特表 2021-523269 複数の活性剤分子を含む生体適合コポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-523269(P2021-523269A)

(43)【公表日】2021年9月2日

(54)【発明の名称】複数の活性剤分子を含む生体適合コポリマー

(51)【国際特許分類】

   C08F 220/56 20060101AFI20210806BHJP

   C07K 7/06 20060101ALI20210806BHJP

   C07K 5/06 20060101ALI20210806BHJP

   C07K 5/08 20060101ALI20210806BHJP

   C07K 5/10 20060101ALI20210806BHJP

   A61K 47/58 20170101ALI20210806BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20210806BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210806BHJP

   C08F 220/10 20060101ALI20210806BHJP

【ＦＩ】

   C08F220/56

   C07K7/06ZNA

   C07K5/06

   C07K5/08

   C07K5/10

   A61K47/58

   A61K31/704

   A61P35/00

   C08F220/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】60

(21)【出願番号】特願2020-562711(P2020-562711)

(86)(22)【出願日】2019年5月8日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月22日

(86)【国際出願番号】EP2019061769

(87)【国際公開番号】WO2019215207

(87)【国際公開日】20191114

(31)【優先権主張番号】62/762,549

(32)【優先日】2018年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ

３．ｓｏｌｕｔｏｌ

４．Ｌａｂｒａｓｏｌ

(71)【出願人】

【識別番号】518084626

【氏名又は名称】シーアイエス ファーマ アクツィエンゲゼルシャフト

【氏名又は名称原語表記】ＣＩＳ Ｐｈａｒｍａ ＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ゲラツ， クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】トマン， クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ハッケバイル， ミヒャエル

(72)【発明者】

【氏名】パニゲッティ， ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】ヒッツ， ハンス

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

4H045

4J100

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076EE10

4C076EE59

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA18

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA13

4C086ZB26

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA13

4H045EA28

4H045FA20

4J100AL08P

4J100AL08Q

4J100AL09P

4J100AM17P

4J100AM21P

4J100AM21Q

4J100BA03P

4J100BA03Q

4J100BA05Q

4J100BA11Q

4J100BA12Q

4J100BA14Q

4J100BA15Q

4J100BA16Q

4J100BA29Q

4J100BA32P

4J100BA34Q

4J100BA50Q

4J100BC02Q

4J100BC43Q

4J100BC53Q

4J100BC65Q

4J100BC73Q

4J100CA04

4J100DA01

4J100DA71

4J100FA03

4J100HC00

4J100JA50

4J100JA51

4J100JA53

(57)【要約】

本開示は、活性剤がアルファ−アミノ基および／またはアルファ−カルボキシル基に直接的にまたはリンカー分子を介して結合している側鎖連結アミノ酸を含む生体適合コポリマーを送達の担体として使用する、活性剤、例えば原薬の送達に関する。活性剤含有コポリマーを機能化して、細胞型または組織型特異的標的化部分を含ませることができる。本開示は、上記に詳述された複数の活性剤分子を含む有効量のコポリマー、および担体を含む医薬組成物にも関する。活性剤の性質に応じて、これらの組成物を様々ながんまたは他の疾患／状態の処置に使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）（１）モノマーが少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことを特徴とする、１つまたは複数の重合性主要モノマーと、
（２）ＹおよびＺのうちの少なくとも一方がＨである式ＩまたはＩＩの１つまたは複数の共主要モノマーと、
（３）必要に応じて、式ＩＩＩ〜Ｘのいずれかの１つまたは複数の共主要モノマーと、
（４）ラジカル重合を制御する薬剤と、
（５）フリーラジカル種を生成する開始剤系とを含む反応混合物を重合して、前記重合がコポリマーを生じること、
（ｂ）必要に応じて、前記コポリマーを細胞型特異的または組織型特異的標的化部分で機能化すること、ならびに
（ｃ）ステップ（ａ）または必要に応じたステップ（ｂ）の後に、活性剤を前記コポリマーにカップリングすること
によって作製される複数の活性剤分子を含む、コポリマー。

【請求項2】

前記コポリマーが、５，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項3】

コポリマー分子の少なくとも８０％（ｗ）が、５，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項4】

前記ラジカル重合を制御する薬剤がＲＡＦＴ剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項5】

前記コポリマーが２つの連続重合反応によって作製され、
第１の重合反応が、アミノ酸基を含まない１つまたは複数の重合性主要モノマー、共重合を制御するＲＡＦＴ剤、およびフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第１の反応混合物において実施され、前記重合がＲＡＦＴプレポリマーを生じ、
第２の重合反応が、前記第１の重合反応の前記ＲＡＦＴプレポリマー、式Ｉおよび／またはＩＩの１つまたは複数の共主要モノマー、必要に応じて、式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の共主要モノマー、必要に応じて、アミノ酸基を含まない１つまたは複数の重合性主要モノマー、ならびにフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第２の反応混合物において実施される、
請求項４に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項6】

前記ＲＡＦＴ剤が、５〜２５単位の単分散スペーサーを含む、請求項４に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項7】

前記ＲＡＦＴ剤が、細胞型特異的または組織型特異的標的化部分による前記コポリマーの機能化に使用される反応性基を含む、請求項４に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項8】

前記反応性基が、チオール、アルデヒド、アルキン、アジド、テトラジン、歪みアルケン、アミン、カルボキシル、エステル、ジアジリン、アジ化フェニル、チオエステル、ジアゾ、シュタウディンガー反応性ホスフィノエステル（もしくは、ホスフィノチオエステル）、ヒドラジン、オキシム、アザマイケルライゲーションを実施するためのアクリレート、または酵素カップリング反応に使用することができるモチーフである、請求項７に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項9】

前記モチーフが、２〜８個のアミノ酸単位を含み、かつソルターゼ媒介カップリング反応を可能にするオリゴ−グリシン、トランスグルタミナーゼ反応性基質、アルデヒドタグ、または自己触媒性インテイン配列である、請求項８に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項10】

前記ＲＡＦＴ剤のＲＡＦＴ基が、前記コポリマーの共重合または機能化の後に脱離される、請求項４〜９のいずれかに記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項11】

（ａ）モノマーが少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことを特徴とする、１つまたは複数の重合性主要モノマーと、
（ｂ）式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の共主要モノマーと、
（ｃ）必要に応じて、式Ｉおよび／または式ＩＩの１つまたは複数の共主要モノマーと、
（ｄ）ラジカル重合を制御する薬剤と、
（ｅ）必要に応じて、コポリマーを細胞型特異的または組織型特異的標的化部分で機能化することと、
（ｆ）フリーラジカル種を生成する開始剤系と、
を含む反応混合物の重合によって作製される、複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項12】

前記コポリマーが、５，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１１に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項13】

前記ラジカル重合を制御する薬剤がＲＡＦＴ剤である、請求項１１または１２に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項14】

前記ＲＡＦＴ剤が、細胞型特異的または組織型特異的標的化部分による前記コポリマーの機能化に使用される反応性基を含む、請求項１３に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項15】

前記反応性基が、チオール、アルデヒド、アルキン、アジド、テトラジン、歪みアルケン、アミン、カルボキシル、エステル、ジアジリン、アジ化フェニル、チオエステル、ジアゾ、シュタウディンガー反応性ホスフィノエステル（もしくは、ホスフィノチオエステル）、ヒドラジン、オキシム、アザマイケルライゲーションを実施するためのアクリレート、または酵素カップリング反応に使用することができるモチーフである、請求項１４に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項16】

前記モチーフが、２〜８個のアミノ酸単位を含み、かつソルターゼ媒介カップリング反応を可能にするオリゴ−グリシン、トランスグルタミナーゼ反応性基質、アルデヒドタグ、または自己触媒性インテイン配列である、請求項１５に記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項17】

前記ＲＡＦＴ剤のＲＡＦＴ基が、前記コポリマーの共重合または機能化の後に脱離される、請求項１３〜１６のいずれかに記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー。

【請求項18】

有効量の、請求項１〜１７のいずれかに記載の複数の活性剤分子を含むコポリマー、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項19】

対象に前記医薬組成物を投与することを含む、前記対象のがん、または別の疾患もしくは状態を処置するための、請求項１８に記載の医薬組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年５月１０日出願の米国特許仮出願第６２／７６２，５４９号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に出願されている。配列表は、２０１９年５月６日に作製され、２ＫＢのサイズであり、表題「CIS-010 PCT_ST25.txt」のファイルとして提出されている。電子フォーマットの配列表の情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

本発明は、活性剤がアルファ−アミノ基および／またはアルファ−カルボキシル基に直接的にまたはリンカー分子を介して結合している側鎖連結アミノ酸を含む生体適合コポリマーを送達の担体として使用する、活性剤、例えば原薬（drug substance）の送達に関する。

【背景技術】

【0004】

がんは、ヒトの健康に対する大きな脅威の一つであり、その尤度が年齢の関数であるという事実を考慮すると、症例数は、人口の加齢と共に増加する。Berger, NA et al. (2006) Cancer in the Elderly, Transactions of the American Clinical and Climatological Association 117: 147-156; Yancik, R (2005) Cancer J. 11: 437-41。近年、腫瘍療法には、モノクローナル抗体などの腫瘍特異的薬剤の使用に起因して、非常に大きな改善がなされてきた。これらの抗体は、上皮増殖因子経路（ＥＧＦＲ）などの増殖シグナルを遮断する（セツキシマブ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／パニツムマブ、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）、Ａｍｇｅｎ／トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路を標的にして新たな血管の形成を予防する（ベバシズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）ことによって腫瘍増殖を遅くさせる。これらの標的抗原が通常は腫瘍組織に過剰発現するので、健康な細胞には障害が少なく、このため抗体療法は、従来の細胞傷害剤と比較して少ないオフターゲット（off-target）効果を有する。Zhou, Q. (2017) Biomedicines 5(4); Reichert, JM (2017) MAbs 9: 167-181。抗体の独自の特異性も、細胞傷害性薬物が腫瘍細胞を標的にすることを目的とした組み合わせ手法に使用された。これらの、いわゆる抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、抗体または細胞傷害剤による単剤療法より優れていることが証明されている。１９６０年代から知られているが、ＡＤＣの概念は、最近の臨床展開によってようやく医薬品業界の関心に遭遇することになり、６０個を超えるＡＤＣが臨床試験を受けている。Mullard, A (2013) Nat Rev Drug Discov 12: 329; Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337。

【0005】

第一世代のＡＤＣは、抗体に遊離アミノ基を使用して、細胞傷害性薬物および薬物リンカー構築物を結合している。抗体１つあたり８０個までの遊離アミノ基を用いることにより、これらの機能化は、薬物の抗体に対する比（ＤＡＲ）が異なっていること、および抗体の結合界面への細胞傷害性薬物の意図されない結合に起因する親和性によって、高度に異種のＡＤＣ種をもたらす。ＤＡＲに関する異種性は、反応に使用される薬物および抗体の化学量を調整することによって、ある程度まで限定することができる。部位特異性に関して、異種性は、最初の臨床試験が実施された１９８０年代の化学の利用可能性によって制限された。ＦＤＡが最初のＡＤＣを承認するまでさらに２０年かかった。ＡＤＣの開発は、それ以来顕著に増えており、３０個のＡＤＣが反応性群に入ってきた。これらの異種性は、最初のＡＤＣについての大きな問題および規制事項でもあった。Yao, H et al. (2016) Int J Mol Sci 17(2): 194。加えて、最初のＡＤＣは、重要な免疫応答を誘発することが知られているマウス免疫グロブリンに基づいていた。これらの欠点のため、初代ＡＤＣは、従来の療法より大きな改善を示すことがなく、そのため、最初のＦＤＡ承認ＡＤＣであるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））は、２０１０年にＰｆｉｚｅｒによって市場から自発的に撤退された。Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315-337; Beck, A et al. (2010) Discov Med 10(53): 329-39。

【0006】

第二世代のＡＤＣは、ヒト化抗体の遊離チオール基を標的にすることによってこれらの困難を軽減する。これらの遊離チオール基は、抗体のヒンジ領域における４つの鎖間ジスルフィド架橋の軽度な還元による（例えば、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いる）カップリング反応の前に生成した。この戦略によって、潜在的な結合部位を８個に低減して、ＡＤＣのより高い均質性をもたらすことができる。鎖間ジスルフィド結合が抗体の完全性に重要な役割を果たすという事実を考慮すると、高い均質性は、抗体の安定性に対する有害な影響によって多くの場合に補われていた。ジスルフィド架橋の完全性を保存するより特異的なリンカーが設計されたが（例えば、Shaunak, S et al. (2006) Nat Chem Biol 2(6): 312-3およびBalan, S et al. (2007) Bioconug Chem 18(1): 61-76において詳述されている）、生成されたＡＤＣは低いＤＡＲを被っており、典型的に約３〜４であった。薬物負荷をさらに増加すると、抗体の安定性は有害な影響を受け、血流からの素早いクリアランスをもたらした。加えて、腫瘍細胞特異的標的への抗体の親和性が有害な影響を受けた。Beck et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315-337; Yao et al. (2016) Int J Mol Sci 17(2): 194.; Beck et al. (2010) Discov Med 10(53): 329-39。わずか数個の細胞傷害性実体がこれらの抗体にカップリングしていたので、ドキソルビシンのような従来の細胞傷害剤は、腫瘍細胞を死滅させるのに十分に有効ではないことが実証された。Tolcher, AW (1999) J Clin Oncol 17(2): 478-478。したがって、細胞傷害性が数桁高い新規クラスの細胞傷害剤を使用する必要があった。これらの物質の例は、メルタンシン（mertansine）（ＤＭ１）またはモノメチルアウリスタチン（monomethylauristatin）Ｅ（ＭＭＡＥ）のような微小管阻害剤である。Beck et al. (2017)。そのような強力な原薬を用いると、ＡＤＣの毒性ペイロード（payload）がその標的部位のみに放出されることがきわめて重大である。そうでなければ、重症の副作用がもたらされる可能性がある。薬物と抗体の間にあるリンカーは、そのため大きな役割を果たす。トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）およびブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）、Ｔｅｋａｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、ならびにＭｅｒｓａｎａ ｃｏｎｃｅｐｔ（Ｍｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ））のような最近市販されているＡＤＣは、システイン担持タンパク質、特に血清アルブミンと反応することが知られているマレイミドベースリンカーを使用する。Alley, SC et al. (2008) Bioconjug Chem 19(3): 759-765。Shen, BQ et al. (2012) Nat Biotechnol 30(2): 184-9。

【0007】

いわゆる第三世代のＡＤＣは、抗体への薬物の部位特異的カップリングを使用している。顕著な例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対する、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓのバダツキシマブタリリン（Vadatuximab tailirine）である。このＡＤＣは、両方の重鎖の２３９位に遺伝子操作されたシステインを含み、ＤＮＡを架橋することができるピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体のカップリングに使用され、それによって、細胞分裂を遮断し、細胞死を引き起こす。このＡＤＣは、第Ｉ相研究において成功裏に試験され、現在、第ＩＩＩ相臨床試験の最中である。Beck et al. (2017); Kennedy, DA et al. (2015) Cancer Res 75(15 Supp.), Abstract DDT02-04。抗体への薬物の部位特異的カップリングの他の例は、スマートタグ（smart tag）、例えば、「アルデヒドタグ」（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔａｌｅｎｔ）または「ソルターゼ（sortase）タグ」（ＳＭＡＣ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）、ＮＢＥ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；Stefan, N et al. (2017) Mol Cancer Ther 16(5): 879-892）を使用する。後者の２つの手法は、遺伝子操作されたペプチドタグを抗体に導入して、酵素カップリング反応の特定モチーフとして機能させる。第三世代のＡＤＣは、増加した安定性を有し、より均質な生成物を表すが、抗体１個あたり依然としてわずか数個の毒性実体を送達する。

【0008】

この制限を回避するため、ポリマー担体を使用する新規手法がＭｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって最近開発された。このコンセプトは、いくつかの細胞傷害性薬物分子での分解性担体ポリマー（「Ｆｌｅｘｉｍｅｒ」と呼ばれる）の機能化に基づいている。次に薬物負荷ポリマーを従来のリンカー化学によってモノクローナル抗体にカップリングする。これにより、ＤＡＲを抗体分子１個あたり１２〜１５個の薬物分子に増加させることができ、薬物分子は、３〜５個の結合ポリマー担体にわたって分布された。”Non-clinical pharmacokinetics of XMT-1522, a HER2 targeting auristatin-based antibody drug conjugate”; poster presentation at the American Association for Cancer Research (AACR) annual meeting in Washington D.C, 2017。この手法は多くの利点を有するが、得られたＡＤＣは、様々な鎖長および薬物負荷のＦｌｅｘｉｍｅｒポリマーを含む。使用されたチオールマレインイミド（thiol-maleinimide）リンカー化学との組み合わせにより、ＡＤＣの分子量はある程度まで変動する。さらに、Ｆｌｅｘｉｍｅｒポリマーは、生物分解性エステル連結を含み、長期保存および／または血清安定性の問題を提起している。 Koitka, M et al. (2010) J Pharm Biomed Anal 51(3): 664-78; Li, B et al. (2005) Biochem Pharmacol 70(11: 1673-84。

【0009】

抗体に加えて、アプタマーを含む他の標的特異的薬剤が、異常な経路を遮断または活性化して代謝疾患およびがんを処置することについて詳述されている。アプタマーは、ワトソンクリック塩基対合により形成された確定三次元立体構造を有する小型一本鎖ポリヌクレオチドである。十分に確定された構造に起因して、これらは細胞上の細菌毒素または表面マーカーなどの単離小分子を含む特異的標的に、高い親和性で結合させられることができる。Mercier, MC et al. (2017) Cancers (Basel) 9(6): E69; Ruscito, A et al. (2016) Front Chem 4 :14。アプタマーは、抗体よりはるかに小さく、産生するのが容易であり、免疫原性が欠如している。Ray, P et al. (2013) Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 61(4): 255-271; Pei, X et al. (2014) Mol Clin Oncol 2(3): 341-348; Zhou, G et al. (2016) Oncotarget 7(12):13446-63。これらは、反復する結合、洗浄および増幅のステップを伴う豊富化プロセスにおいて、１０^１５個までのランダムポリヌクレオチドのプールから通常生成される。各サイクルの後、最高の標的親和性を有するアプタマーが次のサイクルのために選択される。このことは、１０〜１２サイクル後に、ナノ−、さらにはサブ−ナノモル範囲で結合親和性を有する分子の選択をもたらす。このプロセスは、試験管内進化法（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）としても知られている。Zhou, G et al. (2016)。抗体と同様に、最初の治療アプタマーの手法は、主要なタンパク質、受容体または代謝産物との相互作用を介して疾患関連経路を遮断することを目的とした。顕著な例は、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ；ＥｙｅＴｅｃｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｆｉｚｅｒ）であり、最初のＦＤＡ承認アプタマー治療薬であり、２００４年に市場に投入された。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）は２７ヌクレオチド長ＲＮＡアプタマーであり、失明を引き起こす重篤な眼の疾患である加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に使用される。ＡＭＤは、上昇したレベルの増殖因子に起因した血管の異常形成により特徴付けられる。Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）の標的は、血管新生に関与する増殖因子であるＶＥＧＦ_１６５（アイソフォーム）である。このアプタマーは素早い腎クリアランスおよび分解に起因してほんの短い半減期を有するので、４０ｋＤａのＰＥＧポリマーに結合させて、全体のサイズを増加した。加えて、一部のヌクレオチドを２’−フルオロ−ピリミジン（2’-fluor-pyrimidine）および２’−Ｏ−メチル−プリンで置換して、ヌクレアーゼによる分解を回避した。Biagi, C et al. (2014) Eur J Clin Pharmacol 70(12): 1505-12; Pozarowska, D et al. (2016) Cent Eur J Immunol 41(3) : 311-316。抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）と対照的に、Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標）は、おそらくバイパス経路（例えば、ＰＤＧＦ−Ｂ）の作用の代償が原因の全身適用における不十分な機能に起因して、がんの処置のために使用または認可されてこなかった。Alvarez, RH et al. (2006) Mayo Clin Proc 81(9) : 1241-57。さらに近年になされた改善の後には、アプタマーを標的化および遮断のみならず、細胞傷害剤の担体としても使用するいくつかの試みが行われた。Ｂａｇａｌｋｏｔおよび同僚らは、アプタマードキソルビシン複合体を、この薬剤がＤＮＡに入り込む能力を活用することによって開発した。しかし、この複合体は、不十分な負荷効率および急速な全身クリアランスを被っている。Bagalkot, V et al. (2006) Angew Chem Int Ed 45(48): 8149-8152。２０１０年には、異なる手法が、ドセタキセル／シスプラチン負荷ＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子に基づいて開発された。これらの粒子は、腫瘍細胞膜タンパク質を標的にするアプタマーであるＡ１０による機能化によって、前立腺がん細胞に導かれた。このいくぶん複雑な薬物送達系は、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において有望な結果を示した。Kolishetti, N et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(42): 17939-17944。アプタマーは、ｓｉＲＮＡ（特異的遺伝子発現を抑制するように典型的に設計された短干渉ＲＮＡ）などの、いくつかのヌクレオチドベース治療薬の送達のためにさらに試験された。Chu, TC et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(10): e73。腫瘍処置のためにアプタマーの標的化能力を利用する多くの異なる手法の開発にもかかわらず、現在まで、アプタマーは、不十分な負荷容量、血清不安定性および素早い腎クリアランスを被っており、これらの特性はすべて臨床適用を制限している。これらのアプタマー薬物コンジュゲートまたは複合体のうちで、第ＩＩＩ相臨床または市場に投入されたものはなかった。Zhou et al. (2016)。

【0010】

上述の短所を克服し、薬物の抗体／アプタマーに対する比（ＤＡＲ）を増加し、同時に、対応する標的への抗体／アプタマーの親和性を保存するため、本発明者らは、生体適合性、親水性、非分解性のポリマーを活性剤の担体として利用する新たな戦略を開発した。ポリマーには、複数の活性剤分子が初めから「負荷」されている。活性剤は、合成の最中に活性剤コンジュゲートモノマー（治療モノマー）を使用して、または合成後に機能化を介して、ポリマーに導入される。典型的には、活性剤含有ポリマーは、続いて腫瘍標的化部分、例えばモノクローナル抗体またはアプタマーにカップリングされる。高い親水性に起因して、ポリマーは高度の疎水性の細胞傷害性薬物さえも運ぶことができ、同時に対応する抗体／アプタマーの薬力学的特性を維持することができる。ポリマー分子に多数（限度内の任意の所望の数）の活性剤分子を担持させることができる。
本開示に表される手法は、１つのカップリング部位のみが、多数の活性剤分子を抗体またはアプタマー分子に結合するために必要であるという利点を有する。部位特異的カップリング方法、例えば、酵素カップリング反応を抗体の重鎖のＣ末端にあるペプチドタグに対して使用することによって、活性剤含有ポリマーは抗体結合界面からはるかに離れて配置される。この手法によって、標的組織の最大親和性が保存され、さらには相対的に均質な産物も得る。選択された連結戦略は、コポリマーと抗体／アプタマーとの間に安定したペプチド結合を形成し、このことは、血流中のＡＤＣの高い安定性を確実にする。さらに、最終ステップにおける抗体／アプタマーへの完全に機能化され特徴付けられた活性剤含有コポリマーのカップリングは、感受性の高い結合タンパク質への立体構造応力（conformational stress）を最小限にすることを目的としている。加えて、選択された設計のコポリマーは、同じ分子への２個またはそれより多くの異なる活性剤のカップリングを促進し、併用療法を可能にする。活性剤（がんの文脈において細胞傷害性薬物または毒性ペイロードとも呼ばれる）が標的細胞、例えば腫瘍細胞内に放出され、標的化部分（例えば、抗体またはアプタマー）が分解されると、相対的に小さなコポリマーは腎クリアランスによって身体から除去されると考えられる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Berger, NA et al. (2006) Cancer in the Elderly, Transactions of the American Clinical and Climatological Association 117: 147-156

【非特許文献2】Yancik, R (2005) Cancer J. 11: 437-41

【非特許文献3】Zhou, Q. (2017) Biomedicines 5(4); Reichert, JM (2017) MAbs 9: 167-181

【非特許文献4】Mullard, A (2013) Nat Rev Drug Discov 12: 329; Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16: 315-337

【非特許文献5】Yao, H et al. (2016) Int J Mol Sci 17(2): 194

【非特許文献6】Beck, A et al. (2017) Nat Rev Drug Discov 16(5): 315-337

【非特許文献7】Beck, A et al. (2010) Discov Med 10(53): 329-39

【非特許文献8】Shaunak, S et al. (2006) Nat Chem Biol 2(6): 312-3

【非特許文献9】Balan, S et al. (2007) Bioconug Chem 18(1): 61-76

【非特許文献10】Tolcher, AW (1999) J Clin Oncol 17(2): 478-478

【非特許文献11】Alley, SC et al. (2008) Bioconjug Chem 19(3): 759-765

【非特許文献12】Shen, BQ et al. (2012) Nat Biotechnol 30(2): 184-9

【非特許文献13】Kennedy, DA et al. (2015) Cancer Res 75(15 Supp.), Abstract DDT02-04

【非特許文献14】”Non-clinical pharmacokinetics of XMT-1522, a HER2 targeting auristatin-based antibody drug conjugate”; poster presentation at the American Association for Cancer Research (AACR) annual meeting in Washington D.C, 2017

【非特許文献15】Koitka, M et al. (2010) J Pharm Biomed Anal 51(3): 664-78

【非特許文献16】Li, B et al. (2005) Biochem Pharmacol 70(11: 1673-84

【非特許文献17】Mercier, MC et al. (2017) Cancers (Basel) 9(6): E69

【非特許文献18】Ruscito, A et al. (2016) Front Chem 4 :14

【非特許文献19】Ray, P et al. (2013) Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis 61(4): 255-271

【非特許文献20】Pei, X et al. (2014) Mol Clin Oncol 2(3): 341-348

【非特許文献21】Zhou, G et al. (2016) Oncotarget 7(12):13446-63

【非特許文献22】Biagi, C et al. (2014) Eur J Clin Pharmacol 70(12): 1505-12

【非特許文献23】Pozarowska, D et al. (2016) Cent Eur J Immunol 41(3) : 311-316

【非特許文献24】Alvarez, RH et al. (2006) Mayo Clin Proc 81(9) : 1241-57

【非特許文献25】Bagalkot, V et al. (2006) Angew Chem Int Ed 45(48): 8149-8152

【非特許文献26】Kolishetti, N et al. (2010) Proc Natl Acad Sci USA 107(42): 17939-17944

【非特許文献27】Chu, TC et al. (2006) Nucleic Acids Res 34(10): e73

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

本開示は、複数の活性剤分子を含むコポリマー分子、およびこのコポリマーを作製する方法に関する。コポリマーは、（１）少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことによって特徴付けられる、１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、（２）ＹおよびＺのうちの少なくとも一方がＨである、式Ｉおよび／またはＩＩの１つまたは複数の（種類の）共主要（co-principal）モノマー、（３）好ましくはＲＡＦＴ剤である、ラジカル重合を制御するための薬剤、ならびに（４）フリーラジカル種を生成する開始剤系、を含む反応混合物の重合によって作製される。反応混合物は、式ＩＩＩ〜Ｘのいずれかの１つまたは複数の共主要モノマーを必要に応じてさらに含むことができる。後者の重合は、複数の活性剤分子により機能化されうるコポリマーを生じる。機能化は、共主要モノマー単位の遊離アルファ−アミノまたはアルファ−カルボキシ基において発生する。

【0013】

【化1】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｙは、Ｈまたは−ＣＯ−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、Ｚは、Ｈ（Ａが−Ｏ−である場合）または−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、Ａは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。

【0014】

【化2】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｚは、Ｈ（ＡがＯである場合）または−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、Ａは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。

【0015】

活性剤の構造に応じて、活性剤分子は、コポリマーの共主要モノマーのアルファ−アミノまたはアルファ−カルボキシル基に直接的またはリンカー構造を介して間接的に結合することができる。後者のリンカーは、細胞傷害性薬物の意図されない放出を回避するため、保管の間または血流中で安定しているべきである。リンカーは、特定の細胞内酵素により切断される可能性があってもよく、または「非分解」型であって、リソソームおよびペルオキシソームの厳しい環境においてのみ破壊されるものであってもよい。

【0016】

複数の活性剤分子を含むコポリマー分子を、細胞型特異的または組織型特異的標的化部分によりさらに機能化することができる。潜在的な標的化部分は、モノクローナル抗体、抗体断片、ナノ抗体（nano-body）（単一ドメイン抗体）、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）、ペプチドホルモン、腫瘍細胞表面に発現したタンパク質に結合するタンパク質、ＤＮＡもしくはＲＮＡベースアプタマー、または腫瘍細胞に過剰発現することが知られている細胞表面受容体に結合することができる小分子、例えば、葉酸もしくはビオチンであるが、これらに限定されない。標的化部分の共有結合は、コポリマーのヘッド基（head group）（典型的にはＲＡＦＴ剤により導入される）における反応基を典型的に伴う、部位特異的な方法で実施される。適切なカップリング戦略には、ペプチドタグ（例えば、ソルターゼ媒介カップリング）、アルデヒドタグ、もしくはトランスグルタミナーゼタグによる酵素触媒反応、またはコポリマーと標的化部分とのいわゆる「クリック」反応が含まれる。後者のプロセスは、反応性非標準（非天然）アミノ酸を、合成の最中または合成の後に、標的化部分に組み込むことによって達成することができる。ソルターゼ媒介カップリングおよびトランスグルタミナーゼ媒介カップリングが好ましい方法である。前者の機構において、標的化部分は修飾されてソルターゼモチーフを含む。複数の活性剤分子を担持するコポリマー分子を、コポリマーのヘッド基にオリゴ−グリシン伸展を導入することにより、ソルターゼ媒介ペプチド転移の標的にすることができる。これは、従来のＲＡＦＴ剤を、２〜８個のグリシン残基を含む誘導体化ＲＡＦＴ剤に置き換える重合の際に、都合よく達成されうる。トランスグルタミナーゼ媒介反応の場合において、適切な連鎖移動剤により導入されるコポリマーのヘッド基は、反応性リジン（もしくは、グルタミン）残基を含むペプチドモチーフ、または非ペプチドモチーフ、例えば、末端アミノ基を含むリンカー構造を含むことができる。後者のヘッド基修飾は、とりわけ、高い代謝回転速度で非ペプチドモチーフを受容することが知られている微生物トランスグルタミナーゼと組み合わせて使用することができる。

【0017】

異なる実施形態において、本明細書に提示される酵素反応を、反応性基、例えばいわゆる「クリック反応性」基（［３＋２］付加環化にはアジド、または［４＋２］付加環化にはテトラジンなど）を用いて、細胞型または組織型特異的標的化部分を部位特異的に修飾するために使用することもでき、その後、コポリマーのヘッド基にクリック反応の「対応物」（例えば、［３＋２］付加環化の場合にはアルキン、または［４＋２］付加環化の場合には歪み（strained）アルケン）を含む、本開示のコポリマーの結合に使用することもできる。クリック反応の上述の反応性部分は交換可能であることが意図される。

【0018】

活性剤が、短寿命の放射性同位体を含む分子である場合のように不安定である別の実施形態において、上記のように作製されたコポリマーは、上記記載の方法、例えば、ソルターゼ媒介またはトランスグルタミナーゼ媒介カップリングのうちの１つを使用して、細胞型または組織型特異的標的化部分により最初に機能化される。続いて、治療に使用される前に、標的化部分コポリマーコンジュゲートには活性剤が負荷され、それによって、活性剤分子がコポリマーの遊離アルファ−アミノまたはカルボキシル基に直接的またはリンカー構造を介して間接的に結合される。

【0019】

複数の活性剤分子を含むコポリマーは、２つの連続重合反応によって作製することもできる。例えば、第１の重合反応は、アミノ酸基を含まない１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、ＲＡＦＴ剤、およびフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第１の反応混合物において実施され、重合はＲＡＦＴプレポリマーを生じる。第２の重合反応は、第１の重合反応のＲＡＦＴプレポリマー、式Ｉおよび／またはＩＩの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、ならびにフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第２の反応混合物において実施される。反応は、式ＩＩＩ〜Ｘのいずれかの１つもしくは複数の（種類の）共主要モノマー、および／またはアミノ酸基を含まない１つもしくは複数の重合性主要モノマーを必要に応じて含むことができる。

【0020】

より特定の実施形態において、複数の活性剤分子を含むコポリマーは、（１）少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことによって特徴付けられる、１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、（２）ＹおよびＺのうちの少なくとも一方がＨである、式Ｉおよび／または式ＩＩの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（３）必要に応じて、式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（４）５〜２５単位の単分散スペーサー（すなわち、均一サイズのスペーサー）を含むＲＡＦＴ剤、ならびに（５）フリーラジカル種を生成する開始剤系、を含む反応混合物の重合によって作製される。

【0021】

異なる実施形態において、複数の活性剤分子を含むコポリマーは、（１）少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことによって特徴付けられる、１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、（２）式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（３）必要に応じて、式Ｉおよび／またはＩＩの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（４）好ましくはＲＡＦＴ剤である、制御されたラジカル重合を誘導するための薬剤、ならびに（５）フリーラジカル種を生成する開始剤系、を含む反応混合物の重合によって作製される。

【0022】

【化3】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｚは、Ｈ（Ａが−Ｏ−である場合）または−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーであり、Ａは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。

【0023】

【化4】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｙは、Ｈまたは−ＣＯ−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーである。

【0024】

【化5】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーであり、ここでアルファ−アミノおよびカルボキシ基の機能化に使用されるリンカーは、同一である必要はない。

【0025】

【化6】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｚは、Ｈ（Ａが−Ｏ−である場合）または−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーであり、Ａは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。

【0026】

【化7】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーである。

【0027】

【化8】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーであり、ここでアルファ−アミノおよびカルボキシ基の機能化に使用されるリンカーは、同一である必要はない。

【0028】

【化9】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｚは、Ｈ（Ａが−Ｏ−である場合）または−Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１（ここで、ｎ＝１〜８）であり、Ｌは、リンカーであり、Ｊは、Ｈまたは放射性ヨウ素核であり、Ａは、−Ｏ−または−ＮＨ−である。

【0029】

【化10】

式中、Ｒは、−Ｈ、−ＣＨ_３、−ＣＨ_２−ＣＨ_３または−（ＣＨ_２）_２−ＣＨ_３であり、Ｘは、−ＮＨ（ＣＨ_２）_４−、−ＮＨ（ＣＨ_２）_３−、−Ｏ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ_２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）−、−Ｓ−ＣＨ_２−または−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−であり、Ｊは、Ｈまたは放射性ヨウ素核である。ペイロードは、活性剤を指し、Ｌは、リンカーであり、ここでアルファ−アミノおよびカルボキシ基の機能化に使用されるリンカーは、同一である必要はない。

【0030】

より特定の実施形態において、複数の活性剤分子を含むコポリマーは、（１）少なくとも１個のビニル基を有し、アミノ酸残基を含まないことによって特徴付けられる、１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、（２）式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（３）必要に応じて、ＹおよびＺのうちの少なくとも一方がＨである式Ｉおよび／または式ＩＩの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、（４）５〜２５単位の単分散スペーサーを含むＲＡＦＴ剤、ならびに（５）フリーラジカル種を生成する開始剤系、を含む反応混合物の重合によって作製される。

【0031】

複数の活性剤分子を含むコポリマーは、２つの連続重合反応によって作製することもできる。例えば、第１の重合反応は、アミノ酸基を含まない１つまたは複数の（種類の）重合性主要モノマー、ＲＡＦＴ剤、およびフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第１の反応混合物において実施され、重合はＲＡＦＴプレポリマーを生じる。第２の重合反応は、第１の重合反応のＲＡＦＴプレポリマー、式ＩＩＩ〜Ｘの１つまたは複数の（種類の）共主要モノマー、およびフリーラジカル種を生成する開始剤系を含む第２の反応混合物において実施される。反応は、式Ｉおよび／もしくは式ＩＩの１つもしくは複数の（種類の）共主要モノマー、ならびに／またはアミノ酸基を含まない１つもしくは複数の重合性主要モノマーを必要に応じて含むことができる。

【0032】

複数の活性剤分子を含む後者のコポリマー分子を、細胞型または組織型特異的標的化部分により、最初の実施形態に記載されたようにさらに機能化することができる。

【0033】

括弧付きの用語「種類の」は、「１つまたは複数の重合性共主要モノマー」などの表現がモノマーの１つまたは複数の分子を指すのではなく、当該の式（複数可）の１つまたは複数の化学的に異なるモノマーの量を指すことを明らかにするために含まれている。

【0034】

複数の活性剤分子を含む上記記載のコポリマーのいずれかにおいて、式Ｉ〜式Ｘのいずれかのモノマーの総量は、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの好ましくは１％（ｍｏｌ）〜４９．９％（ｍｏｌ）の範囲である。より詳細には、式Ｉ〜式Ｘのモノマーの総量は、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの１％（ｍｏｌ）〜３５％（ｍｏｌ）の範囲である。さらにより好ましくは、式Ｉ〜式Ｘのモノマーの総量は、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの１％（ｍｏｌ）〜２０％（ｍｏｌ）の範囲である。最も好ましくは、式Ｉ〜式Ｘのモノマーの総量は、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの５％（ｍｏｌ）〜１５％（ｍｏｌ）の範囲である。

【0035】

複数の活性剤分子を含む上記記載のコポリマーのいずれかにおいて、コポリマーは、５，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。より好ましくは、コポリマーは、６，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンの平均分子量を有する。最も好ましくは、コポリマーは、６，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。

【0036】

複数の活性剤分子を含む上記記載のコポリマーのいずれかにおいて、コポリマー分子の少なくとも８０％（ｗ）は、５，０００ダルトン〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する。より好ましくは、コポリマー分子の少なくとも８０％（ｗ）は、６，０００ダルトン〜６０，０００ダルトンの平均分子量を有する。最も好ましくは、コポリマー分子の少なくとも８０％（ｗ）は、６，０００ダルトン〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有する。

【0037】

上記に考察されたように、複数の活性剤分子を含む上記記載のコポリマーのいずれかの調製のための重合混合物は、細胞型または組織型特異的標的化部分によるコポリマーの機能化に使用されうる反応性基を担持するＲＡＦＴ剤を含むことができる。後者の反応性基は、チオール、アルデヒド、アルキン、アジド、アミン、カルボキシル、エステル、ジアジリン、アジ化フェニル、チオエステル、ジアゾ、シュタウディンガー反応性ホスフィノエステル（もしくは、ホスフィノチオエステル）、ヒドラジン、オキシム、アザマイケルライゲーション（aza-Micheal ligation）を実施するためのアクリレート、または酵素カップリング反応に使用することができるモチーフでありうる。モチーフは、２〜８個のアミノ酸を含むオリゴ−グリシン（このペプチドモチーフは、ソルターゼ媒介カップリング反応を可能にする）、トランスグルタミナーゼ反応性基質、アルデヒドタグ、または自己触媒性インテイン配列でありうる。

【0038】

他の特定の実施形態において、ＲＡＦＴ剤は、重合および／または機能化が完了すると不活性化され、ここでＲＡＦＴ基の脱離は、熱処理、適切なアミンとの反応（アミノ分解）、またはリンオキソ酸（phosphorus oxoacid）の存在下で開始剤分子による、もしくはリンオキソ酸を用いることなく過剰量の開始剤による新たな反応によって実施される。

【0039】

複数の活性剤分子を含む上記記載のコポリマーのいずれかにおいて、活性剤は、微小管阻害剤、挿入剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、ホルモンもしくはホルモン受容体調節剤、チロシンキナーゼ阻害剤、遺伝子もしくは対応するメッセンジャーＲＮＡを干渉することができるポリヌクレオチドベース薬物、タンパク質ベース細菌毒素、プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴコンセプト）に適した酵素、または放射性同位体でありうる。活性剤は、小分子蛍光団、タンパク質／ペプチドベース蛍光団、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光プローブ、生物発光プローブ、造影剤、または放射性同位体を含むトレーサー分子でもありうる。

【0040】

本開示は、上記に詳述された複数の活性剤分子を含む有効量のコポリマー、および担体を含む医薬組成物にも関する。活性剤の性質に応じて、これらの組成物を様々ながんまたは他の疾患／状態の処置に使用することができる。

【0041】

本開示は、異なるタイプのがんまたは他の疾患および状態を処置する方法であって、本開示の複数の活性剤分子（本明細書において、「活性部分」とも呼ばれる）を含む有効量のコポリマーを含む医薬組成物を投与することを含む方法も包含する。複数の活性剤分子を含む有効量のコポリマーを対象に投与することを含む、対象のがんまたは別の疾患もしくは状態を処置するための、本開示の複数の活性剤分子を含む有効量のコポリマーを含む医薬組成物の使用も、本開示の範囲内である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

特に定義されない限り、すべての用語は、関連する技術における通常の意味を有する。以下の用語が定義され、以下の意味を有する。

【0043】

本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、医薬投与に適合性がある、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤など、例えば、滅菌発熱物質無含有水を含むことが意図される。適切な担体は、この分野の標準的な参照テキストであるRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed. 1995)に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。薬学的に許容される担体として機能を果たすことができる材料の非限定例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；アルファ−、ベータ−およびガンマ−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント末；モルト；ゼラチン；タルク；カカオ脂および坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質無含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性で適合性のある滑沢剤であり、同様に着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味、風味および芳香剤、防腐剤、ならびに酸化防止剤が調合者（formulator）の判断に従って組成物に存在することもできる。ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬおよびｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５などの乳化剤／界面活性剤、レシチン、ならびにホスファチジルコリン（phosphatylcholine）などのリン脂質も包含される。リポソームを使用することもできる。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体および薬剤の使用は、当該技術において周知である。任意の従来の媒体また薬剤が活性化合物と適合性がない場合を除いて、組成物におけるそれらの使用が考慮される。補足的な活性化合物を組成物に組み込むこともできる。

【0044】

用語「対象」は、本明細書で使用されるとき、哺乳動物対象を指す。好ましくは、対象はヒト対象である。

【0045】

用語「活性部分」は、本開示の複数の活性剤分子を含むコポリマーに関する（このコポリマーは、細胞型特異的または組織型特異的標的化部分によりさらに機能化されうる）。

【0046】

本開示の文脈における「細胞型または組織型特異的標的化部分」という用語は、特定の型の細胞または結合活性を有する特定の組織の細胞の表面マーカーに結合し、そのことによってカーゴ（cargo）活性剤を細胞に送達することに有用になる分子を指す。これは、モノクローナル抗体、単一ドメイン、抗体鎖の可変部断片、単鎖抗体、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復タンパク質）、ＤＮＡもしくはＲＮＡベースアプタマー、ペプチドベースアプタマー、細胞表面マーカーを結合することができるペプチドもしくはタンパク質、ホルモン、または細胞表面マーカーを結合することができる小分子でありうる。

【0047】

「トレーシング（tracing）分子」は、診断または科学用途のために読み取りシグナルを生じることができる分子と定義される。これは、小分子蛍光団、タンパク質／ペプチドベース蛍光団、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光プローブ、生物発光プローブ、造影剤、または放射性同位体でありうる。

【0048】

本開示の活性部分の「有効量」とは、処置の間に１回または数回投与されたときに、処置される対象に任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／危険比で治療効果を付与する活性部分の量を意味する。治療効果は、客観的（すなわち、何らかの試験もしくはマーカーにより測定可能）、または主観的（すなわち、対象が効果の徴候を伝えるもしくは効果を感じる）でありうる。本開示の活性部分の有効量は、好ましくは約０．０１ｍｇ／対象の体重ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で活性剤を含む活性部分の量である。有効用量は、また、投与経路に応じて、ならびに他の薬剤との同時使用（co-usage）の可能性に応じて変わる。しかし、本開示の活性部分および医薬組成物の１日に使用される総量は、担当医の合理的な医療判断の範囲内で決定されることが理解される。任意の特定の患者への具体的な有効用量レベルは、治療される障害および障害の重症度；用いられる特定の活性剤の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事；用いられる特定の活性部分の投与の時点、投与経路および排出速度；処置の持続期間；用いられる特定の活性部分と組み合わせて、または同時に使用される薬物；ならびに医療技術に周知の同様の要因を含む様々な要因によって決まる。予防または防止の文脈で使用されるとき、本開示の活性部分の「有効量」は、処置の間に１回または数回投与されたときに、処置される対象に所望の予防効果を付与する活性部分の量であることが意図されることが留意される。

【0049】

用語「活性剤」は、本開示のコポリマーに結合される治療活性物質を意味する。がん療法の文脈において、活性剤は、典型的には細胞傷害性物質／分子である。例示的な細胞傷害性物質／分子には、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはエムタンシン（ＤＭ１）などの微小管阻害剤、挿入薬物、例えばドキソルビシン、シクロホスファミド（ＣＰ）などのアルキル化剤、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤、ホルモンまたはクエン酸タモキシフェンなどのホルモン受容体調節剤、アファチニブまたはボスチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤、ペプチドベース毒素、例えば、α−アマニチン、ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（登録商標）またはｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（登録商標）などの免疫チェックポイント阻害剤、抗体指向酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に適した酵素、遺伝子（複数可）またはその対応するメッセンジャーＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）に干渉することができるポリヌクレオチドベース薬物、ならびにフルオロ−１８、銅−６４、ガリウム−６８、ジルコニウム−８９、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３（診断用途）、またはストロンチウム−８９、イットリウム−９０、ヨウ素−１３１、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、ラジウム−２２３およびアクチニウム−２２５（治療用途）などであるが、これらに限定されない放射性同位体が含まれる。

【0050】

放射性同位体は、重合前の共主要モノマーまたは重合後のコポリマーのいずれかにカップリングされる。重合の前に共主要モノマーまたは重合の後にコポリマーに共有結合的にカップリングされるキレート剤を使用して、放射性同位体を固定化することができる。キレート剤には、（１，４，７，１０）−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸［ＤＯＴＡ］、２，２’，２”−（１０−（２，６−ジオキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３−イル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリイル）三酢酸［ＤＯＴＡ−ＧＡ］、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸［ＮＯＴＡ］、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸［ＴＥＴＡ］およびジエチレン−トリアミン−五酢酸無水物［ＤＴＰＡ］が含まれるが、これらに限定されない。

【0051】

本開示の文脈における「活性剤」という用語は、例えば、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス因子を阻害することによって、もしくは細胞排出ポンプ（cellular efflux pump）（ＭＤＲ−１トランスポーターなど）を標的にすることによって腫瘍細胞の抵抗性を克服することができる物質、または炎症関連療法副作用の低減に有用なコルチコステロイド、グルココルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（例えば、プロスタグランジン）を含む抗炎症性物質をさらに包含する。

【0052】

「モノマー」は、重合されうる低分子量化合物を意味する。式ＩもしくはＩＩの共主要モノマー、または主要モノマーでは、低分子量は、８００ダルトン未満の分子量を典型的に意味する。式ＩＩＩ〜Ｘの共主要モノマーでは、低分子量は、１５００ダルトン未満の分子量を典型的に意味する。コポリマーの文脈において参照されるとき、用語「モノマー」は、コポリマーの最小構成単位（building block）を指す。

【0053】

用語「ＲＡＦＴ剤」および「ＲＡＦＴプロセス」は、適切な連鎖移動剤（ＣＴＡ）の存在下でのモノマーの従来のフリーラジカル重合を伴う。一般的に使用されるＲＡＦＴ剤には、ジチオエステル、ジチオカルバメート、トリチオカーボネートおよびキサンタンなどのチオカルボニルチオ化合物が含まれ、これらの薬剤は可逆的連鎖移動プロセスを介して重合を媒介する。Chiefari, J. et al. (1998) Macromolecules 31(16): 5559-62。

【0054】

用語「プレポリマー」は、ＲＡＦＴ剤がヘッド部にあり、１０〜２５単位の親水性主要モノマー、例えばジメチルアクリルアミドを含む、短ポリマーに関する。そのようなプレポリマーは、主要および共主要モノマーのコポリマーを水性環境で合成する第２の重合反応に使用される、水溶性マクロＲＡＦＴ剤を表す。

【0055】

用語「基質、モチーフもしくはタグ」または「反応性基質、モチーフもしくはタグ」は、酵素触媒反応に参加することができる化学構造に関して交換可能に使用される。これらの化学構造は酵素の活性中心により認識され、酵素触媒反応が発生する前に、共有結合または静電酵素基質複合体を中間的に形成してもよい。本開示の文脈において、これらの反応は、腫瘍細胞または組織特異的標的化部分への本開示のコポリマーの共有結合を媒介するために、多くの場合に使用される。典型的な基質、モチーフおよびタグは、アミノ酸もしくはペプチドの確定配列、アミノ、チオールもしくはカルボキシル基のような反応性官能基、またはコポリマーヘッド基の可動性スペーサー領域における不飽和炭素結合である。

【0056】

用語「抗体薬物コンジュゲート」、略して「ＡＤＣ」は、細胞型または組織型特異的抗原（腫瘍抗原を含む）を標的にする抗体と薬物分子または複数の薬物分子との組み合わせを表し、ここで薬物分子は抗体に共有結合している。本開示の文脈において、ＡＤＣは、細胞型または組織型特異的抗原標的化抗体と、本開示の複数の活性剤分子を含むコポリマーのコンジュゲートを指す。考察されたように、本開示のコポリマーは、共主要モノマーのアルファ−アミノおよびアルファ−カルボキシ基にリンカーを介して、または直接的に結合している、複数の活性剤分子、または異なる活性剤分子の組み合わせを担持する。

【0057】

用語「アプタマー」は以下のように定義される。アプタマーは、特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子である。アプタマーは、最高の標的親和性を有するアプタマー配列を確認するため、反復豊富化プロセスで大きなランダム配列プールから選択することによって、通常作り出される。このプロセスは、「試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）」としても知られている。より詳細には、アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼノ核酸（xeno nucleic acid）（ＸＮＡ）（糖主鎖が異なる、天然の核酸に対する合成代替物）、またはペプチドアプタマーに分類することができる。アプタマーは、（通常は、短）鎖のオリゴヌクレオチドまたは配列のアミノ酸からなる。ここでオリゴヌクレオチド配列は、１種類のヌクレオチド、例えばＤＮＡから、または異なるヌクレオチド型、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡの組み合わせから、およびまたは２’酸素と４’炭素を接続する外部架橋で修飾されているリボース部分を有する特別に設計された、いわゆる「ロックドヌクレオチド（locked-nucleotide）」から形成されうる。本開示のアプタマーは、１つ（または、複数の）短ペプチドドメインからなるペプチドアプタマーも意味する。

【0058】

用語「アプタマー薬物コンジュゲート」は、アプタマーと活性剤分子または異なる活性剤分子の組み合わせを意味する。本開示の文脈において、活性剤分子は、コポリマーとアプタマーのカップリングの前または後のいずれかにおいて、コポリマーに結合される。

【0059】

用語「増強された透過性および残存（ＥＰＲ）効果」は、腫瘍組織における異常な分子および体液輸送力学を、とりわけ高分子薬物について記載するために使用される。特定のサイズの分子（典型的には、リポソーム、ナノ粒子、および高分子薬物）は、正常な組織より高いレベルで腫瘍組織に蓄積する傾向がある。この現象に与えられる一般的な説明は、腫瘍細胞が迅速に増殖するために、腫瘍細胞は血管の産生を刺激しなければならないというものである。新たに形成された腫瘍血管は、通常、形態および構造が異常であり、高分子量の分子が透過可能である。さらに、腫瘍組織は、通常、有効なリンパ排出が欠如しており、そのため、分子が腫瘍組織に侵入すると、分子はこの組織から有効に除去されない。

【0060】

共主要モノマーの文脈における「側鎖連結アミノ酸」という用語は、アミノ酸が、その側鎖を介して（例えば、エステルまたはアミド連結を介して）、アクリロイル基を含む部分に共有結合的に連結されていることを意味する。式Ｉ〜Ｘのモノマーは、側鎖連結アミノ酸を含む。

【0061】

用語「主要モノマー」および「共主要モノマー」は、本発明の説明を容易にするために主に使用される。主要モノマーはアミノ酸を含まないモノマーを指し、共主要モノマーはアミノ酸を含むモノマーを指す。

【0062】

後者の主要および共主要モノマーを含むコポリマーは、「Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー」とも一般的に呼ばれ、用語「Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ」は、側鎖連結アミノ酸（例えば、式ＩＩＩ〜Ｘにおけるように、さらに機能化されていてもよい）を含むモノマーがコポリマーに存在することを示す役割を果たす。側鎖連結アミノ酸には、リジン（Ｋ）、チロシン（Ｙ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、４−ヒドロキシプロリン（ＨＯ−Ｐ）、オルニチン（ＯＲＮ）、および４−アミノ−フェニルアラニン（ＨＯＸ）が含まれる。アミノ酸は、ＬもしくはＤ型、またはラセミ混合物でありうる。コポリマーには、単一タイプの側鎖連結アミノ酸または複数タイプの側鎖連結アミノ酸が存在してもよい。例えば、コポリマーは、アクリロイル−Ｌ−リジン（ＡＫ）とアクリロイル−Ｌ−トレオニン（ＡＴ）の両方を含むことができる。明快さのために、式Ｉ〜Ｘにより説明されたすべてのモノマーは、側鎖連結アミノ酸（機能化された、または機能化されていない）を含む。本開示のアミノ酸含有コポリマーは、少なくとも１個のビニル基を有するが、アミノ酸残基を含まない、１つまたは複数の重合性主要モノマー、式Ｉ〜式Ｘのいずれかによる１つまたは複数の共主要モノマー（後者の式の２つまたはそれより多くにおいて示される共主要モノマーを含む）を含むことを特徴とする。

【0063】

好ましくは、共主要モノマーは、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの１％（ｍｏｌ）〜４９．９％（ｍｏｌ）の量で重合混合物に存在する。より好ましくは、共主要モノマーは、コポリマーに含まれたすべてのモノマーの１％（ｍｏｌ）〜３５％（ｍｏｌ）、さらにより好ましくは１％（ｍｏｌ）〜２０％（ｍｏｌ）、最も好ましくは５％（ｍｏｌ）〜１５％（ｍｏｌ）の量で重合混合物に存在する。

【0064】

側鎖連結アミノ酸を含むモノマーの合成は、以前に記載されていた。Zbaida, D et al. (1987) Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents 6(2-3): 241-253。そのようなモノマーは、リジン、チロシン、セリン、トレオニン、システイン、オルニチン、４−アミノ−フェニルアラニンまたは４−ヒドロキシプロリンのアミノ酸銅複合体を、塩化アクリロイル、塩化メタクリロイル、塩化エチルアクリロイルまたは塩化プロピルアクリロイルのいずれかと反応させ、続いて硫化水素ガス流または硫化ナトリウムの酸性溶液により処理して非保護モノマーを生じることによって、調製することができる。プロトコールは、実施例において開示されている。

【0065】

特定の実施形態において、主要モノマーは、アクリルアミドの誘導体であり、ジメチル−アクリルアミド、Ｎ−イソブチル−アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ．ブチル−アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシエチル−アクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、Ｎ−（３−アミノプロピル）−アクリルアミド塩酸塩、またはＮ−（３−アミノプロピル）−メタクリルアミド塩酸塩が含まれる。

【0066】

他の特定の実施形態において、主要モノマーは、アクリル酸の誘導体であり、メタ−アクリル酸２−ヒドロキシエチル−アクリレート、２−ヒドロキシプロピル−アクリレート、３−ヒドロキシプロピル−アクリレート、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル−アクリレート、２−アミノエチルアクリレート塩酸塩、３−ヒドロキシプロピル−メタクリレート、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル−メタクリレート、２−ヒドロキシエチル−メタクリレート、２−ヒドロキシプロピル−メタクリレートおよび２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩が含まれる。

【0067】

式Ｉ〜Ｘの１つまたは複数の種類の共主要モノマーおよび１つまたは複数の種類の主要モノマーを含むコポリマーは、ラジカル重合反応によって典型的に調製される。本開示のコポリマーが狭いサイズ分布を有することが重要であり、それは、様々な療法において、特にがん療法において、薬物負荷が正確に制御される必要があるからである。注意深く制御されないと、過剰投与または不十分な投与効果に遭遇することがある。狭いサイズ分布のコポリマーを得るためには、重合プロセスにおけるフリーラジカルの数が制御される必要がある。これは、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）または可逆的付加開裂連鎖移動重合（reversible addition-fragmentation-chain transfer polymerization）（ＲＡＦＴ重合）を含む重合技術の使用によって達成することができる。ＲＡＦＴは、本明細書に記載されたコポリマーに最も好ましい技術であり、それは、広範囲のモノマー、とりわけアクリル酸と適合性があり、水性系において容易に実施できるからである。さらに、ＲＡＦＴ重合をブロックコポリマーの合成に使用することができる。加えて、ＲＡＦＴ基を使用して、ポリマーのヘッド基に反応性部分を付加することができる（例えば、抗体またはアプタマーとのコンジュゲーションのため）。ＲＡＦＴ技術は、Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＣＳＩＲＯ）の研究者らによって発明された。Chiefari et al. (1998)。鎖のサイズ分布の制御は、成長ポリマー鎖から連鎖移動剤への連鎖移動反応を介して達成される。いわゆる、ＲＡＦＴ剤は、中間体を形成し、伝播鎖のラジカル（Ｒ基と称される）および安定化部分（Ｚ基と称される）に断片化されうる。その結果、ラジカルの数は制限され、すべての成長ポリマー鎖は類似した伝播可能性を有し、狭いサイズ分布のコポリマーをもたらす。ＲＡＦＴ重合により得た典型的な多分散指数（ＰＤＩ）［Ｍｗ／Ｍｎと定義され、ここで、Ｍｗはポリマーの重量平均モル質量であり、Ｍｎはポリマーの数平均モル質量である］は、１．０５〜１．４の範囲である。適切なＲＡＦＴ剤は、チオカルボニルチオ化合物である。チオカルボニルチオ化合物は、４つの主なクラスにわけることができ、すなわち、ジチオベンゾエート、トリチオカーボネート、ジチオカルバメートおよびキサンテートである。

【0068】

したがって本開示の典型的な重合混合物は、主要および共主要モノマー、ＲＡＦＴ剤、ならびにラジカル開始剤を含む。次いで混合物は適切な容器または成形型の中に注がれ、そこで重合が誘導される。開始剤は熱開始剤（例えば、高温で不安定化されて反応性ラジカルを生じるＶＡ−０４４）、レドックス開始剤または光開始剤でありうる。水溶液中での重合に好ましいレドックス開始剤は、チオ硫酸ナトリウムと組み合わせた過酸化物、例えば過硫酸アンモニウムもしくは過硫酸カリウム、またはアゾ型化合物、例えば、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩もしくは４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）である。非水性溶媒中における重合反応では、アゾ型の開始剤／触媒、例えばアゾビス（イソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）が好ましい。ポリマー修飾アゾ型開始剤、例えば、（ポリジメチルシロキサン、ポリエチレングリコール）を利用することもできる。上述の開始剤は、通常、高温で不安定化されて、反応性ラジカルの形成をもたらす。

【0069】

あるいは、モノマーは、ビニルまたはアクリルモノマーの重合を開始することができる波長の放射線に対して透明である容器または成形型の中で、光重合されうる。適切な光開始剤化合物は、Ｉ型のもの、例えばα−アミノアルキルフェノンまたはＩＩ型のもの、例えばベンゾフェノンでありうる。より長い波長の使用を許容する光増感剤を利用することもできる。使用される開始剤化合物に応じて、重合は、熱、放射線または触媒の添加により開始される。

【0070】

本開示の一部の実施形態において、コポリマー（主要および共主要モノマーの混合物を含む）の重合の前に、１０〜２５モノマー単位の親水性主要モノマーから構成されるマクロＲＡＦＴまたはプレポリマーを合成することが有用である。これによって、多くの場合に疎水性であるＲＡＦＴ剤の親水性が増強され得、水性環境における重合反応を容易にすることができる。

【0071】

他の実施形態において、ＲＡＦＴ剤それ自体は、５〜２５単位の水溶性単分散ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーの組み込みによって化学的に修飾される。修飾されたＲＡＦＴ剤は、改善された水溶性を呈し、親水性アミノ酸含有コポリマーの１重合ステップでの合成を可能にする。

【0072】

ＲＡＦＴ剤は、アミンの存在下で不安定であることが知られており、得られたコポリマーの強い臭気の原因であるので、重合および機能化プロセスが完了すると通常は不活性化されるべきである。本開示におけるＲＡＦＴ基不活性化に好ましい方法は、求核剤との反応、熱による脱離、またはプロトン供与剤もしくは過剰量の機能化開始剤と組み合わせた開始剤との第２の反応である。

【0073】

本開示のコポリマーは患者への薬物送達に使用されることが意図されるので、重合した後にコポリマーを精製することが一般に好ましい。このステップは、残留開始剤、モノマーまたは触媒を含む潜在的に有害な成分を除去する。本発明のコポリマーの好ましい精製方法は、透析、接線流ろ過および毛細管限外ろ過である。

【0074】

有用なパラメーター値を確定することは過剰な努力を必要とせず、それは、パラメーターの数が制限されていること、および一部のパラメトリック値の好ましい範囲が知られていることの両方のおかげであることが留意される。アミノ酸含有コポリマーにおける共主要モノマーのレベルは、重合混合物に存在するすべてのモノマーの、好ましくは１％（ｍｏｌ）〜４９．９％（ｍｏｌ）、より好ましくは１％（ｍｏｌ）〜３５％（ｍｏｌ）、さらにより好ましくは１％（ｍｏｌ）〜２０％（ｍｏｌ）、最も好ましくは５％（ｍｏｌ）〜１５％（ｍｏｌ）である。アミノ酸含有コポリマー（治療薬ペイロード以外）の平均分子量は、一般に５，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは６，０００〜６０，０００Ｄａ、最も好ましくは６，０００〜２０，０００Ｄａである。

【0075】

共重合および精製が完了すると、式Ｉおよび／またはＩＩの共主要モノマーを含む本発明のコポリマーは、活性剤分子により、および／または細胞型特異的もしくは組織型特異的標的化部分（例えば、抗体）により機能化される準備が整っている。この機能化は、コポリマーと活性剤分子および／または標的化部分との間に共有結合の確立をもたらす。ある特定の活性剤、例えば、ある特定の放射性同位体の場合では、キレート剤がコポリマーに共有結合され、活性剤がキレート剤により保持される。

【0076】

特定の実施形態において、活性剤（ここでは、がん療法に使用される細胞傷害性薬物または分子）は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）またはエムタンシン（ＤＭ１）などの微小管阻害剤；挿入薬物、例えばドキソルビシン；シクロホスファミド（ＣＰ）などのアルキル化剤；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；ホルモンまたはクエン酸タモキシフェンなどのホルモン受容体調節剤；アファチニブまたはボスチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤；ペプチドベース毒素、例えば、α−アマニチン；ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（登録商標）またはｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（登録商標）などの免疫チェックポイント阻害剤；抗体指向酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に適した酵素；遺伝子（複数可）またはその対応するメッセンジャーＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに干渉することができるポリヌクレオチドベース薬物；あるいはフルオロ−１８、銅−６４、ガリウム−６８、ジルコニウム−８９、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３（診断用途）、またはストロンチウム−８９、イットリウム−９０、ヨウ素−１３１、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、ラジウム−２２３およびアクチニウム２２５（治療用途）などであるが、これらに限定されない放射性同位体でありうる。

【0077】

なお他の特定の実施形態において、活性剤は、細胞傷害性薬物と、例えば、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス因子を阻害することによって、もしくは細胞排出ポンプ（ＭＤＲ−１トランスポーターなど）を標的にすることによって腫瘍細胞の抵抗性を克服することができる薬物との組み合わせである。

【0078】

前述の活性剤は、本開示のコポリマーに適合性のある薬剤および薬剤クラスの非限定例であり、当業者は、開示された薬剤および薬剤クラスの変種または誘導体を本開示の範囲を超えることなく使用することができる。

【0079】

活性剤の構造に応じて、活性剤は、コポリマーの共主要モノマーのアルファ−アミノまたはアルファ−カルボキシル基に直接カップリングすることができるか、またはリンカー構造を介してコポリマーにカップリングすることができる。そのようなリンカーは、活性剤とコポリマーとの間の簡単なスペーサーとして機能すること、コポリマーの薬物動態の修飾因子として機能すること、または標的細胞における活性剤の放出を可能もしくは容易にする要素を含むことができる。リンカーは、活性剤の意図されない放出を回避するため、保管の間および後に血流中で安定しているべきである。コポリマーからの活性剤の放出は、標的細胞の中でのみ生じるべきである。したがって有用なリンカーは（がん療法に焦点を合わせると）、カスパーゼもしくはカテプシン、グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）（βーグルクロニドベースリンカー）、酸性ｐＨ（腫瘍組織または細胞オルガネラ［リソソーム］に見出される）、または還元環境（細胞内グルタチオンの濃度を増加するように応答する）などの細胞内因子に感受性があるべきである。別の可能性は、ジアミン型またはチオエーテル型の非分解性リンカーの使用であり、これらは、特異的酵素の標的ではなく、リソソームまたはペルオキシソームの厳しい環境においてのみ分解される。後者のリンカー型が好ましく、それは、最大血清安定性および低減された非特異的毒素に関連しているからである。

【0080】

他の実施形態において、コポリマーは合成の後に活性剤または活性剤リンカー複合体により機能化されず、式ＩＩＩ〜Ｘの共主要モノマーの組み込みによって、活性剤含有コポリマーとして直接合成される。活性剤負荷量は、重合の際に存在する、主要モノマー、式ＩＩＩ〜Ｘの共主要モノマー、ならびに式ＩおよびＩＩの共主要モノマーのモル量によって規定される。この手法は、異なる活性剤の組み合わせを含むコポリマーの設計にとってとりわけ有用であり、それは、活性剤を、合成の最中と合成の後の両方において、式ＩおよびＩＩの共主要モノマーの機能化によって取り込むことを可能にするからである。活性剤が短い半減期の放射性同位体、例えば、ヨウ素−１２３である場合、式ＩＸおよびＸ（ＪがＨである場合）の共主要モノマーへの結合は、重合した後に実施することができる。

【0081】

これも上記に考察されたように、複数の活性剤を含むコポリマーを細胞型または組織型特異的標的化部分によりさらに機能化することができる。この機能化ステップは、活性剤がコポリマーにカップリングされた後に典型的に実施されるが、特別の状況下、例えば、ある特定の放射性同位体などの短い半減期を有する活性剤の場合では、コポリマー（式Ｉ、ＩＩ、ＩＸおよび／またはＸの共主要モノマーを含む）と標的化部分とのコンジュゲートを最初に調製する必要がありうる。次いで、コポリマーへの活性剤の負荷は、対象への投与の少し前に行うことができる。潜在的な標的化部分は、免疫チェックポイント阻害剤を含むモノクローナル抗体、抗体断片、ナノ抗体（単一ドメイン抗体）、ＤＡＲＰｉｎ、ペプチドホルモン、細胞表面受容体に結合することができる非抗体タンパク質、ＤＮＡ／ＲＮＡベースアプタマー、ならびに細胞表面受容体に結合することができる小分子（例えば、腫瘍の文脈において葉酸またはビオチン）であるが、これらに限定されない。コポリマーへの標的化部分の共有結合は、均質産物を得るため、ならびに標的化部分の結合親和性を保つために、部位特異的な方法で実施されるべきである。本開示に提示される適切なカップリング戦略は、ペプチドタグ（例えば、ソルターゼ媒介カップリング）、アルデヒドタグ、もしくはトランスグルタミナーゼタグによる酵素触媒反応、またはコポリマーと標的化部分とのいわゆる「クリック」反応である。後者のプロセスは、合成の際に、反応性非標準（非天然）アミノ酸をタンパク質性標的化部分、例えば抗体に組み込むことによって（例えば、非天然アミノ酸のｔＲＮＡに認識される再プログラムされた停止コドンを使用するコドン伸張技術により）達成されうる。上述の方法のうち、ソルターゼ媒介カップリングが、標的化部分へのコポリマーの部位指向性カップリングに好ましい方法である。ソルターゼは、カルボキシル末端局在化シグナル（sorting signal）を認識および切断することにより表面タンパク質を修飾する、原核生物酵素の一群を指す。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来酵素では、認識シグナルはモチーフＬＰＸＴＧ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−任意のもの−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ）からなり、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来酵素では、モチーフはＬＰＸＴＡ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−任意のもの−Ｔｈｒ−Ａｌａ）である。シグナル配列は、高度に疎水性の膜貫通配列およびアルギニンなどの塩基残基のクラスターに先導されている。切断は、シグナル配列のＴｈｒとＧｌｙ／Ａｌａ残基の間に、ソルターゼの活性部位Ｃｙｓ残基へのＴｈｒ残基の一過性の結合を伴って生じ、その後にペプチド転移が続いて、タンパク質を細胞壁構成成分（例えば、グラム陽性細菌のペプチド−グリカン層）に共有結合する。Cozzi, R. et al. (2011) FASEB J 25(6): 1874-86。この酵素機構を適合させて、ペプチドまたはタンパク質の融合を達成することができ、最近はＡＤＣの調製に使用されている。欧州特許出願第２０１３０１５９４８４号（ＥＰ２７７７７１４）；Beerli, RR et al. (2015) PloS One 10(7): e0131177。開示されている手法では、モノクローナル抗体を遺伝子修飾して、その重および軽鎖のＣ末端にソルターゼモチーフを含ませ、細胞傷害性薬物を修飾して、オリゴ−グリシン伸展を含ませた。ソルターゼ触媒反応は、抗体鎖のＣ末端に修飾された薬物分子を高い効率で付加し、均質なＡＤＣをもたらした。

【0082】

本開示のコポリマーのヘッド基をオリゴ−グリシン伸展により修飾することによって、コポリマーそれ自体がソルターゼ触媒反応の標的になる。コポリマーに多数の活性剤を負荷することができるので、この手法は、多くの活性剤分子が抗体の少数の確定（非標準）部位（抗体分子１個あたり２〜４個のＣ末端ソルターゼタグ）に連結しているＡＤＣをもたらす。その結果としてＤＡＲは上昇し、それによってＡＤＣの効力が上昇する。コポリマーのオリゴ−グリシン伸展は、２〜８個のグリシン残基を含む新たに開発されたＲＡＦＴ剤を使用して、重合の開始時に導入することができる。この機能化ＲＡＦＴ剤が使用される場合、１つのソルターゼモチーフのみが各コポリマー分子に存在する。

【0083】

別の好ましい酵素カップリング方法は、トランスグルタミナーゼ触媒反応を利用する。トランスグルタミナーゼは、タンパク質グルタミンガンマグルタミルトランスフェラーゼとも呼ばれ、通常、１つのタンパク質のグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基を、同じまたは別のタンパク質のリジン残基のε−アミノ基に移行させることによりタンパク質を架橋する。過去２０年間にわたり、これらの酵素は、「肉のり（meat-glue）」として食品工業（Martins IM et al. (2014), Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 6957-64?）、組織工学（Ehrbar M. et al. (2007) Bio-macromolecules, 8(10):3000-7）、治療用タンパク質の修飾（Mero A. et al. (2011) J Control Release, 154(1):27-34）または遺伝子送達（Trentin D. et al. (2005) J Control Release, 102(1):263-75）のような多様な分野に使用された。

【0084】

この文脈において、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴｇ）が好ましいクラスの酵素であり、それは、内因性ヒトトランスグルタミナーゼと対照的に、微生物トランスグルタミナーゼは、カルシウム−およびヌクレオチド非依存性酵素であるからである。ヒトトランスグルタミナーゼの４つのドメインと比較して、微生物トランスグルタミナーゼは単一ドメインからなり、ヒトトランスグルタミナーゼの分子量の約半分の分子量を有する。さらに、ＭＴｇは、大きな範囲のｐＨ値、緩衝液および温度で作動し、かなり大きなリストの潜在的基質を有する。Kieliszek M et al. (2014) Rev Folia Microbiol. 59 : 241-50; Martins IM. et al. (2014)。

【0085】

ソルターゼ媒介カップリング戦略と同様に、トランスグルタミナーゼモチーフは、ＲＡＦＴ剤の修飾によって本開示のコポリマーのヘッド基に導入され、ポリマー鎖１つあたり１つのトランスグルタミナーゼモチーフのみが導入されることを確実にする。適切なモチーフは、潜在的なリジン受容体配列としてＦＫＧＧ（Ehrbar M. et al. (2007)）、およびグルタミン受容体配列としてＬＱＳＰもしくはＴＱＧＡ（Caporale A. et al. (2015) Biotechnol J. 10(1):154-61）［この場合、がん細胞特異的標的化部分の反応性リジン残基が使用される］、または潜在的なグルタミン受容体配列として、末端アミノ基を含む５〜２５単位長さの単分散ＰＥＧスペーサーなどであるがこれらに限定されない小ペプチドである。経済的な見通しから、アミノ−ＰＥＧスペーサーは、これらを固相合成および複雑な保護戦略を用いることなく導入することができるので、本開示のコポリマーに最も好ましいモチーフである。

【0086】

この戦略の変種は、標的化部分、例えばモノクローナル抗体へのクリック反応性基（例えば、アジドまたはテトラジン）の部位指向性結合にトランスグルタミナーゼを利用し、この抗体連結反応性基はその後、本開示のコポリマーのポリマーヘッド基の「反対側」のクリック反応性基（アルキンまたは歪みアルケン）との反応に使用される。コポリマー／抗体の上述の反応性部分は交換可能であることが意図される。

【0087】

標的化部分をコポリマーに連結するために他の方法を用いてもよい。抗体または他のポリペプチドを標的にすることは、例えば、アミノ酸側鎖のヒドロキシル官能基を反応性アルデヒドに変換することによって、翻訳後に変更してもよい。ポリヌクレオチドベース標的化部分、例えばアプタマーの場合において、本開示のコポリマーへのカップリングは、固相合成の際にアプタマーに組み込まれた反応性官能基（例えば、アミン、チオール、アルデヒド）との反応により達成してもよい。当該技術に周知の他の部位指向性カップリング技術を使用して、コポリマーを標的化部分にカップリングすることができる。

【0088】

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、有効量の本開示の活性部分を、１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤と一緒に処方して含む。

【0089】

本開示の医薬組成物は、吸入噴霧、局所、直腸内、経鼻、頬側、膣内、または埋め込みレザバーにより非経口投与されてもよく、好ましくは注射（または、注入）により投与されてもよい。本開示の医薬組成物は、任意の従来の非毒性で薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含有することができる。一部の場合では、製剤のｐＨを薬学的に許容される酸、塩基または緩衝液で調整して、処方された活性部分またはその送達形態の安定性を増強することができる。非経口という用語には、本明細書で使用されるとき、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、鞘内、病巣内および頭蓋内の注射または注入技術が含まれる。

【0090】

注射用調合剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用する既知の技能に従って処方することができる。滅菌注射用調合剤は、また、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液剤、懸濁剤または乳剤であってもよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうちで用いることができるものは、水、リンゲル液，Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および塩化ナトリウム等張液である。可溶化賦形剤には、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミドおよびジメチルスルホキシドなどの水溶性有機溶媒；Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＲＨ４０、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＲＨ６０、Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５、ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンモノオレエート、ポロキサマー４０７、Ｌａｂｒａｆｉｌ Ｍ−１９４４ＣＳ、Ｌａｂｒａｆｉｌ Ｍ−２１２５ＣＳ、Ｌａｂｒａｓｏｌ、Ｇｅｌｌｕｃｉｒｅ４４／１４、Ｓｏｆｔｉｇｅｎ７６７、ならびにＰＥＧ３００、４００および１７５０のモノ−およびジ−脂肪酸エステルなどの非イオン性界面活性剤；ヒマシ油、トウモロコシ油、綿実油、オリーブ油、ピーナッツ油、ペパーミント油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油、水素化植物油、水素化ダイズ油、ヤシ油とパーム核油（palm seed oil）の中鎖トリグリセリド、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（例えば、Ｋｌｅｐｔｏｓｅ）およびスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリン（例えば、Ｃａｐｔｉｓｏｌ）などの様々なシクロデキストリン、などの水不溶性脂質；ならびにレシチン、水素化ダイズホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルコリンおよびＬ−α−ジミリストイル−ホスファチジルグリセロールなどのリン脂質が含まれる。Strickley (2004) Pharm. Res. 21: 201-30。

【0091】

注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターでろ過することによって、または後に使用する前に滅菌水または他の滅菌注射用媒体に溶解または分散されうる滅菌固体組成物に滅菌剤を組み込むこと（もしくは、固体組成物を照射によって滅菌すること）によって滅菌することができる。

【0092】

活性剤の効果を延ばすため、皮下または筋肉内注射による活性剤の吸収を遅くすることが多くの場合に望ましい。非経口投与された活性部分の遅延吸収は、活性部分を油ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される。注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生物分解性ポリマーで活性部分をマイクロカプセル化することによって作製される。活性部分のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、活性剤放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が含まれる。デポー注射用製剤は、活性部分を、身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルションに閉じ込めることによっても調製される。

【0093】

直腸内または膣内投与用の組成物は、好ましくは坐剤であり、本開示の活性部分を、カカオ脂、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製することができ、賦形剤／担体は、周囲温度で固体であるが、体温で液体となり、したがって直腸内または膣腔内で融解して活性部分（その結果として活性剤）を放出する。

【0094】

本開示の活性部分の局所または経皮投与用の剤形には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉末剤、液剤、噴霧剤、吸入剤、またはパッチ剤が含まれる。活性部分は、薬学的に許容される担体および必要である場合には任意の防腐剤または緩衝剤と、滅菌条件下で混合される。眼科用製剤、点耳薬、眼軟膏剤、粉末剤、および液剤も、本開示の範囲内であることが考慮される。

【0095】

軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、本開示の活性部分に加えて、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有することができる。

【0096】

粉末剤および噴霧剤は、本開示の活性部分に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。噴霧剤は、追加的に従来の噴射剤を含有することができる。

【0097】

経皮パッチ剤は、活性部分を適切な媒体に溶解または分配することにより作製することができる。吸収増強剤を使用して、皮膚を横切る活性部分の流動を増加させることもできる。速度は、速度制御膜を提供することによって、または活性部分をポリマーマトリックスもしくはゲルに分散することによって制御することができる。

【0098】

肺送達では、本開示の医薬組成物は処方されて、固体または液体粒子形態で直接投与することにより、例えば呼吸器系への吸入により、患者に投与される。本開示の実施のために調製された活性部分の固体または液体粒子形態は、呼吸可能なサイズの粒子、すなわち、吸入時に口腔および喉頭を通過して、肺の気管支および肺胞に達するのに十分に小さいサイズの粒子を含む。エアロゾル化治療薬、特にエアロゾル化抗生物質の送達は、当該技術において公知である（例えば、米国特許第５，７６７，０６８号、米国特許第５，５０８，２６９号およびＷＯ９８／４３６５０を参照すること）。抗生物質の肺送達についての考察は、米国特許第６，０１４，９６９号においても見出される。

【0099】

ヒト対象または患者に単回用量または分割用量で投与される本開示の活性部分の総１日用量には、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性剤、またはより好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の活性剤が含まれる。単回用量の組成物は、そのような量、または１日用量を構成するその分量（submultiple）を含有してもよい。一般に、本開示による処置レジメンは、１日あたり約１ｍｇ〜５０００ｍｇの活性剤（本開示の活性成分に含まれている）を、そのような処置を必要とするヒト対象に単回用量または分割用量で投与することを含む。哺乳動物への用量は、後者のヒト用量に基づいて推定することができる。

【0100】

本開示の活性部分は、例えば、静脈内、動脈内、真皮下（subdermally）、腹腔内、筋肉内もしくは皮下注射により、または頬側、経鼻、経粘膜、局所、軟膏調合剤もしくは吸入により、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性剤を含む１日用量で投与することができる。あるいは、投与量（約１ｍｇ〜５０００ｍｇの活性剤の１日用量に基づく）を、４〜１２０時間ごとに、または特定の活性部分の要件に従って投与することができる。本明細書の方法は、有効量の活性部分（医薬組成物中にある）を投与して、望ましい、または記述された効果を達成することを考慮する。典型的には、本開示の医薬組成物は、１日あたり約１〜約６回投与されるか、または代替的に連続注入として投与される。そのような投与を慢性または急性治療に使用することができる。薬学的に許容される賦形剤または担体と組み合わせて単一剤形を生成することができる活性部分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変わる。典型的な組成物は、約５％〜約９５％の活性部分（ｗ／ｗ）を含有する。あるいは、そのような調合剤は、約２０％〜約８０％の活性部分を含有することができる。任意の特定の患者における具体的な投与量および処置レジメンは、用いられる特定の活性部分の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与時点、排出率、薬物の組み合わせ、疾患、状態または症状の重症度および経過、疾患、状態または症状に対する患者の気質、ならびに処置する医師の判断を含む様々な要因によって決まる。

【0101】

出版物、特許および特許出願を含む、本出願に引用されたすべての参考文献は、それらの全体が組み込まれていると考慮される。

【0102】

本明細書における値の範囲の記載は、単に、本明細書において特に指示されない限り、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個別に参照する簡潔な方法としての機能を果たすことが意図され、それぞれ別々の値は、これが本明細書において個別に記載されるかのように明細書に組み込まれる。特に記述されない限り、本明細書に提供されたすべての正確な値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因または測定に関して提供されたすべての正確な例示的値は、適切な場合、「約」により修飾された対応する近似測定も提供することが考慮されうる）。

【0103】

単一または複数の要素への参照などの用語を使用する本発明の任意の態様または実施形態の本明細書における記載は、特に記述されない限り、または文脈により明確に否定されない限り、その特定の単一または複数の要素「からなる」、「から実質的になる」または「を実質的に含む」本開示の同様の態様または実施形態への支持を提供することが意図される（例えば、特定の要素を含むと本明細書に記載されている組成物は、特に記述されない限り、または文脈により明確に否定されない限り、その要素からなる組成物をも記載することが理解されるべきである）。

【0104】

本発明は、適用される法律が認める最大範囲において、本明細書に提示されている態様または特許請求の範囲に記載されている主題のすべての変更および等価物を含む。

【0105】

したがって一般的に記載されている本開示は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、この実施例は例示として提供され、本発明を限定することを意図しない。

【実施例】

【0106】

注：側鎖連結アミノ酸の合成に関連する実施例において、名称は、最初にＩＵＰＡＣ命名法で示されている。その後に略語名称が使用されている。表１はその対応を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0107】

（実施例１）
銅複合体を介した（Ｓ）−６−アクリルアミド−２−アミノヘキサン酸モノマーの合成
Ｌ−リジン（１４．６２ｇ、１００ｍｍｏｌ）を１５０ｍＬの脱イオン水に溶解し、約８０℃に加熱した。炭酸銅（１６．６ｇ、７５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて少量ずつ加えた。反応物をさらに３０分間撹拌した。高温で深青色の懸濁液をシリカゲルでろ過した。フィルターを少量の水で洗浄した。翌日、リジン銅複合体を含有する合わせたろ液を氷浴で冷却し、１００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加えた。メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＴＢＭＥ）中の塩化アクリロイルの溶液（８．９ｍＬ、１１０ｍｍｏｌ）を、１時間にわたって滴下により添加した。ｐＨを１０％水酸化ナトリウム溶液の並行滴下により添加により最初に８〜１０に維持した。塩化アクリロイル溶液の半分を加えると、生成物が沈殿し始めた。大部分の塩化アクリロイルが添加されたときに、水酸化ナトリウムの添加を遅くして、ｐＨを約６に下げ、反応混合物の温度を室温にした。青色懸濁液をさらに２時間撹拌し、次いでろ過した。フィルターに保持された固体物質を水およびアセトンで洗浄し、次いで乾燥した。収量が６．５ｇのアクリロイル−Ｌ−リジン銅複合体を得た。

【0108】

アクリロイル−Ｌ−リジン銅複合体（２９．５ｇ）を３００ｍＬの脱イオン水に懸濁し、氷浴で冷却した。Ｈ_２Ｓガスを、硫化銅の沈殿が完了するまで懸濁液に吹き込んだ。３グラムの活性炭を懸濁液に加えた。懸濁液を１００℃に短時間加熱した。室温に冷却した後、５００ｍＬのアセトンを懸濁液に加え、次いでシリカゲルでろ過した。透明なろ液をロータリーエバポレーターに入れた。溶媒を蒸発させた後、固体生成物を２００ｍＬの５０％アセトン水溶液で再結晶させた。収量が１７．７６ｇ（７０％）の白色粉末を得た。この化合物の構造をＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ分光法により検証した。

【0109】

（実施例２）
（２Ｓ）−３−（アクリロイルオキシ）−２−アミノプロパン酸の合成
水（５０ｍＬ）中のＬ−セリン（５ｇ、４７．６ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃に加熱し、固体炭酸銅（５．７９ｇ、２６．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を１０分間撹拌した。続いて不溶解残留物をろ過により収集し、水（３０ｍＬ）で洗浄した。合わせたろ液を氷浴で冷却し、ＫＯＨ（２７．１ｍＬ、４７．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。この溶液に、アセトン（３０ｍＬ）中の塩化アクリロイル（４．５２ｍＬ、５９．５ｍｍｏｌ）の混合物を滴下により添加した。次いで反応混合物を撹拌下、４℃で一晩インキュベートした。形成された固体を単離し、水（５０ｍＬ）／メタノール（５０ｍＬ）／エチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５０ｍＬ）（ＭＴＢＥ）で洗浄し、最後に減圧下で乾燥して、Ｏ−アクリロイル−Ｌ−セリン−Ｃｕ^２＋複合体（３．８ｇ、１０．０１ｍｍｏｌ、収率４２．１％）を得た。続いて、複合体中の銅を実施例１に記載された手順と類似した手順により除去した。収量が１．４３ｇ（４５％）のアクリロイル−Ｌ−セリンを白色の粉末として得た。この化合物の同一性をＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ分光法により検証した。

【0110】

（実施例３）
（２Ｓ）−３−（アクリロイルオキシ）−２−アミノブタン酸の合成
６ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む反応容器を、氷浴で冷却した。続いて、固体Ｌ−トレオニン（２．００ｇ、１６．７９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を５分間撹拌した。トリフルオロメタンスルホン酸（０．１８ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）、続いて塩化アクリロイル（２．５ｍＬ、３２．９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間インキュベートした。反応が完了した後、生成物をメチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で沈殿させた。固体を単離した後、生成物をＭＴＢＥおよびアセトンで洗浄した。最後にＯ−アクリロイル−Ｌ−トレオニン塩酸塩を減圧下で乾燥して、白色の粉末（収率３２％）を得た。この化合物の構造をＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳ分光法により検証した。

【0111】

（実施例４）
（Ｓ）−３−（４−（アクリロイルオキシ）フェニル）−２−アミノプロパン酸の合成
Ｏ−アクリロイル−Ｌ−チロシン−Ｃｕ^２＋複合体の合成は、実施例１に記載された手順に従って実施した。銅を以下の手順により複合体から除去した。７３．１５ｇ（１４０ｍｍｏｌ）のＯ−アクリロイル−Ｌ−チロシン−Ｃｕ^２＋複合体を破砕皿中の２２０ｍＬの２Ｎ ＨＣｌに溶解した。混合物を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ＰＴ３０００機器を使用して均質化した。続いて混合物をろ過し、残留物を５０ｍＬの２Ｎ ＨＣｌで２回洗浄した。次いで固体化合物をＮａＯＨにより減圧下、４０℃で乾燥して、Ｏ−アクリロイル−Ｌ−チロシン塩酸塩（４６．９６ｇ、収率６３％）を得た。

【0112】

（実施例５）
（Ｓ）−２−（４−アクリルアミドフェニル）−２−アミノ酢酸の合成
Ｂｏｃ−４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン（２．５０ｇ、８．９ｍｍｏｌ、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を２５ｍＬのクロロホルムに溶解した。トリエチルアミン（２．４７ｍＬ、１７．８ｍｍｏｌ）をこの溶液に加え、混合物を−１５℃に冷却した。続いて、クロロホルム中の塩化アクリロイル（０．７９ｍＬ、９．８ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら混合物に滴下により添加した。塩化アクリロイルの添加が完了した後、反応混合物をさらに３時間撹拌した。その後、反応混合物をガラスフィルターに通し、保護（Ｓ）−２−（４−アクリルアミドフェニル）−２−アミノ酢酸をカラムクロマトグラフィーにより精製し、残留溶媒を蒸発させた。得られた（Ｓ）−２−（４−アクリルアミドフェニル）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）酢酸（５００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を５ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（８００μＬ、１０．３８ｍｍｏｌ）を加え、溶液を室温で１時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、５ｍＬのＤＣＭを加え、溶媒を再び減圧下で除去した。この手順を数回繰り返した。最後に生成物を３ｍＬのＤＣＭに溶解し、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）で沈殿させた。固体をガラスフィルターで収集し、真空下で乾燥して、純粋なアクリロイル−４−アミノ−Ｌ−フェニルアラニンを１５％の収率で得た。この化合物の構造をＮＭＲにより検証した。

【0113】

（実施例６）
（２Ｓ）−４−（アクリロイルオキシ）ピロリジン−２−カルボン酸および（Ｒ）−３−（アクリロイルチオ）−２−アミノプロパン酸の合成
これらの化合物の合成を実施例１に記載されたように実施した。（２Ｓ）−４−（アクリロイルオキシ）ピロリジン−２−カルボン酸および（Ｒ）−３−（アクリロイルチオ）−２−アミノプロパン酸では、出発材料は、それぞれ４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンおよびＬ−システインであった。

【0114】

（実施例７）
（Ｓ）−６−アクリルアミド−２−（３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパンアミド）ヘキサン酸（ＡＫ−フェノール）の合成
ＤＭＦ（９ｍＬ）中のＡＫ（５３８ｍｇ、２．６９ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（４４３μＬ、３．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、ボルトンハンター試薬（６４３ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで反応混合物をろ過し、揮発物をＮ_２ストリーム下で除去した。残留物をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィーにより精製した。構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0115】

（実施例８）
アミノ酸のメタクリル／エチルアクリル／プロピルアクリル誘導体の合成
メタクリル／エチルアクリル／プロピルアクリル誘導体の合成を、対応する酸塩化物、例えば塩化メタクリロイルを実施例１〜７に記載された条件下で使用して実施した。

【0116】

（実施例９）
フルオレセイン修飾共主要モノマーＡＫ−フルオレセイン−Ｖ１の合成
２０ｍＬの反応容器中で、アクリロイル−Ｌ−リジン［実施例１を参照すること］（１５０ｍｇ、０．７４９ｍｍｏｌ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、３２１ｍｇ、０．８２４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１１４ｍＬ、０．８２４ｍｍｏｌ）の溶液をＤＭＦで調製した。反応物を、一定撹拌下、暗所において室温で一晩インキュベートした。続いて、溶液を０．４μｍのフィルターでろ過して、潜在的な粒子を除去した。その後、残留溶媒を、ロータリーエバポレーターにより真空を適用しながら３０℃で除去した。構造を、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳにより検証した（収率９８％、純度＞９５％）。その後、合成されたモノマーを、溶媒としてＤＭＦおよび開始剤としてＡＩＢＮを使用するジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）［９０／１０ｍｏｌ／ｍｏｌ］との共重合で試験した。重合反応を６５℃で６時間実施し、得られたコポリマーを、実施例１３に提示されているプロトコールを使用してゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により分析した。

【0117】

（実施例１０）
フルオレセイン修飾共主要モノマーＡＫ−フルオレセイン−Ｖ２の合成
反応は、実施例９に提示された合成プロトコールに従って出発材料としてフルオレセイン−ＮＨＳを用いて実施したが、１０ｍｏｌ％過剰のＡＫを用い、これを反応後に沈殿により除去した。

【0118】

構造を、ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳにより検証した（収率８５％、純度＞９３％）。その後、合成されたモノマーを、溶媒としてＤＭＦおよび開始剤としてＡＩＢＮを使用するジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）［９０／１０ｍｏｌ／ｍｏｌ］との共重合で試験した。重合反応を６５℃で６時間実施し、得られたコポリマーを、実施例１３に提示されているプロトコールを使用してＧＰＣにより分析した。

【0119】

（実施例１１）
非切断性リンカーを有するドキソルビシン（ＤＯＸ）修飾共主要モノマー（ＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ１）の合成
ＤＭＦ中のＤＯＸ・ＨＣｌ（２００ｍｇ、３４５μｍｏｌ、１．００当量）およびＥｔ_３Ｎ（５０μＬ、３４８μｍｏｌ、１．０１当量）の溶液に、無水コハク酸（３６．２ｍｇ、３６２μｍｏｌ、１．０５当量）を加えた。混合物を不活性雰囲気下、室温で３０分間撹拌し、次いでＮＨＳ（４３．７ｍｇ、３７９μｍｏｌ、１．１０当量）、続いてＥＤＣ・ＨＣｌ（６９．４ｍｇ、３６２μｍｏｌ、１．０５当量）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いでＡＫ（６９．０ｍｇ、３４５μｍｏｌ、１．００当量）、続いてＥｔ_３Ｎ（５３μＬ、３７９μｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。反応混合物を再び室温で一晩撹拌した。揮発物をＮ_２ストリーム下で蒸発させ、残留物をＳｉＯ_２カラムクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（２２８ｍｇ、２７６μｍｏｌ、８０％）を得た。

【0120】

（実施例１２）
カテプシンＢ感受性リンカーを有するドキソルビシン修飾共主要モノマー（ＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ２）の合成
Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）中のＤＯＸ・ＨＣｌ（８６ｍｇ、１４９μｍｏｌ、１．１０当量）、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＯ−ＰＮＰ（１００ｍｇ、１３６μｍｏｌ、１．００当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２６μＬ、１４９μｍｏｌ、１．１０当量）の溶液を室温で２時間撹拌する。得られた混合物に、ＡＫ（２８．５ｍｇ、１４２μｍｏｌ、１．０５当量）、続いてＤＩＰＥＡ（２６μＬ、１４９μｍｏｌ、１．１０当量）を加える。反応混合物を室温で一晩撹拌する。揮発物をＮ_２ストリーム下で蒸発させ、残留物をＳｉＯ_２でのクロマトグラフィーにより精製して、所望の生成物（１０９ｍｇ、８１μｍｏｌ、６０％）を得る。

【0121】

（実施例１３）
ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌの合成の一般手順
ステップ１：ＲＡＦＴ−ＮＨＳ中間体の合成：
ＣＨ_２Ｃｌ_２中の、Tucker et al. (ACS Macro Letters (2017) 6(4): 452-457)に記載されたように合成された２−［［（エチルチオ）チオキソメチル］チオ］−２−メチル−プロパン酸（２２．８５ｇ、１０２ｍｍｏｌ、１．０当量）、および１−ヒドロキシピロリジニン−２，５−ジオン（1-hydroxypyrrolidinine-2,5-dione）（１２．８９ｇ、１１２ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液に、ＥＤＣ・ＨＣｌ（２１．４８ｇ、１１２ｍｍｏｌ、１．１当量）を０℃で加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで反応混合物をＮ_２流下で部分的に（総体積の約半分まで）蒸発させ、ＡｃＯＥｔおよび再蒸留水（ｄｄＨ_２Ｏ）で希釈した。二相溶液を分液漏斗に移し、抽出した後、有機相をｄｄＨ_２Ｏ、ＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（３×）、ｄｄＨ_２Ｏ（２×）およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、すべての揮発物を減圧下で除去した。残留物をｎ−ヘキサンで摩砕し、得られた黄色懸濁液をろ過した。ケーキをｎ−ヘキサンで洗浄した。黄色の固体を減圧下で乾燥し、得られた中間体（ＲＡＦＴ−ＮＨＳ）をさらに精製することなく使用した（３１．８ｇ、９９．０ｍｍｏｌ、９７％）。すべての分析データは、文献の値と一致していた。Yang et al. (2012) Macromolecular rapid communications 33(22): 1921-6。

【0122】

ステップ２：ＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＢＯＣ中間体の合成：
ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＲＡＦＴ−ＮＨＳ出発材料（１．２２ｇ、３．６１ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＣＨ_２Ｃｌ_２中のｔ−ブチル−（２−アミノエチル）カルバメート（０．８１ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．４当量）およびＥｔ_３Ｎ（１．０ｍＬ、７．２ｍｍｏｌ、２．０当量）の溶液を、−１０℃で滴下により添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。有機混合物を、ＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液（２×）、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液（２×）およびブラインで連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、すべての揮発物を減圧下で除去した。残留物をｎ−ヘプタンおよびＥｔ_２Ｏの混合物で再結晶させた。黄色の結晶をろ過し、ｎ−ヘプタンで洗浄し、減圧下で乾燥して、次の中間体（ＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＢＯＣ、１．２６ｇ、３．４４ｍｍｏｌ、９５％）を得た。得られた化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0123】

ステップ３：ＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＯＴｆ中間体の合成：
ＴＦＡ中のＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＢＯＣ（１．２５ｇ、３．４１ｍｍｏｌ、１．０当量）の冷溶液を６０分間撹拌した。次いで反応混合物をＭｅＯＨおよびＣＨ_２Ｃ_ｌ２（１／２）で希釈し、揮発物を部分的に（総体積の２／３を）Ｎ_２流下で除去した。得られたＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＯＴｆを黄色の油状物（２．００ｇ、３．２９ｍｍｏｌ、９６％）として単離し、さらに精製することなく次のステップで使用した。得られた化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0124】

ステップ４：ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＲＡＦＴ中間体の合成：
ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＢＯＣ−Ｇ_３（６９７ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ、１．０当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ水和物）（９２．０ｍｇ、６００μｍｏｌ、０．２５当量）およびＥＤＣ・ＨＣｌ（４８５ｍｇ、２．５３ｍｍｏｌ、１．０５当量）の溶液を、不活性雰囲気（Ｎ_２）下、０℃で３０分間撹拌した。この溶液に、ＣＨ_２Ｃｌ_２中のＲＡＦＴ−ＥＤＡ−ＯＴｆ（９１７ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液およびＤＩＰＥＡ（２．１３ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ、５．２当量）を連続的に滴下により添加した。反応混合物を０℃で１時間、次いで室温で一晩撹拌した。反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２で希釈し、有機混合物を、ＮＨ_４Ｃｌ飽和溶液（３×）、ＮａＨＣＯ_３飽和溶液、ｄｄＨ_２Ｏおよびブラインで連続的に洗浄した。有機相を収集し、乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、揮発物を減圧下で部分的に（総体積の２／３を）除去した。得られた溶液にＥｔＯＡｃを加えた。次いで、得られた曇った溶液を冷蔵庫に一晩保管して、黄色の懸濁液を得て、それをろ過し、ケーキを冷ＥｔＯＡｃで洗浄した。黄色の固体を減圧下で乾燥して、ＢＯＣ−Ｇ_３−ＲＡＦＴ剤（３９６ｍｇ、７３６μｍｏｌ、３１％）を得た。得られた化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0125】

ステップ５：ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマーの合成
ジオキサン中のＤＭＡ（１９２μＬ、１．８６ｍｍｏｌ、１０当量）の溶液に、ＢＯＣ−Ｇ_３−ＲＡＦＴ剤（１００ｍｇ、１８６μｍｏｌ、１．０当量）およびＡＩＢＮ（６．１ｍｇ、３７μｍｏｌ、０．２０当量）を連続的に加えた。反応混合物を６０℃で６時間撹拌した。次いで反応生成物をｎ−ヘキサンに沈殿させた。薄黄色の懸濁液をろ過し、得られたケーキをｎ−ヘキサンで洗浄し、最後にアセトンに溶解した。次いで揮発物を減圧下で除去して、ＢＯＣ−Ｇ_３−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマーを黄色の油状物（２８０ｍｇ、１８６μｍｏｌ、９９％）として得た。得られた化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0126】

ステップ６（必要に応じて）：Ｇ_ｎ−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマーの合成
ジオキサン中のＢＯＣ−Ｇ_３−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマーの溶液を、ジオキサン中のＨＣｌ（４Ｍ）の溶液で２時間処理する。揮発物をＮ_２流下、室温で除去する。残留物を、さらに精製することなく使用する。得られた化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証する。

【0127】

ステップ７：ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌの合成
ｄｄＨ_２Ｏ中のＤＭＡ（１．２３ｍＬ、１１．９ｍｍｏｌ、７０当量）およびＡＫ（２７２ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ、８当量）の溶液に、ＢＯＣ−Ｇ_３−ＤＭＡプレポリマー（２２１ｍｇ、１７０μｍｏｌ、１．０当量）およびＶＡ０４４（２７．５ｍｇ、８５μｍｏｌ、０．４当量）を連続的に加えた。反応混合物を５５℃で４時間撹拌した。反応混合物をｄｄＨ_２Ｏおよびジオキサンで希釈した。この溶液に、ホスフィン酸（５０ｗ％、９３μＬ、８５０μｍｏｌ、５当量）、ＴＥＡ（１１８μＬ、８５０μｍｏｌ、５当量）およびＶＡ０４４（２７．５ｍｇ、８５μｍｏｌ、０．５当量）を連続的に加えた。反応混合物を１００℃で４時間撹拌した。次いで、得られた混合物をｄｄＨ_２Ｏで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして（freeze-dried）、ＢＯＣ−Ｇ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌを白色の粉末（１．２０ｇ、１２０μｍｏｌ、２ステップで７１％）として得た。得られた化合物の構造を、ＮＭＲ分光法および以下のプロトコールを使用するＧＰＣにより検証した。３．３３ｍｇ／ｍＬのコポリマーの貯蔵溶液を、溶出緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３を含有する脱イオン水）で調製し、０．４５μｍシリンジフィルターでろ過した。続いて、０．４ｍＬの貯蔵溶液をＧＰＣ装置（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のポートに注入した。クロマトグラフィーを、溶出緩衝剤により０．５ｍＬ／分の一定流速で実施した。コポリマーの試料を、５５℃の外部カラムオーブンに設置されたＳｕｐｕｒｅｍａ３カラムシステム（プレカラム、１０００Å、３０Å；粒径５μｍ；ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分離した。コポリマーをＲＩ（屈折率）およびＵＶ検出器により分析した。較正曲線（１０ポイント）を、プルラン標準を使用して確立した。特徴付けされたコポリマーの分子量を、この標準を参照することにより推定した。

【0128】

ペンタグリシン誘導体（ＢＯＣ−Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ）の合成は、出発材料としてＢＯＣ−Ｇ_５−Ｎａ塩を使用するというわずかな変更を伴い、上記のプロトコールに従って達成した。ＢＯＣ−Ｇ_５−Ｎａ塩はペンタグリシンから得て、Wang, T.-P. et al (2012) Bioconjugate Chemistry 23(12): 2417-2433に従って合成した。他のオリゴグリシン機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーを、同様のプロトコールを使用して生成することができる。

【0129】

（実施例１４）
ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＰＥＧ_ｘ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌの合成
ＢＯＣ−Ｇ_３−ＰＥＧ_１１−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌの合成は、上記の一般手順（実施例１３：ステップ１〜４および７）に従って達成した。ステップ２は、出発材料としてＢＯＣ−ＰＥＧ_１１−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ_２を使用して実施して、ＲＡＦＴ−ＰＥＧ_１１−ＢＯＣを生じ、ステップ３はＥｔＯＡｃ中のＨＣｌを使用して実施した。

【0130】

ＰＥＧ_２３誘導体（ＢＯＣ−Ｇ_３−ＰＥＧ_２３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ）の合成は、出発材料としてＢＯＣ−ＰＥＧ_２３−ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ_２を使用するというわずかな変更を伴い、上記のプロトコールに従って達成した。他のオリゴグリシン機能化およびＰＥＧ機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーを、同様のプロトコールにより生成することができる。

【0131】

（実施例１５）
ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８またはＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＰＥＧ_ｘ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８の合成
ＮａＨＣＯ_３（０．１Ｎ）の水溶液中のＢＯＣ−Ｇ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ（１．０当量）またはＢＯＣ−Ｇ_３−ＰＥＧ_１１−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ（１．０当量）（調製には、実施例１３、ステップ７を参照すること）の溶液に、ＤＭＳＯ中のＦＩＴＣ（１６当量）の溶液をゆっくりと加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間撹拌し、ＮａＨＣＯ_３の水溶液（０．１Ｎ）、次いでｄｄＨ_２Ｏで透析した（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）。濃縮液をフリーズドライして、暗橙色の粉末（収率：８０〜９２％）を得た。この化合物の構造をＮＭＲおよびＧＰＣにより検証した。
トリグリシンおよびトリグリシン−（ＰＥＧ）_２３誘導体の合成を、同じプロトコールを使用して達成した。

【0132】

（実施例１６）
Ｈ_２Ｎ−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８またはＨ_２Ｎ−Ｇ_ｎ−ＰＥＧ_ｘ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８の合成
ＥｔＯＨ中のＢＯＣ−Ｇ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８（１．０当量）またはＢＯＣ−Ｇ_３−ＰＥＧ_１１−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８（１．０当量）の溶液に、ＥｔＯＨ中のＨＣｌ（約１．２５Ｎ）の溶液を加えた。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌し、水（２×）で透析した（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）。濃縮液をフリーズドライして、暗橙色の（静電）粉末（９９％）を得た。この化合物の構造をＮＭＲおよびＧＰＣにより検証した。

【0133】

（実施例１７）
カテプシンＢ感受性ドキソルビシン含有Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌの合成
ステップ１ Ｈ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨの調製
Ｈ_２Ｏ（１００ｍＬ）中のＬ−リジン塩酸塩（１．０当量）および塩基性炭酸銅（ＩＩ）（１．１当量）の溶液を３０分間還流させた。還流の際に形成された固体を熱時ろ過により除去した。ろ液を０℃に冷却し、固体重炭酸ナトリウム（３．１当量）の添加によりｐＨ９に調整した。クロロギ酸アリル（１．５当量）を１時間かけて滴下により添加し、その間、溶液を０℃で撹拌した。この添加の際に、反応混合物を固体重炭酸ナトリウムの添加によりｐＨ９に維持した。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した。反応の際に形成された青色の固体生成物を、ろ過により定量収率で収集した。
Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）の固体銅塩をＨ_２Ｏ（２５０ｍＬ）に懸濁し、２当量のチオアセトアミド（２．０当量）を加えた。アルカリ性懸濁液を５０℃で３時間撹拌し、その間に固体がゆっくりと溶解した。続いて、溶液を２Ｍ ＨＣｌでｐＨ２に酸性化し、５分間沸騰させた。沈殿したＣｕＳをろ過により除去した。ろ液を真空下で約６０ｍＬに濃縮し、その時点でＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）の塩酸塩が白色の固体（７９％）として沈殿し、それをろ過により回収した。

【0134】

ステップ２ ＦＭＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨの調製
ジオキサン（３０ｍＬ）中のＦＭＯＣ−Ｖａｌ−ＯＳｕ（１．０当量）の室温で激しく撹拌した溶液を、水（３０ｍＬ）中のＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（１．１当量）およびＮａＨＣＯ_３（２．１当量）の溶液と合わせた。温度を、最初の３０分間に冷水浴を使用して２５℃未満に維持した。混合物を室温で１４時間撹拌し続けた。混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、次いで１５％クエン酸でｐＨ３に酸性化した。得られた懸濁液を酢酸エチル（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を水およびブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させて、オフホワイトの固体を得た。固体をＴＨＦに溶解し、次いでメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を加え、ろ過した後に純白な固体（８０％）を得た。

【0135】

ステップ３ ＦＭＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨの調製
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＦＭＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＯＨ（１．０当量）およびＰＡＢＯＨ（１．１当量）の室温で撹拌した溶液を、ＥＥＤＱ（１．１当量）で処理した。１６時間後、混合物を３０℃で蒸発乾固し、残留物をＭＴＢＥで再結晶させて、濃黄色（deep yellow）の生成物（８４％）を得た。

【0136】

ステップ４：Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨの調製
ＣＨ_２Ｃｌ_２（３５ｍｌ）中のＦＭＯＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨ（１．０当量）を室温でジエチルアミン（５０ｍｌ）により処理した。混合物を短時間超音波処理し、室温で４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ_２Ｃｌ_２でフラッシュし、シリカのクロマトグラフィーにかけて、生成物を無色の泡状物（６９％）として得た。

【0137】

ステップ５：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨの調製
ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍｌ）中のＨ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨ（１．１当量）およびＤＩＥＡ（１．１当量）を室温でＣＨ_２Ｃｌ_２（２ｍｌ）中のＭＣ−ＮＨＳ（１．１当量）により処理した。混合物を室温で一晩撹拌した。酢酸エチル（６０ｍｌ）を加え、混合物を水およびブラインで洗浄し、乾燥し、蒸発させて、所望の生成物（９６％）を得た。

【0138】

ステップ６：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯ−ＰＮＰの調製
ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯＨ（１．０当量）の室温で撹拌した溶液を、ＰＮＰクロロホルメート（１．２当量）および乾燥ピリジン（１．５当量）で処理した。反応物を、ＨＰＬＣ分析が混合物に抽出物が存在しないことを示すまで、一晩撹拌した。混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で希釈し、クエン酸（５０ｍＬ、Ｈ_２Ｏ中１０％）で酸性化した。有機相を水（５０ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を蒸発させて、薄黄色の固体を得た。固体をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（２０：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製して、純粋な化合物を、黄色を帯びた固体（５８％）として得た。

【0139】

ステップ７：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＣ−ＤＯＸの調製
ＮＭＰ（８ｍＬ）中のＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＯ−ＰＮＰ（１．０当量）およびＤＯＸ・ＨＣｌ（１．１当量）を室温でＥｔ_３Ｎ（１当量）により処理した。その後、混合物を暗所で３日間インキュベートした。次いで、混合物を１０％の２−プロパノール／酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水（３×１００ｍＬ）およびブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し、蒸発させて、濃橙色（deep orange）の油状物を得た。これをシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、純粋な生成物を赤色固体（９２％）として得た。

【0140】

ステップ８：ＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸの調製
ＴＨＦ（７ｍＬ）中のＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ａｌｌｏｃ）−ＰＡＢＣ−ＤＯＸ（１．０当量）を、アルゴン下、室温で、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．０３当量）、酢酸（２．５当量）および水素化トリブチルスズ（１．５当量）で処理した。混合物を暗所において室温で１時間撹拌し、その最中に橙色の固体が形成し始めた。混合物をエーテル（２５ｍＬ）で希釈し、続いてエーテル中の１Ｍ ＨＣｌ（２ｍＬ）を添加した。得られた懸濁液を短時間超音波処理し、次いでろ過した。橙色の固体をエーテルで繰り返し洗浄し、次いで５：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨに溶解した。これに、Ｃｅｌｉｔｅ（７ｇ）を加え、次いで溶媒を蒸発させた。得られた固体をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）に吸着させ、Ｃｅｌｉｔｅカラム（ＤＣＭ：ＭｅＯＨの１００：１のスラリーから作製）にドライロードした（dry-loaded）。カラムを、ＤＣＭ：ＭｅＯＨの１００：１の混合物、続いてＤＣＭ：ＭｅＯＨの１０：１の混合物で溶出した。所望の生成物を橙色の固体（３０％）として得た。
異なるアミノ酸配列を有するリンカー誘導体ＭＣ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸ、ＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸを、シトルリンリンカーがＡｌｌｏｃ保護基を必要としないこと以外は上記に記述された手順と同じ手順に従って合成した。

【0141】

ステップ９：ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーへのカテプシンＢ感受性リンカーのカップリング
続いて、上記に記述されたリンカードキソルビシンコンジュゲートを、以下の一般手順を使用してＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー（実施例１３、ステップ７）にカップリングした。
ＤＭＦ中のＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー（１．０当量）およびＥｔ_３Ｎ（１２当量）の溶液に、リンカードキソルビシンコンジュゲート（１０当量）の溶液を不活性雰囲気下、室温で滴下により添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。最後に混合物をｄｄＨ_２Ｏで希釈し、得られた懸濁液をろ過した。次いで、ろ液をｄｄＨ_２Ｏ（２×１０Ｌ）で透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液を凍結乾燥して、赤色の易流動性粉末（収率６０〜７０％）を得た。得られた化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0142】

（実施例１８）
ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーからのドキソルビシンのカテプシンＢ媒介放出。
ヒト肝臓カテプシンＢ（Ｍｅｒｃｋ、ＭＷ約２７５００）（５単位）を４００μＬの酢酸塩緩衝液（５０ｍＭの酢酸塩＋１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）に溶解した。１０μＬの酵素溶液を、３９０μＬの活性化溶液（５ｍＭのジチオトレイトール、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢｒｉｊ５８、ｐＨ６．０）と共に３７℃で約３０分間インキュベートした。その間、２０μＬの実施例１７のポリマーリンカーＤＯＸコンジュゲート（１μｍｏｌ）を、１４７３μＬの活性化溶液に加え、３７℃でインキュベートした。３２μＬの活性化酵素（０．０１Ｕ）を基質溶液に加え、反応物を３７℃でインキュベートした。遊離ＤＯＸの放出を、ＨＰＬＣおよび光度計測定によりモニターした。ＭＣ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ−ＤＯＸが最短の半減期を呈し、次にＭＣ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸおよびＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＤＯＸであった。

【0143】

（実施例１９）
ドキソルビシン含有共主要モノマー（ＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ１およびＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ２）の共重合。
ドキソルビシンを含むＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成は、ＲＡＦＴ剤としてＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＲＡＦＴ中間体、ＢＯＣ−Ｇ_ｎ−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマー、ＲＡＦＴ−ＰＥＧ_Ｘ−ＢＯＣ、または対応するＢＯＣ脱保護試薬（実施例１３、ステップ６に記載されたプロトコールに従って得た）（１．０当量）およびドキソルビシン含有共主要モノマー（８．０当量）（ＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ１またはＡＫ−ＤＯＸ−Ｖ２）を使用して、共主要モノマーの共重合についての一般手順（実施例１３、ステップ７）により達成される。

【0144】

（実施例２０）
ＡＫ−フェノールの共重合
ヨウ素反応性モノマーを含むＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成は、ＲＡＦＴ試薬としてＢＯＣ−Ｇ_３−ＲＡＦＴ中間体、ＢＯＣ−Ｇ_３−ＤＭＡ−ＲＡＦＴプレポリマー、ＲＡＦＴ−ＰＥＧ_１１−ＢＯＣ、または対応するＢＯＣ脱保護試薬（実施例１３、ステップ６に記載されたプロトコールに従って得た）（１．０当量）および共主要モノマーとしてＡＫ−フェノール（８．０当量）を使用して、共主要モノマーの共重合についての一般手順（実施例１３、ステップ７）によって達成した。ｄｄＨ_２Ｏの代わりに、０．１ＭのＮａＨＣＯ_３を溶媒として使用した。所望の生成物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0145】

（実施例２１）
ヨウ素反応性ポリマー担体のヨウ素化
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中の実施例２０のＡＫ−フェノールコポリマー（７０ｍｇ、７．０μｍｏｌ）の溶液に、ＮａＩ（７．８６ｍｇ、５２μｍｏｌ）およびクロラミンＴ（１４．８ｍｇ、５２μｍｏｌ）を連続的に加えた。次いで反応混合物を室温で３０分間撹拌し、その後、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５水溶液（０．３Ｍ）で希釈した。次いで、得られた溶液を１０ＬのｄｄＨ２Ｏで透析し、濃縮液をフリーズドライした。所望の生成物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0146】

（実施例２２）
ソルターゼ媒介反応を使用するＨｅｒ２＋モデル抗体へのＨ_２Ｎ−Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８のカップリング
Ｈ_２Ｎ−Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８（実施例１６）を、以下の一般手順を使用して、Ｈｅｒ２抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体にコンジュゲートすることができる。重鎖のＣ末端でソルターゼモチーフ（ＬＰＥＴＧ）およびヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ_６）により遺伝子修飾されたＨｅｒ２モノクローナル抗体［１０μＭ］を、Ｈ_２Ｎ−Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８［１００μＭ］と共に、０．６２μＭのソルターゼＡの存在下、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５中において、２５℃で３．５時間インキュベートする。反応は、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡にしたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させることによって停止させる。充填したカラムを５カラム体積（ＣＶ）の緩衝剤で洗浄する。結合したコンジュゲートを５ＣＶの溶出緩衝液（０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ２．８）で溶出し、１ＣＶの画分を、２５％（ｖ／ｖ）の１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を含む管に収集して、溶液を中和する。タンパク質含有画分をプールし、続いて製造会社の使用説明書に従ってＮＡＰ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩衝剤交換により１０ｍＭのコハク酸ナトリウムｐＨ５．０、１００ｍｇ／ｍＬのトレハロース、０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０に配合する。カップリング反応の成功は、４〜２０％勾配のトリスグリシンゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ならびに抗Ｈｉｓ_６一次抗体およびホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を使用するウエスタンブロット（ＷＢ）分析により定量的に検証する。ＷＢシグナルの検出は、増強化学発光（ＥＣＬ）キット（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を使用して実施する。非修飾抗Ｈｅｒ２−ＬＰＥＴＧ−Ｈｉｓ_６抗体は対照としての機能を果たす。抗Ｈｉｓ_６抗体の消滅は、ソルターゼ反応が完了したことを示す。定量的分析では、サイズ排除クロマトグラフィーを実施する。薬物の抗体に対する比（ＤＡＲ）は、残存非修飾抗体（ＵＶ検出波長２８０ｎｍ）のピーク強度の比較により計算する。

【0147】

（実施例２３）
Ｈ_２Ｎ−Ｇ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの毒性探索
本開示のポリマー担体は生物分解性ではない。したがって、担体が健康な組織に対して無害であることを実証することが重要であった。本開示のポリマー担体（ペイロードなし）の毒性探索研究を実施した。簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェル黒色壁透明底ポリスチレンプレートに１ウェルあたり１００μＬで平板培養した。試験化合物は、ＤＭＡおよびＡＫ（９０／１０ｍｏｌ％）を含むＨ_２Ｎ−Ｇ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー（１２ｋＤａ）であり、実施例１３、ステップ７に記載された手順により調製した。ＨｅｐＧ２細胞に、試験化合物を、０．０４〜１００μＭの濃度で投与した。３７℃での７２時間のインキュベーションの終了時に、適切な色素または抗体を培養物に加えた。次いでプレートを、自動蛍光細胞画像機（ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を使用してスキャンした。
以下の８個の細胞健康パラメーター（ＣＨＰ）を評価した。

【0148】

細胞計数：１ウェルあたりの細胞の減少数は、壊死、アポトーシスまたは細胞増殖の低減によって、毒性を示している。核のサイズ：核野の増加は、壊死またはＧ２細胞周期の停止を示すことができ、減少はアポトーシスを示すことができる。ＤＮＡ構造：ＤＮＡ構造の増加は、染色体の不安定性およびＤＮＡ断片化を示すことができる。ミトコンドリア質量：ミトコンドリア質量の減少は、総ミトコンドリアの損失を示し、増加は、ミトコンドリアの膨張または細胞のエネルギー需要への適応応答を示唆する。ミトコンドリア膜電位（Δψｍ）：減少は、典型的にはアポトーシスシグナル伝達をもたらすミトコンドリアの完全性の損失を示し、ミトコンドリア膜電位の増加は、細胞のエネルギー需要への適応応答を示す。酸化ストレス：反応性酸素種（ＲＯＳ）の増加は、早期の細胞傷害性応答である。グルタチオン含有量：グルタチオン（ＧＳＨ）含有量の減少は、ＲＯＳの産生または試験化合物への直接結合の結果でありうる。ＧＳＨ含有量の増加は、酸化ストレスへの細胞の適応応答を表す。細胞ＡＴＰ：細胞が溶解すると、ＡＴＰは細胞から放出される。代謝的に活性ではない細胞は、ＡＴＰを放出しない。したがって、代謝活性細胞の減少は、検出されるＡＴＰレベルの減少をもたらす。

【表2】

対照１：カルボニルシアニド３−クロロフェニルヒドラゾン；対照２：Ｌ−ブチオニン−スルホキシミン；ＭＥＣ：最小有効用量、すなわち、効果が検出される最低用量：ＡＣ_５０：最大効果の５０％が観察される濃度；ＭＴＤ：最大耐容用量、すなわち、＜２０％の細胞損失が観察された濃度。ＮＲ：応答なし；ＮＳ：統計的に有意ではない。
この研究は、１００μＭまでの濃度のＧ_３−ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーへのＨｅｐＧ２細胞の曝露が、試験ＣＨＰに対して効果を有さなかったことを明らかにした。このことは、本開示のコポリマーの高い生体適合性を実証している。

【0149】

（実施例２４）
Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_ｎ−ＡＤＣのがん細胞特異性
実施例２２のＨＥＲ２抗体機能化Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８コポリマーの、その標的細胞への親和性を、ＳＫＢＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８がん細胞系を使用した実験で検査する。ＳＫＢＲ３細胞は、ヒト上皮増殖因子受容体２を過剰発現し（ＨＥＲ２＋）、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、その受容体を発現しない（ＨＥＲ２−）。結合は、以下の簡潔なプロトコールを使用してＦＡＣＳ（＝蛍光活性化細胞選別）により評価する。

【0150】

細胞を、１６０μＬの培地／ウェル［４．５ｇ／Ｌのグルコース、１．５ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＭＧ−３０、ＣＬＳ）を補充したＤＭＥＭ］中に５，０００〜１０，０００個の細胞の密度で９６ウェルプレートに平板培養する。５％ＣＯ_２雰囲気で加湿インキュベーターにより３７℃で１日インキュベートした後、細胞を採取し、洗浄し、細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％アジ化ナトリウムを補充した氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で１．２５×１０^６細胞／ｍＬの濃度に調整する。細胞懸濁液を１２×７５ｍｍ^２のポリスチレン丸底に移し、次いで５μｇ／ｍＬのＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_１６−ＡＤＣと共に暗所において４℃で４５分間インキュベートする。その後、細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、５００μＬの氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．５、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウムを補充）に再懸濁することにより３回洗浄し、その後、フローサイトメーターにより分析する。

【0151】

Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_１６−ＡＤＣに曝露された、またはフルオレセインタグ付けトラスツズマブに曝露されたＳＫＢＲ３細胞のＦＡＣＳ染色を比較すると、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−フルオレセイン−ＡＤＣにおける抗体の標的親和性が保存されていることが実証される。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を使用して、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＡＤＣの非特異的結合を分析する。

【0152】

（実施例２５）
モデルタンパク質へのＧ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８の結合
モデルタンパク質（赤色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙ）を、Ｃ末端でソルターゼ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ）により、およびＮ末端近くで追加のシステインより遺伝子修飾した。ｍＣｈｅｒｒｙの修飾コード配列を含むＤＮＡ断片を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した。
Ｃｙｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＰＥＴＧ−Ｈｉｓ６のコード配列（配列番号１）：
5’-ATGTGTGGTGGTAGCGGTGGTTCAGGTGGTTCTGGCGGTAGTGGTGGCAGCATGGTTAGCAAAGGTGAAGAGGATAATATGGCCATCATCAAAGAATTCATGCGCTTCAAAGTTCACATGGAAGGTAGCGTTAATGGCCACGAATTTGAAATTGAAGGTGAAGGCGAAGGTCGTCCGTATGAAGGCACCCAGACCGCAAAACTGAAAGTTACCAAAGGTGGTCCGCTGCCGTTTGCATGGGATATTCTGAGTCCGCAGTTTATGTATGGTAGCAAAGCCTATGTTAAACATCCGGCAGATATTCCGGATTACCTGAAACTGAGCTTTCCGGAAGGTTTTAAATGGGAACGTGTGATGAATTTTGAAGATGGTGGTGTTGTTACCGTTACACAGGATAGCAGCCTGCAGGATGGTGAATTTATCTATAAAGTTAAACTGCGTGGCACGAATTTTCCGAGTGATGGTCCGGTTATGCAGAAAAAAACCATGGGTTGGGAAGCAAGCAGCGAACGTATGTATCCGGAAGATGGCGCACTGAAAGGTGAAATTAAACAGCGTCTGAAGCTGAAAGATGGCGGTCATTATGATGCAGAAGTTAAAACCACCTACAAAGCCAAAAAACCGGTTCAGCTGCCTGGTGCATATAACGTTAACATCAAACTGGATATTACCAGCCACAACGAGGATTATACCATTGTGGAACAGTATGAACGTGCAGAAGGTCGCCATAGTACCGGTGGTATGGATGAACTGTATAAAGGTGGCAGTGGTGGATCTGGTGGCTCAGGCGGAAGCGGTGGTAGCCTGCCGGAAACCGGTGGTCTGAATGATATTTTTGAAGCCCAGAAAATCGAATGGCATGAACATCATCAC CATCACCACTAA-3’

【0153】

このＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＭＡ−Ｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にサブクローニングした。後者の構築物をＮｄｅｌおよびＢａｍＨ１で消化した。この消化産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、ｍＣｈｅｒｒｙのＤＮＡを含む断片を切り取り、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＤＮＡを抽出した。次いで、精製されたＤＮＡ断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＫ）を使用して発現ベクターｐＥＴ２８−ｃに連結した。続いて、挿入されたＤＮＡ配列の正確さを配列分析で検証した。タンパク質産生では、得られたプラスミド（ｐＣＩＳ−［Ｃ］−ｍｃｈｅｒｒｙ−［ＬＰＥＴＧ］）をコンピテントなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３細胞に形質転換した。細胞を増殖させて（ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、３７℃、５００ｍｌの振とうフラスコ）、０．４のＯＤ_６００にし、その後、タンパク質発現を１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導した。細胞を４時間後に遠心分離（６０００×ｇ、１５分間、４℃）により採取し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、０．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波処理により溶解した。細胞細片を遠心分離（３０，０００×ｇ、３０分間、４℃）により除去した。Ｃｙｓ−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＬＰＥＴＧ−Ｈｉｓ_６タンパク質の精製は、製造会社のプロトコールに従って、ニッケル−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル−ＮＴＡアガロース、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により実施した。タンパク質の収量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｅｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により定量し、組み換えタンパク質のサイズおよび純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検証した。

【0154】

続いて精製されたＬＰＥＴＧタグ付けｍＣｈｅｒｒｙ［１０μＭ］を実施例１６の異なる濃度のＨ_２Ｎ−Ｇ_５−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８［２０〜１００μＭ］と共に、増加濃度のソルターゼＡ［０．０６２〜０．６２μＭ］の存在下、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５中において２５℃で３．５時間インキュベートする。ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーまたはソルターゼＡが欠如している対照反応を並行して実施する。反応（２０μｌ）を、５μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加液（loading buffer）＋１０％ｗ／ｖのβ−メルカプトエタノール（Ｂｉｏｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加および熱処理（５分間、９５℃、６００ｒｐｍでの一定振とう）によって停止する。次いで試料を４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ Ｇｅｌｓ Ｂｉｏｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により１５０Ｖで３０分間電気泳動し、続いてゲルをクーマシーブルー染色に付した。カップリングの成功は、ｍＣｈｅｒｒｙより大きなサイズの生成物の出現に基づいて推定する。

【0155】

（実施例２６）
腫瘍細胞特異的アプタマーＤＭＬ−７によるＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８の機能化
ステップ１：１−（（３−アジドプロピル）アミノ）−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イルエチルカルボノ−トリチオエートの合成：
ＣＨ_２Ｃｌ_２（４４ｍＬ）中の２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（（（エチルチオ）カルボノチオイル）チオ）−２−メチルプロパノエート（２．４ｇ、７．４７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＥｔ_３Ｎ（１．２４９ｍＬ、８．９６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液に、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１５ｍＬ）中の３−アジドプロパン−１−アミン（０．８７９ｍＬ、８．９６ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を室温および不活性雰囲気下で６０分間かけて滴下により添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。最後に、反応混合物を、ＨＣｌ水溶液（１Ｍ、３×２０ｍＬ）、ｄｄＨ_２Ｏ（２×２５ｍＬ）およびＮａＨＣＯ_３飽和水溶液（２０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、揮発物を減圧下で除去した。残留した橙色の油状物（２．２５ｇ、７．３４ｍｍｏｌ、９８％）を、さらに精製することなく使用した。標記化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0156】

ステップ２：ＲＡＦＴ−ＤＭＡ−Ｎ_３プレポリマーの合成
標記化合物の合成は、実施例１３、ステップ５のプレポリマー合成の一般的プロトコールに従い、１−（（３−アジドプロピル）アミノ）−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イルエチルカルボノトリチオエートを出発材料として使用して達成した。標記化合物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0157】

ステップ３：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−Ｎ_３の合成
標記化合物の合成は、ＲＡＦＴ−ＤＭＡ−Ｎ_３プレポリマーを出発材料として使用し、実施例１３、ステップ７の一般的プロトコールに従って達成した。標記化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0158】

ステップ４：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３の合成
標記化合物の合成は、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−Ｎ_３およびフルオレセイン−ＮＨＳを出発材料として使用し、実施例１５のアミン反応性活性剤についての一般的プロトコールに従って達成した。標記化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0159】

代替的合成：
フルオレセインを含むＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成は、ＲＡＦＴ試薬としてＲＡＦＴ−ＤＭＡ−Ｎ_３プレポリマーおよび共主要モノマーとしてＡＫ−フルオレセイン−Ｖ２（８．０当量）を使用して、共主要モノマーの共重合についての一般手順（実施例１３、ステップ７）を介して達成することができる。

【0160】

ステップ５：アプタマーＤＭＬ−７−［Ｃ６］−ＮＨ_２の合成
転移性前立腺がん細胞への特異性が知られているアプタマーＤＭＬ−７の修飾形態（Duan et al. (2016) Oncotarget 7(24): 36436）を、固相（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）に合成した。
5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGTTGGGG
TCGGGCATGCGTCCGGAGAAGGGCAAAC
GAGAGGTCACCAGCACGTCCATGAG-3’（配列番号２）-[C6]-NH₂
６炭素原子スペーサーおよび反応性アミノ基を付加して、機能化を容易にした。その後、アプタマーの凍結乾燥粉末を（緩衝剤）により室温で２時間再水和した。続いて、溶液を９５℃で１０分間加熱し、次いで、一晩かけて室温に冷まして、正確な三次元立体構造を得た。

【0161】

ステップ６：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３へのＤＭＬ−７−［Ｃ６］−ＮＨ_２アプタマーのカップリング
ＤＮＡアーゼ無含有ＰＢＳ緩衝剤中のＤＭＬ−７−［Ｃ６］−ＮＨ_２（１．０当量、ステップ５で調製）の溶液に、ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（１．５当量）を加える。反応混合物を、アプタマーアミンの完全な変換が観察（ＬＣ−ＭＳ）されるまで室温で混合する。続いて、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３（２．０当量）を加え、アルキン−アプタマー中間体の完全な変換が観察されるまで反応させる。次いで混合物を、溶出剤として水（＋０．０１％のＮａＮ_３）を用いるセミ分取（semi-preparative）ＧＰＣにより精製する。所望の生成物を含有する精製画分を、脱塩カラム（ＰＤ１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎ）で脱塩する。続いて、所望の生成物を凍結乾燥して、白色の粉末を得る。

【0162】

得られたアプタマー含有Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８を電気移動度シフトアッセイ（electromobility shift assay）（ＥＭＳＡ）により分析する。この分析では、１８μＬの後者コポリマーの貯蔵溶液［ＥＭＳＡ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、７５ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００、５％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．２ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中の０．３ｍｇ／ｍＬ］に、２μＬの５×核酸試料緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を加える。続いて、試料を１．５％のアガロースゲルにより電気泳動する（ＵＶ染色用に０．２５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム、１×ＴＡＥ緩衝剤を補充、１３５Ｖ、３５分間）。ＤＭＬ−７アプタマーおよびＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３は対照としての機能を果たす。バンド移行におけるシフトにより、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８部分への共有結合に起因したアプタマーの分子量の増加が明らかに確認される。

【0163】

（実施例２７）
オキシム機能化ポリマー担体の合成
ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチル（６，６−ジメチル−７，１２−ジオキソ−４−チオキソ−３，５−ジチア−８，１１−ジアザトリデカン−１３−イル）オキシカルバメート（ＲＡＦＴ−ＥＤＡ−オキシム−ＢＯＣ）の合成
ＣＨ_２Ｃｌ_２（４０ｍＬ）中の２−（（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）オキシ）酢酸（４８６ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＨＯＢｔ水和物（４６７ｍｇ、３．０５ｍｍｏｌ）およびＮ１−（（エチルイミノ）メチレン）−Ｎ３，Ｎ３−ジメチルプロパン−１，３−ジアミン塩酸塩（５１１ｍｇ、２．６７ｍｍｏｌ、１．０５当量）をＮ_２下、０℃で加えた。得られた溶液を０℃で３０分間撹拌した。最後に、２−（２−（（（エチルチオ）カルボノチオイル）チオ）−２−メチルプロパンアミド）エタンアミニウム２，２，２−トリフルオロアセテート（９６６ｍｇ、２．５４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ−エチル−Ｎ−イソプロピルプロパン−２−アミン（２，２４ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ、５．２当量）を連続的に加え、反応混合物を０℃で１時間、次いで室温で一晩撹拌した。すべての揮発物を減圧下で除去し、残留物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に取った。有機混合物を、ＮＨ_４Ｃｌの飽和水溶液（３×４０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ_３の飽和水溶液（３×４０ｍＬ）、ｄｄＨ_２Ｏ（３×４０ｍＬ）およびブライン（４０ｍＬ）で連続的に洗浄した。有機相を乾燥し（Ｎａ_２ＳＯ_４）、すべての揮発物を減圧下で除去した。得られた黄色の固体残留物をＥｔ_２Ｏ（４０ｍＬ）に懸濁した。懸濁液をろ過し、フィルターケーキをＥｔ_２Ｏ（２×２０ｍＬ）、ｄｄＨ_２Ｏ（３×２０ｍＬ）およびＥｔ_２Ｏ（３×２０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥した。生成物を黄色の粉末（９００ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率７９％）として単離した。標記化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0164】

ステップ２：ＲＡＦＴ−ＤＭＡ−オキシム−ＢＯＣプレポリマーの合成
標記化合物の合成は、実施例１３、ステップ５のプレポリマー合成についての一般的プロトコールに従い、ＲＡＦＴ−ＥＤＡ−オキシム−ＢＯＣを出発材料として使用して達成した。所望の生成物の構造をＭＳおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0165】

ステップ３：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−オキシム−ＢＯＣの合成
標記化合物の合成は、ＲＡＦＴ−ＤＭＡ−オキシム−ＢＯＣプレポリマーを出発材料として使用し、実施例１３、ステップ７の一般的プロトコールに従って達成した。標記化合物の構造をＧＰＣおよびＮＭＲ分光法により検証した。

【0166】

ステップ４：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−オキシム−ＢＯＣの合成
標記化合物の合成は、実施例１５のアミン反応性活性剤についての一般的プロトコールに従い、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−オキシム−ＢＯＣおよびＦＩＴＣを出発材料として使用して達成することができる。標記化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証することができる。

【0167】

ステップ５：Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−オキシムの合成
Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−オキシム−ＢＯＣを、ＢＯＣ脱保護についての一般手順（実施例１６）に従って脱保護する。

【0168】

ステップ６：アルデヒド−ＩｇＧへのＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−オキシムのカップリング
Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−オキシムを、文献（Dong et al. (2017) Angew Chem Int Ed 56: 1273）に記載されているように、酸化（ＮａＩＯ_４）ポリクローナル抗体ＩｇＧ（アルデヒドＩｇＧ）に共有結合的にカップリングさせることができる。所望の生成物の構造をＭＳにより検証することができる。

【0169】

（実施例２８）
モデルタンパク質へのＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３の結合
ステップ１：ｍＣｈｅｒｒｙモデルタンパク質のアルキン機能化：
脱ガスＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．５中の実施例２５のシステイン担持ｍＣｈｅｒｒｙモデルタンパク質（１．０当量）の溶液に、過剰量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（１００当量）を不活性雰囲気下で加える。得られた溶液を十分に混合し、ＤＭＳＯ中のジベンゾシクロオクチン−マレイミド（ＤＢＣＯ−マレイミド）の脱ガス溶液を不活性雰囲気下で加える前に、２０分間放置する。得られた反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで混合物を、溶出剤として水（＋０．０１％のＮａＮ_３）を用いるセミ分取ＧＰＣにより精製する。所望の生成物を含有する精製画分を、脱塩カラムを使用して脱塩して、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＢＣＯを得る。

【0170】

ステップ２：クリック化学を介したｍＣｈｅｒｒｙモデルタンパク質のＣｅｌｌｏｐｈｉｌ機能化：
ＰＢＳ緩衝剤、ｐＨ７．５中のｍＣｈｅｒｒｙ−ＤＢＣＯ（１．０当量）およびＣｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８−Ｎ_３（２．０当量、実施例２６、ステップ４で得た）の溶液を、室温で１６時間撹拌する。次いで混合物を、製造会社のプロトコールに従ってＮｉ^２＋ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー（ニッケル−ＮＴＡアガロース、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により精製する。（ｍＣｈｅｒｒｙはヘキサ−ヒスチジンタグを含む。）所望の生成物を含有する精製画分を、脱塩カラムを使用して脱塩して、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ（フルオレセイン）_８を得る。得られたタンパク質ポリマーコンジュゲートは、実施例２５に提示されたプロトコールおよび対照としてＣｙｓ−ｍｃｈｅｒｒｙ−ＬＰＥＴＧ−Ｈｉｓ_６（実施例２５を参照すること）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。クーマシー染色ゲルにおいて観察された対照と比較した生成物のサイズの増加は、タンパク質へのポリマーのカップリングが成功したことを示している。

【0171】

（実施例２９）
アザマイケルライゲーション戦略を利用したアミン修飾ＮＨ_２−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_８によるＨｅｒ２＋抗体（トラスツズマブ）における未変性リジン残基の機能化
トラスツズマブ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_１６の合成は、抗体の軽鎖にカップリングしているアミン求核剤としてＮＨ_２−Ｇ_ｎ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_８を使用し、Bernades, G. J. L.（J Am Chem Soc (2018) 140: 4004-）により開発されたプロトコールに従って達成される。これは、抗体分子１個あたり平均して１６個のドキソルビシン分子を含むＡＤＣ複合体をもたらす。トラスツズマブ（ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍｌ）はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ、ＵＫから得た。

【0172】

（実施例３０）
トラスツズマブ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_１６の抗がん有効性
トラスツズマブ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_１６（実施例２９を参照すること）の抗がん有効性は、以下のように検証することができる。

【0173】

実験は、ＳＫＢＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８のがん細胞系を使用して９６ウェルプレートで実施する。ＳＫＢＲ３細胞は、ヒト上皮増殖因子受容体２を過剰発現し（ＨＥＲ２＋）、一方、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞は、この受容体を発現しない（ＨＥＲ２−）。ウェルには、５，０００〜１０，０００個の細胞を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１．５ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＭＧ−３０、ＣＬＳ）を補充した、７５μＬのダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）に接種する。加湿インキュベーターにより３７℃および５％ＣＯ_２で１日インキュベートした後、２５μｌの増殖培地中のＡＤＣトラスツズマブ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_１６（実施例２９で調製）の段階希釈物をウェルに加える。ウェルにおける最終ＡＤＣ濃度は０．０２ｎｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬの範囲である（ＡＤＣ未変性細胞が陰性対照としての機能を果たす）。各希釈物を３連で試験する。比較する目的で、並行培養物は増殖培地中のトラスツズマブの段階希釈物を受ける。７２時間インキュベートした後、プレートをインキュベーターから取り出し、室温に平衡にする。およそ２０分後、細胞生存率を、製造会社の使用説明書に従って実施されるａＷＳＴ−１細胞増殖アッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によりアッセイする。アッセイの読み取り値は、４２０〜４８０ｎｍでの吸光度である。トラスツズマブ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＸ）_１６の抗がん有効性は、ＡＤＣ処理培養物、非処理培養物およびトラスツズマブ処理培養物においてそれぞれ測定された吸光度値を比較することによって推定される。ＳＫＢＲ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８から得た結果の比較は、ＡＤＣの標的特異性につての情報を提供する。

【0174】

（実施例３１）
フルオレセイン修飾共主要モノマーを使用するクリック反応性アジドＣｅｌｌｏｐｈｉｌ（フルオレセイン）_８の合成
ＡＫ−フルオレセイン（実施例１０）を、以下のプロトコールを利用して、アジド修飾ＲＡＦＴ剤（１−（（３−アジドプロピル）アミノ）−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イルエチルカルボノトリチオエート）によるＲＡＦＴ重合において共重合した。

【0175】

ＤＭＡ（０．９７ｍｍｏｌ、８０当量）およびＡＫ−フルオレセイン（０．０９７ｍｍｏｌ、８当量）を２ｍｌの乾燥ジオキサンに溶解し、Ｎ_３−ＲＡＦＴ［（１−（（３−アジドプロピル）アミノ）−２−メチル−１−オキソプロパン−２−イルエチルカルボノトリチオエート］（０．０１２ｍｍｏｌ、１当量）およびＡＩＢＮ（４．８５μｍｏｌ、０．４当量）を加えた。完全に溶解した後、重合を、６５℃に加熱することによって誘導した。重合は、６５℃での６時間のインキュベーションの後で完了した。続いて、反応混合物を室温に冷却し、コポリマーのＲＡＦＴ基を、実施例１３に提示されたプロトコールを使用して除去した。次いで、得られた混合物をｄｄＨ２Ｏで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液を凍結乾燥して、Ｎ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８を橙色の粉末（８５％）として得た。この化合物の構造をＮＭＲ分光法およびＧＰＣ分析により検証した（約１３ｋＤａのＭＷ、１．０８のＰＤＩ）。

【0176】

Ｎ_３−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（フルオレセイン）_８を、アルキン（例えば、ＤＢＣＯ）修飾がん細胞特異的標的化部分との銅無含有クリック反応に使用することができる。

【0177】

（実施例３２）
発癌性タンパク質を標的にするヨウ素負荷Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ抗体コンジュゲートの合成
広範囲の癌遺伝子に対するモデル抗体ポリマーコンジュゲートを生成するために、タンパク質ＢＭＩ−１を標的にする市販の抗体を選択した。ＢＭＩ−１（ポリコームリングフィンガー（polycomb ring finger）癌遺伝子）は、成人造血幹細胞、ならびに成人末梢および中枢神経系神経幹細胞の効率的な自己再生細胞分化にとって必要である。ＢＭＩ−１は、細胞周期阻害遺伝子であるｐ１６およびｐ１９を調節する癌遺伝子であると報告されている。ＢＭＩ−１の過剰発現は、膀胱、皮膚、前立腺、乳房、卵巣、結腸直腸などのいくつかのタイプのがん、ならびに血液系悪性腫瘍において重要な役割を果たすと思われる（Lessard J et. al. (2003). Nature 423 (6937): 255−60. doi:10.1038；Molofsky AV et. al. (2005). Genes Dev. 19 (12): 1432−7. doi:10.1101/gad.1299505）。

【0178】

放射性ヨウ素を負荷することができるＮＨ_２−ＧＧＧ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ［ＤＭＡ_４１／ＡＫ−フェノール_３］の合成は、実施例２０に提示されたプロトコールと同様であるが、ＡＫ−フェノール（３当量）と主要モノマーＤＭＡ（４１当量）のモル比を調整して実施した。得られたコポリマーの平均分子量（５．６ｋＤａ）および分子量分布（ＰＤＩ １．１８）が、ＬＣ−ＭＳおよびゲル浸透クロマトグラフィーにより記録された。透析およびフリーズドライにより精製した後、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーを、ソルターゼ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ）を含む完全長ヒトポリコームリングフィンガー癌遺伝子に対するＡｂＦｌｅｘ（商標）ＢＭＩ−１（モノクローナル）抗体に以下のプロトコールを使用してカップリングした。

【0179】

ＢＭＩ−１抗体［６μＭ］をＮＨ_２−ＧＧＧ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ［ＤＭＡ_４１／ＡＫ−フェノール_３］［１２０μＭ］と共に、［２μＭ］のソルターゼＡ（アミノ酸置換基Ｐ９４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｋ１９０ＥおよびＫ１９６Ｔを含み、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを含むソルターゼＡ５タンパク質［Ｓ．ａｕｒｅａｕｓ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０Ａ０７７ＵＮＢ８−１］、Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）の存在下、ＨＥＰＥＳベース反応緩衝液（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）中に３０℃で１時間インキュベートした。米国特許第９，２６７，１２７号。ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーまたはソルターゼＡが欠如している対照反応を並行して実施した。カルシウム依存性カップリング反応を、ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（２５０ｍＭ）の添加により最終の濃度の５ｍＭにして停止させ、試料を最終的に特徴付けするまで４℃で保管した。

【0180】

分析のため、抗体ポリマーコンジュゲートをＦａｂｒｉｃａｔｏｒ（登録商標）（Ｇｅｎｏｖｉｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）で消化した。［ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（ＩｄｅＳ）は、ヒンジの下にある特異的部位で抗体を消化し、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ／２断片の均質プールを生成するシステインプロテアーゼである］。消化は製造会社のプロトコールに従って実施した。続いて、切断生成物を、実施例２５のプロトコールを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。抗体のＦｃ／２バンドにおける高分子量へのシフトは、抗体へのＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーのカップリングが成功したことを示した。カップリング反応の効率を、陰性対照の残存（非修飾）Ｆｃ／２バンドと比較して半定量的に分析した。カップリング効率は約５０％であることが見出された。
カップリング生成物の詳細な特徴付けでは、ＩｄｅＳ消化抗体ＣｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲートのＬＣ−ＭＳ分析を、以下のプロトコールを使用して実施した。

【0181】

ＩｄｅＳ消化抗体Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲートの反応混合物をｄｄＨ_２Ｏで１０倍に希釈した。５μＬの得られた溶液をＬＣＭＳシステム（Ｇ６２３０ ＬＣ−ＭＳ ＴＯＦ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に注入し、水、イソプロパノール、ＡＣＮおよび０．１％ＦＡからなる溶出剤を用いるＣ８−ＨＰＬＣカラムを使用して分離した。続いて、クロマトグラムおよびスペクトルをＡｇｉｌｅｎｔのＭａｓｓｈｕｎｔｅｒソフトウエアソルーションを使用して解析した。クロマトグラムおよびスペクトルの分析は、コポリマーがｍＡＢの重鎖のみにカップリングすることを示した。

【0182】

Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ抗ＢＭＩ−１コンジュゲートに、実施例２１に提示されたプロトコールを使用してヨウ素放射性同位体を負荷して、標的がん療法のための抗体ポリマーコンジュゲートを生成することができる。一部の実施形態において、例えば、長い半減期を有するヨウ素同位体の場合では、ＡＫ−フェノール含有コポリマーの負荷を標的化抗体にカップリングする前に実施してもよい。

【0183】

（実施例３３）
ｍＴＧタグ（＝ＮＨ_２−ＰＥＧ_ｎ）−ＲＡＦＴ−ＢＯＣによるＣｅｌｌｏｐｈｉｌ（ＤＭＡ_ｎ／ＡＫ_ｍ）コポリマーの合成
以下の手順は、放射性同位体を結合するために共有結合キレート剤により機能化されうるＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成を説明している。ここに提示されているコポリマー（ｍＴＧタグ）−ＤＭＡ_３０／ＡＫ_８は、一般合成手順を例示する機能を果たす。コポリマーのサイズおよびコポリマーに含まれている機能化部位の数は、用いるモノマーのモル比を変えることで変更することができる。

【0184】

ｄｄＨ_２Ｏ中のＤＭＡ（１１６μＬ、１１２０μｍｏｌ、３０当量）およびＡＫ（６０ｍｇ、３００μｍｏｌ、８当量）の溶液に、ｔｅｒｔ−ブチル（６，６−ジメチル−７−オキソ−４−チオキソ−１１，１４，１７，２０，２３−ペンタオキサ−３，５−ジチア−８−アザペンタコサン−２５−イル）カルバメート（２２ｍｇ、３２．２μｍｏｌ、１．０当量）およびＶＡ０４４（３．６ｍｇ、１１．２μｍｏｌ、０．３当量）を連続的に加えた。反応混合物を６０℃で４時間撹拌した。次いで反応混合物をｄｄＨ_２Ｏおよびジオキサンで希釈した。この溶液に、ホスフィン酸（５０ｗ％、２７μＬ、１５８μｍｏｌ、５当量）、ＴＥＡ（２２μＬ、１５８μｍｏｌ、５当量）およびＡＩＢＮ（１．６ｍｇ、９．５μｍｏｌ、０．３当量）を連続的に加えた。反応混合物を７５℃で８時間撹拌した。次いで、得られた混合物をｄｄＨ_２Ｏで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ ＢＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ_５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ_８）を白色の粉末（１４０ｍｇ、１２０μｍｏｌ、２ステップで７８％）として得た。得られた化合物の構造を、ＮＭＲ分光法および以下のプロトコールを使用するＧＰＣにより検証した。３．３３ｍｇ／ｍＬのコポリマーの貯蔵溶液を、溶出緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ_３を含有する脱イオン水）で調製し、０．４５μｍシリンジフィルターでろ過した。続いて、０．４ｍＬの貯蔵溶液をＧＰＣ装置（１２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のポートに注入した。クロマトグラフィーを、溶出緩衝剤により一定流速の０．５ｍＬ／分で実施した。コポリマーの試料を、５５℃の外部カラムオーブンに設置されたＳｕｐｕｒｅｍａ３カラムシステム（プレカラム、１０００Å、３０Å；粒径５μｍ；ＰＳＳ、Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分離した。コポリマーをＲＩ（屈折率）およびＵＶ検出器により分析した。較正曲線（１０ポイント）を、プルラン標準を使用して確立した。特徴付けされたコポリマーの分子量を、この標準を参照することにより推定した。

【0185】

（実施例３４）
無水物ＤＯＴＡ／ＮＨＳ−ＤＯＴＡによるＣｅｌｌｏｐｈｉｌ［ＢＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ_５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ_８）］コポリマーの機能化
ｄｄＨ_２Ｏ中のＣｅｌｌｏｐｈｉｌ ＢＯＣ−ＮＨ−ＰＥＧ_５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ_８）（２０ｍｇ、３．４５μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＳＯ中の無水物ＤＯＴＡ（２５ｍｇ、３６μｍｏｌ）またはＮＨＳ−ＤＯＴＡ（２７ｍｇ、３６μｍｏｌ）の溶液を加え、３５℃で２４時間撹拌し、次いでこの溶液に３Ｍ ＨＣｌを加え、０℃に１時間加熱した。次いで、得られた混合物をｄｄＨ_２Ｏで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして、ＮＨ_２−ＰＥＧ_５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）を得た。得られた化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0186】

（実施例３５）
Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ［ＤＢＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ_５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）］の合成。
乾燥ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）中のＣｅｌｌｏｐｈｉｌ ＮＨ_２−ＰＥＧ５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）（３．６μｍｏｌ）、ＤＢＣＯ−ＮＨＳ（１８μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．２μｍｏｌ）の溶液を２５℃で２４時間撹拌した。次いで、得られた混合物を０．１Ｍの炭酸アンモニウムで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして、Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ ＤＢＣＯ−ＮＨ−ＰＥＧ５−（ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）を得た。反応をＧＰＣで追跡し、得られた化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0187】

（実施例３６）
Ｈｅｒ２受容体過剰発現がん細胞を標的にする診断薬および治療薬のための放射標識トラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ_４］_２コンジュゲートの合成
腫瘍診断では、原発性腫瘍またはその転移の検出限界が患者の生存率にとって重要であり、それは後期腫瘍が多くの場合に不十分な予後に関連するからである。がん細胞の検出と同様に後の治療における放射標識腫瘍組織特異的抗体の使用は、放射線医学（radio medicine）にとって潜在的に有望な方法である。しかし、この種の手法は低い信号対雑音比が妨げになっており、それは、わずかな放射性同位体のみが標的化部分／抗体に結合されうるという事実、および目的の放射性同位体が短い（通常、抗体の半減期より短い）半減期を有するという事実に起因している。したがって、放射性同位体のカーゴを増やすことがきわめて望ましい。この実施例には、改善された腫瘍細胞の検出および治療のために放射標識抗体Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲートが記載されている。

【0188】

実施例３３〜３５に提示された手順により合成されたＤＢＣＯ機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌポリマーを、Dennler et al. （Bioconjugate Chem. (2014) 25: 569 -578）により記載された手順により２９５位のグルタミン（Ｑ２９５）がアジド基で機能化されているＩｇＧタイプのがん細胞特異的抗体（例えば、Ｈｅｒ２＋がん細胞を標的にするトラスツズマブ）にコンジュゲートする。

【0189】

簡潔には、抗体をＰＮＧアーゼＦ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で脱グリコシル化する。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のトラスツズマブ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｔｄ、Ｂｅｒｋｓｈｉｒ、ＵＫ）１０μｇあたり１単位の酵素を含有する反応混合物を、Ｑ２９５を活性化するため、３７℃で一晩インキュベートする。続いて、ＰＢＳ（ｐＨ８）中の脱グリコシル化トラスツズマブ（６．６μｍ）をＮＨ_２−ＰＥＧ_５−アジド（８０モル当量）および微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧアーゼ）（６Ｕ／ｍＬ、Ｚｅｄｉｒａ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に３７℃で１６時間インキュベートする。インキュベートした後、ＭＴＧアーゼ活性を、ＭＴＧアーゼ反応停止剤（reactionstopper）（Ｚｅｄｉｒａ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の添加により遮断する。過剰ＮＨ_２−ＰＥＧ_４−アジド、ＭＴＧアーゼおよび残存ＰＮＧアーゼＦを除去するため、反応混合物を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ ４ｍＬカラム（１００ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＮＨ_４ＯＡｃ（０．５ｍ、ｐＨ５．５）に緩衝剤交換する（３回）。

【0190】

続いて実際のクリック反応は、トラスツズマブ−（ＮＨ−ＰＥＧ_５−アジド）_２を３倍モル過剰のＤＢＣＯ機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌポリマーと共に３７℃で３時間インキュベートすることによって実施して、トラスツズマブ−（Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＤＯＴＡ_４）_２を生じる。過剰ポリマーおよび非機能化トラスツズマブをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により除去し、完全機能化抗体を含有する画分をプールすることができる。

【0191】

１１１−ＩｎＣｌ_３による抗体Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲート（トラスツズマブ−（Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＤＯＴＡ_４）_２の１μｇあたり４ＭＢｑ）の放射標識を３７℃で１時間実施し、その後、インジウム−１１１標識抗体ポリマーコンジュゲートを、０．５ｍＬ／分の流速で実施するＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）のＳＥＣにより精製する。大ピーク画分をプールする。得られたトラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ−Ｉｎ−１１１）_４］_２を使用して、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）により、例えば、乳がん、結腸がん、または肺がんの患者において、従来の抗体放射性同位体複合体によって得ることができる感受性より高い感受性でＨｅｒ２＋がん細胞を検出することができる。感受性の増加は、Ｉｎ−１１１カーゴが従来の放射標識抗体と比較して増加していることに起因する。

【0192】

同じ手順を使用して、ルテチウム１７７などの適切な治療用放射性同位体が負荷された治療用抗体Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲートを調製することができる［上記に記載された手順に使用された１１１−ＩｎＣｌ_３を１７７−ＬｕＣｌ_３に置換する］。

【0193】

（実施例３７）
シクロアルキンＣｅｌｌｏｐｈｉｌ（ＤＯＴＡ_ｎ）−ＣＯ_２Ｈの合成
本開示のコポリマーをクリック反応性シクロアルキン基、例えばＤＢＣＯにより機能化するため、クリック反応性部分を、ＲＡＦＴ基の除去の際に組み込むことができる。
ステップ１−シクロアルキン開始剤の合成
ＤＢＣＯ修飾開始剤を、Ｕｌｂｒｉｃｈおよび同僚のプロトコール（Polym. Chem., 2014 5, 1340）に従って合成する。
ステップ２−ＲＡＦＴ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＣＯ_２Ｈコポリマーの合成：
ＲＡＦＴ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＣＯ_２Ｈコポリマーの合成は、実施例１３に記載された一般的プロトコール（ステップ６〜７のエチルＲＡＦＴ試薬から出発する）に従って達成される。
ステップ３−シクロアルキンＣｅｌｌｏｐｈｉｌ（ＤＯＴＡ_ｎ）−ＣＯ_２Ｈコポリマーの合成：
ＤＭＳＯ／ｄｄＨ_２Ｏ（１／１）中のＲＡＦＴ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＣＯ_２Ｈの溶液に、シクロアルキン含有開始剤（２０当量）を一度に加える。反応混合物を封止し、黄色が消滅するまで（４時間）７０℃で加熱する。そのうえ、反応の進行をＨＰＬＣによって追跡する。得られた溶液を室温に冷却し、ｐＨを、ｐ−ＮＣＳ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ−ＧＡ（Ｃｈｅｍａｔｅｃｈ）またはＤＯＴＡ−ＮＨＳ（コポリマーにおける反応性アミノ基１つあたり２当量）を加える前に８に調整する。混合物をｄｄＨ_２Ｏ（ＭＷＣＯ：５０００Ｄａ）で透析し、濃縮液を凍結乾燥し、ＮＭＲ分光法およびＳＥＣにより特徴付ける。

【0194】

（実施例３８）
Ｈｅｒ２受容体過剰発現がん細胞を標的にする治療薬のための放射標識トラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ_４］_４コンジュゲートの合成
実施例３３および３５に提示された手順により合成されたＤＢＣＯ機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌポリマーを、製造会社のプロトコールに従って使用した市販の酵素ベース修飾キット（ＳｉｔｅＣｌｉｃｋ（商標）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）により、重鎖１つあたり２つのアジド基で機能化されている（抗体１つあたり最大４つのアジド基の付加をもたらす）ＩｇＧタイプのがん細胞特異的抗体（Ｈｅｒ２＋がん細胞を標的にするトラスツズマブ（登録商標））にコンジュゲートした。

【0195】

トラスツズマブ−アジド_４におけるアジド基へのカップリングは、抗体のアジド基に対して１．５倍モル過剰のＤＢＣＯ−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーを使用し、実施例３６に提示されたプロトコールに従って実現した。カップリングの成功は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検証した。

【0196】

１７７−ＬｕＣｌ_３による放射標識［トラスツズマブ−（Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−ＤＯＴＡ_４）_４の１μｇあたり８ＭＢｑ］は、３７℃で１時間インキュベートすることによって実施し、その後、ルテチウム−１７７標識抗体ポリマーコンジュゲートを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）のＳＥＣにより精製する。得られたトラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ−Ｌｕ−１７７）_４］_４を使用して、Ｈｅｒ２過剰発現がん細胞を標的にし、破壊することができる。

【0197】

同じ手順を使用して、放射性同位体Ｌｕ−１７７を適切な診断用放射性同位体、例えばガリウム６８に置換して［上記に提示された手順において１７７−ＬｕＣｌ_３を６８−ＧａＣｌ_３に置換することにより］、診断用抗体Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコンジュゲートを調製することができる。

【0198】

（実施例３９）
ｍＴｇタグＣｅｌｌｏｐｈｉｌからの、Ｈｅｒ２受容体過剰発現がん細胞を標的にする診断薬および治療薬のための放射標識トラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ_８］_２コンジュゲートの合成
実施例３４のＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーを、基質としてコポリマーのＮＨ_２−ＰＥＧ_５基を使用して、トランスグルタミナーゼ媒介反応により、トラスツズマブのようなモノクローナル抗体に直接カップリングすることができる。このため、実施例３６のプロトコールを使用するが、ＮＨ２−ＰＥＧ_４−アジドをＮＨ_２−ＰＥＧ_５−ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８に置き換え、抗体の４０倍のモル過剰量で使用して１６個のキレート剤を有する抗体、すなわち、トラスツズマブ−［Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−（ＤＯＴＡ_８］_２を生成することが例外である。

【0199】

（実施例４０）
ＴＣＯ−Ｔｚクリック化学による標的化部分へのカップリングのための、テトラジン機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成
ステップ１：テトラジン−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの合成：
乾燥ＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）中の実施例３４のＣｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー（３．６μｍｏｌ）、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル２−（４−（６−メチル−１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）アセテート（１８μｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．２μｍｏｌ）の溶液を、２５℃で２４時間撹拌した。次いで、得られた混合物を０．１Ｍの炭酸アンモニウムで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして、テトラジン−Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ［ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８］を得た。反応をＳＥＣにより追跡し、得られた化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。

【0200】

（実施例４１）
テトラジン−歪みアルキン［４＋２］付加環化を利用する蛍光団修飾Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ−［ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）の合成
乾燥ＤＭＳＯ（０．５ｍＬ）中の実施例４０のテトラジン修飾Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマー（１．３μｍｏｌ）および（Ｅ）−６−アミノ−９−（２−カルボキシ−５−（（５−（（（シクロオクタ−４−エン−１−イルオキシ）カルボニル）アミノ）ペンチル）カルバモイル）フェニル）−４，５−ジスルホ−３Ｈ−キサンテン−３−イミニウム（１．３μｍｏｌ）の溶液を、２５℃で２４時間撹拌した。次いで、得られた混合物を０．１Ｍの炭酸アンモニウムで透析し（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）、濃縮液をフリーズドライして、ＡＦ色素４８８クリックＣｅｌｌｏｐｈｉｌを得た。反応をＧＰＣにより追跡し、得られた化合物の構造をＮＭＲ分光法により検証した。蛍光団標識Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌ誘導体を使用して、例えば、強力な読み取りシグナルが有益である血流内のコポリマーの半減期または腎排出を決定するために、薬力学的研究を実施することができる。

【0201】

（実施例４２）
ＴＣＯ修飾タンパク質へのＣｅｌｌｏｐｈｉｌテトラジン−［ＤＭＡ_３０／ＡＫ−ＤＯＴＡ_８）のカップリング
実施例４０のテトラジン機能化Ｃｅｌｌｏｐｈｉｌコポリマーの溶液（３当量）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解したトランスシクロオクテン（ＴＣＯ）修飾タンパク質［ＮＨ_２−ＰＥＧ_５−ＴＣＯをＮＨ_２−ＰＥＧ_５−アジドに置換して実施例３６に提示された方法と同様の方法によって調製することができる］（２つのＴＣＯ基を含む１当量）を撹拌下、室温で３時間かけて滴下により添加する。続いて未反応ポリマーを、１００ｋＤａのＭＷＣＯを有する膜を使用する透析により除去する。反応の成功をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣにより追跡する。

【0202】

（実施例４３）
ＡＫ−ＤＯＴＡの合成
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＡＫ（５０ｍｇ、２５０μｍｏｌ）およびＥｔ_３Ｎ（１０４μＬ、７４９μｍｏｌ）の溶液に、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ（ＨＰＦ_６／ＴＦＡ塩）（２００ｍｇ、２６２μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌し、綿のパッドでろ過した。ろ液をＭｅＣＮに沈殿させ、次いでろ過した。ケーキをＭｅＣＮで洗浄し、減圧下で乾燥して、白色の粉末（９５ｍｇ、６５％）を得た。この化合物を、重合の際にコポリマーへのキレート剤の指向組み込みに使用することができる。

【配列表】

2021523269000001.app

【国際調査報告】