特表 2021-523874 抗メソセリン抗体およびその抗体薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-523874(P2021-523874A)

(43)【公表日】2021年9月9日

(54)【発明の名称】抗メソセリン抗体およびその抗体薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/68 20170101AFI20210813BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20210813BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210813BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210813BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210813BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20210813BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210813BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210813BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/68

   C07K16/30ZNA

   C07K16/46

   C12N15/13

   C12N15/63 Z

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   A61K38/05

   A61P35/00

   A61K39/395 Y

   C12P21/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2020-535025(P2020-535025)

(86)(22)【出願日】2019年5月15日

(85)【翻訳文提出日】2020年6月17日

(86)【国際出願番号】CN2019086977

(87)【国際公開番号】WO2019223579

(87)【国際公開日】20191128

(31)【優先権主張番号】201810487856.4

(32)【優先日】2018年5月21日

(33)【優先権主張国】CN

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】520217663

【氏名又は名称】栄昌生物制薬（烟台）有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＭＥＧＥＮ， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】房 健 民

(72)【発明者】

【氏名】黄 長 江

(72)【発明者】

【氏名】姜 静

(72)【発明者】

【氏名】叶 慧

(72)【発明者】

【氏名】李 慎 軍

(72)【発明者】

【氏名】徐 巧 玉

(72)【発明者】

【氏名】羅 文 ▲ティン▼

(72)【発明者】

【氏名】王 名 雪

【テーマコード（参考）】

4B064

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA01

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA10

4C084BA23

4C084BA32

4C084NA14

4C084ZB26

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB01

4C085BB41

4C085CC23

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA51

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＭＳＬＮを標的とする抗体薬物コンジュゲートを開示する。本発明は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を作製する方法も開示する。本発明は、操作された重鎖および軽鎖を含む新規ＭＳＬＮ抗体またはその機能的断片をさらに開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎを有する抗体薬物コンジュゲートであって、式中、
（ａ）ＡｂはＭＳＬＮに特異的に結合する抗体またはその機能的断片であり、
（ｂ）Ｌはリンカーであるか、または存在せず、
（ｃ）Ｄは治療剤であり、
（ｄ）ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である、抗体薬物コンジュゲート。

【請求項2】

ＭＳＬＮに特異的に結合する前記抗体が重鎖および軽鎖を含み、
（ｉ）前記重鎖が３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列が配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有し、
（ｉｉ）前記軽鎖が３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列が配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項3】

ＭＳＬＮに特異的に結合する前記抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ｉ）前記重鎖可変領域が配列番号７に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）前記軽鎖可変領域が配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１または２に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項4】

前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または２重特異性抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項5】

前記治療剤がドラスタチンペプチド、好ましくはＭＭＡＤ、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ、より好ましくはＭＭＡＥである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項6】

前記リンカーおよび前記抗体が前記抗体のチオール基によって連結している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項7】

前記リンカーが以下の式

【化1】

によって示された構造を有するか、または前記リンカーが以下の式

【化2】

によって示された構造を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【請求項8】

以下の式のいずれか１つによって示された構造を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体薬物コンジュゲート。

【化3】

【請求項9】

メソセリンに特異的に結合することができる抗体またはその機能的断片であって、
前記抗体が重鎖および軽鎖を含み、
（ｉ）前記重鎖が３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列が配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有し、
（ｉｉ）前記軽鎖が３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列が配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する、抗体またはその機能的断片。

【請求項10】

前記抗体が重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
（ｉ）前記重鎖可変領域が配列番号７に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）前記軽鎖可変領域が配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項９に記載の抗体またはその機能的断片。

【請求項11】

前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または２重特異性抗体である、請求項９または１０に記載の抗体またはその機能的断片。

【請求項12】

請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片をコードする、単離されたポリペプチド。

【請求項13】

請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドおよび請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドの組み合わせ。

【請求項14】

請求項１２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１３に記載のポリヌクレオチドの組み合わせを含み、前記ポリヌクレオチドが宿主細胞または無細胞発現系においてそれらによってコードされるポリペプチドの発現を可能にする制御配列に作動可能に連結している、発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせ。

【請求項15】

請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲートおよび／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片、および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物。

【請求項16】

癌の処置または予防のための医薬品の製造における、請求項１〜８のいずれか一項に記載のコンジュゲート、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその機能的断片、請求項１２に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチドの組み合わせ、請求項１４に記載の発現ベクターまたは請求項１５に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは前記癌がメソセリン陽性癌である使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、抗メソセリン抗体またはその機能的断片に関する。本発明はまた、抗メソセリン抗体および低分子薬物を含む抗体薬物コンジュゲートに関する。本発明はさらに、腫瘍の処置のための医薬品の製造における本発明の抗体およびコンジュゲートの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

背景技術
ＭＳＬＮ（メソセリン）は、中皮細胞、中皮腫および卵巣癌においてモノクローナル抗体ＣＡＫ１によって認識される抗原である。多くの腫瘍組織で高発現している４０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質なので、治療用抗体の非常に良好な標的マーカーである。

【0003】

モノクローナル抗体は治療標的特異性が高くて副作用は低いが、それらの有効性は単独で使用したときに限定される。抗体薬物コンジュゲートは、リンカーを介して毒素と抗体を連結することによって形成され、強い標的化能力および高効率の細胞傷害性の両方を備えており、新たなＡＤＣ薬の使用は最も有望な免疫療法の１つとなっており、癌免疫療法に多くの注目が寄せられている。

【0004】

いくつかの研究グループが、ＭＳＬＮを標的とする抗体薬物コンジュゲートを構築してきたが、これらの抗体薬物コンジュゲートには依然として多くの欠点があり、例えば、抗体のシステインのチオール基によるカップリングはペプチド鎖間の元々のジスルフィド結合の喪失を引き起こし、得られたＡＤＣは不安定で、一旦ＡＤＣが循環系に入ると、その半減期は短くなり、その毒性のある副作用は深刻であること、抗体のリジンのアミノ基によるカップリングはカップリング部位を無作為化し、抗体の標的化能力に影響を及ぼし得ることなどである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、当業界では、よりすぐれた特性を備えたＭＳＬＮ抗体およびその抗体を含む抗体薬物コンジュゲートを開発することが依然として必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の内容
本発明は、抗メソセリン抗体またはその機能的断片、およびその抗体もしくはその機能的断片を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。特に、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、安定性が高く、毒性のある副作用が少なく、および／またはメソセリンに対する親和性が高い。

【0007】

詳細には：
一態様では、本発明は、以下の構造式を有する抗体薬物コンジュゲートであって、
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎ
式中、ＡｂはＭＳＬＮに特異的に結合する抗体またはその機能的断片であり、
Ｌは空であるか、または任意のリンカーであり、
Ｄは任意の治療剤であり、
ｎは１から８から選択される整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７もしくは８であるかまたはそれらの任意の２つの間の間隔である、抗体薬物コンジュゲートを提供する。

【0008】

さらに、本発明の抗体またはその機能的断片は、重鎖および軽鎖を含み、（ｉ）重鎖は少なくとも３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列は配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を有し、（ｉｉ）軽鎖は少なくとも３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列は配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を有する。好ましくは、本発明の抗体またはその機能的断片は、重鎖および軽鎖を含み、（ｉ）重鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域は配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、および／または（ｉｉ）軽鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域は配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する。最も好ましくは、本発明で開示した抗メソセリン抗体の重鎖のＣＤＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、その軽鎖可変領域のＣＤＲは、配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する。

【0009】

さらに、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗メソセリン抗体またはその機能的断片を提供し、（ｉ）重鎖可変領域は配列番号７に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を含み、（ｉｉ）軽鎖可変領域は配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を含む。好ましくは、抗体は重鎖および軽鎖を含み、（ｉ）重鎖可変領域は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、および／または（ｉｉ）軽鎖可変領域は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、本発明で開示した抗メソセリン抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0010】

ある種の特定の実施形態では、本発明の抗体は重鎖および軽鎖を含み、重鎖は配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0011】

別の態様では、本発明は抗メソセリン抗体またはその機能的断片および治療剤を含む抗体薬物コンジュゲートを提供する。好ましくは、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、抗メソセリン抗体またはその機能的断片を治療剤に連結するリンカーをさらに含む。

【0012】

ある種の実施形態では、本発明のリンカーＬは、当業界で公知の任意の手段、好ましくはチオール基および／またはアミノ基によって抗体に連結することができる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、抗体のチオール基によってリンカーに連結している。本発明のリンカーＬは存在していなくてもよく（すなわち、抗体は治療剤Ｄに直接連結している）、または切断可能な（すなわち、インビボ環境において切断するリンカー）もしくは切断不可能なリンカーのいずれか１つまたはそれらの組み合わせであってもよく、好ましくは、リンカーは以下の表１に挙げたリンカーから選択することができる。

【0013】

【表1】

【0014】

一部の実施形態では、本発明のリンカーは、好ましくは以下の表２に挙げたリンカーから選択される。

【0015】

【表2】

【0016】

本発明の一部の実施形態では、治療剤Ｄは、マイタンシン化合物、Ｖ−ＡＴＰアーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、Ｂｅ１２阻害剤、ＭｃＬ１阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＩＡＰ阻害剤、ｍＴＯｒ阻害剤、微小管安定化剤、微小管不安定化剤、アウリスタチン、ドラスタチン、ＭｅｔＡＰ（メチオニンアミノペプチダーゼ）、タンパク質ＣＲＭ１核外移行阻害剤、ＤＰＰＩＶ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ミトコンドリアでのリン酸転移反応の阻害剤、タンパク質合成阻害剤、キナーゼ阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ９阻害剤、キネシン阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ干渉剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＨＦＲ阻害剤およびドラスタチンペプチドからなる群から選択される。

【0017】

本発明の一部の好ましい実施形態では、治療剤Ｄは細胞傷害性物質（例えば、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、アルカロイド）、免疫作用増強剤または放射性同位元素である。好ましくは、治療剤Ｄは、ＭＭＡＤ（モノメチルアウリスタチンＤ）およびその誘導体、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）およびその誘導体、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）およびその誘導体、メルタンシン誘導体Ｍ１、メルタンシン誘導体Ｍ４、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、ＰＢＤＡ（ピロロベンゾジアゼピン）、ドキソルビシン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、ビンブラスチン、ダウノルビシンからなる群から選択することができ、より好ましくは、治療剤はマイタンシノイド（例えば、アンサマイトシンまたはメルタンシン）、ドラスタチンおよびその誘導体から選択され、最も好ましくは、治療剤はＭＭＡＤおよびＭＭＡＥからなる群から選択される。

【0018】

ある種の実施形態では、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、ＬはＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢからなる群から選択され、ＤはＭＭＡＤまたはＭＭＡＥから選択され、ｎは１から８から選択される整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８またはそれらの任意の２つの間の間隔である。

【0019】

ある種の特定の実施形態では、本発明の抗体薬物コンジュゲートは以下の式のいずれかで示した構造を有し、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0020】

【化1】

【0021】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲは配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、ＬはＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＥである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0022】

【化2】

【0023】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲは配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、ＬはＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＤである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0024】

【化3】

【0025】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲは配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、ＬはＭｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＥである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0026】

【化4】

【0027】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体の重鎖可変領域ＣＤＲは、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、抗体の軽鎖可変領域ＣＤＲは配列番号４、配列番号５および配列番号６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、ＬはＭｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＤである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0028】

【化5】

【0029】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体は、配列番号７に記載の重鎖可変領域配列および配列番号８に記載の軽鎖可変領域配列を有し、ＬはＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＥである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0030】

【化6】

【0031】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体は、配列番号７に記載の重鎖可変領域配列および配列番号８に記載の軽鎖可変領域配列を有し、ＬはＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＤである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0032】

【化7】

【0033】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体は、配列番号７に記載の重鎖可変領域配列および配列番号８に記載の軽鎖可変領域配列を有し、ＬはＭｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＥである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0034】

【化8】

【0035】

特に、本発明は、一般式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｎの抗体薬物コンジュゲートに関し、式中、Ａｂは本発明の任意の抗メソセリン抗体であり、抗体は、配列番号７に記載の重鎖可変領域配列および配列番号８に記載の軽鎖可変領域配列を有し、ＬはＭｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢであり、ＤはＭＭＡＤである。より詳細には、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、以下の式によって示された構造を有するＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤであり、式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７または８である。

【0036】

【化9】

【0037】

別の態様では、本発明は、メソセリンに結合することができる抗体またはその機能的断片を提供し、抗体またはその機能的断片は重鎖および軽鎖を含み、
（ｉ）重鎖は少なくとも３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列は配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列を有するか、またはそれらと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を有し、および／または
（ｉｉ）軽鎖は少なくとも３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域の少なくとも１つのアミノ酸配列は配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するか、またはそれらと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を有する。

【0038】

ある種の特定の実施形態では、本発明の抗メソセリン抗体またはその機能的断片は、重鎖および軽鎖を含み、
（ｉ）重鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域は配列番号１、２もしくは３に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有し、および／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を含み、ＣＤＲ領域は配列番号４、５もしくは６に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する。

【0039】

特に、本発明で開示した抗メソセリン抗体の重鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３でそれぞれ記載されている。

【0040】

特に、本発明で開示した抗メソセリン抗体の軽鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５および配列番号６でそれぞれ示されている。

【0041】

より詳細には、本発明で開示した抗メソセリン抗体では、その重鎖ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２および配列番号３でそれぞれ記載されており、その軽鎖可変領域ＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号５および配列番号６でそれぞれ記載されている。

【0042】

さらなる態様では、本発明は、重鎖および軽鎖を含む抗メソセリン抗体またはその機能的断片を提供し、重鎖および軽鎖は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ含み、
（ｉ）重鎖可変領域は配列番号７に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）軽鎖可変領域は配列番号８に記載のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％（好ましくは、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％）の配列同一性を有する配列を含む。

【0043】

ある種の特定の実施形態では、抗体は重鎖および軽鎖を含み、重鎖および軽鎖は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域をそれぞれ含み、
（ｉ）重鎖可変領域は配列番号７に記載のアミノ酸配列を含み、および／または
（ｉｉ）軽鎖可変領域は配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0044】

特に、本発明の抗メソセリン抗体は重鎖および軽鎖を含み、重鎖および軽鎖は、配列番号１０および配列番号９に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む。

【0045】

ある種の特定の実施形態では、抗メソセリン抗体またはその機能的断片は単離されている。

【0046】

ある種の特定の実施形態では、抗メソセリン抗体またはその機能的断片は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）または２重特異性抗体であり、ある種の特定の実施形態では、抗メソセリン抗体またはその機能的断片はモノクローナル抗体であり、ある種の特定の実施形態では、抗メソセリン抗体またはその機能的断片はヒト化抗体であり、ある種の特定の実施形態では、抗メソセリン抗体またはその機能的断片はＩｇＧｌカッパ抗体である。

【0047】

さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。

【0048】

さらなる態様では、本発明は、単離されたポリヌクレオチドの組み合わせを提供し、この組み合わせは、本発明の抗体またはその機能的断片の軽鎖をコードするポリヌクレオチドおよび本発明の抗体またはその機能的断片の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0049】

さらなる態様では、本発明は、発現ベクターまたは発現ベクターの組み合わせを提供し、それらは、本発明によるポリヌクレオチドまたは本発明によるポリヌクレオチドの組み合わせを含み、ポリヌクレオチドはこのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの発現を可能にする宿主細胞または無細胞発現系の制御配列に作動可能に連結している。

【0050】

さらなる態様では、本発明は、本発明による抗体またはその機能的断片および／または本発明によるコンジュゲートおよび医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。

【0051】

さらなる態様では、本発明は、癌の治療または予防を必要とする対象に、治療有効量の本発明による抗体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、コンジュゲートおよび／または医薬組成物を投与することを含む、癌の処置または予防の方法を提供する。

【0052】

さらなる態様では、本発明は、癌の処置または予防のための医薬品の製造における本発明による抗体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、コンジュゲートおよび／または医薬組成物の使用を提供する。

【0053】

さらなる態様では、本発明は、癌の処置または予防に使用するために、本発明による抗体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの組み合わせ、発現ベクター、コンジュゲートおよび／または医薬組成物を提供する。

【0054】

さらなる態様では、本発明は、癌の処置のための医薬品の製造における上記実施形態のいずれか１つの抗体薬物コンジュゲートの使用を提供する。

【0055】

ある種の特定の実施形態では、本発明の癌はメソセリン陽性癌である。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】リンカーを有するＲＣ８８抗体と薬物コンジュゲートとのカップリングを特徴とするＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析図を示している。

【図2】本発明のコンジュゲートのカップリングを示した図であり、図Ａは疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によるＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのカップリングの検出結果を示しており、図Ｂは疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によるＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのカップリングの検出結果を示している。

【図3】本発明のコンジュゲートの細胞傷害効果を示した図であり、図ＡはＭＳＬＮを高発現しているＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞における本発明のＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（すなわち、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）の細胞傷害効果曲線を示しており、図ＢはＭＳＬＮを高発現しているＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞におけるコンジュゲートしていない抗体リンカーおよび細胞毒素コンジュゲート（Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）の細胞傷害効果曲線を示しており、図ＣはＭＳＬＮを高発現しているＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞における細胞毒素ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤおよび陽性対照ＰＴＸ（パクリタキセル）の細胞傷害効果曲線を示しており、横軸は薬物の対数濃度を表しており、縦軸は薬物の対応する対数濃度での最大阻害率を表している。

【図4】日数に応じた腫瘍を有するマウスの体重のグラフを示しており、マウスはＲＣ８８抗体（２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、２ｍｇ／ｋｇ）およびＭＭＡＥ（０．０７１６ｍｇ／ｋｇ）を投与されており（週に１回、全部で３回投与された）、横軸は日数を表し、縦軸は投与の対応する日数後の腫瘍を有するマウスの体重を表す。この試験では、対照群は生理食塩水（対照）およびＭＭＡＥである。

【図5】日数に応じた腫瘍を有するマウスの腫瘍体積のグラフを示しており、マウスはＲＣ８８抗体（２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、２ｍｇ／ｋｇ）およびＭＭＡＥ（０．０７１６ｍｇ／ｋｇ）を投与されており（週に１回、全部で３回投与された）、横軸は日数を表し、縦軸は投与の対応する日数後の腫瘍を有するマウスの腫瘍体積を表す。この試験では、対照群は生理食塩水（対照）およびＭＭＡＥである。

【図6】ＲＣ８８抗体（２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、２ｍｇ／ｋｇ）およびＭＭＡＥ（０．０７１６ｍｇ／ｋｇ）を週に１回、全部で３回投与された腫瘍を有するマウスの腫瘍重量のグラフを示しており、対照群は生理食塩水（対照）およびＭＭＡＥであった。

【図7】日数に応じた腫瘍を有するマウスの体重のグラフを示しており、マウスはＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）＋ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ＩｇＧ−ＭＭＡＥ（３ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（パクリタキセル、１０ｍｇ／ｋｇ）を投与され（ＰＴＸは週に２回、全部で６回投与され、その他は週に１回、全部で３回投与された）、横軸は日数を表し、縦軸は投与の対応する日数後の腫瘍を有するマウスの体重を表す。この試験では、対照群は生理食塩水（対照）およびＭＭＡＥである。

【図8】日数に応じた腫瘍を有するマウスの腫瘍体積のグラフを示しており、マウスはＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）＋ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ＩｇＧ−ＭＭＡＥ（３ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（パクリタキセル、１０ｍｇ／ｋｇ）を投与され（週に１回、薬物を３回投与された腫瘍を有するマウスの腫瘍体積の合計（ＰＴＸは週に２回、全部で６回投与され、その他は週に１回、全部で３回投与された）、横軸は日数を表し、縦軸は対応する投与日数後の腫瘍を有するマウスの腫瘍体積を表す。この試験では、対照群は生理食塩水（対照）およびＭＭＡＥである。

【図9】ＭＳＬＮを高発現しているＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３ヒト卵巣癌を有するマウスモデルにおけるＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の抗腫瘍効果を示している。

【図10】ＥＬＩＳＡ測定法によるＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の親和性曲線を示している。

【図11】標的に対する本発明のコンジュゲートの親和性を示した図であり、図ＡはＥＬＩＳＡ測定法によるＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の親和性曲線を示しており、図Ｂは組換えヒトＭＳＬＮタンパク質に対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の競合結合曲線を示している。

【図12】組換えヒトＭＳＬＮタンパク質に対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）およびＣＡ１２５の競合結合曲線を示している。

【発明を実施するための形態】

【0057】

本発明を実施するための具体的なモデル
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用した技術用語および科学用語は全て、当業者によって理解されているのと同じ意味を有する。当業界の特定の定義および専門用語については、従事者はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照することができる。アミノ酸残基の略語は、２０個の一般的に使用されるＬ−アミノ酸の１つを意味する当業界で使用される標準的な３文字および／または１文字コードである。

【0058】

本発明では、広範囲に亘って数値範囲およびパラメータ近似値が示されているが、特定の実施形態における数値は可能な限り正確に記載されている。しかし、それぞれの測定値には標準偏差が存在するため、任意の数値は本質的にある種の誤差を含有している。さらに、本明細書で開示した範囲は全て、ありとあらゆる部分的範囲を包含するものと理解されたい。例えば、「１から１０」という引用範囲は、最小１と最大１０（終点を含む）との間のありとあらゆる部分的範囲を包含するものと考えるべきであり、すなわち、最小１以上、例えば、１から６．１で開始する部分的範囲全て、および最大１０以下、例えば、５．５から１０で終了する部分的範囲である。さらに、「本明細書に組み込んだ」と称するいかなる参照も、その全体が組み込まれているものと理解される。

【0059】

説明で使用したように、参照している対象の単数形は、対象の１つに明確および明瞭に限定されていない限り、その複数形を包含することにさらに注意されたい。用語「または」は、文脈で明瞭に他の場合が示されていない限り、用語「および／または」と同義に使用することができる。

【0060】

本明細書で使用したように、ＭＳＬＮとしても知られている用語「メソセリン」は、細胞のメソセリン前駆体タンパク質のプロセシングから得られた任意の天然の成熟メソセリンを意味する。この用語は、特に記載していない限り、霊長類（例えば、ヒト、類人猿およびサル）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来のメソセリンを包含し、この用語はメソセリンのスプライシングバリアントまたは対立形質バリアントなどの天然に生じる任意のバリアントも包含する。

【0061】

本明細書で使用したように、用語「医薬組成物」、「組み合わせ薬物」および「薬物の組み合わせ」は同義に使用され、少なくとも１つの薬物および、任意選択で、特定の目的を実現するために一緒に組み合わせた医薬的に許容される担体または賦形剤を意味する。ある種の実施形態では、医薬組成物は、本発明の目的を実現するために一緒に作用することができる限り、時間および／または空間で分離されている組み合わせを含む。例えば、医薬組成物に含有されている成分（例えば、本発明による抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせ、および／またはコンジュゲート）は、対象にまとめて、または対象に別々に投与することができる。医薬組成物に含有されている成分を対象に別々に投与するとき、成分は対象に同時または順次投与することができる。好ましくは、医薬的に許容できる担体は、水、緩衝化水溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）などの等張生理食塩水、グルコース、マンニトール、デキストロース、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセロール、ヒアルロン酸、エタノールまたはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール、トリグリセリドなどである。使用した医薬的に許容できる担体の種類は、本発明による組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与のために製剤化されているかどうかに特に左右される。本発明による組成物は、添加物として湿潤剤、乳化剤または緩衝物質を含んでいてもよい。

【0062】

本発明による医薬組成物、ワクチンまたは医薬調製物は、任意の適切な経路、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内または静脈内投与を介して投与することができる。

【0063】

本明細書で使用した用語「治療剤」は、治療効果（例えば、任意の疾患および／または障害の処置、予防、改善または阻害）を発揮し得る任意の物質または実体を意味し、限定はしないが、化学療法剤、放射線療法剤、免疫療法剤、温熱療法剤などを含む。

【0064】

本明細書で使用したように、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、１９９１および後のバージョン）によって定義されたように、イムノグロブリンの重鎖および軽鎖の超可変領域を意味する。３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲがある。本明細書で使用したように、用語ＣＤＲまたはＣＤＲ（複数）は、これらの領域の１つまたはこれらの領域のいくつかもしくは全てをも示すために使用され、抗体の抗原またはその認識エピトープに対する親和性による結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含有している。

【0065】

本発明の目的のために、２つの核酸またはアミノ酸配列の間の「一致性」、「同一性」または「類似性」は、最適に整列させた後で得られた比較すべき２つの配列の間の同一なヌクレオチドまたは同一なアミノ酸残基のパーセンテージを意味し、このパーセンテージは単に統計的なもので、２つの配列の間の違いは無作為に分散しており、その長さ全体に亘っている。２つの核酸またはアミノ酸配列の間の配列比較は、最適に整列させた後で配列を比較することによって典型的に実施され、比較は、区域または「比較ウインドウ」によって実施することができる。手動による実施に加えて、配列を比較するための最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）［Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２巻：４８２］の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｄｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）［Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４３］の局所相同性アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５巻：２４４４）の類似性検索法、またはコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴ ＮもしくはＢＬＡＳＴ Ｐ比較ソフトウェア）によっても、これらのアルゴリズムを使用して実施することができる。

【0066】

本明細書で使用したように、「治療有効量」または「有効量」は、投与する対象に対してその有益性を示すのに十分な用量を意味する。投与する実際の量ならびに投与する速度および時間経過は、処置する対象の状態および重症度に左右される。処置の指示（例えば、用量の決定など）は、最終的には総合診療医およびその他の医師の責任であり、処置する疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法およびその他の公知の要素を通常考慮して、医師らの決定次第である。

【0067】

本明細書で使用した用語「対象」は、ヒトなどの哺乳類を意味するが、野生動物（サギ、コウノトリ、ツルなど）、家畜（アヒル、ガチョウなど）または実験動物（オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、リスなど）などのその他の動物であってもよい。

【0068】

本明細書で使用したように、「抗体」は、最も広い意味で使用され、限定はしないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、２重特異性抗体）および抗体断片を含む様々な抗体構造を包含し、特に、本明細書で使用した「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン（ＣＬ）を含有する。ＶＨおよびＶＬ領域はまた、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される多様性の高い複数の領域に細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順番：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成される。重鎖および軽鎖のこれらの可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞など）および古典的な補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主の組織または要素に対するイムノグロブリンの結合を媒介する。キメラまたはヒト化抗体も、本発明による抗体に包含される。

【0069】

用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体から得られたＣＤＲ領域を含む抗体を意味し、抗体分子のその他の部分は１つの（またはいくつかの）ヒト抗体から得られている。さらに、結合親和性を保持するために、フレームワーク領域（ＦＲと称する）区域のいくつかの残基は修飾することができる（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５、１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６、１９８８；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７、１９８８）。本発明によるヒト化抗体またはその断片は、当業者に公知の技術によって（例えば、以下の文献：Ｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０巻：２８４４〜２８５７、１９９２；Ｍｏｕｎｔａｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．、１０巻：１〜１４２、１９９２；またはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６９〜１７５、１９９２に記載のように）調製することができる。

【0070】

用語「キメラ抗体」は、抗体の可変領域配列が１つの種由来で、抗体の定常領域配列が別の種由来である、例えば、可変領域配列がマウス抗体から得られ、定常領域配列がヒト抗体から得られた抗体を意味する。本発明によるキメラ抗体またはその断片は、遺伝子組換え技術を使用することによって調製することができる。例えば、キメラ抗体はプロモーター、本発明による非ヒト、特にマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列およびヒト抗体の定常領域をコードする配列を含む組換えＤＮＡをクローニングすることによって生成することができる。このような組換え遺伝子によってコードされた本発明のキメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラであってもよく、その特異性はマウスＤＮＡから得られた可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡから得られた定常領域によって決定される。キメラ抗体を調製する方法は、例えば、Ｖｅｒｈｏｅｙｎら（ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、８巻：７４、１９８８）の文献を参照することができる。

【0071】

用語「モノクローナル抗体」は、単一の分子組成物を有する抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに単一の結合特異性および親和性を示す。

【0072】

本明細書では、用語「機能的断片」は、機能的断片が得られた抗体の重または軽可変鎖の部分配列からなる、または含む抗体断片を意味し、この部分配列は、機能的断片が得られた抗体と同じ結合特異性および十分な親和性を保持するのに十分で、好ましくは、機能的断片が得られた抗体の少なくとも１／１００と等しい親和性を示し、より好ましくは、少なくとも１／１０と等しい親和性を示す。このような機能的断片は、機能的断片が得られた抗体配列の最少５個のアミノ酸、好ましくは１０、１５、２５、５０および１００個の連続したアミノ酸を含む。

【0073】

本明細書で使用した用語「ＤＡＲ」は、抗体薬物コンジュゲートにおける薬物−抗体比を意味し、１つの抗体とコンジュゲートした薬物分子の平均数を表す。好ましくは、本発明の抗体薬物コンジュゲートは、約２から約６、例えば、約２、２．５、３、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、５、５．５、６またはそれらの間の任意の間隔のＤＡＲ値を有する。

【0074】

一般的に、モノクローナル抗体またはその機能的断片、特にマウスモノクローナル抗体またはその機能的断片を調製するために、マニュアル「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＮＹ、７２６頁、１９８８）で具体的に記載された技術またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７、１９７５）に記載のハイブリドーマ細胞からの調製の技術を参照することができる。

【0075】

本発明によるモノクローナル抗体または抗体薬物コンジュゲートは精製することができ、例えば、アフィニティーカラムで精製することができ、このアフィニティーカラムには本発明による抗体によって特異的に認識されるエピトープを含有するＭＳＬＮ抗原またはその断片の１つが予め固定されている。より詳細には、モノクローナル抗体は、残存するタンパク質混入物およびＤＮＡおよびＬＰＳを排除するために、イオン交換クロマトグラフィーが連結しているか、または連結していないプロテインＡおよび／またはＧクロマトグラフィーによって精製することができ、それ自体は、２量体またはその他の多量体の存在による潜在的な凝集物を排除するために、セファロースゲルの排除クロマトグラフィーが連結しているか、または連結していない。より好ましい実施形態では、これらの技術はいずれも同時または連続的に使用することができる。

【0076】

本明細書で使用した用語「ドラスタチン」は、海洋生物、Ｄｏｌｌａｂｅｌｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａから単離されたポリペプチドを意味し、限定はしないが、ドラスタチン１０およびドラスタチン１５を含む。ドラスタチンペプチドは、強力な抗癌活性を示す有糸分裂阻害剤で、したがって、抗癌薬の候補である。研究者らは、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦなどのドラスタチンペプチドのいくつかの誘導体をさらに発見し、合成した。

【0077】

本明細書では、用語「リンカー」は、抗体を薬物に連結する抗体薬物コンジュゲート（すなわち、ＡＤＣ）の一部を意味し、切断可能であるか、または切断不可能であってもよい。切断可能なリンカー（すなわち、切断できるリンカーまたは生分解できるリンカー）は、標的細胞内または標的細胞上で切断し、薬物を放出することができる。ある種の実施形態では、本発明のリンカーは非常に良好な安定性を有し、標的までの送達中（例えば、血液中で）の薬物の放出を大幅に低減し、それによって副作用および毒性を低減する。いくつかの特定の実施形態では、本発明のリンカーは、ジスルフィドをベースにしたリンカー（高濃度のスルフヒドリル基を有する腫瘍細胞中で選択的に切断する）、ペプチドリンカー（腫瘍細胞中の酵素によって切断される）、ヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーから選択される。その他の特定の実施形態では、本発明のリンカーは、チオエーテルリンカーなどの切断不可能なリンカー（すなわち、切断できないリンカー）から選択される。さらにその他の実施形態では、本発明のリンカーは、切断可能なリンカーおよび切断不可能なリンカーの組み合わせである。好ましくは、本発明のリンカーは、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢおよびＰｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢからなる群から選択される。

【0078】

抗ＭＳＬＮ抗体
本発明の抗体薬物コンジュゲートの抗体は、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合することが特徴である。好ましくは、抗体は高い親和性で、例えば、１×１０^−７Ｍ以下のＫ_ＤでＭＳＬＮに結合する。抗ＭＳＬＮ抗体は、好ましくは以下の特性の１つまたは複数を表す：
（ａ）ヒトＭＳＬＮに１×１０^−７Ｍ以下（例えば、５×１０^−８Ｍ以下、２×１０^−８Ｍ以下、５×１０^−９Ｍ以下、４×１０^−９Ｍ以下、３×１０^−９Ｍ以下、２×１０^−９Ｍ以下）のＫ_Ｄで結合する；
（ｂ）ＭＳＬＮを高発現するＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞に、例えば、２０００ｎｇ／ｍｌ以下（例えば、１０００ｎｇ／ｍｌ以下、５００ｎｇ／ｍｌ以下、４００ｎｇ／ｍｌ以下、３００ｎｇ／ｍｌ以下、２５０ｎｇ／ｍｌ以下、２００ｎｇ／ｍｌ以下、１５０ｎｇ／ｍｌ以下、１００ｎｇ／ｍｌ以下、５０ｎｇ／ｍｌ以下、４０ｎｇ／ｍｌ以下、３０ｎｇ／ｍｌ以下、２０ｎｇ／ｍｌ以下、１０ｎｇ／ｍｌ以下、５ｎｇ／ｍｌ以下）のＥＣ_５０で結合し、好ましくは、ＥＣ_５０はフローサイトメトリー法またはＥＬＩＳＡ法を使用することによって決定される；および
（ｃ）ＭＳＬＮを発現する細胞のインビボにおける増殖を阻害する。

【0079】

モノクローナル抗体ＲＣ８８
本発明の抗体薬物コンジュゲートで好ましく使用した抗体は、ヒトモノクローナル抗体ＲＣ８８である。ＲＣ８８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号７および８で示される。

【0080】

別の態様では、本発明の抗体はＲＣ８８の重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含むことができる。ＲＣ８８のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１〜３で示される。ＲＣ８８のＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号４〜６で示される。ＣＤＲ領域はＫａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５編、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＮＯ：９１−３２４２；以後「Ｋａｂａｔ’３２４２」と称する）を使用して記載される。

【実施例】

【0081】

以下は、本発明の方法および組成物の例である。上記の定義および全般的な説明を踏まえて、様々なその他の実施形態を実施することができることを理解されたい。

【0082】

実施例１：抗メソセリン抗体
本発明の抗メソセリン抗体を生成するために、標準的方法を使用して免疫した動物を作製し、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６巻：４９５〜４９７、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４巻：７２、およびＣｏｌｅら、ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５、７７〜９６頁を参考にした。

【0083】

メソセリンは、公知の技術によって細胞から分離して精製し、動物の免疫のための免疫源として使用し、例えば、Ｚｏｌａ、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＥＰＡＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＥＮＧＩＮＥＥＲＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ（ＢＡＳＩＣＳ：ＦＲＯＭ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ ＴＯ ＢＥＮＣＨ）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２０００；ＢＡＳＩＣ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＺＡＴＩＯＮ、１１章、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ」ＨｏｗａｒｄおよびＢｅｔｈｅｌｌ編、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２０００；ＡＮＴＩＢＯＤＹ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ（ＳＰＲＩＮＧＥＲ ＬＡＢ ＭＡＮＵＡＬ．）、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、２００１を参考にした。

【0084】

脾細胞は、免疫化した動物から採取し、骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマを得た。次に、高い結合親和性を備えた抗ＭＳＬＮ抗体をスクリーニングによって得た。

【0085】

マウス抗ＭＳＬＮモノクローナル抗体は、軽鎖または重鎖ＣＤＲをヒトＩｇＧｌまたは重鎖フレームワーク領域に移植することによってヒト化した。マウス抗ＭＳＬＮ抗体軽鎖および重鎖のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して決定した。抗体可変領域データベースを整列させることによって、マウスＭＳＬＮ抗体と高い相同性を備えたヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を同定した。したがって、ヒト化ＭＳＬＮ抗体の様々な軽鎖可変領域配列およびヒト化抗ＭＳＬＮの様々な重鎖可変領域配列を設計した。この設計によって、ヒト化重鎖および軽鎖の可変領域配列を合成し、完全長のヒト化ＭＳＬＮ軽鎖を得るために、ヒト化ＭＳＬＮ抗体軽鎖可変領域とヒトカッパ定常領域をＰＣＲによって融合させ、完全長のヒト化ＭＳＬＮ重鎖を得るためにヒト化ＭＳＬＮ重鎖可変領域とＩｇＧ定常領域をＰＣＲによって融合させた。様々な軽鎖および重鎖を一緒にして発現させ、精製したヒト化抗体をＥＬＩＳＡ結合親和性によってヒト−マウスキメラ抗体と比較し、候補ヒト化抗体（ＲＣ８８抗体と称する）をスクリーニングによって得た。

【0086】

以下の表３は、ＲＣ８８抗体軽鎖および重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を示す。

【0087】

【表3】

【0088】

ＲＣ８８抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）：

【0089】

【化10】

【0090】

ＲＣ８８抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）：

【0091】

【化11】

【0092】

ＲＣ８８抗体軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を配列９（配列番号９）および配列１０（配列番号１０）で記載する。

【0093】

ＲＣ８８抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号９）：

【0094】

【化12】

【0095】

ＲＣ８８抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号１０）：

【0096】

【化13】

【0097】

実施例２：抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製
実施例２ａ：リンカー−薬物コンジュゲートの調製

【0098】

【化14】

【0099】

（１）化合物１（Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ）の合成
化合物Ｐｙ−ＭＡＡ（１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン−メルカプト酢酸、１０．００ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解し、ＨＡＴＵ（１６．７３ｇ、４４．０ｍｍｏｌ）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（９．２０ｇ、２３．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１５．３２ｍｌ、８７．９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２４時間撹拌し、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、溶媒を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、粗生成物を分取高速液体クロマトグラフィーによって精製し、得られた溶液を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、化合物１（６．６７ｇ、３２．４％、白色固形粉末）を得た。

【0100】

（２）化合物２（Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ）の合成
化合物１（７．０２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解し、ＮＰＣ（ジ（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート、４．５６ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２．０９ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を添加し、反応は室温で５時間実施し、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、反応混合物を石油エーテル（１５００ｍＬ）に注ぎ、撹拌し、濾過して、得られた濾過ケークを石油エーテル（１５０ｍＬ×３）で洗浄し、吸引によって乾燥し、灰白色の固形粉末（６．５７ｇ、７５．７％）を得た。

【0101】

（３）化合物３（Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の合成
化合物２（１．７４ｇ、２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ２０ｍＬに溶解し、ＭＭＡＥ（１．４４ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．７０ｍＬ、４．０ｍｍｏｌ）およびピリジン（４ｍＬ）を窒素ガスの保護下で添加した。室温で２４時間撹拌しながら、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、精製は分取高速クロマトグラフィーによって実施し、得られた溶液を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、化合物３（白色固形粉末、１．３５ｇ、４６．７％）を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ＋）、１４４６．３５（Ｍ＋Ｈ）＋、ＩＲ（３３３４．３２ｃｍ−１、２９６５．９ｃｍ−１、１６５２．７０ｃｍ−１、１５３８．９２ｃｍ−１、１４３６．７１ｃｍ−１）。

【0102】

（４）化合物４（Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）の合成
化合物２（０．８７ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、ＭＭＡＤ（０．７７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）およびピリジン（２ｍＬ）を窒素ガスの保護下で添加した。室温で２４時間撹拌しながら、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、精製は分取高速クロマトグラフィーによって実施し、得られた溶液を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、化合物４（白色固形粉末、０．６５ｇ、４３．５％）を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ＋）、１４９９．７６（Ｍ＋Ｈ）＋。

【0103】

（５）化合物６（Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ）の合成
化合物５（Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ、４．５８ｇ、８．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮＰＣ（ジ（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート、３．６５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（１．７０ｍＬ、９．６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で５時間反応させ、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、反応混合物を石油エーテル（１０００ｍＬ）に注ぎ、撹拌して濾過して、得られた濾過ケークを石油エーテル（６０ｍＬ×３）で洗浄し、吸引によって乾燥し、灰白色の固形粉末（５．０４ｇ、８５．２％）を得た。

【0104】

（６）化合物７（Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の合成
化合物６（１．１９ｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１２ｍＬに溶解し、ＭＭＡＥ（１．０８ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．２１ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．５５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）およびピリジン（２．５ｍＬ）を窒素ガスの保護下で添加した。室温で２４時間撹拌しながら、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、精製は分取高速クロマトグラフィーによって実施し、得られた溶液を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、化合物７（白色固形粉末、０．８９１ｇ、４５．１％）を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ＋）、１３１６．１８（Ｍ＋Ｈ）＋。

【0105】

（７）化合物８（Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）の合成
化合物６（０．７４ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、ＭＭＡＤ（０．７７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（０．１４ｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．３５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）およびピリジン（２ｍＬ）を窒素ガスの保護下で添加した。室温で２４時間撹拌しながら、反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応が完了した後、精製は分取高速クロマトグラフィーによって実施し、得られた溶液を減圧下でロータリーエバポレーターによって蒸発させ、化合物８（白色固形粉末、０．５９ｇ、４２．８％）を得た。ＬＣ−ＭＳ ｍ／ｚ（ＥＳ＋）、１３６９．３８（Ｍ＋Ｈ）＋。

【0106】

実施例２ｂ：抗体薬物コンジュゲートの調製

【0107】

【化15】

【0108】

ＲＣ８８抗体１０ｍｇ／ｍＬ、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）１０ｍｍｏｌ／ＬおよびＴＣＥＰ（トリス−２−カルボキシエチル−ホスフィン）５ｍｍｏｌ／Ｌの５モル倍をＰＣＲ試験管に添加し、２５℃で２時間撹拌し、その後、０℃で２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）および薬物（化合物３、４、７または８）５ｍｍｏｌ／Ｌの５モル倍を添加し、２５℃で１０時間撹拌した。反応が完了した後で、精製して残存する未反応薬物およびＤＭＳＯなどの遊離低分子を除去するためにＰＢＳ緩衝液による３回の遠心分離によって限外濾過を実施して、カップリングはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法および疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって検出した。ＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥは、還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴づけ、この実験ではＮｏｖｅｘ’ｓ ＮｕＰＡＧＥの予め作製されたゲルを使用し、各試料の全試料体積は１０μＬで、結果は図１に示した。ＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥについては、その架橋リンカーは還元されたジスルフィド結合を共有結合によって再度連結するので、異なるバンドがあり、１５０ｋＤａは完全な抗体（ＬＨＨＬ）であり、１２５ｋＤａは１つの軽鎖がカップリングしていないことを示し（ＬＨＨ）、１００ｋＤａは２つの重鎖がカップリングしており（ＨＨ）、７５ｋＤａは１つの軽鎖および１つの重鎖がカップリングしており（ＬＨ）、５０ｋＤａおよび２５ｋＤａはそれぞれ重鎖および軽鎖であった。ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥについては、架橋リンカーは存在せず、ジスルフィド結合は２つのスルフヒドリル基に還元されており、その後２つのリンカー−毒素それぞれにカップリングし、したがって還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥは５０ｋＤａおよび２５ｋＤａの２つのバンドのみを示した。ＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥおよびＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥのカップリングは、疎水性高速液体クロマトグラフィー（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）によって検出され、結果は図２Ａおよび図２Ｂに示されており、結果はＤＡＲ値がそれぞれ、３．９５（ＲＣ８８−ＰＹ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）および３．９（ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）であることを示した。

【0109】

実施例３：ＭＳＬＮを高発現するＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞の構築
良好に増殖したＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３細胞（ＡＴＣＣ）を６ウェルプレートに３×１０^５／ウェルで接種し、一晩接着させた後、元の培地を廃棄して、ポリブレン（ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍＬを含有する新鮮な培地４００μＬを添加し、ヒトＭＳＬＮコーディング配列を含有するレンチウイルスベクター（ｐＲＲＬ−ｃｍｖ）６００μＬを適切な濃度でその間に添加し、ウェルを混合した後、培養を２４時間継続した。培養終了後、新鮮な培地との置換を実施し、培養の拡大を実施し、陽性細胞はフローサイトメーターを使用して選択した。選択した陽性細胞を培養拡大のために使用し、ＭＳＬＮの発現はフローサイトメーターによって分析し、ＭＳＬＮを最高に発現している細胞（以後、Ｏｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮと称する）をその後の実験のために選択した。

【0110】

実施例４：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートおよび対応するリンカー−薬物および薬物の細胞傷害活性の検出
良好な増殖状態のＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（５×１０^４細胞／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）に添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートした。ＲＣ８８抗体、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）および対応するリンカー−薬物コンジュゲート（Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）、薬物（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ）、ＰＴＸ（パクリタキセル）を完全培地で以下の濃度に希釈した：ＲＣ８８抗体、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）については、最終濃度は０．３２、１．６、８、１６、３２、６４、１２８、６４０、３２００ｎｇ／ｍＬであり、リンカー−薬物コンジュゲート（Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｐｙ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ）については、最終濃度は０．４、２、１０、２０、４０、８０、１６０、８００、４０００ｎｇ／ｍＬであり、薬物（ＭＭＡＥ、ＭＭＡＤ）については、最終濃度は０．００１６、０．００８、０．０４、０．２、０．４、０．８、１．６、８、４０ｎｇ／ｍＬであり、ＰＴＸ（パクリタキセル）については、最終濃度は０．００４、０．０２、０．０９８、０．３、０．８９、２．６７、８、４０、２００ｎｇ／ｍＬであった。希釈後、これらを９６プレート（１００μＬ／ウェル）に添加し、ブランク群（薬物を含まない同量の培地）および３つの対照群を設定し、インキュベーションはＣＯ_２恒温インキュベーター内で３７℃で７２時間実施した。１００μＬ／ウェルの用量でＣＣＫ−８ １０μＬを含有する培地（ＦＢＳなし）を添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で２から４時間インキュベートし、４５０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーで読み取った。阻害率は、以下の式：ＩＲ％＝（ＯＤ_ブランク−ＯＤ_薬物）×１００／ＯＤ_ブランクによって計算した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、阻害率をｙ値とし、薬物濃度をｘ値として使用し、４パラメータ曲線適合を実施し、最大阻害率と最小阻害率の間の値に対応する薬物濃度値を記録し（ＩＣ_５０値はソフトウェアによって初期設定した）、結果を図３および表４に示した。結果は、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥはＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮの増殖の阻害に効果的であることを示した。

【0111】

【表4】

【0112】

実施例５：ＭＳＬＮを高発現するＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３ヒト卵巣癌を有するマウスモデルにおけるＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍実験
良好な増殖状態のＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞（２×１０^６）をヌードマウス（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｃａｖａｎｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、証明書番号：２０１６１１２４０、登録番号：ＳＣＸＫ（Ｓｕ）２０１１−０００３）に皮下接種し、腫瘍体積が約１００〜４００ｍｍ^３に増殖した後、動物を無作為化した。ＲＣ８８抗体（２ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、２ｍｇ／ｋｇ）およびＭＭＡＥ（０．０７１６ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ、１週間に１回、全部で３回投与し、陰性対照群には同体積の生理食塩水を同時に投与した。結果を図４、５および６に示す。

【0113】

結果は、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートは腫瘍を有するマウスの体重増加に影響を及ぼさず、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、ＲＣ８８−Ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＤ、２ｍｇ／ｋｇ）はいずれも腫瘍を有するマウスにおける異種移植に著しい阻害を示し、一方、ＲＣ８８抗体はあまり抗腫瘍効果を示さなかったことを示した。

【0114】

実施例６：ＭＳＬＮを高発現しているＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３ヒト卵巣癌を有するマウスモデルにおけるＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートの抗腫瘍実験
正常な増殖状態のＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞（２×１０^６）をヌードマウス（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ｃａｖａｎｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、証明書番号：２０１６１１２４０、登録番号：ＳＣＸＫ（Ｓｕ）２０１１−０００３）に皮下接種し、腫瘍体積が約１００〜４００ｍｍ^３に増殖した後、動物を無作為化した。ＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ）、ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ＲＣ８８抗体（３ｍｇ／ｋｇ）＋ＭＭＡＥ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、ヒト血清ＩｇＧ−ＭＭＡＥ（３ｍｇ／ｋｇ）、ＰＴＸ（パクリタキセル）（１０ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ、週に１回、全部で３回（ＰＴＸは週に２回、全部で６回）投与し、陰性対照群には同量の生理食塩水を同時に投与した。結果を図７、８および９に示す。結果は、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートについては、３ｍｇ／ｋｇ群および１．５ｍｇ／ｋｇ群の腫瘍を有するマウスは最初の投与の７日後に腫瘍の著しい減少を示し、３ｍｇ／ｋｇ群では投与の１０日後に肉眼で認められる腫瘍は示されず、１．５ｍｇ／ｋｇ群では投与の１７日後に肉眼で認められる腫瘍は示されず、０．７５ｍｇ／ｋｇ群では３回投与した後、腫瘍増殖は依然として比較的速いことが示され、対照（生理食塩水）群と比較して投与の２１日後の腫瘍体積には統計学的差は認められず（Ｐ＞０．０５）、Ｔ／Ｃ＞４０％であったことを示した。パクリタキセル（ＰＴＸ）群については、投与の２１日後に２匹の腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍は完全に排除され（ＣＲ）、腫瘍体積およびＲＴＶは対照（生理食塩水）群とは統計学的に異なり（Ｐ＜０．０５）、Ｔ／Ｃ＜４０％であった。パクリタキセル（ＰＴＸ）群とＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート３ｍｇ／ｋｇ群および１．５ｍｇ／ｋｇ群の間には統計学的な差はなかった。ＲＣ８８抗体群、ＭＭＡＥ群、ＲＣ８８抗体＋ＭＭＡＥ群、ＩｇＧ−ＭＭＡＥ群および対照（生理食塩水）群の間には有意な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。

【0115】

実施例７：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートのＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に対する親和性の検出
ＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の親和性を検出するためにフローサイトメーターを使用した。対数増殖期のＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞を１．５ｍＬ ＥＰ試験管（群当たり４×１０^５）中で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＰＢＳで徹底的に洗浄し、上清画分を廃棄し、細胞をパラホルムアルデヒド（２００μＬ、４％）中に再懸濁させ、２５℃で１５分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、２５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清画分を廃棄し、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートを冷１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（ウシ血清アルブミン−ＰＢＳ）緩衝液で１００００ｎｇ／ｍＬから１．５２ｎｇ／ｍＬの３倍勾配に希釈し、各濃度の溶液２００μＬを使用して細胞を再懸濁した。ブランク対照群の細胞を直接冷１％ＢＳＡ−ＰＢＳに再懸濁し、陰性対照群の細胞を１％ＢＳＡで調製したｈＩｇＧ（Ｚｈｏｎｇｋｅ Ｃｈｅｎｙｕ）５μｇ／ｍＬに再懸濁した。インキュベーションを４℃で３０分間実施し、細胞を均一にインキュベートするために上下反転混合を１０分毎に１回実施し、インキュベーション後、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、４℃で２５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を廃棄し、冷ＰＢＳで１：２００に希釈したＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）２００μＬを各試験管に添加し、４℃で３０分間インキュベートし、細胞を均一にインキュベートするために上下反転混合を１０分毎に１回実施した。インキュベーション終了時、細胞を冷ＰＢＳで１回洗浄し、４℃で２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ４００μＬに再懸濁し、検出のためにフローサイトメーター（ＢＤ Ｃａｌｉｂｕｒ）に移し、結果を図１０に示した。結果は、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の両方がＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に対して、それぞれＥＣ５０値１５３．５ｎｇ／ｍＬおよび２５１．４ｎｇ／ｍＬで強い結合親和性を有することを示した。

【0116】

実施例８：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートのＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞への結合活性の検出
ＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞へのＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）の結合活性をＥＬＩＳＡ法によって検出した。対数増殖期のＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞を９６ウェル細胞培養プレート（４×１０^５細胞／ｍＬ、１００μＬ／ウェル）に添加し、ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で一晩インキュベートし、上清画分を廃棄し、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ緩衝液（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド１００μＬをウェル毎に添加し、２５℃で３０分間固定し、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ緩衝液（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、各ウェルに３％ＢＡＳ−ＰＢＳＴ（ウシ血清アルブミン−ＰＢＳＴ）２５０μＬを添加し、室温で２時間インキュベートした後、プレートを０．０５％ＰＢＳＴ緩衝液（２５０μＬ／ウェル）で３回洗浄し、試料を添加し、１）結合曲線：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートを１％ＢＡＳ−ＰＢＳＴ緩衝液で３０００ｎｇ／ｍＬから０．０５ｎｇ／ｍＬの３倍勾配に希釈し、次に９６ウェルプレート（１００μＬ／ウェル）に添加した、２）競合曲線：組換えヒトＭＳＬＮタンパク質（Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ）を１％ＢＡＳ−ＰＢＳＴで１００００ｎｇ／ｍＬから０．５１ｎｇ／ｍＬに希釈し、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートを２０ｎｇ／ｍＬに希釈し、次に同体積のＭＳＬＮタンパク質希釈液と混合し、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、各ウェルに１％ＢＡＳ−ＰＢＳＴで希釈したＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ）（１：２０００）を添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、プレートを３回洗浄し、暗所で５〜１０分間発色させるためにＴＭＢ発色キット（Ｋａｎｇｗｅｉ Ｃｅｎｔｕｒｙ）を使用し、停止のために硫酸２Ｍを使用し、プレートをマイクロプレートリーダーを用いて読み取り、結果を図１１に示した。結果は、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートの両方がＭＳＬＮ陽性腫瘍細胞に強く結合し、ＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートがＲＣ８８抗体と比較してわずかに減少していることを示したが、有意な差はなく、それらのＥＣ_５０値はそれぞれ１１．０±０．８１ｎｇ／ｍＬおよび１９．７±５．８０ｎｇ／ｍＬであることを示した。組換えヒトＭＳＬＮタンパク質の競合実験は、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートがＯｖａｌ−Ｃｉｔａｒ−３−ＭＳＬＮ細胞の表面のＭＳＬＮに特異的に結合することを示した。

【0117】

実施例９：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートおよびＣＡ１２５のＭＳＬＮへの競合結合
ＭＳＬＮに対するＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲート（ＲＣ８８−Ｐｙ−ＭＡＡ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）およびＣＡ１２５の競合結合能力をＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡプレートは、組換えタンパク質ＭＳＬＮ（Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ、２００ｎｇ／ｍＬ）でコーティングした。試料添加：ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートは、２０μｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）から１０点に達するまで、１％ＢＡＳ−ＰＢＳＴ（ウシ血清アルブミン−ＰＢＳＴ）緩衝液で希釈し、組換えタンパク質ＣＡ１２５（ｈｉｓタグ、Ｒ＆Ｄ）は１％ＢＡＳ−ＰＢＳＴ緩衝液で２００ｎｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）まで希釈し、全反応系は１００μＬ／ウェルで、２次抗体（マウス−抗ｈｉｓモノクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ）は５０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェル、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジン）を５〜７分間発色のために使用し、次に、反応を硫酸２Ｍで停止させ、プレートをマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取り、結果を図１２に示した。結果は、組換えＣＡ１２５タンパク質の組換えヒトＭＳＬＮタンパク質への結合はＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートの濃度の増加につれて減少することを示し、ＲＣ８８抗体およびＲＣ８８抗体薬物コンジュゲートは、組換えヒトＣＡ１２５タンパク質の組換えヒトＭＳＬＮタンパク質への結合を遮断することができることを示唆している。

【0118】

上記の説明は、好ましい実施形態を企図しており、例示するだけのものであり、本発明を実施するために必要な性質の組み合わせを制限するものではない。提供した見出しは、本発明の様々な実施形態を制限することを意味するものではない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇ）」などの用語は、制限を意味するものではない。さらに、特に記載しない限り、数字による修飾がないときには複数の形態が含まれ、語句「または」は「および／または」を意味する。本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用した全ての技術用語および科学用語は、当業者によって通常理解されている意味と同じ意味を有する。

【0119】

本出願で言及した出版物および特許は全て、本明細書では参考として組み込まれている。本発明で記載した方法および組成物の数多くの改変および変更が当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態によって説明されているが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載された様式の当業者には明らかな多くの変更は、添付の特許の範囲内に含まれることを企図する。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2021523874000001.app

【国際調査報告】