖｉｎｇｔｄｅｕｘらは、ホスホＡＭＰＫが、ＡＤの脳のＳｅｒ２０２またはＳｅｒ３９６でリン酸化されたタウとともに局在化していることを確認した。さらに、アミロイドβペプチド（Ａβ、ＡＤの老人斑の主要構成要素）への曝露は、Ｔｈｒ２３１およびＳｅｒ３９６／４０４でタウをリン酸化するＡＭＰＫの活性化をもたらし、ＡＤのタウオパチーに寄与する可能性がある［３４、３５］。タウの過剰リン酸化はＡＤの特徴であるため、これらの観察はＡＤにおけるＡＭＰＫ活性化の病理学的役割を示唆している。一貫して、ＡＭＰＫの阻害は、Ａβの産生、およびタウのリン酸化を抑制している［３３、３６］。これらの研究は、ＡＤにおけるＡＭＰＫの活性化がＡＤの神経変性に寄与し得ること示唆している。
【0018】
ＨＤの発症におけるＡＭＰＫの役割と調節が積極的に調査されてきた。我々は以前に、ＡＭＰのα１アイソフォーム（ＡＭＰＫ−α１）の活性化が、ＨＤのヒトとマウスの線条体神経細胞において生じたことを報告している［３１、３７］。線条体におけるＡＭＰＫの過剰活性化は、脳の萎縮を引き起こし、神経細胞の喪失を促進し、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２）でＨｔｔ凝集体の形成を増加させた［３７］。ＡＭＰＫ−α１のこのような核内蓄積は、活性に依存していた。核転座の予防またはＡＭＰＫ−α１の不活化は、変異Ｈｔｔによって引き起こされる細胞死を改善した。線条体細胞の核におけるＡＭＰＫ−α１の異常な活性化は、変異Ｈｔｔによって誘導される新たな毒性経路を表している。ｃＡＭＰ／ＰＫＡ依存経路を介したアデノシン２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）−選択的アゴニスト（ＣＧＳ２１６８０）を用いた、ＡＭＰＫ−α１の活性化および核濃縮のブロッキングは、脳萎縮の救済と関連しており［３１、３７］、線条体のＨＤ発病におけるＡＭＰＫ−α１の関与がさらに強くなった。
【0019】
ＡＴＭは、大きな（〜３７０ｋＤａ）セリン／スレオニンプロテインキナーゼである。ＡＴＭは、ＭＲＮ（Ｍｒｅ１１−Ｒａｄ５０−Ｎｂｓ１）に依存して、ＤＮＡ損傷によって活性化される。これらのタンパク質の機能はよく報告されているにもかかわらず、細胞エネルギーの恒常性と詳細な分子メカニズムを制御する機能はほとんど解明されておらず、脳のエネルギー欠乏を目的とした治療法の開発を大きく妨げている。過去数年にわたって、酸化ストレスとＤＮＡ損傷の相関関係が確認されている。ＡＴＭは、システイン残基の酸化を介した酸化ストレスによって誘発された［３８］。さらに、酸化ストレスは、ＨＤのＤＮＡ−ＰＫ複合体の障害によって、ＤＮＡ修復の機能障害を誘発する。４３Ｑ−ＧＦＰ融合タンパク質の過剰発現は、ＲＯＳ産生およびＡＴＭ活性を増加させ、次いで、ＰＣ１２細胞のＡＴＭ依存性ＤＮＡ損傷を引き起こすことがわかった［３９］。ＡＴＭは、ＡＭＰＫのリン酸化に関与することがわかっており、ＡＭＰＫが、ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ修復の応答において重要な役割を果たし得ることを示唆している。ＩＧＦ−１は、ＡＴＭ依存性およびＬＫＢ１非依存性の方法を介して、ヒト線維芽細胞およびマウス胎児線維芽細胞において、ＡＭＰＫリン酸化を誘導した［４０］。ＡＩＣＡＲまたはＩＲの誘発のＡＭＰＫの活性化は、ＨｅＬａ細胞および癌細胞においてＡＴＭ依存性経路を介していた［４１、４２］。Ｆｕらは、さらに、エトポシドによるＡＴＭの活性化が、ＡＭＰＫのリン酸化／活性化を通して、ＲＯＳ産生とミトコンドリア生合成を誘導することを報告した。ＲＯＳは、ＤＮＡ損傷／ＡＴＭ／ＡＭＰＫ経路を介してミトコンドリア生合成を促進する可能性がある［４３］。
【0020】
本発明では、予想外にも、ジンセノサイドＭ１がＨＤの１つ以上の症状を緩和するのに有効であることが見出された。特に、ジンセノサイドＭ１は、ｍＨｔｔ発現細胞における細胞毒性、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化レベル、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＴＭのリン酸化レベル、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるγＨ２ＡＸの発現レベル、および、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるｐ５３のリン酸化レベル、を減少させることができることが確認されれている。また、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２マウス）では、ジンセノサイドＭ１の経口投与により、疾患の進行を抑制し、運動協調を改善し、寿命を延ばし、罹患した動物の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成を減少させることができることが確認されている。
【0021】
したがって、本発明は、有効量のジンセノサイドＭ１を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における、ハンチントン病（ＨＤ）を治療または予防する方法、を提供する。
【0022】
ジンセノサイドＭ１は、化合物Ｋ（ＣＫ）、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールとも称され、当技術分野で知られているサポニン代謝物の１つである。ジンセノサイドＭ１の化学構造は、次のとおりである：【化1】
【0023】
ジンセノサイドＭ１は、ヒトの腸内細菌によるジペノシド経路を介したプロトパナキサジオール型ジンセノサイドの代謝物の１つとして知られている。ジンセノサイドＭ１は、摂取後、血中または尿中に見ることができる。ジンセノサイドＭ１は、台湾特許出願第０９４１１６００５号（Ｉ２８０９８２）および米国特許第７，９３２，０５７号などの当技術分野で公知の方法による菌発酵により、高麗人参植物から製造することができ、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、ジンセノサイドＭ１を製造するための高麗人参植物として、ウコギ（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）科、トチバニンジン（Ｐａｎａｘ）属、例えば、高麗人参（オタネニンジン；Ｐ．ｇｉｎｓｅｎｇ）、およびヒマラヤニンジン（Ｐ．ｐｓｅｕｄｏ−ｇｉｎｓｅｎｇ）（別名Ｓａｎｑｉ）が挙げられる。一般に、ジンセノサイドＭ１の製造方法は、（ａ）高麗人参植物材料（例えば、葉または茎）の粉末を得る工程；（ｂ）高麗人参植物材料を発酵させるために菌を供給する工程（ここで、発酵温度は２０〜５０℃の範囲であり、発酵湿度は７０〜１００％の範囲であり、ｐＨ値は４．０〜６．０の範囲であり、発酵期間は５〜１５日の範囲である）；（ｃ）発酵産物の抽出および収集の工程；および、（ｄ）発酵産物から、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオールを単離する工程、を含む。
【0024】
本発明においてジンセノサイドＭ１が「単離された」または「精製された」と記載される場合、それは完全に単離または精製されたものではなく、ある程度、単離または精製されたものとして理解される。例えば、精製されたジンセノサイドＭ１は、天然に存在する形態と比較してより精製されたものを表す。一実施形態では、精製されたジンセノサイドＭ１を含む製剤は、製剤総量の、５０％より多い量、６０％より多い量、７０％より多い量、８０％より多い量、９０％より多い量、または１００％（ｗ／ｗ）の量のジンセノサイドＭ１を含んでもよい。本明細書において特定の数を用いて比率または用量を示す場合、その数は、通常、その数よりも１０％多い範囲および少ない範囲、より具体的には、５％多い範囲および少ない範囲の数を含むと理解すべきである。
【0025】
本明細書において、「ハンチンチン」、「ハンチンチンタンパク質」、または「ＨＴＴ」との用語は、ＨＴＴ遺伝子またはＨＤ遺伝子とも呼ばれるハンチンチン遺伝子によってコードされる、ハンチンチンタンパク質を意味する。最初のエクソンにおいてグルタミンをコードするＣＡＧコドンのリピートの数が変わることにより、この遺伝子には多型がある。野生型では、このタンパク質は６〜３５個のグルタミン残基を含み、これはハンチントン病を引き起こさない。ＨＤにかかった個体では、このタンパク質は３５個よりも多いグルタミン残基を含み、ｐｏｌｙＱ−ｈｔｔと呼ばれ、ハンチントン病に関与する変異型である。野生型のｈｔｔは、質量が約３５０ｋＤで、サイズが約３１４４個のアミノ酸である。特に断りのない限り、本明細書において、「ｈｔｔ」との用語は、野生型のｈｔｔタンパク質、すなわちグルタミン残基が３６個未満のポリグルタミントラクトを含むｈｔｔ、を意味する。変異ＨＴＴタンパク質は、非変異の野生型ＨＴＴタンパク質と比較して、異常な機能および／または活性、または追加の活性または機能（例えば、凝集、転写因子との凝集など）を有する。
【0026】
本明細書において、「個体」または「対象」との用語には、ヒト、および、ペット動物（イヌ、ネコなど）、家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、または実験動物（ラット、マウス、モルモットなど）などの、ヒト以外の動物、が含まれる。
【0027】
本明細書において、「治療する」との用語は、疾患、疾患の症状または病状、または疾患の進行を患った対象に、疾患、疾患の症状または病状、疾患によって引き起こされる障害、または、疾患の進行またはその症状や病状を、治療、治癒、軽減、緩和、変化、療養、寛解、改善、または作用する目的で、１つ以上の活性薬剤を含む組成物を、適用または投与することを意味する。本明細書において、「予防する」または「予防」との用語は、疾患またはその症状または病状に患いやすいまたはかかりやすい対象に、１つ以上の活性薬剤を含む組成物を適用または投与することを意味し、したがって、疾患またはその症状または病状の発生、またはその根本的な原因の予防に関する。
【0028】
本明細書において、「有効量」との用語は、治療する対象に所望の治療効果を与える活性成分の量を意味する。例えば、ＨＤを治療または予防するための有効量は、１つ以上症状または病状またはそれらの進行を、防止、改善、緩和、軽減、または予防することができる量であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書における有効量は、ＨＤの対象の神経細胞（特に変異神経細胞）における活性酸素種（ＲＯＳ）産生および細胞毒性を低減するのに有効な量であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書における有効量は、運動協調を改善し、寿命を延ばし、ＨＤの対象の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成を低減するのに有効な量であり得る。
【0029】
治療有効量は、投与経路および頻度、体重および医薬を投与する個体の種、ならびに投与の目的などの様々な理由に応じて変化し得る。当業者は、本明細書の開示、確立された方法、および自身の経験に基づいて、各場合に投与量を決めることができる。例えば、特定の実施形態では、本発明で使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１０〜１，０００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの例では、本発明で使用されるジンセノサイドＭ１の経口投与量は、１日１００〜３００ｍｇ／ｋｇ、１日５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１日２５〜１００ｍｇ／ｋｇ、１日１０〜５０ｍｇ／ｋｇ、または１日５〜３０ｍｇ／ｋｇ、である。さらに、本発明のいくつかの実施形態では、ジンセノサイドＭ１は、特定の期間、例えば、少なくとも１５日間、１ヶ月、または２ヶ月、またはそれ以上の毎日の投与で、定期的に投与される。
【0030】
本発明によれば、ジンセノサイドＭ１は、ハンチントン病（ＨＤ）を治療または予防するための活性成分として使用することができる。一実施形態では、治療上有効な量の活性成分は、薬学的に許容される担体とともに、送達および吸収を目的とした適切な形態の医薬組成物に製剤化することができる。投与方法に応じて、本発明の医薬組成物は、好ましくは、約０．１重量％〜約１００重量％の活性成分を含み、ここで、重量パーセントは、組成物全体の重量に基づいて計算される。
【0031】
本明細書において、「薬学的に許容される」とは、担体が、組成物において活性成分と共存し、好ましくは、前記活性成分を安定化でき、治療を受ける固体に安全であることを意味する。前記担体は、活性成分に対する、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、またはマトリックスであってもよい。適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルボース、マンノース、デンプン、アラビアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロース、が挙げられる。組成物は、さらに、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの滑沢剤；湿潤剤；乳化剤および懸濁剤；ヒドロキシ安息香酸メチルおよびプロピルなどの保存剤；甘味料；および香料、を含んでもよい。本発明の組成物は、患者への投与後、活性成分の、急速、持続または遅延の放出作用を与えることが可能である。
【0032】
本発明によれば、前記組成物の形態は、錠剤、ピル剤、粉末、飴（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）、包装（ｐａｃｋｅｔｓ）、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、ローション、溶液、シロップ、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、および包装粉末、であってもよい。
【0033】
本発明の組成物は、経口、非経口（筋肉内、静脈内、皮下、および腹腔内など）、経皮、坐剤、および鼻腔内の方法などの、生理学的に許容される経路を介して送達することができる。非経口投与に関しては、血液と等張する溶液を作るのに十分な塩またはグルコースなどの他の物質を含んでいてもよい、滅菌水溶液の形態で使用することが好ましい。水溶液は、必要に応じて、適宜（好ましくはｐＨ値３〜９に）緩衝化されていてもよい。無菌条件下での適切な非経口組成物の製造は、当業者に周知の標準的な薬学技術により行うことができ、創造的な労力の追加は必要ではない。
【0034】
本発明によれば、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、ハンチントン病（ＨＤ）を有する個体、あるいはハンチントン病（ＨＤ）のリスクのある個体の治療において、使用することができる。具体的には、ジンセノサイドＭ１またはジンセノサイドＭ１を活性成分として含む組成物は、病気の発生を予防し、または症状を改善し、または症状の悪化を遅らせるために、ＨＤの個体またはＨＤに罹患するリスクのある個体に投与することができる。
【0035】
以下、本発明をさらに実施例によって説明するが、これらは、説明する目的で提供されるものであり、これによって限定されるものではない。当業者は、本開示に照らして、開示する具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、また、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを理解する。
【実施例】
【0036】
ジンセノサイドＭ１、別名化合物Ｋ（ＣＫ）、２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール（以下ＬＣＨＫ１６８と称される）は、台湾特許出願第０９４１１６００５号（Ｉ２８０９８２）および米国特許第７，９３２，０５７号に記載されているものなど、当技術分野で公知の方法により製造した。
【0037】
本研究では、ジンセノサイドＭ１の有効性および関連するメカニズムを、イン・ビトロおよびイン・ビボで調べた。ジンセノサイドＭ１が、ｍＨｔｔ発現細胞において細胞毒性を減少させ、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞において活性酸素種（ＲＯＳ）産生を減少させ、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞においてＡＭＰＫのリン酸化レベルを低下させ、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞においてＡＴＭのリン酸化レベルを低下させ、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞においてγＨ２ＡＸの発現レベルを低下させ、およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞においてｐ５３のリン酸化レベルの低下させることを示した。さらに、ジンセノサイドＭ１の経口投与が、ＨＤ（Ｒ６／２マウス）のトランスジェニックマウスモデルの疾患の進行を低下させ、ＨＤ（Ｒ６／２マウス）のトランスジェニックマウスモデルの寿命を延ばし、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２マウス）の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成を減少させることを示した。
【0038】
実施例１：ジンセノサイドＭ１は、ｍＨｔｔ発現細胞の細胞毒性を著しく低下させた内因性正常ｈｔｔを発現する条件的不死化野生型ＳＴＨｄｈＱ７線条体神経前駆細胞（野生型線条体細胞という）、および、１０９グルタミンで変異ｈｔｔを発現するホモ接合ＳＴＨｄｈＱ１０９ノックインマウスからのホモ接合変異ＳＴＨｄｈＱ１０９線条体神経前駆細胞（変異線条体細胞という）を用いた。ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞は、Ｅｌｅｎａ Ｃａｔｔａｎｅｏ博士とＭａｒｔａ Ｖａｌｅｎｚａ博士（イタリア、ミラノ大学、薬理学科および幹細胞研究センター）から譲与された。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に、３３℃のインキュベーションチャンバーで維持された。
【0039】
ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９の細胞を、３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９の細胞死を、ＭＴＴ還元アッセイによって定量化した。ＭＴＴ還元アッセイでは、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を５０ｍｇ／ｍｌでジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、１００倍のストック溶液とした。実験の最後に、細胞を３７℃で２時間、０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む培地でインキュベートした。次いで、培地をＤＭＳＯで置き換えてＭＴＴホルマザン沈殿物を溶解し、続いてマイクロプレートリーダー（ＯＰＴＩｍａｘチューナブルプレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、５７０ｎｍでの吸光度を測定した。得られた細胞の生存率を、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞の生存率に対して正規化した。図１Ａに示すように、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の生存率は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞の生存率よりも低かった。注目すべきことに、３０μＭのジンセノサイドＭ１とともにインキュベーションしたＳＴＨｄｈＱ１０９細胞は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して生存率を有意に増加させた。ジンセノサイドＭ１の細胞保護作用を確認するために、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１、１０、および３０μＭのジンセノサイドＭ１、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）とともに、２４時間処理した。図１Ｂに示すように、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の生存率を有意に増加させた。結果は、３つのサンプルの平均値±ＳＥＭとして表される。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間（図２Ａ）、または非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞との比較（図２Ｂ）。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0040】
実施例２：ジンセノサイドＭ１は、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生を著しく減少させた酸化ストレスは、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞において細胞死を引き起こす重要な事象の１つである。ジンセノサイドＭ１が、酸化ストレスを減らすことによってＳＴＨｄｈＱ１０９細胞において細胞死を阻害するかどうかを調べるために、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０μＭ細胞内ＲＯＳインジケーター蛍光プローブ２，７−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦＤＡ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ）の存在下で、１、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、１時間、処理した。細胞のＲＯＳ含有量を、蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、蛍光強度（励起／発光：４８８ｎｍ／５１０ｎｍ）を検出することにより測定した。図２に示すように、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、ＲＯＳ産生を有意に減少させた。結果は、３つのサンプルの平均値±ＳＥＭとして表される。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0041】
実施例３：ジンセノサイドＭ１は、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化レベルを著しく低下させたＡＭＰＫの活性化は、ＨＤの発症を促進する［３７］。ジンセノサイドＭ１がＡＭＰＫ活性化を阻害するかどうかを調べるために、ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、２４時間、処理した。ＡＭＰＫのリン酸化レベルは、ウエスタンブロッティングにより測定した。図３に示すように、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＭＰＫのリン酸化レベルは、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して、有意に増加した。注目すべきことに、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞と比較して、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞のＡＭＰＫのリン酸化レベルを有意に減少させた。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これらの３つの実験の平均値±ＳＥＭとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0042】
実施例４：ジンセノサイドＭ１は、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＴＭのリン酸化レベルを著しく低下させたＡＴＭはＤＮＡ損傷によって活性化され、ＡＭＰＫのリン酸化に重要な役割を果たす。ジンセノサイドＭ１がＡＴＭ活性化を阻害するかどうかを調べるために、ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、２４時間、処理した。ＡＴＭのリン酸化レベルは、ウエスタンブロットで測定した。図４に示すように、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるＡＴＭのリン酸化レベルは、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して、有意に増加した。注目すべきことに、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞と比較して、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞のＡＴＭのリン酸化レベルを有意に減少させた。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これら３つの実験の平均値±ＳＤとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0043】
実施例５：ジンセノサイドＭ１は、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるγＨ２ＡＸの発現レベルを著しく低下させたＡＴＭは、現在、γＨ２ＡＸの活性化を通してＤＮＡ修復を調節することが知られている。ジンセノサイドＭ１がγＨ２ＡＸの発現レベルを阻害するかどうかを調べるために、ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、２４時間、処理した。γＨ２ＡＸの発現量はウエスタンブロットにより測定した。図５に示すように、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるγＨ２ＡＸの発現レベルは、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して、有意に増加した。注目すべきことに、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞と比較して、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるγＨ２ＡＸの発現レベルを有意に減少させた。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これら３つの実験の平均値±ＳＤとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0044】
実施例６：ジンセノサイドＭ１は、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるｐ５３のリン酸化レベルを著しく低下させたｐ５３は、細胞周期とアポトーシスの調節において役割を果たしている。ｐ５３は、ＤＮＡ損傷および酸化ストレスに反応して活性化される。ジンセノサイドＭ１がｐ５３のリン酸化レベルを阻害するかどうかを調べるために、ＳＴＨｄｈＱ７およびＳＴＨｄｈＱ１０９細胞を、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１またはビヒクル（ＤＭＳＯ）により、２４時間、処理した。ｐ５３のリン酸化レベルをウエスタンブロットにより測定した。図６に示すように、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞におけるｐ５３のリン酸化レベルは、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ７細胞と比較して、有意に増加した。注目すべきことに、１０および３０μＭのジンセノサイドＭ１は、非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞と比較して、ＳＴＨｄｈＱ１０９細胞のｐ５３のリン酸化レベルを有意に減少させた。ウエスタンブロッティングの結果は、３つの異なる実験の代表であり、ヒストグラムは、これら３つの実験の平均値±ＳＤとして表した定量を示している。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定が行われる。ｐ値＜０．０５が、有意とみなされる。ａｐ＜０．０５：ＳＴＨｄｈＱ７細胞とＳＴＨｄｈＱ１０９細胞の間。ｂｐ＜０．０５：非処理（ビヒクル処理）のＳＴＨｄｈＱ１０９細胞との比較。
【0045】
実施例７：ジンセノサイドＭ１の経口投与は、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２マウス）の疾患進行を著しく低下させたマウスを、ジンセノサイドＭ１（３０ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与）またはビヒクルにより、７週齢から４週間、毎日、処置した。運動協調性は、ロータロッド装置アッセイ（ＵＧＯ ＢＡＳＩＬＥ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、イタリア）を使用して、２分間にわたり、一定速度（１２ｒｐｍ）で評価した。図７に示すように、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２）の運動協調性は、野生型マウスと比較して有意に低下している。ジンセノサイドＭ１の経口投与は、ＨＤ疾患マウスの運動協調性を有意に増加させた。結果は、平均値±ＳＥＭとして表した。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定を行った。ａｐ＜０．０５：ＷＴマウスとＲ６／２ビヒクルマウスの間。ｂｐ＜０．０５：Ｒ６／２ビヒクルマウスとの比較。
【0046】
実施例８：ジンセノサイドＭ１の経口投与は、ＨＤのトランスジェニックマウスモデル（Ｒ６／２マウス）の寿命を著しく延長したマウスを、ジンセノサイドＭ１（３０ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与）またはビヒクルにより、７週齢から４週間、毎日、処置し、マウスの寿命を測定した。図８に示すように、Ｍ１の経口投与は、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２）の寿命を有意に延長した。結果は、平均値±ＳＥＭとして表した。複数の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した後、事後的スチューデント＝ニューマン＝コイルス検定を行った。ａｐ＜０．０５：ＷＴマウスとＲ６／２ビヒクルマウスの間。ｂｐ＜０．０５：Ｒ６／２ビヒクルマウスとの比較。
【0047】
実施例９：ジンセノサイドＭ１の経口投与は、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２マウス）の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成を低下させたマウスを、ジンセノサイドＭ１（３０ｍｇ／ｋｇ体重、経口投与）またはビヒクルにより、７週齢から４週間、毎日、処置した。線条体溶解物中のｍＨｔｔ凝集体の量を、フィルターリタデーションアッセイにより分析した。脳組織を氷冷したＴＮＥバッファーに懸濁およびホモジナイズし、２％ＳＤＳと混合した。サンプルを、まず、スロットブロットマニホールド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において、ＯＥ６６メンブレンフィルター（ポアサイズ０．２ｍｍ、Ｗｈａｔｍａｎ Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＵＫ）を通過させた。フィルター上に保持された不溶性凝集体を、抗Ｈｔｔ抗体を用いて検出した。図９に示すように、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２マウス）の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成は、野生型マウスと比較して有意に増加した。注目すべきことに、ジンセノサイドＭ１の経口投与は、ＨＤ疾患マウス（Ｒ６／２マウス）の線条体におけるｍＨｔｔ凝集体形成を減少させた。
【0048】
本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、さらなる説明を要することなく、本明細書の説明に基づいて、本発明をその最も広い範囲まで利用することができると考えられる。したがって、提供する明細書および特許請求の範囲は、本発明の範囲を限定するのではなく、例示のための目的として理解されるべきである。
【0049】
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【国際調査報告】