特表 2021-523702 ヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体エピトープ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-523702(P2021-523702A)

(43)【公表日】2021年9月9日

(54)【発明の名称】ヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体エピトープ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/35 20060101AFI20210813BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210813BHJP

   C07K 16/08 20060101ALI20210813BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20210813BHJP

   C07K 14/015 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20210813BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20210813BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20210813BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20210813BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210813BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210813BHJP

   A61P 31/00 20060101ALN20210813BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/35ZNA

   C12N15/10 200Z

   C12N15/13

   C07K16/08

   C12Q1/6869 Z

   C07K14/015

   C12N15/864 100Z

   C12N15/63 Z

   C12N7/01

   A61K35/761

   A61P37/04

   A61K39/39

   A61K48/00

   C12P21/08

   A61P31/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2020-561751(P2020-561751)

(86)(22)【出願日】2019年5月6日

(85)【翻訳文提出日】2020年12月23日

(86)【国際出願番号】US2019030955

(87)【国際公開番号】WO2019213668

(87)【国際公開日】20191107

(31)【優先権主張番号】62/667,360

(32)【優先日】2018年5月4日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】508136375

【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】足立 圭

(72)【発明者】

【氏名】チャン，シャオ，ラン

(72)【発明者】

【氏名】中井 浩之

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ10

4B063QQ28

4B063QQ43

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR33

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QR79

4B063QS03

4B063QS05

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4B065AA95X

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA45

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB311

4C085AA03

4C085AA38

4C085DD86

4C085EE06

4C087AA01

4C087AA02

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB31

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA86

4H045EA31

4H045FA74

(57)【要約】

中和抗体のエピトープを含むヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープが提供される。このエピトープは、ヒト抗ＡＡＶ２又は他のＡＡＶ株由来カプシドポリクローナル抗体によって認識できる。エピトープのうちの１つ以上を変異させて、抗体中和を回避できるＡＡＶ２及び他のＡＡＶ株由来カプシドを形成してもよい。ヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープを同定する方法も提供される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のＡＡＶ株のＡＡＶカプシドタンパク質上の１つ以上のエピトープを同定する方法であって、
複数のＡＡＶカプシド変異体を準備する工程であって、各ＡＡＶカプシド変異体は第２のＡＡＶ株由来の改変されたカプシドタンパク質を含み、前記改変されたカプシドタンパク質は１つ以上の改変されたアミノ酸を含み、前記１つ以上の改変されたアミノ酸は前記第１のＡＡＶ株の前記ＡＡＶカプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸のうちの１つ以上に置換される、工程と、
前記複数のＡＡＶカプシド変異体を複数の抗体と反応させる工程であって、各抗体は、前記第１のＡＡＶ株の前記ＡＡＶカプシドタンパク質上の１つ以上のエピトープに結合する、工程と、
１つ以上の抗体に結合する前記ＡＡＶカプシド変異体を回収する工程と、
１つ以上の抗体に結合する前記ＡＡＶカプシド変異体を同定する工程と、を含む、方法。

【請求項2】

前記第１のＡＡＶ株がＡＡＶ２である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第２のＡＡＶ株がＡＡＶ９である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記第２のＡＡＶ株がＡＡＶ５である、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

１つ以上の抗体に結合する前記ＡＡＶカプシド変異体を回収することが、１つ以上の抗体に結合する前記ＡＡＶカプシド変異体を免疫沈降させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

各ＡＡＶカプシド変異体が、前記第１のＡＡＶ株の前記ＡＡＶカプシドタンパク質由来の５つの対応するアミノ酸によって置換される少なくとも５つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項7】

各ＡＡＶカプシド変異体が、前記第１のＡＡＶ株の前記ＡＡＶカプシドタンパク質由来の６つの対応するアミノ酸によって置換される少なくとも６つのアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項8】

各ＡＡＶカプシド変異体が、前記第１のＡＡＶ株の前記ＡＡＶカプシドタンパク質由来の１２の対応するアミノ酸によって置換される少なくとも１２のアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープを含むＡＡＶカプシド変異タンパク質であって、前記少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープは、少なくとも１つの改変されたアミノ酸を含む、ＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項10】

前記変異体ＡＡＶカプシドタンパク質が、抗体結合又は中和を回避するように構成されている、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項11】

請求項９又は１０に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質を含む、ＡＡＶベクター。

【請求項12】

請求項１１に記載のＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項13】

請求項９に記載の変異体ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする、核酸配列。

【請求項14】

請求項１３に記載の核酸配列を含む、プラスミド。

【請求項15】

前記少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープが、少なくとも２つの改変されたアミノ酸を含む、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項16】

前記少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープが、少なくとも３つの改変されたアミノ酸を含む、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項17】

前記少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープが、少なくとも４つの改変されたアミノ酸を含む、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項18】

前記少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープが、少なくとも５つの改変されたアミノ酸を含む、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項19】

少なくとも２つの改変されたカプシドエピトープを含み、各改変されたカプシドエピトープは、少なくとも１つの改変されたアミノ酸を含む、請求項９に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質。

【請求項20】

請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシド変異タンパク質を含む、ＡＡＶベクター。

【請求項21】

請求項２０に記載のＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項22】

エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３、エピトープ４、エピトープ５、エピトープ６、エピトープ７、エピトープ８、エピトープ９、又はエピトープ１０のうちの少なくとも１つから選択されるエピトープのアミノ酸配列中に１つ以上の変異を含む、ＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項23】

前記エピトープの前記アミノ酸配列がランダム化されている、請求項２２に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項24】

前記エピトープのアミノ酸配列における前記１つ以上の変異がＡＡＶｘ以外のＡＡＶ株に由来する、請求項２２に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項25】

ＡＡＶｘがＡＡＶ２である、請求項２２に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項26】

前記抗体エピトープのアミノ酸配列における前記１つ以上の変異がランダム化されている、請求項２５に記載のＡＡＶ２由来カプシド。

【請求項27】

前記エピトープのアミノ酸配列における前記１つ以上の変異がＡＡＶ２以外のＡＡＶ株に由来する、請求項２５に記載のＡＡＶ２由来カプシド。

【請求項28】

エピトープ中のアミノ酸配列における前記１つ以上の変異が、
エピトープ１：４３９−ＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤ−４６９（配列番号５）；
エピトープ２：６５０−ＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱ−６７２（配列番号６）；
エピトープ３：７００−ＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴ−７２８（配列番号７）；
エピトープ４：２４３−ＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ−２７１（配列番号９）；
エピトープ５：３２０−ＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴ−３３７（配列番号１０）；
エピトープ６：４９８−ＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬ−５１６（配列番号１１）；
エピトープ７：５２３−ＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦ−５３３（配列番号１２）；
エピトープ８：５３４−ＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴ−５６０（配列番号１３）；
エピトープ９：５７０−ＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮ−５９６（配列番号８）；あるいは
エピトープ１０：４０９−ＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳ−４２２（配列番号５２）のうち、少なくとも１つから選択される、請求項２２に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項29】

ＡＡＶｘがＡＡＶ２である、請求項２８に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項30】

前記ＡＡＶｘ由来カプシドが、抗体結合又は中和を回避するように構成されている、請求項２２〜２４又は２８のいずれか一項に記載のＡＡＶｘ由来カプシド。

【請求項31】

前記ＡＡＶ２由来カプシドが、抗体結合又は中和を回避するように構成されている、請求項２５〜２７又は２９のいずれか一項に記載のＡＡＶ２由来カプシド。

【請求項32】

請求項２２〜２９のいずれか一項に記載のＡＡＶｘ由来カプシドを含む、ＡＡＶベクター。

【請求項33】

治療的有効量の請求項３２に記載のＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項34】

請求項３３に記載の医薬組成物を含む、ワクチン。

【請求項35】

変異体エピトープ１アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドであって、前記変異体エピトープ１アミノ酸配列は、ＧＧＴＡＡＴＥ（配列番号１４）、ＴＱＥＡＲＰＧ（配列番号２０）、ＴＰＴＰＱＦＳ（配列番号２２）、ＴＬＥＰＬＩＴ（配列番号２４）、ＰＦＥＴＤＬＭ（配列番号２６）、ＬＱＥＡＨＬＴ（配列番号２８）、ＥＥＧＧＲＰＫ（配列番号２９）、ＥＧＤＧＧＣＬ（配列番号３１）、ＤＧＧＡＧＳＷ（配列番号３２）、ＡＥＧＧＧＧＧ（配列番号３４）、ＡＧＧＧＥＭＧ（配列番号３６）、ＧＥＡＡＡＰＡ（配列番号３７）、ＳＶＥＧＧＡＷ（配列番号３８）、又はＳＬＡＳＴＬＥ（配列番号４０）を含む、ＡＡＶカプシド。

【請求項36】

前記ＡＡＶ株がＡＡＶ２である、請求項３５に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項37】

前記ＡＡＶ株が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される、請求項３５に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項38】

前記ＡＡＶ株がカプシドエンジニアリング変異体である、請求項３５に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項39】

変異体エピトープ２アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドであって、前記変異体エピトープ２アミノ酸配列は、ＰＡＲＱＬ（配列番号１５）、ＰＲＰＶＱ（配列番号１９）、ＰＳＡＬＭ（配列番号２１）、ＡＤＳＬＬ（配列番号２３）、ＰＡＳＶＭ（配列番号２５）、ＰＲＰＬＭ（配列番号２７）、ＡＱＰＶＭ（配列番号３０）、ＳＥＫＱＬ（配列番号３３）、ＡＰＡＭＣ（配列番号３５）、ＤＲＲＬＬ（配列番号３９）、又はＴＬＰＭＫ（配列番号４１）を含む、ＡＡＶカプシド。

【請求項40】

前記ＡＡＶ株がＡＡＶ２である、請求項３９に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項41】

前記ＡＡＶ株が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される、請求項３９に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項42】

前記ＡＡＶ株がカプシドエンジニアリング変異体である、請求項３９に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項43】

変異体エピトープ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドであって、前記変異体エピトープ３アミノ酸配列は、ＳＶＤＧＮ（配列番号１６）を含む、ＡＡＶカプシド。

【請求項44】

前記ＡＡＶ株がＡＡＶ２である、請求項４３に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項45】

前記ＡＡＶ株が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される、請求項４３に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項46】

前記ＡＡＶ株がカプシドエンジニアリング変異体である、請求項４３に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項47】

前記ＡＡＶカプシドが、抗体結合又は中和を回避するように構成されている、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシド。

【請求項48】

請求項３５〜４６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶベクター。

【請求項49】

請求項４７に記載のＡＡＶカプシドを含む、ＡＡＶベクター。

【請求項50】

治療的有効量の請求項４８に記載のＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項51】

請求項５０に記載の医薬組成物を含む、ワクチン。

【請求項52】

治療的有効量の請求項４９に記載のＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物。

【請求項53】

請求項５２に記載の医薬組成物を含む、ワクチン。

【請求項54】

請求項３５〜４６のいずれか一項に記載のＡＡＶカプシドをコードする、核酸配列。

【請求項55】

請求項５４に記載の核酸配列を含む、プラスミド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願）
本出願は、２０１８年５月４日に出願された米国特許仮出願第６２／６６７，３６０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（連邦政府の資金提供による研究の記載）
本発明は、国立衛生研究所から支給された認可番号ＮＳ０８８３９９の政府援助により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

ウイルス中和抗体（ＮｔＡｂ）エピトープマッピングは、感染症の予防及び／又は治療のための新しいワクチン及び医薬品の開発を支援することができる。加えて、ウイルスＮｔＡｂエピトープマッピングは、遺伝子導入ベクターの開発を支援することができる。ウイルスＮｔＡｂエピトープの同定及びそれに関する知見は、宿主免疫応答が有効なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法に対する障害であり得るため、宿主免疫応答を回避できるウイルスベクター成分の遺伝子工学に役立ち得る。

【0004】

アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法のための有望なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターである。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子導入ベクターとしてＡＡＶを使用する際、臨床的に有益な結果のための大量のベクターの必要性、有効性を制限するウイルスタンパク質に対する宿主免疫応答、無差別なウイルス親和性、及びヒトに予め存在する抗ＡＡＶ中和抗体の確率などの、克服されるべき様々な問題が残っている。

【0005】

多くの天然に存在する血清型及びサブタイプが、ヒト及び非ヒト霊長類組織から単離されている（Ｇａｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，６３８１−６３８８（２００４）及びＧａｏ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９，１１８５４−１１８５９（２００２））。新たに同定されたＡＡＶ単離株の中でも、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）及びＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）は、これらの２種類の血清型由来の組換えＡＡＶベクターが、末梢を介した全身投与後に、肝臓、心臓、骨格筋、及び中枢神経系を含む様々な器官を高い効率で形質導入できるため、注目を集めている（Ｆｏｕｓｔ ＫＤ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７，５９−６５（２００９）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，ｓｕｐｒａ；Ｇｈｏｓｈ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５，７５０−７５５（２００７）；Ｉｎａｇａｋｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １４，４５−５３（２００６）；Ｎａｋａｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９，２１４−２２４（２００５）；Ｐａｃａｋ ＣＡ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ９９，ｅ３−ｅ９（２００６）；Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３，３２１−３２８（２００５）；及びＺｈｕ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１２，２６５０−２６５９（２００５））。

【0006】

ＡＡＶ８及びＡＡＶ９ベクターによる継続的な形質導入が、これらの細胞型の強い指向性、ベクターの効率的な細胞取り込み、及び／又は細胞内のビリオンシェルの急速な脱殻の要因であると推定されている（Ｔｈｏｍａｓ ＣＥ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８，３１１０−３１２２（２００４））。加えて、より良好な性能を有するカプシドエンジニアリングＡＡＶベクターの出現が、ベクターツールキットとしてのＡＡＶベクターの有用性を大幅に拡大している（Ａｓｏｋａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０，６９９−７０８（２０１２））。ＡＡＶベクターを介する遺伝子療法の概念実証は、ヒト疾患の多くの前臨床動物モデルで示されている。第Ｉ／ＩＩ相臨床試験が、なかでも、血友病Ｂ（Ｍａｎｎｏ ＣＳ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ １２，３４２−３４７（２００６）及びＮａｔｈｗａｎｉ ＡＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５，２３５７−２３６５（２０１１））；筋ジストロフィー（Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３，１４２９−１４３７（２０１１））；心不全（Ｊｅｓｓｕｐ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２４，３０４−３１３（２０１１））；失明に至る網膜症（Ｍａｇｕｉｒｅ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３７４，１５９７−１６０５（２００９））；α１アンチトリプシン欠乏症（Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２２，１２３９−１２４７（２０１１））；及び脊髄性筋萎縮症（Ｍｅｎｄｅｌｌ ＪＲ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３７７：１７１３−１７２２（２０１７））などの遺伝子疾患に対して始まっている、又は完了している。

【0007】

ＡＡＶベクターは、前臨床動物試験で広く使用されており、臨床安全性試験において検討されてきたが、現在のＡＡＶベクターを介する遺伝子導入システムは概して、より広範な臨床用途に最適ではないままである。ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質の配列は、特定のＡＡＶベクターの多数の特徴を定義する。例えば、カプシドタンパク質は、カプシド構造及び会合、Ｒｅｐ及びＡＡＰタンパク質などのＡＡＶ非構造タンパク質との相互作用、宿主体液及び細胞外マトリックスとの相互作用、ウイルスの血液クリアランス、血管透過性、抗原性、ＮｔＡｂに対する反応性、組織／器官／細胞型の指向性、細胞接着及び内部移行の効率、細胞内輸送経路、及びビリオンの脱殻速度などの特徴に影響する。更に、あるＡＡＶカプシドアミノ酸配列とＡＡＶベクターの特性との関係は予測不可能である。

【0008】

高い確率でヒトに予め存在する抗ＡＡＶ中和抗体によって、ＡＡＶベクターを介する遺伝子療法の成功に対して著しい障壁がもたらされる。ＮｔＡｂを回避できる「ステルス型」ＡＡＶベクターの開発に関心が集まっているが、このようなＡＡＶベクターの作成は、一般にＮｔＡｂエピトープに関するより包括的な情報に依存し、これらの情報は、動物及びヒト血清中に存在するポリクローナル抗ＡＡＶカプシド抗体のエピトープを容易かつ効率的にマッピングする方法が存在しないため、現在は限定されたままである。

【0009】

ＤＮＡバーコーディングしたＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅヘキサペプチド（ＨＰ）スキャニングカプシド変異体ライブラリが作製されており、ここでは、ＡＡＶ２由来ＨＰを他の血清型由来のもので置換されている。これらのライブラリを、抗ＡＡＶ１又はＡＡＶ９カプシド抗体を保有しているマウスに静脈内注入することで、マウス血清中の抗ＡＡＶ ＮｔＡｂｓに対するエピトープとしての、ＡＡＶ１カプシド中の４５２−ＱＳＧＳＡＱ−４５７（配列番号１）及びＡＡＶ９カプシド中の４５３−ＧＳＧＱＮ−４５７（配列番号２）同定につながっている（Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５（２０１４））。これらのエピトープは、カプシド上の３回対称軸の突起の一番高いピークに対応する。加えて、この領域はまた、同じｉｎ ｖｉｖｏ法を用いて、マウス抗ＡＡＶ７ ＮｔＡｂｓのエピトープとしても機能し得る。ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑと呼ばれる、配列ベースのハイスループット法は、数百の異なるＡＡＶ株の表現型の特徴確認を可能にでき、抗ＡＡＶ ＮｔＡｂエピトープマッピングに適用することができる。

【発明の概要】

【0010】

本明細書に開示される実施形態は、添付の図面と併用して、以下の記載及び添付の特許請求の範囲からより完全に明白となるであろう。これらの図面は、典型的な実施形態のみを描写しており、それらは、添付の図面を使用して追加の特異性及び詳細と共に記載されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】ＡＡＶ２ ｐＡの下流に１対の１２ヌクレオチド長のＤＮＡバーコード（ｌｔ−ＶＢＣ及びｒｔ−ＶＢＣ）を含有するＤＮＡバーコーディングしたＡＡＶゲノムのマップを示す。各ウイルスバーコード（ＶＢＣ）は、別々にＰＣＲ増幅され得る。この種のＤＮＡバーコーディングしたＡＡＶベクターゲノムを、本発明の発明者らの以前の研究、例えば、Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５：３０７５（２０１４）に公開されているもので使用した。

【図1B】ＤＮＡバーコーディングした二本鎖（ｄｓ）ＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂベクターゲノムのマップを示す。ｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂベクターゲノムは、１対の１２ヌクレオチド長のＤＮＡバーコード（ｌｔ−ＶＢＣ及びｒｔ−ＶＢＣ）を含有する０．６ｋｂのヒトＵ６核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーター駆動性非機能性非翻訳領域ＲＮＡ発現カセットを有する（Ｅａｒｌｅｙ ＬＦ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ９１（２０１７）．）。ベクターゲノムはまた、細菌ｌａｃＺ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）に由来するスタッファーＤＮＡも含有する。ｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂベクタープラスミドは、ＡＡＶベクター形質導入細胞内のＲＮＡバーコードとしてＤＮＡバーコードを発現するように設計された（Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（２０１４））。以下に提示されるものを含む我々の最近のＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ研究の多くは、ｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂ ＡＡＶベクターゲノムを使用している。

【図1C】ＡＡＶ９カプシドの二重アラニン（ＡＡ）スキャニング変位導入を示す。

【図1D】２アミノ酸間隔でのＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅカプシドのヘキサペプチド（ＨＰ）スキャニング変位導入を示す。

【図1E】ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ分析の手順を示す。各サンプルから得られたＰＣＲ産物に、ＰＣＲプライマーに取り付けたサンプル特異的バーコードを用いて印を付ける。これにより、多重ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングが可能になる。表現型値の差（ＰＤ）は、各血清型又は変異体について、表現型（受容体結合、形質導入、指向性、血液クリアランス、ＮｔＡｂへの反応性、血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）透過性など）に関する情報を提供する。

【図2】ＡＡＶ９由来ヘキサペプチド（ＨＰ）又はドデカペプチド（ＤＰ）がＡＡＶ２に由来するもので置換されている、ＡＡＶ９ＨＰスキャニング変異体及びＡＡＶ９ＤＰスキャニング変異体を示す。

【図3】ＡＡＶ５由来ドデカペプチド（ＤＰ）がＡＡＶ２に由来するもので置換されている、ＡＡＶ５ＤＰスキャニング変異体を示す。

【図4】ＩＰ−Ｓｅｑの手順を示す。

【図5】ＡＡＶ９−ＨＰライブラリを使用してヒト血清サンプル中に存在するポリクローナル抗ＡＡＶ２抗体の立体構造エピトープのマッピングの結果を示す。４つの異なるカットオフ値を使用して生成されたデータを比較する。この分析により、共通のヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体の立体構造エピトープが明らかになる。

【図6】ＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰ変異体の両方を含有するライブラリを用いてＩＰ−Ｓｅｑによって同定された、共通のヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体の立体構造エピトープを示す。

【図7】ＡＡＶ５−ＤＰ変異体ライブラリを用いてＩＰ−Ｓｅｑによって同定された、共通のヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体の立体構造エピトープを示す。

【図8】ＡＡＶ９−ＨＰ変異体ライブラリを用いてｉｎ ｖｉｖｏＰＫ−Ｓｅｑによって同定された、共通のヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル中和抗体の立体構造エピトープを示す。

【図9】ＡＡＶ９−ＤＰ変異体ライブラリを用いてｉｎ ｖｉｖｏＰＫ−Ｓｅｑによって同定された、共通のヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル中和抗体の立体構造エピトープを示す。

【図10】ヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル中和抗体−エスケープ変異体を同定するために使用した方法を示す。

【図11】ヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル中和抗体を含有するＧａｍｍａｇａｒｄ（静注用ヒト免疫グロブリン）の存在下又は非存在下における、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ１、及びＡＡＶ９ベクターのＣＨＯ−Ｋ１細胞形質導入能を示す。

【図12】２０μＬの血清サンプル又は１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９粒子を有するＩＶＩＧのプレインキュベートが、ＡＡＶ２に結合する抗体を保持しながらＡＡＶ９に結合する抗体を除去するのに十分であることを示しているＥＬＩＳＡデータを示す。

【図13-1】図１３は、ＡＡＶ２カプシドに対するものとして我々が同定したエピトープ、及び他のＡＡＶ血清型の潜在的エピトープ（ＡＡＶ１、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３）を示す。

【図13-2】図１３−１の続きである。

【図13-3】図１３−２の続きである。

【図13-4】図１３−３の続きである。

【図14】ＡＡＶ５−ＤＰ変異体を使用したＩＰ−Ｓｅｑが、ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を使用したＩＰ−Ｓｅｑが同定できない抗ＡＡＶ２抗体を含む、より多くのアミノ酸配列を同定できることを示す例である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

実施形態は、本明細書に概して記載されるように、例示的であることが容易に理解されるであろう。以下の種々の実施形態のより詳細な説明は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、単に種々の実施形態を代表するものに過ぎない。更に、本明細書で開示する方法のステップ又は操作の順序は、本開示の範囲から逸脱することなく、当業者によって変更され得る。換言すれば、ステップ又は操作の特定の順序が実施形態の適切な実施に必要とされない限り、特定のステップ／又は操作の順序／又は使用を変更してもよい。

【0013】

本開示は、変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法を提供する。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、第１のＡＡＶ株であるＡＡＶｘの野生型配列に対して「変異」又は「改変」されており、変異体ＡＡＶｘカプシドタンパク質は、少なくとも１つの改変されたカプシドエピトープを含み、この方法は、（１）複数のＡＡＶｘカプシド変異体を準備する工程であって、各ＡＡＶｘカプシド変異体が、１つ以上の改変されたアミノ酸を含み、各ＡＡＶｘカプシド変異体が、ウイルス特異的バーコードを用いて印付けられている、工程と、（２）複数のＡＡＶｘカプシド変異体を複数の抗体と反応させる工程であって、各抗体が、ＡＡＶカプシドタンパク質上の１つ以上のエピトープに結合する、工程と、（３）１つ以上の抗体に結合するＡＡＶｘカプシド変異体を回収する工程と、（４）１つ以上の抗体に結合するＡＡＶｘカプシド変異体を同定する工程と、を含む。変異体ＡＡＶカプシドは、抗体結合又は中和を回避するように構成され得る。

【0014】

遺伝子を指すとき、用語「野生型」は通常の意味で使用され、動物種、細胞、又はウイルス株における対応する遺伝子と同じタンパク質コードヌクレオチド配列を有する遺伝子として定義される。多型である遺伝子配列については、「野生型」は、動物種、細胞、又はウイルス株における遺伝子の最も一般的な形態の配列を指す。養母「野生型」はまた、アミノ酸配列がそのタンパク質のアミノ酸配列の最も一般的な形態と同一であるタンパク質と関連して使用され得る。特定の株、例えば、ＡＡＶ株と関連して使用される場合、「野生型」は、その株における特定のタンパク質の最も一般的なアミノ酸配列を指す。用語「変異体」又は「変異された」もまた通常の意味で使用され、動物種、細胞、又はウイルス株における対応する野生型遺伝子と同じタンパク質コードヌクレオチド配列を有さない遺伝子として定義される。変異は、（１）１つ以上のヌクレオチドにおける変更であって、特にその変化がヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を改変する、変更、（２）１つ以上のヌクレオチドの欠失、又は（３）１つ以上のヌクレオチドの挿入、のうち、１つ以上であり得る。用語「改変された」は、野生型とは異なるヌクレオチド又はタンパク質配列を用いて合成的に生成されたヌクレオチド又はタンパク質を示すために使用され得る。用語「変異体」はまた、遺伝子のコピー数、又はその発現を制御する要素のうちの１つ以上の改変も指し得る。

【0015】

特定の実施形態では、１つ以上の改変されたアミノ酸は、ランダム化又はランダムに決定される。他の実施形態では、１つ以上の改変されたアミノ酸は、ＡＡＶｘではない第２のＡＡＶ株に由来する。

【0016】

「ＡＡＶｘ」中の「ｘ」は、任意のＡＡＶ株（血清型、多様体、及びカプシドエンジニアリング変異体）を指し得る。特定の実施形態では、第１のＡＡＶ株のＡＡＶｘはＡＡＶ２である。かかる実施形態では、複数の抗体は、抗ＡＡＶ２カプシド抗体を含み得る。他の実施形態では、第１のＡＡＶ株のＡＡＶｘはＡＡＶ９である。複数の抗体は、抗ＡＡＶ９カプシド抗体を含み得る。

【0017】

変異体ＡＡＶカプシドタンパク質を同定する方法の特定の実施形態では、（３）１つ以上の抗体に結合するＡＡＶｘカプシド変異体を回収する工程は、１つ以上の抗体に結合するＡＡＶｘカプシド変異体を免疫沈降させることを含む。実施例は以下に提供される。

【0018】

本明細書に記載される方法の工程（４）である、ウイルス特異的バーコードを用いて印付けられており、かつ、１つ以上の抗体に結合するＡＡＶｘカプシド変異体の同定は、本明細書に記載されるように、又は、別の次世代ＤＮＡシーケンシング（ＮＧＳ）又は別のハイスループットシーケンシングを用いて行うことができる。

【0019】

本開示はまた、上記の方法を用いて同定される変異体ＡＡＶカプシドの産生；かかる変異体ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶベクター；かかるＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、医薬組成物；かかる変異体ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；並びに、かかる核酸配列を含むプラスミド及びウイルスゲノムなどの遺伝子構築物についても提供する。本明細書に記載のＡＡＶベクターを使用して、例えば、遺伝子療法のために哺乳類細胞に遺伝子を導入してもよい。医薬組成物は、遺伝子療法に、ワクチンとして、又は他の治療目的に使用され得る。

【0020】

本開示はまた、治療的有効量の１つ以上の本明細書に記載のＡＡＶ由来カプシドと、医薬的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む、遺伝子導入ベクター製品を提供する。ＡＡＶ由来カプシドは、ＡＡＶ２由来であってよい。

【0021】

本明細書で提供される遺伝子導入ベクター製品及びワクチンは、薬学的有効量の少なくとも１つの本明細書に記載のＡＡＶ由来カプシド又は新規ＡＡＶカプシドを含み、当該技術分野において既知の好適なアジュバント、賦形剤、担体及び／又は安定剤を利用して、１つ以上の遺伝子を標的細胞若しくは組織に導入する、又は、接種用として、抗体の産生を刺激することによって、疾患に対する免疫応答を示すことができる。本発明において有用な賦形剤、担体及び／又は安定剤は従来のものであり、緩衝剤、安定剤、希釈剤、防腐剤、及び可溶化剤を含んでもよい。一般に、担体又は賦形剤の性質は、使用される特定の投与方法に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、溶剤として、水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的かつ生理学的に許容可能な流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、又はカプセル剤）については、従来の非毒性固体担体として、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、又はステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤、及びｐＨ緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウム又はモノラウリン酸ソルビタンを含有することができる。

【0022】

ワクチンに含まれるアジュバントは、鉱油系アジュバント、好ましくはフロイントの完全又は不完全アジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、好ましくはＩＳＡ、水中油型エマルションアジュバント、好ましくはＲｉｂｉアジュバント系、ムラミルジペプチドを含有するｓｙｎｔａｘアジュバント製剤、及びアルミニウム塩アジュバントからなる群から選択され得る。

【0023】

いくつかの実施形態では、アジュバントは、鉱油系アジュバント、特にＩＳＡ２０６（ＳＥＰＰＩＣ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））又はＩＳＡ５１（ＳＥＰＰＩＣ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ））であるか、又は、ＣｐＧ、イミダゾキノリン、ＭＰＬ、ＭＤＰ、ＭＡＬＰ、フラゲリン、ＬＰＳ、ＬＴＡ、コレラ毒素、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、サポニン、ＱＳ２１、ＩＳＣＯＭ、ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＭＦ５９、アダマンタン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及びサイトカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明による組成物、ワクチン及び／又は遺伝子導入ベクターは、２つ以上の、好ましくは２つのアジュバントの組み合わせを含む。

【0024】

用語「治療的有効量」又は「薬学的有効量」は、そのような治療を必要とする対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与されるとき、以下に定義する治療をもたらすのに十分な量を指す。治療的又は薬学的有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などによって異なり、当業者によって容易に決定することができる。例えば、本明細書に記載されるＡＡＶ２由来カプシドの「治療的有効量」又は「薬学的有効量」は、対象（例えば、ヒト）において免疫応答を生じさせるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、対象における関連するカプシドに対してＡＡＶカプシド中和抗体を増やすのに十分である。

【0025】

スキャニングペプチドの長さは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０などの任意の長さであってもよい。特定の実施形態では、スキャニングペプチドは、長さ６〜１２個のアミノ酸である。特定の実施形態では、各ＡＡＶｘカプシド変異体は、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも１２個、又は６〜１２個の改変されたアミノ酸を含む。

【0026】

本開示はまた、エピトープ１、エピトープ２、エピトープ３、エピトープ４、エピトープ５、エピトープ６、エピトープ７、エピトープ８、エピトープ９、又はエピトープ１０のうちの少なくとも１つから選択されるエピトープのアミノ酸配列中に１つ以上の変異を含むＡＡＶｘ由来カプシドも提供する。変異したエピトープアミノ酸配列はランダム化されてもよい。あるいは、変異したエピトープアミノ酸配列は、ＡＡＶｘ以外のＡＡＶ株に由来してもよい。特定の実施形態では、ＡＡＶｘはＡＡＶ２である。

【0027】

特定の実施形態では、ＡＡＶｘ由来カプシドは、エピトープ１：４３９−ＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤ−４６９（配列番号５）；エピトープ２：６５０−ＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱ−６７２（配列番号６）；エピトープ３：７００−ＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴ−７２８（配列番号７）；エピトープ４：２４３−ＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨ−２７１（配列番号９）；エピトープ５：３２０−ＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴ−３３７（配列番号１０）；エピトープ６：４９８−ＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬ−５１６（配列番号１１）；エピトープ７：５２３−ＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦ−５３３（配列番号１２）；エピトープ８：５３４−ＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴ−５６０（配列番号１３）；エピトープ９：５７０−ＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮ−５９６（配列番号８）；又はエピトープ１０：４０９−ＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳ−４２２（配列番号５２）のうち少なくとも１つから選択されるエピトープのアミノ酸配列中に、１つ以上の変異を含む。ＡＡＶｘはＡＡＶ２であってもよい。本明細書で提供されるＡＡＶｘ由来カプシドは、抗体結合又は中和を回避するように構成され得る。

【0028】

本開示はまた、このようなＡＡＶｘ由来カプシドを含むＡＡＶベクター、及び、治療的有効量のこのようなＡＡＶベクターと、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む医薬組成物も提供する。ベクター及び医薬組成物は、遺伝子療法に、又はワクチンとして使用され得る。

【0029】

本開示はまた、変異体エピトープ１アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドも提供し、この変異体エピトープ１アミノ酸配列は、ＧＧＴＡＡＴＥ（配列番号１４）、ＴＱＥＡＲＰＧ（配列番号２０）、ＴＰＴＰＱＦＳ（配列番号２２）、ＴＬＥＰＬＩＴ（配列番号２４）、ＰＦＥＴＤＬＭ（配列番号２６）、ＬＱＥＡＨＬＴ（配列番号２８）、ＥＥＧＧＲＰＫ（配列番号２９）、ＥＧＤＧＧＣＬ（配列番号３１）、ＤＧＧＡＧＳＷ（配列番号３２）、ＡＥＧＧＧＧＧ（配列番号３４）、ＡＧＧＧＥＭＧ（配列番号３６）、ＧＥＡＡＡＰＡ（配列番号３７）、ＳＶＥＧＧＡＷ（配列番号３８）、又はＳＬＡＳＴＬＥ（配列番号４０）を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ株はＡＡＶ２である。特定の他の実施形態では、ＡＡＶ株は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される。ＡＡＶ株はまた、別の天然に存在するＡＡＶ多様体又はカプシドエンジニアリング変異体であってもよい。

【0030】

本開示はまた、変異体エピトープ２アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドも提供し、この変異体エピトープ２アミノ酸配列は、ＰＡＲＱＬ（配列番号１５）、ＰＲＰＶＱ（配列番号１９）、ＰＳＡＬＭ（配列番号２１）、ＡＤＳＬＬ（配列番号２３）、ＰＡＳＶＭ（配列番号２５）、ＰＲＰＬＭ（配列番号２７）、ＡＱＰＶＭ（配列番号３０）、ＳＥＫＱＬ（配列番号３３）、ＡＰＡＭＣ（配列番号３５）、ＤＲＲＬＬ（配列番号３９）、又はＴＬＰＭＫ（配列番号４１）を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ株はＡＡＶ２である。特定の他の実施形態では、ＡＡＶ株は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される。ＡＡＶ株はまた、別の天然に存在するＡＡＶ多様体又はカプシドエンジニアリング変異体であってもよい。

【0031】

本開示はまた、変異体エピトープ３アミノ酸配列を含むＡＡＶ株のＡＡＶカプシドも提供し、この変異体エピトープ３アミノ酸配列は、ＳＶＤＧＮ（配列番号１６）を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ株はＡＡＶ２である。特定の他の実施形態では、ＡＡＶ株は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶ１３からなる群から選択される。ＡＡＶ株はまた、別の天然に存在するＡＡＶ多様体又はカプシドエンジニアリング変異体であってもよい。

【0032】

特定の実施形態では、上記のＡＡＶカプシドは、抗体結合又は中和を回避するように構成され得る。

【0033】

本開示はまた、上記のＡＡＶカプシドのいずれかを含むＡＡＶベクター；治療的有効量のこれらのＡＡＶベクターの１つ以上と、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、担体、又は安定剤と、を含む医薬組成物；かかるＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；並びに、かかる核酸配列を含むプラスミド及びウイルスゲノムなどの遺伝子構築物も提供する。本明細書に記載のＡＡＶベクターを使用して、例えば、遺伝子療法のために哺乳類細胞に遺伝子を導入してもよい。医薬組成物は、遺伝子療法に、ワクチンとして、又は他の治療目的に使用され得る。

【0034】

ＩＰ−Ｓｅｑ（免疫沈降後のＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ）の手順は、プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを用いて最適化されている。この手順は、２０１５年４月２４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７５３６号に記載されている。完全なＡＡＶ２粒子（Ａ２０）に対するマウスモノクローナル抗体によって認識されるＡＡＶ２カプシド中のエピトープは、ＩＰ−Ｓｅｑによってマッピングされている。ＡＡＶ２ベクターの静脈内注射によって免疫化されたマウスで生じたマウスポリクローナル抗体によって認識されるＡＡＶ２カプシド中のエピトープがマッピングされている。抗ＡＡＶ中和抗体−エスケープＡＡＶカプシド変異体の作製に対する戦略は、新たなＩＰ−Ｓｅｑデータに基づいて開発されてきた。

【0035】

ＰＫ−Ｓｅｑ（ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑによる薬物動態プロファイリング）は、ＡＡＶカプシド中和抗体エピトープを、各ＡＡＶ−ＨＰ又はＡＡＶ−ＤＰのＡＡＶ−バーコード−Ｓｅｑに基づく薬物動態学的プロファイリングによって同定できる手順である。この手順は、２０１５年４月２４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７５３６号に記載されている。簡潔に言えば、ＡＡＶ−ＨＰ又はＡＡＶ−ＤＰカプシド変異体のセットを含むＤＮＡ／ＲＮＡバーコーディングしたＡＡＶライブラリ、及び基準対照ＡＡＶ（例えば、ＨＰ又はＤＰスキャニング変異体と共にパッケージ化されたＤＮＡ／ＲＮＡバーコーディングされたｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリ）を、３７℃で１時間試験管中のヒト又は動物血清と共にインキュベートする。次に、ＡＡＶライブラリと各血清サンプルとの混合物をマウスに静脈内注入し、注射後１分、１０分、３０分、１時間、及び４時間の時点で血液サンプルを採取する。ＡＡＶウイルスゲノムＤＮＡを各サンプルから抽出し、ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ分析（Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５、３０７５（２０１４））にかけてＡＡＶライブラリに含まれる各ＡＡＶ株の血液クリアランス速度を決定する。

【0036】

そのＨＰ又はＤＰアミノ酸配列が抗ＡＡＶ中和抗体エピトープを含むＡＡＶ−ＨＰ又はＤＰ変異体は、抗ＡＡＶ中和抗体を含むヒト又は動物血清とプレインキュベートされると、血液クリアランスが加速される。

【0037】

時間及び労力が大幅に低減されたハイスループット様式で、少数の対象（例えば、組織培養及び実験動物）のみを使用して、数百の異なるＡＡＶ株（すなわち、天然に存在する血清型及び実験的に改変された変異体）の表現型の特性評価を可能にするＮＧＳ系の方法である、ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑが、最近確立されている（Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５、３０７５（２０１４））。この方法を使用して、血液クリアランス速度、形質導入効率、組織指向性、及び抗ＡＡＶ ＮｔＡｂに対する反応性が挙げられるが、これらに限定されない、生物学的側面を評価することができる。図１Ａ〜図１Ｅは、ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ法を概略的に示す。この方法の原理は以下の通りである。多くの異なるＡＡＶ株を含むライブラリストックが特定の種類のサンプル（例えば、細胞）に適用されるとき、ＡＡＶ集団の構成は、ＡＡＶ株のそれぞれがある状況下で正確に同一の生物学的特性を有する場合、元の入力ライブラリとサンプルから回収されたライブラリとの間で理論的には変化しない。しかしながら、一部の株が、他と比較して異なる生物学的特性（例えば、より速い血液クリアランス又はより効率的な細胞内部移行）を示す場合、入力ライブラリ（すなわち、ライブラリストック）と出力ライブラリ（すなわち、サンプルから回収されたライブラリ）との間の集団構成に変化が存在する。基本的な方法は、ＲＮＡ−Ｓｅｑ（Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １０，５７−６３（２００９））に用いられるものと同様の原理を使用する、入力ライブラリと出力ライブラリとの間の生物情報学的比較からなる。この方法は、異なるＡＡＶ株間の表現型差を株の統計学的特性の関数としての定量化を可能にすることができる。このような分析は、特有の短いＤＮＡバーコードで各ＡＡＶ株をタグ付けし、得られた集団にＩＬＬＵＭＩＮＡバーコードシーケンシングを適用することによって可能となる（Ｓｍｉｔｈ ＡＭ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １９，１８３６−１８４２（２００９））。

【0038】

ＡＡＶ ＤＮＡ／ＲＮＡバーコード−Ｓｅｑと呼ばれる、ＲＮＡバーコードを発現する一般的なバーコード−Ｓｅｑシステムが考案されている（Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２（２０１４））。このシステムでは、各ウイルス粒子が、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いているが、それ自体のカプシドに固有のＲＮＡバーコードに転写されるＤＮＡゲノムを含有する、ＡＡＶライブラリが作製される。このＲＮＡバーコードシステムであるＡＡＶ ＤＮＡ／ＲＮＡバーコード−Ｓｅｑは、抗ＡＡＶ ＮｔＡｂエピトープマッピングに用いられている。

【0039】

このシステムでは、ＨＰスキャニング変異体と共にパッケージ化されたＤＮＡ／ＲＮＡバーコードｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリを作製することができる。かかるＨＰ変異体は、抗ＡＡＶｘ ＮｔＡｂエピトープマッピングのためのＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅ−ＨＰスキャニング変異体（ｘ＝抗ＡＡＶ２ ＮｔＡｂと交差反応しないＡＡＶ２以外の任意の株）及び抗ＡＡＶ２ ＮｔＡｂエピトープマッピングのためのＡＡＶ９−ＨＰスキャニング変異体であり得る。ＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅ−ＨＰ変異体の構造を図１Ｃに示す。ＡＡＶ９−ＨＰ変異体は、ＡＡＶ９ ＨＰがＡＡＶ２カプシド由来のもので置換されているものである。

【0040】

ヘキサペプチド（ＨＰ）の代わりに、ドデカペプチド（ＤＰ）を、抗ＡＡＶｘ ＮｔＡｂエピトープマッピングのために同様に利用することもできる。図６及び図９に示すように、多くのＡＡＶ９−ＤＰ変異体の作製に成功している。

【0041】

出発血清型としてＡＡＶ９の代わりに、ＡＡＶ５を、抗ＡＡＶｘ ＮｔＡｂエピトープマッピングのために同様に利用することもできる。図７に示すように、多くのＡＡＶ５−ＤＰ変異体の作製に成功している。他の一般的な血清型よりもヒト集団において抗ＡＡＶ５抗体の存在率が低いため、ＡＡＶ５が、抗体エピトープマッピングのためのＨＰ及びＤＰスキャニングのための有望な基盤になる。

【0042】

ＩＰ−Ｓｅｑをベースとする方法は動物を必要とせず、多重ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングを使用して、複数のサンプルの抗体エピトープを一度にマッピングすることができる。ＩＰ−Ｓｅｑをベースとする抗ＡＡＶ抗体エピトープマッピングの手順は、以下の通りとしてよく、図４に簡単に説明する。まず、２５μＬの血清サンプル（抗ＡＡＶ ＮｔＡｂを含有）及び２０μＬのプロテインＡ／Ｇプラス−アガロース（ＳＡＮＴＡ ＣＲＵＺ、ｓｃ−２００３）を、回転装置上で、４℃で１時間、１．５ｍＬ容チューブ内で、ＰＢＳ中１００μＬの総体積でインキュベートしてよい。ＰＢＳで洗浄した後、ＤＮＡ／ＲＮＡバーコーディングしたｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリ及び免疫グロブリンでコーティングされたアガロースビーズを、総体積１００μＬのＰＢＳ中で混合し、次いで、回転装置上、４℃で一晩インキュベートしてよい。翌日、標準的なＩＰ手順を続け、上清及び免疫沈降物を回収し、Ｗａｋｏ ＤＮＡ抽出キット（例えば、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．から入手可能なＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）シリーズのキット）を使用してウイルスゲノムＤＮＡを抽出し、その後、サンプルをプロテイナーゼＫで処理してよい。

【0043】

後続の手順は、Ａｄａｃｈｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ５，３０７５（２０１４）に記載されているＡＡＶバーコード−Ｓｅｑに使用されるものと同様であってもよい。簡潔に述べると、左側及び右側のウイルスクローン特異的バーコード（図１Ａ〜１Ｅ中のｌｔ−ＶＢＣ及びｒｔ−ＶＢＣ）を、ＩＰ上清及び沈殿物から回収されたウイルスゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲ増幅してよい。ＰＣＲプライマーは、サンプル特異的なＤＮＡバーコードを用いて印付けすることができる。次いで、全てのＰＣＲ増幅産物を混合してプールし、このプールをＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングに供してもよい。ＩＬＬＵＭＩＮＡシーケンシングデータを生物情報学的に分析し、各サンプルにおけるＡＡＶライブラリの統計学的変化を検出することができる。この方法の原理は、他よりもサンプル免疫グロブリンに対する高い結合活性を有するウイルスクローンが、ＩＬＬＵＭＩＮＡバーコードシーケンシングによって、上清中で減少又は枯渇している一方で、沈殿物中に濃縮されているクローンとして検出できることである。そのようなクローンは、検査中の抗ＡＡＶ抗体のエピトープを担持している可能性があり、抗体によって標的化されたエピトープは、統計学的変化を示す特定のＡＡＶクローンのカプシドに組み込まれた異種ペプチドであり得る。１．５ｍＬ容チューブあたり、１×１０^７、１×１０^８、及び１×１０^９ｖｇが使用されてきた。一連のＩＰ−Ｓｅｑ手順では、ＩＰ沈殿物から回収されたＤＮＡのみから信頼性が高く再現可能な結果を得ることができる。

【0044】

本明細書では、ＩＰ−Ｓｅｑ手順を利用した。この手順では、野生型ＡＡＶ９（陰性対照）、並びに野生型ＡＡＶ２及びＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅヘパリン結合欠損変異体（陽性対照）に加えて、合計１５３のＡＡＶ９−ＨＰ変異体を含む、ＤＮＡバーコーディングしたＡＡＶ９−ヘキサペプチド（ＨＰ）スキャニングカプシド変異体ライブラリを作製した。各ＡＡＶ９−ＨＰ変異体は、野生型ＡＡＶ２カプシドの異なる領域由来の６つの連続するアミノ酸の置換を含有しており、ＡＡＶ２カプシド内の様々なＨＰ領域は、ほぼ天然の四次構造の異種ＡＡＶ９カプシド上に呈することができる。ＡＡＶ２カプシドのＨＰスキャニングを２つのアミノ酸間隔で実施し、１５３の重複するＨＰを作成した。これらＡＡＶ９−ＨＰ変異体は、ＡＡＶ２のカプシドとは異なるＡＡＶ２カプシドアミノ酸の大部分を包含する。ＡＡＶ９−ＨＰ−５８４−００００２及びＡＡＶ９−ＨＰ−５８６−００００２の産生は乏しかった。これらの２つの変異体は、ＡＡＶ２カプシド、５８５−ＲＧＮＲ−５８８のヘパリン結合部位にわたり、したがって、ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を使用する方法は、ヘパリン結合部位が抗体エピトープを構成するかどうかを判定することができない。この欠点は、以下に記載されるＡＡＶ９−ＤＰ変異体法を適用することによって克服することができる。

【0045】

ＩＰ−Ｓｅｑ手順は、（１）ＡＡＶ９−ＨＰライブラリ（ＤＮＡバーコーディングしたゲノムを含有するＡＡＶウイルス粒子）の、市販の試薬又は動物血清中に存在するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とのＩＰ；（２）免疫沈降物からのＤＮＡバーコーディングされたゲノムの抽出；及び（３）回収されたウイルスゲノムのＩＬＬＵＭＩＮＡバーコードシーケンシングと、後続の生物情報学的分析の工程を含み得る。最適化実験により、Ａ／Ｇプロテインでコーティングされた磁気ビーズの組み合わせ及び２％ＢＳＡによるブロッキングは、ライブラリクローンの結合を制限することなく非特異的結合を低下させるための最適条件であることが明らかになった。ＩＰ−Ｓｅｑ分析では、各変異体の試験サンプルへの結合の有無を、ＰＤ値に基づいて決定した。特定のＡＡＶ−ＨＰ又はＡＡＶ−ＤＰ変異体のＰＤが、ＡＡＶカプシド変異体ライブラリに含まれるＡＡＶ株の全てのうち極端な外れ値として同定されるとき、このような外れた変異体は、抗ＡＡＶカプシド抗体に結合するＡＡＶ−ＨＰ又はＡＡＶ−ＤＰ変異体とみなされる。極端な外れ値とは、（１）同じ種から得られた抗ＡＡＶカプシド抗体−陰性血清サンプルから得られた全てのＰＤ値の第３四分位値（Ｑ３）から、四分位範囲（ＩＱＲ）の２倍よりも高いＰＤ値を示すもの、（すなわち、＞Ｑ３＋２ＩＱＲ）；（２）＞Ｑ３＋３ＩＲＱ；（３）＞Ｍ（平均）＋２ＳＤ（標準偏差）、及び（４）＞Ｍ＋３ＳＤ、のうち、いずれかとして定義される。外れ値に対する４つの基準のうち、Ｑ３＋３ＩＱＲは最も厳密なカットオフであり、Ｍ＋２ＳＤは最も厳密ではないカットオフである。５つの最も一般的なエピトープのうち４つは、どの基準を使用しても、ＡＡＶ９−ＨＰ系ＩＰ−Ｓｅｑによって容易に同定できる（図５）が、ＰＫ−Ｓｅｑによって明確に同定され得るいくつかのエピトープは、Ｑ３＋３ＩＲＱを用いるとＩＰ−Ｓｅｑによって同定できなかった。例えば、Ｅｐ８が中和抗体エピトープであるとＰＫ−Ｓｅｑがはっきり示したにもかかわらず、Ｑ３＋３ＩＲＱカットオフを使用したとき、Ｅｐ８は、ＩＰ−Ｓｅｑによってエピトープとして同定できなかった。Ｍ＋２ＳＤカットオフを使用したとき、Ｅｐ８を容易に同定することができた。したがって、全ての後続のＩＰ−Ｓｅｑ実験にはＭ＋２ＳＤカットオフを選択した。

【0046】

Ｍ＋２ＳＤカットオフを選択したことにより、この選択がエピトープの同定力を増加できるにもかかわらず、Ｑ３＋３ＩＲＱカットオフを用いた同定と比較して、ＩＰ−Ｓｅｑ分析における偽陽性発見率（ＦＤＲ）が増える恐れがある。偽陽性信号及び偽陰性信号の可能性の識別を助けるために、我々が行ったＩＰ−Ｓｅｑ分析は、野生型基準対照（例えば、ＡＡＶ９又はＡＡＶ５）に対する、各変異体が抗体でコーティングされたビーズに結合する能力を示す２つの追加データ（全ＩＰ−Ｓｅｑデータ中のパネルＢ及びＣ（図５、図６、及び図７）を常に伴う。

【0047】

これらの２つの追加のデータセットにおいて、抗ＡＡＶ抗体−陰性ヒト血清サンプル（図５、図６、及び図７中のパネルＢ）、及びエピトープシグナルに対して陽性のサンプル（図５、図６、及び図７中のパネルＣ）を用いて、結合能を決定した。抗体−陰性サンプルにおいて〜１の相対結合効率を示すエピトープ（図５、図６、及び図７中のパネルＢ）、及び抗体エピトープ陽性サンプルにおいて１をはるかに超えるもの（図５、図６、及び図７中のパネルＣ）は、最も可能性の高い真のエピトープである。一方、偽陽性は、１に近い相対結合効率を示すものの中に含まれ得る。したがって、Ｅｐ４の上流のＮ末端領域で同定された陽性シグナルの一部又は多くは、真のエピトープを示していない場合があり、異なるＡＡＶ９変異体ライブラリを使用した２つの別個のＩＰ−Ｓｅｑ実験において再現されなかった（図５及び図６）。

【0048】

ＡＡＶ９−ＨＰ変異体ライブラリ及びＩＰ−Ｓｅｑ手順を使用して、完全なＡＡＶ２粒子に対するＡ２０マウスモノクローナル抗体の既知のエピトープに含まれるアミノ酸が同定され、この方法の原理が実証された。続いて、同じ方法を使用して、ポリクローナル抗ＡＡＶ２カプシド抗体のエピトープをＡＡＶ２免疫化マウスの血清中で同定した。同定されたエピトープには、複数の血清サンプルにおいて共通である、２６１−ＳＳＱＳＧＡ−２６６（配列番号３）（Ａ２０のエピトープと同じ）及び４５１−ＰＳＧＴＴＴ−４５６（配列番号４）を含む。

【0049】

ヒト血清の初期ＥＬＩＳＡスクリーニングは、多くの抗ＡＡＶ２抗体陽性ヒト血清サンプルも抗ＡＡＶ９抗体に対して陽性であることが示されている。このことは、いくつかの状況において、抗ＡＡＶ２抗体エピトープの有効なマッピングが、サンプルがＡＡＶ９に結合しない場合にのみ通常は可能であるため、ＩＰ−Ｓｅｑ手順をヒトサンプルに直接適用することを困難にし得る。この問題に対処するために、ヒト血清を過剰量のＡＡＶ９粒子と共にインキュベートし、その後その血清をＩＰ−Ｓｅｑに供する抗ＡＡＶ９抗体中和法が開発され、ＥＬＩＳＡにより確認されている（図１２）。したがって、ヒト血清をスクリーニングして、ＩＰ−Ｓｅｑと、ポリクローナルヒト抗体エピトープの同定に好適な血清サンプルを見出すことができる。ＩＰ−Ｓｅｑ手順は、立体構造抗ＡＡＶカプシド抗体エピトープのマッピング、及び将来的な抗ＡＡＶ中和抗体−エスケープ変異体の開発のための有効なアプローチであり得る。

【0050】

２０μμＬの、抗ＡＡＶ２及び抗ＡＡＶ９カプシド抗体の両方を有するヒト血清サンプル中に存在する抗ＡＡＶ９カプシド抗体活性を中和するのに十分なＡＡＶ９ウイルス粒子の量を決定するため、４つの異なる量のＡＡＶ９ベクター粒子、０ｖｇ、１×１０^９ｖｇ、１×１０^１０ｖｇ、又は１×１０^１１ｖｇと共に３７℃で１時間プレインキュベートしたヒト血清サンプル又はＩＶＩＧを用いて、抗ＡＡＶ２カプシド抗体ＥＬＩＳＡ及び抗ＡＡＶ９カプシドＥＬＩＳＡを実施した。サンプルとＡＡＶ９とのプレインキュベートは、ＥＬＩＳＡによって測定される抗ＡＡＶ２抗体力価に顕著な影響を及ぼさなかったが、抗ＡＡＶ９抗体レベルは、プレインキュベートに使用したＡＡＶ９ベクター粒子の量に依存して減少した。１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９とのプレインキュベートが、ヒト血清中に存在する抗ＡＡＶ９カプシド抗体を中和するのに十分であることが判明した。この結果を受けて、１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９を使用して抗ＡＡＶ９カプシド抗体活性を中和し、その後ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験で使用した。

【0051】

同じプレインキュベート法を確立し、ＡＡＶ５−ＤＰライブラリを用いるＩＰ−Ｓｅｑの使用に成功した。

【0052】

ＡＡＶ９−ＨＰ変異体ライブラリに加えて、ＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰライブラリも作製し、エピトープマッピングに使用した。ＤＰスキャニング法は、ＡＡＶ２カプシド由来の５８５−ＲＧＮＲ−５８８ヘパリン結合モチーフを有するＡＡＶ９変異体、すなわち、ＡＡＶ９−ＤＰ−５８２−００００２（Ｈ５８４Ｌ／Ｓ５８６Ｒ／Ａ５８７Ｇ／Ｑ５８８Ｎ／Ａ５８９Ｒ／Ｑ５９２Ａ）、ＡＡＶ９−ＤＰ−５８４−００００２（Ｈ５８４Ｌ／Ｓ５８６Ｒ／Ａ５８７Ｇ／Ｑ５８８Ｎ／Ａ５８９Ｒ／Ｑ５９２Ａ／Ｇ５９４Ａ／Ｗ５９５Ｄ）及びＡＡＶ９−ＤＰ−５８６−００００２（Ｓ５８６Ｒ／Ａ５８７Ｇ／Ｑ５８８Ｎ／Ａ５８９Ｒ／Ｑ５９２Ａ／Ｇ５９４Ａ／Ｗ５９５Ｄ／Ｑ５９７Ｎ）の産生を可能にする。この試験に使用されるＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰライブラリは、３３のＡＡＶ９−ＨＰ変異体と１９のＡＡＶ９−ＤＰ変異体を含んでいた。ＡＡＶ９−ＤＰ−５７８−００００２及びＡＡＶ９−ＤＰ−５８０−００００２の産生が乏しかったため、これら２つの変異体からデータを収集しなかった。

【0053】

ＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰ変異体ライブラリに加えて、図７で使用したＡＡＶ５−ＤＰライブラリを構築した。合計６８のＡＡＶ５−ＤＰ変異体カプシドを構築した（表４）。これらの中でも、１８の変異体は産生されないか、されても低力価であったため、ＡＡＶ５−ＤＰライブラリから除外した。

【0054】

ヒト血清中に存在する抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体の立体構造エピトープを構成し得る、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質中の短いアミノ酸配列が同定されている（ＩＰ−Ｓｅｑを使用）。ウイルス中和抗体ＮｔＡｂエピトープマッピングは、感染症の予防及び治療のための新しいワクチン及び医薬品の開発において役割を果たすことができる。エピトープマッピングはまた、宿主免疫系を回避できる新規遺伝子導入ベクターの開発においても役割を果たすことができる。多くの個体で共通の抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体エピトープを同定することにより、宿主免疫応答（有効なｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子療法に対する障害）を回避する新規ベクターの設計に役立ち得る。

【0055】

ペプチドスキャニングなどの従来の方法を使用した以前の研究では、限られた量のヒト抗ＡＡＶカプシドエピトープに関する情報しか得られなかった。しかしながら、ＩＰ−Ｓｅｑを使用して、ＡＡＶ２に感染している多くの個体で共通の５つのヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープ（Ｅｐ１、Ｅｐ２、Ｅｐ３、Ｅｐ４及びＥｐ５）を同定した。これらの共通エピトープに加えて、Ｅｐ６、Ｅｐ７、Ｅｐ８、Ｅｐ９、及びＥｐ１０も同定された。Ｅｐ６、Ｅｐ７、Ｅｐ８、Ｅｐ９、及びＥｐ１０は、Ｅｐ１、Ｅｐ２、Ｅｐ３、Ｅｐ４、及びＥｐ５よりも共通性は低いが、Ｍ＋２ＳＤカットオフのＩＰ−Ｓｅｑ又はＰＫ−Ｓｅｑのアッセイのうち少なくともいずれかにおいて、抗ＡＡＶ２カプシド抗体に対して陽性である３４例の個体のうちの少なくとも５例に見出すことができた（図５、図６、図７、図８、及び図９参照）。Ｅｐ１、Ｅｐ６、及びＥｐ１０内には、ＩＰ−Ｓｅｑ及びＰＫ−Ｓｅｑのエピトープヒートマップ（図５及び図８）においてギャップが存在するが、これらは、隣接エピトープ含有スキャニングペプチドがギャップ上に重なるため、それらを単一のエピトープとみなす。同定されたエピトープのＮ末端側に隣接する更なる５アミノ酸、及び同定されたエピトープのＣ末端側に隣接する更なる５アミノ酸を、エピトープの一部として特許請求することに留意されたい。ＤＰ

【化1】

（Ｅｐ３）を有するＡＡＶ５−ＤＰ−６５６−００００２が、ＤＰのＮ末端において基盤となるカプシドから１つのアミノ酸の違いのみを有することを見出した

【化2】

。また、ＨＰ

【化3】

（Ｅｐ７）を有するＡＡＶ９−ＨＰ−５２４−００００２が、ＨＰのＣ末端において基盤となるカプシドから１つのアミノ酸の違いのみを有することも見出した

【化4】

。抗原と抗体の接点は、複数のアミノ酸の接触を必要とするため、Ｅｐ３及びＥｐ７は、Ａ及びＤだけでなく、Ａ及びＤ残基に隣接するアミノ酸を、それぞれ三次又は四次構造において含有すべきである。したがって、特定されたエピトープの潜在的部分として、スキャニングペプチドの両側に隣接する５アミノ酸を含むことは妥当である。

【0056】

明示的には、Ｅｐ１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０として示されるアミノ酸配列はアミノ酸残基であり、これらは、抗体結合エピトープの形成に重要であるが、抗体結合部位の構成に必ずしも十分ではない。より明示的には、アミノ酸付加、欠失又は置換によって改変されるとき、Ｅｐ１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０中のアミノ酸配列は、抗ＡＡＶカプシド抗体に対するウイルスカプシドの結合能力の喪失をもたらす可能性がある。

【0057】

上述したように、以下の５つのエピトープ、Ｅｐ１、Ｅｐ２、Ｅｐ３、Ｅｐ４及びＥｐ５を同定した。これらは、ＡＡＶ２に感染している多くの個体で共通の、共通ヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープである。これらのエピトープのアミノ酸配列は以下の通りである。

【0058】

【化5】

下線を有する太字で示されるアミノ酸配列は、ＩＰ−Ｓｅｑ及びＰＫ−Ｓｅｑのいずれか又は両方によって同定されたエピトープであり、エピトープのＮ末端及びＣ末端のそれぞれに付加された追加の５アミノ酸は、上で説明したエピトープを含有し得るアミノ酸であることに留意されたい。

【0059】

抗ＡＡＶ２カプシド抗体を含有する３４のヒト血清サンプルのうち少なくとも５つで見出されたその他のヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープは、以下を含む。

【0060】

【化6】

【0061】

ＡＡＶ９−ＨＰ−５８２−００００２及びＡＡＶ９−ＨＰ−５８８−００００２を用いてその配列が決定されたＥｐ９は、実験であまり共通性がないことが見出されたが、この研究で使用した方法では、エピトープであるＥｐ９の実際の頻度の判定において結論がでなかった。これは、ＡＡＶ９−ＨＰ−５８４−００００２及びＡＡＶ９−ＨＰ−５８６−００００２変異体の産生が乏しかったため、エピトープに関する情報を提供することができなかったからである。

【0062】

とはいえ、この問題は、ＡＡＶ９−ＤＰ変異体を使用することによって部分的に解決されている（図６）。

【0063】

これらのアミノ酸領域（Ｅｐ１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０）は、ヒト抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体によって認識され得るエピトープである。これらの領域内のアミノ酸配列を最初にランダム化し、続いて、定向進化によって結合しなくなった抗体を選択する方法を使用することにより、抗体中和を回避できる新たなＡＡＶ２由来カプシドを作製することが可能であり得る。

【0064】

新たな抗体回避性ＡＡＶ２由来変異体カプシドを作製するための上記の定向進化法の原理を実証するために、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞において、ＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシドライブラリを使用した定向進化実験を実施した（図１０）。ＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシド変異体ライブラリは、ＡＡＶ２カプシドのＥｐ１、Ｅｐ２、又はＥｐ３エピトープ領域における７マー、５マー、及び５マーのペプチド配列がランダム化されている、多種多様な変異体を含んでいた。

【0065】

ＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシド変異体ライブラリを以下のように構築した。ＡＡＶ２Ｅｐ１カプシド変異体ライブラリ、ＡＡＶ２Ｅｐ２カプシド変異体ライブラリ、及びＡＡＶ２Ｅｐ３カプシド変異体ライブラリを、ＨＥＫ２９３細胞において独立して作製した。生成されたウイルス粒子から抽出されたウイルスゲノムＤＮＡのＥｐ１、Ｅｐ２、及びＥｐ３コード領域を、まず別々にＰＣＲ増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅアセンブリによってランダムに結合した。得られた組換えＤＮＡを使用して、ＨＥＫ２９３細胞でＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシド変異体ライブラリを作製した（図１０）。

【0066】

ＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシド変異体ライブラリを、まず、ＡＡＶ２を含む様々なＡＡＶ血清型に対する中和抗体を含有するＩＶＩＧと共にインキュベートした。次いで、ＩＶＩＧ処理したＡＡＶ２Ｅｐ１２３カプシド変異体ライブラリを、アデノウイルス５型の存在下でＨＥＫ２９３細胞に適用した。ＨＥＫ２９３細胞中の増幅ＡＡＶ変異体ウイルス粒子を回収し、ＨＥＫ２９３細胞での次のセレクションに使用した。合計４回のセレクションを行い、抗ＡＡＶカプシド抗体による中和に対して耐性を有するＡＡＶ２Ｅｐ１２３変異体を得た。

【0067】

この定向進化実験で、ＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ１が最も豊富である少なくとも１６のＡＡＶ２Ｅｐ１２３変異体を同定した（表４）。この変異体は、Ｅｐ３エピトープ位置において非天然アミノ酸配列を有する唯一の変異体であった。全ての他の変異体、ＡＡＶ２Ｅｐ１ｍｔ２〜ｍｔ１６は、Ｅｐ３エピトープ領域において野生型配列を有しており、Ｅｐ３領域が、Ｅｐ１又はＥｐ２領域ほどアミノ酸変化に対して寛容ではないことを示している。ＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ１は、Ｅｐ１のＧＧＴＡＡＴＥ（配列番号１４）、Ｅｐ２のＰＡＲＱＬ（配列番号１５）、及びＥｐ３のＳＶＤＧＮ（配列番号１６）を有している。

【0068】

抗体媒介性中和に対するＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔの回避能を、２回の個別のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養実験によって評価した。１×１０^９ベクターゲノム（ｖｇ）のＡＡＶベクター粒子（ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｌｕｃ又はＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ１−ＣＭＶ−ｌｕｃ）を、１０μＬの様々な濃度（１、３及び１０ｍｇ／ｍＬ）のＩＶＩＧと３７℃で１時間反応させ、ルミノメーターを使用してルシフェラーゼ活性を測定することによって、残りのウイルス感染性を評価した。ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｌｕｃ及びＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ１−ＣＭＶ−ｌｕｃは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期エンハンサー−プロモーターの制御下で、蛍ルシフェラーゼを発現するＡＡＶ２ベクターである。結果は、ＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔが、３及び１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧによる中和に対して、それぞれ約７倍及び約１１倍耐性であることを示した（図１１）。

【0069】

上記の定向進化法に加えて、この情報は、他の種類のＡＡＶカプシドエンジニアリングに利用することができる。ＩＰ−Ｓｅｑ及びＰＫ−Ｓｅｑ法は、ヒト抗ＡＡＶカプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープの同定のために、他のＡＡＶ血清型又は変異体に適用することができる。

【0070】

上述したように、バーコーディングしたヘキサペプチド（ＨＰ）又はドデカペプチド（ＤＰ）スキャニングライブラリをハイスループットで用いたウイルス中和抗体（ＮｔＡｂ）エピトープマッピングの原理実証は、ＡＡＶについて確立された。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用したＡＡＶ１、２、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３のＶＰタンパク質の配列アライメントによって、非ＡＡＶ２血清型由来のＡＡＶカプシドの抗ＡＡＶカプシド抗体エピトープである可能性が明らかとなる（図１３）。この情報は、様々な血清型由来の新規ＡＡＶカプシド、及びＮｔＡｂに対する耐性をより有するカプシド変異体の開発に利用することができる。

【実施例】

【0071】

以下の実施例は、開示される方法を例示するものである。本開示の見地から、当業者は、開示した方法のこれらの実施例の変形、及び他の実施例が、過度な実験をすることなく可能であることを理解するであろう。

【0072】

実施例１
５５３人分のヒト血清サンプルをＯｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ＆Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＯＨＳＵ）での血液検査によって採取し、ＥＬＩＳＡによる抗ＡＡＶ２カプシド抗体についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡによる高抗体価を示した最大３４人分のヒト血清サンプルを、ＩＰ−Ｓｅｑに供し、抗ＡＡＶ２カプシドポリクローナル抗体立体構造エピトープを決定した。

【0073】

実施例２
ＡＡＶ９−ＨＰスキャニング変異体と共にパッケージ化したＤＮＡ／ＲＮＡバーコーディングしたｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリを作製した（表１参照）。ｄｓＡＡＶ９−ＨＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂと呼ばれるこのライブラリは、１５３のＡＡＶ９−ＨＰ変異体（１つの変異体につき２つのクローン）、ＡＡＶ２（２つのクローン）、並びに２種類の基準対照、ＡＡＶ２Ｒ５８５Ｅ及びＡＡＶ９（それぞれ１５のクローン）を含有していた。ＰＩＥＲＣＥ（商標）プロテインＡ／Ｇ磁気ビーズを、ヒト血清サンプルとインキュベートし、抗ＡＡＶ２カプシド抗体でビーズをコーティングトした。次いで、抗ＡＡＶ２抗体でコーティングされたビーズを、ｄｓＡＡＶ９−ＨＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリと共にインキュベートした。標準的な免疫沈降手順により、ビーズに結合したＡＡＶクローンを沈殿させた。沈殿したウイルス粒子からウイルスＤＮＡを抽出し、ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ分析（Ａｄａｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ５：３０７５，２０１４．）に供した。全ての値を、ＡＡＶ９基準対照から得られた値で補正した。

【0074】

実施例３
ＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰスキャニング変異体と共にパッケージ化した別のＤＮＡ／ＲＮＡバーコーディングしたｄｓＡＡＶ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリを作製した（表２参照）。ｄｓＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂと呼ばれるこのライブラリは、３３のＡＡＶ９−ＨＰ変異体（１つの変異体につき２つのクローン）、１９のＡＡＶ９−ＤＰ変異体（１つの変異体につき２つのクローン）、ＡＡＶ２（５つのクローン）、及び１つの基準対照、ＡＡＶ９（１５のクローン）を含有していた。このライブラリを用いたＩＰ−Ｓｅｑ分析を、上記と同様に行った。

【0075】

実施例４
上述のｄｓＡＡＶ９−ＨＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂ及びｄｓＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリによるＩＰ−Ｓｅｑ法は、抗ＡＡＶ２カプシド抗体エピトープを同定することができる。しかしながら、ＩＰ−Ｓｅｑにより同定されたエピトープに結合する抗体がＡＡＶ感染の中和能を有するか否かについて判定することはできない。この欠点に対処するために、ｄｓＡＡＶ９−ＨＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂ又はｄｓＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂライブラリを使用したｉｎ ｖｉｖｏＰＫ−Ｓｅｑ法が開発された。このｉｎ ｖｉｖｏ法の概念は、２０１５年４月２４日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７５３６号に記載されている。５０μＬの抗ＡＡＶカプシド抗体含有サンプル（３種類の抗ＡＡＶ２カプシド抗体陽性ヒト血清サンプルと１０ｍｇ／ｍＬのＩＶＩＧ）又は抗体陰性対照サンプル（３種類の抗ＡＡＶ２抗体陰性ヒト血清サンプルとＰＢＳ）を、１×１０^１１ｖｇのＡＡＶ９−ＣＭＶ−ｌａｃＺ（２０μＬ中）と共に３７℃で１時間インキュベートし、抗ＡＡＶ９カプシド抗体活性を中和して、更に１×１０^９ｖｇのｄｓＡＡＶ９−ＨＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂ又はｄｓＡＡＶ９−ＨＰ＋ＤＰ−Ｕ６−ＶＢＣＬｉｂ（２０μＬ中）と共にもう１時間インキュベートした。ｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションの完了後、ＰＢＳ／５％ソルビトールを使用して、サンプル量を３００μＬにした。上記３００μＬの混合物を、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスに尾静脈からボーラスで注射した。血液サンプルを、注射１分、１０分、３０分、１時間、及び４時間後に採取し、ＡＡＶバーコード−Ｓｅｑ分析に供した。抗ＡＡＶ２カプシド抗体エピトープを有するＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰ変異体は、抗ＡＡＶ２カプシド抗体を含有しないサンプルと共にプレインキュベートした場合よりも、抗ＡＡＶ２カプシド抗体を含有するサンプルと共にプレインキュベートした場合の方が、極めて速く血流から消失した（図８及び図９）。サンプル当たり２例のマウスからデータを収集した。ＰＫ−Ｓｅｑ分析により、３つのヒトサンプル（ＩＤ３６５、ＩＤ４０２及びＩＤ４８１）で同定されたＥｐ５はエピトープを中和しないが、Ｅｐ１、Ｅｐ２、Ｅｐ３、Ｅｐ４、Ｅｐ８、及びＥｐ９はエピトープを中和することが明らかになった。更に、ＰＫ−Ｓｅｑは、ＩＰ−Ｓｅｑが同定できなかったエピトープ（例えば、サンプルＩＤ３６５及びＩＤ４８１中のＥｐ４及びＥｐ８）を同定することができた。したがって、ＰＫ−ＳｅｑはＩＰ−Ｓｅｑを補完し、抗体エピトープのより感受性の高い検出をもたらし、エピトープを中和する抗体と中和ない抗体を区別する。しかしながら、６つのＡＡＶ９−ＨＰ及び３つのＡＡＶ９−ＤＰ変異体は、マウスにおいて抗ＡＡＶ２抗体が存在していなくても、静脈内注入後に非常に急速に血液循環から消失した。これにより、これら９つの変異体のエピトープを評価することが困難になる。

【0076】

実施例５
抗ＡＡＶ９抗体も有する抗ＡＡＶ２カプシド抗体陽性ヒト血清サンプルを、ＡＡＶ９ウイルス粒子とのプレインキュベートにより予め除去し、サンプルから抗ＡＡＶ９ポリクローナル抗体を除去した（図１２）。図５に示すＩＰ−Ｓｅｑ分析では、４つの異なる基準を使用して、陽性（すなわち、ビーズに結合するＡＡＶ９−ＨＰ又はＡＡＶ９−ＤＰ変異体）を定義した。図５の一番上と上から２番目のパネルでは、抗体陰性サンプルから得られた、上位四分位値を超えて四分位範囲（ＩＱＲ）の２倍及び３倍超（＞Ｑ３＋２ＩＱＲ及び＞Ｑ３＋３ＩＱＲ）を示す値を、陽性（すなわち、ビーズに結合するＡＡＶ９−ＨＰ又はＡＡＶ９−ＤＰ変異体）とみなし、それぞれ黒色ボックスとして示す。図５の一番下と下から２番目のパネルでは、抗体陰性サンプルから得られた、平均値を超えて標準偏差の２倍及び３倍超（＞Ｍ＋２ＳＤ及び＞Ｍ＋３ＳＤ）を示す値を陽性とみなし、それぞれ黒色ボックスとして示す。多くのサンプルで共通する５つの共通エピトープ（Ｅｐ１、Ｅｐ２、Ｅｐ３、Ｅｐ４及びＥｐ５）が見出され、共通性は低いが、少なくとも５つのサンプルで共通している５つのエピトープ（Ｅｐ６、Ｅｐ７、Ｅｐ８、Ｅｐ９、及びＥｐ１０）も見出された。図５の上から６列は、抗ＡＡＶ２カプシド抗体ＥＬＩＳＡによって評価した抗ＡＡＶ２抗体を持たないヒト血清を示す。２つのＡＡＶ９−ＨＰ変異体、５１４−００００２及び５１６−００００２、並びに野生型ＡＡＶ２は、抗ＡＡＶ２カプシド抗体の非存在下で非特異的にＩＰビーズに結合でき、抗ＡＡＶ２カプシド抗体陰性ヒト血清サンプルによってバックグラウンドシグナルが高くなることが見出された（図５Ｂ）。高いバックグラウンドにより、真の陽性の検出力が犠牲になり得ることを考慮すべきである。ＡＡＶ９に対する各ＡＡＶ株（ＡＡＶ９−ＨＰ変異体及びＡＡＶ２陽性対照）の結合効率は、このデータが決定的な結論を提供しないものの、ＩＰ−Ｓｅｑデータを解釈するのに有用な情報を提供する（図５Ｃ）。つまり、高値（すなわち、１．０より有意に高い）は、真のエピトープであることを強く示すが、低値（すなわち、１．０に近い）の陽性は、必ずしも真のエピトープである可能性を排除するものではない。

【0077】

実施例６
ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を使用してＩＰ−Ｓｅｑにより同定できた共通エピトープはまた、ＡＡＶ９−ＤＰ変異体を用いてＩＰ−Ｓｅｑによっても同定された。ＡＡＶ９−ＤＰを用いるＩＰ−Ｓｅｑが、ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を用いるＩＰ−Ｓｅｑに対していくつかの利点を有することが見出された。第１に、ＡＡＶ２カプシド、５８５−ＲＧＮＲ−５８８のヘパリン結合部位を含有する４つのＡＡＶ９カプシド変異体のうち３つは、後続のＩＰ−Ｓｅｑ手順に十分なレベルで産生され得る。すなわち、５８５−ＲＧＮＲ−５８８を含有するＡＡＶ９−ＤＰ５８０−００００２、ＡＡＶ９−ＤＰ５８２−００００２、ＡＡＶ９−ＤＰ５８４−００００２、及びＡＡＶ９−ＤＰ５８６−００００２のうち、ＡＡＶ９−ＤＰ５８０−００００２のみの産生が乏しかった。第２に、ＡＡＶ９−ＤＰ変異体を使用するＩＰ−Ｓｅｑは、真のエピトープを同定するためのより良好な能力を有する。例えば、エピトープとしてＥｐ８を同定する際に、より高い感度が証明された。ヒトサンプルＩＤ４０２及びＩＤ４８１の明らかな中和抗体エピトープとして、Ｅｐ８がＰＫ−Ｓｅｑによって同定され（図８及び図９）。ＡＡＶ９−ＤＰを用いたＩＰ−Ｓｅｑはまた、Ｅｐ８がこれらのサンプルのエピトープであることを明らかにできた（図６）一方で、ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を用いたＩＰ−ＳｅｑはエピトープとしてＥｐ８を同定できなかった（図５）。

【0078】

実施例７
ＡＡＶ９−ＨＰ又はＡＡＶ９−ＤＰ変異体を使用してＩＰ−Ｓｅｑにより同定できた共通エピトープはまた、ＡＡＶ５−ＤＰ変異体を用いてＩＰ−Ｓｅｑによっても同定された（図７）。ＡＡＶ５−ＤＰ法が、ＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰ法により同定できなかったエピトープを同定できたことで、ＡＡＶ５−ＤＰ変異体法がＡＡＶ９−ＨＰ及びＡＡＶ９−ＤＰ変異体法を補完することが見出された。例えば、ＡＡＶ５−ＤＰ−２３５−００００２、ＡＡＶ５−ＤＰ−２３７−００００２、ＡＡＶ５−ＤＰ−２３９−００００２、ＡＡＶ５−ＤＰ−２４１−００００２、ＡＡＶ５−ＤＰ−２４３−００００２、ＡＡＶ５−ＤＰ−２４５−００００２、及びＡＡＶ５−ＤＰ−２４７−００００２（図１４Ａ）は、抗ＡＡＶ２抗体陽性ヒト血清サンプルでのＩＰ−Ｓｅｑによって外れ値として沈殿されたため、ＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡがＥｐ４を含むアミノ酸であることの同定につながった。しかしながら、Ｅｐ４の左半分であるＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫ配列は、ＡＡＶ９−ＨＰ変異体を用いるＩＰ−ＳｅｑによってＥｐ４の一部として同定することができなかった（図１４Ｂ）。

【0079】

実施例８
抗ＡＡＶ２中和抗体エスケープＡＡＶ２変異体を同定することを目的とした、一連のＡＡＶ２Ｅｐ１２３ｍｔ変異体を産生した手順によって例示されるように、エピトープ情報を利用して、既存の免疫を回避できる任意のＡＡＶ株由来の新規変異体（共通の血清型、様々な天然多様体、及びカプシドエンジニアリング変異体）を開発できる。手順の例は、以下の通りである：（１）各共通中和エピトープにおいてアミノ酸をランダム化する、又は合理的に改変する；（２）適切な抗ＡＡＶ中和抗体の存在下又は非存在下で適切な方法を用いて、アミノ酸配列が改変された単一エピトープ又は２つ以上のアミノ酸配列が改変されたエピトープの組み合わせを含むＡＡＶカプシド変異体の定向進化又はスクリーニングを行う；（３）適切な抗ＡＡＶ中和抗体の存在下又は非存在下で適切な方法を用いて、手順（２）によって選択された配列が改変されたエピトープの組み合わせを含むＡＡＶカプシド変異体の更なる定向進化又はスクリーニングを行う；及び（４）適切な方法を用いて、それぞれの選択されたＡＡＶカプシド変異体の、抗ＡＡＶ抗体媒介性中和の回避能と、培養細胞中の標的細胞又は動物中の標的器官の形質導入能を評価する。

【0080】

【表1】

^１以下の手順を用いて、ヘキサペプチドスキャニングＡＡＶ９変異体を命名する。左３桁は、ＡＡＶ９ ＶＰ１に基づくヘキサペプチドの最初のアミノ酸位置を示す。右５桁は、各ヘキサペプチドが由来するＡＡＶ血清型、１００００はＡＡＶ１、０６０００はＡＡＶ６、００７００はＡＡＶ７、０００８０はＡＡＶ８、００００９はＡＡＶ９、００００２はＡＡＶ２を示す。ヘキサペプチドのアミノ酸配列が複数の血清型で共通しているとき、右５桁は２つ以上の正の整数を有する。ＡＡＶ９−ＨＰ−５８４−００００２及びＡＡＶ９−ＨＰ−５８６−００００２の産生が乏しいので、これら２つの変異体からデータは収集されない。

【0081】

【表2】

^１ヘキサペプチドスキャニングＡＡＶ９変異体と同じ手順を使用して、ドデカペプチドスキャニングＡＡＶ９変異体を命名する。ＡＡＶ９−ＤＰ−５７８−００００２及びＡＡＶ９−ＤＰ−５８０−００００２の産生が乏しいので、これら２つの変異体からデータは収集されない。

【0082】

【表3】

^１ヘキサペプチドスキャニングＡＡＶ９変異体と同じ手順を使用して、ドデカペプチドスキャニングＡＡＶ５変異体を命名する。これらの６８のカプシドを使用して、ＡＡＶベクター産生を作成し、試験した。ＡＡＶ５−ＤＰライブラリに含まれなかった１８の変異体は、後続するライブラリ作製に十分な力価を生成しないものである。

【0083】

【表4】

^１ＡＡＶ２カプシドＶＰ１タンパク質のアミノ酸位置は、エピトープ１、２及び３の、それぞれ４５５〜４６１、６６３〜６６７及び７１３〜７１７である。

【0084】

本開示で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。

【0085】

本発明の根本的な原理から逸脱することなく、上述の実施形態の詳細に多くの変更を加えてもよいことが、当業者に明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲のみによって決定されるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】