特表 2021-524462 マイクロカプセル化した修飾したポリヌクレオチド組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】特表2021-524462(P2021-524462A)

(43)【公表日】2021年9月13日

(54)【発明の名称】マイクロカプセル化した修飾したポリヌクレオチド組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20210816BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20210816BHJP

   A61K 38/17 20060101ALN20210816BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7088

   A61K9/48

   A61K48/00

   A61K47/02

   A61K47/36

   A61K31/7105

   A61K9/50

   A61K38/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2020-564919(P2020-564919)

(86)(22)【出願日】2019年5月23日

(85)【翻訳文提出日】2021年1月14日

(86)【国際出願番号】US2019033705

(87)【国際公開番号】WO2019226875

(87)【国際公開日】20191128

(31)【優先権主張番号】62/675,206

(32)【優先日】2018年5月23日

(33)【優先権主張国】US

(81)【指定国】 AP(BW,GH,GM,KE,LR,LS,MW,MZ,NA,RW,SD,SL,ST,SZ,TZ,UG,ZM,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,RU,TJ,TM),EP(AL,AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,RS,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GQ,GW,KM,ML,MR,NE,SN,TD,TG),AE,AG,AL,AM,AO,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BH,BN,BR,BW,BY,BZ,CA,CH,CL,CN,CO,CR,CU,CZ,DE,DJ,DK,DM,DO,DZ,EC,EE,EG,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,GT,HN,HR,HU,ID,IL,IN,IR,IS,JO,JP,KE,KG,KH,KN,KP,KR,KW,KZ,LA,LC,LK,LR,LS,LU,LY,MA,MD,ME,MG,MK,MN,MW,MX,MY,MZ,NA,NG,NI,NO,NZ,OM,PA,PE,PG,PH,PL,PT,QA,RO,RS,RU,RW,SA,SC,SD,SE,SG,SK,SL,SM,ST,SV,SY,TH,TJ,TM,TN,TR,TT

(71)【出願人】

【識別番号】501083115

【氏名又は名称】メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】アッタ ベーファー

(72)【発明者】

【氏名】アンドレ タージック

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA53

4C076AA61

4C076AA64

4C076AA95

4C076BB11

4C076DD21

4C076EE30H

4C084AA13

4C084MA37

4C084MA38

4C084MA66

4C084NA13

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA37

4C086MA38

4C086MA66

4C086NA13

(57)【要約】

細胞が異種ポリヌクレオチドの転写産物を発現しうるための異種のポリヌクレオチドを細胞内に導入するプラットフォームは、組成物及び方法を含む。その組成物は一般的にカプセル化剤及びカプセル化剤によってカプセル化したポリヌクレオチドを含む。そのカプセル化剤は金属ナノ粒子を含みうる。そのポリヌクレオチドは細胞内のサイトゾルにおけるそのポリヌクレオチドの分解を阻害する一以上の修飾を含む。様々な態様において、そのポリヌクレオチドは少なくとも一つの治療的なポリペプチド又は少なくとも一つの治療的なＲＮＡをコードする。その方法は組成物と細胞とを接触すること及び組成物を細胞に取り込ませることを含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カプセル化剤；及び、
前記カプセル化剤によってカプセル化したポリヌクレオチド、を含み、
ここで前記ポリヌクレオチドは細胞のサイトゾル内の当該ポリヌクレオチドの分解を阻害する少なくとも一つの修飾を含み、当該ポリヌクレオチドは少なくとも一つの治療的なポリペプチド又は少なくとも一つの治療的なＲＮＡをコードする、組成物。

【請求項2】

前記ポリヌクレオチド修飾がシュードノット、ＲＮＡ安定化因子、又は人工的な３’ステムループを含む、請求項１の組成物。

【請求項3】

前記カプセル化剤が金属ナノ粒子を含む、請求項１又は２の組成物。

【請求項4】

前記金属ナノ粒子が前記ポリヌクレオチドを少なくとも部分的に取り囲む複数の金属サブユニットを含む、請求項３の組成物。

【請求項5】

前記金属ナノ粒子がコア構造を形成する複数の金属サブユニットを含む、請求項３の組成物。

【請求項6】

前記複数のナノ粒子が：前記金属ナノ粒子；及び第二の材料を含む少なくとも一つのナノ粒子を含む、請求項４又は５の組成物。

【請求項7】

前記金属ナノ粒子が表面修飾を含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記表面修飾が生体適合性ポリマーを含む、請求項７の組成物。

【請求項9】

前記生体適合性ポリマーが正味の正電荷を含む、請求項８の組成物。

【請求項10】

前記生体適合性ポリマーがキトサンを含む、請求項９の組成物。

【請求項11】

前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含む、前述のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

細胞内へ異種のポリヌクレオチドを導入する方法であって、
前記細胞と、
カプセル化剤及び
当該カプセル化剤によってカプセル化した異種ポリヌクレオチド、を含む医薬組成物とを接触すること、ここで当該ポリヌクレオチドは前記細胞のサイトゾル内にある場合にそのポリヌクレオチドの分解を阻害する少なくとも一つの修飾を含む；そして
前記細胞に前記組成物を取り込ませることを含む、方法。

【請求項13】

前記細胞がエンドサイトーシスによって組成物を取り込む、請求項１２の方法。

【請求項14】

前記異種ポリヌクレオチドが治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡをコードする、請求項１２又は１３の方法。

【請求項15】

前記細胞が心臓細胞、筋細胞、線維芽細胞又は腎臓細胞を含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏ条件である、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記異種ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記カプセル化剤が金属ナノ粒子を含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記金属ナノ粒子が、少なくともポリヌクレオチドを部分的に取り囲む複数の金属サブユニットを含む、請求項１８の方法。

【請求項20】

前記金属ナノ粒子がコア構造を形成する複数の金属サブユニットを含む、請求項１８の方法。

【請求項21】

前記複数のナノ粒子が：前記金属ナノ粒子；及び第二の材料を含む少なくとも一つのナノ粒子を含む、請求項１９又は２０の方法。

【請求項22】

前記金属ナノ粒子が表面修飾を含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記表面修飾が生体適合性ポリマーを含む、請求項２２の方法。

【請求項24】

前記生体適合性ポリマーが正味の正電荷を含む、請求項２３の方法。

【請求項25】

前記生体適合性ポリマーがキトサンを含む、請求項２４の方法。

【請求項26】

細胞内へ治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡを導入する方法であって、
前記細胞と、
カプセル化剤及び
当該カプセル化剤によってカプセル化した異種ポリヌクレオチド、を含む医薬組成物とを接触すること、ここで、当該異種ポリヌクレオチドは前記細胞のサイトゾル内にある場合にその異種ポリヌクレオチドの分解を阻害する少なくとも一つの修飾を含み；当該異種ポリヌクレオチドは前記治療的なポリペプチド又は前記治療的なＲＮＡをコードする；
前記細胞に前記組成物を取り込ませること、そして
前記細胞に前記異種ポリヌクレオチドによってコードされた前記治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡを発現させることを含む方法。

【請求項27】

前記細胞がエンドサイトーシスによって組成物を取り込む、請求項２６の方法。

【請求項28】

前記異種ポリヌクレオチドが治療的なポリペプチドをコードする、請求項２６又は２７の方法。

【請求項29】

前記細胞が心臓細胞、筋細胞、線維芽細胞、又は腎細胞を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏ条件である請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記異種ポリヌクレオチドがｍＲＮＡを含む、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記カプセル化剤が金属ナノ粒子を含む、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記金属ナノ粒子が少なくとも部分的にポリヌクレオチドを取り囲む複数の金属サブユニットを含む、請求項３２の方法。

【請求項34】

前記金属ナノ粒子がコア構造を形成する複数の金属サブユニットを含む、請求項３２の方法。

【請求項35】

前記複数のナノ粒子が前記金属ナノ粒子；及び第二の材料を含む少なくとも一つのナノ粒子を含む、請求項３３又は３４の方法。

【請求項36】

前記金属ナノ粒子が表面修飾を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記表面修飾が生体適合性ポリマーを含む、請求項３６の方法。

【請求項38】

前記生体適合性ポリマーが正味の正電荷を含む、請求項３７の方法。

【請求項39】

前記生体適合性ポリマーがキトサンを含む、請求項３８の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は２０１８年５月２３日に出願された米国特許出願６２／６７５，２０６の利益を請求し、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

【発明の概要】

【0002】

本開示は前記細胞が異種ポリヌクレオチドの転写産物を発現しうるために異種ポリヌクレオチドを細胞内に導入することについてのプラットフォーム及び方法を記載する。

【0003】

それゆえ、一の側面において、本開示は一般的にカプセル化剤及びカプセル化剤によってカプセル化したポリヌクレオチドを含む組成物を記載する。そのポリヌクレオチドは細胞のサイトゾルにおいてポリヌクレオチドの切断を阻害する少なくとも一つの修飾を含む。様々な態様において、そのポリヌクレオチドは少なくとも一つの治療的なポリペプチド又は少なくとも一つの治療的なＲＮＡをコードする。

【0004】

ある態様において、そのカプセル化剤は金属ナノ粒子を含みうる。あるこれらの態様において、その金属ナノ粒子は複数の金属サブユニットを含みうる。あるこれらの態様において、その金属サブユニットはポリヌクレオチドを少なくとも部分的に取り巻き；他の態様において、その金属サブユニットはコア構造を形成する。

【0005】

ある態様において、そのポリヌクレオチドはｍＲＮＡでありうる。

【0006】

別の側面において、本開示は細胞内に異種ポリヌクレオチドを導入する方法を記載する。一般的に、その方法は細胞と医薬組成物とを接触させること及び細胞に医薬組成物を取り込ませることを含む。本医薬組成物は一般的にカプセル化剤及びカプセル化剤によりカプセル化した異種ポリヌクレオチドを含む。その異種ポリヌクレオチドは細胞のサイトゾルにおいてポリヌクレオチドの切断を阻害する少なくとも一つの修飾を含む。

【0007】

ある態様において、そのカプセル剤は金属ナノ粒子を含みうる。あるこれらの態様において、その金属ナノ粒子は複数の金属サブユニットを含みうる。あるこれらの態様において、その金属サブユニットはポリヌクレオチドを少なくとも部分的に取り巻き；他の態様において、その金属サブユニットはコア構造を形成する。

【0008】

ある態様において、その異種ポリヌクレオチドは少なくとも一つの治療的なポリペプチド又は少なくとも一つの治療的なＲＮＡをコードする。

【0009】

ある態様において、その異種ポリヌクレオチドはｍＲＮＡでありうる。

【0010】

ある態様において、その細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。

【0011】

別の側面において、本開示は細胞内への治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡを導入する方法を記載する。一般的に、その方法は細胞と医薬組成物とを接触させること、細胞に医薬組成物を取り込ませること、及び細胞に治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡを発現させることを含む。その治療組成物は一般的にカプセル化剤及びカプセル化剤によってカプセル化した異種ポリペプチドを含む。その異種ポリペプチドは異種ポリヌクレオチドが細胞のサイトゾル内にある場合に異種ポリペプチドの切断を阻害する少なくとも一つの修飾を含む。その異種ポリペプチドは治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡをコードする。

【0012】

ある態様において、そのカプセル化剤は金属ナノ粒子を含みうる。あるこれらの態様において、その金属ナノ粒子は複数の金属サブユニットを含みうる。あるこれらの態様において、その金属サブユニットは少なくとも部分的にポリヌクレオチドを取り巻き；他の態様において、その金属サブユニットはコア構造を形成する。

【0013】

ある態様において、その細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。

【0014】

ある態様において、その異種ポリペプチドはｍＲＮＡである。

【0015】

上記の要約はそれぞれの開示された態様又は本発明のいかなる実施を記載することを意図されない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示する。本出願を通じるいくつかの場所において、案内は例示のリストを通じて提供され、その例は様々な組み合わせにおいて使用されうる。各例において、引用されたリストは代表的な群としてのみ寄与し、除外リストとして解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0016】

本特許又は出願申請書は色において除外された少なくとも一つの描写を含む。色の描写を有する本特許出願又は特許出願公開公報のコピーは要求及び必要な賃金の支払いによって省庁によって提供される。

【0017】

【図1】ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｓ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦｓ）、及びヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現。（Ａ）ＨＣＦｓ及びＨＥＫ細胞からの代表的なｍＣｈｅｒｒｙ発現。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）測定期間での蛍光強度の定量的な変化。２４から７２時間の間で、ｍＣｈｅｒｒｙ発現に関連した強度レベルは、ベースラインの２倍より大きかった。（Ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡトランスフェクション後のＨＣＦｓ及びＨＥＫ細胞の代表的なフローサイトメトリーのプロット（Ｄ）４時間及び２４時間での分類されたＨＤＦｓ、ＨＣＦｓ、及びＨＥＫ細胞のトランスフェクション効率の割合。

【0018】

【図2】心筋細胞内のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現（Ａ）初代心筋細胞内の迅速及び持続したタンパク質発現。スケールバー＝１００μｍ。（Ｂ）２４時間での最大発現量を現した蛍光強度の定量化、続く６日間線形において減少する。（Ｃ）ｘ軸上の蛍光強度及びｙ軸上の側方の散乱強度の散布図は、トランスフェクション後のつじつまの合った二峰性の群を現し、この推移は、４時間及び２４時間で見られる核酸を導入した細胞の数を明らかにする。トランスフェクション効率を定量化し、そしてｍｏｃｋトランスフェクション細胞と比較した。４時間及び２４時間のトランスフェクション効率の分析ではフローサイトメトリーを用いて４時間（〜２０％）と２４時間（４３％）の時点との両方で著しいトランスフェクション効率を示した。（Ｄ）ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦＬｕｃ画像は同じ細胞株において全ての三つのタンパク質の産生を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｅ）同一の細胞の組み合わせにおけるＥＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙタンパク質産生との比較；マージした図はこの発現の同時発生を再度示す。

【0019】

【図3】抗トロポニン抗体、抗ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって、又はＳｉＲ−Ａｃｔｉｎ染色に従って染色した心筋細胞の蛍光画像。

【0020】

【図4】トランスフェクションした初代心筋細胞のカルシウムイメージング。（Ａ）Ｍ³ＲＮＡによってトランスフェクションした初代心筋細胞のＣＡＬ−５２０ Ａｍ及びｍＣｈｅｒｒｙ染色。（Ｂ）収縮期の律動的及び協調的な［Ｃａ²⁺］_iトランジェントと同時に起こる急速な［Ｃａ²⁺］_iバースト、心臓拡張期のその非存在。（Ｃ）Ｃａ²⁺トランジェントの期間（Ｘ軸）に対する細胞内の蛍光強度（Ｙ軸）のプロット。

【0021】

【図5】トランスフェクションした初代心筋細胞の電気的機能。（Ａ）蛍光顕微鏡を用いて同定したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡトランスフェクションした細胞。（Ｂ）電位依存的な特性において異なる二つの典型的な内向き電流の構成要素が誘導される−９０から＋４０ｍＶのランプ波。（Ｃ）〜５０ｍＶでピーク値を有する構成要素は典型的に電圧依存性Ｎａ⁺チャネルの選択的阻害薬のテトロドトキシン（ＴＸＸ、５μＭ）に感受性があった。〜０ｍＶの膜電位のピーク値での構成要素は電圧依存性のＬ型Ｃａ²⁺チャネル阻害薬（Ｉ_Ca）であるニフェジピン（２０μＭ）に感受性があった。

【0022】

【図6】Ｍ³ＲＮＡ構造及び細胞による取り込みの概要図。（Ａ）鉄ナノ粒子を用いた例示的実施形態。鉄ナノ粒子を正に荷電したポリマーによってコートする。正に荷電したナノ粒子はカプセル化され、そして負電荷ｍＲＮＡと相互作用しＭ³ＲＮＡを形成する。（Ｂ）Ｍ³ＲＮＡはエンドサイトーシスにより細胞に入り、そのｍＲＮＡは放出され、そして翻訳される。

【0023】

【図7】Ｍ³ＲＮＡ発現の生物発光及び免疫蛍光の研究。（Ａ）心臓内のＭ³ＲＮＡの心臓標的した発現の生物発光画像。（Ｂ）（Ａ）に示す生物発光の定量化。（Ｃ）ビヒクルコントロール（中央パネル）と比較したｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを注射した心臓組織内のｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現、及び緑色のチャネル内の抗−ｍＣｈｅｒｒｙ抗体によって確認したｍＣｈｅｒｒｙ発現（左パネル）。トロポニン抗体は心筋細胞内のｍＣｈｅｒｒｙ発現を明らかにした。（Ｄ）単一、複数のＭ³ＲＮＡ種の心外膜注射におけるＧＦＰ−Ｍ³ＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡ、及びＦＬｕｃ−Ｍ³ＲＮＡの発現。発現の無いシェム（上段パネル）に対してＭ³ＲＮＡ注射したラットにおいて重複した（抗−ＦＬｕｃ抗体を用いる）ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬｕｃタンパク質発現（図７Ｄ）。

【0024】

【図8】アルギン酸カルシウム溶液内にカプセル化したｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを急性の心筋梗塞のブタのモデルにおいて損傷した組織へＭ３ＲＮＡの標的した送達を提供する。（Ａ）オーバーザワイヤーバルーンを留置する遠位開口部を用いて〜２５０μｇのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡの冠内の大量投与を左前下行枝（ＬＡＤ）内に注入した。（Ｂ）冠内の送達に続き、アルギン酸を冠内の心エコー検査（ＩＣＥ）によって監視するように急性の損傷部位内の選択ゲルを可視化した。（Ｃ）心臓を７２時間で収集し、冷却した通常の生理食塩水によって洗浄し、スライスし、スライスした切片をｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いてＸｅｎｏｇｅｎ上で画像化し、梗塞領域に局在化したｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を示した。（Ｄ）非梗塞領域に対する梗塞領域からの１−ｃｍのスライスの免疫組織化学染色はより高いｍＣｈｅｒｒｙ染色を特徴づけた。

【0025】

【図9】Ｍ³ＲＮＡプラットフォームにおけるｍＲＮＡへの例示的な修飾。（Ａ）修飾したヌクレオチドのプソイドウリジン及び５−メチルシチジンの化学構造。（Ｂ）アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）、修飾したヌクレオチドのプソイドウリジン及び５−メチルシチジン、及びポリアデニル化（ポリＡ）尾部の組み込みを示す、ｍＲＮＡへの修飾の体系的な図。

【0026】

【図10】Ｉｎ ｖｉｖｏのＦＬｕｃ ｍＲＮＡ発現。（Ａ）ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎのみの注射を尾部に受けるコントロールのマウスにおいて発現は見られなかった。（Ｂ）ＦＬｕｃ発現がＦＬｕｃ Ｍ²ＲＮＡの尾部の静脈注射の２時間以内に見られた。この発現は主に肝臓内で非常に一過的であり、２４時間後に検出できない。（Ｃ）無効な皮下注射を受けるコントロールのマウスにおいて発現は見られなかった。（Ｄ）ＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡの皮下送達は（水力学に対して）２時間以内に１０倍のタンパク質発現をもたらし、７２時間持続した。（Ｅ）尾部の静脈注射によるＦＬｕｃ Ｍ²ＲＮＡ発現の経時変化。（Ｆ）皮下注射によるＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡ発現の経時変化。

【0027】

【図11】皮下注射後２４時間のｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡ。

【0028】

【図12】ＦＬｕｃの発現が投与後の異なる組織で見られた。（Ａ）２４時間での筋肉中のルシフェラーゼ発現。（Ｂ）５時間での腎臓内のルシフェラーゼ発現。（Ｃ）４時間での肝臓内のルシフェラーゼ発現。（Ｄ）２４時間での眼内のルシフェラーゼ発現。眼球内注射について、左眼をコントロールとして用いた。

【0029】

【図13】ＩＶＩＳ画像からのルシフェラーゼ発光の定量化。（Ａ）冠内のルシフェラーゼ発現の図。（Ｂ）ルシフェラーゼの発現が２４時間でのピークに達し、その後下がる発現レベルを有する送達後の複数日の間持続される。

【0030】

【図14】ＩＶＩＳ画像からのルシフェラーゼ発光の定量化。心臓内のルシフェラーゼ発現の開胸図。

【0031】

【図15】ｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いるＸｅｎｏｇｅｎ上のスライスした心臓切片のイメージング。（Ａ）ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現は１．５％のアルギン酸濃度を用いた場合に、梗塞領域に局在化した。（Ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙの発現は０．５％のアルギン酸濃度を有するｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ⁴ＲＮＡの同じ用量を受けた心臓の梗塞組織の試料においてかろうじて検出可能である。

【0032】

【図16】ＰＥＧによってコートした微粒子を有するＭ²ＲＮＡ及びキトサンの組み合わせは骨格筋中の遺伝子送達に最適化した推測上のＭ³ＲＮＡ−Ｉｇプラットフォームをもたらす。

【0033】

【図17】ｍＲＮＡの分解速度を減少する３’の戦略は三つの推定上のプラットフォームに焦点を当てる。シュードノットはＵＰＦ１分子のリボソーム上の読みとばし中断することを仲介する。ＲＮＡ安定性因子はデコイとして働き、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）の活性化を避けるＵＰＦ１と３’ＵＴＲとの接触を阻害する。ポリ（Ａ）尾部のステムループ構造を用いてＣＡＰ／ＰＡＢＰ依存ＩＲＥＳプラットフォームが使用される場合に構成物におけるエクソソーム仲介ｍＲＮＡ分解を減少する。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本開示は、本明細書でＭ³ＲＮＡを意味する修飾したポリヌクレオチドをマイクロカプセル化することを含む遺伝子送達システムを用いるｉｎ ｖｉｖｏにおいて異種タンパク質の発現を成し遂げるための組成物及び方法を記載する。そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは定義した計画対象期間に標的化した組織内のＭ³ＲＮＡによってコードされる異種タンパク質の発現を迅速に誘導しうる。

【0035】

本明細書に記載したＭ³ＲＮＡプラットフォームはウイルスに基づいた又はあるＤＮＡに基づいた治療を使用することに直面する課題を克服する。ＲＮＡに基づいた態様はＤＮＡに基づいた治療よりもコード化したタンパク質のより速い翻訳を提供し、そして標的細胞の核内に移動する必要性がない。そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは標的化した細胞集団及び／又は組織内でタンパク質発現を誘導することを必要とする送達及び機能効率を提供することによって慣習のＲＮＡに基づく治療に関する課題を克服する。そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは、Ｍ³ＲＮＡのナノ粒子に対する免疫応答を誘発しないので、ウイルスに基づく治療に関連する課題を克服する。

【0036】

修飾されたＲＮＡ（Ｍ³ＲＮＡ）のマイクロカプセル化

【0037】

Ｍ³ＲＮＡは幅広い組織の配列内にコードした遺伝子の迅速な発現を誘導することによる独特なプラットフォームである。Ｍ³ＲＮＡプラットフォームの背景において、Ｍ³ＲＮＡは修飾したマイクロカプセル化したポリヌクレオチドを意味し；ありのままの修飾されたポリヌクレオチド（未カプセル化）はＭ²ＲＮＡとして称される；Ｍ⁴ＲＮＡは、以下により詳細に記載されるように、マクロカプセル化した（例えばアルギン酸によってカプセル化した）ポリヌクレオチドを意味する。そのＭ³ＲＮＡの命名は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ（すなわち、マイクロカプセル化した修飾したｍＲＮＡ）であることにおける本明細書で記載される例示的実施形態から由来し、Ｍ³ＲＮＡのポリヌクレオチドは例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、環状ＲＮＡ、又はＤＮＡを含む任意の機能的なポリヌクレオチドでありうる。そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは時間枠内で迅速に調整し、同時に多数の遺伝子構成物を送達する能力を提供する。さらに、ＡＡＶ及び他のウイルス遺伝子送達技術と異なり、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは送達システムへの免疫反応のリスクを避け、異なる構成物によるその反復使用を可能にする。ポリヌクレオチドがＲＮＡである態様は、ＤＮＡに基づく治療と関連するリスクを制限する（例えば、組込み又は変異）。

【0038】

前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームはヒトの組織を含む任意の動物の組織による使用と適合する。さらに、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは「トランスフェクションしにくい」初代細胞表現型、例えば初代心筋細胞にトランスフェクションすることに効果的である。以下により詳細を記載するように、Ｍ³ＲＮＡプラットフォームを用いる初代心筋細胞のトランスフェクションは、構造的な又は機能的な心筋細胞の特徴を変化しない。また、Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは筋肉内の送達に適合し、初代心筋細胞培養によって得られた結果と適合する高いトランスフェクション効率を提供する。一般的に、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは、組織特異的な送達及びＭ³ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に適合し（図１２）、そして幅広い細胞型及び／又は組織にトランスフェクションすることを果たしうる。

【0039】

一般的に、前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、以下により詳細に記載されるように修飾される、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含み、続いてカプセル化剤（例えば、カプセル化剤と関連する場合、ナノ粒子）によってカプセル化された（例えば、ナノ粒子又は脂質）。本明細書で用いられるように前記ポリヌクレオチドは「カプセル化される」。それゆえ、全体又は一部において、ｍＲＮＡは、カプセル化剤によって「カプセル化される」ために、包含されることに不要である。ポリヌクレオチドは、任意の適当な化学的又は物理的な相互作用、それらに限定されないが、水素結合、ジスルフィド結合、イオン結合等によってカプセル化剤（例えば、ナノ粒子又は複数のナノ粒子）と関連しうる。

【0040】

ある態様において、図６に体系的に例示される、ポリヌクレオチドは複数の金属サブユニットを含むナノ粒子によって少なくとも部分的に含まれ、「鉄部分」として図６Ａに図示される例示的実施形態に反映される。しかしながら、鉄に基づく金属サブユニットの使用は、単に例示である。その金属サブユニットは、以下により詳細に記載されるように、任意の適当な金属から形成されうる。そのような態様において、少なくともいくつかのサブユニットは金属サブユニットに結合する正に荷電した部分（例えば、正に荷電したポリマー）を有しうる。ある態様において、その正に荷電した部分は少なくとも部分的にサブユニットを覆いうる。正に荷電した部分の性質及びそれが金属サブユニットに結合することに関わらず、その正に荷電した部分は負に荷電したポリヌクレオチドと相互作用しうる。図６Ａに例示された態様において、複数のポリマーコートしたイオンサブユニットは負に荷電した修飾したｍＲＮＡを取り巻くナノ粒子を形成する。

【0041】

図６Ａに例示されるように、その金属サブユニットは（例えば、図６Ａに正に荷電したポリマーとして例示される）複数の正に荷電した部位を含みうる。複数の正に荷電した部位が金属サブユニットと結合した場合に、金属サブユニットに結合するそれぞれのポリマーは、金属サブユニットと結合する他のポリマーと同じ又は異なりうる。例えば、図６Ａに例示される態様において、二つの正に荷電したポリマーは一つの分子種であり、これは複数の金属サブユニットによって形成されるナノ粒子の内側に整列する。また、異なる正に荷電したポリマーは金属サブユニットに結合し、そしてナノ粒子の内側に整列する。

【0042】

図１６に体系的に例示される、別の例となる態様において、ポリヌクレオチドは図示される例示的実施形態、ナノ粒子の表面に結合するキトサンにおいて、正に荷電した部分と相互作用する。そのポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの大部分の質量が、ナノ粒子の核の表面に結合する正に荷電した部分により定義される外形内にあるので、ナノ粒子によってカプセル化されると考えられる。それゆえ、そのポリヌクレオチドはナノ粒子によって「カプセル化される」と考えられるために、部分的でさえも、ナノ粒子によって包含されない。

【0043】

また、図１６に示される例示的実施形態はナノ粒子が複数の金属サブユニットを含みうることを例示する。図１６に例示されるように、金属サブユニットは図６Ａに例示されるように、殻よりもむしろナノ粒子コアを形成しうる。また、図１６は金属ナノ粒子が金属サブユニットの異種の混合物を含みうることを例示する。そのナノ粒子はそのサブユニットが、図１６に示されるようにコアを、図６Ａに示されるように殻を形成するかどうかに関わらず、金属サブユニットの異種の混合物を含みうる。

【0044】

そのＭ³ＲＮＡプラットフォームはＭ³ＲＮＡの分解を遅くしうるポリヌクレオチドをコードする修飾を含み、及び／又は例えば、ｍＲＮＡトランスフェクションの所望されない副作用を制限しうる。そのような修飾は、例えば、一以上の修飾したヌクレオチド、例えば、ＲＮＡにおけるシトシンの場所に５’−メチルシチジン及び／又はウラシルの場所にプソイドウリジン（ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、若しくはジデオキシウラシルを導入することを含む。ある態様において、少なくとも一つの、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０，１００又はそれ以上のヌクレオチドは修飾される。ある態様において、シトシン及び／又はウラシルの少なくとも１％、例えば少なくとも５％、１０％、２５％、５０％又はそれ以上は修飾される。修飾されるヌクレオチド三リン酸はＧＭＰ上の出発物質として容易に利用可能であり、標準のＲＮＡ合成技術を用いることで迅速に導入され、送達に続き著しい分子的な及び翻訳的な利点を提供する。サイトゾル内のｍＲＮＡの寿命を延ばすための他の戦略は、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構の経路によって干渉することを含む。例示的な適当な戦略は図１７に例示されるそれらを含む。また、ｍＲＮＡへの修飾はアンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡキャップ）又はポリアデニル化した尾部（図９Ｂ）の追加を含みうる。ある態様において、修飾したｍＲＮＡは、任意の組み合わせにおいて、一以上の修飾したヌクレオチド、一以上のシュードノット、一以上のＲＮＡ安定化因子、一以上のステムループ、ＡＲＣＡキャップ、及び／又はポリアデニル化した尾部を含みうる。

【0045】

前記ナノ粒子は任意の適当な材料、例えば、それらに限定されないが、金属の、有機の（例えば脂質に基づいた）、無機の、又は混合材料を含み構成されうる。適当な金属の材料は、例えば、鉄、銀、金、プラチナ、又は銅を含む。ある態様において、カチオンポリマーナノ粒子は修飾されたポリヌクレオチドをマイクロカプセル化するために用いられる。カチオンポリマーはそれらの主鎖に正に荷電した基を有し、負に荷電したｍＲＮＡ分子と相互作用し、中和された、ナノメートルサイズの複合体を形成する。適当なカチオンポリマーは、例えば、ゼラチン（Ｎｉｔｔａ Ｃｏｒｐ，ＪＰ）を含む。適当な非金属性の材料は脂質を含む。ある場合において、脂質に基づくナノ粒子は他の試薬（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））と複合化されうる。

【0046】

ある態様において、そのナノ粒子は鉄のナノ粒子でありうり、又は鉄のサブユニットを含む。他の態様において、そのナノ粒子は脂質を含み又は脂質成分を含む。

【0047】

また、修飾したナノ粒子は制御可能な粒子サイズ及び／又は表面の特徴を有しうる。

【0048】

本明細書に記載されるＭ³ＲＮＡプラットフォームにおいて用いられるナノ粒子は、選択される送達方法に適当な任意のサイズでありうる。Ｍ³ＲＮＡプラットフォームに用いられうる粒子は直径で約５０ｎｍから約１２μｍでありうるが、本明細書で記載される組成物及び方法は、この範囲から外れるサイズのナノ粒子を含みうる。それゆえ、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは少なくとも５０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、又は少なくとも１μｍの最小直径（又は最長寸法）を有するナノ粒子を使用しうる。前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、１２μｍ未満、１１．５μｍ未満、１１μｍ未満、１０．５μｍ未満、１０μｍ未満、７．５μｍ未満、５μｍ未満、２μｍ未満、１μｍ未満又は５００ｎｍ未満の最大直径（又は最長寸法）を有するナノ粒子を使用しうる。前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、上記に記載した任意の最小直径及び最小直径より大きい上記に記載した任意の最大直径によって定義されるエンドポイントを有する範囲内に入る直径（又は最長寸法）を有するナノ粒子を使用しうる。ある例となる態様において、ナノ粒子は直径で（又は最長寸法で測定されるように）約５０ｎｍから約１１．５μｍ、約１００ｎｍから約１１μｍ、約２００ｎｍから約１０．５μｍ、又は約５００ｎｍから約１０μｍの直径を有しうる。例えば、Ｍ³ＲＮＡプラットフォームにおいて用いられうる粒子は直径で（又は最長寸法で測定されるように）約５０ｎｍから約７．５μｍでありうる。

【0049】

ある態様において、その引用された直径の範囲はナノ粒子の群の平均直径である。ある態様において、集団における少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の粒子が引用される直径を有する。

【0050】

ある場合において、その粒子のサイズは標的組織（例えば心筋梗塞床）へ粒子の直接的な送達のために用いられうる。ヒトの毛細血管は直径で約５μｍから約１０μｍである。それゆえ、約０．３μｍから約１２μｍの直径を有する本明細書に記載される粒子は、血流経由で毛細血管に入りうるが、毛細血管から抜け出ることに限定され、ここで生物学的な及び／又は発現されたポリペプチドは組織（例えば、心臓、皮膚、肺、固形がん、脳、骨、靭帯、結合組織構造、腎臓、肝臓、皮下、及び血管組織）の毛細血管床内に拡散しうる。

【0051】

前記ナノ粒子は修飾したポリヌクレオチドとの効果的な相互作用について及び／又は送達効率を改善する表面修飾したものである。ナノ粒子は例えば血中の半減期を増加しうるバイオポリマー又はＰＥＧ化のいずれかを導入するために修飾されうる。特定の態様において、ナノ粒子の表面はキトサンによって修飾されうる。キトサンは陽イオンの高分子電解質の特性を示し、それゆえ負に荷電したＤＮＡ又はＲＮＡ分子との強力な静電相互作用を提供する。さらに、キトサンはＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅ分解に対する保護を提供する、それを生分解可能な、生体適合性のある、及び無毒性のバイオポリマーである第一級アミン基を運搬する。ある態様において、前記キトサンは５．３×１０⁵ダルトンの粘度平均分子量及び／又は約４４％のＣ、約７％のＨ、及び約８％のＮの元素組成を有しうる。

【0052】

別の態様において、ナノ粒子の表面はＰＥＧ化によって修飾されうる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、本ケースにおけるナノ粒子である、与えられる分子に共有結合によって結合する技術は、標的化した薬物送達システムにおいて確立した方法である。ＰＥＧ化はＣＨ₃Ｏ−（ＣＨ₂−ＣＨ₂Ｏ）_n−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＯＨとして示され、式中ｎが１００から５０００である多数のモノメトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）のポリマー化を含む。ＰＥＧ分子を導入することは、その増加した疎水性のためにナノ粒子の半減期を著しく増加し、糸球体濾過量を減らし、及び／又は保護的な疎水性シールドを形成することによる抗原部位のマスキングによって免疫原性を下げる。適当な修飾はナノ粒子の表面を修飾し３０００〜４０００のＰＥＧ分子を有することを含み、これはＤＮＡ又はＲＮＡ分子の物理学的な結合について適当な環境を提供する。

【0053】

Ｍ³ＲＮＡにおけるポリヌクレオチドは、任意の適当な治療的なポリペプチド、任意の適当な抑制性のＲＮＡ、任意の適当なマイクロＲＮＡをコードしうる。ある場合において、Ｍ³ＲＮＡは独立してＭ³ＲＮＡ、治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡ（例えば抑制的なＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）における任意の他のポリヌクレオチドの、それらのそれぞれがコードしうる、多数のポリヌクレオチドを含みうる。

【0054】

前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、任意の適当な細胞型又は任意の適当な組織の細胞へ異種のポリヌクレオチドを送達しうる。その送達標的（すなわち細胞型又は組織）は限定されない。それゆえ、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは異種のポリヌクレオチドを、その標的細胞内の異種のポリヌクレオチドによってコードされる治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡを発現するために、例えば、心臓細胞、腎細胞、肝細胞、骨格筋細胞、眼球細胞等に送達するために用いられうる。

【0055】

ある態様において、Ｍ³ＲＮＡポリヌクレオチドによってコードされる治療的なポリペプチド又は治療的なＲＮＡは心臓機能及び／又は心臓組織を再生することを促進しうる。

【0056】

心臓機能及び／又は組織を再生することに有用でありうるポリペプチドの例は、限定されないが、ＴＮＦ−α、ミトコンドリア複合体−１、レゾルビン−Ｄ１、ＮＡＰ−２、ＴＧＦ−α、ＥｒＢｂ３、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＩＬ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ８０／８６、ＷＯ２０１５／０３４８９７に記載されるポリペプチド、又は任意の前述のポリペプチドに対して向けられた抗体を含む。例えば、ヒトＮａｐ−２ポリペプチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２６９５．１（ＧＩ Ｎｏ．５４７３）において説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２７０４（ＧＩ Ｎｏ．５４７３）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＴＧＦ−α ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００３２２７．１（ＧＩ Ｎｏ．７０３９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３２３６（ＧＩ Ｎｏ．７０３９）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＥｒＢｂ３ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１００５９１５．１又はＮＰ＿００１９７３．２（ＧＩ Ｎｏ．２０６５）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１００５９１５．１又はＮＭ＿００１９８２．３（ＧＩ Ｎｏ．２０６５）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＶＥＧＦはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＡＡＡ３５７８９．１（ＧＩ：１８１９７１）、ＣＡＡ４４４４７．１（ＧＩ：３７６５９）、ＡＡＡ３６８０４．１（ＧＩ：３４０２１５）、又はＡＡＫ９５８４７．１（ＧＩ：１５４２２１０９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００１５５３．１（ＧＩ Ｎｏ．３４０２１４）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＩＧＦ−１は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＡＡ０１９５４．１（ＧＩ：１２４７５１９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．２９１１７．１（ＧＩ：１２４７５１８）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＦＧＦ−２は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１９９７．５（ＧＩ：１５３２８５４６１）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２００６．４（ＧＩ：１５３２８５４６０）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＰＤＧＦは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ６０５５２．１（ＧＩ：３３８２０９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００２９８６．１（ＧＩ：３３８２０８）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＩＬ−２は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ４６８８３．１（ＧＩ：１８３６１１１）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｓ７７８３４．１（ＧＩ：９９９０００）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＣＤ１９は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ６９９６６．１（ＧＩ：９０１８２３）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．８４３７１．１（ＧＩ：９０１８２２）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＣＤ２０は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＢＧ７６６９５．１（ＧＩ：２８５３１０１５７）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＨ００３３５３．１（ＧＩ：１１９９８５７）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、ヒトＣＤ８０は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００５１８２．１（ＧＩ：４８８５１２３）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５１９１．３（ＧＩ：１１３７２２１２２）に説明されている核酸配列によりコードされうり、そしてヒトＣＤ８６は、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＢ０３８１４．１（ＧＩ：４３９８３９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＣＲ５４１８４４．１（ＧＩ：４９４５６６４２）に説明されている核酸配列によりコードされうる。例えば、心臓機能及び／又は組織を再生することに有用でありうるポリペプチドは、ＴＮＦ−α、ミトコンドリア複合体−１、又はレゾルビン−Ｄ１に対して向けられた抗体でありうる。ある場合において、Ｍ³ＲＮＡはＮＡＰ−２及び／又はＴＧＦ−αをコードしうる。

【0057】

ある場合において、Ｍ³ＲＮＡは、例えば、主要な心臓有害事象（例えば急性心筋梗塞）を経験する哺乳類及び／又は主要な心臓有害事象を経験するリスクのある哺乳類（例えばＳＴＥＭＩについてＰＣＩを被った患者）を治療することに有用な一以上の抑制性のＲＮＡｓをコードしうる。例えば、Ｍ³ＲＮＡは、一以上の次のポリペプチドの発現を阻害する及び／又は減少する抑制的なＲＮＡをコードしうる：エオタキシン−３、カテプシン−Ｓ、ＤＫ−１、ホリスタチン、ＳＴ−２、ＧＲＯ−α、ＩＬ−２１、ＮＯＶ、トランスフェリン、ＴＩＭＰ−２、ＴＮＦαＲＩ、ＴＮＦαＲＩＩ、アンギオスタチン、ＣＣＬ２５、ＡＮＧＰＴＬ４、ＭＭＰ−３、及びＷＯ２０１５／０３４８９７に記載されるポリペプチド。例えば、ヒトエオタキシン−３ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００６０６３．１（ＧＩ Ｎｏ．１０３３４）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６０７２（ＧＩ Ｎｏ．１０３４４）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトカテプシン−ＳはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００４０７０．３（ＧＩ Ｎｏ．１５２０）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４０７９．４（ＧＩ Ｎｏ．１５２０）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＤＫ−１はＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３６３７４．１（ＧＩ Ｎｏ．２２９４３）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１２２４２（ＧＩ Ｎｏ．２２９４３）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトホリスタチンは続いて、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３７５４１．１（ＧＩ Ｎｏ．１０４６８）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０１３４０９．２（ＧＩ Ｎｏ．１０４６８）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＳＴ−２はＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＡＡ０２２３３（ＧＩ Ｎｏ．６７６１）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ Ｄ１２７６３．１（ＧＩ Ｎｏ．６７６１）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＧＲＯ−αポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１５０２．１（ＧＩ Ｎｏ．２９１９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１５１１（ＧＩ Ｎｏ．２９１９）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＩＬ−２１はＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０６８５７５．１（ＧＩ Ｎｏ．５９０６７）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２１８０３（ＧＩ Ｎｏ．５９０６７）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＮＯＶポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２５０５．１（ＧＩ Ｎｏ．４８５６）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２５１４（ＧＩ Ｎｏ．４８５６）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトトランスフェリンポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０５４．１（ＧＩ Ｎｏ．７０１８）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６３．３（ＧＩ Ｎｏ．７０１８）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３２４６．１（ＧＩ Ｎｏ．７０７７）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００３２５５．４（ＧＩ Ｎｏ．７０７７）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＴＮＦαＲＩポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０５６．１（ＧＩ Ｎｏ．７１３２）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６５（ＧＩ Ｎｏ．７１３２）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＴＮＦαＲＩＩポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０５７．１（ＧＩ Ｎｏ．７１３３）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０６６（ＧＩ Ｎｏ．７１３３）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトアンギオスタチンポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００２９２（ＧＩ Ｎｏ．５３４０）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００３０１（ＧＩ Ｎｏ．５３４０）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＣＣＬ２５ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿５６１５．２（ＧＩ Ｎｏ．６３７０）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５６２４（ＧＩ Ｎｏ．６３７０）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０３４７５６．１又はＮＰ＿６４７４７５．１（ＧＩ Ｎｏ．５１１２９）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１０３９６６７．１又はＮＭ＿１３９３１４．１（ＧＩ Ｎｏ．５１１２９）に説明されている核酸配列によりコードされうる。ある場合において、ヒトＭＭＰ−３ポリペプチドはＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００２４１３．１（ＧＩ Ｎｏ．４３１４）に説明されているアミノ酸配列を有しうり、そしてＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２４２２（ＧＩ Ｎｏ．４３１４）に説明されている核酸配列によりコードされうる。

【0058】

ある場合において、Ｍ³ＲＮＡは心臓再生能力に含まれるマイクロＲＮＡを調節する（例えば擬態する又は阻害する）一以上のヌクレオチドをコードしうる。例えば、Ｍ³ＲＮＡは心臓再生能力を増加させるｍｉＲＮＡを擬態するａｇｏｍｉＲをコードしうる。例えば、Ｍ³ＲＮＡは心臓再生能力を増加させるｍｉＲＮＡを阻害するａｎｔａｇｏｍｉＲｓをコードしうる。心臓再生能力に含まれるｍｉＲＮＡの例は、これらに限定されないが、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−７０８、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６８２−３ｐ、ｍｉＲ−２６８２、ｍｉＲ−４４４３、ｍｉＲ−４４４３、ｍｉＲ−４５２１、ｍｉＲ−４５２１、ｍｉＲ−２６８２−５ｐ、ｍｉＲ−２６８２、ｍｉＲ−１３７．ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−５４９．ｍｉＲ−５４９、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−２２４−５ｐ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−３９２８、ｍｉＲ−３９２８、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２４、ｍｉＲ−５４８ｈ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｈ−１、ｍｉＲ−５４８ｈ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｈ−２、ｍｉＲ−５４８ｈ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｈ−３、ｍｉＲ−５４８ｈ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｈ−４、ｍｉＲ−５４８ｈ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｈ−５、ｍｉＲ−４７２５−３ｐ、ｍｉＲ−４７２５、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−４３２−５ｐ、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−１、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３９４０−３ｐ、ｍｉＲ−３９４０、ｍｉＲ−３１２９−３ｐ、ｍｉＲ−３１２９、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−９４０、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−４８４、ｍｉＲ−１９３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−６５１、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−５７６−５ｐ、ｍｉＲ−５７６、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１３０６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０６、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１３８−１、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３３７、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−３７６ｃ．ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３６、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１２７３ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−１２７３ｇ、ｍｉＲ３４ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−４８５、ｍｉＲ−３７０．ｍｉＲ−３７０、ｌｅｔ−７ｆ−１−３ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−１、ｍｉＲ−３６７９−５ｐ、ｍｉＲ−３６７９、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−５８５．ｍｉＲ−５８５、ｍｉＲ−３９３４、ｍｉＲ−３９３４、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１３８−２、ｍｉＲ−７６９−３ｐ、ｍｉＲ−７６９、ｍｉＲ−１３０６−３ｐ、ｍｉＲ−１３０６、ｍｉＲ−６２５−３ｐ、ｍｉＲ−６２５、ｍｉＲ−１９３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ、ｍｉＲ−６６４−５ｐ、ｍｉＲ−６６４、ｍｉＲ−５０９６．ｍｉＲ−５０９６、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−１、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ、ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１２８７．ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−３６５３、ｍｉＲ−３６５３、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−３９０９．ｍｉＲ−３９０９、ｍｉＲ−１２９４、ｍｉＲ−１２９４、ｍｉＲ−１２７８、ｍｉＲ−１２７８、ｍｉＲ−６２９−３ｐ、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１２８−２、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−６７１−５ｐ、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−３７８−５ｐ、ｍｉＲ−３７８ａ、ｍｉＲ−１２５５ａ、ｍｉＲ−１２５５ａ、ｍｉＲ−４９１−５ｐ、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−５９０−３ｐ、ｍｉＲ−５９０、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２、ｍｉＲ−１２８．ｍｉＲ−１２８−１、ｍｉＲ−３６５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３６５ｂ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１５１ｂ．ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−６５４−５ｐ、ｍｉＲ−６５４、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−１、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−２、ｍｉＲ−１４９−５、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−４７９２．ｍｉＲ−４７９２、ｍｉＲ−１．ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−５７４−５ｐ、ｍｉＲ−５７４、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−３２６．ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−３１７３−５ｐ、ｍｉＲ−３１７３、ｍｉＲ−４５０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０ａ−１、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−４５０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５０ａ−２、ｍｉＲ−１２９１、ｍｉＲ−１２９１、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−７−２、及びｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７を含む。

【0059】

前記Ｍ³ＲＮＡは医薬的に許容可能な担体によって製剤化されうる。本明細書で使用されるように、「担体」は任意の溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗細菌剤及び／又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。医薬活性物質についてのそのような媒体及び／又は薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の慣習の媒体又は薬剤が有効成分に不適合でない限り、治療組成物におけるその使用が考えられる。また、追加の有効成分は組成物内に組み込まれうる。本明細書で用いられるように、「医薬的に許容可能な」は生物学的でない又は他の所望されない材料、すなわち、その材料が任意の所望されない生物学的な効果をもたらすこと又はそれが含まれる医薬組成物の任意の他の成分による有害な方法において相互作用することなく、Ｍ³ＲＮＡと共に個体に投与されうることを意味する。

【0060】

それゆえそのＭ³ＲＮＡは医薬組成物に製剤化されうる。その医薬組成物は好ましい投与経路に適合した様々な形態において製剤化されうる。それゆえ、組成物は既知の経路、例えば経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）、又は局所（例えば、経鼻、肺内、乳房内、経腟、子宮内、皮内、経皮、直腸等）を介して投与されうる。医薬組成物は（例えば噴霧又はエアロゾルによって）例えば鼻又は呼吸粘膜への投与によって粘膜面に投与されうる。また、組成物は持続される又は遅延する放出を介して投与されうる。ある態様において、Ｍ³ＲＮＡは心臓組織、例えば心臓内注射、冠動脈内への送達、冠状動脈洞への送達、又はテベシウス静脈循環への送達に直接的に投与されうる。

【0061】

それゆえ、前記Ｍ³ＲＮＡは任意の適当な形態、これらに限定されないが、溶液、懸濁液、乳剤、噴霧剤、エアロゾル、又は任意の混合形態において供給されうる。その組成物は任意の医薬的に許容可能な賦形剤、担体又はビヒクルによって製剤化され、送達されうる。例えば、その製剤は慣習の局所投与形態、例えばクリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾル噴霧剤、ゲル、ローション等において送達されうる。その製剤はさらに一以上の添加剤、例えばアジュバント、皮膚浸透促進剤、着色剤、香料、調味料、保湿剤、増粘剤等を含みうる。

【0062】

製剤は単位剤形において都合よく提示されてもよく、薬学の技術分野で周知の方法によって調製されうる。医薬的に許容可能な担体によって組成物を調製する方法は一以上の補助的な成分を構成する担体に関連してＭ³ＲＮＡをもたらす工程を含む。一般的に、製剤は均一に調製されうり、及び／又は液体の担体、細粉固形の担体、又は両方に関連して有効成分を密接にもたしうり、そして続いて必要であれば、所望される製剤へ製品を成形しうる。

【0063】

投与されるＭ³ＲＮＡの量は様々な因子、それらに限定されないが、対象の重量、健康状態、及び／若しくは年齢、Ｍ³ＲＮＡが送達される標的細胞若しくは組織並びに／又は投与経路を含む様々な因子に依存して変化しうる。それゆえ、与えられた単位剤形に含まれるＭ³ＲＮＡの絶対量は広く変化しうり、そして対象の種類、年齢、体重及び健康状態、及び／又は投与方法のような因子に依存する。従って、一般的に全てのありうる適用について効果的なＭ³ＲＮＡの量を構成する量を述べることは実用的ではない。しかしながら、当業者はそのような因子の考慮によって容易に適当な量を決定しうる。

【0064】

ある態様において、その方法は例えば約１００ｎｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの投与量を対象に提供する十分なＭ³ＲＮＡを投与することを含みうるが、ある態様においてその方法はこの範囲を外れる用量においてＭ³ＲＮＡを投与することによって実施されうる。これらの態様において、その方法は約１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでの用量、例えば約１００μｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇまでの用量を提供する十分なＭ³ＲＮＡを投与することを含む。

【0065】

ある態様において、Ｍ³ＲＮＡは例えば、一日又は一週間あたり単回投与から複数回投与で投与されうるが、ある態様において、その方法はこの範囲を外れる頻度でＭ³ＲＮＡを投与することによって実施されうる。ある期間内に複数回投与が用いられる場合に、それぞれの用量は同じ又は異なりうる。例えば、一日あたり１ｍｇの用量で、１ｍｇの単回投与、０．５ｍｇの２回投与、又は０．７５ｍｇの第一の投与に続き０．２５ｍｇの第二の投与として投与されうる。また、ある期間中に複数回投与が用いられる場合に、その投与間隔は同じ又は異なりうる。

【0066】

ある態様において、Ｍ³ＲＮＡは一カ月あたり約１回から１週間あたり約５回まで投与されうる。

【0067】

多数の細胞株におけるＭ³ＲＮＡのトランスフェクション

【0068】

蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするｍＲＮＡを含む例示的なモデルのＭ³ＲＮＡは、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、及びヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３）細胞内にトランスフェクションした。蛍光タンパク質の発現を５％のＣＯ₂を有する３７℃チャンバー内でライブイメージングした。早ければ２時間でｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を検出し、４時間で再現性良く定量化できた。ＨＣＦ及びＨＥＫ２９３細胞の蛍光画像（図１Ａ）は迅速なｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を示し、６日間持続した。ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰをコードするＭ³ＲＮＡｓの同時送達は共発現においてもたらされた（図２Ｅ）。三つの異なる細胞株内の蛍光強度の定量化（＞１０視野の細胞数／期間／細胞株）は、最初の２４〜４８時間にわたって強度の増加を認め、少なくともＨＥＫ細胞においては不変のままであった（図１Ｂ）。２４時間でタンパク質発現が最大になったので、トランスフェクション効率をフローサイトメトリーを用いて４時間及び２４時間で測定した。ｘ軸上の蛍光強度及びｙ軸上の側方散乱光の散布図は４時間及び２４時間で見られたトランスフェクションした細胞の数を明らかにする推移を有するトランスフェクションに続く一貫した二峰性の群を現した（図１Ｃ）。トランスフェクション効率を定量化し、そしてＭｏｃｋトランスフェクション細胞と比較した（図１Ｄ）。特にＨＥＫ群において、２４時間の時点で高いトランスフェクション効率を認めた。

【0069】

新生仔ラットの初代心筋細胞のＭ³ＲＮＡトランスフェクション

【0070】

続いて、前記Ｍ³ＲＮＡプラットフォームを用いてトランスフェクションしづらい初代心筋細胞にトランスフェクションした。同期した拍動パターンの参照文献に従い、心筋細胞豊富な培養物にｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡによってトランスフェクションした。４時間から最大で６日間で蛍光画像を取得した。代表的な画像は初代心筋細胞内で迅速及び持続化したタンパク質発現を示した（図２Ａ）。蛍光強度の定量化は２４時間での最大発現量を明らかにし、そして蛍光は６日間検出可能なままであった（図２Ｂ）。著しいトランスフェクション効率が二つの独立した試験からフローサイトメトリーを用いて４時間（〜２０％）及び２４時間（４３％）で見られた（図２Ｃ）。複数の遺伝子トランスフェクションは同じ心筋細胞内で３つのタンパク質（ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びホタルルシフェラーゼ）の同時発現を示した（図２Ｄ）。

【0071】

トランスフェクションは心筋細胞の構造及び機能を変化しない。

【0072】

初代心筋細胞のトランスフェクションがそれらの構造強度を変化することを分析するために、心筋細胞をｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡによってトランスフェクションし、そして心臓特異的なトロポニン抗体及びＳｉＲ−アクチン染色によって染色した。アクチン染色を用いて線維芽細胞から心筋細胞を区別した。トランスフェクションした細胞とトランスフェクションしていない細胞の間において、心筋細胞特異的なトロポニン染色では有意差は確認されず、心筋細胞の完全なままの構造強度を示している。

【0073】

トランスフェクションがトランスフェクションした細胞の主要な電気的性質を変化するかどうかを特定するために、初代心筋細胞の二つの本質的な機能の因子を比較した：１）カルシウムチャネルトランジェント及び２）電圧−電流の関係性。初代心筋細胞からの［Ｃａ²⁺］_i（細胞内カルシウム）トランジェントを遊離した細胞内のＣａ²⁺に結合する色素であるＣＡＬ−５２０ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａ）を用いて記録した。拍動パターンの基準に合う初代心筋細胞をｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡによってトランスフェクションした。ＣＡＬ−５２０ＡＭを用いてＣａ²⁺トランジェントをイメージ化するために、トランスフェクションした及びトランスフェクションしていない細胞の両方を考慮する視野をｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いて選択した（図４Ａ）。長持ちする［Ｃａ²⁺］_iトランスフェクションがｍＣｈｅｒｒｙ発現を有する初代心筋細胞培養物中に見られた。心収縮期及び心臓拡張期で生み出される蛍光強度の代表的なアノテーションは、心収縮期の同時の素早い［Ｃａ²⁺］_iの突発によるリズミカルな及び組織的な［Ｃａ²⁺］_iトランジェントを明らかにし、心臓拡張期では無かった（図４Ｂ）。関連する領域をトランスフェクションした及びトランスフェクションしていない細胞により作り出し（図４Ａ）、そしてＣａ²⁺トランスフェクションの期間（Ｘ軸）に対する細胞内の蛍光強度（Ｙ軸）をプロットした（図４Ｃ）。トランスフェクションした及びトランスフェクションしていない細胞における類似の［Ｃａ²⁺］_iトランジェントを意味する。

【0074】

トランスフェクションした初代心筋細胞の電気的な機能を分析するために、心筋細胞の興奮性及び収縮を試験した。拍動する細胞をｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを用いてトランスフェクションし、そしてトランスフェクションした細胞を蛍光顕微鏡を用いて確認した（図５Ａ）。細胞の興奮において原因となる内部の電流成分を識別するために、トランスフェクションした新生仔の心筋細胞を全細胞の記録のパッチクランプモードにおけるランプ刺激プロトコールにさらした。そのような条件下で、−９０から＋４０ｍＶのランプ波は電位依存特性において異なった二つの典型的な内部の電流成分を誘導した（図５Ｂ）。〜５０ｍＶの最大値を有する第一の成分は電位依存性Ｎａ⁺チャネルの選択的阻害剤である、テトロドトキシン（ＴＸＸ，５μＭ）に典型的に感受性があった（図５Ｃ）。〜０ｍＶの膜電位の最大値の第二の成分は、電圧依存性のＬ型Ｃａ²⁺チャネル阻害剤（Ｉ_Ca）である、ニフェジピンに感受性があった。それゆえ、得られた電圧依存的な関係は、ｍＣｈｅｒｒｙトランスフェクション下でＩ_Na及びＩ_Caの電流成分の完全な特性を明らかにした。

【0075】

Ｍ³ＲＮＡ−ＦＬｕｃの心筋注射は迅速なタンパク質発現を誘導する

【0076】

ｉｎ ｖｉｖｏ条件下の初代心筋細胞の迅速な発現をＦＶＢマウスの左心室内にナノ粒子に基づいたＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡの直接的な心筋注射を用いて確認した。ｉｎ ｖｉｖｏの研究において、正に荷電した生体高分子によってコートされたナノ粒子（〜１００ｎｍ）をｍＲＮＡのキャリアとして用いた。正に荷電したナノ粒子は負に荷電したｍＲＮＡ分子を包んでいた（図６Ａ）。Ｍ³ＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏにおける投与で、ナノ粒子はエンドサイトーシスにより細胞内に入り、そして翻訳のためのｍＲＮＡ分子を放出する。鉄サブユニットを構成したナノ粒子は分解され、そして放出された鉄は通常の鉄代謝経路に入る。ＦＬｕｃを用いて生きた動物におけるタンパク質発現の動態を確認した。

【0077】

生物発光イメージングは注射後早ければ２時間の心臓内の心臓を標的とした発現を確認し、２４時間以内に３．５倍近くに増加し、７２時間までにバックグラウンドの水準近くまで下がる（図７Ａ及び７Ｂ）。心臓領域においてのみシグナルが検出されるように、標的でないトランスフェクションは観察されなかった（図７Ａ）。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡの心臓内注射後、連続的なセクションの２４時間では、ビヒクルコントロールと比較してｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを注射した心臓組織内で有意なｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を（図７Ｃ、中央下パネル）、緑色のチャネルにおいて、抗−ｍＣｈｅｒｒｙ抗体により確認したｍＣｈｅｒｒｙ発現（図７Ｃ、左下パネル）を明らかにした。トロポニン抗体は、心筋細胞内のｍＣｈｅｒｒｙ発現を明らかにし、同様に非心筋細胞領域においてｍＣｈｅｒｒｙの発現を認める（＊）。最終的に、心外膜への単回注射による複数の遺伝子発現を、ラット心臓におけるビヒクルのみと比較して、ＧＦＰ−Ｍ³ＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡ、及びＦＬｕｃ−Ｍ³ＲＮＡを用いて実施した。ＦＬｕｃイメージングを生きた動物において実施しうる；それゆえ、ＦＬｕｃ発現を２４時間でマウス心臓内でＸｅｎｏｇｅｎを用いて確認し、続いてその動物を屠殺し、そして心臓組織を加工し免疫蛍光（ＩＦ）分析をした。ＩＦは、シャム（上パネル）（図７Ｄ）における発現なしに対して、Ｍ³ＲＮＡした注射ラットにおける重複したＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ及び（抗Ｆｌｕｃ抗体を用いた）ＦＬｕｃタンパク質発現を明らかにした（下パネル）。

【0078】

急性心筋梗塞のブタモデルにおけるｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡの標的化された発現

【0079】

ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡをカルシウム−アルギン酸溶液内でカプセル化した。急性の心筋梗塞のブタのモデルを用いて（図８Ａ）、〜２５０μｇのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｍ³ＲＮＡの冠内の大量投与を、オーバーザワイヤーバルーンを留置する遠位開口部を用いて左前下行枝（ＬＡＤ）内に注入した。冠内の送達に続き、アルギン酸を、心エコー検査（ＩＣＥ；図８Ｂ）によって監視するように急性の損傷部位内の選択ゲルを可視化した。その心臓を、７２時間で収集し、冷却した通常の生理食塩水によって洗浄し、そしてＰｒｏＣＵＴサンプリングツールを用いてスライスした。スライスした心臓切片のｍＣｈｅｒｒｙフィルターを用いたＸｅｎｏｇｅｎの画像は、梗塞領域に局在化した著しいｍＣｈｅｒｒｙタンパク質発現を示した（図８Ｃ）。非梗塞領域に対する梗塞領域からの１−ｃｍスライスの免疫組織化学的検査では、より著しく高いｍＣｈｅｒｒｙ染色を特徴とし（図８Ｄ）、心臓の損傷部位内のタンパク質発現の標的化した誘導を確認した。

【0080】

遺伝子療法は、例えば、循環器疾患における治療及び再生のための有望な戦略である。ある臨床的なシナリオは、疾病の経過を逆転する遺伝子発現又は遺伝子編集を必要とする。そのような臨床的なシナリオは、例えば、凝固障害、酵素欠乏症、又は遺伝子変異を含む。しかしながら、健常人の集団において、急性事象に応答する有害炎症は組織の未治癒又は慢性的な損傷をもたらす。ＤＮＡ及びウイルスベクターは、コードしたタンパク質の長期間の発現を必要とする疾病を治療する偉大なツールである。ｍＲＮＡベクターはより適当でありうり、ここで急性炎症を弱めること及び／又はＣＲＩＳＰＲ−仲介ゲノム編集におけるように、一過性発現が好ましく、この中で対象外の事象は所望されない。ＲＮＡベクターはＤＮＡに基づいた及びウイルスに基づいた治療法上ある利点を提供する。例えば、ＲＮＡベクターはＤＮＡベクターと比較して遺伝子挿入のリスクがほとんど存在せず、ウイルスベクターと比較して免疫応答を呼び起こさず、並びにＤＮＡに基づく及びウイルスに基づく治療法の両方と比較して迅速及び一過性のタンパク質発現を惹起しうる。

【0081】

この開示は、初代心筋細胞、心臓、及び急性損傷した心筋を含む多数の細胞株に適合する迅速な発現を誘導する新規Ｍ³ＲＮＡに基づくアプローチを記載する。本プラットフォームは、初代心筋細胞の構造的な及び機能的な特性に影響をほとんど有さない又は全く有さないトランスフェクションによって、多数の細胞株及び初代細胞において制御された発現動態を示した。モデルレポータータンパク質のＦｌｕｃ、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びＧＦＰをコードするＭ³ＲＮＡの心筋注射は、心臓組織内で再現性良く迅速及び一貫したタンパク質発現を誘導した。さらに、本アプローチは、心臓組織内に多数の遺伝子の同時送達に十分な柔軟性であると見られ、そしてブタの心筋梗塞モデルにおいて急性損傷組織内に標的化されうる。Ｍ³ＲＮＡプラットフォームが心臓組織へトランスフェクションするために用いられる例示的実施形態の背景において例示されるので、そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは他の組織の細胞、例えば、線維芽細胞、骨格筋、腎臓、肝臓、及び／又は目に関する組織に核酸を導入するために用いられうる。

【0082】

本明細書に記載されるＭ³ＲＮＡに基づくプラットフォームは、患者のアウトカムを改善しうる。例えば、急性心筋梗塞の間、立て続けに分子的な事象が損傷時及び最終的に組織を損傷する結果となる再灌流後に生じる。損傷を、患者が非常に短時間（＜９０分間）以内に示す場合、迅速な経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）によって十分に中止されうる。しかしながら、＞９０分間から＜１２時間の存在するそれらにおいて、ＰＣＩが、心筋の損傷の範囲を、虚血及び低酸素によってますます悪くすることすら示した。実際に、ほとんどの個人において、最初の９０分後の血流の回復でさえ、心筋の機能及び回復の復帰及び通常に近い組織の能力をもたらす。しかしながら、集団の約３０％において、再灌流にもかかわらず、心筋の重篤な欠損が生じる。この現象を軽減するための取り組みは、抗血小板薬及び神経ホルモン拮抗薬に焦点を合わせた。しかしながら、最近の証拠の概要では、損傷への炎症反応の調節解除が壊滅的な心筋損傷の根本原因でありうる。

【0083】

再灌流療法の域を超えて、多くの再生プラットフォームが用いられ、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）後の心筋損傷を弱める試みがなされた。心保護を標的にする最初の介入は、天然の心保護メカニズムを増加させる取り組みにおいてＡＴＰ感受性カリウムチャネルの活性化に焦点をあてた。心保護の域を超えて、急性心筋梗塞の時点でアウトカムを改善する細胞治療的な取り組みは、骨髄中の単核細胞、間葉系肝細胞及び心筋への細胞特異的な細胞を送達することを辿った。細胞に基づく治療の域を超えて、遺伝子コード化治療（ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）は心臓麻痺及び心筋梗塞の両方においてますます考慮される。さらに、ＲＮＡ及びＤＮＡプラットフォームは、直接的な心外膜への注射を介して心筋内にＶＥＧＦを送達するために用いられている。さらに、また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びノンコーディングマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ＡＭＩ後の心筋の微小環境を変化する有望な治療的なプラットフォームとしてますます示唆されている。これらの遺伝子技術の実現に向けた障害は、現在の通常の診療との相補性の欠失である。それゆえ、前臨床の取り組みが継続して生物学的効果を立証しているが、そのようなプラットフォームの翻訳可能性はかなり乏しいままであった。

【0084】

本明細書に記載したＭ³ＲＮＡプラットフォームは現在の介入の実行と相補的な新規アプローチを示し、ｉｎ ｖｉｖｏでの増加した安定性、発現、及び減少した免疫原性のための修飾されるｍＲＮＡを導入する。Ｍ³ＲＮＡ複合体を金属ナノ粒子において修飾したｍＲＮＡをマイクロカプセル化することによって作製された。

【0085】

損傷後の心筋の微小環境の複雑な性質を考えると、心臓内の単一の遺伝子発現は、心臓血管の病的状態の任意の緩和効果を果たすには不十分である可能性がある。Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは多種類の異種遺伝子の同時遺伝子送達と両立できる。さらに、ある態様において、梗塞された床である標的へのアルギン酸のＭ³ＲＮＡの生物学的効果は、急性心筋梗塞の状況において迅速な遺伝子発現を果たす独特な機会を提供する。この目的で、ある者は障害後の心筋の血管由来の、細胞保護作用の、及び免疫調節の必要に寄与する相補的な遺伝子の送達を予想しうる。

【0086】

そのＭ³ＲＮＡプラットフォームは、細胞生存を標的にし、炎症経路を妨げ、そして血流の回復後迅速に働きうる。しかしながら、これらの経路は４８〜７２時間の期間中変化すると考えられ、長期間の発現は著しい利点とならないかもしれないどころか、有害なリスクを引き起こしうる。それゆえ、それは、異種遺伝子の発現がある程度、例えば７２時間（例えば、１４４時間）後に減少するある状況において有益でありうる。

【0087】

損傷部位でのＣａ²⁺の存在下でアルギン酸の自発的な架橋は、梗塞の治療のための治療的なＲＮＡをカプセル化することにおいて、ｉｎ ｓｉｔｕのアルギン酸マトリックスに局在化した。Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、標的化及び三日間で著しいタンパク質発現を果たす急に梗塞された心臓について、標的遺伝子送達及び発現のためのｉｎ ｓｉｔｕのアルギン酸ゲルと組み合わされうる。このアプローチは心臓発作を患う患者に心臓内で迅速な、一過性の、及び標的化したタンパク質発現を成し遂げることに有益でありうる。

【0088】

それゆえ、Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは、急性事象に適合した計画対象期間中の経皮的冠動脈形成術後すぐの遺伝子の介入の送達を可能にすると考えられる新規技術として寄与する。心臓の域を超えて、本技術が任意の細胞表現型において遺伝子発現を誘導しうるので、Ｍ³ＲＮＡプラットフォームは他の急性事象、例えば骨格筋損傷、麻痺、及び敗血症において用いられうる。

【0089】

前述の記載及び以下の請求項において、「ａｎｄ／ｏｒ」という用語は、任意の２以上のリスト化された要素の一又は全てのリスト化された要素又は組み合わせを意味する；「含む」という用語及びその変形したものは、無制限として解釈され、すなわち、追加の要素又は工程は付随的であり、存在しうる又はしないかもしれない；特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び「少なくとも一つ」は同じ意味で用いられ、そして一以上を意味し；そしてエンドポイントによる数的な範囲の引用はその範囲内に属している全ての数（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等）を含む。

【0090】

前述の記載において、特定の態様は明瞭さのための分離において記載されうる。特定の態様の特徴が別の態様の特徴と不適合であるとはっきりと断りのない限り、ある態様は、一以上の態様に関連する本明細書に記載される適合する特徴の組み合わせを含みうる。

【0091】

別々の工程を含む本明細書に開示される任意の方法について、その工程は任意の実現可能な命令において行われうる。そして、必要に応じて、任意の２以上の工程の組み合わせが同時に行われうる。

【0092】

本発明は以下の実施例により例示される。特定の例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載されている本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されるべきであることが理解されるべきである。

【実施例】

【0093】

実施例１
細胞株及び初代細胞培養

【0094】

ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、及びヒト胎児腎細胞２９３（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）を（グルコースを有する）ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１％グルタミン中で維持及び継代した。細胞株の最初の播種密度は６穴プレート中のウェル当たり、２００，０００ＨＥＫ細胞数及び３５０，０００ＨＤＦ及びＨＣＦ細胞数だった。全ての細胞株を定期的にマイコプラズマ汚染について確認した。妊娠期のラットをＣｈａｒｌｓ Ｒｉｖｅｒより購入し、ラットの心筋細胞を１９日齢の胚より得て、そして心筋細胞をメーカーの説明に従いｎｅｏｎａｔａｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて分離した。

【0095】

抗体、メッセンジャーＲＮＡｓ、及びトランスフェクション

【0096】

用いられた抗体は抗ｍＣｈｅｒｒｙ（Ｒａｔ ＩｇＧ２ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，１：１０００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、抗心臓トロポニンＴ（Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，１：２００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、抗Ｆｌｕｃ（Ｇｏａｔ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ；１：２５０，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）である。ＥＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＦｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＦＬｕｃ）ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡｓ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は修飾、例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ ｃａｐ）、ポリアデニル化した尾部、及び修飾したヌクレオチド５−メチルシチジン及びプソイドウリジンを備えた（図９）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで全ての細胞株におけるトランスフェクション研究をＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、約６０〜６５％のコンフルエントの細胞で実行した。２．５μｇの示されたｍＲＮＡを単一のトランスフェクション又はコトランスフェクションについて６穴ディッシュのウェルごとに用いた。マウスの研究について、１２μｇの示されたｍＲＮＡをマウスの心臓内注射に用いた；２５０μｇ ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ／ブタをブタの研究について用いた。

【0097】

フローサイトメトリー

【0098】

トランスフェクション効率をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて決定した。簡潔に、細胞をｍｏｃｋトランスフェクション、ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＲＮＡトランスフェクション、トリプシン処理し、そして細胞フィルターと適合した透明なポリスチレンチューブにおける４％ホルムアルデヒド内で４時間及び２４時間（１×１０⁶細胞数／ｍＬ）で収集した。続いて、チューブをＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＸ内に導入して分析した。

【0099】

カルシウムイメージング

【0100】

心筋細胞内のカルシウムトランジェントを以前に記載されたように（Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ．ａｌ．，２０１４，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ（Ｌｏｎｄ）５９２：４０５１）、ＣＡＬ−５２０ ＡＭ（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて可視化した。簡潔に、心筋細胞にｍｃｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡを一晩トランスフェクションし、その心筋細胞がトランスフェクション後に拍動していたかどうかを顕微鏡下で評価した。翌日、（ｍＭで）１．３３ｍＭのＣａＣｌ₂、１ｍＭのＭｇＣｌ₂、５．４ｍＭのＫＣｌ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、０．３３ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭのグルコース及び５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＴｙｒｏｄｅ緩衝液について１０μＭの終濃度で、ＣＡＬ−５２０（５ｍＭ）：ＰＯＷＥＬＯＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の１：１溶液中に、細胞をロードした。細胞をインキュベーター内で３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてさらに１５分間インキュベートし、完全なＣａｌ−５２０ＡＭの脱エステル化を認めた。完全培地を細胞に添加し、そしてイメージングをＺｅｉｓｓ ｕｐｒｉｇｈｔ ＬＳＭ５ライブ共焦点顕微鏡で２０Ｘの対物レンズ（ＮＡ ０．８）を用いて５％ＣＯ₂を有する３７℃の加湿チャンバー内で実施した。同じ領域においてトランスフェクションした及びトランスフェクションしていない細胞をｍＣｈｅｒｒｙの５４３ｎｍ励起において同定した。ラット初代心筋細胞のＣａ²⁺トランジェントを４８８ｎｍ励起で収集した。２５０枚のシングルイメージフレームを１０ｆｐｓで収集し、そしてそのデータを分析し、単一の心筋細胞上の対象領域（ＲＯＩ）から放出された蛍光をＺｅｎソフトフェアを用いて測定し、エクセルをエクスポートし、そしてＣａ²⁺トランジェントを示す図を作成した。

【0101】

初代心筋細胞におけるパッチクランプ記録

【0102】

パッチクランプ記録を以前に記載されたプロトコールの改変によって実施した（Ａｌｅｋｓｅｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １５７：２０３；Ｐｉｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：２６９５）。新生仔ラットの初代心筋細胞を、ボルテージクランプ法のパッチクランプ技術の全細胞記録（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を用いてｍＣｈｅｒｒｙ修飾したｍＲＮＡによってトランスフェクションした。５〜７ＭΩ抵抗を有する、パッチ電極を１２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５ｍＭ ＥＧＴＡ、及び５ｍＭのＡＴＰ９を有する１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）で満たし、そして細胞を１３６．５ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂、及び１ｇ／Ｌのグルコースを加えた５．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）で灌流した。膜電流をＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ａｍｐｌｉｆｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて測定した。細胞膜の抵抗及び細胞の容量を容量性の一過性の電流のオンライン分析に基づき決定した。連続した抵抗（１５〜２０ＭΩ）、は５０〜６０％まで補償され、そして補償されない細胞容量に沿って、試験を通じて継続して監視した。電流密度を細胞の容量に対して測定した電流を標準化することによって得た。刺激のプロトコール、細胞のパラメーターの決定及びデータ取得をＢｉｏＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて実施した（Ａｌｅｋｓｅｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １５７：２０３；Ｐｉｔａｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：２６９５；Ｎａｋｉｐｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １２：ｅ０１７７４６９）。試験を３３℃±１．８℃で実施した。

【0103】

画像分析

【0104】

細胞株のイメージングをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ 落射蛍光照明の広視野正立顕微鏡（１０Ｘ対物、ＮＡ０．３）又はＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（４０Ｘ水浸対物、ＮＡ１．２）を用いて実施した。続いて蛍光強度の定量化について図をＴｉｆｆ形式にインポートすることによってデータを分析し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析した。全体の画像について平均蛍光強度を定量化し、プロットした（Ｂｕｒｇｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：１２５６４；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７６：８９５）。

【0105】

ｉｎ ｖｉｖｏのＦｌｕｃ、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ修飾したｍＲＮＡの送達

【0106】

ｉｎ ｖｉｖｏの送達を、修飾されたプロトコールを用いて（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｊ Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ ４：ｅ００１６１４）、ＦＶＢ／ＮＪマウス（１８〜２２グラム、６〜８週齢、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）において実行した。麻酔下で、心臓を曝露し、示されるＭ³ＲＮＡを（示されるように）１２．５μｇ／ｍＲＮＡ／マウスで左心室の心筋に注射した。示された時点で動物を続けて撮影又は免疫組織化学染色のための加工をした。２０匹の動物はＭ³ＲＮＡ注射を受けて；１０匹をコントロールのために用いた。

【0107】

注射可能なアルギン酸Ｍ³ＲＮＡ調製

【0108】

カルシウム架橋アルギン酸溶液を、１ｍＬの２％アルギン酸（ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）と、０．５ｍＬの０．６％Ｃａ グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とを混合することによって調製し、０．５ｍＬの水を混合して２ｍＬのアルギン酸溶液をもたらした。５００μＬのカプセル化したｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ（２５０μｇ／ブタ）をＮａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｌｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｕｓ，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＹ）を用いて、メーカーの説明に従い調製した。溶液を一緒に混合し、以下の記載のようにブタの心臓の冠内に注射した。

【0109】

ブタの心筋梗塞におけるＭ³ＲＮＡ発現

【0110】

四頭のヨークシャー豚は、左前下行枝の９０分間のバルーン閉塞を用いて心筋梗塞を経験した。心腔内心エコー法（ＩＣＥ）プローブをリアルタイムＬＶモニタリングのために右心房に設置した。ＡＲ−２様式の冠状動脈カテーテルを用いて、ブタの左主幹動脈にアクセスし、そしてオムニパークの点滴によって蛍光顕微鏡を介して可視化した。０．０１４”のｂａｌａｎｃｅｄ ｍｉｄｄｌｅｗｅｉｇｈｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｗｉｒｅを、左前下行枝（ＬＡＤ）の遠位部に進めた。血管造影の誘導画像を保存して利用することで、２．５〜３ｎｍのバルーンを進め、ＬＡＤの第二の斜めの血管にわたって配置した。そのバルーンを膨張させ、ＬＡＤを９０分間梗塞し、続いて再灌流した。虚血性障害をＩＣＥ及び連続したＥＧＣテレメトリーによって監視した。再灌流後、末梢灌流バルーンカテーテルをバルーンの位置で設置した。アルギン酸溶液と組み合わせたカプセル化したｍＲＮＡを５分間ＬＡＤに導入し、遺伝子送達の標的化した梗塞域を３日目に確認した。

【0111】

統計

【0112】

データを平均±ＳＥＭとして示す。統計学的有意性を多重比較による一元配置分散分析又は二元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって決定した。０．０５未満のＰ値を統計学的有意差として得た。「ｎ」値は、反復された実験の回数又は動物の数を意味する。

【0113】

実施例２

【0114】

材料

【0115】

ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）、及びヒト胎児由来腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）を（グルコースを有する）ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％グルタミン中で維持及び継代した。マイコプラズマ汚染について両方の細胞株を定期的に確認した。

【0116】

ｍＣｈｅｒｒｙメッセンジャーＲＮＡをＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手した。このｍＲＮＡをＡＲＣＲ ｃａｐ、ポリアデニル化した尾部、及び修飾したヌクレオチド５−メチルシチジン及びプソイドウリジンを用いて修飾した（図９Ｂ）。

【0117】

修飾したｍＲＮＡ（Ｍ²ＲＮＡ）をｉｎ ｖｉｔｒｏのトランスフェクション試薬として、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＣ ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いてマイクロカプセル化した。トランスフェクション担体試薬、例えばＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを用いてマイクロカプセル化したＭ²ＲＮＡはマイクロカプセル化した修飾したｍＲＮＡ（Ｍ³ＲＮＡ）と称される。

【0118】

方法

【0119】

全ての細胞株についてｉｎ ｖｉｔｒｏのトランスフェクションの研究をＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて実施した。２．５μｇの示されたｍＲＮＡを単一のトランスフェクション又はコトランスフェクションについて６穴ディッシュのウェルごとに用いた。修飾したｍＲＮＡトランスフェクション後の線維芽細胞の位相差及び蛍光画像を４時間、２４時間、４８時間、及び１４４時間で得た；分析を実施し、それぞれのそれらの時点で発現の強度レベルを定量化した。細胞を５％ＣＯ₂を有する３７℃の湿度チャンバー内でライブイメージ化した。イメージングをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ 落射蛍光照明の広視野正立顕微鏡（１０Ｘ対物、ＮＡ０．３）又はＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（４０Ｘ水浸対物、ＮＡ１．２）を用いて実施した。蛍光強度の定量化についてのデータを続けて図をＴｉｆｆ形式にインポートすることによって分析し、そしてＩｍａｇｅＪを用いて分析した。全体の画像について平均蛍光強度を定量化し、プロットした。プロットは示された時点での平均±ＳＥＭの平均蛍光強度（任意単位）に基づいて作成した（ｎ＝３）。多重比較による一元配置分散分析を統計分析のために実施した（^****ｐ＜０．０００１）。

【0120】

４時間及び２４時間で試料をｍＣｈｅｒｒｙ発現によって分類し、これらの細胞の発現レベルを定量化し、トランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション効率をＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＸを用いて決定した。細胞をｍｏｃｋトランスフェクション、ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＲＮＡトランスフェクション、トリプシン処理し、細胞フィルターと適合した透明なポリスチレンチューブにおける４％ホルムアルデヒド内で４時間及び２４時間（１×１０⁶細胞数／ｍＬ）で収集した。続いて、チューブをＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＸ内に導入して分析した。その効率についてｍｏｃｋトランスフェクション細胞とコントロールとを比較した。結果を３つの異なる細胞株のトランスフェクション効率の割合（ｎ＝３）について３つの異なる実験のセットの平均±ＳＥＭのとしてプロットした（^****ｐ＜０．０００１；^**ｐ＜０．０１）。

【0121】

結果を図１において示し、そしてＭ³ＲＮＡが皮膚線維芽細胞、心臓線維芽細胞、及び上皮細胞内に持続的に発現されうることを示す。

【0122】

実施例３

【0123】

材料

【0124】

心筋細胞を妊娠ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得た１９日齢の胚から単離した。その心筋細胞をメーカーの説明に従って新生仔の初代心筋細胞分離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて単離した。

【0125】

また、実施例２に記載されるようにｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ²ＲＮＡを用いた。

【0126】

方法

【0127】

心筋細胞豊富な培養物を同時の拍動パターンの参照文献によって確認した。これらの細胞をＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸトランスフェクション試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて単一のトランスフェクション又はコトランスフェクションについて６穴ディッシュに２．５μｇのｍＲＮＡ／ウェルによってトランスフェクションした。Ｍ³ＲＮＡトランスフェクション後の心筋細胞の位相差及び蛍光画像を４時間、２４時間、４８時間、及び１４４時間で得た；分析を実行し、それぞれのそれらの時点で発現の強度レベルを定量化した。細胞を５％ＣＯ₂を有する３７℃の加湿したチャンバー内でライブイメージ化した。イメージングをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ 落射蛍光照明の広視野正立顕微鏡（１０Ｘ対物、ＮＡ０．３）又はＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（４０Ｘ／Ｗ、ＮＡ１．２）を用いて実施した。蛍光強度の定量化についてのデータを続けて図をＴｉｆｆ形式にインポートすることによって分析し、そしてＩｍａｇｅＪを用いて分析した。全体の画像について平均蛍光強度を定量化し、プロットした。トランスフェクションの定量化（ｎ＝３，＞１０画像／時点を有する）を平均±ＳＥＭの平均蛍光強度としてプロットした。多重比較による一元配置分散分析を統計分析のために実施した（^****ｐ＜０．０００１；^***ｐ＜０．００１）。

【0128】

４時間及び２４時間で試料をｍＣｈｅｒｒｙ発現によって分類し、これらの細胞の発現レベルを定量化し、そしてトランスフェクション効率を測定した。トランスフェクション効率をＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＸを用いて決定した。細胞をｍｏｃｋトランスフェクション、ｍＣｈｅｒｒｙ−ｍＲＮＡトランスフェクション、トリプシン処理し、細胞フィルターと適合した透明なポリスチレンチューブにおける４％ホルムアルデヒド内で４時間及び２４時間（１×１０⁶細胞数／ｍＬ）で収集した。続いて、チューブをＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＸ内に導入して分析した。その効率をコントロールとしてｍｏｃｋトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞と比較した。実験の三つの異なるセットより、トランスフェクションの割合について値を用いた。

【0129】

結果を図２Ａ〜２Ｃに示し、Ｍ³ＲＮＡは心筋細胞内に持続的に発現されうることを示す。

【0130】

実施例４

【0131】

材料

【0132】

心筋細胞を実施例３において記載されるように単離した。ＥＧＦＰメッセンジャーＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙメッセンジャーＲＮＡ、及びホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）メッセンジャーＲＮＡをＴｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手し、そして実施例２に記載されるように修飾した。

【0133】

方法

【0134】

心筋細胞豊富な培養液を確認し、そして実施例３において記載されるようにトランスフェクションした。

【0135】

細胞を５％ＣＯ₂を有する３７℃の加湿したチャンバー内でライブイメージ化した。ＤＡＰＩを用いて細胞核を示した。イメージングをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ 落射蛍光照明の広視野正立顕微鏡（１０Ｘ対物、ＮＡ０．３）又はＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（４０Ｘ／Ｗ、ＮＡ１．２）を用いて実施した。

【0136】

結果を図２Ｄ及び図２Ｅに示し、多数のＭ³ＲＮＡは同じ心筋細胞内に同時に共発現されうることを示す。

【0137】

実施例５

【0138】

材料

【0139】

６〜８週齢のＦＶＢ／ＮＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥより入手した。

【0140】

ｍＣｈｅｒｒｙ

【0141】

ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ²ＲＮＡは実施例２に記載される。ｍＲＮＡを含むホタルルシフェラーゼ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡを調製した。ＲＮＡを含むホタルルシフェラーゼは、空のキャップ及びポリアデニル化を含み、そしてそれゆえＭ²ＲＮＡであると考えられる。

【0142】

ＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡ及びｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡをナノ粒子に基づくｉｎ ｖｉｖｏのトランスフェクション試薬を用いて調製した（Ａｌｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａｓ Ｖｅｇａｓ，ＮＶ）。

【0143】

ＦＬｕｃ Ｍ²ＲＮＡを尾静脈注射のために２０μｇＦＬｕｃ Ｍ²ＲＮＡと１８００μＬのｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）とを混合することによって製剤化した。

【0144】

ＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡを皮下注射のために２０μｇＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡと１８００μＬのポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｐｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳＡ，Ｉｌｌｋｒｉｃｈ−Ｇｒａｆｆｅｎｓｔａｄｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて製剤化した。

【0145】

方法

【0146】

マウスにｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎの尾静脈注射を介するＦｌｕｃ Ｍ²ＲＮＡ溶液を投与し、皮下注射を介してｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡ又はＦｌｕｃ Ｍ³ＲＮＡを投与した。実験の開始時及び投与後２時間、４時間、６時間、及び２４時間で発現したルシフェラーゼの量を評価した。皮下注射を介してルシフェラーゼｍＲＮＡを含むナノ粒子を投与したマウスについて、発現したルシフェラーゼの量を投与後２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で評価した。マウスに皮下注射を介してｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを投与した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現を蛍光顕微鏡を用いて評価した。

【0147】

ルシフェラーゼ発現をＸｅｎｏｇｅｎ（ＩＶＩＳ）イメージングシステムを用いてイメージ化した。ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎの尾静脈注射を介してルシフェラーゼｍＲＮＡの溶液をマウスに投与した。

【0148】

結果を図１０及び図１１に示し、Ｍ³ＲＮＡが皮下投与後にｉｎ ｖｉｖｏで持続的に発現しうることを示す。

【0149】

実施例６

【0150】

材料

【0151】

６〜８週齢のＦＶＢ／ＮＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥより入手した。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）Ｍ²ＲＮＡを実施例５に記載した。Ｍ³ＲＮＡを実施例５に記載するように、Ａｌｔｏｇｅｎのナノ粒子試薬によって調製した。

【0152】

方法

【0153】

ｍＣｈｅｒｒｙ及びＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡを実施例５に記載するように調製し、投与した。送達のために、１２μｇ ｍＲＮＡ又は滅菌注射による等量の食塩水のいずれかを送達した。マウスはマウスの後肢、腎臓、又は肝臓のいずれかに注射を受けた。眼注射の場合において、その目の前眼房内に５μｇのｍＲＮＡのみ又は滅菌注射により等量の生理食塩水を送達した。全てのマウスをその後、Ｄ−ルシフェリンを基質として腹腔内に注射することによって多数回イメージ化し、そしてＸｅｎｏｇｅｎ（ＩＶＩＳ）イメージングシステムによって評価した。

【0154】

結果を図１２Ａ〜１２Ｄに示し、Ｍ³ＲＮＡを直接投与後異なる組織内でｉｎ ｖｉｖｏで持続発現しうることを示す。

【0155】

実施例７

【0156】

材料

【0157】

６〜８週齢のＦＶＢ／ＮＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥより入手した。ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）Ｍ³ＲＮＡを実施例５に記載するように調製した。

【0158】

方法

【0159】

１２μｇ／ｍＲＮＡ／マウスをエコーガイドでの心腔内注射を介して左心室の心筋に注射した。ルシフェラーゼ発現をＸｅｎｏｇｅｎ（ＩＶＩＳ）イメージングシステムを用いてイメージ化した。発現したルシフェラーゼ量を投与後２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で評価した。蛍光強度の定量化のためのデータを続けて図をＴｉｆｆ形式にインポートすることによって分析し、そしてＩｍａｇｅＪを用いて分析した。全体の図について平均蛍光強度を定量化し、プロットした。

【0160】

結果を図１３Ａ〜１３Ｂに示し、そしてＭ³ＲＮＡが心腔内注射後ｉｎ ｖｉｖｏにおいて持続的に発現しうることを示す。

【0161】

実施例８

【0162】

材料

【0163】

６〜８週齢のＦＶＢ／ＮＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥより入手した。ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）Ｍ³ＲＮＡを実施例５に記載されるように調製した。

【0164】

方法

【0165】

麻酔下で、マウスの心臓を曝露し、１２μｇ／ｍＲＮＡ／マウスのＦＬｕｃ Ｍ³ＲＮＡを左心室の心筋に注射した。動物を続いて示した時点でイメージ化又は免疫蛍光のために加工した。ルシフェラーゼ発現をＸｅｎｏｇｅｎ（ＩＶＩＳ）イメージングシステムを用いてイメージ化した。

【0166】

結果を図１４Ａ〜１４Ｂに示し、そしてＭ³ＲＮＡを心腔内注射後ｉｎ ｖｉｖｏで持続的に発現しうることを示す。

【0167】

実施例９

【0168】

材料

【0169】

医薬品グレードの、ｈｉｇｈ−Ｇ ａｌｇｉｎａｔｅ（ＮＯＶＡＭＡＴＲＩＸ，ＦＭＣ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ＡＳ，Ｓａｎｄｖｉｋａ，Ｎｏｒｗａｙ）及びグルコン酸カルシウム（０．６％カルシウム濃度、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を商業的供給源より入手した。

【0170】

ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを実施例５に記載するように調製した。

【0171】

方法

【0172】

ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを冠動脈内の送達のためにアルギン酸と混合した。結果として生じるマクロカプセル化したアルギン酸溶液をＭ⁴ＲＮＡと称する。この目的にのために、２％（重量）アルギン酸溶液を第一にＲＮａｓｅフリー／ＤＮａｓｅフリー水で作製した。カルシウム架橋したアルギン酸溶液（１％アルギン酸）を続いて１ｍＬの２％アルギン酸溶液と０．５ｍＬのグルコン酸カルシウムと０．５ｍＬの水とを混合することによって調製し、２ｍＬの溶液にした。処置の時点で、５００μＬの（２５０μｇのｍＲＮＡを含む）ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを２ｍＬのアルギン酸カルシウム溶液に混合し、それぞれのブタに注射した。

【0173】

四頭の大人のヨークシャー豚は、左前下行枝の９０分間のバルーン閉塞を用いて心筋梗塞を経験した。心腔内心エコー法（ＩＣＥ）プローブをリアルタイムＬＶモニタリングのために右心房に設置した。ＡＲ−２様式の冠状動脈カテーテルを用いて、ブタの左主幹動脈にアクセスし、そしてオムニパークの点滴によって蛍光顕微鏡を介して可視化した。０．０１４”のｂａｌａｎｃｅｄ ｍｉｄｄｌｅｗｅｉｇｈｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｗｉｒｅを、左前下行枝（ＬＡＤ）の遠位部に進めた。血管造影の誘導画像を保存して利用することで、２．５〜３ｎｍのバルーンを進め、ＬＡＤの第二の斜めの血管にわたって配置した。そのバルーンを膨張させ、ＬＡＤを９０分間梗塞し、続いて再灌流した。虚血性障害をＩＣＥ及び連続したＥＧＣテレメトリーによって監視した。

【0174】

再灌流後、末梢灌流バルーンカテーテルをバルーンの位置で設置した。Ｍ⁴ＲＮＡを５分間にわたりＬＡＤの二頭の豚に導入し、遺伝子送達の標的化にされる梗塞領域を３日目（７２時間）に確認した。その時点で、心臓を収集し、冷却した通常の生理食塩水によって洗浄し、そしてＰｒｏＣＵＴサンプリングツールを用いて切片化した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現量を調製した組織内で評価した。

【0175】

統計学的有意性を多重比較による一元配置分散分析又は二元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって決定した。０．０５未満のＰ値を統計学的有意差として得た。

【0176】

結果を図８Ｂ及び図８Ｃに示し、１％のアルギン酸濃度を有するＭ⁴ＲＮＡのアルギン酸に基づく送達が、送達後７２時間までにブタの梗塞した心臓組織内のＭ³ＲＮＡの標的化した発現をもたらすことを示す。

【0177】

実施例１０

【0178】

材料

【0179】

医薬品グレードの、ｈｉｇｈ−Ｇ ａｌｇｉｎａｔｅ、グルコン酸カルシウム、ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを実施例９に全て記載する。

【0180】

方法

【0181】

Ｍ³ＲＮＡを冠動脈内送達のためにアルギン酸と混合した。二つの異なるカルシウム架橋アルギン酸溶液を用いた：１．５％のアルギン酸濃度及び０．５％のアルギン酸濃度。０．５ｍＬの（２５０μｇのｍＲＮＡを含む）ｍＣｈｅｒｒｙ Ｍ³ＲＮＡを実施例９に記載するように２ｍＬのアルギン酸カルシウムと混合した。

【0182】

二頭の大人のヨークシャー豚は、左前下行枝の９０分間のバルーン閉塞を用いて心筋梗塞を経験した。心腔内心エコー法（ＩＣＥ）プローブをリアルタイムＬＶモニタリングのために右心房に設置した。ＡＲ−２様式の冠状動脈カテーテルを用いて、ブタの左主幹動脈にアクセスし、そしてオムニパークの点滴によって蛍光顕微鏡を介して可視化した。０．０１４”のｂａｌａｎｃｅｄ ｍｉｄｄｌｅｗｅｉｇｈｔ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｗｉｒｅを、左前下行枝（ＬＡＤ）の遠位部に進めた。血管造影の誘導画像を保存して利用することで、２．５〜３ｎｍのバルーンを進め、ＬＡＤの第二の斜めの血管にわたって配置した。そのバルーンを膨張させ、ＬＡＤを９０分間梗塞し、続いて再灌流した。虚血性障害をＩＣＥ及び連続したＥＧＣテレメトリーによって監視した。

【0183】

再灌流後、末梢灌流バルーンカテーテルをバルーンの位置で設置した。それぞれのブタに同じ用量のＭ⁴ＲＮＡを有する異なるアルギン酸濃度を投与し、５分間にわたりＬＡＤのそれぞれのブタに導入した。遺伝子送達の標的化にされる梗塞領域を３日間（７２時間）で確認した。その時点で、心臓を収集し、冷却した通常の生理食塩水によって洗浄し、そしてＰｒｏＣＵＴサンプリングツールを用いてスライスした。ｍＣｈｅｒｒｙ発現量を調製した組織内で評価した。

【0184】

統計学的有意性を多重比較による一元配置分散分析又は二元配置分散分析を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７によって決定した。０．０５未満のＰ値を統計学的有意差として得た。

【0185】

結果を図１５に示し、減少したアルギン酸濃度が生物製剤の送達を拡散させ、シグナルの欠失をもたらすことを示す。

【0186】

本明細書で引用される全ての特許、特許出願及び公開公報及び電子的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑのような塩基配列登録、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ，ＰＩＲ，ＰＲＦ，ＰＤＢのようなアミノ酸配列登録、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおいて注釈されるコード領域からの翻訳を含む）はそれらの全体が参照によって取り込まれる。任意の矛盾が本出願の開示と本明細書に参照によって取り込まれる任意の資料の開示との間に存在する事象において、本出願の開示が適用される。本明細書の前述の記載及び実施例は理解の明確さのためのみに与えられている。そこから不必要な制限を理解する必要はない。本発明は示され、記載された正確な詳細に限られず、当業者に明らかな変化について、請求項によって定義される本発明に含まれるだろう。

【0187】

特に断りのない限り、成分、分子量、並びに明細書及び請求の範囲に用いられるその他の量を示す全ての数は「約」という用語によって全ての例において修飾されるように理解されることになる。従って、それとは反対に、特に断りのない限り、明細書及び特許請求の範囲において記述される数値的なパラメータは本発明によって得られることが求められる所望される特性に依存して変化しうる概算である。最低限及び請求の範囲と同等の原理に限定する試みとしてでなく、それぞれの数的パラメータが少なくとも、報告された有効数字に照らして、そして通常の丸め技術を適用することによって解釈されると考えられる。

【0188】

本発明の幅広い範囲の上記で設定した数的な範囲及びパラメータが概算であるにもかかわらず、特定の例における数的な値は、可能な限り正確に報告される。しかしながら、全ての数的な値は、本質的にそれらの対応の試験測定において見られる標準偏差に起因する必要な範囲を含む。

【0189】

全ての見出しは読者の便宜のためであり、特に断りのない限り、見出しに続く文章の意味を制限するために用いられるべきではない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【国際調査報告】