特表 2021-521866 コーヒー豆中のカフェイン含有量を低減させるための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-521866(P2021-521866A)

(43)【公表日】2021年8月30日

(54)【発明の名称】コーヒー豆中のカフェイン含有量を低減させるための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20210802BHJP

   A01H 6/76 20180101ALI20210802BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20210802BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210802BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20210802BHJP

   A23F 5/00 20060101ALI20210802BHJP

   A23F 5/24 20060101ALI20210802BHJP

   A01G 22/40 20180101ALI20210802BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20210802BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20210802BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/82 Z

   A01H6/76ZNA

   A01H1/00 A

   C12N15/09 110

   C12N15/55

   A01H1/00 Z

   A23F5/00

   A23F5/24

   A01G22/40

   C12N15/12

   C12N15/54

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】72

(21)【出願番号】特願2020-560965(P2020-560965)

(86)(22)【出願日】2019年4月30日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月22日

(86)【国際出願番号】IB2019053538

(87)【国際公開番号】WO2019211750

(87)【国際公開日】20191107

(31)【優先権主張番号】1807192.8

(32)【優先日】2018年5月1日

(33)【優先権主張国】GB

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】519428096

【氏名又は名称】トロピック バイオサイエンシーズ ユーケー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(74)【代理人】

【識別番号】100165157

【弁理士】

【氏名又は名称】芝 哲央

(74)【代理人】

【識別番号】100205659

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 拓也

(74)【代理人】

【識別番号】100126000

【弁理士】

【氏名又は名称】岩池 満

(74)【代理人】

【識別番号】100185269

【弁理士】

【氏名又は名称】小菅 一弘

(72)【発明者】

【氏名】マオリ エヤル

(72)【発明者】

【氏名】ピグノッチ クリスティナ

(72)【発明者】

【氏名】シウォスゼク アグニエスカ

(72)【発明者】

【氏名】ガランティ ヤーロン

(72)【発明者】

【氏名】ネヴィット ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】チャパッロ ガルシア アンジェラ

(72)【発明者】

【氏名】メイア オフィール

【テーマコード（参考）】

2B022

2B030

4B027

【Ｆターム（参考）】

2B022AA01

2B022AB20

2B030AA03

2B030AB03

2B030AD09

2B030CA01

2B030CA14

2B030CA17

2B030CA19

2B030CA24

2B030CB02

4B027FB21

4B027FC04

4B027FE01

4B027FE02

4B027FQ02

4B027FQ06

4B027FQ20

(57)【要約】

カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含むゲノムを含むコーヒー植物が開示される。コーヒー植物またはその一部を製造する方法、カフェイン含有量が減少したコーヒー豆を製造する方法、およびカフェイン含有量が減少したコーヒーを製造する方法も開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含むゲノムを含む、コーヒー植物。

【請求項2】

コーヒー植物またはその一部を製造する方法であって、前記方法が：
（ａ）コーヒー植物細胞を、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤にさらして、前記カフェイン生合成経路の前記少なくとも１つの成分をコードする前記核酸配列における機能喪失突然変異をもたらすステップ；および
（ｂ）コーヒー植物またはその一部を前記コーヒー植物細胞から再生するステップ
を含む方法。

【請求項3】

前記コーヒー植物から豆を収穫することをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記コーヒー植物を自殖または交雑することをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。

【請求項5】

前記突然変異が少なくとも１つの対立遺伝子において起こる、請求項１に記載のコーヒー植物、または請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記突然変異が全ての対立遺伝子において起こる、請求項１に記載のコーヒー植物、または請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記カフェイン生合成経路の前記少なくとも１つの成分をコードする前記核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理されている、請求項１、５または６に記載のコーヒー植物またはその子孫。

【請求項8】

前記突然変異が、欠失、挿入、挿入／欠失（Ｉｎｄｅｌ）、および置換からなる群より選択される、請求項１もしくは５〜７のいずれか一項に記載のコーヒー植物、または請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記コーヒー植物が、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ種由来である、請求項１もしくは５〜８のいずれか一項に記載のコーヒー植物、または請求項２〜６もしくは８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記コーヒー植物が、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種由来である、請求項１もしくは５〜８のいずれか一項に記載のコーヒー植物、または請求項２〜６もしくは８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記さらすステップが、前記ＤＮＡ編集剤をコードする核酸構築物である、請求項２〜６または８〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記さらすステップは、ＤＮＡ遊離送達法によるものである、請求項２〜６または８〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記コーヒー植物が、前記機能喪失突然変異を欠く同じ遺伝的背景および発生段階および成長条件のコーヒー植物のそれと比較して少なくとも５％のカフェインの減少を含む、請求項１もしくは５〜１０のいずれか一項に記載のコーヒー植物、または請求項２〜６もしくは８〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

コーヒー植物の細胞において前記ＤＮＡ編集剤を発現するための植物プロモーターに作動可能に結合されているカフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分に向けられたＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。

【請求項15】

前記ＤＮＡ編集剤が少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む、請求項７〜１０もしくは１３のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６もしくは８〜１３のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４に記載の核酸構築物。

【請求項16】

前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５１〜７８からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項１５に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項17】

ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含まない、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜１６のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜１６のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項18】

ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含む、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜１６のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜１６のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項19】

前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集系のものである、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜１８のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜１８のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項20】

前記ＤＮＡ編集剤がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集系のものである、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜１８のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜１８のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項21】

前記ＤＮＡ編集剤が、細胞における発現をモニタリングするためのレポーターに連結されている、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜２０のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜２０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項22】

前記レポーターが蛍光タンパク質である、請求項２１に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項23】

前記ＤＮＡ編集剤は、Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０（配列番号９に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０（配列番号７に記載）、Ｃｃ００＿ｇ２４７２０（配列番号１に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０（配列番号５に記載）、Ｃｃ０１＿ｇ００７２０（配列番号３に記載）およびＣｃ０２＿ｇ０９３５０（配列番号１１に記載）の間で少なくとも９０％同一である核酸配列に向けられる、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜２２のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜２２のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項24】

前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号２６〜３１、３３〜３６、３８〜４１、４３〜４５、４７〜４８または５０のいずれか１つに述べた核酸配列に含まれる核酸セグメントに向けられる、請求項７〜１０、１３もしくは１５〜２３のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜２３のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項25】

前記カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分がメチルトランスフェラーゼである、請求項１、５〜１０、１３もしくは１５〜２４のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜２４のいずれか一項に記載の方法、または請求項１４〜２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項26】

前記メチルトランスフェラーゼがコアＳＡＭ結合ドメインを含む、請求項２５に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項27】

前記メチルトランスフェラーゼがＮ−メチルトランスフェラーゼである、請求項２５または２６に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項28】

前記Ｎ−メチルトランスフェラーゼが、キサントシンメチルトランスフェラーゼ（ＸＭＴ）、７−メチキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＭＸＭＴ）、および３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＤＸＭＴ）からなる群より選択される、請求項２７に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項29】

前記Ｎ−メチルトランスフェラーゼが、Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０（配列番号１０に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０（配列番号８に記載）、Ｃｃ００＿ｇ２４７２０（配列番号２に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０（配列番号６に記載）、Ｃｃ０１＿ｇ００７２０（配列番号４に記載）、Ｃｃ０２＿ｇ０９３５０（配列番号１２に記載）、ＢＡＣ７５６６３．１（配列番号１４に記載）、ＡＢＤ９０６８６．１（配列番号１６に記載）、ＢＡＢ３９２１５．１（配列番号１８に記載）、ＡＢＤ９０６８５．１（配列番号２０に記載）、ＢＡＢ３９２１６．１（配列番号２２に記載）、およびＢＡＣ７５６６４．１（配列番号２４に記載）からなる群から選択される、請求項２７に記載のコーヒー植物、方法、または核酸構築物。

【請求項30】

前記コーヒー植物が非トランスジェニックである、請求項１、５〜１０、１３もしくは１５〜２９のいずれか一項に記載のコーヒー植物、請求項２〜６、８〜１３もしくは１５〜２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

請求項１、５〜１０、１３または１５〜３０のいずれか一項に記載のコーヒー植物の植物部分。

【請求項32】

豆である、請求項３１に記載の植物部分。

【請求項33】

前記豆が乾燥している、請求項３２に記載の植物部分。

【請求項34】

カフェイン含有量が低下したコーヒー豆を製造する方法であって、前記方法が以下：
（ａ）請求項１、５〜１０、１３または１５〜３０のいずれか一項に記載の植物を栽培するステップ；および
（ｂ）植物から豆を収穫するステップ
を含む方法。

【請求項35】

カフェイン含有量を低下させたコーヒーを製造する方法であって、前記方法が請求項３４に記載の豆を抽出、脱水および任意に焙焼に供するステップを含む方法。

【請求項36】

請求項３または３２〜３３のいずれか一項に記載の豆のコーヒー。

【請求項37】

請求項３４に記載の方法または請求項３５に記載の方法により製造された豆のコーヒー。

【請求項38】

粉末の形態である、請求項３６または３７に記載のコーヒー。

【請求項39】

粒状形態である、請求項３６または３７に記載のコーヒー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願（単数／複数）
本出願は、２０１８年５月１日出願の英国仮特許出願第１８０７１９２．８号の優先権の利益を主張するものであり、その内容は、その全体において参照によって本出願中に組み込まれている。

【0002】

配列表の記述
本出願の出願と同時に提出された９２，８１２バイトを含む２０１９年４月３０日に作成された題名７３８８２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのＡＳＣＩＩファイルは、参照によって本出願中に組み込まれている。

【0003】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、コーヒー豆中のカフェイン含有量を減少させるための組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（ロブスタコーヒー）は、一般的な飲料コーヒーを作り出すために収穫され、処理されるその種子のために商業的に栽培される２つのＣｏｆｆｅａ種の１つである。コーヒーは、世界中で消費され、コーヒー植物に天然に蓄積し、適度なレベルで飲料内に出現する刺激性カフェインを含む。カフェインは、多数の消費者にとって望ましいものではあるが、避けたいと望むものはかなり少ない。カフェイン含有量が減少したコーヒーの販売は、現在１．６ｂｎドル（市場の約７％）を占めている。現在、脱カフェインコーヒーを商業的に生産するために種々の方法が採用されており、そのすべてが収穫後のプロセスである。これらのプロセスを最適化するために多くの研究および開発が行われてきたが、それらは最終飲料への風味に寄与する他の成分に影響することなく、非ロースト豆からカフェインを除去することができない。

【0005】

カフェインは、プリンアルカロイドであり、プリン代謝に由来する二次代謝産物である。プリン代謝からのキサントシンは、３つのメチル化ステップおよびリボース残基の除去を経て、カフェインを生成する。これらのメチル化ステップは、３つのメチルトランスフェラーゼ、キサントシンメチルトランスフェラーゼ（ＸＭＴ）、７−メチキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＭＸＭＴまたはテオブロミンシンターゼ）、および３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＤＸＭＴまたはカフェインシンターゼ）に起因する。

【0006】

第１のステップは、ＸＭＴによるキサントシンのメチル化であり、７−メチキサントシンを生じ（図１、ステップ１）、リボース残基は、その後メチルキサントシンヌクレオシダーゼによって除去される（図１、ステップ２）。リボース非含有７−メチキサントシンは、ＭＸＭＴにより触媒される第２のメチル化を受けて、３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）が生成し（図１、ステップ３）、ＤＸＭＴによりさらにメチル化されて、１，３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）が生成する［非特許文献１］。

【0007】

多くのグループは、植物体内のカフェイン蓄積を減少させるために、コーヒー中のカフェイン生合成を研究してきた。例えば、Ｏｇｉｔａらのグループ［非特許文献２；非特許文献３；および非特許文献１］は、トランスジェニックＲＮＡｉカセットの過剰発現を介して脱カフェイン化アラビカコーヒー植物を生産した。彼らは、ＣａＭＸＭＴ１の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびコード領域を標的とするそれらのＲＮＡｉ構築物を設計した。ＣａＭＸＭＴ１ ＲＮＡｉ構築物の過剰発現は、ＣａＭＸＭＴ１だけでなく、ＣａＤＸＭＴ１およびＣａＸＭＴ１の転写レベルを低下させた。これは、一次低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＣａＸＭＴ１およびＣａＤＸＭＴ１のｍＲＮＡ配列を標的とする多くの二次低分子ｄｓＲＮＡを産生するメチルトランスフェラーゼのコード領域間で共有される類似性（９０％超）の結果である可能性が高い。この方法により、彼らは、葉中のカフェイン蓄積を平均５０％減少させることができ、１例では７０％の減少を示した。

【0008】

いくつかの特許出願は、カフェイン合成に関与する遺伝子のダウンレギュレーションに関するものであり、ダウンレギュレーションは、リボザイム（特許文献１）によって、またはアンチセンス分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）（特許文献２、特許文献３および特許文献４）によってもたらされる。

【0009】

追加の背景技術には、特許文献５が含まれる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許出願第２００３／００１４７７５号

【特許文献2】米国特許出願第２００８／０１２７３７３号

【特許文献3】米国特許出願第２００２／０１０８１４３号

【特許文献4】ＰＣＴ公開第１９９８／０３６０５３号

【特許文献5】米国特許出願第２０１７／００１４４４９号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｏｇｉｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：４６１−４６８

【非特許文献2】Ｏｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２３：８２３

【非特許文献3】Ｏｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００４）５４（６）：９３１−９４１

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含むゲノムを含むコーヒー植物が提供される。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、コーヒー植物またはその一部を生産する方法が提供され、その方法は、（ａ）コーヒー植物細胞を、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤にさらして、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異をもたらすステップ；および（ｂ）コーヒー植物またはその一部をコーヒー植物細胞から再生するステップを含む。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、コーヒー植物の細胞においてＤＮＡ編集剤を発現するための植物プロモーターに作動可能に結合されているカフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分に向けられるＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物の植物部分が提供される。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、カフェイン含有量が低下したコーヒー豆を製造する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明のいくつかの実施形態の植物を栽培するステップ；および（ｂ）植物から豆を収穫するステップを含む。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、カフェイン含有量が減少したコーヒーを製造する方法が提供され、この方法は、本発明のいくつかの実施形態の豆を抽出、脱水および任意に焙焼に供するステップを含む。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の豆のコーヒーが提供される。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、本発明のいくつかの実施形態の方法によって製造された豆のコーヒーが提供される。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、コーヒー植物から豆を収穫することを含む。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態によれば、この方法はさらに、コーヒー植物の自家受精または交雑を含む。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態によれば、突然変異は、少なくとも１つの対立遺伝子において起こる。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態によれば、突然変異は、すべての対立遺伝子において起こる。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物またはその子孫は、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理されている。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態によれば、突然変異は、欠失、挿入、挿入／欠失（Ｉｎｄｅｌ）、および置換からなる群から選択される。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態によれば、コーヒー植物は、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ種由来である。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態によれば、コーヒー植物は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種由来である。

【0028】

本発明のいくつかの実施形態によると、主題は、ＤＮＡ編集剤をコードする核酸構築物である。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態によれば、主題は、ＤＮＡ非含有送達方法による。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態によると、コーヒー植物は、機能喪失突然変異を欠く同じ遺伝的背景および発生段階および成長条件のコーヒー植物のそれと比較して、カフェインの少なくとも５％の減少を含む。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、組み込まれていないＤＮＡ編集剤である。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡを含む。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ｓｇＲＮＡは、配列識別番号５１〜７８からなる群から選択される核酸配列を含む。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ、ｄＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ、およびホーミングエンドヌクレアーゼからなる群から選択されるＤＮＡ編集系のものである。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集系のものである。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、細胞内での発現をモニタリングするためのレポーターに連結されている。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態によれば、レポーターは、蛍光タンパク質である。

【0040】

本発明のいくつかの実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０（配列番号９に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０（配列番号７に記載）、Ｃｃ００＿ｇ２４７２０（配列番号１に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０（配列番号５に記載）、Ｃｃ０１＿ｇ００７２０（配列番号３に記載）およびＣｃ０２＿ｇ０９３５０（配列番号１１に記載）の間で少なくとも９０％同一である核酸配列に向けられる。

【0041】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、配列番号２６〜３１、３３〜３６、３８〜４１、４３〜４５、４７〜４８または５０のいずれか１つに示される核酸配列に含まれる核酸セグメントに向けられる。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態によれば、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分は、メチルトランスフェラーゼである。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態によれば、メチルトランスフェラーゼは、コアＳＡＭ結合ドメインを含む。

【0044】

本発明のいくつかの実施形態によれば、メチルトランスフェラーゼは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼである。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、キサントシンメチルトランスフェラーゼ（ＸＭＴ）、７−メチキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＭＸＭＴ）、および３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＤＸＭＴ）からなる群から選択される。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０（配列番号１０に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０（配列番号８に記載）、Ｃｃ００＿ｇ２４７２０（配列番号２に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０（配列番号６に記載）、Ｃｃ０１＿ｇ００７２０（配列番号４に記載）、Ｃｃ０２＿ｇ０９３５０（配列番号１２に記載）、ＢＡＣ７５６６３．１（配列番号１４に記載）、ＡＢＤ９０６８６．１（配列番号１６に記載）、ＢＡＢ３９２１５．１（配列番号１８に記載）、ＡＢＤ９０６８５．１（配列番号２０に記載）、ＢＡＢ３９２１６．１（配列番号２２に記載）、およびＢＡＣ７５６６４．１（配列番号２４に記載）からなる群から選択される。

【0047】

本発明のいくつかの実施形態によれば、コーヒー植物は、非トランスジェニックである。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態によると、植物部分は、豆である。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態によれば、豆は、乾燥している。

【0050】

本発明のいくつかの実施形態によると、コーヒーは、粉末形態である。

【0051】

本発明のいくつかの実施形態によると、コーヒーは、顆粒形態である。

【0052】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および／または科学的用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料は、本発明の実施形態の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料を、以下に記載する。不一致の場合には、定義を含む特許明細書が管理することになる。さらに、材料、方法、例は、例示的であるに過ぎず、必ずしも限定的であることを意図するものではない。

【0053】

本発明のいくつかの実施形態は、添付図面を参照して、例のみによって本明細書に記載される。ここで詳細に図面を特定的に参照すると、示されている特定は、本発明の実施形態の例示的な議論の例によって、および目的のためのものであることが強調される。この点に関して、図面と共に採用される記述は、本発明の実施態様がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】図１は、コーヒー植物におけるカフェイン生合成経路を示す。第１のステップ（１）、第３のステップ（３）、第４のステップ（４）は、メチル基転移を特徴づけ、第２のステップ（２）は、リボース除去を伴う。ＸＭＴ、キサントシンメチルトランスフェラーゼ；ＭＸＭＴ、７−メチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ；ＤＸＭＴ、３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ。Ｏｇｉｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：４６１−４６８より包含し、修正した。

【図2(1)】図２は、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）からの選択された候補遺伝子およびカフェインの生合成に関与するＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）からの特徴付けられたメチルトランスフェラーゼのタンパク質アライメントを示す（配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８、２２および２４に記載されているように）。

【図2(2)】図２は、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）からの選択された候補遺伝子およびカフェインの生合成に関与するＣｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）からの特徴付けられたメチルトランスフェラーゼのタンパク質アライメントを示す（配列番号２、４、６、８、１０、１４、１８、２２および２４に記載されているように）。

【図3】図３は、１０種の植物由来のＮ−メチルトランスフェラーゼ配列の進化的関係を示す隣接結合分析を示している。枝長の和＝７６．０９４３５３１２の最適樹を示す。この系統樹は、アミノ酸アラインメント（ＭＵＳＣＬＥ）からＭＥＧＡ ｖ６で計算した。ブートストラップ試験（１００反復）で関連分類群が一緒にクラスター化した反復系統樹のパーセンテージは、着色した枝（赤色、４０％未満；緑色、８０％超）として示す。赤色太字の遺伝子ＩＤは、カフェイン生合成経路で特徴付けられており、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａのゲノム中の密接に関連した遺伝子を検索するためのクエリー配列として使用されたＣ．ａｒａｂｉｃａ由来の遺伝子を示す。緑色太字の遺伝子ＩＤは、カフェイン生合成に関与するＣ．ａｒａｂｉｃａ遺伝子に最も近い傾向が最も高い相同体であるＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ候補遺伝子を示す。緑色の他のすべての遺伝子ＩＤは、検索した他のＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ Ｎ−メチルトランスフェラーゼに対応する。

【図4】図４は、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ組織における選択された候補遺伝子の遺伝子発現を示す。ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴの最も近い相同体（すなわち、それぞれＣｃ０９＿ｇ０６９７０、Ｃｃ００＿ｇ２４２７０およびＣｃ０１＿ｇ００７２０）は、種々の葉組織において中程度から高度に発現される。データは、ｗｗｗ．ｃｏｆｆｅｅ−ｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／から取得し、遺伝子発現解析に用いるＲＮＡ−ｓｅｑデータの詳細な説明は、Ｄｅｎｏｕｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）３４５（６２０１）：１１８１−１１８４に見出すことができる。

【図5】図５は、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ組織における選択された候補遺伝子の遺伝子発現を示す。ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴの追加の相同体（すなわち、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０およびＣｃ０９＿ｇ０６９５０）は、種々の葉組織において低いまたは中程度の発現を有する。データは、ｗｗｗ．ｃｏｆｆｅｅ−ｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／から取得し、遺伝子発現解析に用いるＲＮＡ−ｓｅｑデータの詳細な説明は、Ｄｅｎｏｕｅｄ ｅｔ ａｌ．，２０１４、前出に見出すことができる。

【図6(1)】図６は、カフェインの生合成に関与することが報告されている特徴付けられたＮ−メチルトランスフェラーゼの推定相同体としてコーヒーゲノム中で同定された５つの選択された候補遺伝子の多重アラインメントを示す（配列番号１、３、５、７および９に記載されているように）。ヌクレオチド配列は、デフォルトパラメータを用いてＭＵＳＣＬＥとアラインメントした。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３、１４、３７および３８の標的部位は、候補遺伝子上に赤色の文字でマークされているか、または他のｓｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ１１およびｓｇＲＮＡ３７）との重複配列がある場合は青緑色で強調されている。ＰＡＭ領域は、灰色で強調されている。

【図6(2)】図６は、カフェインの生合成に関与することが報告されている特徴付けられたＮ−メチルトランスフェラーゼの推定相同体としてコーヒーゲノム中で同定された５つの選択された候補遺伝子の多重アラインメントを示す（配列番号１、３、５、７および９に記載されているように）。ヌクレオチド配列は、デフォルトパラメータを用いてＭＵＳＣＬＥとアラインメントした。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３、１４、３７および３８の標的部位は、候補遺伝子上に赤色の文字でマークされているか、または他のｓｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ１１およびｓｇＲＮＡ３７）との重複配列がある場合は青緑色で強調されている。ＰＡＭ領域は、灰色で強調されている。

【図6(3)】図６は、カフェインの生合成に関与することが報告されている特徴付けられたＮ−メチルトランスフェラーゼの推定相同体としてコーヒーゲノム中で同定された５つの選択された候補遺伝子の多重アラインメントを示す（配列番号１、３、５、７および９に記載されているように）。ヌクレオチド配列は、デフォルトパラメータを用いてＭＵＳＣＬＥとアラインメントした。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３、１４、３７および３８の標的部位は、候補遺伝子上に赤色の文字でマークされているか、または他のｓｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ１１およびｓｇＲＮＡ３７）との重複配列がある場合は青緑色で強調されている。ＰＡＭ領域は、灰色で強調されている。

【図7A】図７Ａは、選択したＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を示しており、これらは列挙したｓｇＲＮＡを標的としていた。太字は試験したコーヒーの４系列間の対立遺伝子変異を示し、太字および下線付き文字はｓｇＲＮＡによって標的される配列を示し、下線付き文字はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３および１４の各々についての標的ｓｇＲＮＡ配列を、以下に提供し（注目すべきことに、これらの配列は、例えばプラスミドにおいてトランスフェクションに使用されるｓｇＲＮＡ配列ではない）、影付きはＰＡＭ部位を示し、これらを５’から３’の順に列挙する。配列は、配列番号２５〜４８に記載されている。

【図7B】図７Ｂは、選択したＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を示しており、これらは列挙したｓｇＲＮＡを標的としていた。太字は試験したコーヒーの４系列間の対立遺伝子変異を示し、太字および下線付き文字はｓｇＲＮＡによって標的される配列を示し、下線付き文字はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３および１４の各々についての標的ｓｇＲＮＡ配列を、以下に提供し（注目すべきことに、これらの配列は、例えばプラスミドにおいてトランスフェクションに使用されるｓｇＲＮＡ配列ではない）、影付きはＰＡＭ部位を示し、これらを５’から３’の順に列挙する。配列は、配列番号２５〜４８に記載されている。

【図7C】図７Ｃは、選択したＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を示しており、これらは列挙したｓｇＲＮＡを標的としていた。太字は試験したコーヒーの４系列間の対立遺伝子変異を示し、太字および下線付き文字はｓｇＲＮＡによって標的される配列を示し、下線付き文字はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３および１４の各々についての標的ｓｇＲＮＡ配列を、以下に提供し（注目すべきことに、これらの配列は、例えばプラスミドにおいてトランスフェクションに使用されるｓｇＲＮＡ配列ではない）、影付きはＰＡＭ部位を示し、これらを５’から３’の順に列挙する。配列は、配列番号２５〜４８に記載されている。

【図7D】図７Ｄは、選択したＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を示しており、これらは列挙したｓｇＲＮＡを標的としていた。太字は試験したコーヒーの４系列間の対立遺伝子変異を示し、太字および下線付き文字はｓｇＲＮＡによって標的される配列を示し、下線付き文字はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３および１４の各々についての標的ｓｇＲＮＡ配列を、以下に提供し（注目すべきことに、これらの配列は、例えばプラスミドにおいてトランスフェクションに使用されるｓｇＲＮＡ配列ではない）、影付きはＰＡＭ部位を示し、これらを５’から３’の順に列挙する。配列は、配列番号２５〜４８に記載されている。

【図7E】図７Ｅは、選択したＣ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を示しており、これらは列挙したｓｇＲＮＡを標的としていた。太字は試験したコーヒーの４系列間の対立遺伝子変異を示し、太字および下線付き文字はｓｇＲＮＡによって標的される配列を示し、下線付き文字はプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位を示す。ｓｇＲＮＡ６、７、１１、１２、１３および１４の各々についての標的ｓｇＲＮＡ配列を、以下に提供し（注目すべきことに、これらの配列は、例えばプラスミドにおいてトランスフェクションに使用されるｓｇＲＮＡ配列ではない）、影付きはＰＡＭ部位を示し、これらを５’から３’の順に列挙する。配列は、配列番号２５〜４８に記載されている。

【図8A】図８Ａは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ａ）染色体９中の遺伝子（Ｃｃ０９ｇ０６９５０、Ｃｃ０９ｇ０６９６０、Ｃｃ０９ｇ０６９７０）を表す画像であり、カフェイン生合成における推定上の役割があり、他の密接に関連するＮ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子Ｃｃ００ｇ２４７２０およびＣｃ０１ｇ００７２０との保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡを設計し、選択した相対的位置を示す。

【図8B】図８Ｂは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｂ）Ｃｃ０９ｇ０６９５０、Ｃｃ０９ｇ０６９６０、Ｃｃ０９ｇ０６９７０遺伝子座を、図８Ａ（Ｐ−２３〜Ｐ−２８）に示すようにｓｇＲＮＡ領域の外側にある特異的プライマーで増幅し、ｐＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、配列解析およびＴ７Ｅ１アッセイを行った。

【図8C】図８Ｃは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイで測定した突然変異検出。「２７」は、ｓｇＲＮＡを含まない対照プラスミドを示す。「２３」および「２５」は、用いられるｓｇＲＮＡの組み合わせである。赤色星印は、遺伝子編集の正の証拠を示す。

【図8D】図８Ｄは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｄ）特定のｓｇＲＮＡによって誘導されるゲノム編集機器の発現によって誘導される変異ＤＮＡ配列を、野生型（２０２７−Ｃｔｒｌ）配列に並べる。ＰＡＭは黒色線で示し、ｓｇＲＮＡ位置は赤色長方形で示す。遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０について、１塩基対（ｂｐ）欠失（図８Ｄ）が、解析した７クローンのうち２クローン（２０２３−３および２０２３−６と標識）で認められた。各遺伝子についての他の５クローンの配列を示し、野生型配列と同一である。

【図8E】図８Ｅは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｅ）特定のｓｇＲＮＡによって誘導されるゲノム編集機器の発現によって誘導される変異ＤＮＡ配列を、野生型（２０２７−Ｃｔｒｌ）配列に並べる。ＰＡＭは黒色線で示し、ｓｇＲＮＡ位置は赤色長方形で示す。遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９７０について、１ｂｐ挿入（図８Ｅ）が、解析した７クローンのうち２クローン（２０２３−３および２０２３−４と標識）で認められた。各遺伝子についての他の５クローンの配列を示し、野生型配列と同一である。

【図8F】図８Ｆは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｆ）遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９５０およびＣｃ０９ｇ０６９７０についての追加の突然変異配列。個々のクローン化アンプリコンの配列決定により２８９ｂｐの大きな欠失が遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９５０に認められ（８クローン中４クローン）、個々のクローン化アンプリコンの配列決定により２１０ｂｐおよび４０ｂｐの再配列の欠失が遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９７０に認められた（４クローン中３クローン）。ｓｇＲＮＡ位置を赤色文字で示し、ＰＡＭ領域を灰色で強調する。

【図8G】図８Ｇは、配列決定分析およびＴ７アッセイを示し、染色体９中の選択された候補遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０（ｘｍｔ／ｍｘｍｔ／ｄｘｍｔ）、およびＣｃ０９ｇ０６９７０（ｘｍｔ）のいくつかにおける突然変異の存在を明らかにする。（図８Ｇ）遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９５０およびＣｃ０９ｇ０６９７０についての追加の突然変異配列。個々のクローン化アンプリコンの配列決定により２８９ｂｐの大きな欠失が遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９５０に認められ（８クローン中４クローン）、個々のクローン化アンプリコンの配列決定により２１０ｂｐおよび４０ｂｐの再配列の欠失が遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９７０に認められた（４クローン中３クローン）。ｓｇＲＮＡ位置を赤色文字で示し、ＰＡＭ領域を灰色で強調する。

【図9】図９Ａ〜Ｆは、すべての形質についてのトランスフェクトしたコーヒープロトプラストの再生を示す。（図９Ａ）プラスミドｐＤＫ２０２７、ｐＤＫ２０２３またはｐＤＫ２０２５によるトランスフェクションに供した新たに単離したコーヒープロトプラスト；（図９Ｂ）プロトプラスト単離およびトランスフェクションの４８時間後に最初の細胞分裂が起こる；（図９Ｃ）トランスフェクションの３か月後にトランスフェクションしたプロトプラストから得た胚発生微小アリ；（図９Ｄ）微小アリから１〜２ｍｍの胚発生カルスが発生する；（図９Ｅ）胚発生カルスから再生する球状およびトルペド胚；（図９Ｆ）再生されたコーヒー小植物。

【図10】図１０は、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａからの候補のゲネスを標的とするように設計された追加のｓｇＲＮＡを示す。注目すべきことに、ＰＡＭ領域は、灰色で強調されている。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、コーヒー豆中のカフェイン含有量を減少させるための組成物および方法に関する。

【0056】

本発明の原理および動作は、図面および付随する説明を参照して、より良く理解され得る。

【0057】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記載に示された、または実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、または様々な方法で実行もしくは実施されることが可能である。また、ここで採用されている用語および専門用語は、記述の目的のためのものであり、限定的なものと見なされるべきではないことは理解されるべきである。

【0058】

現在、様々な収穫後プロセスが、脱カフェインコーヒーを商業的に生産するために用いられている。これらのプロセスを最適化するために多くの研究および開発が行われてきたが、それらは、最終飲料に風味を与える他の成分に影響することなく、焙焼されていない豆からカフェインを除去することができない。

【0059】

カフェインはプリンアルカロイドであり、プリン代謝に由来する二次代謝産物である。プリン代謝からのキサントシンは、３つのメチル化ステップを経て、リボース残基を除去してカフェインを生成する。これらのメチル化ステップは、３つのメチルトランスフェラーゼ、キサントシンメチルトランスフェラーゼ（ＸＭＴ）、７−メチキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＭＸＭＴまたはテオブロミンシンターゼ）、および３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＤＸＭＴまたはカフェインシンターゼ）に起因する。カフェイン蓄積が減少したコーヒー植物の作出は、より少ない収穫後の加工および改善された飲料特性を必要とする製品をもたらすであろう。

【0060】

ゲノム編集は、今日では、改変のためにゲノムＤＮＡの特定の配列を標的化するために使用できる確立された方法である。遺伝子のコード領域内のわずか数ヌクレオチドの改変は、しばしばｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の妨害をもたらし得、その結果生じるタンパク質を不活性にする。この種の遺伝子ノックアウトは、カフェインのような特定の二次代謝産物の蓄積を減らすために、代謝経路の鍵となる酵素を改変するのに用いることができる。

【0061】

本発明を実行まで減少させる一方で、本発明者らは、コーヒー植物におけるカフェイン合成を標的とし、かつ妨害するように設計された遺伝子編集技術を考案した。ここに記載の技術は、機能喪失突然変異を引き起こし、カフェイン生合成をダウンレギュレートする突然変異を導入することによって、カフェイン合成に関与する内因性メチルトランスフェラーゼ、例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴを標的とする。さらに、記載された遺伝子技術は、プロモーター、ターミネーター、選択マーカーを有する発現カセットを含む古典的な分子遺伝学的およびトランスジェニック手段を必要としない。

【0062】

以下に、および後続する実施例の章に示すように、本発明者らは、コーヒー植物におけるカフェイン製造を減少させるために標的化され得るカフェイン生合成遺伝子を同定した（以下の実施例１参照）。本発明者らは、次に、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子を標的化し、これらのメチルトランスフェラーゼの少なくとも１つを対象とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系中で使用することができるｓｇＲＮＡを設計した（以下の実施例２参照）。コーヒープロトプラスト中の２対のｓｇＲＮＡを用いてＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子を標的化し、配列解析およびＴ７アッセイによって明らかなように正確な突然変異を誘発した（以下の図８Ｂ〜Ｅおよび実施例２参照）。次に、ゲノム編集事象を経たプロトプラストからコーヒー植物を再生した（以下の図９Ａ〜Ｆおよび実施例３を参照）。総合すると、この技術は、コーヒー植物を生成するために使用することができ、その結果、コーヒー豆は、風味に寄与する他の成分に影響を及ぼすことなく、低下したカフェイン含有量を含む。

【0063】

したがって、本発明の一態様によれば、コーヒー植物またはその一部を生産する方法であって、当該方法が：（ａ）コーヒー植物細胞を、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤にさらして、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異をもたらすステップ；および（ｂ）コーヒー植物またはその一部をコーヒー植物細胞から再生するステップを含む方法が提供される。

【0064】

本明細書中で使用される「コーヒー」とは、Ｒｕｂｉａｃｅａｅ科、Ｃｏｆｆｅａ属の植物を指す。コーヒー種が多い。本発明の実施形態は、２つの主要な市販コーヒー種：アラビカコーヒーとして知られるコーヒーアラビカ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）およびロバスタコーヒー（Ｃ．ｒｏｂｕｓｔａ）として知られるコーヒーカネフォラを指すことができる。Ｃｏｆｆｅａ ｌｉｂｅｒｉｃａ Ｂｕｌｌ．ｅｘ Ｈｉｅｒｎもここで検討されており、それは、世界のコーヒー豆市場の３％を占める。Ｃｏｆｆｅａ ａｒｎｏｌｄｉａｎａ Ｄｅ Ｗｉｌｄまたはより一般的にはリベリアコーヒーとしても知られている。アラビカ種からのコーヒーは、一般に「ブラジル」とも呼ばれ、または「他のマイルド」に分類される。ブラジル産コーヒーはブラジル産であり、「他のマイルド」は他の高級コーヒー生産国で栽培されており、それは、一般に、コロンビア、グアテマラ、スマトラ、インドネシア、コスタリカ、メキシコ、米国（ハワイ）、エルサルバドル、ペルー、ケニア、エチオピアおよびジャマイカを含むと認識されている。Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ、すなわちロバスタは、典型的には、アラビカコーヒーの低コスト増量剤として使用される。これらのロバスタコーヒーは、典型的には、西および中央アフリカ、インド、東南アジア、インドネシア、およびまたブラジルの下部地域で生育している。当業者は、地理的領域がコーヒー栽培プロセスが同一のコーヒー苗木を利用し、栽培環境が類似しているコーヒー栽培地域を指すことを理解するであろう。

【0065】

本明細書中で使用される「植物」とは、植物全体（複数可）、移植された植物、植物の祖先および子孫、ならびに種子、果実、シュート、茎、根（塊茎を含む）、台木、穂軸、ならびに植物細胞、組織および器官を含む植物部分を指す。

【0066】

具体的な実施形態によれば、植物は、植物細胞、例えば胚細胞懸濁液中の植物細胞である。

【0067】

具体的な実施形態によると、植物部分は豆である。

【0068】

「穀物」、「種子」、または「豆」は、顕花植物の再生の単位を指し、別のそのような植物に発生することができる。本明細書中で、特にコーヒー植物に関して使用されるように、用語は同義的かつ互換的に使用される。

【0069】

具体的な実施形態によると、細胞は生殖細胞である。

【0070】

具体的な実施形態によると、植物細胞は胚形成細胞である。

【0071】

具体的な実施形態によると、細胞は体細胞である。

【0072】

具体的な実施形態によると、植物細胞は体細胞性胚形成細胞である。

【0073】

具体的な実施形態によれば、細胞はプロトプラストである。

【0074】

１つの実施形態によれば、プロトプラストは、任意の植物組織、例えば、果実、花、根、葉、胚細胞懸濁液、カルスまたは実生組織に由来する。

【0075】

植物は、懸濁培養、プロトプラスト、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を含む任意の形態でよい。

【0076】

具体的な実施形態によると、植物部分はＤＮＡを含む。

【0077】

具体的な実施形態によれば、コーヒー植物は、コーヒー育種系統、より好ましくはエリート系統のものである。

【0078】

具体的な実施形態によれば、コーヒー植物は、エリート系統のものである。

【0079】

具体的な実施形態によれば、コーヒー植物は、純粋な系統のものである。

【0080】

具体的な実施形態によれば、コーヒー植物は、コーヒー変種または育種生殖質のものである。

【0081】

本明細書中で使用される「育種系統」という用語は、野生変種または在来種とは対照的に、商業的に価値のある、または農学的に望ましい特性を有する栽培されたコーヒーの系統を指す。この用語は、商業的Ｆ_１雑種を作出するために使用される植物の本質的にホモ接合性であり、通常は近交系を表す、エリート育種系統またはエリート系統への参照を含む。多くの農学的に望ましい形質を含む優れた農学的性能のための育種および選択によって、エリート育種系統が得られる。エリート植物とは、エリート系統からのあらゆる植物である。優れた農学的性能は、本明細書に定義される農学的に望ましい形質の所望の組合せを指し、ここでは、農学的に望ましい形質の多数、好ましくは全てが、非エリート育種系統と比較して、エリート育種系統において改良されることが望ましい。エリート育種系統は、本質的にホモ接合であり、好ましくは近交系である。

【0082】

本明細書中で使用される「エリート系統」という用語は、優れた農学的性能のための育種および選択から生じた任意の系統を指す。エリート系統は、好ましくは、本明細書中で定義される望ましい農業形質について、複数の、好ましくは少なくとも３、４、５、６またはそれ以上（遺伝子）を有する系統である。

【0083】

「栽培品種」および「変種」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、自家消費用または商品化用の農産物を生産するために、例えば、農民および栽培者によって商業化される目的で、育種、例えば、交配および選択によって意図的に開発された植物を示す。「育種生殖質」という用語は、「野生」状態以外の生物学的状態を有する植物を示し、当該「野生」状態は、元々の栽培されていない状態、または植物もしくは系統の天然の状態を示す。

【0084】

「育種生殖質」という用語は、限定されるわけではないが、半天然、半野生、雑草、伝統的栽培品種、在来品種、育種材料、研究材料、育種家系、合成集団、雑種、創始者株／基礎集団、近交系（雑種栽培品種の親）、分離集団、突然変異体／遺伝的ストック、市場クラスおよび高度／改良栽培品種を含む。本明細書中で使用される用語「純血種」、「純粋な血種」または「近交系」は互換可能であり、反復自家交配および−または戻し交配によって得られる実質的にホモ接合性の植物または植物系統を指す。

【0085】

コーヒー変種の非包括的リストを、以下に示す：
野生コーヒー：これは、エチオピア原産のコーヒー種である「Ｃｏｆｆｅａ ｒａｃｅｍｏｓａ Ｌｏｕｒ」の通称である。

【0086】

Ｂａｒｏｎ Ｇｏｔｏ Ｒｅｄ：’Ｃａｔｕａｉ Ｒｅｄ’に非常に類似したコーヒー豆栽培品種。ハワイの数カ所で栽培されている。

【0087】

ブルーマウンテン：Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｂｌｕｅ Ｍｏｕｎｔａｉｎ’。Ｊａｍａｉｃａｎ ｃｏｆｆｅａまたはＫｅｎｙａｎ ｃｏｆｆｅａとしても一般的に知られている。それは、ジャマイカ原産であるが、現在はハワイ、パプアニューギニアおよびケニアで栽培されている有名なアラビカ栽培品種である。それは、高品質のカップ風味を有する素晴らしいコーヒーである。それは、ナッツ状の芳香、鮮やかな酸味および特有の牛球状の風味が特徴である。

【0088】

ブルボン：Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｂｏｕｒｂｏｎ’。Ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａの植物変種または栽培品種であり、それは、インド洋のマダガスカルの東部に位置する現在Ｒｅｕｎｉｏｎと呼ばれているフランスの支配されたＢｏｕｒｂｏｎ島で最初に栽培された。

【0089】

ブラジル産コーヒー：Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｍｕｎｄｏ Ｎｏｖｏ’。「Ｂｏｕｒｂｏｎ」および「Ｔｙｐｉｃａ」変種から作出したコーヒー植物交雑種を識別するのに用いられる慣用名。

【0090】

Ｃａｒａｃｏｌ／Ｃａｒａｃｏｌｉ：「’ｓｅａｓｈｅｌｌ’」を意味するスペイン語のＣａｒａｃｏｌｉｌｌｏから採用し、ピーベリーコーヒー豆を記述する。

【0091】

カチモール：１９５９年ポルトガルのＣａｔｕｒｒａ株とＨｉｂｒｉｄｏ ｄｅ Ｔｉｍｏｒ株との間で交差開発されたコーヒー豆栽培品種である。それは、コーヒー葉さび病（Ｈｅｍｉｌｅｉａ ｖａｓｔａｔｒｉｘ）に対して耐性である。収量は優れているが品質は平均的なより新しい栽培品種選択。

【0092】

Ｃａｔｕａｉ：Ｍｕｎｄｏ ＮｏｖｏとＣａｔｕｒｒａ Ａｒａｂｉｃａ栽培品種との間の交配である。その高収率で知られており、黄色（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｃａｔｕａｉ Ａｍａｒｅｌｏ’）または赤色チェリー（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｃａｔｕａｉ Ｖｅｒｍｅｌｈｏ’）のいずれかによって特徴付けられる。

【0093】

Ｃａｔｕｒｒａ：比較的最近開発されたＣｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ種の亜変種であり、一般的により急速に成熟し、より大きな収量を与え、ＢｏｕｒｂｏｎおよびＴｙｐｉｃａのような伝統的な「旧アラビカ」変種よりも耐病性である。

【0094】

Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ：コロンビアを起源とする栽培品種。それは、頑健であり、大量の産生株であるが、カップ品質は平均的である。

【0095】

Ｃｏｎｇｅｎｃｉｓ：Ｃｏｆｆｅａ Ｃｏｎｇｅｎｃｉｓ − コンゴの土手のコーヒー豆栽培品種であり、良質なコーヒーを生産しているが、収量は低い。商業的栽培に適さない。

【0096】

ＤｅｗｅｖｒｅｉＩｔ：Ｃｏｆｆｅａ ＤｅｗｅｖｒｅｉＩｔ。ベルギー・コンゴの森林に自生するのを発見されたコーヒー豆栽培品種。商業的栽培には適さないと考えられる。

【0097】

ＤｙｂｏｗｓｋｉｉＩｔ：Ｃｏｆｆｅａ ＤｙｂｏｗｓｋｉｉＩｔ。このコーヒー豆栽培品種は、熱帯間アフリカのＥｕｃｏｆｆｅａの群に由来する。商業的栽培に適さないと考えられる

【0098】

Ｅｘｃｅｌｓａ：Ｃｏｆｆｅａ Ｅｘｃｅｌｓａ − １９０４年に発見されたコーヒー豆栽培品種。病害に対する自然の耐性を持ち、高い収量をもたらす。いったん老化すると、アラビカ変種に似た臭いのあり、心地良い味を送達することができる。

【0099】

Ｇｕａｄａｌｕｐｅ：現在ハワイで評価されているＣｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａの栽培品種。

【0100】

Ｇｕａｔｅｍａｌａ（ｎ）：ハワイの他の地域で評価されているＣｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａの栽培品種。

【0101】

Ｈｉｂｒｉｄｏ ｄｅ Ｔｉｍｏｒ：これは、ＡｒａｂｉｃａとＲｏｂｕｓｔａとの自然雑種である栽培品種である。それは、４４本の染色体をもつ点でアラビカコーヒーに似ている。

【0102】

Ｉｃａｔｕ：「Ａｒａｂｉｃａ ＆ Ｒｏｂｕｓｔａ ｈｙｂｒｉｄｓ」をＭｕｎｄｏ Ｎｏｖｏ ａｎｄ ＣａｔｕｒｒａのＡｒａｂｉｃａ栽培品種に混合した栽培品種。

【0103】

種間雑種：コーヒー植物種の雑種であり；ＩＣＡＴＵ（ブラジル；Ｂｏｕｒｂｏｎ／ＭＮおよびＲｏｂｕｓｔａの交雑種）、Ｓ２８２８（インド；ＡｒａｂｉｃａおよびＬｉｂｅｒｉａの交雑種）、Ａｒａｂｕｓｔａ（Ｉｖｏｒｙ Ｃｏａｓｔ；ＡｒａｂｉｃａおよびＲｏｂｕｓｔａの交雑種）を含む。

【0104】

「Ｋ７」、「ＳＬ６」、「ＳＬ２６」、「Ｈ６６」、「ＫＰ５３２」：Ｈｅｍｉｌｅｉａのようなコーヒー植物病害の種々の変異体に対してより耐性のある有望な新しい栽培品種。

【0105】

ケント：マイソールインドで最初に開発され、東アフリカで栽培されたアラビカコーヒー豆の栽培品種。それは、「コーヒーさび病」病害に対して耐性であるが、コーヒーベリー類病には非常に弱い高収量植物である。それは、「Ｓ．２８８」、「Ｓ．３３３」および「Ｓ．７９５」のより耐性のある栽培品種に徐々に置き換えられつつある。

【0106】

名称がＫｏｕｉｌｌｏｕ：マダガスカルのガボンの川に由来するＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（Ｒｏｂｕｓｔａ）変種の名称。

【0107】

ラウリア：良質のカップを持つが、かなりの収量しか持たない干ばつ耐性栽培品種。

【0108】

Ｍａｒａｇｏｇｉｐｅ／ Ｍａｒａｇｏｇｙｐｅ：Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ。’Ｍａｒａｇｏｐｉｐｅ’。「Ｅｌｅｐｈａｎｔ Ｂｅａｎ」としても知られている。ブラジルのＢａｈｉａ州のＭａｒａｇｏｇｙｐｅ郡で最初に発見された（１８８４）Ｃｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａ（Ｔｙｐｉｃａ）の突然変異変種。

【0109】

モーリチアナ：Ｃｏｆｆｅａ Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ。苦いカップを作るコーヒー豆の栽培品種。商業的栽培には適さないと考えられる。

【0110】

Ｍｕｎｄｏ Ｎｏｖｏ：変種「Ａｒａｂｉｃａ」と「Ｂｏｕｒｂｏｎ」との間の交雑種としてブラジルを起源とする自然雑種。それは、３５００〜５５００フィート（１０７０ｍ〜１５２５ｍ）で良好に生育し、病害に耐性があり、生産収率が高い非常に頑健な植物である。他の栽培品種よりも遅く成熟する傾向がある。

【0111】

Ｎｅｏ−Ａｒｎｏｌｄｉａｎａ：Ｃｏｆｆｅａ Ｎｅｏ−Ａｒｎｏｌｄｉａｎａは、収量が高いためコンゴの一部地域で栽培されているコーヒー豆栽培品種である。市販の栽培には適さないと考えられる。

【0112】

Ｎｇａｎｄａ：Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ Ｐｉｅｒｒｅ ｅｘ Ａ．Ｆｒｏｅｈｎｅｒ’Ｎｇａｎｄａ’。コーヒー植物の直立型のＣｏｆｆｅａ Ｃａｎｅｐｈｏｒａは、Ｒｏｂｕｓｔａと呼ばれ、その普及型はまた、ＮｇａｎｄａまたはＫｏｕｉｌｌｏｕとして知られている。

【0113】

パカ：エルサルバドルの農学者によって作られ、このアラビカの栽培品種は、ブルボンよりも短く、収量も高いが、ラテンアメリカでは人気があるにもかかわらず、カップが劣っていると多くの人が信じている。

【0114】

Ｐａｃａｍａｒａ：低収率の大豆変種Ｍａｒａｇｏｇｉｐｅを高収率のＰａｃａと交雑させることにより作出したアラビカ栽培品種。１９６０年代にエルサルバドルで開発され、この豆は、平均的なコーヒー豆よりも約７５％大きい。

【0115】

Ｐａｃｈｅ Ｃｏｌｉｓ：栽培品種ＣａｔｕｒｒａとＰａｃｈｅ ｃｏｍｕｍとの間の交配であるアラビカ栽培品種。もともとＭａｔａｑｕｅｓｃｕｉｎｔｌａのグアテマラ農場で生育していることがわかった。

【0116】

Ｐａｃｈｅ Ｃｏｍｕｍ：サンタロサグアテマラで開発されたＴｙｐｉｃａ（アラビカ）の栽培品種変異。それは、良好に適応し、その平滑であり、やや平坦なカップに注目される。

【0117】

プレアンガー：現在ハワイで評価されているコーヒー植物栽培品種。

【0118】

プレトリア：現在ハワイで評価されているコーヒー植物栽培品種。

【0119】

Ｐｕｒｐｕｒｅｓｃｅｎｓ：その異常な紫葉を特徴とするコーヒー植物栽培品種。

【0120】

Ｒａｃｅｍｏｓａ：Ｃｏｆｆｅａ Ｒａｃｅｍｏｓａ−乾季に葉を喪失し、雨季の始まりに再生育するコーヒー豆栽培品種。それは、一般的に味が悪く、商業的栽培には適していないと評価されている。

【0121】

Ｒｕｉｒｕ １１：ケニアのＲｕｉｒｕのコーヒー研究所で開発され、１９８５年に発売された新しい矮性交雑である。Ｒｕｉｒｕ １１は、コーヒーベリー類病とコーヒー葉さび病との両方に耐性がある。それはまた、収量が高く、通常の密度の２倍で植えるのに適している。

【0122】

Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ：Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｓａｎ Ｒａｍｏｎ’．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｃａ ｖａｒ ｔｙｐｉｃａ）の矮星変種である。耐風性があり、収量が多く、耐干性がある小型の樹高。

【0123】

Ｔｉｃｏ：中米で栽培されるＣｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａの栽培品種。

【0124】

Ｔｉｍｏｒ Ｈｙｂｒｉｄ：１９４０年代にティモールで見出され、Ａｒａｂｉｃａ種とＲｏｂｕｓｔａ種との間の天然に存在する交雑種であるコーヒーの木の変種。

【0125】

チピカ：正しい植物学名は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．’Ｔｙｐｉｃａ’である。それは、エチオピア原産であるＣｏｆｆｅａ Ａｒａｂｉｃａのコーヒー変種である。Ｖａｒ Ｔｙｐｉｃａは、すべてのコーヒー変種の中で最も古く、最もよく知られており、依然として世界のコーヒー生産のバルクを構成している。最良のラテンアメリカコーヒーのいくつかは、チピカ株から得られたものである。その低収量生産の限界は、その優れたカップで補償されている。

【0126】

具体的な実施形態によると、コーヒー植物は、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ種由来である。

【0127】

具体的な実施形態によると、コーヒー植物は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ種由来である。

【0128】

具体的な実施形態によると、コーヒー植物は、Ａｒａｂｕｓｔａ種由来である。

【0129】

具体的な実施形態によると、コーヒー植物は、リベリカ種由来である。

【0130】

本明細書中で用いる「カフェイン」という用語は、キサンチンアルカロイド１，３，７−トリメチルキサンチンを指す。

【0131】

カフェインは、プリン代謝に由来する二次代謝産物である。主なカフェイン生合成経路は、キサントシン→７−メチルキサントシン→７−メチルキサンチン→テオブロミン→カフェインからなる順序であり、カフェインの生合成は、３つのメチル化ステップを含み、リボース残基を除去してカフェインを形成する。メチル化ステップは、メチルトランスフェラーゼに起因する。

【0132】

具体的な実施形態によれば、カフェイン生合成経路におけるメチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性メチルトランスフェラーゼである。

【0133】

具体的な実施形態によると、カフェイン生合成経路におけるメチルトランスフェラーゼは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼである。

【0134】

具体的な実施形態によれば、カフェイン生合成経路におけるメチルトランスフェラーゼは、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴである。

【0135】

本明細書中で使用される用語「ＸＭＴ」または「キサントシンメチルトランスフェラーゼ」は、ＥＣ ２．１．１．１５８に規定する酵素を指す。典型的には、ＸＭＴは、７−メチルキサントシンを生成するメチル基のキサントシンへの転移を触媒する。

【0136】

具体的な実施形態によれば、ＸＭＴ酵素は、Ｃ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０からコードされる。

【0137】

具体的な実施形態によると、ＸＭＴ酵素は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ遺伝子ＡＢ０４８７９３からコードされる。

【0138】

具体的な実施形態によると、ＸＭＴ酵素は、Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子ＤＱ４２２９５４からコードされる。

【0139】

本明細書で使用する用語「ＭＸＭＴ」または「７−メチルキサンチンメチルトラスフェラーゼ」は、ＥＣ ２．１．１．１５９に規定する酵素を指す（テオブロミンシンターゼとも呼ばれる）。典型的には、ＭＸＭＴは、３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）を生成するメチル基の７−メチルキサンチンへの転移を触媒する。

【0140】

具体的な実施形態によれば、ＭＸＭＴ酵素は、Ｃ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子Ｃｃ００＿ｇ２４７２０からコードされる。

【0141】

具体的な実施形態によると、ＭＸＭＴ酵素は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ遺伝子ＡＢ０４８７９４．１からコードされる。

【0142】

具体的な実施形態によると、ＭＸＭＴ酵素は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ遺伝子ＡＢ０８４１２６からコードされる。

【0143】

本明細書中で使用される用語「ＤＸＭＴ」または「３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ」は、ＥＣ ２．１．１．１６０に規定される酵素を指す（カフェインシンターゼとも呼ばれる）。典型的には、ＤＸＭＴは、１，３，７−トリメチルキサンチン（カフェイン）を生成するメチル基の３，７−ジメチルキサンチン（テオブロミン）への転移を触媒する。

【0144】

具体的な実施形態によれば、ＤＸＭＴ酵素は、Ｃ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子Ｃｃ０１＿ｇ００７２０またはＣｃ０２＿ｇ０９３５０からコードされる。

【0145】

具体的な実施形態によると、ＤＸＭＴ酵素は、Ｃ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子ＤＱ４２２９５５からコードされる。

【0146】

具体的な実施形態によると、ＤＸＭＴ酵素は、Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ遺伝子ＡＢ０８４１２５．１からコードされる。

【0147】

具体的な実施形態によれば、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＸＭＴ／ＭＸＭＴ／ＤＸＭＴ遺伝子）は、Ｃ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ遺伝子Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０またはＣｃ０９＿ｇ０６９６０からコードされる。

【0148】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0149】

本明細書中で用いられる「機能喪失」突然変異とは、キサントシンからカフェインを合成するためのメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよび／またはＤＸＭＴ）の能力の低下（すなわち、機能障害）または不能をもたらすゲノム異常を指す。本明細書中で用いられる「能力の低下」とは、機能喪失突然変異がない野生型酵素のそれと比較して、メチルトランスフェラーゼ活性（すなわち、カフェイン生合成）の低下を指す。具体的な実施形態によれば、減少した活性は、同じアッセイ条件下での野生型酵素の活性と比較して少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらにそれ以上である。メチルトランスフェラーゼ活性は、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ａｂｃａｍ ａｎｄ Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販）により検出することができる。

【0150】

具体的な実施形態によると、機能喪失突然変異は、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよび／もしくはＤＸＭＴ）ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現をもたらさない。

【0151】

具体的な実施形態によると、機能喪失突然変異は、カフェイン生合成を支持することができないメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよび／またはＤＸＭＴ）タンパク質の発現をもたらす。

【0152】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、カフェイン生合成経路の１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0153】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、ＸＭＴをコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0154】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、ＭＸＭＴをコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0155】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、ＤＸＭＴをコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0156】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、ＸＭＴ、ＭＸＭＴまたはＤＸＭＴのいずれか２つをコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0157】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴの全てをコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含む。

【0158】

具体的な実施形態によれば、機能喪失突然変異は、欠失、挿入、挿入−欠失（Ｉｎｄｅｌ）、逆位、置換およびそれの組合せ（例えば、欠失および置換、例えば、欠失およびＳＮＰ）からなる群から選択される。

【0159】

具体的な実施形態によると、突然変異はホモ接合性である。

【0160】

具体的な実施形態によると、突然変異はヘテロ接合性である。

【0161】

機能欠失突然変異の生成のための提案された標的位置の例を、配列番号２６〜５０に提供する。

【0162】

カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列に機能喪失突然変異を誘発するためには、ＤＮＡ編集剤が利用される。

【0163】

以下は、本開示の具体的な実施形態に従って使用できる、目的の遺伝子およびそれを実施するための剤に核酸分子変化を導入するために使用される方法およびＤＮＡ編集剤の様々な非限定的な例の記述である。

【0164】

操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集−このアプローチは、ゲノム中の所望の位置（複数可）で典型的に切断および特異的な二本鎖切断を作成するために人工的に操作されたヌクレアーゼを使用する逆遺伝学的方法を指し、それは、その後、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞内因性プロセスによって修復される。ＮＨＥＪは、二本鎖切断におけるＤＮＡ末端を直接結合し、一方ＨＲは、相同な供与配列を鋳型（すなわち、Ｓ期に形成される姉妹染色分体）として利用して、切断部位での失われたＤＮＡ配列を再生する。特異的なヌクレオチド修飾をゲノムＤＮＡに導入するためには、ＨＲ（外因的に提供される一本鎖または二本鎖ＤＮＡ）の間に、所望の配列を含む供与体ＤＮＡ修復鋳型が存在しなければならない。

【0165】

ほとんどの制限酵素はその標的としてＤＮＡ上の数塩基対を認識し、これらの配列はしばしばゲノム全体の多くの場所に見出され、所望の位置に限定されない複数の切断を生じるため、従来の制限エンドヌクレアーゼを用いて、ゲノム編集を行うことはできない。この課題を克服し、部位特異的な一本鎖または二本鎖切断を作り出すために、現在までにいくつかの異なるクラスのヌクレアーゼが発見され、バイオエンジニアリングされている。これらには、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が含まれる。

【0166】

メガヌクレアーゼ−メガヌクレアーゼは、一般的にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴づけられる。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの要素は、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１つまたは２つのコピーを有することを特徴とする。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造要素ならびにしたがってＤＮＡ認識配列特異性および触媒活性に関して、互いに広く分離されている。メガヌクレアーゼは、微生物種において一般的に見出され、非常に長い認識配列（１４ｂｐ超）を有するという独特の特性を有し、従って、それらを所望の位置での切断に対して自然に非常に特異的にする。

【0167】

これを、ゲノム編集において部位特異的な二本鎖切断を行うために利用することができる。当業者は、これらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するために、突然変異誘発およびハイスループットスクリーニング法が、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼ変形例を作り出すために使用されてきた。たとえば、各種メガヌクレアーゼを融合させて、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作られた。

【0168】

あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用アミノ酸を変えて、配列特異的メガヌクレアーゼを設計することもできる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号参照）。メガヌクレアーゼは、例えばＣｅｒｔｏ，ＭＴ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５；米国特許第８，３０４，２２２号；８，０２１，８６７号；８，１１９，３８１号；８，１２４，３６９号；８，１２９，１３４号；８，１３３，６９７号；８，１４３，０１５号；８，１４３，０１６号；８，１４８，０９８号；または８，１６３，５１４号に記載された方法を用いて設計することができ、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーゼを、市販の技術、例えばＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ’Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を用いて得ることができる。

【0169】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ−二つの異なるクラスの操作されたヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、共に標的された二本鎖切断の産生に有効であることが証明されている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。

【0170】

基本的に、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮ制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ一連の亜鉛フィンガードメインまたはＴＡＬＥ反復のいずれか）に結合する非特異性ＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位および切断部位が互いに分離している制限酵素を選択する。切断部分を分離し、次にＤＮＡ結合ドメインに連結することにより、所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素は、Ｆｏｋｌである。さらに、Ｆｏｋｌは、ヌクレアーゼ活性を有するために二量体化を必要とする利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーが独特なＤＮＡ配列を認識するにつれて、特異性が劇的に増加することを意味する。この効果を高めるために、ヘテロ二量体としてしか機能できず、触媒活性が増加したＦｏｋｌヌクレアーゼが操作されている。ヘテロ二量体機能ヌクレアーゼは、望まれないホモ二量体活性の可能性を避け、したがって二本鎖切断の特異性を増加させる。

【0171】

したがって、たとえば特定の部位を標的とするために、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、その対の各要素は、標的部位で隣接する配列に結合するように設計されている。細胞内で過渡状態に発現すると、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量体を形成して、二本鎖切断を生じる。これらの二本鎖切断が非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して修復されると、しばしば小さな欠失または小さな配列挿入が生じる。ＮＨＥＪが行う各々の修復は独特であるので、１つのヌクレアーゼ対を用いると、標的部位にある範囲のさまざまな欠失をもつ対立遺伝子系列をつくることができる。

【0172】

一般に、ＮＨＥＪは、遺伝子編集において比較的正確であり（ヒト細胞中のＤＳＢの約８５％が、検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）、誤ったＮＨＥＪは、修復が正確な場合、修復産物が変異原性になるまでヌクレアーゼが切断し続けるため信頼され、認識／切断部位／ ＰＡＭモチーフがなくなっている／変異している、または一時的に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しない。

【0173】

欠失は、典型的には数塩基対から数百塩基対の長さのどこにも及ぶが、２対のヌクレアーゼを同時に用いることにより、より大きな欠失が細胞培養でうまく生じている（Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。さらに、標的領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片をヌクレアーゼ対と連動して導入すると、相同組換え（ＨＲ）を介して（例えば、供与体鋳型の存在下で）二本鎖切断を修復して、特異的修飾を生成することができる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００５）。

【0174】

ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これらの操作されたヌクレアーゼ間の違いは、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーおよびＴＡＬＥ上のＴＡＬＥＮに依存する。ペプチドドメインを認識するこれらのＤＮＡは共に、そのタンパク質中に自然に組み合わさって見出されるという特徴をもっている。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２亜鉛フィンガーは、典型的には、３ｂｐ離れた反復に見出され、様々な核酸相互作用タンパク質において多様な組み合わせで見出される。他方、ＴＡＬＥは、アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間に１対１の認識比をもつ反復中に見出される。亜鉛フィンガーおよびＴＡＬＥは共に繰返しパターンで起こるので、種々の組み合わせを試して、多種多様な配列特異性をつくることができる。部位特異的亜鉛フィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチには、例えば、モジュールアセンブリー（必要な配列をカバーするためにトリプレット配列と相関する亜鉛フィンガーが列で付着される）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対トリプレットヌクレオチドの低ストリンジェンシー選択、続いて細菌系におけるペプチド組み合わせ対最終標的の高ストリンジェンシー選択）、およびとりわけ亜鉛フィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが含まれる。ＺＦＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から設計し、商業的に得ることもできる。

【0175】

ＴＡＬＥＮを設計し、入手する方法については、例えば、Ｒｅｙｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１２ Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３−１４８；Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９−５３に述べられており、参照により本明細書に組み込まれる。最近開発されたＭｏｊｏ Ｈａｎｄと名付けられたウェブベースのプログラムは、ゲノム編集アプリケーションのためのＴＡＬおよびＴＡＬＥＮ構築物を設計するためにＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃにより導入された（ｗｗｗ．Ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇを通してアクセス可能である）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から設計し、商業的に得ることもできる。

【0176】

Ｔ−ＧＥＥ系（ＴａｒｇｅｔＧｅｎｅ’ｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅ）−標的細胞内でｉｎ ｖｉｖｏで集合し、所定の標的核酸配列と相互作用することができる、ポリペプチド部分および特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含むプログラム可能な核タンパク質分子複合体が、提供される。プログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変および／もしくは編集し、かつ／または標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を修飾することができる機能ドメイン、および（ｉｉ）特異性を与える核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列、および（ｉｉ）ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）を含む。組成物は、特異性付与核酸および標的核酸の塩基対形成を介して、標的核酸に対する分子複合体の高い特異性および結合能力を有する、所定の核酸配列対象を正確に、確実に、かつコスト効果的に改変することを可能にする。組成物は遺伝毒性が低く、アセンブリにおいてモジュール的であり、特注なしで単一プラットフォームを利用し、専門のコア施設以外での独立した使用のために実用的であり、開発時間枠が短く、コストが削減される。

【0177】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（本明細書では「ＣＲＩＳＰＲ」とも呼ばれる）−多くの細菌および古細菌は、侵入するファージおよびプラスミドの核酸分子を分解することができる内因性ＲＮＡベースの適応免疫系を含む。これらの系は、ＲＮＡ成分を産生するクラスター化された規則的に間隙のある短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレオチド配列およびタンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子からなる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルスおよびプラスミドのＤＮＡに対する短い領域の相同性を含み、対応する病原体の相補的核酸を分解するためにＣａｓヌクレアーゼを指令するガイドとして作用する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の研究により、３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、一緒になって配列特異的ヌクレアーゼ活性に十分であることが示されている：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対する２０塩基対の相同性を含むｃｒＲＮＡ、およびトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１）。

【0178】

さらに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの間の融合から構成される合成キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９をｉｎ ｖｉｔｒｏでｃｒＲＮＡに相補的であるＤＮＡ標的を切断するよう指示できることが実証された。また、合成ｓｇＲＮＡと組み合わせたＣａｓ９の一過性発現を使用して、さまざまな異なる種で標的された二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成できることも実証された（Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１，２３０−２３２；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９−８２３；ＤｉＣａｒｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４１：４３３６−４３４３；Ｈｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：２２７−２２９；Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ｅＬｉｆｅ ２０１３；２：ｅ００４７１；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３−８２６）。

【0179】

ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系には、２つの異なる構成要素が含まれる：ｓｇＲＮＡおよびエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９。

【0180】

ｓｇＲＮＡは、典型的には、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、単一のキメラ転写物中のＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にｃｒＲＮＡを連結する内在性細菌ＲＮＡの組合せをコードする２０ヌクレオチド配列である。ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｓｇＲＮＡ配列と補体ゲノムＤＮＡとの間の塩基対形成によって標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合を成功させるためには、ゲノム標的配列は、標的配列の直後に正しいＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）配列も含まなければならない。ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が結合すると、Ｃａｓ９がＤＮＡの両鎖を切断して二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことができるように、Ｃａｓ９がゲノム標的配列に局在化する。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって産生される二本鎖切断（ＤＳＢ）は、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を受けることができ、ＤＮＡ修復中に特異的な配列改変を受けやすい。

【0181】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨをもち、それぞれが異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性であるとき、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こす。

【0182】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの重要な利点は、この系の高い効率が合成ｓｇＲＮＡを容易に作り出す能力と結合されることである。これは、異なるゲノム部位での標的改変および／または同じ部位での異なる改変を標的とするように容易に改変され得る系を作り出す。さらに、複数の遺伝子の同時標的化を可能にするプロトコルが確立されている。突然変異を有する細胞の大部分は、標的された遺伝子に両対立遺伝子性突然変異を提示する。

【0183】

しかし、ｓｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対形成相互作用における見かけ上の柔軟性は、Ｃａｓ９によって切断される標的配列との不完全な一致を可能にする。

【0184】

単一の不活性な触媒ドメイン、ＲｕｖＣ−またはＨＮＨ−のいずれかを含むＣａｓ９酵素の改変された版は「ニッカーゼ」と呼ばれる。活性のあるヌクレアーゼドメインを１つだけもっていると、Ｃａｓ９ニッカーゼは標的ＤＮＡの一方の鎖だけを切断し、一本鎖切断または「ニック」をつくる。一本鎖切断、すなわちニックは、ＰＡＲＰ（センサー）およびＸＲＣＣ１／ＬＩＧ ＩＩＩ複合体（連結反応）などのタンパク質が関与する一本鎖切断修復機構によってほとんど修復される。トポイソメラーゼＩ毒によって、または天然に存在するＳＳＢ上にＰＡＲＰ１を捕捉する薬物によって一本鎖切断（ＳＳＢ）が生じた場合、これらは持続し得、細胞がＳ期に入り、複製フォークがこのようなＳＳＢに出会うと、それらは、ＨＲによって修復されるに過ぎない一本鎖終結ＤＳＢになる。しかし、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された二つの近位、反対側の鎖のニックは、二本鎖切断として扱われ、これは「二重ニック」ＣＲＩＳＰＲ系と呼ばれることが多い。基本的に非平行ＤＳＢである二重ニックは、遺伝子標的に対する所望の効果およびドナー配列の存在および細胞周期段階に依存して、ＨＲまたはＮＨＥＪによって他のＤＳＢのように修復され得る（ＨＲは、はるかに低い存在量であり、細胞周期のＳおよびＧ２段階においてのみ起こり得る）。したがって、特異性およびオフターゲット効果の低下が極めて重要である場合、Ｃａｓ９ニッカーゼを用いて、ゲノムＤＮＡの近接および反対の鎖上に標的配列を有する２つのｓｇＲＮＡを設計することにより、二重ニックを作り出すことにより、これらの事象が不可能ではないにもかかわらず、いずれかのｓｇＲＮＡのみがゲノムＤＮＡを変化させそうにないニックを生じるため、オフターゲット効果を低下させるであろう。

【0185】

２つの不活性な触媒ドメイン（デッドＣａｓ９、またはｄＣａｓ９）を含むＣａｓ９酵素の改変版は、ヌクレアーゼ活性を有さず、一方ｓｇＲＮＡ特異性に基づいて依然としてＤＮＡに結合可能である。ｄＣａｓ９は、不活性な酵素を既知の調節ドメインに融合することにより、遺伝子発現を活性化または抑制するＤＮＡ転写調節因子のプラットフォームとして利用することができる。たとえば、ゲノムＤＮＡの標的配列にｄＣａｓ９だけが結合すると、遺伝子の転写を妨げることができる。

【0186】

本発明のいくつかの実施形態によって使用され得るＣａｓ９の追加の変種は、ＣａｓＸおよびＣｐｆ１を含むが、これらに限定されない。ＣａｓＸ酵素は、Ｃａｓ９と比較してサイズが小さく、細菌に見出され（それは典型的にはヒトには見出されない）、したがって、ヒトにおいて免疫系／応答を引き起こす可能性がより低い、ＲＮＡ誘導ゲノムエディターの別個のファミリーを含む。また、ＣａｓＸは、Ｃａｓ９と比較して異なるＰＡＭモチーフを利用し、したがってＣａｓ９ ＰＡＭモチーフが見出されない標的配列に使用できる［Ｌｉｕ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．（２０１９）５６６（７７４３）：２１８−２２３を参照］。Ｃａｓ１２ａとも呼ばれるＣｐｆ１は、Ｃａｓ９ ＰＡＭ（ＮＧＧ）がはるかに少ないＡＴリッチ領域の編集に特に有利である［Ｌｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ．（２０１９）３７（１）：２１−２７；Ｍｕｒｕｇａｎ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．（２０１７）６８（１）：１５−２５を参照］。

【0187】

別の実施形態によれば、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＤＮＡ切断ドメインなどの様々なエフェクタードメインと融合させることができる。ＤＮＡ切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。ＤＮＡ切断ドメインを誘導することができるエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＣａｔａｌｏｇまたはＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．参照）。例示的な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の切断ドメインは、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼドメインまたは修飾されたＦｏｋｌエンドヌクレアーゼドメインである。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）の使用は、別の代替である。ＨＥは、細菌、古細菌、および単細胞真核生物に見出される小タンパク質（３００アミノ酸未満）である。ＨＥの際立った特徴は、制限酵素（４〜８ｂｐ）などの他の部位特異的エンドヌクレアーゼに比べて比較的長い配列（１４〜４０ｂｐ）を認識することである。ＨＥは、歴史的に小さな保存されたアミノ酸モチーフによって分類されてきた。少なくとも５つのそのようなファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ；ＧＩＹ−ＹＩＧ；ＨＮＨ；Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスおよびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫが同定されており、これらはＥＤｘＨＤ酵素に関連しており、一部は別のファミリーと考えている。構造レベルでは、ＨＮＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスは、ＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ｘＫおよびＥＤｘＨＤ酵素と同様に共通の折りたたみ（ββα−金属と表示）を共有している。ファミリーの各々の触媒的およびＤＮＡ認識戦略は様々であり、様々な応用のための工学に異なる程度でそれらを提供する。例えばＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１４）１１２３：１−２６を参照。本発明のいくつかの実施形態に従って使用され得る例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、限定されるものではないが、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＰｐｏＩおよびＩ−Ｓｓｐ６８０３１を含む。

【0188】

ＣＲＩＳＰＲの改良版、例えば、デッドＣＲＩＳＰＲ（ｄＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ）はまた、ＣＲＩＳＰＲ転写阻害（ＣＲＩＳＰＲｉ）またはＣＲＩＳＰＲ転写活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）に利用され得る。例えば、Ｋａｍｐｍａｎｎ Ｍ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２０１８）１３（２）：４０６−４１６；Ｌａ Ｒｕｓｓａ ＭＦおよびＱｉ ＬＳ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２０１５）３５（２２）：３８００−９］参照。

【0189】

本発明のいくつかの実施形態に従って使用され得るＣＲＩＳＰＲの他のバージョンには、ＣＲＩＳＰＲ系からの構成要素を他の酵素とともに使用して、細胞ＤＮＡまたはＲＮＡに点突然変異を直接導入するゲノム編集が含まれる。

【0190】

したがって、１つの実施形態によれば、編集剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤である。

【0191】

１つの実施形態によると、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、塩基編集を誘発する。

【0192】

ここで用いる「塩基編集」という用語は、二本鎖ＤＮＡ切断を行わずに細胞ＤＮＡまたはＲＮＡに点突然変異を導入することを指す。

【0193】

塩基編集では、ＤＮＡ塩基エディターは典型的に、触媒的に障害されたＣａｓヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）上で働く塩基修飾酵素との間の融合を含む。その標的ＤＮＡ座に結合すると、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡ鎖との間の塩基対形成により、一本鎖ＤＮＡの小さな断片の「Ｒループ」への置換がもたらされる。このｓｓＤＮＡバブル内のＤＮＡ塩基は、塩基編集酵素（たとえば、デアミナーゼ酵素）によって修飾される。真核細胞における効率を向上させるために、触媒的に無効になったヌクレアーゼはまた、編集されていないＤＮＡ鎖にニックを生じさせ、編集された鎖を鋳型として使用して、編集されていない鎖を修復するように細胞を誘導する。

【0194】

２つのクラスのＤＮＡ塩基エディターが記載されている：シトシン塩基エディター（ＣＢＥ）は、Ｃ−Ｇ塩基対をＴ−Ａ塩基対に変換し、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）は、Ａ−Ｔ塩基対をＧ−Ｃ塩基対に変換する。まとめると、ＣＢＥおよびＡＢＥは、可能性のある４つの転移突然変異（ＣからＴ、ＡからＧ、ＴからＣおよびＧからＡ）すべてを媒介することができる。同様に、ＲＮＡでは、イノシンへの標的アデノシン変換は、アンチセンスおよびＣａｓ１３誘導ＲＮＡ標的法の両方を利用する。

【0195】

１つの実施形態によると、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ｄＣａｓ）を含む。

【0196】

１つの実施形態によると、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性なＣａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９）である。

【0197】

１つの実施形態によると、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼは、不活性なＣａｓ１３（例えば、ｄＣａｓ１３）である。

【0198】

１つの実施形態によると、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、エピジェネティック編集（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはヒストンタンパク質に化学的変化を与える）が可能である酵素を含む。

【0199】

例示的な酵素は、限定されるわけではないが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼを含む。より具体的には、例示的な酵素は、例えば、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ３Ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００、１０−１１転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１）、リジン（Ｋ）特異的デメチラーゼ１Ａ（ＬＳＤ１）ならびにカルシウムおよびインテグリン結合タンパク質１（ＣＩＢ１）を含む。

【0200】

触媒的に障害されたヌクレアーゼに加えて、本発明のＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、ヌクレオベースデアミナーゼ酵素および／またはＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤も含み得る。

【0201】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、ｓｇＲＮＡとともに、ＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ）またはＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）−ＵＧＩ）を含む。ＡＰＯＢＥＣ１はデアミナーゼ全長または触媒活性フラグメントであり、ＸＴＥＮはタンパク質リンカーであり、ＵＧＩはウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤であって、その後のＵ：Ｇミスマッチが修復されてＣ：Ｇ塩基対に戻るのを防ぎ、ｄＣａｓ９（Ａ８４０Ｈ）はニッカーゼであり、ｄＣａｓ９を元に戻して、編集されていない鎖のみをニックするＨＮＨドメインの触媒活性を回復し、新しく合成されたＤＮＡを模擬して、目的のＵ：Ａ生成物に至る。

【0202】

本発明のいくつかの実施形態に従った塩基編集に使用できる追加の化合物は、Ｒｅｅｓ ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１８）１９：７７０−７８８に明記されており、その全体において参照によって本出願中に組み込まれている。

【0203】

標的配列の選択および／または設計に役立つ公的に利用可能な多くのツール、ならびに、限定されないがＦｅｎｇ Ｚｈａｎｇ ｌａｂ’ｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂｏｕｔｒｏｓ ｌａｂ’ｓ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦＩｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム内の特定のＣａｓ９標的を識別するためのＦｌｅｘｉｂｌｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍおよびＣＲＩＳＰＲ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｉｎｄｅｒのような、さまざまな種のさまざまな遺伝子について、生物情報学的に決定された固有のｓｇＲＮＡのリストが多数ある。

【0204】

ＣＲＩＳＰＲ系を用いるには、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓエンドヌクレアーゼ（たとえばＣａｓ９）の両方を標的細胞に発現させるか、または存在させるべきである（たとえばリボ核タンパク質複合体として）。挿入ベクターは、単一のプラスミド上に両方のカセットを含むことができ、またはカセットは、２つの別々のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）由来のｐｘ３３０プラスミドなどが市販されている。クラスター化規則的空間間短回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）−ガイドＲＮＡ技術および植物ゲノムを改変するためのＣａｓエンドヌクレアーゼの使用も、少なくともＳｖｉｔａｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６９（２）：９３１−９４５；ＫｕｍａｒおよびＪａｉｎ，２０１５，Ｊ Ｅｘｐ Ｂｏｔ ６６：４７−５７；および米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号によって開示されており、それは、その全体において参照によって本出願中に特定的に組み込まれている。ｓｇＲＮＡによるＤＮＡ編集を効果づけるのに用いることができるＣａｓエンドヌクレアーゼには、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ．１６３（３）：７５９−７１）、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ｃｍｓ１（Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；６０（３）：３８５−９７）およびＣａｓ １３Ａ／Ｂ（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ１ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ，６５：５８２−５８４；Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔｕｒｅ ５５０：２８０−２８４）が含まれるが、これに限定されない。Ｃａｓ １３ Ａ ＯＲ Ｂ（Ｃａｓ １３ Ａ／Ｂ）は、ＤＮＡではなくＲＮＡを認識し、切断することができ、これは、ＲＮＡ分解（ＲＮＡＩ様）が望まれるときに適用できる。

【0205】

「ヒットおよびラン」または「インアウト」は、２ステップ組換え手順を伴う。第１のステップでは、二重のポジティブ／ネガティブ選択可能マーカーカセットを含む挿入型ベクターを用いて、所望の配列改変を導入する。挿入ベクターは、標的遺伝子座に相同性の単一連続領域を含み、関連する突然変異を有するように改変される。この標的化構築物は、相同領域内の１つの部位で制限酵素で線状化され、細胞内に導入され、ポジティブの選択が行われて、相同組換え事象が単離される。相同配列を有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖または二本鎖オリゴとして提供することができる。これらの相同組換え体は、選択カセットを含む介在ベクター配列によって分離される局所的な重複を含む。第２ステップでは、標的クローンをネガティブの選択に供して、重複配列間の染色体内組換えを介して選択カセットを失った細胞を同定する。局所的な組換え事象は、重複を取り除き、組換えの部位に応じて、対立遺伝子は導入された突然変異を保持するか、または野生型に戻るかのいずれかである。最終結果は、いかなる外来性配列の保持もなしに所望の変形例を導入することである。

【0206】

「二重置換」または「タグおよび交換」戦略は、ヒットおよびランアプローチと同様の２ステップ選択手順を含むが、２つの異なる標的化構築物の使用を必要とする。第１のステップでは、３’および５’相同アームを有する標準的な標的化ベクターを用いて、突然変異が導入されるべき箇所の近くに二重のポジティブ／ネガティブ選択可能カセットを挿入する。系構成要素が細胞に導入され、適用されたポジティブの選択の後、ＨＲ事象を同定することができた。次に、所望の突然変異と相同の領域を含む第２の標的化ベクターを、標的されたクローンに導入し、ネガティブの選択を適用して、選択カセットを除去し、突然変異を導入する。最終的な対立遺伝子は、所望の突然変異を含み、一方望ましくない外来性配列は排除される。

【0207】

部位特異的組換え酵素−酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに由来するＰ１バクテリオファージおよびＦｌｐ組換え酵素に由来するＣｒｅ組換え酵素は、各々独特の３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」および「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡ組換え酵素であり、Ｌｏｘ部位またはＦＲＴ部位のいずれかに隣接する配列は、それぞれＣｒｅまたはＦｌｐ組換え酵素の発現時に部位特異的組換えを介して容易に除去することができる。たとえば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対の逆方向反復が隣接する非対称な８塩基対のスペーサー領域で構成されている。Ｃｒｅは、１３塩基対の逆方向反復配列に結合し、スペーサー領域内で鎖の切断および再連結を触媒することによって、３４塩基対のｌｏｘ ＤＮＡ配列を組換える。スペーサー領域のＣｒｅによってできたずれたＤＮＡ切削は、６塩基対離れて、相同性センサーとして働く重複領域を与え、同じ重複領域をもつ組換え部位だけが確実に組換えを起こすようにする。

【0208】

基本的に、部位特異的組換え酵素系は、相同組換え事象後の選択カセットの除去のための手段を提供する。この系はまた、時間的または組織特異的方式で不活性化または活性化され得る条件的改変対立遺伝子の生成を可能にする。注目すべきことに、ＣｒｅおよびＦｌｐ組換え酵素は、３４塩基対のＬｏｘまたはＦＲＴ「瘢痕」に残る。残っているＬｏｘまたはＦＲＴ部位は、典型的には、改変された遺伝子座のイントロンまたは３’ＵＴＲに残されており、本証拠は、これらの部位が通常、遺伝子機能に有意に干渉しないことを示唆している。

【0209】

したがって、Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびＦｌｐ／ＦＲＴ組換えは、関連する突然変異、２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列、および典型的には２つのＬｏｘまたはＦＲＴ配列の間に配置された選択可能なカセットを含む３’および５’相同アームを有する標的化ベクターの導入を含む。ポジティブの選択が適用され、標的突然変異を含む相同組換え事象が同定される。負の選択と併せてＣｒｅまたはＦｌｐを過渡状態に発現させる結果、選択カセットが切り出され、カセットが失われた細胞が選択される。最終的な標的された対立遺伝子は、外来性配列のＬｏｘまたはＦＲＴ瘢痕を含む。

【0210】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、組み込まれていないＤＮＡ編集剤である。

【0211】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＤＮＡ標的化モジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。

【0212】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含まない。

【0213】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、エンドヌクレアーゼを含む。

【0214】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、触媒的に不活性なエンドヌクレアーゼを含む。

【0215】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアーゼ）およびＤＮＡ標的化モジュール（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。

【0216】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／エンドヌクレアーゼである。

【0217】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のｓｇＲＮＡ）を含む。

【0218】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、２つのｓｇＲＮＡを含む。

【0219】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、２対のｓｇＲＮＡを含む。

【0220】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、例えば、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９またはｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９である。

【0221】

例えばプラスミドなどの発現構築物内に見出され得る例示的なｓｇＲＮＡ配列は、以下に提供されるものを含むが、これらに限定されない：
ｓｇＲＮＡ＃６ ＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴ（配列番号５１）
ｓｇＲＮＡ＃７ ＴＧＣＣＴＡＡＴＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣ（配列番号５２）
ｓｇＲＮＡ＃１１ ＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴ（配列番号５３）
ｓｇＲＮＡ＃１２ ＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧ（配列番号５４）
ｓｇＲＮＡ＃１３ ＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＴ（配列番号５５）
ｓｇＲＮＡ＃１４ ＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号５６）
ｓｇＲＮＡ＃３７ ＣＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号５７）
ｓｇＲＮＡ＃３８ ＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＡＴ（配列番号５８）
ｓｇＲＮＡ−１ ＴＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＧＧＧ（配列番号５９）
ｓｇＲＮＡ−２ ＣＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧ（配列番号６０）
ｓｇＲＮＡ−３ ＡＣＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＧＧＧ（配列番号６１）
ｓｇＲＮＡ−４ ＣＡＡＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧ（配列番号６２）
ｓｇＲＮＡ−５ ＧＡＡＧＴＣＣＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＡＡＧＧ（配列番号６３）
ｓｇＲＮＡ−６ ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＣＴＴＴＧＧ（配列番号６４）
ｓｇＲＮＡ−７ ＴＴＧＧＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧ（配列番号６５）
ｓｇＲＮＡ−８ ＧＧＧＡＧＴＡＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧ（配列番号６６）
ｓｇＲＮＡ−９ ＴＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＧ（配列番号６７）
ｓｇＲＮＡ−１０ ＴＧＣＴＴＴＡＡＡＧＴＴＧＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧ（配列番号６８）
ｓｇＲＮＡ−１１ ＡＡＡＡＴＡＧＧＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧ（配列番号６９）
ｓｇＲＮＡ−１２ ＣＧＡＡＣＴＧＴＴＧＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＴＧＧ（配列番号７０）
ｓｇＲＮＡ−１３ ＣＣＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＣＧＴＧＧ（配列番号７１）
ｓｇＲＮＡ−１４ ＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＣＧＧ（配列番号７２）
ｓｇＲＮＡ−１５ ＡＴＴＡＧＡＡＣＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＣＡＧＧ（配列番号７３）
ｓｇＲＮＡ−１６ ＡＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣＣＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号７４）
ｓｇＲＮＡ−１７ ＣＡＴＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＧ（配列番号７５）
ｓｇＲＮＡ−１８ ＧＴＣＴＡＴＧＧＴＡＴＴＣＡＧＧＣＣＡＴＣＧＧ（配列番号７６）
ｓｇＲＮＡ−１９ ＡＧＣＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＡＣＴＧＧＧ（配列番号７７）
ｓｇＲＮＡ−２０ ＴＣＧＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＴＴＣＡＧＧＴＧＧ（配列番号７８）

【0222】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、塩基編集を誘発する。

【0223】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡまたはＲＮＡ編集剤は、エピジェネティック編集のための酵素を含む。

【0224】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＴＡＬＥＮである。

【0225】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、ＺＦＮである。

【0226】

具体的な実施形態によると、ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼである。

【0227】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、単一のメチルトランスフェラーゼ標的配列（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴまたはＤＸＭＴ）を改変する。

【0228】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、２、３、４、５またはそれ以上のメチルトランスフェラーゼ標的配列（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴまたはＤＸＭＴ）を改変する。

【0229】

具体的な実施形態によれば、単一のＤＮＡ編集剤は、多数の遺伝子（例えば、２〜１０個の遺伝子、例えば、５〜１０個の遺伝子、例えば、２〜５個の遺伝子、例えば、４〜５個の遺伝子、例えば、３〜５個の遺伝子、例えば、５個の遺伝子）を標的とする。

【0230】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、少なくとも５０〜９９％同一、例えば５１〜９９％、５３〜９９％、５５〜９９％、５７〜９９％、５９〜９９％、６１〜９９％、６３〜９９％、６５〜９９％、６７〜９９％、６９〜９９％、７１〜９９％、７３〜９９％、７５〜９９％、７７〜９９％、７９〜９９％、８１〜９９％、８３〜９９％、８５〜９９％、８７〜９９％、８９〜９９％、９１〜９９％、９３〜９９％、９５〜９９％、９７〜９９％、９８〜９９％同一、例えば５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一、例えば９９％同一である核酸配列を対象とし、Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０（配列番号９に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０（配列番号７に記載）、Ｃｃ００＿ｇ２４７２０（配列番号１に記載）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９５０（配列番号５に記載）、Ｃｃ０１＿ｇ００７２０（配列番号３に記載）およびＣｃ０２＿ｇ０９３５０（配列番号１１に記載）間で、５〜１００ヌクレオチド（例えば、５〜５０ヌクレオチド、例えば、５〜２５ヌクレオチド、例えば、１０〜２５ヌクレオチド）にわたって、局所的整列（例えば、ＭＵＳＣＬＥによるＣＬＵＳＴＡＬ複数配列整列）によって決定される。

【0231】

本明細書中で使用されるように、２つの核酸またはポリペプチド配列の関連における「配列同一性」または「同一性」は、整列されたときに同じである２つの配列中の残基への言及を含む。配列の同一性のパーセンテージをタンパク質に参照して用いる場合、同一でない残基の位置が保存的アミノ酸置換によってしばしば異なることが認識され、アミノ酸残基は類似の化学的性質（例えば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって分子の機能的特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合には、配列の同一性のパーセントが上方に調節されて、置換の保存的性質が補正され得る。このような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると考えられる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコア化し、それにより、配列同一性のパーセンテージを増加することを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存的置換は、ゼロと１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＳおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ ＪＧ．［Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５−９］のアルゴリズムに従って計算される。

【0232】

同一性（例えば、パーセント相同性）は、例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含む、任意の相同性比較ソフトウェアを用いて、例えばデフォルトパラメータを用いることによって決定することができる。

【0233】

本発明のいくつかの実施形態によると、同一性は、全体的同一性、すなわち、本発明の全アミノ酸または核酸配列にわたる同一性であり、その部分にわたるものではない。

【0234】

本発明のいくつかの実施形態によれば、用語「相同性」または「相同な」は、２つ以上の核酸配列の同一性；または２つ以上のアミノ酸配列の同一性；または１つ以上の核酸配列に対するアミノ酸配列の同一性を指す。

【0235】

本発明のいくつかの実施形態によれば、相同性は、全体的相同性、すなわち、本発明の全アミノ酸または核酸配列にわたる相同性であり、その部分にわたるものではない。

【0236】

２つ以上の配列間の相同性または同一性の程度は、種々の既知の配列比較ツールを用いて決定することができる。例えば、ポリヌクレオチド配列で開始し、他のポリヌクレオチド配列に対して比較する場合、ＥＭＢＯＳＳ−６．０．１ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ｅｎｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ａｐｐｓ／ｃｖｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｐｐｓ／ｎｅｅｄｌｅ．ｈｔｍｌから入手可能）を、以下のデフォルトパラメータで使用することができる：（ＥＭＢＯＳＳ−６．０．１）ｇａｐｏｐｅｎ＝１０；ｇａｐｅｘｔｅｎｄ＝０．５；データファイル＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ；ｂｒｉｅｆ＝ＹＥＳ。

【0237】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、配列番号２５〜５０のいずれか１つに記載の核酸配列に含まれる核酸セグメントに向けられる。

【0238】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、配列番号２６〜３１、３３〜３６、３８〜４１、４３〜４５、４７〜４８または５０のいずれか１つに記載の核酸配列に含まれる核酸セグメントに向けられる。

【0239】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、配列番号２６〜３１、３３〜３６、３８〜４１、４３〜４５、４７〜４８または５０のいずれか１つに記載の核酸配列の部分配列に向けられる。

【0240】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、配列番号２６〜３１、３３〜３６、３８〜４１、４３〜４５、４７〜４８または５０のいずれか１つに記載の全核酸配列に向けられる。

【0241】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、標的配列メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよび／またはＤＸＭＴ）を改変し、「標的外」活性を欠く、すなわち、コーヒーゲノム中の他の配列を改変しない。

【0242】

具体的な実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、コーヒーゲノム中の非必須遺伝子上の「標的外活性」を含む。

【0243】

非必須とは、ＤＮＡ編集剤で改変した場合、農業的に価値のある方法（例えば、風味、バイオマス、収率、生物的／非生物的ストレス、害虫耐性、耐容性など）で標的ゲノムの表現型に影響を及ぼさない遺伝子を指す。

【0244】

１つの実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤は、植物細胞における発現をモニタリングするためのレポーターに連結される。

【0245】

１つの実施形態によると、レポーターは、蛍光レポータータンパク質である。

【0246】

用語「蛍光タンパク質」は、蛍光を発し、典型的にはフローサイトメトリー、顕微鏡法または任意の蛍光イメージング系によって検出可能であるポリペプチドを指し、したがって、そのようなタンパク質を発現する細胞の選択のための基礎として使用することができる。

【0247】

レポーターとして使用できる蛍光タンパク質の例は、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）および赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）である。蛍光または他のレポーターの非限定的なリストは、発光（例えば、ルシフェラーゼ）または比色分析（例えば、ＧＵＳ）によって検出可能なタンパク質を含む。具体的な実施形態によると、蛍光レポーターは、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）またはＧＦＰである。

【0248】

新しいクラスの蛍光タンパク質および応用の総説は、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ［Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅｒｉｋ Ａ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ．；Ｌｉｎ，Ｊｏｈｎ Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚ．；Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａｔｓｕｓｈｉ；Ｐａｌｍｅｒ，Ａｍｙ Ｅ．；Ｓｈｕ，Ｘｉａｏｋｕｎ；Ｚｈａｎｇ，Ｊｉｎ；Ｔｓｉｅｎ，Ｒｏｇｅｒ Ｙ．”Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｏｗｉｎｇ Ｔｏｏｌｂｏｘ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｓ．２０１６．０９．０１０］中に見出される。

【0249】

当該技術分野で既知の任意の結合方法（例えば、レポーターへのＤＮＡ編集剤）を、本教示に従って使用することができる。

【0250】

本明細書で用いられる「結合された」という用語は、一つの配列が結合した配列に必要な機能を提供し得るような核酸配列の接合を指す。レポーターとの関連において、結合するとは、レポーターの転写がＤＮＡ編集剤の転写によって制御され、調節されるように、レポーターがＤＮＡ編集剤の配列に結合されることを意味する。さらに、またはその代替として、結合されたとはまた、レポーターおよびＤＮＡ編集剤の配列が、例えば２つの異なるプロモーターを用いて、同一のプラスミドから、または複数のプラスミドから転写されることを意味し得る（コトランスフェクション）。したがって、結合は、転写融合、翻訳融合であってもよく、または非融合であってもよい。

【0251】

ＤＮＡ編集剤は、典型的には、発現ベクターを用いて植物細胞に導入される。

【0252】

したがって、本発明の態様によれば、コーヒー植物の細胞においてＤＮＡ編集剤を発現するためのシス作用性調節要素（例えば、植物プロモーター）に作動可能に結合しているカフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分に向けられるＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。

【0253】

本教示はまた、ｍＲＮＡ＋ｓｇＲＮＡトランスフェクションまたはＲＮＰトランスフェクションのようなＤＮＡフリーの方法を用いるＤＮＡ編集剤の導入に関することが理解されるであろう。

【0254】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物は、ＤＮＡ編集剤のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９または上述のエンドヌクレアーゼ）をコードする核酸配列を含む。

【0255】

いくつかの実施形態による方法で有用な構築物は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。このような構築物は、商業的に入手可能であり得、植物に形質転換するのに適しており、形質転換された細胞における関連する遺伝子の発現に適している。

【0256】

別の具体的な実施形態によると、エンドヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡは、各々が植物細胞において活性なシス作用性調節要素（例えば、プロモーター）に作動可能に結合する異なる構築物からコードされる。

【0257】

本発明のいくつかの実施形態の特定の実施形態において、調節要素は、植物発現性プロモーターである。

【0258】

本明細書中で使用される「植物発現性」という語句は、植物細胞、組織または器官、好ましくは単子葉植物または双子葉植物の細胞、組織、または器官において発現を誘導、付与、活性化または増強することが少なくとも可能である、それに付加される、またはその中に含まれる任意の追加の調節要素を含むプロモーター配列を指す。本発明のいくつかの実施形態の方法に有用なプロモーターの例には、アクチン、ＣＡＮＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ＧＯＳ２が含まれるが、これらに限定されない。様々な組織、または発生段階において活性であるプロモーターもまた、用いることもできる。

【0259】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ３プロモーターを含む。Ｐｏｌ３プロモーターの例としては、ＡｔＵ６−２９、ＡｔＵ６２６、ＡｔＵ３Ｂ、ＡｔＵ３ｄ、ＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。

【0260】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ２プロモーターを含む。Ｐｏｌ２プロモーターの例としては、ＣａＭＶ ３５Ｓ、ＣａＭＶ １９Ｓ、ユビキチン、ＣＶＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。

【0261】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物中のプロモーターは、３５Ｓプロモーターを含む。

【0262】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物中のプロモーターは、Ｕ６プロモーターを含む。

【0263】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物中のプロモーターは、ゲノム編集剤をコードする核酸配列または蛍光レポーターをコードする核酸配列に作動可能に結合した少なくとも１つのｓｇＲＮＡおよび／またはＰｏｌ２（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターをコードする核酸剤に作動可能に結合したＰｏｌ ３（例えば、Ｕ６）プロモーターを含む（以下の具体的な実施形態で記載されるように）。

【0264】

具体的な実施形態によると、プロモーターは、Ｕ６ ｐｏｌ ３プロモーターである。

【0265】

本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドの核酸配列は、植物発現のために最適化され得る。このような配列改変の例には、限定されるものではないが、関連する植物種において典型的に見出されるより密接なアプローチへの変化したＧ／Ｃ含有量、およびコドン最適化と一般的に呼ばれる植物種において非典型的に見出されるコドンの除去が含まれる。

【0266】

植物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物で安定に、または一時的に形質転換され得る。安定な形質転換において、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子は、植物ゲノムに組み込まれ、そのため、それは、安定であり、遺伝的な形質を表す。過渡状態形質転換では、核酸分子は、細胞形質転換された細胞によって発現されるが、それはゲノムに組み込まれず、そのため、それは過渡状態ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を表す。

【0267】

具体的な実施形態によれば、植物は、ＤＮＡ編集剤で一時的にトランスフェクトされる。

【0268】

具体的な実施形態によれば、構築物は、一過性発現に有用である（Ｈｅｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：１３）。一過性形質転換の方法については、以下にさらに述べる。

【0269】

本発明のいくつかの実施態様の教示に従って、様々なクローニングキットを使用することができる［例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）によるＧｏｌｄｅｎＧａｔｅアセンブリキット］。

【0270】

具体的な実施形態によれば、核酸構築物は、バイナリーベクターである。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ−ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎまたはｐＰＺＰである（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９（１９９４）およびＨｅｌｌｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５，４４６（２０００））。

【0271】

ＤＮＡ送達の他の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、衝撃、ウイルス接種）で使用されるべき他のベクターの例は：ｐＧＥ−ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．２０１６ ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００４ ３２，９４７−９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲ−ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）−ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３ １１；９（１）：３９）である。

【0272】

たとえばプロトプラストを用いる、植物細胞にＤＮＡを導入するいくつかの方法があり、熟練した技術者は、いずれを選択するかを知っているだろう。

【0273】

核酸の送達は、当業者に知られている任意の方法によって、本発明の実施形態において植物細胞に導入され得、例えば、限定されずに：プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照されたい）；乾燥／阻害を介したＤＮＡ取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−８を参照）。エレクトロポレーションによる（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照）；炭化ケイ素繊維を用いた攪拌による（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号を参照のこと）。アグロバクテリウムを介した形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、第５，５９１，６１６号、第５，６９３，５１２号、第５，８２４，８７７号、第５，９８１，８４０号、および第６，３８４，３０１号を参照）；ＤＮＡ被覆粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、５，５５０，３１８号、５，５３８，８８０号、６，１６０，２０８号、６，３９９，８６１号、および６，４０３，８６５号を参照）ならびにナノ粒子、ナノキャリアおよび細胞透過性ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号；国際公開第２００９０４６３８４Ａ１号；国際公開第２００８１４８２２３Ａ１号）を含み、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチドおよび／もしくはタンパク質、または核酸およびペプチドの組み合わせを植物細胞に送達するための方法における。

【0274】

トランスフェクションの他の方法としては、トランスフェクション試薬（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３，４８９７−９０２）、細胞浸透ペプチド（Ｍａｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６９（２）：１０１−７）またはポリアミン（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ，２０１０，Ｓｈｏｒｔ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９−３６６）の使用が挙げられる。

【0275】

具体的な実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）へのＤＮＡの導入は、エレクトロポレーションによって行われる。

【0276】

具体的な実施形態によれば、植物細胞（例えば、胚発生細胞）へのＤＮＡの導入は、衝撃／バイオリスティクスによって行われる。

【0277】

具体的な実施形態によれば、プロトプラストにＤＮＡを導入するために、この方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介ＤＮＡ取り込みを含む。さらなる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．９：５７５−５７８；Ｍａｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１４：２２１−２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３−３７３を参照されたい。次に、プロトプラストは、細胞壁が成長し、分裂を開始してカルスを形成し、芽および根が発達し、植物全体を再生することを可能にする条件下で培養する。

【0278】

一過性の形質転換は、改変された植物ウイルスを用いたウイルス感染によっても起こりうる。

【0279】

植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶおよびＢＶが含まれる。植物ウイルスを用いた植物の形質転換については、米国特許第４，８５５，２３７号（ＢＧＶ）、欧州特許第６７，５５３号（ＴＭＶ）、日本国特許出願第６３−１４６９３号（ＴＭＶ）、欧州特許第１９４，８０９号（ＢＶ）、欧州特許第２７８，６６７号（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１７２−１８９（１９８８）に記載されている。植物を含む多くの宿主における外来ＤＮＡの発現に使用するためのシュードウイルス粒子は、国際公開第８７／０６２６１号に記載されている。

【0280】

植物における非ウイルス性外来性核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記の参考文献によって、ならびにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４−１２９７；およびＴａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３−７６によって例証されている。

【0281】

ウイルスがＤＮＡウイルスである場合には、ウイルス自体に適当な改変を施すことができる。別法として、ウイルスＤＮＡを、外来性ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築するのを容易にするために、まず細菌性プラスミド中にクローン化することができる。次いで、ウイルスＤＮＡを、プラスミドから切り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、細菌の複製の起点がウイルスＤＮＡに結合し、それが次いで細菌によって複製される。このＤＮＡの転写および翻訳によって、コートタンパク質がつくられ、それは、ウイルスＤＮＡをキャプシド形成する。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合は、一般にウイルスをｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミドに挿入する。次に、プラスミドを用いて、構築物のすべてをつくる。次いで、ＲＮＡウイルスは、プラスミドのウイルス配列を転写し、ウイルス遺伝子を翻訳して、ウイルスＲＮＡをキャプシド形成するコートタンパク質（複数可）を産生することによって産生される。

【0282】

本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれるような非ウイルス性外因性核酸配列の植物への導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献ならびに米国特許第５，３１６，９３１号によって実証される。

【0283】

１つの実施形態において、植物ウイルス核酸が提供され、天然コートタンパク質コード配列は、ウイルス核酸、非天然植物ウイルスコートタンパク質コード配列、および非天然プロモーターから削除されており、好ましくは、植物宿主での発現、組換え植物ウイルス核酸のパッケージングが可能であり、組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染を確実にする非天然コートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが、挿入されている。あるいは、コートタンパク質遺伝子は、タンパク質が産生されるように、その内部に非天然核酸配列を挿入することによって不活性化され得る。組換え植物ウイルス核酸は、１つ以上の追加の非天然サブゲノムプロモーターを含み得る。各非天然サブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子または核酸配列を転写または発現することができ、互いに、および天然サブゲノムプロモーターと組換えることができない。非天然（外来）核酸配列は、１つより多い核酸配列が含まれる場合には、天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターまたは天然および非天然植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入され得る。非天然核酸配列は、所望の産物を産生するために、サブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または発現される。

【0284】

第２の実施態様において、天然のコートタンパク質コード配列が、非天然コートタンパク質コード配列の代わりに非天然コートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して配置されることを除いて、組換え植物ウイルス核酸が、第１の実施形態におけるように提供される。

【0285】

第３の実施形態では、天然のコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つ以上の非天然のサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている、組換え植物ウイルス核酸が提供される。挿入された非天然サブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接する遺伝子を転写または発現することが可能であり、互いに、および天然サブゲノムプロモーターと組換えることができない。非天然核酸配列は、配列がサブゲノムプロモーターの制御下で宿主植物において転写または発現されて、所望の産物を産生するように、非天然サブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入され得る。

【0286】

第４の実施形態において、組換え植物ウイルス核酸は、天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列によって置換されることを除いて、第３の実施形態におけるように提供される。

【0287】

ウイルスベクターは、組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によってキャプシド形成されて、組換え植物ウイルスを産生する。組換え植物ウイルス核酸または組換え植物ウイルスを用いて、適当な宿主植物に感染させる。組換え植物ウイルス核酸は、宿主内での複製、宿主内での全身拡散、および宿主内での外来遺伝子（複数可）（単離された核酸）の転写または発現が可能であって、所望のタンパク質を産生する。

【0288】

採用された形質転換／感染方法にかかわらず、本教示はさらに、本明細書に記載される核酸構築物（複数可）を含む任意の細胞、例えば植物細胞（例えば、プロトプラスト）に関する。

【0289】

形質転換に続いて、細胞は、選択方法に供される。当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、形質転換した細胞を選択することができる。

【0290】

選択に続いて、形質転換された植物細胞（例えば、プロトプラスト）の正に選択されたプールを採集し、アリコートを用いて、ＤＮＡ編集事象を試験することができる。

【0291】

あるいは（または任意の検証に続いて）、クローンは、コロニー、すなわちクローン（少なくとも２８日）およびマイクロカルスに発達するまで、選択（例えば、選択マーカーのための抗生物質）の非存在下で培養される。少なくとも６０〜１００日の培養（例えば、少なくとも７０日、少なくとも８０日）に続いて、カルスの細胞の一部を、ＤＮＡ編集事象およびＤＮＡ編集剤の存在、すなわち、ＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の消失について分析（検証）し、この方法の一過性の性質を指摘する。

【0292】

したがって、クローンは、求められる編集のタイプ、例えば、挿入、欠失、挿入−欠失（Ｉｎｄｅｌ）、逆位、置換およびそれらの組合せに依存して、本明細書中で「突然変異」または「編集」とも呼ばれるＤＮＡ編集事象の存在について検証される。

【0293】

具体的な実施形態によれば、突然変異は、約１〜５００ヌクレオチド、約１〜２５０ヌクレオチド、約１〜１５０ヌクレオチド、約１〜１００ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜２５ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチドまたは約１００〜２００ヌクレオチドの改変を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0294】

１つの実施形態によれば、突然変異は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または多くとも５００ヌクレオチドの改変を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0295】

１つの実施形態によれば、改変は、連続する核酸配列（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００塩基）においてであり得る。

【0296】

１つの実施形態によれば、改変は、例えば１０、２０、５０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、５０００の核酸配列全体にわたって、非連続的な方法においてであり得る。

【0297】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも２００ヌクレオチドの改変を含む。

【0298】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも１５０ヌクレオチドの改変を含む。

【0299】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも１００ヌクレオチドの改変を含む。

【0300】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも５０ヌクレオチドの改変を含む。

【0301】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも２５ヌクレオチドの改変を含む。

【0302】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも２０ヌクレオチドの改変を含む。

【0303】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも１５ヌクレオチドの改変を含む。

【0304】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも１０ヌクレオチドの改変を含む。

【0305】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも５ヌクレオチドの改変を含む。

【0306】

具体的な実施形態によると、突然変異は、多くとも２ヌクレオチドの改変を含む。

【0307】

具体的な実施形態によると、突然変異は、１つのヌクレオチドの改変を含む。

【0308】

１つの実施形態によれば、突然変異は、標的分子の認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが、元のＰＡＭ認識部位を消失させるように改変されるようなものである。

【0309】

具体的な実施形態によると、突然変異は、ＰＡＭモチーフ中の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の核酸におけるものである。

【0310】

１つの実施形態によると、突然変異は、挿入を含む。

【0311】

具体的な実施形態によれば、挿入は、約１〜５００ヌクレオチド、約１〜２５０ヌクレオチド、約１〜１５０ヌクレオチド、約１〜１００ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜２５ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチドまたは約１００〜２００ヌクレオチドの挿入を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0312】

一実施形態によれば、挿入は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００または多くとも５００ヌクレオチドの挿入を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0313】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも２００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0314】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも１５０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0315】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも１００ヌクレオチドの挿入を含む。

【0316】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも５０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0317】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも２５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0318】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも２０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0319】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも１５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0320】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも１０ヌクレオチドの挿入を含む。

【0321】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも５ヌクレオチドの挿入を含む。

【0322】

具体的な実施形態によると、挿入は、多くとも２ヌクレオチドの挿入を含む。

【0323】

具体的な実施形態によると、挿入は、１つのヌクレオチドの挿入を含む。

【0324】

１つの実施形態によると、突然変異は、欠失を含む。

【0325】

具体的な実施形態によれば、欠失は、約１〜５００ヌクレオチド、約１〜２５０ヌクレオチド、約１〜１５０ヌクレオチド、約１〜１００ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜２５ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチドまたは約１００〜２００ヌクレオチドの欠失を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0326】

一実施形態によれば、欠失は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または多くとも５００ヌクレオチドの欠失を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0327】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも２００ヌクレオチドの欠失を含む。

【0328】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも１５０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0329】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも１００ヌクレオチドの欠失を含む。

【0330】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも５０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0331】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも２５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0332】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも２０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0333】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも１５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0334】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも１０ヌクレオチドの欠失を含む。

【0335】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも５ヌクレオチドの欠失を含む。

【0336】

具体的な実施形態によると、欠失は、多くとも２ヌクレオチドの欠失を含む。

【0337】

具体的な実施形態によると、欠失は、１つのヌクレオチドの欠失を含む。

【0338】

１つの実施形態によると、突然変異は、点突然変異を含む。

【0339】

具体的な実施形態によれば、点突然変異は、約１〜５００ヌクレオチド、約１〜２５０ヌクレオチド、約１〜１５０ヌクレオチド、約１〜１００ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜２５ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約１０〜２５０ヌクレオチド、約１０〜２００ヌクレオチド、約１０〜１５０ヌクレオチド、約１０〜１００ヌクレオチド、約１０〜５０ヌクレオチド、約１〜５０ヌクレオチド、約１〜１０ヌクレオチド、約５０〜１５０ヌクレオチド、約５０〜１００ヌクレオチドまたは約１００〜２００ヌクレオチドの点突然変異を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0340】

１つの実施形態によれば、点突然変異は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または多くとも５００ヌクレオチドの点突然変異を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0341】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも２００ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0342】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも１５０ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0343】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも１００ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0344】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも５０ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0345】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも２５ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0346】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも２０ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0347】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも１５ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0348】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも１０ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0349】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも５ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0350】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、多くとも２ヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0351】

具体的な実施形態によると、点突然変異は、１つのヌクレオチドにおける点突然変異を含む。

【0352】

１つの実施形態によると、突然変異は、欠失、挿入および／または点突然変異のいずれかの組合せを含む。

【0353】

１つの実施形態によると、突然変異は、ヌクレオチド置換（例えば、置換）を含む。

【0354】

具体的な実施態様によれば、置換は、約１〜５００ヌクレオチド、１〜４５０ヌクレオチド、１〜４００ヌクレオチド、１〜３５０ヌクレオチド、１〜３００ヌクレオチド、１〜２５０ヌクレオチド、１〜２００ヌクレオチド、１〜１５０ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜９０ヌクレオチド、１〜８０ヌクレオチド、１〜７０ヌクレオチド、１〜６０ヌクレオチド、１〜５０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜９０ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜７０ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１０〜１５ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜７０ヌクレオチド、３０〜４０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３０〜７０ヌクレオチド、４０〜５０ヌクレオチド、４０〜８０ヌクレオチド、５０〜６０ヌクレオチド、５０〜７０ヌクレオチド、５０〜９０ヌクレオチド、６０〜７０ヌクレオチド、６０〜８０ヌクレオチド、７０〜８０ヌクレオチド、７０〜９０ヌクレオチド、８０〜９０ヌクレオチド、９０〜１００ヌクレオチド、１００〜１１０ヌクレオチド、１００〜１２０ヌクレオチド、１００〜１３０ヌクレオチド、１００〜１４０ヌクレオチド、１００〜１５０ヌクレオチド、１００〜１６０ヌクレオチド、１００〜１７０ヌクレオチド、１００〜１８０ヌクレオチド、１００〜１９０ヌクレオチド、１００〜２００ヌクレオチド、１１０〜１２０ヌクレオチド、１２０〜１３０ヌクレオチド、１３０〜１４０ヌクレオチド、１４０〜１５０ヌクレオチド、１６０〜１７０ヌクレオチド、１８０〜１９０ヌクレオチド、１９０〜２００ヌクレオチド、２００〜２５０ヌクレオチド、２５０〜３００ヌクレオチド、３００〜３５０ヌクレオチド、３５０〜４００ヌクレオチド、４００〜４５０ヌクレオチド、または約４５０〜５００ヌクレオチドの置換を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0355】

一実施形態によれば、ヌクレオチド交換は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または多くとも５００ヌクレオチドのヌクレオチド置換を含む（カフェイン生合成経路の野生型成分、例えば、ＸＭＴ／ＤＸＭＴ／ＭＸＭＴのヌクレオチド配列と比較して）。

【0356】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも２００ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0357】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも１５０ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0358】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも１００ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0359】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも５０ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0360】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも２５ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0361】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも２０ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0362】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも１５ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0363】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも１０ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0364】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも５ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0365】

具体的な実施形態によれば、ヌクレオチド置換は、多くとも２ヌクレオチドにおいてヌクレオチド置換を含む。

【0366】

具体的な実施形態によると、ヌクレオチド置換は、１つのヌクレオチドにおけるヌクレオチド置換を含む。

【0367】

具体的な実施形態によると、ゲノム編集事象は、コーヒー植物のゲノムへの外来ＤＮＡの導入（例えば、挿入または置換突然変異）を含み、他の方法では、例えば、第２の植物からの（例えば、交配による）伝統的な育種によって植物に導入することができる。

【0368】

具体的な実施形態によると、ゲノム編集事象は、伝統的な育種を通して（例えば、交配によって）導入され得るコーヒー植物のゲノムへの外来ＤＮＡの導入（例えば、挿入または置換突然変異）を含まない。

【0369】

配列変化を検出するための方法は、当該技術分野において周知であり、限定されるものではないが、ＤＮＡ配列決定（例えば、次世代配列決定）、電気泳動、酵素ベースミスマッチ検出アッセイ、ならびにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、インシチューハイブリダイゼーション、プライマー伸長、サザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロット分析などのハイブリダイゼーションアッセイを含む。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出のために使用される種々の方法、例えばＰＣＲベースのＴ７エンドヌクレアーゼ、ＨｅｔｒｏｄｕｐｌｅｘおよびＳａｎｇｅｒ配列決定を、使用することもできる。

【0370】

ＤＮＡ編集事象の存在を確認する別の方法、例えばＩｎｄｅｌｓは、ミスマッチしたＤＮＡを認識し、切断する構造選択的酵素（例えば、エンドヌクレアーゼ）を用いるミスマッチ切断アッセイを含む。

【0371】

ミスマッチ切断アッセイは、インデルの検出のための簡便で費用対効果の高い方法であり、したがってゲノム編集によって誘導される突然変異を検出するための典型的な手順である。このアッセイでは、ヘテロ二本鎖ＤＮＡをミスマッチで切断する酵素および複数のヌクレオチドによって形成されるらせん外ループを用い、２つ以上のより小さな断片が得られる。約３００〜１０００ｂｐのＰＣＲ産物を、生成した断片がサイズが異なっており、従来のゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって容易に分割できるように、予測されるヌクレアーゼ切断部位が中心から離れた状態で生成する。末端標識された消化産物は、自動ゲル電気泳動または毛細管電気泳動によっても分析できる。遺伝子座におけるインデルの頻度は、ＰＣＲアンプリコンおよび切断されたＤＮＡバンドの統合強度を測定することによって推定することができる。消化ステップには１５〜６０分を要し、ＤＮＡ調製およびＰＣＲステップを加えると、３時間未満で全体アッセイを完了できる。

【0372】

このアッセイでは、２種類の代替の酵素が典型的に用いられる。Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）は、ミスマッチの上流の第１、第２または第３のホスホジエステル結合で不完全に一致したＤＮＡを認識し、切断するリゾルベースである。Ｔ７Ｅ１ベースのアッセイの感度は、０．５〜５％である。一方、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ Ｉｎｃ．，Ｏｍａｈａ，ＮＥ，ＵＳＡ）は、セロリ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーの要素である。それは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）または小さいインデルの存在によるミスマッチを認識し、切断し、ミスマッチの下流の両方のＤＮＡ鎖を切断する。それは、１２ ｎｔまでのインデルを検出でき、約３％程度の低い頻度、すなわち３２コピーに１個の頻度で存在する突然変異に対して感受性がある。

【0373】

編集の存在を確認する尚他の方法は、さらに高分解能融解分析を含む。

【0374】

高分解能融解分析（ＨＲＭＡ）では、蛍光色素を組み込んだリアルタイムＰＣＲによりゲノム標的（９０〜２００ｂｐ）に及ぶＤＮＡ配列を増幅し、続いてアンプリコンの溶融曲線解析を行うことを伴う。ＨＲＭＡは、熱変性の間に二本鎖ＤＮＡからインターカレート色素が放出されるときの蛍光の消失に基づいている。それは、アンプリコンの温度依存性変性プロファイルを記録し、溶融プロセスに１種以上の分子種が関与しているか否かを検出する。

【0375】

さらに別の方法は、ヘテロ二本鎖可動性アッセイである。天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって直接再ハイブリダイズしたＰＣＲ断片を分析することによっても、突然変異を検出することができる。この方法は、ポリアクリルアミドゲル中のヘテロ二本鎖ＤＮＡとホモ二本鎖ＤＮＡとの移動の違いを利用する。インデルによって引き起こされる、マッチングされた、およびミスマッチされたＤＮＡストランドの間の角度は、ヘテロ二本鎖ＤＮＡが天然の条件下でホモ二本鎖ＤＮＡよりも著しく遅い速度で移動することを意味し、それらは、その移動性に基づいて容易に区別できる。１５％ポリアクリルアミドゲルで、１４０〜１７０ｂｐの断片を分離できる。このようなアッセイの感度は、最適条件下で０．５％に近づくことができ、これはＴ７Ｅ１と同様である。ＰＣＲ産物を再アニーリングした後、アッセイの電気泳動成分は約２時間かかる。

【0376】

編集事象の存在を検証する他の方法については、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ ２０１７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ １（１）：９５−１０４に長く記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0377】

コーヒー植物は、例えば、Ｔｒａｎ，Ｈｕｅ Ｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．“Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｄｒａｆｔ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｃｏｆｆｅｅ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ＳＮＰｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｆｆｅｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ”，Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ（２０１８）１６（１０）：１７５６−１７６６．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２９１２に記載されているように、二倍体または倍数体、例えば四倍体であり得、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、ポジティブクローンは、ＤＮＡ編集事象についてホモ接合性（すなわち、編集はすべての対立遺伝子で起こる）またはヘテロ接合性（すなわち、編集は、少なくとも１つの対立遺伝子で、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれ以上の対立遺伝子で起こる）であり得ることが理解される。ヘテロ接合型の場合には、異なる対立遺伝子が異なる編集事象を担うことがある。さらに、ヘテロ接合型では、すべての対立遺伝子が当該事象（同一または異なる編集事象）を起こし得るわけではない。ホモ接合型の場合には、すべての対立遺伝子が同じ編集を起こすことがある。熟練技術者は、意図される使用に応じて、さらなる培養／再生および交配のためのクローンを選択する。

【0378】

所望によりＤＮＡ編集事象の存在を示すクローンは、ＤＮＡ編集剤の存在についてさらに分析される。すなわち、ＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の消失であり、この方法の一過性の性質を指摘している。

【0379】

このことは、ＤＮＡ編集剤（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質で）の発現を、例えば、ＧＦＰまたはｑ−ＰＣＲの蛍光検出によって分析することによって行うことができる。

【0380】

代わりに、または追加的に、細胞を、本明細書に記載されるような核酸構築物、またはその部分、例えばレポーターポリペプチドまたはＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列の存在について分析する。

【0381】

蛍光レポーターまたはＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡを示さないクローン（例えば、蛍光顕微鏡検査、ｑ−ＰＣＲおよびまたはサザンブロット、ＰＣＲ、配列決定のような任意の他の方法によって確認されたように）であって、尚所望されるようなＤＮＡ編集事象（複数可）［突然変異（複数可）］を含むものは、さらなるプロセシングのために単離される。

【0382】

したがって、これらのクローンは保存できる（例えば凍結保存）。

【0383】

あるいは、細胞（たとえばプロトプラスト）を、まずカルスに発生する植物細胞の群に成長させ、次に植物組織培養法を用いてカルスから芽を再生（コーロジェネシス）させることによって、植物体全体に再生させることもできる。プロトプラストをカルスに成長させ、芽を再生させるには、植物の種ごとに特注されなければならない組織培養培地中の植物生長調節因子の適切なバランスが必要である。

【0384】

プロトプラスト融合とよばれる技術を用いて、プロトプラストを植物の育種に用いることもある。異なる種からのプロトプラストは、電場またはポリエチレングリコールの溶液を用いることによって融合を誘導される。この技術は、組織培養において体細胞雑種を生成するために使用され得る。

【0385】

プロトプラスト再生の方法は、当技術分野ではよく知られている。プロトプラストの単離、培養、および再生には、いくつかの要因が影響する。すなわち、遺伝子型、供与体組織およびその前処理、プロトプラスト単離のための酵素処理、プロトプラスト培養の方法、培養、培養培地、ならびに物理的環境である。徹底的なレビューについてはＭａｈｅｓｈｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．１９８６ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｎｄ ｏｆ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌｓ：３−３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照のこと。参照により本明細書に組み込まれる。

【0386】

再生した植物は、熟練した技術者が適合するように、更なる育種、自殖、交配、戻し交配および選択に供することができる。

【0387】

最終系統、植物または中間育種産物の表現型は、例えばメチルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよび／またはＤＸＭＴ）の配列の決定、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルにおけるその発現、タンパク質の活性および／またはコーヒー豆の特性（例えば、低下したカフェインレベル）の分析などによって分析することができる。

【0388】

本明細書および以下に続く実施例の章に例示されている通りである。本発明者らは、安定した遺伝子組換えを回避しながら、ゲノム編集剤でコーヒーを形質転換することができた。

【0389】

したがって、本方法論は、選択可能な、またはスクリーニング可能なレポーターを組み込むことなく、ゲノム編集を可能にする。

【0390】

したがって、本発明の実施形態は、本発明の教示に従って作成された遺伝子編集事象（複数可）を含む植物、植物部分（例えば、豆）、植物細胞および植物の加工製品に関する。

【0391】

本発明の一態様によれば、カフェイン生合成経路の少なくとも１つの成分をコードする核酸配列における機能喪失突然変異を含むゲノムを含むコーヒー植物が提供される。

【0392】

本発明の一実施形態によれば、本明細書中に記載の方法に従って生成されたコーヒー植物が提供される。

【0393】

１つの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物またはその一部は、機能喪失突然変異を欠く同じ遺伝的背景および発生段階および成長条件のコーヒー植物のものと比較して、カフェイン含有量を低下させることを含む。具体的な実施形態によれば、低下したカフェイン含有量は、機能喪失突然変異を欠く同じ遺伝的背景および発生段階および成長条件のコーヒー植物のものと比較して少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはさらにそれ以上である。

【0394】

一実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、機能喪失突然変異を欠く同一の遺伝的背景および発生段階および成長条件のコーヒー植物のものと比較して、カフェインの少なくとも約５％の減少を含む。

【0395】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、機能喪失突然変異を欠く遺伝的背景および発生段階および成長条件が同じコーヒー植物のものと比較して少なくとも約１０％のカフェインの減少を含む。

【0396】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、非トランスジェニック（非ＧＭＯ）である。

【0397】

１つの実施形態によると、本発明のいくつかの実施形態のコーヒー植物は、トランスジェニック（ＧＭＯ）である。

【0398】

本教示はまた、本明細書に記載されている植物の部分、またはその加工製品に関する。

【0399】

具体的な実施形態によると、植物部分は豆である。

【0400】

別の具体的な実施形態によると、豆は乾燥している。

【0401】

いくつかの実施形態によれば、カフェイン含有量が低下したコーヒー豆を製造する方法が提供され、この方法は、以下：
（ａ）本発明のいくつかの実施形態の植物を成長させるステップ；
（ｂ）植物から豆を収穫するステップ
を含む。

【0402】

さらなる実施形態によれば、カフェイン含有量が低下したコーヒーを製造する方法が提供され、当該方法は、本発明のいくつかの実施形態の豆を抽出、脱水および任意に焙焼に供するステップを含む。

【0403】

コーヒー豆（コーヒー植物から）を収穫するための当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。例えば、コーヒーチェリー（すなわち、豆を含むコーヒー果実）は、ストリップピッキング（機械もしくは手のいずれかによってコーヒーチェリーを一度に枝からはがす）または選択的ピッキング（成熟したチェリーのみを収穫し、手で個別に拾う）によって拾うことができる。

【0404】

さらに、コーヒー豆を加工するための当該技術分野で公知の任意の方法を、本発明に従って使用することができる。

【0405】

１つの実施形態によれば、コーヒー豆は、「湿式処理」によって処理され、チェリーの果肉／皮が豆から分離され、次に豆が例えば約２日間水中に浸漬されて発酵される。次いで、豆は、例えば太陽中で、または商業的な製造業者の場合は乾燥機中で洗浄され、乾燥され得る。

【0406】

１つの実施形態によれば、コーヒー豆は、「乾燥処理」によって処理され、小枝および他の異物がチェリーから分離され、チェリーは、例えば２〜３週間、例えばコンクリートまたはレンガ上で太陽中で広げられ（発酵が起こる）、さらに乾燥するために規則的に回転される。

【0407】

使用される処理方法（例えば「湿式処理」または「乾燥処理」）にかかわらず、チェリーの果肉／皮膚は、典型的には発酵の開始前に除去されることが認識されるであろう。

【0408】

１つの実施形態によれば、処理が行われた後、外皮を除去し（豆から）、豆を焙焼する。

【0409】

１つの実施形態によれば、本発明のいくつかの実施形態の豆のコーヒーが提供される。

【0410】

いくつかの実施形態の加工されたコーヒー組成物は、抽出もしくは醸造されるべきコーヒー粉末または可溶性コーヒー粉末の形態であり得る。したがって、コーヒーは粗粉、フィルターコーヒーまたはインスタントコーヒーであり得る。一方、本発明のコーヒー組成物は、焙焼されたコーヒー豆全体を含むこともできる。

【0411】

１つの実施形態によると、コーヒーは、粉末の形態である。

【0412】

１つの実施形態によると、コーヒーは、顆粒状形態である。

【0413】

本発明のさらなる実施形態は、コーヒー組成物および水を含むコーヒー飲料に関する。このようなコーヒー飲料は、当業者に公知の方法、例えば水で抽出する、水で醸造する、または本発明のコーヒー組成物を水に浸すことによって調製することができる。

【0414】

本発明のコーヒー飲料は、天然または人工の香味物質、乳製品、アルコール、発泡剤、天然または人工の甘味剤などのような他の物質も含むことができる。

【0415】

いくつかの実施形態のコーヒー組成物は、限定されるものではないが、アメリカーノ、カプチーノ、カフェラテ、エスプレッソ、マキアート、ブラック、フラットホワイト、アフォガート、モカチノ、アイリッシュコーヒーおよびモカなどの飲料における使用に適している。

【0416】

本発明のさらなる実施形態は、すぐに飲める飲料、クリーマー、コーヒーミックス、ココアモルト飲料を製造するための、およびチョコレート、パンまたは料理製品を製造するための、コーヒー組成物の使用に関する。

【0417】

本発明のコーヒー組成物は、飲料ディスペンサーに使用するためにカプセルに詰め込むことができる。さらに、またはその代替として、本発明のコーヒー組成物は、好ましくはコーヒーの乾燥および鮮度が維持されるように、紙、布またはプラスチック袋に詰め込むことができる。

【0418】

ここで使用する「約」とは、±１０％を指す。

【0419】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する」およびそれらの結合体は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。

【0420】

「からなる」という用語は、「含み、これに限定される」を意味する。

【0421】

用語「本質的に〜からなる」とは、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部分を含み得るが、追加の成分、ステップおよび／または部分が特許請求される組成物、方法または構造の基本的および新規の特徴を実質的に変更しない場合に限ることを意味する。

【0422】

本明細書中で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が他の点を明確に指示しない限り複数の参照を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

【0423】

本明細書を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便利および簡潔のためにすぎず、本発明の範囲に関する柔軟性のない制限として解釈すべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の説明は、当該範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブ範囲を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記述は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびに当該範囲内の個別の数、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。

【0424】

ここで数値範囲を示す場合は必ず、示された範囲内に引用されたいかなる数表示（分数または積分）も含めることを意味する。第１の表示番号と第２の表示番号との「間の範囲の／範囲」という句、および第１の表示番号「から」第２の表示番号までの「範囲の／範囲」という句は、本明細書では互換的に使用され、第１および第２の表示番号ならびにそれらの間のすべての分数および整数を含むことを意味する。

【0425】

ここでいう「方法」とは、化学、薬理学、生物学、生化学および医学分野の専門家が公知の、または公知の方法、手段、技術および手順から容易に開発された当該方法、手段、方法、技術および手順を含むが、これらに限定されるものではない。

【0426】

本明細書中で使用される、用語「処置する」は、状態の進行を阻止する、実質的に抑制する、遅くする、または逆行させる、状態の臨床的または審美的条件を実質的に改善する、または状態の臨床的または審美的条件の出現を実質的に妨げることを含む。

【0427】

別々の実施形態との関連で記述される本発明の特定の特徴は、単一の実施形態においても組み合わせて提供され得ることが分かる。逆に、簡潔に言うと、単一の実施形態との関連で記載される本発明の様々な特徴は、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションにおいて、または本発明の任意の他の記載された実施形態において適切なものとして提供されることもできる。様々な実施形態との関連で記載されている特定の特徴は、実施形態がそれらの要素を伴わない手術不能でない限り、それらの実施形態の必須の特徴とは考えられない。

【0428】

以下の請求項に記載されている本発明の様々な実施形態および側面は、以下の実施例において実験的裏付けを見出す。

【0429】

本出願において開示されたいかなる配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）も、その配列ＩＤ ＮＯが言及されている状況に応じて、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列のいずれかを指すことができることが理解されるが、それは、たとえその配列ＩＤ ＮＯがＤＮＡ配列フォーマットまたはＲＮＡ配列フォーマットのみで発現されている場合であっても、その配列ＩＤ ＮＯが言及されている状況に依存する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ＤＮＡ配列形式で発現されるが（例えば、チミンについてＴを引用する）、それは、ＭＸＭＴ核酸配列に相当するＤＮＡ配列、またはＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載されている分子の実際のタイプに応じて、ＲＮＡ配列形式で発現される（例えば、ウラシルについてＵを引用する）が、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、または示されているＲＮＡ配列に相当するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、任意の置換で開示された配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方が想定される。

【実施例】

【0430】

ここでは、上記の説明とともに、本発明を非限定的な様式で例示する以下の実施例を参照する。

【0431】

一般に、本明細書中で使用される命名法および本発明で使用される実験室手順は、分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献で徹底的に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ，”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）”Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ”，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；５，１９２，６５９号および５，２７２，０５７号に述べられている方法論；”Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＩＩ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），”Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８版），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）を参照；利用可能なイムノアッセイは、特許文献および科学文献に広く記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；３，８３９，１５３号；３，８５０，７５２号；３，８５０，５７８号；３，８５３，９８７号；３，８６７，５１７号；３，８７９，２６２号；３，９０１，６５４号；３，９３５，０７４号；３，９８４，５３３号；３，９９６，３４５号；４，０３４，０７４号；４，０９８，８７６号；４，８７９，２１９号；５，０１１，７７１号および５，２８１，５２１号；”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｄ．（１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，ｅｄｓ．（１９８５）；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ｅｄ．（１９８６）；”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，（１９８４）および”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌ．１−３１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；”ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ − Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ”ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）を参照されたい；これらのすべては、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。その他の一般的参考文献は、本文書全体を通して提供される。その中の手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。ここに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0432】

一般的な材料および実験手順
胚発生カルスならびに細胞浮遊生成および維持
胚カルスは、以前に記載されているように［Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔｓ．２００５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ．１６７−１７９５中のＥｔｉｅｎｎｅ，Ｈ．，Ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ｃｏｆｆｅｅ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ Ｌ．ａｎｄ Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ Ｐ．）］得た。簡単に言うと、若い葉を表面滅菌し、１ｃｍ^２片に切断し、２．２６μＭの２、４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、４．９２μＭのインドール−３−酪酸（ＩＢＡ）および９．８４μＭのイソペンテニルアデニン（ｉＰ）を添加した半強度半固体ＭＳ培地上に１か月間置いた。次いで、外植片を、４．５２μＭの２，４−Ｄおよび１７．７６μＭの６−ベンジルアミノプリン（６−ＢＡＰ）を含有する半強度半固体ＭＳ培地に、胚発生カルスの再生まで６〜８か月間移した。胚発生カルスは、５μＭの６−ＢＡＰを添加したＭＳ培地上で維持した。

【0433】

細胞懸濁培養物を、以前に記載されているように胚形成カルスから作製した［Ａｃｕｎａ，Ｊ．Ｒ．およびＭ．ｄｅ Ｐｅｎａ，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ（１９９１）．，１０（６）：３４５−３４８］。胚発生カルス（３０ｇ／ｌ）を、１３．３２μＭの６−ＢＡＰを添加した液体ＭＳ培地中に置いた。フラスコを、振盪インキュベーター（１１０ｒｐｍ）中に２８℃で入れた。細胞懸濁液は、完全に確立するまで２〜４週間ごとに継代培養／継代した。細胞懸濁培養物は、４．４４μＭの６−ＢＡＰを含む液体ＭＳ培地中で維持した。

【0434】

標的遺伝子
栽培品種Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａ（Ｒｏｂｕｓｔａコーヒー）における標的遺伝子は、メチルトランスフェラーゼ：キサントシンメチルトランスフェラーゼ（ＸＭＴ）、７−メチキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＭＸＭＴまたはテオブロミンシンターゼ）、および３，７−ジメチルキサンチンメチルトランスフェラーゼ（ＤＸＭＴまたはカフェインシンターゼ）をコードする遺伝子である。

【0435】

【表1】

【0436】

ｓｇＲＮＡ設計
ｓｇＲＮＡ配列は、２つの別々の戦略に従って設計される。第１の戦略は、２つのｃｒＲＮＡを直接用いてＸＭＴ遺伝子（Ｃｃ０９＿ｇ０６９７０）を標的とすることを伴う。第２の戦略は、遺伝子が相同性を共有しており、したがってｃｒＲＮＡが経路中の脱カフェイン化遺伝子（デカフコーヒー遺伝子ともよばれる）の発現されたすべてのコピーを標的とするように設計されたという事実を利用している。

【0437】

ｃｒＲＮＡ配列は、オンラインＣＲＩＳＰＲ ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／）を用いて設計し、最良の対は、戦略に依存する標的配列への独特性に依存して選択した。

【0438】

各コーヒー変種からの各遺伝子を配列決定し、ｃｒＲＮＡ対象がｓｇＲＮＡ結合を阻害するＳＮＰを含まないことを保証するために整列させた。ｓｇＲＮＡ配列は、０６、０７、０９および２３と称されるＣｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａの４つの系統を用いて研究するために設計した。

【0439】

ｓｇＲＮＡ配列
ｓｇＲＮＡ＃６ ＡＡＡＡＣＣＧＡＡＴＴＧＡＡＡＴＣＡＴＴ（配列番号５１）
ｓｇＲＮＡ＃７ ＴＧＣＣＴＡＡＴＡＧＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣ（配列番号５２）
ｓｇＲＮＡ＃１１ ＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴ（配列番号５３）
ｓｇＲＮＡ＃１２ ＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＴＧ（配列番号５４）
ｓｇＲＮＡ＃１３ ＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＡＡＴ（配列番号５５）
ｓｇＲＮＡ＃１４ ＡＡＡＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣ（配列番号５６）
ｓｇＲＮＡ＃３７ ＣＧＴＡＴＧＣＡＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＡＡ（配列番号５７）
ｓｇＲＮＡ＃３８ ＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＡＴ（配列番号５８）

【0440】

ｓｇＲＮＡクローニング
利用したプラスミドは、（ｉ）、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰ；（ｉｉ）、ＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓ９；および（ｉｉｉ）、ｓｇＲＮＡを駆動するＡｔＵ６プロモーターからなる転写単位で構成された。バイナリーベクター、例えばｐＣＡＭＢＩＡまたはｐＲＩ−２０１−ＡＮ ＤＮＡを、使用することができる。

【0441】

プロトプラスト単離
植物材料（例えば、葉またはカルス）を消化溶液（１％セルラーゼ、０．５％マセロザイム、０．５％ドリセラーゼ、０．４Ｍマンニトール、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ２）中で４〜２４時間室温でインキュベートし、穏やかに振盪することによって、プロトプラストを単離した。消化後、残った植物材料を、Ｗ５溶液（１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１２５ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）で洗浄し、プロトプラスト懸濁液を、４０μｍストレイナーでろ過した。室温で８０ｇで３分間遠心分離した後、プロトプラストを２ｍｌのＷ５緩衝液に再懸濁し、氷中で重力により沈殿させた。最後のプロトプラストペレットを、２ｍｌのＭＭＧ（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ ＭａｇＣｌ２、４ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．６）に再懸濁し、プロトプラスト濃度を、血球計数により決定した。Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色を用いて、プロトプラストの生存率を推定した。

【0442】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プラスミドトランスフェクション
コーヒープロトプラストのＰＥＧトランスフェクションは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，．（２０１５）［Ｗａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ（２０１５）１９１：８２−８９］によって報告された戦略の改良版を用いて実施される。プロトプラストを、ＭＭＧ溶液中で２〜５×１０^６プロトプラスト／ｍｌの密度に再懸濁する。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液を、プラスミドを含むチューブに加える。プラスミド：プロトプラスト比は、形質転換効率に大きく影響するので、プロトプラスト懸濁液中のプラスミド濃度の範囲、５〜３００μｇ／μｌをアッセイする。この混合物にＰＥＧ溶液（１００〜２００μｌ）を加え、２３℃で１０〜６０分間の範囲の様々な時間の長さの間インキュベートする。ＰＥＧ４０００濃度を最適化し、２００〜４００ｍＭマンニトール中の２０〜８０％ＰＥＧ４０００の範囲、１００〜５００ｍＭのＣａＣｌ_２溶液をアッセイする。次にプロトプラストをＷ５で洗浄し、８０ｇで３分間遠心分離し、あらかじめ１ｍｌ Ｗ５で再懸濁し、２３℃で暗所でインキュベートする。２４〜７２時間インキュベートした後、顕微鏡により蛍光を検出する。

【0443】

細胞／組織衝撃
粒子衝撃は、高速微小突起を用いて植物細胞にＤＮＡを導入する手段として用いられる。先に述べたプロトコルは、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａの葉およびカルスを出発材料として用いて利用される（Ｈｉｂｂｅｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。簡単に言うと、カルスまたは表面殺菌した葉を、浸透処理のためにマンニトールを含む培地上に平板培養する。一方、ＤＮＡコートした金粒子は、直径１．０ｕｍの金４０ｍｇを秤量し、それを４℃の低結合性Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ中で１００％のエタノールと混合することによって調製する。金粒子の遠心分離および洗浄ステップに続いて、ＤＮＡでコーティングする：４５μｌのプラスミド（１０００ｎｇ／μｌ）を添加し、ボルテックスして回転させる。次に、スペルミジンおよびＣａＣｌ_２の混合物を調製し、これをその後ＤＮＡコートした金粒子に加える。氷冷後、ＤＮＡコートした金粒子混合物をエタノール中で再び洗浄し、新鮮な１００％エタノール中に放置して衝撃を与える準備をする。衝撃にはＢｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する。８０〜４５０ｐｓｉの破壊ディスクを、イソプロパノールおよび滅菌したマクロキャリアに入れる（チャンバおよびすべての成分は、７０％のエタノールで滅菌する）。次に、ＤＮＡコートした金粒子混合物を、各マイクロキャリアの中心に配置し、エタノールを蒸発させ、すべての成分を組み立てて衝撃を与える。真空圧を設定し、ヘリウム弁を開き、カルスまたは葉を衝撃する。衝撃後、カルスまたは葉を衝撃後培地に通じて、浸透電位を低下させ、暗所でインキュベートして細胞修復を可能にする。

【0444】

蛍光タンパク質発現細胞のＦＡＣＳ選別
プラスミド／ＲＮＡ送達の４８時間後に、細胞を集め、フローサイトメーターを用いて蛍光タンパク質発現のために選別して、ＧＦＰ／編集剤発現細胞について濃縮した［Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ（２０１６）．６：２４３５６に既述のとおり］。この濃縮ステップは、抗生物質の選択をバイパスし、蛍光タンパク質、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを一時的に発現する細胞のみを収集することを可能にする。これらの細胞は、非相同体末端結合（ＮＨＥＪ）および対応する遺伝子発現の喪失による標的遺伝子の編集についてさらに試験することができた。

【0445】

ＣＲＩＳＰＲ系ＤＮＡの遺伝子改変および欠損のスクリーニング
各コロニーから、ＲＦＰ選別プロトプラスト（任意のステップ）または衝撃由来コロニーのアリコートからＤＮＡを抽出し、標的遺伝子に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。コロニーをポジティブとしてサンプリングするための措置が取られた−後で植物を再生するために使用されたコロニー。同じ方法に供したがＣａｓ９−ｓｇＲＮＡを含まない対照反応を含ませ、野生型（ＷＴ）と考えた。次にＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分離して、ＷＴと比較して産物サイズのあらゆる変化を検出した。ＷＴ産物とは異なるＰＣＲ反応産物を、ｐＢＬＵＮＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。さらに、編集事象の検証には配列決定を用いた。得られたコロニーを拾い、プラスミドを単離し、配列決定して、突然変異の性質を決定した。対応するタンパク質のドメイン改変または完全な消失をもたらすと予測される突然変異を有するクローン（コロニーまたはカルス）を、全ゲノム配列決定のために選択して、それらがＣＲＩＳＰＲ系ＤＮＡ／ＲＮＡから遊離していることを検証し、ゲノムＤＮＡレベルで突然変異を検出した。

【0446】

植物再生
配列が決定され、標的遺伝子の発現を失っていると予測され、ＣＲＩＳＰＲ系ＤＮＡ／ＲＮＡが存在しないことが見出されたクローンを、大量に作製するために増殖させ、並行して分化させて、所望の形質を試験するために機能的アッセイを実施する実生を作製した。

【0447】

要するに、形質移入されたプロトプラストを、フィーダープレート上のセルロース膜上に高密度で平板培養して、約１５週間コロニー形成を可能にした。この間、プロトプラストに液体培地（Ｂ５培地＋ビタミン、９２ｇ／Ｌグルコース）を毎週供給した。１５週間後、プロトコロニー（マイクロカルス）を、増殖培地（半強度ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、＋３０ｇ／Ｌスクロース）に移した。次に、増殖しているカルスを、胚発生および発芽のために再生培地（半強度ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）に移した。３〜４週間後、発芽している胚は、実生の伸長のために固形培地に移す準備が整う。

【0448】

【表2】

【0449】

【表3】

【0450】

実施例１
カフェイン生合成遺伝子の同定に用いられるパイプライン
ロブスタコーヒー植物のカフェインレベルを低下させるために、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴを含むカフェイン生合成に関連する遺伝子（図１）を、モデルまたは作物種における特徴づけされた経路から相同配列を検索することにより同定した。このプロセスには、系統解析による遺伝子の進化史の再構築、一般的および標的組織におけるそれらの発現の検証による候補のフィルター処理、および適切なｓｇＲＮＡ設計を保証するための（ミスマッチを避けるための）候補遺伝子の配列決定を目的とする、ＤＮＡおよびタンパク質配列の比較分析のための一連の連続的ステップが含まれる。この手順により、遺伝子の選択、ノックアウトのための最適化された標的領域（保存された、および潜在的に触媒性のドメイン）の同定、ならびに適切なｓｇＲＮＡの設計が可能となった。このパイプラインは、共通の祖先をもつ相同タンパク質が同様の機能をもつ可能性があるという仮定と、系統再構築を行うことによって、遺伝子ファミリーが確立され、進化的な文脈における機能的多様性が評価されることに基づいている。これは、大規模なゲノム重複を起こした植物種および拡大した遺伝子ファミリーにとって、特に重要である。それにもかかわらず、遺伝子ファミリー内のパラログは必ずしも同じ機能をもっているわけではなく、そのプロセスの一部は、ファミリー内の遺伝子の選択を、個々に、または重複性をも説明するための群として標的化することである。

【0451】

実施例２
カフェイン生合成遺伝子の同定および標的化
前述したように、二次代謝産物カフェインの合成には、キサントシンを７−メチルキサンチンに変換してテオブロミンをカフェインに変換する３つのメチル化反応が関与している。この生合成経路に沿った重要な酵素は、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴであり、これらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの合成経路を再構成することによって、およびコーヒー遺伝子の発現によって、カフェイン産生に関与することが、異種系のＯｇｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）前出およびＵｅｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ．［Ｕｅｆｕｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）５９：２２１−２２７］において広範囲に研究され、証明されている。Ｃｏｆｆｅａ ｃａｎｅｐｈｏｒａの全ゲノム解析により、二次代謝産物生合成に関与するいくつかの遺伝子が、Ｎ−メチルトランスフェラーゼを含む遺伝子ファミリーの拡張を受けていたことが明らかになった［Ｄｅｎｏｅｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４）３４５（６２０１）］。この研究はまた、Ｎ−メチルトランスフェラーゼファミリーがコーヒー中に２３の遺伝子をクラスター化するが、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Ｄｅｎｏｅｕｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）前出）などの他の植物種では明らかなクラスターを持たないことを示した。推定上の機能的Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードするコーヒーゲノム内の遺伝子を同定するために、特徴づけされたカフェイン生合成経路からの相同配列を同定した（図３および表２）。タンパク質整列から、選択された遺伝子は８０〜９９％の類似性を共有していることが示された（図２）。

【0452】

【表4】

【0453】

コーヒーゲノムハブ（ｗｗｗ．ｃｏｆｆｅｅ−ｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ）を利用して、種々のコーヒー組織における個々の候補遺伝子の各々の発現データを検索した（図４および５）。ＸＭＴ、ＤＸＭＴおよびＭＸＭＴ Ｃｃ０９ｇ０６９７０、Ｃｃ０１ｇ００７２０、Ｃｃ０９ｇ０６９５０およびＣｃ００ｇ２４７２０のホモログは葉組織および精子周囲で中等度から高度の発現を示し、一方遺伝子Ｃｃ０９ｇ０６９６０は精子周囲を除いて低発現であった（図４および５）。これらの結果に基づき、１つの戦略は、Ｃｃ０９ｇ０６９７０、Ｃｃ０１ｇ００７２０、Ｃｃ０９ｇ０６９５０およびＣｃ００ｇ２４７２０を標的とするｓｇＲＮＡを設計することであった。しかし、ヌクレオチドレベルでの類似性が高いことから（図６）、Ｃｃ０９＿ｇ０６９６０を含むすべてのメチルトランスフェラーゼを標的とするようにｓｇＲＮＡを設計できる保存領域を選択した。次に、これらの領域の配列を決定して、Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ系統（図７Ａ〜Ｅに太字および下線を付した；配列番号２５〜４８）における配列を確認した。最後に、いくつかのアルゴリズムを用いて、ｓｇＲＮＡを設計し（図７Ａ〜Ｅ、図１０および配列番号５１〜７８）、これらを、予測された効率および確率に従ってランク付けして、ノックアウトを生成した。

【0454】

ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子（Ｃｃ０９ｇ０６９７０、Ｃｃ０９ｇ０６９５０およびＣｃ０９ｇ０６９６０）は、図８Ａに示すように２対のｓｇＲＮＡを標的とした。ｓｇＲＮＡは、候補遺伝子のエクソン１とエクソン３との間に位置した。これらの領域は、前述の候補遺伝子間で高度に保存されているため選択された。ｓｇＲＮＡは、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃａｓ−９、およびＵ６ ｐｏｌ ３プロモーターによって駆動される２つのｓｇＲＮＡを含むトランスフェクションプラスミドにクローニングされた。

【0455】

次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体、ならびにＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ候補遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを、コーヒープロトプラストにトランスフェクトし（ＰＥＧを用いて上述したように）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってそのような複合体を担持する細胞を濃縮した。ｍＣｈｅｒｒｙマーカーを用いて、蛍光タンパク質を一過性に発現するトランスフェクトしたコーヒー細胞、Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを分離し、選別し、トランスフェクション後３日目にｍＣｈｅｒｒｙポジティブコーヒープロトプラストを採取した（ｄｐｔ）。６ ｄｐｔで５０００の選別したプロトプラスト（Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｎｅａｓｙ抽出キット）からＤＮＡを抽出した。図８Ａに示すように、プライマーを用いて、感受性を増加させるために、ネステッドＰＣＲを実施した。候補ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子の増幅した領域のアガロースゲルを、図８Ｂに示す。

【0456】

明らかな欠失が認められないことは、ゲノム編集が標的遺伝子で行われなかったことを示すものではない。したがって、ｓｇＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が活性であり、ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子におけるゲノム編集事象を誘発するかどうかを評価するために、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した。すべてのｓｇＲＮＡの組合せは、Ｃｃ０９ｇ０６９７０、Ｃｃ０９ｇ０６９６０遺伝子においてゲノム編集事象を誘導することが見出された（図８Ｃ）。さらに、クローニングおよび配列決定により、Ｔ７Ｅ１の結果が確認された。したがって、いくつかのｓｇＲＮＡが、図８Ｄおよび８Ｇに示されるように、誘導されたインデルを使用することが見出された。Ｔ７Ｅ１アッセイは、より高感度であり、したがって、ｓｇＲＮＡが標的された遺伝子において何らかの活性を有するかどうかを評価するのに有用である。結論として、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が内在性ＸＭＴ、ＭＸＭＴおよびＤＸＭＴ遺伝子における正確な突然変異の導入にうまく使用でき、ｓｇＲＮＡの設計および選択がゲノム編集の効率に影響することを実証する。

【0457】

実施例３
トランスフェクトしたコーヒー植物の再生
上記実施例２と平行して、プロトプラスト−再生パイプラインにおいてプロトプラストを進めた。簡単に述べると、プロトプラストを、フィーダープレート上のセルロース膜上に高密度で平板培養して、コロニー形成を可能にした。コロニーを拾い、増殖させ、２つのアリコートに分割した。ＤＮＡ抽出およびゲノム編集（ＧＥ）試験には１アリコートを使用し、一方残りのアリコートはその状態が確認されるまで培養に保持した。ＧＥであることを明確に示すもののみを、前方に選択した。

【0458】

次に、増殖カルスを、胚発生および発芽のために再生培地（半強度ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）に移した。３〜４数週間後、発芽胚は、実生伸長のために固形培地に移す準備が整った。（図９Ａ〜Ｆ）

【0459】

本発明は、その具体的な実施形態と併せて記載されているが、多くの代替法、改変および変形が当業者に明らかであることは明らかである。したがって、添付した特許請求範囲の精神および広い範囲内にある全てのこのような代替法、改変および変形を含めることが意図されている。

【0460】

本明細書に記載されているすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、本明細書にその全体が組み込まれる。さらに、この出願におけるあらゆる参照の引用または同定は、そのような参照が本発明の先行技術として利用可能であると認められるものとして解釈しないものとする。章の見出しが用いられる範囲では、それらは、必ずしも限定的であると解釈すべきではない。

【0461】

さらに、本出願のあらゆる優先権文書（複数可）は、ここにその全体を引用して組み込まれている。

【図1】

【図2(1)】

【図2(2)】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6(1)】

【図6(2)】

【図6(3)】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】