特表 2021-524280 ハウスダストダニアレルギーの処置および予防

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-524280(P2021-524280A)

(43)【公表日】2021年9月13日

(54)【発明の名称】ハウスダストダニアレルギーの処置および予防

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20210816BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210816BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210816BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210816BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210816BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210816BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210816BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 39/385 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 39/35 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20210816BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20210816BHJP

   C12N 15/36 20060101ALN20210816BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20210816BHJP

   C07K 14/02 20060101ALN20210816BHJP

   C07K 14/435 20060101ALN20210816BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N15/63 Z

   C07K19/00

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   A61P37/08

   A61K39/385

   A61K39/35

   A61K48/00

   A61K47/64

   A61K47/65

   C12N15/36

   C12N15/12

   C07K14/02

   C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2021-514485(P2021-514485)

(86)(22)【出願日】2019年5月17日

(85)【翻訳文提出日】2021年1月15日

(86)【国際出願番号】EP2019062800

(87)【国際公開番号】WO2019219907

(87)【国際公開日】20191121

(31)【優先権主張番号】18173258.7

(32)【優先日】2018年5月18日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520450514

【氏名又は名称】ワーグ ファーマシューティカルズ（ハンジョウ）カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】ヴァレンタ，ルドルフ

(72)【発明者】

【氏名】カリン，ミレラ

(72)【発明者】

【氏名】チェン，クァン−ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】フィルタラ，スザンヌ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C076CC07

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB131

4C084ZB132

4C085AA17

4C085BB03

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045CA01

4H045CA50

4H045DA86

4H045EA22

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、式（Ｉ）：Ｘ_１−Ｙ−Ｘ_２ （Ｉ）を有する融合タンパク質に関する
（式中、Ｘ_１およびＸ_２は、互いに融合したそれぞれ４〜６つのアレルゲン断片またはそれらのバリアントを含み、ここで、前記アレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の少なくとも２つのアレルゲンに由来し、Ｙは担体タンパク質である）。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）
Ｘ_１−Ｙ−Ｘ_２ （Ｉ）
を有する融合タンパク質
（式中、
Ｘ_１およびＸ_２は、互いに融合したそれぞれ４〜８つのアレルゲン断片またはそれらのバリアントを含み、ここで、前記アレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の少なくとも２つのアレルゲンに由来し、
Ｙは担体タンパク質である）。

【請求項2】

前記少なくとも２つのアレルゲンが、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓおよび／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅのものである、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記少なくとも２つのアレルゲンが、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓのものであり、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３からなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記少なくとも２つのアレルゲンのアレルゲン断片が、２５〜５０個のアミノ酸残基、好ましくは２８〜４８個のアミノ酸残基、より好ましくは３０〜４５個のアミノ酸残基からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

アレルゲン断片のシステイン残基のうちの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、特にすべてが、セリン、スレオニン、グリシン、アラニンまたはロイシンで置換されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

ａ）Ｄｅｒ ｐ １のアレルゲン断片が、
ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号１）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号２）、ＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮ（配列番号３）、ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ（配列番号４）、ＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号５）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号６）およびＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮ（配列番号７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｂ）Ｄｅｒ ｐ ２のアレルゲン断片が、
ＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫ（配列番号８）、ＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号９）、ＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫ（配列番号１０）およびＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号１１）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｃ）Ｄｅｒ ｐ ５のアレルゲン断片が、
ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱ（配列番号１２）およびＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ（配列番号１３）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｄ）Ｄｅｒ ｐ ７のアレルゲン断片が、
アミノ酸配列ＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤ（配列番号１４）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｅ）Ｄｅｒ ｐ ２１のアレルゲン断片が、
アミノ酸配列ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹ（配列番号１５）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｆ）Ｄｅｒ ｐ ２３のアレルゲン断片が、
ＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＣＴ（配列番号１６）およびＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴ（配列番号１７）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｇ）Ｄｅｒ ｆ １のアレルゲン断片が、
ＴＳＡＣＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号３８）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号３９）、ＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＣＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮ（配列番号４０）およびＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭ（配列番号４１）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｈ）Ｄｅｒ ｆ ２のアレルゲン断片が、
ＨＧＳＤＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫ（配列番号４２）およびＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＣＨＹＩＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号４３）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｉ）Ｄｅｒ ｆ ５のアレルゲン断片が、
ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱ（配列番号４４）およびＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶ（配列番号４５）
からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｊ）Ｄｅｒ ｆ ７のアレルゲン断片が、
アミノ酸配列ＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤ（配列番号４６）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｋ）Ｄｅｒ ｆ ２１のアレルゲン断片が、
アミノ酸配列ＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤ（配列番号４７）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなり、ならびに／または
ｌ）Ｄｅｒ ｆ ２３のアレルゲン断片が、
アミノ酸配列ＧＹＦＡＤＰＫＤＰＣＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＩＨＫＳＣＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＣＴ（配列番号４８）と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列からなる、
請求項３から５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および／または配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

担体タンパク質が、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの表面ポリペプチドまたは前記表面ポリペプチドの断片である、請求項１から７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

配列番号２７のアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。

【請求項11】

請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項12】

請求項１０に記載の核酸分子または請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項13】

請求項１から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの融合タンパク質、または請求項１０に記載の少なくとも１つの核酸分子を含む医薬調製物。

【請求項14】

調製物に含まれている２つの融合タンパク質または核酸分子が、１：１０〜１０：１の、好ましくは１：５〜５：１の、より好ましくは２：１〜１：２の、より好ましくは１：１の重量比を有する、請求項１３に記載の医薬調製物。

【請求項15】

前記調製物が、配列番号２７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および／もしくは配列番号２８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質、または、
配列番号２７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および／もしくは配列番号２８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードする核酸分子
を含む、
請求項１３または１４に記載の医薬調製物。

【請求項16】

ハウスダストダニのアレルゲンによって引き起こされるアレルギーの処置または予防に使用するための、請求項１から９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１０に記載の核酸分子、または請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬調製物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アレルギー、特にハウスダストダニアレルギーに罹患している患者の免疫療法の分野に関する。

【背景技術】

【0002】

工業先進国における人口の２５％超が、ＩｇＥ媒介アレルギーに罹患している。アレルギー患者は、それ自体は無害の抗原（すなわち、アレルゲン）に対してＩｇＥ抗体の産生が増加していることによって特徴付けられる。Ｉ型アレルギーの即時型症状（アレルギー性鼻炎結膜炎、喘息、皮膚炎、アナフィラキシーショック）は、肥満細胞結合ＩｇＥ抗体のアレルゲン誘導性架橋および生物活性メディエーター（例えば、ヒスタミン、ロイコトリエン）の放出によって引き起こされる。

【0003】

ＷＯ２０１２／１６８４８７には、アレルゲン断片向けの担体タンパク質としてのｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）の表面ポリペプチドの使用が記載されている。

【0004】

Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２（２０１４）：４８６７〜４８７５ページ）では、ＰｒｅＳのＮ末端およびＣ末端に融合されているＤｅｒ ｐ ２３の同一の２つまたは４つのアレルゲン断片を含むタンパク質が開示されている。Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓらによれば、ＰｒｅＳのＣ末端に同一の２つのＤｅｒｐ ２３断片を含み、ＰｒｅＳのＮ末端にその他の同一の２つのＤｅｒ ｐ ２３断片を含む融合タンパク質によって、ＰｒｅＳの両末端に同じＤｅｒ ｐ ２３断片を含む融合タンパク質と比較して、有意なＩｇＥ阻害を示すＤｅｒ ｐ ２３特異的抗体の形成が誘導された。

【0005】

Ｃｕｒｉｎ Ｍら（Ａｌｌｅｒｇｙ ７３（２０１８）：１６５３〜１６６１ページ）は、ワクチンのさらなる開発に使用することができるＤｅｒ ｐ ５およびＤｅｒ ｐ ２１の断片について開示している。

【0006】

ＥＰ２７２７９３４では、ＩｇＥ反応性を欠き、Ｔ細胞反応性を呈するいくつかのＤｅｒ ｐアレルゲンのアレルゲン断片が試験された。

【0007】

Ｈｕｅｙ−Ｊｙ Ｈら（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６（２０１６）：増補版１ １９２、５）は、とりわけ、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ７およびＤｅｒ ｐ ８の断片を含むポリペプチドについて記載している。

【0008】

Ｂｕｓｓｉｅｒｅｓ Ｌら（Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３（２０１０）：１４１〜１５１ページ）ならびにＥＰ１９０８７７６は、成熟Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２を含む融合タンパク質について記載している。

【0009】

ＷＯ２００９／１１８６４２は、少なくとも５０個のアミノ酸残基の長さを有するＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２の断片を含む融合ポリペプチドについて開示している。

【0010】

Ｃｈｅｎ Ａら（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５（２００８）：２４８６〜２４９８ページ）、Ｃａｓｓｅｔ Ａら（Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９（２５３〜２６２ページ）、ＷＯ２０１５／０７０９２５およびＣｈｅｎ Ｋ−Ｗら（Ａｌｌｅｒｇｙ ６７（２０１２）：６０９〜６２１ページ）は、Ｄｅｒ ｐアレルゲンの断片について開示している。これらの断片の一部は、担体タンパク質に結合することが可能である。

【0011】

ハウスダストダニ（ＨＤＭ）は、世界中で最も重要なアレルゲン源の１つの代表である。人口のほぼ１０％およびアレルギー患者の５０％超が、ダニアレルゲンに感作される。ＨＤＭであるＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（Ｄｅｒ ｐ）およびＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａ（Ｄｅｒ ｆ）は世界中で流行している。Ｄｅｒ ｐおよびＤｅｒ ｆのアレルゲンは、そのほとんどがこれまでに特徴付けられている３０種超のタンパク質または糖タンパク質を含む。グループ１、２、および２３のアレルゲン（Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２およびＤｅｒ ｐ ２３、ならびにＤｅｒ ｆ １およびＤｅｒ ｆ ２およびＤｅｒ ｆ ２３）は、ＨＤＭ由来の非常に重要なアレルゲンの代表であり、ＨＤＭアレルギー患者の８０％超が感作されている。しかし、最近、その他のＨＤＭアレルゲン（例えば、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７およびＤｅｒ ｐ ２１ならびにＤｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ７およびＤｅｒ ｆ ２１）が、重要なＨＤＭアレルゲンの代表であり、ＨＤＭアレルギー患者のうち１５％から４０％を超える患者において感作およびアレルギー症状を引き起こすことが示された（Ｐｏｓａら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７年２月；１３９（２）：５４１〜５４９ページ．ｅ８）。これに関連して、現在のアレルゲン抽出物ベースのＨＤＭワクチンは、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１、およびＤｅｒ ｐ ２３に対する十分な防御ＩｇＧ抗体を誘導しないことがわかり、多くのＨＤＭアレルギー患者が治療されないままになっている（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｍａｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｎ ＫＷ、Ｚｉｅｇｌｍａｙｅｒ Ｐ、Ｚｉｅｇｌｍａｙｅｒ Ｒ、Ｌｅｍｅｌｌ Ｐ、Ｈｏｒａｋ Ｆ、Ｂｕｎｕ ＣＰ、Ｖａｌｅｎｔａ Ｒ、Ｖｒｔａｌａ Ｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９年３月；１４３（３）：１２４８〜１２５２ページ．ｅ１２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１８．１０．０４８．Ｅｐｕｂ ２０１８年１１月１４日）。したがって、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１、およびＤｅｒ ｐ ２３ならびに相応するＤｅｒ ｆ アレルゲンに対するブロッキング抗体を誘導することによりＨＤＭアレルギー患者の完全な防御を可能とする、ハウスダストダニアレルギーのアレルギー免疫療法向けのワクチンを発見および開発することが重要な課題として認識された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】ＷＯ２０１２／１６８４８７

【特許文献2】ＥＰ２７２７９３４

【特許文献3】ＷＯ２００９／１１８６４２

【特許文献4】ＷＯ２０１５／０７０９２５

【非特許文献】

【0013】

【非特許文献1】Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９２（２０１４）：４８６７〜４８７５ページ

【非特許文献2】Ｃｕｒｉｎ Ｍら、Ａｌｌｅｒｇｙ ７３（２０１８）：１６５３〜１６６１ページ

【非特許文献3】Ｈｕｅｙ−Ｊｙ Ｈら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９６（２０１６）：増補版１ １９２、５

【非特許文献4】Ｂｕｓｓｉｅｒｅｓ Ｌら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３（２０１０）：１４１〜１５１ページ

【非特許文献5】Ｃｈｅｎ Ａら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５（２００８）：２４８６〜２４９８ページ

【非特許文献6】Ｃａｓｓｅｔ Ａら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５９（２５３〜２６２ページ）

【非特許文献7】Ｃｈｅｎ Ｋ−Ｗら、Ａｌｌｅｒｇｙ ６７（２０１２）：６０９〜６２１ページ

【非特許文献8】Ｐｏｓａら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７年２月；１３９（２）：５４１〜５４９ページ．ｅ８

【非特許文献9】Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｕｓｅ ｄｕｓｔ ｍｉｔｅ−ａｌｌｅｒｇｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｍａｙ ｅｎｈａｎｃｅ ｓｕｃｃｅｓｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｈｅｎ ＫＷ、Ｚｉｅｇｌｍａｙｅｒ Ｐ、Ｚｉｅｇｌｍａｙｅｒ Ｒ、Ｌｅｍｅｌｌ Ｐ、Ｈｏｒａｋ Ｆ、Ｂｕｎｕ ＣＰ、Ｖａｌｅｎｔａ Ｒ、Ｖｒｔａｌａ Ｓ．Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９年３月；１４３（３）：１２４８〜１２５２ページ．ｅ１２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１８．１０．０４８．Ｅｐｕｂ ２０１８年１１月１４日

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

ハウスダストダニアレルギー向けの現在承認されている免疫療法製品は、ＨＤＭの体および糞便粒子からの抽出物に基づいている。これらの製品は、種々の濃度のＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｆ １、およびＤｅｒ ｆ ２を含有する。これらの製品は、関連するＨＤＭアレルゲンすべてを含有するわけではなく、とりわけ、Ｄｅｒ ｐ ２３およびＤｅｒ ｆ ２３の濃度は極めて低い。したがって、これらの製品では、ハウスダストダニアレルギーの患者の処置または予防に不完全な解決策をもたらすだけである（Ｃａｓｓｅｔら、Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１６１（３）：２８７〜２８８ページ）。例を挙げると、ＡＬＫ Ａｂｅｌｌｏが市販している舌下錠は、プラセボと比較してアレルギー症状を平均して１８％軽減するだけである（Ｄｅｍｏｌｙら、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１３７：４４４〜４５１ページ）。異なるハウスダストダニアレルゲンの数が比較的多いことに起因して、強力な免疫療法には、少なくとも最も重要なハウスダストダニアレルゲンをカバーするために、異なる多くのタンパク質およびポリペプチドの投与が必要となるであろう。

【0015】

したがって、本発明の目的は、主要な６種のアレルゲンすべてによって引き起こされるハウスダストダニアレルギーの処置および／または予防に使用することができるワクチンおよびそれに含まれる各成分を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0016】

この目的は、式（Ｉ）
Ｘ_１−Ｙ−Ｘ_２ （Ｉ）
を有する１つまたは複数の融合タンパク質によって解決される
（式中、Ｘ_１およびＸ_２は、互いに融合したそれぞれ４〜８つのアレルゲン断片またはそれらのバリアントを含み、ここで、前記アレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の少なくとも２つのアレルゲンに由来し、Ｙは担体タンパク質である）。

【0017】

本発明の別の態様は、上記の少なくとも１つの融合タンパク質を含む医薬調製物に関する。

【0018】

本発明のさらなる態様は、ハウスダストダニのアレルゲンによって引き起こされるアレルギーの処置または予防に使用するための、本発明の融合タンパク質または医薬調製物に関する。

【0019】

本発明の別の態様は、本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。

【0020】

本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。

【0021】

本発明のさらに別の態様は、本発明による核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】構築物Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）の略図を示す図である。ＰｒｅＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原ＰｒｅＳを表す。「Ｐ」は、表Ｉに記載の、ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３に由来するペプチドを示す。

【図2】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した精製ＰｒｅＳ融合タンパク質を示す図である。

【図3】イムノブロットによって決定した、Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）のＩｇＥ反応性アッセイの結果を示す図である。

【図4-1】Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３がアレルゲン活性を欠いていることを実証する好塩基球活性化アッセイの結果を示す図である。

【図4-2】Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３がアレルゲン活性を欠いていることを実証する好塩基球活性化アッセイの結果を示す図である。

【図5-1】Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６がアレルゲン活性を欠いていることを実証する好塩基球活性化アッセイの結果を示す図である。

【図5-2】Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６がアレルゲン活性を欠いていることを実証する好塩基球活性化アッセイの結果を示す図である。

【図6】Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３に特異的な抗血清による、Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２への患者のＩｇＥ結合の阻害を示す図である。

【図7】Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６に特異的な抗血清による、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３への患者のＩｇＥ結合の阻害を示す図である。

【図8A】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図8B】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図8C】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図8D】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図8E】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図8F】ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図８Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図８Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図８Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図８Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図８Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図８Ｆ）に特異的に結合しているＩｇＧの血清レベルであって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）、８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）、Ｔｙｒｏ−ＳＩＴ（「Ｂｅｎｃａｒｄ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５０３（「ＡＬＫ Ｄ．ｐｔｅｒ」）、Ａｌｕｔａｒｄ ＳＱ ５１０（「ＡＬＫ Ｄｐ／Ｄｆ」）、ＡＣＡＲＯＩＤ（「Ａｌｌｅｒｇｏｐｈ．」）、ＰＵＲＥＴＨＡＬ Ｍｉｌｂｅｎｍｉｓｃｈｕｎｇ（「ＨＡＬ」）、ＣＬＵＳＴＯＩＤ Ｍｉｌｂｅｎ Ｉｎｊｅｋｔｉｏｎｓｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ（「Ｒｏｘａｌ」）およびｎＤｅｒ ｐ１、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清レベルを示す図である。試料は１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した。

【図9-1】免疫原の１回目の注射の前、ならびに１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した血清の、ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図９Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図９Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図９Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図９Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図９Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図９Ｆ）、に特異的に結合しているＩｇＧの血清力価であって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）および８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清力価を示す図である。対照として、それぞれのアレルゲンのＩｇＧの血清力価を、アレルゲンｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３でワクチン接種したウサギの血清試料で決定した。

【図9-2】免疫原の１回目の注射の前、ならびに１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した血清の、ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図９Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図９Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図９Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図９Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図９Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図９Ｆ）、に特異的に結合しているＩｇＧの血清力価であって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）および８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清力価を示す図である。対照として、それぞれのアレルゲンのＩｇＧの血清力価を、アレルゲンｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３でワクチン接種したウサギの血清試料で決定した。

【図9-3】免疫原の１回目の注射の前、ならびに１回目の注射の３８日後および６６日後に回収した血清の、ハウスダストダニアレルゲンＤｅｒ ｐ １（図９Ａ）、Ｄｅｒ ｐ ２（図９Ｂ）、Ｄｅｒ ｐ ５（図９Ｃ）、Ｄｅｒ ｐ ７（図９Ｄ）、Ｄｅｒ ｐ ２１（図９Ｅ）およびＤｅｒ ｐ ２３（図９Ｆ）、に特異的に結合しているＩｇＧの血清力価であって、２０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ２０」）、４０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ４０」）および８０μｇ ＢＭ３５（「ＢＭ３５ ８０」）で免疫したウサギ血清からＥＬＩＳＡによって決定した、血清力価を示す図である。対照として、それぞれのアレルゲンのＩｇＧの血清力価を、アレルゲンｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３でワクチン接種したウサギの血清試料で決定した。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明は、式（Ｉ）
Ｘ_１−Ｙ−Ｘ_２ （Ｉ）
を有する１つまたは複数の融合タンパク質に関する
（式中、Ｘ_１およびＸ_２は、互いに融合したそれぞれ４〜８つのアレルゲン断片またはそれらのバリアントを含み、ここで、前記アレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の少なくとも２つのアレルゲンに由来し、Ｙは担体タンパク質である）。

【0024】

驚くべきことに、式（Ｉ）によって定義される「構成」を有する融合タンパク質が、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の少なくとも２つのアレルゲンに対する抗体のｉｎ ｖｉｖｏ形成を誘導することがわかった。具体的には、担体タンパク質のＣ末端およびＮ末端に４〜８つのアレルゲン断片が存在することは、アレルゲン特異的ＩｇＥの、そのそれぞれのアレルゲンへの相互作用を阻害する抗体の誘導に関して有利な効果を有する。そのような抗体の形成によってアレルギー反応を軽減または予防さえすることが可能になり、その結果、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属のアレルゲンによって引き起こされるアレルギーの処置がもたらされる。

【0025】

本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」とは、２つ以上のポリペプチドおよび／またはペプチドを互いに結合させることによって作り出されたタンパク質またはポリペプチドを指す。融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によってまたは化学共有結合性のコンジュゲーションによって生成することができる。

【0026】

本明細書で使用する場合、「アレルゲン断片」とは、断片化によってアレルゲンから派生させたペプチドストレッチまたはポリペプチドストレッチを指す。

【0027】

互いに融合している４〜８つ、好ましくは４〜６つのアレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ属の１種または複数のハウスダストダニの、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのアレルゲンに、特に１つ、２つ、３つまたは４つのアレルゲンに由来する。これらのアレルゲン断片は、前記アレルゲンの、８〜１００個、好ましくは８〜８０個、より好ましくは８〜６０個、より好ましくは１０〜６０個、より好ましくは１０〜５０個、より好ましくは１５〜５０個、より好ましくは２０〜５０個、より好ましくは２５〜５０個の連続するアミノ酸残基からなる。

【0028】

本発明の融合タンパク質は、同じアレルゲンに由来する２つ以上の断片を含むことができる。かかる場合、断片は、同じアレルゲンの、異なる（すなわち、隣接していない）領域に由来しても隣接領域に由来してもよい。後者の場合、断片の順序は、断片が由来するアレルゲンにおけるのとは異なってもよい。

【0029】

本発明の融合タンパク質はまた、同じまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する１つまたは複数のアレルゲン断片を含むことができる。本明細書で使用する場合、「実質的に同じ」とは、同じアレルゲンに由来する２つ以上の配列が、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示すことを意味する。

【0030】

第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との同一性の程度は、ある特定のアルゴリズムを使用して両アミノ酸配列間の直接比較によって決定することができる。そのようなアルゴリズムは、例を挙げると、種々のコンピュータプログラムまたはウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）（例えば、「ＢＬＡＳＴ ２ ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ（ｂｌａｓｔｐ）」（Ｔａｔｕｓｏｖａら（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７〜２５ページ；Ｃｏｒｐｅｔ Ｆ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１〜１０８９０ページ）に、以下のパラメータ：マトリックス ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップ１１およびエクステンションギャップ１のペナルティ；ギャップｘ＿ドロップオフ５０；期待値 １０．０ワードサイズ３；フィルター：無し、と共に組み込まれている。

【0031】

本発明の融合タンパク質はまた、アレルゲン断片のバリアントを含むことができる。アレルゲン断片の特定の好ましいバリアントは、アレルゲン断片と比較して、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個のアミノ酸交換を含む。特に好ましいのは、アレルゲン断片中に天然に存在する少なくとも１個の、好ましくは少なくとも２個の、より好ましくは少なくとも３個のシステイン残基、特にすべてのシステイン残基の、他のアミノ酸残基、好ましくはセリン、スレオニン、グリシン、アラニン、またはロイシン残基による交換である。したがって、本発明のアレルゲン断片のバリアントは、好ましくは、システイン残基を１個も含有しない。

【0032】

本発明の融合タンパク質内のアレルゲン断片は、互いに直接融合していてもよいし、単一のアミノ酸残基または２〜３０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個のアミノ酸残基からなるリンカーペプチドによって隔てられていてもよい。また、Ｘ_１／Ｘ_２および担体タンパク質Ｙは、上で定義したように、単一のアミノ酸残基またはリンカーペプチドによって隔てられていてもよい。

【0033】

本発明の融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の発現系において組換えで産生することができる。特に好ましい発現系には、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、または、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＳ２細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９もしくはＳｆ２１細胞、またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＴＮｉ細胞などの昆虫細胞、が含まれる。

【0034】

本発明の融合タンパク質のアレルゲン断片は、任意のハウスダストダニに由来していてよい。しかし、ほとんどのヒトにアレルギー反応を引き起こすハウスダストダニ由来のアレルゲンを使用することが特に好ましい。したがって、アレルゲン断片は、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓおよび／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅのアレルゲンに由来することが好ましい。

【0035】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも２つのアレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓのものであり、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３からなる群から選択される。

【0036】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも２つのアレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅのものであり、Ｄｅｒ ｆ １、Ｄｅｒ ｆ ２、Ｄｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ ２１およびＤｅｒ ｆ ２３からなる群から選択される。

【0037】

アレルギーのヒトは、同じ給源に由来するアレルゲンに対して異なる反応をする。Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓおよび／またはＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｆａｒｉｎａｅによって引き起こされるハウスダストダニアレルギーに罹患しているヒトは、それぞれ、アレルゲンＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２に対してもＤｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３に対しても、ならびに、アレルゲンＤｅｒ ｆ１およびＤｅｒ ｆ ２に対してもＤｅｒ ｆ ５、Ｄｅｒ ｆ ７、Ｄｅｒ ｆ２１およびＤｅｒ ｆ ２３に対しても反応する。したがって、これらのアレルゲンのうちの１つまたは複数のアレルゲン断片を含む融合タンパク質を提供することが特に好ましい。

【0038】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、上記少なくとも２つのアレルゲンのアレルゲン断片は、２５〜５０個のアミノ酸残基、好ましくは２８〜４８個のアミノ酸残基、より好ましくは３０〜４５個のアミノ酸残基からなる。

【0039】

本発明の好ましい実施形態によれば、アレルゲン断片のシステイン残基のうちの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、特にすべてが、セリン、スレオニン、グリシン、アラニンまたはロイシンで置換されている。

【0040】

本発明の融合タンパク質で使用されるアレルゲン断片のうちの一部またはすべてのシステイン残基は、他のアミノ酸残基で置換されていてもよい。１個または複数のシステイン残基の置換によって、本発明の融合タンパク質の組換え体発現中またはそのプロセシング（例えば、封入体からの融合タンパク質の精製、ワクチン製剤の製造）中に形成される可能性のあるジスルフィド結合の数を減少することができる。さらに、アレルゲン断片内のシステイン残基の置換によって、融合タンパク質中の遊離硫黄基の減少または完全な排除がもたらされ、その結果、かかる基が他の化合物と反応することが可能となることを防止する。

【0041】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ １のアレルゲン断片は、ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号１）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号２）、ＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮ（配列番号３）、ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ（配列番号４）、ＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号５）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号６）およびＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮ（配列番号７）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0042】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ ２のアレルゲン断片は、ＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫ（配列番号８）、ＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号９）、ＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫ（配列番号１０）およびＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0043】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ ５のアレルゲン断片は、ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱ（配列番号１２）およびＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ（配列番号１３）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0044】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ ７の断片は、アミノ酸配列ＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤ（配列番号１４）と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0045】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ ２１の断片は、アミノ酸配列ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹ（配列番号１５）と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0046】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｐ ２３の断片は、ＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＣＴ（配列番号１６）およびＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴ（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0047】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ １のアレルゲン断片は、ＴＳＡＣＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡ（配列番号３８）、ＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱ（配列番号３９）、ＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＣＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮ（配列番号４０）およびＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭ（配列番号４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0048】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ ２のアレルゲン断片は、ＨＧＳＤＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫ（配列番号４２）およびＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＣＨＹＩＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮ（配列番号４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0049】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ ５のアレルゲン断片は、ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱ（配列番号４４）およびＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶ（配列番号４５）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0050】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ ７の断片は、アミノ酸配列ＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤ（配列番号４６）と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0051】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ ２１の断片は、アミノ酸配列ＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤ（配列番号４７）と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0052】

本発明の好ましい実施形態によれば、Ｄｅｒ ｆ ２３の断片は、ＧＹＦＡＤＰＫＤＰＣＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＩＨＫＳＣＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＣＴ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列からなる。

【0053】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、Ｘ_１は、Ｄｅｒ ｐ １の４つのアレルゲン断片およびＤｅｒ ｐ ２の２つの断片あるいはＤｅｒ ｐ ２１の３つの断片およびＤｅｒ ｐ ２３の３つの断片を含む。

【0054】

驚くべきことに、これらのアレルゲン断片を任意の順序で含むまたはそれらからなるＸ_１が担体タンパク質のＮ末端に融合されていると、それぞれの天然に存在するアレルゲンのアレルゲン特異的ＩｇＥへの結合を阻害することができる抗体の形成がもたらされることがわかった。これによって、かかる融合タンパク質をワクチンとして使用して、それぞれのアレルゲンによって引き起こされるアレルギー反応を処置または予防することができる。

【0055】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、Ｘ_２は、Ｄｅｒ ｐ １の２〜４つのアレルゲン断片およびＤｅｒ ｐ ２の２つの断片あるいはＤｅｒ ｐ ５の４つの断片、Ｄｅｒ ｐ ７の２つの断片を含む。

【0056】

担体タンパク質のＣ末端に融合されたＸ_２は、任意の順序で前述のアレルゲン断片を含むまたはそれらからなることができる。担体タンパク質のＣ末端上のかかるアレルゲン断片によって、それぞれの天然に存在するアレルゲンのアレルゲン特異的ＩｇＥへの結合を阻害することができる抗体の形成を誘導する融合タンパク質がもたらされることがわかった。これによって、かかる融合タンパク質をワクチンとして使用して、それぞれのアレルゲンによって引き起こされるアレルギー反応を処置または予防することができる。

【0057】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、融合タンパク質は、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４および／または配列番号２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む。

【0058】

配列番号１８および１９のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、アレルゲンＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２の断片を含む。

【0059】

配列番号１８：
ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮ

【0060】

配列番号１９：
ＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧ

【0061】

配列番号１８からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１である。

【0062】

配列番号１９からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_２である。

【0063】

配列番号２０および２１のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、アレルゲンＤｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３の断片を含む。

【0064】

配列番号２０：
ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴ

【0065】

配列番号２１：
ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ

【0066】

配列番号２０からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１である。

【0067】

配列番号２１からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_２である。

【0068】

配列番号２２および２３のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、アレルゲンＤｅｒ ｆ １およびＤｅｒ ｆ ２の断片を含む。

【0069】

配列番号２２：
ＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＣＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮＨＧＳＤＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫＨＧＳＤＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＣＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮ

【0070】

配列番号２３：
ＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＣＨＹＩＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＣＨＹＩＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＳＡＣＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＳＡＣＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡ

【0071】

配列番号２２からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１である。

【0072】

配列番号２３からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_２である。

【0073】

配列番号２４および２５のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、アレルゲンＤｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３の断片を含む。

【0074】

配列番号２４：
ＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＧＹＦＡＤＰＫＤＰＣＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＩＨＫＳＣＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＣＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＣＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＩＨＫＳＣＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＣＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＣＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＩＨＫＳＣＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＣＴ

【0075】

配列番号２５：
ＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶ

【0076】

配列番号２４からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１である。

【0077】

配列番号２５からなるポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_１またはＸ_２とすることができ、それによって、本発明の最も好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、式（Ｉ）のＸ_２である。

【0078】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、担体タンパク質は、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの表面ポリペプチドまたは当該表面ポリペプチドの断片である。

【0079】

本発明の好ましい実施形態によれば、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスである。

【0080】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスの表面ポリペプチドは、ＰｒｅＳである。

【0081】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、表面ポリペプチドの断片は、Ｂ型肝炎ＰｒｅＳ１またはＢ型肝炎ＰｒｅＳ２である。

【0082】

本発明の好ましい実施形態によれば、担体タンパク質は、配列番号２６と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0083】

本発明で使用される担体タンパク質は、配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＴ２８６７８．１）のアミノ酸配列を含むまたはそれからなることができる。
ＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮ

【0084】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、融合タンパク質は、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３と、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、特に１００％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。

【0085】

本発明の融合タンパク質は、担体タンパク質ＹとしてＰｒｅＳ、および担体タンパク質に隣接して位置する２つのポリペプチドＸ_１とＸ_２とをそれぞれ形成する種々のアレルゲンの断片を含むことができる（式（Ｉ）を参照されたい）。特に好ましい融合タンパク質は、アレルゲンＤｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３の断片を含む。かかる融合タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むまたはそれらからなることができる。

【0086】

配列番号２７（「Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３」）
ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧ

【0087】

配列番号２８（「Ｄｅｒ ｐ ５７２１２３＿Ｐ６（大）」）
ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＶＨＫＤＳＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＳＴＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ

【0088】

配列番号２９（「Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ１」）
ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧ

【0089】

配列番号３０（「Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ２」）
ＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＳＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＨＧＳＥＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＳＨＹＭＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＮＡＳＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧ

【0090】

配列番号３１（「Ｄｅｒ ｐ ５．７．２１．２３＿Ｐ４Ｐ５」）
ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＨＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＣＴＫＦＹＩＣＳＮＷＥＡＶＨＫＤＣＰＧＮＴＲＷＮＥＤＥＥＴＣＴＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ

【0091】

配列番号３２（「Ｄｅｒ ｐ ５＿７＿２１ Ｃ１」）
ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ

【0092】

配列番号３３（「Ｄｅｒ ｐ ５＿７＿２１ Ｃ２」）
ＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＹＮＹＥＦＡＬＥＳＩＫＬＬＩＫＫＬＤＥＬＡＫＫＶＫＡＶＮＰＤＥＹＹＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＥＲＩＨＥＱＩＫＫＧＥＬＡＬＦＹＬＱＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＶＤＥＡＶＡＡＩＥＫＳＥＴＦＤＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶＥＱＹＮＬＥＭＡＫＫＳＧＤＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＡＲＶＫＫＩＥＶ

【0093】

配列番号３６（「Ｄｅｒ ｆ １／２ Ｃ３」）
ＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＳＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮＨＧＳＤＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫＨＧＳＤＰＳＩＩＨＲＧＫＰＦＮＬＥＡＩＦＤＡＮＱＮＴＫＴＡＫＶＲＮＳＷＤＴＴＷＧＤＳＧＹＧＹＦＱＡＧＮＮＬＭＭＩＥＱＹＰＹＶＶＩＭＱＮＧＶＶＥＥＲＳＹＰＹＶＡＲＥＱＱＳＲＲＰＮＳＱＨＹＧＩＳＮＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＳＨＹＩＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＥＶＤＶＰＧＩＤＴＮＡＳＨＹＩＫＳＰＬＶＫＧＱＱＹＤＡＫＹＴＷＮＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＳＡＳＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＴＳＬＤＬＳＥＱＥＬＶＤＳＡＳＱＨＧＳＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＴＳＡＳＲＩＮＳＶＮＶＰＳＥＬＤＬＲＳＬＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＳＧＳＳＷＡＦＳＧ

【0094】

配列番号３７（「Ｄｅｒ ｆ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６」）
ＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＹＮＦＥＴＡＶＳＴＩＥＩＬＶＫＤＬＡＥＬＡＫＫＶＫＡＶＫＳＤＤＧＹＦＡＤＰＫＤＰＳＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＩＨＫＳＳＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＳＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＩＨＫＳＳＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＳＴＧＹＦＡＤＰＫＤＰＳＫＦＹＩＳＳＮＷＥＡＩＨＫＳＳＰＧＮＴＲＷＮＥＫＥＬＴＳＴＧＧＷＳＳＫＰＲＫＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＩＫＤＨＷＰＡＡＮＱＶＧＶＧＡＦＧＰＧＬＴＰＰＨＧＧＩＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＳＴＩＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＡＦＨＱＡＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＡＰＮＩＡＳＨＩＳＳＩＳＡＲＴＧＤＰＶＴＮＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱＤＹＱＮＥＦＤＦＬＬＭＱＲＩＨＥＱＭＲＫＧＥＥＡＬＬＨＬＱＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤＤＰＩＨＹＤＫＩＴＥＥＩＮＫＡＩＤＤＡＩＡＡＩＥＱＳＥＴＩＤＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶＥＲＹＮＶＥＩＡＬＫＳＮＥＩＬＥＲＤＬＫＫＥＥＱＲＶＫＫＩＥＶ

【0095】

本発明の別の態様は、本発明による少なくとも１つの融合タンパク質を含む医薬調製物（すなわち、ワクチン製剤）に関する。

【0096】

本発明の好ましい実施形態によれば、調製物は、配列番号２７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質および配列番号２８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。

【0097】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、前記調製物は、１０ｎｇ〜１ｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１０ｍｇ、とりわけ０．５μｇ〜２００μｇの本発明の融合タンパク質または前記融合タンパク質をコードする核酸分子または前記核酸分子を含むベクターを含む。

【0098】

本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の融合タンパク質は、０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１ｐｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重の量で少なくとも１回個体に投与される。

【0099】

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、融合タンパク質は、体重とは無関係に（すなわち、用量は、１５、２０、２５、３０、または８０μｇを含むことができる）または体重１ｋｇ当たりのいずれかで、５〜１００μｇ、好ましくは１０〜８０μｇ、より好ましくは１０〜４０μｇの量で患者に投与される。

【0100】

賦形剤と組み合わせて単一剤形を製造することができる融合タンパク質の量は、処置されるホストおよび投与の特定様式によって変わることになる。ポリペプチド構築物の用量は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の抗体応答を誘発する能力などの要因に応じて異なってもよい。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調整することができる。例えば、数回に分けた用量を毎日投与してもよいし、治療状況の危急性が示す通りに用量を比例的に減少してもよい。ポリペプチド構築物の用量はまた、状況に応じて最適な予防用量応答を提供するように様々であってもよい。例を挙げると、本発明の融合タンパク質は、アレルゲン特異的なＩｇＧ誘導のレベルに常に応じて、数日、１週間もしくは２週間の間隔で、またはさらには数カ月の間隔で個体に投与してもよい。

【0101】

本発明の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および医薬調製物は、２〜１０回の間、好ましくは２〜７回の間、さらにより好ましくは５回まで適用される。本発明のさらに好ましい実施形態では、単一のブースターの適用は、第１の投与スケジュールに続いて３カ月〜５年の間、与えられる。こういったブースターの適用は、２〜１０回の間、好ましくは２〜５回の間、最も好ましくは２〜３回の間で繰り返してもよい。特に好ましい実施形態では、続いて行うワクチン接種間の時間間隔は、２週間〜５年の間、好ましくは３週間〜３年までの間、より好ましくは３週間〜１年の間であるように選択される。本発明の融合タンパク質の反復投与により、処置の最終効果を最大限にすることができる。

【0102】

本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または医薬調製物は、３〜６回、好ましくは５回の毎月注射を使用して適用され、これに続いて、上記のブースター注射を１〜６カ月毎に、好ましくは３〜４カ月毎に、少なくとも１年間、好ましくは少なくとも２年間、より好ましくは２から６年間、より好ましくは３から５年間、与えることができる。

【0103】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記調製物は、少なくとも１つのアジュバント、医薬的に許容される賦形剤および／または防腐剤をさらに含む。

【0104】

本発明の融合タンパク質および医薬調製物は、皮下、筋肉内、静脈内、粘膜等に投与することができる。剤形および投与経路に応じて、本発明のポリペプチド構築物を賦形剤、希釈剤、アジュバントおよび／または担体と組み合わせることができる。好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムである。ワクチン製剤の製造に適したプロトコルは当業者に公知であり、例えば「Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、Ｍ．Ｐ．Ｃｒａｎａｇｅ、Ｍ．Ｈｕｄｓｏｎ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、米国；第２版 ２００３）に見いだすことができる。

【0105】

本発明の融合タンパク質はまた、ワクチンにおいて通常的に使用される他のアジュバントと共に製剤化してもよい。例を挙げると、適切なアジュバントは、ＭＦ５９、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サポニン（例えばＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ポリフォスファゼン、乳剤（例えば、フロイントのもの、ＳＡＦ）、リポソーム、ビロソーム、イスコム、コクリエート、ＰＬＧ微粒子、ポロキサマー粒子、ウイルス様粒子、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、変異体毒素（例えばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２）、微粒子、および／または重合リポソームとすることができる。適切なアジュバントは市販されており、例えば、ＡＳＯ１Ｂ（リポソーム製剤でのＭＰＬおよびＱＳ２１）、ＡＳＯ２Ａ、ＡＳ１５、ＡＳ−２、ＡＳ−０３、およびこれらの誘導体（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、米国）；ＣＷＳ（細胞壁骨格）、ＴＤＭ（トレハロース−６，６’−ジミコレート）、ＬｅＩＦ（リーシュマニア伸長開始因子）、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム塩、鉄塩、または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖類；カチオン誘導体化またはアニオン誘導体化多糖類；ポリフォスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびＱｕｉｌ Ａである。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイキン−１２などのサイトカインも、アジュバントとして使用することができる。Ｔｈ１型優位の応答（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ Ｔｈｌ−ｔｙｐｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発するのに使用するための好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）と場合によりアルミニウム塩との組合せを含む。モノホスホリルリピドＡと界面活性剤とを含む水性製剤は、ＷＯ９８／４３６７０に記載されている。

【0106】

別の好ましいアジュバントは、サポニンまたはサポニンの模倣物もしくは誘導体であり、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）であり、これは単独で使用しても、他のアジュバントとの組合せで使用してもよい。例えば、増強システムはモノホスホリルリピドＡとサポニンの誘導体との組合せ、例えば、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組合せを含む。他の好ましい製剤は、水中油型乳剤およびトコフェロールを含む。特に強力なアジュバント製剤は、水中油型乳剤でのＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、およびトコフェロールである。本発明での使用のためのさらなるサポニンのアジュバントは、ＱＳ７（ＷＯ９６／３３７３９およびＷＯ９６／１１７１１に記載）およびＱＳ１７（米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ０３６２２７９Ｂ１に記載）を含む。

【0107】

本発明の医薬調製物は、最も好ましくは、アジュバントとして水酸化アルミニウムを含む。

【0108】

本発明の別の態様は、本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子とすることができる。核酸分子は、任意の種類の生物細胞にトランスフェクトまたは導入することができるベクター（例えば、タンパク質発現ベクター、組み込みベクター、クローニングベクター）の一部とすることができる。好ましい細胞には、大腸菌などの細菌細胞、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞および昆虫細胞が含まれる。かかる核酸分子、ベクターおよび細胞を得るための手段および方法は、当業者によく知られている。

【0109】

本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子はまた、それを必要とする対象にワクチン接種するのに直接使用することができる。これらの核酸分子は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子とすることができる。

【0110】

本発明のさらなる態様は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。

【0111】

本発明の好ましい実施形態によれば、前記ベクターは、発現ベクターまたはクローニングベクターである。ベクターは、細菌、真菌、昆虫、ウイルスまたは哺乳動物のベクターとすることができる。

【0112】

本発明のベクターは、細菌、酵母、糸状菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞またはその他の任意の原核生物細胞もしくは真核生物細胞のような種々の宿主におけるクローニングおよび発現の目的で好ましくは用いることができる。したがって、前記ベクターは、本発明による融合タンパク質をコードする核酸の他にも、宿主特異的調節配列を含む。

【0113】

本発明のさらに別の態様は、本発明による核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。

【0114】

本発明のさらなる態様は、ハウスダストダニのアレルゲンによって引き起こされる、特に、Ｄｅｒ ｐ １、Ｄｅｒ ｐ ２、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１またはＤｅｒ ｐ ２３によって引き起こされる、アレルギーの処置または予防に使用するための、本発明による融合タンパク質または本発明による医薬調製物に関する。

【0115】

「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書で使用する場合、本発明による融合タンパク質または医薬調製物の投与の結果である、対象におけるアレルギーまたはその症状の再発、発生および発症の予防または阻害を指す。一部の実施形態では、「予防する」および「予防」とは、特定のアレルゲンに対するアレルギーを発症するリスクの低減を指す。「予防する」という用語は、アレルギーの発生を予防するための措置だけでなく、アレルギーの進行を阻止し、いったん確立したアレルギーの帰結を軽減するための措置に及ぶ。

【0116】

本明細書で使用する場合、「処置」および「処置する」という用語は、アレルギーの進行および持続の軽減または阻害、アレルギーの重症度の軽減または軽快、およびその１つまたは複数の症状の軽快を指す。「処置」とは、アレルギーまたはアレルギー反応の症状の改善および／または好転も包含する。アレルギーに関連する任意のパラメータの改善を引き起こす融合タンパク質は、治療的融合タンパク質またはコンジュゲートとして同定することができる。「処置」という用語は、治療的処置と予防的措置の両方を指す。例えば、本発明の組成物および方法による処置から利益を得ることができる個体としては、アレルギーを既に有するヒトならびにアレルギーを予防する予定の個体が挙げられる。

【0117】

本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、それに限定されることはない。

【実施例】

【0118】

（実施例１）本発明の融合タンパク質で使用するアレルゲン断片の設計
目的のアレルゲン配列にまたがるペプチドは、ＥｘＰＡＳＹサーバーからのＰｒｏｔＳｃａｌｅバイオインフォマティクスツールによって決定したアミノ酸の表面露出の予測に基づいて同定した（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｓｃａｌｅ／）。ペプチドがその配列にシステイン残基を含有していない場合は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にペプチドが結合できるようにするために、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にシステインを付加した。ペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ ４３３Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、米国）を使用して合成し、続いて、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）（Ｆｏｃｋｅら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００１；１５（１１）：２０４２〜４ページ）によって精製した。ペプチドのサイズと同一性は、質量分析法（Ｂｒｕｋｅｒ、オーストリア）によって確認した。

【0119】

ハウスダストダニアレルゲンである、Ｄｅｒ ｐ １（ＴＮＡＣＳＩＮＧＮＡＰＡＥＩＤＬＲＱＭＲＴＶＴＰＩＲＭＱＧＧＣＧＳＣＷＡＦＳＧＶＡＡＴＥＳＡＹＬＡＹＲＮＱＳＬＤＬＡＥＱＥＬＶＤＣＡＳＱＨＧＣＨＧＤＴＩＰＲＧＩＥＹＩＱＨＮＧＶＶＱＥＳＹＹＲＹＶＡＲＥＱＳＣＲＲＰＮＡＱＲＦＧＩＳＮＹＣＱＩＹＰＰＮＶＮＫＩＲＥＡＬＡＱＴＨＳＡＩＡＶＩＩＧＩＫＤＬＤＡＦＲＨＹＤＧＲＴＩＩＱＲＤＮＧＹＱＰＮＹＨＡＶＮＩＶＧＹＳＮＡＱＧＶＤＹＷＩＶＲＮＳＷＤＴＮＷＧＤＮＧＹＧＹＦＡＡＮＩＤＬＭＭＩＥＥＹＰＹＶＶＩＬ；配列番号３４）、Ｄｅｒ ｐ ２（ＤＱＶＤＶＫＤＣＡＮＨＥＩＫＫＶＬＶＰＧＣＨＧＳＥＰＣＩＩＨＲＧＫＰＦＱＬＥＡＶＦＥＡＮＱＮＳＫＴＡＫＩＥＩＫＡＳＩＥＧＬＥＶＤＶＰＧＩＤＰＮＡＣＨＹＭＫＣＰＬＶＫＧＱＱＹＤＩＫＹＴＷＩＶＰＫＩＡＰＫＳＥＮＶＶＶＴＶＫＶＭｅｔＧＤＮＧＶＬＡＣＡＩＡＴＨＡＫＩＲＤ；配列番号３５）、Ｄｅｒ ｐ ５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｘ１７６９９）、Ｄｅｒ ｐ ７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：Ｕ３７０４４）、Ｄｅｒ ｐ ２１（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：ＤＱ３５４１２４）およびＤｅｒ ｐ ２３（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．：ＥＵ４１４７５１．１）に由来するアレルゲン断片を表Ｉに列挙するが、これらは、ＩｇＥ反応性、好塩基球活性化、免疫原性、およびアレルゲン特異的ＩｇＥ分子のブロッキングについて試験したものである。

【0120】

【表1】

【0121】

ペプチドのＩｇＥ反応性は、ドットブロット分析によって決定した。この目的のために、相応するアレルゲンの、各ペプチドの一定分量０．５μｇおよび対照としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をＷｈａｔｍａｎ Ｐｒｏｔｒａｎニトロセルロース膜（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）上にドットした。ゴールドバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７．４］、０．５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ、および０．０５％［ｗ／ｖ］アジ化ナトリウム）で２０分間、３回ブロッキングした後、ＨＤＭアレルギー患者の血清（ゴールドバッファ中１：１０）でまたは非アレルギーのヒトからの血清（ゴールドバッファ中１：１０）で４℃で一晩、膜をインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体を、１：１０に希釈したＩ１２５標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂｓ（Ｄｅｍｅｄｉｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋｉｅｌ、ドイツ）で検出し、オートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ ＸＯＭＡＴフィルム）によって視覚化した。

【0122】

ペプチドの免疫原性を決定するために、ウサギを、各ＫＬＨ−コンジュゲートペプチド（２００μｇ／注射）で３回（４週間後の１回目のブースター注射および７週間後の２回目のブースター注射）、ならびに、対照目的の場合、フロイントの完全アジュバント１回およびフロイントの不完全アジュバント２回（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｃｈａｔｉｌｌｏｎ ｓｕｒ Ｃｈａｌａｒｏｎｎｎｅ、フランス）および／またはＡｌ（ＯＨ）_３（Ｓｅｒｖａ）を使用してそれぞれのアレルゲン（２００μｇ／注射）で免疫した。ウサギの免疫応答をＥＬＩＳＡ力価測定によって解析した。特定のウサギＩｇＧ抗体を測定するために、ＥＬＩＳＡプレートをそれぞれのアレルゲンで一晩コーティングした。ブロッキング後、プレートを、相応するウサギ抗血清、または非免疫のウサギからの血清の連続希釈（１：５００、１：２，０００、１：１０，０００および１：２０，０００）で一晩インキュベートした。結合したウサギＩｇＧ抗体を、１：１，０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）で検出した。

【0123】

ペプチドＩｇＧのブロッキング能力を決定するために、それぞれのアレルゲン１μｇ／ｍＬで一晩コーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）を、抗ペプチド抗血清、抗アレルゲン抗血清のそれぞれと共に、または、対照目的の場合、非免疫のウサギからの血清と共に（すべて１：５０の希釈で）、２４時間プレインキュベートし、次いで、洗浄した。ＨＤＭアレルギー患者からの血清（１：１０に希釈）と共に一晩インキュベートした後、結合したＩｇＥ抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で検出した。ウサギ抗血清とのプレインキュベーションによって得られたＩｇＥ結合の減少の百分率は、以下の通りに計算した：１００−（ＯＤＩ／ＯＤＰ）×１００）。ＯＤＩおよびＯＤＰは、それぞれ、ウサギ免疫血清または正常ウサギ血清とのプレインキュベーション後の光学濃度値を表す。

【0124】

ペプチドのアレルゲン活性を試験するために、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩを発現するラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ）（１×ｌ０^５／ウェル）に、ＨＤＭアレルギー患者からの血清を、対照目的の場合、１人の非アレルギーの個体からの血清を、１：１０の希釈で、一晩ロードした。細胞をタイロードバッファ（Ｓｉｇｍａ、オーストリア）で３回洗浄し、アレルゲンとペプチドの連続希釈に１時間曝露した。上清を前記のようにβ−ヘキソサミニダーゼ活性について分析した。実験は３連で実施したが、結果を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加後に放出された総β−ヘキソサミニダーゼの平均百分率＋／−平均のＳＥ（ＳＥＭ）として提示する。

【0125】

【表2】

【0126】

（実施例２）タンパク質の組換え産生
融合タンパク質Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）をコードする遺伝子（大腸菌発現向けにコドン最適化した）を合成し（ＡＴＧ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ、Ｍｅｒｚｈａｕｓｅｎ、ドイツおよびＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、米国）、ｐＥＴ−２７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ドイツ）のＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入した。組換えタンパク質を、大腸菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）において発現させた。Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３（図１を参照されたい；配列番号２７）の発現を、細菌培養物に０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、３７℃で３時間インキュベートすることにより、ＯＤ６００が０．４で誘導した。Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）（図１を参照されたい；配列番号２８）を、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、培養物を３７℃で２．５時間インキュベートすることにより、ＯＤ６００が０．６で誘導した。

【0127】

回収しプロテアーゼ阻害剤を添加して、可溶性細菌タンパク質を除去するために封入体の調製を行った。部分的に精製されたＤｅｒ ｐ １−２ Ｃ３タンパク質を含有するペレットを、６Ｍ尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ８、４％イソプロパノールに溶解し、ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィーによって引き続き精製を行った。カラムからのタンパク質の溶出を、ＮａＣｌ濃度を直線的に増加させることで行った。高純度の溶出画分を一つにし、段階的透析を行って尿素と塩を除去し、タンパク質が凝集することなくリフォールディングすることを可能にした。Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３タンパク質を、続いて以下の溶液で４℃で最低４〜５時間インキュベートした：１）６Ｍ尿素、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ８、４％イソプロパノール、２）４Ｍ尿素、１０３ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ８、３）２Ｍ尿素、５０．２ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ８、４）１Ｍ尿素、２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ８、５）０．５Ｍ尿素、１２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ８、６）２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ８。

【0128】

Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）を含有する細胞溶解物を６Ｍ尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ７．５、４％イソプロパノールに溶解し、ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに適用し、カラムからのタンパク質の溶出を、ＮａＣｌ濃度を直線的に増加させることで行った。純粋な画分を一つにし、以下の通りに透析した。段階的透析条件Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）：タンパク質を、続いて以下の溶液で４℃で最低４〜５時間インキュベートした：１）６Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ７．５、４％イソプロパノール、２）４Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、３）２Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、４）１Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、５）０．５Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、６）１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、７）５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、８）２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、９）１２．５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５、１０）２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＰＨ７．５。

【0129】

タンパク質の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー染色によってチェックした（図２を参照されたい）。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、リフォールディングしたタンパク質のオリゴマー化が生じてないことを確認した。

【0130】

（実施例３）ＩｇＥ反応性の決定
実施例２の構築物のＩｇＥ反応性を、イムノブロットによって決定した（Ｃｕｒｉｎ Ｍら Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２２（２０１７）：１２１３５ページ）。０．５μｇの精製ｎＤｅｒ ｐ １（天然分離株；受託番号：ＰＤＢ：３ＲＶＷ＿Ａ；参照方法：Ｈａｌｅｓ，Ｂ．Ｊ．ら Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ．３０（２０００）：９３４〜９４３ページ）、ｒＤｅｒ ｐ ２（組換えにより産生したＤｅｒ ｐ ２；Ｃｈｅｎ ＫＷら、Ａｌｌｅｒｇｙ．６７（２０１２）：６０９〜２１ページに公開の配列；参照方法：Ｃｈｅｎ，Ｋ．ら Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５（２００８）：２４８６〜２４９８ページ）、ｒＤｅｒ ｐ ５（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｘ１７６９９；参照方法：Ｗｅｇｈｏｆｅｒ Ｍら Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（２００８）：１０１〜９ページ）、ｒＤｅｒ ｐ ７（ＧｅｎｅＢａｎｋ：Ｕ３７０４４；参照方法：Ｒｅｓｃｈ Ｙら Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ．４１（２０１１）：１４６８〜７７ページ）、ｒＤｅｒ ｐ ２１（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＤＱ３５４１２４；参照方法：Ｗｅｇｈｏｆｅｒ Ｍら Ａｌｌｅｒｇｙ．６３（２００８）：７５８〜６７ページ）、ｒＤｅｒ ｐ ２３（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＥＵ４１４７５１．１；参照方法：Ｗｅｇｈｏｆｅｒ Ｍら Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０（２０１３）：３０５９〜６７ページ）、Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３（実施例２を参照されたい）、Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）（実施例２を参照されたい）を含有する一定分量を、および対照目的の場合は、ＢＳＡを、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ）上にドットした。膜をゴールドバッファ（５０ｍＭリン酸ナトリウム［ｐＨ７．４］、０．５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％［ｗ／ｖ］ＢＳＡ、および０．０５％［ｗ／ｖ］アジ化ナトリウム）で２０分間、３回ブロッキングし、次いで、ハウスダストダニアレルギー患者の血清（ゴールドバッファで１：１０に希釈）と、および非アレルギーのヒトからの血清（ゴールドバッファで１：１０に希釈）と、４℃で一晩インキュベートした。結合したＩｇＥを、１：１０に希釈した１２５Ｉ標識抗ヒトＩｇＥ Ａｂｓ（Ｄｅｍｅｄｉｔｅｃ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｋｉｅｌ、ドイツ）で検出し、前記のようにオートラジオグラフィー（Ｋｏｄａｋ ＸＯＭＡＴフィルム）によって視覚化した（Ｃｕｒｉｎら Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２２（２０１７）：１２１３５ページ）。

【0131】

Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３のＩｇＥ反応性を、ドットブロットアッセイによって、２０人のＨＤＭ感作患者におけるＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２のＩｇＥ反応性と比較した（図３Ａ）。アレルギー患者はＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２と反応したが、Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３と、問題となるＩｇＥ反応性を示した患者はいなかった。非アレルギーの対象（ＮＡ）からの血清では反応性は観察されず、対照タンパク質ＢＳＡもＩｇＥ反応性を示さなかった（図３Ａ）。次の実験では、Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）のＩｇＥ反応性を、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３に対するＩｇＥ反応性と比較した。１８人のＨＤＭ感作患者がＤｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１およびＤｅｒ ｐ ２３と、患者に応じた様式で反応したが、試験した患者のどちらも、Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）とも対照タンパク質ＢＳＡとも反応しなかった（図３Ｂ）。

【0132】

（実施例４）ＩｇＥ競合アッセイ
ブロッキング抗体がアレルギーの免疫療法において主要な役割を果たすことが示されたので、ブロッキング抗体を誘導するペプチドの能力に関する情報は重要である。

【0133】

Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）の哺乳動物への投与によって誘導される免疫グロブリン（特にＩｇＧ）が、ハウスダストダニアレルギーの患者のＩｇＥのハウスダストダニアレルゲンへの結合を阻害する能力を調べるために、ＥＬＩＳＡ競合実験を行った。

【0134】

ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ競合アッセイを行って、抗Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３および抗Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）特異的ウサギＩｇＧによるｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１、ｒＤｅｒ ｐ ２３へのヒトＩｇＥ結合の阻害について分析した。要約すると、それぞれのアレルゲン１μｇ／ｍＬで一晩コーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）を、抗Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３抗血清、抗Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）、比較の場合、それぞれの抗アレルゲン抗血清（抗ｎＤｅｒ ｐ １、抗ｒＤｅｒ ｐ ２、抗ｒＤｅｒ ｐ ５、抗ｒＤｅｒ ｐ ７、抗ｒＤｅｒ ｐ ２１または抗ｒＤｅｒ ｐ ２３の各抗血清）と共に、または、対照目的の場合、非免疫のウサギからの血清と共に、（すべて１：３に希釈）、２４時間プレインキュベートし、次いで、洗浄した。ＨＤＭアレルギー患者からの血清（１：１０に希釈）と一晩インキュベートした後、結合したＩｇＥ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で検出した。ウサギ抗血清とのプレインキュベーションによって得られたＩｇＥ結合の減少の百分率は、以下の通りに計算した：１００−（ＯＤＩ／ＯＤＰ）×１００）（図６および７を参照されたい）。ＯＤＩおよびＯＤＰは、それぞれ、ウサギ免疫血清または正常ウサギ血清とのプレインキュベーション後の光学濃度値を表す（Ｃｕｒｉｎ Ｍら Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２２（２０１７）：１２１３５ページを参照されたい）。

【0135】

本実施例で使用した抗Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３特異的ウサギＩｇＧおよび抗Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）特異的ウサギＩｇＧは、以下のようにして得た。ウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、フランス）をＤｅｒ ｐ １−２ Ｃ３でまたはＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）で３回免疫した（４週間後の１回目のブースター注射および７週間後の２回目のブースター注射）（２００μｇ／注射）。Ａｌ（ＯＨ）_３（Ｓｅｒｖａ）をアジュバントとして使用した。１タンパク質当たり２匹のウサギを免疫した。ウサギの免疫応答をＥＬＩＳＡ力価測定によって分析した。

【0136】

抗Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３抗体で得られたｎＤｅｒ ｐ １への患者ＩｇＥ結合の阻害は、抗ｎＤｅｒ ｐ １での阻害（７８％の平均阻害）に対していくぶんかより低かったが類似していた（５３％および５８％の平均阻害）。ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３抗体で得られたｒＤｅｒ ｐ ２へのＩｇＥ結合の阻害（８９％および８５％の平均）は、ウサギ抗Ｄｅｒ ｐ ２で得られた阻害（平均８４％）と同等であった（図６）。抗Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）で得られたＤｅｒ ｐ ５への患者のＩｇＥ結合の阻害（平均阻害７６％および８５％）は、抗Ｄｅｒ ｐ ５での阻害（平均阻害８８％）と同等であり、一方、Ｄｅｒ ｐ ２１に対する阻害は、抗Ｄｅｒ ｐ ２１（平均阻害８７％）によるものよりも、Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）（平均阻害５８％および５８％）によるものの方がいくぶんか低かった。Ｄｅｒ ｐ ７およびＤｅｒｐ ２３に対する阻害は、抗Ｄｅｒ ｐ ７（５８％）および抗Ｄｅｒ ｐ ２３（７％）によるものよりもＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）（Ｄｅｒ ｐ ７では両方のウサギで７４％、Ｄｅｒ ｐ ２３では４７％および４２％）によるものの方が高かった。（図７）。

【0137】

（実施例５）好塩基球活性化アッセイによって決定したアレルゲン活性
本発明の構築物、特にＤｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）のアレルゲン活性を試験するために、ヒト高親和性ＩｇＥ受容体ＦｃεＲＩを発現するラット好塩基球白血病細胞（ＲＢＬ）（１×１０^５／ウェル）に、ハウスダストダニアレルギー患者からの血清を１：１０の希釈率で一晩ロードした。細胞をタイロードバッファ（Ｓｉｇｍａ、オーストリア）で３回洗浄し、アレルゲン（それぞれ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および１ｎｇ／ｍＬのｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１、ｒＤｅｒ ｐ ２３、Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大））の連続希釈に１時間曝露した。アレルゲンを含まない血清または血清を含まないアレルゲンを陰性対照として使用した。上清を前記のようにβ−ヘキソサミニダーゼ活性について分析した（Ｈａｒｔｌら Ａｌｌｅｒｇｙ ５９（２００４）：６５〜７３ページ）。実験は３回繰返しで実施し、結果を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加後に放出された総β−ヘキソサミニダーゼの平均百分率＋／−平均のＳＥ（ＳＥＭ）として提示する（図４および５を参照されたい）。

【0138】

Ｄｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２は、ＨＤＭアレルギー患者からの血清ＩｇＥをロードした好塩基球からのβ−ヘキソサミニダーゼの放出を誘導したが、一方、Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３は好塩基球を活性化しなかったことがわかった（図４）。次のセットの実験から、Ｄｅｒ ｐ ５、Ｄｅｒ ｐ ７、Ｄｅｒ ｐ ２１、およびＤｅｒ ｐ ２３が、患者に応じた様式で血清ＩｇＥをロードした好塩基球からのβ−ヘキソサミニダーゼの放出を誘導したが、一方、Ｄｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）は同じ患者の血清に対して好塩基球の放出を誘導しなかったことが示された（図５）。これらのデータは、構築物Ｄｅｒ ｐ １−２ Ｃ３およびＤｅｒ ｐ ５ ７ ２１ ２３＿Ｐ６（大）はアレルゲン活性を提示しないことを示している。

【0139】

（実施例６）市販ＨＤＭワクチンと比較した、ＢＭ３５によって誘導されるアレルゲン特異的ＩｇＧの形成
２匹のニュージーランドシロウサギの群を、種々の用量のＢＭ３５（配列番号２７および２８のアミノ酸配列を１：１の重量比で含む融合タンパク質を含む調製物）で、および、製造業者の指示に従って市販の調製物（表ＩＩＩを参照されたい）で、それぞれ皮下免疫した。対照ウサギを、アレルゲンｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１およびｒＤｅｒ ｐ ２３で免疫した。

【0140】

【表3】

【0141】

ハウスダストダニアレルゲン特異的抗体応答を決定する目的で、ハウスダストダニアレルゲンｎＤｅｒ ｐ １、ｒＤｅｒ ｐ ２、ｒＤｅｒ ｐ ５、ｒＤｅｒ ｐ ７、ｒＤｅｒ ｐ ２１、およびｒＤｅｒ ｐ ２３に特異的に結合するＩｇＧの形成をモニタリングするために、１回目の免疫の日、ならびに１回目の免疫の３８日後および６６日後にウサギから血清試料を採取した。アレルゲン特異的ウサギＩｇＧ応答を、血清を１：５００に希釈することによって、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。結合したウサギＩｇＧを、１：２０００希釈ロバ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＩｇＧ抗体（ＮＡ ９３４；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ Ｇｉｌｅｓ、英国）で検出した。発色を、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）を用いて行った。野生型ハウスダストダニアレルゲンで免疫した後に得られた血清を、陽性対照として利用した。

【0142】

図８および９に示す結果によって、ＢＭ３５が市販製品と比較してはるかにより高い力価のアレルゲン特異的ＩｇＧの形成を誘導できることが明確に示されている。特に驚くべきことは、ＢＭ３５が６つのハウスダストダニアレルゲンすべてに対する抗体の形成を誘導したのに対し、一方、市販製品は、はるかにより低いアレルゲン特異的ＩｇＧ力価で、しかもそれぞれのアレルゲンに対してのみという結果であったことである。このように、すべての市販製品が、ＢＭ３５と比較して、非常に限られた数のアレルゲンに特異的に結合するＩｇＧの、より弱い誘導を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【配列表】

2021524280000001.app

【国際調査報告】