特表 2021-524287 改善されたポリヌクレオチド配列検出法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-524287(P2021-524287A)

(43)【公表日】2021年9月13日

(54)【発明の名称】改善されたポリヌクレオチド配列検出法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20210816BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20210816BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6851 ZZNA

   C12N15/09 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

【全頁数】42

(21)【出願番号】特願2021-525387(P2021-525387)

(86)(22)【出願日】2019年7月19日

(85)【翻訳文提出日】2021年2月2日

(86)【国際出願番号】GB2019052017

(87)【国際公開番号】WO2020016590

(87)【国際公開日】20200123

(31)【優先権主張番号】18184575.1

(32)【優先日】2018年7月19日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2018/083227

(32)【優先日】2018年11月30日

(33)【優先権主張国】EP

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521027629

【氏名又は名称】バイオフィデリティ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100157923

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴喰 寿孝

(72)【発明者】

【氏名】バームフォース，バーナビー

(72)【発明者】

【氏名】フレイリング，キャメロン

(72)【発明者】

【氏名】シルバ−ウェザリー，アナ

(72)【発明者】

【氏名】ストラレク−ヤヌツキーヴィチ，マグダレーナ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QR07

4B063QR08

4B063QR14

4B063QR15

4B063QR16

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって： ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し； ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し； ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し； ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する工程によって特徴づけられる、前記方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる、前記方法。

【請求項2】

連結前に、Ａ_１がまず５’−３’方向に伸長されることで特徴づけられるｃ（ｉｉ）またはｃ（ｉｉｉ）を使用する、請求項１に請求するような方法。

【請求項3】

連結および随意に伸長が、連結前にＡ_１がアニーリングする、さらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われ、Ｄが、Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ_１の５’端のいずれかに相補的な領域を含むことで特徴づけられる、請求項１または２に請求するような方法。

【請求項4】

オリゴヌクレオチドＤが、３’修飾のため、またはＤの３’端およびＡ_１の対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ_１に対する伸長を経ることが不可能であることで特徴づけられる、請求項３に請求するような方法。

【請求項5】

工程（ｃ）の後で、反応混合物をエキソヌクレアーゼで処理して、実質的に非連結核酸物質も消化し、そしてｃ（ｉｉ）を使用する場合、オリゴヌクレオチドＣが、３’−５’エキソヌクレアーゼ消化から該オリゴヌクレオチドを保護する３’または内部修飾をさらに含むことでさらに特徴づけられる、請求項１〜４に請求するような方法。

【請求項6】

工程（ｄ）の前にエキソヌクレアーゼを非活性化することでさらに特徴づけられる、請求項５に請求するような方法。

【請求項7】

ｃ（ｉ）を使用する請求項１に請求するような方法であって、Ｂが（ｉ）Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域および（ｉｉ）Ａ_０またはターゲット配列に実質的に相補的でない５’の隣接オリゴヌクレオチド領域を含み、そして工程（ｄ）で用いるプライマーオリゴヌクレオチドの１つがＡ_２の伸長された領域にアニーリングすることで特徴づけられる、前記方法。

【請求項8】

プローブオリゴヌクレオチドＡ_０が、エキソヌクレオリシス（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ）に耐性である５’端を有し、そして工程（ａ）および（ｂ）の後に、そこから産生される反応媒体を、５’−３’エキソヌクレアーゼで処理して、このエキソヌクレオリシスに耐性を与えられていない核酸分子も実質的に除去することで特徴づけられる、先行する請求項いずれかに請求するような方法。

【請求項9】

用いるエキソヌクレアーゼが、５’リン酸基の存在に少なくとも部分的に依存する活性を有し、そして消化がキナーゼおよびリン酸ドナーの存在下で行われることで特徴づけられる、請求項８に請求するような方法。

【請求項10】

工程（ｂ）がホスファターゼの存在下で行われることで特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項11】

工程（ａ）および（ｂ）が反復されて、分析物から、部分的に消化されたプローブＡ_１の多数のコピーを生成することでさらに特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項12】

工程（ｂ）の後で、ピロホスファターゼの添加によって、加ピロリン酸分解反応を停止することで特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項13】

工程（ｅ）が、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブを用いて、多数コピーから得られるシグナルを検出する工程を含むことで特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項14】

工程（ｄ）および（ｅ）が同時に行われることで特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項15】

工程（ｄ）におけるアンプリコンの生成から生じる、長期間に渡るシグナルの増加を用いて、分析物中のターゲット配列の濃度を推測することで特徴づけられる、請求項１４に請求するような方法。

【請求項16】

工程（ａ）の前に、（ｉ）分析物および随意にバックグラウンドゲノムＤＮＡで構成される生物学的試料を、増幅サイクルに供することによって、分析物のアンプリコンを産生し、そして（ｉｉ）工程（ｉ）の産物を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼで消化する工程によって、生物学的試料から一本鎖分析物を得る、ここで使用するプライマーの１つにエキソヌクレアーゼブロッキング基が含まれることで特徴づけられる、先行する請求項のいずれか一項に請求するような方法。

【請求項17】

工程（ａ）の前に、（ｉ）分析物および随意にバックグラウンドゲノムＤＮＡで構成される生物学的試料を増幅サイクルに供することにより分析物のアンプリコンを産生する工程によって生物学的試料から一本鎖分析物を得る、ここで使用するプライマーの１つを他のもの（単数または複数）より過剰に導入することで特徴づけられる、請求項１〜１５のいずれかに請求するような方法。

【請求項18】

工程（ｉ）で用いる増幅法が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを使用し、そして工程（ｉ）の後で、産物をプロテイナーゼと反応させて、ポリメラーゼを破壊し、そして次いで、この反応の産物を加熱することによってプロテイナーゼを破壊することで特徴づけられる、請求項１６または１７に請求するような方法。

【請求項19】

デオキシチミジン三リン酸の代わりにデオキシウリジン三リン酸を用い、そしてＵＴＰ−ＤＮＡグリコラーゼの存在下で、工程（ｉ）を実行することで特徴づけられる、請求項１６〜１８に請求するような方法。

【請求項20】

各々、異なるターゲット配列に対して選択され、そして各々、同定領域を含む、多数のプローブＡ_０を使用することで特徴づけられ、そして工程（ｄ）で増幅する領域にこの同定領域が含まれることでさらに特徴づけられる、先行する請求項のいずれかに請求するような方法。

【請求項21】

工程（ｄ）で生成するアンプリコンが由来する、プローブ（単数または複数）Ａ_０、およびしたがって、分析物中に存在するターゲット配列が、同定領域（単数または複数）の検出を通じて推測されることでさらに特徴づけられる、請求項２０に請求するような方法。

【請求項22】

分子プローブを用いるかまたは配列決定を通じて、同定領域（単数または複数）の検出を行うことで特徴づけられる、請求項２１に請求するような方法。

【請求項23】

（ｅ）が：
ｉ． １つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、Ａ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を標識し；
ｉｉ． 多数コピーの蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ． 変性条件のセットに多数コピーを曝露し；そして
ｉｖ． 変性条件への曝露中に、多数コピーの蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む、請求項２２に請求するような方法。

【請求項24】

工程（ａ）の前に、分析物を多数の反応体積に分割し、各々の体積が、異なるターゲット配列を検出するために導入された、異なるプローブオリゴヌクレオチドＡ_０を有することで特徴づけられる、請求項１〜１９に請求するような方法。

【請求項25】

異なるプローブＡ_０が共通のプライミング部位を含み、工程（ｄ）における増幅のために、単一のまたは単一セットのプライマーを用いることを可能にすることで特徴づけられる、請求項２０〜２４に請求するような方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌、感染性疾患および移植臓器拒絶の同定に用いられるものを含めて、多数の診断マーカーの存在に関して試験するために適した、改善されたポリヌクレオチド配列検出法に関する。これはまた、確実に、そして低コストで、マーカーパネルを同定しなければならないコンパニオン診断試験にも有用である。

【発明の概要】

【0002】

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、確実に検出され、そして／または定量化されうるレベルまで、実験室試料および診断試料に存在するＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するための、周知であり、そして強力な技術である。しかし、低レベルのこうした分子を含有する分析物試料を調べる目的のために適用した場合、いくつかの限界に悩まされる。第一に、この技術は、単一ターゲット分子と同程度に少ない分子を検出可能であるが、試料中に存在する他の核酸配列の望ましくない増幅のため、偽陽性結果を生じる傾向がある。このため、反応を開始するために用いるオリゴヌクレオチドプライマーの選択が重要となり；これは次に、必要なレベルの特異性を持つプライマーを設計することを比較的複雑にする。その結果、現在、市場で入手可能であるＰＣＲに基づく多くの試験は、限定された特異性を有する。

【0003】

第二の欠点は、ＰＣＲに基づく方法の多重化が、実際のところ、プライマー−プライマー相互作用の回避のために、最大、数十のターゲット配列（しばしば１０未満）に限定され、比較的狭い操作ウィンドウの必要性を生じることである。

【0004】

別の問題は、ＰＣＲ反応は、指数関数方式でサイクリングするため、ターゲットの定量化が困難なことであり；反応効率の小さな変動が、生成される検出可能な物質の量に多大な影響を有する。したがって、適切な対照および較正が整っていても、定量化は、典型的には、ほぼ１／３からほぼ３倍の正確さに限定される。

【0005】

最後に、ＰＣＲ増幅法による研究のためにターゲティングされる領域中の突然変異は、望ましくない副作用を有しうる。例えば、ターゲット生物が、試験プライマーによってターゲティングされる遺伝子領域中の突然変異を経て、多数の偽陰性が生じたため、ＦＤＡに認可された試験が撤回されなければならなかった例があった。逆に、特定の一塩基多型（ＳＮＰ）を増幅のためにターゲティングした場合、野生型変異体が存在すると、ＰＣＲ法は、しばしば、偽陽性を生じるであろう。これを回避するには、非常に注意深いプライマー設計が必要であり、そしてさらに多重化の有効性が限定される。癌試験／スクリーニングまたはコンパニオン診断において一般的な要件であるような、ＳＮＰパネルに関する検索の際には、これは特に関連する。

【0006】

発明の要旨
本発明者らは、現在、これらの限界の多くを克服するため、本発明者らの以前の配列決定特許（例えばＷＯ ２０１６０１２７８９を参照されたい）に使用する加ピロリン酸分解（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｌｙｓｉｓ）法を用いた本発明者らの経験をもとに、新規方法を開発している。これを行う際、加ピロリン酸分解の二本鎖特異性；すなわち、一本鎖オリゴヌクレオチド基質、あるいはブロッキング基またはヌクレオチドミスマッチを含む二本鎖基質では効率的に進行しない反応であることを利用する。したがって、本発明にしたがって、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる、前記方法を提供する。

【0007】

本発明の方法を適用してもよい分析物は、探しているターゲットポリヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸、例えば天然存在または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。１つの態様において、分析物は、典型的には、該分析物および他の生物学的物質を含有する水溶液中に存在し、そして１つの態様において、分析物は、試験の目的のための関心対象ではない他のバックグラウンド核酸分子とともに存在するであろう。いくつかの態様において、分析物は、これらの他の核酸構成要素に比較して、少量で存在するであろう。好ましくは、例えば、分析物が細胞性物質を含有する生物学的標本に由来する場合、方法の工程（ａ）を実行する前に、これらの他の核酸および無関係な生物学的物質のある程度またはすべては、試料調製技術、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィまたは電気泳動を用いて、除去されているであろう。適切には、分析物は、哺乳動物被験体（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば血液、血漿、痰、尿、皮膚または生検に由来する。１つの態様において、生物学的試料は、存在する細胞も破壊することによって分析物を放出させるため、溶解に供されるであろう。他の態様において、分析物は、試料自体の中で、すでに遊離して；例えば血液または血漿中に循環している細胞不含ＤＮＡとして存在してもよい。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】実施例１の反応産物のゲル電気泳動画像。オリゴヌクレオチド２の存在下で、オリゴヌクレオチド１はオリゴヌクレオチド２から融解する長さまで分解され、長さおよそ５０ヌクレオチド短くなったオリゴヌクレオチドが残ることがわかる。逆に、オリゴヌクレオチド３の存在下では、オリゴヌクレオチド１の３’端での単一ヌクレオチドミスマッチのため、加ピロリン酸分解は観察されない。オリゴヌクレオチド４〜６の存在下では、オリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解は、一塩基ミスマッチの位まで進行し、この位で停止して、短くなったオリゴヌクレオチドが残り、該オリゴヌクレオチドはさらには分解されない。

【図2】実施例２の反応産物のゲル電気泳動画像。短くなったオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）が、連結反応によって効率的に環状化され、そして続くエキソヌクレアーゼ消化後に残存する一方、短くなっていないオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）は環状化されず、そして効率的に消化されることがわかる。

【図3】実施例３の反応産物のゲル電気泳動画像。実施例２において、短くなったオリゴヌクレオチドが存在し、そして環状化されている場合、この増幅によって、多量の産物が産生されることがわかる。逆に、実施例２において、短くなっていないオリゴヌクレオチドが存在し、そして環状化が起こらない場合、ＤＮＡの観察可能な増幅はなかった。

【図4】実施例４に記載するように測定した蛍光トレース。加ピロリン酸分解が、ピロリン酸またはイミド二リン酸の存在下で進行するが、これらの非存在下では進行しないことがわかる。同様に、ポリメラーゼが存在しない比較実験において、蛍光シグナルは生成されなかった。ピロリン酸の存在下での加ピロリン酸分解は、遊離ヌクレオチド三リン酸を生じる一方、イミド二リン酸の存在下での加ピロリン酸分解は、ベータおよびガンマリン酸の間のＯの位置にＮ−Ｈ基を含む修飾遊離ヌクレオチド三リン酸（２’−デオキシヌクレオシド−５’−［（β，γ）−イミド］三リン酸）を生じる。

【図5】ＥＧＦＲ遺伝子に生じうる３つの異なる突然変異：（ｉ）Ｔ７９０Ｍ（エクソン２０）、（ｉｉ）Ｃ７９７Ｓ（エクソン２０）および（ｉｉｉ）Ｌ８６１Ｑ（エクソン２１）に関するプライマーを用いた、実施例５のローリングサークル増幅から産生される増幅産物に関する融解ピーク結果。温度を９５℃まで上昇させ、測定を０．５℃間隔で行った。（ｉｖ）において、融解ピークの位置を用いて、どの突然変異、すなわちＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７ＳまたはＬ８６１Ｑが存在するかを同定可能である。

【図6】実施例７に記載するような、０．１％および０．５％突然変異体アレル頻度（ＭＡＦ）での上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）エクソン１９突然変異の単一ウェル１０重検出に関する、野生型（ＷＴ）結果を超えるシグナル。

【図7】実施例７に記載するような、単一ウェル中、０．１％および１％で、Ｔ７９０Ｍ（ｉ）およびＣ７９７Ｓ（ｉｉ）ＥＧＦＲ突然変異の同時検出および同定のための、２色での野生型結果を超えるシグナル。

【図8】（ｉ）実施例８に記載するような、アッセイおよび対照プローブ由来のＬ８５８Ｒ ＥＧＦＲ突然変異の存在下で観察される、野生型を超えるシグナル、ならびに（ｉｉ）各試料に関するアッセイプローブのものから対照プローブシグナルを引いた結果。

【図9】本発明の方法の工程ａ〜ｂの１つの態様。工程ａにおいて、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしていないＡ_０が、どのように方法のさらなる工程に関与しないかを例示するため、存在するＡ_０の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。工程ａのこの例示的例において、Ａ_０の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ_０の５’端はアニーリングしない。Ａ_０の５’端は、５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。工程ｂにおいて、部分的に二本鎖である第一の中間産物は、Ａ_０の３’端から３’−５’方向で、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解されて、部分的に消化された鎖Ａ_１、分析物、および工程ａでターゲットにアニーリングしなかった未消化Ａ_０分子を生じる。

【図10】本発明の方法の工程ｃ（ｉ）およびｄの１つの態様。工程ｃ（ｉ）において、Ａ_１を一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングさせ、そしてＡ_１鎖をＢに対して５’−３’方向に伸長して、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成する。この例示的例において、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学ブロックを有する。方法の工程ｂ由来の未消化Ａ_０は、トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングするが、Ｂに対して５’−３’方向に伸長して、工程ｄの増幅プライマーのターゲットである配列を生成することが不可能である。工程ｄにおいて、Ａ_２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。

【図11】本発明の方法の工程ｃ（ｉｉ）およびｄの１つの態様。工程ｃ（ｉｉ）において、Ａ_１をスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングさせ、そして次いで、３’および５’端の連結によって環状化する。工程ｄにおいて、ここで環状化されたＡ_２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例における化学物質）によって、またはＤの３’端およびＡ_２の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ_１に対して伸長することが不可能である。工程ｄにおいて、Ａ_２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。

【図12】本発明の方法の工程ｃ（ｉｉｉ）およびｄの１つの態様。工程ｃ（ｉｉｉ）において、スプリントオリゴヌクレオチドＤの３’領域は、Ａ_１の３’領域にアニーリングする一方、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’領域は、連結プローブＣの５’領域にアニーリングする。したがって、第二の中間産物Ａ_２は、Ａ_１、Ｃ、および随意に５’−３’方向でのＡ_１の伸長によって形成されてＣの５’端に連結される中間体領域で構成されて、形成される。この例示的例において、連結プローブＣは、３’化学ブロッキング基を有し、したがって、増幅工程ｄの前に、３’−５’エキソヌクレアーゼを用いて、非連結Ａ_１も消化することも可能である。工程ｄにおいて、Ａ_２を、少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明にしたがって、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる、前記方法を提供する。

【0010】

本発明の方法を適用してもよい分析物は、探しているターゲットポリヌクレオチド配列（単数または複数）を含む核酸、例えば天然存在または合成のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。１つの態様において、分析物は、典型的には、該分析物および他の生物学的物質を含有する水溶液中に存在し、そして１つの態様において、分析物は、試験の目的のための関心対象ではない他のバックグラウンド核酸分子とともに存在するであろう。いくつかの態様において、分析物は、これらの他の核酸構成要素に比較して、少量で存在するであろう。好ましくは、例えば、分析物が細胞性物質を含有する生物学的標本に由来する場合、方法の工程（ａ）を実行する前に、これらの他の核酸および無関係な生物学的物質のある程度またはすべては、試料調製技術、例えば濾過、遠心分離、クロマトグラフィまたは電気泳動を用いて、除去されているであろう。適切には、分析物は、哺乳動物被験体（特にヒト患者）から採取された生物学的試料、例えば血液、血漿、痰、尿、皮膚または生検に由来する。１つの態様において、生物学的試料は、存在する細胞も破壊することによって、分析物が放出されるように、溶解に供されるであろう。他の態様において、分析物は、試料自体の中で、すでに遊離して；例えば血液または血漿中に循環している細胞不含ＤＮＡとして存在してもよい。

【0011】

１つの態様において、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列は、癌性腫瘍細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域であり、そして１つまたはそれより多い突然変異；例えば１つまたはそれより多い一塩基多型（ＳＮＰ）の形の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、疾患の再発を監視する際に有用であろう。治療後に疾患から解放されたと宣言されている患者を長期間監視し、疾患の再発を検出してもよい。これは、非侵襲性に行われる必要があり、そして血液試料からのターゲット配列の高感度検出を必要とする。同様に、いくつかの癌に関しては、治療後、患者において残存する残渣癌細胞がある。患者血液中に存在するこれらの細胞（または細胞不含ＤＮＡ）のレベルを、本発明を用いて監視すると、疾患の再発または現在の療法の失敗、そして代替療法へのスイッチの必要性の検出が可能になる。

【0012】

１つの態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列の検出は、疾患治療中の患者試料の反復試験を可能にし、療法に対する耐性の発展を早期に検出することを可能にするであろう。例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤、例えばゲフィチニブ、エルロチニブは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の第一選択の治療として一般的に用いられる。治療中、腫瘍は、しばしば、治療に対する耐性を与える、ＥＧＦＲ遺伝子中の突然変異（例えばＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）を発展させるであろう。これらの突然変異の早期検出は、患者の代替療法への転換を可能にする。

【0013】

１つの態様において、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列は、胎児起源のＤＮＡまたはＲＮＡ内の遺伝子または染色体領域にあり、そして１つまたはそれより多い突然変異；例えば１つまたはそれより多い一塩基多型（ＳＮＰ）の形の突然変異の存在によって特徴づけられるであろう。したがって、本発明は、他の利用可能な試験技術よりも、妊娠のより初期の段階で、非常に低いアレル割合の突然変異を検出するために使用可能である。

【0014】

別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、得られる遺伝情報以外は健康である個体に由来する遺伝子またはゲノム領域にあってもよく、価値あるコンパニオン情報を生成し、ヒト集団内の１つまたはそれより多い定義される群に渡って医学的または療法的結論を引き出すことを補助しうる。

【0015】

さらに別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、感染性疾患に特徴的であってもよく；例えば細菌またはウイルスの遺伝子または染色体領域に特徴的なポリヌクレオチド配列である。

【0016】

１つの態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ドナーＤＮＡに特徴的であってもよい。移植された臓器が患者によって拒絶される場合、この臓器由来のＤＮＡは、患者の血流内に脱落する。このＤＮＡを早期検出すれば、拒絶の早期検出が可能になるであろう。これは、ドナー特異的マーカーのカスタムパネルを用いて、またはあるものはドナー中に存在し、そしてあるものはレシピエントに存在する、集団に一般的であることが知られる変異体のパネルを用いることによって、達成可能である。したがって、長期に渡る臓器レシピエントのルーチンの監視が、請求する方法によって可能である。

【0017】

さらに別の態様において、プローブおよびトリガーオリゴヌクレオチド（以下を参照されたい）の異なる組み合わせを用いる多様なバージョンの方法を平行して使用して、多数のターゲット配列；例えば、癌の供給源、癌の指標または感染の多数の供給源に関して、分析物を同時にスクリーニングすることが可能になる。このアプローチでは、方法の平行適用によって、工程（ｄ）で得られる増幅された産物を、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または配列特異的分子プローブ、例えば分子ビーコン、ヘアピンプローブ等で構成される検出パネルと接触させる。したがって、本発明の別の側面において、ターゲットポリヌクレオチド配列に関して選択的である１つまたはそれより多い化学的および生物学的プローブと、あるいは増幅されたプローブ領域を同定するための配列決定の使用と組み合わせた、少なくとも１つのプローブおよび随意に以下に定義するトリガーオリゴヌクレオチドの使用を提供する。

【0018】

本発明の方法の工程（ａ）は、所定の試料中のその存在を探している分析物と、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０をアニーリングさせる工程を含む。１つの態様において、このオリゴヌクレオチドは、プライミング領域および検出しようとするターゲットポリヌクレオチド配列に相補的である３’端を含む。この手段によって、少なくとも部分的に二本鎖である第一の中間産物を生成する。１つの態様において、過剰なＡ_０の存在下で、そして分析物および任意の他の核酸分子を含有する水性媒体中で、この工程を行う。

【0019】

１つの態様において、工程（ｅ）における検出のために分子プローブを用いようとする場合、プローブオリゴヌクレオチドＡ_０は、ターゲット配列に相補的な領域の５’側にオリゴヌクレオチド同定領域を含むように設定され、そして使用される分子プローブは、この同定領域にアニーリングするよう設計される。１つの態様において、Ａ_０の相補領域のみが、ターゲットにアニーリング可能であり；すなわち他の領域はいずれも、工程（ｂ）を行う温度で、安定な二重鎖が存在するために十分な、分析物との相補性を欠く。ここで、そして全体に、用語「十分な相補性」によって、所定の領域が分析物上の所定の領域と相補性を有する限りにおいて、相補性領域は長さ１０ヌクレオチド以上であることを意味する。

【0020】

１つの好ましい態様において、Ａ_０の５’端またはプライミング領域の５’側の内部部位は、エキソヌクレオリシスに耐性を与えられる。この手段によって、そして工程（ｂ）の後で、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを、随意に、存在する任意の他の核酸分子を消化する一方、Ａ_０および部分的に消化された鎖Ａ_１を含む物質も損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）状態で残す目的のため、反応培地に添加してもよい。適切には、エキソヌクレオリシスに対するこの耐性は、必要なポイントで、オリゴヌクレオチドＡ_０内に１つまたはそれより多いブロッキング基を導入することによって達成される。１つの態様において、これらのブロッキング基は、ホスホロチオエート連結および当該技術分野に一般的に用いられる他の主鎖修飾、Ｃ３スペーサー、リン酸基、修飾塩基等により選択されてもよい。さらに別の態様において、Ａ_０は、以下にさらに記載するトリガーオリゴヌクレオチドの３’および５’端のいずれかまたは両方に関して、オリゴヌクレオチドフラップミスマッチを有する。

【0021】

１つの態様において、同定領域は、ユニークな配列を有し、そして工程（ｅ）において、増幅された構成要素Ａ_２に適用される配列特異的分子プローブを用いて、間接的に同定されるか、またはこれらの構成要素の配列決定によって直接同定されるように適応されている、バーコード領域を含むかまたはこうしたバーコード領域内に包埋されているであろう。使用してもよい分子プローブの例には、限定されるわけではないが、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ等が含まれる。

【0022】

方法の工程（ｂ）において、第一の中間産物の二本鎖領域は、そのＡ_０鎖の３’端から３’−５’方向に加ピロリン酸分解される。その結果、Ａ_０鎖は次第に消化されて、部分的に消化された鎖を生成し；以後これをＡ_１と称する。プローブオリゴヌクレオチドが誤って非ターゲット配列にハイブリダイズした場合、加ピロリン酸分解反応が、ミスマッチでも停止し、方法の続く工程が進行することを防ぐ。別の態様において、Ａ_１が、分析物またはその中のターゲット領域と安定な二重鎖を形成するために十分な相補性を欠くようになるまで、この消化を続ける。この時点で、多様な鎖は次いで、融解によって分離し、それによって、一本鎖型のＡ_１を生じる。典型的な加ピロリン酸分解条件下では、この分離は、分析物およびＡ_０の間に、６〜２０の間の相補的ヌクレオチドが存在する場合に起こる。

【0023】

適切には、加ピロリン酸分解工程（ｂ）は、加ピロリン酸分解活性を示すポリメラーゼおよびピロリン酸イオンの供給源の存在下で、２０〜９０℃の範囲の温度で、反応媒体中で行われる。ポリヌクレオチドの消化に適用されるような、加ピロリン酸分解反応に関するさらなる情報は、例えば、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４４（１９６９）ｐｐ．３０１９−３０２８または本発明者らの以前の特許出願に見られうる。

【0024】

１つの態様において、加ピロリン酸分解工程（ｂ）は、過剰なポリピロリン酸の供給源の存在によって駆動され、適切な供給源には、３つまたはそれより多いリン原子を含有する化合物が含まれる。

【0025】

１つの態様において、加ピロリン酸分解工程（ｂ）は、過剰な修飾ピロリン酸の供給源の存在によって駆動される。適切な修飾ピロリン酸には、架橋酸素の代わりに置換された他の原子または基を持つもの、あるいは他の酸素上に置換基または修飾基を含むピロリン酸（またはポリピロリン酸）が含まれる。当業者は、本発明の使用に適した修飾ピロリン酸の多くのこうした例があることを理解するであろうし、その限定されない選択は：

【0026】

【化1】

【0027】

である。
１つの好ましい態様において、ピロリン酸イオンの供給源は、ＰＮＰ、ＰＣＰまたはトリポリリン酸（ＰＰＰｉ）である。

【0028】

さらに、限定されるわけではないが、加ピロリン酸分解工程（ｂ）で用いるためのピロリン酸イオンの供給源の例は、ＷＯ２０１４／１６５２１０およびＷＯ００／４９１８０に見られうる。

【0029】

１つの態様において、過剰な修飾ピロリン酸の供給源は、Ｙ−Ｈとして示されることも可能であり、式中、Ｙは一般式（Ｘ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｂ）−（Ｚ−Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ−Ｘ））_ｎ−に対応し、式中、ｎは１〜４の整数であり；各Ｚ−は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−ＣＨ_２−より独立に選択され；各Ｂは独立にＯまたはＳのいずれかであり；Ｘ基は、−Ｈ、−Ｎａ、−Ｋ、アルキル、アルケニル、または複素環基より独立に選択され、但し、ＺおよびＢの両方が−Ｏ−に対応し、そしてｎが１である場合、少なくとも１つのＸ基はＨでない。

【0030】

１つの態様において、Ｙは、一般式（Ｘ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｂ）−（Ｚ−Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ−Ｘ））_ｎ−に対応し、式中、ｎは１、２、３または４である。別の態様において、Ｙ基は、一般式（Ｘ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｈ）−に対応し、式中、Ｘ基の１つは−Ｈである。さらに別の好ましい態様において、Ｙは、（Ｘ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｘ）−−に対応し、式中、Ｘ基の少なくとも１つは、メチル、エチル、アリルまたはジメチルアリルより選択される。

【0031】

別の態様において、Ｙは、一般式（Ｈ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｈ）−に対応し、式中、各Ｚは、−ＮＨ−または−ＣＨ_２−または（Ｘ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｘ）−−のいずれかであり、式中、Ｘ基はすべて、−Ｎａまたは−Ｋのいずれかであり、そしてＺは−ＮＨ−または−ＣＨ_２−のいずれかである。

【0032】

別の態様において、Ｙは、一般式（Ｈ−Ｏ）_２Ｐ（＝Ｂ）−Ｏ−Ｐ（＝Ｂ）（Ｏ−Ｈ）−に対応し、式中、各Ｂ基は、独立に、ＯまたはＳのいずれかであり、少なくとも１つはＳである。

【0033】

Ｙの好ましい態様の特定の例には、式（Ｘ１−Ｏ）（ＨＯ）Ｐ（＝Ｏ）−Ｚ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ−Ｘ２）のものが含まれ、式中、ＺはＯ、ＮＨまたはＣＨ_２であり、そして（ａ）Ｘ１はγ，γ−ジメチルアリルであり、そしてＸ２は−Ｈであるか；または（ｂ）Ｘ１およびＸ２はどちらもメチルであるか；または（ｃ）Ｘ１およびＸ２はどちらもエチルであるか；または（ｄ）Ｘ１はメチルであり、そしてＸ２はエチルであるかまたはその逆である。

【0034】

１つの態様において、工程（ｂ）は、ホスファターゼ酵素の存在下で行われ、加ピロリン酸分解反応によって産生されたヌクレオシド三リン酸が、加水分解によって連続して除去される。別の態様において、ピロホスファターゼ酵素を工程（ｂ）の後に添加して、残渣ピロリン酸イオンを加水分解して、それによってさらなる加ピロリン酸分解が後の工程で起きないことを確実にする。別の態様において、工程（ａ）および（ｂ）を反復し、したがって、各ターゲット分子から、Ａ_１の多数コピーが生成される。これは、続く工程を行う前にまたは行っている間に起こってもよい。工程（ｄ）において増幅と組み合わせる場合、この反復は、方法の感度および信頼性のさらなる改善を導き、そして最初の直鎖増幅を導入することによって、ターゲットポリヌクレオチドのより正確な定量化が可能になる。

【0035】

１つの好ましいが非必須の態様において、工程（ｂ）の終了時、あるいは工程（ｃ）の前または後に、Ａ_０またはＡ_１鎖（５’ブロッキング基が存在する）で構成されるもの以外の、存在する残渣核酸物質が分解されることを確実にする目的で、５’−３’方向活性を有するエキソヌクレアーゼを添加する、中間工程が導入される。別の態様において、このエキソヌクレアーゼは、工程（ｄ）を行う前に非活性化される。さらに別の態様において、このエキソヌクレオリシスを実行する前または実行中、存在する核酸物質のすべては、例えばキナーゼおよびリン酸ドナー、例えばＡＴＰを用いて、５’端でリン酸化されて、特定のタイプの５’−３’エキソヌクレアーゼによるエキソヌクレオリシスを開始するために必要なリン酸化端部位が産生される。

【0036】

工程（ｂ）の後、または適切な場合、上述の中間工程の後、Ａ_１は、１つの態様（ｉ）において、一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングして、やはり部分的に二本鎖である第二の中間産物を生成する。１つの態様において、Ｂは、Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域で構成され、Ａ_０に実質的に相補的でない隣接オリゴヌクレオチド領域をその５’端に含む。ここで、そして全体で、用語「実質的に相補的でない」または同等の表現は、所定の隣接領域が、Ａ_０上の所定の領域に相補性を有する限りにおいて、相補性領域が長さ１０ヌクレオチド未満であることを意味する。その後、工程（ｃ）において、この第二の中間産物のＡ_１鎖は、５’−３’方向に伸長されて、Ｂおよび伸長されたＡ_１鎖で構成される、第三の中間産物を生成する（以後、Ａ_２と称する）。

【0037】

別の態様において、Ｂは（ｉ）Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域；（ｉｉ）Ａ_１の５’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、および随意に（ｉｉｉ）これらの２つの領域の間の中間オリゴヌクレオチド領域を含み、そしてＢは、その３’端の１つまたはそれより多いヌクレオチドミスマッチまたは化学修飾の存在のいずれかの存在のため、Ａ_１に対する伸長を経ることが不可能である。別の態様において、Ｂは３’端および内部の両方で修飾されて、他のオリゴヌクレオチドがこれに対して伸長されることを防ぐ。

【0038】

これらの態様のどちらにおいても、Ｂは、適切に、各々独立に、最大１５０ヌクレオチド、典型的には５〜１００ヌクレオチド、そして最も好ましくは１０〜７５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド領域で構成される。１つの態様において、Ｂのすべての領域は、独立に、１０〜５０ヌクレオチドの範囲の長さを有する。別の好ましい態様において、Ｂの５’端またはそれに隣接する領域もまた、上述のタイプのブロッキング基で保護され、エキソヌクレオリシスに対して耐性にされる。いくつかの態様において、Ｂの５’端は、それ自体の上に畳み込まれて、二本鎖ヘアピン領域を生成する。さらに別の態様において、Ｂの３’および５’端の両方は、Ａ_１対応鎖の末端に対して、１つまたはそれより多いヌクレオチドミスマッチを有する。

【0039】

別の態様において、工程（ｃ）は、あるいは、（ｉｉ）Ａ_１の２つの端を、リガーゼの存在下でともに連結して、Ａ_１鎖が伸長されず、むしろ環状化される、第三の中間産物を生成する。この連結は、典型的には、Ａ_１の３’および５’端に相補的な領域を有する、スプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われ、そのため、Ｄにアニーリングした際に、Ａ_１の３’および５’端が連結可能なニックを形成するか、または続く連結前に充填可能なギャップを形成するようになる。この態様において、環状化Ａ_１は、事実上、続く工程の目的のため、Ａ_２になる。別の態様において、Ａ_１鎖は、５’−３’エキソヌクレアーゼおよび鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いて、５’−３’方向になお伸長され、そして次いで環状化され、そのため、この伸長されそして環状化された産物が、事実上、Ａ_２になる。別の態様において、Ａ_１の３’および５’端、または伸長されたＡ_１は、必ずしもオリゴヌクレオチド領域を含まなくてもよい架橋基によってともに連結される。

【0040】

第三の中間産物が環状化されたＡ_２鎖を含む場合、工程（ｃ）において生成される反応混合物を、エキソヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの組み合わせで処理して、環状化されていない残渣核酸構成要素を消化することが好適である。その後、別の態様において、エキソヌクレアーゼは、工程（ｄ）を行う前に非活性化される。

【0041】

別の態様（ｉｉｉ）において、スプリントオリゴヌクレオチドＤの５’端領域の少なくとも一部に、またはターゲットオリゴヌクレオチドに相補的な５’領域を有する連結プローブＣ、リガーゼ、ならびに随意に、鎖置換能および５’−３’方向エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠くポリメラーゼの存在下で、工程（ｃ）を行う。こうした手段によって、Ａ_２鎖がＡ_１、Ｃ、および随意に、Ａ_１の５’−３’方向の伸長によって形成されてＣの５’端と結合する中間領域で構成される、第二の中間産物を形成する。こうした態様において、少なくとも、Ａ_１のＣへの連結が起こる部位を含むＡ_２の領域を増幅するように、工程（ｄ）で使用するプライマー（以下を参照されたい）を選択する。この態様において、本発明者らは、増幅前に、３’−５’エキソヌクレアーゼを用いて、非連結Ａ_１を消化可能であるように、Ｃ上に３’ブロッキング基を含むことが好適であることを見出した。使用可能な適切なポリメラーゼには、限定されるわけではないが、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＭａｋｏおよびＳｔｏｆｆｅｌ断片が含まれる。

【0042】

１つの態様において、工程ｃ（ｉｉ）またはｃ（ｉｉｉ）を使用する場合、Ａ_１は、随意に、連結前に５’−３’方向に伸長される。１つの態様において、この随意の伸長および連結は、ターゲットオリゴヌクレオチドに対して行われる一方、別の態様において、これらは、伸長および／または連結前に、Ａ_１がアニーリングするさらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われる。１つの態様において、Ｄは、Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域、およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ_１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む。別の態様において、Ｄは、３’端修飾のため、またはＤの３’端およびＡ_１の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ_１に対して伸長不能である。

【0043】

続く工程（ｄ）において、多数の、典型的には数百万のコピーが作製されるように、Ａ_２鎖またはその望ましい領域が増幅を経るようにされる。これは、Ａ_２および続いてそれに由来する任意のアンプリコンを、例えば順方向／逆方向またはセンス／アンチセンス対の形で提供され、これらの上の相補領域にアニーリング可能である、一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングすることによって、達成される。プライミングされた鎖は次いで、増幅のための起点になる。増幅法には、限定されるわけではないが、熱サイクリングおよび等温法、例えばポリメラーゼ連鎖反応、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅およびローリングサークル増幅が含まれ；これらのうち最後のものは、Ａ_２が環状化されている場合に適用可能である。これらの手段のいずれによっても、Ａ_２の多くのアンプリコンコピーおよびいくつかの場合、その配列相補体が迅速に生成されうる。これらの増幅法のいずれかを実行するための正確な方法論は、一般の当業者に周知であり、そして使用する正確な条件および温度管理体制は、一般文献で容易に入手可能であり、そちらを参照されたい。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合、方法論は、一般的に、ポリメラーゼおよび多数の単一ヌクレオシド三リン酸の供給源を用いて、相補鎖が産生されるまで、５’−３’方向にＡ_２鎖に対してプライマーオリゴヌクレオチドを伸長し；産生された二本鎖産物を脱ハイブリダイズし、Ａ_２鎖および相補鎖を再生し；Ａ_２鎖およびそのアンプリコンのいずれも再プライミングして、そしてその後、これらの伸長／脱ハイブリダイズ／再プライミング工程を複数回反復して、信頼可能に検出されうるレベルまで、Ａ_２アンプリコンの濃度を増大させる工程を含む。

【0044】

最後に、工程（ｅ）において、アンプリコンを検出し、そして得られる情報を用いて、元来の分析物にポリヌクレオチドターゲット配列が存在するかまたは存在しないか、および／またはそれに関連する特性を推測する。例えば、この手段によって、癌性腫瘍細胞に特徴的であるターゲット配列を、探している特定のＳＮＰを参照して検出してもよい。別の態様において、ウイルスまたは細菌のゲノム（その新規突然変異を含む）に特徴的であるターゲット配列を検出してもよい。例えば、オリゴヌクレオチド結合色素、配列特異的分子プローブ、例えば蛍光標識分子ビーコンまたはヘアピンプローブを含めて、アンプリコンまたは同定領域を検出する多くの方法を使用してもよい。あるいは、当該技術分野に使用されるかまたは報告される直接配列決定法の１つを用いて、Ａ_２アンプリコンの直接配列決定を行ってもよい。オリゴヌクレオチド結合色素、蛍光標識ビーコンまたはプローブを使用する場合、刺激性電磁放射の供給源（レーザー、ＬＥＤ、ランプ等）、および放出された蛍光を検出し、そしてそこから、特に設計されたアルゴリズムを用いて、マイクロプロセッサまたはコンピュータによって分析可能であるデータストリームを含むシグナルを生成するように配置された光検出装置を含む配置を用いて、アンプリコンを検出することが好適である。

【0045】

本発明の１つの特異的明示において、各々、異なるターゲット配列に関して選択的であり、そして各々同定領域を含む、多数のＡ_０プローブを使用する。１つの態様において、その結果、工程（ｄ）において増幅される領域には、この同定領域が含まれる。別の態様において、工程（ｄ）で生成されるアンプリコンを、次いで、同定領域（単数または複数）の検出を通じて推測する。次いで、同定は、分子プローブまたは配列決定法、例えばサンガー配列決定法、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）配列決定法または本発明者らが先に記載している方法の１つを用いる工程を含んでもよい。別の明示において、工程（ａ）の前に、分析物を多数の反応体積に分けて、各体積は、異なるターゲット配列（単数または複数）を検出するように設計された、異なる単数のプローブオリゴヌクレオチドＡ_０またはその複数のものを有する。別の好ましい態様において、異なるプローブＡ_０は、単一のまたは単一セットのプライマーを増幅工程（ｄ）に用いることを可能にする共通のプライミング部位を含む。

【0046】

いくつかの態様において、標準的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、または等温増幅、例えばローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を通じて、増幅工程（ｄ）を行ってもよい。いくつかの態様において、ＲＣＡは、指数関数的ＲＣＡ、例えば高分岐ＲＣＡの形であってもよく、これは、多様な異なる長さの二本鎖ＤＮＡを生じうる。いくつかの態様において、異なる長さを有する異なる産物を生じうる異なるプローブを提供することが望ましい可能性もある。

【0047】

いくつかの態様において、工程（ｅ）は：
ｉ． １つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、Ａ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を標識し；
ｉｉ． 多数コピーの蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ． 変性条件のセットに多数コピーを曝露し；そして
ｉｖ． 変性条件への曝露中に、多数コピーの蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列を同定する
工程をさらに含む。

【0048】

いくつかの態様において、工程（ｅ）は、融解曲線分析を用いた検出および分析の形を取ってもよい。融解曲線分析は、加熱中の二本鎖ＤＮＡの解離特性の評価であってもよい。試料中の５０％のＤＮＡが２つの別個の鎖に変性する温度は、融解温度（Ｔｍ）として知られる。温度を上昇させるにつれて、二本鎖は解離し始め、二本鎖ＤＮＡの異なる分子は、組成（Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−Ｔの間の２つのみに比較して、３つの水素結合を有し、したがって、Ｇ−Ｃを分離させるには、Ａ−Ｔよりもより高い温度が必要である）、長さ（より多くの水素結合を含む二本鎖ＤＮＡのより長い長さは、より短いものよりも、２つの別個の一本鎖に完全に解離するまでに、より高い温度を必要とするであろう）および相補性（多数のミスマッチを含むＤＮＡ分子は、マッチした塩基対の間の水素結合をより少なくしか含有しない性質のため、より低いＴｍを有するであろう）に基づいて、異なる温度で解離する。

【0049】

いくつかの態様において、挿入蛍光剤の存在下で増幅工程（ｄ）を行ってもよい。したがって、融解曲線分析を行う場合、反応産物のＴｍ（およびしたがって同一性）、そしてしたがってターゲットポリヌクレオチド配列を示す、蛍光の変化を監視する。刺激性電磁放射の供給源（レーザー、ＬＥＤ、ランプ等）、および放出された蛍光を検出し、そしてそこから、特に設計されたアルゴリズムを用いて、マイクロプロセッサまたはコンピュータによって分析可能であるデータストリームを含むシグナルを生成するように配置された光検出装置を含む配置を用いて、蛍光の変化を検出してもよい。

【0050】

挿入蛍光剤は、二本鎖ＤＮＡに特異的な色素、例えばＳＹＢＲグリーン、Ｅｖａグリーン、ＬＧグリーン、ＬＣグリーンプラス、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ＣｈｒｏｍｏｆｙまたはＳＹＴＯ９であってもよい。当業者は、本発明に使用してもよい多くの挿入蛍光剤があり、そして上記リストは、本発明の範囲を限定するとは意図されないことを認識するであろう。挿入蛍光剤は、蛍光標識ＤＮＡプローブであってもよい。本発明の１つの態様において、近位プローブ、フルオロフォアを含むもの、他の適切な消光剤を用いて、ターゲット増幅配列に対するＤＮＡプローブの相補性を決定してもよい。

【0051】

本発明の別の側面において、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を同定する方法であって：
ａ． 核酸分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；
ｅ． １つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、Ａ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域をラベリングし；
ｆ． 多数コピーの蛍光シグナルを測定し；
ｇ． 多数のコピーを変性条件セットに曝露し；そして
ｈ． 変性条件への曝露中の多数コピーの蛍光シグナルの変化を監視することによって、ターゲットポリヌクレオチド配列を同定する
工程によって特徴づけられる、前記方法を提供する。

【0052】

いくつかの態様において、温度を変化させる、例えば二本鎖が解離し始める点まで温度を増加させることによって、変性条件を提供してもよい。さらにまたはあるいは、また、条件が酸性であるかまたはアルカリ性であるようにｐＨを変化させることによって、あるいは添加剤または剤、例えば強酸または塩基、濃縮無機塩または有機溶媒、例えばアルコールを添加することによって、変性条件を提供してもよい。

【0053】

第一の側面の方法と関連してまたは独立に使用してもよい、本発明のさらなる側面において、分析物を増幅し、そして典型的にはかなり過剰に存在するバックグラウンドゲノムＤＮＡから分析物を分離するように設計された、一連の予備工程によって、上述の生物学的試料から、一本鎖型の分析物を調製してもよい。この方法は、一般的に、一本鎖ターゲット分析物の産生に適用可能であり、そしてしたがって、該方法が本発明の第一の側面の方法の一部と統合されるかまたはこれをさらに含む場合以外の状況で有用である。したがって、（ｉ）分析物（単数または複数）の対応する二本鎖型で構成される生物学的試料、および随意にバックグラウンドゲノムＤＮＡを、増幅周期に供することによって、分析物（単数または複数）のアンプリコンを産生する工程によって特徴づけられる、ターゲットポリヌクレオチド領域で構成される核酸の少なくとも１つの一本鎖分析物を調製するための方法を提供する。１つの好ましい態様において、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、およびプライマーの１つが５’−３’エキソヌクレアーゼブロッキング基を含む少なくとも１つの対応するプライマー対の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、増幅を行い、そして（ｉｉ）随意に、工程（ｉ）の産物を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼで消化する。１つの態様において、方法はさらに、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の産物をプロテイナーゼと反応させてポリメラーゼを破壊して、そしてその後、（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の産物を、５０℃を超える温度に加熱することによって、プロテイナーゼを非活性化する工程を含んでもよい。

【0054】

１つの好ましい態様において、工程（ｉ）〜（ｉｖ）を本発明の第一の側面の方法の工程（１）の前に行って、生物学的試料に由来するターゲット配列を検出する統合法を生じる。別の態様において、生物学的試料は、工程（ｉ）を行う前に、細胞溶解を経ている。

【0055】

工程（ｉ）の１つの態様において、ヌクレオシド三リン酸は、天然存在ＤＮＡに特徴的な４つのデオキシヌクレオシド３リン酸の混合物である。好ましい態様において、デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物は、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）の代わりにデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）を含み、そして工程（ｉ）はさらに、酵素ｄＵＴＰ−ＤＮＡグリコラーゼ（ＵＤＧ）の存在下で行われて、以前のアッセイからの混入アンプリコンも除去する。さらに別の態様において、高忠実度ポリメラーゼ、例えば商標名Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）またはＱ５のもとで販売されるものを工程（ｉ）で用いる。

【0056】

１つの態様において、限定された量のプライマーおよび過剰な増幅周期を用いて、工程（ｉ）を行う。この手段によって、分析物の最初の量に関わらず、固定された量のアンプリコンが産生される。したがって、続く工程前の分析物定量化の必要性が回避される。工程（ｉｉ）の必要性を取り除く利点を有する、工程（ｉ）の別の態様において、２つのプライマーの一方が他方より過剰に存在するプライマー対の存在下で増幅を行い、１つのプライマーが完全に利用されたら、一本鎖アンプリコンの生成を生じる。

【0057】

工程（ｉｉ）の１つの好ましい態様において、５’プライマーは、ホスホロチオエート連結、反転塩基、ＤＮＡスペーサー、および当該技術分野に一般的に知られる他のオリゴヌクレオチド修飾より選択されるエキソヌクレアーゼブロッキング基でブロッキングされる。別の態様において、対である他のプライマーは、５’端にリン酸基を有する。

【0058】

１つの態様において、工程（ｉｉｉ）において、使用するプロテイナーゼはプロテイナーゼＫであり、そして８０〜９５℃の温度に最大３０分間加熱することによって、工程（ｉｖ）を行う。別の態様において、工程（ｉｉ）の後であるが、工程（ｂ）の前のある時点で、反応媒体をアピラーゼまたは他のホスファターゼで処理して、存在しうる残渣ヌクレオシド三リン酸も除去する。

【0059】

本発明のさらなる側面において、加ピロリン酸分解工程（ｂ）を、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼを用いたエキソヌクレアーゼ消化工程で置き換える、代替態様を提供する。当業者は、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼには、とりわけ、３’−５’方向に読むもの、例えばＥｘоＩＩＩ、および５’−３’方向に読むもの、例えばラムダＥｘｏが含まれることを理解するであろう。

【0060】

この側面の１つの態様において、工程（ｂ）の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、３’−５’方向に進行する。こうした態様において、本発明の方法は：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼで消化して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる。

【0061】

この側面の１つの態様において、工程（ｂ）の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼは、５’−３’方向に進行する。こうした態様において、本発明の方法は：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の５’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の５’端から５’−３’方向に、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼで消化して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の５’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの３’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる。

【0062】

工程（ｂ）が二本鎖特異的５’−３’エキソヌクレアーゼを利用する、本発明の態様において、ターゲット分析物に相補的であるのはＡ_０の５’端であり、そして共通プライミング配列およびブロッキング基は、ターゲットに相補的な領域の３’側に位置する。工程（ｅ）における検出のために分子プローブを用いようとする、さらなる態様において、プローブオリゴヌクレオチドＡ_０は、ターゲット配列に相補的な領域の３’側に、オリゴヌクレオチド同定領域を含むように設定され、そして使用する分子プローブは、この同定領域にアニーリングするように設計される。

【0063】

工程（ｂ）が二本鎖特異的５’−３’エキソヌクレアーゼを利用する、本発明の態様において、工程ｂ．の後に、存在する他の核酸分子も消化する一方、Ａ_０および部分的に消化された鎖Ａ_１を含む物質も損なわれないままに残す目的のため、３’から５’のエキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼを、随意に反応混合物に添加してもよい。適切には、エキソヌクレオリシスに対するこの耐性は、先に記載するように達成される。

【0064】

各々異なる分子プローブ等に関連している、多数の異なるＡ_０、および随意にＢ、ＣまたはＤ構成要素を用いることによって、複数の異なる分析物を含む反応混合物に、本発明の方法を適用してもよいことが認識されるであろう。こうした多重化法において、所定の癌または多数の感染性疾患等に特徴的である多数のターゲット領域の検出が可能になる。１つの態様において、生成されるすべての異なるＡ_２鎖は、共通プライマー部位を有するが、異なる同定領域を有し、１つまたは単一セットのプライマーを増幅工程（ｄ）で用いることが可能になることが好ましい。

【0065】

本発明の別の側面において、哺乳動物被験体、特にヒト患者を、感染性疾患、癌の存在に関して、あるいはコンパニオン診断情報を生成する目的のために、スクリーニングするための、上記の方法の使用を提供する。

【0066】

本発明のさらなる側面において、上述のような方法で使用するための対照プローブを提供する。本発明の態様には、単数または複数の特異的ターゲット配列の存在が、蛍光シグナルの生成によって解明されるものが含まれる。

【0067】

こうした態様において、試料中に存在する非ターゲットＤＮＡから生成される、あるレベルのシグナルが必然的に存在しうる。所定の試料に関して、このバックグラウンドシグナルは、「真」のシグナルよりも後に開始するが、この開始は、試料間で多様でありうる。正確には、低濃度の単数または複数のターゲット配列の存在の検出は、したがって、その非存在下で、どのシグナルが予期されるかの知識に頼る。企図される試料に関しては参照が入手可能であるが、患者由来の真の「ブラインド」試料に関しては当てはまらない。対照プローブ（Ｅ_０）を利用して、各アッセイプローブに関する予期されるバックグラウンドシグナルプロファイルを決定する。対照プローブは、試料中に存在すると予期されない配列をターゲットとし、そして次いで、このプローブから生成されるシグナルを用いて、ターゲット配列の非存在下での試料からのシグナル生成の予期される速度を推測してもよい。

【0068】

したがって、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ． 一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０を試料に添加して、ターゲット分析物とアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し；
ｆ． ターゲット配列に少なくとも部分的にミスマッチしている３’端領域を有する第二の一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＥ_０を用いて、試料の別個のアリコットを用いるかまたは同じアリコット中でそして第二の検出チャネルを用いるかのいずれかで、工程（ａ）〜（ｅ）を、続いてまたは同時にのいずれかで反復し；
ｇ． （ｆ）の結果から、試料中のターゲット分析物も非存在下で、Ａ_０から生じると予期されるバックグラウンドシグナルを推測して；そして
ｈ． （ｅ）で観察される実際のシグナルと、（ｇ）で推測される予期されるバックグラウンドシグナルの比較を通じて、分析物中のポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在を推測する
工程によって特徴づけられる、前記方法を提供する。

【0069】

いくつかの態様において、本発明記載の工程（ｅ）における方法は：
ｉ． １つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、Ａ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を標識し；
ｉｉ． 工程（ｄ）で産生された多数コピーの蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ． 変性条件のセットに多数コピーを曝露し；そして
ｉｖ． 変性条件への曝露中に、工程（ｆ）の産物に対して行った同じ測定に比較して、多数コピーの蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、増幅された産物の存在を検出し、そして該産物を同定する
工程によって起こる。

【0070】

１つの態様において、対照プローブ（Ｅ_０）およびＡ_０を試料の別個の部分に添加する一方、別の態様において、Ｅ_０およびＡ_０を試料の同じ部分に添加し、そして異なる検出チャネル（例えば異なる有色色素）を用いて、それぞれのシグナルを測定する。次いで、Ｅ_０によって生成されたシグナルを利用して、試料中のポリヌクレオチドターゲット配列の非存在下で、Ａ_０によって生成されると予期されるバックグラウンドシグナルを推測し、そしてこれに関して修正してもよい。例えば、バックグラウンドシグナルの修正は、Ａ_０から観察されるものから、Ｅ_０から観察されるシグナルを減算することを伴うか、または多様な条件下で、Ａ_０およびＥ_０によって生成される相対シグナルの較正曲線を用いた、Ａ_０から観察されるシグナルの較正を通じてもよい。

【0071】

１つの態様において、単一のＥ_０を用いて、産生されうるアッセイプローブすべてを較正してもよい。
１つの態様において、別個のＥ_０を用いて、最初の増幅工程で生成された試料ＤＮＡの各アンプリコンを較正してもよい。各アンプリコンは、関心対象の多数の突然変異／ターゲット配列を含有してもよいが、単一アンプリコンに対してアッセイプローブのすべてを較正するために、単一のＥ_０で十分であろう。

【0072】

さらなる態様において、各ターゲット配列に関して、別個のＥ_０を用いてもよい。例えば、Ｃ＞Ｔ突然変異をターゲティングする場合、患者に生じていることが知られていない同じ部位のＣ＞Ｇ突然変異をターゲティングするＥ_０を設計してもよい。多様な条件下で、Ｅ_０によって生成されるシグナルプロファイルを較正反応において評価して、そしてこれらのデータを用いて、変異体が存在しない場合のＣ＞Ｔ変異体をターゲティングするアッセイプローブから予期されるシグナルを推測してもよい。

【0073】

本発明の方法の１つの態様は、図９〜１２に見られうる。図９において、工程ａ〜ｂの１つの態様を例示する。工程ａにおいて、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０は、ターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングして、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成する。本発明のこの単純化された態様において、ターゲットにアニーリングしなかったＡ_０が、方法のさらなる工程に、どのように関与しないかを例示するため、存在するＡ_０の２つの分子および１つのターゲットポリヌクレオチド配列がある。工程ａのこの例示的例において、Ａ_０の３’端はターゲットポリヌクレオチド配列にアニーリングする一方、Ａ_０の５’端はアニーリングしない。Ａ_０の５’端は５’化学ブロッキング基、共通プライミング配列およびバーコード領域を含む。

【0074】

工程ｂにおいて、部分的に二本鎖である第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１、分析物および工程ａでターゲットにアニーリングしなかった未消化Ａ_０分子を生成する。

【0075】

図１０において、工程ｃ（ｉ）〜ｄの１つの態様を例示する。工程ｃ（ｉ）において、Ａ_１を一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングさせて、そしてＡ_１鎖をＢに対して５’−３’方向に伸長してオリゴヌクレオチドＡ_２を生成する。この例示的例において、トリガーオリゴヌクレオチドＢは５’化学ブロックを有する。方法の工程ｂ由来の未消化Ａ_０はトリガーオリゴヌクレオチドＢにアニーリングするが、Ｂに対して５’−３’方向に伸長して、工程ｄの増幅プライマーに関するターゲットである配列を生成することは不可能である。

【0076】

工程ｄにおいて、Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。
図１１において、工程ｃ（ｉｉ）〜ｄの１つの態様を例示する。工程ｃ（ｉｉ）において、Ａ_１をスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングさせて、そして次いで、その３’および５’端の連結によって環状化する。工程ｄにおいて、ここで環状化されているＡ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例においては化学物質）のため、またはＤの３’端およびＡ_２の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じて、Ａ_１に対して伸長することは不可能である。

【0077】

工程ｄにおいて、Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。
図１２において、工程ｃ（ｉｉｉ）〜ｄの１つの態様を例示する。工程ｃ（ｉｉ）において、Ａ_１をスプリントオリゴヌクレオチドＤにアニーリングさせて、そして次いで、３’および５’端の連結によって環状化する。工程ｄにおいて、ここで環状化されているＡ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域を生成する。この例示的例において、スプリントオリゴヌクレオチドＤは、３’修飾（この例においては化学物質）のため、またはＤの３’端およびＡ_２の対応する領域の間のヌクレオチドミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ_１に対して伸長することは不可能である。

【0078】

工程ｄにおいて、Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングして、そして多数コピーのＡ_２またはＡ_２の領域が生成される。
野生型ＤＮＡの少なくとも一部をブロッキングし、Ａ_０のターゲットポリヌクレオチド配列のみへのアニーリングを促進することによって、本発明の方法の特異性を改善してもよい。ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異性を改善してもよい。用いられる一般的な技術は、ＰＣＲプライマー間でアニーリングし、そしてＰＣＲポリメラーゼによって置換されるかまたは消化されることが不可能である、オリゴヌクレオチドを設計することである。オリゴヌクレオチドは、非ターゲット（通常、健康な）配列にアニーリングするように設計される一方、ターゲット（突然変異体）配列にはミスマッチ（しばしば一塩基で）である。このミスマッチは、２つの配列に対して異なる融解温度を生じ、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ伸長温度では、非ターゲット配列にアニーリングしたままである一方、ターゲット配列からは解離するように設計される。

【0079】

ブロッキングオリゴヌクレオチドは、しばしば、ＰＣＲポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性による消化を防止するか、またはターゲットおよび非ターゲット配列の間の融解温度差異を増進させるような修飾を有してもよい。

【0080】

ロックド核酸（ＬＮＡ）または他の融解温度改変修飾のブロッキングオリゴヌクレオチド内への取り込みは、ターゲットおよび非ターゲット配列に対するオリゴヌクレオチドの融解温度の差異を有意に増加させうる。

【0081】

したがって、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いる本発明の態様を提供する。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、消化されずまた置換されないことを確実にするために、加ピロリン酸分解（ＰＰＬ）反応に耐性でなければならない。これは、いくつかの異なる方法で、例えば３’端のミスマッチを通じるか、あるいはホスホロチオエート結合またはスペーサーなどの修飾を通じるかのいずれかで、達成可能である。

【0082】

ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いる、本発明のこうした態様または側面において、所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法は：
ａ． 一本鎖ブロッキングオリゴヌクレオチドを少なくとも非ターゲットポリヌクレオチドのサブセットにアニーリングさせ；
ｂ． 分析物ターゲット配列を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端が分析物ターゲット配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｃ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｄ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｅ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域を生成し；そして
ｆ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるポリヌクレオチドターゲット配列の存在または非存在をそこから推測する
工程によって特徴づけられる。

【0083】

１つの態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’端でのミスマッチを通じて加ピロリン酸分解に耐性であるように作製される。別の態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、３’ブロッキング基の存在を通じて耐性であるように作製される。別の態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、スペーサーまたは他の内部修飾の存在を通じて耐性であるように作製される。さらなる態様において、ブロッキングオリゴヌクレオチドには、融解温度を増加させる修飾または修飾ヌクレオチド塩基の両方が含まれ、そして加ピロリン酸分解に耐性を与えられる。

【0084】

本発明は、ここで、以下の実験データを参照しながら例示される。

【実施例】

【0085】

実施例１： 単一ヌクレオチドミスマッチに対する加ピロリン酸分解特異性
以下のヌクレオチド配列：

【0086】

【化2】

【0087】

式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、ＤＮＡの適切な特徴的核酸塩基を所持するヌクレオチドに相当する
を有する一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド１（配列番号１）を調製した。

【0088】

５’から３’方向に以下のヌクレオチド配列：

【0089】

【化3】

【0090】

式中、オリゴヌクレオチド２には、オリゴヌクレオチド１の３’端の５２塩基に相補的な５２塩基領域が含まれ、そしてオリゴヌクレオチド３〜６には、それぞれ、１位、１０位、２０位および３０位で単一ヌクレオチドミスマッチを含む同じ領域が含まれる
を有する一本鎖オリゴヌクレオチド２〜６（配列番号２〜６）のセットもまた調製した。

【0091】

次いで、以下の配合：
２０μＬ ５ｘ緩衝剤 ｐＨ８．０
１０μＬオリゴヌクレオチド１、３０００ｎＭ
１０μＬオリゴヌクレオチド２、３、４、５または６、３０００ｎＭ
２．５Ｕ Ｍａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＱｉａｇｅｎ Ｂｅｖｅｒｌｙ）
１０μＬ無機ピロリン酸、６ｍＭ
０．０４Ｕアピラーゼ
１００μＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する反応混合物を調製した。

【0092】

次いで、混合物を３７℃で１２０分間インキュベーションすることによってオリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解を行い、そして生じた反応産物を、ゲル電気泳動によって分析した。

【0093】

この分析の結果を図１に示し、この図において、オリゴヌクレオチド２の存在下で、オリゴヌクレオチド１はオリゴヌクレオチド２から融解する長さまで分解され、長さおよそ５０ヌクレオチド短くなったオリゴヌクレオチドが残ることがわかる。逆に、オリゴヌクレオチド３の存在下では、オリゴヌクレオチド１の３’端での単一ヌクレオチドミスマッチのため、加ピロリン酸分解は観察されない。オリゴヌクレオチド４〜６の存在下で、オリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解は、一塩基ミスマッチの位まで進行し、この点で停止して、さらには分解されない短くなったオリゴヌクレオチドが残る。

【0094】

実施例２： 分解されたプローブの環状化および非環状化ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ消化
以下のヌクレオチド配列：

【0095】

【化4】

【0096】

式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、ＤＮＡの適切な特徴的核酸塩基を所持するヌクレオチドに相当し、そしてＰは５’リン酸基に相当し、そしてオリゴヌクレオチド１は、適切なターゲットオリゴヌクレオチドに対するオリゴヌクレオチド２の加ピロリン酸分解を通じて得られるであろうような、短くなったオリゴヌクレオチド２を含む
を有する、一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド１（配列番号７）および２（配列番号８）を調製した。

【0097】

以下のヌクレオチド配列：

【0098】

【化5】

【0099】

式中、／３ｄｄＣ／は、３’ジデオキシシトシンヌクレオチドに相当し、そしてオリゴヌクレオチド３は、オリゴヌクレオチド１の３’端およびオリゴヌクレオチド２の内部領域に相補的な５’端、ならびにオリゴヌクレオチド１および２の５’端に相補的な３’端を有する
を有する、第三の一本鎖オリゴヌクレオチド３（配列番号９）もまた調製した。

【0100】

次いで、以下の配合：
２０μＬ ５ｘ緩衝剤 ｐＨ８．０
１０μＬオリゴヌクレオチド１または２、３０００ｎＭ
１０μＬオリゴヌクレオチド３、３０００ｎＭ
７Ｕ大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）リガーゼ
１００μＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する反応混合物を調製した。

【0101】

次いで、混合物を３７℃で３０分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチド連結を行った。
次いで、以下の配合：
２０μＬ ５ｘ緩衝剤 ｐＨ８．０
１２５ＵエキソヌクレアーゼＩＩＩまたは同等の体積の水
１００μＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する、第二の反応混合物を調製した。

【0102】

次いで、第一および第二の反応混合物を合わせて、そして生じた混合物を３７℃で３０分間インキュベーションして、非環状化ＤＮＡのエキソヌクレアーゼ消化も可能にした。次いで、生じた溶液をゲル電気泳動によって分析した。

【0103】

この分析の結果を図２に示し、ここで、短くなったオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）が、連結反応によって効率的に環状化され、そして続くエキソヌクレアーゼ消化でも残る一方、短くなっていないオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド２）は環状化されず、そして効率的に消化されることがわかる。

【0104】

実施例３： 環状化プローブの増幅
以下のヌクレオチド配列：

【0105】

【化6】

【0106】

式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、ＤＮＡの適切な特徴的核酸塩基を所持するヌクレオチドに相当する
を有する、一本鎖のオリゴヌクレオチドプライマー１（配列番号１０）および２（配列番号１１）の対を調製した。

【0107】

次いで、以下の配合：
２０μＬ ５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌｅｘ ＨＦ反応緩衝剤
０．１μＬの実施例２由来の最終反応混合物
１００μＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する反応混合物を調製した。

【0108】

以下の配合：
２０μＬ ５ｘＰｈｕｓｉｏｎ Ｆｌｅｘ ＨＦ反応緩衝剤
１０μＬベタイン、２．５Ｍ
１０μＬオリゴヌクレオチド１、３０００ｎＭ
１０μＬオリゴヌクレオチド２、３０００ｎＭ
１０μＬ ｄＮＴＰ、２ｍＭ
２Ｕ ＰｈｕｓｉｏｎホットスタートＦｌｅｘ ＤＮＡポリメラーゼ
１００μＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する、第二の反応混合物もまた調製した。

【0109】

次いで、第二の反応混合物を、０．１μＬの第一の反応混合物と合わせ、そして生じた混合物を９８℃で１分間、その後、３０周期の（９８℃ｘ２０秒間；５５℃ｘ３０秒間；６８℃ｘ３０秒間）に供し、ポリメラーゼ連鎖反応を通じて指数関数的増幅が起こることを可能にした。

【0110】

次いで、生じた反応産物をゲル電気泳動によって分析し、その結果を図３に示す。この分析から、実施例２において短くなったオリゴヌクレオチドが存在し、そしてこれが環状化された場合、この増幅によって多量の産物が産生されることがわかる。逆に、短くなっていないオリゴヌクレオチドが、実施例２において存在せず、そして環状化が起こらなかった場合、ＤＮＡの観察可能な増幅はなかった。

【0111】

実施例４： ピロリン酸類似体を用いた加ピロリン酸分解
以下のヌクレオチド配列：

【0112】

【化7】

【0113】

式中、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴは、ＤＮＡの適切な特徴的核酸塩基を所持するヌクレオチドに相当し；Ｆは慣用的なアミン付着化学反応を用いてＡｔｔｏ ５９４色素で標識されたデオキシチミジンヌクレオチド（Ｔ）に相当し、そしてＱはＢＨＱ−２消光剤で標識されたデオキシチミジンヌクレオチドに相当する
を有する、一本鎖の第一のオリゴヌクレオチド１（配列番号１２）を調製した。

【0114】

以下のヌクレオチド配列：

【0115】

【化8】

【0116】

式中、オリゴヌクレオチド２がオリゴヌクレオチド１にアニーリングした際、オリゴヌクレオチド１の３’端が後退して、加ピロリン酸分解のターゲットとなる一方、オリゴヌクレオチド２の３’端が逆方向末端ヌクレオチドの存在によって加ピロリン酸分解から保護されるように、Ｘは、反転３’ｄＴヌクレオチドに相当する
を有する、別の一本鎖オリゴヌクレオチド２（配列番号１３）もまた調製した。

【0117】

次いで、以下の配合：
２０μＬ ５ｘ緩衝剤 ｐＨ８．０
１０μＬオリゴヌクレオチド１、１０００ｎＭ
１０μＬオリゴヌクレオチド２、１０００ｎＭ
２．５Ｕ Ｍａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＱｉａｇｅｎ Ｂｅｖｅｒｌｙ）
１０μＬ無機ピロリン酸、６ｍＭ、またはイミド二リン酸、１０ｍＭ、または水
１００μＬまでの水
ここで、５ｘ緩衝剤は以下の混合物を含んだ：
５０μＬ酢酸Ｔｒｉｚｍａ、１Ｍ、ｐＨ８．０
２５μＬ水性酢酸マグネシウム、１Ｍ
２５μＬ水性酢酸カリウム、５Ｍ
５０μＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤（１０％）
１ｍＬまでの水
に由来するものに対応する組成を有する反応混合物を調製した。

【0118】

次いで、混合物を３７℃で７５分間インキュベーションすることによって、オリゴヌクレオチド１の加ピロリン酸分解を行った。オリゴヌクレオチド１が進行性に加ピロリン酸分解されるにつれて、蛍光色素分子は消光剤から分離し、そして次いで蛍光シグナルを生成することが可能になった。インキュベーション中のこの蛍光の増大を、ＣＬＡＲＩＯＳｔａｒマイクロプレート読み取り装置（例えばＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて監視し、そしてこれを用いて、無機ピロリン酸、イミド二リン酸または水の存在下でのオリゴヌクレオチドの加ピロリン酸分解速度を推測した。

【0119】

この実験の結果を図４にグラフで示す。ここから、ピロリン酸またはイミド二リン酸の存在下で、加ピロリン酸分解が進行するが、非存在下では進行しないことがわかる。同様に、ポリメラーゼが存在しない比較実験においては、蛍光シグナルは生じなかった。ピロリン酸の存在下での加ピロリン酸分解は、遊離ヌクレオチド三リン酸を産生する一方、イミド二リン酸の存在下での加ピロリン酸分解は、ベータおよびガンマリン酸の間に、Ｏの代わりにＮ−Ｈ基を有する、修飾遊離ヌクレオチド三リン酸（２’−デオキシヌクレオシド−５’−［（β，γ）イミド］三リン酸）を生じる。

【0120】

実施例５： 融解曲線分析
本発明の方法を行って、ヒトＥＧＦＲ遺伝子で生じうる３つの異なる突然変異：Ｔ７９０Ｍ（エクソン２０）、Ｃ７９７Ｓ（エクソン２０）およびＬ８６１Ｑ（エクソン２１）の存在を検出し、そして同定した。

【0121】

野生型ゲノムＤＮＡを含有する６つの試料を調製した。これらの試料のうち３つには、これらの試料中の最終突然変異アレル割合が１％になるように、関心対象の３つの突然変異の各々に関する単一合成突然変異配列でスパイク処理した。各試料に、異なる単一突然変異の検出のために設計されたプローブオリゴＡ_０を添加した：

【0122】

【化9】

【0123】

無機ピロリン酸イオンおよびＭａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼの添加を通じて、試料を加ピロリン酸分解に供し、そして４１℃でインキュベーションした。プローブオリゴの加ピロリン酸分解後、大腸菌リガーゼおよび以下の配列：

【0124】

【化10】

【0125】

を含むスプリントオリゴの添加を通じて、連結を行った。
連結後、以下の配列を有するｄＮＴＰ、ＢｓｔＬＦ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｙｂｒグリーン挿入色素、突然変異特異的順方向プライマーおよび普遍的逆方向プライマーの添加を通じて、試料を、高分岐ローリングサークル増幅に供し、その後、６０℃で７０分間インキュベーションした。

【0126】

【化11】

【0127】

次いで、試料の温度を７０℃から９５℃に上げ、そして０．５℃ごとに蛍光測定を行った。生じるデータ曲線を差異化して、融解ピークを生じ、その結果を図５に示す。したがって、有意な融解ピークの存在を用いて、所定のプローブによってターゲティングされる突然変異の存在を推測する一方、このピークの位置を用いて、突然変異の性質を同定することも可能であることがわかる。

【0128】

実施例６： 適用および使用
以下に記載する以下の適用は、本発明の方法をどのように適用しうるかのいくつかの例を提供する。

【0129】

比較診断
本発明の方法を用いて、試料における特定の遺伝子マーカーを検出してもよく、これは適切な療法の選択のガイドを補助するために使用されうる。これらのマーカーは腫瘍特異的突然変異であってもよいし、または野生型ゲノム配列であってもよく、そして組織、血液または任意の他の患者試料タイプを用いて検出されてもよい。

【0130】

耐性監視
疾患の治療中の患者試料の反復試験によって、療法に対して発展する耐性の早期検出が可能になりうる。この適用の例は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤（例えばゲフィチニブ、エルロチニブ）が第一の治療として一般的に用いられる、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。治療中、腫瘍はしばしば、ＥＧＦＲ遺伝子中に突然変異（例えばＴ７９０Ｍ、Ｃ７９７Ｓ）を発展させ、これが薬剤に対する耐性を与える。これらの突然変異の早期検出は、代替療法（例えばＴａｇｒｉｓｓｏ）への患者の転換を可能にしうる。

【0131】

典型的には、耐性開始に関して監視される患者は、反復組織生検を行うには病状が悪すぎる可能性もある。反復組織生検はまた、費用が高く、侵襲性であり、そして関連するリスクを持つ可能性もある。血液から試験することが好ましいが、妥当な採血試料においては、関心対象の突然変異は非常に低コピー数でしか存在しない可能性もある。したがって、監視は、定期的に実行可能であるように、単純でそして費用効率的である、本発明の方法を用いた、血液試料由来の高感度試験を必要とする。

【0132】

再発監視
この適用例において、治療後に疾患がないと宣言されている患者を、長期に渡って監視して、疾患の再発を検出してもよい。これは、非侵襲性に行われる必要があり、そして血液試料からのターゲット配列の高感度検出を必要とする。本発明の方法を用いることによって、定期的に実行可能である、単純でそして低コストの方法を提供する。ターゲティングされる配列は、関心対象の疾患に一般的であることが知られる遺伝子突然変異であってもよいし、または寛解前の腫瘍組織における変異体の検出に基づいて、特定の患者に関して設計されるターゲットのカスタムパネルであってもよい。

【0133】

最小残渣疾患（ＭＲＤ）監視
治療後、患者に残る残渣癌細胞があるいくつかの癌に関しては、これが癌および白血病の再発の主な原因である。ＭＲＤ監視および試験は、いくつかの重要な役割：治療が癌を根絶させたかまたは痕跡が残っているかを決定すること、異なる治療の有効性を比較すること、患者寛解状態を監視すること、ならびに白血病の再発を検出すること、およびこれらの必要性を最適に満たすであろう治療を選択することを有する。

【0134】

スクリーニング
疾患の早期検出のための集団スクリーニングは、特に癌診断において、かねてからの目的である。困難な点は２点である：あまりにも多い偽陰性を伴わずに、疾患の確実な検出を可能にするマーカーパネルの同定、ならびに十分な感度および十分に低いコストの方法の開発である。本発明の方法を用いて、ＰＣＲに基づく試験よりもより大きな突然変異パネルに取り組むが、配列決定に基づく診断法よりもはるかに単純なワークフローおよびより低いコストであることが可能である。

【0135】

臓器移植拒絶
移植された臓器がレシピエントによって拒絶される場合、この臓器からのＤＮＡがレシピエントの血流内に脱落する。このＤＮＡの早期検出によって、拒絶の早期検出が可能になる。ドナー特異的マーカーのカスタムパネルを用いて、または集団において一般的であることが知られる変異体のパネルを用いることによって、これを達成してもよく、こうした変異体のうちいくつかは、ドナーに存在し、そしていくつかは、レシピエントに存在する。長期に渡る、臓器レシピエントのルーチンの監視は、本明細書に開示する本発明の低コストおよび単純なワークフローによって可能になりうる。

【0136】

非侵襲性出生前試験（ＮＩＰＴ）
胎児ＤＮＡが母体血液中に存在することは長い間知られており、そしてＮＩＰＴ市場は現在、配列決定を用いて突然変異を同定し、そして特定の染色体のコピー数をカウントして、胎児異常の検出を可能にする企業によってかなり飽和している。本明細書に開示するような本発明の方法は、非常に低いアレル割合の突然変異を検出する能力を有し、胎児ＤＮＡのより早期の検出を潜在的に可能にする。所定の集団における共通の突然変異の同定は、母体または胎児ＤＮＡのいずれに存在してもよい突然変異をターゲティングするか、または妊娠のより早期段階での異常の検出を可能にするアッセイを開発することを可能にするであろう。

【0137】

実施例７： 単一ウェル多重化技術
いくつかの例において、任意の１つのターゲットの存在を同定すべきであるが同一性は同定しなくてもよい、突然変異またはターゲット配列の群がある。他のものにおいては、突然変異または配列の存在および同一性の両方に関する情報が必要である。どちらの場合も、多数のターゲットが単一反応体積においてアッセイされるように、反応を多重化することが有益である。これは、プロセスの効率の改善を導き、一度にプロセシング可能な試料の数またはアッセイ可能なターゲットパネルのサイズのいずれかを増加させる。ターゲット配列の存在が必要であるが同一性は必要でない場合、多重化は、多数のターゲットに関するプローブを単一反応体積に組み合わせる程度に単純でありうる。標準的ＰＣＲに勝る本発明の方法の１つの重要な利点は、１つの単一セットのプライマーを用いて、「活性化された」プローブ（Ａ_２）すべてを、反応の最終工程で増幅可能であることである。

【0138】

ＥＧＦＲ遺伝子上のエクソン１９欠失を用いて、本発明者らは、単一反応において、０．１％突然変異体アレル頻度（ＭＡＦ）で１０倍多重化検出を立証した。
各々、０．１％または０．５％の１０の異なるエクソン１９欠失の１つをスパイク処理した野生型（ＷＴ）ＤＮＡを含む、２０の試料を調製した。ＷＴ ＤＮＡのみを含むさらなる試料を対照として用いた。すべての１０の異なるエクソン１９突然変異の検出のためのプローブをすべての試料に添加し、そして標準条件を用いて、反応を行った。結果（図６を参照されたい）は、０．５％および０．１％ＭＡＦ両方で各突然変異の明らかな検出を示す。

【0139】

標準技術である、挿入色素、標識プローブ（Ｔａｑｍａｎ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ、ステム−ループプライマー）、分子ビーコン、または当業者に知られるであろう任意の他の標準技術を用いて、検出を行ってもよい。

【0140】

ターゲットの同一性が必要である場合、多色系を用いて、どのプローブが活性化されているか（Ａ_２）同定する可能性が最も高い。これは必然的に、異なるターゲットに関するプローブ中に、異なる「バーコード」配列があるプローブ設計を必要とし、これを次いで、同定のために用いる。次いで、先に論じるように同定を行ってもよい。

【0141】

１色を用いた１０重多重化検出と同様に、本発明者らはまた、現在の方法の直鎖およびローリングサークル増幅実施の両方で（前者はＴａｑｍａｎプローブを用い、後者はステム−ループプライマーを用いる）、単一ウェルにおける２色検出を立証している。この例において、Ｔ７９０Ｍ突然変異またはＣ７９７Ｓ突然変異のいずれかを、０％、０．１％および０．５％のアレル割合で含有する試料を調製した。加ピロリン酸分解および続く連結後、異なるフルオロフォアで標識した突然変異ターゲティングプローブＡ_０に特異的なプライマーまたはプローブを用いて、試料をローリングサークルまたは直鎖ＰＣＲ増幅に供した。標識ステム−ループプライマーを用いたローリングサークル増幅の結果を図７に示し、ここで、Ｔ７９０Ｍ突然変異の存在下で、Ｃｙ５検出チャネルにおいてシグナルが生成される一方、Ｃ７９７Ｓ突然変異を含有する試料においてＴｅｘａｓＲｅｄチャネルでシグナルが観察されることがわかる。

【0142】

実施例８： バックグラウンドシグナル較正のための対照プローブの使用
各々、最終濃度１００ｎＭのヒトＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２１のＬ８５８Ｒ突然変異領域の野生型配列を含む、合成オリゴヌクレオチド１（配列番号２４）を含む、３つの試料１〜３を調製した：

【0143】

【化12】

【0144】

ＥＧＦＲ遺伝子の同じ領域に由来し、そしてさらにＬ８５８Ｒ突然変異を含む、以下の配列を有する、合成「突然変異体」オリゴヌクレオチド２（配列番号２５）を調製した：

【0145】

【化13】

【0146】

オリゴヌクレオチド２を試料２および３に、それぞれ、１００ｐＭおよび１ｎＭ最終濃度で添加して、試料２中のＬ８５８Ｒ突然変異部位を含む分子が０．１％であり、そして試料３中のものの１％がこの突然変異を含むようにした。次いで、各試料を２つの反応体積に分けた。第一の反応体積に、アッセイプローブオリゴヌクレオチド３（配列番号２６）を１０ｎＭ最終濃度で添加して、該配列は、突然変異Ｌ８５８Ｒ配列領域に完全にマッチする３’端を含む一方、第二の体積には対照プローブオリゴヌクレオチド４（配列番号２７）を同じ濃度で添加し、該配列は、Ｌ８５８Ｒ突然変異領域以外は同じ配列を含み、該領域において、突然変異体および野生型アレルの両方に対してミスマッチである配列を含んだ：

【0147】

【化14】

【0148】

次いで、反応体積を、０．６ｍＭピロリン酸イオンおよび３７．５Ｕ／ｍＬ Ｍａｋｏ ＤＮＡポリメラーゼの添加および４１℃３０分間の加熱を通じて、加ピロリン酸分解に供した。この反応後、５０Ｕ／ｍＬ熱安定性無機ピロホスファターゼおよび１００Ｕ／ｍＬ大腸菌リガーゼとともに、スプリントオリゴヌクレオチド５（配列番号２８）を各反応体積に１０ｎＭ最終濃度に添加して、そして加ピロリン酸分解されたプローブも、３７℃１０分間のインキュベーションを通じて環状化した。次いで、大腸菌リガーゼを９５℃１０分間の加熱を通じて不活性化した。

【0149】

【化15】

【0150】

この後、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよびＴ５エキソヌクレアーゼの添加および３０℃５分間のインキュベーションを通じて、試料をエキソヌクレアーゼ消化に供した後、９５℃に５分間加熱することを通じて、エキソヌクレアーゼを不活性化した。

【0151】

次いで、各試料に、２００ｎＭ最終濃度の２つのプライマーオリゴヌクレオチド６（配列番号２９）および７（配列番号３０）、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、３２０Ｕ／ｍＬ ＢｓｔＬＦ ＤＮＡポリメラーゼおよび０．５ｘ最終濃度Ｓｙｂｒグリーン挿入色素を添加した。

【0152】

【化16】

【0153】

試料を６０℃で８０分間インキュベーションし、そして各試料中のＳｙｂｒグリーン色素からの蛍光を１分あたり１回測定した。このインキュベーションの結果を図８（ｉ）に示し、ここで、アッセイプローブの存在下で、蛍光シグナルは、Ｌ８５８Ｒ突然変異の存在に依存する一方、対照プローブから観察されるシグナルは、この突然変異の存在からは独立であり、そして突然変異の非存在下でプローブから観察されるシグナルに緊密にマッチすることがわかる。図８（ｉｉ）は、３つの試料各々に関するアッセイプローブシグナルからの対照プローブシグナルの減算の結果を示す。参照試料の使用を伴わずに、０．１％アレル割合が下限であるＬ８５８Ｒ突然変異の定量的検出は、したがって、この技術を通じて可能である。

【0154】

本発明の多様なさらなる側面および態様は、本開示を考慮して、当業者に明らかであろう。
「および／または」は、本明細書において、他方を伴うまたは伴わない、２つの明記する特徴または構成要素の各々の特異的開示として解釈されるものとする。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書に個々に示されるのと同様に、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の特異的開示として解釈されるものとする。

【0155】

背景が別に示さない限り、上に示す特徴の説明および定義は、本発明の任意の特定の側面または態様に限定されず、そして記載されるすべての側面および態様に等しく適用される。

【0156】

当業者は、本発明が例として、いくつかの態様に言及して記載されてきているが、開示する態様に限定されず、そして付随する請求項に定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、代替態様が構築可能であることをさらに認識するであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2021524287000001.app

【手続補正書】

【提出日】2021年6月18日

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

所定の核酸分析物において、ターゲットポリヌクレオチド配列を検出する方法であって：
ａ． 分析物を、一本鎖プローブオリゴヌクレオチドＡ_０にアニーリングさせて、少なくとも部分的に二本鎖であり、そしてＡ_０の３’端がターゲットポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成する、第一の中間産物を生成し；
ｂ． 第一の中間産物を、Ａ_０の３’端から３’−５’方向に、加ピロリン酸分解酵素で加ピロリン酸分解して、部分的に消化された鎖Ａ_１および分析物を生成し；
ｃ． （ｉ）Ａ_１に一本鎖トリガーオリゴヌクレオチドＢをアニーリングさせ、そしてＢに対して、５’−３’方向に、Ａ_１鎖を伸長するか；または（ｉｉ）３’および５’端の連結を通じてＡ_１を環状化するか；または（ｉｉｉ）Ａ_１の３’端を連結プローブオリゴヌクレオチドＣの５’端に連結し；各場合で、オリゴヌクレオチドＡ_２を生成し；
ｄ． Ａ_２を少なくとも１つの一本鎖プライマーオリゴヌクレオチドでプライミングし、そしてＡ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域の多数コピーを生成し；そして
ｅ． 多数コピー由来のシグナルを検出し、そして分析物におけるターゲットポリヌクレオチド配列の存在または非存在をそこから推測する
工程を含む、前記方法。

【請求項2】

ｃ（ｉｉ）またはｃ（ｉｉｉ）を使用し、そして連結前に、Ａ_１がまず５’−３’方向に伸長される、請求項１の方法。

【請求項3】

連結が、連結前にＡ_１がアニーリングする、さらなるスプリントオリゴヌクレオチドＤの添加を通じて行われ、Ｄが、Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域およびオリゴヌクレオチドＣの５’端またはＡ_１の５’端のいずれかに相補的な領域を含む、請求項１の方法。

【請求項4】

オリゴヌクレオチドＤが、３’修飾のため、またはＤの３’端およびＡ_１の対応する領域の間のミスマッチを通じてのいずれかで、Ａ_１に対する伸長を経ることが不可能である、請求項３の方法。

【請求項5】

工程（ｃ）の後で、工程（ｃ）より生成した反応混合物をエキソヌクレアーゼで処理して、実質的に非連結核酸物質を消化し、そしてｃ（ｉｉ）を使用する場合、オリゴヌクレオチドＣが、３’−５’エキソヌクレアーゼ消化から該オリゴヌクレオチドを保護する３’または内部修飾をさらに含む、請求項１の方法。

【請求項6】

工程（ｄ）の前にエキソヌクレアーゼを非活性化する、請求項５の方法。

【請求項7】

ｃ（ｉ）を使用する請求項１の方法であって、Ｂが（ｉ）Ａ_１の３’端に相補的なオリゴヌクレオチド領域および（ｉｉ）Ａ_０またはターゲットポリヌクレオチド配列に実質的に相補的でない５’端の隣接オリゴヌクレオチド領域を含み、そして工程（ｄ）で用いるプライマーオリゴヌクレオチドの１つがＡ_２の伸長された領域にアニーリングする、前記方法。

【請求項8】

プローブオリゴヌクレオチドＡ_０が、エキソヌクレオリシス（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｓｉｓ）に耐性である５’端を有し、そして工程（ａ）および（ｂ）の後に、そこから産生される反応媒体を、５’−３’エキソヌクレアーゼで処理して、このエキソヌクレオリシスに耐性を与えられていない核酸分子を実質的に除去する、請求項１の方法。

【請求項9】

工程（ｂ）がホスファターゼの存在下で行われる、請求項１の方法。

【請求項10】

工程（ａ）および（ｂ）が反復されて、分析物から、部分的に消化されたプローブＡ_１の多数のコピーを生成する、請求項１の方法。

【請求項11】

工程（ｂ）の後で、ピロホスファターゼの添加によって、加ピロリン酸分解反応を停止する、請求項１の方法。

【請求項12】

工程（ｅ）が、１つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド結合色素または分子プローブを用いて、多数コピーから得られるシグナルを検出する工程を含む、請求項１の方法。

【請求項13】

工程（ｄ）および（ｅ）が同時に行われる、請求項１の方法。

【請求項14】

工程（ｄ）におけるアンプリコンの生成から生じる、長期間に渡るシグナルの増加を用いて、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列の濃度を推測する、請求項１３の方法。

【請求項15】

分析物が一本鎖であり、そして工程（ａ）の前に、該分析物は、
（ｉ）生物学的試料を、増幅サイクルに供することによって、分析物のアンプリコンを産生し、そして
（ｉｉ）工程（ｉ）の産物を、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するエキソヌクレアーゼで消化する
工程によって、得られる分析物を含有する生物学的試料に由来する、ここで工程（ｉ）で使用するプライマーの１つにエキソヌクレアーゼブロッキング基が含まれる、請求項１の方法。

【請求項16】

デオキシチミジン三リン酸の代わりにデオキシウリジン三リン酸を用い、そしてＵＴＰ−ＤＮＡグリコラーゼの存在下で、工程（ｉ）を実行する、請求項１５の方法。

【請求項17】

分析物が一本鎖であり、そして工程（ａ）の前に、該分析物は、（ｉ）生物学的試料を増幅サイクルに供することにより分析物のアンプリコンを産生する工程によって得られる分析物を含有する生物学的試料に由来する、ここで使用するプライマーの１つを他のもの（単数または複数）より過剰に導入する、請求項１の方法。

【請求項18】

増幅が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを使用し、工程（ｉ）の後で、工程（ｉ）の産物をプロテイナーゼと反応させて、ポリメラーゼを破壊し、そして次いで、この反応の産物を加熱することによってプロテイナーゼを破壊する、請求項１７の方法。

【請求項19】

増幅が３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを使用し、工程（ｉ）の後で、工程（ｉ）の産物をプロテイナーゼと反応させて、ポリメラーゼを破壊し、そして次いで、この反応の産物を加熱することによってプロテイナーゼを破壊する、請求項１７の方法。

【請求項20】

デオキシチミジン三リン酸の代わりにデオキシウリジン三リン酸を用い、そしてＵＴＰ−ＤＮＡグリコラーゼの存在下で、工程（ｉ）を実行する、請求項１７の方法。

【請求項21】

各々、異なるターゲットポリヌクレオチド配列に対して選択的であり、そして各々、同定領域を含む、多数のプローブＡ_０を使用し、そして工程（ｄ）で増幅する領域にこの同定領域が含まれる、請求項１の方法。

【請求項22】

分析物中に存在するターゲット配列の存在が、同定領域（単数または複数）の検出を通じて、工程（ｄ）で生成するアンプリコンより推測される、、請求項２１の方法。

【請求項23】

分子プローブを用いるかまたは配列決定を通じて、同定領域（単数または複数）の検出を行う、請求項２２の方法。

【請求項24】

（ｅ）が：
ｉ． １つまたはそれより多いオリゴヌクレオチド蛍光結合色素または分子プローブを用いて、Ａ_２の多数コピーまたはＡ_２の領域の多数のコピーを標識し；
ｉｉ． 多数コピーの蛍光シグナルを測定し；
ｉｉｉ． 変性条件のセットに多数コピーを曝露し；そして
ｉｖ． 変性条件への曝露中に、多数コピーの蛍光シグナルにおける変化を監視することによって、分析物中のターゲットポリヌクレオチド配列を同定する
工程をさらに含む、請求項２３の方法。

【請求項25】

異なるプローブＡ_０が共通のプライミング部位を含み、工程（ｄ）における増幅のために、単一のまたは単一セットのプライマーを用いることを可能にする、請求項２１の方法。

【請求項26】

工程（ａ）の前に、分析物を多数の反応体積に分割し、各々の体積が、異なるターゲット配列を検出するために導入された、異なるプローブオリゴヌクレオチドＡ_０を有する、請求項１の方法。

【国際調査報告】