特表 2021-521781 三価三重特異性抗体構築物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-521781(P2021-521781A)

(43)【公表日】2021年8月30日

(54)【発明の名称】三価三重特異性抗体構築物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210802BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210802BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20210802BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210802BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210802BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210802BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210802BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C12N15/62 Z

   C07K16/28

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   A61K39/395 Y

   A61P35/00

   C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】126

(21)【出願番号】特願2020-557151(P2020-557151)

(86)(22)【出願日】2019年4月17日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月11日

(86)【国際出願番号】US2019027816

(87)【国際公開番号】WO2019204398

(87)【国際公開日】20191024

(31)【優先権主張番号】62/659,047

(32)【優先日】2018年4月17日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】514194417

【氏名又は名称】インベンラ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ベイリー， ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】グレーザー， ブライアン

(72)【発明者】

【氏名】リー， チューフェイ

(72)【発明者】

【氏名】グリーン， ローランド

(72)【発明者】

【氏名】プルクナット， ディリープ クマール

(72)【発明者】

【氏名】ノクラ−ルゴウスカ， マウゴジャータ アグニェシュカ

(72)【発明者】

【氏名】ゲルハート， ダニエル ジャスティン

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4C085AA14

4C085AA15

4C085AA33

4C085CC23

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

三重特異性三価抗体構築物、この構築物を含む医薬組成物、およびその使用の方法を提示する。本明細書に記載されている結合分子のいずれかを含む、精製された結合分子も本明細書に開示されている。ある特定の態様では、結合分子は、ＣＨ１親和性精製ステップを含む精製方法によって精製される。ある特定の態様では、精製方法は、単一ステップの精製方法である。本明細書に記載されている結合分子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤とを含む医薬組成物も本明細書に開示されている。本明細書において、がんを有する対象を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、方法も開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

三価三重特異性結合分子であって、
第１、第２、第３、第４および第５のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＮおよびドメインＯを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）前記第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、
ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｆ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｇ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｈ）前記第１および前記第５のポリペプチドは、前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用および前記Ｏドメインと前記Ｑドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成し；
（ｉ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成し；
（ｊ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；
（ｋ）前記第２および前記第５のポリペプチド鎖が同一であり、前記第４のポリペプチド鎖が異なるか、または、前記第４および前記第５のポリペプチド鎖が同一であり、前記第２のポリペプチド鎖が異なり；
（ｌ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｎドメインと前記Ｐドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、
結合分子。

【請求項2】

前記第２および前記第５のポリペプチド鎖が同一であり、前記第４のポリペプチド鎖が前記第２および第５のポリペプチド鎖と異なり、
ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＯおよびドメインＢと異なる、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項3】

前記第４および前記第５のポリペプチド鎖が同一であり、前記第２のポリペプチド鎖が前記第２および前記第５のポリペプチド鎖と異なり、
ドメインＯおよびドメインＩのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＢのアミノ酸配列がドメインＯおよびドメインＩと異なる、
請求項１に記載の結合分子。

【請求項4】

三価三重特異性結合分子であって、
第１、第２、第３、第４および第６のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）前記第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、
ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）前記第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、
ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）前記第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、ドメインＫ、ドメインＲおよびドメインＳを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、
ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＲは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）前記第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、
ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）前記第６のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、
ここで前記ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、
ドメインＴは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｆ）前記第１および前記第２のポリペプチドは、前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用および前記Ｂドメインと前記Ｇドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｇ）前記第３および前記第４のポリペプチドは、前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用および前記Ｉドメインと前記Ｍドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｈ）前記第１および前記第６のポリペプチドは、前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用および前記Ｓドメインと前記Ｕドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成し；
（ｉ）前記第１および前記第３のポリペプチドは、前記Ｄドメインと前記Ｊドメインとの間の相互作用および前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間の相互作用を介して会合して、前記結合分子を形成し；
（ｊ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；
（ｋ）前記第２および前記第６のポリペプチド鎖が同一であり、前記第４のポリペプチド鎖が異なるか、または、前記第４および前記第６のポリペプチド鎖が同一であり、前記第２のポリペプチド鎖が異なり；
（ｌ）前記Ａドメインと前記Ｆドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、
前記Ｈドメインと前記Ｌドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、
前記Ｒドメインと前記Ｔドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、
結合分子。

【請求項5】

前記第４および前記第６のポリペプチド鎖が同一であり、前記第４のポリペプチド鎖が前記第２および前記第６のポリペプチド鎖と異なり、
ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＢのアミノ酸配列がドメインＳおよびドメインＩと異なる、
請求項４に記載の結合分子。

【請求項6】

前記第２および前記第６のポリペプチド鎖が同一であり、前記第４のポリペプチド鎖が前記第２および前記第６のポリペプチド鎖と異なり、
ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列が同一であり、
ドメインＩのアミノ酸配列がドメインＳおよびドメインＢと異なる、
請求項４に記載の結合分子。

【請求項7】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が、内在性ＣＨ３配列である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項8】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインのアミノ酸配列が異なり、それぞれ別々に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｂドメインは前記Ｇドメインと相互作用し、前記Ｂドメインと前記Ｇドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項9】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、ドメインＢとドメインＧとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項８に記載の結合分子。

【請求項10】

操作されたジスルフィド架橋を生成する前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項９に記載の結合分子。

【請求項11】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項12】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記ノブ・イン・ホール変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項１１に記載の結合分子。

【請求項13】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項14】

前記Ｂドメインおよび前記Ｇドメインの前記電荷対変異が、前記ＢドメインとＧドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である、請求項１３に記載の結合分子。

【請求項15】

ドメインＩがＣＬ配列を有し、ドメインＭがＣＨ１配列を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項16】

ドメインＩがＣＨ１配列を有し、ドメインＭがＣＬ配列を有する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項17】

前記ＣＨ１配列および前記ＣＬ配列がそれぞれ、１つまたは複数の直交型修飾を含み、前記ＣＨ１配列を有するドメインが、前記直交型修飾を欠くＣＬ配列を有するドメインと有意に相互作用しない、請求項１５または１６に記載の結合分子。

【請求項18】

前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＨ１配列の１３８位および前記ＣＬ配列の１１６位における操作されたシステイン；前記ＣＨ１配列の１２８位および前記ＣＬ配列の１１９位における操作されたシステイン、ならびに前記ＣＨ１配列の１２９位および前記ＣＬ配列の２１０位における操作されたシステインからなる群から選択される、請求項１７に記載の結合分子。

【請求項19】

前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬカッパ配列の１１８位における操作されたシステインを含む、請求項１７に記載の結合分子。

【請求項20】

前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含み、前記変異が、前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｃ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ；および前記ＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＰ１７１Ｃ変異からなる群から選択される、請求項１７に記載の結合分子。

【請求項21】

前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ａ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；前記ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｖ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ；および前記ＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄからなる群から選択される、請求項１７から２０のいずれかに記載の結合分子。

【請求項22】

前記直交型修飾が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の電荷対変異を含み、前記電荷対変異が、前記ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ、および前記ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と対応する前記ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋからなる群から選択される、請求項１７から２０のいずれかに記載の結合分子。

【請求項23】

前記Ｅドメインが、ＣＨ３アミノ酸配列を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項24】

前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が同一であり、前記配列は内在性ＣＨ３配列である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項25】

前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が異なる、請求項１から２３のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項26】

前記異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、前記Ｅドメインは前記Ｋドメインと相互作用し、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインのどちらも、前記直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない、請求項２５に記載の結合分子。

【請求項27】

前記直交型修飾が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインとの間に操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む、請求項２６に記載の結合分子。

【請求項28】

操作されたジスルフィド架橋を生成する前記変異が、前記Ｅドメインと前記Ｋドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、および他方のドメインにおける３４９Ｃである、請求項２７に記載の結合分子。

【請求項29】

前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、ノブ・イン・ホール変異を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項30】

前記ノブ・イン・ホール変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに他方のドメインにおけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である、請求項２９に記載の結合分子。

【請求項31】

前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインにおける前記直交型修飾が、電荷対変異を含む、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項32】

前記電荷対変異が、前記Ｅドメインまたは前記Ｋドメインの一方におけるＴ３６６Ｋ変異、および他方のドメインにおける対応するＬ３５１Ｄ変異である、請求項３１に記載の結合分子。

【請求項33】

前記Ｅドメインおよび前記Ｋドメインのアミノ酸配列が、前記第１のポリペプチドと前記第３のポリペプチドとの間の特異的会合を促進する特異的相互作用を有するように選択された２つの異なる抗体ドメインの内在性配列である、請求項２５に記載の結合分子。

【請求項34】

前記２つの異なるアミノ酸配列が、ＣＨ１配列およびＣＬ配列である、請求項３３に記載の結合分子。

【請求項35】

ドメインＡがＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＦがＶＨアミノ酸配列を有する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項36】

ドメインＡがＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＦがＶＬアミノ酸配列を有する、請求項１から３４のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項37】

ドメインＨがＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬがＶＨアミノ酸配列を有する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項38】

ドメインＨがＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＬがＶＬアミノ酸配列を有する、請求項１から３６のいずれか一項に記載の結合分子。

【請求項39】

前記Ａドメインと前記Ｂドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＩＫＲＴＰＲＥＰまたはＩＫＲＴＶＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項40】

前記Ｆドメインと前記Ｇドメインとの間のジャンクションを形成する配列が、ＳＳＡＳＰＲＥＰである、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項41】

少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、前記ＣＨ３アミノ酸配列とヒンジアミノ酸配列とを連結するＣ末端トリペプチド挿入を有し、ここで前記トリペプチド挿入は、ＰＧＫ、ＫＳＣおよびＧＥＣからなる群から選択される、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項42】

前記配列が、ヒトの配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項43】

少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、ＩｇＧ配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項44】

前記ＩｇＧ配列がＩｇＧ１配列である、請求項４３に記載の結合分子。

【請求項45】

少なくとも１つのＣＨ３アミノ酸配列が、１つまたは複数のイソアロタイプ変異を有する、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項46】

前記イソアロタイプ変異がＤ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍである、請求項４５に記載の結合分子。

【請求項47】

前記ＣＬアミノ酸配列がＣカッパ配列である、上記請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項48】

前記ＣＨ２配列が、Ｆｃエフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異を有する、上述の請求項のいずれかに記載の結合分子。

【請求項49】

前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する、請求項４８に記載の結合分子。

【請求項50】

前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである、請求項４９に記載の結合分子。

【請求項51】

前記１つまたは複数の操作された変異が、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである、請求項４９に記載の結合分子。

【請求項52】

ＣＨ１親和性精製ステップを含む精製方法によって精製された請求項１から５１のいずれか一項に記載の結合分子を含む、精製された結合分子。

【請求項53】

前記精製方法が、単一ステップの精製方法である、請求項５２に記載の精製された結合分子。

【請求項54】

請求項１から５３のいずれか一項に記載の結合分子と、薬学的に許容される希釈剤とを含む、医薬組成物。

【請求項55】

がんを有する対象を処置するための方法であって、治療有効量の請求項５４に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１７日に出願された米国仮出願第６２／６５９，０４７号の利益および優先権を主張する。上記の参照出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
２．配列表

【0002】

本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表を含み、ここに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年ＸＸ月に作成され、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称で、Ｘ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

３．背景
抗体は、医療分野における非常に重要なツールである。特に、科学研究および医療診断におけるそれらの役割を含むモノクローナル抗体の重要性は、数十年にわたり広く認識されてきた。しかしながら、アダリムマブ（ヒュミラ）、リツキシマブ（リツキサン）、インフリキシマブ（レミケード）、ベバシズマブ（アバスチン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）およびイピリムマブ（ヤーボイ）の成功した療法によって実証されているように、抗体の最大の可能性、特に、治療剤としてのそれらの成功した使用は、ごく最近になって実証された。これらの臨床的成功を受けて、抗体療法への関心は、高まりつづけるだろう。したがって、抗体の効率的な生成および製造についての必要性が、薬物の開発の研究および下流の臨床状況の両方において、本分野に存在する。

【0004】

抗体療法分野における積極的な研究の領域は、多特異性抗体、すなわち、複数の標的を認識するように操作された単一抗体の設計および使用である。これらの抗体は、より高い治療管理の見込みを提供する。例えば、特に抗体に基づく免疫療法の場合において、多くの抗体療法に関連するオフターゲット効果を低減するために、標的特異性を改善するための必要性が存在する。加えて、多特異性抗体は、特に免疫療法の文脈において、複数の細胞受容体の相乗的な標的化などの新たな治療戦略を提供する。このような免疫療法の１つは、Ｔ細胞マーカーおよび腫瘍細胞マーカーの二重特異性係合を介して、Ｔ細胞をリクルートして、特異的腫瘍細胞集団を標的化し死滅させるための、二重特異性抗体の使用である。例えば、ＣＤ３ｘＣＤ１９二重特異性抗体を使用したＢ細胞リンパ腫のターゲティングは、米国特許出願公開第２００６／０１９３８５２号に記載されている。

【0005】

多特異性抗体の有望性にもかかわらず、それらの産生および使用は、それらの実際のインプリメンテーションを制限する多数の制約に悩まされている。一般に、すべての多特異性抗体プラットフォームは、同族の重鎖と軽鎖との対の間の高忠実度の対形成を保証するという課題を解決しなければならない。しかしながら、多数の問題点がさまざまなプラットフォームに存在している。例えば、抗体鎖工学は、組み立てられた抗体の不十分な安定性、抗体鎖の不十分な発現およびフォールディング、ならびに／または免疫原性ペプチドの生成をもたらし得る。他のアプローチは、複雑なｉｎ ｖｉｔｒｏの組立反応または精製方法などの非実用的な製造プロセスに悩まされている。加えて、いくつかのプラットフォームは、異なる抗体結合ドメインにおいて容易かつ効率的に組み込むことができないことに悩まされている。多特異性抗体の製造に関連するこれらのさまざまな課題は、多くのプラットフォームの適用性、特に、多くの治療薬のパイプラインのために必要なハイスループットスクリーニングにおける、例えば、改善された抗原結合特異性または親和性についてのスクリーニングにおける、それらの使用を制限する。
したがって、高レベルの発現および効率的な精製が可能な抗体プラットフォームについての必要性が存在する。特に、研究および治療状況の両方における直接の適用性を有する多特異性抗体の製造能力を改善する多特異性抗体プラットフォームについての必要性が存在する。親和性もしくはアビディティの増加、オフターゲット結合の低減、および／または意図しない免疫活性化の低減を含む改善を伴う、腫瘍細胞集団を含む別個の細胞集団に特異的に結合する改善された多特異性抗体についての必要性も存在する。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００６／０１９３８５２号明細書

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

４．概要
本明細書において、三価三重特異性結合分子であって、第１、第２、第３、第４および第５のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｆ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｇ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｈ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｉ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｊ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；（ｋ）第２および第５のポリペプチド鎖が同一であり、第４のポリペプチド鎖が異なり、または第４および第５のポリペプチド鎖が同一であり、第２のポリペプチド鎖が異なり；（ｌ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、結合分子を開示する。

【0008】

ある特定の態様では、第２および第５のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第５のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＯおよびドメインＢと異なる。

【0009】

ある特定の態様では、第４および第５のポリペプチド鎖は同一であり、第２のポリペプチド鎖は第２および第５のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＯおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＯおよびドメインＩと異なる。

【0010】

本明細書において、三価三重特異性結合分子であって、第１、第２、第３、第４および第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、ドメインＫ、ドメインＲおよびドメインＳを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＲは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第６のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｆ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｇ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｈ）第１および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｉ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；（ｊ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；（ｋ）第２および第６のポリペプチド鎖が同一であり、第４のポリペプチド鎖が異なり、または第４および第６のポリペプチド鎖が同一であり、第２のポリペプチド鎖が異なり；（ｌ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、Ｒドメイン（Ｒ ｄｏｍａｉｎ Ｒ）とＴドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する、結合分子も開示する。

【0011】

ある特定の態様では、第４および第６のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第６のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＳおよびドメインＩと異なる。

【0012】

ある特定の態様では、第２および第６のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第６のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＳおよびドメインＢと異なる。

【0013】

本明細書に記載されている結合分子のいずれかを含む、精製された結合分子も本明細書に開示されている。ある特定の態様では、結合分子は、ＣＨ１親和性精製ステップを含む精製方法によって精製される。ある特定の態様では、精製方法は、単一ステップの精製方法である。

【0014】

本明細書に記載されている結合分子のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤とを含む医薬組成物も本明細書に開示されている。

【0015】

本明細書において、がんを有する対象を処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載のいずれかの医薬組成物を投与することを含む、方法も開示する。
５．図面の簡単な説明

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、ＣＨ１−Ｃ_Ｌと対になったＣＨ３−ＣＨ３ ＩｇＧ１二量体対のアラインメントを示す。四次構造は、約１．６Å^２のＲＭＳＤで整列している。

【0017】

【図2】図２は、本明細書に記載の様々な結合分子（抗体構築物とも称される）について、それぞれの命名規則と共に、構成の概略図を示す。

【0018】

【図3】図３は、本明細書に記載の二価１×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインのより高解像度の概略図を示す。

【0019】

【図4】図４は、例示的な二価の単一特異性構築物の構成を示す。

【0020】

【図5】図５は、実施例１に記載のバイオレイヤー干渉（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）実験からのデータを示し、ここでは、図４に示した構成を有する二価の単一特異性結合分子［ポリペプチド１：ＶＬ−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ポリペプチド２：ＶＨ−ＣＨ３（ホール）］がアッセイされた。抗原結合部位は、ＴＮＦαに対して特異的であった。結合分子固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのＢＬＩ応答は、抗原への頑強で特異的な二価結合を示す。データは、分子が、ポリペプチド１とポリペプチド２との意図された対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。

【0021】

【図6】図６は、例示的な二価の１×１二重特異性結合分子「ＢＣ１」の特徴を示す。

【0022】

【図7】図７Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂）により、ゲル濾過を介して、＞９８％が非凝集二価タンパク質である単一の単分散ピークが得られることを実証する、「ＢＣ１」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データ［Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， ２０１１ Ｊｕｌ ５；１０８（２７）：１１１８７−９２）からのデータ］を示す。

【0023】

【図8】図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準プロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィの溶出プロファイルである。

【0024】

【図9】図９は、様々な精製段階での「ＢＣ１」の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

【0025】

【図10】図１０Ａおよび１０Ｂは、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ａ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１０Ｂ）と比較した図である。

【0026】

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。

【0027】

【図12】図１２は、精製後の不完全な対形成の非存在を確認する、非還元条件下で精製された「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。

【0028】

【図13】図１３は、２つのＩｇＧ対照抗体と比較した、「ＢＣ１」の４０℃で８週間にわたる安定性を実証する、加速安定性試験データを示す。

【0029】

【図14】図１４は、実施例３でさらに説明されている、例示的な二価１×１二重特異性結合分子「ＢＣ６」の特徴を示す。

【0030】

【図15】図１５Ａは、単一ステップのＣＨ１親和性精製によって単一の単分散ピークが得られることと非共有結合凝集体が存在しないことを実証する、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）解析を示す。図１５Ｂは、非還元条件下での「ＢＣ６」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

【0031】

【図16】図１６は、実施例４でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ２８」の特徴を示す。

【0032】

【図17】図１７は、「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」および「ＢＣ３２」の単一ステップのＣＨ１親和性精製後の非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。

【0033】

【図18】図１８は、それぞれ、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。

【0034】

【図19】図１９は、実施例５でさらに説明されている、例示的な二価の二重特異性結合分子「ＢＣ４４」の特徴を示す。

【0035】

【図20】図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ加速安定性試験条件下での、２つの二価結合分子「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」のサイズ排除クロマトグラフィデータを示す。「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」は、異なる可変領域−ＣＨ３ジャンクションを有する。

【0036】

【図21】図２１は、本明細書に記載の三価２×１抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。

【0037】

【図22】図２２は、実施例７でさらに説明されている、例示的な三価２×１二重特異性結合分子「ＢＣ１−２×１」の特徴を示す。

【0038】

【図23】図２３は、様々な精製段階で、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現された「ＢＣ１」および「ＢＣ１−２×１」タンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【0039】

【図24】図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を使用して、二価１×１構築物「ＢＣ１」のアビディティを、三価２×１構築物「ＢＣ１−２×１」のアビディティと比較したものである。

【0040】

【図25】図２５は、三価２×１構築物「ＴＢ１１１」の顕著な特徴を示す。

【0041】

【図26】図２６は、本明細書に記載の三価１×２抗体構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。

【0042】

【図27】図２７は、実施例１０にさらに説明されている、例示的な三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の特徴を示す。

【0043】

【図28】図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元（「−ＤＴＴ」）および還元（「＋ＤＴＴ」）条件下の三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。

【0044】

【図29】図２９は、２つの抗体：二価１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および三価１×２構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の間の抗原結合の比較を示す。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。

【0045】

【図30】図３０は、実施例１１にさらに説明されている、例示的な三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の特徴を示す。

【0046】

【図31】図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現および単一ステップのＣＨ１親和性樹脂精製後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。

【0047】

【図32】図３２は、実施例１２でさらに説明されるように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【0048】

【図33】図３３Ａ〜３３Ｃは、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４へのＯｃｔｅｔ結合分析を示す。実施例１３でさらに説明されるように、図３３Ａは、「ＢＣ１」の、ＰＤ１および抗原「Ａ」への結合を示し；図３３Ｂは、二価二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」の、ＣＴＬＡ４、抗原「Ａ」およびＰＤ１への結合を示し；図３３Ｃは、三価三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」の、ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４への結合を示す。

【0049】

【図34】図３４は、本明細書に記載の特定の四価２×２構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。

【0050】

【図35】図３５は、実施例１４にさらに説明されている、例示的な四価２×２構築物「ＢＣ２２−２×２」の特定の顕著な特徴を示す。

【0051】

【図36】図３６は、様々な精製段階で、２×２四価「ＢＣ２２−２×２」構築物を、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」および２×１三価構築物「ＢＣ２１−２×１」と比較する、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。

【0052】

【図37】図３７は、例示的な四価２×２構築物の構成を示す。

【0053】

【図38】図３８は、本明細書に記載の特定の四価構築物について、それぞれの命名規則と共に、ポリペプチド鎖とそれらのドメインの概略図を示す。

【0054】

【図39】図３９は、二重特異性四価構築物の例示的な構成を示す。

【0055】

【図40】図４０は、共通軽鎖ストラテジーを利用した三重特異性四価構築物についての例示的な構成を示す。

【0056】

【図41】図４１は、図３９に概略化された四価構築物による二重特異性抗原係合を示し、この構築物が同時係合できたことを実証する。Ｂ−Ｂｏｄｙ固定化および固定化された構築物へのＴＮＦα結合からのバイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）応答は、分子が、意図された鎖の対形成を高いパーセンテージで有していることと一致する。

【0057】

【図42】図４２は、Ｂ−Ｂｏｄｙの細胞表面抗原への結合のフローサイトメトリー解析を示す。網掛けで示すシグナルは、抗原なしの細胞を示し；ドットで示すシグナルは、表面抗原で一過性にトランスフェクトされた細胞を示す。

【0058】

【図43】図４３は、三価構築物の例示的な構成を示す。

【0059】

【図44】図４４は、三価構築物の例示的な構成を示す。

【0060】

【図45】図４５は、実施例１７でさらに説明されているように、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の二価および三価構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【0061】

【図46】図４６は、ジャンクションバリアントの対形成安定性を評価するために測定された「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示す。

【0062】

【図47】図４７は、変異誘発されていないＳＰ３４−８９一価Ｂ−ｂｏｄｙについてのＣＤ３への結合親和性を決定するために使用される２倍段階希釈（２００〜１２．５ｎＭ）のＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を示す。

【0063】

【図48】図４８は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップ（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂）を使用して精製された二重特異性抗体のＦｃ部分内の天然位置で確認された、ＣＨ３ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異を含む二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。

【0064】

【図49】図４９は、トラスツズマブへのＦｃγＲＩａ結合（図４９Ａ「ＷＴ ＩｇＧ１」）を実証し、ｓＦｃ１０への結合はない（図４９Ｂ）ことを実証するＯｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー干渉解析を示す。

【0065】

【図50】図５０は、ＡＤＣＣアッセイにおけるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）による殺傷を示すが、検査したＦｃバリアントによる殺傷は示さない。

【0066】

【図51】図５１は、Ｃ１ｑ ＥＬＩＳＡにおけるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）によるＣ１ｑ結合を示すが、検査したＦｃバリアントによる結合は示さない。

【0067】

【図52】図５２は、本明細書に記載の一連の三価三重特異性２×１抗体構築物について、それぞれの命名規則による、ポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を表す。

【0068】

【図53】図５３は、本明細書に記載の一連の三価三重特異性２×１抗体構築物について、それぞれの命名規則による、ポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を表す。

【0069】

【図54】図５４は、本明細書に記載の一連の三価三重特異性１×２抗体構築物について、それぞれの命名規則による、ポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を表す。

【0070】

【図55】図５５は、本明細書に記載の一連の三価三重特異性１×２抗体構築物について、それぞれの命名規則による、ポリペプチド鎖およびそれらのドメインの概略図を表す。

【0071】

【図56-1】図５６は、ＯＸ４０−１３ ＶＨドメインと対形成したＶＬドメイン、図５６Ａに示される非同族ＶＬドメイン１〜１２および２１〜２４、図５６Ｂに示される非同族ＶＬドメイン２５〜４０、ならびに図５６Ｃに示される非同族ＶＬドメイン１４〜２０および同族ＶＬドメインＶＬ１３についてのＯｃｔｅｔ結合分析を示す。

【図56-2】同上。

【図56-3】同上。

【発明を実施するための形態】

【0072】

図面は、例示の目的のためのみに、本発明の様々な実施形態を示している。当業者は、本明細書に例示された構造および方法の代替的実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく利用しうることを以下の説明から容易に認識する。
６．詳細な説明
６．１．定義

【0073】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されている意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、下記で与えられる意味を有する。

【0074】

「抗原結合部位」は、所与の抗原またはエピトープを特異的に認識するまたはそれに特異的に結合する三価三重特異性結合分子の領域を意味する。

【0075】

「Ｂ−ｂｏｄｙ」は、本明細書で使用される場合、また、図３を参照すると、第１および第２のポリペプチド鎖の特色を含む結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する、結合分子を指す。Ｂ−ｂｏｄｙは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５７２６８により詳細に記載されている。

【0076】

本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指し、ここで目的は、多発性硬化症、関節炎またはがんの進行などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益または望ましい臨床結果としては、検出可能であろうとまたは検出不能であろうと、症状の緩和、疾患の範囲の縮減、疾患の安定した（つまり、悪化していない）状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患の状態の回復または緩和、および寛解（部分的寛解または完全寛解）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けない場合の予測生存期間と比較した生存期間の延長も意味しうる。処置を必要とする対象には、すでに状態もしくは障害に罹患している対象、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある対象、または状態もしくは障害を予防すべき状態にある対象が含まれる。

【0077】

「対象」、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」は、診断、予防または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家庭用動物、農業用動物、ならびに動物園、スポーツまたはペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などが含まれる。

【0078】

「十分な量」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量、例えば、細胞内のタンパク質凝集を調節するために十分な量を意味する。

【0079】

「治療有効量」は、疾患の症状を改善するために有効な量である。予防が治療と考えることができるように、治療有効量は「予防有効量」であることができる。
６．２．その他の解釈上の規則

【0080】

別途指定しない限り、本明細書における配列に対する全ての参照は、アミノ酸配列に対するものである。

【0081】

他に規定のない限り、抗体の定常領域残基の番号付けは、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれるｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ／Ｈｕ＿ＩＧＨＧｎｂｅｒ．ｈｔｍｌ＃ｒｅｆｓ （ａｃｃｅｓｓｅｄ Ａｕｇ． ２２， ２０１７）に記載のＥｕインデックスおよびＥｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ， ６３：７８−８５ （１９６９）に従い、本明細書に記載の三価三重特異性結合分子の鎖内の残基の物理的な位置に関わらず、内在性定常領域の配列におけるその位置に従って残基を特定する。「内在性配列」または「天然配列」は、生物、組織、または細胞に由来し、人工的に修飾または変異されていない、核酸およびアミノ酸配列の両方を含む任意の配列を意味する。

【0082】

ポリペプチド鎖番号（例えば、「第１の」ポリペプチド鎖、「第２の」ポリペプチド鎖等、またはポリペプチド「鎖１」、「鎖２」等）は、結合分子を形成する特異的ポリペプチド鎖に特有の識別子として本明細書で使用され、結合分子内の異なるポリペプチド鎖の順序または含量の暗示を意図するものではない。

【0083】

この開示において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその言語的変化形は、米国特許法でそれらが帰する意味を有し、明示的に列挙されている成分以外のさらなる成分の存在を許容する。

【0084】

本明細書で提供される範囲は、列挙される端点を含む範囲内の全ての値についての省略表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲を含むと理解される。

【0085】

特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「または」という用語は、包括的であると理解される。特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。

【0086】

特に明記されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野で通常許容される範囲内、例えば、平均の２標準偏差以内と理解される。約は、示された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内と理解することができる。文脈から明らかでない限り、本明細書で提供される全ての数値は、約という用語によって修飾されている。
６．３．三価三重特異性結合分子

【0087】

第１の態様では、三価三重特異性結合分子を提供する。三価三重特異性結合分子は、ＡＢＳが合わせて３つの認識特異性を有する３つの抗原結合部位を有し、したがって、「三価三重特異性」と称される。
６．３．１．三価三重特異性２×１抗体構造

【0088】

図２１に関して、さまざまな三価の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、第１、第２、第３、第４および第５のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＮおよびドメインＯを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＮは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＯは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、ドメインＰは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＱは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｆ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｇ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｈ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；
（ｉ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；
（ｊ）ドメインＮ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；
（ｋ）第２および第５のポリペプチド鎖が同一であり、第４のポリペプチド鎖が異なり、または第４および第５のポリペプチド鎖が同一であり、第２のポリペプチド鎖が異なり；
（ｌ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。

【0089】

図２に図示するように、これらの三価の実施形態は「２×１」三価構築物と称される。

【0090】

図５２に関して、ある特定の実施形態では、第２および第５のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第５のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＯおよびドメインＢと異なる。

【0091】

図５３に関して、ある特定の実施形態では、第４および第５のポリペプチド鎖は同一であり、第２のポリペプチド鎖は第２および第５のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＯおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＯおよびドメインＩと異なる。

【0092】

様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結される。様々な実施形態では、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結するかまたはドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．２０．６においてより詳細に記載されている６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．２．三価三重特異性１×２抗体構造

【0093】

図２６に関して、さまざまな三価の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、第１、第２、第３、第４および第６のポリペプチド鎖を含み、
（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＢは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、
ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＧは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、ドメインＫ、ドメインＲおよびドメインＳを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＲは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＳは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｅ）第６のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＵは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；
（ｆ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｇ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；
（ｈ）第１および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；
（ｉ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成し；
（ｊ）ドメインＲ、ドメインＡおよびドメインＨのアミノ酸配列が異なり；
（ｋ）第２および第６のポリペプチド鎖が同一であり、第４のポリペプチド鎖が異なり、または第４および第６のポリペプチド鎖が同一であり、第２のポリペプチド鎖が異なり；
（ｌ）ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用は、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用は、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用は、第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。

【0094】

図２に図示するように、これらの三価の実施形態は「１×２」三価構築物と称される。

【0095】

図５４に関して、ある特定の実施形態では、第４および第６のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第６のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＳおよびドメインＩのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＢのアミノ酸配列はドメインＳおよびドメインＩと異なる。

【0096】

図５５に関して、ある特定の実施形態では、第２および第６のポリペプチド鎖は同一であり、第４のポリペプチド鎖は第２および第６のポリペプチド鎖と異なり、ドメインＳおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩのアミノ酸配列はドメインＳおよびドメインＢと異なる。

【0097】

各種の実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結されている。各種の実施形態では、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結されている。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結するか、またはドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、６．３．２０．６項により詳細に記載するように、６アミノ酸のＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．３．ドメインＡ（可変領域）

【0098】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＡは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。本明細書に記載されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．３．１および６．３．３．４でさらになお詳細に後述される。好まれる実施形態では、ドメインＡはＶＬ抗体ドメイン配列を有し、ドメインＦはＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．３．１．ＶＬ領域

【0099】

本明細書に記載の三価三重特異性結合分子において有用なＶＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖可変ドメイン配列である。本明細書に記載の天然抗体および抗体構築物の両方における典型的な配列では、特異的ＶＬアミノ酸配列が、特異的ＶＨアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、下記セクション６．３．３．２および６．３．３．３においてさらに詳細に記載されているように、ヒト配列、合成配列、または、ヒト配列、非ヒト哺乳動物配列、哺乳動物配列および／もしくは合成配列の組合せを含む、哺乳動物配列である。

【0100】

様々な実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖可変ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＶＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖可変ドメイン配列である。

【0101】

本明細書に記載の三価三重特異性結合分子では、ドメインＡのＣ末端は、ドメインＢのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＡは、下記セクション６．３．２０．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＣ末端で変異しているＶＬアミノ酸配列を有する。
６．３．３．２．相補性決定領域

【0102】

ＶＬアミノ酸配列は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される高度に可変性の配列、典型的に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤ２、およびＣＤＲ３）を含む。様々な実施形態では、ＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＤＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＣＤＲは、特定の抗原またはエピトープに対して抗原結合部位の結合親和性を変化させるように変異された天然に存在する配列である。ある特定の実施形態では、天然に存在するＣＤＲは、親和性成熟および体細胞超変異を介してｉｎ ｖｉｖｏ宿主で変異されている。ある特定の実施形態では、ＣＤＲは、ＰＣＲ突然変異誘発および化学的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない方法を介してｉｎ ｖｉｔｒｏで変異されている。様々な実施形態では、ＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。
６．３．３．３．フレームワーク領域およびＣＤＲグラフト化

【0103】

ＶＬアミノ酸配列は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）配列を含む。ＦＲは、一般的に、散在されたＣＤＲの足場として作用する保存配列領域（セクション６．３．３．２．参照）であり、典型的には、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４配置（Ｎ末端からＣ末端へ）である。様々な実施形態では、ＦＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＦＲは、ヒト配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、天然に存在する配列である。様々な実施形態では、ＦＲは、合理的に設計された配列を含むがそれに限定されない、合成配列である。

【0104】

様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは両方が、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。様々な実施形態では、ＦＲおよびＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来し、ここでＣＤＲはＦＲ足場にグラフト化され、ＣＤＲが特定の抗原に対する特異性を提供している。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは全て、同じ天然に存在する可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、異なる可変ドメイン配列に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲは、ランダム配列ＣＤＲライブラリおよび合理的に設計されたＣＤＲライブラリから得られたＣＤＲを含むがこれらに限定されない、合成配列である。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、同じ種に由来する。ある特定の実施形態では、グラフト化されたＣＤＲおよびＦＲは、異なる種に由来する。好ましいグラフト化されたＣＤＲ実施形態では、抗体は「ヒト化」されており、ここで、グラフト化されたＣＤＲは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバおよびヤギ配列を含むがこれらに限定されない非ヒト哺乳動物配列であり、ＦＲはヒト配列である。ヒト化抗体は、教示する全てについてその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，４０７，２１３号においてより詳細に議論されている。様々な実施形態では、ある種に由来するＦＲの部分または特定の配列は、別の種のＦＲの部分または特定の配列を置き換えるために使用される。
６．３．３．４．ＶＨ領域

【0105】

本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子におけるＶＨアミノ酸配列は、抗体重鎖可変ドメイン配列である。天然のおよび本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子の両方の典型的な抗体配置において、特異的ＶＨアミノ酸配列は、特異的ＶＬアミノ酸配列と会合して、抗原結合部位を形成する。様々な実施形態では、セクション６．３．３．２および６．３．３．３にさらに詳細に上述されている通り、ＶＨアミノ酸配列は、ヒト配列を含む哺乳動物配列、合成配列、または非ヒト哺乳動物、哺乳動物および／または合成配列の組合せである。様々な実施形態では、ＶＨアミノ酸配列は、天然に存在する配列の変異した配列である。
６．３．４．ドメインＢ（定常領域）

【0106】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＢは定常領域ドメイン配列を有する。本明細書に記載されている定常領域ドメインアミノ酸配列は、抗体の定常領域ドメインの配列である。

【0107】

様々な実施形態では、定常領域配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、定常領域配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体軽鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ラムダまたはカッパ軽鎖由来である。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、抗体重鎖由来である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプである抗体重鎖配列である。特定の実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＧアイソタイプに由来する。好まれる実施形態では、定常領域配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、セクション６．３．４．１でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスＣＨ２配列である。オルソロガスＣＨ２配列は、セクション６．３．４．２でさらになお詳細に後述される。

【0108】

特定の実施形態では、定常領域配列は、１つまたは複数の直交型変異を含むように変異された。好まれる実施形態では、ドメインＢは、セクション６．３．１６．２でさらになお詳細に後述される通り、ノブ・ホール（ｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ）（同義的に「ノブ・イン・ホール」、「ＫＩＨ」）直交型変異、およびセクション６．３．１６．１にさらになお詳細に後述されている通り、直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好まれる実施形態では、ノブ・ホール直交型変異は、Ｔ３６６Ｗ変異である。
６．３．４．１．ＣＨ３領域

【0109】

ＣＨ３アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、抗体重鎖のＣ末端ドメインの配列である。

【0110】

様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプに由来し、またはＩｇＥもしくはＩｇＭアイソタイプ由来のＣＨ４配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。一部の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＩｇＡアイソタイプに由来する。

【0111】

ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸２２４−３３０である。様々な実施形態では、ＣＨ３配列は、内在性ＣＨ３配列のセグメントである。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｃ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、Ｎ末端アミノ酸Ｇ２２４およびＱ２２５ならびにＣ末端アミノ酸Ｐ３２８、Ｇ３２９およびＫ３３０を欠く内在性ＣＨ３配列を有する。好ましい実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＣＨ３配列を有する複数のドメインを有し、ここで、ＣＨ３配列は、全長内在性ＣＨ３配列、ならびにＮ末端アミノ酸、Ｃ末端アミノ酸、またはその両方を欠くＣＨ３配列の両方を指すことができる。

【0112】

ある特定の実施形態では、ＣＨ３配列は、１つまたは複数の変異を有する内在性配列である。特定の実施形態では、変異は、セクション６．３．１６．１−６．３．１６．４においてさらに詳細に記載されているように、内在性ＣＨ３配列に導入されて特定のＣＨ３配列の特定の対形成をガイドする、１つまたは複数の直交型変異である。

【0113】

ある特定の実施形態では、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＳｔｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ． ２０１１ Ａｐｒ； １２（３）： ２１３−２２１）においてより詳細に記載されているように、ＣＨ３配列は、本明細書でイソアロタイプ変異と称される、あるアロタイプの特定のアミノ酸を別のアロタイプのアミノ酸に置き換えることによって、抗体の免疫原性を低減するように操作されている。特定の実施形態では、Ｇ１ｍ１アロタイプの特定のアミノ酸が置き換えられている。好ましい実施形態では、ＣＨ３配列において、イソアロタイプ変異Ｄ３５６ＥおよびＬ３５８Ｍがなされている。

【0114】

好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；およびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有する。他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｔ３６６Ｋ；およびトリペプチド挿入４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。さらなる他の好ましい実施形態では、ドメインＢは、以下の変異変化：Ｙ３４９Ｃおよびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。

【0115】

ある特定の実施形態では、ドメインＢは、それらと異なって、内在性ＣＨ３配列に組み込まれた４４７Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。

【0116】

本明細書に記載される三価三重特異性結合分子では、ドメインＢのＮ末端が、ドメインＡのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．２０．１および実施例６においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＡとドメインＢとの間のジャンクションにおいてそのＮ末端で変異しているＣＨ３アミノ酸配列を有する。

【0117】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＢのＣ末端は、ドメインＤのＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．２０．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＢとドメインＤとの間のジャンクションにＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。

【0118】

一部の実施形態では、ドメインＢは、ヒトＩｇＡ ＣＨ３配列を含む。ＩｇＡ ＣＨ３アイソタイプ置換は、６．３．１６．４項にさらに詳細に記載する。例示的なヒトＩｇＡ ＣＨ３アミノ酸配列は、ＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬ（配列番号８４）である。
６．３．４．２．オルソロガスなＣＨ２領域

【0119】

本明細書に記載されているＣＨ２アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端へと参照した場合の、抗体重鎖の第３のドメインの配列である。ＣＨ２アミノ酸配列は、全般に、セクション６．３．５により詳細に後述される。一連の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＣＨ２配列を有するＣＨ２ドメインの２つ以上の対セットを有し、第１のセットは、第１のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列、および別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列の１つまたは複数のオルソロガスセットを有する。本明細書に記載されているオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、共有されるアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列と相互作用することができるが、三価三重特異性結合分子に存在する別のアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列とは有意に相互作用しない。特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全セットが、同じ種に由来する。好まれる実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の全セットが、ヒトＣＨ２アミノ酸配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットは、異なる種に由来する。特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列の第１のセットは、三価三重特異性結合分子における他の非ＣＨ２ドメインと同じアイソタイプに由来する。特定の実施形態では、第１のセットは、ＩｇＧアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有し、１つまたは複数のオルソロガスセットは、ＩｇＭまたはＩｇＥアイソタイプ由来のＣＨ２アミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットのうち１つまたは複数は、内在性ＣＨ２配列である。他の実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列のセットのうち１つまたは複数は、１つまたは複数の変異を有する内在性ＣＨ２配列である。特定の実施形態では、１つまたは複数の変異は、直交型ノブ・ホール変異、直交型電荷対変異または直交型疎水性変異である。三価三重特異性結合分子に有用なオルソロガスＣＨ２アミノ酸配列は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７／０１１３４２およびＷＯ２０１７／１０６４６２により詳細に記載されている。
６．３．５．ドメインＤ（定常領域）

【0120】

本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子において、ドメインＤは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．４により詳細に記載されている。

【0121】

好まれる一連の実施形態では、ドメインＤは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、本明細書に記載されるように、Ｎ末端からＣ末端へ参照して天然抗体重鎖の第３のドメインのＣＨ２アミノ酸配列である。様々な実施形態では、ＣＨ２配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。

【0122】

ある特定の実施形態では、ＣＨ２配列は、内在性配列である。特定の実施形態では、配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１１１−２２３である。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、下記セクション６．３．２０．３においてより詳細が議論されているように、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントを、ＣＨ２ドメインへ連結するＮ末端ヒンジ領域ペプチドを有する。

【0123】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＤのＮ末端が、ドメインＢのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、ドメインＢは、下記セクション６．３．２０．３においてさらに詳細に記載されているように、ドメインＤとドメインＢとの間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されているＣＨ３アミノ酸配列を有する。
６．３．６．ドメインＥ（定常領域）

【0124】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＥは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．４により詳細に記載されている。

【0125】

ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、上記セクション６．３．４．１においてさらに詳細に記載されている。特定の実施形態では、定常領域配列は、１つまたは複数の直交型変異を含むように変異されている。好ましい実施形態では、ドメインＥは、下記セクション６．３．１６．２においてより詳細に記載されているように、ノブ−ホール（同義的に「ノブ・イン・ホール」、「ＫＩＨ」）直交型変異、ならびに下記セクション６．３．１６．１においてより詳細に記載されているように、直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ノブ−ホール直交型変異は、Ｔ３６６Ｗ変異である。

【0126】

ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＥのＣＨ１アミノ酸配列は、三価三重特異性結合分子における唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、下記で６．３．２０．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＬ配列である。ある特定の実施形態では、下記で６．３．２０．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に連結されている。ＣＨ１およびＣＬ配列は、セクション６．３．１０．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．７．ドメインＦ（可変領域）

【0127】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＦは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．３．１および６．３．３．４にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインＦは、ＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．８．ドメインＧ（定常領域）

【0128】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＧは、定常領域アミノ酸配列を有する。定常領域アミノ酸配列は、セクション６．３．４により詳細に記載されている。

【0129】

好まれる特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＨ３配列である。ＣＨ３配列は、セクション６．３．４．１でさらになお詳細に後述される。他の好まれる実施形態では、定常領域配列は、オルソロガスＣＨ２配列である。オルソロガスＣＨ２配列は、セクション６．３．４．２でさらになお詳細に後述される。

【0130】

ある特定の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；およびトリペプチド挿入４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変異変化：Ｓ３５４Ｃ；および４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋトリペプチド挿入を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。一部の好ましい実施形態では、ドメインＧは、以下の変化：Ｌ３５１Ｄ；および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３配列を有する。
６．３．９．ドメインＨ（可変領域）

【0131】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれセクション６．３．３．１および６．３．３．４にさらになお詳細に上述されている。好まれる実施形態では、ドメインＨはＶＬ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．１０．ドメインＩ（定常領域）

【0132】

三価三重特異性結合分子において、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション６．３．４にさらになお詳細に上述されている。三価三重特異性結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有する。別の一連の実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有する。ＣＨ１およびＣＬアミノ酸配列は、セクション６．３．１０．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．１０．１．ＣＨ１およびＣＬ領域

【0133】

ＣＨ１アミノ酸配列は、本明細書に記載される場合、Ｎ末端からＣ末端へ参照して抗体重鎖の第２のドメインの配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＨ１配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ヒト配列である。ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＭアイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＩｇＧ１アイソタイプに由来する。好ましい実施形態では、ＣＨ１配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５７アミノ酸１−９８である。

【0134】

本明細書に記載される三価三重特異性結合分子において有用なＣＬアミノ酸配列は、抗体軽鎖定常ドメイン配列である。ある特定の実施形態では、ＣＬ配列は、内在性配列である。様々な実施形態では、ＣＬ配列は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト配列を含むがこれらに限定されない哺乳動物配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列は、ヒト配列である。

【0135】

ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ラムダ（λ）軽鎖定常ドメイン配列である。特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ラムダ（λ）軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＧ０４である。

【0136】

ある特定の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、カッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、ヒトカッパ（κ）軽鎖定常ドメイン配列である。好ましい実施形態では、カッパ軽鎖配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１８３４である。

【0137】

ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は両者共に内在性配列である。ある特定の実施形態では、下のセクション６．３．１０．２にさらになお詳細に記述される通り、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含む。ＣＨ１配列における直交型変異が、ＣＨ１結合試薬とＣＨ１ドメインとの間の特異的結合相互作用を排除しないことを理解されたい。しかし、一部の実施形態では、直交型変異は、特異的結合相互作用を排除しないとしても、低減させる場合がある。ＣＨ１配列またはその部分を有するドメインが、ＣＨ１配列またはその部分を有するドメインと会合することができるように、ＣＨ１およびＣＬ配列は、内在性または修飾配列のいずれかの、その部分となることもできる。さらに、上述のＣＨ１配列の一部分を有する三価三重特異性結合分子は、ＣＨ１結合試薬に結合され得る。

【0138】

理論に制約されることは望まないが、ＣＨ１ドメインは、また、そのフォールディングが典型的にＩｇＧの分泌における律速ステップであるという点において、特有である（Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． ２００９ Ｊｕｎ １２；３４（５）：５６９−７９；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。よって、ＣＨ１を含むポリペプチド鎖の律速成分に基づく三価三重特異性結合分子の精製は、不完全鎖から完全複合体を精製する手段、例えば、１つまたは複数の非ＣＨ１を含む鎖のみを有する複合体からの律速ＣＨ１ドメインを有する複合体の精製を提供することができる。

【0139】

記述された通り、ＣＨ１律速発現は、一部の態様では利益となる場合があるが、ＣＨ１は、完全三重特異性三価結合分子の全体的な発現を限定する可能性がある。よって、ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、完全複合体を形成する三価三重特異性結合分子の効率を改善するように調整される。説明目的の例では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターの比は、他のポリペプチド鎖を発現するように構築されたプラスミドベクターと比べて増加させることができる。別の説明目的の例では、ＣＬ配列（複数可）を含むポリペプチド鎖と比較した場合、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖は、２つのポリペプチド鎖のうち小さい方となることができる。別の特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、いずれのポリペプチド鎖がＣＨ１配列（複数可）を有するか制御することにより調整することができる。例えば、ＣＨ１ドメインが、４ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載されている第３のポリペプチド鎖）におけるＣＨ１配列のネイティブ位置の代わりに、２ドメインポリペプチド鎖（例えば、本明細書に記載されている第４のポリペプチド鎖）に存在するように、三価三重特異性結合分子を操作することは、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現の制御に使用することができる。しかし、他の態様では、他の鎖と比較して高すぎるＣＨ１含有鎖の相対的発現レベルは、ＣＨ１鎖を有するが他の鎖のそれぞれがない不完全複合体をもたらし得る。よって、ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列（複数可）を含むポリペプチド鎖の発現は、ＣＨ１含有鎖がない不完全複合体の形成を低減させ、かつ、ＣＨ１含有鎖があるが完全複合体に存在する他の鎖がない不完全複合体の形成を低減させるように調整される。
６．３．１０．２．ＣＨ１およびＣＬ直交型修飾

【0140】

ある特定の実施形態では、ＣＨ１配列およびＣＬ配列は別個に、それぞれ直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含む。

【0141】

本明細書に記載の「直交型修飾」または同意語の「直交型変異」は、直交型修飾が不存在の第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交型修飾を有する第２のドメインに対する直交型修飾を有する第１のドメインの結合の親和性を変える、抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異である。一部の実施形態では、直交型修飾は、直交型修飾が不存在の第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交型修飾を有する第２のドメインに対する直交型修飾を有する第１のドメインの結合の親和性を減少させる。好ましい実施形態では、直交型修飾は、直交型修飾が不存在の第１および第２のドメインの結合と比較して、相補的な直交型修飾を有する第２のドメインに対する直交型修飾を有する第１のドメインの結合の親和性を増加させる。ある特定の好ましい実施形態では、直交型修飾は、相補的な直交型修飾を欠くドメインに対する直交型修飾を有するドメインの親和性を減少させる。

【0142】

ある特定の実施形態では、直交型修飾は、内在性抗体ドメイン配列における変異である。各種の実施形態では、直交型修飾は、アミノ酸の付加または欠失を含むが、これらに限定されない、内在性抗体ドメイン配列のＮ末端またはＣ末端の修飾である。特定の実施形態では、直交型修飾には、下記でさらに詳細に記載する、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せを含む。特定の実施形態では、直交型修飾は、６．３．４．１項においてさらに詳細に記載するイソアロタイプ変異などの免疫原性を低減するアミノ酸置換と組み合わせることができる。

【0143】

ある特定の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ対のＣＨ１配列およびＣＬ配列は、それぞれ別々に直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含む。他の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ対の１つの配列は、少なくとも１つの修飾を含むが、ＣＨ１／ＣＬ対の他の配列は、それぞれの直交のアミノ酸位置に修飾を含まない。

【0144】

ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、ＣＨ１ドメインにおける修飾残基と、対応するＣＬドメインにおける修飾残基または未修飾残基との間の相互作用を介してＣＨ１／ＣＬドメインの対形成に影響を与え得る。

【0145】

ＣＨ１配列における直交型変異がＣＨ１結合試薬とＣＨ１ドメインとの間の特異的な結合相互作用を排除しないことが理解されるべきである。しかしながら、一部の実施形態では、直交型変異は、特異的な結合相互作用を低減させるが、除外しない場合がある。ＣＨ１およびＣＬ配列はまた、ＣＨ１配列を有するドメインまたはその部分がＣＨ１配列またはその部分を有するドメインと会合することができるように、内在性配列または修飾配列のいずれかのその部分であり得る。さらにまた、本明細書に記載のＣＨ１配列の部分を有する結合分子は、ＣＨ１結合試薬によって結合され得る。
例示的なＣＨ１／ＣＬ直交型修飾：操作されたジスルフィド架橋

【0146】

ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾の一部の実施形態は、ＣＨ１およびＣＬに、操作されたシステインの間の操作されたジスルフィド架橋を含む。このような操作されたジスルフィド架橋は、修飾ＣＨ１を含むポリペプチドと対応する修飾ＣＬを含むポリペプチドとの間の相互作用を安定化し得る。

【0147】

操作されたジスルフィド架橋を含む直交型ＣＨ１／ＣＬ修飾は、一例として、ＥＵインデックスにより番号付けされる、１２８、１２９、１３８、１４１、１６８または１７１位に操作されたシステインを有するＣＨ１ドメインを含むことができる。操作されたジスルフィド架橋を含むこのような直交型ＣＨ１／ＣＬ修飾は、一例として、ＥＵインデックスにより番号付けされる、１１６、１１８、１１９、１６４、１６２または２１０位に操作されたシステインを有するＣＬドメインをさらに含んでいてもよい。

【0148】

例えば、ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５３，５６２号および米国特許第９，５２７，９２７号において番号づけされ、より詳細に議論される、ＣＨ１配列の１３８位およびＣＬ配列の１１６位、ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬ配列の１１９位、またはＣＨ１配列の１２９位およびＣＬ配列の２１０位の操作されたシステインから選択され得る。一部の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、ＥＵインデックスによって番号付けされる、ＣＨ１配列の１４１位およびＣＬ配列の１１８位に操作されたシステインを含む。

【0149】

一部の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、ＥＵインデックスによって番号付けされる、ＣＨ１配列の１６８位およびＣＬ配列の１６４位に操作されたシステインを含む。一部の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、ＥＵインデックスによって番号付けされる、ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬ配列の１１８位に操作されたシステインを含む。一部の実施形態では、ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾は、ＥＵインデックスによって番号付けされる、ＣＨ１配列の１７１位およびＣＬ配列の１６２位に操作されたシステインを含む。一部の実施形態では、ＣＬ配列はＣＬ−ラムダ配列である。好ましい実施形態では、ＣＬ配列はＣＬ−カッパ配列である。一部の実施形態では、操作されたシステインは、ＥＵインデックスによって番号付けされる、ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬカッパ配列の１１８位にある。

【0150】

下記の表８は、ＥＵインデックスに従って番号付けされる、ＣＨ１とＣＬとの間の操作されたジスルフィド架橋を含む例示的なＣＨ１／ＣＬ直交型修飾を提供する。

【表8】

【0151】

一連の好ましい実施形態では、非内在性（操作された）システインアミノ酸を提供する変異は、Ｅｕインデックスによって番号付けされる、ＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と、ＣＨ１配列における対応するＡ１４１Ｃ、またはＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異と、ＣＨ１配列における対応するＬ１２８Ｃ、ＣＬ配列におけるＴ１６４Ｃ変異と、ＣＨ１配列における対応するＨ１６８Ｃ変異、またはＣＬ配列におけるＳ１６２Ｃ変異と、ＣＨ１配列における対応するＰ１７１Ｃ変異である。
ＣＨ１／ＣＬ直交型変異：電荷対変異

【0152】

各種の実施形態では、ＣＬ配列およびＣＨ１配列における直交型修飾は電荷対変異である。本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが、相補的な電荷対変異なしのドメインとの会合と比べて、相補的な電荷対変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、ドメイン表面における残基の電荷に影響を与えるアミノ酸置換である。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特異的ドメインの間の直交型会合を改善する。電荷対変異は、米国特許第８，５９２，５６２号、米国特許第９，２４８，１８２号および米国特許第９，３５８，２８６号にさらに詳細に記載されており、このそれぞれは、それらが教示するすべてについて、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特異的ドメインの間の安定性を改善する。特定の実施形態では、電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＢｏｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄｅｓｉｇｎ ＆ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ２０１７， ｐｐ．１−１２）においてさらに詳細に記載されているように、ＥｕインデックスによってナンバリングされるＣＬ配列におけるＦ１１８Ｓ、Ｆ１１８ＡまたはＦ１１８Ｖ変異と対応するＣＨ１配列におけるＡ１４１Ｌ、またはＣＬ配列におけるＴ１２９Ｒ変異と対応するＣＨ１配列におけるＫ１４７Ｄである。

【0153】

一部の場合では、ＣＨ１／ＣＬ電荷対変異は、Ｅｕインデックスによって番号付けされる、ＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異と、ＣＨ１配列における対応するＧ１６６Ｄ、またはＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異と、ＣＨ１配列における対応するＧ１６６Ｋである。一部の実施形態では、電荷対変異は、ＣＨ１配列におけるＰ１２７Ｅ変異と、対応するＣｌ配列における対応するＥ１２３Ｋ変異である。一部の実施形態では、電荷対変異は、ＣＨ１配列におけるＰ１２７Ｋ変異と、対応するＣＬ配列における対応するＥ１２３（変異していない）である。

【0154】

下記の表９は、例示的なＣＨ１／ＣＬ直交電荷対修飾を提供する。

【表9】

６．３．１０．３．ＣＨ１／ＣＬ直交型修飾の組合せ

【0155】

ある特定の実施形態では、単一のＣＨ１／ＣＬ対のＣＨ１およびＣＬドメインは、別々に２つまたはそれよりも多くのそれぞれの直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含有する。例えば、ＣＨ１およびＣＬ配列は、第１の直交型修飾および第２の直交型修飾を内在性ＣＨ１およびＣＬ配列に含有していてもよい。内在性ＣＨ１およびＣＬ配列における２つまたはそれよりも多くのそれぞれの直交型修飾は、本明細書に記載のＣＨ１／ＣＬ直交型修飾のいずれかから選択することができる。

【0156】

一部の実施形態では、第１の直交型修飾は直交型電荷対変異であり、第２の直交型修飾は直交型の操作されたジスルフィド架橋である。一部の実施形態では、第１の直交型修飾は、表９に記載の直交型電荷対変異であり、追加の直交型修飾は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０５３，５６２号および米国特許第９，５２７，９２７号において番号付けされ、より詳細に議論される、ＣＨ１配列の１３８位およびＣＬ配列の１１６位、ＣＨ１配列の１２８位およびＣＬ配列の１１９位、またはＣＨ１配列の１２９位およびＣＬ配列の２１０位の操作されたシステインから選択される操作されたジスルフィド架橋を含む。一部の実施形態では、第１の直交型修飾は、表９に記載の直交型電荷対変異であり、追加の直交型修飾は、表８に記載の操作されたジスルフィド架橋を含む。一部の実施形態では、第１の直交型修飾は、ＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交型修飾は、同じＣＨ１配列における残基１６６の修飾および同じＣＬ配列における残基１３８の修飾を含む。一部の実施形態では、第１の直交型修飾は、ＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交型修飾は、ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｄ変異およびＣＬ配列におけるＮ１３８Ｋ変異を含む。一部の実施形態では、第１の直交型修飾は、ＣＨ１配列におけるＬ１２８Ｃ変異およびＣＬ配列におけるＦ１１８Ｃ変異を含み、第２の直交型修飾は、ＣＨ１配列におけるＧ１６６Ｋ変異およびＣＬ配列におけるＮ１３８Ｄ変異を含む。
６．３．１１．ドメインＪ（ＣＨ２）

【0157】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＪは、ＣＨ２アミノ酸配列を有する。ＣＨ２アミノ酸配列は、上記セクション６．３．５でさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、下記セクション６．３．２０．４においてより詳細に記載されているように、ドメインＪをドメインＩへ連結するＮ末端ヒンジ領域を有する。

【0158】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＪのＣ末端は、ドメインＫのＮ末端に連結されている。特定の実施形態では、ドメインＪは、下記セクション６．３．２０．５においてさらに詳細に記載されているように、ＣＨ１アミノ酸配列またはＣＬアミノ酸配列を有するドメインＫのＮ末端に連結されている。
６．３．１２．ドメインＫ（定常領域）

【0159】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＫは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＫは、下記セクション６．３．１６．２でさらに詳細に記載されているノブ−ホール直交型変異；上記６．３．４．１においてより詳細に記載されているイソアロタイプ変異；ならびに下記セクション６．３．１６．１においてより詳細に記載されている直交型変異を含有するＣＨ３ドメインと操作されたジスルフィド架橋を形成するＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃ変異のいずれかを含むＣＨ３配列である定常領域配列を有する。一部の好ましい実施形態では、イソアロタイプ変異と組み合わされたノブ−ホール直交型変異は、以下の変異変化：Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖである。

【0160】

ある特定の実施形態では、定常領域ドメイン配列は、ＣＨ１配列である。特定の実施形態では、ドメインＫのＣＨ１アミノ酸配列は、三価三重特異性結合分子における唯一のＣＨ１アミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、６．３．２０．５でさらになお詳細に後述される通り、ＣＨ１ドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続される。ある特定の実施形態では、定常領域配列は、ＣＬ配列である。ある特定の実施形態では、６．３．２０．５でさらになお詳細に後述される通り、ＣＬドメインのＮ末端は、ＣＨ２ドメインのＣ末端に接続される。ＣＨ１およびＣＬ配列は、セクション６．３．１０．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．１３．ドメインＬ（可変領域）

【0161】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＬは、可変領域ドメインアミノ酸配列を有する。セクション６．３．１にさらになお詳細に記述されている可変領域ドメインアミノ酸配列は、ＶＬおよびＶＨ抗体ドメイン配列を含む抗体の可変領域ドメインアミノ酸配列である。ＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれ上記セクション６．３．３．１および６．３．３．４においてさらに詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ドメインＬは、ＶＨ抗体ドメイン配列を有する。
６．３．１４．ドメインＭ（定常領域）

【0162】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＭは、定常領域ドメインアミノ酸配列を有する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、上記セクション６．３．４においてさらに詳細に記載されている。三価三重特異性結合分子の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を有する。別の一連の好まれる実施形態では、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を有する。ＣＨ１およびＣＬアミノ酸配列は、セクション６．３．１０．１にさらに詳細に記載されている。
６．３．１５．ドメインＡおよびＦの対形成

【0163】

三価三重特異性結合分子では、ドメインＡ ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列およびコグネートドメインＦ ＶＬまたはＶＨアミノ酸配列は会合して、抗原結合部位（ＡＢＳ）を形成する。Ａ：Ｆ抗原結合部位（ＡＢＳ）は、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＡＢＳによる抗原結合は、下記セクション６．３．１５．１においてさらに詳細に記載されている。

【0164】

様々な多価の実施形態では、ドメインＡおよびＦ（Ａ：Ｆ）によって形成されるＡＢＳは、三価三重特異性結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が同一であり、したがって、三価三重特異性結合分子内の１つまたは複数の他の配列同一ＡＢＳと同じ認識特異性を有する。

【0165】

様々な多価の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、三価三重特異性結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳと配列が非同一である。ある特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、三価三重特異性結合分子における１つまたは複数の他の配列非同一ＡＢＳと異なる認識特異性を有する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、三価三重特異性結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによって認識される抗原と異なる抗原を認識する。特定の実施形態では、Ａ：Ｆ ＡＢＳは、三価三重特異性結合分子における少なくとも１つの他の配列非同一ＡＢＳによっても認識される抗原の、異なるエピトープを認識する。この実施形態では、ドメインＡおよびＦによって形成されるＡＢＳは、抗原のエピトープを認識し、ここで、三価三重特異性結合分子内の１つまたは複数の他のＡＢＳは、同じ抗原を認識するが、同じエピトープは認識しない。
６．３．１５．１．ＡＢＳによる抗原の結合

【0166】

ＡＢＳおよびそのようなＡＢＳを含む三価三重特異性結合分子は、ＡＢＳが特異的に結合するエピトープ（またはより全体的には抗原）を「認識する」と言われ、エピトープ（またはより全体的には抗原）は、ＡＢＳの「認識特異性」または「結合特異性」と言われる。

【0167】

ＡＢＳは、特定の親和性で、その特定の抗原またはエピトープに結合すると言われる。本明細書で記載される場合、「親和性」は、１個の分子と別の分子との間の非共有結合性分子間力相互作用の強度を指す。親和性、つまり相互作用の強度は、解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）として表すことができ、ここでＫ_Ｄ値は低いほど、分子間の相互作用が強力であることを示す。抗体構築物のＫ_Ｄ値は、当技術分野で周知の方法によって測定することができ、例えば、バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））、および細胞結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の目的のために、親和性は、Ｏｃｔｅｔ／ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）を使用してバイオレイヤー干渉法によって測定された解離平衡定数である。

【0168】

「特異的結合」は、本明細書で使用される場合、ＡＢＳとそのコグネート抗原またはエピトープとの間の親和性を指し、ここでＫ_Ｄ値は、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満である。

【0169】

図２に概略化されるように、本明細書に記載される結合分子におけるＡＢＳの数は、結合分子の「価」を定義する。単一のＡＢＳを有する結合分子は「一価」である。複数のＡＢＳを有する結合分子は、「多価」であると言われる。２つのＡＢＳを有する多価結合分子は「二価」である。３つのＡＢＳを有する多価結合分子は「三価」である。４つのＡＢＳを有する多価結合分子は「四価」である。

【0170】

様々な多価の実施形態では、複数のＡＢＳは全て同じ認識特異性を有する。図２に概略化されているように、そのような結合分子は、「単一特異性」「多価」結合構築物である。他の多価の実施形態では、複数のＡＢＳの少なくとも２つが、異なる認識特異性を有する。そのような結合分子は、多価および「多重特異性」である。ＡＢＳが集約的に２つの認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は「二重特異性」である。ＡＢＳが集約的に３つの認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は「三重特異性」である。

【0171】

ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原に存在する異なるエピトープに対して複数の認識特異性を有する多価の実施形態では、結合分子は、「多重パラトピック（ｍｕｌｔｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）」である。ＡＢＳが、集約的に、同じ抗原の２つのエピトープを認識する多価の実施形態では、結合分子は、「二重パラトピック（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）」である。

【0172】

さまざまな多価の実施形態では、本明細書に記載の三価三重特異性結合分子を含む多価の結合分子は、特異的な標的に対する結合分子のアビディティを改善する。本明細書で記載される場合、「アビディティ」は、２つまたはそれより多くの分子、例えば特定の標的に対する多価結合分子間の全体的な相互作用の強度を指し、ここで、アビディティは、複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。アビディティは、上記で説明されているような、親和性を決定するために使用される方法と同じ方法によって測定することができる。ある特定の実施形態では、特定の標的に対する三価三重特異性結合分子のアビディティは、相互作用が特異的結合相互作用であり、ここで２つの分子間のアビディティは、１０^−６Ｍ、１０^−７Ｍ、１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍまたは１０^−１０Ｍ未満のＫ_Ｄ値を有する。ある特定の実施形態では、特定の標的に対する結合分子のアビディティが、相互作用が特異的結合相互作用であるＫ_Ｄ値であり、ここで個々のＡＢＳの１つまたは複数の親和性は、それらの各抗原またはエピトープ自体への特異的結合として十分なＫ_Ｄ値を有していない。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の特定の標的または複合体の別個の抗原、例えば個々の細胞で見出される別個の抗原に対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。ある特定の実施形態では、アビディティは、共通の個々の抗原の別個のエピトープに対する複数のＡＢＳの親和性によって与えられる相互作用の累積強度である。
６．３．１６．ドメインＢおよびＧの対形成

【0173】

本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子において、ドメインＢ定常領域アミノ酸配列およびドメインＧ定常領域アミノ酸配列が会合する。定常領域ドメインアミノ酸配列は、セクション６．３．４にさらになお詳細に上述されている。

【0174】

一連の好まれる実施形態では、ドメインＢおよびドメインＧは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。ＣＨ３配列は、セクション６．３．４．１にさらになお詳細に上述されている。様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は、同一である。これらの実施形態のいくつかでは、配列は、内在性ＣＨ３配列である。

【0175】

様々な実施形態では、ＢおよびＧドメインのアミノ酸配列は異なっており、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＢドメインはＧドメインと相互作用し、ＢドメインとＧドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。

【0176】

本明細書に記載される「直交型修飾」または同義的に「直交型変異」は、直交型修飾を有する第１のドメインの、相補的な直交型修飾を有する第２のドメインに対する結合の親和性を増加させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異である。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、直交型修飾を有するドメインの、相補的な直交型修飾を欠くドメインに対する親和性を減少させる。ある特定の実施形態では、直交型修飾は、内在性抗体ドメイン配列における変異である。様々な実施形態では、直交型修飾は、アミノ酸の付加または欠失を含むがこれらに限定されない、内在性抗体ドメイン配列のＮ末端またはＣ末端の修飾である。特定の実施形態では、直交型修飾には、セクション６．３．１６．１−６．３．１６．４においてさらに詳細に記載されている操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異、電荷対変異およびアイソタイプ置換が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せが含まれる。特定の実施形態では、直交型修飾は、上記セクション６．３．４．１においてさらに詳細に記載されているイソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
６．３．１６．１．直交型操作されたジスルフィド架橋

【0177】

様々な実施形態では、直交型修飾は、第１のドメインと第２のドメインとの間の操作されたジスルフィド架橋を生成する変異を含む。本明細書に記載される場合、「操作されたジスルフィド架橋」は、２つまたはそれより多いドメインが会合するとき非天然ジスルフィド結合を形成するように、２つまたはそれより多いドメインに非内在性システインアミノ酸を提供する変異である。操作されたジスルフィド架橋は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ （１９９８） １６：６７７−６８１）においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。特定の実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＫ３９２Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＤ３９９Ｃである。好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、第１または第２のＣＨ３ドメインの一方におけるＳ３５４Ｃ変異、ならびに他方のＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃである。別の好ましい実施形態では、操作されたジスルフィド架橋を生成する変異は、ＫＳＣトリペプチド配列を組み込んだＣＨ３ドメインのＣ末端の伸長によって提供される第１および第２のＣＨ３ドメインの両方における４４７Ｃ変異である。
６．３．１６．２．直交型ノブ−ホール変異

【0178】

様々な実施形態では、直交型修飾は、ノブ−ホール（同義的にノブ・イン・ホール）変異を含む。本明細書で記載される場合、ノブ−ホール変異は、第１のドメインが、相補的立体変異のないドメインとの会合と比較して、相補的立体変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、第１のドメインの表面の立体的特徴を変化させる変異である。ノブ−ホール変異は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号および米国特許第８，２１６，８０５号において、より詳細に記載されている。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ （１９９８） １６：６７７−６８１））においてさらに詳細に記載されているように、操作されたジスルフィド架橋と組み合わされる。様々な実施形態では、ノブ−ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異が組み合わされる。

【0179】

ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ｔ変異である。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＦ４０５Ａ、ならびに第２のドメインにおけるＴ３９４Ｗである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｙ変異およびＦ４０５Ａであり、第２のドメインにおけるＴ３９４ＷおよびＹ４０７Ｔである。ある特定の実施形態では、ノブ・イン・ホール変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ４０７Ａである。ある特定の実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。好ましい実施形態では、組み合わされたノブ・イン・ホール変異、イソアロタイプ変異、および操作されたジスルフィド変異は、第１のドメインにおけるＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異、ならびに第２のドメインにおけるＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異である。
６．３．１６．３．直交型電荷対変異

【0180】

様々な実施形態では、直交型修飾は、電荷対変異である。本明細書で使用される場合、電荷対変異は、ドメインが、相補的電荷対変異のないドメインとの会合と比較して、相補的電荷対変異を有する第２のドメインと優先的に会合するように、ドメインの表面のアミノ酸の電荷に影響を与える変異である。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の直交型会合を改善させる。電荷対変異は、それぞれ教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５９２，５６２号、米国特許第９，２４８，１８２号、および米国特許第９，３５８，２８６号においてより詳細に記載されている。ある特定の実施形態では、電荷対変異は、特定のドメイン間の安定性を改善させる。好ましい実施形態では、電荷対変異は、第１のドメインにおけるＴ３６６Ｋ変異、および他のドメインにおけるＬ３５１Ｄ変異である。
６．３．１６．４．ＩｇＡ−ＣＨ３アイソタイプドメイン置換

【0181】

一部の実施形態では、ＣＨ３配列を含有し得る第１および第２のドメインと、ＣＨ３配列も含有し得る第３および第４のドメインとの望ましくない会合を低減することが望ましい。このような場合において、第１および／または第２のドメインにおけるヒトＩｇＡに由来するＣＨ３配列（ＩｇＡ−ＣＨ３）の使用は、このような望ましくない会合を低減することによって、抗体の組立および安定性を改善し得る。第３および第４のドメインがＩｇＧ−ＣＨ３配列を含む結合分子の一部の実施形態では、第１および／または第２のドメインは、ＩｇＡ−ＣＨ３配列を含む。

【0182】

一部の実施形態では、第１または第２のドメインの少なくとも１つは、６．３．２０．３項に記載のＣＨ３リンカー配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２のドメインの両方とも、６．３．２０．３項に記載のＣＨ３リンカー配列を含む。一部の実施形態では、第１のドメインは第１のＣＨ３リンカー配列を含み、第２のドメインは第２のＣＨ３リンカー配列を含む。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカー配列は、第１および第２のＣＨ３リンカー配列のシステイン残基の間でのジスルフィド架橋の形成によって、第２のＣＨ３リンカー配列と会合する。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一である。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一ではない。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１〜６アミノ酸の長さで異なる。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１〜３アミノ酸の長さで異なる。

【0183】

一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーを下記の表１０に提供する。

【表10】

【0184】

好ましい実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。
６．３．１７．ドメインＥおよびＫの対形成

【0185】

様々な実施形態では、Ｅドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。

【0186】

様々な実施形態では、Ｋドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。

【0187】

様々な実施形態では、ＥおよびＫドメインのアミノ酸配列は同一であり、配列は、内在性ＣＨ３配列である。

【0188】

様々な実施形態では、ＥドメインとＫドメインの配列は異なる。様々な実施形態では、異なる配列が、それぞれ別個に直交型修飾を内在性ＣＨ３配列に含み、ここでＥドメインはＫドメインと相互作用し、ＥドメインとＫドメインのどちらも、直交型修飾を欠くＣＨ３ドメインと有意に相互作用しない。ある特定の実施形態では、直交型修飾には、６．３．１６．１〜６．３．１６．４項でさらに詳細に記載する、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異、電荷対変異およびアイソタイプ置換を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、直交型修飾には、限定されないが、操作されたジスルフィド架橋、ノブ・イン・ホール変異および電荷対変異から選択される直交型修飾の組合せを含む。特定の実施形態では、直交型修飾は、イソアロタイプ変異などの免疫原性を減少させるアミノ酸置換と組み合わせることができる。
６．３．１８．ドメインＩおよびＭならびにドメインＨおよびＬの対形成

【0189】

様々な実施形態では、ドメインＩは、ＣＬ配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１配列を有する。様々な実施形態では、ドメインＨは、ＶＬ配列を有し、ドメインＬは、ＶＨ配列を有する。好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、およびドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有する。

【0190】

様々な実施形態では、ＩドメインおよびＭドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでＩドメインはＭドメインと相互作用し、ＩドメインとＭドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｉドメインにおける直交型変異はＣＬ配列にあり、Ｍドメインにおける直交型変異はＣＨ１配列にある。ＣＨ１およびＣＬ配列に存在する直交型変異は、上のセクション６．３．１０．２により詳細に記載されている。

【0191】

様々な実施形態では、ＨドメインおよびＬドメインのアミノ酸配列は、それぞれ別個に直交型修飾を内在性配列に含み、ここでＨドメインはＬドメインと相互作用し、ＨドメインとＬドメインのどちらも、直交型修飾を欠くドメインと有意に相互作用しない。一連の実施形態では、Ｈドメインにおける直交型変異はＶＬ配列にあり、Ｌドメインにおける直交型変異はＶＨ配列にある。特定の実施形態では、直交型変異は、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異である。好ましい実施形態では、ＶＨ／ＶＬ境界での電荷対変異は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＩｇａｗａ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． Ｄｅｓ． Ｓｅｌ．， ２０１０， ｖｏｌ． ２３， ６６７−６７７）においてより詳細に記載されているように、ＶＨにおけるＱ３９Ｅと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｋ、またはＶＨにおけるＱ３９Ｋと対応するＶＬにおけるＱ３８Ｅである。

【0192】

ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。
６．３．１９．四価２×２結合分子

【0193】

様々な実施形態では、結合分子は、４つの抗原結合部位を有し、したがって「四価」と称される。

【0194】

図３４に関して、さらなる一連の実施形態では、結合分子は、第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含み、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＮおよびドメインＯをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｎ−Ｏ−Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され；（ｂ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され；（ｃ）結合分子は、第５および第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで第５のポリペプチド鎖はドメインＰおよびドメインＱを含み、ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｐ−Ｑの配向で配置され、第６のポリペプチド鎖はドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され；（ｄ）第１および第５のポリペプチドは、ＮドメインとＰドメインとの間の相互作用およびＯドメインとＱドメインとの間の相互作用を介して会合しており、第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。

【0195】

様々な実施形態では、ドメインＯは、ペプチドリンカーを介してドメインＡに連結され、ドメインＳは、ペプチドリンカーを介してドメインＨに連結される。好ましい実施形態では、ドメインＯをドメインＡに連結し、ドメインＳをドメインＨに連結するペプチドリンカーは、セクション６．３．２０．６においてより詳細に記載されているように、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。
６．３．１９．１．四価２×２二重特異性構築物

【0196】

図３４を参照して、一連の四価２×２二重特異性結合分子では、ドメインＮおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＨおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。

【0197】

図３４を参照して、別の一連の四価２×２二重特異性結合分子では、ドメインＨおよびドメインＡのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＮおよびドメインＲのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＩおよびドメインＢのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＯおよびドメインＳのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＬおよびドメインＦのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＰおよびドメインＴのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＭおよびドメインＧのアミノ酸配列は同一であり、ドメインＱおよびドメインＵのアミノ酸配列は同一であり；ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＮおよびドメインＰが、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成し、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第４の抗原結合部位を形成する。
６．３．２０．ドメインジャンクション
６．３．２０．１．ＶＬとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション

【0198】

様々な実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸は、ＶＬドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＬドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端とを連結しているジャンクションは、下記のセクション６．１３．７の表２に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で、欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＬドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。特定の実施形態では、Ａ１１１が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されており、Ｐ３４３が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失されている。別の好ましい実施形態では、Ａ１１１およびＶ１１０が、ＶＬドメインのＣ末端で欠失され、ＣＨ３ドメインのＮ末端が、Ｐ３４３Ｖ変異を有する。
６．３．２０．２．ＶＨとＣＨ３ドメインとを連結するジャンクション

【0199】

様々な実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端との間のジャンクションを形成するアミノ酸配列は、操作された配列である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインのＣ末端とＣＨ３ドメインのＮ末端を連結するジャンクションは、下記のセクション６．１３．７の表３に記載されている配列の１つである。特定の実施形態では、Ｋ１１７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失または付加されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３およびＲ３４４は、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、Ｐ３４３、Ｒ３４４およびＥ３４５が、ＣＨ３ドメインのＮ末端で欠失されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸が、ＶＨドメインのＣ末端およびＣＨ３ドメインのＮ末端の両方で欠失または付加されている。好ましい実施形態では、Ｔ１１６、Ｋ１１７およびＧ１１８が、ＶＨドメインのＣ末端で欠失されている。
６．３．２０．３．ＣＨ３のＣ末端をＣＨ２のＮ末端に連結しているジャンクション（ヒンジ）

【0200】

本明細書に記載の三価三重特異性結合分子では、ＣＨ２ドメインのＮ末端は、「ヒンジ」領域アミノ酸配列を有する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域は、抗体のＮ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントと抗体のＣＨ２ドメインとを連結している抗体重鎖の配列である。加えて、ヒンジ領域は、典型的に、Ｎ末端可変ドメイン−定常ドメインセグメントとＣＨ２ドメインとの間のフレキシビリティ、ならびに重鎖間のジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列モチーフ（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）の両方を提供する。本明細書で使用される場合、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。

【0201】

様々な実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とＣＨ２ドメインのＮ末端との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長されている。ある特定の実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＣＨ３ドメインのＣ末端とヒンジ領域との間のジャンクションにおいてＣ末端で伸長され、次いでＣＨ２ドメインのＮ末端に連結されている。好ましい実施形態では、ＣＨ３アミノ酸配列は、ＰＧＫトリペプチド配列の挿入、続いてＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフの挿入によって伸長されている。

【0202】

特定の実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成することができるアミノ酸配列を組み込んでいる。好ましい実施形態では、ＣＨ３ドメインのＣ末端における伸長は、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んでおり、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフは、カッパ軽鎖のＧＥＣモチーフを組み込んでいる別のＣＨ３ドメインの直交型Ｃ末端伸長とジスルフィド結合を形成する。
６．３．２０．４．ＣＬのＣ末端とＣＨ２のＮ末端とを連結するジャンクション（ヒンジ）

【0203】

様々な実施形態では、ＣＬアミノ酸配列は、そのＣ末端を介してヒンジ領域に連結され、次いで、ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結される。ヒンジ領域配列は、上記セクション６．３．２０．３においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ヒンジ領域アミノ酸配列は、配列番号５６である。
６．３．２０．５．ＣＨ２のＣ末端を定常領域ドメインに連結するジャンクション

【0204】

様々な実施形態では、ＣＨ２アミノ酸配列は、そのＣ末端を介して、定常領域ドメインのＮ末端に連結されている。定常領域は、上記セクション６．３．６においてより詳細に記載されている。好ましい実施形態では、ＣＨ２配列は、その内在性配列を介してＣＨ３配列に連結されている。他の実施形態では、ＣＨ２配列は、ＣＨ１またはＣＬ配列に連結されている。ＣＨ２配列のＣＨ１またはＣＬ配列への連結を議論する例が、その全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，２４２，２４７号においてより詳細に記載されている。
６．３．２０．６．三価および四価分子においてドメインＯをドメインＡにまたはドメインＳをドメインＨに連結するジャンクション

【0205】

様々な実施形態では、抗体の重鎖（例えば、第１および第３のポリペプチド鎖）が、追加のＡＢＳを提供する追加のドメインを含むようにそのＮ末端で伸長される。図２１、図２６および図３４を参照して、ある特定の実施形態では、ドメインＯおよび／またはドメインＳの定常領域ドメインアミノ酸配列のＣ末端は、それぞれ、ドメインＡおよび／またはドメインＨの可変領域ドメインアミノ酸配列のＮ末端に連結されている。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ３アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。一部の好ましい実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＬアミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＬアミノ酸配列である。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ペプチドリンカーを介して可変領域ドメインに連結されている。好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、６アミノ酸ＧＳＧＳＧＳペプチド配列である。

【0206】

様々な実施形態では、抗体の軽鎖（例えば、第２および第４のポリペプチド鎖）が、抗体の追加の可変ドメイン−定常ドメインセグメントを含むようにそのＮ末端で伸長される。ある特定の実施形態では、定常領域ドメインは、ＣＨ１アミノ酸配列であり、可変領域ドメインは、ＶＨアミノ酸配列である。
６．４．特異的二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造

【0207】

さらなる態様では、下記および６．４．１．〜６．４．５項に記載の二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子を提供する。

【0208】

図３を参照して、一連の実施形態では、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造は、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を含み、ここで（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＪはＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域ドメインアミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域ドメインアミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造を形成する。

【0209】

好ましい実施形態では、ドメインＥは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＨは、ＶＬアミノ酸配列を有し；ドメインＩは、ＣＬアミノ酸配列を有し、ドメインＫは、ＣＨ３アミノ酸配列を有し；ドメインＬは、ＶＨアミノ酸配列を有し；ドメインＭは、ＣＨ１アミノ酸配列を有する。

【0210】

ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造は、二重特異性二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造である。ある特定の実施形態では、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用が、第１の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成し、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造は、単一特異性二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造である。
６．４．１．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」

【0211】

図３および図６に関して、一連の実施形態では、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有する二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢはＴ３６６Ｋ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列、およびＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフに続くＫＳＣトリペプチド配列が組み込まれたＣ末端伸長を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＬ３５１Ｄ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列、およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフが組み込まれたＣ末端伸長を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する、結合分子を提供する。

【0212】

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号８の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号９の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．２．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」

【0213】

図３および図１４を参照して、一連の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有する二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、ＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する、結合分子を提供する。
６．４．３．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」

【0214】

図３および図１６を参照して、一連の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有する二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１ ＣＨ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する、結合分子を提供する。

【0215】

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．４．二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」

【0216】

図３および図１９を参照して、一連の実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖を有する二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子であって、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤ、およびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＢは、Ｙ３４９Ｃ変異、Ｐ３４３Ｖ変異、およびＰＧＫトリペプチド配列とそれに続くＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはＳ３５４Ｃ変異およびＴ３６６Ｗ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＧはＳ３５４Ｃ変異およびＰＧＫトリペプチド配列を組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪ、およびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＩはヒトＣＬカッパアミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、およびＫはＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＭはヒトＩｇＧ１アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合し；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造を形成し；（ｈ）ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し；（ｉ）ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する、結合分子を提供する。

【0217】

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３２の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号１０の配列を有し、および第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有する。
６．４．５．ＩｇＡ−ＣＨ３ドメイン対を有する二価結合分子

【0218】

図３に関して、一連の実施形態では、結合分子は、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を有し、（ａ）第１のポリペプチド鎖はドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＤおよびドメインＥを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅの配向で配置され、ドメインＡは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＢはヒトＩｇＡ ＣＨ３アミノ酸配列を有し、ドメインＤはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＥはヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）第２のポリペプチド鎖はドメインＦおよびドメインＧを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆ−Ｇの配向で配置され、ドメインＦは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＧはヒトＩｇＡ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３のポリペプチド鎖はドメインＨ、ドメインＩ、ドメインＪおよびドメインＫを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＨは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＩは定常領域アミノ酸配列を有し、ドメインＪはヒトＩｇＧ１ ＣＨ２アミノ酸配列を有し、ドメインＫはヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｄ）第４のポリペプチド鎖はドメインＬおよびドメインＭを有し、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｌ−Ｍの配向で配置され、ドメインＬは可変領域アミノ酸配列を有し、ドメインＭは定常領域アミノ酸配列を有し；（ｅ）第１および第２のポリペプチドは、ＡドメインとＦドメインとの間の相互作用およびＢドメインとＧドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｆ）第３および第４のポリペプチドは、ＨドメインとＬドメインとの間の相互作用およびＩドメインとＭドメインとの間の相互作用を介して会合しており；（ｇ）第１および第３のポリペプチドは、ＤドメインとＪドメインとの間の相互作用およびＥドメインとＫドメインとの間の相互作用を介して会合して、結合分子を形成する。一部の実施形態では、ドメインＡおよびドメインＦは、第１の抗原に特異的な第１の抗原結合部位を形成し、ドメインＨおよびドメインＬは、第２の抗原に特異的な第２の抗原結合部位を形成する。

【0219】

一部の実施形態では、ドメインＡはＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＦはＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＨはＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＩはＣＨ１アミノ酸配列を含み、ドメインＬはＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＭはＣＬアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ドメインＡは第１のＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＦは第１のＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＨは第２のＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＬは第２のＶＬアミノ酸配列を含む。

【0220】

好ましい実施形態では、ドメインＡはＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＦはＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＨはＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＬはＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＩはＣＬアミノ酸配列を含み、ドメインＭはＣＨ１アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＬアミノ酸配列はＣＬ−カッパ配列である。一部の実施形態では、ドメインＡは第１のＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＦは第１のＶＨアミノ酸配列を含み、ドメインＨは第２のＶＬアミノ酸配列を含み、ドメインＬは第２のＶＨアミノ酸配列を含む。

【0221】

一部の実施形態では、ドメインＥは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列にＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異をさらに含む。一部の実施形態では、ドメインＫは、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列にＹ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異をさらに含む。

【0222】

一部の実施形態では、ドメインＢは、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＤＫＴＨＴモチーフに続いて、６．３．２０．３項に記載の第１のＣＨ３リンカー配列を含み、ドメインＧは、６．３．２０．３項に記載の第２のＣＨ３リンカー配列を含む。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカー配列は、第１および第２のＣＨ３リンカー配列のシステイン残基の間でのジスルフィド架橋の形成によって、第２のＣＨ３リンカー配列と会合する。

【0223】

一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一である。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは同一ではない。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１〜６アミノ酸の長さで異なる。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーおよび第２のＣＨ３リンカーは、１〜３アミノ酸の長さで異なる。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＧＳＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。一部の実施形態では、第１のＣＨ３リンカーはＡＧＫＣであり、第２のＣＨ３リンカーはＡＧＣである。

【0224】

一部の実施形態では、結合分子は、６．３．１０．３項および６．３．１０．３項に記載の１つまたは複数のＣＨ１／ＣＬ修飾をさらに含む。

【0225】

一部の実施形態では、結合分子は、６．８．４項に記載のエフェクター機能を低減する修飾をさらに含む。
６．５．特定の三価結合分子
６．５．１．三価１×２二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×２」

【0226】

６．４．３項および図２６に関して、一連の実施形態では、上記に記載の二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子は、第６のポリペプチド鎖を含み、（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第１のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳはＹ３４９Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列、およびドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドに続いて、ＰＧＫトリペプチド配列が組み込まれたＣ末端伸長を有し；（ｂ）三価三重特異性結合分子は、ドメインＴおよびドメインＵを含む第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第１のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＳ３５４Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列、およびＰＧＫトリペプチド配列が組み込まれたＣ末端伸長を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、三価三重特異性結合分子を形成し、（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴは、第１の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。

【0227】

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号３７の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有する。
６．５．２．三価１×２三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８−１×１×１ａ」

【0228】

セクション６．４．３ならびに図２６および図３０を参照して、一連の実施形態では、上記の二価Ｂ−Ｂｏｄｙ構造に基づく三価三重特異性結合分子は、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、ここで（ａ）第３のポリペプチド鎖はドメインＲおよびドメインＳをさらに含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｒ−Ｓ−Ｈ−Ｉ−Ｊ−Ｋの配向で配置され、ドメインＲは第３のＶＬアミノ酸配列を有し、ドメインＳは、Ｔ３６６Ｋ変異およびＫＳＣトリペプチド配列とそれに続くドメインＳをドメインＨに連結するＧＳＧＳＧＳリンカーペプチドを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｂ）三価三重特異性結合分子が、第６のポリペプチド鎖をさらに含み、第６のポリペプチド鎖が、ドメインＴおよびドメインＵを含み、ここでドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ−Ｕの配向で配置され、ドメインＴは第３のＶＨアミノ酸配列を有し、ドメインＵはＬ３５１Ｄ変異およびＧＥＣアミノ酸ジスルフィドモチーフを組み込んだＣ末端伸長を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３アミノ酸配列を有し；（ｃ）第３および第６のポリペプチドは、ＲドメインとＴドメインとの間の相互作用およびＳドメインとＵドメインとの間の相互作用を介して会合して、三価三重特異性結合分子を形成し；（ｄ）ドメインＲおよびドメインＴが第３の抗原に特異的な第３の抗原結合部位を形成する。

【0229】

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号２４の配列を有し、第２のポリペプチド鎖は、配列番号２５の配列を有し、第３のポリペプチド鎖は、配列番号４５の配列を有し、第４のポリペプチド鎖は、配列番号１１の配列を有し、および第６のポリペプチド鎖は、配列番号５３の配列を有する。
６．６．他の結合分子プラットフォーム

【0230】

上述の様々な抗体プラットフォームは、限定的なものではない。特異的ＣＤＲサブセットを含む本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子は、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、ラクダ類ＶＨＨ、および当業者に公知の他の抗体断片またはフォーマットを含むがこれらに限定されない、いずれかの適合性の結合分子プラットフォームに基づくことができる。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （ＭＡＢＳ， ２０１７， Ｖｏｌ． ９， Ｎｏ． ２， １８２−２１２）に詳細に記載されている。

【0231】

一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＣｒｏｓｓＭａｂ（商標）プラットフォームに基づく。ＣｒｏｓｓＭａｂ（商標）抗体は、米国特許第８，２４２，２４７号；米国特許第９，２６６，９６７号；および米国特許第８，２２７，５７７号、米国特許出願公開第２０１２０２３７５０６号、米国特許出願公開第２００９０１６２３５９号、ＷＯ２０１６０１６２９９号、ＷＯ２０１５０５２２３０号に記載されている。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖；ならびにｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖を含む二価二重特異性抗体に基づいており、第２の抗原に特異的に結合する抗体に由来する定常ドメインＣＬおよびドメインＣＨ１は、互いに置き換えられる。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、６．４項および図３に関して構造化されたフォーマットに基づいており、ＡはＶＨであり、ＢはＣＨ１であり、ＤはＣＨ２であり、ＥはＣＨ３であり、ＦはＶＬであり、ＧはＣＬであり、ＨはＶＬまたはＶＨであり、ＩはＣＬであり、ＪはＣＨ２であり、ＫはＣＨ３であり、ＬはＶＨまたはＶＬであり、ＭはＣＨ１である。

【0232】

一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、米国特許第８，８７１，９１２号およびＷＯ２０１６０８７６５０号に記載の一般的な構造を有する抗体に基づく。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＶＬ−ＣＨ３で構成される軽鎖（ＬＣ）、およびＶＨ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３を含む重鎖（ＨＣ）を含むドメイン交換抗体に基づいており、ＬＣのＶＬ−ＣＨ３はＨＣのＶＨ−ＣＨ３と二量化し、それによりＣＨ３ＬＣ／ＣＨ３ＨＣドメイン対を含むドメイン交換ＬＣ／ＨＣ二量体を形成する。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、６．４項および図３に関して構造化されたフォーマットに基づいており、ＡはＶＨであり、ＢはＣＨ３であり、ＤはＣＨ２であり、ＥはＣＨ３であり、ＦはＶＬであり、ＧはＣＨ３であり、ＨはＶＨであり、ＩはＣＨ１であり、ＪはＣＨ２であり、ＫはＣＨ３であり、ＬはＶＬであり、ＭはＣＬである。

【0233】

一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＷＯ２０１７０１１３４２号に記載のプラットフォームに基づく。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、６．４項および図３に関して構造化されたフォーマットに基づいており、ＡはＶＨまたはＶＬであり、ＢはＩｇＭまたはＩｇＥに由来するＣＨ２であり、ＤはＣＨ２であり、ＥはＣＨ３であり、ＦはＶＬまたはＶＨであり、ＧはＩｇＭまたはＩｇＥに由来するＣＨ２であり、ＨはＶＨであり、ＩはＣＨ１であり、ＪはＣＨ２であり、ＫはＣＨ３であり、ＬはＶＬであり、ＭはＣＬである。

【0234】

一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＷＯ２００６０９３７９４号に記載のプラットフォームに基づく。一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、６．４項および図３に関して構造化されたフォーマットに基づいており、ＡはＶＨであり、ＢはＣＨ１であり、ＤはＣＨ２であり、ＥはＣＨ３であり、ＦはＶＬであり、ＧはＣＬであり、ＨはＶＬであり、ＩはＣＬまたはＣＨ１であり、ＪはＣＨ２であり、ＫはＣＨ３であり、ＬはＶＨであり、ＭはＣＨ１またはＣＬである。
６．７．抗原特異性

【0235】

本明細書に記載の結合分子に潜在的に関連する抗原結合部位は、多種多様な分子標的に特異的に結合するように選択され得る。例えば、抗原結合部位（単数または複数）は、Ｅ−Ｃａｄ、ＣＬＤＮ７、ＦＧＦＲ２ｂ、Ｎ−Ｃａｄ、Ｃａｄ−１１、ＦＧＦＲ２ｃ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＯＬＲ１、ＩＧＦ−Ｉｒａ、ＧＬＰ１Ｒ、ＰＤＧＦＲａ、ＰＤＧＦＲｂ、ＥＰＨＢ６、ＡＢＣＧ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、インテグリン−ａｖｂ３、ＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、アネキシン、ＴＮＦα、ＣＤ１３７、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、ＢＡＦＦ、ベータアミロイド、Ｃ５、ＣＡ−１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＥＡ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＴＬＡ−２、ＤＬＬ４、ＥＧＦＲ、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＲ３、ＧＤ２ガングリオシド、ＧＤＦ−８、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＣＤ２２２１、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、インテグリン、ＣＤ１１ａ、ＭＵＣ１、Ｎｏｔｃｈ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦβ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦｃ、ヘマトポエチン（４ヘリックスバンドル）（ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＩＬ−２（Ｔ細胞増殖因子）、ＩＬ−３（マルチコロニーＣＳＦ）、ＩＬ−４（ＢＣＧＦ−１、ＢＳＦ−１）、ＩＬ−５（ＢＣＧＦ−２）、ＩＬ−６ ＩＬ−４（ＩＦＮ−β２、ＢＳＦ−２、ＢＣＤＦ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３（Ｐ６００）、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５（Ｔ細胞増殖因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＯＳＭ（ＯＭ、オンコスタチンＭ）、およびＬＩＦ（白血病阻止因子）など）；インターフェロン（ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βなど）；免疫グロブリンスーパーファミリー（Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６）など）；ＴＮＦファミリー（ＴＮＦ−α（カケクチン）、ＴＮＦ−β（リンホトキシン、ＬＴ、ＬＴ−α）、ＬＴ−β、Ｆａｓ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、および４−１ＢＢＬなど）；ならびに特定のファミリーに分類されないもの（ＴＧＦ−β、ＩＬ １α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ ＲＡ、ＩＬ−１０（サイトカイン合成阻害因子Ｆ）、ＩＬ−１２（ＮＫ細胞刺激因子）、ＭＩＦ、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７（ｍＣＴＬＡ−８）、および／またはＩＬ−１８（ＩＧＩＦ、インターフェロン−γ誘導因子）など）に特異的に結合しうる；二重特異性抗体に関する実施形態では、抗体は、例えば、これらの標的のうちの２つに結合しうる。さらに、標的マスト細胞および好塩基球を標的とするためのＩｇＥ抗体のＦｃ部分の使用など、Ｆｃ受容体発現細胞を標的とするために、抗体の重鎖のＦｃ部分を使用してもよい。ＴＮＦＲ１（ＣＤ１２０ａおよびＴＮＦＲＳＦ１Ａとしても公知）、ＴＮＦＲ２（ＣＤ１２０ｂおよびＴＮＦＲＳＦ１Ｂとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ３（ＬＴβＲとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ４０およびＣＤ１３４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ５（ＣＤ４０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳおよびＣＤ９５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（ＤＣＲ３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ７（ＣＤ２７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ８（ＣＤ３０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ９（４−１ＢＢとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＴＲＡＩＬＲ１、ＤＲ４およびＣＤ２６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＴＲＡＩＬＲ２、ＤＲ５およびＣＤ２６２としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＴＲＡＩＬＲ３、ＤＣＲ１、ＣＤ２６３としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（ＴＲＡＩＬＲ４、ＤＣＲ２およびＣＤ２６４としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＲＡＮＫおよびＣＤ２６５としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＯＰＧとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＦＮ１４、ＴＷＥＡＫＲおよびＣＤ２６６としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＴＡＣＩおよびＣＤ２６７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（ＢＡＦＦＲ、ＢＲ３およびＣＤ２６８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１４（ＨＶＥＭおよびＣＤ２７０としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１６（ＮＧＦＲ、ｐ７５ＮＴＲおよびＣＤ２７１としても公知）またはＴＮＦＲＳＦ１７（ＢＣＭＡおよびＣＤ２６９としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１８（ＧＩＴＲおよびＣＤ３５７としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ１９（ＴＲＯＹ、ＴＡＪおよびＴＲＡＤＥとしても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２１（ＣＤ３５８としても公知）、ＴＮＦＲＳＦ２５（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＬＡＲＤまたはＷＳ−１としても公知）、ＥＤＡ２Ｒ（ＸＥＤＡＲとしても公知）を含むがこれらに限定されない、受容体のＴＮＦファミリーに特異的に結合する抗原結合部位（単数または複数）が選択され得る。

【0236】

限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、ＰＤＬ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＢＹ５５およびＣＧＥＮ−１５０４９などのチェックポイント阻害剤の標的を含む、免疫−腫瘍学の標的に特異的に結合する抗原結合部位（複数可）が選択され得る。

【0237】

特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、２つの腫瘍関連抗原およびＴ細胞表面発現分子に特異的に結合する抗原結合部位を有する。詳細な実施形態では、三価三重特異性結合分子は、２つの腫瘍関連抗原およびＴ細胞表面発現タンパク質のＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を有する。理論に縛られることを望まないが、２つの腫瘍抗原およびＴ細胞表面発現分子（すなわち、ＣＤ３）に特異的に結合する三価三重特異性結合分子は、Ｔ細胞が腫瘍関連抗原を発現する細胞（すなわち、標的細胞）に再指向することよって、２つの腫瘍関連抗原を発現する細胞のＴ細胞媒介死滅（細胞傷害毒性）を指向し得る。二重特異性抗ＣＤ３分子を使用するＴ細胞媒介死滅は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９３８５２号に詳細に記載されている。一部の実施形態では、Ｔ細胞表面発現分子は、Ｔ細胞の標的細胞への再指向を可能にする任意の分子から選択される。一部の実施形態では、２つの腫瘍関連抗原に対する個々のＡＢＳの１つまたは複数の親和性は、それら自身上のそれらのそれぞれの抗原またはエピトープに特異的に結合すると見なされるＫ_Ｄ値を有さないが、２つの腫瘍関連抗原を発現する特異的標的細胞に対する三価三重特異性結合分子のアビディティは、相互作用が特異的結合相互作用であるようなＫ_Ｄ値を有する。

【0238】

一連の実施形態では、腫瘍関連細胞を特異的に標的にする抗原結合部位（複数可）が選択され得る。さまざまな実施形態では、抗原結合部位（複数可）は、腫瘍関連免疫細胞を特異的に標的にする。ある特定の実施形態では、抗原結合部位（複数可）は、腫瘍関連調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を特異的に標的にする。詳細な実施形態では、結合分子は、結合分子が腫瘍関連調節性Ｔ細胞を特異的に標的にするような、ＣＤ２５、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１の１つまたは複数から選択される抗原に特異的な抗原結合部位を有する。詳細な実施形態では、結合分子は、結合分子が腫瘍関連調節性Ｔ細胞を特異的に標的にするような、ＣＤ２５およびＯＸ４０、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５およびＮＲＰ１、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０およびＮＲＰ１、またはＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１に特異的に結合する抗原結合部位を有する。好ましい実施形態では、二重特異性二価結合分子は、結合分子が腫瘍関連調節性Ｔ細胞を特異的に標的にするような、ＣＤ２５およびＯＸ４０、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５およびＮＲＰ１、ＯＸ４０およびＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０およびＮＲＰ１、またはＣＴＬＡ−４およびＮＲＰ１に特異的に結合する抗原結合部位を有する。詳細な実施形態では、腫瘍関連調節性Ｔ細胞の特異的標的化は、調節性Ｔ細胞の欠乏（例えば、死滅）をもたらす。好ましい実施形態では、調節性Ｔ細胞の欠乏は、下記の６．８．１項でより詳細に議論されるように、抗体が毒素にコンジュゲートするなどの抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の修飾によって媒介される。
６．８．さらに別の修飾

【0239】

さらなる一連の実施形態では、三価三重特異性結合分子は追加的修飾を有する。
６．８．１．抗体−薬物コンジュゲート

【0240】

様々な実施形態では、三価三重特異性結合分子は、治療剤（すなわち、薬物）にコンジュゲートされて、三価三重特異性結合分子−薬物コンジュゲートを形成する。治療剤には、化学治療剤、画像化剤（例えば、放射性同位体）、免疫調節剤（例えば、サイトカイン、ケモカイン、またはチェックポイント阻害剤）、および毒素（例えば、細胞毒性剤）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、治療剤は、下記セクション６．８．３においてより詳細に議論されているように、リンカーペプチドを介して三価三重特異性結合分子に連結されている。

【0241】

薬物を本明細書に開示される三価三重特異性結合分子にコンジュゲートするために適合しうる抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製方法は、例えば、それぞれ教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，６２４，００３号（ポット法）、米国特許第８，１６３，８８８号（ワンステップ法）、米国特許第５，２０８，０２０号（ツーステップ法）、米国特許第８，３３７，８５６号、米国特許第５，７７３，００１号、米国特許第７，８２９，５３１号、米国特許第５，２０８，０２０号、米国特許第７，７４５，３９４号、ＷＯ２０１７／１３６６２３、ＷＯ２０１７／０１５５０２、ＷＯ２０１７／０１５４９６、ＷＯ２０１７／０１５４９５、ＷＯ２００４／０１０９５７、ＷＯ２００５／０７７０９０、ＷＯ２００５／０８２０２３、ＷＯ２００６／０６５５３３、ＷＯ２００７／０３０６４２、ＷＯ２００７／１０３２８８、ＷＯ２０１３／１７３３３７、ＷＯ２０１５／０５７６９９、ＷＯ２０１５／０９５７５５、ＷＯ２０１５／１２３６７９、ＷＯ２０１５／１５７２８６、ＷＯ２０１７／１６５８５１、ＷＯ２００９／０７３４４５、ＷＯ２０１０／０６８７５９、ＷＯ２０１０／１３８７１９、ＷＯ２０１２／１７１０２０、ＷＯ２０１４／００８３７５、ＷＯ２０１４／０９３３９４、ＷＯ２０１４／０９３６４０、ＷＯ２０１４／１６０３６０、ＷＯ２０１５／０５４６５９、ＷＯ２０１５／１９５９２５、ＷＯ２０１７／１６０７５４、Ｓｔｏｒｚ （ＭＡｂｓ． ２０１５ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ； ７（６）： ９８９−１００９）、Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （Ａｄｖ Ｔｈｅｒ， ２０１７ ３４： １０１５）、Ｄｉａｍａｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ． （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ２０１６， １１４， ３６２−３６７）、Ｃａｒｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２００７． ３： ３２１−２）、Ｗｅ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ２００９． １０６： ３０００−５）、Ｒａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．， ２０１１ １４： ７９０−６）、Ｈｕｄａｋ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．， ２０１２： ４１６１−５）、Ｒａｂｕｋａ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．， ２０１２ ７：１０５２−６７）、Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．， ２０１３， １１０： ４６−５１）、Ａｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ２０１３， ２４： ８４６−８５１）、Ｂａｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ａｎｄ Ｄ．， ２０１４， １４：３４−４１）、Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．， ２０１４， ２５：１３３１−４１）、Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．， ２０１４， １３６：１０８５０−３）、Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ． （Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．， ２０１５， ２８：１７４−８０）およびＹｏｒｋ ｅｔ ａｌ． （ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１６， １６（１）：２３）に記載されている。
６．８．２．さらなる結合部分構造

【0242】

様々な実施形態では、三価三重特異性結合分子は、１つまたは複数の追加の結合部分構造を含む修飾を有する。ある特定の実施形態では、結合部分構造は、例えば、全長抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、ｓｃダイアボディ、ＤＡＲＴ、ｔａｎｄＡｂ、ミニボディ、カメリドＶＨＨ、および当業者に公知の他の抗体断片もしくはフォーマットを含むがこれらに限定されない抗体断片または抗体フォーマットである。例示的な抗体および抗体断片フォーマットは、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＢｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （ＭＡＢＳ， ２０１７， Ｖｏｌ． ９， Ｎｏ． ２， １８２−２１２）において詳細に記載されている。

【0243】

特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１または第３のポリペプチド鎖のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、第１および第３のポリペプチド鎖の両方のＣ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造の個々の部分が、機能性結合部分構造を形成するように、第１および第３のポリペプチド鎖のＣ末端に別個に連結されている。

【0244】

特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、ポリペプチド鎖のいずれか（例えば、第１、第２、第３、第４、第５、または第６のポリペプチド鎖）のＮ末端に連結されている。ある特定の実施形態では、追加の結合部分構造の個々の部分が、機能性結合部分構造を形成するように、異なるポリペプチド鎖のＮ末端に別個に連結されている。

【0245】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、三価三重特異性結合分子内のＡＢＳの異なる抗原またはエピトープに特異的である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、三価三重特異性結合分子内のＡＢＳの同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、同じ抗原またはエピトープに特異的である。修飾が２つまたはそれより多い追加の結合部分構造である特定の実施形態では、追加の結合部分構造は、異なる抗原またはエピトープに特異的である。

【0246】

ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、下記セクション６．８．３においてより詳細が議論されているように、例えば、反応性化学および親和性タグシステムを含むがこれらに限定されないｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を使用して三価三重特異性結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、Ｆｃ媒介結合（例えば、プロテインＡ／Ｇ）を介して三価三重特異性結合分子に連結される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の追加の結合部分構造は、例えば、三価三重特異性結合分子と追加の結合部分構造との融合産物のヌクレオチド配列を同じ発現ベクター（例えば、プラスミド）にコード化するなどの組換えＤＮＡ技術を使用して、三価三重特異性結合分子に連結される。
６．８．３．官能基／反応基

【0247】

様々な実施形態では、三価三重特異性結合分子は、例えば追加の部分構造（例えば、上記セクション６．８．１および６．８．２においてより詳細が議論されている薬物コンジュゲートおよび追加の結合部分構造）の連結などの下流プロセスおよび下流精製プロセスにおいて使用することができる、官能基または化学的反応性基を含む修飾を有する。

【0248】

ある特定の実施形態では、修飾は、例えば、反応性チオール（例えば、マレイミド系反応性基）、反応性アミン（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド系反応性基）、「クリック化学」基（例えば、反応性アルキン基）、およびホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を保持するアルデヒド類を含むがこれらに限定されない化学的反応性基である。ある特定の実施形態では、修飾は、親和性ペプチド配列（例えば、ＨＡ、ＨＩＳ、ＦＬＡＧ、ＧＳＴ、ＭＢＰおよびＳｔｒｅｐシステムなど）を含むがこれらに限定されない官能基である。ある特定の実施形態では、官能基または化学的反応性基は、開裂可能なペプチド配列を有する。特定の実施形態では、開裂可能なペプチドは、光開裂、化学開裂、プロテアーゼ開裂、還元条件、およびｐＨ条件を含むがこれらに限定されない手段によって開裂される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞内プロテアーゼによって実施される。特定の実施形態では、プロテアーゼ開裂は、細胞外または膜会合プロテアーゼによって実施される。プロテアーゼ開裂を採用するＡＤＣ治療は、教示する全てについて参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈｏｉ ｅｔ ａｌ． （Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ， ２０１２； ２（２）： １５６−１７８．）においてより詳細に記載されている。
６．８．４．低減されたエフェクター機能

【0249】

ある特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、抗体結合に通常関連するエフェクター機能を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異を有する。エフェクター機能としては、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体固定（例えば、Ｃ１ｑ結合）、抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、オプソニン化など、抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体結合に起因する細胞機能が挙げられるがこれらに限定されない。エフェクター機能を低減させる操作された変異は、それの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０１３７５３０号、Ａｒｍｏｕｒ， ｅｔ ａｌ． （Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９（８） （１９９９） ２６１３−２６２４）、Ｓｈｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６（９） （２００１） ６５９１−６６０４）およびＯｇａｎｅｓｙａｎ， ｅｔ ａｌ． （Ａｃｔａ Ｃｒｉｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｄ６４ （２００８） ７００−７０４）により詳細に記載されている。

【0250】

特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、ＦｃＲ受容体による三価三重特異性結合分子のＦｃ部分の結合を低減させる抗体ドメインのアミノ酸配列における１つまたは複数の操作された変異を有する。一部の実施形態では、ＦｃＲ受容体は、ＦｃＲγ受容体である。特定の実施形態では、ＦｃＲ受容体は、ＦｃγＲＩＩａおよび／またはＦｃγＲＩＩＩＡ受容体である。

【0251】

特定の実施形態では、エフェクター機能を低減させる１つまたは複数の操作された変異は、抗体のＣＨ２ドメインにおける変異である。様々な実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４およびＬ２３５位に存在する。特定の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａである。他の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に存在する。特定の実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇである。好まれる実施形態では、１つまたは複数の操作された変異は、ＣＨ２ドメインのＬ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｋである。
６．９．精製方法

【0252】

Ｂ−ｂｏｄｙプラットフォームを含む三価三重特異性結合分子を精製する方法が本明細書に提供される。

【0253】

一連の実施形態では、方法は、ｉ）三価三重特異性結合分子を含む試料をＣＨ１結合試薬と接触させるステップであって、三価三重特異性結合分子が、複合体において会合した少なくとも第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含み、複合体が、少なくとも１つのＣＨ１ドメインまたはその部分を含み、複合体におけるＣＨ１ドメインの数が、複合体の価数（ｖａｌｅｎｃｙ）よりも少なくとも１つ少なく、接触が、ＣＨ１結合試薬がＣＨ１ドメインまたはその部分に結合するのに十分な条件下で行われる、ステップと；ｉｉ）１つまたは複数の不完全複合体から複合体を精製するステップであって、不完全複合体が、第１、第２、第３および第４のポリペプチド鎖を含まない、ステップとを含む。

【0254】

典型的な天然に存在する抗体において、Ｎ末端からＣ末端へナンバリングされた第２のドメインとしてＣＨ１ドメインをそれぞれ有する、２つの重鎖が会合する。よって、典型的な抗体は、２つのＣＨ１ドメインを有する。ＣＨ１ドメインは、セクション６．３．１０．１により詳細に記載されている。本明細書に記載されている種々の三価三重特異性結合分子において、タンパク質におけるＣＨ１ドメインの数が有効に低減されるように、タンパク質に典型的に見出されるＣＨ１ドメインは、別のドメインに置換されている。非限定的な説明目的の例では、典型的な抗体のＣＨ１ドメインをＣＨ３ドメインに置換し、単一のＣＨ１ドメインのみを有する抗原結合タンパク質を生成することができる。

【0255】

三価三重特異性結合分子は、典型的な抗体アーキテクチャをもはや保有しないように操作された抗体アーキテクチャに基づく分子を指すこともできる。例えば、抗体は、そのＮまたはＣ末端において拡張して、抗原結合タンパク質の価数（セクション６．３．１５．１により詳細に記載されている）を増加させることができ、ある特定の実例では、ＣＨ１ドメインの数も、典型的な２つのＣＨ１ドメインを越えて増加される。このような分子は、タンパク質におけるＣＨ１ドメインの数が、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも１つ少なくなるように、そのＣＨ１ドメインのうち１つまたは複数を置換させることもできる。一部の実施形態では、他のドメインによって置換されるＣＨ１ドメインの数は、単一のＣＨ１ドメインのみを有する三価三重特異性結合分子を生成する。他の実施形態では、別のドメインによって置換されるＣＨ１ドメインの数は、２つまたはそれよりも多いが、抗原結合タンパク質の価数よりも少なくとも１つ少ないＣＨ１ドメインを有する三価三重特異性結合分子を生成する。特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子が２つまたはそれよりも多いＣＨ１ドメインを有する場合、複数のＣＨ１ドメインは全て、同じポリペプチド鎖に存在することができる。他の特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子が２つまたはそれよりも多いＣＨ１ドメインを有する場合、複数のＣＨ１ドメインは、完全複合体に存在する同じポリペプチド鎖の複数コピーにおける単一のＣＨ１ドメインとなることができる。
６．９．１．ＣＨ１結合試薬

【0256】

三重特異性三価結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、三価三重特異性結合分子を含む試料は、ＣＨ１結合試薬と接触される。本明細書に記載されているＣＨ１結合試薬は、ＣＨ１エピトープに特異的に結合するいずれかの分子となることができる。ＣＨ１エピトープをもたらす様々なＣＨ１配列は、セクション６．３．１０．１により詳細に記載されており、特異的結合は、セクション６．３．１５．１により詳細に記載されている。

【0257】

一部の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来し、ＣＨ１エピトープに特異的に結合する抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する。特定の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、「抗ＣＨ１抗体」とも称される抗体である。抗ＣＨ１抗体は、種々の種に由来することができる。特定の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヤギおよびヒト抗体を含むがこれらに限定されない、哺乳動物抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、単一ドメイン抗体である。本明細書に記載されている単一ドメイン抗体は、ＡＢＳを形成し、ＣＨ１エピトープに特異的に結合する単一の可変ドメインを有する。例示的な単一ドメイン抗体としては、それが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれる、国際出願ＷＯ２００９／０１１５７２により詳細に記載されているラクダおよびサメに由来する重鎖抗体が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、ラクダ由来の抗体（「ラクダ類抗体」とも称される）である。例示的なラクダ類抗体としては、ヒトＩｇＧ−ＣＨ１ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１９４３２００１０）およびヒトＩｇＡ−ＣＨ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１９４３１１０１０）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は典型的に、培養されている抗体産生細胞系から産生される。他の実施形態では、抗ＣＨ１抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、それぞれがＣＨ１エピトープを認識する異なる抗ＣＨ１抗体の集合体である。ポリクローナル抗体は典型的に、目的の抗原またはその断片、この場合はＣＨ１で免疫化した動物の抗体含有血清を収集することにより産生される。

【0258】

一部の実施形態では、ＣＨ１結合試薬は、免疫グロブリンタンパク質に由来しない分子である。このような分子の例としては、Ｐｅｒｒｅｔ ａｎｄ Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ （Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｆｅｂ． ２０１８， Ｖｏｌ １４５：９８−１１２）により詳細に記載されている通り、アプタマー、ペプトイドおよびアフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）が挙げられるがこれらに限定されない。
６．９．２．固体支持体

【0259】

三重特異性三価結合分子を精製する例示的で非限定的な方法において、ＣＨ１結合試薬は、本発明の様々な実施形態では、固体支持体に取り付けることができる。本明細書に記載されている固体支持体は、他の実体、例えば、ＣＨ１結合試薬を取り付けるまたは固定化することができる材料を指す。「担体」とも称される固体支持体は、国際出願ＷＯ２００９／０１１５７２により詳細に記載されている。

【0260】

特定の実施形態では、固体支持体は、ビーズまたはナノ粒子を含む。ビーズおよびナノ粒子の例としては、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、磁気ナノ粒子（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ポリマー（例えば、デキストラン）、合成ポリマー（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標））、またはＣＨ１結合試薬の取付けに適した他のいずれかの材料が挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、固体支持体は、ＣＨ１結合試薬の取付けを可能にするように修飾される。固体支持体修飾の例としては、タンパク質と共有結合を形成する化学修飾（例えば、活性化されたアルデヒド基）、およびＣＨ１結合試薬のコグネート修飾と特異的に対形成する修飾（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン対、ジスルフィド連結、ポリヒスチジン−ニッケル、またはアジド−アルキニル対などの「クリックケミストリー」修飾）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0261】

ある特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子へのＣＨ１結合試薬接触に先立ち、ＣＨ１結合試薬は、固体支持体に取り付けられ、「抗ＣＨ１樹脂」とも本明細書で称される。一部の実施形態では、抗ＣＨ１樹脂は、溶液中に分散される。他の実施形態では、抗ＣＨ１樹脂は、カラム内に「充填される」。次に、抗ＣＨ１樹脂は、三価三重特異性結合分子と接触され、ＣＨ１結合試薬は、三価三重特異性結合分子に特異的に結合する。

【0262】

他の実施形態では、ＣＨ１結合試薬が三価三重特異性結合分子に接触した後に、ＣＨ１結合試薬は、固体支持体に取り付けられる。非限定的な例証として、ビオチン修飾を有するＣＨ１結合試薬は、三価三重特異性結合分子と接触させることができ、その後、ＣＨ１結合試薬／三価三重特異性結合分子混合物は、ストレプトアビジン修飾固体支持体と接触させて、三価三重特異性結合分子に特異的に結合されたＣＨ１結合試薬を含むＣＨ１結合試薬を固体支持体に取り付けることができる。

【0263】

ＣＨ１結合試薬が固体支持体に取り付けられる方法において、種々の実施形態では、結合された三重特異性三価結合分子は、固体支持体から放出または「溶出」され、三価三重特異性結合分子を有する溶出液を形成する。一部の実施形態では、対形成した修飾を反転させる（例えば、ジスルフィド連結の還元）、三価三重特異性結合分子と競合して外すための試薬を添加する（例えば、ニッケルへの結合に関してポリヒスチジンと競合するイミダゾールの添加）、三価三重特異性結合分子を切断して外す（例えば、修飾に切断可能部分が含まれていてよい）、または三価三重特異性結合分子に対するＣＨ１結合試薬の特異的結合に他の仕方で干渉することにより、結合された三重特異性三価結合分子が放出される。特異的結合に干渉する方法としては、ＣＨ１結合試薬に結合された三重特異性三価結合分子と低ｐＨ溶液との接触が挙げられるがこれに限定されない。好まれる実施形態では、低ｐＨ溶液は、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４．０を含む。他の実施形態では、結合された三重特異性三価結合分子は、ある範囲の低ｐＨ溶液、すなわち、「勾配」と接触させることができる。
６．９．３．さらなる精製

【0264】

例示的で非限定的な方法の一部の実施形態では、三価三重特異性結合分子をＣＨ１結合試薬と接触させ、続いて三価三重特異性結合分子を溶出するステップを使用した方法の単一の反復が使用されて、１つまたは複数の不完全複合体から三価三重特異性結合分子を精製する。特定の実施形態では、他の精製ステップは行われない。他の実施形態では、１つまたは複数の追加的な精製ステップが行われて、１つまたは複数の不完全複合体から三価三重特異性結合分子をさらに精製する。１つまたは複数の追加的な精製ステップとしては、サイズ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィ）、電荷（例えば、イオン交換クロマトグラフィ）または疎水性（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィ）などの他のタンパク質特徴に基づく三価三重特異性結合分子の精製が挙げられるがこれらに限定されない。好まれる実施形態では、追加的な陽イオン交換クロマトグラフィが行われる。その上、上述のＣＨ１結合試薬と三価三重特異性結合分子との接触を繰り返すと共に、反復間のＣＨ１精製方法を修飾して、例えば、第１の反復のための溶出ステップおよびその後の溶出のための勾配溶出を使用して、三価三重特異性結合分子は、さらに精製することができる。
６．９．４．複合体のアセンブリおよび純度

【0265】

本発明の実施形態では、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖が、一体に会合して、完全複合体、すなわち、三価三重特異性結合分子を形成する。しかし、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖を含有しない不完全複合体を形成する場合もある。例えば、ポリペプチド鎖のうち１、２または３つのみを有する不完全複合体を形成し得る。他の例では、不完全複合体は、４つ以上のポリペプチド鎖を含有することができるが、少なくとも４つの別個のポリペプチド鎖を含有しない、例えば、不完全複合体は、別個のポリペプチド鎖の２つ以上のコピーと不適切に会合する。本発明の方法は、不完全複合体から複合体、すなわち、完全にアセンブルした三重特異性三価結合分子を精製する。

【0266】

精製ステップの有効性および効率を評価するための方法は、当業者にとって周知であり、そのようなものとしては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよび質量分析が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、種々の判断基準に従って評価することもできる。判断基準の例としては、１）完全にアセンブルされた三重特異性三価結合分子によって提供される溶出液における総タンパク質のパーセンテージの評価、２）所望の産物を精製するための方法の倍数濃縮またはパーセント増加の評価、例えば、溶出液における完全にアセンブルされた三重特異性三価結合分子によって提供される総タンパク質の、出発試料におけるものとの比較、３）特異的な望まれない産物（例えば、会合していない単一のポリペプチド鎖、ポリペプチド鎖のいずれかの組合せの二量体、またはポリペプチド鎖のいずれかの組合せの三量体）のパーセントまたはパーセント減少の決定を含む、望まれない産物、例えば、上述の不完全複合体の総タンパク質のパーセンテージ、またはパーセント減少の評価が挙げられるがこれらに限定されない。純度は、本明細書に記載されている方法のいずれかの組合せの後に評価することができる。例えば、純度は、本明細書に記載されている通り、抗ＣＨ１結合試薬を使用した単一の反復の後に、またはセクション６．９．３により詳細に記載されている通り、追加的な精製ステップの後に評価することができる。精製ステップの有効性および効率を使用して、抗ＣＨ１結合試薬を使用して記載されている方法を、プロテインＡ精製などの当業者にとって公知の他の精製方法と比較することもできる。
６．１０．製造方法

【0267】

本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子は、抗体製造のために現在使用されている、標準無細胞翻訳、一過性トランスフェクションおよび安定したトランスフェクションアプローチを使用した発現により容易に製造することができる。特定の実施形態では、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅなどのＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのプロトコールおよび試薬、またはそれが教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＦａｎｇ ｅｔ ａｌ． （Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ， ２０１７， １９：１１）に詳細に記載されているポリエチレンイミンなどの当業者にとって公知の他の試薬を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を三価三重特異性結合分子の産生のために使用することができる。

【0268】

後述する実施例にさらに記載されている通り、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＣＨ１樹脂などのＣＨ１親和性樹脂およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから提供されたプロトコールを使用して、発現されたタンパク質は、望まれないタンパク質およびタンパク質複合体から容易に分離することができる。他の精製戦略としては、プロテインＡ、プロテインＧまたはプロテインＡ／Ｇ試薬の使用が挙げられるがこれらに限定されない。当技術分野でルーチンに使用される通り、イオン交換クロマトグラフィを使用して、さらなる精製をもたらす（ａｆｆｅｃｔ）ことができる。
６．１１．医薬組成物

【0269】

別の態様では、本明細書に記載される三価三重特異性結合分子と、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物が提供される。典型的な実施形態では、医薬組成物は滅菌される。

【0270】

様々な実施形態では、医薬組成物は、三価三重特異性結合分子を０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、三価三重特異性結合分子を、０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、三価三重特異性結合分子を、１０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で含む。ある特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、またはさらには５０ｍｇ／ｍｌもしくはそれより高い濃度で存在する。特定の実施形態では、三価三重特異性結合分子は、５０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で存在する。

【0271】

様々な実施形態では、医薬組成物は、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，９６１，９６４号、米国特許第８，９４５，８６５号、米国特許第８，４２０，０８１号、米国特許第６，６８５，９４０号、米国特許第６，１７１，５８６号、米国特許第８，８２１，８６５号、米国特許第９，２１６，２１９号、米国特許出願第１０／８１３，４８３号、ＷＯ２０１４／０６６４６８、ＷＯ２０１１／１０４３８１およびＷＯ２０１６／１８０９４１においてより詳細に記載されている。
６．１２．処置方法

【0272】

別の態様では、処置方法であって、患者の処置に有効な量で、本明細書に記載されている三価三重特異性結合分子を患者に投与するステップを含む方法が提供される。

【0273】

一部の実施形態では、本開示の抗体は、がんを処置するために使用されうる。がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、上咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮由来のがんとなることができる。一部の実施形態では、がんは、新生物、悪性腫瘍；癌腫；未分化の癌腫；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；ピロマトリックス癌；移行上皮癌；乳頭移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管細胞癌；肝細胞癌；混合型肝細胞癌および肝細胞癌；小柱状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；家族性大腸ポリポーシスの腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支（ｂｒａｎｃｈｉｏｌｏ）−肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭状濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性腺管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；乳房のパジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌：扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質性腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性セルトリ間質細胞腫瘍；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；小リンパ球型悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；およびヘアリー細胞白血病であり得る。

【0274】

本開示の抗体は、例えば、がん、自己免疫、移植拒絶反応、外傷後の免疫応答、移植片対宿主病、虚血、脳卒中、および感染症の処置のために、例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０などのウイルス抗原を標的とすることにより、それ自体または医薬組成物の形態で、対象に投与することができる。
６．１３．

【実施例】

【0275】

以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定するものではない。
６．１３．１．方法

【0276】

様々な抗原結合タンパク質の精製のための非限定的な説明目的の方法、および様々なアッセイにおけるそれらの使用は、下により詳細に記載されている。
６．１３．１．１．Ｅｘｐｉ２９３発現

【0277】

製造業者の使用説明書に従ってＥｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して、検査されている様々な抗原結合タンパク質を発現させた。簡潔に説明すると、４つの個々の鎖をコードする４つのプラスミドを、他に記述がなければ１：１：１：１質量比で混合し、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３トランスフェクションキットを用いてＥｘｐｉ ２９３細胞へとトランスフェクトした。細胞を３７℃で、８％ＣＯ２、１００％湿度にて、１２５ｒｐｍで振盪しつつ培養した。トランスフェクトした細胞に、トランスフェクションの１６〜１８時間後に１回栄養供給した。２０００ｇで１０分間の遠心分離により、５日目に細胞を回収した。親和性クロマトグラフィ精製のために上清を収集した。
６．１３．１．２．プロテインＡおよび抗ＣＨ１精製

【0278】

様々な抗原結合タンパク質を含有する清澄化された上清を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣにおいてプロテインＡ（ＰｒｏｔＡ）樹脂または抗ＣＨ１樹脂のいずれかを使用して分離した。直接（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較が行われた例において、様々な抗原結合タンパク質を含有する上清を、２つの等しい試料へと分割した。ＰｒｏｔＡ精製のため、１ｍＬプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳ（５ｍＭリン酸ナトリウム・リン酸カリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐＨ７．４、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で平衡化した。５ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。０．１Ｍ酢酸ｐＨ４．０を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。抗ＣＨ１精製のため、１ｍＬ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＸＬカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＰＢＳで平衡化した。５ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。０．１Ｍ酢酸ｐＨ４．０を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、解析のために溶出ピークをプールした。
６．１３．１．３．ＳＤＳ−Ｐａｇｅ解析

【0279】

様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物、不完全産物の存在および全体的な純度に関して、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。２μｇの各試料を、１５μＬ ＳＤＳローディング緩衝剤に添加した。還元試料は、１０ｍＭ還元剤の存在下で７５℃にて１０分間インキュベートした。非還元試料は、還元剤なしで９５℃にて５分間インキュベートした。還元および非還元試料を、ランニング緩衝剤により４〜１５％勾配ＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ）にロードし、３０分間２５０ボルトでランを行った。ランの完了後に、ゲルをＤＩ水で洗浄し、ＧｅｌＣｏｄｅ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して染色した。解析に先立ちゲルをＤＩ水で脱染した。脱染したゲルのスキャンした画像のデンシトメトリー解析を、標準画像解析ソフトウェアを使用して行って、各試料におけるバンドの相対的存在量を計算した。
６．１３．１．４．ＩＥＸクロマトグラフィ

【0280】

様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、完全産物の不完全産物および不純物に対する比に関して陽イオン交換クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ ＦＰＬＣにおける５ｍｌ ＭｏｎｏＳ（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）により解析した。ＭｏｎｏＳカラムを緩衝剤Ａ、１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０で平衡化した。２ｍｌ／分にて試料をカラムにロードした。６ＣＶにわたる緩衝剤Ｂ（１０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ６．０、１Ｍ塩化ナトリウム）による０〜３０％勾配を使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により試料の純度を計算して、単量体ピークおよび夾雑物ピークの存在量を同定した。単量体ピークおよび夾雑物ピークは、上述のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析のために別々にプールした。
６．１３．１．５．分析的ＳＥＣクロマトグラフィ

【0281】

様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料は、単量体の高分子量産物および不純物に対する比に関して分析的サイズ排除クロマトグラフィにより解析した。清澄化された上清は、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣにおける業界標準ＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により解析した。ＴＳＫカラムをＰＢＳで平衡化した。１ｍｇ／ｍＬの各試料２５μＬを、１ｍｌ／分にてカラムにロードした。１．５ＣＶのＰＢＳの均一濃度の流れを使用して試料を溶出した。２８０ｎｍの吸光度により溶出をモニターし、ピーク積分により溶出ピークを解析した。
６．１３．１．６．質量分析

【0282】

様々な分離された抗原結合タンパク質を含有する試料を、質量分析により解析して、分子量により正確な種を確認した。全解析は、第三者研究機関により行われた。簡潔に説明すると、試料は、酵素のカクテルで処置して、グリコシル化を除去した。試料は両者共に還元フォーマットで検査して、分子量により各鎖を特異的に同定した。試料は全て、非還元条件下で検査して、試料における全ての複合体の分子量を同定した。質量スペクトル解析を使用して、分子量に基づき特有の産物の数を同定した。
６．１３．１．７．ファージディスプレイによる抗体発見

【0283】

ヒトＦａｂライブラリのファージディスプレイは、標準プロトコールを使用して行われる。目的のビオチン化抗原は、購入されるか、または合成される。標準プロトコールを使用したファージＥＬＩＳＡにより、目的の抗原に結合する能力に関してファージクローンをスクリーニングする。簡潔に説明すると、ファージにおける複製および発現が可能な発現ベクター（ファージミドとも称される）を使用して、Ｆａｂフォーマットされたファージライブラリを構築する。重鎖および軽鎖の両方が、同じ発現ベクターにおいてコードされており、重鎖は、ファージコートタンパク質ｐＩＩＩのトランケートバリアントに融合された。軽鎖および重鎖−ｐＩＩＩ融合体は、別々のポリペプチドとして発現され、細菌周辺質においてアセンブルし、そこで、レドックス潜在力が、ジスルフィド結合形成を可能にして、候補ＡＢＳを含有するファージディスプレイ抗体を形成する。ライブラリにおいて使用されるファージディスプレイ重鎖（配列番号７４）および軽鎖（配列番号７５）足場は、下に収載されており、それによると、小文字「ｘ」は、ライブラリを作成するために変動されたＣＤＲアミノ酸を表し、太字イタリック体は、一定であったＣＤＲ配列を表す。

【0284】

特異的ライブラリは、ＶＬ ＣＤＲ配列およびＶＨ ＣＤＲ配列に多様性を導入することによって生成される。多様性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｕｎｋｅｌ， ＴＡ （ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ １， １９８５． ８２ （２） ４８８−４９２）により詳細に記載されている通り、自然抗体レパートリーにおいて見出される多様性を模倣するためにＶＬ ＣＤＲ３、ならびにＶＨ ＣＤＲ１（Ｈ１）、ＣＤＲ２（Ｈ２）およびＣＤＲ３（Ｈ３）に多様性を導入するプライマーを使用する、Ｋｕｎｋｅｌ変異生成によって作成される。簡潔に説明すると、標準手順を使用して、単離されたファージから一本鎖ＤＮＡを調製し、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発を実行する。次に、化学合成されたＤＮＡを電気穿孔してＴＧ１細胞に入れ、続いて回収する。回収された細胞を継代培養し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染させて、ファージライブラリを産生する。

【0285】

標準手順を使用してファージパニングを行う。簡潔に説明すると、ファージパニングの第１のラウンドは、ＰＢＳＴ−２％ＢＳＡにおける１ｍＬの体積で、調製されたライブラリ由来の約５×１０^１２個のファージに晒した、ストレプトアビジン磁気ビーズに固定化された標的により行う。１時間インキュベーション後に、ビーズに結合したファージを、磁気スタンドを使用して上清から分離する。ビーズを３回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、次いでこれを、ＯＤ_６００約０．６のＥＲ２７３８細胞（５ｍＬ）に添加する。２０分後に、感染した細胞を、２５ｍＬ ２×ＹＴ＋アンピシリンおよびＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージにおいて継代培養し、激しく振盪しつつ一晩３７℃で育成する。翌日、ＰＥＧ沈殿による標準手順を使用してファージを調製する。ＳＡＶコーティングされたビーズに特異的なファージのプレクリアランス（Ｐｒｅ−ｃｌｅａｒａｎｃｅ）をパニングに先立ち行う。標準手順を使用した１００ｎＭビーズ固定化抗原によるＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁気ビーズハンドラーを使用して、パニングの第２のラウンドを行う。総計して、３〜４ラウンドのファージパニングを行って、標的抗原に特異的なＦａｂをディスプレイするファージを濃縮する。標的特異的濃縮は、ポリクローナルおよびモノクローナルファージＥＬＩＳＡを使用して確認する。ＤＮＡ配列決定を使用して、候補ＡＢＳを含有する単離されたＦａｂクローンを決定する。

【0286】

抗原結合剤発見キャンペーンにおいて結合親和性を測定するために、上述のファージスクリーニングにおいて同定されたＶＬおよびＶＨドメインを、二価単一特異性ネイティブヒト全長ＩｇＧ１アーキテクチャへとフォーマットし、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤー（ｂｉｏｌａｙｅｒ）干渉計におけるバイオセンサーに固定化した。目的の可溶性抗原は、次いで、系に添加され、結合が測定される。

【0287】

Ｂ−ｂｏｄｙフォーマットを使用して行われる実験のため、下に示す通り、また、図３を参照する通り、個々のクローンのＶＬ可変領域を二価１×１ Ｂ−ｂｏｄｙ「ＢＣ１」足場のドメインＡおよび／またはＨへとフォーマットし、ＶＨ領域をそのドメインＦおよび／またはＬへとフォーマットする。

【0288】

「ＢＣ１」足場：
第１のポリペプチド鎖（配列番号７８）
ドメインＡ＝抗原１ Ｂ−ｂｏｄｙドメインＡ／Ｈ足場（配列番号７６）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（配列番号７９）：
ドメインＦ＝抗原１ Ｂ−ｂｏｄｙドメインＦ／Ｌ足場（配列番号７７）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ；４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号８０）：
ドメインＨ＝抗原２ Ｂ−ｂｏｄｙドメインＡ／Ｈ足場（配列番号７６）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（配列番号８１）：
ドメインＬ＝抗原２ Ｂ−ｂｏｄｙドメインＦ／Ｌ足場（配列番号７７）
ドメインＭ＝ＣＨ１。

【0289】

ＢＣ１ １×２フォーマットのために、可変ドメインは、上記の鎖１、２および４、ならびに配列番号８２の配列を有する鎖３のスキャフォールドにフォーマット化され、ドメインＳおよびドメインＨの間のジャンクションは、配列ＴＡＳＳＧＧＳＳＳＧ（配列番号８３）を有する１０アミノ酸リンカーである。ポリペプチド鎖２および鎖６は、１×２フォーマットにおいて同一である。
６．１３．１．８．ＮＦκＢ ＧＦＰ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞刺激アッセイ

【0290】

ＮＦκＢ／Ｊｕｒｋａｔ／ＧＦＰ転写レポーター細胞系は、Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｔ＃ＴＲ８５０−１）から購入した。同時刺激に使用された抗ＣＤ２８抗体は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｃａｔ ５５５７２５）から購入した。溶液Ｃバックグラウンド抑制色素は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｋ１０３７）から購入した。簡潔に説明すると、９６ウェルの黒色の壁と透明な底のプレートにおいて、Ｂ−ｂｏｄｙ（商標）抗体の希釈系列および１ｕｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体の存在下、Ｊｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞、Ｅ）を腫瘍細胞（Ｔ）と２：１〜４：１のＥ：Ｔ比で混合した。プレートを３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートし、その後、溶液Ｃバックグラウンドサプレッサーの６×溶液をプレートに添加し、プレートリーダーにおいてＧＦＰ蛍光を読み出した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すＥＣ５０値を、希釈系列から決定した。
６．１３．１．９．初代Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ

【0291】

標的腫瘍抗原を発現する細胞（Ｔ）およびエフェクター細胞（Ｅ）を３：１〜１０：１に及ぶＥ：Ｔ比で混合した。使用されたエフェクター細胞は、ＰＢＭＣまたは単離された細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。候補の再び方向付けるＴ細胞抗体は、希釈系列で細胞に添加した。対照は、培地のみ対照、腫瘍細胞のみ対照、および無処置Ｅ：Ｔ細胞対照を含んだ。混合した細胞および対照条件を３７℃／５％ＣＯ_２で４０〜５０時間インキュベートした。Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ（ＬＤＨ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｃａｔ ４７４４９３４００１）から購入し、製造業者の指示に従った。簡潔に説明すると、腫瘍細胞に添加した溶解溶液は、１００％細胞傷害性対照とし、無処置Ｅ：Ｔ細胞は、０％細胞傷害性対照とした。各試料における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）のレベルは、４９０ｎｍの吸光度により決定し、１００％および０％対照に対して正規化した。最大半量応答を生じる抗体の濃度を指すＥＣ５０値を、希釈系列から決定した。
６．１３．２．
（実施例１）
二価単一特異性構築物および二価の二重特異性構築物

【0292】

ＴＮＦαを認識する二価単一特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを、標準的な分子生物学的手法を使用して、以下の構成（ＶＬ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ノブ）−ＣＨ２−ＣＨ３／ＶＨ（セルトリズマブ）−ＣＨ３（ホール））で構築した。この構築物において、
第１のポリペプチド鎖（配列番号１）
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ノブ：Ｓ３５４Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖（配列番号２）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）（ホール：Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第３のポリペプチド鎖：
第１のポリペプチド鎖と同一
第４のポリペプチド鎖：
第２のポリペプチド鎖と同一。

【0293】

ドメインおよびポリペプチド鎖の参照は、図３に従う。構築物の全体の構成を図４に示す。「（ＶＬ）」と略記して特定されているドメインＡを有する第１のポリペプチド鎖の配列は、配列番号１で提供される。「（ＶＨ）」と略記して特定されているドメインＦを有する第２のポリペプチド鎖の配列は、配列番号２で提供される。

【0294】

全長構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ無細胞タンパク質合成発現系で、約１８時間、２６℃で穏やかに撹拌しながら発現させた。発現後、無細胞抽出物を遠心分離して、不溶性物質をペレット化し、上清を、１０×カイネティックバッファー（Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ）で２倍希釈して、バイオレイヤー干渉のための検体として使用した。

【0295】

ビオチン化ＴＮＦαを、ストレプトアビジンセンサーに固定化し、約１．５ｎｍのウェーブシフト応答に付した。１０×カイネティックバッファーでベースラインを確立した後、センサーを、抗体構築物検体溶液中に浸漬した。構築物は、セルトリズマブの従来のＩｇＧフォーマットに匹敵する約３ｎｍの応答を与え、機能性の全長抗体へと組み立てられる二価単一特異性構築物の能力を実証した。結果を図５に示す。

【0296】

本発明者らはまた、以下のドメイン構成を有する二価の二重特異性抗体を構築した：
第１のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３（ノブ）
第２のポリペプチド鎖：ＶＨ−ＣＨ３
第３のポリペプチド鎖：ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３（ホール）
第４のポリペプチド鎖 ＶＨ−ＣＨ１。

【0297】

配列（可変領域配列を除く）を、配列番号３（第１のポリペプチド鎖）、配列番号４（第２のポリペプチド鎖）、配列番号５（第３のポリペプチド鎖）、配列番号６（第４のポリペプチド鎖）でそれぞれ示す。
６．１３．３．
（実施例２）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１」

【0298】

本発明者らは、ＰＤ１および第２の抗原「抗原Ａ」に特異的な「ＢＣ１」と称する二価の二重特異性構築物を構築した。「ＢＣ１」構成の顕著な特徴を、図６に示す。

【0299】

さらに詳細に、図３に従ってドメインおよびポリペプチド鎖の参照を示し、天然の配列からの修飾を括弧内に示すと、構成は、以下の通りであった：
第１のポリペプチド鎖（配列番号８）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（配列番号９）：
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ；４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号１０）：
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。

【0300】

Ａドメイン（配列番号１２）およびＦドメイン（配列番号１６）は、「抗原Ａ」に特異的な抗原結合部位（Ａ：Ｆ）を形成する。Ｈドメインは、ニボルマブ由来のＶＨ配列を有し、Ｌドメインは、ニボルマブ由来のＶＬ配列を有し；ＨおよびＬは会合して、ヒトＰＤ１に特異的な抗原結合部位（Ｈ：Ｌ）を形成する。

【0301】

Ｂドメイン（配列番号１３）は、いくつかの変異、つまりＴ３６６Ｋ、４４５Ｋ、４４６Ｓおよび４４７Ｃ挿入を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。Ｔ３６６Ｋ変異は、ドメインＧにおけるＬ３５１Ｄ残基の電荷対コグネートである。ドメインＢにおける「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＫＳＣトリペプチド挿入に由来するものである。

【0302】

ドメインＤ（配列番号１４）は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２の配列を有する。

【0303】

ドメインＥ（配列番号１５）は、変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。３６６Ｗは、「ノブ」変異である。３５４Ｃは、ドメインＫにおけるコグネート３４９Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。

【0304】

ドメインＧ（配列番号１７）は、以下の変異：Ｌ３５１Ｄ、および４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃトリペプチド挿入を有する、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。Ｌ３５１Ｄ変異は、ドメインＢ Ｔ３６６Ｋ変異に対する電荷対コグネートを導入する。ドメインＧの「４４７Ｃ」残基は、Ｃ末端ＧＥＣトリペプチド挿入に由来する。

【0305】

ドメインＩ（配列番号１９）は、ヒトＣカッパ軽鎖（Ｃκ）の配列を有する。

【0306】

ドメインＪ［配列番号２０］は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインの配列を有し、ドメインＤの配列と同一である。

【0307】

ドメインＫ［配列番号２１］は、以下の変化：Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３の配列を有する。３４９Ｃ変異は、ドメインＥのコグネート３５４Ｃ変異とジスルフィド結合を形成することができるシステインを導入する。３５６ＥおよびＬ３５８Ｍは、免疫原性を減少させるイソアロタイプアミノ酸を導入する。３６６Ｓ、３６８Ａおよび４０７Ｖは、「ホール」変異である。

【0308】

ドメインＭ［配列番号２３］は、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域の配列を有する。

【0309】

「ＢＣ１」は、哺乳動物発現を使用して１００μｇ／ｍｌを超える濃度で、高レベルで容易に発現することができる。

【0310】

本発明者らは、二価の二重特異性「ＢＣ１」タンパク質が、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＣＨ１特異的ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）親和性樹脂を使用して単一ステップで容易に精製することができることを見出した。

【0311】

図７Ａに示すように、ＳＥＣ解析は、単一ステップのＣＨ１親和性精製ステップにより、ゲル濾過を介して、＞９８％がモノマーである単一の単分散ピークが得られることを実証する。図７Ｂは、ＣｒｏｓｓＭａｂ二価抗体構築物のＳＥＣ解析の比較文献データを示す。

【0312】

図８Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであって、単一のタイトなピークが示されている。図８Ｂは、標準的なプロテインＡ精製を使用して精製した後の「ＢＣ１」の陽イオン交換クロマトグラフィ溶出プロファイルであり、不完全な組み立て産物の同時精製と一致する追加的な溶出ピークを示す。

【0313】

図９は、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン３でみられるように、ＣＨ１親和性樹脂を用いた「ＢＣ１」の単一ステップの精製により、ほぼ均一な単一バンドが得られる。レーン４は、続いて陽イオン交換仕上げ工程で最小の追加的な精製を行ったものを示す。レーン７は、比較による、標準的なプロテインＡ精製を使用した軽度の精製を示し、レーン８〜１０は、陽イオン交換クロマトグラフィを使用した、プロテインＡ精製物質のさらなる精製を示す。

【0314】

図１０は、非還元および還元条件下の両方での単一ステップのＣＨ１−親和性精製後の「ＢＣ１」のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＡ）を、参照文献で公開されている非還元および還元条件下のＣｒｏｓｓＭａｂ二重特異性抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（パネルＢ）と比較した図である。

【0315】

図１１は、還元条件下の２つの別個の重鎖（図１１Ａ）、および２つの別個の軽鎖（図１１Ｂ）を実証する「ＢＣ１」の質量分析の解析を示す。図１２における質量分析データは、精製後の不完全対形成の非存在を確認する。

【0316】

加速安定性試験を実行して、「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙ設計の長期安定性を評価した。精製されたＢ−ＢｏｄｙをＰＢＳバッファー中８．６ｍｇ／ｍｌに濃縮して４０℃でインキュベートした。構造的完全性をＳｈｏｄｅｘ ＫＷ−８０３カラムを備えた分析的サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を使用して毎週測定した。構造的完全性を、凝集物の形成と関連させて、無傷のモノマーのパーセンテージ（％モノマー）を測定することによって決定した。データを図１３に示す。ＩｇＧ対照１は、良好な安定性特性を有する陽性対照である。ＩｇＧ対照２は、インキュベーション条件下で凝集することが公知の陰性対照である。「ＢＣ１」Ｂ−Ｂｏｄｙは、分析的ＳＥＣで決定されるように、構造的完全性を何ら失うことなく、８週間、インキュベートされた。

【0317】

また、二価構築物のＴＭは約７２℃であり、本発明者らは、「ＢＣ１」が高い耐熱性を有すると決定した。

【0318】

表１は、重要な開発性特徴について、「ＢＣ１」とＣｒｏｓｓＭａｂとを比較する。

【表1】

＊Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１１ Ｊｕｌ ５；１０８（２７）：１１１８７−９２）からのデータ
６．１３．４．
（実施例３）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ６」

【0319】

本発明者らは、「ＢＣ６」と称する二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙを構築した。「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」と同様であるが、ドメインＢの残基３６６およびドメインＧの残基３５１で野生型残基を保持していることを除いてＢＣ１と同一であった。したがって「ＢＣ６」は、「ＢＣ１」のドメインＢとドメインＧにおける正しい対形成を容易にするように設計された電荷対コグネートＴ３６６ＫおよびＬ３５１Ｄを欠く。「ＢＣ６」構成の顕著な特徴を図１４に示す。

【0320】

「ＢＣ１」に存在する電荷対残基の非存在にもかかわらず、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ６」の単一ステップの精製は、高度に均質な試料をもたらすことが分かった。図１５Ａは、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ６」のＳＥＣ解析を示す。データは、単一のステップＣＨ１親和性精製によって、「ＢＣ１」での観察と同様に、単一の単分散ピークが得られることを実証し、ポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖２との間およびポリペプチド鎖３とポリペプチド鎖４との間のジスルフィド結合が無傷のままであることを実証する。またクロマトグラムは、非共有結合性の凝集物が存在しないことも示す。

【0321】

図１５Ｂは、非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、レーン１は単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第１のロットをローディングしたものであり、レーン２は、単一ステップのＣＨ１親和性精製後の「ＢＣ６」の第２のロットをローディングしたものである。レーン３および４は、ＣＨ１親和性精製に続けてイオン交換クロマトグラフィを用いて達成しうるさらなる精製を実証する。
６．１３．５．
（実施例４）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ３１」

【0322】

本発明者らは、ドメインＢおよびＧのＣＨ３境界内の操作されたジスルフィドを「ＢＣ１」および「ＢＣ６」に存在するＣ末端ジスルフィドに対する代替的Ｓ−Ｓ連結として有する二価１×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ２８」、「ＢＣ２９」、「ＢＣ３０」および「ＢＣ３１」を構築した。文献は、ＣＨ３境界のジスルフィド結合が、Ｆｃ ＣＨ３ドメインの状況で直交性を行使するには不十分であることを示している。これらのＢ−Ｂｏｄｙ構築物の全体の構成を図１６に概略化し、「ＢＣ２８」の顕著な特徴を下記に示す：
ポリペプチド鎖１：「ＢＣ２８」鎖１（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
ポリペプチド鎖２：「ＢＣ２８」鎖２（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ポリペプチド鎖３：「ＢＣ１」鎖３（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
ポリペプチド鎖４：「ＢＣ１」鎖４（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。

【0323】

「ＢＣ２８」Ａ：Ｆ抗原結合部位は、「抗原Ａ」に特異的である。「ＢＣ２８」Ｈ：Ｌ抗原結合部位は、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的である。「ＢＣ２８」ドメインＢは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入を有する。「ＢＣ２８」ドメインＥは、野生型ＣＨ３と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗを有する。「ＢＣ２８」ドメインＧは、野生型と比較して以下の変化：Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入を有する。

【0324】

したがって、「ＢＣ２８」は、ドメインＢの残基３４９Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの残基３５４Ｃに操作されたシステインを有する（「３４９Ｃ−３５４Ｃ」）。

【0325】

「ＢＣ２９」は、ドメインＢの残基３５１ＣおよびドメインＧの３５１Ｃに、操作されたシステインを有する（「３５１Ｃ−３５１Ｃ」）。「ＢＣ３０」は、ドメインＢの残基３５４ＣおよびドメインＧの３４９Ｃに操作されたシステインを有する（「３５４Ｃ−３４９Ｃ」）。ＢＣ３１は、残基３９４Ｃに操作されたシステイン、およびドメインＧの３９４Ｃに操作されたシステイン（「３９４Ｃ−３９４Ｃ」）を有する。ＢＣ３２は、ドメインＢの残基４０７ＣおよびドメインＧの４０７Ｃに操作されたシステインを有する（「４０７Ｃ−４０７Ｃ」）。

【0326】

図１７は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１および３は、無傷の「ＢＣ２８」（レーン１）および「ＢＣ３０」（レーン３）の高レベルの発現および実質的な均一性を示す。レーン２は、ＢＣ２９のオリゴマー化を示す。レーン４および５は、ＢＣ３１およびＢＣ３２の乏しい発現をそれぞれ示し、ＢＣ３２の連結が不十分であることを示す。別の構築物ＢＣ９（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって報告された、ドメインＢの残基３９２およびドメインＧの３９９に導入されたシステインを有し（「３９２Ｃ−３９９Ｃ」）、ジスルフィド対を形成する構築物）は、ＳＤＳ ＰＡＧＥでオリゴマー化を示した（データは示さず）。

【0327】

図１８は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用したワンステップ精製後の「ＢＣ２８」および「ＢＣ３０」のＳＥＣ解析を示す。さらに本発明者らは、「ＢＣ２８」が、プロテインＡ樹脂を使用した単一ステップの精製を使用して容易に精製することができることを実証した（結果は示さず）。
６．１３．６．
（実施例５）
二価の二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」

【0328】

図１９は、本発明者らの現行の好ましい二価の二重特異性１×１構築物である二価の二重特異性１×１ Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ４４」の一般的構成を示す。
第１のポリペプチド鎖（「ＢＣ４４」鎖１）（配列番号３２）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｐ３４３Ｖ；Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＥ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」ポリペプチド鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖３）（配列番号１０）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」ポリペプチド鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
６．１３．７．
（実施例６）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作

【0329】

本発明者らは、ドメインＡとＢとの間のＶＬ−ＣＨ３ジャンクション、ならびにドメインＦとＧとの間のＶＨ−ＣＨ３ジャンクションを変異させた一連のバリアントを作製し、二価１×１ Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物の発現レベル、組み立て、および安定性を評価した。多くの解決策がありうるが、本発明者らは、Ｔ細胞エピトープの導入を減少させるために、ＶＬ、ＶＨおよびＣＨ３ドメイン内で天然に見出される残基のみを使用することを選択した。ドメイン構成の構造的評価は、好ましい配列組合せをさらに限定する。下記表２および表３は、「ＢＣ１」および他の二価構築物に基づくいくつかのジャンクションバリアントについてのジャンクションを示す。

【表2】

【表3】

【0330】

図２０は、４０℃での加速安定性試験プロトコールにおける示された週数での「ＢＣ１５」および「ＢＣ１６」試料のサイズ排除クロマトグラフィを示す。「ＢＣ１５」は安定なままであった；「ＢＣ１６」は、経時的に不安定となることが分かった。
６．１３．８．
（実施例７）
三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＢＣ１−２×１」）

【0331】

本発明者らは、「ＢＣ１」に基づいて三価２×１二重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ「ＢＣ１−２×１」を構築した。構成の顕著な特徴を図２２に示す。

【0332】

より詳細には、図２１に要約されているドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＮ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＯ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４４７Ｃ）
ドメインＡ＝ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、４４７Ｃ）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
第５のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＰ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＱ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖２）
ドメインＦ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４７Ｃ）
第３のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖３）
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１

【0333】

図２３は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｅｘｐｉ２９３一過性トランスフェクション系を使用して発現されたタンパク質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【0334】

レーン１は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の三価２×１「ＢＣ１−２×１」タンパク質の溶離液を示す。レーン２は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の、より分子量が低く、移動が速い、二価「ＢＣ１」タンパク質を示す。レーン３〜５は、プロテインＡを使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。レーン６および７は、ＣＨ１親和性樹脂を使用した「ＢＣ１−２×１」の精製を示す。

【0335】

図２４は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）解析を使用して、二価「ＢＣ１」構築物のアビディティを、三価２×１「ＢＣ１−２×１」構築物のアビディティと比較したものである。ビオチン化抗原「Ａ」を表面に固定化し、その表面上を、結合解析のために、抗体構築物に通過させる。
６．１３．９．
（実施例８）
三価２×１三重特異性Ｂ−Ｂｏｄｙ構築物（「ＴＢ１１１」）

【0336】

本発明者らは、図２５に概略化された構成を有する三価２×１三重特異性分子「ＴＢ１１１」を設計した。図２１に示すドメイン命名規則を参照して、ＴＢ１１１は、以下の構成を有する（「Ａｄａ」は、アダリムマブ由来のＶ領域を示す）：
ポリペプチド鎖１
ドメインＮ：ＶＨ（「Ａｄａ」）
ドメインＯ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３９４Ｃ）
ドメインＡ：ＶＬ（「抗原Ａ」）
ドメインＢ：ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ、３４９Ｃ）
ドメインＤ：ＣＨ２
ドメインＥ：ＣＨ３（ノブ、３５４Ｃ）
ポリペプチド鎖５
ドメインＰ：ＶＬ（「Ａｄａ」）
ドメインＱ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３９４Ｃ）
ポリペプチド鎖２
ドメインＦ：ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＧ：ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、３５１Ｃ）
ポリペプチド鎖３
ドメインＨ：ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ：ＣＬ（カッパ）
ドメインＪ：ＣＨ２
ドメインＫ：ＣＨ３（ホール、３４９Ｃ）
ポリペプチド鎖４（＝「ＢＣ１」鎖４）
ドメインＬ：ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ：ＣＨ１
この構築物は、発現しなかった。
６．１３．１０．
（実施例９）
三価１×２二重特異性構築物（「ＢＣ２８−１×２」）

【0337】

本出願人らは、次のドメイン構造を有する三価１×２二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙを構築した：
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）（配列番号２４）
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号３７）
ドメインＲ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）：
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１
第６のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＴ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）。

【0338】

Ｈ：Ｌ結合抗原結合部位と同様に、Ａ：Ｆ抗原結合部位は「抗原Ａ」に特異的である。Ｒ：Ｔ抗原結合部位は、ＰＤに対して特異的である。この構築物の特異性は、したがって抗原「Ａ」×（ＰＤ１−抗原「Ａ」）である。
６．１３．１１．
（実施例１０）
三価１×２二重特異性構築物（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）

【0339】

本発明者らは、図２７に概略化した一般構造を有する、三価１×２二重特異性分子（「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」）を構築した。ドメインの命名法を図２６に示す。

【0340】

図２８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、ここで非還元および還元条件下の「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」構築物を示すレーンを枠で囲っている。

【0341】

図２９は、２つの抗体「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」および「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」の抗原結合を比較している。「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」は、ＣＴＬＡ４に一価的に結合する一方、「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」は、ＣＴＬＡ４に二価的に結合する。
６．１３．１２．
（実施例１１）
三価１×２三重特異性構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」

【0342】

本発明者らは、図３０に概略化した一般構造を有する三価１×２三重特異性分子を構築した。図２６に示すドメインの命名法を参照して、
第１のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖１）［配列番号２４］
ドメインＡ＝ＶＬ（抗原「Ａ」）
ドメインＢ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
ドメインＤ＝ＣＨ２
ドメインＥ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ）
第２のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ２８」鎖２）（配列番号２５）
ドメインＦ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＧ＝ＣＨ３（Ｓ３５４Ｃ；４４５Ｐ、４４６Ｇ、４４７Ｋ挿入）
第３のポリペプチド鎖（配列番号４５）
ドメインＲ＝ＶＬ（ＣＴＬＡ４−４）
ドメインＳ＝ＣＨ３（Ｔ３６６Ｋ；４４５Ｋ、４４６Ｓ、４４７Ｃ挿入）
リンカー＝ＧＳＧＳＧＳ
ドメインＨ＝ＶＬ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＩ＝ＣＬ
ドメインＪ＝ＣＨ２
ドメインＫ＝ＣＨ３（Ｙ３４９Ｃ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）
第４のポリペプチド鎖（＝「ＢＣ１」鎖４）（配列番号１１）
ドメインＬ＝ＶＨ（「Ｎｉｖｏ」）
ドメインＭ＝ＣＨ１。
第６のポリペプチド鎖（＝ｈＣＴＬＡ４−４鎖２）（配列番号５３）
ドメインＴ＝ＶＨ（ＣＴＬＡ４）
ドメインＵ＝ＣＨ３（Ｌ３５１Ｄ、４４５Ｇ、４４６Ｅ、４４７Ｃ挿入）

【0343】

この三重特異性構築物の抗原結合部位は、以下の通りであった：
抗原結合部位Ａ：Ｆは、「抗原Ａ」に特異的であった；
抗原結合部位Ｈ：Ｌは、ＰＤ１（ニボルマブ配列）に特異的であった；
抗原結合部位Ｒ：Ｔは、ＣＴＬＡ４に特異的であった。

【0344】

図３１は、単一の明確に確定されるピークを示す、一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の「ＢＣ２８−１×１×１ａ」のサイズ排除クロマトグラフィを示す。
６．１３．１３．
（実施例１２）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析

【0345】

図３２は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

【0346】

レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、三価の二重特異性２×１構築物「ＢＣ１−２×１」である（実施例７参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、三価１×２二重特異性構築物「ＣＴＬＡ４−４×Ｎｉｖｏ×ＣＴＬＡ４−４」である（実施例１０参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。

【0347】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１３．１４．
（実施例１３）
結合解析

【0348】

図３３は、３つの抗原：ＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ−４へのＯｃｔｅｔ結合解析を示す。それぞれの場合において、抗原が固定化され、Ｂ−Ｂｏｄｙが検体である。参照のために、１×１二重特異性の「ＢＣ１」と「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」も比較すると、１×１ Ｂ−Ｂｏｄｙが、抗原結合部位が選択される抗原のみに特異的に結合することが実証された。

【0349】

図３３Ａは、「ＢＣ１」がＰＤ１および抗原「Ａ」に結合するが、ＣＴＬＡ４に結合しないことを示す。図３３Ｂは、二価の二重特異性１×１構築物「ＣＴＬＡ４−４×ＯＸ４０−８」がＣＴＬＡ４に結合するが、抗原「Ａ」またはＰＤ１に結合しないことを示す。図３３Ｃは、三価三重特異性１×２構築物「ＢＣ２８−１×１×１ａ」がＰＤ１、抗原「Ａ」およびＣＴＬＡ４に結合することを示す。
６．１３．１５．
（実施例１４）
四価構築物

【0350】

図３５は、２×２四価二重特異性構築物「ＢＣ２２−２×２」の全体の構成を示す。２×２四価二重特異性は、それぞれの可変ドメイン−定常ドメインセグメントを複製することによって「ＢＣ１」足場で構築した。ドメインの命名法を図３４に概略化する。

【0351】

図３６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン７〜９は、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後（「ＣＨ１溶離液」）、およびさらにイオン交換クロマトグラフィ精製した後（レーン８、「ＩＥＸ後のｐｋ１」；レーン９、「ＩＥＸ後のｐｋ２」）の「ＢＣ２２−２×２」四価構築物をそれぞれ示す。レーン１〜３は、ＣＨ１親和性精製した後（レーン１）、レーン２および３はさらにイオン交換クロマトグラフィした後の三価２×１構築物「ＢＣ２１−２×１」である。レーン４〜６は、１×２三価構築物「ＢＣ１２−１×２」である。

【0352】

図３７は、２×２四価構築物全体の構成を示す。

【0353】

図３９および４０は、代替的な構成を有する四価構築物の概略図である。ドメインの命名法を図３８に示す。
６．１３．１６．
（実施例１５）
Ｂ−Ｂｏｄｙによる二重特異性抗原係合

【0354】

四価二重特異性２×２ Ｂ−Ｂｏｄｙ「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ ２×２」を構築した。より詳細には、図３８にまとめたドメインおよびポリペプチド鎖の参照を使用して、
第１のポリペプチド鎖
ドメインＡ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＢ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＤ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＥ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第３のポリペプチド鎖（第１のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＨ＝ＶＬ（セルトリズマブ）
ドメインＩ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ノブ）
ドメインＪ＝ＣＨ２（ＩｇＧ１）
ドメインＫ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１）
ドメインＷＷ＝ＶＨ（抗原「Ａ」）
ドメインＸＸ＝ＣＨ１（ＩｇＧ１）
第２のポリペプチド鎖
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第４のポリペプチド鎖（第３のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＦ＝ＶＨ（セルトリズマブ）
ドメインＧ＝ＣＨ３（ＩｇＧ１、ホール）
第７のポリペプチド鎖
ドメインＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺ＝ＣＬカッパ
第８のポリペプチド鎖（第７のポリペプチド鎖と同一）
ドメインＹＹ＝ＶＨ（「抗原Ａ」）
ドメインＺＺ＝ＣＬカッパ。

【0355】

これを、実施例１に記載されるようにクローニングし、発現させた。ここで、ＢＬＩ実験は、ビオチン化抗原「Ａ」のストレプトアビジンセンサー上への固定化、その後の１０×カイネティックバッファーを用いたベースラインの確立で構成した。次いで、センサーを、無細胞発現された「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ ２×２」中に浸漬し、次いで、新たなベースラインを確立した。最終的に、センサーを、第２の結合事象が観察された１００ｎＭ ＴＮＦαに浸漬し、単一の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ ２×２」構築物による両方の抗原の二重特異性結合を確認した。結果を図４１に示す。
６．１３．１７．
（実施例１６）
「ＢＢ−ＩｇＧ ２×２」の抗原特異的細胞結合

【0356】

Ｅｘｐｉ−２９３細胞を、Ｅｘｐｉ−２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ｍｏｃｋトランスフェクトするかまたは抗原「Ｂ」で一過性トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、Ｅｘｐｉ−２９３細胞を回収し、４％パラホルムアルデヒド中で１５分間、室温で固定化した。細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄した。２００，０００抗原ＢまたはＭｏｃｋトランスフェクトされたＥｘｐｉ−２９３細胞を、Ｖ底９６ウェルプレート内の１００μＬのＰＢＳ中に入れた。細胞を、３ｕｇ／ｍＬの濃度の「Ｂ−Ｂｏｄｙ−ＩｇＧ ２×２」と１．５時間、室温でインキュベートした。細胞を、３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、８μｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト第２抗体と室温で１時間インキュベートした。細胞を３００×Ｇで７分間遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、細胞結合をＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅを使用してフローサイトメトリーによって確認した。結果を図４２に示す。
６．１３．１８．
（実施例１７）
二価および三価構築物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析

【0357】

図４５は、それぞれ一過性発現およびＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＨ１親和性樹脂を使用してワンステップ精製した後の様々な構築物の、非還元および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。

【0358】

レーン１（非還元条件）およびレーン２（還元条件、＋ＤＴＴ）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ１」である。レーン３（非還元）およびレーン４（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ２８」である（実施例４参照）。レーン５（非還元）およびレーン６（還元）は、二価１×１二重特異性構築物「ＢＣ４４」である（実施例５参照）。レーン７（非還元）およびレーン８（還元）は、三価１×２二重特異性「ＢＣ２８−１×２」構築物である（実施例９参照）。レーン９（非還元）およびレーン１０（還元）は、実施例１１に記載の三価１×２三重特異性「ＢＣ２８−１×１×１ａ」構築物である。

【0359】

ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、各構築物の完全なアセンブリを実証しており、各構築物について、非還元ゲルの主要なバンドが、予測される分子量で示されている。
６．１３．１９．
（実施例１８）
可変−ＣＨ３ジャンクション操作の安定性解析

【0360】

様々なジャンクションバリアントの組合せ間の対形成安定性を評価した。示差走査蛍光定量を行って、鎖１のＶＬ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＡおよびＢ）と鎖２のＶＨ−ＣＨ３ポリペプチド（ドメインＦおよびＧ）との間の様々なジャンクションバリアント対形成の融点を決定した。ジャンクションバリアント「ＢＣ６ｊｖ」、「ＢＣ２８ｊｖ」、「ＢＣ３０ｊｖ」、「ＢＣ４４ｊｖ」および「ＢＣ４５ｊｖ」（それぞれ、上記表２および表３でみられる「ＢＣ６」、「ＢＣ２８」、「ＢＣ３０」、「ＢＣ４４」および「ＢＣ４５」の対応するジャンクション配列を有する）は、７６〜７７度の範囲のＴｍを有し、対形成安定性の増加を実証する（表４参照）。図４６は、「ＢＣ２４ｊｖ」、「ＢＣ２６ｊｖ」および「ＢＣ２８ｊｖ」の熱転移の差異を示し、「ＢＣ２８ｊｖ」が３つの中で安定性が最も大きいことを実証している。図のｘ軸は温度であり、ｙ軸は温度変化で割った蛍光変化（−ｄＦｌｕｏｒ／ｄＴｅｍｐ）である。実験は、教示する全てについて参照により本明細書に組み込まれるＮｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， （２００７） ２， ２２１２ − ２２２１）に記載されているように行った。

【表4】

６．１３．２０．
（実施例１９）
ＣＤ３候補結合分子

【0361】

後述する通り、様々なＣＤ３抗原結合部位を構築し検査した。
６．１３．２０．１．ＣＤ３結合アーム

【0362】

ＳＰ３４抗ＣＤ３抗体（ＳＰ３４−８９、配列番号６８および６９）のヒト化バージョンに基づく一連のＣＤ３結合アームバリアントを、ＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（配列番号７０〜７３）のいずれかにおける点変異により操作した。表５に記載されている通り、様々なＶＨおよびＶＬ配列を一体に対形成させた。

【表5】

【0363】

ＶＬおよびＶＨバリアントは、１×１ ＢＣ１ Ｂ−ｂｏｄｙの一方のアームへとクローニングし、一方、他方のアームは、無関係抗原結合部位を含有した。図４７は、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤーインターフェロメトリー解析によって決定された、非変異誘発ＳＰ３４−８９一価Ｂ−ｂｏｄｙの結合親和性を実証する。構築物の２倍系列希釈（２００〜１２．５ｎＭ）を使用して、ＳＰ３４−８９に対する２３ｎＭの結合親和性を決定し（ｋ_ｏｎ＝３×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、ｋ_ｏｆｆ＝７．１×１０^−３ｓ^−１）、これは、文献における他のＳＰ３４バリアントに対する親和性にマッチする。動態親和性も、平衡結合親和性にマッチした。
６．１３．２０．２．ＣＤ３結合アーム発見

【0364】

Ｆａｂ ＣＤＲに多様性が導入された化学合成Ｆａｂファージライブラリを、モノクローナルファージＥＬＩＳＡフォーマットを使用してＣＤ３抗原に対してスクリーニングし、それによると、プレート固定化されたＣＤ３バリアントが、上述の通りファージへの結合に関して評価された。ＣＤ３抗原を認識したＦａｂを発現するファージクローンを配列決定した。表Ａは、ＣＤ３抗原結合部位の候補を列挙する。興味深いことに、ＣＤ３−８は、ヒトおよびカニクイザルのＣＤ３抗原と交差反応性であった。

【表A】

６．１３．２１．
（実施例２０）
二重特異性Ｂ−ｂｏｄｙ単一ステップの精製

【0365】

二重特異性抗体の抗ＣＨ１精製効率も、二重特異性抗体のＦｃ部分内のそのネイティブ位置に見出されるＣＨ３ドメインに導入された標準ノブ・ホール直交型変異のみを有し、他のドメイン修飾がない結合分子に関して検査した。したがって、検査した２種の抗体ＫＬ２７−６およびＫＬ２７−７はそれぞれ、抗体の各アームに１つが存在する、２つのＣＨ１ドメインを含有した。セクション６．１３．１により詳細に記載されている通り、各二重特異性抗体を発現させ、抗ＣＨ１カラムにおいて望まれないタンパク質産物から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいてランを行った。図４８に示す通り、不完全二重特異性抗体を表す７５ｋＤａの有意なバンドが存在し、これは、図３を参照すると、（ｉ）第１および第２の、または（ｉｉ）第３および第４のポリペプチド鎖のみを含有する複合体として解釈される。よって、抗ＣＨ１を使用して、各アームにＣＨ１ドメインを有する完全二重特異性分子を精製する方法は、不完全抗体複合体によるバックグラウンドコンタミネーションをもたらした。
６．１３．２２．
（実施例２１）
エフェクター機能を低減させるＦｃ変異

【0366】

一連の操作されたＦｃバリアントを、モノクローナルＩｇＧ１抗体トラスツズマブ（ハーセプチン、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）において生成し、これは、ＣＨ２ドメインのＬ２３４、Ｌ２３５およびＰ３２９位に変異を有する。検査したバリアントの特異的変異は、下の表６に記載されており、ｓＦｃ１（ＰＡＬＡＬＡ）、ｓＦｃ７（ＰＧＬＡＬＡ）およびｓＦｃ１０（ＰＫＬＡＬＡ）を含む。すべてのバリアントは、本明細書に記載の通り、Ｅｘｐｉ２９３発現によって作製した。

【表6】

【0367】

タンパク質の融解温度は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。簡潔には、目的のタンパク質を１ｍｇ／ｍｌの濃度にした。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｄｙｅ ｍｉｘ（水、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ緩衝液およびＴｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｄｙｅ）を目的のタンパク質に添加した。タンパク質／ｔｈｅｒｍａｌ ｄｙｅ ｍｉｘを、ガラスキャピラリー管に添加し、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒにおける温度勾配を使用して分析した。タンパク質を、３７℃で２分間インキュベートした後、０．１℃／秒の温度上昇速度で３７℃〜９９℃の温度勾配を開始した。蛍光の増加を経時的に測定し、これを使用して、熱融解温度を計算した。表６は、上記のＰｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ実験からの結果を表す。すべてのバリアントは、野生型ＩｇＧと同等の安定性を示した。

【0368】

ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントをＯｃｔｅｔバイオセンサーに固定化し、可溶性ＦｃγＲＩａを系に添加して、結合を決定した。図４９は、トラスツズマブへのＦｃγＲＩａ結合を実証する（図４９Ａ「ＷＴ ＩｇＧ１」）が、ｓＦｃ１０への結合を実証しない（図４９Ｂ）、Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ）バイオレイヤーインターフェロメトリー解析を示す。ＦｃγＲＩａの添加後に、トラスツズマブについてシグナルの増加がみられたが、ｓＦｃ１０について観察可能なシグナル増加は検出されず、ＦｃγＲＩａが、操作された変異を有する抗体にもはや結合しなくなったことを実証する。検査したバリアントの結合概要を表６に提示する。加えて、全バリアントが、ＨＥＲ２への強い結合を保持した（図示せず）。

【0369】

ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントを、ＦｃγＲ結合の別の尺度として、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて検査した。簡潔には、ＦＣγＲＩＩＩａエフェクター機能に対する選択されたＦｃ変異の影響を、ＡＤＣＣ Ｂｉｏｒｅｐｏｒｔｅｒアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して評価した。各バリアントの連続希釈物をＳＫＢＲ３細胞とともにインキュベートした。次いで、反応物を、製造者のプロトコールに従って、ＡＤＣＣ Ｂｉｏａｓｓａｙエフェクター細胞とともに、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃でインキュベートし、６〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を各試料に添加し、発光シグナルをグロー型発光読み取り機能を有するプレートリーダーで測定した。

【0370】

図５０に示すように、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）は死滅を実証したが、試験したＦｃバリアントは検出可能なレベルの死滅をもたらさなかった。

【0371】

ＷＴ−ＩｇＧ１およびＦｃバリアントも、ＥＬＩＳＡによって、補体成分のＣ１ｑの結合について試験した。簡潔には、最大で１２８μｇ／ｍｌのＩｇＧを、それぞれのバリアントについて固定化した。ＥＬＩＳＡを、１２μｇ／ｍｌのＣ１ｑ、および１／４００希釈のＣ１ｑ−ＨＲＰ二次抗体を用いて行った。洗浄物および試料をＰＢＳＴ−ＢＳＡ（１％）に希釈した。

【0372】

図５１に示す通り、トラスツズマブ（ハーセプチン、「ＷＴ−ＩｇＧ１」）は、Ｃ１ｑ結合を実証したが、ｓＦｃ１とｓＦｃ７とｓＦｃ１０のいずれも、検出可能なＣ１ｑ結合をもたらさなかった。よって、結果は、検査したＦｃバリアントが、低減したレベルのＦｃエフェクター機能を有することを実証する。
６．１３．２３．
（実施例２２）
共通の軽鎖ライブラリを使用する共通のＶＬ配列を有する新たなＡＢＳの発見

【0373】

共通の軽鎖可変配列を共有する２つの新たな抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する三価三重特異性結合分子は、デノボで特定される。使用した共通の軽鎖ライブラリは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に対するＣＤＲの多様性を制限する。共通の軽鎖ライブラリは、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイなど）について、またはヒト化動物モデルにおいて作成される。共通の軽鎖ライブラリを用いて行われた選択により、２つのＡＢＳについてのＶＨドメインにおける多様性を有するが、両方のＡＢＳに共通する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）における単一配列を有さない、三価三重特異性結合分子を作製する。
６．１３．２３．１．共通の軽鎖ファージライブラリの構築

【0374】

共通の軽鎖ライブラリは、特異的な重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ３−２３）および特異的な軽鎖可変ドメイン（例えば、Ｖｋ−１）に由来する配列を使用して作成される。ファージディスプレイライブラリは、当技術分野において公知のいくつかの戦略により作成され得る。ここで、Ｆａｂフォーマット化ファージライブラリは、ファージにおける複製および発現が可能な発現ベクター（ファージミドとも称される）を使用して構築される。重鎖および軽鎖は両方とも、同じ発現ベクターにおいてコードされ、重鎖はファージコートタンパク質ｐＩＩＩの切断バリアントと融合されている。軽鎖および重鎖は、別々のポリペプチドとして発現され、軽鎖および重鎖−ｐＩＩＩ融合体は細菌のペリプラズム中で組み立てられ、酸化還元電位は、ジスルフィド結合形成を可能にして、候補ＡＢＳを含有する抗体を形成する。

【0375】

共通の軽鎖ライブラリを構築するために、単一の軽鎖可変ドメインは、共通の軽鎖ＣＤＲ１（Ｌ１）およびＣＤＲ２（Ｌ２）がヒト生殖細胞系列に残ったままであり、ＣＤＲ３（Ｌ３）が多種の抗原への結合を支持することが可能なコンセンサス配列から選択される場合に、選択される。ライブラリを構築することもでき、ここで、共通の軽鎖におけるすべてのＶＬ ＣＤＲが軽鎖可変配列の完全なヒトの多様性を表すように変更される。所与の共通の軽鎖について、ＶＨドメインのすべてのＣＤＲの位置は、ヒト抗体レパートリーにおいて見出されるＣＤＲ長による位置のアミノ酸の頻度に一致するように多様化される。多様性は、当技術分野において公知のいくつかの戦略により作成され得る。ここで、Ｋｕｎｋｅｌ変異生成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｕｎｋｅｌ， ＴＡ （ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ １， １９８５． ８２ （２） ４８８−４９２）により詳細に記載されている通り、自然抗体レパートリーにおいて見出される多様性を模倣するためにＶＨ ＣＤＲ Ｈ１、Ｈ２およびＨ３に多様性を導入するプライマーを用いて行われる。簡潔には、一本鎖ＤＮＡは、標準手順を使用して単離されたファージから調製され、Ｋｕｎｋｅｌ変異生成が行われる。化学的に合成されたＤＮＡは、次いで、ＴＧ１細胞にエレクトロポレーションされ、続いて回収される。回収された細胞は、二次培養され、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージにより感染させて、ファージライブラリを作製する。
６．１３．２３．２．共通の軽鎖ファージスクリーニング

【0376】

ファージパニングは、標準手順を使用して行われる。簡潔には、ファージパニングの第１ラウンドは、ストレプトアビジン磁気ビーズに固定化された標的抗原を、上記に記載の調製されたライブラリからの約５×１０^１２ファージと、ＰＢＳＴ−２％ＢＳＡ中で１ｍＬの体積で混合して行う。１時間のインキュベーション後、ビーズ結合ファージを、磁気スタンドを使用して上清から分離する。ビーズを３回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、次いで、ＥＲ２７３８細胞（５ｍＬ）に約０．６のＯＤ_６００で添加する。２０分後、感染細胞を、２５ｍＬの２×ＹＴ＋アンピシリンおよびＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ中で二次培養し、激しく振とうしながら３７℃で終夜生育させる。翌日、ファージを、ＰＥＧ沈殿によって、標準手順を使用して調製する。ＳＡＶコートビーズに特異的なファージの事前クリアランスを、パニングの前に行う。パニングの第２ラウンドは、標準手順を使用して、１００ｎＭのビーズ固定化抗原を有するＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁気ビーズハンドラーを使用して行う。合計で、３〜４ラウンドのファージパニングを行って、標的抗原に特異的なＦａｂをファージディスプレイにおいて富化する。次いで、標的特異的富化は、ポリクローナルおよびモノクローナルファージＥＬＩＳＡを使用して確認する。
６．１３．２３．３．共通の軽鎖ライブラリを使用する三価三重特異性抗体の発見

【0377】

共通の軽鎖可変領域（ＶＬ）を共有する２つの新たなＡＢＳを有し、異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープをそれぞれ認識する、三価三重特異性抗体は、発見キャンペーンにおいて特定される。三価三重特異性抗体は、共通のＶＬ領域を共有せず、第３の明確に異なる抗原に特異的である、第３のＡＢＳも有する。

【0378】

上記に記載の共通の軽鎖ライブラリを使用するファージディスプレイキャンペーンを使用して、抗原１（Ａ１）または抗原２（Ａ２）に結合する候補ＡＢＳが別々に特定される。抗原１または抗原２に対する特異性を与える異なるＶＨを有するが、共通のＶＬを共有するＡＢＳは、１μＭから１ｎＭを下回る範囲の親和性で、特定される。ＡＢＳは、特徴付けのために、全長ヒト二価一重特異性ネイティブＩｇＧ１構造に再フォーマット化される。候補は、結合親和性、エピトープおよび一般的な生物物理学量（発現、純度、開発可能性など）について評価される。抗原１および抗原２の両方に結合する、１０ｎＭ〜１μＭ、または好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の個々の結合親和性を有するＡＢＳが特定される。

【0379】

抗原１および抗原２に対する親ＩｇＧ候補に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインは、抗原３（Ａ３）に特異的な第３のＡＢＳと一緒に、下記の１×２抗体フォーマットに再フォーマット化される。候補の組合せは、一過性哺乳動物発現を介して発現され、精製され、細胞表面上の両方の抗原に同時に共関与する能力について試験される。候補は以下の結合特性を有する。
抗原１に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原２に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原３に対する一価ＫＤ：＜１００ｎＭ
二重陽性細胞に対する二価アビディティ：＜１０ｎＭ

【0380】

候補の鎖構造（図５５に関して）
鎖１：ＶＨ_Ａ１−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｈｏｌｅ
鎖２および鎖６：ＶＬ_{Ａ１／Ａ２−ｃｏｍｍｏｎ}−ＣＨ３
鎖３：ＶＨ_Ａ２−ＣＨ３−ＶＨ_Ａ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｋｎｏｂ
鎖４：ＶＬ_Ａ３−ＣＬ１
（注記：ＶＬ_Ａ３−ＣＬ１およびＶＨ_Ａ３−ＣＨ１は交換することができ、すべてのドメインは、以前に記載された直交型変異のいずれかを保有していてもよい）
６．１３．２３．４．共通の軽鎖ライブラリを使用するＴ細胞を再指向する三価三重特異性抗体の発見

【0381】

共通の軽鎖可変領域（ＶＬ）を共有する２つの新たなＡＢＳを有し、異なる腫瘍抗原または同じ腫瘍抗原の異なるエピトープをそれぞれ認識する、三価三重特異性抗体は、発見キャンペーンにおいて特定される。三価三重特異性抗体は、共通のＶＬ領域を共有せず、ＣＤ３イプシロンなどのＴ細胞再指向療法に有用なＴ細胞分子に特異的である、第３のＡＢＳも有する。この三価三重特異性抗体はまた、２つの腫瘍抗原に対する低い一価親和性を利用し、さらに細胞表面上に両方の抗原が存在する腫瘍細胞への強い二価結合を達成するように設計することができる。

【0382】

上記に記載の共通の軽鎖ライブラリを使用するファージディスプレイキャンペーンを使用して、腫瘍抗原１（ＴＡ１）または腫瘍抗原２（ＴＡ２）に結合する候補ＡＢＳが別々に特定される。腫瘍抗原１または腫瘍抗原２に対する特異性を与える異なるＶＨを有するが、共通のＶＬを共有するＡＢＳは、１μＭから１ｎＭを下回る範囲の親和性で、特定される。ＡＢＳは、特徴付けのために、全長ヒト二価一重特異性ネイティブＩｇＧ１構造に再フォーマット化される。候補は、結合親和性、エピトープおよび一般的な生物物理学量（発現、純度、開発可能性など）について評価される。抗原１および抗原２の両方に結合する、１０ｎＭ〜１μＭ、または好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の個々の結合親和性を有するＡＢＳが特定される。

【0383】

腫瘍抗原１および腫瘍抗原２に対する親ＩｇＧ候補に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ＣＤ３に特異的な第３の公知のＡＢＳ（例えば、ＳＰ３４、ＯＫＴ３など、およびこれらのヒト化バリアント）と一緒に、下記の１×２抗体フォーマットに再フォーマット化される。候補の組合せは、一過性哺乳動物発現を介して発現され、精製され、細胞表面上の両方の抗原に同時に共関与する能力について試験する。Ｔ細胞死滅および増殖アッセイなどの追加の機能アッセイを行って、抗体の有効性を特徴付ける。候補は以下の結合特性を有する。
抗原１に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原２に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
ＣＤ３イプシロンに対する一価ＫＤ：２０〜１００ｎＭ
二重陽性腫瘍細胞に対する二価アビディティ：＜１０ｎＭ

【0384】

候補の鎖構造（図５５に関して）
鎖１：ＶＨ_ＴＡ１−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｈｏｌｅ
鎖２および鎖６：ＶＬ_{ＴＡ１／ＴＡ２−ｃｏｍｍｏｎ}−ＣＨ３
鎖３：ＶＨ_ＴＡ２−ＣＨ３−ＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｋｎｏｂ
鎖４：ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１
（注記：ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１およびＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１は交換することができ、すべてのドメインは、以前に記載された直交型変異のいずれかを保有していてもよい）
６．１３．２４．
（実施例２３）
共通の重鎖ライブラリを使用する共通のＶＨ配列を有するＡＢＳの発見

【0385】

共通の重鎖可変配列を共有する２つの新たな抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する三価三重特異性結合分子は、デノボで特定される。使用した共通の軽鎖ライブラリは、ＣＤＲの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）への多様性を制限する。共通の重鎖ライブラリは、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイなど）について、またはヒト化動物モデルにおいて作成される。共通の重鎖ライブラリを用いて行われた選択により、２つのＡＢＳについてのＶＬドメインにおける多様性を有するが、両方のＡＢＳに共通する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）における単一配列を有さない、三価三重特異性結合分子を作製する。
６．１３．２４．１．共通の重鎖ファージライブラリの構築

【0386】

共通の重鎖ライブラリは、特異的な重鎖可変ドメイン（例えば、ヒトＶＨ３−２３）および特異的な軽鎖可変ドメイン（例えば、ヒトＶｋ−１）に由来する配列を使用して作成される。ファージディスプレイライブラリは、当技術分野において公知のいくつかの戦略により作成され得る。ここで、Ｆａｂフォーマット化ファージライブラリは、ファージにおける複製および発現が可能な発現ベクター（ファージミドとも称される）を使用して構築される。重鎖および軽鎖は両方とも、同じ発現ベクターにおいてコードされ、重鎖はファージコートタンパク質ｐＩＩＩの切断バリアントと融合されている。軽鎖および重鎖は、別々のポリペプチドとして発現され、軽鎖および重鎖−ｐＩＩＩ融合体は細菌のペリプラズム中で組み立てられ、酸化還元電位は、ジスルフィド結合形成を可能にして、候補ＡＢＳを含有する抗体を形成する。

【0387】

共通の重鎖ライブラリを構築するために、単一の重鎖可変ドメインは、共通の重鎖ＣＤＲ１（Ｈ１）およびＣＤＲ２（Ｈ２）がヒト生殖細胞系列に残ったままであり、ＣＤＲ３（Ｈ３）が多種の抗原への結合を支持することが可能なコンセンサス配列から選択される場合に、選択される。ライブラリを構築することもでき、ここで、共通の重鎖におけるすべてのＶＨ ＣＤＲが重鎖可変配列の完全なヒトの多様性を表すように変更される。所与の共通の重鎖について、ＶＬドメインのすべてのＣＤＲの位置は、ヒト抗体レパートリーにおいて見出されるＣＤＲ長による位置のアミノ酸の頻度に一致するように多様化される。多様性は、当技術分野において公知のいくつかの戦略により作成され得る。ここで、Ｋｕｎｋｅｌ変異生成は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｕｎｋｅｌ， ＴＡ （ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ １， １９８５． ８２ （２） ４８８−４９２）により詳細に記載されている通り、自然抗体レパートリーにおいて見出される多様性を模倣するためにＶＬ ＣＤＲ Ｌ１、Ｌ２およびＬ３に多様性を導入するプライマーにより行われる。簡潔には、一本鎖ＤＮＡは、標準手順を使用して単離されたファージから調製され、Ｋｕｎｋｅｌ変異生成が行われる。化学的に合成されたＤＮＡは、次いで、ＴＧ１細胞にエレクトロポレーションされ、続いて回収される。回収された細胞は、二次培養され、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージにより感染させて、ファージライブラリを作製する。
６．１３．２４．２．共通の重鎖ファージスクリーニング

【0388】

ファージパニングは、標準手順を使用して行われる。簡潔には、ファージパニングの第１ラウンドは、ストレプトアビジン磁気ビーズに固定化された標的抗原を、上記に記載の調製されたライブラリからの約５×１０^１２ファージと、ＰＢＳＴ−２％ＢＳＡ中で１ｍＬの体積で混合して行う。１時間のインキュベーション後、ビーズ結合ファージを、磁気スタンドを使用して上清から分離する。ビーズを３回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去し、次いで、ＥＲ２７３８細胞（５ｍＬ）に約０．６のＯＤ_６００で添加する。２０分後、感染細胞を、２５ｍＬの２×ＹＴ＋アンピシリンおよびＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ中で二次培養し、激しく振とうしながら３７℃で終夜生育させる。翌日、ファージを、ＰＥＧ沈殿によって、標準手順を使用して調製する。ＳＡＶコートビーズに特異的なファージの事前クリアランスを、パニングの前に行う。パニングの第２ラウンドは、標準手順を使用して、１００ｎＭのビーズ固定化抗原を有するＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁気ビーズハンドラーを使用して行う。合計で、３〜４ラウンドのファージパニングを行って、標的抗原に特異的なＦａｂをファージディスプレイにおいて富化する。次いで、標的特異的富化は、ポリクローナルおよびモノクローナルファージＥＬＩＳＡを使用して確認する。
６．１３．２４．３．共通の重鎖ライブラリを使用する三価三重特異性抗体の発見

【0389】

共通の重鎖可変領域（ＶＨ）を共有する２つの新たなＡＢＳを有し、異なる抗原または同じ抗原の異なるエピトープをそれぞれ認識する、三価三重特異性抗体は、発見キャンペーンにおいて特定される。三価三重特異性抗体は、共通のＶＨ領域を共有せず、第３の明確に異なる抗原に特異的である、第３のＡＢＳも有する。

【0390】

上記に記載の共通の重鎖ライブラリを使用するファージディスプレイキャンペーンを使用して、抗原１（Ａ１）または抗原２（Ａ２）に結合する候補ＡＢＳが別々に特定される。抗原１または抗原２に対する特異性を与える異なるＶＬを有するが、共通のＶＨを共有するＡＢＳは、１μＭから１ｎＭを下回る範囲の親和性で、特定される。ＡＢＳは、特徴付けのために、全長ヒト二価一重特異性ネイティブＩｇＧ１構造に再フォーマット化される。候補は、結合親和性、エピトープおよび一般的な生物物理学量（発現、純度、開発可能性など）について評価される。抗原１および抗原２の両方に結合する、１０ｎＭ〜１μＭ、または好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の個々の結合親和性を有するＡＢＳが特定される。

【0391】

抗原１および抗原２に対する親ＩｇＧ候補に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインは、抗原３（Ａ３）に特異的な第３のＡＢＳと一緒に、下記の１×２ Ｂ−Ｂｏｄｙフォーマットに再フォーマット化される。例示的な１×２ Ｂ−Ｂｏｄｙスキャフォールド鎖は、配列番号７８、７９、８１および８２によって記載される。候補の組合せは、一過性哺乳動物発現を介して発現され、精製され、細胞表面上の両方の抗原に同時に共関与する能力について試験する。候補は以下の結合特性を有する。
抗原１に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原２に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原３に対する一価ＫＤ：＜１００ｎＭ
二重陽性細胞に対する二価アビディティ：＜１０ｎＭ

【0392】

候補の鎖構造（図５５に関して）
鎖１：ＶＬ_Ａ１−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｈｏｌｅ
鎖２および鎖６：ＶＨ_{Ａ１／Ａ２−ｃｏｍｍｏｎ}−ＣＨ３
鎖３：ＶＬ_Ａ２−ＣＨ３−ＶＬ_Ａ３−ＣＬ１−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｋｎｏｂ
鎖４：ＶＨ_Ａ３−ＣＨ１
（注記：ＶＬ_Ａ３−ＣＬ１およびＶＨ_Ａ３−ＣＨ１は交換することができ、すべてのドメインは、以前に記載された直交型変異のいずれかを保有していてもよい）
６．１３．２４．４．共通の重鎖ライブラリを使用するＴ細胞を再指向する三価三重特異性抗体の発見

【0393】

共通の重鎖可変領域（ＶＨ）を共有する２つの新たなＡＢＳを有し、異なる腫瘍抗原または同じ腫瘍抗原の異なるエピトープをそれぞれ認識する、三価三重特異性抗体は、発見キャンペーンにおいて特定される。三価三重特異性抗体は、共通のＶＨ領域を共有せず、ＣＤ３イプシロンなどのＴ細胞再指向療法に有用なＴ細胞分子に特異的である、第３のＡＢＳも有する。この三価三重特異性抗体はまた、２つの腫瘍抗原に対する低い一価親和性を利用し、さらに細胞表面上に両方の抗原が存在する腫瘍細胞への強い二価結合を達成するように設計することができる。

【0394】

上記に記載の共通の重鎖ライブラリを使用するファージディスプレイキャンペーンを使用して、腫瘍抗原１（ＴＡ１）または腫瘍抗原２（ＴＡ２）に結合する候補ＡＢＳが別々に特定される。腫瘍抗原１または腫瘍抗原２に対する特異性を与える異なるＶＬを有するが、共通のＶＨを共有するＡＢＳは、１μＭから１ｎＭを下回る範囲の親和性で、特定される。ＡＢＳは、特徴付けのために、全長ヒト二価一重特異性ネイティブＩｇＧ１構造に再フォーマット化される。候補は、結合親和性、エピトープおよび一般的な生物物理学量（発現、純度、開発可能性など）について評価される。抗原１および抗原２の両方に結合する、１０ｎＭ〜１μＭ、または好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の個々の結合親和性を有するＡＢＳが特定される。

【0395】

腫瘍抗原１および腫瘍抗原２に対する親ＩｇＧ候補に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ＣＤ３に特異的な第３のＡＢＳ（例えば、ＳＰ３４、ＯＫＴ３など、およびこれらのヒト化バリアント）と一緒に、下記の１×２ Ｂ−Ｂｏｄｙフォーマットに再フォーマット化される。例示的な１×２ Ｂ−Ｂｏｄｙスキャフォールド鎖は、配列番号７８、７９、８１および８２によって記載される。候補の組合せは、一過性哺乳動物発現を介して発現され、精製され、細胞表面上の両方の抗原に同時に共関与する能力について試験する。Ｔ細胞死滅および増殖アッセイなどの追加の機能アッセイを行って、抗体の有効性を特徴付ける。候補は以下の結合特性を有する。
抗原１に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
抗原２に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
ＣＤ３イプシロンに対する一価ＫＤ：２０〜１００ｎＭ
二重陽性腫瘍細胞に対する二価アビディティ：＜１０ｎＭ

【0396】

候補の鎖構造（図５５に関して）
鎖１：ＶＬ_ＴＡ１−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｈｏｌｅ
鎖２および鎖６：ＶＨ_{ＴＡ１／ＴＡ２−ｃｏｍｍｏｎ}−ＣＨ３
鎖３：ＶＬ_ＴＡ２−ＣＨ３−ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｋｎｏｂ
鎖４：ＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１
（注記：ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１およびＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１は交換することができ、すべてのドメインは、以前に記載された直交型変異のいずれかを保有していてもよい）
６．１３．２５．
（実施例２４）
公知のＡＢＳ配列に基づく共通のＶＬ配列またはＶＨ配列を有する新たなＡＢＳの発見

【0397】

公知の特異性を有する親ＡＢＳ配列から出発して、共通の軽鎖可変配列または共通の重鎖可変配列のいずれかを共有する２つの新たな抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する三価三重特異性結合分子が、特定される。共通の軽鎖ライブラリは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に対するＣＤＲの多様性を制限するが、共通の重鎖ライブラリは、重鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対するＣＤＲの多様性を制限する。共通の軽鎖または重鎖ライブラリは、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイなど）について、またはヒト化動物モデルにおいて作成される。

【0398】

他のライブラリは、結合特異性に関して不可知である、生殖細胞系列配列を含むＶＨ配列またはＶＬ配列からデノボで出発するが、スクリーニングは、ここで、生殖細胞系列配列以外のＣＤＲ配列を含み得る公知の特異性を有するＡＢＳから出発して行われる。公知のＡＢＳ配列から出発して、親ＶＨまたはＶＬ配列は、それぞれ、以前に記載された通り、それらのＣＤＲに導入された多様性を有するＶＬ配列またはＶＨ配列のいずれかと対形成する。非同族ＶＨ／ＶＬ対（すなわち、ＶＨおよびＶＬ対は親ＡＢＳに由来しない）は、以前に記載された通り、抗原１および抗原２の２つの抗原への結合についてスクリーニングされる。抗原の１つは、親ＡＢＳに結合する同じ抗原であり得る。候補ＡＢＳをさらに特徴付けるためのＶＨ配列およびＶＬ配列の追加の再フォーマット化は、以前に記載された通り、行われる。

【0399】

スクリーニングおよび特徴付けは、共通のＶＬ領域またはＶＨ領域の配列を共有する、異なる抗原またはエピトープにそれぞれ特異的な２つの新たなＡＢＳを有する三価三重特異性結合分子をもたらす。三価三重特異性抗体は、共通のＶＬ領域またはＶＨ領域を共有せず、第３の明確に異なる抗原に特異的である、第３のＡＢＳも有する。
６．１３．２５．１．公知のＡＢＳに由来する共通の重鎖を使用する三価三重特異性抗体の発見

【0400】

抗原のヒトＯＸ４０に特異的な新たな抗原結合部位を、ヒトＯＸ４０に対する公知の特異性を有する親ＡＢＳ配列から出発して決定した。

【0401】

簡潔には、ヒトＯＸ４０に対するファージパニングキャンペーンから単離されたＶＨドメインを、共通の重鎖可変ドメイン配列として使用し、ＯＸ４０キャンペーンから単離された、３９個の他のＡＢＳ候補のＶＬドメイン、およびその親の同族ＶＬドメインと対形成した。キャンペーンでは、ＶＬドメインの多様性は、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２定常を保持しながら、ＣＤＲ３配列に限定した。候補のＶＬ ＣＤＲ３配列を表７に示す。ＯＸ４０−１３のＶＨは、最初に、Ｌ９２〜Ｌ９４位の嵩高い残基のその相対的な欠如について選択した（ＣＤＲＨ１：ＧＦＴＦＳＳＹＩＩＨＷ；ＣＤＲＨ２：ＷＶＡＹＩＦＰＹＳＧＥＴＹＹＡＤＳ；ＣＤＲＨ３：ＣＡＲＧＡＹＹＹＴＤＬＶＦＤＹＷ）。ＡＢＳ候補は、小スケールで、２ｍＬの体積で、Ｅｘｐｉ２９３細胞中でモノクローナル抗体として発現した。発現の５日後、澄明な上清をＰＢＳＴ−ＢＳＡに３倍希釈し、ｂｉｏｌａｙｅｒ干渉分光法（Ｏｃｔｅｔ）を介して、ビオチン化ヒトＯＸ４０に対する結合の維持について試験した。ここで、ストレプトアビジンセンサーを、約０．８ｎｍの結合応答に達するまで、ビオチン化ＯＸ４０で固定化した。ベースラインを確立した後、希釈された上清を抗原結合について評価した。

【0402】

図５６は、ＯＸ４０−１３ ＶＨドメインと、図５６Ａに示された非同族ＶＬドメイン１〜１２および２１〜２４、図５６Ｂに示された非同族ＶＬドメイン２５〜４０ならびに図５６Ｃに示された非同族ＶＬドメイン１４〜２０およびＶＬドメインＶＬ１３と対形成したＶＬドメインについてのＯｃｔｅｔ結合分析を示す。非同族ＶＬドメインのいくつかは、ＯＸ４０−１およびＯＸ４０−２７のＶＬを含む、親ＯＸ４０−１３ ＡＢＳと同等の結合を実証した。他は、親ＯＸ４０−１３ ＡＢＳと同等の検出可能な結合を実証しなかった。一方、依然として他は、親ＯＸ４０−１３ ＡＢＳの間の中程度の結合の範囲、および検出可能な結合の限定を実証した。興味深いことに、ＯＸ４０−１およびＯＸ４０−２７などの配列のいくつかは、親ＯＸ４０−１３ ＶＬ配列から著しく分化し、多くのＶＬ配列が親ＶＨの抗原認識を維持し得ることを示唆する。

【0403】

ＯＸ４０−１３に由来する共通の重鎖可変配列とそれぞれ対形成した、ここで発見した２つの新たなＯＸ４０ ＡＢＳは、新たなＡＢＳ候補が、発現、収率または結合特性の顕著な喪失を引き起こさない、三価三重特異性抗体にフォーマット化される。

【表7】

６．１３．２６．
（実施例２５）
公知のＡＢＳに由来する共通のＶＬ配列またはＶＨ配列を有する新たなＡＢＳの発見

【0404】

公知の特異性を有する親ＡＢＳ配列から出発して、共通の軽鎖可変配列または共通の重鎖可変配列のいずれかを親ＡＢＳと共有する新たな抗原結合部位（ＡＢＳ）を有する三価三重特異性結合分子が、特定される。共通の軽鎖ライブラリは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に対するＣＤＲの多様性を制限するが、共通の重鎖ライブラリは、重鎖可変ドメイン（ＶＬ）に対するＣＤＲの多様性を制限する。共通の軽鎖または重鎖ライブラリは、ｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ（ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、哺乳動物ディスプレイなど）について、またはヒト化動物モデルにおいて作成される。

【0405】

他のライブラリは、結合特異性に関して不可知である、生殖細胞系列配列を含むＶＨ配列またはＶＬ配列からデノボで出発する。しかしながら、スクリーニングは、ここで、共通のＶＨ配列またはＶＬ配列を親ＡＢＳと共有しながら、異なる抗原特異性を有する新たなＡＢＳを発見するために、公知の特異性を有する親ＡＢＳから出発して行われる。公知のＡＢＳ配列から出発して、親ＶＨまたはＶＬ配列は、それぞれ、以前に記載された通り、それらのＣＤＲに導入された多様性を有するＶＬ配列またはＶＨ配列のいずれかと対形成する。対は、以前に記載された通り、目的の抗原への結合についてスクリーニングされる。候補ＡＢＳをさらに特徴付けるためのＶＨ配列およびＶＬ配列の追加の再フォーマット化は、以前に記載された通り、行われる。

【0406】

スクリーニングおよび特徴付けは、公知の抗原に特異的な公知の親ＡＢＳおよび異なる抗原に特異的な新たなＡＢＳを有する三価三重特異性結合分子をもたらし、ここで、ＡＢＳは、共通のＶＬ領域またはＶＨ領域の配列を共有する。三価三重特異性抗体は、共通のＶＬ領域またはＶＨ領域を共有せず、第３の明確に異なる抗原に特異的である、第３のＡＢＳも有する。
６．１３．２６．１．トラスツズマブと共有する共通のＶＬを有する新たなＡＢＳの発見

【0407】

共通の軽鎖ライブラリを使用するファージディスプレイキャンペーンは、ＨＥＲ２に特異的なトラスツズマブの軽鎖ＶＬ配列を使用して作成される。ヒトＶＨ３−２３ ＣＤＲ配列は、ヒト抗体レパートリーにおいて見出されるＣＤＲ長による位置のアミノ酸の頻度に一致するように多様化され、対形成したＶＬ／ＶＨ配列を発現するファージは、以前に記載された通り、目的の抗原（Ａ２）への結合についてスクリーニングされる。ＡＢＳは、特徴付けのために、全長ヒト二価一重特異性ネイティブＩｇＧ１構造に再フォーマット化される。候補は、結合親和性、エピトープおよび一般的な生物物理学量（発現、純度、開発可能性など）について評価される。抗原１および抗原２の両方に結合する、１０ｎＭ〜１μＭ、または好ましくは５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲の個々の結合親和性を有するＡＢＳが特定される。

【0408】

目的の抗原に対する親ＩｇＧ候補に由来するＶＬドメインおよびＶＨドメインは、ＣＤ３に特異的な第３のＡＢＳ（例えば、ＳＰ３４、ＯＫＴ３など、およびこれらのヒト化バリアント）と一緒に、下記の１×２抗体フォーマットに再フォーマット化される。候補の組合せは、一過性哺乳動物発現を介して発現され、精製され、細胞表面上の両方の抗原に同時に共関与する能力について試験する。Ｔ細胞死滅および増殖アッセイなどの追加の機能アッセイを行って、抗体の有効性を特徴付ける。候補は以下の結合特性を有する。
トラスツズマブ１に対する一価ＫＤ：７ｎＭ
目的の抗原（Ａ２）に対する一価ＫＤ：５０〜１００ｎＭ
ＣＤ３イプシロンに対する一価ＫＤ：２０〜１００ｎＭ
二重陽性腫瘍細胞に対する二価アビディティ：＜１０ｎＭ

【0409】

候補の鎖構造の例
鎖１：ＶＨ_{ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ}−ＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｈｏｌｅ
鎖２および鎖６：ＶＬ_{ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ}−ＣＨ３
鎖３：ＶＨ_Ａ２−ＣＨ３−ＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３_Ｋｎｏｂ
鎖４：ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１
（注記：ＶＬ_ＣＤ３−ＣＬ１およびＶＨ_ＣＤ３−ＣＨ１は交換することができ、すべてのドメインは、以前に記載された直交型変異のいずれかを保有していてもよい）
６．１４．配列

【化1】

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

【化10】

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

他の配列：

【化15】

【化16】

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

【化21】

７．参照による組み込み

【0410】

本出願で引用された全ての公開文献、特許、特許出願および他の文献は、あたかも個別の公開文献、特許、特許出願または他の文献が、あらゆる目的のために参照により個別に示されて組み込まれているのと同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
８．均等物

【0411】

様々な特定の実施形態を例証および記載してきたが、上記明細書は限定的なものではない。様々な変更が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行われうることが理解される。多くの変形が、本明細書を検討すると、当業者には明らかになる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56-1】

【図56-2】

【図56-3】

【配列表】

2021521781000001.app

【国際調査報告】