特表 2021-521245 キレート化された放射性核種に対する抗体および除去剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-521245(P2021-521245A)

(43)【公表日】2021年8月26日

(54)【発明の名称】キレート化された放射性核種に対する抗体および除去剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/61 20170101AFI20210730BHJP

   A61K 31/555 20060101ALI20210730BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210730BHJP

   A61K 51/04 20060101ALI20210730BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210730BHJP

   C07K 16/44 20060101ALN20210730BHJP

   C07K 16/46 20060101ALN20210730BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20210730BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20210730BHJP

   A61K 103/00 20060101ALN20210730BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/61

   A61K31/555

   A61P43/00 121

   A61K51/04 100

   A61K39/395 N

   A61K39/395 D

   C07K16/44ZNA

   C07K16/46

   C07K16/30

   A61K47/68

   A61K103:00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

【全頁数】246

(21)【出願番号】特願2020-558420(P2020-558420)

(86)(22)【出願日】2019年4月16日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月14日

(86)【国際出願番号】IB2019000521

(87)【国際公開番号】WO2019202399

(87)【国際公開日】20191024

(31)【優先権主張番号】62/658,468

(32)【優先日】2018年4月16日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/658,471

(32)【優先日】2018年4月16日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＵＮＩＸ

(71)【出願人】

【識別番号】520401619

【氏名又は名称】オラノ メド エスアエス

(71)【出願人】

【識別番号】306021192

【氏名又は名称】エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】トルグ， ジュリアン

(72)【発明者】

【氏名】ユレク， ポール

(72)【発明者】

【氏名】ロハス−キハーノ， フェデリコ

(72)【発明者】

【氏名】キーファー， ギャリー イー．

(72)【発明者】

【氏名】フライターク， オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】ゲルデス， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】クライン， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ウマーニャ， パブロ

(72)【発明者】

【氏名】ハース， アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】フロスト， ソフィア

(72)【発明者】

【氏名】サイディ， アマル

(72)【発明者】

【氏名】ナヤック， タパン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA12

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085EE01

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC58

4C086HA04

4C086HA06

4C086HA07

4C086HA28

4C086MA01

4C086MA03

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本出願は、二重特異性抗体を含む、キレート化された放射性核種に特異的に結合する抗体に関する。本出願はさらに、放射線免疫イメージングおよび放射線免疫療法などの適用におけるそのような二重特異性抗体の使用に関する。本出願はさらに、そのような方法において有用な除去剤および組成物に関する。
【選択図】図５１

[この文献は図面を表示できません]

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＯＴＡＭおよびＤＯＴＡＭの機能的バリアントから選択されるキレート剤にコンジュゲートされたデキストランまたはその誘導体を含む除去剤であって、前記キレート剤が金属イオンと複合体化した除去剤。

【請求項2】

以下の式：
デキストラン−（リンカー−（Ｍ−ＤＯＴＡＭ））_ｘ
［式中、
デキストランは、デキストランまたはその誘導体であり；
リンカーは、連結部分であり；
Ｍ−ＤＯＴＡＭは、ＤＯＴＡＭまたは金属イオンが組み込まれたその機能的バリアントであり；および
ｘ≧１である］
の化合物である、請求項１に記載の除去剤。

【請求項3】

ｘが、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、または５０以上である、請求項１に記載の除去剤。

【請求項4】

連結部分が、以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

［式中、ｙは１〜６であり、^＊はデキストランへの結合点を表し、^＊＊はＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントの環原子への結合点を表す］
の二価の基である、請求項２または３に記載の除去剤。

【請求項5】

デキストランの誘導体が、アミノ酸およびグルコース以外の糖類から選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよいアミノデキストランである、請求項１から４のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項6】

デキストランまたはデキストラン誘導体のグルコース単位の数のパーセンテージとしてのＤＯＴＡＭ基の数が、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも５％である、請求項１から５のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項7】

デキストランの平均分子量が、２００〜８００ｋＤａであり、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５００ｋＤａ未満であり、必要に応じて、約５００ｋＤａである、請求項１から６のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項8】

分子量カットオフ未満のデキストラン成分または除去剤が除去されており、分子量カットオフが５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上である、請求項７に記載の除去剤。

【請求項9】

分子量カットオフが、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａまたは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲にあり、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、約１００ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは２００ｋＤａである、請求項８に記載の除去剤。

【請求項10】

平均分子量が、４５０ｋＤａ〜５５０ｋＤａ、例えば、約５００ｋＤａである、請求項７から９のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項11】

金属イオンが、安定な同位体または本質的に安定な同位体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項12】

金属イオンが、Ｐｂ、ＢｉまたはＣａイオンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項13】

デキストランまたはデキストラン誘導体をＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントもしくは誘導体にコンジュゲートすることを含み、ＤＯＴＡＭのデキストランへのコンジュゲーションの前および／または後に、ＤＯＴＡＭを金属イオンとキレート化することを含む、除去剤を調製する方法。

【請求項14】

金属イオンが、安定な、または本質的に安定な金属イオンである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

金属イオンが、Ｐｂ、ＢｉまたはＣａイオンである、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

コンジュゲーションの前に、デキストランまたはデキストラン誘導体を、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上の分子量カットオフ／閾値より下の種を除去するための濾過工程にかける、および／または
方法が、コンジュゲートを濾過工程にかけて、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上の分子量カットオフ／閾値より下の種を除去することを含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

放射線免疫療法または放射線免疫イメージングの方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項18】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること；
を含み、必要に応じて、
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含み；必要に応じて、
ｉｖ）キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項19】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること
を含み；
必要に応じて、
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項20】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること
を含み；必要に応じて、
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含み；必要に応じて、
ｉｖ）キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法。

【請求項21】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗体結合部位をブロックする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること
を含み；必要に応じて、
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法。

【請求項22】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、少なくとも、
ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、または配列番号２中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＰｈｅ５０、Ａｓｐ５６、およびＴｙｒ５８を含まず、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／またはＡｒｇ５４も含まない、そのバリアント；
ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、または配列番号３中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、必要に応じて、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、および／もしくはＰｒｏ１００Ｅも含まない、ならびに／または必要に応じて、Ｔｙｒ９９も含まない、そのバリアント；
ｃ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、または配列番号４中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＴｙｒ２８およびＡｓｐ３２を含まない、そのバリアント；
ｄ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または配列番号６中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよびＴｙｒ９６を含まない、そのバリアント
を含み、
番号付けが、Ｋａｂａｔによるものである、請求項１８もしくは１９に記載の使用のための除去剤または請求項２０もしくは２１に記載の方法。

【請求項23】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、重鎖ＣＤＲ１と軽鎖ＣＤＲ２とをさらに含む、請求項２２に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項24】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、
ｉ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１もしくは配列番号１中に１、２、もしくは３個までの置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント；および／または
ｉｉ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２もしくは配列番号５中に少なくとも１、２、もしくは３個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント
を含む、請求項２３に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項25】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、
ａ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１
ｂ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＷＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２
ｃ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３
ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２
ｆ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項26】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートの、
ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体；または
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項27】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、ヒト、キメラまたはヒト化されたものである、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項28】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号７および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号７もしくは配列番号９に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項29】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号８もしくは配列番号１０に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項30】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項31】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１８から３０のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項32】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下のＫｄ値でＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合する、請求項１８から３０のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項33】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートおよびＢｉ−ＤＯＴＡＭキレートに結合し、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭキレート／Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのＫｄ値の比が、０．１〜１０または１〜１０の範囲にある、請求項１８から３２のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項34】

標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、請求項１８から３３のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項35】

腫瘍特異的抗原が、ＣＥＡ、ＨＥＲ２およびＣＤ２０からなる群から選択される、請求項１８から３４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項36】

腫瘍特異的抗原が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項１８から３５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項37】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２もしくは３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
ｄ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む
ｅ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む
ｆ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む；
および／またはＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲを含み、
ａ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
請求項１８から３６のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項38】

ＣＥＡの抗原結合部位が、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つ（すなわち、全部）のＣＤＲを含む、請求項３７に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項39】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１７に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１８に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項40】

ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項３９に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項41】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から３５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項42】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３４に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３５または４１のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項43】

ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項４２に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項44】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から３５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項45】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４６に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３５または４４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項46】

ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項４５に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項47】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｆｃ領域を含む、請求項１８から４６のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項48】

Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低下させるように操作されている、請求項４７に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項49】

Ｆｃ領域が、残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および／または３２９の１つまたは複数の置換によって操作されている、請求項４８に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項50】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体を含み、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を形成し、第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の使用のための除去剤。

【請求項51】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分をさらに含む、請求項５０に記載の使用のための除去剤。

【請求項52】

多重特異性または二重特異性抗体が、
第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を含む交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体
を含み；
第１または第２の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、ＣＨ１およびＶＨドメインを含むポリペプチドに融合されており、第１および第２のポリペプチドが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成するように、前記第１のポリペプチドが、ＣＬおよびＶＬを含む第２のポリペプチドと集合する、請求項５１に記載の使用のための除去剤。

【請求項53】

第２の抗体重鎖のＮ末端が、リンカーを介して前記第１のポリペプチドに融合されている、請求項５２に記載の使用のための除去剤。

【請求項54】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体、および
ｉｉ）第２の抗原のための抗原結合部位を一緒になって形成する、少なくとも第２の重鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、
請求項４７から４９のいずれか一項に記載の使用のための除去剤。

【請求項55】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の一方のＮまたはＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含むＦａｂまたは交差Ｆａｂを形成する、請求項５４に記載の使用のための除去剤。

【請求項56】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１および第２のポリペプチドが一緒になって、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するような
ｉ）ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉ）ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉｉ）ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチド
を含む、請求項５５に記載の使用のための除去剤。

【請求項57】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の一方のＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチドに連結されている、請求項５６に記載の使用のための除去剤。

【請求項58】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体；
ｂ）
ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成し、
第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、請求項４４に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項59】

第１の抗原が標的抗原であり、第２の抗原がＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートである、請求項５０から５８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項60】

第１の抗原がＣＥＡである、請求項５９に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項61】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号２２もしくは２３のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；ならびに／または
ｂ）
ｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに／または
ｃ）
ｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、請求項６０に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項62】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号１９もしくは２０のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；
ｂ）
ｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、請求項６０に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項63】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号２２の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２３の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの軽鎖
を含む、請求項６２に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項64】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６２のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項65】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１９の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６２に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項66】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６２に記載の使用のための除去剤または方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、二重特異性抗体を含む、キレート化された放射性核種に特異的に結合する抗体に関する。本出願はさらに、放射線免疫イメージングおよび放射線免疫療法などの適用におけるそのような二重特異性抗体の使用に関する。本出願はさらに、そのような方法において有用な除去剤および組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

薬物をがん細胞に標的化するためのモノクローナル抗体が開発されてきた。毒性薬剤を、腫瘍関連抗原に結合する抗体にコンジュゲートすることによって、周囲の組織にあまり損傷を与えることなく、腫瘍をより特異的に殺傷することができる可能性がある。

【0003】

プレターゲティングされた放射線免疫療法（ＰＲＩＴ）においては、一方では腫瘍関連抗原に対する親和性を有し、他方では放射標識化合物に対する親和性を有する抗体コンストラクトが使用される。第１の工程では、抗体が投与され、それが腫瘍内に局在化する。続いて、放射標識化合物が投与される。放射標識化合物は小さいため、腫瘍に迅速に送達することができ、また素早く除去される。これにより、腫瘍以外への放射線曝露が低減される（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２０１２、２（５）、５２３〜５４０頁）。直接的な細胞殺傷効果の他に、ＰＲＩＴはまた、免疫原性細胞の細胞死の誘導因子およびがん免疫療法および内因性ワクチン接種手法のための潜在的な組合せパートナーとして作用することもできる。同様の手順を、イメージングのために使用することもできる。プレターゲティングは、二重特異性抗体、またはアビジン−ビオチンを使用するシステムを使用することができるが、後者は、アビジン／ストレプトアビジンが免疫原性であるという欠点を有する。

【0004】

ＰＲＩＴにおける使用のための放射性核種は、一般的には、目的の放射性核種が搭載されたキレートの形態にある。

【0005】

Ｓｕら（Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ２００５、３２：７４１〜７４７頁）は、ｍＡｂ−ストレプトアビジンおよびＤＯＴＡ−ビオチンを含む抗体プレターゲティングシステムを評価した。放射標識された^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡ−ビオチンが安定ではなく、３０％を超える遊離^２１２Ｂｉ（^２１２Ｐｂの崩壊産物）が^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡから放出されることがわかった。

【0006】

ＷＯ２０１０／０９９５３６は、イットリウム、ルテニウムおよびガドリニウムのＤＯＴＡ複合体に結合することができる二重特異性抗体を記載している。しかしながら、ＤＯＴＡは、全ての放射性核種に安定に結合するわけではなく、遅い複合体形成速度を示し得る（ＹｏｎｇおよびＢｒｅｃｈｂｉｅｌ、Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００１年６月２１日；４０（２３）、６０６８〜６０７６頁）。放射性核種に安定に結合しないキレート剤は、腫瘍への放射線の送達を低減させ、一方、毒性は増大させてしまうリスクをもたらす。

【発明の概要】

【0007】

本発明は、ＤＯＴＡＭおよび鉛（Ｐｂ）を含む金属キレートに結合する抗体を提供する。ＤＯＴＡＭは、安定な様式でＰｂをキレート化して、Ｐｂ［ＤＯＴＡＭ］複合体を形成することができる。

【0008】

本発明の抗体は、ＤＯＴＡＭおよびＰｂを含むキレートに結合し、Ｐｂは安定な（非放射性）同位体または放射性同位体であってよい。鉛の放射性同位体は、放射線イメージングおよび放射線免疫療法などの適用において有用である。

【0009】

好ましくは、本発明の抗体は、ｐＭ〜ｆＭ範囲の、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに対する非常に高い親和性を有する。

【0010】

抗体はさらに、ＤＯＴＡＭによってキレート化されたビスマス（Ｂｉ）に結合する。^２１２Ｐｂは、^２１２Ｂｉの親放射性核種であり、^２１２Ｂｉのｉｎ ｖｉｖｏでの生成元として働くことができる。キレート化されたＢｉならびにキレート化されたＰｂに結合する抗体の能力は、Ｂｉ同位体がＰｂ同位体からの崩壊産物として生成される放射線免疫療法などの適用におけるその有用性を増大させる。一部の実施形態では、抗体は、ｐＭ〜ｆＭ範囲の非常に高い親和性で、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭキレートと、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭとの両方に結合することができる。

【0011】

さらに、本発明の抗体は、必要に応じて、または好ましくは、Ｃｕ−ＤＯＴＡＭキレートなどの他のキレート剤−金属錯体と比較して、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭおよびＰｂ−ＤＯＴＡＭに対して選択性である。

【0012】

一実施形態では、本発明は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位が、少なくとも１、２もしくは３つの重鎖ＣＤＲ配列を含む重鎖を含み：
ａ）重鎖ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む；
ｂ）重鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む；
ｃ）重鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む；
ならびに／または抗原結合部位が、少なくとも１、２もしくは３つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む軽鎖を含み：
ｄ）軽鎖ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む；
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む；
ｆ）軽鎖ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む、抗体を提供する。

【0013】

一部の実施形態では、抗原結合部位は、上で定義された軽鎖と、重鎖との両方を含む。

【0014】

別の実施形態では、本発明は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位が、少なくとも：
ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、または配列番号２中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＰｈｅ５０、Ａｓｐ５６、および/Ｔｙｒ５８を含まず、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／もしくはＡｒｇ５４も含まない、そのバリアント；
ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、または配列番号３中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、必要に応じて、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、および／もしくはＰｒｏ１００Ｅも含まない、ならびに／または必要に応じて、Ｔｙｒ９９も含まない、そのバリアント；
ｃ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、または配列番号４中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＴｙｒ２８およびＡｓｐ３２を含まない、そのバリアント；
ｄ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または配列番号６中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよびＴｙｒ９６を含まない、そのバリアント
を含む、抗体を提供する。

【0015】

残基の番号付けは、カバットによるものである。

【0016】

一部の実施形態では、抗体はさらに、必要に応じて：
ｉ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１または配列番号１中に１、２、もしくは３個までの置換を有するそのバリアント；
ｉｉ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２または配列番号５中に少なくとも１、２、もしくは３個の置換を有し、必要に応じて、Ｇｌｎ５０を含まない、そのバリアント
である重鎖ＣＤＲ１と軽鎖ＣＤＲ２とを含む。

【0017】

上記のＣＤＲを含む配列のバリアントに関する本発明の任意の実施形態では、タンパク質は、上記の１つまたは複数の残基はインバリアントであってもよい。

【0018】

一部の実施形態では、本発明による抗体は、本明細書に開示される抗体が結合するものと、キレート化された放射性核種の同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する。

【0019】

一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ ＰＲＩＴ−０２１３またはＰＲＩＴ−０２１４が結合するエピトープと同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する。例えば、抗体は、
ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体；または
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と同じエピトープ、または重複するエピトープに結合してもよい。

【0020】

一実施形態では、抗原結合部位は、
ａ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２；
ｆ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む。

【0021】

必要に応じて、上記の態様のいずれかにおける抗体は、ヒト、キメラまたはヒト化されたものである。

【0022】

必要に応じて、抗原結合部位は、配列番号７および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号７もしくは配列番号９に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含んでもよい。

【0023】

必要に応じて、抗原結合部位は、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号８もしくは配列番号１０に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含んでもよい。

【0024】

必要に応じて、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、配列番号７もしくは配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または上で定義されたそのバリアントと、配列番号８もしくは配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または上で定義されたそのバリアントとを含んでもよい。例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインまたはそのバリアントと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインまたはそのバリアントとを含んでもよい。別の実施形態では、それは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインまたはそのバリアントと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインまたはそのバリアントとを含んでもよい。

【0025】

抗体は、全抗体および抗体断片を含む、任意の形式にあってもよい。抗体は、単一特異性であってもよい。この形態では、抗体は、例えば、放射標識部分を上手く分離するための、例えば、選別および精製スキームにおいて有用である。

【0026】

一部の態様では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的に結合する抗体は、標的剤を生産するために細胞結合剤／ターゲティング部分にカップリングされている。そのような薬剤は、例えば、プレターゲティングされた放射線免疫療法またはプレターゲティングされた放射線免疫イメージングにとって有用である。

【0027】

カップリングは、好ましくは、融合ポリペプチドまたはタンパク質としての発現によるものであってもよい。融合は、直接的であっても、またはリンカーを介するものであってもよい。融合ポリペプチドまたはタンパク質を、組換え的に生産し、コンジュゲーション化学反応の必要性を回避することができる。

【0028】

一部の実施形態では、ターゲティング部分（標的のための抗原結合部位を含む）は、抗体またはその断片である。すなわち、一部の実施形態では、上記の抗体は、以下でさらに考察されるように、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体の形態にあってもよい。

【0029】

別の態様では、本発明はさらに、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートを標的細胞に標的化するのに好適な多重特異性抗体／抗体複合体に関する。

【0030】

したがって、別の態様では、本発明は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートと、標的抗原、例えば、標的細胞の表面上に発現される抗原との両方に特異的に結合する二重特異性または多重特異性抗体に関する。二重特異性抗体は、ＤＯＴＡＭ−キレート化鉛に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、標的抗原のための少なくとも１つの抗原結合部位とを含む。

【0031】

一部の実施形態では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、上記の実施形態のいずれかによるものであってもよい。

【0032】

標的抗原は、本明細書でさらに考察されるような任意の抗原、例えば、任意の腫瘍特異的抗原であってもよい。一部の実施形態では、それは、原核生物またはウイルスなどの病原体によって発現されるタンパク質またはポリペプチドであってもよい。

【0033】

一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）であってもよい。すなわち、一部の実施形態では、二重特異性抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含んでもよい。ＣＥＡは、比較的ゆっくりと内在化され、かくして、高いパーセンテージの二重特異性抗体が、放射性核種への結合のために、初期処理後に細胞の表面上で利用可能なままであるため、本発明の文脈において有利である。他の低内在化標的／腫瘍関連抗原も好ましく、本明細書に記載される。本発明において有用であり得る腫瘍関連抗原の他の例としては、ＣＤ２０またはＨＥＲ２が挙げられる。

【0034】

一部の実施形態では、標的抗原がＣＥＡである場合、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位は、
ｄ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む；
ｅ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む；
ｆ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、
少なくとも１、２、もしくは３つの重鎖ＣＤＲを含んでもよく；
および／またはＣＥＡに特異的な抗原結合部位は、
ａ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
少なくとも１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲを含んでもよい。

【0035】

一部の実施形態では、ＣＥＡのための抗原結合部位は、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つ（すなわち、全部）のＣＤＲを含んでもよい。

【0036】

一部の実施形態では、ＣＥＡのための抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号１７に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含んでもよい。

【0037】

必要に応じて、抗原結合部位は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号１８に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含んでもよい。

【0038】

必要に応じて、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインまたはそのバリアントと、配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインまたはそのバリアントとを含んでもよい。

【0039】

本明細書にさらに記載されるものを含む、二重特異性抗体または多重特異性抗体のための様々な可能な形式が当業界で公知である。本発明の抗体は、これらの形式のいずれかを採用してもよい。例えば、一部の実施形態では、二重特異性抗体は、二価、三価または四価であってもよい。

【0040】

本発明の抗体は、Ｆｃ領域を含むことが好ましい場合がある。Ｆｃ領域の存在は、放射線免疫療法および放射線イメージングの文脈において利益を有し、例えば、より小さい断片に関して観察され得るものよりも、タンパク質の循環半減期を延長させる、および／または高い腫瘍取込みをもたらす。

【0041】

一部の実施形態では、Ｆｃ領域が存在する場合、Ｆｃ領域はエフェクター機能を低下させるように操作されていることが好ましい場合がある。これは、Ｆｃ領域残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および／または３２９のうちの１つまたは複数、例えば、２３４、２３５および／または３２９のうちの１つまたは複数の置換を含んでもよい。一部の実施形態では、Ｆｃ領域を、Ｐｒｏ３２９からＧｌｙへの置換、Ｌｅｕ２３４からＡｌａへの置換および／またはＬｅｕ２３５からＡｌａへの置換（ＥＵインデックスによる番号付け）を含むように操作することができる。

【0042】

Ｆｃドメインを含む多重特異性抗体の様々な形式が公知である。

【0043】

一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、ｉ）Ｆｃドメイン、ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ、交差Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、もしくはｓｃＦｖ断片または単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）およびｉｉｉ）標的抗原に特異的な抗原結合部位を含む少なくとも１つのＦａｂ、交差Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦａｂ、もしくはｓｃＦｖ断片または単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を含んでもよい。

【0044】

一部の実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）について多価、例えば、二価であることが好ましい可能性がある。これは、アビディティを増大させる利点を有する。

【0045】

一部の実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭについて一価である。これは、除去剤が使用される場合の高分子量複合体形成のリスクを低減する（以下のさらなる考察を参照されたい）。

【0046】

かくして、一部の実施形態では、抗体は、三価であってもよい：すなわち、標的抗原について二価およびＰｂ−ＤＯＴＡＭについて一価であってもよい。

【0047】

１つの例示的な形式では、二重特異性または多重特異性抗体は、第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体（例えば、ＩｇＧ）であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を形成する、完全長抗体を含んでもよい。必要に応じて、さらなる抗原結合部分を、例えば、ポリペプチドリンカーを介して、第１および／または第２の重鎖のＮまたはＣ末端に融合して、一方または両方の抗原に関する価数を増加させることができる。例えば、第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分を、重鎖分子の一方または両方のＮ末端に融合することができる。

【0048】

別の例示的な形式では、二重特異性または多重特異性抗体は、第１の抗原のための抗原結合部位（例えば、第１の抗原について二価であってもよい）を含む完全長抗体（例えば、ＩｇＧ）を含んでもよく、第２の抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部分をさらに含む。様々な実施形態では、抗原結合部分は、Ｆａｂ断片、クロスオーバーＦａｂ分子、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ、もしくは単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）であってもよく、または第２の完全長抗体の部分であってもよい。例えば、抗体は、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含んでもよく、一緒になって第２の抗原のための抗原結合部位を形成する、少なくとも第２の重鎖可変ドメインと、第２の軽鎖可変ドメインとをさらに含む。第１または第２の抗原のいずれかはＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方の抗原は標的抗原である。

【0049】

本明細書の形式の一部の実施形態では、第２の抗原はＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、第１の抗原は標的、例えば、腫瘍関連抗原（一部の実施形態では、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＥＲＢＢ２）である。

【0050】

別の例示的な形式では、二重特異性または多重特異性抗体は、第１の抗原のための抗原結合部位（例えば、第１の抗原について二価であってもよい）を含む完全長抗体であって、重鎖の一方のＮまたはＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含むＦａｂまたは交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体を含んでもよい。例えば、この形式は、第１および第２のポリペプチドが一緒になって、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するような、
ｉ）ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉ）ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉｉ）ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチド
を含んでもよい。

【0051】

一部の実施形態では、融合は、完全長抗体の重鎖の一方のＮ末端にあってもよい。

【0052】

別の特定の実施形態では、抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体；
ｂ）
ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。

【0053】

この形式では、第１または第２の抗原のいずれかは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートであってもよい。その他方は、標的抗原、例えば、腫瘍関連抗原であろう。

【0054】

一部の実施形態では、第２の抗原はＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、第１の抗原は標的、例えば、腫瘍関連抗原（一部の実施形態では、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＥＲＢＢ２）である。

【0055】

上記の抗体は、三価であってもよい。別のあり得る実施形態では、さらなる抗原結合部分を融合させて、本明細書でさらに考察されるように、一方または両方の抗原に関する価数を増加させることができる。

【0056】

必要に応じて、前記リンカー（および本明細書で考察される任意のリンカー）は、少なくとも５アミノ酸、好ましくは２５〜５０の間のアミノ酸のペプチドであってもよい。リンカーは、剛性リンカーまたは可撓性リンカーであってもよい。一部の実施形態では、それは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙおよび／またはＡｌａ残基を含む、またはそれからなる可撓性である。例えば、それは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含む、またはそれからなってもよい。一部の実施形態では、それは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ［式中、ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である］などの反復モチーフを有してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２６）であってもよいか、またはそれを含んでもよい。他のリンカーを使用してもよく、当業者であれば同定することができる。

【0057】

この抗体形式のさらなる詳細は、ＷＯ２０１０／１１５５８９Ａ１（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ）に提供されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0058】

必要に応じて、
ｉ）ａ）の下の完全長抗体の第１の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）もしくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、ａ）の下の第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸もしくは２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される；または
ｉｉ）ｂ）の下の第２の軽鎖の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）もしくはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）もしくはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、ｂ）の下の第２の重鎖の定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸もしくは２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）もしくはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される。

【0059】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、上記の三価構造を有してもよく、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号２２もしくは２３のアミノ酸１〜４５０（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する（すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する）少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；ならびに／または
ｂ）
ｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに／または
ｃ）
ｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチドを含んでもよく；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する。

【0060】

一例では、完全長抗体の重鎖の一方は、ＥＵインデックスの番号付けによる、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗおよび必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうちの１つ、好ましくは、Ｓ３５４Ｃ）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、必要に応じて、Ｙ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ、好ましくは、Ｙ３４９Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）。

【0061】

一部の実施形態では、（ａ）の下の２つの抗体重鎖は、ｉ）配列番号２３のアミノ酸１〜４５０（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖（すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する）に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３４９位にＣ、３６６位にＳ、３６８位にＡおよび４０７位にＶ（ＥＵ番号付け）を有する、第１の抗体重鎖；ならびにｉｉ）配列番号２２のアミノ酸１〜４５０（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３５４位にＣおよび３６６位にＷ（ＥＵ番号付け）を有する、第２の抗体重鎖を含む。

【0062】

本明細書に記載される「固定」残基は、ＣＨ３中の「ノブ・イントゥー・ホール」突然変異であるか、または他方の重鎖のＣＨ３上の対応する残基と対形成して、所望の分子の形成を好む、ジスルフィド架橋形成残基などの他の残基である。他方の重鎖上に存在してもよい可能な残基は、表２の配列（例えば、配列１９および２０または２２および２３）に由来するものであってもよい。例えば、一実施形態では、第１の抗体重鎖が３４９位にＣを有する場合、第２の抗体重鎖は、３５４位にＣを有する。

【0063】

必要に応じて、リンカーは、上記の通りである。

【0064】

別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、上記の三価構造を有してもよく、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号１９もしくは２０のアミノ酸１〜４５０（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく：すなわち、リンカーの前の配列）の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；
ｂ）
ｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含んでもよく；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する。

【0065】

上記のように、上記実施形態のいずれかにおいて、完全長抗体の重鎖の一方は、ＥＵインデックスの番号付けによる、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗおよび必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうちの１つ、好ましくは、Ｓ３５４Ｃ）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、必要に応じて、Ｙ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ、好ましくは、Ｙ３４９Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）。

【0066】

一実施形態では、（ａ）の下の２つの抗体重鎖は、ｉ）配列番号２２のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３５４位にＣおよび３６６位にＷ（ＥＵ番号付け）を有する、第１の抗体重鎖；ならびにｉｉ）配列番号２３のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３４９位にＣ、３６６位にＳ、３６８位にＡおよび４０７位にＶ（ＥＵ番号付け）を有する、第２の抗体重鎖を含んでもよい。

【0067】

必要に応じて、リンカーは、上記の通りである。

【0068】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号２２の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２３の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む。

【0069】

さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、ＰＲＩＴ−０２１３と本明細書で呼ばれる分子である。

【0070】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号１９の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む。

【0071】

さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、ＰＲＩＴ−０２１４と本明細書で呼ばれる分子である。

【0072】

一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、上記の三価構造を有してもよく、
ａ）ＥＲＢＢ２に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号３６もしくは３７のアミノ酸１〜４４９（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する（すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する）少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号３８の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；ならびに／または
ｂ）
ｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに／または
ｃ）
ｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチドを含んでもよく；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する。

【0073】

一例では、完全長抗体の重鎖の一方は、ＥＵインデックスの番号付けによる、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗおよび必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうちの１つ、好ましくは、Ｓ３５４Ｃ）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ、好ましくは、Ｙ３４９Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）。

【0074】

一部の実施形態では、（ａ）の下の２つの抗体重鎖は、ｉ）配列番号３７のアミノ酸１〜４４９（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖（すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する）に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３４９位にＣ、３６６位にＳ、３６８位にＡおよび４０７位にＶ（ＥＵ番号付け）を有する、第１の抗体重鎖；ならびにｉｉ）配列番号３６のアミノ酸１〜４４９（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３５４位にＣおよび３６６位にＷ（ＥＵ番号付け）を有する、第２の抗体重鎖を含む。

【0075】

必要に応じて、リンカーは、上記の通りである。

【0076】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号３６の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号３７の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号３８の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む。

【0077】

さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、Ｐ１ＡＤ９８２７と本明細書で呼ばれる分子である。

【0078】

別の実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、上記の三価構造を有してもよく、
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号４７もしくは４８のアミノ酸１〜４４８（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する（すなわち、リンカーの前の配列の部分に対する）少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号４９の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；ならびに／または
ｂ）
ｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）、
ｉｉｉ）配列番号７もしくは配列番号９（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号７）の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに／または
ｃ）
ｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン；
ｉｉｉ）配列番号８もしくは配列番号１０（一部の実施形態では、好ましくは、配列番号８）の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含んでもよく；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する。

【0079】

一例では、完全長抗体の重鎖の一方は、ＥＵインデックスの番号付けによる、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗおよび必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうちの１つ、好ましくは、Ｓ３５４Ｃ）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、必要に応じて、Ｙ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ、好ましくは、Ｙ３４９Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）。

【0080】

一部の実施形態では、（ａ）の下の２つの抗体重鎖は、ｉ）配列番号４８のアミノ酸１〜４４８（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖（すなわち、リンカーの前の配列の部分）に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３４９位にＣ、３６６位にＳ、３６８位にＡおよび４０７位にＶ（ＥＵ番号付け）を有する、第１の抗体重鎖；ならびにｉｉ）配列番号４７のアミノ酸１〜４４８（両端の値を含み、連続する番号付けに基づく）の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し、３５４位にＣおよび３６６位にＷ（ＥＵ番号付け）を有する、第２の抗体重鎖を含む。

【0081】

必要に応じて、リンカーは、上記の通りである。

【0082】

別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号４７の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号４８の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号４９の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む。

【0083】

さらに別の実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、Ｐ１ＡＤ９８２６と本明細書で呼ばれる分子である。

【0084】

さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットに関する。さらなる実施形態では、本発明は、前記ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含むベクターまたは発現ベクターのセット、必要に応じて、発現ベクターに関する。さらなる目的では、本発明は、本発明のベクターを含む原核または真核宿主細胞に関する。さらに、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む、抗体を生産する方法が提供される。

【0085】

本明細書に記載される二重特異性または多重特異性抗体は、プレターゲティングされた放射線免疫療法およびプレターゲティングされた放射線免疫イメージングなどの、治療および診断適用を含む様々な適用において有用であってよい。

【0086】

かくして、さらなる態様では、本発明は、プレターゲティングされた放射線イメージングにおける使用のための本明細書に記載の任意の二重特異性または多重特異性抗体に関する。そのような実施形態では、キレート化されたＰｂは、好ましくは、^２０３Ｐｂである。

【0087】

イメージングのために放射性同位体を組織または臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること；および
ｉｉ）続いて、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種であって、標的細胞の表面に局在化された抗体に結合する、ＤＯＴＡＭまたはその前記機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。

【0088】

必要に応じて、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位に結合する除去剤を投与する。除去剤は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのための抗原結合部位をブロックし、循環している抗体がキレート化されたＰｂ放射性核種に結合するのを防止する。あるいは、またはさらに、除去剤は、体内からの抗体のクリアランスの速度を増大させることができる。「除去剤」は、あるいは「ブロッキング剤」と呼んでもよい：これらの用語は、以下の考察において互いに置換することができる。

【0089】

除去剤は、金属イオンと、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントとの複合体であって、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのための抗原結合部位によって認識される前記複合体を含んでもよい。好ましくは、金属イオンは、安定な同位体または本質的に安定な同位体である。「安定な同位体」とは、放射性崩壊を受けない同位体を意味する。「本質的に安定な同位体」とは、非常に長い半減期で放射性崩壊を受け、それを使用にとって安全にする同位体を意味する。好ましくは、金属イオンは、Ｐｂ、ＣａおよびＢｉのイオンから選択される。例えば、除去剤は、ＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントと複合体化したＰｂ、ＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントと複合体化したＣａ、またはＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントと複合体化した^２０９Ｂｉ（１．９ｘ１０^１９年の半減期を有する本質的に安定な同位体）の安定な同位体を含んでもよい。Ｐｂは、安定な（非放射性）同位体^２０４Ｐｂ、^２０６Ｐｂ、^２０７Ｐｂおよび^２０８Ｐｂの混合物である、天然に存在する鉛であってもよい。

【0090】

ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、除去部分にコンジュゲートされる。この部分は、例えば、そのサイズおよび／または高い流体力学半径のため、腫瘍への取込みが低い除去剤を提供する。好適な除去部分は、以下でさらに考察される。一部の実施形態では、除去剤は、デキストランまたはその誘導体にコンジュゲートされたＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含んでもよい。

【0091】

イメージング方法の別の実施形態では、多重特異性または二重特異性抗体を、投与の時点でキレート化されたＰｂ放射性核種に結合させることができる。

【0092】

必要に応じて、任意の実施形態では、前記方法は、
ｉｉｉ）ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種が局在化された組織または臓器をイメージングすること
をさらに含んでもよい。

【0093】

一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍特異的抗原であってよく、イメージングは、腫瘍または複数の腫瘍をイメージングする方法であってもよい。

【0094】

さらなる態様では、本発明は、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための本明細書に記載の抗体に関する。そのような実施形態では、キレート化されたＰｂは、好ましくは、^２１２Ｐｂである。

【0095】

療法のために放射性同位体を組織または臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること；および
ｉｉ）続いて、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を投与すること
を含んでもよい。

【0096】

必要に応じて、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に、除去剤を上記のように投与する。

【0097】

一部の実施形態では、標的抗原は、腫瘍関連抗原であり、方法は、がんを処置する方法である。他の実施形態では、標的抗原は、感染と関連する抗原、例えば、原核生物またはウイルス感染細胞によって発現されるタンパク質であってもよい。

【0098】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体を、併用療法の一部として投与することができる。例えば、それらを、１つまたは複数の放射線増感剤および／または化学療法剤と組み合わせて投与してもよい：放射線増感剤または化学療法剤と、抗体とを、同時的に、またはいずれかの順序で連続的に投与してもよい。

【0099】

本明細書に記載の放射線イメージングおよび放射線免疫療法の方法を、必要に応じて、例えば、抗体および^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの両方を、例えば、混合物として投与することによって、組み合わせることができる。

【0100】

本発明はさらに、本発明の抗体と、薬学的に許容される添加物とを含む医薬組成物にも関する。

【0101】

さらなる実施形態では、本発明は、本発明の抗体と、
ｉ）薬学的に許容される添加物；
ｉｉ）ＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントによってキレート化されたＰｂ放射性核種；
ｉｉｉ）本明細書に記載の除去剤；
ｉｖ）１つもしくは複数のさらなる化学療法剤；および／または
ｖ）１つもしくは複数の放射線増感剤
のうちの１、２、３、４つもしくは全部を含むキットに関する。

【0102】

本発明のさらなる態様では、本発明者らは、新規除去剤を開発してきた。そのような除去剤を、本明細書に記載のような診断、イメージングまたは治療の方法のいずれかにおいて使用することができる。

【0103】

一態様では、本発明は、ＤＯＴＡＭおよびＤＯＴＡＭの機能的バリアントから選択されるキレート剤にコンジュゲートされたデキストランまたはその誘導体を含む除去剤であって、前記キレート剤がＰｂ、Ｚｎ、ＣａまたはＢｉと複合体を形成する除去剤に関する。除去剤は、典型的には、Ｐｂ、Ｚｎ、ＣａまたはＢｉイオンなどの、キレート化された金属イオンを含む。

【0104】

除去剤は、ＤＯＴＡＭまたはＤＯＴＡＭの機能的バリアントにカップリングされたアミノデキストランを含んでもよい。例えば、除去剤は、イソチオシアネートカップリングを用いてアミノデキストランにカップリングされたＤＯＴＡＭ（例えば、アミノデキストランをｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＴＣＭＣと反応させることによって得られる化合物）を含んでもよい。

【0105】

除去剤の使用に伴う１つの潜在的な困難は、それらが腫瘍に進入し、放射性リガンドのその後の結合に負に影響し得る可能性である。

【0106】

本発明者らはさらに、ｉ）高い平均分子量を有する、およびｉｉ）ある特定のサイズより下の断片が除去されるように分子量カットオフにかけられた、デキストランベースの除去剤を使用する場合、腫瘍への低い除去剤浸透と共に、血液からの良好なクリアランスを達成することができることを見出した。

【0107】

かくして、好ましい除去剤は、ｉ）除去剤中のデキストランまたはその誘導体の平均分子量が、２００〜８００ｋＤａ、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより高く、必要に応じて、７００、６５０、６００または５５０ｋＤａ未満であり、必要に応じて、約５００ｋＤａであるもの、およびｉｉ）特定の分子量カットオフ未満のデキストラン、デキストラン誘導体または除去剤が除去され、分子量カットオフが５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上であり、必要に応じて、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａまたは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲にあり、必要に応じて、約１００ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは２００ｋＤａであるものであってもよい。

【0108】

さらなる態様では、本発明は、除去剤を調製する方法、および放射線免疫療法または放射線免疫イメージングの方法における除去剤の使用に関する。

【0109】

本発明のこれらの態様および他の態様は、以下でさらに考察される。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】図１は、可能な二重特異性抗体形式の模式図を示す。この形式は、１種の標的（Ａ）に対する２個の抗原結合部位、および第２の標的（Ｂ）に対する１個の抗原結合部位を含む（２：１形式）。

【図2】図２は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体形成したＰＲＩＴ−０２１３の構造を示す。

【図3】図３は、カバット（Kabat）に従って番号付けした、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体形成したＰＲＩＴ−０２１３の相互作用部位に関する表示を示す。

【図4】図４は、放射標識されたＤＯＴＡＭの注射２４時間後の^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。ＰＲＩＴ−０２０６、−０２０７、−０２０８および−０１６５は、Ｔ８４．６６を標的とし、一方、ＰＲＩＴ−０１８６、−０１８７および−０１５６は、ＣＨ１Ａ１Ａを標的とする。ＰＲＩＴ−０１７５は、非ＣＥＡ結合コントロールである。

【図5】図５は、放射標識されたＤＯＴＡＭと予め結合させたＰＲＩＴ抗体の注射９６時間後のカウント毎分（ＣＰＭ）として表現される、^２０３Ｐｂの分布を示す（ＣＰＭ±ＳＤ、ｎ＝３）。ＰＲＩＴ−０２０５、−０２０６、−０２０７、−０２０８および−０２０９は、完全にヒト化されたコンストラクトであり、一方、ＰＲＩＴ−０１６５および−０１７５は、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールである。

【図6】図６は、放射標識されたＤＯＴＡＭと予め結合させたＰＲＩＴ抗体の注射後の様々な時点における、ＣＰＭ±ＳＤ（ｎ＝３）として表現される、ＢｘＰＣ３腫瘍および血液における^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ｂｓＡｂの蓄積／クリアランスを示す。ＰＲＩＴ−０２０６は、ＰＲＩＴ−０１６５の完全にヒト化型である；ＰＲＩＴ−０１７５は、非ＣＥＡ結合コントロールである。

【図7】図７は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図8】図８は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２４時間後の、選択された組織および尿における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図9】図９は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２４時間後の、選択された組織および尿における臓器別の（organ-wise）放射能分布を示す（％ＩＤ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図10】図１０は、腫瘍がないマウスにおける^２０３Ｐｂ標識された除去剤の注射１週間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図11】図１１は、腫瘍がないマウスにおける^２０３Ｐｂ標識された除去剤の注射１週間後の、選択された組織における臓器別の放射能分布を示す（％ＩＤ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図12】図１２は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射４時間後の、血液における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。縞模様のバーは、全候補試薬を比較した、ＣＡなしコントロール（除去剤なし）を表す。アステリスクは、低（＊）から高（＊＊＊）へと、統計的有意性のレベルをマークする。

【図13】図１３は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液における平均放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。縞模様のバーは、全候補試薬を比較した、ＣＡなしコントロール（除去剤なし）を表す。

【図14】図１４は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図15】図１５は、３０もしくは１００μｇの二重特異性抗体および１０〜１００μｇの除去剤と１００もしくは３０ｋＤａ濾過カットオフ、または除去剤完全不含（ＰＢＳ）を使用した、放射標識されたＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図16】図１６は、漸増量の除去剤（０〜１００μｇ）による、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂの放射能（activity）濃度における効果を示す。腫瘍は、１００μｇのＰＲＩＴ−０１６５を使用してプレターゲティングし、続いて４日後に、１００ｋＤａカットオフでＤｅｘ５００ダイアフィルトレーションした、またはＰＢＳを使用してこれを行った。除去剤の２時間後に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを投与した。記号は、放射能注射２４時間後の％ＩＤ／ｇを表し、線は、腫瘍データの線形回帰を表す。

【図17】図１７は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。暗灰色および黒色のバーは、候補試薬を比較した、ＣＡなしポジティブコントロール（除去剤なし）を表す。

【図18】図１８は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂ含有量（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）、ならびに対応する腫瘍対血液比を示す。暗灰色および黒色のバーは、候補試薬を比較した、ＣＡなしポジティブコントロール（除去剤なし）を表す。

【図19】図１９は、除去剤（ＣＡ）量（ＰＪＲＤ０８−４６）およびＴＣＭＣ飽和の関数として、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の腫瘍対血液比を示す（９対、２０対、３９対または８４対１）。破線は、それぞれのデータの線形回帰（Ｒ^２＝０．８２）および非線形曲線適合（Ｒ^２＝０．７４）を表す。

【図20】図２０は、放射標識されたＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。白色および灰色の背景を有するバーは、それぞれＴ８４．６６およびＣＨ１Ａ１Ａのターゲティングを表す；黒色のバーは、非ＣＥＡ結合コントロールを表す。

【図21】図２１は、ＢｘＰＣ３モデルにおける処置サイクル１および２に関する、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＥＭ、ｎ＝３）。

【図22】図２２は、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図23】図２３は、初期体重のパーセンテージとして表現される、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重変化を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図24】図２４は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する腫瘍増殖平均と標準誤差を示す（ｎ＝８）。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図25】図２５は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する個々の腫瘍増殖曲線を示す。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【図26】図２６は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇにおける生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す（ｎ＝８）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【図27】図２７は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける処置サイクル１および２に関する、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図28】図２８は、ＬＳ１７４ＴモデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図29】図２９は、初期体重のパーセンテージとして表現される、ＬＳ１７４ＴモデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重変化を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図30】図３０は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇに関する腫瘍増殖平均と標準誤差を示す（ｎ＝８）。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図31】図３１は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇに関する個々の腫瘍増殖曲線を示す。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【図32】図３２は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇにおける生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す（ｎ＝８）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【図33】図３３は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。灰色のバーは、様々な量のＤｅｘ５００−（５０％）除去剤（ＣＡ）の注射後の組織蓄積を表す；黒色のバーは、ＣＡなしコントロール（除去剤なし）を表す。

【図34】図３４は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂ含有量、ならびに対応する腫瘍対血液比を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。灰色のバーは、様々な量のＤｅｘ５００−（５０％）除去剤（ＣＡ）の注射後の組織蓄積を表す；黒色のバーは、ＣＡなしコントロール（除去剤なし）を表す。

【図35】図３５は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射４時間後の、血液における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図36】図３６は、ＭＫＮ−４５細胞への１種の抗体（ＰＲＩＴ−０１６５）の結合を示し、これを、二次検出（右パネル、Ａｌｅｘａ ４８８）またはＤＯＴＡＭ ＦＩＴＣ（左パネル、ＦＩＴＣ−Ａ）のいずれかを使用して検出する。

【図37】図３７は、例示的な標的抗原としてＣＥＡを使用して、二重特異性抗体の可能な形式を示す。他の標的抗原を使用することもできる。

【図38】図３８は、Ｈｅｒ２結合能を実証するための、ＫＰＬ−４細胞へのＰ１ＡＤ８９２７の結合を示す：ヒトＩｇＧ特異的二次抗体を使用した抗体の検出。

【図39】図３９は、ＤＯＴＡＭ結合能を実証するための、ＫＰＬ−４細胞へのＰ１ＡＤ８９２７の結合を示す：Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＦＩＴＣを使用した、アイソタイプ補正された検出。

【図40】図４０は、ＣＤ２０結合能を実証するための、Ｒａｊｉ細胞へのＰ１ＡＤ８９２６の結合を示す：ヒトＩｇＧ特異的二次抗体を使用した抗体の検出。

【図41】図４１は、ＤＯＴＡＭ結合能を実証するための、Ｒａｊｉ細胞へのＰ１ＡＤ８９２６の結合を示す：Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＦＩＴＣを使用した、アイソタイプ補正された検出。

【図42】図４２は、ＳＣＩＤマウスにおけるｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍のＣＥＡ−ＰＲＩＴを評価する、プロトコール１０３の試験概要を示す（ｈ＝時間、ｄ＝日、ｗ＝週）。

【図43】図４３：パネルＡは、％ＩＤ／ｇ±ＳＤ（ｎ＝３）として表現される、両方の処置サイクル後の収集された組織における^２１２Ｐｂの平均蓄積を示す。パネルＢは、安楽死時の対応する腫瘍体積（ｍｍ^３）と共に、マウス毎の^２１２Ｐｂの個々の腫瘍取込みを示す。

【図44】図４４は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する平均腫瘍増殖曲線と標準誤差を示す（ｎ＝１０）。ｎ＜５で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与（３０または１０μＣｉ）を示す。

【図45】図４５は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する個々の腫瘍増殖曲線を示す（ｎ＝１０）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与（３０または１０μＣｉ）を示す。

【図46】図４６は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇにおける生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す（ｎ＝１０）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与（３０または１０μＣｉ）を示す。

【図47】図４７は、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇにおける平均体重減少を示す（ｎ＝１０）。ｎ＜５で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【図48】図４８は、ｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２０３Ｐｂ−ＢｓＡｂ（２０μＣｉ、１００μｇ）の分布を示す。マウスに、２０μＣｉの予め結合した^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭまたは^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ（ネガティブコントロール）を注射し、続いて注射後１、４、７または１０日目に臓器採集して、収集された組織における蓄積された放射能を評価した（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝５）。

【図49】図４９は、２０μＣｉ／１００μｇの予め結合した^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭまたは^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ（ネガティブコントロール）の注射１〜１０日後のｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍における^２０３Ｐｂ−ＢｓＡｂの蓄積を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝５）。

【図50】図５０は、ｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す。放射能注射の５分〜４８時間後に、マウスに、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与前にＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂおよびＣＡを注射した（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝５）。＊経時的な、すなわち、以前の値を含む各時点における、尿および糞便における累積的^２１２Ｐｂ含有量。尿における推定％ＩＤ／ｇは、５匹のマウスからプールされた尿／洗浄液（５０ｍＬ）の１／５（１０ｍＬ）に基づいた。

【図51】図５１は、ｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡ、および５種の異なる金属（Ｚｎ、Ｇｄ、Ｃｕ、ＣａまたはＰｂ）のいずれかによりクエンチされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを使用したＰＲＩＴ後の^２１２Ｐｂのｉｎ ｖｉｖｏ分布を評価する、プロトコール１３１の試験概要を示す（ｄ＝日、ｈ＝時間）。

【図52】図５２は、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ−プレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２時間後の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝４）。

【図53】図５３は、異なる金属でクエンチされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２時間後の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスの選択された正常組織における^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ）。

【図54】図５４は、ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂまたはネガティブコントロールＤＩＧ−ＤＯＴＡＭによってプレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図55】図５５は、ＨＥＲ２−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂまたはネガティブコントロールＤＩＧ−ＤＯＴＡＭによってプレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図56】図５６は、ｓ．ｃ．ＨＰＡＦ−ＩＩ腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、様々なＢｓＡｂコンストラクトを使用したＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの体内分布を評価する、プロトコール１５４の試験概要を示す（ｈ＝時間、ｄ＝日）。

【図57】図５７は、ネガティブコントロールＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ、標準ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂまたは代替ＢｓＡｂコンストラクトの１種のいずれかによってプレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射６時間後の腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図58】図５８は、ネガティブコントロールＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ、標準ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂまたは代替ＢｓＡｂコンストラクトの１種のいずれかによってプレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射６時間後の^２１２Ｐｂの血液含有量および腫瘍蓄積を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【図59】図５９は、プロトコール１６２の実験スケジュールを示す。ｓ．ｃ．ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおいて、ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ、Ｃａ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡおよび^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを使用してＣＤ２０−ＰＲＩＴを実行した；ｓ．ｃ．ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおいて、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと予め結合させたＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ（^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ）を使用して１段階ＲＩＴを実行した。

【図60】図６０は、ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ−プレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭまたは予め結合させた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂの分布を示す。臓器および組織における放射能含有量は、平均％ＩＤ／ｇおよび標準偏差（ＳＤ；ｎ＝３）として表現される。

【図61】図６１は、ｍｍ^３±ＳＥＭ（ｎ＝１０）で表現される、群Ａ〜Ｇに関する平均ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ ｓ．ｃ．腫瘍増殖を示す。

【図62】図６２は、初期体重±ＳＥＭの％として表現される、様々な処置後のマウス体重の平均変化を示す。点線は、処置スキームに応じた^２１２Ｐｂまたは抗体注射を示す。

【発明を実施するための形態】

【0111】

定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それと同じアミノ酸配列を含んでもよいか、またはそれはアミノ酸配列変化を含有してもよい。一部の実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下である。一部の実施形態では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。

【0112】

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の合計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性を、本明細書に記載のものを含む、当業界で公知の一般的方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特異的な実証的および例示的実施形態は、以下に記載される。

【0113】

「親和性成熟」抗体とは、１つまたは複数の変更を有しない親抗体と比較して、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）中にそのような変更を有する抗体を指し、そのような変更は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。

【0114】

用語「抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体」、「Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに結合する抗体」、「Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合する抗体」、および同等の用語は、抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ標識部分を分離するための選別および／もしくは精製スキームにおいて有用であるような、ならびに／または例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを細胞に標的化するために、抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを、抗体の部位に局在化させることができるような、十分な親和性でＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合することができる抗体を指す。用語「抗標的抗体」および「標的に結合する抗体」は、抗体が、例えば、細胞の表面上に発現される場合、抗体の標的への局在化を含む治療および／または診断適用において有用であるような十分な親和性で標的に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗体の、関連しない部分および／または関連しない標的タンパク質への結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される場合、抗体のＰｂ−ＤＯＴＡＭまたは標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍ以下、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよび／または標的に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0115】

本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む様々な抗体構造を包含する。

【0116】

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

【0117】

参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする抗体、逆に、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％以上ブロックする参照抗体を指してもよい。例示的な競合アッセイは、本明細書に提供される。

【0118】

用語「キメラ」抗体とは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が、異なる供給源または種に由来する抗体を指す。

【0119】

抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、およびＩｇＡ_２にさらに分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

【0120】

本明細書で使用される場合、用語「細胞傷害性剤」とは、細胞機能を阻害する、もしくは防止する、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤としては、限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、^２２５Ａｃ、^２１１Ａｔ、^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^９０Ｙ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１５３Ｓｍ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^３２Ｐ、^２１２ＰｂおよびＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または薬（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）；増殖阻害剤；拡散分解酵素などの酵素およびその断片：抗生物質；低分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性毒素（その断片および／またはバリアントを含む）などの毒素；ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤が挙げられる。

【0121】

「エフェクター機能」とは、抗体アイソタイプと共に変化する、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。

【0122】

薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療または予防結果を達成するのに必要な用量で、および期間にわたって有効な量を指す。

【0123】

本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域およびＦｃ領域バリアントを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に向かって伸びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在しなくてもよい。本明細書で別途特定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されたように、ＥＵインデックスとも呼ばれる。

【0124】

「フレームワーク」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。

【0125】

用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」は、本明細書では互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似する構造を有する、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。完全長抗体は、例えば、ＩｇＧであってもよい。

【0126】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、初代形質転換細胞および継代回数に関係なく、それに由来する子孫を含む「形質転換体」および「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量において親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含有してもよい。元々形質転換された細胞中でスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫も、本明細書に含まれる。

【0127】

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、具体的には非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。

【0128】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、選択されたヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列中に最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、選択されたヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般的には、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１−３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１）、第１−３巻に記載されたようなサブグループである。一実施形態では、ＶＬについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら、上掲に記載のようなサブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔら、上掲に記載のようなサブグループＩＩＩである。

【0129】

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基と、ヒトＦＲに由来するアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全部または実質的に全部が非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全部または実質的に全部がヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むであろう。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。「ヒト化型」の抗体、例えば、非ヒト抗体とは、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0130】

本明細書で使用される場合、用語「超可変領域」または「ＨＶＲ」とは、配列において超可変性である（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含有する、抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、抗体は、３個はＶＨ中に（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３個はＶＬ中に（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、６個のＨＶＲを含む。例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７頁（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｃｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２〜７４５頁（１９９６））；ならびに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、および９４〜１０２（Ｈ３）
を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せを含む。

【0131】

上記の代わりに、本明細書に記載のＣＤＲ−Ｈ１の配列は、Ｋａｂａｔ２６からＫａｂａｔ３５まで伸びてもよい。

【0132】

一実施形態では、ＨＶＲまたはＣＤＲ残基は、表２または本明細書の他の箇所で同定されるものを含む。

【0133】

別途指示がない限り、ＨＶＲ／ＣＤＲ残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、Ｋａｂａｔら、上掲によって番号付けられる。

【0134】

「イムノコンジュゲート」は、限定されるものではないが、細胞傷害性剤を含む、１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

【0135】

「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されるものではないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。ある特定の実施形態では、個体または対象は、ヒトである。

【0136】

本明細書に記載の分子は、「単離されて」いてもよい。「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離されたものである。一部の実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定された場合、９５％または９９％の純度よりも高く精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９〜８７頁（２００７）を参照されたい。

【0137】

用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。それぞれのヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリンまたはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、およびリン酸基から構成される。核酸分子は、核酸分子の一次構造（直鎖状構造）を表す、塩基の配列によって記載されることが多い。塩基の配列は、典型的には、５’から３’に向かって表される。本明細書では、核酸分子という用語は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成型、ならびにこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。核酸分子は、直鎖状または環状であってもよい。さらに、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方、ならびに一本鎖型と二本鎖型の両方を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、天然または非天然ヌクレオチドを含有してもよい。非天然ヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖もしくはリン酸骨格結合または化学修飾残基を有する修飾ヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子はまた、例えば、宿主または患者における、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの本発明の抗体の直接的発現のためのベクターとして好適であるＤＮＡおよびＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、非修飾または修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡを化学修飾して、ＲＮＡベクターの安定性および／またはコードされた分子の発現を増強し、ｍＲＮＡを対象に注射して、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成させることができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンライン公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６またはＥＰ２１０１８２３Ｂ１を参照されたい）。

【0138】

「単離された」核酸とは、その天然の環境の成分から分離されている核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0139】

「抗体をコードする単離された核酸」とは、単一のベクターまたは別々のベクター中のそのような核酸分子を含む、抗体重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする１つまたは複数の核酸分子を指し、そのような核酸分子は、宿主細胞中の１つまたは複数の位置に存在する。

【0140】

本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の生産中に生じる、あり得る抗体バリアントであって、一般的には、少量で存在するそのようなバリアントを除いて、その集団を含む個々の抗体は同一である、および／または同じエピトープに結合する。典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。かくして、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体を、限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な技術によって作製することができ、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法は、本明細書に記載される。

【0141】

「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。ネイキッド抗体は、薬学的製剤中に存在してもよい。

【0142】

「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合する２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖とから構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、次いで、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、それぞれの重鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、次いで、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの型の１つに割り当てることができる。

【0143】

用語「添付文書」は、適応症、使用、用量、投与、併用療法、禁忌および／または治療薬の使用に関する警告に関する情報を含有する、そのような治療薬の市販のパッケージに習慣的に含まれる説明書を指すために使用される。

【0144】

参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じて、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成した後、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントを、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公共的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用する、当業界における技術の範囲内にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって著されたものであり、そのソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザー文書と共にファイリングされており、米国著作権局登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから公共的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。

【0145】

ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、それと比べたの、またはそれに対するアミノ酸配列同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂとの、それと比べたの、またはそれに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有する、または含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のように算出される：
画分Ｘ／Ｙの１００倍
［式中、Ｘは、ＡとＢとの配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のアラインメントにおける、そのプログラムによる同一の一致としてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である］。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％と等しくないことが理解されるであろう。別途具体的に記述されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％の値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されたように得られる。

【0146】

用語「薬学的製剤」とは、そこに含まれる活性成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態にあり、製剤が投与される対象にとって許容できないほどに毒性であるさらなる成分を含有しない調製物を指す。

【0147】

「薬学的に許容される担体」とは、対象にとって非毒性的である、活性成分以外の、薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されるものではないが、バッファー、添加物、安定剤、または防腐剤が挙げられる。

【0148】

本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）は、治療される個体の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のため、または臨床病理の過程の間に実施することができる。治療の望ましい効果としては、限定されるものではないが、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行を減速させるために使用される。

【0149】

用語「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は、一般に、類似する構造を有し、それぞれのドメインは、４個の保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３個の超可変領域（ＨＶＲ）を含む（例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい）。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分なものであってよい。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、その抗原に結合する抗体に由来するＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離して、それぞれ、相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０〜８８７頁（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８頁（１９９１）を参照されたい。

【0150】

本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、それが連結される別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。

【0151】

本明細書で使用される場合、用語「Ｐｂ」または「鉛」は、そのイオン、例えば、Ｐｂ（ＩＩ）を含む。かくして、知識のある読者であれば、例えば、鉛、Ｐｂ、^２１２Ｐｂまたは^２０３Ｐｂという用語が、その元素のイオン形態、特に、Ｐｂ（ＩＩ）を包含することが意図されることを理解できる。本発明の様々な態様では、Ｐｂは、放射性同位体（例えば、放射線免疫療法もしくは放射線免疫イメージングの方法において使用する場合）であってよいか、または安定な、非放射性同位体（例えば、除去剤の文脈において好ましい場合があるように）であってよい。

【0152】

「ＤＯＴＡＭ」は、化学名：１，４，７，１０−テトラキス（カルバモイルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンを有し、
以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

の化合物である。

【0153】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、以下の構造：

[この文献は図面を表示できません]

を有する。

【0154】

本発明は、ある特定の態様および実施形態では、金属イオンを含むＤＯＴＡＭの機能的バリアントまたは誘導体も使用する。ＤＯＴＡＭの好適なバリアント／誘導体は、ＤＯＴＡＭの構造とはある特定の限られた程度で異なり、機能する能力を保持する（すなわち、本明細書に記載の１つまたは複数の目的のために使用される十分な活性を保持する）。そのような態様および実施形態では、ＤＯＴＡＭおよびＤＯＴＡＭの機能的バリアント／誘導体は、ＷＯ２０１０／０９９５３６に開示された活性バリアントの１つであってもよい。

【0155】

好適な機能的バリアント／誘導体は、以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

の化合物、またはその薬学的に許容される塩
［式中、
Ｒ^Ｎは、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４−アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、およびＣ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４−アルキルであり；Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、およびＣ_２〜６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｗ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４−アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、およびＣ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４−アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｘ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｌ^１は、独立してＣ_１〜６アルキレン、Ｃ_１〜６アルケニレン、またはＣ_１〜６アルキニレンであり、それぞれ、１、２または３個の独立して選択されるＲ^１基で置換されていてもよく；
Ｌ^２は、Ｃ_２〜４直鎖アルキレンであり、独立して選択されるＲ^１基で置換されていてもよく；Ｃ_１〜４アルキルおよび／またはＣ_１〜４ハロアルキルから独立して選択される１、２、３または４個の基で置換されていてもよく；
Ｒ^１は、Ｄ^１−Ｄ^２−Ｄ^３、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルコキシ、Ｃ_１〜６ハロアルコキシ、Ｃ_１〜６アルキルチオ、Ｃ_１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ_１〜６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１〜６アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜６アルキルアミノ、Ｃ_１〜４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１〜６アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜６アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１〜６アルコキシカルボニル−（Ｃ_１〜６アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１〜６アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１〜６アルキルカルバミルから独立して選択され、
Ｄ^１はそれぞれ、Ｃ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜９ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_３〜１０シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜９ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜８アルキレン、Ｃ_１〜８アルケニレン、およびＣ_１〜８アルキニレンから独立して選択され；前記Ｃ_１〜８アルキレン、Ｃ_１〜８アルケニレン、およびＣ_１〜８アルキニレンは、１、２、３または４個の独立して選択されるＲ^４基で置換されていてもよく；前記Ｃ_６〜１０アリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜９ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_３〜１０シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜９ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^５基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｄ^２はそれぞれ、独立して存在しないか、またはＣ_１〜２０直鎖アルキレンであり、前記Ｃ_１〜２０直鎖アルキレンの１〜６個の非隣接メチレン基は、独立して選択される−Ｄ^４−部分でそれぞれ置き換えられていてもよいが、但し、前記Ｃ_１〜２０直鎖アルキレン中の少なくとも１個のメチレン単位は、必要に応じて−Ｄ^４−部分で置き換えられていないことを条件とし；前記Ｃ_１〜２０直鎖アルキレンは、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４ハロアルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ_１〜４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１〜４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルアミノ、Ｃ_１〜４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１〜４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１〜４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１〜４アルキルカルバミルから独立して選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよく；
Ｄ^３はそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、Ｃ_３〜１４シクロアルキル、Ｃ_３〜１４シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜１４ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_６〜１４アリール、Ｃ_６〜１４アリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜１３ヘテロアリール、Ｃ_１〜１３ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^６基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３〜１４シクロアルキル、Ｃ_３〜１４シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜１４ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_６〜１４アリール、Ｃ_６〜１４アリール−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜１３ヘテロアリール、Ｃ_１〜１３ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルは、１、２、３または４個の独立して選択されるＲ^７基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｄ^４はそれぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｓ）−、−ＮＲ^ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｃ−−ＮＲ^ｂＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ｃ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ−、−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ｂＳ（＝Ｏ）ＮＲ^ｃ−、およびＮＲ^ｂＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｏ−から独立して選択され；
Ｒ^４およびＲ^６はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ_１〜４ハロアルコキシ、Ｃ_１〜４アルキルチオ、Ｃ_１〜４アルキルスルフィニル、Ｃ_１〜４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１〜４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルアミノ、Ｃ_１〜４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１〜４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１〜４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１〜４アルキルカルバミルから独立して選択され；
Ｒ^５はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、シアネート、イソチオシアネート、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜４アルケニル、Ｃ_２〜４アルキニル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ_１〜４ハロアルコキシ、Ｃ_１〜４アルキルチオ、Ｃ_１〜４アルキルスルフィニル、Ｃ_１〜４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１〜４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルアミノ、Ｃ_１〜４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１〜４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１〜４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１〜４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１〜４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１〜４アルキルカルバミルから独立して選択され；
Ｒ^７はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキル、−ＯＲ^Ｏ、−ＳＲ^Ｏ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^Ｐ、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｐ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｒ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｒ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｒ、−ＮＲ^ｑＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｒ、およびＮＲ^ＰＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｓＲ^ｔから独立して選択され；前記Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ’基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ’’基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、およびＲ^ｃはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｗ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｘ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ^Ｏ、Ｒ^ｐ、Ｒ^ｑ、Ｒ^ｒ、Ｒ^ｓおよびＲ^ｔはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニル、Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６ハロアルキル、Ｃ_２〜６アルケニル、Ｃ_２〜６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^ｙ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３〜７シクロアルキル、Ｃ_３〜７シクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２〜７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１〜４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜７ヘテロアリール、Ｃ_１〜７ヘテロアリール−Ｃ_１〜４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^ｚ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ’、Ｒ^ｗおよびＲ^ｙはそれぞれ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ_１〜４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１〜４アルキルアミノ、およびジ−Ｃ_１〜４アルキルアミノから独立して選択され；
Ｒ’’、Ｒ^ｘ、およびＲ^ｚはそれぞれ、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ_１〜４アルキル、Ｃ_１〜４ハロアルキル、Ｃ_１〜４アルコキシ、Ｃ_１〜４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１〜４アルキルアミノ、およびジ−Ｃ_１〜４アルキルアミノから独立して選択されるが；
但し、置換されていてもよい部分のそれぞれの原子の価数を超えないことを条件とする］
であってもよい。

【0156】

好適には、上記式の機能的バリアント／誘導体は、ＤＯＴＡＭのものと同等であるか、またはそれより高い本発明の抗体に対する親和性を有し、ＤＯＴＡＭのものと同等であるか、またはそれより高い、Ｐｂに対する結合強度を有する（「親和性」は、上記のように、解離定数によって測定される）。例えば、本発明の抗体または／Ｐｂとの機能的バリアント／誘導体の解離定数は、同じ抗体／ＰｂとのＤＯＴＡＭの解離定数よりも１．１倍以下、１．２倍以下、１．３倍以下、１．４倍以下、１．５倍以下、または２倍以下であってもよい。

【0157】

Ｒ^Ｎはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１〜６アルキル、またはＣ_１〜６ハロアルキル；好ましくは、Ｈ、Ｃ_１〜４アルキル、またはＣ_１〜４ハロアルキルであってよい。最も好ましくは、Ｒ^ＮはそれぞれＨである。

【0158】

ＤＯＴＡＭバリアントについて、１、２、３個または最も好ましくは、それぞれのＬ^２は、Ｃ_２アルキレンである。有利には、ＤＯＴＡＭのＣ_２アルキレンバリアントは、Ｐｂに対する特に高い親和性を有してもよい。Ｌ^２のための任意の置換基は、Ｒ^１、Ｃ_１〜４アルキル、またはＣ_１〜４ハロアルキルであってもよい。好適には、Ｌ^２のための任意の置換基は、Ｃ_１〜４アルキルまたはＣ_１〜４ハロアルキルであってもよい。

【0159】

必要に応じて、Ｌ^２はそれぞれ、非置換Ｃ_２アルキレン−ＣＨ_２ＣＨ_２−であってもよい。

【0160】

Ｌ^１はそれぞれ、好ましくは、Ｃ_１〜４アルキレン、より好ましくは、−ＣＨ_２−などのＣ_１アルキレンである。

【0161】

機能的バリアント／誘導体はまた、１つまたは複数のさらなる部分、例えば、低分子、ポリペプチドまたは炭水化物にコンジュゲートされた、ＤＯＴＡＭまたは上記の化合物を含んでもよい。この結合は、大員環の骨格中の１個の炭素を介して生じてもよい。低分子は、例えば、色素（Ａｌｅｘａ ６４７もしくはＡｌｅｘａ４８８）、ビオチンまたはビオチン部分であってもよい。ポリペプチドは、例えば、オリゴペプチド、例えば、抗体などの治療ペプチドまたはポリペプチドであってもよい。例示的な炭水化物としては、デキストラン、直鎖状または分枝状ポリマーまたはコポリマー（例えば、ポリアルキレン、ポリ（エチレン−リジン）、ポリメタクリレート、ポリアミノ酸、多糖またはオリゴ糖、デンドリマー）が挙げられる。

【0162】

ＤＯＴＡＭの機能的バリアント／誘導体は、以下の式：

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［式中、Ｚはそれぞれ独立して、上で定義されたＲ^１であり；ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、０、１または２であり；ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓは１以上である］
の化合物であってもよい。好ましくは、ｐ、ｑ、ｒ、およびｓは、０もしくは１である、および／またはｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓは１である。例えば、化合物は、ｐ＋ｑ＋ｒ＋ｓ＝１を有してもよく、Ｚはｐ−ＳＣＮ−ベンジル部分であり、そのような化合物は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌａｎｏ、Ｔｅｘａｓ）から市販されている。

【0163】

詳細な説明
組成物および方法
抗体
一態様では、本発明は、部分的には、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ（すなわち、本明細書では「Ｐｂ−ＳＯＴＡＭキレート」とも呼ばれる、Ｐｂと複合体化したＤＯＴＡＭを含むキレート）に特異的に結合する抗体の提供に基づく。

【0164】

ある特定の実施形態では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに特異的に結合する抗体は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有してもよい：
・Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよびＢｉ−ＤＯＴＡＭに特異的に結合する；
・Ｃｕ−ＤＯＴＡＭなどの他のキレート化された金属と比較して、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに対して選択的である；
・非常に高い親和性でＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合する；
・本明細書に記載の抗体、例えば、ＰＲＩＴ−０２１３もしくはＰＲＩＴ−０２１４と同じＰｂ−ＤＯＴＡＭ上のエピトープに結合する、および／または前記抗体と同じ接触残基を有する。

【0165】

Ｐｂの放射性同位体は、診断および療法の方法において有用である。本発明において有用であり得る鉛の特定の放射性同位体としては、^２１２Ｐｂおよび^２０３Ｐｂが挙げられる。鉛の安定な同位体、例えば、^２０４Ｐｂ、^２０６Ｐｂ、^２０７Ｐｂまたは^２０８Ｐｂを、除去剤において使用することもできる。Ｐｂは、安定な（非放射性）同位体^２０４Ｐｂ、^２０６Ｐｂ、^２０７Ｐｂおよび^２０８Ｐｂの混合物である、天然に存在する鉛であってもよい。

【0166】

α粒子放射体である放射性核種は、短い経路長と、高い線エネルギー付与との組合せのため、β放射体よりも周囲の組織に対する損傷が少なく、より特異的な腫瘍細胞殺傷の能力を有する。^２１２Ｂｉは、α粒子放射体であるが、その短い半減期はその直接的使用を阻む。^２１２Ｐｂは、^２１２Ｂｉの親放射性核種であり、^２１２Ｂｉのｉｎ ｖｉｖｏでの生成元として働き、それによって、^２１２Ｂｉの短い半減期を効率的に克服することができる（ＹｏｎｇおよびＢｒｅｃｈｂｉｅｌ、Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００１年６月２１日；４０（２３）６０６８〜６０７６頁）。

【0167】

^２０３Ｐｂは、イメージング同位体として有用である。かくして、^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに結合した抗体は、放射線免疫イメージング（ＲＩＩ）において有用であってよい。

【0168】

一般に、放射性金属は、キレート化された形態で使用される。本発明の態様では、ＤＯＴＡＭは、キレート剤として使用される。ＤＯＴＡＭは、Ｐｂ（ＩＩ）の安定なキレート剤である（ＹｏｎｇおよびＢｒｅｃｈｂｉｅｌ、Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．２００１年６月２１日；４０（２３）６０６８〜６０７６頁；Ｃｈａｐｐｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２７巻、９３〜１００頁、２０００）。かくして、ＤＯＴＡＭは、^２１２Ｐｂおよび^２０３Ｐｂなどの、上で考察された鉛の同位体とのコンジュゲーションにおいて特に有用である。

【0169】

上で考察された通り、本発明による抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに結合する。一部の実施形態では、抗体は、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下、例えば、０．９ｐＭ以下、０．８ｐＭ以下、０．７ｐＭ以下、０．６ｐＭ以下または０．５ｐＭ以下の結合親和性のＫｄ値でＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合することが好ましい。

【0170】

抗体はさらに、ＤＯＴＡＭによってキレート化されたＢｉに結合する。一部の実施形態では、抗体は、１ｎＭ、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ以下、例えば、９ｐＭ、８ｐＭ、７ｐＭ、６ｐＭ、５ｐＭ以下の結合親和性のＫｄ値でＢｉ−ＤＯＴＡＭ（すなわち、本明細書では「Ｂｉ−ＤＯＴＡＭキレート」とも呼ばれる、ビスマスと複合体化したＤＯＴＡＭを含むキレート）に結合することが好ましい。

【0171】

一部の実施形態では、抗体は、同様の親和性でＢｉ−ＤＯＴＡＭおよびＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合してもよい。例えば、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭ／Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに関する、親和性の比、例えば、Ｋｄ値の比は、０．１〜１０、例えば、１〜１０の範囲にあることが好ましい。

【0172】

本発明による例示的な抗体（ＰＲＩＴ−０２１３）に関する試料親和性値は、以下に提供される：

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【0173】

親和性は、ＫｉｎＥｘＡ平衡測定によって決定した。

【0174】

さらに、本発明の抗体は、好ましくは、Ｃｕ−ＤＯＴＡＭなどの他のキレート化された金属と比較して、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭおよび／またはＰｂ−ＤＯＴＡＭについて選択的である。例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ／Ｃｕ−ＤＯＴＡＭに関する、親和性の比、例えば、Ｋｄ値の比は、少なくとも１００，０００であってもよい。

【0175】

一部の実施形態では、抗体は、
ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を有する、二重特異性抗体（本明細書ではＰＲＩＴ−０２１３と呼ばれる）のものと等しいか、またはそれより高い親和性（例えば、親和性のＫｄ値）で、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよび／またはＢｉ−ＤＯＴＡＭに結合することが好ましい。

【0176】

一部の実施形態では、抗体は、
ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を有する、二重特異性抗体（本明細書ではＰＲＩＴ−０２１４と呼ばれる）のものと等しいか、またはそれより高い親和性（例えば、親和性のＫＤ値）で、ＤＯＴＡＭ−キレート化Ｐｂおよび／またはＤＯＴＡＭ−キレート化Ｂｉに結合することが好ましい。

【0177】

一部の実施形態では、本発明による抗体は、本明細書に開示される抗体と、同じか、または重複する、キレート化された放射性核種のエピトープに結合する。

【0178】

一部の実施形態では、抗体は、
ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を有する、Ｆａｂ ＰＲＩＴ−０２１３と同じか、または重複する、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレート（Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ）のエピトープに結合する。

【0179】

所与の抗体が結合するキレート化された放射性核種（例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ）のエピトープを決定することができ、これを、本明細書に開示される抗体（例えば、Ｆａｂ ＰＲＩＴ−０２１３）が結合するキレート化された放射性核種のエピトープと比較することができる。

【0180】

本開示は、実施例１４において、１．４０Åの分解能でＰｂ−ＤＯＴＡＭと複合体化したＦａｂ ＰＲＩＴ−０２１３の結晶構造の決定、ならびにタンパク質界面表面およびアセンブリ（ＰＩＳＡ）プログラム（ＫｒｉｓｓｉｎｅｌおよびＨｅｎｒｉｃｋ、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００７）３７２（３）：７７４〜９７頁）を使用したこの構造の分析に基づく、Ｆａｂ ＰＲＩＴ−０２１３とＰｂ−ＤＯＴＡＭとの結合相互作用の特性評価を記載する。

【0181】

一部の実施形態では、本発明による抗体は、例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体化した抗体の構造のＰＩＳＡ分析によって決定された場合、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに関して以下の部位の１つまたは複数：アザシクロドデカン環より下のアザシクロドデカン環領域（例えば、テトラシクロドデカン環）に対してエッジ・トゥー・フェイス、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ５および／またはＣ１２との相互作用を示してもよい。一部の実施形態では、抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに関して以下の部位の１つまたは複数：Ｎ７、Ｎ８、アザシクロドデカン環に対してエッジ・トゥー・フェイス、テトラシクロドデカン環および／またはＮ６との相互作用を示してもよい。

【0182】

一部の実施形態では、抗体は、例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体化した抗体の構造のＰＩＳＡ分析によって決定された場合、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに関して以下の相互作用の１つまたは複数：アザシクロドデカン環に対してエッジ・トゥー・フェイスの無極性相互作用、Ｎ８との極性相互作用、Ｎ７との水素結合、Ｎ８との水素結合、Ｎ５との極性相互作用、Ｃ１２との無極性相互作用、Ｎ７との極性相互作用、Ｎ６との極性（水素）結合、および／またはテトラシクロドデカン環との無極性相互作用を示してもよい。

【0183】

一部の実施形態では、抗体は、例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体化した抗体の構造のＰＩＳＡ分析によって決定された場合、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに関して以下の相互作用の１つまたは複数：抗体重鎖ＣＤＲ３の１つもしくは複数の残基とＮ７との水素結合、抗体重鎖ＣＤＲ３の１つもしくは複数の残基とＮ８との水素結合、アザシクロドデカン環に対してエッジ・トゥー・フェイスの抗体重鎖ＣＤＲ２の１つもしくは複数の残基間の無極性相互作用、抗体軽鎖ＣＤＲ３とテトラシクロドデカン環の間の無極性相互作用、および／または抗体軽鎖ＣＤＲ１とＮ６の間の無極性相互作用を示してもよい。

【0184】

他の実施形態では、抗体は、本明細書に記載のように同じ接触残基を共有してもよい：例えば、これらの残基は、インバリアントであってもよい。これらの残基は、以下のもの：
ａ）重鎖ＣＤＲ２中に：Ｐｈｅ５０、Ａｓｐ５６および／またはＴｙｒ５８、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／またはＡｒｇ５４も；
ｂ）重鎖ＣＤＲ３中に：Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｔｙｒ９９、Ａｌａ１００Ｃおよび／またはＴｙｒ１００Ｄ、必要に応じて、Ｐｒｏ１００Ｅも；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ１中に：Ｔｙｒ２８および／またはＡｓｐ３２；
ｄ）軽鎖ＣＤＲ３中に：Ｇｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよび／またはＴｙｒ９６；
ｅ）軽鎖ＣＤＲ２中に：必要に応じて、Ｇｌｎ５０
を含んでもよい。

【0185】

本発明による抗体のある特定の態様および実施形態は、上で考察されている。本発明によるさらに好適な態様および実施形態は、以下で考察される。全ての実施形態において、抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに、好ましくは、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭにも結合する能力を保持し、さらにより好ましくは、上で考察された親和性および／または選択性で結合する能力を保持する。

【0186】

一実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体を提供することができる。

【0187】

一実施形態では、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３および配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２および配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１を含む。さらなる実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。

【0188】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0189】

別の態様では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号３から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、ならびに（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0190】

別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。

【0191】

一部の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号１〜６のアミノ酸配列と比較して置換、例えば、１、２または３個の置換を有する、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２および／またはＣＤＲ−Ｌ３のうちの１つまたは複数を含んでもよい。これらの置換は、上記のようなインバリアントな位置には存在しないことが好ましい。

【0192】

例えば、一部の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２は、アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）、または配列番号２中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＰｈｅ５０、Ａｓｐ５６、および／もしくはＴｙｒ５８を含まず、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／もしくはＡｒｇ５４（全てＫａｂａｔによって番号付けられる）も含まない、そのバリアントを含んでもよい。

【0193】

一部の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下に示される１つまたは複数の位置で置換されていてもよい。ここで、および以下の置換表において、置換は、生殖系列残基（下線付き）に基づくか、または理論的に立体的に適合し、また、その部位で結晶化されたレパートリー中に存在するアミノ酸によるものである。一部の実施形態では、上記の残基を固定し、他の残基を以下の表に従って置換してもよい：他の実施形態では、任意の残基の置換を、以下の表に従って行ってもよい。

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【0194】

必要に応じて、ＣＤＲ−Ｈ３は、アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）、または配列番号３中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、必要に応じて、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、および／もしくはＰｒｏ１００Ｅも含まない、ならびに／または必要に応じて、Ｔｙｒ９９も含まない、そのバリアントを含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、置換は、Ｇｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８、Ｔｙｒ９９、Ａｌａ１００ＣおよびＴｙｒ１００Ｄを含まない。

【0195】

ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｈ３は、以下に示される１つまたは複数の位置で置換されていてもよい。一部の実施形態では、上記の残基を固定し、他の残基を以下の表に従って置換してもよい：他の実施形態では、任意の残基の置換を、以下の表に従って行ってもよい。

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【0196】

必要に応じて、ＣＤＲ−Ｌ１は、アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）、または配列番号４中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＴｙｒ２８およびＡｓｐ３２（カバット番号付け）を含まない、そのバリアントを含んでもよい。

【0197】

ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｌ１は、以下に示される１つまたは複数の位置で置換されていてもよい。再度、一部の実施形態では、上記の残基を固定し、他の残基を以下の表に従って置換してもよい：他の実施形態では、任意の残基の置換を、以下の表に従って行ってもよい。

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【0198】

必要に応じて、ＣＤＲ−Ｌ３は、アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）、または配列番号６中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよび/もしくはＴｙｒ９６（カバット）を含まない、そのバリアントを含んでもよい。

【0199】

ある特定の実施形態では、ＣＤＲ−Ｌ３は、以下に示される以下の位置で置換されていてもよい（多くの残基は溶媒露出されており、抗原接触を持たないため、多くの置換が想定される）。再度、一部の実施形態では、上記の残基を固定し、他の残基を以下の表に従って置換してもよい：他の実施形態では、任意の残基の置換を、以下の表に従って行ってもよい。

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【0200】

抗体はさらに、必要に応じて、それぞれ、配列番号１もしくは配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１およびＣＤＲ−Ｌ２、またはそれと比較して少なくとも１、２、もしくは３個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアントを含んでもよい。

【0201】

上記実施形態のいずれかにおいて、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体は、ヒト化されていてもよい。一実施形態では、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体は、上記実施形態のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。別の実施形態では、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体は、上記実施形態のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、ｖｋ １ ３９および／またはｖｈ ２ ２６に由来するフレームワーク領域をさらに含む。ｖｋ １ ３９について、一部の実施形態では、復帰突然変異が存在しなくてもよい。ｖｈ ２ ２６について、生殖系列Ａｌａ４９残基は、Ｇｌｙ４９に復帰突然変異しなくてもよい。

【0202】

必要に応じて、抗原結合部位は、配列番号７および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号７もしくは配列番号９に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含んでもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、好ましくは、本明細書に記載のような親和性で、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに結合する能力を保持する。ＶＨ配列は、上記のようなインバリアントな残基を保持してもよい。ある特定の実施形態では、配列番号７または配列番号９において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、抗体は、配列番号７または配列番号９中のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0203】

別の態様では、抗体が、配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体が提供される。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体は、好ましくは、本明細書に記載のような親和性で、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに結合する能力を保持する。ＶＬ配列は、上記のようなインバリアントな残基を保持してもよい。ある特定の実施形態では、配列番号８または配列番号１０において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体は、配列番号８または配列番号１０中のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0204】

別の態様では、抗体が、上に提供された実施形態のいずれかに記載のようなＶＨと、上に提供された実施形態のいずれかに記載のようなＶＬとを含む、抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体が提供される。一実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号７および配列番号８のＶＨおよびＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。別の実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号９および配列番号１０のＶＨおよびＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0205】

本発明のさらなる態様では、上記実施形態のいずれかに記載の抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、またはＦ（ａｂ’）_２断片である。抗体断片としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が挙げられる。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４頁（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ（編）、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい；また、ＷＯ９３／１６１８５；ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増大したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。

【0206】

ダイアボディは、二価または二重特異性であってよい２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４頁（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４〜６４４８頁（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９〜１３４頁（２００３）に記載されている。

【0207】

単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。

【0208】

抗体断片を、限定されるものではないが、本明細書に記載されるような、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生などの様々な技術によって作製することができる。

【0209】

別の実施形態では、抗体は、完全長抗体、例えば、本明細書に定義されるような、インタクトなＩｇＧ抗体または他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。

【0210】

標的剤
一部の態様では、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂに特異的に結合する抗体は、標的剤を生産するために細胞結合剤／ターゲティング部分にカップリングされている。必要に応じて、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂに特異的に結合する抗体は、上記の実施形態のいずれかに記載の抗体であってもよい。

【0211】

カップリングは、好ましくは、融合ポリペプチドまたはタンパク質としての発現によるものであってもよい。融合は、直接的であっても、またはリンカーを介するものであってもよい。融合ポリペプチドまたはタンパク質を、組換え的に生産し、コンジュゲーション化学反応の必要性を回避することができる。必要に応じて、前記リンカーは、少なくとも５アミノ酸、好ましくは、２５〜３０の間のアミノ酸のペプチドであってもよい。リンカーは、剛性リンカーまたは可撓性リンカーであってもよい。一部の実施形態では、それは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙおよび／またはＡｌａ残基を含む、またはそれからなる可撓性である。例えば、それは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含む、またはそれからなってもよい。一部の実施形態では、それは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）_ｎ［式中、ｎは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である］などの反復モチーフを有してもよい。一部の実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２６）であってもよいか、またはそれを含んでもよい。他のリンカーを使用してもよく、当業者であれば同定することができる。

【0212】

かくして、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートと、別の標的抗原、例えば、標的細胞の表面上に存在する抗原との両方に特異的に結合する多重特異性（例えば、二重特異性）抗体複合体が提供される。

【0213】

本発明が治療方法および治療方法における使用のための生成物に関する限り、それは、患者の疾患細胞に標的化される細胞傷害活性によって治療可能である任意の状態に適用可能である。治療は、好ましくは、腫瘍またはがん（例えば、膵臓がん、乳がんまたは前立腺がん）のものである。しかしながら、本発明の適用可能性は、腫瘍およびがんに限定されない。例えば、治療はまた、ウイルス感染のものであってもよい。感染細胞の表面上に発現されるウイルス抗原に対するイムノトキシンが、ＨＩＶ、狂犬病およびＥＢＶなどの様々なウイルス感染について精査されている。ＣａｉおよびＢｅｒｇｅｒ ２０１１ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９０（３）：１４３〜５０頁は、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスに感染した細胞の標的化された殺傷のためにＰＥ３８を含有するイムノトキシンを使用した。さらに、Ｒｅｓｉｍｍｕｎｅ（登録商標）（Ａ−ｄｍＤＴ３９０−ｂｉｓＦｖ（ＵＣＨＴ１））は、ヒト悪性Ｔ細胞を選択的に殺傷し、正常Ｔ細胞を一過的に枯渇させ、多発性硬化症および移植片対宿主疾患などのＴ細胞誘導性自己免疫疾患、ならびに臨床試験を受けているＴ細胞血液がんの治療のための潜在能力を有すると考えられる。

【0214】

かくして、好適な標的抗原は、がん細胞抗原、特に、ヒトがん細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原を含んでもよい。

【0215】

本明細書に記載の標的抗原は、腫瘍細胞などの疾患細胞に、その細胞表面抗原を介して結合するように設計される。抗原は、通常、過剰発現される、または異常な時間に発現される正常細胞表面抗原である。理想的には、標的抗原は、疾患細胞（腫瘍細胞など）上でのみ発現されるが、これが実際に観察されるのは稀である。結果として、標的抗原は通常、疾患組織と健康な組織との間での示差的発現に基づいて選択される。

【0216】

かくして、標的抗体は、任意の好適な細胞表面マーカーに特異的に結合することができる。特定のターゲティング部分および／または細胞表面マーカーの選択は、標的化される特定の細胞集団に応じて選択することができる。細胞表面マーカーは、当業界で公知であり（例えば、Ｍｕｆｓｏｎら、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１１：３３７〜４３頁（２００６）；Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６：３２６〜３３４頁（２０００）；およびＫｒｅｉｔｍａｎら、ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ、８（３）：Ｅ５３２〜Ｅ５５１頁（２００６）を参照されたい）、例えば、タンパク質または炭水化物であってもよい。本発明の実施形態では、ターゲティング部分（細胞結合剤）は、細胞表面上の受容体に特異的に結合するリガンドである。例示的なリガンドとしては、限定されるものではないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｆａｓ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、リンホカイン、ホルモン、および増殖因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦａ）、神経成長因子、上皮増殖因子）が挙げられる。

【0217】

細胞表面マーカーは、例えば、腫瘍関連抗原であってもよい。

【0218】

本明細書で使用される場合、用語「腫瘍関連抗原」または「腫瘍特異的抗原」とは、抗原が腫瘍および／またはがんと関連するような、腫瘍細胞および／またはがん細胞によって専ら、もしくは主に発現される、または過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物など）を指す。腫瘍関連抗原はさらに、正常な、非腫瘍、または非がん性細胞によって発現されてもよい。しかしながら、そのような場合、正常な、非腫瘍、または非がん性細胞による腫瘍関連抗原の発現は、腫瘍またはがん細胞による発現ほどロバストではない。これに関して、腫瘍またはがん細胞は、抗原を過剰発現するか、または正常な、非腫瘍、もしくは非がん性細胞による抗原の発現と比較して、有意に高いレベルで抗原を発現することができる。また、腫瘍関連抗原はさらに、発生または成熟の異なる段階の細胞によって発現されてもよい。例えば、腫瘍関連抗原はさらに、成体宿主には通常見出されない、胚段階または胎児段階の細胞によって発現されてもよい。あるいは、腫瘍関連抗原はさらに、成体宿主には通常見出されない、幹細胞または前駆細胞によって発現されてもよい。

【0219】

腫瘍関連抗原は、本明細書に記載のがんおよび腫瘍を含む、任意のがんまたは腫瘍の任意の細胞によって発現される抗原であってもよい。腫瘍関連抗原は、腫瘍関連抗原が、ただ１つの型のがんまたは腫瘍と関連するか、またはそれに特徴的であるような、ただ１つの型のがんまたは腫瘍の腫瘍関連抗原であってもよい。あるいは、腫瘍関連抗原は、１つより多い型のがんまたは腫瘍の腫瘍関連抗原であってもよい（例えば、それに特徴的であってよい）。例えば、腫瘍関連抗原は、乳がん細胞と前立腺がん細胞の両方によって発現され、正常な、非腫瘍、または非がん細胞によっては全く発現されなくてもよい。

【0220】

細胞結合剤が特異的に結合することができる例示的な腫瘍関連抗原としては、限定されるものではないが、ムチン１（ＭＵＣ１；腫瘍関連上皮ムチン）、優先的に発現される黒色腫抗原（ＰＲＡＭＥ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＰＳＣＡ、ＥｐＣＡＭ、Ｔｒｏｐ２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ５６、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（ｅｒｂＢ−２としても知られる）、ＣＤＳ、ＣＤ７、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）Ｉ、およびＴＲＰ２が挙げられる。好ましい実施形態では、ターゲティング部分（細胞結合剤）が特異的に結合する細胞表面マーカーは、分化抗原群（ＣＤ）１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン３、骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３（インターロイキン３受容体アルファ）、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、グリピカン−３、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＣＡ９＝ＣＡＩＸ（炭酸脱水酵素ＩＸ）、Ｌ１ ＣＡＭ（神経細胞接着分子Ｌ１）、エンドシアリン、ＨＥＲ３（上皮増殖因子受容体ファミリーメンバー３の活性化コンフォメーション）、Ａｌｋ１／ＢＭＰ９複合体（未分化リンパ腫キナーゼ１／骨形成タンパク質９）、ＴＰＢＧ＝５Ｔ４（トロホブラスト糖タンパク質）、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様表面抗原）、ＨＥＲ１（上皮増殖因子受容体の活性化コンフォメーション）、およびＣＬＬ１（Ｃ型レクチンドメインファミリー１２、メンバーＡ）からなる群から選択される。メソテリンは、例えば、卵巣がん、中皮腫、非小細胞肺がん、肺腺癌、ファローピウス管がん、頭頸部がん、子宮頸がん、および膵臓がんにおいて発現される。ＣＤ２２は、例えば、毛様細胞性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）において発現される。ＣＤ２５は、例えば、毛様細胞性白血病およびホジキンリンパ腫を含む、白血病およびリンパ腫において発現される。Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗原は、例えば、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、肺がん、および膵臓がんにおいて発現される。ＣＤ３３は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＬ）、および骨髄増殖性疾患において発現される。

【0221】

本発明の実施形態では、ターゲティング部分は、標的、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体（抗体断片を含む）である。そのような実施形態では、薬剤は、二重特異性または多重特異性抗体と呼んでもよい。

【0222】

腫瘍関連抗原に特異的に結合する例示的な抗体としては、限定されるものではないが、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＨＢ２１およびそのバリアント）、ＣＤ２２に対する抗体（例えば、ＲＦＢ４およびそのバリアント）、ＣＤ２５に対する抗体（例えば、抗Ｔａｃおよびそのバリアント）、メソテリンに対する抗体（例えば、ＳＳ１、ＭＯＲＡｂ−００９、ＳＳ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＭＮ、ＭＢ、およびそのバリアント）およびＬｅｗｉｓ Ｙ抗原に対する抗体（例えば、Ｂ３およびそのバリアント）が挙げられる。これに関して、ターゲティング部分（細胞結合剤）は、ｏｆＢ３、ＲＦＢ４、ＳＳ、ＳＳ１、ＭＮ、ＭＢ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＢ２１、およびＭＯＲＡｂ−００９からなる群から選択される抗体、ならびにその抗原結合性部分であってもよい。本発明のキメラ分子における使用にとって好適なさらなる例示的なターゲティング部分は、例えば、米国特許第５，２４２，８２４号（抗トランスフェリン受容体）；第５，８４６，５３５号（抗ＣＤ２５抗体）；第５，８８９，１５７号（抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体）；第５，９８１，７２６号（抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体）；第５，９９０，２９６号（抗Ｌｅｗｉｓ Ｙ抗体）；第７，０８１，５１８号（抗メソテリン抗体）；第７，３５５，０１２号（抗ＣＤ２２抗体および抗ＣＤ２５抗体）；第７，３６８，１１０号（抗メソテリン抗体）；第７，４７０，７７５号（抗ＣＤ３０抗体）；第７，５２１，０５４号（抗ＣＤ２５抗体）；および第７，５４１，０３４号（抗ＣＤ２２抗体）；米国特許出願公開第２００７／０１８９９６２号（抗ＣＤ２２抗体）；Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６：３２６〜３３４頁（２０００）、ならびにＫｒｅｉｔｍａｎら、ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ、８（３）：Ｅ５３２〜Ｅ５５１頁（２００６）（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

【0223】

Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３３、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）、ＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｃ１６およびＴＭＥＥＦ２などの特異的腫瘍関連抗原を標的化するための抗体を生じさせてきた。

【0224】

本発明の一部の実施形態では、腫瘍関連抗原はがん胎児性抗原（ＣＥＡ）であることが好ましい場合がある。ＣＥＡは、ヒトＣＥＡ、特に、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｐ０６７３１（バージョン１１９）、またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４３５４．２に示される、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）のアミノ酸配列を有してもよい。ＣＥＡに対して生じさせてきた抗体としては、ＷＯ２０１６／０７５２７８Ａ１および／またはＷＯ２０１７／０５５３８９に記載されたＴ８４．６６−ＬＣＨＡ、ＣＨ１Ａ１ａ、ＷＯ２０１１／０３４６６０に記載された抗ＣＥＡ抗体、ならびに以下の表２に記載されるＣＥＡ ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号および米国特許第５，８７４，５４０号も参照されたい）などの、Ｔ８４．６６ならびにそのヒト化およびキメラバージョンが挙げられる。

【0225】

ＣＥＡは、比較的ゆっくりと内在化され、かくして、高いパーセンテージの抗体が、放射性核種への結合のために、初期処理後に細胞の表面上で利用可能なままであるため、本発明の文脈において有利である。他の低内在化標的／腫瘍関連抗原も好ましい。例えば、一部の実施形態では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ２０またはＨＥＲ２であってもよい。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００４４３９、ＸＰ＿００５２５７１９６、およびＸＰ＿００５２５７１９７は、２０１３年１０月４日にＧｅｎＢａｎｋによって提供された、Ｈｅｒ２タンパク質配列を開示し、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース登録番号Ｐ１１８３６は、ＣＤ２０配列を開示している。さらなる実施形態では、標的は、ＥＧＰ−１（トロホブラスト−２としても知られる、上皮糖タンパク質−１）、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）または膵臓ムチンＭＵＣ１であってもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、２０１２（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ ２（５））を参照されたい。この参考文献はまた、ＣＳＡｐに結合するＭｕ−９（Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３；６３：３５４〜６３頁も参照されたい）、ＭＵＣ１に結合するｈＰＡＭ４（Ｇｏｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８：６８：４８１９〜２６頁も参照されたい）、ＣＤ２０に結合するバルツズマブ（Ｓｈａｒｋｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；６８：５２８２〜９０頁も参照されたい）およびＥＧＰ−１に結合するｈＲＳ７（Ｃｕｂａｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００９；１７９６：３０９〜１４頁も参照されたい）などの抗体も記載している。これらの抗体、またはその抗原結合性部分はいずれも、本発明において有用であってよい、すなわち、本明細書に記載の抗体に組み込むことができる。

【0226】

多重特異性抗体
上で考察されたように、ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。二重特異性抗体を、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。

【0227】

近年、様々な組換え抗体形式、例えば、ＩｇＧ抗体形式および単鎖ドメインの融合による四価二重特異性抗体（例えば、Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １５（１９９７）１５９〜１６３頁；ＷＯ２００１／０７７３４２；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２５（２００７）１２３３〜１２３４頁を参照されたい）が開発されてきた。

【0228】

また、２つ以上の抗原に結合することができる、ダイアボディ、トリアボディまたはテトラボディ、ミニボディ、いくつかの単鎖形式（ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ）などの、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）がもはや保持されない他の新しい形式も開発されている（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（２００５）１１２６〜１１３６頁；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．、Ｌｅｇｅｒ，Ｏ．、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３〜１４頁；Ｓｈｅｎ，Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３１８（２００７）６５〜７４頁；Ｗｕ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（２００７）１２９０〜１２９７頁）。

【0229】

そのような形式は全て、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）を、さらなる結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合させる、または例えば、２つのＦａｂ断片もしくはｓｃＦｖ（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｎ．、Ｌｅｇｅｒ，Ｏ．、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７４（２００７）３〜１４頁）を融合させるリンカーを使用する。当業者であれば、天然に存在する抗体に対する高い程度の類似性を維持することによって、Ｆｃ受容体結合により媒介される、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの、エフェクター機能を保持することを望むことができることに留意しなければならない。

【0230】

ＷＯ２００７／０２４７１５では、操作された多価および多重特異性結合タンパク質として、二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物活性抗体ダイマーの調製のためのプロセスが、米国特許第６，８９７，０４４号に報告されている。ペプチドリンカーを介して互いに連結される少なくとも４つの可変ドメインを有する多価Ｆｖ抗体コンストラクトが、米国特許第７，１２９，３３０号に報告されている。二量体および多量体抗原結合構造が、ＵＳ２００５／００７９１７０号に報告されている。タンパク質が天然の免疫グロブリンではない接続構造によって互いに共有的に結合する３つまたは４つのＦａｂ断片を含む三価または四価単一特異性抗原結合タンパク質が、米国特許第６，５１１，６６３号に報告されている。ＷＯ２００６／０２０２５８では、原核および真核細胞中で効率的に発現させることができ、治療および診断方法において有用である四価二重特異性抗体が報告されている。２つの型のポリペプチドダイマーを含む混合物に由来する少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されないダイマーに由来する少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されるダイマーを分離するか、または優先的に合成する方法は、ＵＳ２００５／０１６３７８２に報告されている。二重特異性四価受容体が、米国特許第５，９５９，０８３号に報告されている。３つ以上の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が、ＷＯ２００１／０７７３４２に報告されている。

【0231】

多重特異性および多価抗原結合ポリペプチドが、ＷＯ１９９７／００１５８０に報告されている。ＷＯ１９９２／００４０５３は、典型的には、合成架橋剤によって共有的に連結される同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から調製されるホモコンジュゲートを報告している。抗原に対する高いアビディティを有するオリゴマーモノクローナル抗体が、ＷＯ１９９１／０６３０５に報告されており、それによって、典型的には、一緒になって結合して、四価または六価ＩｇＧ分子を形成する２つ以上の免疫グロブリンモノマーを有するＩｇＧクラスのオリゴマーが分泌される。ヒツジ由来抗体および操作された抗体コンストラクトが、米国特許第６，３５０，８６０号に報告されており、これを使用して、インターフェロンガンマ活性が病原性である疾患を治療することができる。ＵＳ２００５／０１００５４３では、二重特異性抗体の多価担体である標的化可能なコンストラクト、すなわち、標的化可能なコンストラクトの各分子が、２つ以上の二重特異性抗体の担体として働くことができる、標的化可能なコンストラクトが報告されている。遺伝子操作された二重特異性四価抗体が、ＷＯ１９９５／００９９１７に報告されている。ＷＯ２００７／１０９２５４では、安定化されたｓｃＦｖからなる、またはそれを含む安定化された結合分子が報告されている。

【0232】

また、同じ抗原特異性の１つまたは複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称形態で、すなわち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５２およびＷＯ２０１５／１５０４４７を参照されたい）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５３を参照されたい）または完全なＦａｂアーム（例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２０１６／０１６２９９を参照されたい、また、Ｓｃｈａｅｆｅｒら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１８７〜１１９１頁、およびＫｌｅｉｎら、ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０〜２０頁も参照されたい）を交換することにより、多重特異性抗体を提供することもできる。一態様では、多重特異性抗体は、交差Ｆａｂ断片を含む。用語「交差Ｆａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」とは、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されるＦａｂ断片を指す。交差Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とから構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とから構成されるポリペプチド鎖を含む。荷電または非荷電アミノ酸突然変異を、ドメイン接触面に導入して、正確なＦａｂペアリングを指向させることによって、非対称性Ｆａｂアームを操作することもできる。例えば、ＷＯ２０１６／１７２４８５を参照されたい。

【0233】

上記形式はいずれも、本発明による多重特異性抗体のために使用することができる。

【0234】

１つの例示的な形式では、二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２１４／１８０７５４に記載されたような「トリマライザー」である。これは、ヒト軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭＰ）に由来する三量体化ドメインに融合された少なくとも１つの抗原結合部分をそれぞれ含み、前記三量体化ドメインが、三量体抗原結合分子の安定な結合を媒介することができる、３つの融合ポリペプチドを含む三量体抗原結合分子を指す。抗原結合部分は、例えば、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ、または単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）であってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質はそれぞれ、例えば、両方とも必要に応じて、ペプチドリンカーを介して、第１の抗原結合部分が、前記三量体化ドメインのＮ末端アミノ酸に融合されており、第２の抗原結合部分が、前記三量体化ドメインのＣ末端アミノ酸に融合されている、２つ（第１および第２）の抗原結合部分を含む。この形式では、第１または第２の抗原結合部分のいずれかは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合することができる。その他方は、標的抗原、例えば、腫瘍関連抗原に結合するであろう。Ｃ末端に融合されている３つの抗原結合分子はそれぞれ、同じ抗原に特異的であってもよい；Ｎ末端に融合されている３つの抗原結合分子はそれぞれ、他の抗原に特異的であってもよい。

【0235】

本明細書において有用なＣＭＰ三量体化ドメインは、以下に示されるヒト軟骨タンパク質に由来しており、一実施形態では、以下に示される三量体化ドメインの配列に対する少なくとも９５％の同一性および最も好ましくは、少なくとも９８％の同一性を有する配列を含む。一実施形態では、前記三量体化ドメインは、前記三量体化ドメインの配列を含む。

【0236】

[この文献は図面を表示できません]

【0237】

別の例示的な形式は、二重特異性または多重特異性抗体は、第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体（例えば、ＩｇＧ）であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を形成する、完全長抗体を含む。

【0238】

ヘテロ二量体重鎖の正確な集合を、例えば、ノブ・イントゥー・ホール突然変異および／または以下でさらに考察される他の修飾の使用によって支援することができる。

【0239】

軽鎖と、それぞれの対応する重鎖との正確な集合を、交差ｍａｂ技術によって支援することができる。この手法では、第１の重鎖と第１の軽鎖、または第２の重鎖と第２の軽鎖は、集合して交差Ｆａｂ断片を形成することができる（その一方、その他は集合して従来のＦａｂを形成する）。かくして、一実施形態では、第１の重鎖は、ＶＨドメインの代わりにＶＬドメインを含んでもよく（例えば、ＶＬ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、第１の軽鎖は、ＶＬドメインに交換されたＶＨドメイン（例えば、ＶＨ−ＣＬ）を含んでもよく、または第１の重鎖は、ＨＣ１ドメインの代わりにＣＬドメインを含んでもよく（例えば、ＶＨ−ＣＬ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、第１の軽鎖は、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含んでもよい（例えば、ＶＬ−ＣＨ１）。この実施形態では、第２の重鎖および第２の軽鎖は、従来のドメイン構造（例えば、それぞれ、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ−ＣＬ）を有する。代替的な実施形態では、第２の重鎖は、ＶＨドメインの代わりにＶＬドメインを含んでもよく（例えば、ＶＬ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、第２の軽鎖は、ＶＬドメインに交換されたＶＨドメイン（例えば、ＶＨ−ＣＬ）を含んでもよく、または第２の重鎖は、ＨＣ１ドメインの代わりにＣＬドメインを含んでもよく（例えば、ＶＨ−ＣＬ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、第２の軽鎖は、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含んでもよい（例えば、ＶＬ−ＣＨ１）。この実施形態では、第１の重鎖および第１の軽鎖は、従来のドメイン構造を有する。

【0240】

一部の実施形態では、軽鎖と、その対応する重鎖との正確な集合は、さらに、またはあるいは、以下に考察されるような電荷修飾を使用することによって支援することができる。

【0241】

１つのそのような抗体は、Ｐ１ＡＥ１７６８として図３７に示される。ここで、第２の重鎖は、ＨＣ１ドメインの代わりにＣＬドメインを含み（例えば、ＶＨ−ＣＬ−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、第２の軽鎖は、ＣＬドメインの代わりにＣＨ１ドメインを含む（例えば、ＶＬ−ＣＨ１）；第１の重鎖および第１の軽鎖は、従来のドメイン構造を有する。従来の構造を有するＦａｂは、電荷修飾を含む。かくして、一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号５９および配列番号５８の第１および第２の重鎖、ならびにそれぞれ、配列番号５７および配列番号６０の第１および第２の軽鎖を含む。

【0242】

上記形式の一部の実施形態では、形式は、二価であってもよい。別の可能な実施形態では、さらなる抗原結合部分を、例えば、第１および／または第２の重鎖に融合して、一方または両方の抗原の価数を増加させることができる。例えば、第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分を、重鎖分子の一方または両方のＮ末端に融合することができる。抗体は、第１の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）について、多価、例えば、二価であってよく、第２の抗原（例えば、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂ）について一価であってよい。

【0243】

さらなる抗原結合部分は、例えば、第１の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）のための抗原結合部位を含む、例えば、ｓｃＦａｂであってもよい。ｓｃＦａｂは、単鎖として発現されるように、ＶＬおよびＣＬドメインの代わりドメインにポリペプチドリンカーによって連結された、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む。換言すれば、ｓｃＦａｂは、Ｆｄと軽鎖との間のポリペプチドリンカーを含む。

【0244】

別の実施形態では、さらなる抗原結合部分は、Ｆａｂまたは交差Ｆａｂである。例えば、一方の重鎖のＮまたはＣ末端を、ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合して、Ｆａｂを形成する、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチドに、ポリペプチドリンカーによって連結することができる。別の実施形態では、一方の重鎖のＮまたはＣ末端を、ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合する、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチドに、ポリペプチドリンカーによって連結することができる。別の実施形態では、一方の重鎖のＮまたはＣ末端を、ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合する、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチドに、ポリペプチドリンカーによって連結することができる。

【0245】

この形式では、同じ抗原特異性の結合アームが同じ軽鎖との結合によって形成されることが好ましい場合がある。かくして、第１の抗原のための抗原結合部分／アームは交差Ｆａｂであってよく、第２の抗原のための抗原結合部分／アームは従来のＦａｂであってもよい。あるいは、第１の抗原のための抗原結合部分／アームは従来のＦａｂであってよく、第２の抗原のための抗原結合部分／アームは交差Ｆａｂであってもよい。

【0246】

この形式はまた、以下でさらに考察されるように、電荷修飾を含んでもよい。

【0247】

この形式の一実施形態では、
第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原（例えば、腫瘍特異的抗原、例えば、ＣＥＡ）のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原（例えば、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂ）のための抗原結合部位を含む交差Ｆａｂを形成し（例えば、第２の重鎖がＶＨドメインの代わりにＶＬドメインを有し、第２の軽鎖がＶＬドメインの代わりにＶＨドメインを有する）；
第１または第２の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、ＣＨ１およびＶＨドメインを含むポリペプチドに融合されており、第１および第２のポリペプチドが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成するように、前記第１のポリペプチドが、ＣＬおよびＶＬを含む第２のポリペプチドと集合する、完全長抗体
を含む多価抗体が提供される。

【0248】

融合は、完全長抗体の重鎖の一方、必要に応じて、第２の重鎖のＮ末端にあってもよい。

【0249】

必要に応じて、電荷修飾を使用することもできる。例えば、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂは、以下に考察されるように、電荷修飾置換を含んでもよい。

【0250】

そのような形式の例は、図３７に示されるＰ１ＡＥ１７６９である。かくして、一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号６４および配列番号６３の第１および第２の重鎖、ならびにそれぞれ、配列番号６２および配列番号６１の第１および第２の軽鎖を含む。

【0251】

別の例示的な形式は、第２の抗原のための抗原結合部分に連結された、第１の抗原のための抗原結合部位（例えば、第１の抗原について二価であってもよい）を含むＩｇＧなどの完全長抗体を含む。

【0252】

例えば、第２の抗原のための抗原結合部分は、第２の抗原（例えば、Ｐｂ−ＤＯＴＡＬキレート）のための抗原結合部位を含むｓｃＦａｂであってもよい。一部の実施形態では、ｓｃＦａｂを、完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端、例えば、そのＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することができる。ヘテロ二量体重鎖の正確な集合を、例えば、ノブ・イントゥー・ホール突然変異および／または以下でさらに考察される他の修飾の使用によって支援してもよい。１つのそのような抗体は、Ｐ１ＡＥ１７７０として図３７に例示される。かくして、一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６６および配列番号６７の重鎖と、配列番号６５の軽鎖とを含む。

【0253】

別の例示的な形式は、第１の抗原のための抗原結合部位（例えば、第１の抗原について二価であってもよい）を含む完全長抗体であって、重鎖の一方のＮまたはＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含むＦａｂまたは交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体を含む。例えば、この形式は、第１および第２のポリペプチドが、一緒になって、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するような、
ｉ）ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉ）ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉｉ）ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチド
を含んでもよい。

【0254】

ヘテロ二量体重鎖の正確な集合を、例えば、ノブ・イントゥー・ホール突然変異および／または以下でさらに考察される他の修飾の使用によって支援してもよい。例えば、完全長抗体のＦａｂドメインは、電荷修飾を含んでもよい。

【0255】

一実施形態では、第１のポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを介して、重鎖の一方のＣ末端に、例えば、そのＣＨ３ドメインのＣ末端に連結される。第１のポリペプチドは、Ｎ末端ＶＬドメインと、Ｃ末端ＣＨ１ドメインとを含んでもよい。かくして、融合物を有する重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１を含んでもよい。軽鎖は、ＶＨ−ＣＬを含んでもよい。完全長抗体のＦａｂは、電荷修飾置換を含んでもよい。１つのそのような抗体は、Ｐ１ＡＥ１７６７として図３７に示される。かくして、一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号６３および配列番号６４の重鎖と、配列番号６１および配列番号６２の軽鎖とを含む。

【0256】

別の実施形態では、第１のポリペプチドは、ポリペプチドリンカーを介して、重鎖のＶＨドメインのＮ末端に連結される。第１のポリペプチドは、Ｎ末端ＶＬドメインと、Ｃ末端ＣＨ１ドメインとを含んでもよい。かくして、融合物を有する重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含んでもよい。軽鎖は、ＶＨ−ＣＬを含んでもよい。

【0257】

別の例示的な形式では、抗体は、第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなり、それぞれの重鎖のＣ末端が、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部分に融合されている、完全長抗体を含んでもよい。

【0258】

一実施形態では、第１の抗原は標的、例えば、腫瘍特異的抗原であり、第２の抗原はＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであるが、これらのものは逆であってもよい。

【0259】

別の例示的な形式では、抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体；
ｂ）
ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。

【0260】

この形式では、第１のポリペプチドがｂ（ｉ）に記載のものである場合、第２のポリペプチドはｃ（ｉ）に記載のものである；第１のポリペプチドがｂ（ｉｉ）に記載のものである場合、第２のポリペプチドはｃ（ｉｉ）に記載のものである；および第１のポリペプチドがｂ（ｉｉｉ）に記載のものである場合、第２のポリペプチドはｃ（ｉｉｉ）に記載のものである。電荷修飾置換を、例えば、完全長抗体のＦａｂにおいて使用することもできる。

【0261】

この形式では、第１または第２の抗原は、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂであってもよい。他方は、標的、例えば、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＥＡ、ＣＤ２０またはＥＲＢＢ２であってもよい。一部の実施形態では、第２の抗原はＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂであり、第１の抗原は標的である。

【0262】

上記の抗体は、三価であってもよい。別のあり得る実施形態では、さらなる抗原結合部分を融合させて、一方または両方の抗原に関する価数を増加させることができる。例えば、抗体が、第１の抗原について４の価数を有し（それが両方の重鎖のカルボキシ末端に融合される場合）、第２の抗原について１の価数を有するように、例えば、第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分を、完全長抗体（例えば、腫瘍関連抗原）の重鎖のいずれかまたは両方のカルボキシ末端に融合させてもよい。

【0263】

（ｂ）の抗体がＶＨドメインからなり、（ｃ）の抗体がＶＬドメインからなる上記形式の例は、ＰＲＩＴ−２１３およびＰＲＩＴ２１４である。（ｂ）がＶＨドメインおよびＣＬドメインからなり、（ｃ）がＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる上記形式の例は、図３７に示されるようなＰ１ＡＥ１７６６である。かくして、一実施形態では、本発明の抗体は、それぞれ、配列番号５１および配列番号５２の第１および第２の重鎖と、配列番号５０の軽鎖とを含む。

【0264】

必要に応じて、本発明の多重特異性抗体のために使用される形式は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／１１５５８９Ａ１（Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ ＡＧ）に記載されたような三価形式であってもよい。

【0265】

ＷＯ２０１０／１１５５８９は、構造の任意の安定化を記載し、それにより、（ｂ）の下のポリペプチドの抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｃ）の下のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが連結されており、鎖間ジスルフィド架橋によって、例えば、以下の位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位から軽鎖可変ドメインの１００位、
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位から軽鎖可変ドメインの４３位、または
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位から軽鎖可変ドメインの１００位（カバットのＥＵインデックスによって常に番号付ける）
の間でのジスルフィド結合の導入によって安定化される。

【0266】

ＷＯ２０１０／１１５５８９はまた、本発明による前記完全長抗体のＣＨ３ドメインを、例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９（１９９６）６１７〜６２１頁；およびＭｅｒｃｈａｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６（１９９８）６７７〜６８１頁にいくつかの例と共に詳細に記載されている「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって変更することができる。

【0267】

かくして、一部の実施形態では、前記三価の二重特異性抗体はさらに、完全長抗体の一方の重鎖のＣＨ３ドメインと、完全長抗体の他方の重鎖のＣＨ３ドメインとがそれぞれ、抗体ＣＨ３ドメイン間の元の接触面を含む接触面で向かい会い、前記接触面が、三価の二重特異性抗体の形成を促進するように変更されていることを特徴とし、その変更は、
ａ）三価の二重特異性抗体内の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面に向かい会う一方の重鎖のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることによって、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内に、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの接触面内の空洞に位置し得る突起を生成するように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていること、
および
ｂ）三価の二重特異性抗体内の第１のＣＨ３ドメインの元の接触面に向かい会う第２のＣＨ３ドメインの元の接触面内で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられることによって、第２のＣＨ３ドメインの接触面内に、第１のＣＨ３ドメインの接触面内の突起が位置し得る空洞を生成するように、他方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されていること
を特徴とする。

【0268】

より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、必要に応じて、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）からなる群から選択することができる。より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、必要に応じて、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）からなる群から選択することができる。

【0269】

必要に応じて、一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは両方とも、両方のＣＨ３ドメイン間のジスルフィド架橋を形成することができるように、それぞれのＣＨ３ドメインの対応する位置にアミノ酸としてシステイン（Ｃ）を導入することによってさらに変更される。

【0270】

ＷＯ２０１０／１１５５８９Ａ１に記載された二重特異性三価抗体形式のこれらの、および他の詳細を、本発明において利用することができる。

【0271】

本明細書で使用される場合、用語「完全長抗体」は、２つの「完全長抗体重鎖」および２つの「完全長抗体軽鎖」からなる抗体を示す。「完全長抗体重鎖」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）のＮ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と省略される、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、および抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）；ならびに必要に応じて、サブクラスＩｇＥの抗体の場合、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）からなるポリペプチドであってもよい。好ましくは、「完全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２およびＣＨ３からなるポリペプチドである。交差Ｍａｂ形成の可能性は、「完全長」に対する参照によって排除されることを意図しない、かくして、重鎖は、ＶＬドメインに交換されたＶＨドメイン、またはＣＬドメインに交換されたＣＨ１メインを有してもよい。「完全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ−ＣＬと省略される、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなるポリペプチドであってもよい。あるいは、交差Ｍａｂの場合、ＶＬドメインをＶＨドメインに交換するか、またはＣＬドメインをＣＨ１ドメインに交換することができる。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）またはλ（ラムダ）であってもよい。２つの完全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結される。典型的な完全長抗体の例は、ＩｇＧのような天然抗体（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）である。本発明による完全長抗体は、単一の種、例えば、ヒトに由来するものであってよいか、またはそれらはキメラ化もしくはヒト化抗体であってもよい。本明細書に記載の完全長抗体は、それぞれ、一対のＶＨとＶＬによって形成される２つの抗原結合部位を含む。前記完全長抗体の重鎖または軽鎖のＣ末端は、前記重鎖または軽鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。

【0272】

ｂ）の下のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）およびｃ）の下のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端は、ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端の最後のアミノ酸を示す。

【0273】

上記形式のいずれかにおいて、第１の抗原は腫瘍関連抗原であってよく、第２の抗原はＰｂ−ＤＯＴＡＭであってもよい（が、これらのものは、一部の実施形態では逆であってもよい）。

【0274】

上記形式のいずれかにおいて、重鎖ヘテロダイマーの正確な集合を、重鎖の配列に対する修飾によって支援することができる。一実施形態では、ノブ・イントゥー・ホール技術が使用される。２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する両方の重鎖のヘテロ二量体化を増加させるように変更することができる。２つのＣＨ３ドメイン（２つの重鎖の）はそれぞれ、「ノブ」であってよいが、他方は「ホール」である。例えば、一方は、ＥＵインデックスの番号付けによる、いわゆる「ノブ突然変異」（Ｔ３６６Ｗおよび必要に応じて、Ｓ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃのうちの１つ、好ましくは、Ｓ３５４Ｃ）を含み、他方は、いわゆる「ホール突然変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ、必要に応じて、Ｙ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ、好ましくは、Ｙ３４９Ｃ）を含む（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）。

【0275】

さらに、またはあるいは、ジスルフィド架橋の導入を使用して、ヘテロダイマーを安定化し（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６（１９９８）６７７〜６８１頁；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６〜３５頁）、収量を増加させることができる。例としては、以下の位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの４４位から軽鎖可変ドメインの１００位、
ｉｉ）重鎖可変ドメインの１０５位から軽鎖可変ドメインの４３位、または
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの１０１位から軽鎖可変ドメインの１００位（カバットのＥＵインデックスによって常に番号付ける）
の間でのジスルフィド結合の導入が挙げられる。

【0276】

電荷修飾
本発明の多重特異性抗体は、１つ（または複数（２つを超える抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合））のその結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベースの二重／多重特異性抗原結合分子の生産において起こり得る、軽鎖と、非一致重鎖とのミスペアリング（Ｂｅｎｃｅ−Ｊｏｎｅｓ型副生成物）の低減において特に効率的である、そこに含まれるＦａｂ分子中にアミノ酸置換を含んでもよい（全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１５０４４７、特に、その中の実施例も参照されたい）。望ましくない副生成物、特に、その結合アームの一方において生じるＢｅｎｃｅ Ｊｏｎｅｓ型副生成物と比較した、所望の多重特異性抗体の比率を、Ｆａｂ分子のＣＨ１およびＣＬドメイン中の特定のアミノ酸位置での反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入によって改善することができる（本明細書では「電荷修飾」と呼ばれることもある）。

【0277】

したがって、一部の実施形態では、Ｆａｂ分子を含む本発明の抗体は、本明細書に記載の電荷修飾を含む重鎖定常ドメインＣＨ１ドメインと、本明細書に記載の電荷修飾を含む軽鎖定常ＣＬドメインとを有する少なくとも１つのＦａｂを含む。

【0278】

電荷修飾は、本発明の抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（例えば、図３７に示されるものなど：Ｐ１ＡＥ１７６６、Ｐ１ＡＥ１７６７、Ｐ１ＡＥ１７６８、Ｐ１ＡＥ１７６９）、または本発明の抗体に含まれるクロスオーバーＦａｂ分子のいずれか（両方ではない）において作製される。特定の実施形態では、電荷修飾は、本発明の抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（特定の実施形態では、標的細胞抗原に特異的に結合する）において作製される。

【0279】

したがって、一部の実施形態では、本発明の抗体は、ａ）第１の抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合する第１の抗原結合部分およびｂ）第２の抗原（例えば、Ｄｏｔａｍ−Ｐｂ）に結合する第２の結合部分を含み、二重特異性抗原結合分子の第１および第２の抗原結合部分は両方ともＦａｂ分子であり、抗原結合部分（一部の実施形態では、特に、第２の抗原結合部分）の一方は交差Ｆａｂ断片であり、Ｆａｂ分子の一方は本明細書に記載の電荷修飾を含むＣＨ１ドメイン、および本明細書に記載の電荷修飾を含むＣＬドメインを含む。電荷修飾を含むＦａｂは、従来の（非交差）Ｆａｂである、例えば、一部の実施形態では、第１の抗原に結合する抗原結合部分であることが好ましい場合がある。

【0280】

本発明による抗体はさらに、第１の抗原に特異的に結合する第３のＦａｂ分子を含んでもよい。特定の実施形態では、前記第３のＦａｂ分子は、ａ）の下で第１のＦａｂ分子と同一である。これらの実施形態では、以下の実施形態によるアミノ酸置換（電荷修飾）を、第１のＦａｂ分子および第３のＦａ分子のそれぞれの定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において作製することができる。あるいは、以下の実施形態によるアミノ酸置換を、第１のＦａｂ分子および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１ではなく、ｂ）の下の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において作製することができる。

【0281】

一部の実施形態では、電荷修飾を含む軽鎖定常ドメインＣＬおよび電荷修飾を含む重鎖定常ドメインＣＨ１を含むＦａｂ分子において、軽鎖定常ドメインＣＬにおける電荷修飾は１２４位、および必要に応じて、１２３位（カバットによる番号付け）にあり、重鎖定常ドメインＣＨ１における電荷修飾は１４７位および／または２１３位（カバットによる番号付け）にある。

【0282】

一部の実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して置換され（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）によって独立して置換される）、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸および／または２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される。

【0283】

別の実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸または２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される。

【0284】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される。

【0285】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され（カバットによる番号付け）、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって独立して置換される（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）。

【0286】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）（カバットによる番号付け）によって独立して（１つの好ましい実施形態では、リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）によって独立して）置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換され、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって独立して置換される。

【0287】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。

【0288】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、２１３位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。

【0289】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、１２３位のアミノ酸は、アルギニン（Ｒ）（カバットによる番号付け）によって置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、２１３位のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。

【0290】

さらなる実施形態では、軽鎖定常ドメインにおいて、１２４位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、１２３位のアミノ酸は、リジン（Ｋ）（カバットによる番号付け）によって置換され、重鎖定常ドメインＣＨ１において、１４７位のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換され、２１３位のアミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）（カバットのＥＵインデックスによる番号付け）によって置換される。

【0291】

一実施形態では、抗体は、第１の抗原に特異的に結合する第１の重鎖および第１の軽鎖と、第２の抗原に特異的に結合する第２の重鎖および第２の軽鎖を含み、
ａ）第１の軽鎖の定常ドメインＣＬおよび第１の重鎖の定常ドメインＣＨ１は、本明細書に記載の電荷変異置換を含み；
ｂ）第２の軽鎖および第２の重鎖の軽鎖定常ドメインＣＬおよび重鎖定常ドメインＣＨ１は互いに置き換えられる（かくして、公差Ｆａｂを形成する）。そのような配置の例は、Ｐ１ＡＥ１７６８について示される。

【0292】

別の実施形態では、抗体は、
第１の抗原に特異的に結合し、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる完全長抗体であって、完全長抗体の２つの重鎖定常ドメインＣＨ１および２つの軽鎖定常ドメインＣＬが本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体；ならびに
ポリペプチドリンカーを介してＶＬおよびＣＬドメインに連結されたＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ）を含むｓｃＦａｂであって、ｓｃＦａｂが重鎖の一方のＮ末端に融合されており、ｓｃＦａｂが第２の抗原に対する抗原結合部位を形成する、ｓｃＦａｂを含む。そのような配置の例は、Ｐ１ＡＥ１７７０である。

【0293】

別の実施形態では、多重特異性抗体は、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体（例えば、第１の抗原について二価であってもよい）であって、完全長抗体の２つの重鎖定常ドメインＣＨ１および２つの軽鎖定常ドメインＣＬが、本明細書に記載の電荷修飾を含み、
重鎖の一方のＣ末端（例えば、そのＣＨ３ドメインのＣ末端）が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含む交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体を含む。

【0294】

第１のポリペプチドは、Ｎ末端ＶＬドメインと、Ｃ末端ＣＨ１ドメインとを含んでもよい。かくして、融合物を有する重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１を含んでもよい。軽鎖は、ＶＨ−ＣＬを含んでもよい。そのような配置の例は、Ｐ１ＡＥ１７６７である。

【0295】

さらなる実施形態では、抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、重鎖のＣＨ１ドメインおよび軽鎖のＣＬドメインが本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体；
ｂ）
ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成する、二重特異性抗体であってもよい。そのような配置の例は、ＰＲＩＴ−２１３およびｐ１ＡＥ１７６６である。

【0296】

一部の実施形態では、本発明の抗体は、ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合部分、ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合部分、およびｃ）第１の抗原に結合する第３の抗原結合部分を含み、抗体の第１、第２および第３の抗原結合部分は、全てＦａｂ分子であり、抗原結合部分（特に、第２の抗原結合部分）の１つにおいて、Ｆａｂ軽鎖およびＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬおよびＶＨはそれぞれ、互いに置き換えられ、
ｉ）上記実施形態によるアミノ酸置換は、ｂ）の下の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１ではなく、第１のＦａｂ分子および第３のＦａｂ分子のそれぞれの定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において作製される；または
ｉｉ）上記実施形態によるアミノ酸置換は、第１のＦａｂ分子および第３のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１ではなく、ｂ）の下の第２のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬおよび定常ドメインＣＨ１において作製される。一部の実施形態では、電荷修飾は、従来の（非交換）Ｆａｂに存在する：かくして、例えば、第２の抗原結合部分が交差Ｆａｂである場合、選択肢（ｉ）が好ましい。

【0297】

１つの特定の実施形態では、本発明の多価抗体は、
第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原（例えば、腫瘍特異的抗原、例えば、ＣＥＡ）のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原（例えば、ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂ）のための抗原結合部位を含む交差Ｆａｂを形成し（例えば、第２の重鎖がＶＨドメインの代わりにＶＬドメインを有し、第２の軽鎖がＶＬドメインの代わりにＶＨドメインを有する）；
第１または第２の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、ＣＨ１およびＶＨドメインを含むポリペプチドに融合されており、第１および第２のポリペプチドが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成するように、前記第１のポリペプチドが、ＣＬおよびＶＬを含む第２のポリペプチドと集合し、
第１の重鎖のＣＨ１ドメインおよび第１の軽鎖のＣＬドメインが、本明細書に記載の電荷修飾を含む、完全長抗体を含む。

【0298】

また、第１のポリペプチドのＣＨ１ドメインおよび第２のポリペプチドのＣＬドメインは、本明細書に記載の電荷修飾を含んでもよい。

【0299】

融合は、完全長抗体の重鎖の一方、必要に応じて、第２の重鎖のＮ末端にあってもよい。そのような配置の例は、Ｐ１ＡＥ１７６９である。

【0300】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよびＣＥＡに結合する多重特異性抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭとＣＥＡの両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための抗原結合部位と、ＣＥＡのための抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。

【0301】

必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、一価の結合について１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のＫｄ値で結合してもよい。

【0302】

必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含んでもよい。

【0303】

必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含んでもよい。一実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。

【0304】

必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0305】

必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、ならびに（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0306】

別の態様では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0307】

上記実施形態のいずれかにおいて、多重特異性抗体は、ヒト化されていてもよい。一実施形態では、抗ＣＥＡ抗原結合部位は、上記実施形態のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。

【0308】

別の実施形態では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＣＥＡに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１７において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１７中のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0309】

別の実施形態では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、配列番号１８のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＣＥＡに結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号１８において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＣＥＡのための抗原結合部位は、配列番号１８中のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0310】

別の実施形態では、ＣＥＡに結合する抗原結合部位は、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＨと、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＬとを含む。一実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号１７および配列番号１８のＶＨおよびＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0311】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書で提供されるＰＲＩＴ−０２１３またはＰＲＩＴ−０２１４と同じＣＥＡエピトープに結合することができる。

【0312】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよびＥＲＢＢ２に結合する多重特異性抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭとＥＲＢＢ２の両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２のための抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。

【0313】

必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、一価の結合について１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のＫｄ値で結合してもよい。

【0314】

必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含んでもよい。

【0315】

必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含んでもよい。一実施形態では、抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３および配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。

【0316】

必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0317】

必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号３０から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、ならびに（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0318】

別の態様では、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0319】

上記実施形態のいずれかにおいて、多重特異性抗体は、ヒト化されていてもよい。一実施形態では、抗ＥＲＢＢ２抗原結合部位は、上記実施形態のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。

【0320】

別の実施形態では、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、配列番号３４のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＥＲＢＢ２に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号３４において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、配列番号３４中のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0321】

別の実施形態では、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、配列番号３５のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＥＲＢＢ２に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号３５において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＣＥＡのための抗原結合部位は、配列番号３５中のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0322】

別の実施形態では、ＥＲＢＢ２に結合する抗原結合部位は、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＨと、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＬとを含む。一実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号３４および配列番号３５のＶＨおよびＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0323】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書で提供されるＰ１ＡＤ９８２７抗体と同じＥＲＢＢ２エピトープに結合することができる。

【0324】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよびＣＤ２０に結合する多重特異性抗体
一部の実施形態では、本発明の抗体は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭとＣＤ２０の両方に結合する多重特異性、例えば、二重特異性抗体であることが好ましい場合がある。かくして、それらは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための抗原結合部位と、ＣＤ２０のための抗原結合部位とを含む。そのような実施形態では、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位は、本明細書に記載の実施形態のいずれかによるものであってもよい。この形式は、本明細書に記載の形式のいずれかであってもよい。

【0325】

必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、一価の結合について１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、または１００ｐＭ以下のＫｄ値で結合してもよい。

【0326】

必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含んでもよい。

【0327】

必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含んでもよい。一実施形態では、抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。別の実施形態では、抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３および配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、および配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。さらなる実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。

【0328】

必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲ配列を含む。一実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0329】

必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、（ａ）（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号４１から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＨ ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；ならびに（ｂ）（ｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つ全部のＶＬ ＣＤＲを含むＶＬドメイン、ならびに（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0330】

別の態様では、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。

【0331】

上記実施形態のいずれかにおいて、多重特異性抗体は、ヒト化されていてもよい。一実施形態では、抗ＣＤ２０抗原結合部位は、上記実施形態のいずれかにおけるようなＣＤＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。

【0332】

別の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、配列番号４５のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＣＤ２０に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号４５において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、配列番号４５中のＶＨ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0333】

別の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、配列番号４６のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入、または欠失を含有するが、その配列を含む抗原結合部位は、好ましくは、上記のような親和性で、ＣＤ２０に結合する能力を保持する。ある特定の実施形態では、配列番号４６において、合計１〜１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲ外の領域（すなわち、ＦＲ）に存在する。必要に応じて、ＣＤ２０のための抗原結合部位は、配列番号４６中のＶＬ配列を含み、その配列の翻訳後修飾を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、（ａ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｃ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される１、２または３つのＣＤＲを含む。

【0334】

別の実施形態では、ＣＤ２０に結合する抗原結合部位は、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＨと、上で提供された実施形態のいずれかに記載のＶＬとを含む。一実施形態では、抗体は、それぞれ、配列番号４５および配列番号４６のＶＨおよびＶＬ配列を含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。

【0335】

一部の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書で提供されるＰ１ＡＤ９８２６抗体と同じＣＤ２０エピトープに結合することができる。

【0336】

抗体バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗体をコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列バリアントを調製することができる。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入、および／またはその置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有するという条件で、最終コンストラクトに到達するために、任意の組合せの欠失、挿入、および置換を作製することができる。

【0337】

置換、挿入、および欠失バリアント
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位としては、ＨＶＲ（ＣＤＲ）およびＦＲが挙げられる。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下で表１に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」の見出しの下で表１に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される。アミノ酸置換を、目的の抗体に導入し、生成物を、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

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【0338】

アミノ酸を、共通の側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0339】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とするであろう。

【0340】

１つの型の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。一般に、さらなる試験のために選択される得られるバリアントは、親抗体と比較して、ある特定の生物学的特性（例えば、親和性の増大、免疫原性の低下）における修飾（例えば、改善）を有するであろう、および／または親抗体のある特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載のものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して、簡便に生成することができる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、１つまたは複数のＨＶＲ残基を変異させ、変異抗体をファージ上に展示させ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。

【0341】

変更（例えば、置換）を、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて行うことができる。そのような変更を、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス（例えば、Ｃｈｏｗｄｆｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９〜１９６頁（２００８）を参照されたい）中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基、および／または結合親和性について試験される、得られるバリアントＶＨもしくはＶＬを有する抗原と接触する残基において行うことができる。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１〜３７頁（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら（編）、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００１））に記載されている。親和性成熟の一部の実施形態では、様々な方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指定突然変異）のいずれかによって成熟について選択された可変遺伝子中に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作出する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体バリアントを同定する。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、１回で４〜６個の残基）を無作為化するＨＶＲ指定手法を含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基を、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３およびＣＤＲ−Ｌ３が標的化されることが多い。

【0342】

ある特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で行ってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ中で行うことができる。そのような変更は、例えば、ＨＶＲ中の抗原接触残基の外部にあってもよい。上で提供されたバリアントＶＨおよびＶＬ配列のある特定の実施形態では、それぞれのＨＶＲは、変更されないか、または１、２もしくは３つ以下のアミノ酸置換を含有する。

【0343】

突然変異誘発のために標的化することができる抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５頁によって記載されたように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）を同定し、中性の、または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置き換えて、抗体と抗原との相互作用が影響されるかどうかを決定する。さらなる置換を、初期の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入してもよい。あるいは、またはさらに、抗体と抗原との接触点を同定するための、抗原−抗体複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接残基を、置換のための候補として標的化するか、または除去することができる。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含有するかどうかを決定することができる。

【0344】

アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴのためのもの）または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドに対する抗体のＮまたはＣ末端への融合物が挙げられる。

【0345】

グリコシル化バリアント
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体を変更して、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させる。１つまたは複数のグリコシル化部位が作出されるか、または除去されるように、アミノ酸配列を変更することによって、抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失を簡便に達成することができる。

【0346】

抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般的に結合する分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含んでもよい。一部の実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾を行って、ある特定の特性が改善された抗体バリアントを作出することができる。

【0347】

一実施形態では、Ｆｃ領域に結合した（直接または間接に）フコースを欠く糖鎖構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、そのような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されたような、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定された場合、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造体（例えば、複合ハイブリッドおよび高マンノース構造体）と比較した、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７とは、Ｆｃ領域中の２９７位付近に位置するアスパラギン残基（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における少しの配列差異のため、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち、２９４位と３００位の間に位置してもよい。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９〜１２４９頁（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４頁（２００４）が挙げられる。脱フコシル化された抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３〜５４５頁（１９８６）；米国特許出願第２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓら、特に、実施例１１）、およびアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４頁（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０〜６８８頁（２００６）；およびＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。

【0348】

例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアントがさらに提供される。そのような抗体バリアントは、減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａら）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌら）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。

【0349】

抗体を修飾して、グリコシル化の程度を減少させることが好ましい場合がある。一部の実施形態では、抗体は、無グリコシル化または脱グリコシル化されていてもよい。抗体は、Ｎ２９７の置換、例えば、Ｎ２９７Ｄ／Ａを含んでもよい。

【0350】

Ｆｃ領域バリアント
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾を、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域中に導入することによって、Ｆｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含んでもよい。

【0351】

ある特定の実施形態では、本発明は、エフェクター機能が低下した、例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣおよび／またはＦｃγＲ結合が低下した、または除去された抗体バリアントを企図する。ある特定の態様では、本発明は、全てではないが、いくつかのエフェクター機能を有する抗体バリアントを企図し、それを、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不必要であるか、または有害である適用のための望ましい候補にする。

【0352】

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞傷害アッセイを行って、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）ことを確保することができる。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７〜４９２頁（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：７０５９〜７０６３頁（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’l Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１４９９〜１５０２頁（１９８５）を参照されたい）；米国特許第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１〜１３６１頁（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２〜６５６頁に開示されたものなどの動物モデルにおいて評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがって、ＣＤＣ活性を欠くことを確認することもできる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９およびＷＯ２００５／１００４０２に記載のＣ１ｑおよびＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３頁（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５〜１０５２頁（２００３）；ならびにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．およびＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８〜２７４３頁（２００４）を参照されたい）。また、ＦｃＲｎ結合およびｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランス／半減期の決定を、当業界で公知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９〜１７６９頁（２００６）；ＷＯ２０１３／１２０９２９Ａ１を参照されたい）。

【0353】

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９のうちの１つまたは複数の置換を有するもの（米国特許第６，７３７，０５６号）、例えば、Ｐ３２９Ｇが挙げられる。そのようなＦｃ変異体としては、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７，３３２，５８１号）を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられる。

【0354】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減弱させる１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２３４位および２３５位（残基のＥＵ番号付け）の置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。ある特定の態様では、抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域中にＤ２６５Ａおよび／またはＰ３２９Ｇをさらに含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である(例えば、ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照されたい)。別の態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域中のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。

【0355】

他の実施形態では、ＩｇＧ４またはＩｇＧ２などのエフェクター機能が減少したＩｇＧサブタイプを使用することが可能であってよい。

【0356】

ＦｃＲへの結合が改善された、または減弱したある特定の抗体バリアントが記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、およびＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４頁（２００１）を参照されたい）。

【0357】

一部の実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、およびＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８〜４１８４頁（２０００）に記載されたような、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変更（すなわち、改善または減弱、好ましくは、減弱）をもたらす変更を、Ｆｃ領域中で行う。

【0358】

一部の実施形態では、例えば、半減期がより短くなるように、ＦｃＲｎ結合を減少させてもよい。他の実施形態では、ＦｃＲｎの結合は正常であってもよい。例えば、一部の実施形態では、正常なＦｃＲｎ結合を、除去剤を含む方法において使用することができる。

【0359】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２５３位および／または３１０位および／または４３５位（残基のＥＵ番号付け）の置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、２５３位、３１０位および４３５位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域中のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａである。例えば、Ｇｒｅｖｙｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４（２０１５）５４９７〜５５０８頁を参照されたい。

【0360】

ある特定の態様では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の３１０位および／または４３３位および／または４３６位（残基のＥＵ番号付け）の置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の態様では、抗体バリアントは、３１０位、４３３位および４３６位にアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域中のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３ＡおよびＹ４３６Ａである（例えば、ＷＯ２０１４／１７７４６０Ａ１を参照されたい）。例えば、一部の実施形態では、正常なＦｃＲｎ結合を使用することができる。

【0361】

また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８〜４０頁（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。

【0362】

本明細書で報告される抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫを有する完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、１つまたは２つのＣ末端アミノ酸残基が除去された短縮されたＣ末端であってもよい。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端は、短縮されたＣ末端ＰＧである。

【0363】

本明細書で報告される全ての態様の一態様では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６、アミノ酸位置のＥＵインデックスによる番号付け）を含む。これは、本明細書で使用される用語「完全長抗体」または「完全長重鎖」と共に依然として明示的に包含される。

【0364】

抗体誘導体
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体をさらに修飾して、当業界で公知であり、容易に利用可能であるさらなる非タンパク質性部分を含有させることができる。抗体の誘導体化にとって好適な部分としては、限定されるものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定例としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸類（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、およびデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコールホモポリマー類、プロリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにその混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造における利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量のものであってよく、分枝状または非分枝状であってもよい。抗体に結合したポリマーの数は変化してもよく、１つより多いポリマーが結合する場合、それらは同じか、または異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または型を、限定されるものではないが、改善しようとする抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での治療において使用されるかどうかなどの考慮に基づいて決定することができる。

【0365】

別の実施形態では、抗体と、放射線への曝露によって選択的に加熱することができる非タンパク質性部分とのコンジュゲートが提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１１６００〜１１６０５頁（２００５））。放射線は、任意の波長のものであってもよく、限定されるものではないが、通常の細胞には害を及ぼさないが、抗体−非タンパク質性部分に近い細胞が殺傷される温度に非タンパク質性部分を加熱する波長が挙げられる。

【0366】

組換え法および組成物
例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたような、組換え法および組成物を使用して、抗体を生産することができる。一実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。１つのそのような実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクターおよび抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それを形質転換されている）。

【0367】

多重特異性抗体の場合、特定の抗体形式の重鎖および軽鎖成分のそれぞれをコードする核酸を提供することができる。そのような核酸を含むベクターまたはベクターのセットも提供される。

【0368】

一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、本発明による抗体を作製する方法であって、上で提供された抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現にとって好適な条件下で培養すること、および必要に応じて、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。

【0369】

抗体の組換え生産のために、例えば、上記のような、抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために１つまたは複数のベクター中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定することができる。

【0370】

抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核または真核細胞が挙げられる。例えば、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、抗体を細菌中で産生させてもよい。細菌中での抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照されたい（また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での抗体断片の発現を記載する、Ｃｈａｒｌｔｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３、２４５〜２５４頁も参照されたい）。発現後、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから抗体を単離し、さらに精製することができる。

【0371】

原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株および酵母株を含む、糸状菌または酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９〜１４１４頁（２００４）、およびＬｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０〜２１５頁（２００６）を参照されたい。

【0372】

グリコシル化抗体の発現のための好適な宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための昆虫細胞と共に使用することができる、いくつかのバキュロウイルス株が同定されている。

【0373】

植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号、および第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。

【0374】

脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓細胞株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９頁（１９７７）に記載された２９３または２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１頁（１９８０）に記載されたＴＭ４細胞；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８頁（１９８２）に記載されたＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６頁（１９８０））を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産にとって好適なある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５〜２６８頁（２００３）を参照されたい。

【0375】

アッセイ
本明細書で提供される抗体を、当業界で公知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的特性および／または生物活性について同定、スクリーニング、または特性評価することができる。

【0376】

結合アッセイおよび他のアッセイ
一態様では、本発明の抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットなどの公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。

【0377】

別の態様では、競合アッセイを使用して、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭまたはＣＥＡへの結合について、例えば、ＰＲＩＴ−０２１３またはＰＲＩＴ−０２１４と競合する抗体を同定することができる。ある特定の実施形態では、そのような競合抗体は、ＰＲＩＴ−０２１３またはＰＲＩＴ−０２１４が結合する同じエピトープ（例えば、線状または立体エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）、「Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供されている。

【0378】

例示的な競合アッセイにおいては、固定化された抗原を、抗原（例えば、ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４）に結合する第１の標識化抗体および抗原への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の未標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化された抗原を、第２の未標識化抗体ではなく、第１の標識化抗体を含む溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を可能にする条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体を除去し、固定化された抗原と結合した標識の量を測定する。固定化された抗原と結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは第２の抗体が抗原への結合について第１の抗体と競合していることを示す。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。

【0379】

抗体親和性
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下もしくは１ｐＭ以下の、またはそうでなければ本明細書に記述されるような解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0380】

一実施形態では、Ｋｄは、放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、目的の抗体のＦａｂバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するＦａｂの溶解結合親和性は、未標識抗原の滴定系列の存在下で、Ｆａｂと、最小濃度の（^１２５Ｉ）標識された抗原とを平衡化させた後、抗Ｆａｂ抗体でコートされたプレートを用いて結合した抗原を捕捉することによって測定される（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照されたい）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂｓ）で一晩コートした後、室温（約２３℃）で２〜５時間にわたってＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）中で、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［^１２５Ｉ］−抗原を、目的のＦａｂの段階希釈液と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：４５９３〜４５９９頁（１９９７）における、抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致する）。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートする；しかしながら、インキュベーションは、平衡に達するのを確保するために、より長い期間（例えば、約６５時間）にわたって継続してもよい。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間にわたる）のために捕捉プレートに移す。次いで、溶液を除去し、ＰＢＳ中の０．１％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））でプレートを８回洗浄する。プレートが乾燥した時、１５０μＬ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、プレートを計測する。２０％未満またはそれと等しい最大結合を与えるそれぞれのＦａｂの濃度が、競合結合アッセイにおける使用のために選択される。

【0381】

別の実施形態によれば、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用するアッセイを、約１０反応単位（ＲＵ）の固定された抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施する。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。約１０反応単位（ＲＵ）のカップリングしたタンパク質を達成するために、抗原を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８を用いて、５μｌ／分の流量での注入前に５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して、未反応の基をブロックする。動力学測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、約２５μｌ／分の流量、２５℃で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に注入する。結合および解離センサーグラムを同時に適合させることによって、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を使用して、結合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５〜８８１頁（１９９９）を参照されたい。上の表面プラズモン共鳴アッセイにより会合速度が１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える場合、流動停止を備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または撹拌キュベットを含む８０００シリーズのＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの、分光光度計で測定された場合、漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｘｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増大または低下を測定する蛍光消光技術を使用することによって、会合速度を決定することができる。

【0382】

別の実施形態では、Ｋｄは、ＳＥＴ（溶液平衡滴定）アッセイを使用して測定される。このアッセイによれば、試験抗体を、典型的には一定の濃度で適用し、試験抗原の段階希釈液と混合する。平衡を確立するためにインキュベートした後、遊離抗体の一部を、抗原でコートされた表面上に捕捉し、一般的には、電気化学発光（例えば、Ｈａｅｎｅｌら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３９（２００５）１８２〜１８４頁に記載されている）を使用して、標識／タグ付けされた抗種抗体で検出する。

【0383】

例えば、一実施形態では、３８４ウェルのストレプトアビジンプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ ＃１１９７４９９８００１）を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳバッファー中の２５μｌ／ウェルの抗原−ビオチン−異性体混合物と共に４℃で一晩インキュベートする。抗体試料と、遊離抗原との平衡化のために、０．０１ｎＭ〜１ｎＭの抗体を、２５００ｎＭ、５００ｎＭまたは１００ｎＭの抗原の濃度から開始して、１：３、１：２または１：１．７の希釈段階の関連抗原で滴定する。試料を、密閉されたＲＥＭＰ保存ポリプロピレンマイクロプレート（Ｂｒｏｏｋｓ）中、４℃で一晩インキュベートする。一晩インキュベートした後、ストレプトアビジンプレートを、ウェルあたり９０μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。平衡化プレートに由来する１５μｌの各試料を、アッセイプレートに移し、ＲＴで１５ｍｉｎインキュベートした後、ＰＢＳＴバッファー９０μｌで３回洗浄工程を行う。２５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３６−０８８、ＯＳＥＰ中で１：４０００）を添加した後、ＰＢＳＴバッファー９０μｌで６回洗浄工程を行うことによって、検出を実行する。２５μｌのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号１１８３５０３３００１）を、各ウェルに添加する。Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）上、３７０／４９２ｎｍで測定を行う。

【0384】

別の実施形態では、Ｋｄを、ＫｉｎＥｘＡ（結合平衡除外）アッセイを使用して測定する。このアッセイによれば、典型的には、抗原を、一定濃度の抗体結合部位中で滴定し、試料を平衡化させた後、抗原飽和抗体複合体を洗浄除去しながら、遊離抗体結合部位が抗原コートビーズ上に捕捉されるフローセルに通す。次いで、ビーズに捕捉された抗体を、標識された、例えば、蛍光標識された抗種抗体で検出する（Ｂｅｅら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、２０１２；７（４）：ｅ３６２６１）。例えば、一実施形態では、ＫｉｎＥｘＡ実験を、ランニングバッファーとしてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用して、室温（ＲＴ）で実施する。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを添加したランニングバッファー（「試料バッファー」）中で試料を調製する。０．２５ｍｌ／分の流量を使用する。５ｐＭの結合部位濃度を有する一定量の抗体を、１００ｐＭから開始する２倍段階希釈（０．０４９ｐＭ〜１００ｐＭの濃度範囲）によって抗原で滴定する。抗原を含まない抗体の１つの試料は、１００％のシグナル（すなわち、阻害なし）として働く。抗原−抗体複合体を、少なくとも２４時間にわたってＲＴでインキュベートして、平衡に到達させる。次いで、平衡化した混合物を、５ｍｌの容量でＫｉｎＥｘＡシステム中の抗原結合ビーズのカラムに通して、溶液の平衡状態を乱すことなく、未結合の抗体をビーズによって捕捉させる。捕捉された抗体を、試料バッファー中の２５０ｎｇ／ｍｌのＤｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｃ）にコンジュゲートした抗ヒトＦｃ断片特異的二次抗体を使用して検出する。各試料を、全ての平衡実験のために２回測定する。「標準分析」法を使用するＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）に含まれる１部位均一結合モデルを使用して、データの非線形回帰分析からＫＤを得る。

【0385】

治療方法および組成物
上で考察された通り、本発明による多重特異性抗体は、放射性核種を標的に送達することが望ましい任意の治療にとって好適である。したがって、本発明は、治療方法における使用のための本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体などの標的化された抗体を提供する。より具体的には、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための本明細書に記載の標的化された抗体（例えば、多重特異性または二重特異性抗体）が提供される。そのような実施形態では、キレート化されたＰｂは、好ましくは、^２１２Ｐｂである。

【0386】

上述の通り、治療は、患者の疾患細胞に標的化される細胞傷害活性によって治療可能である任意の状態のものであってよい。治療は、好ましくは、腫瘍またはがんのものである。しかしながら、本発明の適用可能性は、腫瘍およびがんに限定されない。例えば、治療は、ウイルス感染、または別の病原性生物、例えば、原核生物による感染のものであってもよい。必要に応じて、ターゲティングは、Ｔ細胞誘導性自己免疫性疾患またはＴ細胞性血液がんの治療のためのＴ細胞であってもよい。かくして、治療される状態は、ＨＩＶ、狂犬病、ＥＢＶおよびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのウイルス感染、ならびに多発性硬化症および移植片対宿主疾患薬などの自己免疫性疾患を含んでもよい。

【0387】

本明細書で使用される場合、用語「がん」は、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、ファローピアス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫などの固形がんと血液がんの両方を含み、上記がんのいずれかの難治性型、または上記がんの１つもしくは複数の組合せを含む。

【0388】

療法のために放射性同位体を組織または臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること；および
ｉｉ）続いて、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種であって、細胞表面に局在化された抗体に結合する、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。

【0389】

必要に応じて、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に、除去剤／ブロッキング剤を投与する。除去剤／ブロッキング剤は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに特異的な抗原結合部位に結合し、キレート化された放射性核種によるその後の結合をブロックすることができる。除去剤は、金属イオンとキレート化され、除去部分にコンジュゲートされた、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含んでもよい。

【0390】

好適な除去部分の例は、分子のサイズおよび／または流体力学半径を増大させ、循環中の抗体に結合する分子の能力と干渉することなく、腫瘍に接近する分子の能力を阻害する部分を含んでもよい。例示的な部分としては、親水性ポリマーが挙げられる。部分は、例えば、デキストラン、デキストリン、ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）またはポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）のポリマーまたはコポリマーであってもよい。他の実施形態では、部分は、ＸＴＥＮポリペプチド（非構造化親水性タンパク質ポリマー）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ）、エラスチン様ペプチド（ＥＬＰ）、またはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）などの非構造化ペプチドまたはタンパク質であってもよい。ポリマーに関する好適な分子量は、例えば、少なくとも５０ｋＤａ、例えば、５０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの範囲にあってもよい。例えば、分子量は、２００〜８００ｋＤａ、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５５０ｋＤａより小さい、必要に応じて、約５００ｋＤａであってもよい。

【0391】

一部の実施形態では、除去剤は、例えば、以下にさらに記載されるような、デキストランまたはその誘導体にコンジュゲートされた、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアント（金属イオンとキレート化される）であってもよい。

【0392】

一部の実施形態では、抗体の除去剤に対する重量比は、１：１、２：１、３：１または４：１から、２０：１、１５：１、１０：１、８：１、６：１または５：１までの範囲、例えば、１：１〜２０：１、１：１〜１０：１、２：１〜８：１または２：１〜６：１の範囲にあってもよい。

【0393】

一部の実施形態では、除去剤を、多重特異性抗体による治療の数時間または数日後に投与してもよい。一部の実施形態では、除去剤を、多重特異性抗体の少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２２もしくは２４時間後、または少なくとも１、２、３、４、５、６もしくは７日後に投与することが好ましい場合がある。一部の実施形態では、除去剤を、抗体後１４日以内、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３または２日以内に投与することが好ましい場合がある。

【0394】

必要に応じて、除去剤を、多重特異性抗体の後、４〜１０日、４〜７日、２〜７日、または２〜４日の間の期間で投与する。

【0395】

一部の実施形態では、Ｐｂ放射性核種を、除去剤の後、数分、数時間または数日で投与する。一部の実施形態では、Ｐｂ放射性核種を、除去剤の少なくとも３０分後に、必要に応じて、除去剤の投与の４８時間、２４時間、８時間または４時間以内に投与することが好ましい場合がある。一部の実施形態では、Ｐｂ放射性核種を、除去剤の投与の翌日に投与してもよい。

【0396】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体を、併用療法の一部として投与することができる。例えば、それらを、１つまたは複数の化学療法剤と共に投与することができる：化学療法剤と抗体とを、同時的に、またはいずれかの順序で連続的に投与することができる。

【0397】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体を、さらにまたはあるいは、放射線増感剤と共に投与してもよい。放射線増感剤と抗体とを、同時に、またはいずれかの順序で連続的に投与することができる。

【0398】

薬学的製剤
本明細書に記載の抗Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗体、例えば、多重特異性または二重特異性抗体の薬学的製剤を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の純度を有するそのような抗体と、１つまたは複数の任意選択の薬学的に許容される担体とを混合することによって調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０））。薬学的に許容される担体は、一般的には、用いられる用量および濃度でレシピエントに対して非毒性的であり、限定されるものではないが、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成性対抗イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの間質薬分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせる。

【0399】

例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号およびＷＯ２００６／０４４９０８に記載のものが挙げられ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸バッファーを含む。

【0400】

本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症にとって必要な１つより多い活性成分、好ましくは、互いに有害に影響しない相補的活性を有するものを含有してもよい。例えば、上で考察された化学療法剤および／または放射線増感剤をさらに提供することが望ましい場合がある。そのような活性成分は、好適には、意図される目的にとって有効である量で一緒に存在する。

【0401】

活性成分を、例えば、液滴形成技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に捕捉することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）（１９８０）に開示されている。

【0402】

徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。

【0403】

ｉｎ ｖｉｖｏでの投与のために使用される製剤は、一般的には滅菌性である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成することができる。

【0404】

診断および検出のための方法および組成物
本発明は、対象に対して実行される診断方法における使用のための、標的抗体、例えば、本明細書に記載の多重特異性抗体をさらに提供する。診断方法は、例えば、増殖性疾患または感染症を有すると疑われる対象を診断するための、プレターゲティングされた放射線免疫イメージングの方法であってもよい。そのような実施形態では、キレート化されたＰｂは、好ましくは、^２０３Ｐｂである。

【0405】

イメージングのために放射性同位体を組織または臓器に標的化する方法は、
ｉ）対象に、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体であって、標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、前記抗体を投与すること；および
ｉｉ）続いて、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、ＤＯＴＡＭまたはその前記機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を個体に投与すること
を含んでもよい。

【0406】

別の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体を、投与の時点でキレート化されたＰｂ放射性核種と結合させてもよい。

【0407】

必要に応じて、方法は、
ｉｉｉ）ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種が局在化されるか、または局在化されると期待される組織または臓器をイメージングすること
をさらに含んでもよい。

【0408】

別の実施形態では、本発明の方法は、対象が、
ｉ）標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、本明細書に記載の多重特異性または二重特異性抗体；および
ｉｉ）ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種であって、細胞の表面に局在化された抗体に結合する、ＤＯＴＡＭまたはその前記機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種
を個体に以前に投与された、対象の組織または臓器をイメージングすることを含んでもよい。

【0409】

必要に応じて、工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に、除去剤／ブロッキング剤を投与する。除去剤、除去剤のための投与レジメンおよび抗体の除去剤に対する重量比は、上記の通りであってよい。

【0410】

標的抗原は、本明細書で考察される任意の標的抗原であってもよい。一部の実施形態では、標的抗原は、上で考察された腫瘍特異的抗原であってよく、イメージングは、腫瘍または複数の腫瘍をイメージングする方法であってもよい。個体は、腫瘍を有することが知られているか、または有すると疑われてもよい。

【0411】

例えば、方法は、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞上皮細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）がん、結腸がん、乳がん、子宮がん、ファローピアス管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆管がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（上記がんのいずれかの難治性型、または上記がんの１つもしくは複数の組合せを含む）を有するか、または有すると疑われる個体において腫瘍をイメージングする方法であってもよい。

【0412】

除去剤
本発明のさらなる態様では、本発明者らは、新規除去剤を開発した。そのような除去剤を、本明細書に記載のような診断、イメージングまたは治療の方法のいずれかにおいて使用することができる。

【0413】

一態様では、本発明は、Ｍ−ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントにコンジュゲートされた、デキストランまたはその誘導体を含むデキストランベースの除去剤に関する。

【0414】

一部の実施形態では、除去剤は、以下の式：
デキストラン−（リンカー−（Ｍ−ＤＯＴＡＭ））_ｘ
［式中、
デキストランは、デキストランまたはその誘導体であり；
リンカーは、連結部分であり；
Ｍ−ＤＯＴＡＭは、ＤＯＴＡＭまたは金属イオンが組み込まれたその機能的バリアントであり；および
ｘ≧１である］
の化合物であってもよい。

【0415】

一部の実施形態では、連結部分は、尿素基（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、置換された尿素基（−ＮＲ^ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^ｘ−［式中、一方もしくは両方のＲ^ｘ基はＨではない］）、チオウレア基（−ＮＨ−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−）、置換されたチオウレア基（−ＮＲ^ｘ−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ^ｘ−［式中、一方もしくは両方のＲ^ｘ基はＨではない］）、アミド基（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）、置換されたアミド基（−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ^ｘ−［式中、Ｒ^ｘはＨではない］）、チオアミド基（−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−）、置換されたアミド基（−Ｃ（Ｓ）−ＮＲ^ｘ−［式中、Ｒ^ｘはＨではない］）、トリアゾール基、または置換されたトリアゾールから選択される１つまたは複数の二価官能基であってよいか、またはそれを含んでもよい。これらの実施形態では、連結部分は、必要に応じて、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、アルキレン基およびヘテロアラルキレン基などの、１つまたは複数のさらなる二価官能基を含んでもよい。置換基Ｒ^ｘは、特に限定されない。特定の実施形態では、Ｒ^ｘは、存在する場合、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２アリール、Ｃ５〜Ｃ１２ヘテロアリールおよびハロ基から選択される。

【0416】

特定の実施形態では、連結部分は、尿素基、チオウレア基、アミド基、チオアミド基、またはトリアゾール基から選択される１つまたは複数の二価官能基であってもよいか、またはそれを含んでもよい。

【0417】

好ましい実施形態では、連結部分は、二価チオウレア官能基または二価チオアミド官能基を含む。

【0418】

一部の実施形態では、連結部分は、二価チオウレア官能基および置換されていてもよいアリーレン基を含む。一部の実施形態では、連結部分は、二価チオウレア官能基、置換されていてもよいアリーレン基および置換されていてもよいアルキレン基を含む。特定の実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、置換されていてもよいアリーレン基に共有的に結合した二価チオウレア官能基を含む。さらなる実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、置換されていてもよいアリーレン基に共有的に結合した二価チオウレア官能基を含み、置換されていてもよいアリーレン基は、置換されていてもよいアルキレン基に共有的に結合している。好ましい実施形態では、アリーレン基は、非置換である。特定の実施形態では、アリーレン基は、フェニレン基である。好ましい実施形態では、アルキレン基は、非置換である。特定の実施形態では、アルキレン基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキエン（alkyene）基である。特に好ましい実施形態では、アルキレン基は、メチレンおよびエチレンから選択される。連結部分に存在する場合、アリーレン基およびアルキレン基は、非置換であってもよい。特定の実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、アリーレン基に共有的に結合した二価チオウレア官能基からなり、アリーレン基は、アルキレン基に共有的に結合している。

【0419】

一部の実施形態では、連結部分は、二価チオアミド官能基および置換されていてもよいアリーレン基を含む。一部の実施形態では、連結部分は、二価チオアミド官能基、置換されていてもよいアリーレン基および置換されていてもよいアルキレン基を含む。特定の実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、置換されていてもよいアリーレン基に共有的に結合した二価チオアミド官能基を含む。さらなる実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、置換されていてもよいアリーレン基に共有的に結合した二価チオアイド（ｔｈｉｏａｉｄｅ）官能基を含み、置換されていてもよいアリーレン基は、置換されていてもよいアルキレン基に共有的に結合している。好ましい実施形態では、アリーレン基は、非置換である。特定の実施形態では、アリーレン基は、フェニレン基である。好ましい実施形態では、アルキレン基は、非置換である。特定の実施形態では、アルキレン基は、Ｃ１〜Ｃ６アルキエン基である。特に好ましい実施形態では、アルキレン基は、メチレンおよびエチレンから選択される。連結部分に存在する場合、アリーレン基およびアルキレン基は、非置換であってもよい。特定の実施形態では、連結部分は、その窒素原子の１つを介して、アリーレン基に共有的に結合した二価チオアミド官能基からなり、アリーレン基は、アルキレン基に共有的に結合している。

【0420】

一部の実施形態では、連結部分は、以下の式：

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［式中、ｙは１〜６（好ましくは、１または２）であり、^＊はデキストランまたはその誘導体への結合点を表し、^＊＊はＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントの環原子への結合点を表す］
の基であってもよいか、またはそれを含んでもよい。

【0421】

一部の実施形態では、連結部分を、アミン（好ましくは、第１級アミン）と、イソシアネートまたはイソチオシアネートとのコンジュゲーションから形成させることができる。そのようなコンジュゲーションは、それぞれ、二価尿素官能基およびチオウレア官能基を形成する。そのような実施形態では、イソシアネートが反応物の１つである場合、連結部分は、必要に応じて、二価尿素官能基または二価アミド官能基を含むと考えてもよい。そのような実施形態では、イソチオシアネートが反応物の１つである場合、連結部分は、適宜、二価チオウレア官能基または二価チオアミド官能基を含むと考えてもよい。

【0422】

好ましくは、ｘが１より大きい場合、それぞれのデキストランは、１分子あたり１より大きい平均数のＭ−ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを有する。例えば、ｘは、２以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、または好ましくは５０以上であってもよい。本発明者らは、複数のＭ−ＤＯＴＡＭ基で標識されたデキストランを使用して、改善された除去を達成することができることを見出した。

【0423】

ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、ただ１つのリンカーを含み、デキストランの架橋を防止することができる。

【0424】

除去剤において有用であり得るデキストランの誘導体としては、デキストランが１つまたは複数のアミンで置換されているアミノデキストランが挙げられる。特に有用なものは、デキストランの１つまたは複数のヒドロキシル基が、アミノ置換カルボキシメチルアミド基で置換されているアミノデキストランである。デキストランをカルボキシメチル基で修飾し（例えば、クロロ酢酸と反応させ）、次いで、置換されていてもよいジアミン（好ましくは、α，ω−アルキレンジアミン、例えば、エチレンジアミンなどのアルキルジアミン）とさらに反応させることによって、そのような化合物を生産することができる。

【0425】

アミノ基は、リンカーのための結合点を提供する。少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％の利用可能なアミノ基を、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントで置換することができる。

【0426】

好ましくは、上の式中の「デキストラン」は、それ自身、エチレンジアミンで置換されている１つまたは複数のカルボキシメチル基で置換されたデキストランに対応する、アミノデキストランである。

【0427】

デキストランは、式−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（ＣＨ_２）_ｆＮＨＲ^Ｆ［式中、Ｒ^Ｆは水素またはＤＯＴＡＭに対するリンカーを示し、ｆは１〜６、最も好ましくは、２である］の１つまたは複数の基で置換されていてもよい。例えば、基は、以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

［式中、破線は、デキストラン上の酸素への結合点を示す］
を有してもよい。

【0428】

アミノデキストランは、例えば、α（１，２）、α（１，３）またはα（１，４）グリコシド結合によって連結された他のグルコピラノシル単位の分枝を有してもよい、主にα（１，６）結合グルコピラノシル反復単位の骨格を有してもよい。ヒドロキシル基の少なくともいくつかは、上で考察されたようにアミノ置換カルボキシメチルアミド基（特に、式−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＲ^Ｆの基）で置換される。換言すれば、アミノデキストランは、以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

［Ｒ^Ｇはそれぞれ、Ｈ、アミノ置換カルボキシメチルアミド基（−ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨＲ^Ｆなど）、または主に、α（１，６）結合を介する、さらなるグルコピラノシル単位への結合であり、破線は隣接単位への結合を示す］
の単位を含んでもよい。

【0429】

除去剤は、以下の式：

[この文献は図面を表示できません]

［式中、^＊＊は、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントへの結合点を表し、ｙは上で定義された通りである］の１つまたは複数の単位を含んでもよい。

【0430】

デキストランの誘導体は、アミノ酸、またはグルコース以外の糖類から選択される１つまたは複数の基で修飾されたデキストランまたはアミノデキストランを含んでもよい。例えば、デキストランは、Ｇｌｕ、（Ｇｌｕ）_２、（Ｇｌｕ）_３、または（Ｇｌｕ）_４を含む、１つまたは複数のグルタミン酸またはポリグルタミン酸単位で修飾（例えば、キャップ）されていてもよい。さらに、またはあるいは、デキストランは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）などのグルコース以外の糖類、またはｔｒｉ−ＧａｌＮＡｃなどのそのような糖類から形成される多糖類で修飾（例えば、キャップ）されていてもよい。

【0431】

一部の実施形態では、デキストラン成分の分子量は、少なくとも５０ｋＤａ、例えば、５０ｋＤａ〜２０００ｋＤａの間であってもよい。例えば、分子量は、２００〜８００ｋＤａ、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５５０ｋＤａより小さい、必要に応じて、約５００ｋＤａであってもよい。

【0432】

デキストランまたはそのデキストラン誘導体のグルコース単位の数のパーセンテージとしてのアミノ基の数（アミノ基によるグルコース単位の「飽和」）は、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％であってよいか、または１００％であることが好ましい場合がある。一部の実施形態では、アミノ基によるデキストランの飽和は、少なくとも、または約１％または１０％、例えば、１％〜１０％であることが好ましい場合がある。

【0433】

デキストラン誘導体のアミノ単位の数のパーセンテージとしてのＤＯＴＡＭ基の数（ＤＯＴＡＭによるアミノデキストラン成分の「飽和」）は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％であってよいか、または１００％であることが好ましい場合がある。一部の実施形態では、ＤＯＴＡＭによるデキストラン誘導体の利用可能なアミノ基の飽和は、少なくとも、または約４０％または５０％、例えば、４０〜６０％であることが好ましい場合がある。

【0434】

除去剤の使用に伴う１つの潜在的な困難は、それらが腫瘍に進入し、腫瘍関連抗原に結合し、放射性リガンドのその後の結合に負に影響し得る可能性である。

【0435】

本発明者らはさらに、ｉ）高い平均分子量を有する、およびｉｉ）ある特定のサイズより下の断片が除去されるように分子量カットオフにかけられた、デキストランベースの除去剤を使用する場合、腫瘍への低い除去剤浸透と共に、血液からの良好なクリアランスを達成することができることを見出した。カットオフを、コンジュゲーション工程の前にデキストランもしくはデキストラン誘導体に適用する；および／またはコンジュゲーション後に除去剤に適用する；および／または金属との複合体化の後に除去剤に適用することができる。

【0436】

かくして、本発明において有用な除去剤は、金属キレートにコンジュゲートされた、デキストランまたはその誘導体（例えば、上で定義されたもの、好ましくは、アミノデキストラン）を含むデキストランベースの除去剤であって、ｉ）デキストランまたはその誘導体の平均分子量が、好ましくは２００〜８００ｋＤａ、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５５０ｋＤａ未満であり、必要に応じて、約５００ｋＤａである、およびｉｉ）分子量カットオフ未満のデキストラン、デキストラン誘導体または除去剤が除去されており、分子量カットオフが５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上、必要に応じて、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａまたは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲にあり、必要に応じて、約１００ｋＤａまたは１５０ｋＤａまたは２００ｋＤａである、デキストランベースの除去剤であってもよい（疑いを避けるために、本発明者らは、カットオフが５０ｋＤａ以上と記述される場合、これは、カットオフが５０ｋＤａまたは５０ｋＤａを超える任意の値であってよいことが、それは依然として、除去されるカットオフ未満のデキストラン、デキストラン誘導体または除去剤であることを意味する）。

【0437】

カットオフより下の分子量を有する種の量は、例えば、除去剤の重量パーセントとして、５ｗｔ％以下、４ｗｔ％以下、３ｗｔ％以下、２ｗｔ％以下、１ｗｔ％以下、０．５ｗｔ％以下、０．４ｗｔ％以下、０．３ｗｔ％以下、０．２ｗｔ％以下、０．１％ｗｔ％以下または０．０１ｗｔ％以下であってもよい。好ましくは、除去剤は、本質的にはカットオフより下の分子量を有する種を含まない。

【0438】

分子量カットオフは、濾過、例えば、ダイアフィルトレーション、限外濾過、タンジェント流濾過またはクロスフロー濾過によって達成することができる。好ましくは、少なくとも２回、必要に応じて、少なくとも３回の濾過工程が実行される。「平均分子量」とは、本発明者らは、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析によって決定される重量平均分子量を意味する。

【0439】

ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントに組み込まれた場合、金属が金属イオンとして存在し、酸化状態が特定の元素に応じて変化することが理解されるであろう。かくして、知識のある読者であれば、例えば、鉛、Ｐｂ、または^２０６Ｐｂという用語が、その元素のイオン形態、特に、Ｐｂ（ＩＩ）を包含することが意図されることを理解できる。

【0440】

除去剤中に存在する金属は、鉛の安定な（非放射性）同位体、または別の金属イオンの安定な、もしくは本質的に安定な同位体であってよいが、但し、金属イオン−ＤＯＴＡＭ複合体は、抗体によって高い親和性で認識される。例えば、他の好適な金属は、Ｚｎ（Ｚｎ^２＋）、Ｃａ（Ｃａ^２＋）または^２０９Ｂｉ（Ｂｉ^２＋）であってよく、後者は放射性であるが、その非常に長い半減期のため、実質的に安定であると考えられる。

【0441】

さらなる態様では、本発明は、デキストランまたはデキストラン誘導体をＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントもしくは誘導体にコンジュゲートすることを含む、除去剤を調製する方法であって、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントのデキストランへのコンジュゲーションの前および／または後に、ＤＯＴＡＭをＰｂまたは上記の別の金属イオン［例えば、Ｐｂ（ＩＩ）］でキレート化することを含む、除去剤を調製する方法に関する。

【0442】

さらなる態様では、本発明は、除去剤を調製する方法であって、
ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントもしくは誘導体をデキストランまたはデキストラン誘導体にコンジュゲートすることによって、コンジュゲートを形成すること
を含み；
コンジュゲーションの前に、デキストランまたはデキストラン誘導体を濾過工程にかけて、例えば、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上もしくは２００ｋＤａ以上、必要に応じて、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａもしくは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲の分子量カットオフ／閾値より下の種、例えば、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａもしくは２００ｋＤａより下の種を除去するか、または
方法が、コンジュゲートを濾過工程にかけて、例えば、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上もしくは２００ｋＤａ以上、必要に応じて、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａもしくは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲の分子量カットオフ／閾値より下の種、例えば、１００ｋＤａ、１５０ｋＤａもしくは２００ｋＤａより下の種を除去することをさらに含む、除去剤を調製する方法に関する。

【0443】

上記のように、本発明者らは、分子量カットオフを適用して、ある特定のサイズより下の断片を除去することが有益であることを見出した。濾過方法は、例えば、ダイアフィルトレーションであってもよい。知識のある読者であれば、「分子量カットオフ／閾値より下の種を除去する」における単語「除去する」は、「数を減少させる」と同義であり、用いられる特定の濾過方法に応じて、いくらかの残留低分子量種が残存してもよいことを理解できる。カットオフより下の分子量を有する種の量は、例えば、除去剤の重量パーセントとして、５ｗｔ％以下、４ｗｔ％以下、３ｗｔ％以下、２ｗｔ％以下、１ｗｔ％以下、０．５ｗｔ％以下、０．４ｗｔ％以下、０．３ｗｔ％以下、０．２ｗｔ％以下、０．１％ｗｔ％以下または０．０１ｗｔ％以下であってもよい。好ましくは、除去剤は、本質的には、濾過後にカットオフ／閾値より下の分子量を有する種を含まない。

【0444】

ＤＯＴＡＭの機能的バリアントまたは誘導体は、上で定義された通りであってよく、少なくとも１つのＲ^１基は、リンカー部分として働く。例えば、好適な（リンカー−（Ｍ−ＤＯＴＡＭ））基を、以下の式の化合物と、上記のアミノデキストランとを反応させることによって形成させることができる：

[この文献は図面を表示できません]

【0445】

この化合物の合成は、Ｃｈａｐｐｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２７巻、９３〜１００頁、２０００に記載されており、ＤＯＴＡＭ誘導体は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌａｎｏ、Ｔｅｘａｓ）から市販されている。

【0446】

それぞれのデキストラン誘導体が平均で１個より多いＤＯＴＡＭを有するように、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを過剰に添加してもよい。それぞれのデキストラン上のＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントの平均数は、１より大きい、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、５０以上、１００以上、または好ましくは、４０以上であってもよい。本発明者らは、複数のＭ−ＤＯＴＡＭ基にコンジュゲートされたデキストランを使用して、改善された除去を達成することができることを見出した。

【0447】

好ましくは、デキストランは、２００〜８００ｋＤａ、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５５０ｋＤａより小さい、必要に応じて、約５００ｋＤａの平均分子量を有する。

【0448】

除去剤を調製する方法はまた、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを、金属イオンとキレート化することを含む、キレート化工程を含んでもよい。金属イオンは、非放射性同位体、例えば、Ｐｂ、Ｃａ、Ｚｎの非放射性同位体、または^２０９Ｂｉなどの実質的に安定な同位体であってもよい。

【0449】

キレート化工程は、ＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントのデキストランへのコンジュゲーションの前に、および／またはＤＯＴＡＭもしくはその機能的バリアントのデキストランへのコンジュゲーションの後に、必要に応じて、濾過工程の前に実行される。ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントによる金属イオンのキレート化は、二重特異性抗体の除去剤への適切な結合を確保する、例えば、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントが抗体と遭遇するための正確なコンフォメーションを採ることを確保するのに必要であってよい。

【0450】

方法がキレート化工程を含む場合、方法は好ましくは、未結合の金属を除去するその後の工程も含む。これは、さらなるキレート剤を添加することによって達成することができ、その後、濾過工程中にデキストランに結合したＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントから分離することができる。さらなるキレート剤は好ましくは、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントとは異なる。好ましくは、さらなるキレート剤は、サイズに基づく分離を容易にするために、デキストラン−キレート剤コンジュゲートよりも低い分子量を有する。例えば、さらなるキレート剤は、エチレンジアミノ四酢酸（ＥＤＴＡ）などの、ポリアミノカルボン酸またはその塩であってもよい。

【0451】

好ましくは、キレート剤を調製する方法は、
ｉ）ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントもしくは誘導体をデキストランまたはデキストラン誘導体にコンジュゲートすることによって、コンジュゲートを形成すること；
ｉｉ）必要に応じて、工程（ｉ）の生成物から低分子量種を除去すること；
ｉｉｉ）コンジュゲートを、金属イオン、例えば、Ｐｂ、Ｂｉ、ＺｎまたはＣａのイオンでキレート化すること；
ｉｖ）さらなるキレート剤を添加して、未結合の金属イオンをキレート化すること；および
ｖ）濾過工程を実行して、分子量カットオフ／閾値より下の種を除去すること
を含む。

【0452】

ＤＯＴＡＭ−キレート化されたＰｂ放射性核種
ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を、本明細書に記載の診断、イメージングまたは治療の方法のいずれかにおいて使用することができる。そのような方法において使用される場合、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種は、組成物中に含まれることが理解されるであろう。１つの特定の実施形態では、組成物は、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントによってキレート化されたＰｂ放射性核種と、Ｐｂ放射性核種でキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントとを含む。かくして、別の態様では、本発明は、そのような組成物、および／または本明細書に記載のイメージングもしくは治療の方法のいずれかにおける使用のためのそのような組成物に関する。そのような方法において言及されるＤＯＴＡＭでキレート化されたＰｂ放射性核種は、本明細書に記載の組成物の形態にあってもよい。

【0453】

Ｐｂ放射性核種でキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、キレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントであってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏで使用される場合、キレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、環境由来の金属イオン、例えば、カルシウムイオンとの複合体を形成することができる。ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたそのようなカルシウムイオンは、薬理的に不活性であり、腫瘍中の標的に由来するＤＯＴＡＭまたはそのバリアントでキレート化された薬理的に活性なＰｂ放射性核種を潜在的にブロックすることができ、したがって、治療の有効性、ならびに／またはイメージングおよび診断の標準化された取込み値を減少させ得る。

【0454】

本発明者らは、規定の条件下で、キレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを消光することによって、キレート化されたＰｂ放射性核種のｉｎ ｖｉｖｏ製剤の制御を増大させることができる、および／または薬学的に活性なキレートと薬学的に不活性なキレートとの潜在的な競合を回避するか、もしくは減少させることができる。したがって、一部の実施形態では、Ｐｂ放射性核種でキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、非放射性金属イオンとキレート化されているＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントである。

【0455】

一部の実施形態では、キレート化されたＰｂ放射性核種は、^２１２Ｐｂである。一部の実施形態では、キレート化されたＰｂ放射性核種は、^２０３Ｐｂである。

【0456】

ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントに組み込まれた場合、Ｐｂ放射性核種が金属イオンとして存在し、酸化状態が特定の元素に応じて変化することが理解されるであろう。かくして、知識のある読者であれば、例えば、鉛、Ｐｂ、または^２０６Ｐｂという用語が、その元素のイオン形態、特に、Ｐｂ（ＩＩ）を包含することが意図されることを理解できる。

【0457】

組成物中に存在する非放射性金属は、鉛の安定な（非放射性）同位体、または別の金属イオンの安定な、もしくは本質的に安定な同位体であってもよい。例えば、他の好適な金属は、Ｇｄ、（Ｇｄ２＋）、Ｃｕ（Ｃｕ２＋）、Ｚｎ（Ｚｎ２＋）、Ｃａ（Ｃａ２＋）または^２０９Ｂｉ（Ｂｉ２＋）であってもよく、後者は放射性であるが、その非常に長い半減期のため、実質的に安定であると考えられる。一部の実施形態では、金属は、ＣａまたはＣｕであり、一部の実施形態では、金属はＣａである。

【0458】

ＤＯＴＡＭの機能的バリアントまたは誘導体は、上で定義された通りであってよい。

【0459】

さらなる態様では、本発明は、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化されたＰｂ放射性核種を含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）Ｐｂ放射性核種を提供すること、
ｉｉ）Ｐｂ放射性核種を、ＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントでキレート化すること、
ｉｉｉ）キレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを、非放射性金属イオンとキレート化すること
を含む方法に関する。

【0460】

工程ｉｉｉ）におけるキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、工程ｉｉ）においてＰｂ放射性核種でキレート化されなかったＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントである。

【0461】

非放射性金属イオンは、Ｐｂ、Ｃａ、Ｚｎ、ＧｄまたはＣｕのイオンであってもよい。一部の実施形態では、金属イオンは、ＣａまたはＣｕのイオンである。一部の実施形態では、金属イオンは、Ｃａのイオン、特に、Ｃａ２＋である。

【0462】

一部の実施形態では、工程ｉｉ）後に残存するキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、Ｐｂ放射性核種に添加されたＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントの少なくとも９０ｍｏｌ％、少なくとも９５ｍｏｌ％、少なくとも９９ｍｏｌ％である。１つの特定の実施形態では、工程ｉｉ）後に残存するキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、少なくとも９９ｍｏｌ％である。

【0463】

一部の実施形態では、工程ｉｉｉ）後に残存するキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、Ｐｂ放射性核種に添加されたＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントの５ｍｏｌ％未満、２ｍｏｌ％未満、１ｍｏｌ％未満、０．１ｍｏｌ％未満、０．０１ｍｏｌ％未満である。１つの特定の実施形態では、工程ｉｉｉ）後に残存するキレート化されていないＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントは、１ｍｏｌ％未満、０．１ｍｏｌ％未満、０．０１ｍｏｌ％未満である。

【0464】

工程ａ）で提供されるＰｂ放射性核種を、目的のＰｂ放射性核種を崩壊させる放射性材料であって、固体材料に結合する放射性材料を生成器に入れることによって生成することができる。例えば、^２１２Ｐｂの生産におけるそのような放射性材料は、２２４ラジウムであってもよい。次いで、目的の放射性核種を、生成器から放射性および化学的不純物を含有してもよい水溶液中に抽出する。目的のＰｂ放射性核種および不純物を含有する水溶液を、カラム上での液体クロマトグラフィーによって精製する。カラム上での液体クロマトグラフィーは、抽出クロマトグラフィーまたは分配クロマトグラフィーであってもよい。抽出または分配クロマトグラフィーは、有機相、または抽出物と、水性相との間で分離される要素の分布に基づくものであり、抽出物は、不活性支持体に結合し、固定相を形成するが、水性相は移動相である。

【0465】

抽出クロマトグラフィーは、水と混和しない有機希釈剤、典型的には、長い炭化水素鎖アルコール、換言すれば、Ｃｘ鎖以上中の溶液中で、抽出物としてエーテルクラウン、特に、シクロヘキシルまたはベンジル基が、直鎖または分枝鎖を有する、１または複数のＣ［Ｃに対する］２アルキル基で置換されている、ジシクロヘキサノ−１，８−クラウン−６またはジベンゾ−１，８−クラウン−６を含む固定相を使用してもよい。

【0466】

特に、好ましくは、オクタン−１−オール中で希釈された、抽出物として４，４’（５’）−ジ−エール（ｅｒ）−ブチルシクロヘキサノ−１，８−クラウン−６を含む固定相を使用してもよい。そのような固定相は、典型的には、ラジウム−２２４生成器から^２１２Ｐｂを抽出するために使用される水溶液の型に対応する、１．５〜２．５モル／Ｌの強酸を含有する水溶液中に、９９％を超えて選択的に残存する^２１２Ｐｂが存在する利点を有する。この型の固定相は、例えば、ボトル中で利用可能であるだけでなく、商品名「Ｐｂ樹脂」の下でＴＲＩＳＫＥＭ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌという会社から、クロマトグラフィーのための即時使用可能なカラムまたはカートリッジ中に包装される。

【0467】

あるいは、所望の放射性核種および不純物を含む溶液を、イオン交換クロマトグラフィー、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することもできる。

【0468】

^２１２Ｐｂを生産し、精製する方法は、ＷＯ２０１３１７４９４９に記載されている。

【0469】

配列
本明細書に記載のある特定の配列を、以下の表に提供する。

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【0470】

本明細書で引用された全ての特許文献および科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

【0471】

本発明をここで具体例を参照してさらに説明する。様々な他の実施形態を、上に提供された一般的説明を考慮して実行することができることが理解されるであろう。

【実施例】

【0472】

実施例１：免疫化の説明
ウサギの免疫化
２種のエナンチオマーＰｂ−ＤＯＴＡＭ−アルキル−ＰＥＧ_４−ＫＬＨ画分（ＭＳ２−ＤＯＴＡＭ ＫＬＨ画分１およびＭＳ２−ＤＯＴＡＭ ＫＬＨ画分２）の１：１ミックスを、ＷＯ２０００／４６２５１、ＷＯ２００２／１２４３７、ＷＯ２００５／００７６９６、ＷＯ２００６／０４７３６７、ＵＳ２００７／００３３６６１およびＷＯ２００８／０２７９８６に報告される通り、ニュージーランドホワイト（New Zealand White）ウサギまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックウサギの免疫化に使用した。各ウサギは、０日目に皮内適用により、完全フロイントアジュバントで乳化した５００ｕｇの免疫原ミックスで免疫化し、７、１４、２８、５６日目に交互の筋肉内および皮下適用により、各５００ｕｇで免疫化した。その後、ウサギは、５００ｕｇの皮下免疫化を毎月受け、血清力価の決定のため、免疫化の７日後に少量の血液試料を採取した。免疫化の３番目の月および９番目の月に（免疫化後５〜７日目に）、より大量の血液試料（推定総血液体積の１０％）を採取し、末梢単核細胞を単離し、これを、Ｂ細胞クローニングプロセス（実施例２）における抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。

【0473】

血清力価の決定（ＥＬＩＳＡ）
２種のエナンチオマーＰｂ−ＤＯＴＡＭ画分（ＰＪＲＤ０５．１３３Ｆ１またはＰＪＲＤ０５．１３３Ｆ２）のそれぞれを、ＰＢＳ中の１ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウェルで、９６ウェルＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に固定化し、続いて：２００ｕｌ／ウェルでＰＢＳ中の２％クロテイン（Crotein）Ｃによるプレートのブロッキング；１００ｕｌ／ウェルでＰＢＳ中の０．５％クロテインＣにおける２回複製した抗血清の段階希釈の適用；１００ｕｌ／ウェルでＰＢＳ中の０．５％クロテインＣにそれぞれ希釈した、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｄｉａｎｏｖａ ７１１−０３６−１５２；１／１６０００）およびストレプトアビジン−ＨＲＰによる検出を行った。全ステップのため、プレートを１時間３７℃でインキュベートした。全ステップの間に、プレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄した。１００ｕｌ／ウェルのＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ基質可溶型（Ｒｏｃｈｅ）の添加によりシグナルを発色させ；１００ｕｌ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌの添加により停止した。参照としての６９０ｎｍに対し４５０ｎｍで吸光度を読み取った。力価は、最大半量シグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。

【0474】

実施例２：ウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
免疫化されたウサギの血液試料を採取した。ＥＤＴＡ含有全血を１×ＰＢＳ（ＰＡＡ、オーストリア、パッシング）で２倍に希釈し、その後、製造業者の仕様書に従ってｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ ｍａｍｍａｌ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カナダ、オンタリオ州バーリントン）を使用して密度遠心分離した。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。

【0475】

ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国ユタ州ローガン）、２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＰＡＡ、オーストリア、パッシング）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ、アイデンバッハ）および０，０５ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ、スコットランド、ペーズリー）を補充したＲＰＭＩ １６４０（Ｐａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ、アイデンバッハ）を使用した。

【0476】

プレートのコーティング
滅菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸塩バッファー（０，１Ｍ重炭酸ナトリウム、３４ｍＭ炭酸水素二ナトリウム（Disodiumhydrogencarbonate）、ｐＨ９，５５）中の２μｇ／ｍｌ ＫＬＨで一晩４℃にてコーティングした。プレートを使用前に滅菌ＰＢＳにおいて３回洗浄した。滅菌ストレプトアビジン被覆６ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ、ドイツ、ベルンリート）を、ＰＢＳ中のビオチン化ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＣ３−ビオチン異性体Ａ（１μｇ／ｍｌ）およびＢ（１μｇ／ｍｌ）の１＋１エナンチオマー混合物で３時間室温にてコーティングした。パニングステップに先立ち、このような６ウェルプレートを滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。

【0477】

マクロファージ／単球の枯渇
滅菌ＫＬＨ被覆６ウェルプレートにＰＢＭＣを播種して、非特異的接着によりマクロファージおよび単球を枯渇させ、ＫＬＨに結合する細胞を除去した。各ウェルに、４ｍｌ培地および免疫化されたウサギ由来の最大６×１０ｅ６個のＰＢＭＣを最大限に充填し、１時間、３７℃および５％ＣＯ２で結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を抗原パニングステップに用いた。

【0478】

Ｐｂ含有ＴＣＭＣエナンチオマーにおけるＢ細胞の濃縮
ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＣ３−ビオチン異性体ＡおよびＢのエナンチオマー混合物でコーティングされた６ウェルプレートに、４ｍｌ培地あたり最大６×１０ｅ６個のＰＢＬを播種し、１時間３７℃および５％ＣＯ２で結合させた。ウェルを１×ＰＢＳで１〜３回慎重に洗浄することにより、非接着性細胞を除去した。残っている粘着性細胞を、１０分間３７℃および５％ＣＯ２のトリプシンによって剥離した。ＥＬ−４ Ｂ５培地によりトリプシン処理（Trypsination）を停止した。免疫蛍光染色まで細胞を氷上に維持した。

【0479】

免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー
抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ、ドイツ、デュッセルドルフ）を単一細胞選別に使用した。表面染色のため、枯渇および濃縮ステップ由来の細胞を、ＰＢＳにおいて抗ＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と共にインキュベートし、４５分間暗所で４℃にてインキュベートした。染色後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳ解析に直ちに付した。ＦＡＣＳ解析に先立ち５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を添加して、死細胞と生細胞との間を識別した。

【0480】

コンピュータおよびＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを備えるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を単一細胞選別に使用した。

【0481】

Ｂ細胞培養
Ｌｉｇｈｔｗｏｏｄら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００６、３１６：１３３〜１４３）によって記載された方法により、ウサギＢ細胞の培養物を調製した。簡潔に説明すると、単一の選別されたウサギＢ細胞を、インキュベーター内で、９６ウェルプレートにおいてＰａｎｓｏｒｂｉｎ細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ドイツ、ダルムシュタット）、５％ウサギ胸腺細胞上清（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ、ドイツ、ベルンリート）およびガンマ線照射されたマウスＥＬ−４ Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５個の細胞／ウェル）を含有する２００μｌ／ウェルＥＬ−４ Ｂ５培地と共に７日間３７℃でインキュベートした。Ｂ細胞培養物の上清をスクリーニングのために除去し、残っている細胞を直ちに採集し、１００μｌ ＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）において−８０℃で凍結した。

【0482】

実施例３：ウサギ抗体の発現
Ｖ−ドメインのＰＣＲ増幅
製造業者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ８／９６ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０７０９．４，７４０６９８）を使用して、Ｂ細胞溶解物（ＲＬＴバッファー − Ｑｉａｇｅｎ − Ｃａｔ．Ｎ°７９２１６に再懸濁）から全ＲＮＡを調製した。６０μｌのＲＮａｓｅ不含水でＲＮＡを溶出した。６μｌのＲＮＡを使用して、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １８０８０−４００）およびオリゴｄＴ−プライマーを使用した逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを生成した。全ステップを、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行った。４μｌのｃＤＮＡを使用して、重鎖のためにプライマーｒｂＨＣ．ｕｐおよびｒｂＨＣ．ｄｏならびに軽鎖のためにｒｂＬＣ．ｕｐおよびｒｂＬＣ．ｄｏ（表３）を使用した最終体積５０μｌにおけるＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２３４４−０４０）により免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ）を増幅した。全フォワードプライマーは、（それぞれＶＨおよびＶＬの）シグナルペプチドに特異的であった一方、リバースプライマーは、（それぞれＶＨおよびＶＬの）定常領域に特異的であった。ＲｂＶＨ＋ＲｂＶＬのためのＰＣＲ条件を次に示す：９４℃５分間のホットスタート；３５サイクルの２０秒間９４℃、２０秒間７０℃、４５秒間６８℃、および６８℃７分間の最終伸長。

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【0483】

５０μｌ ＰＣＲ溶液のうち８μｌを、４８ Ｅ−ゲル２％（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇ８００８−０２）にロードした。陽性ＰＣＲ反応液を、製造業者のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ；７４０６０９２５０）を使用して浄化し、５０μｌ溶出バッファーに溶出した。全浄化ステップをＨａｍｉｌｔｏｎ ＭＬ Ｓｔａｒｌｅｔ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行った。

【0484】

ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現
ウサギモノクローナル二価抗体の組換え発現のため、オーバーハングクローニング方法（ＲＳ Ｈａｕｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２）１３、５１５〜５１８；ＭＺ Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００７）４、２５１〜２５６）により、ＶＨまたはＶＬをコードするＰＣＲ産物を、ｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした。発現ベクターは、イントロンＡを含む５’ＣＭＶプロモーターおよび３’ＢＧＨポリアデニル化配列からなる発現カセットを含有した。発現カセットに加えて、プラスミドは、大腸菌（E.coli）におけるプラスミド増幅のためのｐＵＣ１８由来複製開始点、およびアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含有した。次の、基礎プラスミドの３種のバリアントを使用した：ＶＨ領域を受け入れるように設計されたウサギＩｇＧ定常領域を含有する１種のプラスミド、一方、ＶＬ領域を受け入れるためのウサギまたはヒトカッパＬＣ定常領域を含有する２種の追加的なプラスミド。カッパまたはガンマ定常領域およびＶＬ／ＶＨインサートをコードする直鎖化された発現プラスミドを、重複プライマーを使用したＰＣＲにより増幅した。精製されたＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートし、これにより、一本鎖オーバーハングを生成した。ｄＣＴＰ添加により反応を停止した。次のステップにおいて、プラスミドおよびインサートを組み合わせ、部位特異的組換えを誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えプラスミドを大腸菌に形質転換した。翌日、成長したコロニーを採取し、プラスミド調製、制限解析およびＤＮＡ配列決定により、正確な組換えプラスミドに関して試験した。抗体発現のため、試薬サプライヤーによって示唆される手順に従い２３９−Ｆｒｅｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することにより、単離されたＨＣおよびＬＣプラスミドを、２ｍｌ（９６ウェルプレート）のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＨＥＫ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｒ７９０−０７）に一過性にコトランスフェクトした。１週間後に上清を採集し、精製のために送達した。

【0485】

実施例４：ウサギモノクローナル抗体の選択
下表は、様々なモノクローナル二価ウサギ抗体の特性を示す。キレート化ＰｂおよびＢｉへの匹敵する結合、他のキレート化金属への低下した結合、ならびに高い親和性（＜１００ｐＭ）を有することから、リード候補としてＰＲＩＴ−０１２８を選択した。

【0486】

ＳＥＴ（溶解平衡滴定）アッセイを後述する通りに実行した。

【0487】

アッセイプレートの調製：３８４ウェルストレプトアビジンプレート（Ｎｕｎｃ、Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳバッファー中の２５μｌ／ウェルのＤＯＴＡＭ−ビオチン−異性体ミックスと共に一晩４℃でインキュベートした。

【0488】

遊離ＤＯＴＡＭ−金属キレート（Ｐｂ、Ｂｉ、Ｃａ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｍｇ、Ｆｅ）による抗ＤＯＴＡＭ抗体試料の平衡：０．０１ｎＭ〜１ｎＭの抗体を、関連するＤＯＴＡＭ−金属キレートにより、２５００ｎＭ、５００ｎＭまたは１００ｎＭのＤＯＴＡＭ−金属キレートの濃度から開始する１：３、１：２または１：１．７希釈ステップにおいて滴定した。試料を、密封したＲＥＭＰ Ｓｔｏｒａｇｅポリプロピレンマイクロプレート（Ｂｒｏｏｋｓ）において４℃で一晩インキュベートした。

【0489】

一晩インキュベーション後に、ストレプトアビジンプレートをウェルあたり９０μｌのＰＢＳＴで３×洗浄した。平衡プレートから１５μｌの各試料をアッセイプレートに移し、１５分間ＲＴでインキュベートし、続いてＰＢＳＴバッファーで３×９０μｌ洗浄ステップを行った。２５μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体−ＰＯＤコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９−０３６−０８８、ＯＳＥＰで１：４０００）を添加し、続いてＰＢＳＴバッファーで６×９０μｌ洗浄ステップを行うことにより検出を実行した。２５μｌのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、カタログ番号：１１８３５０３３００１）を各ウェルに添加した。Ｓａｆｉｒｅ２リーダー（Ｔｅｃａｎ）において３７０／４９２ｎｍで測定を行った。

【0490】

材料：
１．ＤＯＴＡＭ−ビオチン−異性体ミックス：
次の成分、濃度＝２０ｎｇ／ｍｌの混合物、
− Ｐｂ−Ｄｏｔａｍ−Ｂｎ−ビオチン／ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＧ３−ビオチン、異性体Ａ
− Ｐｂ−Ｄｏｔａｍ−Ｂｎ−ビオチン／ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＧ３−ビオチン、異性体Ｂ
− Ｐｂ−Ｄｏｔａｍ−アルキル−ビオチン異性体Ａ
− Ｐｂ−Ｄｏｔａｍ−アルキル−ビオチン異性体Ｂ
２．ＰＢＳ：ＤＰＢＳ、ＰＡＮ、Ｐ０４−３６５００
３．ＢＳＡ：Ｒｏｃｈｅ、１０７３５０８６００１
４．Ｔｗｅｅｎ ２０：ポリソルベート２０（ｕｓｂ、＃２０６０５、５００ｍｌ）
５．ＰＢＳＴ：１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１／０，１％Ｔｗｅｅｎ ２０
６．ＯＳＥＰ：ＰＢＳ（１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）／０，５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）／０，０５％Ｔｗｅｅｎ ２０

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【0491】

実施例５：分子生物学
組換えＤＮＡ技法
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されている通り、標準方法を使用してＤＮＡを操作した。製造業者の説明書に従って、分子生物学的試薬を使用した。

【0492】

遺伝子およびオリゴヌクレオチド合成
Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ（ドイツ、レーゲンスブルク）における化学合成により、所望の遺伝子セグメントを調製した。合成された遺伝子断片を、繁殖／増幅のために大腸菌プラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により検証した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはＰＣＲにより、短い合成ＤＮＡ断片をアセンブルした。ｍｅｔａｂｉｏｎ ＧｍｂＨ （ドイツ、プラネック−マーティンスリード（Planegg-Martinsried））により、それぞれのオリゴヌクレオチドを調製した。

【0493】

タンパク質決定
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて計算されるモル消衰係数を使用して、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を決定することにより、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。

【0494】

抗体重鎖または軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子／タンパク質（例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン（例えば、そのＣ末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン）を含有する完全長抗体重鎖）の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
− 発現されるべき遺伝子／タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0495】

発現されるべき所望の遺伝子を含む発現単位／カセットに加えて、基礎／標準哺乳動物発現プラスミドは、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含有した。

【0496】

ａ）抗体重鎖のための発現プラスミド
Ｇ４Ｓ×４リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメント（Ｖ−重またはＶ−軽）をコードするＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体Ｖ−重またはＶ−軽ドメインを含むＣ末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ）。それぞれ２個のＣＨ３ドメインのＣ末端に１個のＶＨおよび１個のＶＬドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0497】

ＨＥＫ２９３細胞における抗体重鎖と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメインの一過性発現のための発現プラスミドは、抗体重鎖断片と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメイン発現カセットの他に、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。抗体重鎖断片と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメイン融合遺伝子の転写単位は、次の機能的エレメントを含む：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ）コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0498】

前に概要を述べた方法に従って、表２に言及されている全ての重鎖ポリペプチド／タンパク質をコードする発現プラスミドを構築した。

【0499】

ｂ）抗体軽鎖のための発現プラスミド
それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0500】

抗体軽鎖の一過性発現のための発現プラスミドは、抗体軽鎖断片の他に、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。抗体軽鎖断片の転写単位は、次の機能的エレメントを含む：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0501】

前に概要を述べた方法に従って、表２に言及されている全ての軽鎖ポリペプチド／タンパク質をコードする発現プラスミドを構築した。

【0502】

使用されている形式の模式図を図１に描写する。星印は、ＰＧＬＡＬＡ置換を指す：１は、ＤＯＴＡＭ結合剤を指し、２および３は、抗標的（本明細書においてはＣＥＡ）結合剤を指す。

【0503】

実施例６：ＰＲＩＴ分子の一過性発現
抗体分子の一過性発現
Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）において培養される、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児性腎細胞株２９３由来）において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「２９３−Ｆｒｅｅ」トランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの３から７（３〜７）日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度（例えば、−８０℃）で貯蔵した。

【0504】

例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７〜２０３で得られる。

【0505】

実施例７：タンパク質の精製
採集された細胞培養上清を、流量５ｍｌ／分で、５ｍｌのプロテインＡ樹脂（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ）を充填したカラム（１．１ｃｍ直径、５ｃｍ長さ）にアプライした。２０ｍｌ ＰＢＳバッファーによる洗浄後に、２５ｍｌクエン酸Ｎａ、ｐＨ３．０により抗体を溶出させた。

【0506】

次に、１Ｍトリス、ｐＨ９．０で溶出液をｐＨ５．０に調整し、４℃で一晩インキュベートした。

【0507】

１０分間１００００×ｇの遠心分離および０．２μｍフィルターを通した濾過の後に、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０を含有するバッファーにおいて前平衡したサイズ排除クロマトグラフィーのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（２．６ｃｍ直径、６０ｃｍ長さ）に濾液をアプライし、同バッファーにより溶出させた。

【0508】

精製された抗体を含有する主要溶出ピークを収集し、最終純度を解析した。

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【0509】

実施例８：ＦＡＣＳ
トリプシンを使用して培養ボトルからＭＫＮ−４５細胞を剥離し、Ｃａｓｙ細胞計数器を使用して計数した。４℃、３００ｇでペレットにした後に、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中に２．５％ＦＣＳ）に再懸濁し、２．０Ｅ＋０６個の細胞／ｍＬとなるように調整し、９６ウェルＰＰ Ｖ字底型Ｐｌａｔｔｅに分配した（２５μＬ／ウェル＝５．０Ｅ＋０４Ｚｅｌｌｅｎ／ウェル）。

【0510】

− ＤＯＴＡＭ−ＦＩＴＣを使用したＦＡＣＳ染色
一次ＣＥＡ特異的抗体を、ＦＡＣＳバッファーにおいて４０μｇ／ｍＬとなるように調整し、最終濃度１０μｇ／ｍＬをもたらした。ＲＳ−ＣＥＡ−Ｉｌ２ｖを参照として用いた。ＦＩＴＣで標識されたＰｂ−ＤＯＴＡＭおよび一次抗体は、等モル比で用いた。これらを混合し、１０分間ＲＴでインキュベートして、抗体をＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合させた。その後、２０μｌの調製されたミックスを２５μｌ細胞懸濁液に添加し、１時間４℃でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した測定のために７０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。

【0511】

− ＜ｈｕカッパ＞を使用したＦＡＣＳ染色
一次ＣＥＡ特異的抗体は、ＦＡＣＳバッファーにおいて２０μｇ／ｍＬとなるように調整し、最終濃度１０μｇ／ｍＬをもたらした。ＲＳ−ＣＥＡ−Ｉｌ２ｖを参照として用いた。２０μｌを２５μｌ細胞懸濁液に添加し、１時間４℃でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーにおいて２回洗浄した。洗浄後に、二次抗体（＜ｈｕＩｇＧ＞−Ａｌｅｘａ４８８、ｃ＝１０μｇ／ｍＬ）を含有する５０μＬ ＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁し、１時間４℃でインキュベートした。次に、細胞をＦＡＣＳバッファーにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用した測定のために７０μｌ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。

【0512】

ＭＫＮ−４５細胞への１種の抗体（ＰＲＩＴ−０１６５）の結合、二次検出（右パネル、Ａｌｅｘａ ４８８）またはＤＯＴＡＭ ＦＩＴＣ（左パネル、ＦＩＴＣ−Ａ）のいずれかを使用したその検出を示す例が、図３６に描写されている。

【0513】

実施例９：ヒト化：
ＤＯＴＡＭ結合剤ＰＲＩＴ−０１２８のヒト化における適したヒトアクセプターフレームワークの同定のため、２種の方法論の組合せを使用した。一方では、親抗体に対し高い配列相同性を有するアクセプターフレームワークを検索し、その後、このアクセプターフレームワークにＣＤＲ領域を移植することによる、古典的手法を採用した。親抗体に対する同定されたフレームワークの各アミノ酸差は、結合剤の構造的統合性における影響に関して判断し、適切であれば常に、親配列に向けた復帰突然変異（backmutation）を導入した。

【0514】

他方では、インハウス開発されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏツールを使用して、ヒト化型のＶＨおよびＶＬドメインの互いに対する配向を予測した（ＷＯ２０１６／０６２７３４を参照）。これは、あらゆる可能なヒト生殖系列組合せにおけるＣＤＲのバーチャルな移植のために実行された。この結果を、親結合剤のＶＨ−ＶＬドメイン配向と比較して、幾何学の点で出発抗体に近いフレームワーク組合せを選択した。

【0515】

各場合において、親抗体の次のＣＤＲ領域をアクセプターフレームワークに移植した（カバットに従った番号付け）：
ＶＨ＿ＣＤＲ１：３１〜３５
ＶＨ＿ＣＤＲ２：５０〜６５
ＶＨ＿ＣＤＲ３：９５〜１０２
ＶＬ＿ＣＤＲ１：２４〜３４
ＶＬ＿ＣＤＲ２：５０〜５６
ＶＬ＿ＣＤＲ３：８９〜９７。

【0516】

ＶＨ／ＶＬ Ｆｖ融合体（それぞれＣＨ１およびＣｋなし）として腫瘍標的化ＩｇＧのＦｃのＣ末端に融合されたＤＯＴＡＭ結合剤を有する最終形式で、ヒト化バリアントを産生した。最終形式の親（非ヒト化）ＤＯＴＡＭ結合剤ＰＲＩＴ−０１２８由来分子は、ＰＲＩＴ−０１５６と呼ばれる。

【0517】

ＶＨ／ＶＬ予測の観点からの適合性およびフレームワークの安定性増加のため、ハーセプチンフレームワークも同様に含まれた。全てのＶＨヒト化バリアントのため、ヒトＪエレメントｈＪＨ２を使用した。全てのＶＫヒト化バリアントのため、ヒトＪエレメントｈＪＫ４を使用した。

【0518】

ＨＣ４は、１個の復帰突然変異カバットＡ４９Ｇを有するヒト生殖系列ＩＧＨＶ３−３０−０２におけるＰＲＩＴ−１２８の移植である。

【0519】

可変重鎖ＨＣ５を得るために、復帰突然変異（backmuation）としてＡ４９Ｇおよび本来のウサギＮ末端を反映するための最初のアミノ酸の欠失を有するヒト生殖系列ｈＶＨ＿２＿２６にＣＤＲを移植した。

【0520】

ハーセプチンＶ−領域（ヒト生殖系列ｈＶＨ３＿６６に由来する）に移植されると、バリアントＨＣ７は、アクセプターフレームワークにおける数個の修飾によって特徴づけられる：Ｎ末端Ｅの欠失、Ａ４９Ｇ、Ａ７１ＲおよびＳ９３Ａ。

【0521】

ＨＣ１０のため、ＰＲＩＴ−１２８のＣＤＲは、ヒト生殖系列ＩＧＨＶ４＿３４＿０１に移植された。

【0522】

そこで、Ｑ２から開始する本来のウサギ抗体を反映するように、Ｖ２から開始するＮ末端が修飾された。加えて、フレームワーク３におけるＶ７１ＲおよびＦ７８Ｖと共に、Ｇ２９ＦおよびＦ３１Ｌは、復帰突然変異ｗｒｔカバット命名法として考慮された。

【0523】

軽鎖ＬＣ１のため、ＣＤＲは、いかなる復帰突然変異もないヒト生殖系列ＩＧＫＶ１＿３９＿０１に移植された。Ａ２から開始する本来のウサギＡｂを反映するように、開始はＩ２として選ばれた。

【0524】

ヒト生殖系列ｈＶＫ１＿５におけるＣＤＲの移植により、軽鎖バリアントＬＣ３を得た。Ｄ１が欠失され、Ｉ２Ａ復帰突然変異は、新たなＮ末端として考慮された。追加的な復帰突然変異として、Ｋ４２ＱおよびＡ４３Ｐを考慮に入れた。

【0525】

ヒト化マトリックスのあらゆる可能な組合せが産生された訳ではなく、所与の組合せのＶＨ／ＶＬ予測および配列リスク等の考慮に基づき、選択された特定の組合せが選ばれた。

【0526】

ヒト化の目標は、ＤＯＴＡＭに対する親和性の観点から１０倍を超えて失わず、可能であれば増加した安定性を呈する、ヒト化結合剤を得ることであった。これは、ＤＯＴＡＭに対する匹敵するまたはさらにはより優れた親和性と共に、約１０〜１５℃のＤＬＳによって測定される熱安定性の増加の、いくつかの結合剤により達成された。下の表７および８を参照されたい。

【0527】

実施例１０：溶解平衡に基づくｋｄ決定
Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに対するその親和性に関してより大量のヒト化候補をスクリーニングするために、溶解平衡滴定（ＳＥＴ）を使用した。

【0528】

表６は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに対する選択されたヒト化ＤＯＴＡＭ結合剤のＳＥＴに基づく親和性決定を詳述する。表６における全ての抗体は、ＣＥＡへの二価結合およびＰｂ−Ｄｏｔａｍへの一価結合を含む二重特異性抗体である（２：１形式、図１を参照）：

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【0529】

実施例１１：Ｋｉｎｅｘａに基づくｋｄ決定
親和性決定に関するより詳細な解析および直交性方法のため、Ｋｉｎｅｘａを使用した。

【0530】

計測手段および材料
オートサンプラーを備えるＳａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（アイダホ州ボイシ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器を使用した。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズは、Ｓａｐｉｄｙｎｅから購入し、一方、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ）および抗ＤＯＴＡＭ抗体は、インハウス（Ｒｏｃｈｅ）で調製した。Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０（登録商標）コンジュゲートされたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ断片交差吸着（cross-adsorbed）抗体は、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（テキサス州モントゴメリー）から購入した。ビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗原（Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−アルキル−ビオチン異性体ＡおよびＢ、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−Ｂｎ−ビオチン／ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＧ３−ビオチン、異性体ＡおよびＢ）および非ビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、ＡＲＥＶＡ Ｍｅｄ（メリーランド州ベセスダ）から得た。

【0531】

抗原コーティングされたビーズの調製
ビオチン化分子のためのＫｉｎＥｘＡハンドブックプロトコール（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従って、ＰＭＭＡビーズをコーティングした。簡潔に説明すると、第一に、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０μｇのビオチン−ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、吸着コーティングのために１本のバイアル（２００ｍｇ）のビーズにつき添加した。２時間室温で回転させた後に、上清を除去し、ビーズを１ｍｌ ＰＢＳで５回洗浄した。第二に、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１ｍｌの１００μｇのニュートラアビジン、ビオチン結合タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をビーズに添加し、室温でさらなる２時間インキュベートして、ニュートラアビジンをビーズにカップリングさせ、ビオチン化タンパク質のその後の結合のための追加的なビオチン結合部位をもたらした。次に、ニュートラアビジンコーティングされたビーズを１ｍｌ ＰＢＳで５回リンスした。最後に、ビーズをＰＢＳ中の２００ｎｇ／ｍｌビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−異性体ミックス（異性体毎に５０ｎｇ）でコーティングし、さらに２時間室温でインキュベートした。次に、ビーズを３０ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、直ちに使用した。

【0532】

ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイ
全てのＫｉｎＥｘＡ実験は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用して室温（ＲＴ）で行った。試料は、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを補充したランニングバッファー（「試料バッファー」）において調製した。０．２５ｍｌ／分の流量を使用した。５ｐＭ結合部位濃度を有する一定量の抗ＤＯＴＡＭ抗体を、１００ｐＭから開始する２倍段階希釈（濃度範囲０．０４９ｐＭ〜１００ｐＭ）によりＰｂ−ＤＯＴＡＭ抗原で滴定した。抗原なし抗体の１種の試料は、１００％シグナル（すなわち、阻害なし）とした。抗原−抗体複合体をＲＴで少なくとも２４時間インキュベートして、平衡に達するようにした。次に、平衡した混合物を、体積５ｍｌのＫｉｎＥｘＡシステムにおけるＰｂ−ＤＯＴＡＭカップリングビーズのカラムに通して、溶液の平衡状態を乱すことなく、結合していない抗体をビーズによって捕捉させた。捕捉された抗体は、試料バッファーにおける２５０ｎｇ／ｍｌ Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｃ）コンジュゲートされた抗ヒトＦｃ断片特異的二次抗体を使用して検出した。各試料は、全平衡実験で２回複製して測定した。

【0533】

「標準解析」方法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）内に含有される１部位均一結合モデルを使用して、データの非線形回帰解析からＫＤを得た。ソフトウェアは、ＫＤを計算し、データ点を理論的ＫＤ曲線にフィットさせることにより９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間（Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＴｅｃｈＮｏｔｅ ＴＮ２０７Ｒ０）は、ＫＤ低およびＫＤ高として得られる。

【0534】

ＰＲＩＴ−２１３に関して、Ｋｉｎｅｘａによって決定される親和性値の他の例を下に提示する。ＰＲＩＴ−０２１３は、別のＣＥＡ結合ＶＨ／ＶＬを除いて、ＰＲＩＴ−０１８６と同じ分子であり、表８を参照されたい。

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【0535】

実施例１２：ヒト化ＰＲＩＴ分子の熱安定性測定
方法およびデータ解析
最終形式でのヒト化ＰＲＩＴ分子の異なるバリアント（２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０における）を、１ｍｇ／ｍｌとなるように同じバッファーに希釈した。３０μｌの各試料を、３８４ウェルプレートフィルターデバイスに移した（参照としての抗ＨＥＲ３抗体と一緒に）。１，０００ｇ、１分間の遠心分離後に、ウェルを１０μｌのパラフィン油で覆った。プレートを再度遠心分離し（１，０００ｇで１分間）、ＤＬＳ ｐｋｌａｔｅリーダー（Ｄｙｎａ Ｐｒｏ ＰｌａｔｅＲｅａｄｅｒ−ＩＩ、Ｗｙａｔｔ）に移した。２５℃から開始して、温度を０．０５℃／分のスピードで７９．９℃まで増加させた。Ｄｙｎａｍｉｃｓソフトウェア（Ｖ７．０）を使用して散乱光を記録した。

【0536】

データをＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）に移し、試料および（und）温度によって選別し、ソフトウェアアドインを使用して、融解曲線を作成した。温度は、ベースラインからの明らかな逸脱が起こった箇所を「凝集開始」として定義し、融解曲線の変曲点を「融解温度」として定義した。

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【0537】

実施例１３：候補の選択
ＰＲＩＴ−０１５６は、ＣＥＡ結合剤ＣＨ１Ａ１Ａと組み合わせたウサギＤＯＴＡＭ結合剤ＰＲＩＴ−０１２８を含む２：１抗体である。ＰＲＩＴ−０１７８からＰＲＩＴ−０２０４は、同じ形式で、同じＣＥＡ結合剤を有する、ヒト化バリアントである。ＰＲＩＴ−０２０５からＰＲＩＴ−０２２１までは、ＤＯＴＡＭ結合部分においてＰＲＩＴ−０１７８からＰＲＩＴ−０２０４ヒト化バリアントに対応するが、Ｔ８４．６６に変化されたＣＥＡ結合剤を有する。

【0538】

下表は、様々なＰＲＩＴ分子の特性を比較する。好まれる化合物は、ＰＲＩＴ−２１３およびＰＲＩＴ−２１４であった。

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【0539】

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【0540】

実施例１４：Ｆａｂ Ｐ１ＡＡ１２２７ Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ複合体の結晶化、データ収集および構造決定
複合体形成のため、２６ｍｇ／ｍｌのＰ１ＡＡ１２２７と呼ばれるＰＲＩＴ−０２１３におけるヒト化ＶＨ／ＶＬに由来するＦａｂを、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ粉末と１：４．２のモル比で混合した。４℃での２時間インキュベーション後に、ＪＣＳＧ＋スクリーン（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン）を使用して、２１℃でシッティングドロップ蒸気拡散（sitting drop vapor diffusion）装置において初期結晶化の試みを行った。結晶は、０．２Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１Ｍビス−トリス、ｐＨ５．５、２５％ｗ／ｖ ＰＥＧ３３５０から５日以内に出現した。結晶は、いかなるさらなる最適化ステップも用いず、スクリーニングプレートから直接的に採集した。

【0541】

データ収集および構造決定。データ収集のため、１０％エチレングリコール（ethylenglycol）を含有する沈殿剤溶液において結晶を１００Ｋで瞬間（flash）凍結した。Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（スイス、ビリゲン（Villigen））のビームラインＸ１０ＳＡでＰＩＬＡＴＵＳ ６Ｍ検出器を使用して、１．００００Åの波長で回折データを収集した。データは、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６、１３３〜１４４（２０１０））により処理し、ＳＡＤＡＢＳ（ＢＲＵＫＥＲ）により調整した。複合体の結晶は、ａ＝１３５．６３Å、ｂ＝５６．４２Å、ｃ＝６４．５２Åおよびβ＝１０８．３６°のセル軸による空間群Ｃ２に属し、１．４０Åの分解能に対し回折する。検索モデルとしてインハウスＦａｂ構造の座標を使用して、ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ、Ａ．Ｊ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ、Ｒ．Ｗ．、Ａｄａｍｓ、Ｐ．Ｄ．、Ｓｔｏｒｏｎｉ、Ｌ．Ｃ．およびＲｅａｄ、Ｒ．Ｊ． Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０、６５８〜６７４（２００７））による分子置換えによって構造を決定した。差電子密度を使用して、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを配置し、実空間精密化により配列差に従ってアミノ酸を変化させた。ＣＣＰ４一式（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０、７６０〜７６３（１９９４）．）およびＢＵＳＴＥＲ（Ｂｒｉｃｏｇｎｅ、Ｇ．、Ｂｌａｎｃ、Ｅ．、Ｂｒａｎｄｌ、Ｍ．、Ｆｌｅｎｓｂｕｒｇ、Ｃ．、Ｋｅｌｌｅｒ、Ｐ．、Ｐａｃｉｏｒｅｋ、Ｗ．、Ｒｏｖｅｒｓｉ、Ｐ．、Ｓｈａｒｆｆ、Ａ．、Ｓｍａｒｔ、Ｏ．Ｓ．、Ｖｏｎｒｈｅｉｎ、Ｃ．、Ｗｏｍａｃｋ、Ｔ．Ｏ．（２０１１）．Ｂｕｓｔｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．９．５、英国、ケンブリッジ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ．）由来のプログラムにより構造を精密化した。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ、Ｐ．、Ｌｏｈｋａｍｐ、Ｂ．、Ｓｃｏｔｔ、Ｗ．Ｇ．およびＣｏｗｔａｎ、Ｋ． Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６６、４８６〜５０１（２０１０））により手動復元を行った。

【0542】

データ収集および精密化統計は、表９に要約されている。

【0543】

全てのグラフィック提示は、ＰＹＭＯＬ（Ｔｈｅ Ｐｙｍｏｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン１．７．４．、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ．）により調製した。

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【0544】

Ｐｂ−Ｄｏｔａｍと複合体形成したＦａｂ Ｐ１ＡＡ１２２７の構造
Ｆａｂ Ｐ１ＡＡ１２２７とＰｂ−Ｄｏｔａｍとの相互作用の詳細を特徴づけるため、本出願人らは、１．４０Åの分解能で複合体の結晶構造を決定した。構造は、軽鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３の主な寄与ならびに重鎖のＣＤＲ２およびＣＤＲ３によりＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合するＦａｂ Ｐ１ＡＡ１２２７を明らかにする。

【0545】

プログラムＰＩＳＡによる結合接触面の解析は、３個の水素結合、極性相互作用およびファンデルワールス接触を介したＰｂ−ＤＯＴＡＭとＦａｂ Ｐ１ＡＡ１２２７との相互作用パターンを明らかにする。Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、重鎖および軽鎖によって形成されたポケット内で結合する。このポケットは、１側面が開いた箱の形状を有する。ポケットの側壁および底面は、無極性相互作用に寄与し、一方、壁の周縁部では、極性相互作用が優勢である。側鎖水素結合は、ＤＯＴＡＭカルバモイル窒素原子Ｎ７およびＮ８と重鎖Ｇｌｕ９５およびＡｓｐ９７のＣＤＲ３残基の間で形成される。ＤＯＴＡＭの原子Ｎ７とＡｒｇ９６の主鎖カルボニル原子により、追加的な水素結合が確立される。複合体は、アザシクロドデカン環に面する配向された縁である、重鎖ＣＤＲ２ Ｐｈｅ５０およびＴｙｒ５８側鎖の無極性相互作用によりさらに安定化される。軽鎖は、大部分が、ポケットの「底面」に寄与し、ＣＤＲ３残基Ｇｌｙ９１〜Ｔｙｒ９６は、テトラシクロドデカン環への無極性接触をもたらす。Ａｓｐ３２は、ＤＯＴＡＭのカルバモイル窒素原子Ｎ６への水素結合を受け入れる（カバットに従った番号付け）。

【0546】

図２は、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと複合体形成したＰ１ＡＡ１２２７の構造を示す。

【0547】

図３は、相互作用部位における表示を示す。

【0548】

下表は、プログラムＰＩＳＡによる解析に基づく、重鎖パラトープ残基を示す。

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【0549】

下表は、プログラムＰＩＳＡによる解析に基づく、軽鎖パラトープ残基を示す。

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【0550】

パラトープ残基はまた、下に示す配列において下線を引く：

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【0551】

実施例１５：ｉｎ ｖｉｖｏ体内分布および有効性：材料および方法

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【0552】

プロトコールの材料および方法
一般
全ての実験プロトコールは、地方当局（Ｃｏｍｉｔｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｄｕ Ｌｉｍｏｕｓｉｎ （ＣＲＥＥＡＬ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ ｄ’Ａｎａｌｙｓｅｓ ｅｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅ ｌａ Ｈａｕｔｅ−Ｖｉｅｎｎｅ）によって審査および承認された。雌重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、倫理指針に沿って、明暗の日周サイクル（１２時間／１２時間）により、特定の病原体がない条件下で維持した。到着後最初の１週間において操作は行わず、動物を新たな環境に順化させた。全てのマウスを、体調および全般的な健全性の評価に関して毎日モニターした。

【0553】

腫瘍体積をノギス計測により推定し、式：体積＝０．５×長さ×幅^２に従って計算した。プロトコールによって指示される通り、血液を終結時に後眼窩出血を使用して静脈洞から収集し、続いて放射能測定および／または組織学的解析のための追加的な組織採集を行った。予想外なまたは異常な状態を記録した。

【0554】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）およびＪＭＰ ８（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を使用して統計解析を行った。

【0555】

試薬
二重特異性抗体は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｅｎｚｂｅｒｇ（ドイツ、ペンツベルク）によって提供され、注射日まで−８０℃で貯蔵された。次に、二重特異性抗体を解凍し、標準ビヒクルバッファー（２０ｍＭヒスチジン／ヒスチジンＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ６．０）に希釈した。

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【0556】

除去試薬は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（米国テキサス州プレイノ）によって提供された。除去試薬は、注射日まで−８０℃で貯蔵し、注射日に解凍し、所望の濃度となるようにＰＢＳに希釈した。

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【0557】

放射標識のためのＤＯＴＡＭキレートは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓによって提供され、放射標識前に−２０℃で維持された。鉛−２０３（^２０３Ｐｂ）または鉛−２１２（^２１２Ｐｂ）のいずれかによるその後の標識は、ＡＲＥＶＡ Ｍｅｄ（フランス、ラゼ（Razes））によって行われた。マウスに、所望のＰｂ線量／放射能濃度を得るようＰＢＳで希釈された、それぞれのＰｂ−ＤＯＴＡＭ溶液の１００μＬを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、二重特異性抗体と予め結合して使用し、一方、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、ＰＲＩＴおよび除去剤の後に投与した。放射能測定は、２４７０ ＷＩＺＡＲＤ^２自動ガンマ計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して行った。

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【0558】

ＢｘＰＣ３は、ＣＥＡを天然に発現するヒト初代膵臓腺癌細胞株である。ＢｘＰＣ３細胞は、１０％ウシ胎仔血清および１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号３５０５０−０６１）を強化したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、参照番号４２４０１−０１８）において培養した。ＬＳ１７４Ｔは、ＣＥＡを天然に発現するヒト結腸直腸腺癌細胞株である。ＬＳ１７４Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清を強化したＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、参照番号４２４３０−０８２）において培養した。ＭＫＮ４５は、ＣＥＡを天然に発現するヒト胃腺癌細胞株である。ＭＫＮ４５細胞は、２０％ウシ胎仔血清を強化したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、参照番号４２４０１−０１８）において培養した。固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ培地における細胞の、右側腹部への皮下注射により確立した。

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【0559】

実施例１６：様々なＣＥＡ標的化二重特異性抗体によるプレターゲティング（プロトコール８０（ａ、ｂ、ｃ））
本試験は、レジメンを最適化し、臨床治験への移行に最も適した候補を選択するために、様々なＣＥＡ標的化二重特異性抗体によるプレターゲティング後のマウスにおける膵臓腺癌異種移植片におけるＰｂ蓄積を評価することを目標とした。実験を３種の別々のプロトコールに分け、ｉ）８０ｂ、ｉｉ）８０ｃおよびｉｉｉ）８０ａの順序で行った。プロトコール８０ｂは、^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと予め結合させた、５種の完全にヒト化された二重特異性抗体コンストラクトの腫瘍取込みを評価した。プロトコール８０ｃは、注射後の３つの異なる時点における、^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと予め結合させた二重特異性抗体コンストラクトの腫瘍取込みを評価して、プレターゲティングレジメンにおけるＰＲＩＴ注射およびＣＡ／キレート注射の間のタイミングを最適化した。最後に、プロトコール８０ａは、Ｔ８４．６６またはＣＨ１Ａ１Ａのいずれかを標的とする５種の完全にヒト化された二重特異性抗体コンストラクトを使用して、標準プレターゲティング設定における^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの腫瘍取込みを評価した。

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【0560】

各マウス（６〜７週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／ＭａｔｒｉｇｅｌにおけるＢｘＰＣ３細胞（継代３０）を、右側腹部へと皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍細胞注射５日後に、１６０〜１７０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。１００μＬあたり３０μｇの最終濃度となるように抗体を希釈し、その後、単独で（８０ａ）、または^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと予め結合して（８０ｂ、８０ｃ）のいずれかでｉ．ｖ．投与した。ＰＲＩＴ−０１６５およびＰＲＩＴ−０１５６は、それぞれＴ８４．６６およびＣＨ１Ａ１Ａを標的とするポジティブＣＥＡ結合コントロールとして使用した。ＰＲＩＴ−０１７５は、非ＣＥＡ結合コントロールとして使用した。

【0561】

プロトコール８０ａにおいて、二重特異性抗体の３日後に、除去剤を１００μＬあたり３０μｇの濃度で静脈内注射し、続いて２時間後に、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した。

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【0562】

２４時間（８０ａ）；９６時間（８０ｂ）；または２４、７２もしくは１６８時間（８０ｃ）後に、体内分布を調べる目的のためにマウスを屠殺した。プロトコール８０ａにおいて全マウスから、次のものを採集した：血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、筋肉および腫瘍。プロトコール８０ｂおよび８０ｃにおける全マウスから、次のものを採集した：血液、膀胱、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨（femoral bone）、筋肉および腫瘍。収集された試料を秤量し、即時放射能測定のためにプラスチックチューブに入れた。次に、放射能崩壊およびバックグラウンドのための補正を含む、組織１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）を計算した。

【0563】

結果、８０ａ
全てのＣＥＡ結合二重特異性抗体が、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの特異的腫瘍標的化をもたらし、ＤＯＴＡＭ注射２４時間後に正常組織における取り込みは殆どなかったまたは全くなかった。ＰＲＩＴ−０２０６、ＰＲＩＴ−０２０７およびＰＲＩＴ−０２０８に関して、平均腫瘍取込み±ＳＤは、それぞれ８．６２±１．０５、７．３０±３．８４および７．７５±２．６１％ＩＤ／ｇであり、それらの対応するＴ８４．６６結合ポジティブコントロールＰＲＩＴ−０１６５は、９．１３±１．８２％ＩＤ／ｇであった。ＣＨ１Ａ１Ａ結合剤ＰＲＩＴ−０１８６およびＰＲＩＴ−０１８７は、１７．４４±１．３９および１６．５０±３．２５％ＩＤ／ｇの腫瘍値をもたらし、それらのポジティブコントロールＰＲＩＴ−０１５６は、１８．９８±１．８９％ＩＤ／ｇであった。非ＣＥＡ結合ＰＲＩＴ−０１７５は、腫瘍において０．４１±０．４２％ＩＤ／ｇをもたらした。

【0564】

全体的に見て、ＣＨ１Ａ１Ａを標的とする二重特異性抗体は、Ｔ８４．６６を標的とする抗体よりも有意に高い腫瘍取込みをもたらした（独立ｔ検定、ｐ＜０．０００１）；ＣＨ１Ａ１ＡおよびＴ８４．６６は両者共に、ネガティブコントロールと比較して、有意により高い取り込みをもたらした（一方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。結果を図４に示す。

【0565】

結果、８０ｂ
腫瘍の特異的標的化は、全ての予め結合させたＣＥＡ結合二重特異性抗体により達成されたが、％ＩＤ／ｇは、ポジティブコントロールＰＲＩＴ−０１６５と比較して、完全にヒト化型に関して僅かにより低かった。非ＣＥＡ結合コントロールは、比較的無視できる腫瘍蓄積をもたらした。

【0566】

全体的に見て、この予め結合させる実験設定において計算された％ＩＤ／ｇは、対応するＰＲＩＴレジメンのものよりもおよそ１０倍高いレベルに達した；しかし、アウトプットデータは、ガンマ計数器放射能測定値を反映し、計算誤差は見出されなかった。重要なことに、腫瘍対正常組織比は、予想される範囲内のままであった。具体的には、腫瘍対血液比（±ＳＤ、ｎ＝３）は、ＰＲＩＴ−０２０５で６．７６±２．９５、ＰＲＩＴ−０２０６で７．５６±２．２７、ＰＲＩＴ−０２０７で９．３３±０．９１、ＰＲＩＴ−０２０８で１０．７７±０．８４、ＰＲＩＴ−０２０９で１１．７１±０．８４、ＰＲＩＴ−０１６５で１０．７８±０．８８、ＰＲＩＴ−０１７５で０．８５±０．１２であった。結果を図５に示す。

【0567】

結果、８０ｃ
両方のＣＥＡ結合抗体が、ネガティブコントロールと比較して、有意な腫瘍蓄積をもたらした。統計解析は、試験された時点のいずれに関しても、ＰＲＩＴ−０２０６またはＰＲＩＴ−０１６５を使用した腫瘍標的化の間に有意差を示さず、試験された抗体のいずれに関しても、どちらにも、３および７日目の間で％ＩＤ／ｇにいかなる有意差もなかった（二方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。プロトコール８０ｂと類似して、計算された％ＩＤ／ｇ値は全体的に高かった；しかし、腫瘍対血液比は、予想される範囲内のままであった。１および３日目の間に、腫瘍対血液比に有意差は見られなかったが、ＰＲＩＴ−０１６５およびＰＲＩＴ−０２０６に関して、７日間の待機は、比を有意に増加させる（二方向ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。結果を図６に示す。

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【0568】

概要および結論
Ｔ８４．６６またはＣＨ１Ａ１Ａのいずれかを標的とする全ての完全にヒト化された二重特異性抗体が、これらそれぞれのポジティブコントロールのものに匹敵する、ＢｘＰＣ３腫瘍における放射能の有意な蓄積をもたらした。

【0569】

腫瘍における^２０３Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ｂｓＡｂの％ＩＤ／ｇは、３および７日間の間で有意に異ならなかったが、対応する腫瘍対血液比は、血中放射能の減少のため、より後の時点を支持した。

【0570】

実施例１７：除去剤の体内分布（プロトコール４４）
本試験の目標は、異なる特性（例えば、分子骨格、サイズおよび電荷）を有する選択された除去剤の体内分布、より具体的には、腫瘍におけるそれらの存在および／または蓄積に取り組むことであった。除去剤が潜在的に、腫瘍内に進入する、腫瘍結合抗体に結合する、および／またはこれらを腫瘍から抜き出し、放射性リガンドのその後の結合にマイナスに影響を与える可能性があるため、このことを知ることは興味深かった。

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【0571】

３０μｇのＤｅｘ７０、Ｄｅｘ２５０およびトリＧａｌＮａｃ修飾除去剤を、５μＣｉ ^２１２Ｐｂでクエンチし、ＰＢＳにおいて希釈して、ｉ．ｖ．注射のために１００μＬ総体積あたり３０μｇを得た。

【0572】

^２１２Ｐｂ−ＣＡの注射２または２４時間後に、マウスを屠殺し、剖検した。血液、膀胱、心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、腸（十二指腸、空腸、回腸）、結腸、膵臓、胃、卵巣、脳、骨髄を有する大腿骨、および腫瘍を収集し、秤量し、放射能含有量に関して測定し、％ＩＤおよび％ＩＤ／ｇをその後計算した。加えて、２４時間の時点で尿をサンプリングした。

【0573】

結果、４４
全ての除去剤は、血流から急速に除去され、既に注射後２時間目には肝臓および結腸に主に蓄積する。臓器別の（％ＩＤ）放射能分布によって実証される通り、注射された^２１２Ｐｂの約５０％は、注射２４時間後に肝臓に見出された。トリＧａｌＮＡｃ分子の存在によって説明される通り、トリＧａｌＮＡｃ修飾除去剤も、ある程度まで脾臓に蓄積した。一般に、２４時間後に尿に放射能は殆ど見出されなかった。しかし、最も小型の除去剤（Ｄｅｘ７０）は、予想よりもゆっくりと排泄された。

【0574】

図７は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける、^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0575】

図８は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける、^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２４時間後の、選択された組織および尿における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0576】

図９は、ＭＫＮ４５腫瘍を有するマウスにおける、^２１２Ｐｂ標識された除去剤の注射２４時間後の、選択された組織および尿における臓器別の放射能分布を示す（％ＩＤ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0577】

概要および結論
放射標識されたＣＡのいずれも、マウス１匹あたり３０μｇの用量で投与された場合、^２１２Ｐｂの腫瘍取込みをもたらさなかった。トリＧａｌＮａｃによるＤｅｘ５００の修飾は、修飾されていないＤｅｘ７０およびＤｅｘ２５０除去剤と比較して有益ではなかった。

【0578】

実施例１８：除去剤の長期体内分布（プロトコール７０）
本試験は、６種の異なる除去剤の長期体内分布を比較した。^２０３Ｐｂによる放射標識により、ｉｎ ｖｉｖｏ追跡を行った。

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【0579】

結果、７０
図１０は、腫瘍がないマウスにおける、^２０３Ｐｂ標識された除去剤の注射１週間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0580】

図１１は、腫瘍がないマウスにおける、^２０３Ｐｂ標識された除去剤の注射１週間後の、選択された組織における臓器別の放射能分布を示す（％ＩＤ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0581】

実施例１９：血液における除去剤（プロトコール８３および８７）
このパートは、２つの試験を網羅し、そのうち第１の試験は、血液中の滞留時間の観点から、９種の異なるデキストランベースの除去剤をＰＢＳと比較する初期スクリーニングを含む。目標は、３週間隔てた反復処置を可能にする、将来のプレターゲティング実験の有望な候補を同定することであった。延長した時間にわたり循環中に残る除去剤が、投与された二重特異性抗体に結合し、その後に注射される放射標識されたＤＯＴＡＭの結合を有効にブロックするという仮説を立てた。除去試薬は、サイズ、電荷、および１，４，７，１０−テトラキス（カルバモイルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＴＣＭＣ）ロードの観点から変動した。

【0582】

第２の試験は、抗体除去効率の観点から９種の除去剤を評価した。この実験は、ＣＡ投与後の保持されるｂｓＡｂの指標として血液における^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ保持を評価する、腫瘍がないマウスにおける標準単一注射ＰＲＩＴレジメンとして設計された。

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【0583】

第１のＰＲＩＴ注射時に、マウスは７〜９週齢であった。試験における全マウスは腫瘍がなかった；したがって、いかなるＤＯＴＡＭ結合二重特異性抗体をスクリーニング目的で使用することもできる。１００μＬあたり３０（プロトコール８３）または６０（プロトコール８７）μｇの最終濃度となるようＰＢＳに希釈したＰＲＩＴ−０１５５の１日後に、除去剤を静脈内投与した。群Ｏは、除去剤の代わりにＰＢＳを受けた。群Ａ〜Ｄにおける化合物は、変動するＴＣＭＣ置換を有する、２０、７０、２５０または５００ｋＤａのデキストランサイズに基づいた。群Ｊ〜Ｎにおける化合物は、変動する電荷（Ｇｌｕ）を有するキャッピングされた（すなわち、過剰アミンの中和による）デキストラン−５００（ＣＤｅｘ）、またはモノバージョンのＧｌｕ（Ｍ（Ｇｌｕ））を有するデキストラン−５００およびデキストラン−２０に基づいた。−（Ｇｌｕ）４、−（Ｇｌｕ）３および−（Ｇｌｕ）２を有するキャッピングされたデキストランは、それぞれ強く負、負および中性の正味電荷に対応した；モノバージョン−Ｍ（Ｇｌｕ）２は、負から僅かに正の正味電荷に対応した。

【0584】

結果、８３
ＰＢＳコントロール群のもの（４１．１±１．４％ＩＤ／ｇ）と有意に異なった血液における放射能含有量（％ＩＤ／ｇ）の群平均は、投与３週間後の循環における除去剤の保持を示した。３種の化合物は、コントロールと有意に異ならなかった：キャッピングされたＤｅｘ５００−（Ｇｌｕ）４、Ｄｅｘ５００−モノ−（Ｇｌｕ）２およびＤｅｘ２０−モノ−（Ｇｌｕ）３；その他は、変動する程度で異なった。

【0585】

図１２は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射４時間後の、血液における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。縞模様のバーは、全候補試薬を比較した、ＣＡなしコントロールを表す。アステリスクは、低（＊）から高（＊＊＊）へと、統計的有意性のレベルをマークする。

【0586】

結果、８７
被験除去剤は、次の１つの例外を除いて、全般に良い成績を収めた：Ｄｅｘ５００−Ｍ（Ｇｌｕ）２は際立っており、２４時間後に８．０７±０．６１％ＩＤ／ｇが血液に残っていた。

【0587】

図１３は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液における平均放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。縞模様のバーは、全候補試薬を比較した、ＣＡなしコントロールを表す。

【0588】

概要および結論
スクリーニングした試薬は、自己クリアランスの観点から全体的に良い成績を収め、循環からの抗体クリアランスを達成した。ＣＡ注射間３週間による反復処置は、二重特異性抗体への^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ結合にリスクを生じることなく実現可能と判明した。加えて、二重特異性抗体は、被験化合物の大部分を使用したＣＡ注射後２時間以内に除去された。

【0589】

実施例２０：除去剤の腫瘍浸透（プロトコール８５）
浸透するＤＯＴＡＭ結合ＣＡ断片は、抗体でプレターゲティングされた腫瘍細胞への結合において^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと競合し得るため、除去剤の腫瘍浸透は、ＰＲＩＴレジメンにおける潜在的な問題である。本試験において、腫瘍への^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ会合の阻害の観点から、６種の異なる除去剤を比較した。ｉ）デキストランサイズおよびｉｉ）分子の電荷から、腫瘍会合性放射能における影響を評価するために、ベースラインＣＡスクリーニング（プロトコール８３）の結果に基づき候補を選んだ。

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【0590】

各マウス（７週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／ＭａｔｒｉｇｅｌにおけるＢｘＰＣ３細胞（継代３３）を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射５日後に、２００ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0591】

除去剤は、変動するＴＣＭＣ置換を有する、２０、７０または５００ｋＤａのデキストランサイズに基づいた。ＣＤｅｘ５００−（Ｇｌｕ）４は、負の正味電荷を有するキャッピングされた（すなわち、過剰アミンの中和による）デキストラン−５００（ＣＤｅｘ）に基づいた；Ｄｅｘ５００−Ｍ（Ｇｌｕ）２は、モノバージョンのＧｌｕ（Ｍ（Ｇｌｕ））および中性から僅かに正の正味電荷を有した。ＰＲＩＴ−０１６５の３日後に１００μＬあたり３０μｇで、全て静脈内投与した。群Ｇは、除去剤の代わりにＰＢＳを受けた。

【0592】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後に、マウスを屠殺した。血液および腫瘍を収集し、これらそれぞれの％ＩＤ／ｇを、試料重量および放射能含有量から計算した。

【0593】

結果、８５
候補のうち３種：Ｄｅｘ２０（０．２６±０．０３％ＩＤ／ｇ）、Ｄｅｘ７０（４．０６±２．０６％ＩＤ／ｇ）およびＣＤｅｘ５００−（Ｇｌｕ）４（２．９８±０．７３％ＩＤ／ｇ）が、腫瘍取込みを殆ど呈さずまたは全く呈さず、腫瘍への大規模ＣＡ浸透を示す。対照的に、Ｄｅｘ５００−Ｍ（Ｇｌｕ）２は、ｂｓＡｂクリアランス失敗として解釈される、ＰＢＳコントロールのもの（それぞれ腫瘍および血液における５９．０２±１５．５３および２７．９２±２．３８％ＩＤ／ｇ）と同様のレベルで、腫瘍（６９．３９±９．７０％ＩＤ／ｇ）および血液（２０．６８±１．２２％ＩＤ／ｇ）の両方において高い放射能をもたらした。Ｄｅｘ５００は、腫瘍における放射能の相当の蓄積を呈し（２０．７８±３．７６％ＩＤ／ｇ）、僅かな腫瘍浸透を示し、一方、血液クリアランスは、基本的に完全であった（０．１７±０．０１％ＩＤ／ｇ）。にもかかわらず、ＣＡなしコントロールにおいて達成された腫瘍取込みは、ある程度の低分子量（ＭＷ）ＤＯＴＡＭ−デキストラン断片が、Ｄｅｘ５００バッチにも存在したことを示した。

【0594】

図１４は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0595】

概要および結論
本実験は、低ＭＷ ＣＡ種の存在が、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの腫瘍蓄積に実質的に干渉し得るという概念を確認した。本実験は、指定されたサイズに関係なく、ＣＡのいずれかのバッチに存在する分子の幅広いＭＷ範囲も実証した。そのため、指定されたＣＡサイズが大きいほど、腫瘍に浸透し得る低ＭＷ断片を導入するリスクは低くなる。しかし、Ｄｅｘ５００であっても、ＣＡなしコントロールと比較した腫瘍取込みの差によって示される通り、あるレベルの浸透が明らかになった。結果的に、この溶液は、将来、より高いＭＷカットオフを使用してダイアフィルトレーションして、このような干渉断片を可能な限り多く除去するべきである。Ｄｅｘ５００のために３０から１００ｋＤａへとＭＷカットオフを増加させる判断を下した。

【0596】

実施例２１：Ｄｅｘ５００のための除去剤製造プロセス
アミノデキストラン（２０．０ｇ）を、Ｈ_２Ｏ（４００ｍＬ）における０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３およびＨ_２Ｏ（４００ｍＬ）における０．１Ｍ ＮａＨＣＯ_３の混合物に溶解した。清澄な無色溶液が得られたら、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡＭ・４ＨＣｌ（Ｓ−２−（４−イソチオシアナトベンジル）−１，４，７，１０−テトラアザ−１，４，７，１０−テトラ（２−カルバモイルメチル）シクロドデカン四塩酸塩、２．０３ｇ）を撹拌下添加した。その結果生じる僅かに濁りがある溶液を室温で４時間撹拌し、その後、２Ｍ ＨＣｌを添加することにより反応混合物をｐＨ６〜７に中和した。その結果生じる溶液を、１００ｋＤａカットオフによるタンジェント流濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ、Ｓｌｉｃｅ ２００ １００ｋＤａ ０．０２ｍ^２、安定化されたセルロースベースの膜、限外濾過カセット）により精製して、低分子量不純物を除去した。その結果生じる溶液を減圧下で凍結乾燥して、１７．９ｇの所望の中間体を得た。

【0597】

フリーズドライから得た１６．１ｇの固体を、Ｈ_２Ｏ（６０ｍＬ）における０．１Ｍ ＡｃＯＨおよび０．１Ｍ ＮａＯＡｃ・３Ｈ_２Ｏ（５４０ｍＬ）の混合物に溶解した。清澄な無色溶液に、Ｐｂ（ＯＡｃ）_２・３Ｈ_２Ｏ（７４４ｍｇ）を固体として添加した。清澄な無色溶液を６０分間撹拌し、その後、キシレノールオレンジの溶液（Ｈ_２Ｏにおける１％、２５０ｕＬ）を添加した。紫色は、溶液における遊離Ｐｂ（ＩＩ）の存在を示した。黄色への色変化が観察されるまで、ＥＤＴＡの溶液（Ｈ_２Ｏにおける０．０１Ｍ）を添加した（６５．２ｍＬ）。その結果生じる溶液を、１００ｋＤａカットオフによるタンジェント流濾過（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ、Ｓｌｉｃｅ ２００ １００ｋＤａ ０．０２ｍ^２、安定化されたセルロースベースの膜、限外濾過カセット）により精製して、低分子量不純物を除去した。その結果生じる溶液を減圧下で凍結乾燥して、１４．０ｇの所望の除去剤を得た。

【0598】

その結果生じる除去剤は、下に模式的に示す形態の複数のＰｂ−ＤＯＴＡＭ部分で置換される：

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【0599】

実施例２２：腫瘍蓄積における除去剤用量（プロトコール９０）
本試験は、より多い量の除去剤が、腫瘍へのより高い程度の除去剤浸透をもたらし、これにより、腫瘍結合した二重特異性抗体のＤＯＴＡＭ結合アームをブロックすることにより標識されたキレートのその後の取り込みを減少させ得ることを仮定する、皮下腫瘍モデルにおける腫瘍蓄積における除去剤用量の影響を調査することを目標とした。しかし、低すぎる用量は、循環におけるより高いレベルのＤＯＴＡＭ結合二重特異性抗体のため、効率が低い腫瘍会合性放射能蓄積をもたらすであろう。

【0600】

加えて、ＤＯＴＡＭ結合デキストラン断片の腫瘍浸透を減少させる試みにおいて、３０または１００ｋＤａのいずれかでのカットオフで低ＭＷ成分を除去するためにダイアフィルトレーションされた除去剤バッチの間で比較を行った。

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【0601】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩ培地におけるＢｘＰＣ３細胞（継代３０）の皮下注射により確立した。各マウス（１１週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個の細胞を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射５日後に、１５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0602】

１００μＬあたり３０または１００μｇのいずれかの濃度でＰＲＩＴ−０１６５をｉ．ｖ．注射し、続いて４日後に、１００μＬあたり１０、２５、３０、５０または１００μｇの濃度の除去剤（群Ａ〜Ｆ）を注射した。ＣＡの２時間後に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した。群ＧおよびＨは、二重特異性抗体および放射標識キレートの投与の間に除去剤を受けなかった。

【0603】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後に、体内分布を調べる目的のためにマウスを屠殺し、血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾および腫瘍を収集した。試料を秤量し、放射能に関して測定し、崩壊およびバックグラウンドに対する補正を含む、臓器毎の％ＩＤ／ｇをその後計算した。

【0604】

結果、９０
正常組織における^２１２Ｐｂ蓄積は、除去剤が投与された全群で低かった；対照的に、除去剤を受けなかった群は、全体的に有意なレベルの放射能を呈した。

【0605】

体内分布データは、除去剤（１００−ｋＤａカットオフ）量の変動の効果を実証する。個々の腫瘍データの線形回帰は、有意な勾配を生じ、減少する量のＤｅｘ５００によるより高い腫瘍取込みを示す（ｐ＝０．０３、Ｒ^２＝０．３１）。血液における放射能含有量における効果は劇的であり、ＰＢＳを使用した３１．５±０．２％ＩＤ／ｇから、１０μｇのＤｅｘ５００を使用した１．６±０．５％ＩＤ／ｇに至った。

【0606】

２群は、等しい（１：１）比のＰＲＩＴ−０１６５およびＤｅｘ５００を受けた；１００または３０μｇのいずれかの各薬剤。腫瘍におけるその結果生じる％ＩＤ／ｇは、２群の間で有意に異ならなかった（独立ｔ検定、ｐ＝０．７２６）。重要なことに、異なる濾過カットオフによる等しい量のＤｅｘ５００の間の比較は、３２．５±４．４％ＩＤ／ｇの代わりに５４．９±６．９（独立ｔ検定、ｐ＝０．００９）の、より高いＭＷカットオフを使用したところ、腫瘍蓄積の有意な増加を示した。

【0607】

図１５は、３０もしくは１００μｇの二重特異性抗体、および１００もしくは３０ｋＤａ濾過カットオフによる１０〜１００μｇの除去剤、または除去剤完全不含（ＰＢＳ）を使用した、放射標識されたＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0608】

図１６は、漸増量の除去剤（０〜１００μｇ）による、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂの放射能濃度における効果を示す。１００μｇのＰＲＩＴ−０１６５、続いて４日後に、１００−ｋＤａカットオフによりダイアフィルトレーションしたＤｅｘ５００、またはＰＢＳを使用して腫瘍をプレターゲティングした。ＣＡの２時間後に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを投与した。記号は、放射能注射２４時間後の％ＩＤ／ｇを表し、線は、腫瘍データの線形回帰を表す。

【0609】

概要および結論
本試験は、低レベルの循環放射能を維持しながらの、^２１２Ｐｂの腫瘍蓄積の徹底的な増加を実証した。次の２つの鍵となる知見が結論付けられた：１）１００−ｋＤａカットオフによるダイアフィルトレーションは、ＤＯＴＡＭ結合デキストラン断片の腫瘍浸透を有意に減少させたこと、および２）ＣＡのｂｓＡｂに対する比が、絶対ＣＡ量を超えて成績に影響を与えたこと。優れた腫瘍対血液比は、１００μｇの二重特異性抗体の投与後に、１０：１の抗体：ＣＡ比を使用して達成された。さらに、Ｄｅｘ５００ベースの除去剤を使用した将来の試験は全て、１００−ｋＤａカットオフを使用してダイアフィルトレーションされた試薬を使用するべきであると結論付けられた。

【0610】

実施例２３：腫瘍会合性放射能における影響（プロトコール９５）
本試験において、腫瘍への^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ会合の阻害の観点から、デキストラン−５００に基づく９種の異なる除去剤を比較した。より具体的には、実験は、ｉ）ＴＣＭＣ飽和、ｉｉ）除去剤対抗体比およびｉｉｉ）産生／精製方法から、腫瘍会合性放射能における影響を評価した。加えて、プレターゲティングまたはＣＡなしで、１０または３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射後に、腫瘍取込みを比較して、腫瘍の放射能飽和が低い方の用量で既に達成されたか評価した。

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【0611】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩ培地におけるＢｘＰＣ３細胞（継代２０）の皮下注射により確立した。各マウス（８週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個の細胞を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射１５日後に、２１０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0612】

ＰＲＩＴ−０１６５（１００μＬあたり１００μｇ）をｉ．ｖ．投与し、続いて３日後に、変動するＴＣＭＣ置換（１０〜１００％）を有するデキストラン−５００ベースの除去試薬（１００μＬあたり１０〜１７０μｇ）を投与した。群ＪおよびＫは、除去剤の代わりにＰＢＳを受けた。２時間後、マウスに、１００μＬのそれぞれの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ溶液（１０または３０μＣｉ）をｉ．ｖ．注射した。

【0613】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後に、マウスを屠殺し、剖検した。血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾および腫瘍を収集し、秤量し、放射能含有量に関して測定し、％ＩＤ／ｇをその後計算した。

【0614】

結果、９５
体内分布データは、投与された量に依存した、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射２４時間後の収集された組織における平均放射能含有量（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ）における明らかな傾向を明らかにし、より低いＣＡ量により、血液および正常組織におけるより高い^２１２Ｐｂ濃度が得られた。加えて、より高い^２１２Ｐｂ放射能は、対応する正常組織取り込み増加を伴わずに、腫瘍におけるより高い^２１２Ｐｂ蓄積をもたらした。

【0615】

図１７は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。暗灰色および黒色のバーは、候補試薬を比較した、ＣＡなしポジティブコントロールを表す。

【0616】

多重比較のための補正による一方向ＡＮＯＶＡは、Ｄｅｘ５００−（４０％）（７６．７９±３３．２８、ｐ＜０．０００１）およびＤｅｘ５００−（１００％）（４３．２６±２４．６６、ｐ＝０．０１１５）のみが、腫瘍対血液比の観点から、１０μＣｉネガティブコントロール（２．２６±０．２５）とは有意に異なったことを明らかにした。最高の腫瘍対血液比を有する除去試薬（Ｄｅｘ５００−（４０％））および以前の標準（Ｄｅｘ５００−（１００％））の間の認知される差は、統計的に有意ではなかった（独立ｔ検定、ｐ＝０．２３３６）。

【0617】

図１８は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂ含有量（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）、ならびに対応する腫瘍対血液比を示す。暗灰色および黒色のバーは、候補試薬を比較した、ＣＡなしポジティブコントロールを表す。

【0618】

線形回帰および多項式（三次）曲線適合を行って、腫瘍対血液比における、漸増除去剤（Ｄｅｘ５００−（１０％））量およびＴＣＭＣロード（ＣＡなし、Ｄｅｘ５００−（１０％）、Ｄｅｘ５００−（２０％）、Ｄｅｘ５００−（４０％）、Ｄｅｘ５００−（１００％））からの影響を解析した。線形曲線の勾配は、増加した腫瘍対血液比のためにより大量のＤｅｘ５００−（１０％）を支持して、統計的に有意であった（ｐ＜０．０００１）が、一方、注射したある量のＴＣＭＣのため、１００μｇのＤｅｘ５００−（１０％）に基づき、６０前後のＴＣＭＣ対Ｄｅｘ５００比において最大が示された。これらの結果が、試薬量またはＴＣＭＣ飽和に関する一般的な結論を出すにあたって、その文脈から切り離されて解釈されるべきではないことを認めることが重要である；これらは、適用された設定でのみ妥当である。

【0619】

図１９は、ＣＡ量（ＰＪＲＤ０８−４６）およびＴＣＭＣ飽和（９対、２０対、３９対または８４対１）の関数として、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の腫瘍対血液比を示す。破線は、それぞれのデータの線形回帰（Ｒ^２＝０．８２）および非線形曲線適合（Ｒ^２＝０．７４）を表す。

【0620】

最終試験は、抗体または除去剤の注射なしで、１０対３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを比較した。血液における含有量は、２種の試験群で同様であったが、３０μＣｉは、１０μＣｉよりも高い腫瘍蓄積をもたらした：１０７．７４±１４．７１対７２．３８±１０．８３％ＩＤ／ｇ（±ＳＤ、ｎ＝３）。その結果生じる腫瘍対血液比は、有意に異なった：それぞれ３０および１０μＣｉに関して、３．２０±０．２０対２．２６±０．２５（独立ｔ検定、ｐ＝０．００７）。

【0621】

概要および結論
結論として、１分子あたり３９個のＴＣＭＣを有する２０μｇのＤｅｘ５００（Ｄｅｘ５００−（４０％））は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与２４時間後に、低い血液中保持と組み合わせて、プレターゲティングされた腫瘍における^２１２Ｐｂの非常に高い蓄積を生成した。これは、１分子あたり８４個のＴＣＭＣを有する、１０μｇの以前の標準ＣＡ、Ｄｅｘ５００−（１００％）によるサイド・バイ・サイドで、最も成績が良い除去剤であった。相当な群内可変性および小さい標本サイズにより、腫瘍対血液比における差は、２種の試薬の間で統計的に異ならなかったが、平均値は、Ｄｅｘ５００−（１００％）が好ましい可能性があることを示した。加えて、３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭが、１０μＣｉよりも高い腫瘍蓄積を生じ得る、すなわち、低い方の用量で飽和に達しなかったことが結論付けられた。

【0622】

実施例２４：腫瘍蓄積における二重特異性抗体用量の影響（プロトコール９１）
本試験は、皮下腫瘍モデルにおける腫瘍蓄積における二重特異性抗体用量の影響を調査することを目標とした。より多い量の二重特異性抗体が、腫瘍細胞における利用できる結合部位をより容易に飽和させ、これにより、標識されたキレートのその後の取り込みを増加させることができるという仮説を立てた。他方では、用量の過度の増加は、より高いレベルの循環二重特異性抗体により、腫瘍会合性放射能の効率が低い蓄積をもたらすことができる。

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【0623】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩ培地におけるＢｘＰＣ３細胞（継代３４）の皮下注射により確立した。各マウス（７〜１２週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個の細胞を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射５日後に、２２０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0624】

マウスに、１００μＬあたり３０〜２００μｇの濃度のＣＥＡ結合二重特異性抗体ＰＲＩＴ−０１６５もしくはＰＲＩＴ−０１５６、または１００μｇの非ＣＥＡ結合コントロール抗体ＰＲＩＴ−０１７５をｉ．ｖ．投与した。４日後に、全群に、１００μＬあたり３、１０または２０μｇの濃度（注射された抗体用量の１／１０）の除去剤、続いて２時間後に、１０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭをｉ．ｖ．注射した。２４時間後にマウスを屠殺し、剖検を行った。血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾および腫瘍を収集した。試料を秤量し、放射能に関して測定し、％ＩＤ／ｇを臓器毎に計算した。

【0625】

結果、９１
１００μｇのいずれかのＣＥＡ結合二重特異性抗体を使用したプレターゲティングは、１００μｇの非ＣＥＡ結合コントロールと比較して、腫瘍における^２１２Ｐｂの有意な蓄積をもたらした（独立ｔ検定、それぞれＰＲＩＴ−０１５６およびＰＲＩＴ−０１６５との比較について、ｐ＝０．０２７および０．００８）。いずれかのＣＥＡ結合コンストラクトのために３０から２００μｇへと抗体用量を増加させた場合、腫瘍取込みに有意差は観察されなかった。しかし、全体的な放射能レベルは、３０μｇを上回る抗体用量に関して、大部分の正常組織において僅かに上昇した。重要なことに、ＰＲＩＴ−０１５６の１００および２００μｇの間を除いて、血液における％ＩＤ／ｇは、用量増分毎に有意に増加した（独立ｔ検定、ｐ＜０．０５）。

【0626】

図２０は、放射標識されたＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、^２１２Ｐｂの分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。白色および灰色の背景を有するバーは、それぞれＴ８４．６６およびＣＨ１Ａ１Ａのターゲティングを表す；黒色のバーは、非ＣＥＡ結合コントロールを表す。

【0627】

概要および結論
全３種の抗体用量レベル（３０、１００および２００μｇ）が、両方の被験二重特異性コンストラクトに関して、腫瘍における放射能の高い、特異的な取り込みをもたらした。増加した用量による腫瘍蓄積における差の欠如は、結合部位が、低い方の投薬量で既に飽和されたこと、またはＰＲＩＴ投与および除去剤注射の間の時間（４日間）が、さらなる腫瘍蓄積を可能にするには短すぎたことを示した。予想通り、血液における放射能レベルが、漸増用量に伴い増加し、処置の治療ウィンドウが僅かに狭くなる。

【0628】

実施例２５：ＣＥＡ−ＰＲＩＴの有効性（プロトコール９３（ａ、ｂ））
本試験において、２種の臨床ｂｓＡｂ候補（ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４）を使用したＣＥＡ−ＰＲＩＴの有効性を、２種の平行皮下腫瘍モデル：ＢｘＰＣ３およびＬＳ１７４Ｔにおいて評価した。単一および二重サイクル処置レジメンにおいて、二重特異性抗体をサイド・バイ・サイドで比較した。

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【0629】

群Ａ〜Ｇは、有効性の評価のために追跡された処置されたマウスを表し、一方、群Ｈ〜Ｌは、その最後の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射の２４時間後に体内分布を調べる目的のため屠殺されたマウスを含む。

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【0630】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩ（ＢｘＰＣ３）またはＤＭＥＭ（ＬＳ１７４Ｔ）培地における細胞の皮下注射により確立した。

【0631】

プロトコール９３ａのため、マウス（７週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個のＢｘＰＣ３細胞（継代３３）を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射１２日後に、２３５ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0632】

プロトコール９３ｂのため、マウス（９週齢）に、１００μＬ ＤＭＥＭ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける１×１０^６個のＬＳ１７４Ｔ細胞（継代２６）を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射３日後に、１５０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0633】

各処置サイクルは、ヒト化ｂｓＡｂ（ＰＲＩＴ−０２１３、ＰＲＩＴ−０２１４またはＰＲＩＴ−０１７５）の注射により開始した。４日後に、除去剤（Ｄｅｘ５００）、続いて２時間後に、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを投与した。処置サイクル１後に放射能尿／糞便の再経口摂取を最小化するために、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与４時間後に、次いで再度、２４時間ｐ．ｉ．にケージを交換した。サイクル２のため、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与後、標準寝床を備える新たなケージに移す前に、焼却処理した床（grilled floor）を備えるケージにマウスを４時間配置した。次に、サイクル１後として、２４時間ｐ．ｉ．に全ケージを交換した。

【0634】

１週間に３回の反復ノギス計測により、マウスにおける腫瘍発達を追跡した。必要であれば、スケジュールにある測定間の間隙で、追加的なノギス計測を行った。動物の体重を同じ様式で反復して測定した。その腫瘍体積が３０００ｍｍ^３に達したマウスは直ちに安楽死させた。倫理的な理由から安楽死に考慮される他の要因は、動物の体重減少、腫瘍状態（例えば、潰瘍）および全身的外観であった。放射線誘発毒性による急性体重減少（集団的または個体的）があったために要求される場合、全個体が十分に回復するまで、放射能注射の５日後から、全動物にウェットタイプの食物を与えた。

【0635】

安楽死の時点で群Ａ〜Ｇから次の臓器および組織を採集した：膀胱、卵巣、肝臓、脾臓、腎臓、大腿骨（骨髄を含む）、結腸、空腸、胃および腫瘍。予想外なまたは異常な状態を記述および写真撮影した。組織は、１０％中性緩衝ホルマリン（４℃）に直ちに入れ、次いで５日後にＰＢＳ（４℃）に移した。次に、ホルマリン固定した試料は、さらなる処理および解析のため、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂａｓｅｌに輸送した。

【0636】

群Ｈ、ＪおよびＬにおけるマウスは、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのそれらの第１のかつ唯一の注射の２４時間後に屠殺し剖検した；群ＩおよびＫは、それらの第２の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射の２４時間後に屠殺し剖検した。次の臓器および組織を採集した：血液、膀胱、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、尾および腫瘍。収集された試料を秤量し、放射能に関して測定し、崩壊およびバックグラウンドに対する補正を含む、組織１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）をその後計算した。

【0637】

結果、９３ａ
処置サイクル１後の結果は、このモデルにおける以前に達成された組織取り込みと良く対応し、高い腫瘍蓄積（それぞれＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４で２５．０±９．７および１９．５±６．４％ＩＤ／ｇ）および正常組織における低い蓄積であった。しかし、サイクル２は、異なる^２１２Ｐｂ分布プロファイルをもたらし、全ての収集された組織において放射能含有量が増加した。

【0638】

図２１は、ＢｘＰＣ３モデルにおける処置サイクル１および２に関する、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＥＭ、ｎ＝３）。

【0639】

３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した全マウスが、体重の初期降下を経験し、これは、第１の放射能注射後１０日目までに軽減された。おそらくは、関連するサイクル２体内分布において観察される、よりゆっくりした放射能クリアランスおよびその結果生じる正常組織における^２１２Ｐｂ蓄積のため、第２の３０μＣｉ注射を投与した群は、より顕著な急性体重減を患った。第２のサイクルの１０μＣｉを受けた群では、このような効果は観察されず、その後の体重減は中等度であった。

【0640】

図２２は、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0641】

図２３は、初期体重のパーセンテージとして表現される、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重変化を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0642】

全群が、ベースラインと比較して、１４〜１９日目までにその腫瘍体積を倍加させた。１６日目に第１の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ処置を与え、その後、ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４群における腫瘍は、約１週間成長し続け、その後、体積の縮小を示した。腫瘍は完全には縮小しなかったが、体積は、４０〜４７日目まで低レベルで相対的に一定のままであり、その時点でもう一度、ベースラインと比較して二倍体積に達した。このポイント（４４日目）で、第２の３０μＣｉ ^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射を投与し、これにより、以前に記述された通り、翌週内に大部分の罹患マウスで急性体重減およびその後の安楽死がもたらされた。３０μＣｉの代わりに１０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭによる第２の処置サイクルを与えたマウス（５５日目）は、少ない放射線誘発毒性を経験した。１０μＣｉ注射は、およそ５８〜７５日目の間持続する腫瘍縮小の第２フェーズをもたらした。非特異的ｂｓＡｂによるＰＲＩＴは、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ単独またはＰＢＳと比較して、有意な、ただし限られた腫瘍増殖阻害をもたらした。ダネット法を使用した比較手段は、ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４を使用した全処置レジメンが、等しい処置対コントロール比をもたらし、全て、２３〜２６日目およびそれ以降で、いずれかのコントロール群と比較して有意に異なることを明らかにした。

【0643】

全処置群がまだ表されている最後の日である４７日目に、腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、ＰＢＳと比較して、それぞれ群「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋１０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋１０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０１７５、３０＋３０μＣｉ」および「ＤＯＴＡＭ単独、３０＋３０μＣｉ」について、８７．３、８８．８、８４．１、８８．７、５７．５および１５．８％であった。ビヒクルコントロール群における最後のマウスは、６６日目に相当し、この時点で、ＴＧＩは、残っている３群：それぞれ「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋１０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋１０μＣｉ」および「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」について８７．８、８４．５および８７．３％であった。群「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋１０μＣｉ」から１匹、群「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋１０μＣｉ」から３匹および群「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」から２匹の、総計６匹のマウスが、実験の終わり（８４日目）まで生存した。

【0644】

図２４は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する腫瘍増殖平均と標準誤差を示す（ｎ＝８）。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0645】

図２５は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇに関する個々の腫瘍増殖曲線を示す。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【0646】

図２６は、ＢｘＰＣ３モデルにおける群Ａ〜Ｇにおける生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す（ｎ＝８）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【0647】

ペア毎の検定を行って、いずれの群が生存の観点から有意に異なったかを指定した：ログランク検定（後期の生存事象に重きを置く）およびウィルコクソン検定（初期の生存時間に重きを置く）、両者共に多重検定するためのボンフェローニ補正を使用。放射線誘発毒性のため、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋３０μＣｉ」は、コントロール群に等しいまたはそれよりも悪い成績であった。対応するＰＲＩＴ−０２１４処置は、僅かにより良い結果を達成し、ＰＢＳおよび非特異的抗体と比較して生存を増加させた。第２のサイクルにおける１０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭによる２群は、互いおよび「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」を除いて、全群と比較して生存を有意に増加させた。

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【0648】

結果、９３ｂ
両方の処置サイクルが、高い^２１２Ｐｂ腫瘍蓄積および正常組織における低い^２１２Ｐｂ蓄積をもたらした。サイクル１の後の腫瘍取込みは、それぞれＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４で３０．９±２．９および２１．４±１．９％ＩＤ／ｇであった；サイクル２の後に、対応する数値は、３３．２±０．７および４０．１±６．５％ＩＤ／ｇであった。

【0649】

図２７は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける処置サイクル１および２に関する、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0650】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した全マウスは、両方の３０μＣｉ処置サイクル後に同様に、体重の中等度減少を経験した。しかし、多くの動物は、不良な腫瘍状態のため、倫理的な理由から時期を早めて安楽死させた。

【0651】

図２８は、ＬＳ１７４ＴモデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0652】

図２９は、初期体重のパーセンテージとして表現される、ＬＳ１７４ＴモデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴ後の群Ａ〜Ｇ（ｎ＝８）における平均体重変化を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0653】

第１の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ処置を８日目に与えた。腫瘍はベースラインと比較して縮小しなかったが、ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４群平均は、相対的に一定のままであり、非常にゆっくり増加した。第２の３０μＣｉ ^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射を３６日目に投与した；しかし、コントロール群における急速腫瘍増殖、および全群にわたる不良な腫瘍状態に伴う以前に記述された問題により、その時点までに多くのマウスが既に安楽死されていた。^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの第２の３０μＣｉ注射を受けなかったマウスは、その腫瘍制御を回復または保持したが、腫瘍は完全には縮小しなかった。ダネット法を使用した比較手段は、ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４を使用した全処置レジメンが、１４日目から、ＰＢＳ群と比較して、有意に異なる処置対コントロール比をもたらしたことを明らかにした。また、ＰＲＩＴ−０１７５およびＤＯＴＡＭコントロールは、それぞれ１６および２２日目から、ビヒクルコントロールとは有意に異なった。

【0654】

全処置群がまだ表されている最後の日である２２日目に、ＴＧＩは、ＰＢＳと比較して、それぞれ群「ＰＲＩＴ−０２１３、３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０１７５、３０＋３０μＣｉ」および「ＤＯＴＡＭ単独、３０＋３０μＣｉ」に関して、８３．１、８８．８、８７．５、９１．０、５３．０および６４．７％であった。ビヒクルコントロール群における最後のマウスは、３０日目に相当し、この時点で、ＴＧＩは、それぞれ残っている群「ＰＲＩＴ−０２１３、３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０μＣｉ」、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」および「ＰＲＩＴ−０１７５、３０＋３０μＣｉ」に関して、９２．５、８９．５、９０．８、９２．６および７９．９％であった。２匹のマウスが実験の終わり（１０１日目）まで生存し、両者とも、群「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」に由来した。

【0655】

図３０は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇに関する腫瘍増殖平均と標準誤差（ｎ＝８）を示す。各群における最初の死亡で曲線を打ち切った。垂直な点線は、試験設計に従った、一部または全ての群のための^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与を示す。

【0656】

図３１は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇに関する個々の腫瘍増殖曲線を示す。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【0657】

図３２は、ＬＳ１７４Ｔモデルにおける群Ａ〜Ｇにおける生存を示すカプラン・マイヤー曲線を示す（ｎ＝８）。垂直な点線は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与を示す。

【0658】

ボンフェローニ補正によりログランクおよびウィルコクソン検定を行って、いずれの群が生存の観点から有意に異なったか指定した。鍵となる知見は、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」が、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０μＣｉ」を除いた全群と比較して、生存を有意に増加させたことであった。しかし、群「ＰＲＩＴ−０２１３、３０＋３０μＣｉ」における全生存は、「ＰＲＩＴ−０２１３、３０μＣｉ」のものと有意に異ならず、よって、「ＰＲＩＴ−０２１４、３０＋３０μＣｉ」のものとごく僅かに異なった。

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【0659】

概要および結論
１または２処置サイクルで、２種の二重特異性抗体ＰＲＩＴ−０２１３およびＰＲＩＴ−０２１４のいずれかを使用したＣＥＡ−ＰＲＩＴは、両方の試験された腫瘍モデルで、有意な腫瘍増殖阻害および生存増加をもたらした。ＢｘＰＣ３試験における予想外の第２サイクル^２１２Ｐｂ体内分布およびその後の放射線誘発毒性後のトラブルシューティングの試みは、この状況が、未同定の注射関連の課題によって引き起こされた可能性があると結論付けた。ＢｘＰＣ３有効性試験を反復して、問題が処置レジメンに固有のものでないことを確認するべきである。ＬＳ１７４Ｔモデルにおける将来の実験は、不良な腫瘍状態の問題が解決されるまで行うべきではない。第２の処置サイクルの効率を増加させるために、２つのサイクルの間のタイミングが、腫瘍再増殖を回避するために短縮されることが提案される。加えて、レジメンに第３の処置サイクルを加えることも、さらなる評価のための選択肢となり得る。

【0660】

最後に、腫瘍増殖の根底にある機序の試験は、その増殖は、明らかに阻害されるが、腫瘍が完全には縮小せず、その代わりに、ある時間量の後に再増殖を開始する理由を明らかにするために大変興味深い。

【0661】

実施例２６：除去剤用量（プロトコール１０５）
本試験において、５０％ＴＣＭＣ飽和を有するデキストラン−５００ベースの除去剤の用量の範囲は、プレターゲティングされた腫瘍への^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ会合における効果の観点から評価した。

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【0662】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩ培地におけるＢｘＰＣ３細胞（継代２６）の皮下注射により確立した。各マウス（６週齢）に、１００μＬ ＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個の細胞を右側腹部へとｓ．ｃ．注射した。腫瘍細胞注射１５日後に、２２２ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0663】

ＣＥＡ−ＰＲＩＴ（１００μＬあたり１００μｇ）、続いて３日後に、Ｄｅｘ５００−（５０％）（１００μＬあたり５〜２５０μｇ）をｉ．ｖ．投与した。群Ｆは、除去剤の代わりにＰＢＳを受けた。２時間後、マウスに、１００μＬの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ（１０μＣｉ）をｉ．ｖ．注射した。

【0664】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後に、マウスを屠殺し、剖検した。血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾および腫瘍を収集し、秤量し、放射能含有量に関して測定し、％ＩＤ／ｇをその後計算した。

【0665】

結果、１０５
^２１２Ｐｂの腫瘍蓄積は、２５０μｇを除いて全ＣＡ用量で全般に高かった。ＣＥＡ−ＰＲＩＴ二重特異性抗体の血液クリアランスは、３０、７５および２５０μｇのＣＡ用量で最も効率的であった。結果的に、最高の腫瘍対血液比は、３０、７５および２５０μｇのＣＡで達成され、それぞれ１８７．７、１８０．２および２４３．５であった。^２１２Ｐｂの対応する腫瘍取込みは、９１．８±１８．９、７０．５±１１．１および３５．２±１７．０％ＩＤ／ｇ（±ＳＤ、ｎ＝３）であった。

【0666】

図３３は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、選択された組織における放射能分布を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。灰色のバーは、様々な量のＤｅｘ５００−（５０％）ＣＡの注射後の組織蓄積を表す；黒色のバーは、ＣＡなしコントロールを表す。

【0667】

図３４は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２４時間後の、血液および腫瘍における^２１２Ｐｂ含有量（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）、および対応する腫瘍対血液比を示す。灰色のバーは、様々な量のＤｅｘ５００−（５０％）ＣＡの注射後の組織蓄積を表す；黒色のバーは、ＣＡなしコントロールを表す。

【0668】

概要および結論
腫瘍における達成された^２１２Ｐｂ蓄積、血液クリアランスおよびその後の腫瘍対血液比に基づき、３０μｇのＤｅｘ５００−（５０％）の用量は、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴに好ましいと思われた。

【0669】

実施例２７：デキストラン−５００ベースの除去剤の血液中の滞留時間（プロトコール１０６）
本試験において、５０％ＴＣＭＣ飽和を有するデキストラン−５００ベースの除去剤は、血液中の滞留時間の観点から評価した。目標は、反復処置に適した時間枠（１〜４週間）を同定し、投与された二重特異性抗体に結合し得る除去剤が循環中に殆どまたは全く残っておらず、その後に注射される放射標識されたＤＯＴＡＭの結合を有効にブロックすることを確実にすることであった。

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【0670】

マウス（９週）に、ＣＥＡ−ＰＲＩＴ（１００μＬあたり１００μｇ）、続いて１日後、Ｄｅｘ５００−（５０％）（１００μＬあたり２５μｇ）をｉ．ｖ．投与した。群Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨは、除去剤の代わりにＰＢＳを受けた。１、２、３または４週間後に、マウスに、ＣＥＡ−ＰＲＩＴ（１００μＬあたり１００μｇ）、続いて１日後、１００μＬの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ（１０μＣｉ）を再度ｉ．ｖ．注射した。

【0671】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射４時間後にマウスを屠殺した。安楽死の時点で血液を収集し、試料を秤量し、放射能含有量に関して測定した。崩壊およびバックグラウンドに対する補正を含む、血液１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）をその後計算した。

【0672】

結果、１０６
試験した時点のいずれにおいても、Ｄｅｘ５００−（５０％）またはＰＢＳを受けたマウスの間に平均放射能含有量に統計的有意差はなかった（１方向ＡＮＯＶＡ、シダックの多重比較検定、ｐ＞０．０５）。

【0673】

図３５は、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射４時間後の、血液における放射能含有量を示す（％ＩＤ／ｇ±ＳＤ、ｎ＝３）。

【0674】

概要および結論
結果は、反復したＣＥＡ−ＰＲＩＴ処置サイクルが、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ｂｓＡｂへのその後投与された^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの結合をブロックすることなく、Ｄｅｘ５００−（５０％）の最後の注射の１週間後に既に開始され得ることを示す。

【0675】

実施例２８：二重特異性抗体の追加的な形式
抗体重鎖または軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子／タンパク質（例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン（例えば、そのＣ末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン）を含有する完全長抗体重鎖）の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
− 発現されるべき遺伝子／タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0676】

発現されるべき所望の遺伝子を含む発現単位／カセットに加えて、基礎／標準哺乳動物発現プラスミドは、
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有した。

【0677】

Ｐ１ＡＥ１７６６
Ｇ４Ｓ×４リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体ＶＬ−ＣＨ１またはＶＨ−Ｃ−カッパドメインを含むＣ末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＨ−Ｃｋ）。それぞれ２個のＣＨ３ドメインのＣ末端に１個のＶＬ−ＣＨ１および１個のＶＨ−Ｃｋドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0678】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0679】

Ｐ１ＡＥ１７６８
ノブ・イントゥー・ホール技術を使用することにより、ＣＥＡまたはＤＯＴＡＭのいずれかを標的とする完全かつ機能的な抗体重鎖を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0680】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。ＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用して（ＣＬおよびＣＨ１ドメインをアームの１本と取り替えて）、正確な会合を確実にした。

【0681】

Ｐ１ＡＥ１７６９
ＶＨ−ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ断片を、Ｇ４Ｓ×４リンカーを介して、ＶＨドメインに代えたＶＬドメインの交換を含有するヒトＩｇＧ分子のＶＬドメインのＮ末端に融合する（よって、構造ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３をコードする融合遺伝子を作製する）ことにより、融合遺伝子をアセンブルした。１個のＶＨ−ＣＨ１を有し、それぞれのＮ末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0682】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体ＶＨ−Ｃカッパコード化遺伝子をアセンブルした。

【0683】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0684】

ＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用して、正確な会合を確実にした。

【0685】

Ｐ１ＡＥ１７６７
Ｇ４Ｓ×４リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体Ｖ−軽−ＣＨ１ドメインを含むＣ末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１）。１個のＶＬ−ＣＨ１を有し、それぞれ２個のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0686】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体ＶＨ−Ｃカッパコード化遺伝子をアセンブルした。

【0687】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0688】

ＣｒｏｓｓＭａｂ技術を使用して、正確な会合を確実にした。

【0689】

Ｐ１ＡＥ１７７０
Ｇ４Ｓ×４リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体Ｖ−軽−Ｃ−カッパ−リンカー−Ｖ−重−ＣＨ１ドメインを含むＣ末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ−Ｃｋ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１）。１個の単鎖Ｆａｂを有し、それぞれ２個のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合がない組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0690】

それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0691】

抗体分子の一過性発現
Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）において培養される、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児性腎細胞株２９３由来）において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「２９３−Ｆｒｅｅ」トランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの３から７（３〜７）日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度（例えば、−８０℃）で貯蔵した。

【0692】

例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７〜２０３で得られる。

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【0693】

ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（アフィニティークロマトグラフィー）およびそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（サイズ排除クロマトグラフィー）によって、分子を精製した。

【0694】

異なる形式のＤＯＴＡＭ結合特性のＫｉｎｅｘａ評価
親和性決定の詳細な解析のため、Ｋｉｎｅｘａを使用した。

【0695】

計測手段および材料
オートサンプラーを備えるＳａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（アイダホ州ボイシ）製のＫｉｎＥｘＡ ３２００機器を使用した。ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズは、Ｓａｐｉｄｙｎｅから購入し、一方、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ）および抗ＤＯＴＡＭ抗体は、インハウス（Ｒｏｃｈｅ）で調製した。Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０（登録商標）コンジュゲートされたアフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ断片交差吸着抗体は、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（テキサス州モントゴメリー）から購入した。ビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ抗原（Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−アルキル−ビオチン異性体ＡおよびＢ、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−Ｂｎ−ビオチン／ＴＣＭＣ−Ｐｂ−ｄＰＥＧ３−ビオチン、異性体ＡおよびＢ）および非ビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭは、ＡＲＥＶＡ Ｍｅｄ（メリーランド州ベセスダ）から得た。

【0696】

抗原コーティングされたビーズの調製
ビオチン化分子のためのＫｉｎＥｘＡハンドブックプロトコール（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）に従って、ＰＭＭＡビーズをコーティングした。簡潔に説明すると、第一に、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０μｇのビオチン−ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、吸着コーティングのために１本のバイアル（２００ｍｇ）のビーズにつき添加した。２時間室温で回転させた後に、上清を除去し、ビーズを１ｍｌ ＰＢＳで５回洗浄した。第二に、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の１ｍｌの１００μｇのニュートラアビジン、ビオチン結合タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をビーズに添加し、室温でさらなる２時間インキュベートして、ニュートラアビジンをビーズにカップリングさせ、ビオチン化タンパク質のその後の結合のための追加的なビオチン結合部位をもたらした。次に、ニュートラアビジンコーティングされたビーズを１ｍｌ ＰＢＳで５回リンスした。最後に、ビーズを、ＰＢＳ中の２００ｎｇ／ｍｌビオチン化Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−異性体ミックス（異性体毎に５０ｎｇ）でコーティングし、さらに２時間室温でインキュベートした。次に、ビーズを３０ｍｌ ＰＢＳに再懸濁し、直ちに使用した。

【0697】

ＫｉｎＥｘＡ平衡アッセイ
全てのＫｉｎＥｘＡ実験は、ランニングバッファーとしてＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用して室温（ＲＴ）で行った。１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを補充したランニングバッファー（「試料バッファー」）において試料を調製した。０．２５ｍｌ／分の流量を使用した。５ｐＭ結合部位濃度を有する一定量の抗ＤＯＴＡＭ抗体を、１００ｐＭから開始する２倍段階希釈（濃度範囲０．０４９ｐＭ〜１００ｐＭ）によってＰｂ−ＤＯＴＡＭ抗原で滴定した。抗原なし抗体の１種の試料は、１００％シグナル（すなわち、阻害なし）とした。抗原−抗体複合体をＲＴで少なくとも２４時間インキュベートして、平衡に達するようにした。次に、平衡した混合物を、体積５ｍｌのＫｉｎＥｘＡシステムにおけるＰｂ−ＤＯＴＡＭカップリングビーズのカラムに通して、溶液の平衡状態を乱すことなく、結合していない抗体をビーズによって捕捉させた。試料バッファー中の２５０ｎｇ／ｍｌ Ｄｙｌｉｇｈｔ ６５０（Ｃ）コンジュゲートされた抗ヒトＦｃ断片特異的二次抗体を使用して、捕捉された抗体を検出した。各試料は、全平衡実験で２回複製して測定した。

【0698】

「標準解析」方法を使用して、ＫｉｎＥｘＡソフトウェア（バージョン４．０．１１）内に含有される１部位均一結合モデルを使用してデータの非線形回帰解析からＫＤを得た。ソフトウェアは、ＫＤを計算し、データ点を理論的（theroretical）ＫＤ曲線にフィットさせることにより９５％信頼区間を決定する。９５％信頼区間（Ｓａｐｉｄｙｎｅ ＴｅｃｈＮｏｔｅ ＴＮ２０７Ｒ０）は、ＫＤ低およびＫＤ高として得られる。

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【0699】

全コンストラクトは、信頼区間が重複するためＫＤが匹敵する。

【0700】

異なる形式での分子の配列：
必要に応じた電荷修飾は、太字文字列および下線で示す：ＥＱ−＞ＲＫまたはＫＫ−＞ＥＥ
Ｐ１ＡＥ１７６６
＞ＣＥＡ軽鎖ＲＫ

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＞ＣＥＡ重鎖とＤＯＴＡＭ ＶＬ／ＣＨ１

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＞ ＣＥＡ重鎖とＤＯＴＡＭ ＶＨ／ＣＫ

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Ｐ１ＡＥ１７６７
＞ＤＯＴＡＭ「ＬＣ」とＶＨ／ＣＫ

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＞ＣＥＡ軽鎖ＲＫ

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＞ＣＥＡ重鎖とＤＯＴＡＭ ＶＬ／ＣＨ１

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＞ＣＥＡ重鎖

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Ｐ１ＡＥ１７６８
＞ＣＥＡ ＬＣ

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＞ＤＯＴＡＭ重鎖とＶＬ／ＣＨ１

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＞ＣＥＡ重鎖

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＞ＤＯＴＡＭ「ＬＣ」ＶＨ／ＣＫ

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Ｐ１ＡＥ１７６９
＞ＤＯＴＡＭ「ＬＣ」とＶＨ／ＣＫ

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＞ＣＥＡ ＬＣ

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＞ＣＥＡ ＨＣとＣＥＡ ＶＨ／ＣＨ１／ＤＯＴＡＭ ＶＬ／ＣＨ１

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＞ＣＥＡ ＨＣ

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Ｐ１ＡＥ１７７０
＞ＣＥＡ ＬＣ

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＞ＣＥＡ ＨＣとＤＯＴＡＭ ｓｃＦａｂ：ＤＯＴＡＭ ＶＬ／Ｃｋ／リンカー／ＶＨ ＣＨ１

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＞ＣＥＡ ＨＣ

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【0701】

実施例２９：Ｐｂ−ＤＯＴＡＭおよびＣＤ２０またはＨｅｒ２に結合する二重特異性抗体
抗体重鎖または軽鎖の組換え発現のためのプラスミドの生成
ヒト胎児性腎細胞（ＨＥＫ２９３）の一過性トランスフェクションにより、所望のタンパク質を発現させた。所望の遺伝子／タンパク質（例えば、完全長抗体重鎖、完全長抗体軽鎖、または追加的なドメイン（例えば、そのＣ末端における免疫グロブリン重鎖または軽鎖可変ドメイン）を含有する完全長抗体重鎖）の発現のため、次の機能的エレメントを含む転写単位を使用した：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列（ＳＳ）、
− 発現されるべき遺伝子／タンパク質、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0702】

発現されるべき所望の遺伝子を含む発現単位／カセットに加えて、基礎／標準哺乳動物発現プラスミドは、
− 大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子
を含有した。

【0703】

ａ）抗体重鎖のための発現プラスミド
Ｇ４Ｓ×４リンカーによってそれぞれ分離されたそれぞれの配列エレメント（Ｖ−重またはＶ−軽）をコードするＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合することにより、完全かつ機能的な抗体重鎖に続く、追加的な抗体Ｖ−重またはＶ−軽ドメインを含むＣ末端融合遺伝子を含む抗体重鎖コード化遺伝子をアセンブルした（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ）。それぞれ２個のＣＨ３ドメインのＣ末端に１個のＶＨおよび１個のＶＬドメインを有する組換え抗体分子を、ノブ・イントゥー・ホール技術を使用して発現させた。

【0704】

ＨＥＫ２９３細胞における抗体重鎖と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメインの一過性発現のための発現プラスミドは、抗体重鎖断片と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメイン発現カセットの他に、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。抗体重鎖断片と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメイン融合遺伝子の転写単位は、次の機能的エレメントを含む：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体重鎖（ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＨまたはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−リンカー−ＶＬ）コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0705】

成熟抗体重鎖断片と、Ｃ末端ＶＨまたはＶＬドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を次に示す。
Ｐ１ＡＤ９８２６ → ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ

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【0706】

Ｐ１ＡＤ９８２７ → ＥＲＢＢ２−ＤＯＴＡＭ

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【0707】

ｂ）抗体軽鎖のための発現プラスミド
それぞれの配列エレメントをコードするＤＮＡ断片を融合することにより、完全かつ機能的な抗体軽鎖を含む抗体軽鎖コード化遺伝子をアセンブルした。

【0708】

抗体軽鎖の一過性発現のための発現プラスミドは、抗体軽鎖断片の他に、大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８由来の複製開始点、および大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を付与するベータ−ラクタマーゼ遺伝子を含んだ。抗体軽鎖断片の転写単位は、次の機能的エレメントを含む：
− イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター（Ｐ−ＣＭＶ）、
− ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
− マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
− 抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）コード化核酸、ならびに
− ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。

【0709】

Ｐ１ＡＤ９８２７ → ＥＲＢＢ２−ＤＯＴＡＭ

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【0710】

Ｐ１ＡＤ９８２６ → ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ

[この文献は図面を表示できません]

【0711】

抗体分子の一過性発現
Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）において培養される、一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児性腎細胞株２９３由来）において抗体分子を生成した。トランスフェクションのため、「２９３−Ｆｒｅｅ」トランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用した。上述のそれぞれの抗体重鎖および軽鎖分子は、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションは、製造業者の説明書に指定される通りに行った。トランスフェクションの３から７（３〜７）日後に、免疫グロブリン含有細胞培養上清を採集した。上清は、精製するまで、低下した温度（例えば、−８０℃）で貯蔵した。

【0712】

例えば、ＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は：Ｍｅｉｓｓｎｅｒ、Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７５（２００１）１９７〜２０３で得られる。

【0713】

抗体分子Ｐ１ＡＤ８９２６およびＰ１ＡＤ８９２７の精製
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ（アフィニティークロマトグラフィー）およびそれに続くＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（サイズ排除クロマトグラフィー）によって、ＰＲＩＴ分子を精製した。

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【0714】

質量分析：
ＰＲＩＴ分子の同一性を確認するために、ＥＳＩ−ＭＳを使用した。

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【0715】

Ｐ１ＡＤ８９２７機能性のＦＡＣＳ解析
Ｐ１ＡＤ８９２７の機能性を評価するため、３７℃で１０分間アキュターゼ（accutase）を使用して培養容器からＫＰＬ−４細胞を剥離した。その後（Subequently）、細胞をＰＢＳにおいて２回洗浄し、４×１０６個の細胞／ウェルの最終密度となるように９６ウェルｖ字底型プレートに播種した。

【0716】

抗体を、Ｚｅｎｏｎ＜ヒトＩｇＧ＞Ａ４８８で前標識し、図３８に示される濃度で細胞に添加した。その後、細胞を氷上で１時間インキュベートし、ＰＢＳにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏを使用したＦＩＴＣ蛍光の測定のために２００μｌ ＰＢＳ／５％ＦＣＳに再懸濁した。

【0717】

結果を図３８に示す。

【0718】

ＤＯＴＡＭへの抗体の結合能を評価するために、ＫＰＬ−４細胞への結合後に、細胞を洗浄して、結合していない抗体（antibdy）を除去した。その後、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＦＩＴＣを添加して、ＤＯＴＡＭ結合能力がある細胞結合抗体を検出した（図３９）。Ｐ１ＡＤ８９２７は、アイソタイプ補正された用量依存性ＦＩＴＣシグナルを示す。本実験は、ＤＯＴＡＭ結合が、この抗体において機能的であることを示す。

【0719】

Ｐ１ＡＤ８９２６機能性のＦＡＣＳ解析
Ｐ１ＡＤ８９２６の機能性を評価するため、Ｒａｊｉ細胞をＰＢＳにおいて２回洗浄し、４×１０６個の細胞／ウェルの最終密度となるように９６ウェルｖ字底型プレートに播種した。

【0720】

抗体を、Ｚｅｎｏｎ＜ヒトＩｇＧ＞Ａ４８８で前標識し、図４０に示される濃度で細胞に添加した。その後、細胞を氷上で１時間インキュベートし、ＰＢＳにおいて２回洗浄し、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏを使用したＦＩＴＣ蛍光の測定のために２００μｌ ＰＢＳ／５％ＦＣＳに再懸濁した。

【0721】

ＤＯＴＡＭへの抗体の結合能を評価するために、Ｒａｊｉ細胞への結合後に、細胞を洗浄して、結合していない抗体を除去した。その後、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＦＩＴＣを添加して、ＤＯＴＡＭ結合能力がある細胞結合抗体を検出した（図４１）。Ｐ１ＡＤ８９２７は、アイソタイプ補正された用量依存性ＦＩＴＣシグナルを示す。本実験は、ＤＯＴＡＭ結合が、この抗体において機能的であることを示す。

【0722】

実施例３０：実施例３１〜３７の材料および方法
本実施例は、実施例３１〜３７の試験のための材料および方法を設定する。
３段階ＰＲＩＴ（１サイクル）
ステップ１：ＢｓＡｂの投与（Adminstration）（ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．）：試験で使用されるＢｓＡｂは、高い親和性でＰｂ−ＤＯＴＡＭに結合し、例えばＣＥＡを介して腫瘍を標的とする。
ステップ２：ＣＡの投与（ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．）：^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの効率的な腫瘍蓄積を可能にするために、循環ＢｓＡｂは、腫瘍へと浸透することなく、結合していないＢｓＡｂへの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ結合をブロックし、結果的に、プレターゲティングされた部位をブロックするＣＡを使用して血液中で中和される必要がある。ＢｓＡｂが腫瘍に十分な程度まで蓄積したら、一般に、４〜１０日後に、ＣＡが投与される。Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡは、下に示す通り、チオウレアリンカーを介してＤＯＴＡＭがコンジュゲートされている、５００ｋＤａの平均分子量を有するアミノデキストランに基づき開発された。

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ステップ３：^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの投与（ｉ．ｖ．）：最後のステップにおいて、一般に、ＣＡ注射の２４〜４８時間後に、放射能注射を行って、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭが、プレターゲティングされた腫瘍部位に優先的に結合することを可能にし、全身性放射線曝露を効率的に低下させる。

【0723】

一般的な材料および方法
ＡＲＣｏＬａｂで行われる実験プロトコールは、地方当局（Ｃｏｍｉｔｅ Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ ｄｅ ｌ’Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｄｕ Ｌｉｍｏｕｓｉｎ （ＣＲＥＥＡＬ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｄｅｐａｒｔｅｍｅｎｔａｌ ｄ’Ａｎａｌｙｓｅｓ ｅｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ ｄｅ ｌａ Ｈａｕｔｅ−Ｖｉｅｎｎｅ）によって審査および承認された。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）およびＣＤ１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによって提供され、倫理指針に沿って、明暗の日周サイクル（１２時間／１２時間）による特定のおよび日和見性の病原体がない（ＳＯＰＦ）条件下で維持された。試験１２１は、Ｅｎｖｉｇｏによって提供されたマウスにより、特定の病原体がない（ＳＰＦ）条件を用いた。到着後の最初の５日間、操作は行わず、動物を新たな環境に順化させた。臨床症状および有害事象検出に関して全マウスを毎日管理した。

【0724】

固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合した細胞培養培地におけるＣＥＡ発現腫瘍細胞の皮下（ｓ．ｃ．）注射により確立した。腫瘍体積を手動ノギス計測により推定し、式：体積＝０．５×長さ×幅^２に従って計算した。

【0725】

放射能尿／糞便の再経口摂取を最小化するために、全ての有効性試験マウスは、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ投与後、標準寝床を備える新たなケージに移すまで、焼却処理した床を備えるケージ内に４時間配置した。次に、注射後（ｐ．ｉ．）２４時間目に全ケージを交換した。放射能注射２４時間後までに体内分布を調べる目的のため安楽死されるマウスに対して、この手順は行わなかった。

【0726】

試験動物の体重（ＢＷ）を１週間に少なくとも３回測定し、必要であれば、健康状態に応じて追加的な測定を行った。そのＢＷ減少が自身の初期ＢＷの２５％を超えた、またはその腫瘍体積が３０００ｍｍ^３に達したマウスは、直ちに安楽死させた。倫理的な理由から安楽死に考慮される他の要因は、腫瘍状態（例えば、壊死性区域、血液／体液漏出、自傷の徴候）および動物の全身的外観（例えば、毛皮、姿勢、動作）であった。急性ＢＷ減少（集団的または個体的）があったために要求される場合、全個体が十分に回復するまで、放射能注射５日後から、全マウスにウェットタイプの食物を与えた。

【0727】

プロトコールによって指示される通り、血液を終結時に後眼窩出血を使用して静脈洞から収集し、続いて放射能測定および／または組織学的解析のための追加的な組織採集を行った。予想外なまたは異常な状態を記録した。ホルマリン固定のために収集された組織を１０％中性緩衝ホルマリン（４℃）に直ちに入れ、次いで５日後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；４℃）に移した。体内分布を調べる目的のため収集された臓器および組織を秤量し、２４７０ ＷＩＺＡＲＤ^２自動ガンマ計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射能に関して測定し、崩壊およびバックグラウンドに対する補正を含む、組織１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）をその後計算した。

【0728】

ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）およびＪＭＰ ８（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）を使用して統計解析を行った。次式を使用して、平均腫瘍体積に基づき腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）の曲線解析を行った：

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（式中、ｄは、処置日を示し、０は、ベースライン値を示す）。参照群としてビヒクル（ＰＢＳ）を選択した。腫瘍縮小（ＴＲ）は、次式に従って計算した：

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（式中、正の値は、腫瘍縮小を示し、−１を下回る値は、ベースライン値の二倍を越えた増殖を示す）。

【0729】

ペア毎の検定を行って、いずれの群が生存の観点から有意に異なったかを指定した：ログランク検定（後期の生存事象に重きを置く）およびウィルコクソン検定（初期の生存時間に重きを置く）、両者共に多重検定するためのボンフェローニ補正を使用。

【0730】

被験化合物
記載の試験で利用されている化合物は、下の「二重特異性抗体」、「除去剤」および「放射標識キレート」という見出しの表に提示されている。

【0731】

ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ（ＰＲＩＴ−０２１３）は、ＣＥＡのＴ８４．６６エピトープを標的とする完全ヒト化ＢｓＡｂであり、一方、ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ（ＰＲＩＴ−０１７５）は、ネガティブコントロールとして使用される非ＣＥＡ結合ＢｓＡｂである。Ｐ１ＡＥ１７６６、Ｐ１ＡＥ１７６７、Ｐ１ＡＥ１７６８、Ｐ１ＡＥ１７６９およびＰ１ＡＥ１７７０は、上の実施例２８に記載されている通り、ＣＥＡのＣＨ１Ａ１Ａエピトープを標的とするヒト化ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂである。抗体コンストラクトは、注射日まで−８０℃で貯蔵し、注射日に、解凍し、静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）投与のためのそれら最終のそれぞれの濃度となるよう標準ビヒクルバッファー（２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ６．０）または０．９％ＮａＣｌに希釈した。

【0732】

Ｃａ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００およびＰｂ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡは、注射日まで−２０℃で貯蔵し、注射日に、解凍し、ｉ．ｖ．またはｉ．ｐ．投与のためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）において希釈した。

【0733】

放射標識のためのＤＯＴＡＭキレートは、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓによって提供され、放射標識まで−２０℃で維持された。トリウム発生装置からのＤＯＴＡＭとの溶出により、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを生成し、その後、標識後にＣｕ、Ｃａ、Ｚｎ、ＧｄまたはＰｂによりクエンチした。^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ溶液をＰＢＳまたは０．９％ＮａＣｌで希釈して、ｉ．ｖ．注射のための所望の^２１２Ｐｂ放射能濃度を得た。

【0734】

ビヒクルコントロール群におけるマウスは、ＢｓＡｂ、ＣＡおよび^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの代わりにＰＢＳの複数の注射を受けた。

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【表64】

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【表65】

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【0735】

腫瘍モデル
使用される腫瘍細胞株およびマウスにおける接種のための注射量は、下の表「腫瘍細胞株」に記載されている。ＢｘＰＣ３は、ＣＥＡを天然に発現するヒト初代膵臓腺癌細胞株である。ＢｘＰＣ３細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３００８８．０３）を強化したＲＰＭＩ−１６４０培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ、参照番号７２４００−０２１）において培養した。ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＣＲＬ−１９９７）は、ＣＥＡを天然に発現するヒト膵臓腺癌細胞株である。ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞は、１０％標準ウシ胎仔血清、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ １００×、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（最小必須培地非必須アミノ酸）１００×（Ｇｉｂｃｏ １１１４０−０３５）および１％ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ １１３６０−０７０）を強化したＥＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ３１０９５−０２９）において培養した。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２は、ＣＤ２０を天然に発現するヒトＢ細胞リンパ腫細胞株である。ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２細胞は、１０％ウシ胎仔血清を強化したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、参照番号７２４００−０２１）において培養した。ＮＣＩ−Ｎ８７は、ＨＥＲ２を天然に発現する胃がん細胞株である。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞は、１０％ウシ胎仔血清を強化したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、参照番号７２４００−０２１）において培養した。固形異種移植片は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（増殖因子低下；カタログ番号３５４２３０）と１：１混合したＲＰＭＩまたはＤＭＥＭ培地における細胞の右側腹部への皮下注射により、試験０日目に各ＳＣＩＤマウスにおいて確立した。

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【0736】

試験
実施例３１：腫瘍モデルにおけるＣＥＡ−ＰＲＩＴの有効性（プロトコール１０３）
本試験は、マウスにおけるｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍の処置のためにＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂを使用してＣＥＡ−ＰＲＩＴの有効性を評価した。治療法は、１０もしくは３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭによる単一処置として、または２種の放射能レベルのいずれかのための３回の反復サイクルにおいて投与した。非ＣＥＡ結合コントロール抗体（ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ）、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ単独（放射能なし）および処置なし（ＰＢＳ）を使用したＰＲＩＴとの比較を行った。第１および第２のサイクル後に体内分布検査を行って、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ標的化およびクリアランスを確認し、ＴＧＩ、ＴＲおよび生存の観点から処置有効性を評価した。試験を通してマウスを慎重にモニターして、異なる処置スケジュールの忍容性を評価した。試験概要を図４２に示す。

【0737】

試験設計
プロトコール１０３の経時変化および設計を下の表に示す。

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【0738】

右側腹部へのＲＰＭＩ／Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける５×１０^６個の細胞（継代２４）のｓ．ｃ．注射により、試験０日目に各ＳＣＩＤマウスにおいて固形異種移植片を確立した。腫瘍細胞注射２０日後に、２９０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0739】

ロジスティックな理由により、上の表に記載されている通り初日における群Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｊ、ＫおよびＬのＢｓＡｂまたはＰＢＳ注射、続いて翌日における群Ａ、Ｂ、ＨおよびＩのＢｓＡｂ注射により、２日間の経過中に処置を開始した。４日後に、ＣＡを注射し、続いて２時間後に、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭまたはＰＢＳを注射した。３０または０μＣｉを受ける群が、先ず注射され、続いて翌日、１０μＣｉを受ける群が注射される。群Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、ＫおよびＬは、放射能注射間が２週間で複数の処置を受けた。全ての反復処置サイクル（第２および第３）は、同時に始めた、すなわち、全マウスは、同日にＢｓＡｂまたはＰＢＳ注射を受け、続いて、ＣＡおよび^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭまたはＰＢＳを４日後に受けた。安楽死の時点で群Ａ〜Ｇから次の臓器および組織を採集した：膀胱、卵巣、肝臓、脾臓、腎臓、大腿骨（骨髄を含む）、結腸、空腸、胃および腫瘍。

【0740】

群ＨおよびＪにおけるマウスは、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのそれらの第１のかつ唯一の注射の２４時間後に屠殺し剖検した；群Ｉ、ＫおよびＬは、それらの第２の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射の２４時間後に屠殺し剖検した。安楽死時に放射能測定のために、血液、膀胱、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、尾および腫瘍を採集した。

【0741】

結果
２４時間ｐ．ｉ．の^２１２Ｐｂのｉｎ ｖｉｖｏ分布は、図４３から分かる通り、皮下ＢｘＰＣ３腫瘍における高い取り込みおよび正常組織における低い蓄積を実証した。ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭによってプレターゲティングされた腫瘍および非ＣＥＡ結合ＢｓＡｂ ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭによってプレターゲティングされた腫瘍の間の有意差は、処置の高い特異性を確認した。シダックの多重比較検定による一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、１（５０．３％ＩＤ／ｇ）および２（４３．０％ＩＤ／ｇ）回の１０μＣｉ注射の間にも、１（３７．６％ＩＤ／ｇ）および２（２４．１％ＩＤ／ｇ）回の３０μＣｉ注射の間にも、^２１２Ｐｂの平均腫瘍取込みに有意差がなかったことを示した。同様に、１サイクルの１０μＣｉおよび１サイクルの３０μＣｉの投与の間に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、いずれかのＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ処置と比較したＤＩＧ−ＤＯＴＡＭによりプレターゲティングされた腫瘍における２サイクルの３０μＣｉ（２．９％ＩＤ／ｇ）後の腫瘍取込みと同様に、腫瘍取込みは、２サイクルの１０μＣｉと比較して、２サイクルの３０μＣｉの後に有意により低かった。図４３のパネルＢは、％ＩＤ／ｇが、様々な処置群内で、異なるサイズの腫瘍に関して匹敵したことを示す。

【0742】

平均腫瘍発達および個々の腫瘍増殖曲線をそれぞれ図４４および図４５に示す。２０〜２４日目までに全群がその腫瘍体積を倍加させた。２４日目に第１の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ処置を与え、その後、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ群における腫瘍は、縮み始める前に、およそ１週間増殖し続けた。腫瘍は完全には縮小しなかったが、複数の処置群（ＢおよびＤ）の体積は、５２日目の最後の処置まで相対的に一定のままであった。１０または３０μＣｉのいずれかで１回のみ注射したマウスにおける腫瘍は、４４日目に再増殖を開始したが、より高い放射能受ける腫瘍は、僅かによりゆっくりした増殖速度を有した。ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭを有する非特異的ＰＲＩＴは、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ単独またはビヒクルと比較して、統計的に有意だが限られたＴＧＩをもたらした。２種の後者コントロール群は、同一の腫瘍発達を示した。

【0743】

手段に基づき全処置群を解析することができる最後の日である６３日目に、ＴＧＩは、処置なしと比較して、それぞれ群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦに関して、５７．２、８９．８、７７．７、９６．６、−６．２および６７．３％であった。ビヒクルコントロール群における最後のマウスは、７４日目に相当し、この時点で、ＴＧＩは、それぞれ残っている４群：Ａ、Ｂ、ＣおよびＤに関して４８．５、８３．３、６３．５および９５．７％であった。試験は、最後の残っているマウス（群Ｄ）の安楽死により、細胞注射後１１８日目に終結した。

【0744】

ログランクおよびウィルコクソン検定を行って、いずれの群が生存の観点から有意に異なったか指定し、結果を下の２つの表に示す。全てのＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＰＲＩＴレジメンは、３種のコントロール群と比較して生存を有意に増加させた。全生存は、３サイクルの１０μＣｉ後に、単一の１０μＣｉサイクル後よりも僅かに優れていた（ｐ＝０．０１１０）が、３サイクルの１０μＣｉおよびＣＥＡ−ＤＯＴＡＭプレターゲティングによる３０μＣｉレジメンのいずれかの間に有意差はなかった。カプラン・マイヤー生存曲線を図４６に示す。

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【0745】

有害事象および毒性
倫理的な理由からマウスの屠殺を動機づける観察された有害事象は、２群に選別することができる：１）腫瘍状態および２）放射線誘発毒性。第１の群は、壊死性および／または潰瘍性腫瘍を指し、これは、マウスが、自身のまたはケージ仲間の腫瘍区域を「清潔にする」よう促す。このステージに達したマウスは、苦痛を回避するため直ちに安楽死させた。

【0746】

第２の群の有害事象は、放射線誘発毒性の典型的症状、例えば、ＢＷ減少、下痢および嗜眠を含んだ。図４７は、治療群におけるＢＷ発達を示す。３０μＣｉの_２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した全マウスは、初期ＢＷ降下を経験し、これは、第１の放射能注射後８日目までに軽減された。複数の３０μＣｉ注射を投与した群（ＤおよびＦ）は、より延長したＢＷ減少を患った。ＢＷ減少は、複数の注射であっても、１０μＣｉを受けた群（ＡおよびＢ）において軽度であった。よって、１０および３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを受けたマウスの間に明らかな差が認知された。反復１０μＣｉ処置の後であっても、マウスは、全般に、有害毒性の主要徴候を呈さなかった。１サイクルの３０μＣｉで処置したマウスは、一過性体重減を表したが、回復した。しかし、第２および第３の３０μＣｉサイクルは、より大規模な有害毒性をもたらし、ＢＷ減少ならびに疼痛および／または不快の徴候の組合せにより、多数の動物を屠殺させた。このことから、１０μＣｉが、適用される条件下で、安全な放射能レベルである一方、３０μＣｉが、最大耐容放射能に近づいていると結論付けることができる。

【0747】

結論
本出願人らは、単剤療法レジメンとして与えると、反復ＣＥＡ−ＰＲＩＴと１０または３０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭが、生存およびＴＧＩの有意な増加をもたらしたが、この設定において、完全腫瘍根絶も持続性腫瘍制御ももたらさなかったと結論付ける。経時的な腫瘍制御を維持しつつ放射線誘発毒性を回避するために、これらの結果は、３０μＣｉ未満だが１０μＣｉを超える^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの使用を示唆する。

【0748】

実施例３２：ＣＥＡ−ＰＲＩＴのためのＢｓＡｂおよびＣＡ注射間の適切な時間の選択（プロトコール１１６および１２１）
プロトコール１１６および１２１は、高い腫瘍取込みおよび均一な腫瘍内ＢｓＡｂ分布に基づいて、ＣＥＡ−ＰＲＩＴのためのＢｓＡｂおよびＣＡ注射間の適切な時間の選択をガイドするように設計した。プロトコール１１６は、免疫蛍光染色によって検出される、ｉ．ｖ．注射後４、７および１４日目に、ＢｘＰＣ３モデルにおけるＣＥＡ発現と比較して腫瘍内ＢｓＡｂ分布を評価した。プロトコール１２１は、１、４、７および１０日後のＢｘＰＣ３腫瘍における、鉛−２０３（^２０３Ｐｂ）で直接的に標識したＢｓＡｂの蓄積を評価した。ＢｓＡｂは、^２１２Ｐｂ（半減期１０．６時間）と比較してより長い期間にわたり発達を追跡することができるように、Ｐｂ同位体^２０３Ｐｂ（半減期２．２日間）で標識した。

【0749】

試験設計
プロトコール１１６および１２１の経時変化および設計を下の４つの表に示す。

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【0750】

固形異種移植片は、ＢｘＰＣ３細胞のｓ．ｃ．注射により確立した。接種１９日後に、プロトコール１１６におけるマウスは、２２７ｍｍ^３の平均腫瘍体積により実験群へと選別した。プロトコール１２１において、平均腫瘍体積は、２０日後に２０３ｍｍ^３であった。

【0751】

免疫蛍光染色
プロトコール１１６におけるマウスを安楽死の後に剖検し、脾臓、腎臓、肝臓、筋肉および腫瘍を採集した。収集された組織を２つの小片に分割した：一方は、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）最適切削温度（ＯＣＴ）包埋化合物を含有する凍結用の型（cryomold）に入れ、急速凍結のためにドライアイスの上に置き、他方は、１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で２４時間固定し、次いで、パラフィン包埋まで貯蔵のためにＰＢＳに移した。ＯＣＴ中の凍結した試料は、切片作製まで−８０℃で維持した。下表に収載されている試薬を使用して、組織学的染色を行った。

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【0752】

ＣＥＡの染色
凍結した腫瘍は、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０ ＵＶクライオトーム（cryotome）を使用して、１２μｍスライスとなるよう切片作製し、−２０℃でスライドを貯蔵した。染色前に、スライドを１時間室温（ＲＴ）で解凍し、次いで、ＰＢＳ（１×、ｐＨ７．４）で５分間、続いて冷アセトン（−２０℃）において５分間、もう一度ＰＢＳで５分間洗浄した。紙片を組織の周りに置いてスライドを乾燥させ、疎水性のペン（Ｄａｋｏ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して組織を囲むように丸を描いた。１時間ＲＴにおいて、４００μＬのブロッキング血清（ヤギ）と共に切片のインキュベーションを行った。ブロッキング血清を除去し、２００μＬの一次抗体（ウサギＩｇＧ抗ヒトＣＥＡ）を切片に添加し、続いて暗くしたチャンバー内で一晩４℃でインキュベーションした。２日目に、切片を１０分間ＰＢＳで２回洗浄し、４００μＬのブロッキング血清を添加した。１時間ＲＴにおけるインキュベーション後に、ブロッキング血清を除去し、２００μＬの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ）および対比染色（ヘキスト）を切片に添加し、続いて暗くしたチャンバー内で２時間ＲＴでインキュベーションした。次に、スライドを１０分間ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、蛍光マウント用培地（Ｄａｋｏ Ｓ３０２３；Ａｇｉｌｅｎｔ）およびカバーガラスをスライドに加え、その後これを風乾させ、−２０℃の暗所に貯蔵した。染色したスライドの解析は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ．Ａ１モジュラー顕微鏡を使用して行った。

【0753】

ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭの染色
凍結した腫瘍切片は、一次抗体の代わりにＰＢＳを用いた以外は上のＣＥＡ染色について記載されている通りに、貯蔵および処理した。二次抗体は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧであった。

【0754】

Ｈ＆Ｅ染色
プロトコール１１６由来の凍結した腫瘍切片のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、Ｌｅｉｃａ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ ＸＬ自動スライド染色装置を使用して行った。

【0755】

体内分布
プロトコール１２１におけるマウスは、体内分布を調べる目的のため屠殺し、終結前に後眼窩出血によりその血液を収集した。加えて、膀胱、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、胃、肝臓、肺、心臓、脳、大腿骨、筋肉、皮膚、尾および腫瘍を安楽死後に採集し、放射能に関して測定した。

【0756】

結果
免疫蛍光染色 − プロトコール１１６
未処置コントロールは、収集した腫瘍に均一に分布した高レベルのＣＥＡを呈した。ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂのコントロール染色は、予想通りシグナルをもたらさなかった。

【0757】

ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂを注射したマウス由来の腫瘍を４、７および１４日ｐ．ｉ．に採取した。４日目に、ＢｓＡｂは、組織内の腫瘍細胞小結節の境界を完全に覆っていたが、より大きい小結節には完全に浸透した訳ではなかった。これは、明るく赤色の境界にある細胞層に囲まれた、より暗いヘキスト染色区域の存在によって示される。７日後に、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ染色由来のシグナルは、より均一に分布しているように見え、暗い内部区域を有するより少ない腫瘍細胞構造が存在した。１週間後、１４日ｐ．ｉ．に、蛍光シグナルの分布は、７日間時点と同様のままであったが、全体的により低いシグナルであった。

【0758】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの照射を含む全ＰＲＩＴサイクルを投与した２群由来の腫瘍試料は、放射線誘発性細胞死による壊死区域を呈した。知見は、細胞膨張、細胞細部の喪失（ゴースト細胞）、一部の核非定型性（nuclear atypia）、および間質性線維症の潜在的増加を含んだ。第１のＢｓＡｂ注射の２週間後にＣＥＡ−ＤＯＴＡＭの第２の用量を受けた群Ｆにおけるマウス由来の腫瘍は、高く均一なＣＥＡ発現を保持し、第２のＢｓＡｂ注射の４日間後のＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ分布は、非照射腫瘍のものに似ていた、すなわち、ＢｓＡｂは、腫瘍の全てのＣＥＡ発現部分に分布したが、ある特定のより大きい構造への浸透は限られており、画像上により暗い区域をもたらした。対応するコントロール試料は、初期ＰＲＩＴサイクル後に第２のＢｓＡｂ注射を受けなかった群Ｇから同時に取得した。これらの腫瘍切片において、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ染色に微かなシグナルを観察することができ、ある量のＢｓＡｂが、注射１８日後に依然として腫瘍結合性であったことを示す。

【0759】

体内分布 − プロトコール１２１
ＢｘＰＣ３腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける平均^２０３Ｐｂ蓄積およびクリアランスを図４８に示す。ＣＡの助けなしの抗体から予想される通り、血液クリアランスはゆっくりであった。正常臓器または組織において、標識ＢｓＡｂの予想外の取り込みがないことが明らかになった。注射１日後の４９％ＩＤ／ｇの平均から開始し、それぞれ４、７および１０日目に１３０、１８９および１９７％ＩＤ／ｇへと増加する、経時的な腫瘍蓄積を図４９に示す。標識ネガティブコントロールは、注射後４日目に３％ＩＤ／ｇにより、腫瘍蓄積をもたらさなかった。

【0760】

シダックの多重比較検定を使用した一方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計解析を行って、異なる時点での腫瘍取込みにおける認知される差が有意であったか評価した。検定によると、有意な^２０３Ｐｂ蓄積増加は、１および７日目、ならびに１および１０日目の間でのみ達成された；他の時点は互いに有意に異ならなかった。独立ｔ検定を使用した単なる４対７日間の検定は、７日間に統計的に有意な増加をもたらし（ｐ＝０．０４６８）、一方、７対１０日間に対応する検定を行っても、有意な増加は見られなかった（ｐ＝０．８３１６）。

【0761】

結論
結果は、注射４および７日後の間で腫瘍における２０３Ｐｂ−ＢｓＡｂ取り込みの全体的な増加を示したが、時間間隔を１０日間に拡張した場合に、さらなる改善は達成されなかった。顕微鏡下で、腫瘍へのＢｓＡｂ浸透は、４日後と比較して、７日後に改善された。１４日時点での利益は見られず、この時点までに、全体的な蛍光シグナルは、腫瘍内分布を改善することなく、減少するように思われる。本試験は、４日間よりも、７日間のＢｓＡｂ−ＣＡ時間間隔を選ぶことを支持する。

【0762】

実施例３３：体内分布（腫瘍および正常組織への吸収放射線量の推定のための、ｉｎ ｖｉｖｏ ^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ分布データ）（プロトコール１４６）
プロトコール１４６は、ｓ．ｃ．ＢｘＰＣ３腫瘍を保有するＳＣＩＤマウスにおける、腫瘍および正常組織への吸収放射線量の推定のために、ＰＲＩＴ後のｉｎ ｖｉｖｏ ^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ分布データをもたらすように設計した。Ｃａを使用して^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのクエンチングを行った（実施例３４を参照）。

【0763】

ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂ、続いて７日後、ＣＡの注射により、プレターゲティングを行った。２４時間後に、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを投与した。放射能注射５分後から４８時間後の複数の時点で、マウスの群を屠殺し、放射能測定のために血液および臓器を採集した。代謝ケージの使用により、選択された時点で排泄物をサンプリングして、放射能化合物の排泄率を評価した。その結果生じる時間−放射能曲線を使用した確立された方法により、吸収線量を最後に計算した。

【0764】

試験設計
プロトコール１４６の経時変化および設計を下の２つの表に示す。

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【0765】

固形異種移植片は、８週齢ＳＣＩＤマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）へのＢｘＰＣ３細胞のｓ．ｃ．注射により確立した。接種２８日後に、３１０ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。

【0766】

群ＥおよびＦにおけるマウスは、焼却処理した床の代謝ケージ内に、個々に収容した（すなわち、１ケージにつき１匹のマウス）。放射能注射２、６および２４時間後に、各ケージから尿および糞便を収集し、放射能に関して個々の試料をその後測定した。群Ｆにおけるマウスは、２４時間ｐ．ｉ．に通常ケージに移した。

【0767】

終結前に後眼窩出血により全マウスから血液／血清を収集した。安楽死の後に、放射能測定および％ＩＤ／ｇの計算のため、次の追加的な臓器および組織を採集した：膀胱、子宮、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、胃、肝臓、肺、心臓、脳、大腿骨、皮膚、筋肉、腹部脂肪、尾および腫瘍。

【0768】

照射線量測定
医療内部被ばく線量（Medical Internal Radiation dose）（ＭＩＲＤ）委員会のパンフレット２１号（Ｂｏｌｃｈ ＷＥ、Ｅｃｋｅｒｍａｎ ＫＦ、Ｓｇｏｕｒｏｓ ＧおよびＴｈｏｍａｓ ＳＲ． Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００９；５０：４７７〜４８４）に概要が述べられている形式に従って、吸収線量を計算した。公式には、標的組織または領域ｒ_Ｔにおける吸収線量Ｄ（ｒ_Ｔ）は、全ての供給源領域ｒ_Ｓを合計した、単位放射能あたりの吸収線量率Ｓ（ｒ_Ｔ←ｒ_Ｓ）を乗じた、放射能Ａ（ｒ_Ｓ，ｔ）の時間積分として計算される。^２１２Ｐｂ崩壊系列によって放出された圧倒的多数のエネルギーが、アルファ線に由来し、さらに、アルファ線のはるかにより高い生物学的有効性（相対生物学的有効性、ＲＢＥによって特徴づけられる通り）によると仮定すると、次の２つの見積もりが得られた：
１．エネルギーは、アルファ粒子の短い範囲により、局所的に吸収され、これは、項Ｓ（ｒ_Ｔ←ｒ_Ｔ）のみが考慮されることを意味し、
２．ベータおよびガンマ線からの寄与が無視される。

【0769】

アルファ崩壊によって放出されるエネルギー、またはむしろ、ここで単位Ｊ／(μＣｉ・ｈ)で表現される^２１２Ｐｂの崩壊系列におけるアルファ崩壊によって放出される平均エネルギーの和であるΔαにより、標的組織または領域ｒ_Ｔにおける吸収線量は、次式によって計算される：

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【0770】

計算は、［％ＩＤ／ｇ］_ｔとして表現される、時間ｔにおける複合（平均）崩壊補正放射能濃度に基づく。第１のステップにおいて、これは、標的組織ｒ_Ｔに関する組織重量１ｋｇあたりのμＣｉとしての放射能濃度へと転換される：

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Ａ_０［μＣｉ］は、注射された放射能であり、λは、^２１２Ｐｂの指数関数的崩壊速度０．０６５１ｈ^-１（１０．６時間の半減期に対応）である。

【0771】

第２のステップにおいて、放射能濃度は、組織毎に時間について積分された。これは、薬物動態ソフトウェアＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ ６．４（Ｃｅｒｔａｒａ ＵＳＡ、Ｉｎｃ．、米国０８５４０ニュージャージー州プリンストン、スイート１０１、１００オーバールックセンター（100 Overlook Center, Suite 101））における「線形対数台形計算方法」を使用して達成された。モデルタイプ「Ｐｌａｓｍａ」を均一重み付けにより使用した。

【0772】

最終ステップにおいて、放射能濃度の時間積分に、エネルギー放出Δα＝１７０・１０^−６Ｊ／(μＣｉ・ｈ)を乗じることにより、吸収線量を計算した。その上、ＭＩＲＤパンフレット２２号（Ｓｇｏｕｒｏｓ Ｇ、Ｒｏｅｓｋｅ ＪＣ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ ＭＲら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２０１０；５１：３１１〜３２８）に示唆される通り、５のＲＢＥを使用して、ＲＢＥ重み付け吸収線量を計算した。

【0773】

結果
体内分布
腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける平均^２１２Ｐｂ蓄積およびクリアランスを図５０に示す。放射能蓄積は、腫瘍において高く、既に注射５分後に１７％ＩＤ／ｇであり、６時間ｐ．ｉ．までに４０％超に増加し、当該レベルで少なくとも４８時間残っていた。腫瘍がない状態と比較して、正常組織において、大きな差は発見されなかった。

【0774】

吸収線量
プロトコール１４６のために計算されたＧｙ単位の平均吸収線量を表２４に、絶対値として（ＲＢＥ＝１）、およびアルファ放射体のより高い細胞毒性に対する補正して（ＲＢＥ＝５）の両方で示す。ＳＣＩＤマウスに関して、平均体重は、１８．５ｇであった；２０μＣｉの注射された^２１２Ｐｂ放射能により、これは、１．１μＣｉ／ｇ体重の正規化された注射された放射能をもたらした。

【0775】

およそ２０Ｇｙの吸収線量が、腫瘍において達成されたが、吸収線量は、膀胱を除いた大部分の正常組織において２Ｇｙをはるかに下回ったままであった。膀胱における^２１２Ｐｂ含有量は、個々のマウスの間で有意に異なり、この組織に対する高い可変性を示す。ＲＢＥ補正された線量を提供して、外部ガンマ線を使用した放射線療法との比較を可能にし、注射した^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの２０μＣｉあたりおよそ１００Ｇｙの腫瘍への推定吸収線量をもたらした。

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【0776】

結論
およそ２０Ｇｙの吸収線量が、腫瘍において達成されたが、大部分の正常組織における吸収線量は、２Ｇｙをはるかに下回ったままであった。全体的に見て、本試験は、評価されるＰＲＩＴレジメンを使用した、用量規制毒性の主要リスクを示さなかった。

【0777】

実施例３４：非キレート化ＤＯＴＡＭのクエンチング（プロトコール１３１）
アルファ放射体^２１２Ｐｂは、トリウム含有樹脂からの溶出後にＤＯＴＡＭにキレート化され、薬理学的に活性な^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを産生する。放射標識後に、過剰（＞９９％）な遊離非キレート化ＤＯＴＡＭが、溶液中に残り、環境から金属イオンを容易に捕捉する。患者への注射後に、これは、循環中のＣａ^２＋に急速に結合し、薬理学的に不活性なＣａ−ＤＯＴＡＭを形成するであろう。ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂは、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭに優先的に結合するように設計されているが、匹敵する程度でＣａ−ＤＯＴＡＭとも安定した複合体を形成するであろう。結果として、プレターゲティングされた腫瘍部位からの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのブロックが、飽和条件で起こり得、ＰＲＩＴ処置の有効性を潜在的に減少させる。したがって、潜在的な競合を回避するために、クエンチングステップが、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ溶出プロセスに加えられ、それによると、金属イオン（「Ｘ」）が、有意により高い解離定数（Ｋｄ）を有する「Ｘ−ＤＯＴＡＭ」の形成を制御するために導入される。ＫｉｎＥｘＡ（動力学排除アッセイ）平衡測定によって決定される、様々なＸ−ＤＯＴＡＭキレートに対するＤＯＴＡＭ結合剤の親和性を下表に示す。

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【0778】

クエンチングにための初期選択は、Ｃｕであったため、非キレート化ＤＯＴＡＭをクエンチされた非競合Ｃｕ−ＤＯＴＡＭに置き換え、この条件を使用してＣＥＡ−ＰＲＩＴプログラム内の多数の試験を実行した。しかし、Ｃｕ−ＤＯＴＡＭ複合体が、実際には、ｉｎ ｖｉｖｏで安定していなかったことが後に発見され、試験を行って、ヒトおよびマウスの血清、血漿および血液において、代替クエンチングイオンと比較してその安定性を評価した。選択されたイオンは、一方では、同様の親和性を有するＰｂおよびＣａであり、他方では、有意により低い親和性を有するＺｎおよびＣｕであった。本試験は、３５分ｐ．ｉ．における自発的Ｃａ−ＤＯＴＡＭ形成によって測定される、ヒトおよびマウス血液における、Ｃｕ−ＤＯＴＡＭと比較してＺｎ−ＤＯＴＡＭの有意により高い安定性を実証し、Ｚｎ−ＤＯＴＡＭの０％および０％、ならびにＰｂ−ＤＯＴＡＭの４％および４％と比較して、初期に注射されたＣｕ−ＤＯＴＡＭに関して、それぞれマウスおよびヒトの血液においておよそ２５％および３０％に達した。

【0779】

プロトコール１３１は、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＯＴＡＭクエンチング候補金属を評価し、ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭによるプレターゲティングおよびＰｂ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００による除去後の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの腫瘍および正常組織蓄積におけるその効果を比較するように設計した。ＤＯＴＡＭとの合理的なｉｎ ｖｉｔｒｏ複合体安定性を有するＺｎおよびＧｄを、Ｃｕとのサイド・バイ・サイドで評価した。加えて、Ｃａおよび安定Ｐｂをコントロールとして使用した。試験概要を図５１に示す。

【0780】

プロトコール１３１の経時変化および設計を下の２つの表に示す。

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【0781】

固形異種移植片は、５〜７週齢ＳＣＩＤマウスの右側腹部へのＢｘＰＣ３細胞のｓ．ｃ．注射により確立した。腫瘍細胞注射１８日後に、２００ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。接種後２６日目に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射し、このポイントで、平均腫瘍体積は３５０ｍｍ^３であった。

【0782】

表「プロトコール１３１における試験群」および図５１に従ったｉ．ｖ．投与のために１００μＬあたり１００μｇの最終濃度となるよう、２０ｍＭ Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において抗体を希釈した。ＢｓＡｂ注射７日後に、ＣＡを解凍し、ｉ．ｖ．投与のために１００μＬあたり２５μｇの最終濃度となるようＰＢＳにおいて希釈した。さらに２４時間後、５種の異なる金属のいずれかを使用してクエンチされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭをｉ．ｖ．注射した（１００μＬ ０．９％ＮａＣｌにおける１０μＣｉ）。

【0783】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射２時間後に、体内分布を調べる目的のためにマウスを屠殺し、次の組織および臓器を採集した：血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾および腫瘍。

【0784】

結果
^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射２時間後の全ての収集された組織における平均^２１２Ｐｂ蓄積およびクリアランスを図５２に示す。Ｐｂコントロールと比較して、クエンチング金属のいずれかの間の平均％ＩＤ／ｇに統計的有意差はなかった（ダネットの多重比較検定による二方向ＡＮＯＶＡ）。腫瘍および選択された正常組織の個々の値を図５３に示す。^２１２Ｐｂ含有量におけるより大きい個々の差異が、他の金属と比較して、ＺｎおよびＧｄによるクエンチング後の脾臓および筋肉において観察されたが、異なる処置群の間の平均％ＩＤ／ｇにおける差は、有意でなかった（チューキーの多重比較検定による一方向ＡＮＯＶＡ）。

【0785】

結論
プロトコール１３１は、Ｃａ−またはＰｂ−クエンチングと比較して、ＤＯＴＡＭのＺｎ−、Ｇｄ−またはＣｕ−クエンチングからの、プレターゲティングされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの腫瘍および正常組織蓄積における効果を評価した。^２１２Ｐｂの腫瘍取込みにおける差は観察されず、適用された実験条件下でコントロールＣａおよびＰｂを使用して、プレターゲティングされた結合部位の有意なブロックがないことを示す。ＺｎおよびＧｄによるクエンチング後に、脾臓および筋肉における^２１２Ｐｂ含有量の差異増加が観察され、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭと競合する金属−ＤＯＴＡＭ複合体が、非標的化組織における非ＣＡ結合ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭの中和に寄与し得ることを示す。Ｃｕによるクエンチングは、Ｃａクエンチングに匹敵する結果をもたらし、示されたＣｕ−ＤＯＴＡＭのｉｎ ｖｉｖｏ不安定性をさらに確認する。３つの主要な理由により、ＤＯＴＡＭのクエンチングのためにＣａを最終的に選んだ：Ｃｕクエンチングと比較した、^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ溶液のｉｎ ｖｉｖｏ製剤の制御増加；^２１２Ｐｂの正常組織取り込みにおける可変性を低下させる、非ＣＡ結合ＢｓＡｂの中和を増大させる潜在力；および亜飽和条件下で容易に到達可能な標的への即時結合により、抗原に対し高い親和性を有する分子の浸透が制限される、仮定上の「結合部位障壁」現象の効果を低下させる潜在力。

【0786】

実施例３５：ＰＲＩＴのためのＣＤ２０−ＤＯＴＡＭおよびＨＥＲ２−ＤＯＴＡＭの評価（プロトコール１５１および１５２）
プロトコール１５１および１５２は、それぞれ完全ヒト化ＢｓＡｂのＣＤ２０−ＤＯＴＡＭおよびＨＥＲ２−ＤＯＴＡＭによってプレターゲティングされたマウスにおける皮下腫瘍への^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの結合を評価することを目標とした。抗体コンストラクト、続いて７日間後にＣａ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡ、最後に２４時間後に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射により、３段階ＰＲＩＴを行った。放射能注射２４時間後にマウスを屠殺し、放射能測定のために血液および臓器を採集した。

【0787】

試験設計
プロトコール１５１および１５２の経時変化および設計を次の４つの表に示す。

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【0788】

固形異種移植片は、プロトコール１５１において、ＤＭＥＭ培地におけるＣＤ２０発現ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２ヒトＢ細胞リンパ腫細胞の、９週齢ＳＣＩＤマウスへのｓ．ｃ．注射により確立した。腫瘍細胞注射４日後に、１０５ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。接種後１３日目に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射し、このポイントで、平均腫瘍体積は２４２ｍｍ^３であった。

【0789】

プロトコール１５２において、１０週齢ＳＣＩＤマウスに、ＲＰＭＩ１６４０培地におけるＨＥＲ２発現ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃癌細胞のｓ．ｃ．注射により異種移植した。腫瘍細胞注射１４日後に、７４ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。接種後２２日目に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した；２１日目に平均腫瘍体積は６１ｍｍ^３であった。

【0790】

放射能注射２４時間後に、体内分布検査マウスを屠殺した。麻酔下で後眼窩出血により終結前に血液を収集した。安楽死の後に全マウスを剖検し、皮膚、膀胱、胃、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、尾および腫瘍の追加的な収集を行った。

【0791】

結果
体内分布 − プロトコール１５１
注射２４時間後の全ての収集された組織における平均^２１２Ｐｂ含有量を図５４に示す。ネガティブコントロールＢｓＡｂ ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭは、ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍に放射能蓄積を生じなかったが（０．４±０．３％ＩＤ／ｇ）、ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂは、２５．０±３．７％ＩＤ／ｇをもたらした。膀胱（１２．５±４．５％ＩＤ／ｇ）、腎臓（３．１±０．３％ＩＤ／ｇ）および肺（２．２±０．２％ＩＤ／ｇ）を除いて、正常組織／臓器に有意な^２１２Ｐｂ取り込みは見られなかった。

【0792】

体内分布 − プロトコール１５２
注射２４時間後の全ての収集された組織における平均^２１２Ｐｂ含有量を図５５に示す。ネガティブコントロールＢｓＡｂ ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭは、ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍に放射能蓄積を生じなかったが（０．８±０．４％ＩＤ／ｇ）、ＨＥＲ２−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂは、２４．６±１．５％ＩＤ／ｇをもたらした。非常に低い値の腎臓（１．６±０．１％ＩＤ／ｇ）および肺（１．４±０．２％ＩＤ／ｇ）を除いて、正常組織／臓器に有意な^２１２Ｐｂ取り込みは見られなかった。

【0793】

結論
プロトコール１５１および１５２の結果は、ＣＥＡ−ＰＲＩＴのために開発された３段階プレターゲティング手法を使用した、ＣＤ２０−ＰＲＩＴおよびＨＥＲ２−ＰＲＩＴの特異的標的化およびｉｎ ｖｉｖｏ概念実証を実証した。

【0794】

実施例３６：他の形式のためのｉｎ ｖｉｖｏ分布および腫瘍蓄積データ（プロトコール１５４）
プロトコール１５４は、ＰＲＩＴのための５種の新規ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂコンストラクトの使用を評価することを目標とした。本プロトコールは、皮下ＨＰＡＦ−ＩＩ異種移植片を保有するＳＣＩＤマウスにおける^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭのｉｎ ｖｉｖｏ分布および腫瘍蓄積データをもたらすように設計された。ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭコンストラクト、続いて７日後にＣａ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡ、最後にＣＡの２４時間後に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射により、３段階ＰＲＩＴを行った。放射能注射６時間後にマウスを屠殺し、放射能測定のために血液および臓器を採集した。標準ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂおよび非ＣＥＡ結合ＢｓＡｂを使用したＰＲＩＴとの比較を行った。試験概要を図５６に示す。

【0795】

試験設計
プロトコール１５４の経時変化および設計を下の２つの表に示す。

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【0796】

固形異種移植片は、９週齢マウスの右側腹部へのＨＰＡＦ−ＩＩ細胞のｓ．ｃ．注射により確立した。腫瘍細胞注射１１日後に、７９ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。接種後２０日目に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射し、このポイントで、平均腫瘍体積は２３０ｍｍ^３であった。

【0797】

表「プロトコール１５４における試験群」および図５６に従ったｉ．ｖ．投与のために１００μＬあたり１００μｇの最終濃度となるように、２０ｍＭ Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において全ての抗体を希釈した。ＢｓＡｂ注射７日後に、ＣＡを解凍し、ｉ．ｖ．投与のために１００μＬあたり２５μｇの最終濃度となるようにＰＢＳにおいて希釈した。さらに２４時間後、Ｃａによりクエンチされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭをｉ．ｖ．注射した（１００μＬ ０．９％ＮａＣｌにおける１０μＣｉ）。

【0798】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの注射６時間後に、体内分布を調べる目的のためにマウスを屠殺し、次の組織および臓器を採集した：血液、皮膚、膀胱、胃、小腸、結腸、脾臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、心臓、大腿骨、筋肉、脳、尾および腫瘍。

【0799】

結果
注射６時間後の全ての収集された組織における平均^２１２Ｐｂ蓄積およびクリアランスを図５７に示す。血液含有量および腫瘍蓄積を図５８にさらに詳細に示す。ネガティブコントロールＢｓＡｂ ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭは、腫瘍における放射能蓄積を生じなかったが（１．４±０．１％ＩＤ／ｇ）、標準ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂは、３６．８±３．４％ＩＤ／ｇをもたらした。新規コンストラクトに関して、対応する数値は、３１．８±３．１％ＩＤ／ｇ（Ｐ１ＡＥ１７６６）、３５．０±８．５％ＩＤ／ｇ（Ｐ１ＡＥ１７６７）、１４．２±６．７％ＩＤ／ｇ（Ｐ１ＡＥ１７６８）、３８．８±１０．１％ＩＤ／ｇ（Ｐ１ＡＥ１７６９）および３９．５±６．８％ＩＤ／ｇ（Ｐ１ＡＥ１７７０）であった。Ｐ１ＡＥ１７６８の有意により低い腫瘍蓄積は、この抗体コンストラクトのＣＥＡ一価性によって説明することができる。

【0800】

放射能が、このＰＲＩＴレジメンのための６時間ｐ．ｉ．で一般に見られるレベルに達した膀胱を除いて、正常組織／臓器に有意な^２１２Ｐｂ取り込みは見られなかった。

【0801】

結論
本試験の結果は、３段階ＰＲＩＴのために全ての被験ＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ抗体コンストラクト（Ｐ１ＡＥ１７６６、Ｐ１ＡＥ１７６７、Ｐ１ＡＥ１７６８、Ｐ１ＡＥ１７６９およびＰ１ＡＥ１７７０）のｉｎ ｖｉｖｏ概念実証を実証した。

【0802】

実施例３７：ＣＤ２０−ＰＲＩＴ有効性（プロトコール１６２）
本試験の目標は、代替標的：表面抗原分類２０（ＣＤ２０）に対して作製されたＣＥＡ−ＰＲＩＴのために開発された処置レジメンの概念実証を示すことであった。皮下ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２腫瘍を有するマウスにおける３サイクルのＣＤ２０−ＰＲＩＴの後に、治療有効性を評価した。次のものとの比較も行った：注射前に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭとプレインキュベートしたＢｓＡｂを使用した１段階ＣＤ２０−ＲＩＴ；ＣＤ２０に対して作製されたＩ型モノクローナル抗体であるリツキシマブ、およびＣＤ２０＋疾患の処置における参照；ならびに同様にＣＤ２０に対して作製されたＩＩ型モノクローナル抗体であるＧＡ１０１。

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【0803】

図５９に図示されている実験スケジュールに従って動物を処置した。固形ＷＳＵ−ＤＬＣＬ２異種移植片は、右側腹部への１．５×１０^５個の細胞の皮下注射により、８週齢ＳＣＩＤマウスにおいて試験０日目に確立した。腫瘍細胞注射７日後に、１４４ｍｍ^３の平均腫瘍体積により、マウスを実験群へと選別した。接種後１５日目に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭを注射した；平均腫瘍体積は１４日目に３０６ｍｍ^３であった。

【0804】

群Ａ〜Ｇにおけるマウスを追跡して、処置の有効性を評価した。ＰＲＩＴのため、投与された放射能は、１サイクルあたり２０μＣｉであったが、１段階ＲＩＴのための対応する放射能は、このレジメンを使用した血液および正常組織におけるより長い保持時間に続く急性放射線誘発毒性を回避するために、１０μＣｉであった。

【0805】

^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭまたは^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＢｓＡｂのそれらの第１のかつ唯一の注射の２４時間後に、群Ｈ、ＩおよびＬにおけるマウスを屠殺し、体内分布を調べる目的のため剖検した；群ＪおよびＫは、それぞれそれらの第２および第３の^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ注射の２４時間後に屠殺し剖検した。これらのマウスから次の臓器および組織を採集した：血液、膀胱、脾臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、尾、皮膚および腫瘍。収集された試料を秤量し、次いで２４７０ ＷＩＺＡＲＤ^２自動ガンマ計数器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して放射能に関して測定し、崩壊およびバックグラウンドに対する補正を含む、組織１グラムあたりのパーセント注射用量（％ＩＤ／ｇ）をその後計算した。

【0806】

ＰＲＩＴのため、ｉ．ｐ．投与のために２００μＬあたり１００μｇの最終濃度となるように、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）においてＣＥＡ−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂまたはＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ（ネガティブコントロールＢｓＡｂ）のいずれかを希釈した。ＢｓＡｂ注射７日後に、Ｃａ−ＤＯＴＡＭ−デキストラン−５００ ＣＡをｉ．ｐ．投与し（２００μＬあたり２５μｇ）、続いて２４時間後、Ｃａクエンチされた^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ（１００μＬにおける２０μＣｉ）を投与した。

【0807】

１段階ＲＩＴで処置したマウスは、ｉ．ｖ．注射（１００μＬの０．９％ＮａＣｌにおける２０μＣｉ／２０μｇ ＢｓＡｂ）前に^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭをＣＤ２０−ＤＯＴＡＭ ＢｓＡｂと共に１０分間３７℃でインキュベートすることにより調製された、予め結合した^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭを受けた。

【0808】

リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））またはＧＡ１０１（オビヌツズマブ）で処置したマウスは、２００μＬにおける６００μｇの最終濃度となるように２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）において希釈したそれぞれの抗体をｉ．ｖ．注射した。ＰＲＩＴおよびＲＩＴ処置群のための放射能注射と同日に注射を行った。

【0809】

予備的結果、１６２
本試験は、本実施例の執筆時にまだ進行中であるが、それ相応の予備的結果を報告することができる：
注射２４時間後の全ての収集された組織における平均^２１２Ｐｂ蓄積およびクリアランスを第１の処置サイクルに関して図６０に示す。ネガティブＰＲＩＴコントロールは、腫瘍における取り込みをもたらさなかった（０．７％ＩＤ／ｇ）。腫瘍取込みは、ＣＤ２０−ＰＲＩＴおよびＣＤ２０−ＲＩＴの両方に関して２２％ＩＤ／ｇであった。

【0810】

評価される処置に関する平均腫瘍発達を図６１に示す。非処置ビヒクル群、ＤＩＧ−ＤＯＴＡＭ群および抗体ベースの処置群における腫瘍は、着実に増殖した。対照的に、ＣＤ２０−ＲＩＴおよびＣＤ２０−ＰＲＩＴ群における腫瘍は、第１の処置サイクル後にサイズが減少した。

【0811】

全ての治療群におけるＢＷ発達を図６２に示す。２０μＣｉの^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭの複数の注射は、良好な耐容性を示したが、１０μＣｉの予め結合した^２１２Ｐｂ−ＤＯＴＡＭ−ＣＤ２０−ＤＯＴＡＭは、ＢＷの有意な降下をもたらした。

【0812】

概要および結論
本試験は、ＣＥＡ−ＰＲＩＴのために以前に実証されたものに匹敵する腫瘍増殖阻害の指標により、ＣＤ２０−ＰＲＩＴの概念実証を示した。ＣＤ２０−ＰＲＩＴ処置は、良好な耐容性を示し、これは、１段階ＣＤ２０−ＲＩＴ処置には当てはまらなかった。

【0813】

本発明のさらなる実施形態
以下の番号付きの陳述は、本発明のある特定のさらなる態様および実施形態である。

【0814】

１．ＤＯＴＡＭ−鉛（Ｐｂ）キレートに特異的な抗原結合部位を含む抗体であって、前記抗原結合部位が、少なくとも、
ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、または配列番号２中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＰｈｅ５０、Ａｓｐ５６、およびＴｙｒ５８を含まず、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／もしくはＡｒｇ５４も含まない、そのバリアント；
ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、または配列番号３中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、必要に応じて、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、および／もしくはＰｒｏ１００Ｅも含まない、ならびに／または必要に応じて、Ｔｙｒ９９も含まない、そのバリアント；
ｃ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、または配列番号４中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＴｙｒ２８およびＡｓｐ３２を含まない、そのバリアント；
ｄ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または配列番号６中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよびＴｙｒ９６を含まない、そのバリアント
を含み、
番号付けが、カバットによるものである、抗体。

【0815】

２．重鎖ＣＤＲ１と軽鎖ＣＤＲ２とをさらに含む、段落１に記載の抗体。

【0816】

３．ｉ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１もしくは配列番号１中に１、２、もしくは３個までの置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント；および／または
ｉｉ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２もしくは配列番号５中に少なくとも１、２、もしくは３個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント
を含む、段落２に記載の抗体。

【0817】

４．抗原結合部位が、
ａ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１
ｂ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＷＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２
ｃ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３
ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２
ｆ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、段落１から３のいずれかに記載の抗体。

【0818】

５．ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体；または
ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する抗体
と、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートの、同じエピトープ、または重複するエピトープに結合する、段落１から４のいずれか１つに記載の抗体。

【0819】

６．ヒト、キメラまたはヒト化されたものである、段落１から５のいずれか１つに記載の抗体。

【0820】

７．抗原結合部位が、配列番号７および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号７もしくは配列番号９に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、段落１から６のいずれか１つに記載の抗体。

【0821】

８．抗原結合部位が、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号８もしくは配列番号１０に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、段落１から７のいずれか１つに記載の抗体。

【0822】

９．抗原結合部位が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、段落１から８のいずれか１つに記載の抗体。

【0823】

１０．抗原結合部位が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、段落１から１１のいずれか１つに記載の抗体。

【0824】

１１．抗原結合部位が、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下のＫｄ値でＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合する、段落１から１０のいずれか１つに記載の抗体。

【0825】

１２．抗原結合部位が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートおよびＢｉ−ＤＯＴＡＭキレートに結合し、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭキレート／Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのＫｄ値の比が、０．１〜１０または１〜１０の範囲にある、段落１から１１のいずれか１つに記載の抗体。

【0826】

１３．全抗体である、またはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、もしくは単鎖抗体分子からなる群から選択される抗体断片である、段落１から１２のいずれか１つに記載の抗体。

【0827】

１４．抗体が、標的抗原に特異的に結合する部分にカップリングされている、段落１から１３のいずれか１つに記載の抗体。

【0828】

１５．標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、段落１４に記載の抗体。

【0829】

１６．多重特異性または二重特異性抗体、必要に応じて、段落１７から５１のいずれか１つに記載の多重特異性抗体または二重特異性抗体である、段落１４または１５に記載の抗体。

【0830】

１７．Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、標的抗原のための少なくとも１つの抗原結合部位とを含む多重特異性または二重特異性抗体。

【0831】

１８．Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、段落１から１２のいずれか１つに定義された通りである、段落１７に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0832】

１９．標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、段落１７または１８に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0833】

２０．腫瘍特異的抗原が、ＣＥＡ、ＨＥＲ２およびＣＤ２０からなる群から選択される、段落１９に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0834】

２１．腫瘍特異的抗原が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である、段落２０に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0835】

２２．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２もしくは３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
ｄ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む
ｅ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む
ｆ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む；
および／またはＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲを含み、
ａ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
段落１７から２１のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0836】

２３．ＣＥＡのための抗原結合部位が、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つ（すなわち、全部）のＣＤＲを含む、段落２２に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0837】

２４．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１７に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１８に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、段落１７から２３のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0838】

２５．ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、段落２４に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0839】

２６．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、段落１７から２０のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0840】

２７．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３４に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、段落１７から２０または２６のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0841】

２８．ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、段落２７に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0842】

２９．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、段落１７から２０のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0843】

３０．多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４６に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、段落１７から２０または２９のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0844】

３１．ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、段落３０に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0845】

３２．Ｆｃ領域を含む、段落１７から３１のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0846】

３３．Ｆｃ領域がエフェクター機能を低下させるように操作されている、段落３２に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0847】

３４．Ｆｃ領域残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および／または３２９のうちの１つまたは複数の置換によるＦｃ領域、段落３３に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0848】

３５．第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体を含み、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を形成し、
第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、段落３２から３４のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0849】

３６．第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分をさらに含む、段落３５に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0850】

３７．第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を含む交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体を含み；
第１または第２の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、ＣＨ１およびＶＨドメインを含むポリペプチドに融合されており、第１および第２のポリペプチドが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成するように、前記第１のポリペプチドが、ＣＬおよびＶＬを含む第２のポリペプチドと集合する、段落３６に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0851】

３８．第２の抗体重鎖のＮ末端が、リンカーを介して前記第１のポリペプチドに融合されている、段落３７に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0852】

３９．ｉ）第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体；および
ｉｉ）第２の抗原のための抗原結合部位を一緒になって形成する、少なくとも第２の重鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインを含み、
第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、段落３２から３４のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0853】

４０．第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の１つのＮまたはＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含むＦａｂまたは交差Ｆａｂを形成する、段落３９に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0854】

４１．ｉ）ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉ）ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉｉ）ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチドを含み；
第１および第２のポリペプチドが、一緒になって、第２の抗原のための抗原結合部位を形成する、段落４０に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0855】

４２．第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の１つのＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチドに連結される、段落４１に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0856】

４３．ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体；
ｂ）ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成し、
第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、段落３９に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0857】

４４．第１の抗原が標的抗原であり、第２の抗原がＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートである、段落３５から４３のいずれか１つに記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0858】

４５．第１の抗原がＣＥＡである、段落４４に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0859】

４６．ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号２２もしくは２３のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；
ｂ）ｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；および
ｉｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに
ｃ）ｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチドを含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインは、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、段落４５に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0860】

４７．ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号１９もしくは２０のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；
ｂ）ｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）ｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、段落４５に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0861】

４８．ｉ）配列番号２２の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２３の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第２の重鎖、および
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む、段落４５に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0862】

４９．ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、段落４８に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0863】

５０．ｉ）配列番号１９の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む、段落４５に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0864】

５１．ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、段落５０に記載の多重特異性または二重特異性抗体。

【0865】

５２．段落１から５１のいずれか１つに記載の抗体をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。

【0866】

５３．段落５２に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含むベクター。

【0867】

５４．段落５２に記載のポリヌクレオチドのセットを一緒に含む、ベクターのセットを含むキットまたは組成物。

【0868】

５５．発現ベクターである、段落５３に記載のベクターまたは段落５４に記載のベクターのセット。

【0869】

５６．必要に応じて、段落５３に記載のベクターまたは段落５４に記載のベクターのセットを含む、段落５２に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセットを含む原核または真核宿主細胞。

【0870】

５７．段落５６に記載の宿主細胞から抗体を発現させることを含む、段落１から５１のいずれか１つに記載の抗体を生産する方法。

【図1】

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【図2】

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【図3】

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【図4】

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【図5】

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【図6】

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【図7】

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【図8】

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【図9】

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【図10】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17】

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【図18】

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【図19】

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【図20】

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【図21】

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【図22】

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【図23】

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【図24】

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【図25】

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【図26】

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【図27】

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【図28】

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【図29】

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【図30】

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【図31】

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【図32】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【図36】

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【図37】

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【図38】

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【図39】

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【図40】

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【図41】

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【図42】

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【図43】

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【図44】

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【図45】

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【図46】

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【図47】

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【図48】

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【図49】

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【図50】

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【図51】

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【図52】

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【図53】

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【図54】

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【図55】

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【図56】

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【図57】

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【図58】

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【図59】

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【図60】

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【図61】

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【図62】

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【配列表】

2021521245000001.app

【手続補正書】

【提出日】2020年3月30日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＯＴＡＭおよびＤＯＴＡＭの機能的バリアントから選択されるキレート剤にコンジュゲートされたデキストランまたはアミノデキストランを含む除去剤であって、前記キレート剤が金属イオンと複合体化し、ＤＯＴＡＭの前記機能的バリアントが、以下の式：

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またはその薬学的に許容される塩
［式中、
Ｒ^Ｎは、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、およびＣ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルであり；Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、およびＣ_２−６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｗ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４−アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、およびＣ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４−アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｘ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｌ^１は、独立してＣ_１−６アルキレン、Ｃ_１−６アルケニレン、またはＣ_１−６アルキニレンであり、それぞれ、１、２または３個の独立して選択されるＲ^１基で置換されていてもよく；
Ｌ^２は、Ｃ_２−４直鎖アルキレンであり、独立して選択されるＲ^１基で置換されていてもよく；Ｃ_１−４アルキルおよび／またはＣ_１−４ハロアルキルから独立して選択される１、２、３または４個の基で置換されていてもよく；
Ｒ^１は、Ｄ^１−Ｄ^２−Ｄ^３、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−６アルコキシ、Ｃ_１−６ハロアルコキシ、Ｃ_１−６アルキルチオ、Ｃ_１−６アルキルスルフィニル、Ｃ_１−６アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１−６アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−６アルキルアミノ、Ｃ_１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル、Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１−６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１−６アルコキシカルボニル−（Ｃ_１−６アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１−６アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１−６アルキルカルバミルから独立して選択され；
Ｄ^１はそれぞれ、Ｃ_６−１０アリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−９ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_３−１０シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−９ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−８アルキレン、Ｃ_１−８アルケニレン、およびＣ_１−８アルキニレンから独立して選択され；前記Ｃ_１−８アルキレン、Ｃ_１−８アルケニレン、およびＣ_１−８アルキニレンは、１、２、３または４個の独立して選択されるＲ^４基で置換されていてもよく；前記Ｃ_６−１０アリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−９ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_３−１０シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−９ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^５基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｄ^２はそれぞれ、独立して存在しないか、またはＣ_１−２０直鎖アルキレンであり、前記Ｃ_１−２０直鎖アルキレンの１〜６個の非隣接メチレン基は、独立して選択される−Ｄ^４−部分でそれぞれ置き換えられていてもよいが、但し、前記Ｃ_１−２０直鎖アルキレン中の少なくとも１個のメチレン単位は、必要に応じて−Ｄ^４−部分で置き換えられていないことを条件とし；前記Ｃ_１−２０直鎖アルキレンは、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４ハロアルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、Ｃ_１−４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１−４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルアミノ、Ｃ_１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル、Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１−４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１−４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１−４アルキルカルバミルから独立して選択される１つまたは複数の基で置換されていてもよく；
Ｄ^３はそれぞれ、水素、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_３−１４シクロアルキル、Ｃ_３−１４シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−１４ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_６−１４アリール、Ｃ_６−１４アリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−１３ヘテロアリール、Ｃ_１−１３ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^６基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３−１４シクロアルキル、Ｃ_３−１４シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−１４ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−１４ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_６−１４アリール、Ｃ_６−１４アリール−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−１３ヘテロアリール、Ｃ_１−１３ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルは、１、２、３または４個の独立して選択されるＲ^７基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｄ^４はそれぞれ、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）−、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｓ）−、−ＮＲ^ｂＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｃ−−ＮＲ^ｂＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ｃ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）_２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ａ−、−ＯＣ（＝Ｓ）ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ａ−、−ＮＲ^ｂＳ（＝Ｏ）ＮＲ^ｃ−、およびＮＲ^ｂＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^Ｏ−から独立して選択され；
Ｒ^４およびＲ^６はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−４アルコキシ、Ｃ_１−４ハロアルコキシ、Ｃ_１−４アルキルチオ、Ｃ_１−４アルキルスルフィニル、Ｃ_１−４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１−４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルアミノ、Ｃ_１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル、Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１−４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１−４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１−４アルキルカルバミルから独立して選択され；
Ｒ^５はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、シアネート、イソチオシアネート、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−４アルケニル、Ｃ_２−４アルキニル、Ｃ_１−４アルコキシ、Ｃ_１−４ハロアルコキシ、Ｃ_１−４アルキルチオ、Ｃ_１−４アルキルスルフィニル、Ｃ_１−４アルキルスルホニル、アミノ、Ｃ_１−４アルキルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルアミノ、Ｃ_１−４アルキルカルボニル、カルボキシ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル、Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、ジ−Ｃ_１−４アルキルカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ_１−４アルコキシカルボニル−（Ｃ_１−４アルキル）アミノ、カルバミル、Ｃ_１−４アルキルカルバミル、およびジ−Ｃ_１−４アルキルカルバミルから独立して選択され；
Ｒ^７はそれぞれ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ヒドロキシル、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキル、−ＯＲ^Ｏ、−ＳＲ^Ｏ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−Ｓ（＝Ｏ）_２Ｒ^Ｐ、−Ｓ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｐ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^Ｐ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＮＲ^ｓＲ^ｔ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｒ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）ＯＲ^ｒ、−ＮＲ^ｑＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｒ、−ＮＲ^ｑＳ（＝Ｏ）_２Ｒ^ｒ、および−ＮＲ^ＰＳ（＝Ｏ）_２ＮＲ^ｓＲ^ｔから独立して選択され；前記Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ’基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ’’基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、およびＲ^ｃはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｗ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^Ｘ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ^Ｏ、Ｒ^ｐ、Ｒ^ｑ、Ｒ^ｒ、Ｒ^ｓおよびＲ^ｔはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニル、Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルから独立して選択され；前記Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−６ハロアルキル、Ｃ_２−６アルケニル、Ｃ_２−６アルキニルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^ｙ基でそれぞれ置換されていてもよく；前記Ｃ_３−７シクロアルキル、Ｃ_３−７シクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル、Ｃ_２−７ヘテロシクロアルキル−Ｃ_１−４アルキル、フェニル、フェニル−Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−７ヘテロアリール、Ｃ_１−７ヘテロアリール−Ｃ_１−４アルキルは、１、２、３、または４個の独立して選択されるＲ^ｚ基でそれぞれ置換されていてもよく；
Ｒ’、Ｒ^ｗおよびＲ^ｙはそれぞれ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、Ｃ_１−４アルコキシ、Ｃ_１−４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１−４アルキルアミノ、およびジ−Ｃ_１−４アルキルアミノから独立して選択され；
Ｒ’’、Ｒ^ｘ、およびＲ^ｚはそれぞれ、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ_１−４アルキル、Ｃ_１−４ハロアルキル、Ｃ_１−４アルコキシ、Ｃ_１−４ハロアルコキシ、アミノ、Ｃ_１−４アルキルアミノ、およびジ−Ｃ_１−４アルキルアミノから独立して選択されるが；
但し、置換されていてもよい部分のそれぞれの原子の価数を超えないことを条件とする］
である、除去剤。

【請求項2】

Ｒ^Ｎがそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、またはＣ_１−６ハロアルキルであり；Ｌ^１がそれぞれＣ_１−４アルキレンであり；Ｌ^２がそれぞれＣ_２アルキレンである、請求項１に記載の除去剤。

【請求項3】

以下の式：
デキストラン−（リンカー−（Ｍ−ＤＯＴＡＭ））_ｘ
［式中、
デキストランは、デキストランまたはそのアミノデキストランであり；
リンカーは、連結部分であり；
Ｍ−ＤＯＴＡＭは、ＤＯＴＡＭまたは金属イオンが組み込まれたその前記機能的バリアントであり；および
ｘ≧１である］
の化合物である、請求項１または２に記載の除去剤。

【請求項4】

ｘが、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、または５０以上である、請求項２に記載の除去剤。

【請求項5】

連結部分が、以下の式：

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［式中、ｙは１〜６であり、^＊はデキストランへの結合点を表し、^＊＊はＤＯＴＡＭまたはその前記機能的バリアントの環原子への結合点を表す］
の二価の基である、請求項３または４に記載の除去剤。

【請求項6】

アミノデキストランが、アミノ酸およびグルコース以外の糖類から選択される１つまたは複数の基で置換されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項7】

デキストランまたはアミノデキストランのグルコース単位の数のパーセンテージとしてのＤＯＴＡＭ基の数が、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも５％である、請求項１から６のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項8】

デキストランの平均分子量が、２００〜８００ｋＤａであり、必要に応じて、３００、３５０、４００または４５０ｋＤａより大きく、必要に応じて、７００、６５０、６００または５００ｋＤａ未満であり、必要に応じて、約５００ｋＤａである、請求項１から７のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項9】

分子量カットオフ未満のデキストラン成分または除去剤が除去されており、分子量カットオフが５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上である、請求項８に記載の除去剤。

【請求項10】

分子量カットオフが、５０ｋＤａ〜２５０ｋＤａまたは５０ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲にあり、必要に応じて、１００ｋＤａ〜２００ｋＤａ、必要に応じて、約１００ｋＤａ、１５０ｋＤａまたは２００ｋＤａである、請求項９に記載の除去剤。

【請求項11】

平均分子量が、４５０ｋＤａ〜５５０ｋＤａ、例えば、約５００ｋＤａである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項12】

金属イオンが、安定な同位体または本質的に安定な同位体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項13】

金属イオンが、Ｐｂ、ＢｉまたはＣａイオンである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項14】

デキストランまたはアミノデキストランを、請求項１または２に記載のＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントにコンジュゲートすることを含み、ＤＯＴＡＭのデキストランへのコンジュゲーションの前および／または後に、ＤＯＴＡＭを金属イオンとキレート化することを含む、除去剤を調製する方法。

【請求項15】

金属イオンが、安定な、または本質的に安定な金属イオンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

金属イオンが、Ｐｂ、ＢｉまたはＣａイオンである、請求項１４または１５に記載の方法。

【請求項17】

コンジュゲーションの前に、デキストランまたはアミノデキストランを、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上の分子量カットオフ／閾値より下の種を除去するための濾過工程にかける、および／または
方法が、コンジュゲートを濾過工程にかけて、５０ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上または２００ｋＤａ以上の分子量カットオフ／閾値より下の種を除去することを含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること；
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
を含み；必要に応じて、
ｉｖ）キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項19】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること；
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化したＤＯＴＡＭを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
を含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤。

【請求項20】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗原結合部位をブロックする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること；
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化した、請求項１または２に記載のＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
を含み；必要に応じて、
ｉｖ）キレート化された放射性核種が局在化した組織または臓器をイメージングすること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線イメージングの方法。

【請求項21】

ｉ）対象に、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位および標的抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含む多重特異性または二重特異性抗体を投与することであって、投与後、抗体が標的抗原に結合し、標的抗原を発現する細胞の表面に局在化する、多重特異性または二重特異性抗体を投与すること；
ｉｉ）Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのための結合部位で抗体に結合することができ、細胞の表面に局在化されない抗体のクリアランスを増加させる、および／またはその抗体結合部位をブロックする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の除去剤を投与すること；
ｉｉｉ）その後、Ｐｂ放射性同位体とキレート化した、請求項１または２に記載のＤＯＴＡＭまたはその機能的バリアントを含む複合体を投与することであって、前記複合体が、細胞の表面に局在化した抗体に結合する、複合体を投与すること
をさらに含む、プレターゲティングされた放射線免疫療法の方法。

【請求項22】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、少なくとも、
ａ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、または配列番号２中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＰｈｅ５０、Ａｓｐ５６、およびＴｙｒ５８を含まず、必要に応じて、Ｇｌｙ５２および／またはＡｒｇ５４も含まない、そのバリアント；
ｂ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、または配列番号３中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｕ９５、Ａｒｇ９６、Ａｓｐ９７、Ｐｒｏ９８を含まず、必要に応じて、Ａｌａ１００Ｃ、Ｔｙｒ１００Ｄ、および／もしくはＰｒｏ１００Ｅも含まない、ならびに／または必要に応じて、Ｔｙｒ９９も含まない、そのバリアント；
ｃ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、または配列番号４中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＴｙｒ２８およびＡｓｐ３２を含まない、そのバリアント；
ｄ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３、または配列番号６中に１、２、もしくは３個までの置換を有し、これらの置換がＧｌｙ９１、Ｔｙｒ９２、Ａｓｐ９３、Ｔｈｒ９５ｃおよびＴｙｒ９６を含まない、そのバリアント
を含み、
番号付けが、Ｋａｂａｔによるものである、請求項１８もしくは１９に記載の使用のための除去剤または請求項２０もしくは２１に記載の方法。

【請求項23】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、重鎖ＣＤＲ１と軽鎖ＣＤＲ２とをさらに含む、請求項２２に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項24】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、
ｉ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１もしくは配列番号１中に１、２、もしくは３個までの置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント；および／または
ｉｉ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２もしくは配列番号５中に少なくとも１、２、もしくは３個の置換、必要に応じて、保存的置換を有するそのバリアント
を含む、請求項２３に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項25】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、
ａ）アミノ酸配列ＧＦＳＬＳＴＹＳＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１
ｂ）アミノ酸配列ＦＩＧＳＲＧＤＴＹＹＡＳＷＡＫＷＧ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２
ｃ）アミノ酸配列ＥＲＤＰＹＧＧＧＡＹＰＰＨＬ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３
ｄ）アミノ酸配列ＱＳＳＨＳＶＹＳＤＮＤＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１
ｅ）アミノ酸配列ＱＡＳＫＬＡＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２
ｆ）アミノ酸配列ＬＧＧＹＤＤＥＳＤＴＹＧ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から２４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項26】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、ヒト、キメラまたはヒト化されたものである、請求項１８から２５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項27】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号７および配列番号９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、または配列番号７もしくは配列番号９に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、請求項１８から２６のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項28】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号８および配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または配列番号８もしくは配列番号１０に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアントを含む、請求項１８から２７のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項29】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１８から２８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項30】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項31】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ以下のＫｄ値でＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートに結合する、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項32】

Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な抗原結合部位が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートおよびＢｉ−ＤＯＴＡＭキレートに結合し、Ｂｉ−ＤＯＴＡＭキレート／Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートのＫｄ値の比が、０．１〜１０または１〜１０の範囲にある、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項33】

標的抗原が、腫瘍特異的抗原である、請求項１８から３２のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項34】

腫瘍特異的抗原が、ＣＥＡ、ＨＥＲ２およびＣＤ２０からなる群から選択される、請求項１８から３３のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項35】

腫瘍特異的抗原が、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である、請求項１８から３４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項36】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２もしくは３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖を含み、
ｄ）重鎖ＣＤＲ１が、配列番号１１のアミノ酸配列を含む
ｅ）重鎖ＣＤＲ２が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む
ｆ）重鎖ＣＤＲ３が、配列番号１３のアミノ酸配列を含む；
および／またはＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、少なくとも１、２、もしくは３つの軽鎖ＣＤＲを含み、
ａ）軽鎖ＣＤＲ１が、配列番号１４のアミノ酸配列を含む；
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む；
ｃ）軽鎖ＣＤＲ３が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、
請求項１８から３５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項37】

ＣＥＡの抗原結合部位が、
ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；
ｆ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つ（すなわち、全部）のＣＤＲを含む、請求項３６に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項38】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＥＡに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１７に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号１８に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３７のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項39】

ＣＥＡに特異的な抗原結合部位が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項３８に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項40】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から３４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項41】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＥＲＢＢ２に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３４に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号３５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３４または４０のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項42】

ＥＲＢＢ２に特異的な抗原結合部位が、配列番号３４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号３５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項４１に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項43】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、（ａ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（ｆ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３から選択される少なくとも１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含む、請求項１８から３４のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項44】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｐｂ−ＤＯＴＡＭキレートに特異的な少なくとも１つの抗原結合部位と、ＣＤ２０に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、
ｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４５に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント；および／または
ｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、もしくは配列番号４６に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むそのバリアント
を含む、請求項１８から３４または４３のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項45】

ＣＤ２０に特異的な抗原結合部位が、配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび／または配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項４４に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項46】

多重特異性または二重特異性抗体が、Ｆｃ領域を含む、請求項１８から４５のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項47】

Ｆｃ領域が、エフェクター機能を低下させるように操作されている、請求項４６に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項48】

Ｆｃ領域が、残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および／または３２９の１つまたは複数の置換によって操作されている、請求項４７に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項49】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体を含み、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を形成し、第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤。

【請求項50】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のためのさらなる抗原結合部分をさらに含む、請求項４９に記載の使用のための除去剤。

【請求項51】

多重特異性または二重特異性抗体が、
第１および第２の抗体重鎖と、第１および第２の抗体軽鎖とを含む完全長抗体であって、第１の重鎖と第１の軽鎖とが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成し、第２の重鎖と第２の軽鎖とが集合して、第２の抗原のための抗原結合部位を含む交差Ｆａｂを形成する、完全長抗体
を含み；
第１または第２の抗体重鎖のいずれかが、リンカーを介して、ＣＨ１およびＶＨドメインを含むポリペプチドに融合されており、第１および第２のポリペプチドが集合して、第１の抗原のための抗原結合部位を含むＦａｂを形成するように、前記第１のポリペプチドが、ＣＬおよびＶＬを含む第２のポリペプチドと集合する、請求項５０に記載の使用のための除去剤。

【請求項52】

第２の抗体重鎖が、リンカーを介して前記第１のポリペプチドに融合されている、請求項５１に記載の使用のための除去剤。

【請求項53】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体、および
ｉｉ）第２の抗原のための抗原結合部位を一緒になって形成する、少なくとも第２の重鎖可変ドメインと第２の軽鎖可変ドメインを含み、第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、
請求項４６から４８のいずれか一項に記載の使用のための除去剤。

【請求項54】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の一方のＮまたはＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、第１のポリペプチドに連結されており、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドと会合して、第２の抗原のための結合部位を含むＦａｂまたは交差Ｆａｂを形成する、請求項５３に記載の使用のための除去剤。

【請求項55】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１および第２のポリペプチドが一緒になって、第２の抗原のための抗原結合部位を形成するような
ｉ）ＶＬおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉ）ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチド；または
ｉｉｉ）ＶＬおよびＣＨ１ドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＨドメインおよびＣＬドメインからなる第１のポリペプチド
を含む、請求項５４に記載の使用のための除去剤。

【請求項56】

多重特異性または二重特異性抗体が、第１の抗原のための抗原結合部位を含む完全長抗体を含み、重鎖の一方のＣ末端が、ポリペプチドリンカーを介して、ＶＨおよびＣＬドメインからなる第２のポリペプチドと会合している、ＶＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる第１のポリペプチドに連結されている、請求項５５に記載の使用のための除去剤。

【請求項57】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体；
ｂ）
ｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；または
ｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体定常ドメイン（ＣＨ１）；または
ｉｉｉ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；または
ｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；または
ｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になって第２の抗原への抗原結合部位を形成し、
第１または第２の抗原のいずれかがＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートであり、他方が標的抗原である、請求項４３に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項58】

第１の抗原が標的抗原であり、第２の抗原がＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートである、請求項４９から５７のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項59】

第１の抗原がＣＥＡである、請求項５８に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項60】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号２２もしくは２３のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；ならびに／または
ｂ）
ｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号７の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；ならびに／または
ｃ）
ｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号８の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、請求項５９に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項61】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ａ）ＣＥＡに特異的に結合し、２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖からなる完全長抗体であって、
重鎖が配列番号１９もしくは２０のアミノ酸１〜４５０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有し；
軽鎖が配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する、完全長抗体；
ｂ）
ｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；もしくは
ｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号９の重鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
からなるポリペプチドであって、
ＶＨドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の一方のＣ末端に融合されているポリペプチド；
ｃ）
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；もしくは
ｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；もしくは
ｉｉｉ）配列番号１０の軽鎖可変ドメインに対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％の同一性を有する前記抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）
からなるポリペプチドであって、
ＶＬドメインのＮ末端が、ペプチドリンカーを介して、前記完全長抗体の２つの重鎖の他方のＣ末端に融合されているポリペプチド
を含み；
（ｂ）の下のペプチドの抗体重鎖可変ドメインおよび（ｃ）の下のペプチドの抗体軽鎖可変ドメインが、一緒になってＰｂ−ＤＯＴＡＭキレートへの抗原結合部位を形成する、請求項５９に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項62】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号２２の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２３の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの軽鎖
を含む、請求項６１に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項63】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６１のいずれか一項に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項64】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１９の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の重鎖、
ｉｉ）配列番号２０の重鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する第２の重鎖、
ｉｉｉ）配列番号２１の軽鎖に対する少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６１に記載の使用のための除去剤または方法。

【請求項65】

多重特異性または二重特異性抗体が、
ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を有する第１の重鎖；
ｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２の重鎖；および
ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を有する２つの抗体軽鎖
を含む、請求項６１に記載の使用のための除去剤または方法。

【国際調査報告】

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